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UFRRJ
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS - GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
CIÊNCIA DO SOLO
DISSERTAÇÃO
Caracterização e Seleção de Rizóbios
de Mucuna
Andréa Aparecida de Lima
2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
CIÊNCIA DO SOLO
CARACTERIZAÇÃO E SELEÇÃO DE RIZÓBIOS
DE MUCUNA
ANDRÉA APARECIDA DE LIMA
Sob a Orientação do Pesquisador
Gustavo Ribeiro Xavier
e Co-orientação da Pesquisadora
Norma Gouvêa Rumjanek
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em
Agronomia, Área de Concentração
em Ciência do Solo.
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA - CIÊNCIA DO SOLO
ANDRÉA APARECIDA DE LIMA
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências,
no Curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de Concentração em Ciência do Solo.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM: 06/03/2009
Gustavo Ribeiro Xavier. Dr.UFRRJ
Orientador
Eduardo Lima. Dr. UFRRJ
Carolina Ettiene de Rosália e Silva Santos Dra. UFRPE
DEDICATÓRIA
Dedico à minha filha Alice que é a razão do meu
viver, à minha mãe Alair que sempre me apoiou e
me deu amor, ao meu pai Lauro “in memoriam” pelo
exemplo e ao meu marido Diogo pela compreesão
em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
À capes pela concessão da bolsa.
Ao CPGA-CS pelo apoio.
À Embrapa Agrobiologia pela estrutura no andamento dos trabalhos.
Ao meu orientador Dr. Gustavo R. Xavier e minha Co-orientadora Dra. Norma G.
Rumjanek pelo incentivo e persistência nos trabalhos.
À minha filha Alice pelo amor e carinho mesmo com a minha ausência.
À minha mãe Alair por todo o afeto e confiança a mim dedicados e pelo exemplo de
mulher e mãe e ao meu pai Lauro “in memorian” pelo carinho.
À minha família, meus irmãos e sobrinhos pelo amor e entendimento. Especial
agradecimento ao meu irmão Edson que foi meu espelho pra continuar até aqui.
À minha sogra Girseli, sogro Ubirajara e cunhada Danielle pela ajuda e pelo amor
dedicado á minha filha em todos estes anos.
Ao meu marido Diogo pelo companheirismo e compreensão nos momentos mais
difíceis.
Às antigas e atuais moradoras do quarto F4-203 e agregadas pela sincera amizade,
afeto e cumplicidade.
Aos meus amigos Hugo e Alex e Wallace, meus irmãos de Rural obrigada pela
amizade.
Às minhas amigas, Fernanda Delgado, Alessandra Dalla Costa, Anita Bueno e Míriam
Bianchi e Renata Silva obrigada pelo carinho.
Aos funcionários e estagiários da Embrapa Agrobiologia da casa vegetação Rômulo
Hernani, Naldo, Marildo e em especial Claudinho que foi sem sombra de dúvidas meu “anjo”
neste tempo de mestrado.
Aos meus amigos do lab Ecologia Microbiana: João Luiz, Paulo Ivan e Samuel e Rosa
“minha mãezinha” pela ajuda e amizade.
Às meninas da equipe de adubo verde: Sumaya, Fernanda e Carol pela ajuda nos
trabalhos.
À Geraldo Baêta pela amizade e profissionalismo.
Ao pessoal da secretaria de Pós-graduação: Roberto, Marquinhos e Luciene.
Ao pessoal do alojamento da Embrapa.
Enfim à todos que de alguma forma contribuíram para o meu crescimento pessoal e
profissional o meu muito obrigada.
BIOGRAFIA
Andréa Aparecida de Lima nasceu na cidade de Irani - SC em 03 de março de 1980. Iniciou o
curso de graduação em Ciências Agrícolas na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
em 2001, transferindo-se para o curso de Engenharia Agronômica em 2003, diplomando-se
em 2006. Durante a graduação foi Estagiária no Departamento de Solos, área de Biologia dos
Solos sob orientação do Dr. Ricardo Luís Louro Berbara e sob a mesma orientação foi
bolsista de Iniciação Científica pela Fundação Mokiti Okada. Estagiou no laboratório de
Micorrizas na Embrapa Agrobiologia sob a orientação do Dr. Orivaldo Saggin júnior. Em
março de 2007 ingressou no curso de Pós-Graduação em Agronomia – Ciência do Solo
(UFRRJ), sob orientação do Dr. Pesquisador Gustavo Ribeiro Xavier do laboratório de
Ecologia microbiana da Embrapa agrobiologia, obtendo o grau de Mestre em Ciência, em
2009.
RESUMO
LIMA, Andréa Aparecida de. Caracterização e seleção de rizóbios de Mucuna. 2009. 86f
Dissertação (Mestrado em Agronomia, Ciência do Solo). Instituto de Agronomia,
Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2009.
O objetivo deste trabalho foi caracterizar e pré-selecionar rizóbios de mucuna do
SIPA(Sistema Integrado de Produção Agroecológica) para serem usados como inoculantes.
Um primeiro experimento foi montado nas dependências da Embrapa Agrobiologia em vasos
com oito solos coletados no SIPA para obter nódulos de mucuna para posterior isolamento e
caracterização. O delineamento foi inteiramente casualizado com duas repetições. Com
nódulos coletados, procedeu-se então o isolamento e caracterização morfológica dos adubos
verdes, dando origem a um dendrograma de similaridade. Representantes desses grupos foram
caracterizados por ARDRA, utilizando três enzimas de restrição (Msp I, Hinf I e Dde). Com
os isolados obtidos dos nódulos procedeu-se o teste de nodulação para a pré-seleção dos
isolados mais promissores, sendo avaliado número de nódulos, massa seca de nódulos e
massa seca da parte aérea. No teste de eficiência com as cinco estirpes mais promissoras foi
avaliada a massa seca de nódulos, massa fresca e seca da parte aérea, massa seca de raíz e
Ntotal da parte aérea. Os testes foram realizados em casa de vegetação, o delineamento foi em
blocos ao acaso com quatro repetições e duas coletas. O tempo de crescimento e alteração de
pH foi determinantes para a formação dos grupos morfológicos de isolados de mucuna. Em
geral os isolados de rizóbios do SIPA apresentaram resultados similares à testemunha
nitrogenada e à estirpe recomendada. Observou-se ampla diversidade de rizóbios de mucuna
nas caracterizações realizadas.
Palavras-chave: Adubação verde, FBN, simbiose, diversidade.
ABSTRACT
LIMA, Andréa Aparecida de. Characterization and selection of rhizobia Mucuna. 2007. 86p.
Dissertation (Master Science in Agronomy, Soil Science). Instituto de Agronomia,
Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2009.
The objective of this study was to characterize and select rhizobia of mucuna to be used as
inoculants. A first trial was in the dependencies of Embrapa Agrobiologia in pots with soil
collected in eight Fazendinha for nodules of mucuna for subsequent isolation and
characterization. The design was completely randomized with two replications. With nodules
collected, it is now the isolation and morphological characterization of green manure,
resulting in a dendrogram of similarity. Representatives of these groups were characterized by
ARDRA, using three restriction enzymes (Msp I, I and HinfI DDE). With isolates obtained
from nodules was carried out the test of nodulation for pre-selection of promising more
isolated, and estimated number of nodules, dry weight of nodules and dry weight of shoot.
The test of efficiency with the five most promising strains were assessed for dry mass of
nodules, fresh and dry mass of shoot, dry mass of root and shoot of Ntotal. The test was
conducted in a greenhouse, the design of randomized blocks with four replications and two
collections. The time of growth and change of pH to determine the formation of groups of
isolates of mucuna mofológicos. In general, the strains of rhizobia showed similar results to
control nitrogen and the strain recommended. There was wide diversity of rhizobia in the
characterizations of mucuna performed.
Keywords: green manure, Rhizobium, biological nitrogen fixation, symbiosis.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................................. 2
2.1. Crise Energética............................................................................................................... 2
2.2. Contribuição da Adubação Verde na agricultura ............................................................ 3
2.3. Fixação Biológica de Nitrogênio ..................................................................................... 6
2.4. Interação entre rizóbio e adubo verde ............................................................................. 9
2.5. Sobrevivência e Especificidade de Rizóbios ................................................................. 12
2.6. Inoculantes..................................................................................................................... 14
2.7. Caracterização e Seleção de Rizóbios ........................................................................... 17
3. Material e Métodos .............................................................................................................. 21
3.1. Área Experimental ......................................................................................................... 21
3.2. Plantios de adubos verdes para coleta de nódulos ......................................................... 21
3.3. Coletas de nódulos......................................................................................................... 24
3.4. Teste de nodulação ........................................................................................................ 25
3.4.1. Mucuna anã ............................................................................................................. 26
3.4.2. Mucuna Cinza ......................................................................................................... 26
3.4.3. Mucuna Preta .......................................................................................................... 27
3.5. Testes de eficiência de estirpes em condição controlada .............................................. 27
3.5.1. Mucuna anã, cinza e preta....................................................................................... 27
3.6. Caracterização Genotípica de bactérias ......................................................................... 28
3.6.1. Extração .................................................................................................................. 28
3.6.2. A reação de PCR ..................................................................................................... 28
3.6.3. A análise de restrição ........................................................................................... 29
4. Resultados e discussão......................................................................................................... 30
4.1. Nódulos das espécies de mucuna plantados em vasos .................................................. 30
4.2. Caracterização fenotipica ........................................................................................... 33
4.2.1. Caracterização fenotípica de mucuna anã............................................................ 33
4.2.2. Caracterização fenotípica em mucuna cinza ........................................................... 36
4.2.3. Caracterização fenotípica em mucuna preta ........................................................... 39
4.3. Diversidade Morfológica de i solados de Rizóbio ........................................................ 42
4.4. Teste de nodulação ........................................................................................................ 43
4.4.1. Teste de nodulação em mucuna anã........................................................................ 43
4.4.2. Teste de nodulação em mucuna cinza ................................................................. 47
4.4.3. Teste de nodulação em mucuna preta ..................................................................... 50
4.5 . Teste de eficiência em casa de vegetação..................................................................... 52
4.5.1. Teste de eficiência em mucuna anã......................................................................... 52
4.5.2. Teste de eficiência em mucuna cinza....................... Erro! Indicador não definido.
4.5.3. Teste de eficiência em mucuna preta ...................................................................... 57
4.6. Caracterização genotípica.............................................................................................. 60
4.6.1. Caracterização genotípica por ARDRA em mucuna anã........................................ 60
4.6.2. Caracterização genotípica por ARDRA em mucuna Cinza .................................... 64
4.6.3. Caracterização genotípica por ARDRA em mucuna Cinza .................................... 66
4.7. Avaliação do agrupamento dos isolados das três espécies de mucuna através do perfil
de restrição................................................................................................................. 68
5. Conclusão............. ........................................................................................................... ....71
6. Referências Bibliográficas .................................................................................................. 73
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Imagem aérea da área do SIPA e em detalhe os locais de implantação dos experimentos.
Foto cedida por Ricardo Eiras Moreria da Rocha. (Escala 1:2.000). ............................................... 23
Figura 2. Nodulação de mucuna anã, cinza e preta em solos coletados na Fazendinha, Sendo 1, 2 e 3:
Planossolo; 4, 7 e 8: Argissolo amarelo; 5, 6: Argissolo vermelho amarelo. .................................. 30
Figura 3. Massa seca da parte aérea de mucuna anã, cinza e preta em solos coletados da Fazendinha.
Sendo: Solos 1, 2 e 3: Planossolo; 4, 7 e 8: Argissolo amarelo e; 5 e 6: Argissolo vermelho amarelo.31
Figura 4. Percentagem de nodulação de Mucuna preta, M. cinza e M. anã usadas como adubos verdes
em diferentes classes de solos...................................................................................................... 32
Figura 5. Percentagem de massa seca da parte aérea (MSPA) de Mucuna preta, M. cinza e M. anã
usadas como adubos verdes em diferentes classes de solos. ........................................................... 33
Figura 6. Dendrograma de similaridade com base em características morfológicas de isolados de
bactérias que nodulam mucuna anã de solos oriundos do SIPA, pelo coeficiente de Jaccard e pelo
método de agrupamento UPGMA. ............................................................................................... 34
Figura 7. Dendrograma de similaridade com base em características morfológicas de isolados de
bactérias que nodulam mucuna cinza de solos oriundos do SIPA, pelo coeficiente de Jaccard e pelo
método de agrupamento UPGMA. ............................................................................................... 37
Figura 8. Dendrograma de similaridade com base em características morfológicas de isolados de
bactérias que nodulam mucuna preta de solos oriundos do SIPA, pelo coeficiente de Jaccard e pelo
método de agrupamento UPGMA. ............................................................................................... 40
Figura 9. Número de isolados de mucuna anã, distribuídos em classes em função de diferença
estatísticaem teste de Scott-knott a nível de significância de 0,05................................................... 43
Figura 10. Número de nódulos em 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna anã.... 44
Figura 11. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
anã em casa de vegetação. ........................................................................................................... 44
Figura 12. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
anã em casa de vegetação. ........................................................................................................... 45
Figura 13. Número de isolados de mucuna cinza, distribuídos em classes em função de diferença
estatística em teste de Scott-knott a nível de significância de 0,05. ................................................. 47
Figura 14. Número de nódulos em 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna cinza. 47
Figura 15. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
anã em casa de vegetação. ........................................................................................................... 48
Figura 16. Matéria seca de nódulos de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna anã
em casa de vegetação. ................................................................................................................. 48
Figura 17. Número de isolados de mucuna cinza, distribuídos em classes em função de diferença
estatística em teste de Scott-knott a nível de significância de 0,05. ................................................. 50
Figura 18. Número de nódulos em 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna preta.em
casa de vegetação. ...................................................................................................................... 50
Figura 19. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
preta em casa de vegetação.......................................................................................................... 51
Figura 20. Matéria seca de nódulos de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna anã
em casa de vegetação. ................................................................................................................. 51
Figura 21. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna anã e clivadas com
as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e Dde I................................................................................ 62
Figura 22. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna cinza e clicadas
com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e Dde I. ....................................................................... 65
Figura 23. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna preta e clicadas
com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e Dde I. ....................................................................... 67
Figura 24. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna preta, cinza e anã,
clivadas com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e Dde.............................................................. 69
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Gêneros e espécies de rizóbios e seus hospedeiros(Adaptado de Zilli, 2001; Moreira 2008)
(Continua).................................................................................................................................... 7
Tabela 2. Produção de Massa seca (MS) e N fixado em diferentes espécies de mucuna. .................. 11
Tabela 3. Inoculantes recomendados para adubos verdes no Brasil................................................. 16
Tabela 4. Classes de solo do SIPA, sua localização e seu respectivo uso......................................... 22
Tabela 5. Características químicas dos oito solos utilizados neste estudo. ....................................... 24
Tabela 6. Parâmetros de separação dos grupos no dendrograma de Mucuna anã.............................. 35
Tabela 7. Parâmetros.de separação dos grupos no dendrograma de Mucuna cinza. .......................... 38
Tabela 8. Parâmetros de separação dos grupos no dendrograma de Mucuna preta. .......................... 41
Tabela 9. Diversidade, riqueza e abundância de rizóbios em solos da fazendinha agroecológica....... 42
Tabela 10. Média das variáveis avaliadas (número de nódulos, matéria seca de nódulos e matéria seca
da parte aérea)em teste de nodulação dos cinco isolados pré-selecionados para teste de eficiência.... 45
Tabela 11. Características das bactérias que apresentaram as melhores médias de MSN e MSPA em
teste de nodulação em mucuna anã. ............................................................................................. 46
Tabela 12. Média das variáveis avaliadas (número de nódulos, matéria seca de nódulos e matéria seca
da parte aérea)em teste de nodulação dos cinco isolados pré-selecionados para teste de eficiência.... 49
Tabela 13. Características culturais e de solo das bactérias que apresentaram as melhores médias de
MSN e MSPA em teste de nodulação em mucuna cinza. ............................................................... 49
Tabela 14. Parâmetros analisados em teste de eficiência em casa de vegetação na espécie de mucuna
anã usada como adubo verde. ...................................................................................................... 53
Tabela 15. Parâmetros analisados em teste de eficiência em casa de vegetação com cinco isolados de
mucuna cinza pré-selecionados e três testemunhas. ....................................................................... 56
Tabela 16. Parâmetros analisados em teste de eficiência em casa de vegetação com cinco isolados de
mucuna preta pré-selecionados e três testemunhas. ....................................................................... 59
1
1. INTRODUÇÃO
Com a crise mundial do petróleo e a preocupação ambiental, é cada vez mais evidente
a necessidade de alternativas tecnológicas mais sustentáveis para os sistemas de produção
agrícolas. Além do alto custo energético e financeiro para a obtenção de insumos sintéticos,
seu uso na agricultura pode ter efeitos negativos ao ambiente devido às lixiviações
acarretando em poluição dos lençóis freáticos. Na agricultura atual a busca por formas
alternativas de suprimento de nutrientes às plantas é constante e necessária. Alguns nutrientes
são mais limitantes ao crescimento vegetal, como no caso do nitrogênio (N) que tem alta
mobilidade no solo sendo facilmente perdido.
O uso de espécies de leguminosas é bastante difundido e tem sido responsável também
pela maximização da fixação biológica de nitrogênio (FBN) nos sistemas agrícolas. O uso de
adubos verdes para suprir nitrogênio ao sistema vem crescendo nos últimos anos, sendo uma
forma racional e benéfica o ambiente, fornecendo grande parte do N exigido pela cutura
principal e de importância econômica..
A FBN é resultado da associação simbiótica entre a planta e bactérias diazotróficas,
responsáveis pela redução do N
2
à NH
4
forma assimilada pelas plantas. Além dos fatores
intrínsecos da simbiose esse processo de FBN é influenciado pelas características edafo-
climáticas, refletindo nas diferentes respostas em relação a sobrevivência, competitividade,
faixa hospedeira, especificidade e eficiência simbiótica das estirpes usadas nos programas de
inoculação de sementes (BRATTI et al., 2005).
O sucesso para otimizar a FBN depende da seleção e espeficidade simbiótica na
interação rizóbio e planta. As estirpes usadas como inoculante para mucuna foram
selecionadas há vários anos e também recomendadas para outras culturas. A seleção contínua
de rizóbios específicos para essas culturas pode aumentar a eficiência agronômica da FBN,
aumentar a biomassa vegetal e o teor de N-total na planta.
Para isso é necessário o cumprimento de várias etapas que engloba desde o estudo
morfológico, génetico e de eficiência das bactérias fixadoras de nitrogênio até fatores
ambientais, de adaptação e especificidade de espécies.
O objetivo do trabalho foi caracterizar e selecionar rizóbios de mucuna oriundos da
fazendinha agroecológica em Seropédica - RJ para uso como inoculante.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Crise Energética
Os combustíveis fósseis (petróleo, gás natural e carvão) contribuem com cerca de 80%
do total da oferta mundial de energia. De acordo com as previsões para os próximos anos, o
consumo de petróleo ainda é crescente, de 85 milhões de barris por dia em 2006 para 118 em
2030 (Hester, 2006; EIA-DOE, 2007), com pico para a produção mundial de petróleo
estimada entre 2010 e 2020 (Kerr, 1998). A depender das taxas de produção e de consumo, as
reservas atualmente conhecidas de combustíveis fósseis são estimadas entre 41 há
aproximadamente 700 anos (Goldemberg e Johansson, 2004; Goldemberg, 2007).
A combinação da insaciável demanda mundial com a expectativa de declínio da
produção tem implicações óbvias para a segurança energética. Dentre os 10 maiores países
consumidores do mundo, sete deles apresentam déficit na produção. Ao longo dos últimos
anos, os preços do barril de petróleo oscilaram de US$ 25 dólares (janeiro/2000) para mais de
U$$ 140 (junho/2008). Atualmente (janeiro/2009) está abaixo dos US$ 40 (EIA-DOE, 2009).
A finitude dos combustíveis fósseis, a instabilibilidade nos preços e na política nas
regiões mais ricas em petróleo, associada as preocupações para a segurança energética, e mais
recentemente a necessidade de responder às alterações climáticas, levaram ao crescente
interesse mundial em fontes de energia renováveis (Koh and Ghazoul, 2008).
Em especial para o Brasil, é verdade que as recentes descobertas brasileiras, na área do
pré-sal, podem contribuir para minimizar esse impacto político-econômino, mas, a falta de
tecnologia para a extração em águas ultraprofundas e, também os custos de produção podem
retardar o processo de extração, refino e transporte do óleo, exigindo cada vez mais incentivo
para opções renováveis de energia em consonância a preservação do meio ambiente.
Por outro lado, o Brasil foi pioneiro na produção de biocombustíveis em larga escala,
impulsionado pela crise do petróleo dos anos 1970. Diante das altas nos preços do petróleo e
baixa do açúcar, o govermo militar introduziu etanol à gasolina e ofereceu subsídios para a
produção de cana-de-açúcar para bioetanol.
Hoje, transcorridos quase 40 anos, uma nova concepção se instala no Brasil para a
cultura dos biocombustíveis. Reduzir a dependência energértica a partir de fontes não
3
renonáveis e muitas das vezes com disponiliblidade limitada, poderá garantir maior
competitividade ao produto nacional, sobretudo se tiver associada à redução de custos de
produção (KOVALESKI & SOLA, 2004).
Se por um lado conter a dependência perpassa pela utilização de biocombustível, por
outro, uma outra possibilidade é a redução ou eliminação dos adubos nitrogenados nas
culturas, cuja síntese requer condições de alta temperatura e pressão obtidos através da
combustão de energia fóssil, a partir da técnica análoga à de Haber-Bosch,
A incorporação de nitrogênio (N) via fixação aos diferentes ecossistemas do planeta é
bastante elevada, representando uma economia considerável de energia fóssil. Estima-se que a
contribuição do processo de fixação biológico de nitrogênio (FBN) para o total de N
introduzido em sistemas agrícolas no mundo, correspondente a 65% (REIS et al, 2006).
Para o crescimento econômico de um país, aumento da oferta de trabalho e renda é
necessário investimento em energia, principalmente renovável, minimizando os impactos
ambientais (KOVALESKI & SOLA, 2004).
2.2. Contribuição da Adubação Verde na agricultura
O nitrogênio é o nutriente que mais limita a produtividade agrícola em solos tropicais
(Urquiaga & Zapata, 2000). A prática de utilização de resíduos orgânicos é uma das mais
antigas aplicadas na agricultura seja através da compostagem ou da adubação verde. O uso de
plantas de cobertura de solo baseia-se na utilização de espécies com características desejáveis
em rotação ou consórcio com culturas de interesse econômico (ESPINDOLA et al., 2005).
As leguminosas herbáceas constituem algumas das plantas mais utilizadas como
adubos verdes, embora espécies de outras famílias botânicas também sejam freqüentemente
utilizadas. A adubação verde é uma prática agrícola que consiste no plantio de espécies
vegetais, tanto de ciclo anual como perenes, em sistema de rotação ou em consórcio com
culturas de interesse econômico. Esta prática é caracterizada por melhorar as condições
químicas, físicas e biológicas do solo, através da redução das perdas por erosão, aumento do
teor de matéria orgânica, da capacidade de troca catiônica, da reciclagem dos nutrientes e pelo
controle de nematóides e de plantas invasoras (MOJTAHEDI et al., 1993; STAMPFORD et
al., 1994; DE-POLLI et al., 1996; BIEDERBECK et al., 1998; ALCÂNTARA et al., 2000).
A adubação verde permite também o aporte de quantidades expressivas de fitomassa,
possibilitando uma elevação no teor de matéria orgânica do solo ao longo dos anos. Como
4
conseqüência, obtêm-se um aumento da capacidade de troca catiônica (CTC) do solo, o que
acarreta maior retenção de nutrientes junto às partículas do solo, reduzindo perdas por
lixiviação (KIEHL, 1985).
A presença de material orgânico fornecido pelos adubos verdes favorece a atividade
dos organismos do solo (FILSER, 1995; KIRCHNER et al., 1993), já que seus resíduos
servem como uma fonte de energia e nutrientes. Além disso, a manutenção da cobertura
vegetal permite reduzir as oscilações térmicas e de umidade, criando condições que
favorecem o desenvolvimento dos organismos do solo. Por sua vez, a maior atividade
biológica do solo aumenta a reciclagem de nutrientes, o que permite inclusive um melhor
aproveitamento dos fertilizantes aplicados ao solo (PANKHURST & LYNCH, 1994).
A proteção mecânica promovida pela cobertura vegetal também atua amenizando o
impacto direto das gotas de chuva, que causam a desagregação das partículas do solo
(FLEMING et al., 1997). A manutenção da cobertura vegetal promovida pelos adubos verdes
permite ainda uma retenção mais eficiente da água na superfície do solo, além de reduzir a
oscilação térmica na camada superficial (SIDIRAS et al., 1984).
Essa prática tem a vantagem também de promover a recuperação da fertilidade do
solo, perdida devido ao manejo inadequado e à adoção de monocultivo, e o aumento da
disponibilização do N para a cultura seguinte, contribuindo ainda para reduzir a poluição
ambiental por adubos altamente solúveis (CREWS & PEOPLES, 2004). A utilização de
insumos alternativos, como os adubos verdes, pode permitir também a utilização de esterco
atualmente aplicadas e contribuir para repor as reservas de N do solo, retirado do sistema com
a colheita.
Existem várias formas de utilização de leguminosas como fonte de N para o solo
(CALEGARI, 2000). A mais comum é a sua utilização sob a forma de pré-cultivo, em que o
adubo verde precede a cultura principal, que se beneficia posteriormente com a mineralização
do nitrogênio. Porém, nas condições tropicais úmidas, essa prática tem limitações quanto ao
fornecimento de N em virtude das altas temperaturas e excessiva umidade, que proporcionam
uma mineralização acelerada dos resíduos (SÉGUY et al., 1997).
As condições edafoclimáticas interferem diferentemente sobre o rendimento das
diferentes espécies e na escolha do adubo verde. Sendo uma das razões da diferença no
comportamento das espécies quando plantadas em locais diferentes, o diferencial na
produtividade entre duas espécies pode ser devido à maior capacidade de uma delas em
absorver e assimilar nutrientes menos disponíveis à planta, isto para uma mesma condição de
5
solo. Maior tolerância às doenças e pragas, estresse e sensibilidade ao fotoperíodo são
também características que interferem no rendimento das espécies (RIBASKI et al., 2000).
Diferentes critérios podem ser utilizados na seleção de leguminosas para adubação
verde, como tolerância à seca e a geada; rápido crescimento inicial e eficiente cobertura do
solo; capacidade de produzir elevadas quantidades de massa verde e massa seca; elevados
teores de N na fitomassa; capacidade de reciclagem de nutrientes como P, K, Ca e Mg; baixa
suscetbilidade e não serem hospedeiras de pragas e doenças; além de apresentarem sistema
radicular bem desenvolvido (ESPÍNDOLA et al.,1997).
A utilização de Crotalaria spectabilis mostrou-se adaptada a condições de baixa
fertilidade do solo, enquanto que várias outras leguminosas utilizadas como adubos verdes
apresentam alguma tolerância à acidez do solo. Dentre as espécies mais tolerantes à acidez,
Abboud (1986) destaca o feijão bravo do Ceará (Canavalia brasiliensis), o feijão de porco
(Canavalia ensiformis) e mucuna preta (Mucuna aterrima). Em trabalhos anteriores
Mascarenhas et al (1967) observaram na utilização da Crotalária juncea como adubo verde
um incremento de produtividade de grãos de feijão acima de 34%. Esses relatos enfatizam a
importância da utilização dessa prática no manejo agrícola.
Mulongoy e Akobundu (1990) conduziram experimentos com um número de
leguminosas que abrangem as culturas incluindo Calopogonium mucunoides, Centrosema
pubescens, Mucuna pruriens var. utilis, Psophocarpus palustres e Pueraria phaseoloides pelo
potencial dessas culturas em sistema de cobertura. Rendimentos anuais de matéria seca dessas
leguminosas variaram entre 1,5 e 7,5 ton.ha
-1
, com rendimentos de N de 30 a 300 Kg.ha
-1
por
ano. Observando que o verdadeiro impacto na conservação do solo e sustentabilidade foi
demonstrado pela resposta no milho para efeitos residuais dos sistemas de cobertura com P.
Palustris e C. pubescens.
Oliveira et al (2007) verificaram que o uso de guandu como adubo verde, em faixas
intercalares, mostrou-se eficiente no controle de plantas daninhas, contribuindo para a
melhoria da fertilidade do solo com a poda da faixa de guandu, aportando cerca de 6,58 t.ha
-1
de biomassa seca e 159 kg.ha
-1
de N e a ciclagem de macronutrientes como P, K Ca e Mg
ocorreu nas proporções de 20, 136, 64 e 16 kg ha
-1
respectivamente.
Por outro lado, a utilização de crotalária no cultivo de milho em sistema de plantio
direto, proporcionou maior produtividade de grãos e acúmulo de N em relação ao milheto e
lablab, em pré-safra (Andrioli et al., 2008).
6
Espíndola (2006) em estudos com plantas de cobertura observaram diferentes padrões
de composição dos resíduos vegetais e liberação de nutrientes, podendo influenciar
negativamente na disponibilidade destes para a cultura principal. Neste mesmo estudo, as
leguminosas, amendoim forrageiro (Arachis pintoi), cudzu tropical (Pueraria phaseoloides) e
siratro (Macroptilum artropurpureum) apresentaram rápida liberação de N, quando
comparadas ao capim-colonião (Panicum maximum), já que este causou imobilização do N.
Em um outro estudo, Chagas et al ( 2007) observaram que liberação de K foi mais
rápida em comparação com a liberação de N pelos resíduos de feijão, sendo este similar à
dinâmica de decomposição.
Algumas leguminosasusadas como adubo verde apresentam alguns benefícios, como a
potencial na supressão a Meloidogyne spp.; essas plantas inibem a presença do nematóide
não deixando-o completar seu ciclo. . Dentre elas estão a mucuna anã (Mucuna deeringiana
Bort), mucuna preta (Mucuna aterrima) e C. spectabilis (VALLE et al., 1996; DIAS &
FERRAZ, 1996)
Além disso, o uso de adubos verdes, principalmente as leguminosas, promovem de
maneira natural o aporte de nitrogênio ao solo, em razão da associação simbiótica entre essas
plantas e as bactérias diazotróficas, diminuindo ou mesmo eliminando a necessidade de
fertilizantes nitrogenados (GUERRA et al, 2007, SILVA et al, 2007).).
2.3. Fixação Biológica de Nitrogênio
Na agricultura sustentável, a fixação biológica de N
2
é uma importante via de entrada
de nitrogênio em solos agrícolas, além da aplicação de adubos orgânicos e minerais
(SHARMA et al., 2005; ROSENBLUETH & MARTÍNEZ-ROMERO, 2006). Neste contexto,
o cultivo de leguminosas é de grande importância devido à simbiose com bactérias
diazotróficas (Babic et al, 2008).
A fixação biológica de Nitrogênio (FBN) definida como a redução de N
2
à NH
3
, pela
ação da nitrogenase (Equação 1)
,
é um dos processos mais conhecidos e importantes que
ocorrem nos solos relacionados à conservação da vida e são realizados apenas por
microrganismos procariotos (MOREIRA, 2008). Esses microrganismos são capazes de
promover a fixação biológica do N
2
atmosférico, associando-se à diversas leguminosas num
processo simbiótico. O nitrogênio fixado pelas bactérias é transferido para as leguminosas na
7
forma de aminoácidos, enquanto carboidratos produzidos por essas plantas são fornecidos às
bactérias e servem como fontes de energia (FREIRE, 1992).
Equação 1: Estequiometria da reação de redução de N
2
a NH
3.
N
2
+ 8 H + 8e
-
+ 16 ATP = 2 NH
3
+ H
2
+ 16 ADP + 16 Pi
A nitrogenase é a enzima responsável pela redução do N
2
que pode ser inibida por
alguns fatores como: disponibilidade energética da célula, idade fisiológica, presença de
alguns aminoácidos essenciais, concentração de O
2
; disponibilidade de O
2
e N em excesso,
principalmente o amônio (REIS et al., 2006; GUPTA & LIPSET, 1981).
Os estudos de FBN iniciaram no século XIX, quando Beijerinck observou que
algumas bactérias formavam nódulos nas raízes de ervilha (Pisum sativum), onde
supostamente ocorria a redução do N
2
que era utilizado pela planta. Essas bactérias fixadoras
de nitrogênio, na época, foram chamadas de Bacillus radicicola, posteriormente agrupadas no
gênero Rhizobium até o início da década de 80. Nos dias atuais, este grupo de bactérias,
chamadas de rizóbios pertencentes a alpha-proteobacteria, são as mais conhecidas e
estudadas, estando distribuídas em 46 espécies (Tabela 1) e seis gêneros: Bradyrhizobium,
Rhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium e Sinorhizobium (GARRITY &
HOLT, 2001), baseada em informações fenotípicas, genotípicas e filogenéticas (GRAHAM et
al. 1991).
Tabela 1. Gêneros e espécies de rizóbios e seus hospedeiros (Adaptado de ZILLI, 2001;
MOREIRA 2008) (Continua).
Gêneros
Espécies
Hospedeiros
Autores
Allorhizobium A. undicola
Neptunia natans
Lotus arabicus
de Lajudie et al., 1998a
Azorhizobium A. caulinodans Sesbania rostrata Dreyfus et al., 1988
Bradyrhizobium
B. elkanii Glycine spp., Vigna unguiculata Kuykendall et al., 1992
B. japonicum
Glycine spp., V. unguiculata,
Macroptilium atropurpureum
Jordan, 1982 e 1984
B. liaoningense Glycine spp. Xu et al., 1995
B. yuanmimgense Lespedeza spp. Yao et al, 2002
B. canariense
Lupinus spp, Adenocarpus spp.
Lupinus spp
Vinuesa et al, 2005
B. spp Aeschynomene indica
Van Berkun and earddly,
2002,van Berkun at al, 2006
B. Blastobacter
B. denitrificans
8
Mesorhizobium
M. amorphae Amorpha fructicosa Wang et al., 1999
M. ciceri Cicer arietinum Nour et al., 1994
M. huakuii Astragalus sinicus Chen et al., 1991 e 1997
M. loti Lotus spp. Jarvis et al., 1982 e 1997
M. mediteraneum C. arietinum Nour et al., 1995
M. plurifariun Acacia spp., Leucaena spp. De Lajudie et al., 1998b
M. chacoense Prosopis alba Velásquez et al, 2001
M. temperatum Astragalus adsurgens Gao et al, 2004
M. spetentrionale Astragalus adsurgens Gao et al, 2004
M. plurifalium Prosopis juliflora, Neptunia oleraceae
De Lajudie et al, 1998
M. tiashanense
Glycyrrhiza spp.,
Halimodendron. holodendron,
Sophora spp.
G. max
Chen et al., 1995
Rhizobium
R. etli Phaseulos vulgaris Segovia et al., 1993
R. gallicum P. vulgaris Amarger et al., 1997
R. galegae Galega spp. Lindström et al., 1989
R. giardinii P. vulgaris Amarger et al., 1997
R.etli biovar mimosae
P. vulgaris Wang et al, 1999
R. yanglingense P. vulgaris Tan et al, 2001
R. sullae Hedysarum coronarium Squartini et al, 2002
R. indigoferae Indigofera spp. Wei et al, 2002
R. loessense Astragalus spp Wei et al, 2003
R. daejeonense Medicago sativa Quan et al, 2005
R. hainanense
Stylosantes sp, Cetrosema sp.,
Tephrosia sp., Desmodium sinuantum,
V. unguiculata,
Arachis hipogea, Desmodium
triquetrum.
Chen et al., 1997
R. huautlense
Sesbania herbaceae,leucaena
leucocephala, Sesbania rostrata.
Wang et al., 1998
9
R. leguminosarum
P. vulgaris, Macroptilium
atropurpureum
Jordam et al., 1984
R. mongolense Medicago ruthenica, Vicia vilosa. van Berkun et al., 1998
R. tropici
P. vulgaris, Leucaena sculenta, L.
leucocephala
Martinez-Romero et al.,
1991
Sinorhizobium
S. arboris Acacia senegal, Prosopis chislensis Nick et al., 1999
S. fredii
P.vulgaris, Glycine spp.
V. unguiculata, Cajanus cajan
Scholla, 1984 e de Lajudie
et al., 1994
S. kostiense Acacia senegal, Prosopis chislensis Nick et al., 1999
S. meliloti Medicago sativa
Jarvis et al., 1992 e de
Lajudie et al., 1994
S. medicae Medicago spp. Rome et al., 1996
S. saheli
Sesbania spp., Acacia spp.,
L. leucocefala, N. oleracea
de Lajudie et al., 1994
S. teranga
Sesbania spp., Acacia spp.,
L. leucocefala, N. oleracea
de Lajudie et al., 1994
S. xinjiangensis Glycine max Chen et al., 1988
S. morelense Leucaena leucocephala Wang et al, 2002
S. Kummerowiae Kummerowia stipulacea Wei et al, 2002
S. americanum Acácia spp., P. vulgaris Toledo et al, 2003
2.4. Interação entre rizóbio e adubo verde
Os agrossistemas podem ser definidos como sistemas que produzem alimentos e
fibras, um processo que é governado por muitos fatores e componentes, como: o tipo de solo,
sistemas de cultivo e sistemas de manejos. Todas essas interferências no solo podem provocar
alterações na composição da sua biota e em especial os microrganismos que são mediadores
dos principais processos de ciclagem dos nutrientes. A importância dos microrganismos
nestes sistemas depende dos grupos funcionais, na qual são participantes ativos em vários
processos para a nutrição das plantas, como as bactérias diazotróficas, que são responsáveis
pela fixação biológica do nitrogênio atmosférico (LANZE et al, 2007).
Devido à capacidade das leguminosas de fixarem nitrogênio atmosférico em
associação com bactérias diazotróficas, essas plantas podem substituir ou reduzir os adubos
10
minerais no fornecimento de N para várias culturas de interesse comercial (SMYTH et al.,
1991). Por outro lado, a contribuição de N pelas leguminosas para culturas em consórcio
depende das espécies de leguminosas, da FBN e do crescimento das leguminosas, que é
determinado pelo clima, pelo solo e manejo dos resíduos (RAO E MATHUVA, 2000).
Lacerda e Silva (2006) realizaram análises em solo degradado e conservado com e
sem inoculação com rizóbio, com a finalidade de observar os benefícios da rotação de cultura
com o feijão-de-porco e da adubação verde nas características do solo. No solo conservado, o
notável aumento de 53,7% no teor de matéria orgânica influenciou significativamente a
densidade global, a qual diminuiu em 9,7% conduzindo, em consequência, a um aumento de
12,2% para a porosidade, em relação aos valores encontrados para o solo degradado. Os
autores concluíram que os efeitos prejudiciais da erosão e benéficas da conservação do solo
foram evidenciados em todas as propriedades físicas e químicas, particularmente no teor de
matéria orgânica. As melhores condições físicas e químicas encontradas no solo conservado
potencializaram os efeitos positivos da inoculação com rizóbios, associada à rotação de feijão-
de-porco com o algodão.
Em sistemas agrícolas a cobertura vegetal com leguminosas, a umidade, a temperatura,
o pH, e os teores de fósforo no solo são fatores que mais influenciam a sobrevivência de
rizóbios no solo (HIRSCH, 1996). No entanto, fatores não menos importantes, mas de menor
ocorrência, como por exemplo, alta salinidade, carência de micronutrientes e contaminações
com metais pesados e resíduos orgânicos também afetam significativamente a população de
rizóbio presente no solo (ZILLI, 2001).
A temperatura do solo é uma variável ambiental que também geralmente afeta a
atividade biológica dos rizóbios e seus hospedeiros. Segundo Toro, (1996) a faixa de
temperatura do ambiente considerada ótima para a maioria das leguminosas nodularem
abundantemente varia entre 20
0
a 30
0
C. Para as leguminosas temperadas, a alta temperatura,
além de afetar a FBN, afeta a própria planta, enquanto que em leguminosas tropicais o que é
principalmente afetado é a eficiência da FBN. Baixas temperaturas reduzem a formação de
nódulos e a fixação de nitrogênio em leguminosas de clima tropical (PADMANABHAN,
1990).
Muitos autores têm comprovado o aporte de N, proveniente da FBN, por bactérias
diazotróficas, quando se cultivam leguminosas de interesse econômico e como adubos verdes
para culturas principais (MARTINAZZO, 1989; DE-POLLI et al., 1996; BODDEY et al.,
11
1997; SHARMA et al., 2000, MARTINS et al., 2003), demonstrando o potencial de uso
destas associações simbióticas.
Normalmente, as leguminosas contêm altos teores de N em seus tecidos no período de
floração, o que significa uma contribuição acima de 150 kg/ha/ano de N, com um percentual
de 60% a 80% do N proveniente da fixação biológica de nitrogênio (GILLER, 2001).
Considerando-se o sistema solo-planta, a presença das leguminosas representa uma valorosa
contribuição para o aporte de N derivado da FBN, que seria suficiente para balancear as
exportações de N pela cultura principal. Em um estudo avaliando a produtividade de frutos de
berinjela foi observado uma exportação de 40,0 a 70,8 kg ha
-1
de N e a utilização de
leguminosas, contribuiu com uma adição de N via FBN que variou de 23 a 104 kg ha
1
(CASTRO et al., 2005).
Gomez e Zandstra (1977) também observaram um acúmulo de N fixado (Kg/ha/ano
1
)
em diferentes espécies de leguminosas: Centrosema (112), Soja perene (160-450), Guandu
(41-280), Leucaena leucocephala (310-800), Feijão-de-porco (49-190), Calopogônio (370-
450), demonstrando o potencial dessas plantas em fixar N.
Tabela 2. Produção de Massa seca (MS) e N fixado em diferentes espécies de mucuna.
Espécies
Produção de MS em t.ha
-1
.ano N fixado em t.ha
-1
.ano
Calegari,
1998
Garcia
2002
Gomez e
Zandstra, 1977
Calegari,
1998
Mucuna
preta 4-7,5 9,96 157 157
Mucuna
cinza 5 a 9 11,6 ----- -----
Mucuna
anã 3,5 a 6,5 3,48 ----- 76 a 282
Por outro lado, de modo geral o excesso de N no solo reduz a nodulação de plantas e o
processo de FBN (STANFORD et al., 1995). A planta apresenta uma economia de energia
quando obtém N do solo em comparação a obtenção via FBN e desta forma,
preferencialmente, a planta utiliza N disponível no solo em detrimento da formação do
processo de FBN. Contudo, a existência de estirpes de rizóbio capazes de fixar N, mesmo em
condições de alto teor de N no solo, revela novas oportunidades científicas (FERNANDEZ et
al., 1986), como a relação de especificidade e a capacidade competitiva do rizóbio no solo.
12
A partir de um estudo nos anos de 2004 e 2005 na área do SIPA (Sistema Integrado de
Produção Agroecológica – Fazendinha km 47), foram coletados nódulos de diferentes adubos-
verdes não inoculados, mas efetivos. Uma coleção de 306 isolados obtidos de nódulos de
amendoim forrageiro (Arachis pintoi), cunhã (Clitoria ternatea), feijão-de-porco (Canavalia
ensiformis), guandu (Cajanus cajan), crotalaria (Crotalaria juncea, C. ochroleuca, C.
spectabilis, C. mucronata e C. breviflora) e mucuna anã (Mucuna deeringeana) e mucuna
cinza (Mucuna pruriens) foi obtida e caracterizada culturalmente. Neste trabalho observou-se
uma alta diversidade de rizóbios e uma forte relação de especificidade dos adubos-verdes
(BRATTI et al., 2005).
2.5. Sobrevivência e Especificidade de Rizóbios
O estabelecimento da nodulação envolve diferentes mecanismos, como (1)
reconhecimento molecular entre a planta e rizóbio, (2) formação do cordão de infecção e
invasão dos rizóbios (3), formação dos nódulos, (4) conversão de bactérias em bacterióides e
(5) estabelecimento da fixação biológica de nitrogênio (FREIBERG et al. 1997). Dentre essas
etapas, o reconhecimento molecular entre rizóbios e plantas hospedeiras é um passo crítico
para determinar a faixa hospedeira de rizóbios.
A simbiose entre leguminosa e rizóbio apresenta, geralmente, um elevado grau de
especificidade baseada na troca de sinais químicos entre os parceiros. Molecúlas de lipo-
chitooligossacarídeos, conhecidas como fatores Nod, atuam como sinais morfogênicos
específicos capazes de induzir deformação no pêlo radicular, divisão células corticais da raiz e
formação dos nódulos (CARDINALE et al., 2008). Simbioses promíscuas são consideradas
amplamente distribuídas e mais antigas do que as simbioses restritivas que representam maior
especialização e são limitados a determinados nichos (PERRET et al. 2000). A
promiscuidade, compreendida como a capacidade da leguminosa associar-se com diversas
espécies e estirpes de rizóbio, é extremamente relevante no caso das leguminosas tropicais
(THIES et al., 1991A).
Algumas estirpes bacterianas apresentam elevada especificidade ao hospedeiro, tais
como Mesorhizobium huakuii, que só pode ser nodulada com a leguminosa Astragalus sinicus
(CHENG et al. 2006), enquanto que alguns rizóbios, como a estirpe NGR234, pode nodular
uma ampla gama de hospedeiros, incluindo Parasponia, não leguminosa (PUEPPKE
BROUGHTON et al, 1999).
13
As espécies hospedeiras são um dos fatores mais importantes para efeito da
distribuição da população indígena de rizóbios. A presença da leguminosa proporciona
condições ecológicas específicas para selecionar estirpes com alta capacidade de adaptação
para a planta hospedeira, para que possam adquirir alta competitividade e de estabelecer-se
com sucesso (ZHANG et al., 2007).
A importância da nodulação e a respectiva contribuição da FBN são determinadas por
uma variedade de fatores (bióticos e abióticos) que incluem principalmente a presença e a
qualidade das populações nativas de rizóbios, fatores químicos limitantes do solo, como a
disponibilidade de nitrogênio e fósforo e o uso de culturas consorciadas (MENDONÇA &
SCHIAVINATO, 2005).
No caso de Phaseolus vulgaris, existem algumas limitações à maximização da
produção de por meio de inoculação, dentre elas está a competição das estirpes oriunda do
inoculante com as estirpes nativas predominantes no nódulo do hospedeiro, sensibilidade do
hospedeiro a temperatura e acidez elevadas e ao ciclo da cultura ser relativamente curto
(MOREIRA, 2008). O ambiente rizosférico pode alterar a população de microrganismos do
solo pela presença de exudados, utilizados no metabolismo microbiano. Contudo, estas
alterações são complexas e não-específicas para o grupo dos rizóbios (MIETHLING et al.,
2000).
Starkanova et al (1999) afirmaram que algumas estirpes de rizóbio são capazes de
solubilizar fosfatos pouco solúveis do solo, e disponibilizam o fósforo tanto para si como para
a planta hospedeira, promovendo o crescimento das mesmas.
O pH ácido e alta concentração de alumínio tóxico, podem diminuir a população
desses microrganismos no solo (HUNGRIA & VARGAS, 2000), mas algumas estirpes
podem desenvolver mecanismos de tolerância a esses fatores estressantes (KAWAI et al.,
2000). A utilização dessas estirpes tolerantes pode aumentar a fixação biológica em solos
ácidos e reduzir a aplicação de nitrogênio e fósforo, de acordo comos princípios da agricultura
ecológica e economicamente sustentável (HARA & OLIVEIRA, 2005).
O pH neutro à pouco alcalino ajuda na exudação de carbono pelas raízes das plantas,
interferindo na sobrevivência e competição do rizóbio no solo, porque compostos de carbono
são substratos para os microorganismos que vivem na rizosfera (TORO, 1996).
Além da eficiência simbiótica, a capacidade de sobrevivência no solo e a habilidade
competitiva com a população rizobiana nativa ou naturalizada do solo são características
altamente desejáveis em estirpes de rizóbios recomendadas para inoculação em leguminosas
14
(BROCKWELL, 1981). Essas características têm sido freqüentemente relacionadas à maior
resistência das estirpes a antibióticos, ao Al e a temperaturas elevadas (OLIVEIRA &
GRAHAM, 1990; WOLFF et al., 1991; XAVIER et al., 1998, FERNANDES et al., 2003).
Segundo Munns & Keyser (1981), o alumínio reduz a atividade das células de rizóbio
próximas a divisão celular, aumentando o tempo de geração de células. Ocorrendo uma queda
na população de rizóbio, uma vez que a taxa de mortalidade se torna mais alta que a
multiplicação celular, representando segundo Wani et al. (1995), um fator limitante à
sobrevivência e ao estabelecimento do rizóbio no solo.
A umidade do solo interfere diretamente no metabolismo celular da bactéria e da
planta, bem como no processo de FBN, sendo a sua carência ou excesso fator determinante da
permanência e multiplicação da bactéria no solo (SANGINGA et al., 1992).
A estrutura e comportamento da população de rizóbio presente no solo são critérios
que precisam ser considerados no momento da seleção de inoculantes (THIES et al., 1991B),
pois a densidade, efetividade e habilidade competitiva são características da população de
rizóbio nativo que afetam grandemente as respostas de inoculação (CHATEL et al. 1968).
A adoção de tecnologias sustentáveis que permitam a conservação dos recursos
naturais e promovam uma melhoria na qualidade de vida da população configura-se como um
componente importante para garantir cidadania e dignidade aos agricultores. Dentro desse
contexto, a inoculação de estirpes de rizóbio em leguminosas pode suprir em parte ou
totalmente a necessidade de nitrogênio da cultura através de FBN. Além dos programas de
melhoramento da planta, torna-se necessário a otimização do processo de FBN privilegiando a
seleção das estirpes concomitante ao melhoramento vegetal, considerando os estudos de
especificidade entre o macro e microssimbionte, a eficiência agronômica e a adaptabilidade
das estirpes frente às características regionais, culminado na recomendação das estirpes para a
cultura como inoculante (RUMJANEK et al., 2006).
Stewart et al. (1991), ao comentarem sobre a definição de uma agricultura sustentável,
recomendam pesquisas sobre práticas de produção, utilizando-se a biotecnologia, destacando-
se neste contexto a adubação verde, associada à inoculação com rizóbio, como uma das
técnicas mais promissoras para recuperação de solos degradados, a baixo custo.
2.6. Inoculantes
Inoculante é todo material contendo microrganismos e que atua em prol ao
desenvolvimento das plantas. O inoculante contém bactérias específicas para cada espécie de
15
leguminosa. Portanto, o inoculante preparado para uma leguminosa não pode ser utilizado em
outras espécies. Algumas das vantagens do uso do inoculante em leguminosas são: melhoria
na qualidade do solo, diminuição considerável no uso de adubação nitrogenada, economia
para o agricultor, aumento na produtividade da lavoura, produto natural, sem prejuízo para o
meio ambiente. (PAVAN E MOREIRA FILHO, 2006; Site: EMBRAPA AGROBIOLOGIA,
2008).
Geralmente, quanto maior a população nativa de rizóbio no solo, mais difícil é a
introdução com sucesso da estirpe inoculante (THIES et al., 1991b). Tem sido freqüentemente
observado que inoculantes reconhecidos como eficientes quanto à atividade de FBN não
conseguem garantir uma boa nodulação, pois são incapazes de se estabelecer no solo e
competir com a microbiota nativa (FERREIRA et al., 1999). Desta forma, a introdução de
estirpes mais eficientes em um solo contendo população de rizóbio nativa ou naturalizada
estabelecida pode ser prejudicada, devido à baixa competitividade e falta de adaptação das
estirpes inoculantes às condições ambientais locais (NEVES & RUMJANEK, 1997).
A inoculação de leguminosas com rizóbio tem sido amplamente utilizada nos sistemas
agrícolas para melhorar produtividade da cultura no campo. No entanto, inoculantes
rizobianos disponíveis comercialmente muitas vezes não conseguem se estabelecer nos solos
com as populações nativas de rizóbios (HARTMANN et al., 1998). Nesse contexto, a seleção
das mais eficazes e competitivas estirpes é necessária (SIKORA et al., 1997). É geralmente
aceite que as populações nativas estejam mais bem adaptadas ao seu ambiente e, portanto, são
capazes de formar uma simbiose mais eficaz do que inoculantes comerciais isoladas a partir
de um tipo de solo distantes ou independentes (GANDEE et al., 1999; BRADICET al., 2003).
No entanto, algumas estirpes hoje recomendadas para adubos-verdes, foram
originalmente isolados a quase 40 anos e em outras leguminosas hospedeiras e segundo a
Instrução Normativa, nº 10 de 2006, do MAPA, existem mais de um inoculante recomendado
para mais de uma espécie de adubo verde (Tabela 3). A exemplo da estirpe BR 2801 (SEMIA
6157), isolada de Indigofera no ano de 1966 e recomendada para cunhã e guandu, as estirpes
BR 2003 (SEMIA 6156) e BR 2811 (SEMIA 6158) isoladas de Crotalaria spectabilis e
recomendada para feijão de porco, estirpe BR 2811 (SEMIA 6158), também é recomendada
para Mucuna spp., enquanto a estirpe BR 2001 (SEMIA 6145), material coletado na Libéria,
Africa, isolado de C. juncea, em 1967 e recomendada para cunhã (ROSA PITARD,
informações do banco de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia).
16
Particularmente no caso da estirpe BR2001 (SEMIA 6145), esta estirpe desde 2004 era
recomendada também para a cultura do feijão-caupi, mas devido à ineficiência no campo e a
incapacidade de competir com a população nativa, esta estirpe deixou de ser recomendada
para esta cultura na última atualização das estirpes autorizadas (MAPA, IN nº 10, de 21 de
março de 2006). Em recentes estudos com feijão-caupi, 3 novas estirpes (SEMIA 6461, 6462
e 6463) passaram a ser recomendadas para esta cultura (MARTINS, et al., 2003 e
LACERDA, et al., 2004).
Já no caso de mucuna-preta utilizando as estirpes BR7701 (6 H3, Embrapa/CNPAB) e
BR 7702 (TAL 574, Niftal-Hawaí) e feijão de porco utilizando as estirpes BR 2003 (IJ,
Embrapa/CPAC) e BR 3102 (SMS300, IAC) RODRIGUES et al., (1994) não observaram
efeito da inoculação destas estirpes em relação a nodulação espontânea do solo.
Estes dados vêm mostrar que nos últimos anos, além da concepção de seleção de
rizóbios, que passa pelo processo de coleta e isolamento das bactérias, estudos voltados para
caracterizar a diversidade e ecologia de rizóbios (XAVIER et al., 1998, FERNANDES et al.,
2003), fazem parte da estratégica para a seleção de materiais mais promissores e adaptáveis às
condições edafo-climáticas das culturas.
Tabela 3. Inoculantes recomendados para adubos verdes no Brasil.
Adubo verde
Sp. do
microrganismo
Número na coleção
oficial (SEMIA
Nome vulgar
Espécie
Calopogônio Calopogonio sp. Bradyrhizobium sp. 6152
Feijão de Porco Canavalia ensiformis Bradyrhizobium sp. 6156, 6158
Crotalária Crotalaria juncea Bradyrhizobium sp. 6145, 6156
Crotalária Crotalaria spectabilis Bradyrhizobium sp. 6156, 6158
Feijão Guarda,
Cyamopolis
tetragonoloba
Bradyrhizobium sp. 6145, 6319
Tremoço Lupinus sp. Bradyrhizobium sp. 928, 938
Kudzu Pueraria phaseloides Bradyrhizobium sp. 6175
Feijão mucuna
Stizolobium
atterrimum
Bradyrhizobium sp. 6158
Portanto, para se explorar de forma mais otimizada a FBN, é necessário que se
conheça a ecologia dessas bactérias antes do desenvolvimento do inoculante (RUMJANEK et
al., 2005). A análise qualitativa mostra que as características fenotípicas dos microrganismos
são influenciadas por condições edafo-climáticas específicas, bem como a presença de plantas
17
leguminosas parece ser um forte determinante da diversidade da população de rizóbio
(SINGLETON TAVARES, 1986; HIRSCH et al., 1993).
2.7. Caracterização e Seleção de Rizóbios
A interação entre leguminosas e rizóbios é um exemplo de associação biológica
intensamente estudada, cujos benefícios para a sustentabilidade agrícola são reconhecidos
devido ao processo de FBN, refletido no aumento da produtividade vegetal, na recuperação de
áreas degradadas, no incremento da fertilidade e da matéria orgânica do solo. Entretanto, sua
principal aplicabilidade, em curto prazo, indiscutivelmente está associada à economia no uso
de fertilizantes nitrogenados industrializados, através inoculação de estirpes selecionadas de
rizóbio (BRATTI et al, 2005).
A seleção de uma estirpe de rizóbio para ser utilizada como inoculante deve priorizar
tanto os aspectos relacionados à FBN propriamente dita, quanto àqueles relacionados à
sobrevivência e ao estabelecimento no solo, assim como características que garantam a
capacidade competitiva frente às estirpes nativas. A grande atenção que tem sido dada a esses
fatores é decorrente da expectativa de se aumentar à produtividade através do estabelecimento
de estirpes mais eficientes (MARTINS, 2003).
A seleção de uma estirpe de rizóbio a ser utilizada como inoculante para uma
determinada leguminosa é um processo demorado que passa por uma série de etapas.
Inicialmente, é preciso avaliar uma coleção de estirpes quanto à eficiência para as condições
requeridas de uso. As estirpes consideradas eficientes devem, em seguida, ser testadas quanto
a sua capacidade de competir com a microbiota nativa o que irá determinar a capacidade de
colonização da raiz e a formação dos nódulos (NEVES & RUMJANEK, 1998).
Em solos com níveis de pH próximos à neutralidade favorecem a presença de
microrganismos produtores de antibióticos, supondo que rizóbios que vivem nessas condições
sejam mais tolerantes. Inversamente, o solo ácido pode abrigar populações mais sensíveis
(LOMBARDI, 1995).
A caracterização das populações que apresentam como atributo a resistência intrínseca
a antibióticos tem sido usada como técnica na ecologia da comunidade bacteriana nos solos
(PEREIRA et al 1994; XAVIER et al., 1998).
Por muito tempo a taxonomia de microrganismos recebeu pouca importância, devido
às dificuldades de classificação utilizadas pelos métodos tradicionais, com base
essencialmente em características fenotípicas e fisiológicas. O estudo taxonômico além da
18
enorme contribuição na avaliação da biodiversidade no ambiente, fornece também
informações em relação à expressão de características fisiológicas que podem ser
correlacionadas com fatores ambientais (BULL et al. 1992).
Segundo Souza et al (2008) os parâmetros de massa de nódulos e massa da parte aérea
foram eficientes na avaliação da fixação biológica de nitrogênio em soja, quando seus
coeficientes de variação atingem no máximo de 33 e 18%, respectivamente, que contribuiu
com 72 a 88% do nitrogênio total da parte aérea.
O conhecimento do padrão de distribuição desses grupos morfológicos pode ser o
ponto de partida para a seleção devido à capacidade das leguminosas fixarem nitrogênio
atmosférico em associação com rizóbios específicos para cada adubo verde, visando à
utilização como inoculante para essas culturas (BRATTI et al., 2005).
Martins et al. (1996) analisaram a variabilidade existente na população de rizóbios,
inicialmente também a partir da caracterização morfológica dos isolados em meio de cultura
seguida de eficiência em casa de vegetação, a partir dos grupos mais discriminantes. A partir
desse trabalho, associado à seleção de outras características intrínsecas do rizóbio, como
tolerância a antibiótico (XAVIER et al., 1998), foi possível selecionar uma estirpe capaz de
alcançar patamares de até 30% de produtividade do feijão-caupi em relação ao controle não
inoculado (MARTINS et al., 2003).
Estudos da população de rizóbio do solo possuem papel fundamental, pois o
entendimento da composição, das características simbióticas e adaptativas, bem como da
taxonomia da população de rizóbio do solo, podem possibilitar a seleção e introdução de
novos inoculantes de rizóbio com maior eficiência simbiótica e capacidade competitiva
(ZILLI, 2001)
Alguns autores estudaram a nodulação de várias leguminosas em ambientes tropicais e
observaram grande variação na efetividade na faixa hospedeira, sendo necessário um manejo
adequado para que se possa selecionar estirpes específicas para uso agronômico, onde alta
produtividade e percentagem de nitrogênio fixado são essenciais (THIES et al., 1991).
Comumente se tem dividido os rizóbios em grupos, em razão da velocidade de
crescimento, como sugerido primeiramente por Lohnis & Hansen (1921), sendo crescimento
rápido (Rhizobium, Azorhizobium e Sinorhizobium), crescimento intermediário
(Mesorhizobium e Allorhizobium) e crescimento lento (Bradyrhizobium)
19
O feijão-caupi nodula eficientemente espécies como o Rhizobium etli, Bradyrhizobium
japonicum e B. elkanii (NEVES & RUMJANEK, 1997), e tem sido observada com freqüência
alta diversidade entre as estirpes que nodulam essa espécie (MARTINS et al., 1996).
A caracterização dessas bactérias a partir da toletância a temperatura também tem sido
utilizada. Fernandes et al (2003), observaram que o crescimento de cinco estirpes não foi
alterado a 35ºC, comparando com a temperatura de 28ºC, somente uma estirpe cresceu a 45ºC
e o diâmetro das colônias nesta temperatura foi equivalente à metade do observado quando a
bactéria foi incubada a 28ºC. Temperaturas elevadas têm, representado um dos principais
fatores limitantes à FBN em regiões tropicais, já que afetam praticamente todas as etapas de
crescimento do rizóbio e das plantas hospedeiras, sendo os efeitos ainda mais críticos na
relação simbiótica (HUNGRIA & VARGAS, 2000), Concluindo que os limites de
temperatura para FBN com leguminosas tropicais se situam entre 27°C e 40°C.
Mudanças na forma de caracterizar fenotipicamente as bactérias diazotróficas
provavelmente ocorrerão no grupo dos rizóbios que nodulam as leguminosas tropicais, tanto
pela aplicação de técnicas moleculares como pela combinação de características morfológicas
e genotípicas que conferem maiores informações no estudo de diversidade (SILVA, 1999).
À medida que aumenta o uso de técnicas de biologia molecular e imunologia, mais
informações sobre os diferentes grupos de rizóbio são constatados, focalizando rizóbios
associados a leguminosas tropicais (ZILLI, 2001). Uma diferença de 2% entre a seqüência de
bases nucleotídicas do DNA de Bradyrhizobium japonicum e os isolados de rizóbio com
crescimento lento, obtidos de nódulos de caupi na região amazônica, sugerem que este grupo
represente uma nova espécie dentro deste gênero, baseado nos resultados de ARDRA
(SILVA, 1999).
Em levantamento da diversidade genética de rizóbio nodulante de feijão em solos de
Cerrado, Mercante (1997) utilizou como planta isca o feijão e a leucena. Os resultados
mostraram a existência de ampla diversidade de rizóbios, que foi confirmada com uso de
sondas para genes específicos, as quais detectaram a presença de 3 diferentes espécies de
rizóbio: Rhizobium etli, R. leguminosarum bv. phaseoli e R. tropici e também mostraram que
10% dos isolados de leucena e 49% de feijão não se agruparam com nenhuma espécie de
rizóbio descrita.
A variabilidade genética existente no gênero Crotalaria sp., bem como na Mucuna
sp., entre outros, não tem sido adequadamente explorada, uma vez que existem centenas de
espécies nestes gêneros (POLLHILL & RAVEN, 1981). Uma conseqüência da utilização
20
contínua de espécies como C. Juncea e mucuna preta e feijão-de-porco consiste no aumento
da vulnerabilidade genética destas espécies, o que acarretaria maior suscetibilidade ao ataque
de pragas e doenças, limitando sobremaneira o emprego destas nos sistemas de produção
orgânica. Por outro lado, o cultivo sucessivo permite selecionar microrganismos associativos
benéficos mais adaptáveis às condições de cultivo, como os rizóbios, apesar de que há ainda
lacunas no conhecimento científico sobre a FBN em várias espécies de leguminosas para
adubação verde (RESENDE et al., 2003; PERIN et al., 2004; PEREIRA, 2004).
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Área Experimental
A área de coleta de amostras de solo foi realizada no Sistema de Manejo Integrado de
Produção Agroecológica (SIPA), também conhecido como Fazendinha, localizado no
município de Seropédica, RJ. Esta área é um campo experimental mantido pela Embrapa
Agrobiologia, UFRRJ e PESAGRO-EES, com aproximadamente 70 ha, dos quais 30 ha são
formados de horto e área de preservação permanente, 20 ha destinados à formação de
pastagens para criação de bovinos e outros 20 ha destinados à produção de hortaliças, cereais,
frutíferas, cana-de-açúcar e cafeicultura.
O SIPA situa-se à 33 m de altitude, 22º 46` de latitude sul e 43º 41` de longitude
oeste. O clima é do tipo AW. A estação chuvosa inicia-se em setembro, estendendo-se até
março. Nesse período a temperatura do ar alcança valores de até 40º C à sombra com relativa
freqüência. A partir de maio a taxa de precipitação pluviométrica diminui de forma acentuada,
alcançando valores mínimos nos meses de julho e agosto. Os solos predominantes na área são
classificados como Argissolo Vermelho-Amarelo e Planossolos e apresentam baixa fertilidade
natural.
Esse sistema foi criado para constituir um espaço motivador do exercício da
agroecologia em bases científicas e programado para o aproveitamento das potencialidades
locais, com base na integração lavoura-pecuária, envolvendo plena diversificação de cultivos
e algumas criações, dentro de uma estratégia que busca sustentabilidade e estabilização da
atividade produtiva. Implantado desde 1993, acumula cerca de 15 anos de experiência em
sistemas orgânicos de produção, em que o uso de leguminosas como adubo verde é constante.
3.2. Plantios de adubos verdes para coleta de nódulos
As sementes das três mucunas (cinza, preta e anã) foram obtidas da produção da
Fazendinha Agroecológica e o plantio foi conduzido nas dependências da Embrapa
Agrobiologia – Seropédica – RJ, utilizando vasos com capacidade de 5 Kg contendo oito
amostras de solos do SIPA (Tabela 4 e Figura 1), sem a prática de inoculação. As amostras de
22
solo foram caracterizadas quanto à fertilidade do solo de acordo com EMBRAPA (1997)
(Tabela 4), a partir de 8 amostra composta de 32 sub-amostras de cada solo.
Os vasos foram enterrados e mantidos ao ar livre nos meses de dezembrode 2007 a
fevereiro de 2008, mantendo superfície alinhada ao solo. Foram semeadas duas plantas por
vaso e, durante o ciclo foram realizados tratos culturais com a retirada manual de invasoras e
irrigação das plantas foi feito com regadores. O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado com 2 repetições de cada espécie de adubo verde para cada solo, totalizando 48
vasos (3 espécies x 8 solos x 2 repetições).
Aos 60 dias após o plantio iniciou-se a coleta das plantas. A parte aérea foi destacada
das plantas, seca em estufa (a 65ºC por 72h) e pesada para a obtenção da matéria seca (MS) e
as raízes foram coletadas em meados de fevereiro de 2008 nas dependências da Embrapa
Agrobiologia.
Tabela 4. Classes de solo do SIPA, sua localização e seu respectivo uso.
Solo Classe de solo Localização Utilização da área
1 Planossolo Perto do PSA (Projeto
de Sanidade Animal)
Cultura mais recente:
Guandu (roçado)
2 Planossolo Gleba II Plantação de crotalária
e rami
3 Planossolo Gleba XXIV Cultura anterior:
Crotalária
4 Argissolo amarelo Gleba XIV Rotação guandu-
crotalária. Atualmente
guandu.
5 Argissolo vermelho
amarelo
Gleba XX Área atualmente
desnuda. Culturas
anteriores foram
mucuna e milho.
6 Argissolo vermelho
amarelo
Gleba X Plantio de milho,
cultura anterior
mucuna.
7 Argissolo amarelo Gleba IX Cultura atual Berinjela
em (plantio direto),
anteriormente mucuna.
8 Argissolo amarelo Gleba VII Área preparada para
plantio (arada). Cultura
anterior: crotalária.
23
Legenda:
1. Perto PSA (Planossolo)
2. Gleba II (Planossolo)
3. Gleba XXIV (Planossolo)
4. Gleba XIV (Argissolo amarelo)
5. Gleba XX (Argissolo vermelho amarelo)
6. Gleba X (Argissolo vermelho amarelo)
7. Gleba IX (Argissolo amarelo)
8. Gleba VII (Argissolo amarelo).
Figura 1. Imagem aérea da área do SIPA e em detalhe os locais de implantação dos experimentos. Foto cedida por Ricardo Eiras Moreria da
Rocha. (Escala 1:2.000).
4
8
7
6
2
5
3
1
54
Tabela 5. Características químicas dos oito solos utilizados neste estudo.
Análise de Solo
Solos
do
SIPA
pH em água
Al Ca+Mg Ca Mg P K C MO N
--------cmolc/dm
3
-------- ---mg/dm
3
--- --------%---------
1 5,4 0,1 2,3 1,7 0,6 19,6 36 0,74 1,28 0,082
2 5,2 0,1 2,4 1,6 0,8 7,0 18 0,36 0,61 0,049
3 6,6 0,1 6,4 4,4 2,1 234,3
104
0,89 1,54 0,128
4 6,0 0,1 4,6 2,4 2,2 20,1 81 0,95 1,64 0,122
5 6,4 0,0 4,4 2,8 1,6 65,4 108
0,71 1,23 0,120
6 5,2 0,2 1,0 0,5 0,5 13,4 22 0,24 0,41 0,033
7 5,7 0,1 2,2 1,5 0,6 21,3 48 0,36 0,61 0,056
8 5,8 0,1 2,0 1,1 0,9 65,7 59 0,3 0,51 0,055
3.3. Coletas de nódulos
As raízes foram lavadas em água corrente com auxílio de uma peneira e os nódulos
retirados, secos em papel toalha, contados, e estocados em recipientes contendo sílica-gel para
a desidratação dos nódulos, sem perda da viabilidade das bactérias e para posterior
isolamento.
3.3. Isolamento e caracterização de bactérias
Inicialmente, os cinco (05) nódulos retirados de cada vaso de mucuna anã, cinza e
preta foram rehidratados em água destilada e estéril, por cerca de 40 minutos, em seguida foi
realizada uma lavagem com etanol (p.a.) durante 30 segundos, para reduzir a tensão
superficial, seguida de uma desinfestação superficial com Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
30%
pa) durante 3 minutos, em seguida 10 lavagens com água destilada esterilizada.
Os 80 nódulos de cada espécie de mucuna foram desinfestados assepticamente e
pressionados com uma pinça sobre o meio YMA (FRED & WAKSMAN, 1928, VICENT,
1970), contendo vermelho congo (0,25%) em placa de Petri, com o objetivo de separar
rizóbios de suposta contaminação. O meio YMA é composto de: manitol (crescimento lento)-
10g e para bactérias de crescimento rápido com Rhizobium adicionar açúcar; K2HPO4-
sol.10%:1ml; KH2PO4-sol. 10%: 4 ml; MgSO4.&H2O-sol.10%:2ml; NaCl-sol.10%: 1ml;
Extrato de levedura: 0,4g; vermelho congo (0,25%), ajuste do pH: 6,8 a 7,0; adicionar Agar:
15g/L. As placas foram incubadas a 28ºC até o aparecimento de colônias isoladas, as mesmas
foram repicadas para novas placas, contendo o meio YMA (FRED & WAKSMAN, 1928,
25
VICENT, 1970) Azul de Bromotimol: 0,5% em 0,2N de KOH: 5ml, em placa de Petri, com
incubação de 28ºC, para obter sua purificação, isolamento e posterior caracterização e
armazenamento dos isolados.
A caracterização morfológica dos isolados foi realizada de um a seis dias após o
aparecimento das colônias isoladas. Os parâmetros avaliados foram: tempo de crescimento de
cada isolado, considerando: crescimento rápido (até três dias) ou lento (quatro ou mais dias);
pH do meio após o crescimento das bactérias, observado pela coloração do meio da cultura,
contendo azul de bromotimol (ácido, alcalino ou neutro); tamanho (mm); forma da
colônia(circular ou irregular); elevação (plana ou com elevação); borda (inteira ou irregular);
transparência (opaca, translúcida ou transparente); aparência (homogênea ou heterogênea) e
cor (branca ou amarela).
Em relação ao muco produzido, foram avaliados os aspectos quanto a: aderência à alça
de platina, observada pela remoção do muco da superfície do meio de cultura (limpando ou
não); e elasticidade, observada pela formação ou não de fio, no momento da remoção do
muco do meio de cultura (1= sem elasticidade, 2= pouca elasticidade, 3= muita elasticidade),
limpa placa (sim ou não).
Uma matriz de dados originais foi construída, com 80 isolados de rizóbios
caracterizados de cada espécie de mucuna e cinco estirpes padrão. Os isolados foram
comparados por seu grau de similaridade estimado pelo coeficiente de Jacard (Sj), agrupados
pelo método UPGMA e representados graficamente por um dendrograma obtido pelo
programa NTSYS-pc, versão 2.1.
As cinco estirpes padrão foram usadas na comparação com as bactérias isoladas, são
elas BR5410 (A. cauli), BR 29 (B. elkani), BR 322 (R. tropici), BR 112 (S. fredii), BR 526 (S.
saheli).
Os isolados foram armazenados em superfeezer a -70°C para garantir a manutenção
das amostras para estudos futuros.
3.4. Teste de nodulação
Esse teste foi utilizado como uma primeira estratégia para verificar a capacidade da
coleção de 240 isolados em nodular os hospedeiros de origem, em condição de casa de
vegetação utilizando substrato estéril. Para tal, foram instalados 3 experimentos de acordo
com a espécie de hospedeiro, a capacidade disponível em casa de vegetação e o tempo de
crescimento dos isolados e os solos coletados.
26
3.4.1. Mucuna anã
O experimento foi instalada em junho de 2008, e, conduzido em casa de vegetação na
Embrapa Agrobiologia. O delineamento foi em blocos ao acaso, contendo 80 isolados, uma
estirpe recomendada comercialmente para essa espécie (BR2811) e um controle negativo com
duas repetições cada. A estirpe BR 2811 foi obtida da coleção de culturas sob
responsabilidade da curadora Rosa Pittard, da Embrapa Agrobiologia.
Foram utilizados vasos de Leonard modificado (VINCENT, 1970), tendo como
substrato areia e vermiculita (2:1) estéril. Por ocasião do plantio, as sementes foram imersas
em álcool etílico 95% por 30 segundos para facilitar o contato do tegumento com a solução
desinfetante, em seguida estas foram desinfetadas com Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
30%
p.a.) por 3 minutos e lavadas 10 vezes seguidas em água estéril. Foram plantadas três
sementes em cada vaso e quando germinadas foram desbastadas diexando uma planta por
vaso.
Os isolados foram crescidos em meio 79 líquido, a 28º C com agitação, de um a seis
dias de acordo com o tempo de crescimento. No período de sete dias aproximadamente após a
germinação foi efetuada a inoculação com 1,0 ml de suspensão contendo as isolados em teste
com cerca de 10
9
células de rizóbio. As plantas inoculadas foram cobertas com uma camada
de dois cm de areia esterilizada para prevenir possíveis contaminações. Semanalmente, em
cada vaso, foi realizada a aplicação de solução nutritiva isenta de nitrogênio (NORRIS &
T’MANNETJE, 1964) e sempre que necessário foi adicionada água estéril para a planta não
sofrer qualquer tipo de estresse hídrico. A solução nutritiva é composta de Entre 45 e 50 dias
após o plantio (DAP), os nódulos foram retirados das raízes, contados, em seguida os nódulos
e a parte aérea foram embalados em sacos de papel e levados a estufa a uma temperatura de
65°C por 72 horas.
Os dados foram avaliados através do software SAEG (Universidade Federal de
Viçosa). Foi realizada a análise de variância e o teste de comparação de médias Scott-Knott a
5% de significância.
3.4.2. Mucuna Cinza
O experimento com isolados de mucuna cinza foi instalado em casa de vegetação
(Embrapa Agrobiologia), no início de agosto de 2008. O delineamento foi em blocos ao
acaso, contendo 80 isolados, uma estirpe recomendada (BR 2811) e um controle negativo
27
(testemunha absoluta), com duas repetições cada tratamento. A estirpe BR2811 obtida do
banco de coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, sob responsabilidade
da curadora Rosa Pittard. Os procedimentos na montagem e monitoramento do experimento
foram iguais ao descrito no item anterior. A coleta dos nódulos e da parte aérea foi realiza
entre 45-50 DAP, em final de setembro de 2008.
3.4.3. Mucuna Preta
O experimento com isolados de mucuna preta foi realizado em uma única etapa e,
instalado em casa de vegetação estéril (Embrapa Agrobiologia), no final de outubro de 2008.
O delineamento foi em blocos ao acaso, contendo 80 isolados, uma estirpe recomendada (BR
2811) e um controle (negativo) com duas repetições cada. A estirpe BR2811 foi obtida do
banco de coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia sob responsabilidade da
curadora Rosa Pittard, da Embrapa Agrobiologia. Os procedimentos na montagem e
monitoramento do experimento foram iguais ao descrito no item 3.4.1. A coleta dos nódulos e
da parte aérea foi realiza aos 45 dias após o plantio (DAP), início de dezembro de 2008.
3.5. Testes de eficiência de estirpes em condição controlada
De acordo com os resultados dos testes de nodulação, foram selecionados cinco
isolados para os testes de eficiência. Essas estirpes foram depositas no banco de coleção de
bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia.
3.5.1. Mucuna anã, cinza e preta
O delineamento foi em blocos ao acaso com oito tratamentos de cada espécie (cinco
isolados pré-selecionados, uma estirpe recomendada para mucuna a BR 2811obtida também
do banco de coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, um tratamento sem
inoculação e com aplicação de N (100 mg de N.vaso
-1
.semana
-1
) e um tratamento controle
(sem inoculação e sem N), com quatro repetições e duas coletas (8 x 4 x 2), totalizando 64
vasos para cada espécie de mucuna (anã, cinza e preta). Para o plantio as sementes foram
imersas em álcool etílico 95% por 30 segundos, em seguida estas foram desinfestadas com
Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
30% p.a. ) por 3 minutos e lavadas 10 vezes seguidas em água
estéril.
Foram plantadas Três sementes em cada vaso de Leonard (VICENT, 1970)
autoclavado (areia e vermiculita, 2:1) contendo 250 ml de solução nutritiva modificada de
28
Norris (NORRIS & T’MANNETJE, 1964). As estirpes foram crescidas em meio 79 líquido, a
28º C, por um dia com agitação. Os isolados foram inoculadas, utilizando 1,0 ml da suspensão
de rizóbios em fase de crescimento exponencial. Foi utilizados cinco isolados pré-
selecionados para cada espécie de mucuna, uma estirpe já recomendada como inoculante
comercial para mucuna (BR 2811- SEMIA 6158) e dois tratamentos controles sem inoculação
e sem nitrogênio e um com 100 mg de N
((NH
4
)
2
SO
4
) parcelado semanalmente. Foram
avaliados os seguintes parâmetros: a massa fresca da parte aérea (MFPA), massa seca da parte
aérea (MSPA), massa seca de nódulos (MSN), massa seca da raiz (MSR) e N total (parte
aérea), pelo método semi-micro KJELDAHL (LIAO, 1981).
Os dados foram avaliados através do software SAEG (Universidade Federal de
Viçosa). Foi realizada a análise de variância e o teste de comparação de médias Scott-Knott a
5% de significância.
3.6. Caracterização Genotípica de bactérias
3.6.1. Extração
De acordo com os resultados obtidos do dendrograma com as características
morfológicas dos isolados, foram selecionados 66 isolados representantes ( 22 para mucuna
anã, 20 para cinza e 14 preta) para a caraterização do perfil de restrição de DNA pela técnica
de ARDRA (Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado).
Foram utilizados 19 espécies de bactérias diazotróficas obtidas do banco de coleção de
bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, sendo BR 525 (S. medicae), BR 7411(S.
meliloti), BR 522 (M. mediterraneum), BR 527 (S. terangeae), BR 526 (S. saheli), BR 112 (S.
fredii), BR 114 (B. japonicum), BR523 (M. tianshanense), BR524 (M. huakuii), BR 10016 (R.
tropicii II), BR 529 ( R. giardinii), BR7606 (R. leg. Bortri folii), BR extraído foi submetido à
eletroforese (100 V; 30 min.) em gel de agarose (1%), corado com brometo de etídio (10
ppm), um corante fluorescente que se intercala entre as bases do DNA e, sob radiação
ultravioleta permite a visualização do DNA.
3.6.2. Reação de PCR
A reação de PCR foi dimensionada para volume final de 35 uL contendo tampão de
reação 1X, MgCl
2
1,5 mM, Taq DNA polimerase 1,75U (Invitrogen cat. N° 11615-010), BSA
29
0,3ug/uL, dNTP 250 uM e 0,2 uM de cada iniciador. Os iniciadores utilizados foram Y1 que
está compreendido entre a região 20 a 43 do gene 16s rDNA de E.Coli e Y3 (Odee et al.
2002) que corresponde a região 1507 a 1482 do gene 16S rDNA de E. coli. A amplificação
consistiu em uma etapa de desnaturação inicial de 93° C por 5 min seguidos de 35 ciclos de
93°C por 1 min, 62°C por 1 min e 72°C por 2 min e extensão final a 72°C por 10 min.
3.6.3. Análise de restrição
A análise de restrição procedeu-se utilizando as endonucleases de restrição DdeI, MspI
e HinfI, utilizando 5uL de DNA amplificado seguindo as orientações do fabricante. O DNA
digerido foi analisado em gel horizontal a 3% de agarose em tampão TBE 0,5% por 3 horas a
voltagem constante de 75 V onde se utilizou nas laterais do gel o marcador de peso molecular
φX174( Invitrogen cat. N° 10488-037). Os fragmentos do DNA digerido foram analisados
pelo programa Gel Compar 2.0 Applied Maths baseado no coeficiente de Jaccard e o método
de agrupamento UPGMA para a construção do dendrograma de similaridade.
30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Nódulos das espécies de mucuna plantados em vasos
Os dados obtidos do experimento implantado nas dependências da Embrapa
Agrobiologia com três espécies de mucuna foram: número de nódulos e peso de matéria seca
da parte aérea.
Figura 2. Nodulação de mucuna anã, cinza e preta em solos coletados na Fazendinha, Sendo
1, 2 e 3: Planossolo; 4, 7 e 8: Argissolo amarelo; 5, 6: Argissolo vermelho amarelo.
Os maiores valores da mucuna anã quanto ao número de nódulos, foram encontrados
nos solos 4, 8 e 7 correspondentes à classe Argissolo amarelo (figura 2), equivalentes a 24,21,
21,34 e 14,74%, respectivamente.
No solo 6 (Argissolo vermelho amarelo) a mucuna cinza obteve o maior valor, com
cerca de 20% dos nódulos totais desta espécie, seguido do solo 5 pertencente à mesma classe
de solo e equivalente à 15,6%, foram também os maiores valores comparados com as demais
espécies, podendo o tipo de solo estar influenciando na nodulação de cada espécie de
mucuna. Corroborando com Aguirre & Valdes (1993) que afirmaram que a ocorrência de
resposta variável à infecção de rizóbios em solos de regiões tropicais, pode depender da
espécie infectada e, até mesmo, do tipo de solo.
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8
Solos
Número de nódulos
M. Anã M. cinza M. preta
31
Já a mucuna preta apresentou maior nodulação com 17,1% no solo 6, 16,02% no solo
2 e 15,84% no solo 7, das classes de argissolo vermelho amarelo, planossolo e argissolo
amarelo, respectivamente.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8
Solos
Massa seca da parte aérea
M. anã M. cinza M.preta
Figura 3. Massa seca da parte aérea de mucuna anã, cinza e preta em solos coletados da
Fazendinha. Sendo: Solos 1, 2 e 3: Planossolo; 4, 7 e 8: Argissolo amarelo e; 5 e 6: Argissolo
vermelho amarelo.
A maior média de peso de matéria seca (MS) foi observada na mucuna preta do solo 4
(argissolo amarelo), com 112g por planta solo, coletado em área com plantio de adubo verde,
com a segunda maior média também da mucuna preta com 100g por planta, no solo 7
(Argissolo amarelo), área esta de plantio direto com beringela. A boa média de produção de
massa seca pode ser em razão da quantidade de nutrientes nas áreas de coleta, principalmente
no plantio de berinjela, em sistema de plantio direto e da adaptação desta espécie nos
diferentes tipos de solos.
A mucuna cinza obteve sua maior média no solo 6, com 95g de matéria seca por
planta. Mulongoy e Akobundu (1990) verificaram ótima produção de Matéria seca de Mucuna
pruriens var. utilis, podendo chegar a mais de 5 t.ha
-1
com a contribuição de N de mais de 100
Kg.ha
-1
.
Com relação à mucuna anã o solo 6 (gleba X) obteve maior percentual de matéria
seca, com 22,34% do total para esta espécie, seguido do solo 7 (gleba IX) e 8 (gleba VII) com
32
18,61 e18,35%, respectivamente. Já os menores percentuais estão no solo 2 e 5 com 3,19%
para cada, correspondendo a 10g de MS por planta.
0% 20% 40% 60% 80% 100%
M. Anã
M. cinza
M. preta
Adubos verdes
Percentagem de nodulação
Planossolo Argissolo Amarelo Argissolo vermelho amarelo
Figura 4. Percentagem de nodulação de Mucuna preta, M. cinza e M. anã usadas como
adubos verdes em diferentes classes de solos.
A figura 4 refere-se ao total de nodulação referente a cada espécie representado por
percentagem, não indicando que a nodulação foi semelhante entre espécies. A mucuna preta
obteve em argissolo vermelho amarelo aproximadamente 40% da nodulação total da espécie
em comparação com os demais solos. Aproximadamente 45% da nodulação total da M. cinza
também estão concentrados no argissolo vermelho amarelo. Estes resultados sugerem que
para estas duas espécies o argissolo vermelho amarelo proporcionou melhores condições no
parâmetro nodulação. Embora o crescimento dos nódulos seja afetado pelo excesso de N,
pequenas doses podem estimular tanto o crescimento da planta como aumentar a massa de
nódulos produzidos (ARAÚJO & CARVALHO, 2006), como se verificou certa quantidade de
nitrogênio no solo (tabela 5) em análise realizada.
Já na mucuna anã cerca de 60% dos nódulos são de argissolo amarelo, 15% são de
argissolo vermelho amarelo e 25% de solos coletados em área de planossolo, indicando que o
primeiro solo influenciou positivamente na nodulação.
33
0% 20% 40% 60% 80% 100%
M. anã
M. cinza
M.preta
Adubos verdes
Percentual de MSPA
Planossolo Argissolo amarelo Argissolo Vermelho amarelo
Figura 5. Percentagem de massa seca da parte aérea (MSPA) de Mucuna preta, M. cinza e M.
anã usadas como adubos verdes em diferentes classes de solos.
Em mucuna preta e anã o maior percentual de massa seca da parte aérea foi no
argissolo amarelo, com 40,10 e 42,31% do total de cada espécie, respectivamente. Na mucuna
cinza por sua vez o argissolo vermelho amarelo obteve o maior percentual de massa seca com
mais de 39,24% do total desta espécie (figura 5). As classes de argissolo podem estar
proporcionando condições favoráveis ao desenvolvimento das mucunas confirmadas pelos
resultados da análise química (tabela 5) principalmente do solo 7 ( argissolo amarelo) com
altas quantidades de nutrientes, fornecidos pelo sistema de plantio direto e, que é o mais
equilibrado de todas as áreas coletadas.
4.2. Caracterização fenotipica
4.2.1. Caracterização fenotípica de mucuna anã
Foi realizada a caracterização morfológica de 80 isolados de nódulos de mucuna anã,
provenientes do experimento em vasos com oito solos da Fazendinha. A tabela com as
informações fenotípicas está em anexo.
O dendrograma abaixo mostra a similaridade entre as bactérias isoladas de nódulos de
mucuna anã.
34
Figura 6. Dendrograma de similaridade com base em características morfológicas de isolados
de bactérias que nodulam mucuna anã de solos oriundos do SIPA, pelo coeficiente de Jaccard
e pelo método de agrupamento UPGMA.
MUCUNA ANÃ
35
A partir das informações fenotípicas, foi possível a construção de um dendrograma de
similaridade, possibilitando a separação dos isolados em grupos. Foi usado cinco estirpes
padrão para a comparação com as características dos isolados. Em coeficiente de Jaccard de
0,67 obteve-se a divisão em quatro grupos, podendo-se observar grupos bastante distintos.
Entre as características mais relevantes destacam-se o pH e o tempo de crescimento. Em
relação ao pH, 84,81% das bactérias acidificam o meio de cultura, enquanto que 15,19%
alcalinizaram. A reação de mudança de pH em meio de cultura YMA é, habitualmente,
consistente dentro dos gêneros Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium, que apresentam a
característica de acidificar o meio de cultura. Enquanto que Azorhizobium e Bradyrhizobium
alcalinizam o meio YMA (COUTINHO et al., 2000). Em relação ao tempo de crescimento,
86,08 dos isolados tiveram crescimento rápido e 13,92% crescimento lento. Segundo Norris
(1965) bactérias isoladas de solos alcalinos excretam substâncias que acidificam o meio,
sendo uma vantagem competitiva. Chao & Alexander (1982) afirmam que a sobrevevência
das bactérias noduladoras dependem do pH do solo. Confirmando os resultados de fertilidade
dos solos utilizados neste trabalho, em que o pH ficou em média 6,0,e solo considerado
propício para o crescimento de bactérias ácidas.
Do total de isolados, 83,54% apresentaram forma da colônia: circular. O tamanho das
colônias variou entre <1mm (puntiformes) e 11mm, sendo uma característica importante para
o agrupamento dos isolados e, para Herridge & Roughley (1975) e Martins (1997) as menores
colônias principalmente as puntiformes foram mais eficientes segundo estudos.
Tabela 6. Parâmetros de separação dos grupos no dendrograma de Mucuna anã.
Grupos
morfológicos
Características do grupo Características do grupo
Características do
grupo
GRUPO
1
Crescimento lento;
pH alcalino; Aparência do
muco homogêneo.
1.1-Forma circular
1.2-Forma irregular
GRUPO
2
Crescimento rápido
pH ácido; Aparência do muco
homogêneo.
2.1-Elevação lente
2.1.1
-
Cor
amarela
2.1.2
-
Cor branca
2.2-Elevação plana
2.2.1
-
Borda
recortada
36
2.2.2
-
Borda
inteira
GRUPO
3
Crescimento rápido
pH ácido; Aparência do muco
homogêneo.
3.1-Forma circular;
elevação lente e convexa.
3
-
2
-
Forma irregular;
elevação plana.
GRUPO
4
Crescimento lento; pH alcalino;
Aparência do muco
heterogêneo.
4.1-Borda inteira
4.2-Borda recortada
As estirpes padrão Bradirhizobium e o Allorizobium apresentaram similaridade em
torno de 0,81 com o isolado M32(2). Já o Mesorhzobium, Rhizobium e Sinorhizobium
tiveram similaridade até 0,74 do coeficiente de Jaccard com os isolados do grupo 2. O grupo 1
apresentou 50% dos isolados oriundos do planossolo e o grupo 4 apresentou 85,33%, já os
demais gruposapresentaram-se dispersos nas classes de solo.
As características que mais contribuíram para a separação em grupos foi o tempo de
crescimento e o pH do meio de colônias que variaram, dando origem então a diversos grupos.
4.2.2. Caracterização fenotípica em mucuna cinza
Os isolados foram divididos em 5 grupos de acordo com a similaridade apresentada, o
ponto de corte foi 0,76 do coeficiente de Jaccard.
37
Figura 7. Dendrograma de similaridade com base em características morfológicas de isolados
de bactérias que nodulam mucuna cinza de solos oriundos do SIPA, pelo coeficiente de
Jaccard e pelo método de agrupamento UPGMA.
MUCUNA CINZA
38
Dentre os isolados 73,75% apresentaram tempo de crescimento rápido e 23,25% lento.
Segundo Sprent (1994) bactérias de crescimento rápido são comuns e regiões áridas, devido
ao fato de priorizarem a sobrevivência e não a fixação do nitrogênio. Esta região tropical
(local de coleta) pode estar propiciando condições favoráveis para a seleção destas bactérias.
Isolados de rizóbio de caupi são mais comuns em regiões tropicais e são em sua
maioria de crescimento lento, no entanto observou-se também a presença de bactérias de
crescimento rápido nodulando caupi (MARTINS et al,1997). Resultados diferentes dos
encontrados neste trabalho na Fazendinha Agroecológica, com as bactérias isoladas de
mucuna em que a maioria foi de crescimento rápido.
Do total de isolados 71,25 acidificaram o meio e 28,75% alcalinizaram. As
características morfológicas de rizóbio fornecem importantes informações para sua
identificação e agrupamento, destacando-se, entre várias outras características o tempo de
crescimento e a reação de pH em meio de cultura (STOWERS & ELKAN, 1984).
Como característica em destaque também está a forma da colônia, com 76,25%
circulares, 46% dos isolados são translúcidos, em relação à elevação, 47,5% apresentam
elevação plana e 40% lente, 73,75% apresentam a cor branca. Sendo estas as características de
maior destaque na morfologia dos isolados.
Tabela 7. Parâmetros.de separação dos grupos no dendrograma de Mucuna cinza (continua).
GRUPO 1
Lento; básico;
1.1-convexo
1.2-lente
1.2.1
-
circular
1.2.2
-
irregular
GRUPO 2
Crescimento
rápido; pH ácido;
ap. colônia HO;
Elasticidade 1 ;
não limpa placa.
2.1-Convexa;
2.2-plana
GRUPO 3
Crescimento
rápido; pH ácido;
ap. colônia HO;
Elasticidade 1;
limpa placa.
3.1
-
Cor
branca
3.1.1.
-
Transparente.
3.1.2
-
opaca
3.2-Cor branca
com centro
amarelado
3.2.2-Circular
Tamanho < 4
mm
Tamanho
< 1mm
Tamanho
> 1mm
Tamanho > 4
mm
3.2.1
-
irregular
GRUPO 4
Crescimento
rápido; pH ácido;
ap. colônia HO;
4.1
-
Irregular;
plana
39
Elasticidade 2;
branca e
translúcida.
4.2
-
Circular;
plana
4.3
-
Irregular;
lente
GRUPO 5
Crescimento
rápido; pH ácido;
ap. colônia HE;
5.1
-
Não limpa
placa
5.1.1
-
Lente
5.1.2
-
plana
5.2-Limpa
placa
5.2.1
-
Translúcida
5.2.2
-
opaca
Na mucuna cinza, do total de isolados do argissolo amarelo 80% apresentaram
crescimento rápido e 76% dos isolados alcalinizaram o meio. Como característica importante
mostrou-se o tamanho da colônia com 53,33% dos isolados do argissolo amarelo
apresentando tamanho < 5 mm.
No planossolo 66,33% dos isolados de mucuna cinza apresentaram pH ácido e 70%
crescimento rápido, os isolados com tamanho entre 1 e 4 mm equivaleram a 63,33% do total
nesta classe de solo. Dos isolados deste solo 73,33% são circulares e 83,33 apresentam a cor
branca.
No argissolo vermelho amarelo 70% dos isolados de mucuna cinza apesentaram
crescimento rápido e pH ácido, 75% com forma circular, 50% com elavação plana, 50% com
tamanho entre 1 e 4 mm e 100% com aparência do muco homogênea.
A distância morfológica em relação aos padrões,indica a possibilidade de ser padrões
não descritos no trabalho ou ainda de novas espécies.
4.2.3. Caracterização fenotípica em mucuna preta
A partir da caracterização de bactérias isoladas de nódulos de mucuna preta, foi possível a
formação de cinco grupos de acordo com as similaridades e as diferenças apresentadas.
40
Figura 8. Dendrograma de similaridade com base em características morfológicas de isolados
de bactérias que nodulam mucuna preta de solos oriundos do SIPA, pelo coeficiente de
Jaccard e pelo método de agrupamento UPGMA.
MUCUNA PRETA
41
Diante das características observadas, foi possível separar em quatro grupos nos
pontos entre 0,68 e 0,79 de similaridade do coeficiente de Jaccard. Dentre as características
mais interessantes está o fato de todos os isolados serem similares no pH e tempo de
crescimento, sendo ácidos e rápidos respectivamente.
Para a mucuna preta, 92,50% dos isolados caracterizados tem a forma circular e 7,5%
irregular, 53,75% tem elevação plana e 27,5% convexa, enquanto 87,5% dos isolados
apresentaram borda da colônia inteira e 16,25% apresentam a borda recortada. Corroborando
com Martins et al (1997) que afirma que estirpes de rizóbio independente da forma da
colônia, possuem a borda lisa ou inteira. No parâmetro transparência 61,25 do total de
isolados são opacas e 38,75% são translúcidas, encomtrando resultados semelhantes aos de
Martins et al (1995) 75,25% apresentaram aparência da colônia homogênea (HO), enquanto
que 23,75 foram heterogêneas.
Foram observados apenas 3,75% dos isolados com cor colônia branca com borda
transparente, 76,25% branco e 20% Amarelo. A morfologia da colônia e muito útil na
determinação da eficiência simbióticadas estirpes de Bradyrhizóbium que nodulam soja
(FUHRMANN, 1990) Apenas 15% dos isolados tiveram aparência do muco homogênea os
outros 85% foram heterogêneos, sendo que as características citadas acima tiveram
importância fundamental na formação dos grupos.
Tabela 8:Parâmetros de separação dos grupos no dendrograma de Mucuna preta.
GRUPO
1
Elevação convexa;
cor branca.
Padrão, amarelo
Branco; tamanho
> 5 mm.
Amarelo; tamanho
<5 mm.
GRUPO
2
lente
Opaca e
plana
Lente
Translúcida;
convexa
GRUPO
3
Translúcida e plana
recortada
Cor amarela
Tamanho <1
Tamanho >1
Cor branca
inteiro
recortado
inteiro
GRUPO
4
Opaca
convexo
irregular
circular
Lente e plana
Lente
Pla
na
42
No primeiro grupo todos os isolados foram oriundos da classe de planosssolo e
agruparam-se com as cinco estirpes usadas como padrão. Nesta classe 96,33% tiveram forma
circular, 76,67% apresentaram a cor branca e 53,33% com tamanho <4mm. Dos Isolados
obtidos de argissolo amarelo 66,33% tiveram tamanho < 4mm e, 60% de cor amarela.
Já no argissolo vermelho amarelo 50% são de cor branca e somente 16,67 são irregulares
enquanto que 83,33% foram circulares.
Na mucuna preta ao contrário das demais espécies, o pH e o tempo de crescimento não
foram fatores para formação de grupos, em razão de todos os isolados serem de crescimento rápido
e pH ácido. Nesta espécie destacaram-se como parâmetros para a formação de grupos a forma, a
elevação e a cor. A ocorrência de bactérias de crescimento lento em regiões tropicais, é mais freqüente
(MARTINS et al, 1997) diferentemente dos resultados encontrados nos solos da fazendinha
agroecológica na espécie de mucuna cinza qm que 100% das bactérias foram rápidas.
4.3. Diversidade Morfológica de i solados de Rizóbio
As 240 bactérias caracterizadas morfologicamente foram usadas para os índices de
Shannon-Weaver, abundância de Simpsom e riqueza de Margalef, índices estes que permitem
comparar amostras com diferentes tamanhos de populações (ODUM, 1988).
Tabela 9. Diversidade, riqueza e abundância de rizóbios em solos da fazendinha
agroecológica.
Solos Shannon-Weaver Simpson Margalef
solo1 3.83 0.08 4.66
solo2 4.22 0.06 5.88
solo3 3.65 0.1 4.37
solo4 4.25 0.06 5.94
solo5 3.73 0.08 4.7
solo6 4.23 0.05 6.47
solo7 3.78 0.08 5.0
solo8 3.81 0.07 5.05
A área 4 (tabela 9) com rotação crotalária guandu proporcionou maior diversidade
dentre as bactérias caracterizadas morfologicamente, seguido do solo 6 com plantio de milho
em que a cultura anterior tinha sida mucuna.
O solo 3 em que a cultura anterior foi crotalária foi o menos diverso e o mais
abundante este fato pode ter ocorrido devido ao solo estar desnudo no momento da coleta,
43
podendo estar passando por estresse o que causou a alta abundancia constatada pelo índice de
Simpson. Enquanto que o menos abundante foi o solo 6 e que foi o segundo mais diverso
indicado pelo índice de Shannon-Weaver.
O solo 6 possui maior riqueza segundo o índice de Margalef, indicando constante
atividade microbiana neste solo. Já o solo 7, com sistema de plantio direto, em que se
esperava valores mais relevantes por sua aparente estabilidade, apresentou valores
intermediários nos índices avaliados.
4.4. Teste de nodulação
4.4.1. Teste de nodulação em mucuna anã
O teste de nodulação foi feito com o bjetivo de verificar quais das bactérias isoladas
foram capazes de nodular seus hospedeiros de origem. Os dados do teste de nodulação foram
submetidos à estatística, mas somente número de nódulos foi significativo ao teste de Scott-
knott a nível de 5% de significância. Diante disso, a pré-seleção dos cinco melhores isolados
foi baseada na massa seca de nódulos e na matéria seca da parte aérea que obteve correlação
de (r = 0,98*).
3%
8%
10%
50%
29%
classe a
classe b
classe c
classe d
classe e
Figura 9. Número de isolados de mucuna anã, distribuídos em classes em função de diferença
estatísticaem teste de Scott-knott a nível de significância de 0,05.
A distribuição em classes (Figura 9) de foi a forma mais didática para a separação dos
80 isolados. A classe a refere-se aos maiores valores significativos seguidos pela b, nestas
duas classes estão inclusos os cinco melhores isolados que foram submetidos ao teste de
eficiência.
44
Segundo García-de los Santos et al (1996) isolados de crescimento rápido que não
nodularam podem ter perdido material genético envolvido no processo de nodulação, isto
pode ter ocorridona fase de isolamento em laboratório, justificando os 29% de bactérias que
não nodularam com resultados semelhantes aos de Zilli (2001). O número de nódulos por
apresentar diferença significativa foi usado como parâmetro para a formação das classes.
251
146
100
18
0
0
50
100
150
200
250
300
a b c d e
Classe
nódulos/planta
Figura 10. Número de nódulos em 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
anã.
Como comentado anteriormente, a divisão em classes foi baseada na variável NN,
apesar da escolha dos isolados mais eficientes do teste ser baseado na MSPA e MSN.
A média da classe a foi de 251nódulos, mas o número nem sempre tem correlação
com eficiência, que geralmente são baseados na MSN e MSPA além do Ntotal que não foi
analisado neste teste. A classe e condiz aos isolados que não apresentaram nodulação. Os
isolados pré-selecionados condizem as classes a e b. A nodulação depende de fatores
ambientais, de solo e da simbiose rizóbio-planta
2.25
1.91
1.66
1.49
1.41
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
a b c d e
Classes
MSPA (g/planta)
Figura 11. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em
mucuna anã em casa de vegetação.
45
A maior média de MSPA foi verificada na classe a sendo similar neste caso à
nodulação. A diferença de MSPA não tem relevância a partir da classe c que é bastante
similar as demaias classes inferiores partir das classes inferiores d e e. Esta variável è um
forte indicativo da fixação biológica em leguminosas e neste caso específico da mucuna anã,
espécie utilizada para fins de adubo verde.
1.04
0.75
0.54
0.106
0.001
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
a b c d e
classes
MSN (g/planta)
Figura 12. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em
mucuna anã em casa de vegetação.
A média da classe a (1,04g/planta) está em torno de 10 vezes maior que a d (0,106),
sendo uma variável essencial para a indicação da presença ou não de bactérias eficientes na
fixação biológica do nitrogênio, que juntamente com os dados de matéria seca da parte
aéreasão positivamente correlacionadas com N fixado.
Tabela 10. Média das variáveis avaliadas (número de nódulos, matéria seca de nódulos e
matéria seca da parte aérea) em teste de nodulação dos cinco isolados pré-selecionados para
teste de eficiência.
Isolado
Número de
Nódulos
Matéria seca de
Nódulos (g)
Matéria seca da
parte aérea(g)
M38(2) 163 0,3190 2,635
M30(3) 189 0,2025 4,500
M6(2-1) 152 0,3150 2,520
M6(4-2) 139 0,3800 2,805
M6(5) 138 0,2860 3,500
46
O entendimento dos fatores que influenciam positivo ou negativamente a eficiência da
bactéria isolada faz-se necessária, para a busca de estirpes adaptadas á fatores bióticos e
abióticos adversos (MARTINS,1995; MARTINS 1997)
A tabela mostra as melhores médias de matéria seca de nódulos (MSN) e massa seca
da parte aérea (MSPA) que foram usadas para avaliar os pré-selecionados para o teste de
eficiência. O número de nódulos (NN) não foi usado para a seleção, porque somente está
mostrando a quantidade de nódulos na planta.
As características das bactérias têm grande importância na interpretação dos resultados
quanto à nodulação, que pode ser juntamente com a fixação biológica do nitrogênio podem
ser influenciadas por vários fatores: atemperatura, condições de solo, como acidez, deficiência
de umidade, deficiência de nutrientes, excesso de nitrogênio, estirpes nativas pouco eficientes,
(VIEIRA, 1999).
Tabela 11. Características das bactérias que apresentaram as melhores médias de MSN e
MSPA em teste de nodulação em mucuna anã.
Isolado solo
Classe de solo Tempo de Crescimento
pH
M38(2) 3 Planossolo rápido ácido
M30(3) 4 Argissolo amarelo lento alcalino
M6(2-1) 5 Argissolo vermelho amarelo
rápido alcalino
M6(4-2) 5 Argissolo vermelho amarelo
rápido ácido
M6(5) 5 Argissolo vermelho amarelo
rápido ácido
Vários autores comentam a influência do tipo de solo na nodulação, e sobrevivência de
rizóbios e sua eficiência adaptação no ambiente e De acordo com Herridge et al. (2008), a
proporção média de N derivado da FBN nas principais espécies leguminosas varia de 40 a
75% e a quantidade de nitrogênio fixado por leguminosas varia em função das espécies
utilizadas e das condições de clima e de solo, em alguns casos, essa quantidade pode chegar a
mais de 100 kg de N/ha (DERPSCH et al., 1991) como no caso das espécies de mucunas
estudadas.
Os isolados que obtiveram melhores resultados no teste de nodulação foram
submetidos a teste de eficiência (Tabela 11), destacando-se pela maior média em todos os
parâmetros estudados. Sendo estes obtidos de nódulos da mesma planta cultivada em
Argissolo vermelho amarelo em sua maioria.
47
4.4.2. Teste de nodulação em mucuna cinza
Uma das razões do uso da mucuna cinza foi pelo seu histórico de contribuição seja em
forma de N seja pela adição de matéria orgânica no solo, além de outros fatores físicos,
químicos e biológicos que favorecem ao solo (SILVA, 2007).
41%
57%
2%
Classe a
Classe b
Classe c
Figura 13. Número de isolados de mucuna cinza, distribuídos em classes em função de
diferença estatística em teste de Scott-knott a nível de significância de 0,05.
Não houve diferença estatística nos parâmetros MSN e MSPA quando testados em
casa de vegetação sob temperatura controlada em teste de nodulação. A única variável que
apresentou diferença nos 80 isolados foi o NN, como explicado anteriormente não foi
determinante na escolha dos isolados.
Nesta espécie de adubo verde somente 2% dos isolados não nodularam fazendo parte
da classe c. O porte da mucuna cinza foi superior às demais espécies em no teste de nodulação
e, neste caso produzindo mais matéria seca.
0
58
13
0
10
20
30
40
50
60
70
a b c
classe
nódulos/planta
Figura 14. Número de nódulos em 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
cinza.
48
A divisão em três classes apresentou a classe c com média de zero (0) nódulos a sse b
com 13 e a classe a com média de 58 nódulos por planta. A pequena quantidade de nódulos
afeta necessariamente a sua produção desde que a massa nodular não seja diretamentel ao
número.
5.13
3.72
1.75
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
a b c
Classes
MSPA (g/planta)
Figura 15. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em
mucuna cinza em casa de vegetação.
A produção de matéria seca em casa de vegetação divididas em classes atingiu médias
de 5,13g por planta resultados semelhantes à produção de matéria seca por feijão caupi em
experimentos de Zilli (2001), que atingiu pouco mais de 6g. planta
-1
.vaso
-1.
A classe b
também atingiu boa produção de MSPA com média de 3,72.g.planta
-1
.vaso
-1
. Essa espécie de
mucuna em experimentos em vasos com solo, no início dos trabalhos, obteve a produção
superior a 100g de MSPA. Portanto verifica-se a contribuição dos rizóbios na produção de
leguminosas que é fundamental, além dos benefícios ao meio ambiente.
0.49
0.29
0
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
a b c
classes
MSN (g/planta)
Figura 16. Matéria seca de nódulos de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em
mucuna cinza em casa de vegetação.
49
A figura 16 mostra as classes na produção de massa nodular e, percebe-se que a classe
a apresenta médias superiores a b e a c, com 0,49g.planta
-1
.vaso
-1
, enquanto b apresentou
0,29g e c zero grama.
Tabela 12. Média das variáveis avaliadas (número de nódulos, matéria seca de nódulos e
matéria seca da parte aérea) em teste de nodulação dos cinco isolados pré-selecionados para
teste de eficiência.
Isolado
Número de
nódulos
Matéria seca de
nódulos (g)
Matéria seca da
parte aérea (g)
M41(3) 49 0,725 7,98
M3(6) 73 0,746 7,45
M25(3) 128 0,889 7,168
M15(6) 40 0,736 8,01
M47(1) 61,5 0,9175 7,44
As médias de matéria seca da parte aérea dos cinco isolados pré selecionados de
mucuna cinza foram superiores à média das classes, sendo que esta pode subestimar os reais
valores.. A maior média foi 8,01g de mucuna inoculada com o isolado M15(6) (Tabela 12)
valor este 2,88g maior que a média da classe a desta espécie. E superior também ao valor
encontrado por Zilli (2001).
Tabela 13. Características culturais e de solo das bactérias que apresentaram as melhores
médias de MSN e MSPA em teste de nodulação em mucuna cinza.
Isolado Solo Classe de solo
tempo de
crescimento pH
M41(3)
5 Argissolo vermelho amarelo
rápido ácido
M3(6) 4 Argissolo amarelo lento alcalino
M25(3)
5 Argissolo vermelho amarelo
lento alcalino
M15(6)
8 Argissolo amarelo rápido ácido
M47(1)
4 Argissolo amarelo rápido alcalino
Com a predominância dos isolados das classes de argissolos percebe-se a
influência que o solo exerce no desenvolvimento das plantas e sobrevivência das bactérias do
solo asssim também da sua ação no ambiente.
50
4.4.3. Teste de nodulação em mucuna preta
No teste de nodulação de mucuna preta não houve diferença estatítica nos parâmetros
MSN e MSPA quando testados em casa de vegetação. Nesta espécie o parâmetro que
apresentou diferença foi o NN a exemplo das espécies anã e cinza
21%
68%
11%
Classe a
Classe b
Classe c
Figura 17. Número de isolados de mucuna preta distribuídos em classes em função de
diferença estatística em teste de Scott-knott a nível de significância de 0,05.
Do total de isolados testados casa de vegetação com o objetivo de verificar sua
nodulação, 11% não apresentou nodulação e a grande maioria 68% obtiveram nodulação
intermediária
56
17
9
0
10
20
30
40
50
60
a b c
classes
nódulos (g/planta)
Figura 18. Número de nódulos em 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em mucuna
preta em casa de vegetação.
O exemplo das espécies anteriores o número de nódulos, foi a única variável que
diferiu estatisticamente. Portanto as variáveis MSPA e MSN foram também separadas em
função dessa diferença.
51
A classe a (Figura 18) apresentou 56 nódulos em sua média, número bem superior aos
demais, mas não se pode considerar uma nodulação satisfatória, pode ser pelo fato de todas as
bactérias isoladas desta espécie ser de crescimento rápido, e terem perdido sua eficiência ao
decorrer do isolamento.
3.6
2.9
1.63
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
a b c
classes
MSPA (g/planta)
Figura 19. Matéria seca da parte aérea de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em
mucuna preta em casa de vegetação.
A média da classe a ficou em 3,6g, superior ao resultado encontrado em campo por
Melloni et al, (2006)com caupi que variou entre 1,9 a 3,25g.planta
-1
. A mesma autora
encontrou ainda variações na produção de MSPA quando cultivadas em diferentes solos. O
que confirma os resultados encontrados neste trabalho.
0.194
0.15
0.001
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
a b c
classes
MSN (g/planta)
Figura 20. Matéria seca de nódulos de 80 isolados submetidos ao teste de nodulação em
mucuna anã em casa de vegetação.
Na mucuna preta a matéria seca de nódulos foi baixa, até mesmo na classe a em que a
média atingiu 0,194 g.planta
-1
.vaso
-1
.e a menor média a classe c que por considerar 0,001
52
g.planta
-1
.vaso
-1
considerou-se sem nodulação. Diante dos resultados do teste nesta espécie os
isolados foram considerados pouco eficientes.
4.5 . Teste de eficiência em casa de vegetação
4.5.1. Teste de eficiência em mucuna anã
Baseado nas melhores médias dos parâmetros de massa seca da parte aérea (MSPA) e
massa seca de nódulos no teste de nodulação, os isolados pré-selecionados para utilização em
teste de eficiência para mucuna anã foram: (m38-2, m30-3, m6-21, m6-42, m6-5).
54
Tabela 14. Variáveis analisadas em teste de eficiência em casa de vegetação com cinco isolados de mucuna anã pré-selecionados e três
testemunhas em duas épocas.
*Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e minúsculas na linha não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-knott ao nível de
significância de 0,05
A primeira coleta foi aos 40 e a segunda aos 55 dias após o plantio.
Tratamento
Matéria fresca da parte aérea
(g.planta
-1
)
Matéria seca da parte
aérea (g.planta
-1
)
Matéria seca de nódulos
(g.planta
-1
)
Matéria seca de raíz
(g.planta
-1
)
Nitrogê
nio total parte
aérea (mg.planta
-1
)
Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2
M38(2) 9,29A*a* 11,69 Ba 2,00 Aa 3,08 Ba 0,201Aa 0,381Aa 0,50Aa 0,84 Aa 56,0 Aa 63,75 Ba
M30(3) 9,51 Ab 23,15Aa 2,11 Ab 5,33Aa 0,206 Ab 0,54 Aa 0,35 Ab 1,094 Aa 56,5 Ab 112,25 Aa
M6(2-1) 7,88 Ab 20,36 Aa 1,69 Ab 4,78 Aa 0,140 Ab 0,517 Aa 0,485 Ab 1,192 Aa 35,0 Bb 116,0 Aa
M6(4-2) 7,54 Aa 10,67 Ba 1,63 Aa 2,82 Ba 0,249 Aa 0,270 Ba 0,57 Aa 0,886 Aa 44,5 Aa 61,25 Ba
M6(5) 9,15 Aa 11,00 Ba 1,95 Aa 2,51 Ba 0,254 Aa 0,19 Ba 0,45 Ab 0,97 Aa 15,75 Bb 47,0 Ba
BR 2811 6,21 Ab 16,61Aa 1,37 Ab 3,95Aa 0,142 Ab 0,453 Aa 0,515 Ab 1,109 Aa 26,25 Bb 103,25 Aa
Testemunha
nitrogenada
11,53 Aa 18,19 Aa 2,49 Aa 4,24 Aa 0,006 Aa 0,003 Ca 0,625 Aa 0,793 Aa 2,0 Cb 134,0 Aa
Testemunha total 3,71 Aa 4,84 Ba 1,03 Aa 2,14 Ba 0,000 Aa 0,0025 Ca 0,402 Ab 0,992 Aa 16,5 Ba 1,25 Cb
55
Os isolados de mucuna anã de uma forma geral apresentaram as melhores médias nas
variáveis analisadas, juntamente com a adubação nitrogenada e, sendo superior em em casos
casos à estirpe recomendada.
Observa-se (tabela14), que os parâmetros analisados não apresentaram diferença
estatística entre os tratamentos na época 1 ( coleta aos 40 dias após o plantio).
Comparando matéria fresca da parte aérea (MFPA) nos tratamentos da época 2 com
coleta aos 60 dias após o plantio, observou-se que a planta de mucuna inoculada com o
isolado pré-selecionado M30(3) obteve média foi superior, porém não diferiu estatisticamente
dos tratamentos M6(2-1), da testemunha nitrogenada e da estirpe recomendada que ficaram
com médias estatísticas iguais a esta.
Comparando os tratamentos em duas épocas, os isolados M30(3) e M6(2-1) e a BR
2811 mostraram-se superiores na segunda coleta em comparação com a primeira, nos
parâmetros: matéria fresca da parte aérea (MFPA), matéria seca da parte aérea (MSPA) e
massa seca de nódulos (MSN).
Na época 2, o isolado M38(2) apresentou maior produção de MSPA, porém com
semelhança estatistica com tratamentos com N, BR 2811 e M6(2-1) esses resultados sugerem
que esses isolados tenham potencial para produção de MSPA.
Em relação à MSN os tratamentos apresentaram diferença significativa na época 2,
sendo que três isolados apresentaram as maiores médias estatísticas, seguido de M38(2) e a
BR 2811. Em MSN a testemunha total e a nitrogenada apresentaram os menores valores, o
que já era esperado para estes tratamentos.
Embora o aparecimento dos nódulos seja sensível ao excesso de N, pequenas doses
podem estimular tanto o crescimento da planta como aumentar a massa de nódulos
produzidos. Esse fato é importante, pois segundo DOBEREINER (1966), há uma correlação
positiva entre a massa nodular e a quantidade de N acumulado (Ntotal) em leguminosas. Esssa
correlação positiva, foi encontrada por outros autores Wadisirisuk & Weaver (1985) e
Fernandes & Fernandes (2000), assim como e Fernandes et al (2003) notaram correlações
positivas quanto à massa seca de nódulos (MSN), quando dados de caupi e guandu foram
correlacionados aos do feijão-de-porco.
A MSR é um parâmetro importante neste trabalho, que objetiva a utilização da
mucuna como adubo verde e a raiz para incorporação como matéria orgânica. Não houve
diferença estatística entre os tratamentos dentro de cada época, mas ocorreu entre as épocas
em cinco tratamentos.
55
A eficiência de uma determinada bactéria na planta hospeira é medida em um conjunto
de variáveis, mas se expressa mais claramente no N total, que mostrou ser melhor no isolado
apesar de muitas vezes não apresentar diferença estatística em relação aos demais.
O crescente acumulo de N da época 1 para a época 2, mostrou que esta variável
acompanhou o crescente aumento média de produção de MFPA, MSPA, MSN, MSR da
mucuna anã indicando assim uma melhor época para o uso da planta como adubo verde
proporcionando uma maior aproveitamento do material, neste caso aos 60 dias após o plantio.
Acredita-se que o N acumulado na parte aérea da mucunaseja proveniente da fixação
biológica.
Diante dos resultados obtidos nos parâmetros de mucuna anã, pôde-se observar o os
isolados M30(3) e M6(2-1) obtiveram melhores médias, podendo indicar uma maior
eficiência destes em relação aos demais, podendo ser testados em experimento de campo para
posterior seleção como inoculante para mucuna anã.
4.5.3. Teste de eficiência em mucuna cinza
O teste de eficiência em mucuna cinza é uma das etapas para confirmar a eficiência
dos isolados provenientes de solo da Fazendinha agroecológica em promover o fornecimento
de nitrogênio à planta e aumento na produção de matéria seca para adicionar ao solo.
57
Tabela 15. Variáveis analisadas em teste de eficiência em casa de vegetação com cinco isolados de mucuna cinza pré-selecionados e três
testemunhas em duas épocas.
*Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e minúsculas na linha não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-knott ao nível de
significância de 0,05
A primeira coleta foi feita aos 45dias após o plantio e a segunda aos 55 dias após o plantio.
Tratamento
Matéria fresca da parte aére
a
(g.planta
-1
)
Matéria seca da parte
aérea (g.planta
-1
)
Massa seca de nódulos
(g.planta
-1
)
Matéria seca de raíz
(g.planta
-1
)
Nitrogênio total
(mg.planta
-1
)
Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2
M41(3) 19,66 A*b* 28,47 Aa 3,96 Ab 6,62 Aa 0,394 Ab 0,695 Aa 0,902 Ba 1,523Aa 104,0 Ab 178,75 Aa
M3(6) 19,14 Aa 25,87 Aa 3,78 Ab 6,08 Aa 0,431 Aa 0,584 Aa 1,280Aa 1,225 Aa 102,0 Ab 158,75 Aa
M25(3) 22,20 Aa 25,17 Aa 4,79 Aa 6,13 Aa 0,365 Ab 0,629Aa 0,662 Bb 1,126 Aa 81,25 Aa 154,50 Aa
M15(6) 15,32 Ab 25,21 Aa 3,48 Ab 5,93 Aa 0,425 Ab 0,777 Aa 0,825 Ba 1,176 Aa 79,50 Ab 135,0 Ba
M47(1) 21,17 Aa 18,73 Ba 4,86 Aa 4,38 Ba 0,439 Aa 0,545 Aa 1,380 Aa 0,990 Aa 135,75 Aa 96,75 Ba
BR 2811 16,41 Aa 22,40 Aa 3,64 Aa 5,41 Aa 0,30 Ab 0,633 Aa 0,795 Ba 1,198 Aa 82,50 Ab 146,25 Aa
Testemunha
nitrogenada
22,93 Aa 30,11 Aa 5,20 Ab 7,25 Aa 0,001Ba 0,015 Ba 0,830 Bb 1,507 Aa 140,75 Ab 200,0 Aa
Testemunha total 7,24 Ba 13,42 Ba 2,88 Aa 3,88 Ba 0,010 Ba 0,007 Ba 0,608Ba 0,892 Aa 1,25 Ba 2,5 Ca
58
Os resultados (Tabela 15) de MFPA mostram que na época 1 a testemunha total
obteve média inferior aos demais tratamentos, já na época 2 a planta inoculada com o isolado
M47(1) e a testemunha sem inoculação e sem aplicação de N obtiveram as menores médias.
Em relação à MSPA apenas a época 2 apresentou diferença significativa e, a exemplo
da MFPA o isolado M47(1) e a testemunha total foram apresentaram médias inferiores aos
demais tratamentos, isso é devido á proporcionalidade na perda de água.
Como esperado MSN apresentou diferença dos isolados e da estirpe recomendada em
relação às testemunhas nitrogenada e total, pois nestas plantas estão isentas de simbiose
devido a ausência do rizóbio.
Quanto à matéria seca da raiz os isolados os isolados M3(3) e M47(1) obtiveram
médias superiores às demais na primeira coleta, já na segunda não houve diferença entre os
tratamentos.
Quanto ao Ntotal houve diferença entre os isolados e a testemunha total na época 1.
Enquanto que, na época 2 os islados M41(3), M3(6) e M25(3) obtiveram semelhança
estatística à BR 2811e à testmunha nitrogenada, a presença de N nas testemunhas totaisforam
atribuídos à reserva de N nas sementes (FERNANDES et al, 2003)
4.5.3. Teste de eficiência em mucuna preta
Assim como as espécies anteriores a mucuna preta foi submetidaao teste de eficiência
com os isolados pré-selecionados no teste de nodulação.
59
Tabela 16. Variáveis analisadas em teste de eficiência em casa de vegetação com cinco isolados de mucuna preta pré-selecionados e três
testemunhas em duas épocas
*Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e minúsculas na linha não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-knott ao nível de
significância de 0,05.
A primeira coleta foi feita aos 45 e a segunda aos 55 dias após o plantio.
Tratamento
Matéria fresca da parte
aérea (g.planta
-1
)
Matéria seca da parte aérea
(g.planta
-1
)
Massa seca de nódulos
(g.planta
-1
)
Matéria seca de raiz
(g.planta
-1
)
Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2 Época 1 Época 2
M20(6)b1 6,33 A*a* 7,85Aa 1,59Ba 2,01 Aa 0,117 Aa 0,12 Aa 0,748 Aa 0,443 Aa
M16(1) 6,12 Aa 7,35 Aa 1,63 Ba 1,97 Aa 0,036Aa 0,13 Aa 0,759Aa 0,605Aa
M8(4)b 5,50 Aa 5,56 Aa 1,59 Ba 1,52 Aa 0,00Aa 0,015 Ba 0,726Aa 0,681Aa
M19(4) 5,27 Aa 6,44 Aa 1,36 Ba 1,65 Aa 0,00 Aa 0,00 Ba 0,738Aa 0,508Aa
M8(1)a1 4,30 Aa 8,13 Aa 1,19 Ba 2,11Aa 0,00 Aa 0,00 Ba 0,943Aa 0,969Aa
BR 2811 4,39 Aa 9,92 Aa 1,07 Ba 2,28Aa 0,073 Aa 0,187 Aa 0,657Aa 0,835Aa
Testemunha
nitrogenada
13,86 Aa 7,65Ab 3,00 Aa 1,95Aa 0,00 Aa 0,00 Ba 0,501Aa 0,729Aa
Testemunha total 3,26 Aa 3,50 Aa 0,71 Ba 0,86 Aa 0,00 Aa 0,00 Ba 0,594Aa 0,429Aa
60
Nesta espécie as médias foram relativamente baixasem todas as variáveis analisadas.Em
relação À MSPA foi observado diferença significativa somente da testemunha nitrogenada em
relação aos demais tratamentos. Quanto à MSN os três isolados obtiveram média zero na
época 1, indicando que a MSPA e Ntotal não foram provenientes da fixação biológica. Onde o
maior valor foi atribuído a estirpe recomendada com média de 0,187g de MS na segunda
coleta.
Não houve diferença significativa nas médias de MSR, dentro de cada época e entre as
épocas, o que indicou pouco desenvolvimento radicular. As análises de Ntotal não foram
disponibilizadas a tempo de incluir.
4.6. Caracterização genotípica
4.6.1. Caracterização genotípica por ARDRA em mucuna anã
Foram separados representantes dos grupos de bactérias isoladas de mucuna e caracterizadas
morfologicamente, foram escolhidos para este dendrograma também os isolados pré-
selecionados para o teste de eficiência em casa de vegetação.
O isolado M6(3) com características de crescimento rápido e pH alcalino, apresentou
similaridade de aproximadamente 53% com os padrões de Rhizobium, formando assim um
primeiro grupo. Um segundo grupo foi formado somente por estirpes padrão, sinorhizobium,
Mesorhizobium e Bradyrhizobium que se ramificaram entre 50 e 55% de similaridade,
acompanhando a tendência.
Um terceiro grupo foi formado aos 50% de similaridade, em que o isolado M6(2-1)
isolado oriundo de argissolo vermelho amarelo e, pré-selecionado para o teste de eficiência
em casa de vegetação, apresentou similaridade genética de 100% com a estirpe BR
2811(Bradyrhizobium) recomendada para uso como inoculante em mucuna. Foi observado,
que o isolado M30(3) com características de crescimento lento (seis dias) e pH alcalino e que
foi pré-selecionado para teste de eficiência, obteve aproximadamente 90% de similaridade
genética com a BR 2811 e com o isolado M6(2-1). Ainda no terceiro agrupamento, os
isolados M18(4) e M32(6) foram similares em 100%. A característica mais importante para a
formação deste grupo foi o pH alcalino em todos os isolados em questão sendo um fator
geneticamente influenciável.
No quarto grupamento o M6(5) foi similar em 100% com o isolado M38(2), estas
bactérias foram isoladas de nódulos de mucuna, de diferentes solos, que podem estar
61
propiciando condições para o crescimento e estabelecimento de bactérias similares em
diferentes solos.
No último grupamento a maior similaridade encontrada foi dos isolados 33(4) e 48(2)
com cerca de 90%, ambos foram isolados de nódulos de mucuna anã de argissolo amarelo. O
que pode estar indicando predomínio de solos neste agrupamento.
61
Figura 21. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna anã e clivadas com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e
Dde I.
hinf+Msp+Dde
MUCUNAS
100
90
80
70
60
50
40
30
20
hinf Msp Dde
BR 10016(R. tropici II)
BR 529(R. giardinii)
BR 10026( R. etei)
BR 10052(R. leg. bv. phaseoli)
BR 7606(R. leg. bortri folii)
BR 528( R. gallicum)
M6(3)
BR 114( B. Japonicum)
BR 523(M. tianshanense)
BR 525(S. medicae)
BR 7411( S. meliloti)
BR 522( M. mediterraneum)
BR 527(S. terangae)
BR 526(S. saheli)
BR 112(S. fredii)
BR 521(M. siceri)
BR 113(B. elkanii)
BR 524(M. huakuii)
BR 5401(Azospirillum doberaneae)
BR 5410(Azorhizobium caulinadans)
Br 2811
M6(2-1)
M30(3)
M32(2)
M18(4)
M32(6)
M18(3)
M40(4)
M33(3-1)
M40(3)
M6(5)
M38(2)
M1(1-2)
M6(4-2)
M46(7)
M33(5)
M34(4)
M33(1)
M33(4)
M48(2)
M34(1)
M1(5)
MUCUNA ANÃ
62
4.6.2. Caracterização genotípica por ARDRA em mucuna Cinza
Foram separados representantes dos grupos de bactérias isoladas de mucuna e
caracterizadas morfologicamente, foram escolhidos para este dendrograma também os
isolados pré-selecionados para o teste de eficiência em casa de vegetação.
O primeiro grupamento tem sua formação em torno de 38% de similaridade e é
formado apenas por isolados obtidos de nódulos de mucuna cinza, sem presnça de estirpes
padrão. Neste grupo encontram-se três isolados pré-selecionados para o teste de eficiência,
sendo estes M41(3), M15 (6) e M47 (1), os dois primeiros com crescimentorápido e pH ácido
e o último com crescimento rápido e pH alcalino.
No segundo grupo observou-se alta similaridade (>70%) entre os isolados analisados,
o M13(4) e M13(2) foram isolados da mesma planta e apresentaram 90% de similaridade
genética. Enquanto que, o M23(4) e M17(3) de argissolo e planossolo, respectivamente são
totalmente similares entre si e, 90% com o M15(3) também argissolo amarelo. Neste grupo
100% dos isolados tem crescimento rápido e pH ácido.
No terceiro grupamento todos os componentes pertencem às estirpes padrão que foram
usadas para comparação no dendrograma (figura 22) Foi usado Azospirilum e este apresentou
<40% de similaridade com as demais estirpes padrão.
O quarto grupo é formado por bactérias alcalinas e de crescimento lento, ocorreu
similaridade de 100% entre o isolado M3(6) e a BR 2811 (Bradyrhizobium) recomendada
como inoculante para mucuna, ambos tem crescimento lento (6 dias) e pH alcalino.
Pode-se sugerir que na formação de grupos distintos da maioria das bactérias em
relação às estirpes padrão, ocorra o aparecimento de novos grupos, podendo até mesmo não
ser rizóbios e sim outra bactéria noduladora.
63
Figura 22. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna cinza e clicadas com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e
Dde I.
hinf+Msp+Dde
MUCUNAS
100
90
80
70
60
50
40
30
hinf Msp Dde
M41(3)
M12(4)
M15(6)
M47(1)
M9(5)
M13(4)
M13(2)
M17(3)
M23(4)
M15(3)
M23(2)
M47(4)
M26(1-2)
BR 525(S. medicae)
BR 7411( S. meliloti)
BR 522( M. mediterraneum)
BR 527(S. terangae)
BR 526(S. saheli)
BR 112(S. fredii)
BR 521(M. siceri)
BR 113(B. elkanii)
BR 114( B. Japonicum)
BR 523(M. tianshanense)
BR 10016(R. tropici II)
BR 529(R. giardinii)
BR 7606(R. leg. bortri folii)
BR 528( R. gallicum)
BR 10026( R. etei)
BR 10052(R. leg. bv. phaseoli)
BR 524(M. huakuii)
BR 5401(Azospirillum doberaneae)
BR 5410(Azorhizobium caulinadans)
M44(5)
M25(3)
M3(4)
M44(6)
M31(6)
M2(6)
Br 2811
M3(6)
MUCUNA CINZA
64
4.6.3. Caracterização genotípica por ARDRA em mucuna preta
Na carcaterização genética e mucuna preta, os grupos 1 e 2 foram compostos somente
por estirpes padrão. No primeiro grupo as espécies de Sinorhizobium e Bradyrhizobium se
agrupam. No grupo 2 o Rhizobium tropici tliiII e R.giardinii apresentraram-se similares em
100%, assim também o Rhizobium etli e R. leg. bv. phaseoli.
No grupamento 3 observou-se similaridade em cerca de 90%, entre os isolados
M11(2)a e M16(1), o primeiro é oriundo da classe de solo vermelho amarelo e o segundo
argissolo amarelo. A similaridade entre o M19(3) e 19(4), pode ser devido ao fato de serem
originários da mesma planta.
NO quarto grupamento o M28(7) e M39(4) obtiveram > de 90% de similaridade entre
si, porém não são do mesmo solo.
A mucuna preta é a espécie que apresentou menores variações nas cractererísticas
morfoçógicas dos isolados, onde e todos os isolados foram de crescimento rápido e
apresentaram pH ácido.
65
Figura 23. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna preta e clicadas com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e
Dde I.
hinf+Msp+Dde
MUCUNAS
100
90
80
70
60
50
40
30
20
hinf Msp Dde
BR 525(S. medicae)
BR 7411( S. meliloti)
BR 522( M. mediterraneum)
BR 527(S. terangae)
BR 526(S. saheli)
BR 112(S. fredii)
BR 521(M. siceri)
BR 113(B. elkanii)
BR 114( B. Japonicum)
BR 523(M. tianshanense)
BR 524(M. huakuii)
BR 10016(R. tropici II)
BR 529(R. giardinii)
BR 10026( R. etei)
BR 10052(R. leg. bv. phaseoli)
BR 7606(R. leg. bortri folii)
BR 528( R. gallicum)
Br 2811
BR 5401(Azospirillum doberaneae)
BR 5410(Azorhizobium caulinadans)
m20(6)b1
M19(3)b
M11(2)a
M16(1)
M8(4)b
M4(5)a
M19(3)
M19(4)
M22(1)
M22(2)
M28(7)
M39(4)
M39(2)
M8(1)a1
MUCUNA PRETA
66
4.7. Avaliação do agrupamento dos isolados das três espécies de mucuna através do
perfil de restrição.
A avaliação do agrupamento de todos os isolados juntamente com os padrões
utilizados neste estudo permite verificar a formação de seis grupos. O primeiro é um grupo
formado apenas por das três mucunas, sem a presença de rizóbios padrão e tem similaridade
de aproximadamente 30% (Figura 24) segundo grupo é formado também excusivamente pelos
isolados das três espécies de mucuna, e tem a similaridade de aproximadamente 40%. O
terceiro grupo é formado por estirpes padrão e contem também dois isolados de mucuna anã
(Figura 24), este gruopo tyem a sijmailaridade de aproximadamente 40%. O quarto grupo é
formado por isolados de mucuna cinza e anã, além da estirpe BR 2811 de Bradyrhizobium
elkanii (Figura24) recomendada para a produção de inoculantes para as mucunas. O quinto
grupo tembém é formado exclusivamente por isolados das mucunas cinza e anã e tem
aproximadamente 50% de similaridade. O sexto grupo tem aproximadamente 60% de
similaridade e é formado por oito isolados de mucuna preta, além um único isolado de
mucuna anã (Figura 24).
A avaliação da similaridade genética dos isolados de mucuna através da técnica de
restrição do 16S rDNA, revelou elevada variabilidade genética entre os isolados obitidos neste
estudo. Nos agrupamentos tanto dos isolados agrupados por plantas de origem, como no
agrupamento dos isolados de todas as espécies de mucuna estudadas, o posicionamento do
grupo com as estirpes padrão revelou uma elavada distância entre os isolados obtidos neste
estudo e as bactérias padrão. Estes resultados sugerem que os isolados de mucuna preta, cinza
e anã, podem representar novos grupos de rizóbio ainda não descritos.
Além da variabilidade genética dos isolados o sexto grupo, composto por rizóbios de
mucuna preta, sugere a existência de certa especificidade entre os representantes deste grupo e
a sua hospedeira, mediante a similaridade genética elevada entre estes isolados. Elevada
variabilidade também foi encontrada ao se avaliar a diversidade genética de rizóbuios de
adubos verdes originários dos tabuleiros conteiros do Nordeste brasileiro (FERNANDES et
al., 2003), onde os isolados avaliados também não agruparam com a maioria dos padrões
utilizados em um estudo utilizando a técvnica do ARDRA.
69
M6(3)
BR 5401(Azospirillum doberaneae)
BR 5410(Azorhizobium caulinadans)
M3(4)
M44(6)
M31(6)
M44(5)
M25(3)
M32(2)
M2(6)
M18(4)
M32(6)
M18(3)
Br 2811
M6(2-1)
M3(6)
M30(3)
M19(3)b
M13(4)
M33(5)
M13(2)
M17(3)
M23(4)
M15(3)
M34(4)
M23(2)
M33(1)
M33(4)
M48(2)
M34(1)
M19(3)
M19(4)
M11(2)a
M16(1)
M4(5)a
M8(4)b
M22(1)
M22(2)
M1(5)
anã
cinza
cinza
cinza
cinza
cinza
anã
cinza
anã
anã
anã
anã
cinza
anã
preta
cinza
anã
cinza
cinza
cinza
cinza
anã
cinza
anã
anã
anã
anã
preta
preta
preta
preta
preta
preta
preta
preta
anã
Figura 24. Dendrograma de similaridade genética de bactérias isoladas de mucuna preta,
cinza e anã, clivadas com as enzimas de restrição Msp I, Hinf I e Dde.
70
A variabilidade genética de rizóbios de oriundos de feijão-caupi cultivado na região do
Vale do São Francisco também já foi avaliada através da técnica do ARDRA, e grande
variabilidade genética foi encontrada onde a maioria dos isolados não agruparam com
diversos padrões de rizóbios estudados (PASSOS, et al., 2008).
Estudando a diversidade de rizóbios de feijão caupi, oriundo de solos com diferentes
coberturas vegetais, ZILLI et al. (2004) revelou grande diversidade genotípica dos isolados,
onde grande parte das bactérias estudadas não agrupou com estirpes de rizóbio padrão
utilizadas. Avaliando a diversidade genética de rizóbios de adubos verdes em diferentes
regiões da China, Liu et al (2007) encontraram uma diversidade genotípica muito grande, e a
presença de espécies ainda não descritas, foi reforçada por resultados de sequenciamento.
Adubos verdes como a crotalária, por exemplo, podem estabelecer associaçãoes com
bactérias formadoras de nódulos não pertencentes aos grupos dos rizóbios tradicionais, como
por exemplo, Methylobacterium nodulans (JOURAND et al., 2006; RENIER et al., 2008).
Estes resultados, aliado ao pouco conhecimento da ecologia e taxonomias dos rizóbios de
adubos verdes sugerem que outras espécies como as mucunas e, por exemplo, possam se
associar com rizóbios ainda não descritos, além de bactérias pertencentes a outras sub-ordens
alem das alfaproteobactérias.
71
5. CONCLUSÃO
• Tempo de crescimento e alteração de pH foram as variáveis que discriminaram
morfologicamente, os isolados de mucuna;
• Dos 240 isolados obtidos, 86% foram capazes de nodular as espécies de hospedeiros
de origem.
Isolados de rizóbios de mucuna apresentaram resultados superiores ou iguais ao controle com
a estirpe recomendada e ao controle nitrogenado (100 mg de N.vaso
-1
.semana
-1
); com
destaque para M30(3), M(2-1), M3(6) e M20 (6b1)
• Foi observada ampla diversidade de rizóbios de mucuna, com características
fenotípicas diferentes dos padrões de espécies descritas;
• Foi observada ampla diversidade de rizóbios de mucuna, com perfil de ARDRA
diferentes dos padrões de espécies descritas;
• O perfil de ARDRA permitiu discriminar a especificidade de rizóbios de mucuna
preta.
• Esses dados sugerem o potencial dos isolados em mucuna serem utilizados em futuros
programas de recomendação de estirpes eficientes para adubo verde.
72
73
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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