( PDF ) Biomonitoramento de uma reserva particular do patrimônio natural (RPPN) através da aplicação de biomarcadores bioquímicos, morfológicos e genéticos em Astyanax sp

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MANUELA DREYER DA SILVA

BIOMONITORAMENTO DE UMA RESERVA PARTICULAR DO PATRIMÔNIO

NATURAL (RPPN) ATRAVÉS DA APLICAÇÃO DE BIOMARCADORES

BIOQUÍMICOS, MORFOLÓGICOS E GENÉTICOS EM Astyanax sp.

CURITIBA

2008

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MANUELA DREYER DA SILVA

BIOMONITORAMENTO DE UMA RESERVA PARTICULAR DO PATRIMÔNIO

NATURAL (RPPN) ATRAVÉS DA APLICAÇÃO DE BIOMARCADORES

BIOQUÍMICOS, MORFOLÓGICOS E GENÉTICOS EM Astyanax sp.

Dissertação apresentada como requisito

parcial à obtenção do título de Mestre,

Programa de Pós-Graduação em Ecologia e

Conservação, Área de Concentração em

Ecotoxicologia, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná.

Orientadora: Prof

. Dr

. Helena Cristina da

Silva de Assis.

Co-orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de

Oliveira Ribeiro.

CURITIBA

2008

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas que de alguma forma colaboraram com minha

vida acadêmica, profissional e pessoal, contribuindo para tornar possível meu projeto

(ou os meus projetos de vida) e fazendo dessa escolha uma realização mais plena.

À minha mãe Tânia e ao pai Gerson por todo o apoio não apenas nessa

conquista, mas em todas as outras de minha vida. Obrigada também por todo

carinho e compreensão extra trabalho. Amo muito vocês!

Ao Le, marido querido e amado, amigo de todas as horas e Biólogo que

tanto me ajudou e me faz compreender um pouco mais dessa profissão. Obrigada

pela paciência, incentivo nas horas mais complicadas e pelos momentos mágicos.

Aos meus irmãos Diogo, Rosana e Filipe (com ‘i’) por todos os momentos

vividos juntos, companheirismo e amizade, mesmo que em muitas ocasiões a

distância aumente tanto as saudades. Ao pitoco Caio, que tantas vezes esteve do

meu ladinho, com seu jeitinho curioso e encantador.

À minha orientadora Helena, pela orientação, conselhos, paciência e

amizade, que me fizeram crescer como pessoa e como Bióloga desde a graduação.

Ao co-orientador Ciro, pela força e pelas oportunidades oferecidas.

Às minhas grandes amigas biólogas, amigas de tantos momentos, de tantas

conquistas, de tantas descobertas e viagens, amigas da vida.

Às gurias extra facul, que fizeram parte das mais variadas fases da minha

vida e, como não poderia deixar de ser, amigas nesse momento também.

Aos amigos de trabalho de todos os dias, pessoas que me fazem

compreender como é atuar nessa profissão que tanto amo e que possibilitam a

prática de atividades de extensão em comunidades.

A todo o pessoal do laboratório e do departamento, por todos os auxílios,

mesmo que corridos, e bate-papos diários. Agradecimento especial à Stéfani, amiga

que me ajudou muito nas fases de campo e nas discussões produtivas sobre esse

trabalho. Também ao pessoal do Laboratório de Toxicologia Celular e Mutagênese

Ambiental, por todo o auxílio nas análises realizadas nesse trabalho.

Aos amigos do mestrado, pelas conversas na cantina e nos corredores, pelo

companheirismo nas disciplinas e pela amizade.

Ao pessoal da coordenação e da secretaria da PPGECO, por todas as

ajudinhas e conversas nas diferentes horas.

Ao pessoal do laboratório do professor Marcelo Aranha, da UFPR, e do

Museu de História Natural Capão da Imbuia, pela ajuda na identificação dos

espécimes utilizados nesse trabalho. Também aos amigos de campo que tanto lutam

para conservar os fragmentos de Floresta Estacional Semidecidual do Paraná.

Ao pessoal da Usina Vale do Ivaí, por tornarem esse trabalho realidade e

pelos auxílios oferecidos. Obrigada especial ao guarda-parque Zaquel, pela

paciência e conhecimento apresentados nas fases de campo.

Com carinho, obrigada a todos.

SUMÁRIO

RESUMO __________________________________________________________i

ABSTRACT _______________________________________________________ ii

LISTA DE FIGURAS ________________________________________________ iii

LISTA DE TABELAS________________________________________________ v

LISTA DE ABREVIATURAS __________________________________________ vi

INTRODUÇÃO _________________________________________________ 01

1.1. UNIDADES DE CONSERVAÇÃO E AS RESERVAS PARTICULARES DO

PATRIMÔNIO NATURAL _____________________________________ 01

1.2. CONTAMINAÇÃO EM AMBIENTES AQUÁTICOS __________________ 03

1.2.1. Glifosato ______________________________________________ 08

1.2.2. Diuron ________________________________________________ 10

1.3. BIOMONITORAMENTO_______________________________________ 11

1.3.1. Biomarcadores _________________________________________ 13

1.3.1.1. Biotransformação e Estresse Oxidativo ________________ 15

1.3.1.2. Neurotoxicidade __________________________________ 19

1.3.1.3. Histopatologia ____________________________________ 20

1.3.1.4. Genotoxicidade ___________________________________ 21

OBJETIVOS ___________________________________________________ 23

2.1. OBJETIVOS GERAIS_________________________________________ 23

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ___________________________________ 23

CAPÍTULO I: APLICAÇÃO DE BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS,

MORFOLÓGICOS E GENÉTICOS EM Astyanax sp. NO BIOMONITORAMENTO

DA RESERVA PARTICULAR DO PATRIMÔNIO NATURAL (RPPN) FAZENDA

BARBACENA ____________________________________________________ 24

I.1 INTRODUÇÃO ______________________________________________ 24

I.2 MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________ 27

I.2.1 ÁREA DE ESTUDO_______________________________________ 27

I.2.2 DESENHO EXPERIMENTAL _______________________________ 28

I.2.2.1 Modelo Biológico_____________________________________ 31

I.2.2.2 Extração Enzimática __________________________________ 32

I.2.2.3 Histopatologia de Fígado ______________________________ 35

I.2.2.4 Teste do Micronúcleo Písceo ___________________________ 35

I.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ___________________________________ 36

I.3 RESULTADOS ______________________________________________ 37

I.3.1 ATIVIDADE DA GLUTATIONA-S-TRANSFERASE ______________ 37

I.3.2 ATIVIDADE DA CATALASE ________________________________ 37

I.3.3 LIPOPEROXIDAÇÃO _____________________________________ 38

I.3.4 ATIVIDADE DA ACETILCOLINESTERASE ____________________ 39

I.3.5 COMPARAÇÃO ENTRE ÉPOCA CHUVOSA E ÉPOCA SECA _____ 40

I.3.6 HISTOPATOLOGIA DE FÍGADO ____________________________ 43

I.3.7 TESTE DO MICRONÚCLEO PÍSCEO ________________________ 47

I.4 DISCUSSÃO ________________________________________________ 49

CAPÍTULO II: BIOMONITORAMENTO COMO FERRAMENTA PARA O

INCREMENTO DE PLANOS DE MANEJO EM RESERVAS PARTICULARES DO

PATRIMÔNIO NATURAL: CASO DA RPPN FAZENDA BARBACENA _______ 59

II.1 CONTEXTUALIZAÇÃO DAS RPPN E LEVANTAMENTO DA

PROBLEMÁTICA DA RPPN FAZENDA BARBACENA __________________ 59

II.2 BIOMONITORAMENTO AMBIENTAL NA GESTÃO DE RPPN _________ 62

II.2.1 ZONAS DE AMORTECIMENTO EM RPPN ___________________ 63

II.2.2 PLANO DE MANEJO DA RPPN FAZENDA BARBACENA ________ 67

2.2.1 Subprograma de Monitoramento da Qualidade das Águas e

Subprograma de Controle do Entorno __________________________ 67

2.2.2 Programa de Interpretação e Educação Ambiental ___________ 69

II.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ____________________________________ 70

CONCLUSÕES GERAIS ____________________________________________ 72

RESUMO

Dentre as Unidades de Conservação se encontram as Reservas Particulares do

Patrimônio Natural (RPPN). Como muitas RPPN estão em áreas sujeitas a diversos

impactos, os estudos de biomonitoramento nessas reservas devem ser

desenvolvidos. O presente estudo objetivou avaliar o impacto de pesticidas na RPPN

Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí, Paraná, utilizando biomarcadores de

contaminação ambiental a fim de contribuir com a elaboração de estratégias de

minimização dos possíveis impactos em áreas do entorno das RPPN e/ou no interior

dessa unidade. Foram analisados os biomarcadores bioquímicos (atividade da

Acetilcolinesterase - AChE, da Glutationa S-transferase - GST, da Catalase - CAT e

Peroxidação Lipídica - LPO), morfológicos (histopatologia de fígado) e genético

(teste de Micronúcleo Písceo) em Astyanax sp. em duas fases de campo: seca

(setembro/2006) e chuvosa (março/2007). Foram coletados 30 indivíduos de

Astyanax sp., em cada ponto amostral: (1) tanque formado na lavoura de cana de

açúcar; (2) tanque formado no entorno da área produtiva com a RPPN e (3) no rio no

interior da RPPN. Amostras de sangue foram coletadas para realização do teste do

micronúcleo, amostras de fígado para análise da GST, CAT, LPO e histopatologia e

de músculo para a AChE. Os resultados bioquímicos foram analisados por ANOVA

de uma via, seguido do Teste de Tukey para comparação entre os grupos. Os

resultados dos índices histopatológicos e das alterações nucleares foram analisados

pelo teste de Kruskal-Wallis. Para todos os testes foi considerado nível de

significância de 5%. Um aumento na atividade da CAT foi observado na coleta de

set/06 no grupo coletado no interior da RPPN quando comparado ao ponto 1 e 2. A

LPO aumentou nos peixes coletados no entorno da área produtiva e RPPN em

set/06, quando comparado ao interior da RPPN e à área de cana-de-açúcar; e na

coleta de mar/07 nesse mesmo ponto em relação aos demais. Também houve

aumento da atividade da GST no entorno da reserva na última coleta, quando

comparada à cana-de-açúcar. A AChE não apresentou alteração significativa. Foram

observados, ainda, em todos os pontos de coleta, alterações hepáticas como

presença de melanomacrófagos livres, necrose, infiltração leucocitária, alteração dos

núcleos dos hepatócitos e diferenciação tecidual. Na contagem de micronúcleos em

eritrócitos foi encontrada diferença entre o entorno e os demais pontos, na coleta de

mar/07. Os dados obtidos neste trabalho permitem afirmar que há alteração nos

biomarcadores analisados na área produtiva de cana e até mesmo na RPPN, e que

essas alterações podem ter sido causadas pela administração de herbicidas como o

glifosato e o diuron, mas não se descarta a hipótese de haver exposição múltipla da

RPPN a vários xenobiontes provenientes do cultivo de cana-de-açúcar vizinho.

ABSTRACT

Private Reserves of Natural Heritage (RPPN) are a kind of Protected Areas in which

several environmental impacts can occur, therefore biomonitoring studies should be

developed in these areas. The present study aimed to evaluate the impact of

pesticides in RPPN “Fazenda Barbacena” (Barbacena Farm), in São Pedro do Ivaí,

Paraná State, using environmental contamination biomarkers in order to contribute to

the development of strategies to minimize the possible impacts in RPPN. The

biochemical biomarkers (enzymatic activity of Acetylcholinesterase - AChE,

Glutathione S-transferase - GST, Catalase - CAT and Lipid Peroxidation - LPO), the

liver histopathology and Piscine Micronucleus Test were analyzed in Astyanax sp. in

September/2006 and March/2007. The specimens of Astyanax sp. (N=30) were

collected at each sampling point: (1) sugarcane farming; (2) around the producing

area with the RPPN (3) in the interior of RPPN. The blood samples were collected in

order to carry out the micronucleus test, liver samples were collected to GST, CAT,

LPO analysis and histopathology and muscle samples for AChE activity assay. The

biochemical results were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA)

followed of Tukey post-test, to comparison among the groups. The results of

histopathologic rates and nuclear alterations were analyzed by Kruskal-Wallis test.

For all the tests was considered a significance level of 5%. It was observed an

increase in CAT activity in Sept/06 sample in group 3, when compared to groups 1

and 2. LPO increased in group 2 in Sept/06 when compared to groups 3 and 1, and

in March samples when compared to the others. There was also an increase in GST

around the producing area with the RPPN in the last sampling, when compared to

sugarcane farming. AChE did not present any significant alteration. It was observed,

in all the points, liver alteration as presence of free melano-macrophages, necrosis,

leukocyte infiltration, hepatocytes nuclear alterations and tissue differentiation. The

erythrocytes micronucleus counting was different in the group 2 compared to the

others in March/07 sampling. The results showed a change in sugarcane farming

area and in the RPPN. It may have been caused by herbicide administration such as

glyphosate and diuron, but there cannot be discarded the hypothesis of multiple

exposure of the RPPN to a various xenobiotics from the sugarcane farming in the

neighbourhood area.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Movimento dos pesticidas em ambientes aquáticos______________ 06

FIGURA 2 - Fórmula estrutural do Glifosato (C3H8NO5P) - (N-phosphonomethyl)

glycine)__________________________________________________________ 08

FIGURA 3 - Fórmula estrutural do Diuron (C9H10Cl2N2O) - (3-(3,4-dichlorophenyl)-

1,1-dimethylurea) _________________________________________________ 10

FIGURA 4 - Representação esquemática das vias de desintoxicação e de possíveis

efeitos moleculares decorrentes de uma alteração no sistema biológico _______ 16

FIGURA 5 - Esquema representativo da localização da RPPN Fazenda Barbacena,

São Pedro do Ivaí, Paraná, Brasil _____________________________________ 28

FIGURA 6 - Imagens da RPPN e dos pontos de coleta na Fazenda Barbacena, São

Pedro do Ivaí, Paraná ______________________________________________ 29

FIGURA 7 - Representação da RPPN e dos pontos de coleta na Fazenda

Barbacena, São Pedro do Ivaí, Paraná _________________________________ 30

FIGURA 8 - Atividade específica (AE) da GST (nmol.min

-1

.mgproteína

-1

) no fígado de

Astyanax sp., nos grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN ________________ 37

FIGURA 9 - Atividade específica (AE) da CAT (µmol.min

-1

.mgproteína

-1

) no fígado de

Astyanax sp, nos grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN ________________ 38

FIGURA 10 - Concentração de hidroperóxidos (CP) (nmol.mgproteína

-1

) no fígado de

Astyanax sp, nos grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN ________________ 39

FIGURA 11 - Atividade específica (AE) da AchE (nmol.min

-1

.mgproteína

-1

) no

músculo de Astyanax sp, nos grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN _______ 39

FIGURA 12 - Atividade específica da GST (nmol.min

-1

.mgproteína

-1

) e CAT

(µmol.min

-1

.mgproteína

-1

) no Astyanax sp, nos diferentes pontos amostrais (Cana de

Açúcar, Entorno e RPPN)____________________________________________ 41

FIGURA 13 - Atividade específica da AchE (nmol.min

-1

.mgproteína

-1

) e concentração

de hidroperóxido (nmol.mgproteína

-1

) no Astyanax sp, nos diferentes pontos

amostrais (Cana de Açúcar, Entorno e RPPN) ___________________________ 42

FIGURA 14 - Cortes histológicos de fígado de Astyanax sp. coletados em corpos

hídricos da Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí, PR ___________________ 44

FIGURA 15 - Cortes histológicos de fígado de Astyanax sp. coletados em corpos

hídricos da Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí, PR ___________________ 45

iii

FIGURA 16 - Índice de Lesão histopatológica em fígado de Astyanax sp., nos grupos

Cana de Açúcar, Entorno e RPPN_____________________________________ 46

FIGURA 17 - Índice de Lesão histopatológica em fígado de Astyanax sp., nos grupos

Cana de Açúcar, Entorno e RPPN_____________________________________ 46

FIGURA 18 - Alterações Nucleares e micronúcleos em eritrócitos de Astyanax sp.,

nos grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN ___________________________ 47

FIGURA 19 - Eritrócitos de Astyanax sp. coletados na Fazenda Barbacena, São

Pedro do Ivaí, PR _________________________________________________ 48

FIGURA 20 - Desenvolvimento da criação de RPPN na Mata Atlântica, de 1998 a

2006 ___________________________________________________________ 61

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Potencial de risco dos pesticidas glifosato e diuron _____________ 07

TABELA 2 - Ocorrência de lesões em fígado de Astyanax sp. coletados em setembro

de 2006 e março de 2007, Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí, PR _______ 43

TABELA 3 - Representação das RPPN no bioma Mata Atlântica _____________ 60

LISTA DE ABREVIATURAS

AchE – Acetilcolinesterase

ATC – Iodeto de Acetiltilcolina

BHT – Hidroxitolueno Butilato

CAT – Catalase

CDNB – 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno

CHP – Concentração de Hidroperóxido

CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente

DTNB – Ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

ERO – Espécie(s) Reativa(s) de Oxigênio

FOX – do inglês Ferrous Oxidation / Xylenol Orange Method

GSH – Glutationa Reduzida

GST – Glutationa S-transferase

– Peróxido de Hidrogênio

HO• – Radical Hidroxila

IAP – Instituto Ambiental do Paraná

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

ICMS – Imposto sobre Circulação de Mercadorias e Serviços

IUCN – União Internacional para Conservação da Natureza

LPO – Peroxidação Lipídica (do inglês lipid peroxidation)

MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MMA – Ministério do Meio Ambiente

•- – Ânion Superóxido

RPPN – Reserva Particular do Patrimônio Natural

SEMA – Secretaria do Estado do Meio Ambiente

SNUC – Sistema Nacional de Unidades de Conservação

UC – Unidade de Conservação

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 UNIDADES DE CONSERVAÇÃO E AS RESERVAS PARTICULARES DO

PATRIMÔNIO NATURAL

A fragmentação é uma crescente ameaça aos ecossistemas naturais do

Brasil, os quais vêm cedendo lugar a diversas atividades, principalmente a

agropecuária. Combinado ao processo de fragmentação, ambientes naturais vêm

sofrendo diferentes alterações, sendo que muitos distúrbios podem ser atribuídos a

contaminantes ambientais, em especial aos pesticidas utilizados nas culturas de

soja, milho, cana de açúcar e arroz (SILVA, 2004; ARMAS, 2005).

A interferência dos pesticidas nesses sistemas pode ser observada, também,

em áreas protegidas e unidades de conservação. Unidades de Conservação (UC)

são “porções do território nacional, incluindo as águas territoriais, com características

naturais de relevante valor, de domínio público ou propriedades privadas, legalmente

instituídas pelo Poder Público com objetivos e limites definidos, sob regimes

especiais de administração e às quais se aplicam garantias de proteção”

(FUNATURA, 1989).

Dada a pluralidade dos objetivos de conservação ambiental, faz-se

necessário considerar tipos distintos de UC. Essas classes distintas são

denominadas categorias de unidades de conservação, cada uma das quais

atendendo prioritariamente a determinados objetivos (MILANO, 2000).

Em sua especificidade, as Reservas Particulares do Patrimônio Natural

(RPPN) encontram-se inseridas em um quadro bastante complexo, no qual

fragmentos vêm sendo protegidos por diversos proprietários rurais, sem, no entanto,

possuírem um manejo que integre a área protegida com as características do

entorno, em grande parte áreas agrícolas.

As RPPN são áreas privadas, naturais ou pouco alteradas, de tamanhos

variáveis, que são oficialmente protegidas para conservação da biodiversidade e/ou

outros atributos naturais considerados relevantes. Essas áreas são instituídas por

manifestação e destinação dos proprietários, sendo reconhecidas pelo Estado,

destinando-se de forma perpétua à conservação dos atributos que tornaram possível

seu reconhecimento (SNUC, 2000).

Através do Decreto 4.262, o Estado do Paraná instituiu a categoria de manejo

de conservação denominada RPPN (SEMA, 2007). Essa categoria de manejo foi

criada em 1990, para legitimar as intenções conservacionistas de proprietários

rurais. A Lei 9.985 de 2000, que aprovou o Sistema Nacional de Unidades de

Conservação (SNUC), deu mais força às RPPN, tornado-as categoria de unidade de

conservação. O decreto estadual n°4.890, de 31 de m aio de 2005, dispõe sobre as

RPPN como unidade de proteção integral inserida no Sistema Estadual de Unidades

de Conservação, estabelecendo critérios e procedimentos administrativos para a sua

criação e estímulos para a sua implementação. E em 2007, o decreto estadual

n°1529 (chamado Estatuto das Terras Privadas) trouxe força à categoria, com a

criação de incentivos à conservação da biodiversidade em áreas privadas.

Nesse sentido, as RPPN têm servido cada vez mais como instrumento

adicional para o fortalecimento do sistema de conservação da natureza, permitindo

em várias situações a manutenção de um grau mais elevado de conectividade da

paisagem natural, assim como o incremento da representação de áreas prioritárias

para a conservação, ainda não contempladas pela rede de áreas protegidas públicas

(SEMA, 2007).

Sendo unidades de dimensões e características tão variáveis, os objetivos de

manejo podem variar de RPPN para RPPN. Nas RPPN do Paraná podem ser

implementadas atividades de pesquisa, educação ambiental e turismo em áreas

naturais, com anuência do proprietário e devidamente autorizadas e licenciadas pelo

Instituto Ambiental do Paraná (IAP). O objetivo primordial, contudo, das RPPN sendo

interpretadas como de proteção integral no estado, deve ser o de conservação da

biodiversidade. Tendo em vista o atendimento desse objetivo, muitas características

ambientais devem ser consideradas na conservação das RPPN: a própria

preservação da diversidade biológica; a proteção de espécies raras, endêmicas,

vulneráveis ou em perigo de extinção; a preservação de recursos de flora e/ou fauna

e de recursos hídricos; o incentivo à pesquisa científica; o incentivo à educação

ambiental; a contribuição do monitoramento ambiental; entre outros (SNUC, 2000).

O Brasil conta, atualmente, com 800 RPPN cadastradas e averbadas em

caráter perpétuo como determina o Decreto Federal nº 1.922/96 (dados de fevereiro

de 2008). O Paraná possui 191 delas, perfazendo um total de 37.149,77 hectares de

área conservada, distribuídas por 82 municípios (SEMA, 2007). Em sua

especificidade, o ecossistema Floresta Estacional Semidecidual, ambiente foco

desse estudo, possui importantes fragmentos conservados como RPPN, entre eles a

RPPN Estadual Fazenda Barbacena. A RPPN Fazenda Barbacena possui quase

555 ha, sendo considerado um dos mais importantes fragmentos da região. Está

inserida em um mosaico de produção de cana de açúcar, no qual se aplicam,

periodicamente, pesticidas recomendados para esse cultivo (glifosato e diuron).

As características citadas acima são suficientes para que as RPPN sejam, de

fato, protegidas. A necessidade de compreender e manejar essas áreas é tarefa

prioritária, já que, muitas vezes, as demandas sócio-econômicas (atividades

industriais, agrícolas, turísticas, entre outras) tendem a colidir com os interesses

conservacionistas.

Nesse sentido, o presente estudo visou o biomonitoramento da RPPN

Fazenda Barbacena, possivelmente alterada pelo uso de contaminantes ambientais

de origem agrícola, através da utilização de biomarcadores bioquímicos,

morfológicos e genéticos em peixes, no intuito de contribuir para o desenvolvimento

de estratégias efetivas de controle das possíveis alterações.

Embora o projeto tenha sido desenvolvido em uma área-piloto relativamente

restrita, os resultados relativos ao manejo integrado da matriz (área de cultivo) com a

área protegida são passíveis de utilização em outras porções da Floresta Atlântica,

bem como em outros biomas brasileiros, desde que respeitadas suas

particularidades.

1.2 CONTAMINAÇÃO EM AMBIENTES AQUÁTICOS

Poluentes são substâncias que causam desvio da composição normal de um

ecossistema. Contaminantes ambientais, por sua vez, são substâncias presentes em

quantidades maiores que a concentração natural, como um resultado da atividade

humana e que apresentam um efeito de prejuízo ao ambiente (ODUM, 1988). Os

ecossistemas aquáticos são considerados receptores finais de poluentes liberados

no ambiente, estando susceptíveis a ação de contaminantes ou poluentes aéreos,

que chegam aos corpos d´água por deposição atmosférica, e contaminantes ou

poluentes terrestres, os quais atingem os ambientes aquáticos através do

escoamento pelas chuvas.

As principais fontes de impacto ambiental nesses ambientes seriam o

escoamento de esgoto proveniente de áreas urbanas, a liberação de diversos

produtos químicos (orgânicos e inorgânicos) pela atividade industrial e a agricultura.

Em sua especificidade, os rios situados em regiões agropecuárias são susceptíveis

aos impactos decorrentes da utilização de pesticidas. Os pesticidas podem ser

categorizados consoante o seu objetivo de utilização, sendo os três mais

importantes grupos os herbicidas, os inseticidas e os fungicidas (SINDAG, 2003).

Para o presente projeto, foi considerada, principalmente, a categoria dos herbicidas.

Existe uma discussão em relação ao próprio nome dado aos produtos

utilizados no controle de pragas, doenças e plantas daninhas na agricultura.

Segundo as indústrias produtoras dos produtos para este fim, a denominação é

produtos fitossanitários ou defensivos agrícolas (SINDAG, 2003). Por ocasião da

promulgação da Lei Federal – 7802 de 11 de julho de 1989 sobre o tema instituiu-se

o termo agrotóxico. Internacionalmente, contudo, o termo mais utilizado é pesticida.

De acordo com o Decreto nº 4.074, de 4 de janeiro de 2002, que regulamenta

a Lei nº7802/1989 acima citada, os pesticidas são produtos e agentes de processos

físicos, químicos ou biológicos destinados ao uso nos setores de produção, no

armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na

proteção de florestas, nativas ou plantadas e de outros ecossistemas e de

ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição

da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos

considerados nocivos, bem como as substâncias de produtos empregados como

desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (SINDAG,

2003).

No passado, os organismos indesejáveis à agricultura eram controlados

através da aplicação de pequeno número de compostos inorgânicos à base de cobre

e arsênico, além de alguns inseticidas de ocorrência natural, como as piretrinas. Até

a II Guerra Mundial o desenvolvimento e uso efetivo de compostos orgânicos foram

lentos, porém, com a descoberta da propriedade inseticida do dicloro-difenil-

tricloroetano, o DDT, iniciou-se a expansão e desenvolvimento de uso, característico

dos últimos 40 anos. Em função do modelo de agricultura adotado a partir desse

período, baseado no uso intenso de pesticidas, estas substâncias passaram, então,

a ser amplamente utilizadas (ANVISA, 2004).

Não se pode negar que esses produtos possibilitaram o aumento da

produtividade agrícola, entretanto, seu uso desordenado e excessivo vem

provocando diversos impactos sobre o meio ambiente. No ambiente aquático, os

pesticidas podem sofrer transformações através de reações fotoquímicas e químicas

como oxirredução e hidrólise, além de transformações biológicas ocorridas nos

organismos. A transformação desses compostos pode ser mais ou menos tóxica que

o produto original (RAND e PETROCELLI, 1985).

A Figura 1, extraída de Tomita (2002), demonstra a movimentação dos

pesticidas no ambiente. Processos de lixiviação, precipitação, volatização e

escoamento são conhecidos por influenciar o comportamento dos herbicidas no

meio que atuam, sendo que os pesticidas podem alcançar os ambientes aquáticos

através da aplicação intencional, deriva e escoamento superficial a partir de áreas

onde ocorreram aplicações. O destino de um pesticida é decidido através da

combinação de efeitos de processos físico-químicos e biológicos, que causam a

transformação e/ou a degradação do produto. Esses processos podem transformar o

produto de molécula inicial em uma série de produtos secundários, definindo seu

comportamento no ambiente (BLUS,1995). O transporte de pesticidas na água por

escoamento superficial ou enxurrada tem sido considerado como um dos maiores

meios de contaminação de rios e lagos (GAYNOR et al., 1995).

Os resíduos provenientes dos pesticidas presentes na água podem tornar-se

aderidos ao material em suspensão, depositados no sedimento ou absorvidos pelos

organismos. Peixes e invertebrados podem acumular pesticidas em grande

concentração em relação ao meio em que vivem, pois tais compostos podem se ligar

à matéria ingerida ou serem passivamente absorvidos durante as trocas

respiratórias. Quanto mais lipofílico, maior a facilidade com que o pesticida será

absorvido pelos organismos aquáticos. Tamanho, sexo e idade do organismo podem

afetar a taxa de absorção, além disso o mesmo composto pode ser absorvido em

diferentes concentrações (RAND e PETROCELLI, 1985).

Figura 1 - Movimento dos pesticidas em ambientes aquáticos.

Fonte: Tomita, R. Y. 2002. O Biológico.

Os pesticidas que merecem destaque no presente trabalho são herbicidas

comumente utilizados na cultura de cana-de-açúcar: Glifosato e Diuron. Segundo

Armas (2005), a cultura da cana-de-açúcar respondeu, em 2002, por 11,5% das

vendas de pesticidas no Brasil, atrás somente da soja. Em 2003, a cultura

representou 8,0% das vendas, ocupando a 4ª posição, movimentando 251 milhões

de dólares.

A cana-de-açúcar (Sccharum sp.) pertence à família Poaceae (Gramineae) e

sua origem geográfica é atribuída ao Sudoeste Asiático, Java, Nova Guiné e também

a Índia. Atualmente a cana-de-açúcar, além de produzir açúcar, álcool e aguardente,

tem os subprodutos bagaço, vinhaça e torta de filtro de grande importância

socioeconômica na geração de energia, produção de ração animal, produtos

aglomerados e fertilizantes.

O surpreendente aumento do plantio de cana-de-açúcar, ocorrido no Brasil no

ano de 2001, foi decisivo para mudar radicalmente as perspectivas para o mercado

mundial de açúcar, o que significou, em outras palavras, um maior investimento na

tecnologia de produção, incluindo o uso de defensivos químicos (SILVA, 2004).

Por outro lado, o sistema de produção da cana de açúcar provoca ainda

impactos desconhecidos sobre o meio aquático, mesmo que com um manejo

adequado de aplicação de pesticidas. O carreamento de nutrientes e de pesticidas,

que podem ser lixiviados e conduzidos para corpos hídricos nas proximidades da

plantação ou mesmo para canais de linhaça, originando a perda de recursos

materiais e financeiros, e pode impactar o meio, afetando as populações que fazem

uso das águas dos corpos receptores (CAVENAGHI et al., 2002).

A Tabela 1 mostra o potencial de risco dos pesticidas glifosato e diuron,

segundo Duarte (2003). Segundo o autor, o diuron possui maior capacidade de

mobilidade disperso em água, enquanto que o glifosato possui alto potencial de

transporte associado ao sedimento.

TABELA 1 - POTENCIAL DE RISCO DOS PESTICIDAS GLIFOSATO E DIURON

SUBSTÂNCIA SOLUBILIDADE K

Diuron A (42 mg/l) N A (90 dias)

Glifosato A (900.000 mg/l) N A (47 dias)

FONTE: Duarte (2003)

NOTA: N = não atende ao crítico;

A = atende ao crítico como potencial perigoso;

Solubilidade em água: quando A, Sol. em água > 30mg/l (segundo a Agência de Proteção

Ambiental dos Estados Unidos - EPA);

= meia vida (quando A, o DT

> 2-3 semanas, segundo EPA);

= coeficiente de adsorção à matéria orgânica do solo (quando A, o K

< 300-500,

segundo EPA).

Em âmbito nacional, não há limites legais estabelecidos para a interação de

pesticidas no ambiente. No entanto, a resolução do CONAMA n°357/05 trás os

limites para o glifosato em água, apesar de não indicar limites para o diuron. No caso

do glifosato, a resolução aponta o limite de 65 µg/L para águas de Classe I

(indicadas para consumo humano; recreação de contato primário; irrigação de

hortaliças e proteção de comunidades aquáticas) e 280 µg/L para Classe III

(irrigação de culturas arbóreas, cerealíferas e forrageiras; pesca amadora; recreação

de contato secundário e dessedentação de animais). No caso das águas de Classe

I, definidas como aquelas no interior de unidades de conservação de proteção

integral (aqui entram as RPPN, portanto) e para abastecimento humano e proteção

do equilíbrio natural das comunidades aquáticas, é vedado o lançamento de

efluentes ou disposição de agricultura.

No Brasil há, também, normas e critérios para a realização de testes

preliminares para a avaliação ecotoxicológica de pesticidas. Estes testes consistem

em estudos de biodegradabilidade, adsorção e mobilidade. Estudos que avaliem o

comportamento e destino dos pesticidas em solos de regiões tropicais são limitados,

entretanto, existem aqueles efetuados em regiões de clima temperado (AMARANTE

e SANTOS, 2002).

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA) estabelece limite

de 700 µg/L de glifosato em água potável como “limite consultivo de saúde”. A

Comunidade Européia, por sua vez, estabelece como “concentração máxima

admissível” para pesticidas em água potável, como substâncias individuais, o limite

de 0,1 g/L, desde que a concentração total de pesticidas não ultrapasse 0,5 g/L.

1.2.1 Glifosato

O herbicida glifosato (N-(fosfonometil)glicina), não-seletivo e sistêmico,

representa 60% do mercado mundial de herbicidas não seletivos (SMITH, 1992). Foi

criado em 1950 como um potente agente complexo e, a partir de 1971, quando sua

ação herbicida foi descoberta, passou a ser largamente utilizado. Desde então, três

principais tipos de glifosato vêm sendo comercializados: glifosato-isopropilamônio,

glifosato-sesquisódio (patenteados pela empresa Monsanto e vendido como

Roundup) e glifosato-trimesium (patenteado pela empresa ICI, atual Syngenta). O

glifosato é indicado no controle de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, em culturas

de arroz irrigado, cana-de-açúcar, café, citros, maçã, milho, pastagens, soja (plantio

direto ou indireto), fumo e uva (ANVISA, 2006). Sua fórmula estrutural pode ser vista

na Figura 2.

Figura 2 - Fórmula estrutural do Glifosato (C3H8NO5P) - (N-(phosphonomethyl)glycine) – (ANVISA,

2006).

O presente estudo tem como alvo a discussão da marca Roundup,

considerando que a Usina Vale do Ivaí, administradora da RPPN foco desse estudo,

utiliza tal produto. Além da substância ativa, o glifosato, o Roundup apresenta como

ingredientes inertes água e um surfactante, o polioxietilenamina, que ajuda o

glifosato a penetrar na folha das plantas, sendo assim um herbicida ativo (PASTRO,

1995). Segundo informações da empresa, eventualmente também se utiliza na

produção da cana a marca Milênia (glifosato Trop), que segue as mesmas

especificações que o Roundup.

Segundo Pastro (1995), a ação herbicida do Roundup se dá pelo bloqueio da

síntese de um aminoácido aromático essencial e do metabolismo de compostos

fenólicos, influenciando diretamente a síntese protéica e a formação dos tecidos da

planta, resultando em parada do crescimento, disfunção celular e conseqüente

morte da planta.

Segundo a ANVISA (2006), o glifosato possui classificação toxicológica IV.

Estudos sobre a degradação do princípio ativo glifosato indicam que a taxa de

biodegradação pode variar substancialmente, dependendo das condições

ambientais em estudo (PASTRO, 1995). Segundo a Organização Mundial da Saúde

(WHO, 1994), o tempo necessário para a biodegradação do glifosato em água, sob

condições aeróbias, é inferior a 14 dias, enquanto que em condições anaeróbias

esse tempo varia entre 14 e 21 dias. Ainda segundo a WHO (1994), o glifosato é

pouco bioacumulável em organismos aquáticos devido a sua alta solubilidade em

água e caráter iônico. O estudo de Duarte (2003), por outro lado, mostrou que

dependendo das condições do terreno o glifosato pode ficar presente no solo por 47

dias.

Apesar do glifosato ser citado como pouco tóxico, há evidências de efeitos

deletérios no ambiente, principalmente devido ao uso prolongado e sistemático do

herbicida. Segundo Amarante e Santos (2002), as concentrações mais altas de

glifosato e seu metabólito, o ácido aminometilfosfônico (AMPA), têm sido

encontradas no solo. A ocorrência de glifosato em água subterrânea é citada com

pouca freqüência, mas já foi constatada no estado do Texas, EUA, por Hallberg

(1989), mas a concentração medida não foi especificada. Como o glifosato é

bastante solúvel em água e em pH próximo à neutralidade se complexa com íons

, Mg

, Fe

e Cu

, em corpos hídricos ele é carreado para o fundo onde se

adere fortemente às partículas de sedimento (PASTRO, 1995). Para Hallberg (1989)

ainda, a aplicação direta como herbicida em águas superficiais pode ser responsável

pela presença de glifosato em água potável.

1.2.2 Diuron

O diuron (3-(3,4–diclorofenil)–1,1–dimetiluréia) é um herbicida não ionizável,

com baixa solubilidade em água (42mg/L a 25°C) e é aplicado em pré-emergência

no controle de plantas daninhas associadas principalmente à cultura de cana-de-

açúcar (MUSUMECI et al., 1995). É um herbicida do grupo dos derivados da uréia

(feniluréias) e tem o 3,4-dicloroanilina como um dos principais produtos do seu

metabolismo. Trata-se de metabólito persistente no solo e em ambientes aquáticos

(GEISSBUHLER et al., 1975).

Segundo Rao e Davidson (1982), o diuron possui tempo de meia-vida no solo

(DT

) de 328 + 212 dias, enquanto que para Duarte (2003) esse período é de 90

dias. Sua ação como herbicida se dá por inibir a reação de Hill do fotossistema II,

bloqueando a fluência elétrica do aceptor primário Q, para a proteína D1

(TEISSEIRE e VERNET, 2000). Sua fórmula estrutural pode ser vista na Figura 3.

Figura 3 - Fórmula estrutural do Diuron (C9H10Cl2N2O) - (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) -

(ANVISA, 2006).

Segundo Silva (2004), o diuron sendo analisado pelo potencial de lixiviação,

segundo o critério de Goundwater Ubiquity Score – GUS (índice de GUS, pelo qual

os pesticidas podem ser classificados em função dos (a) produtos que possuem

potencial não lixiviador - valor de GUS=1,8; (b) intermediário - valor de

1,8<GUS<2,8; e (c) lixiviador - GUS=2,8); apresenta-se com potencial intermediário

de lixiviação, com GUS=2,58.

Outra característica relatada do diuron é sua possível toxicidade a organismos

do solo e a organismos aquáticos. Nebeker e Schuytema (1998) estudaram o efeito

crônico do diuron em peixes e invertebrados e constataram que a sobrevivência e

reprodução de Daphnia pulex foi reduzida significativamente quando a concentração

de diuron na água era de 7,7 mg/L.

1.3 BIOMONITORAMENTO

Segundo Shugart et al. (1992), biomonitoramento consiste no monitoramento

de uma área possivelmente impactada através do estudo de uma ou mais espécies

(bioindicadores). Através de programas de monitoramento é possível identificar e

acompanhar impactos antropogênicos em determinadas áreas ao longo do tempo

(LANGE et al., 1996).

Inicialmente, os estudos de monitoramento focavam a detecção de

contaminantes no compartimento abiótico de ambientes aquáticos (coluna d’água e

sedimento) (RAINBOW et al., 1995; VAN DER OOST et al., 1996; SILVA et al.,

2001). Posteriormente, começou-se a avaliar a presença de xenobiontes nos

componentes bióticos desses ecossistemas (KEHRIG et al., 1998; SCHMITT et al.,

1999; WATANABE et al., 1999). Estudos de biomonitoramento direcionados a

detecção e avaliação de efeitos em organismos vivos são, portanto, bem mais

recentes (DORAN et al., 2001; NASCI et al., 2002; MONTEIRO et al., 2005).

A utilização de parâmetros biológicos nesses estudos possibilita a avaliação

de áreas impactadas, através de estudos com biomarcadores. Van Der Oost et al.

(2003), caracterizou o termo biomarcador como “qualquer resposta biológica

correspondente a uma exposição, efeito, ou susceptibilidade dos indivíduos aos

agentes químicos e/ou estressores ambientais”. Peakall (1999) já havia também

definido biomarcador como qualquer resposta biológica a químicos ambientais em

um indivíduo ou em parte dele, a qual demonstre uma alteração do estado normal do

organismo. Os biomarcadores permitem detectar, portanto, uma contaminação

ambiental, avaliar a magnitude da contaminação e identificar espécies ou

populações em risco de contaminação (WALKER et al., 1996).

Por outro lado, o termo bioindicador foi definido como as informações

retiradas de um organismo que revelam as condições ambientais medidas no seu

habitat natural, ou mesmo o organismo como um todo (SHUGART et al., 1992; VAN

DER OOST et al., 2003).

A utilização de bioindicadores se vê necessária quando valores atuais ou

valores de entrada de um dado sistema se diferem de valores considerados padrões.

Nisso baseia-se a principal diferença entre o monitoramento de parâmetros físicos e

químicos do uso de bioindicadores de fatores ambientais (WALKER et al., 1996).

Determinadas características devem ser consideradas na utilização de

bioindicadores: (1) a espécie deve ser representativa da área de estudo; (2) deve

possuir hábito preferencialmente sedentário ou de baixa mobilidade, para que possa

refletir as condições da região em estudo (RADTKE, 1979); (3) os organismos

bioindicadores devem ser de fácil identificação e coleta e (4) o nível trófico da

espécie a ser utilizada também deve ser avaliado, pois espécies que ocupam níveis

tróficos superiores geralmente são mais representativas, uma vez que podem

fornecer informações relacionadas aos fenômenos de bioacumulação e

biomagnificação (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 1999).

Segundo Silva Filho et al. (2000), vários trabalhos utilizam os peixes como

bioindicadores, na tentativa de avaliar efeitos tóxicos de diversos contaminantes,

dentre eles os pesticidas de forma geral (SILVA et al., 2001; NASCI et al., 2002;

SVÄRDH, 2003; OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2005; AMADO et al., 2006; ZANETTE et

al., 2006).

Os diferentes padrões de alterações, inerentes a cada composto e a cada

organismo, possibilitam que os efeitos de vários pesticidas possa ser distintamente

analisados em organismos, por meio de uma resposta biológica desses em relação

aos poluentes, considerando que estes efeitos são precedidos por mudanças sub-

letais em moléculas e células. Assim, a utilização de parâmetros biológicos

(bioindicadores) possibilita a avaliação de ambientes aquáticos ditos impactados e o

biomonitoramento de áreas protegidas, através de estudos com biomarcadores. O

bioindicador escolhido para esse estudo foi o lambari do gênero Astyanax sp.

Apesar da importância dessas ferramentas, há escassez de trabalhos que

relacionam diferentes biomarcadores, bioindicadores tropicais e efeitos de

contaminantes, em especial nos peixes (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2000).

Existem três principais situações que requerem biomonitoramento: (1) onde

existam razões para se acreditar que espécies nativas estão sendo ameaçadas; (2)

quando há implicações para a saúde humana quanto ao consumo de organismos

potencialmente afetados e (3) quando existe o interesse em conhecer a qualidade

ambiental (DA SILVA et al., 2003).

O presente projeto realizou um estudo de campo, na região noroeste do

estado do Paraná, Brasil, avaliando a possibilidade de danos causados pela

administração de pesticidas no entorno imediato de uma área natural protegida, a

RPPN Fazenda Barbacena, mais especificamente alterações causadas sobre grupos

de lambari.

1.3.1 Biomarcadores

Segundo Giesy e Graney (1989) existem muitos níveis de organização que

podem ser afetados por poluentes, sendo que, em cada um destes níveis, existem

processos que podem ser empregados para monitorar ou predizer os efeitos destes

poluentes nos organismos. Dentre estes processos ou mecanismos, pode-se pensar

que os biomarcadores devam ser empregados como respostas sensíveis e/ou

específicas das alterações que acontecem nas diferentes espécies.

Durante décadas os efeitos de poluentes sobre o ambiente aquático foram

avaliados pelo monitoramento de mudanças ambientais em cada nível de

organização do ecossistema como, populações, comunidades e o ecossistema

propriamente dito. Entretanto, estes estudos eram limitados, pois vários efeitos

importantes podiam ocorrer simultaneamente. A toxicologia ambiental passou a

estudar o ambiente de uma forma mais complexa, utilizando marcadores para cada

nível de organização. Estes marcadores, bioquímicos, fisiológicos, genéticos,

histológicos e comportamentais, devem apresentar habilidade de medir diferentes

respostas em relação à presença de estressores distintos (HUGGETT et al., 1992).

De acordo com Van Der Oost et al. (2003) existem dois tipos de

biomarcadores: aqueles que indicam um efeito direto na exposição do organismo a

uma substância química (biomarcadores específicos) e aqueles que indicam

qualquer alteração diferente do normal, não se podendo correlacionar

exclusivamente com exposição a uma determinada substância (biomarcadores

inespecíficos). Os primeiros podem também ser classificados como biomarcadores

de efeito, e os segundos, como biomarcadores de exposição. A especificidade dos

biomarcadores aos químicos varia grandemente e tanto os específicos como os não

específicos têm sua importância na avaliação do risco ambiental.

Como comentado, a avaliação de contaminação de ambientes aquáticos

através de biomarcadores tem sido bastante utilizada em estudos de

biomonioramento (STURM et al., 1999; LIONETTO et al, 2003; GALLOWAY et al.,

2004; ZANETTE et al., 2006). A utilização de biomarcadores pertencentes a dois ou

mais níveis de organização biológica como realizado por Amado et al. (2006) e

Camargo e Martinez (2006), vem também crescendo nos últimos anos,

possibilitando a obtenção de diferentes tipos de respostas que podem ser

comparadas e confrontadas. Este tipo de abordagem proporciona um diagnóstico

mais preciso e confiável da situação da área estudada e representa a tendência

atual em estudos de biomonitoramento.

Por detectarem alterações enzimáticas, os biomarcadores bioquímicos são

considerados como sistemas de aviso precoce, indicando a contaminação do

ambiente antes que ocorram danos mais severos aos organismos e, possivelmente,

ao ecossistema (MCCARTHY e SHUGART, 1990). Dentre os biomarcadores

bioquímicos que merecem destaque neste projeto estão a atividade da GST

(Glutationa S-transferase), da CAT (Catalase), da AchE (Acetilcolinesterase) e

também a lipoperoxidação (LPO).

Os biomarcadores morfológicos, por sua vez, auxiliam na detecção da

presença de xenobiontes em ambientes aquáticos, sendo altamente recomendada

sua utilização em estudos de biomonitoramento ambiental e diagnóstico de áreas

impactadas (AKAISHI et al., 2004). Nesse trabalho, a histopatologia de fígado foi

utilizada para complementar o estudo do bioindicador Astyanax sp.

A interferência de compostos tóxicos na integridade e funcionamento do DNA,

além da formação de adutos de DNA e anomalias nucleares, vêm sendo cada vez

mais utilizada em estudos de biomonitoramento (AL-SABTI, 1986; MINISSI et al.,

1996; OBE et al., 2002; FERRARO et al., 2004; CESTARI et al. 2004). Sendo assim,

o presente estudo utilizou o Teste de Micronúcleo Písceo como biomarcador

genético, no intuito de relacionar os danos fisiológicos causados por pesticidas com

aqueles sofridos no material genético dos indivíduos.

As alterações histopatológicas, juntamente com os parâmetros bioquímicos e

genéticos, permitem analisar, portanto, respostas agudas e crônicas aos agentes

estressores, assim como estabelecer o grau de toxicidade dos contaminantes.

1.3.1.1 Biotransformação e Estresse Oxidativo

A transformação metabólica (biotransformação) dos compostos químicos nos

organismos é essencial para alterar a atividade biológica do composto e,

conseqüentemente, cessar a interação entre o elemento químico e a célula. A

biotransformação inclui numerosos sistemas enzimáticos diferentes, os quais atuam

em diversos tipos de substratos. Muitas destas enzimas têm em comum a função de

converter estruturas tóxicas para menos tóxicas, e converter químicos lipofílicos em

estruturas hidrofílicas, que são mais rapidamente excretadas (HANG et al., 2004).

Os biomarcadores bioquímicos mais amplamente utilizados em programas de

monitoramento ambiental são as enzimas envolvidas na biotransformação de

xenobióticos e seus metabólitos (enzimas de biotransformação e enzimas

antioxidantes). Em peixes, como nos demais vertebrados, o fígado é o órgão mais

comumente envolvido na desintoxicação desses compostos (VERMEULEN et al.,

2002). Sabe-se, ainda, que o fígado é o principal órgão responsável pelo

metabolismo de xenobióticos em vertebrados. Isso porque as células do parênquima

hepático, os hepatócitos, tornaram-se especializadas na remoção de substâncias

tóxicas; na sua biotransformação e no lançamento dos produtos de biotransformação

na circulação para posterior excreção (RODRIGUES, 2003).

O oxigênio é indispensável para a vida da maioria dos organismos, sendo

utilizado como substrato de muitas enzimas. Muitas das reações nas quais esse

elemento é utilizado geram as chamadas espécies reativas de oxigênio (ERO ou

ROS). Uma condição para o desenvolvimento da vida aeróbica é a presença de

mecanismos de desintoxicação das ERO (STOREY, 1996). A produção excessiva e

desregulada de ERO pode ter graves conseqüências às células, contudo, em baixas

concentrações, as ERO (e ainda as ERN: espécies reativas de nitrogênio) têm

importante papel no contexto biológico. Elas são importantes reguladores fisiológicos

na sinalização celular, participando de processos envolvidos na proliferação celular,

relaxamento endotelial, destruição de patógenos, apoptose, etc. (PALMER et al.,

1987; MANNICK e SCHONHOFF, 2002).

Muitos tipos de defesas estão envolvidos nesses processos, constituindo o

chamado Sistema de Defesas Antioxidantes (SDA). Estes sistemas têm funções de

prevenção, reparação e interceptação das ERO e podem ou não ser catalisados por

enzimas. Um SDA do tipo enzimático inclui a Catalase (CAT).

Já o estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio intracelular entre a

geração e os níveis normais que formam os mecanismos de defesa aos agentes

oxidantes numa dada espécie (SIES, 1985). O aumento na concentração das ERO

pode levar a um aumento ou a inibição na atividade dos sistemas enzimáticos de

proteção.

O estresse oxidativo pode estar relacionado a danos em diversos níveis tais

como: mutagênese, carcinogênese, lipoperoxidação e a oxidação e fragmentação de

proteínas e carboidratos (SIES, 1985). Vários estudos de biomonitoramento

ambiental relacionam o grande aporte de diversas classes de poluentes com a

geração dessas ERO destacando inúmeras conseqüências aos organismos

aquáticos e aos seus respectivos ecossistemas (MALINS et al., 1988; BAINY et al.,

1996; TORRES et al., 2002). Os efeitos mediados pela oxidação, assim como suas

respostas adaptativas, como o aumento da atividade de enzimas antioxidantes e

concentração de componentes não enzimáticos, são potentes biomarcadores

(VERMEULEN et al., 2002). A Figura 4 traz uma representação das vias de

desintoxicação e de possíveis efeitos decorrentes de uma alteração nesse sistema.

Figura 4 - Representação esquemática das vias de desintoxicação e de possíveis efeitos moleculares

decorrentes de uma alteração no sistema biológico.

FONTE: Van Der Oost et al. 2003. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk

assessment. Envir. Toxicol. Pharmacol.

Metabolismo Toxicidade

Ambiente Organismo

Efeitos moleculares:

- Peroxidação Lipídica

- Dano no DNA

- Alteração enzimática

- Outros

Efeitos Celulares

Efeitos Fisiológicos

Efeitos Individuais

Efeitos Populacionais

Efeitos em Comunidades

Xenobiótico

Metabólitos

Conjugados

Polares

Fase I

Metabolismo

Fase II

Metabolismo

Absorção do

Xenobiótico

Excreção

Reação de

Óxido

Redução

Metabólitos

Tóxicos

reativo

/ OH

)

Sistemas

Antioxidantes

Glutationa S-transferase (GST)

A enzima Glutationa S-transferase (GST) pertence à fase II do metabolismo

sendo responsável pela conjugação de componentes eletrofílicos ou oriundos da

fase I com GSH (VERMEULEN et al., 2002). A reação de conjugação realizada pela

GST é importante às células, pois atua na hidrólise de substâncias lipofílicas, às

quais podem ser excretadas como substâncias inertes no organismo. Essa

superfamília de enzimas ocorre em seres procarióticos, plantas, moluscos,

crustáceos, insetos, anfíbios, répteis, peixes e mamíferos (VAN DER OOST et al.

2003).

As GST são classificadas como alfa, mi, pi, e teta, de acordo com suas

propriedades físicas, químicas e imunológicas. Cada classe de GST pode ser

diferentemente induzida por poluentes ambientais. A família destas enzimas é

caracterizada por ter uma ampla especificidade de substrato com baixa afinidade.

Esta baixa eficiência catalítica teve importante papel na evolução das GST como

agente desintoxicador de amplo espectro, tanto de componentes endógenos, quanto

exógenos (TEW et al., 1999).

A estimulação da enzima GST envolve reações de conjugação na presença

de glutationa. O quociente entre a glutationa reduzida e a oxidada (GSH/GSSG) na

célula é um bom indicador dos níveis de estresse oxidativo. A GST catalisa a

conjugação da glutationa reduzida (GSH) com diversos tipos de xenobióticos ou

componentes celulares danificados por espécies reativas de oxigênio (STOREY,

1996).

Animais aquáticos que habitam ambientes poluídos podem estar expostos a

xenobióticos, os quais sofrem desintoxicação mediada pela glutationa na sua forma

reduzida, catalisada pela enzima glutationa S-transferase. Esta enzima de

biotransformação tem sido estudada em trabalhos de campo no monitoramento de

poluentes de origem industrial e agrícola (CHO et al., 1999). Induções da GST no

tecido hepático de peixes foram observadas por George (1993).

Catalase (CAT)

Catalases são enzimas intracelulares localizadas nos peroxissomos, com a

função de facilitar a remoção do peróxido de hidrogênio (H

), o qual se transforma

em oxigênio molecular (O

) e água (H

O) (reação: H

+ O

•-

→ OH

+ HO

•

+ O

)

(STEGEMAN et al., 1992). As catalases também são citadas como enzimas

envolvidas na desintoxificação de alguns substratos, como fenol, alcoóis, ácido

fórmico e formaldeído (NORDBERG e ARNÉR, 2001; ALBERTS et al., 2002).

Um dos papéis antioxidantes das CAT é reduzir o risco de formação do

radical hidroxila (HO

•

) a partir do H

, via reação de Fenton (H

+ Cu

/Fe

→

+ Cu

/Fe

+ HO

•

) (NORDBERG e ARNÉR, 2001) ou por reação com ânion

superóxido (O

•-

). Apesar da baixa capacidade de difusão, o radical hidroxila é,

provavelmente, a espécie reativa de oxigênio capaz de causar mais danos aos

sistemas biológicos, segundo Diplock et al. (1998); Betteridge (2000); Nordberg e

Arnér (2001).

Contudo, de acordo com Van Der Oost et al. (2003), pesquisas ainda são

necessárias para elucidar melhor o mecanismo da CAT em peixes, o que não retira

a importância dessa enzima como biomarcador de exposição em estudos de

biomonitoramento.

Peroxidação Lipídica (LPO)

A peroxidação lipídica, lipoperoxidação ou oxidação de ácidos graxos

polinsaturados é um processo fisiológico regular, considerando sua importância na

maturação celular (SCHEWE et al., 1986; MATSUI et al. 1997; VAN LEYEN et al.,

1998) e mobilização de lipídios (FEUSSNER et al., 1995; 2001). Determinadas

classes de contaminantes, contudo, podem acarretar em efeitos deletérios nesse

processo (BENZIE, 1996; SEVANIAN e URSINI, 2000), levando a um

comprometimento no funcionamento celular (KOZAR et al., 1994; BAKER e

KRAMER, 1999), destituição da função das membranas celulares e das organelas

essenciais, tais como o processo de transporte, a manutenção de gradiente de

metabólitos e íons e a transdução de sinais mediada por receptores (MEAGHER e

FITZGERALD, 2000), com conseqüentes modificações estruturais dos complexos

lipoprotéicos das membranas celulares (MASON et al., 1997; GIROTTI, 2002).

A lipoperoxidação como conseqüência negativa do estresse oxidativo tem

sido extensamente investigada (STEGEMAN et al., 1992). Esse processo ocorre por

uma reação em cadeia e demonstra a habilidade de um único radical propagar

reações bioquímicas deletérias (VERMEULEN et al., 2002). Durante a

lipoperoxidação os grupos hidroperóxidos ligam-se aos sítios hidrofóbicos dos ácidos

graxos insaturados, tendo este processo uma dupla conseqüência: perturbação nas

interações lipídicas, que levam a alterações estruturais das biomembranas e das

lipoproteínas; e a formação de espécies reativas de oxigênio, que podem induzir a

modificação secundária de outros constituintes da membrana (GIROTTI, 2002).

A lipoperoxidação tem se mostrado um potencial biomarcador de

contaminação ambiental (STEGEMAN et al., 1992), sendo relacionado com danos

causados por estresse oxidativo (KAPPUS, 1987; REGOLLI et al., 2005).

1.3.1.2 Neurotoxicidade

Acetilcolinesterase (AchE)

O termo colinesterase é normalmente utilizado para referir-se a soma da

atividade da “pseudocolinesterase”, ou butirilcolinesterase, com a atividade da

acetilcolinesterase, ou “colinesterase verdadeira”. Estas enzimas diferem na

afinidade pelo substrato, bem como na velocidade de degradação deste e diferem

na localização e concentração numa mesma espécie (SILVA DE ASSIS, 1998).

Peixes possuem somente AchE no cérebro, enquanto no músculo ambas são

encontradas (STURM et al., 1999). A AchE está envolvida na desativação da

acetilcolina na fenda sináptica, prevenindo o estímulo contínuo do neurônio, o que é

vital para o funcionamnto normal do sistema sensorial e motor (MURPHY, 1986).

A medida da atividade da AchE é muito utilizada para diagnosticar exposição

a tóxicos anticolinesterásicos em peixes, e pode ser considerada um dos mais

antigos biomarcadores (SILVA DE ASSIS, 1998; STURM, et al., 1999). Van Der Oost

et al. (2003), indicam que peixes expostos a pesticidas podem apresentar redução

da atividade da acetilcolinesterase proporcional à concentração e ao tempo de

exposição. A medida enzimática da colinesterase possibilita a detecção de efeitos

toxicológicos subletais, principalmente de compostos organofosforados e

carbamatos, mesmo sem a presença de sintomatologia clínica.

Além dos chamados inseticidas anticolinérgicos, outras classes de

contaminantes ambientais, incluindo outros pesticidas, tem o potencial de inibir a

AchE (DAVIES e COOK,1993; GILL et al., 1990a,b). Reddy et al. (1992), observaram

em um estudo com exposição ao diuron (60 dias) uma modificação comportamental

em peixes, com diminuição na movimentação dos opérculos e redução da

locomoção. Os autores atribuíram essas mudanças a uma possível diminuição da

atividade da AchE. Entretanto, ainda poucos trabalhos relatam a influência de

exposição a herbicidas na atividade da AchE.

1.3.1.3 Histopatologia

Técnicas morfológicas como microscopia de luz têm sido utilizadas em

trabalhos de toxicologia, já que permitem avaliar possíveis efeitos de xenobiontes

em órgãos e tecidos alvos. Segundo Fent (1996), os efeitos nas estruturas das

células e tecidos constituem um importante parâmetro a ser considerado na

avaliação do potencial tóxico de contaminantes sobre os organismos vivos.

Wester e Canton (1991) relatam que através da morfologia é possível tanto

revelar os órgãos alvos mais afetados quanto detectar a sensibilidade do organismo

em relação aos níveis tóxicos dos contaminantes aos quais foram expostos. A

histopatologia permite, ainda, diferenciar lesões promovidas por doenças daquelas

induzidas por outros fatores ambientais como a exposição a poluentes

(SCHWAIGER et al., 1997).

O órgão alvo desse trabalho foi o fígado. O fígado, por representar o principal

órgão responsável pelos mecanismos de biotransformação e bioativação de

xenobiontes lipossolúveis, apresenta-se como um excelente alvo para estudos de

danos resultantes da exposição a diferentes contaminantes (OLIVEIRA RIBEIRO et

al., 2002b, 2005; DAMEK-PROPRAWA e SAWICKA-KAPUSTA, 2003; PADROS et

al., 2003; AKAISHI et al., 2004; RABITTO et al., 2005).

O fígado desempenha variadas funções metabólicas, de estoque e de

distribuição nos vertebrados. Genericamente, pode ser tratado como a maior

glândula por produzir substâncias exócrinas não enzimáticas (GUILLOUSO et al.,

1990). É considerado o principal órgão que metaboliza e excreta substâncias

xenobióticas, sendo, portanto, um dos primeiros órgãos a entrar em contato com os

contaminantes após exposição trófica.

O fígado de teleósteos, de maneira geral, é formado por células do

parênquima hepático (com forma oval até polígonos irregulares) que se encontram

dispostas de forma concêntrica ao redor de capilares sanguíneos, os sinusóides.

Seus núcleos são geralmente esféricos. Há regiões especializadas de membranas,

com dois a quatro hepatócitos, que formam canalículos biliares que são canais

intercelulares que recebem a bile por secreção celular. Vários canalículos formam o

ducto biliar. Esses ductos convergem, por sua vez, para um ducto hepático que pode

se abrir no duodeno ou alimentar a vesícula biliar, dependendo da espécie de peixe

(TAKASHIMA e HIBIYA, 1995).

1.3.1.4 Genotoxicidade

Teste de Micronúcleo Písceo e Alterações Morfológicas Nucleares

O estudo de danos no DNA em nível cromossômico é uma parte essencial da

genética toxicológica, uma vez que a mutação cromossômica é um evento

importante na carcinogênese (RIBEIRO, 2003). Dentre as ferramentas para

avaliação genotóxica, o Teste de Micronúcleo Písceo, com a análise das alterações

nucleares, constituem ferramentas importantes devido à resposta clara e de rápida

interpretação (HEDDLE et al., 1991; BOMBAIL et al., 2001).

Micronúcleos são formados pela condensação de fragmentos cromossômicos

acêntricos ou por cromossomos inteiros que não foram incluídos no núcleo principal

durante a anáfase. Apesar do pouco conhecimento sobre os mecanismos que

relacionam a formação dos micronúcleos em peixes com contaminantes ambientais,

a contagem de micronúcleos e o registro de alterações morfológicas nucleares

fornecem dados importantes nas avaliações de genotoxicidade em função da sua

capacidade de detecção da presença de substâncias clastogênicas na água (AL-

SABTI e METCALFE, 1995).

O teste do micronúcleo foi originalmente desenvolvido por Schimd (1975) para

células da medula óssea de camundongos e foi adaptada por Hooftman e Raat

(1982) para o estudo de células sanguíneas de peixes mantidos em laboratórios. O

ensaio do micronúcleo em sangue periiférico é considerado, atualmente, um dos

mais estabelecidos ensaios citogenéticos in vivo no campo da genética toxicológica

(FENECH, 2000). A técnica vem sendo cada vez mais usada em análises ambientais

por demonstrar a sensibilidade dos peixes frente a diversos contaminantes, inclusive

de origem orgânica (GRISOLIA e CORDEIRO, 2000; AYLLON e GARCIA-

VAZQUEZ, 2003; AMADO et al., 2006).

Ayllon e Garcia-Vazquez (2001) indicam que além da identificação de

micronúcleos, a análise de anomalias nucleares deve ser incluída nos estudos de

genotoxicidade em peixes por apresentar resultados mais confiáveis e completos,

considerando que muitas vezes o micronúcleo pode ter baixa sensibilidade devido à

baixa e também variável freqüência de micronúcleos em peixes silvestres.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Biomonitorar a RPPN Fazenda Barbacena e área do entorno (região

possivelmente alterada pelo uso de contaminantes aquáticos) através da aplicação

de biomarcadores bioquímicos, morfológicos e genéticos em peixes.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

− Avaliar possíveis danos causados por contaminantes ambientais na RPPN

Fazenda Barbacena através da medida da atividade da Glutathiona S-transferase

(GST) em Astyanax sp.;

− Avaliar possíveis danos causados por contaminantes ambientais na RPPN

Fazenda Barbacena através da medida da atividade da Acetilcolinesterase (AchE)

em Astyanax sp.;

− Avaliar possíveis danos causados por contaminantes ambientais na RPPN

Fazenda Barbacena através da medida da atividade da Catalase (CAT) em Astyanax

sp.

− Avaliar possíveis danos causados por contaminantes ambientais na RPPN

Fazenda Barbacena através da concentração de Peroxidação Lipídica (LPO) em

Astyanax sp.;

− Avaliar possíveis danos causados por contaminantes ambientais através da

morfologia de células do fígado em Astyanax sp.;

− Avaliar possíveis danos causados por contaminantes ambientais através do

Teste de Micronúcleo em Astyanax sp.;

− Contribuir com a elaboração de estratégias de minimização das possíveis

alterações causadas por pesticidas em áreas do entorno das RPPN e/ou no interior

dessa unidade a partir da discussão de instrumentos de gestão em áreas protegidas.

CAPÍTULO I: APLICAÇÃO DE BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS,

MORFOLÓGICOS E GENÉTICOS EM Astyanax sp. NO BIOMONITORAMENTO

DA RESERVA PARTICULAR DO PATRIMÔNIO NATURAL (RPPN) FAZENDA

BARBACENA

I.1 INTRODUÇÃO

A fragmentação ameaça todos os ecossistemas nacionais, sendo que a

Floresta Estacional Semidecidual do Paraná, ecossistema onde se encaixa essa

proposta, não foge a esta regra, tendo cedido lugar a diversas atividades,

principalmente às atividades agropecuárias. Combinado ao processo de

fragmentação, esses ambientes vêm sofrendo diferentes alterações do seu estado

natural, sendo que muitos distúrbios podem ser atribuídos a contaminantes

ambientais, em especial aos pesticidas utilizados nas culturas de soja, milho e cana

de açúcar (SILVA, 2004; ARMAS, 2005).

A interferência dos pesticidas nos sistemas naturais pode ser observada,

também, em unidades de conservação. Em sua especificidade, as Reservas

Particulares do Patrimônio Natural encontram-se inseridas em um quadro bastante

complexo, no qual fragmentos vêm sendo protegidos por diversos proprietários

rurais, sem, no entanto, possuírem um manejo que integre a área protegida com as

características do entorno (em sua maioria áreas produtoras agrícolas, no caso do

Paraná).

Os ambientes aquáticos inseridos em complexos agrícolas podem ser

afetados diretamente pelo carreamento de pesticidas utilizados nessas áreas. Na

RPPN Fazenda Barbacena, considerada um dos mais importantes fragmentos da

Floresta Estacional Semidecidual do estado do Paraná, o entorno é composto por

um mosaico de produção de cana de açúcar (no qual se aplicam, periodicamente,

diferentes pesticidas recomendados para esse cultivo, em especial o glifosato e o

diuron) combinada a nascentes que formam importantes corpos hídricos da região. A

utilização de parâmetros biológicos nesses estudos de biomonitoramento possibilita

a avaliação de áreas impactadas, através de estudos com biomarcadores (VAN DER

OOST et al., 2003).

Devido, portanto, à ampla utilização de contaminantes no entorno dessas

áreas e a possibilidade de impactos nas UC (BUSCHBACHER, 2000) é de suma

importância o desenvolvimento de estudos de biomonitoramento nas RPPN.

Combinado a isso, a falta de dados referentes a bioindicadores e biomarcadores das

condições ambientais no Brasil também demonstra a necessidade da realização de

trabalhos que visem o monitoramento das regiões protegidas. Vale ressaltar que,

apesar da importância desses estudos, existem poucos dados sobre os efeitos de

tóxicos na fauna e flora, sendo escassos, ainda, dados à respeito da toxicidade de

pesticidas em peixes (objeto de estudo desse trabalho), principalmente quando se

trata de espécies brasileiras (COSTA, 2001). Há escassez, também, de trabalhos

que relacionam as atividades fisiológicas, bioquímicas e genéticas em peixes

tropicais com efeitos de contaminantes, em especial de estudos que sugerem o uso

de diferentes biomarcadores em conjunto (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2000).

O uso de biomarcadores bioquímicos em programas de monitoramento

oferece algumas vantagens, pois são, normalmente, os primeiros a serem alterados,

apresentam boa sensibilidade, relativa especificidade e baixo custo de análise

quando comparados com análises químicas. A medida enzimática da

acetilcolinesterase (AchE), considerada um dos mais antigos biomarcadores,

possibilita a detecção de efeitos toxicológicos subletais, principalmente de

compostos organofosforados e carbamatos, sendo atualmente outros pesticidas

descritos como potenciais inibires da AchE (DAVIES e COOK,1993; GILL et al.,

1990a,b). Van Der Oost et al. (2003) indicam que peixes expostos a diferentes

pesticidas podem apresentar redução da atividade da acetilcolinesterase

proporcional à concentração e ao tempo de exposição.

A catalase (CAT), por sua vez, possui a capacidade de degradar rapidamente

o peróxido de hidrogênio (formado por oxidação metabólica) em oxigênio e água. A

reação de conjugação realizada pela enzima glutationa S-transferase (GST) é

importante às células, pois atua na hidrólise de substâncias lipofílicas, às quais

podem ser excretadas como substâncias inertes no organismo. Induções da GST e

da CAT no tecido hepático já foram observadas em diversas espécies de peixes

expostas a xenobiontes (GEORGE, 1993), sendo que as atividades dessas enzimas

vêm sendo utilizadas com maior freqüência como biomarcadores bioquímicos (VAN

DER OOST et al., 2003; FATIMA et al, 2006).

O estresse oxidativo, que pode ocorrer quando essas enzimas chamadas

antioxidantes (no caso a CAT) têm suas funções alteradas; ou quando o índice de

produção de espécies reativas de oxigênio é alto; pode causar a peroxidação dos

ácidos graxos existentes nas membranas celulares. A presença de xenobióticos,

responsável por essa alteração, pode, portanto, levar a um aumento de peroxidação

lipídica ou peroxidação (LPO) e danificar estruturas celulares (REGOLLI et al.,

2005).

Lesões histopatológicas e alterações genéticas, como aberrações nucleares,

são também efeitos relatados em estudos prévios em organismos aquáticos em

áreas impactadas (AKAISHI et al., 2004; MOUCHET et al., 2006). A ocorrência de

danos celulares e teciduais em fígado de peixes ambientalmente expostos a

pesticidas, metais pesados, esgoto e efluentes industriais tem sido descrita por

vários autores (STENTIFORD et al., 2003; NORENA-BARROSO et al., 2004;

OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2005).

Nesse sentido, o presente projeto vem contribuir para o desenvolvimento de

pesquisas de biomonitoramento em Unidades de Conservação no estado do Paraná,

em especial as Reservas Particulares do Patrimônio Natural. A proposta foi realizar o

biomonitoramento da RPPN Fazenda Barbacena, possivelmente alterada pelo uso

de contaminantes ambientais de origem agrícola, através da utilização de

biomarcadores bioquímicos, morfológicos e genéticos em em Astyanax sp.

I.2 MATERIAL E MÉTODOS

I.2.1 ÁREA DE ESTUDO

O presente projeto foi conduzido em uma área-piloto localizada na região

noroeste do Estado do Paraná, inserida na Fazenda Barbacena, município de São

Pedro do Ivaí, a RPPN Estadual Fazenda Barbacena, de propriedade de Jayme Watt

Longo (Figura 5). Segundo IBGE (2007), esta região está recoberta pela Floresta

Estacional Semidecidual, comunidade vegetal onde 20 a 50% dos indivíduos do

estrato arbóreo superior perdem as folhas na estação desfavorável, por condições

periódicas de seca ou frio.

Atualmente, esta cobertura vegetal encontra-se seriamente comprometida

pelas atividades agropecuárias ali desenvolvidas (MIKICH et al., 2002, MIKICH e

OLIVEIRA, 2003). O clima da região é do tipo Cfa, com tendência de concentração

das chuvas nos meses de verão e temperatura média do mês mais quente acima

dos 22°C e do mês mais frio abaixo dos 18°C (MIKICH e OLIVEIRA, 2003).

A RPPN Fazenda Barbacena foi criada em 2004 e preserva mata nativa de

Floresta Estacional Semidecidual. A área possui também importante papel na

preservação hidrográfica (Bacia do Ivaí) – (SEMA, 2007).

As atividades realizadas atualmente na área protegida abrangem turismo

ecológico, educação ambiental e pesquisa científica. A área é, hoje, administrada

pela empresa Vale do Ivaí. No entorno da RPPN há a produção de cana de açúcar,

também gerida pela empresa citada, a qual utiliza, periodicamente, diferentes tipos

de pesticidas recomendados para esse tipo de cultivo, em especial o glifosato e o

diuron.

A pulverização é realizada por maquinários específicos e eventualmente por

meio de pulverização manual.

Figura 5 - Esquema representativo da localização da RPPN Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí,

Paraná, Brasil.

I.2.2 DESENHO EXPERIMENTAL

Foram realizadas duas fases de campo, uma no mês de setembro de 2006

(final da seca) e outra no mês de março de 2007 (final da chuva), considerando que

a disponibilidade dos pesticidas no ambiente pode variar com a disponibilidade de

água, ou seja, nas diferentes estações pluviométricas, bastante característica da

Floresta Estacional da região trabalhada. Para a escolha das épocas de coleta

considerou-se, também, que os pesticidas nessa fazenda possuem aplicação

contínua (não há variação sazonal de aplicação), segundo informações fornecidas

pela gerência agrícola da empresa Vale do Ivaí. Os meses escolhidos, portanto,

representaram uma época final de cada estação pluviométrica, de seca e chuva.

Foram amostrados três pontos de um mesmo córrego da Fazenda

Barbacena, o córrego Itaubaté, o qual possui sua nascente na área produtiva da

fazenda (com plantio de cana) e cruza, posteriormente, toda a RPPN. O primeiro

ponto se localiza no tanque formado pelas nascentes do córrego, o segundo no

limite da área produtiva com a RPPN e o terceiro no interior da RPPN

(aproximadamente na zona núcleo da reserva) (Figuras 6 e 7).

Figura 6 - Imagens da RPPN e dos pontos de coleta na Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí,

Paraná. A: Vista da RPPN ao fundo, com plantio de cana em primeiro plano. B: Ponto de Coleta

“Cana de Açúcar”: tanque formado por nascentes na área de plantio. C: Ponto de Coleta “Entorno”. D:

Ponto de Coleta “RPPN”: córrego Itaubaté.

Figura 7 - Representação da RPPN e dos pontos de coleta na Fazenda Barbacena, São Pedro do

Ivaí, Paraná. Os pontos vermelhos identificam os pontos amostrais.

Foram coletados 30 indivíduos por ponto amostral, em ambas as coletas.

Primeiramente, os animais tiveram sua coluna secionada e, em seguida, foram

coletadas amostras de sangue (com o auxílio de um tubo capilar para hematócrito)

para confecção de extensão em lâmina (para realização do teste do micronúcleo).

Após secção ventral, retirou-se o fígado (para análises bioquímicas da CAT, GST e

LPO, além de avaliação histológica) e uma porção do músculo axial (para análise da

enzima AchE). Os indivíduos foram, então, armazenados em formol 4%, para

posterior identificação dos espécimes.

As amostras de fígado e músculo coletadas foram acondicionadas em

criotubos devidamente identificados e imediatamente congeladas em nitrogênio

líquido. Uma pequena porção do fígado de cada animal também foi fixada em

ALFAC e depois desidratada em álcool, para avaliação histológica.

As amostras obtidas foram encaminhadas aos laboratórios de Toxicologia

Ambiental do Departamento de Farmacologia, de Toxicologia Celular do

Departamento de Biologia Celular e de Mutagênese Ambiental do Departamento de

Genética da UFPR, para processamento e realização das análises abaixo descritas.

I.2.2.1 Modelo Biológico

Neste estudo foram utilizados lambaris Astyanax sp. A posição taxonômica

segundo Fink e Fink (1981) é Classe Osteichthyes; Superordem Osthariophysi;

Ordem Characiformes; Subordem Characioidea; Família Characidae. A identificação

dos espécimes foi realizada pelo Museu de História Natural Capão da Imbuia,

Curitiba, Paraná.

Os peixes da família Characidae geralmente apresentam uma nadadeira

caudal adiposa, são bons nadadores e incluem a maioria dos peixes de escamas

conhecidos no Brasil, como lambaris, piracanjubas, piranhas, dourados, etc.

(BRITSKI, 1988). O lambari é uma espécie nativa e largamente distribuída no

território brasileiro, sendo encontrado em grandes grupos habitando rios, lagos e

represas. O termo lambari é uma designação (nome popular) a quase 150 espécies,

de diferentes gêneros. Em outras regiões do Brasil, o lambari pode receber o nome

de Piaba ou Canivete.

O gênero Astyanax foi inicialmente proposto em 1854 e a revisão mais

recente, realizada por Lima et al. (2003) cita 86 espécies e algumas subespécies. Os

indivíduos do gênero Astyanax são peixes de escamas, de pequeno porte,

raramente ultrapassando 10 cm de comprimento total. Sua coloração é bastante

variada.

O gênero compreende adultos preferencialmente insetívoros, mas que

também consomem outros itens alimentares vegetais e animais (flores, frutos,

sementes, crustáceos, algas, detritos) (GASPAR DA LUZ e OKADA, 1999;

ANDRIAN, 2001). Grande representatividade numérica tem sido comum em estudos

envolvendo espécies do gênero Astyanax (UIEDA e BARRETO, 1999; ORSI et

al.,2004). Tal característica se dá pelo fato destas espécies apresentarem ciclos de

vida dinâmicos com elevado potencial reprodutivo e oportunismo trófico (FILHO e

BRAGA,1996), fato este interessante para o uso do gênero como modelo biológico

para diferentes estudos. Vale salientar, também, que esse gênero apresenta

comportamento reofílico, ou seja, realiza apenas curtas migrações reprodutivas

durante os períodos de maior precipitação, não variando muito sua ocorrência nas

diferentes faixas dos corpos hídricos (SUZUKI e AGOSTINHO, 1997). Por essas

características e por sua relativa facilidade de captura, o gênero Astyanax foi

escolhido como modelo nesse estudo.

Apesar dessas características, o grupo lambari passa eventualmente por

modificações em sua classificação taxonômica, o que pode dificultar, em alguns

casos, o seu uso como bioindicador. Muitas espécies do gênero Astyanax são

morfologicamente similares e por isso diferentes autores citam a formação de um

complexo do ponto de vista taxonômico (FERNANDES, 2004; MARTINS-SANTOS,

2004). Durante a coleta realizada em setembro de 2006, apareceram alguns

exemplares do lambari Bryconamericus sp. (no ponto localizado no entorno da

reserva). Esses exemplares foram retirados, após identificação do Museu, das

análises bioquímicas, morfológicas e genéticas, sendo utilizado apenas o gênero

Astyanax. Portanto, o número amostral nesse grupo sofreu variações.

I.2.2.2 Extração enzimática

As amostras de fígado armazenadas em freezer -70ºC (pool de 2 animais)

foram descongeladas em temperatura de 4˚C e homogeneizadas em tampão fosfato

0,1M, pH 6,5, com auxílio do homogeneizador automático Potter – Elvejhem, na

proporção 1:10 (peso do tecido / volume do tampão). O homogeneizado utilizado

como fonte de enzimas foi obtido pela centrifugação a 10000 x g a 4°C, por 30

minutos. O sobrenadante (fração S9) foi aliquotada para análise da GST, CAT, LPO

e para dosagem de proteína.

Glutationa-S-transferase (GST):

O método baseia-se no trabalho proposto por HABIG et al. (1974) e HABIG e

JAKOBY (1981). As GSTs catalisam a reação de conjugação do substrato CDNB

com a GSH, formando um tioéter que pode ser monitorado pelo aumento de

absorbância, através da leitura em microplacas.

O sobrenadante resultante da centrifugação foi diluído na proporção 1:10

(volume/volume) em tampão fosfato 0,1M pH6,5, e 100

µl deste foi pipetado nas

microplacas. Em seguida, foram adicionados 200 µl de solução reação (CDNB 2,5

mM, GSH 2 mM em tampão fosfato 0,1M pH6,5), para realização imediata da leitura

(quatro réplicas de cada amostra). O aumento linear da absorbância, a 340nm, foi

monitorado e a atividade foi expressa em nmoles de conjugado GSH-CDNB

produzido por minuto, por miligrama de proteína, em espectrofotômetro de

microplaca Sunrise – TECAN.

Catalase (CAT):

Para a atividade da Catalase, o sobrenadante resultante da centrifugação foi

diluído na proporção 1:5 (volume/volume) em tampão fosfato 0,1M pH6,5. As

amostras de enzima foram pipetadas em cubetas de quartzo (10µl). Em seguida,

foram adicionados 990 µl de solução reação 20mM (Tampão Tris 1 M / EDTA 5mM

pH 8,0, peróxido de hidrogênio 30% e água milli-q, em concentrações específicas e

mantida em banho-maria a 25°C). Foram lidas três ré plicas de cada amostra.

O método consiste em mensurar a atividade da catalase através do consumo

de peróxido de hidrogênio exógeno, gerando oxigênio e água, através de

espectofotometria (AEBI, 1984). O aumento linear da absorbância foi monitorado em

espectrofotômetro (Ultrospec 2000, UV/Visible - Pharmácia Biotec), a 240 nm, por 1

minuto a cada 15 segundos. A atividade enzimática foi expressa em µmol.min

-1

.mg

proteína

-1

Lipoperoxidação Lipídica (LPO):

A análise da LPO baseia-se no método descrito por Jiang et al. (1991; 1992) e

Hermes Lima et al. (1995). A determinação da lipoperoxidação foi feita segundo o

ensaio Laranja de Xilenol ou Ensaio FOX modificado, que tem por princípio a rápida

oxidação do Fe

mediada por peróxidos sob condições ácidas e posterior formação

do complexo Fe

- laranja de xilenol (fonte de absorção de luz), na presença do

estabilizador hidroxitolueno butilato (BHT).

O sobrenadante inicial foi ressuspendido em metanol PA na proporção 1:2

(volume/volume), sonicado durante 1 minuto e centrifugado 10 minutos a 10000 x g

a 4ºC. Em seguida, 30 µl do sobrenadante dessa última centrifugação foi pipetado

em microplacas e incubado por cerca de trinta minutos, com 270 µl de solução

reação (metanol 90%, ácido sulfúrico (H

)

25mM, BHT 4mM, sulfato ferroso

amoniacal 250 µM, e laranja de xilenol 1mM). A leitura foi realizada em

espectrofotômetro de microplacas, a 570 nm. O resultado foi expresso em

equivalentes de CHP (concentração de hidroperóxido) pela quantidade de proteína

encontrada na amostra (nmol.mgproteína

-1

Acetilcolinestarase (AchE):

Foi preparada uma diluição de cada amostra de músculo 10% (peso do

tecido/volume do tampão) em tampão fosfato (0,1 M; pH 7,50). 50 µl da fonte de

enzima foi pipetada em microplaca, com 200 µl de DTNB (0,75 mM) e 50 µl de ATC

(iodeto de acetiltiocolina 9mM). Foram lidas três réplicas de cada amostra.

A atividade da AchE foi medida segundo o método Ellman et al. (1961),

modificado para microplaca por Silva de Assis (1998). O substrato, iodeto de

acetiltiocolina, é hidrolizado pela enzima, liberando tiocolina e acetato. A tiocolina

reage com o íon 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoato) para produzir o ânion amarelo 5-tio-2-

nitrobenzoato.

A absorbância foi medida a 405 nm, em espectrofotômetro de microplaca,

Sunrise – TECAN. Os resultados foram expressos em nmol.min

-1

.mgproteína

-1

Concentração protéica:

Os dados das atividades enzimáticas foram normalizados pelas respectivas

concentrações protéicas totais, quantificadas pelo método de Bradford (1976),

utilizando-se soro albumina como padrão. A leitura foi realizada em

espectrofotômetro de microplaca (Sunrise – TECAN).

I.2.2.3 Histopatologia de fígado

Para análise histopatológica, amostras de fígado foram fixadas em ALFAC por

16 horas (álcool 80%, formol 40% e ácido acético glacial). Em seguida, foram

armazenadas em álcool e transportadas para o laboratório de Toxicologia Celular da

UFPR, para preparação das lâminas histológicas.

Em laboratório, as amostras foram desidratadas em série crescente de

álcoois: 1 hora em 80%, 1 hora em 90%, 1 hora em 95%, 1 hora em 100% e 30

minutos em 100%. O material foi diafanizado utilizando-se xilol PA e álcool 100% na

proporção 1:1 durante 1 hora, em seguida xilol PA por mais 1 hora. A inclusão foi

realizada em paraplast plus a 56ºC por 2 horas. Para a microtomia, os blocos foram

mantidos em freezer por 15 minutos, a fim de facilitar a obtenção dos cortes. Os

cortes foram, então, fixados em lâminas com albumina 1% e distendidos sobre uma

chapa quente.

Os cortes foram corados com Hematoxilina de Harris e Eosina 1%. Para o

processo de coloração, as lâminas foram diafanizadas em xilol (dois banhos de 5

minutos cada), em seguida, hidratadas em série decrescente de álcoois (5 minutos

em álcool 100%, 90% e 70%), imersas em água destilada e então coradas. Após

coloração, as lâminas foram novamente diafanizadas com xilol e finalmente

montadas com resina e lamínula.

As características morfológicas foram analisadas através de microscopia de

luz, sendo o índice das lesões calculado segundo Bernet et al. (1999). Os resultados

foram gravados em imagens digitalizadas através do fotomicroscópio Axiophot Zeiss.

I.2.2.4 Teste do Micronúcleo Písceo

Para a realização do teste do micronúcleo foram coletadas amostras de

sangue dos lambaris, para confecção de extensão em lâmina de vidro, conforme

técnica descrita por Heddle (1973). O sangue foi coletado com o auxílio de um tubo

capilar heparinizado para hematócrito, sendo a amostra depositada imediatamente

em lâmina de vidro para a realização do esfregaço, feito logo em seguida. Após a

lâmina secar por 5 minutos, o material foi fixado em etanol PA (Merck®) durante 30

minutos.

Após fixação, as lâminas foram coradas com Giemsa 5%, diluída em tampão

fosfato pH 8,6, por 10 minutos. As lâminas foram, então, analisadas em microscopia

ótica, para identificação e quantificação de micronúcleos e núcleos com formas

alteradas (teste cego para contabilização total de alterações nucleares em 2000

hemácias periféricas por lâmina). Foram consideradas como micronúcleos as

partículas que se encontravam nitidamente separadas no núcleo principal, sem

exceder 1/3 do seu tamanho, com bordas visíveis e com mesma cor e refringência

do núcleo. As alterações de forma elíptica nucleares que não se enquadraram no

conceito do micronúcleo foram, então, descritas como alterações morfológicas

nucleares (CARRASCO et al.,1990), sendo computadas de forma conjunta e não

como alterações específicas.

I.2.3 ANÁLISE ESTATÍSITCA

Os resultados dos experimentos bioquímicos foram analisados por Anova de

uma via, seguida da Prova de Tukey para comparação entre os grupos. Também

foram comparadas as amostras coletadas em um mesmo ponto nas fases de seca

(setembro de 2006) e de chuva (março de 2007) a partir da realização do Teste de

Mann-Whitney.

Para comparação dos índices histopatológicos e das alterações nucleares, os

resultados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância

adotado para os testes foi de 5%.

I.3 RESULTADOS

I.3.1 Atividade da Glutationa S-Transferase

Não foi observada diferença da atividade da GST nos pontos localizados na

área de plantio de cana de açúcar (média ± erro padrão / 72,9±6,8 nmol.min

-1

.mg

proteína

-1

), no entorno da área protegida (83,5±4,8) e no interior da RPPN

(73,9±14,5) para as amostras coletadas em setembro de 2006 (após época de

seca). Na coleta de março de 2007 (após época de chuva), contudo, foi verificado

um aumento da atividade da GST, expressa em nmol.min

-1

.mg proteína

-1

, no entorno

da reserva (média ± erro padrão / 186,5±7,6), quando comparada à região de plantio

de cana de açúcar (145,2±6,9; p<0,05), como é possível observar na Figura 8.

Figura 8 - Atividade específica (AE) da GST (nmol.min

-1

.mg proteína

-1

) no fígado de Astyanax sp., nos

grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN. Os resultados expressam média±erro padrão. Nível de

significância adotado p<0,05. A: Coleta de setembro de 2006, n=15 para os pontos localizados na

cana de açúcar e RPPN; n=9 para o ponto localizado no entorno. B: Coleta de março de 2007. Letras

diferentes expressam grupos estatisticamente diferentes (p<0,05; n=15).

I.3.2 Atividade da Catalase

Para a CAT foi observada uma indução da expressão enzimática na coleta

realizada em setembro de 2006 (média ± erro padrão), expressa em µmol.min

-1

.mg

proteína

-1

, no grupo coletado no interior da RPPN (616,1±52,0), quando comparado

Cana Açúcar Entorno RPPN

100

150

200

a a

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

GST Setembro 2006

Cana Açúcar Entorno RPPN

100

150

200

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

GST Março 2007

ao ponto localizado na cana de açúcar (240,5±9,1; p<0,05) e entorno (246,3±8,5;

p<0,05). Não foi observada, porém, diferença da atividade da CAT nos pontos

localizados na área de plantio de cana de açúcar (469,3±41,88), no entorno da área

protegida (536,7±19,83) e no interior da RPPN (461,8±52,9) nas amostras coletadas

em março de 2007, conforme indica a Figura 9.

Figura 9 - Atividade específica (AE) da CAT (µmol.min

-1

.mg proteína

-1

) no fígado de Astyanax sp, nos

grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN. Os resultados expressam média±erro padrão. Nível de

significância adotado p<0,05. A: Coleta de setembro de 2006. Letras diferentes expressam grupos

estatisticamente diferentes (p<0,05; n=15 para os pontos localizados na cana de açúcar e RPPN; n=9

para o ponto localizado no entorno). B: Coleta de março de 2007, n=15.

I.3.3 Lipoperoxidação

Foi verificada diferença na LPO na coleta de setembro de 2006 (nmol.mg

proteína

-1

) do grupo coletado no entorno da área protegida (média ± erro padrão /

2,03±0,23) quando comparado ao interior da RPPN (0,69±0,17; p<0,05) e à área de

cana de açúcar (0,73±0,11; p<0,05). Na coleta de março de 2007, esse mesmo

ponto, o entorno, também apresentou diferença da LPO (média ± erro padrão /

4,33±0,30) em relação aos demais pontos (RPPN: 2,3±0,24; p<0,05 e área com

cana: 3,2±0,27; p<0,05), conforme indica a Figura 10.

Cana Açúcar Entorno RPPN

100

200

300

400

500

600

700

AE µmol.min

-1

.mg proteínas

-1

CAT Setembro 2006

Cana Açúcar Entorno RPPN

100

200

300

400

500

600

700

AE µmol.min

-1

.mg proteínas

-1

CAT Março 2007

Figura 10 - Concentração de hidroperóxidos (CP) (nmol.mg proteína

-1

) no fígado de Astyanax sp, nos

grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN. Os resultados expressam média±erro padrão. Nível de

significância adotado p<0,05. Letras diferentes expressam grupos estatisticamente diferentes. A:

Coleta de setembro de 2006, p<0,05; n=15 para os pontos localizados na cana de açúcar e RPPN;

n=9 para o ponto localizado no entorno. B: Coleta de março de 2007, p<0,05; n=15.

I.3.4 Atividade da Acetilcolinesterase

Não foi observada alteração da atividade da AchE (expressa em nmol.min

.mg proteína

-1

) nos pontos localizados na área de plantio de cana de açúcar

(164,3±11,2), no entorno da área protegida (189,5±6,2) e no interior da RPPN

(174,8±4,6) nas amostras coletadas em setembro de 2006; e nesses mesmos

pontos na coleta de março de 2007 (Cana de açúcar: 405,1±19,8; Entorno:

339,0±10,7 e RPPN: 361,5±33,9), conforme indica a Figura 11.

Figura 11 - Atividade específica (AE) da AchE (nmol.min

-1

.mg proteína

-1

) no músculo de Astyanax sp,

nos grupos Cana de Açúcar, Entorno e RPPN. Os resultados expressam média±erro padrão. Nível de

significância adotado p<0,05. A: Coleta de setembro de 2006, n=15 para os pontos localizados na

cana de açúcar e RPPN; n=9 para o ponto localizado no entorno. B: Coleta de março de 2007, n=15.

Cana Açúcar

Entorno RPPN

LPO Setembro 2006

CP nmol.mg proteínas

-1

Cana Açúcar Entorno RPPN

LPO Março 2007

CP nmol.mg proteínas

-1

Cana Açucar

Entorno RPPN

100

200

300

400

500

AE nmol.min

-1

mg.prot

-1

AchE Setembro 2006

Cana Açucar Entorno RPPN

100

200

300

400

500

AchE Março 2007

AE nmol.min

-1

mg.prot

-1

I.3.5 Comparação entre época chuvosa e época de seca

Segundo a SIMEPAR (Sistema Metereológico do Paraná), a precipitação

acumulada obtida para a região durante os meses de estudo (set/06 a mar/07) foi de

1163,6 mm. Os meses que antecederam a coleta no início de setembro de 2006

representaram a época de maior seca (total de 85,8 mm de maio a agosto de 2006)

e os meses que antecederam a coleta de março de 2007 representaram a época de

concentração de chuvas (total de 692,8 mm de dezembro de 2006 a fevereiro de

2007). Esses dados caracterizam, portanto, o clima do tipo Cfa ou Sub-tropical

Úmido Mesotérmico, com tendência de concentração das chuvas até o fim do verão

e seca até o fim do inverno, o que justifica a escolha dos períodos para coleta.

Na comparação dos dados para as diferentes épocas do ano foi verificado

aumento da atividade da GST (nmol.min

-1

.mg proteína

-1

) em todos os pontos de

coleta quando comparados dois a dois, nos diferentes períodos de coleta (média ±

erro padrão / seca x chuva): (1) Cana de Açúcar Seca: 72,4±6,8 / Cana de Açúcar

Chuva: 148,8±6,9; p<0,05; (2) Entorno Seca: 78,8±4,8 / Entorno Chuva: 179,0±7,7;

p<0,05 e (3) RPPN Seca: 70,5±9,8 / RPPN Chuva: 165,1±8,9; p<0,05, como é

possível observar na Figura 12.

Nessa figura observa-se, também, a diferença da atividade da CAT (µmol.min

.mg proteína

-1

) quando realizada a mesma comparação entre os pontos, em épocas

de seca e chuva. No ponto localizado no interior do plantio de cana e no entorno da

reserva houve aumento da CAT na coleta realizada na chuva (Cana de Açúcar Seca:

234,2±9,1 / Cana de Açúcar Chuva: 521,8±32,5; p<0,05; Entorno Seca: 245,6±8,5 /

Entorno Chuva: 518,7±19,8; p<0,05), enquanto que no ponto localizado na RPPN

houve um decréscimo na atividade (RPPN Seca: 646,2±36,6 / RPPN Chuva:

462,3±21,2; p<0,05).

Figura 12 - Atividade específica da GST (nmol.min

-1

.mg proteína

-1

) e CAT (µmol.min

-1

.mg proteína

-1

)

em Astyanax sp, nos diferentes pontos amostrais (Cana de Açúcar, Entorno e RPPN), nas diferentes

épocas de coleta (seca/setembro 2006 e chuva/março 2007), n=15. Os resultados expressam

média±erro padrão. Letras diferentes expressam grupos estatisticamente diferentes (p<0,05).

Foi verificado, ainda, aumento da atividade da AchE (nmol.min

-1

.mg proteína

) em todos os pontos de coleta quando comparados dois a dois, nos diferentes

períodos de coleta (média ± erro padrão / seca x chuva): (1) Cana de Açúcar Seca:

172,7±11,2 / Cana de Açúcar Chuva: 420,2±19,2; p<0,05; (2) Entorno Seca:

192,2±6,2 / Entorno Chuva: 344,6±10,8; p<0,05 e (3) RPPN Seca: 174,8±4,6 /

RPPN Chuva: 342,0±25,9; p<0,05, como é possível observar na Figura 13.

Cana/seca Cana/chuva

200

400

600

800

CAT

mol.min

-1

.mg prot

-1

Entorno/seca Entorno/chuva

200

400

600

800

CAT

mol.min

-1

.mg prot

-1

RPPN/seca RPPN/chuva

200

400

600

800

CAT

mol.min

-1

.mg prot

-1

Cana/seca Cana/chuva

100

150

200

250

GST

Seca

Chuva

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

Entorno/seca Entorno/chuva

100

150

200

250

GST

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

RPPN/seca RPPN/chuva

100

150

200

250

GST

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

Nessa figura observa-se, também, o aumento da concentração de

hidroperóxido (nmol.mg proteína

-1

) em todos os pontos de coleta quando

comparados dois a dois, nos diferentes períodos de coleta: (1) Cana de Açúcar

Seca: 0,60±0,06 / Cana de Açúcar Chuva: 3,2±0,2; p<0,05; (2) Entorno Seca:

1,9±0,2 / Entorno Chuva: 4,5±0,3; p<0,05 e (3) RPPN Seca: 0,61±0,09 / RPPN

Chuva: 2,5±0,2; p<0,05.

Figura 13 - Atividade específica da AchE (nmol.min

-1

.mg proteína

-1

) e concentração de hidroperóxido

(nmol.mg proteína

-1

) em Astyanax sp, nos diferentes pontos amostrais (Cana de Açúcar, Entorno e

RPPN), nas diferentes épocas de coleta (seca/setembro 2006 e chuva/março 2007), n=15. Os

resultados expressam média±erro padrão. Letras diferentes expressam grupos estatisticamente

diferentes (p<0,05).

Cana/seca Cana/chuva

100

200

300

400

500

AchE

Seca

Chuva

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

Entorno/seca Entorno/chuva

100

200

300

400

500

AchE

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

RPPN/seca RPPN/chuva

100

200

300

400

500

AchE

AE nmol.min

-1

.mg prot

-1

Cana/seca Cana/chuva

LPO

CP nmol.mg prot

-1

Entorno/seca Entorno/chuva

LPO

CP nmol.mg prot

-1

RPPN/seca RPPN/chuva

LPO

CP nmol.mg prot

-1

I.3.6 Histopatologia de Fígado

As lesões encontradas no fígado estão demonstradas na Tabela 2 e nas

Figuras 14 e 15. A Figura 14A mostra a estrutura normal do tecido hepático do

Astyanax sp., que apresenta vasos de diferentes tamanhos distribuídos por todo o

parênquima hepático e é observado o tecido pancreático, característica essa comum

nos teleósteos. Em todos os pontos amostrais (Cana-de-açúcar, Entorno e RPPN),

em ambas as estações (setembro/seca e março/chuva) foram identificadas lesões

como alterações nucleares (Figura 14B), vacuolização citoplasmática (Figura 14D),

infiltrações leucocitárias (Figura 15A), diferenciação do tecido e presença de

melanomacrófagos livres (Figura 15D). Foram identificados, também, parasitas

(Figura 15B e 15C). Necrose foi a lesão mais evidente em todos os pontos amostrais

(Figura 14C).

TABELA 2 – FREQUÊNCIA DE OCORRÊNCIA DE LESÕES EM FÍGADO DE Astyanax sp.

COLETADOS EM SETEMBRO DE 2006 E MARÇO DE 2007, FAZENDA BARBACENA, SÃO PEDRO

DO IVAÍ, PR

Lesão Cana/06 Entorno/06 RPPN/06 Cana/07 Entorno/07 RPPN/07

Setembro Março

Melanomacrófago

Livre

4 (13) 11 (14) 15 (15) 8 (14) 13 (14) 7 (14)

Centro de

Melanomacrófago

1 (13) 1 (14) 0 (15) 0 (14) 0 (14) 0 (14)

Infiltração

Leucocitária

5 (13) 2 (14) 2 (15) 4 (14) 1 (14) 5 (14)

Necrose 12 (13) 14 (14) 15 (15) 12 (14) 12 (14) 11 (14)

Neoplasia 1 (13) 1 (14) 0 (15) 0 (14) 0 (14) 0 (14)

Vacúolo 1 (13) 1 (14) 3 (15) 0 (14) 0 (14) 0 (14)

Diferenciação do

Tecido

2 (13) 2 (14) 0 (15) 3 (14) 4 (14) 0 (14)

Alteração Nuclear 0 (13) 0 (14) 0 (15) 0 (14) 0 (14) 2 (14)

NOTA: ( ) = Número de indivíduos analisados.

Figura 14 - Cortes histológicos de fígado de Astyanax sp. coletados em corpos hídricos da Fazenda

Barbacena, São Pedro do Ivaí, PR. Coloração em Hematoxilina e Eosina. A: estrutura normal do

tecido hepático. Seta (→) indica tecido pancreático e (↔) indica vasos sanguíneos (Barra = 50 µm).

B: setas indicam alterações nucleares (Barra = 10 µm). C: setas indicam áreas de necrose (Barra =

20 µm). D: setas apontam para a presença de vacuolização citoplasmática (Barra = 20 µm).

Figura 15 - Cortes histológicos de fígado de Astyanax sp. coletados em corpos hídricos da Fazenda

Barbacena, São Pedro do Ivaí, PR. Coloração em Hematoxilina e Eosina. A: setas indicam áreas de

infiltração leucocitária (Barra = 10 µm). B: setas indicam parasitas no tecido (Barra = 10 µm). C: seta

indica um parasita (Barra = 20 µm). D: setas apontam para a presença de melanomacrófagos em

tecido caracterizado por diferenciação tecidual e infiltração de células sangüíneas (Barra = 20 µm).

Na comparação do índice de lesão entre os pontos amostrais, calculado com

base em Bernet et al. (1999), foi encontrada diferença entre os pontos Cana-de-

Açúcar e RPPN, com um aumento desse índice na área preservada, na coleta

realizada em setembro de 2006, como é possível observar na Figura 16 A. Essa

mesma figura mostra, no entanto, que na coleta de março de 2007 não houve

diferença entre os pontos de coleta (Figura 16 B). Na comparação dos dados para

as diferentes épocas do ano foi verificado aumento do índice na época de seca, nos

indivíduos coletados no entorno da reserva e na RPPN (Figura 17).

A B

C D

Figura 16 – Índice de Lesão histopatológica em fígado de Astyanax sp., nos grupos Cana de Açúcar,

Entorno e RPPN. Nível de significância adotado p<0,05. A: Coleta de setembro de 2006, n=13. B:

Coleta de março de 2007, n=13. Letras diferentes expressam grupos estatisticamente diferentes.

Figura 17 - Índice de Lesão histopatológica em fígado de Astyanax sp., nos grupos Cana de Açúcar,

Entorno e RPPN, nas diferentes épocas de coleta (seca/setembro 2006 e chuva/março 2007). Letras

diferentes expressam grupos estatisticamente diferentes (n=13, p<0,05).

Histopatologia de Fígado -

Setembro 2006

Cana Entorno RPPN

a,b

Índice de Lesão

Histopatologia de Fígado -

Março 2007

Cana Entorno RPPN

Índice de Lesão

Histopatologia de Fígado

Cana/seca Cana/chuva

a a

Seca

Chuva

Índice de lesão

Entorno/seca Entorno/chuva

Índice de lesão

RPPN/seca RPPN/chuva

Índice de lesão

I.3.7 Teste do Micronúcleo Písceo

Na contagem de alterações morfológicas nucleares e micronúcleos em

eritrócitos do Astyanax sp. não foi encontrada diferença entre os pontos cana-de-

açúcar, entorno e RPPN na coleta realizada em setembro de 2006, como é possível

observar na Figura 18 A. Porém, a Figura 18 B mostra que na coleta realizada em

março de 2007 houve diferença entre o entorno e os demais pontos.

Figura 18 – Alterações nucleares e micronúcleos em eritrócitos de Astyanax sp., nos grupos Cana de

Açúcar, Entorno e RPPN. Nível de significância adotado p<0,05. A: Coleta de setembro de 2006,

n=15. B: Coleta de março de 2007, n=15. Letras diferentes expressam grupos estatisticamente

diferentes.

A Figura 19 apresenta as principais alterações nucleares e a presença de

micronúcleos em exemplares de Astyanax sp. coletados nesse estudo.

Alterações Nucleares

Março 2007

Cana Entorno RPPN

Mediana

Alterações Nucleares

Setembro 2006

Cana Entorno RPPN

Mediana

Figura 19 – Eritrócitos de Astyanax sp. coletados na Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí, PR.

Coloração em Giemsa 10%. A: estrutura normal dos núcleos dos eritrócitos (Barra = 10 µm). B e C:

setas indicam alterações nucleares (Barra em B = 10 µm e Barra em C = 50 µm). D: seta aponta para

um eritrócito com um micronúcleo (Barra = 50 µm).

A B

C D

I.4 DISCUSSÃO

Os danos causados por efluentes nos ecossistemas aquáticos vêm sendo

estudados mais intensamente ao longo dos últimos 20 anos, especialmente pela

intensificação das ações antrópicas consideradas impactantes. Entretanto, ainda a

maior parte da bibliografia disponível detecta a presença de pesticidas nos tecidos

dos peixes através de exames químicos, havendo, comparativamente, poucas

referências sobre análises com biomarcadores bioquímicos, morfológicos e

genéticos. Além disso, poucos estudos envolvem análises de mais de um

biomarcador em monitoramento de campo, que representa, geralmente, exposição

múltipla a diversos tipos de pesticidas.

A exposição de organismos a contaminantes ambientais indica interações

entre essas substâncias químicas e os sistemas biológicos, interações essas, que

podem resultar em distúrbios bioquímicos e/ou respostas adaptativas dos

organismos (MASFARAUD et al., 1992). Na maioria das vezes, os processos

metabólicos de biotransformação de fase I e fase II são necessários para

desintoxicação e excreção desses compostos em animais aquáticos (GOKSOYR e

FÖURLIN, 1992).

Apesar da dificuldade de muitas vezes se avaliar e mensurar os efeitos

específicos de misturas químicas nesses ambientes, recentemente tem-se dado

ênfase aos estudos com diversos contaminantes, uma vez que os organismos estão

de fato expostos a misturas complexas de compostos (OLGUN et al., 2004), as quais

podem agir aditivamente, sinergicamente, potencialmente ou antagonicamente nos

organismos (KÖNEMANN, 1981).

A indução da atividade da GST verificada na coleta de março de 2007, no

ponto localizado no entorno quando este é comprado com os demais pontos de

coleta, sugere um aumento do metabolismo dos animais, no intuito de

desintoxicação, conseqüência provável da exposição aos herbicidas locais.

Vale ressaltar que não apenas o entorno parece estar sujeito a alterações

ambientais, mas também a área de plantio de cana e a RPPN, considerando as

diferenças verificadas na atividade da GST (e das outras enzimas estudadas nesse

trabalho) quando comparadas as épocas de seca e de chuva. Compostos

carcinogênicos, pesticidas e compostos secundários reativos podem ser eliminados

via glutationização (Van Der Oost et al., 2003). A indução da GST em relação à

exposição a pesticidas já foi citada na literatura, como mostram os trabalhos de

Egaas et al. (1999); Cho et al. (1999) e Jonsson et al. (2001).

O aumento da atividade da GST também foi reportado para o peixe de água

doce Leuciscus albumoides, inserido em áreas com diferentes perfis de

contaminação (LOPES et al., 2001). A conclusão desses autores para a análise da

GST é que a atividade enzimática aumentada pode estar indicando uma tentativa de

adequação metabólica no caso de exposições contínuas a contaminantes. No caso

do presente estudo, essa argumentação poderia explicar a indução da GST vista no

ponto localizado no entorno da reserva, que após as chuvas passa a receber um

maior volume de água dos demais tanques existentes na fazenda, o que pode

acarretar em aumento da lixiviação dos pesticidas para esse tanque amostrado.

Em alguns casos também, dependendo da concentração e tipo de

contaminantes, a biotransformação de xenobióticos pode envolver reações de

oxidação, produzindo espécies ativas de oxigênio. Essas ERO ativam sistemas de

defesa antioxidante, sendo que a atividade da enzima GST pode ser indiretamente

associada ao estresse oxidativo, uma vez que ela utiliza como co-fator a GSH, e

este também participa da degradação do peróxido de hidrogênio (H

) através da

atuação da enzima Glutationa peroxidase (GPx) (TEW e RONAI, 1999).

O aumento da GST verificado após essa época de concentração de chuvas

na região poderia, portanto, indicar ainda uma relação de desequilíbrio no sistema

antioxidante dos animais coletados. A GST, tendo sido descrita por alguns autores

(HAYES e MCLELLAN, 1999; PASTORE et al., 2003) como agente pró-oxidante,

catalisando a conjugação da GSH com xenobiontes, pode estar, então, indicando

uma situação de estresse oxidativo nos lambaris. Segunda Xia et al. (1996), a

expressão da GST é regulada pelo estado redox da célula, atuando como um sensor

da variação desse estado (ADLER et al. 1999).

A indução da GST também já foi reportada em Lemma minor exposta ao

diuron (TEISSEIRE e VERNET, 2000), sendo que os autores relacionam esse

aumento a uma situação de estresse oxidativo. A atividade da GST e o herbicida

diuron têm sido relacionados em diferentes estudos, com diferentes bioindicadores

(NIEDERER et al., 2001; BARATA et al., 2006). Silva (2004) verificou, ainda, indução

da GST em Astyanax sp. residentes em corpos hídricos de áreas de cultivo de arroz

e de áreas naturais vizinhas, com interferência de diferentes classes de pesticidas.

Essa modificação oxidativa nos peixes pode afetar uma grande variedade de

funções celulares, envolvendo proteínas, e pode contribuir para a ocorrência de

danos secundários a outras biomoléculas, como ao DNA e às membranas celulares

(EVANS et al., 1999). No caso do dano de lipoperoxidação avaliado no presente

estudo, nesse mesmo ponto de coleta, o entorno entre as áreas de plantio de cana e

a RPPN (ponto com a indução da GST), o aumento na concentração de

hidroperóxidos lipídicos foi visto em ambas as coletas (época de seca e chuva).

Variações nos níveis de lipoperoxidação vêm sendo apresentadas como uma

resposta eficiente na exposição a poluentes em organismos aquáticos (THOMAS e

WOFFORD, 1993; REMEO e GNASSIA-BARELLI, 1997; SRIDEVI et al., 1998).

Wilhelm Filho et al. (2001) também demonstraram a eficiência da avaliação da

lipoperoxidação como biomarcador de estresse oxidativo em espécies neotropicais

de água doce, expostas a diversas classes de contaminantes.

Um estudo conduzido no México (TEJEDA-VERA et al., 2007), em um rio que

recebe efluentes da produção de cana-de-açúcar, mostrou aumento nos níveis de

LPO em Ameca splendens e Goodea atripinnis, relacionados com os pesticidas

aplicados nessa produção, em especial o diuron, o que corrobora a ação negativa

desse herbicida sobre os grupos de Astyanax sp. estudados nesse trabalho.

Outros estudos também revelaram um aumento na concentração de

hidroperóxidos em fígado de organismos expostos a diversos contaminantes,

inclusive misturas de pesticidas (LIVINGSTONE et al., 1993; DI GIULIO et al., 1993).

Segundo Acworth e Bailey (1995), quando os ácidos graxos são peroxidados,

eles tornam-se mais hidrofílicos, perturbando as funções normais da membrana, seja

a membrana plasmática ou as membranas de organelas como mitocôndrias e

lisossomos. Desse modo, a peroxidação lipídica traz conseqüências sérias às

células. Os hidroperóxidos lipídicos formados durante a LPO podem interagir com

outros ácidos graxos, principalmente os poliinsaturados, gerando uma cadeia

autocatalítica de peroxidação lipídica, a qual pode levar à modificação estrutural das

membranas biológicas (ABUJA e ALBERTINI, 2001). Considerando que a

integridade das membranas biológicas é indispensável para a regulação de muitos

processos celulares, sua alteração pode comprometer importantes parâmetros como

a fluidez, a permeabilidade, o potencial elétrico e o transporte celular (KÜHN e

BORCHERT, 2002), acarretando em danos irreversíveis (STRMAC e BRAUNBECK,

2002), como a formação de alterações morfológicas nucleares.

Esse mesmo ponto de coleta, o entorno da área protegida com a área

produtiva, apresentou também na coleta de março de 2007, ou seja, após época de

chuva, aumento no número de alterações nucleares, incluindo a formação de

micronúcleos, fato este que pode estar relacionado com a alteração na concentração

de hidroperóxidos citada acima, considerando que os danos ao DNA podem estar

diretamente associados à produção de espécies reativas de oxigênio. Como já

comentado, estas moléculas altamente reativas são conhecidas por atuarem sobre a

estrutura de macromoléculas celulares como proteínas e ácidos nucléicos (EVANS

et al., 1999).

A fragmentação do DNA sob condições com aumento da produção de ERO

pode ocorrer por dois mecanismos: (1) radicais livres lipídicos produzidos a partir

dos ácidos graxos poliinsaturados (tanto na membrana plasmática quanto nuclear)

podem diretamente acometer o DNA presente na cromatina do núcleo e/ou (2) a

lipoperoxidação em uma célula causa a perda da integridade da membrana celular e

pode tornar o ambiente favorável à interferência no DNA por outros tipos de radicais

de oxigênio. O radical hidroxila pode inicialmente causar quebra da fita simples do

DNA e, posteriormente, levar a quebra da fita dupla (HIGUCHI, 2003).

Danos nucleares e a formação de micronúcleos também foram vistos por Rao

et al. (1997) e Ayllon e Garcia-Vazquez (2003) com a exposição de peixes a

diferentes contaminantes ambientais. Minissi et al. (1996) também validam a

utilização do micronúcleo em peixes como ferramenta eficaz no monitoramento de

ambientes naturais.

Heddle et al. (1991) destacam que a formação de micronúcleos é uma

resposta a curto prazo frente a uma substância genotóxica, de modo que a sua

expressão depende da intensidade da exposição ao contaminante e provavelmente

independe da duração de tal exposição. Minissi et al. (1996) também mostram que o

teste de micronúcleo em eritrócitos de peixes é indicativo de danos de curto prazo,

uma vez que podem desenvolver a capacidade de recuperação, fato este observado

com o deslocamento dos peixes do sítio contaminado para local controlado. Essas

observações podem indicar que após uma época de concentração de chuvas os

danos genotóxicos dos compostos utilizados na lavoura de cana-de-açúcar se

acentuam e são detectáveis pela técnica de contagem de alteração nuclear utilizada

no presente estudo.

Por outro lado, nem todos os compostos que induzem a formação de

micronúcleos são clastogênicos. Segundo Heddle et al. (1991), essas alterações

nucleares podem ser resultante de uma não disjunção do fuso a partir de chamados

“contaminantes do fuso”. Desse modo, seriam necessários estudo mais específicos

para elucidar os mecanismos pelos quais os peixes coletados tiveram a formação de

micronúcleos e aparecimento de outras alterações nucleares.

Em relação à CAT, foi visualizada uma indução da atividade enzimática no

ponto localizado no interior da RPPN, na coleta de setembro de 2006 (final da seca).

O aumento da atividade específica da CAT também tem sido relatado como

indicador de estresse oxidativo (VAN DER OOST et al., 2003). Este aumento sugere

uma defesa do organismo na tentativa de eliminar espécies reativas de oxigênio,

formadas principalmente durante o metabolismo de compostos químicos.

O termo “estresse oxidativo” denota, portanto, um desequilíbrio entre a

produção de agentes pró-oxidantes e os respectivos sistemas de defesa

antioxidantes de uma célula ou organismo (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; CUI

et al., 2004). Esse desequilíbrio favorece, conseqüentemente, o estabelecimento de

um ambiente mais oxidante que o normal. As ERO geradas durante o metabolismo

oxidativo possuem um limiar de tolerância bastante estreito em todos os organismos

aeróbicos (TEW e RONAI, 1999). Elas reagem com vários aminoácidos, o que

favorece o aparecimento de enzimas modificadas ou com suas atividades alteradas

(BUTTERFIELD et al., 1998). Apesar de não esperada uma contaminação no ponto

RPPN, por se tratar da área protegida, parece que os lambaris Astyanax sp.

ativaram esse sistema de defesa antioxidante (CAT) para restabelecer o balanço

redox após uma possível contaminação do meio aquático.

Em ambientes aquáticos, aumento nas atividades de enzimas relacionadas à

defesa antioxidante, incluindo a CAT, já foram demonstrados por diversos autores,

em diferentes estudos em peixes (LEMAIRE e LIVINGSTONE, 1993;

LIVINGSTONE, 2001) e outras espécies expostas a misturas de contaminantes e

pesticidas (PORTE et al., 1991; RODRIGUEZ-ARIZA et al., 1993). Peixinho dourado

(Carassius auratus) exposto a misturas de herbicidas, incluindo o diuron, mostrou

alteração em enzimas de estresse oxidativo e, como conseqüência, reduziram sua

resistência contra patógenos, sugerindo uma ação imunossupressora, conforme

mostra o trabalho de Fatima et al. (2006). Exposição de organismos ao glifosato, e a

marcas comerciais deste composto, também mostrou alteração da atividade da

catalase, com e sem o uso de surfactante, no estudo de Gehin et al. (2006).

Quando comparadas as épocas de seca e chuva, as atividades específicas da

GST e AchE tendem a mostrar uma relação direta dose-resposta se considerarmos

que a chuva aumenta a disponibilidade dos pesticidas na água. Segundo Rank et al.

(2005) aumento prolongado de chuvas pode causar turbulência dos sedimentos e

transporte de poluentes para locais distantes do seu local de origem, ou acúmulo de

contaminantes em corpos d’água sem grande circulação, como em lagos e tanques.

Já na atividade da CAT parece que outros fatores podem estar associados nessa

relação. Segundo Vassuer e Cossu-Leguille (2003), a diminuição da CAT pode estar

associada a uma toxicidade diferencial do poluente em maiores concentrações,

decorrente dessa relação indireta dose-resposta, e pode, mesmo assim, provocar

danos celulares por desequilíbrio no sistema antioxidante.

Em relação à AchE, outros compostos além dos organofosforados e dos

carbamatos parecem ter a capacidade de inibir as colinesterases (GILL et al., 1990).

Porém, segundo Sturm et al. (2000), as concentrações desses outros inibidores

requeridas para promover efeitos sobre a AchE seriam relativamente altas em

comparação aos fosforados e carbamatos.

Vale salientar que apesar dos resultados encontrados nesse estudo para a

enzima AchE, a medida da inibição da colinesterase é amplamente aceita como

método diagnóstico de exposição a agentes anticolinesterásicos em vertebrados.

Variações específicas de atividade dessa enzima são inúmeras e a viabilidade do

uso dela como biomarcador de poluição aquática deve sempre estar relacionada à

caracterização nas diferentes espécies (STURM et al., 1999).

A atividade da colinesterase em peixes e outros organismos aquáticos tem

sido utilizada globalmente como biomarcador de contaminação em programas de

monitoramento por diferentes grupos (STURM et al., 1999; RODRIGUEZ-FUENTES

e GOLD-BOUCHOT, 2000; MONSERRAT e BIANCHINI, 2001; MONSERRAT et al.,

2002; VENTURA et al., 2002; CORSI et al., 2003; MONTEIRO et al., 2005;

TORTELLI et al., 2006).

Analisando conjuntamente os biomarcadores bioquímicos, tem-se que a

indução da CAT no tecido hepático pode indicar uma exposição dos peixes, até

mesmo no interior da reserva, aos herbicidas aplicados com maior freqüência na

área de estudo (glifosato e diuron). Já o aumento da LPO encontrado no grupo

coletado no limite entre a área produtiva e a RPPN sugere uma formação de radicais

livres que não estão sendo eliminados pelo sistema antioxidante desses organismos.

Os herbicidas poderiam estar provocando lipoperoxidação celular e o aumento da

GST nesse mesmo ponto poderia indicar, em especial, a tentativa de eliminação dos

xenobiontes pelos peixes.

Foram observadas alterações morfológicas no tecido hepático em todos os

pontos amostrados, nas diferentes estações pluviométricas, não havendo, portanto,

dentro das áreas investigadas nenhuma que estivesse completamente livre de

alteração.

Lesões histopatológicas têm sido freqüentemente descritas como importantes

ferramentas em estudos de biomonitoramento devido à facilidade de interpretação

tanto em situações de exposição aguda quanto crônica (WESTER et al., 2002; GÜL

et al., 2004; OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2005). Assim como relatado neste trabalho, a

ocorrência de lesões hepáticas em animais expostos ambientalmente a

contaminantes tem sido reportada em organismos aquáticos por outros autores

como NOREÑA-BARROSO et al. (2004) e OLIVEIRA RIBEIRO et al. (2005).

Devido aos processos de absorção e metabolização as lesões observadas no

fígado estão geralmente relacionadas à exposição contínua a poluentes. A

ocorrência de necroses foi a mais evidente neste estudo. Este tipo de lesão tem sido

registrada em peixes de áreas impactadas por múltiplos contaminantes (PACHECO

e SANTOS, 2002; STEHR et al., 2003; OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2005). Áreas de

necrose causam prejuízos funcionais e estruturais no fígado de peixes

(STENTIFORD et al., 2003), podendo causar o colapso do órgão (RABITTO et al.,

2005). Embora a ocorrência de áreas necróticas não ter sido, nesse estudo,

relacionada diretamente com a quantificação de um determinado pesticida, o

aparecimento dessa lesão tem sido freqüentemente observada em recursos hídricos

contaminados por agrotóxicos (FANTA et al., 2003). A presença de necroses em

indivíduos coletados no interior da RPPN e também nas áreas mais próximas aos

cultivos de cana-de-açúcar representa um indicativo de que os corpos hídricos locais

estejam comprometidos.

Melanomacrófagos podem ser visualizados como células pigmentadas (ou

conjunto de células no caso do centro de melanomacrófagos) em órgãos como

fígado, rim anterior e intestino de peixes. Hartley et al. (1996) propuseram a

utilização de melanomacrófagos como biomarcador de poluição aquática a partir da

quantificação destas estruturas. Segundo Rabitto et al. (2005), essa sensibilidade

em relação a exposição a contaminantes vem do fato dos melanomacrófagos

estarem relacionados a respostas inflamatórias e desintoxicação de substâncias

exógenas. Meseguer et al. (1994), ao observarem abundantes macrófagos livres no

parênquima do fígado, sugeriram que estes se movem livremente dentro do

parênquima formando os centros de melanomacrófagos quando há um aumento na

atividade fagocítica como resposta imune a lesões em indivíduos expostos a

contaminantes. No presente estudo, foi observada uma alta incidência de

melanomacrófagos livres em organismos que também apresentaram áreas de

necrose, o que pode indicar que os melanomacrófagos estejam envolvidos, nesse

caso, na remoção de células necróticas.

A vacuolização citoplasmática observada no fígado dos lambaris das áreas

estudadas pode representar, por sua vez, um mecanismo de imobilização de

compostos mais lipofílicos como descrito por Oliveira Ribeiro et al. (2005) em

Anguilla anguilla ambientalmente exposta a pesticidas. Essa vacuolização pode

indicar que os animais acumulam o xenobiótico na tentativa de reduzir a

concentração deste na circulação e demais tecidos, conforme verificado por França

(2005) para o peixe Atherinella brasiliensis.

Segundo Bernet et al. (1999), a infiltração de células de defesa, como a

infiltração leucocitária observada no presente estudo, é uma resposta do organismo

frente a presença de contaminantes. Geralmente, essas áreas são encontradas

próximas a outras lesões como focos de necrose, sendo que essas células

atravessam as paredes dos vasos sanguíneos e infiltram no tecido afetado. Já os

centros eosinofílicos encontrados nos lambaris da Fazenda Barbacena podem ser

considerados como um estágio pré-neoplásico (HAWKINS et al., 1990), servindo

como um potencial biomarcador de exposição (STENTIFORD et al., 2003) frente a

seriedade desse tipo de lesão.

É necessário ressaltar, nesse sentido, que a RPPN foi a área que apresentou

maior incidência de lesões pelo cálculo de Bernet et al. (1999) e que o maior índice

de lesão visto para a época de seca nesse ponto, quando comparado com a estação

chuvosa, corrobora a observação de alterações biológicas nos lambaris da reserva e

a importância do monitoramento dessa área. Além disso, vale considerar que os

dados morfológicos podem indicar uma exposição cumulativa da RPPN a

contaminantes aquáticos. Os indivíduos coletados imediatamente no entorno, por

outro lado, apresentaram alterações agudas, fato este que sugere diferença na

estrutura dos grupos de Astyanax sp. dentro e fora da área protegida. De qualquer

modo, as lesões morfológicas aparecem em todos os pontos, em ambas as coletas,

o que reforça a proposta de um monitoramento contínuo da efetividade de

conservação não apenas da reserva, mas também de seu entorno.

Embora a toxicidade aguda do glifosato seja considerada baixa, a WHO

(1994) têm sugerido que o herbicida pode causar defeitos crônicos em determinadas

espécies de animais quando administrado em doses elevadas e por um período

prolongado, sendo os peixes e os invertebrados aquáticos os mais sensíveis a este

herbicida e aos outros componentes de seus produtos comerciais. No caso do

Roundup, tem-se que a toxicidade do produto comercial é maior que o glifosato

utilizado sozinho, provavelmente pela toxicidade do surfactante, como mostra o

estudo de Folmar et al. (1979) no tratamento de diversas espécies de peixes com

roundup, glifosato e o surfactante. O glifosato se mostrou menos tóxico que o

roundup ou o surfactante, e a toxicidade do roundup foi similar a do surfactante.

Um experimento conduzido por Rossi (dados não publicados), também com o

gênero Astyanax sp. exposto aos herbicidas glifosato e diuron em laboratório, indica

maior sensibilidade dos peixes ao Diuron (exposição em dose subletal 30 mg/L), os

quais tiveram aumento na atividade da GST e aumento na atividade da AchE. Nesse

mesmo estudo, o grupo com a mistura desses dois herbicidas mostrou aumento na

concentração de hidroperóxidos. Esses resultados corroboram com o presente

estudo, demonstrando que os dados encontrados nas coletas realizadas na Fazenda

Barbacena devem ter relação com a aplicação de pesticidas na região de cultivo de

cana-de-açúcar.

Em relação ao uso do Astyanax sp. como bioindicador nesse trabalho tem-se

que as características mais marcantes foram: (1) a sensibilidade do gênero no uso

dos biomarcadores aqui estudados e (2) na visualização de danos sub-letais. Esta

última característica permite pôr em prática ações remediadoras ou, melhor, ações

preventivas em áreas protegidas. Daí a importância e o interesse atual de

incorporação do biomonitoramento em programas de manejo de unidades de

conservação inseridas em mosaicos de alteração antrópica.

Vale ressaltar, todavia, que a interpretação dos resultados de campo é

sempre muito complexa, pois um grande número de fatores pode influenciar as

variáveis analisadas de maneira não controlada (ROCHE et al., 2002; ZANETTE et

al., 2006). Abordagens realizadas com múltiplos biomarcadores fornecem uma

melhor caracterização de uma dada área durante um período de tempo em estudos

de biomonitoramento. Este trabalho tem, portanto, um caráter preliminar sugerindo

uma exposição dos lambaris aos herbicidas utilizados na Fazenda Barbacena.

CAPÍTULO II: BIOMONITORAMENTO COMO FERRAMENTA PARA O

INCREMENTO DE PLANOS DE MANEJO EM RESERVAS PARTICULARES DO

PATRIMÔNIO NATURAL: CASO DA RPPN FAZENDA BARBACENA

II.1 CONTEXTUALIZAÇÃO DAS RPPN E LEVANTAMENTO DA PROBLEMÁTICA

DA RPPN FAZENDA BARBACENA

O sistema de áreas protegidas do Brasil possui uma ampla heterogeneidade

no que diz respeito às estratégias de proteção e às categorias de conservação. Em

sua especificidade, a temática da conservação em terras particulares tem se

ampliado de forma considerável, crescendo principalmente a partir da década de 90,

quando os mecanismos de conservação privada passaram a ser incrementados no

Brasil.

Reservas privadas se diferenciam de acordo com a situação legal, forma de

manejo, origem da iniciativa de criação, atividades oferecidas, instituição

responsável e formas de instituição. Como categoria de área protegida privada

prevista no Sistema Nacional de Unidades de Conservação Brasileiro (SNUC, 2000),

as Reservas Particulares do Patrimônio Natural (RPPN) são caracterizadas como

áreas particulares de relevante interesse ecológico, instituídas voluntariamente, cujo

objetivo principal é o de conservar a biodiversidade e onde se admite o uso indireto

dos recursos naturais.

As 800 RPPN atualmente existentes no Brasil têm, cada vez mais, servido

como um instrumento adicional para o fortalecimento do sistema de unidades de

conservação, protegendo mais de 600 mil hectares em todo o país. As RPPN

representam um mecanismo eficiente para ampliação de áreas sob proteção legal,

para o aumento da conectividade da paisagem natural, para proteção complementar

à rede de áreas protegidas públicas, além de contribuírem na proteção de áreas

prioritárias para a conservação da diversidade biológica.

Na Mata Atlântica, bioma foco desse estudo, as RPPN já representam o

dobro, em número, das unidades de conservação públicas de proteção integral,

sendo reconhecidas pela sua importância para a proteção da biodiversidade, seu

valor paisagístico, educacional ou outras variáveis que dependam de proteção ou

restauração do habitat natural. Atualmente, mais da metade das RPPN do Brasil

estão localizadas nesse bioma, 75% (558 RPPN), e mesmo com tamanho muitas

vezes modesto, as RPPN têm sido fundamentais para garantir a proteção da

diversidade biológica dos estados que compõem esse ecossistema, em especial por

incremento aos chamados corredores ecológicos.

A Tabela 3 mostra o número de RPPN em cada estado da Mata Atlântica,

categoria essa que conserva aproximadamente 200 mil hectares no bioma. Apesar

da diferença de representatividade nas ecorregiões desse bioma, o movimento de

conservação em RPPN está em ascensão, como é possível perceber na Figura 20.

Esses esquemas permitem notar que há um crescimento atual no número de RPPN

no Brasil, apesar da falta de incentivos gerais para a conservação em terras

privadas, o que demonstra o perfil de continuidade das ações por parte dos

diferentes atores envolvidos no tema, principalmente dos proprietários das reservas,

incluindo empresas privadas.

TABELA 3 – REPRESENTAÇÃO DAS RPPN NO BIOMA MATA ATLÂNTICA

Número de RPPN no

Bioma Mata Atlântica

Área (ha)

Alagoas 7 610,58

Bahia 54 33.799,19

Ceará 10 9.600,39

Espírito Santo 4 586,22

Minas Gerais 143 76.098,25

Paraíba 8 6.652,62

Paraná 191 37.149,77

Pernambuco 10 2.857,53

Sergipe 1 13,27

Rio Grande do Norte

3 2.939,93

Rio Grande do Sul 25 4.044,79

Rio de Janeiro 44 4.230,39

Santa Catarina 25 15.212,97

São Paulo 33 3.348,99

Total 558 197.144,89

FONTE: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis- IBAMA,

Ministério do Meio Ambiente e Órgãos Ambientais Estaduais, 2007.

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Alagoas

Bahia

Ceará

Espírito

Santo

Goiás

Minas

Gerais

Paraíba

Paraná

Pernambuco

Rio Grande

do Norte

Rio Grande

do Sul

Rio de

Janeiro

Santa

Catarina

São Paulo

Área em ha

1998

2006

Figura 20 - Desenvolvimento da criação de RPPN na Mata Atlântica, de 1998 a 2006.

FONTE: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis- IBAMA,

Ministério do Meio Ambiente e Órgãos Ambientais Estaduais, 2006.

Considerando ainda, que remanescentes importantes para a conectividade da

paisagem estão localizados em sua maioria dentro de propriedades particulares, é

imprescindível incrementar o sistema de conservação em terras privadas, não

deixando, entretanto, de considerar a efetividade de conservação dessas áreas.

Embora se note esse potencial, é importante considerar, por outro lado, que

proprietários de RPPN, organizações ambientalistas e mesmo técnicos de órgãos

ambientais reconhecem a necessidade de fortalecimento para trabalhar com o tema.

A preocupação com a quantidade e qualificação dos responsáveis pelo

desenvolvimento e consolidação dos mecanismos de conservação privada, e até

mesmo dos gestores diretos das RPPN, tem sido constante.

Paralelamente, a necessidade de compreender e manejar essas áreas é

tarefa prioritária, já que, muitas vezes, as demandas sócio-econômicas (atividades

industriais, agrícolas, entre outras) tendem a colidir com os interesses

conservacionistas. Considerando que muitas RPPN estão sujeitas a impactos

ocasionados pelas matrizes produtivas, estudos para a elaboração/incremento dos

planos de manejo dessas áreas devem ser desenvolvidos, objetivando a detecção e

a minimização dos possíveis danos existentes em um trabalho conjunto da área

protegida com seu entorno.

Sob o ponto de vista das atividades realizadas no entorno das RPPN, em

especial do Sul e Sudeste do Brasil, a atividade agrícola e suas características de

produção merecem destaque na presente discussão. Segundo Tomita (2002), os

ambientes aquáticos inseridos em complexos agrícolas podem ser afetados

diretamente pelo carreamento de pesticidas utilizados nas culturas de soja, milho,

cana-de-açúcar, arroz, entre outros.

Na RPPN Fazenda Barbacena, considerada um dos mais importantes

fragmentos da Floresta Estacional Semidecidual do estado do Paraná e foco desse

trabalho, esse tema encontrou abertura, sendo realizado o estudo de monitoramento

através de biomarcadores em Astyanax sp.

A RPPN Fazenda Barbacena, localizada na região noroeste do Estado do

Paraná, inserida na Fazenda Barbacena, município de São Pedro do Ivaí, foi criada

em 2004 (pela Portaria 207/2004) e possui importante papel na preservação

hidrográfica da Bacia do Ivaí (a reserva está inserida na microbacia do Rio

Barbacena, afluente de 1

ordem do Rio Ivaí). As atividades realizadas atualmente

na área protegida abrangem turismo ecológico, educação ambiental e pesquisa

científica. O entorno da RPPN é composto por uma região de plantio, utilizada pela

Usina Vale do Ivaí. A atividade principal se caracteriza pela produção de cana de

açúcar, a qual utiliza, periodicamente, diferentes tipos de pesticidas recomendados

para esse tipo de cultivo, em especial o glifosato e o diuron.

Os resultados discutidos no capítulo I, para o estudo de biomonitoramento,

permitem afirmar que os pontos amostrados no interior da RPPN, bem como no

entorno da reserva e na área de plantio direto de cana-de-açúcar, não estão

completamente livres de algum tipo de alteração causada por esse sistema de

produção.

Nesse sentido, o presente capítulo pretende discutir possibilidades de

incremento ao plano de manejo da RPPN Fazenda Barbacena, frente ao diagnóstico

dessas alterações.

II.2 BIOMONITORAMENTO AMBIENTAL NA GESTÃO DE RPPN

Um dos primeiros passos para a resolução dos problemas sócio-ambientais

gerados pela gestão inadequada dos recursos hídricos é o desenvolvimento de

metodologias de diagnóstico eficientes. O presente trabalho aponta a importância do

tema Biomonitoramento, que consiste no uso sistemático das respostas fisiológicas

mensuráveis em organismos vivos para avaliar as mudanças ocorridas no ambiente

(VAN DER OOST et al., 2003), como ferramenta para o incremento de planos de

manejo em reservas particulares.

Apesar do grande número de variáveis encontradas em campo dificultar a

relação causa-efeito de uma determinada alteração em organismos, estrutura de

populações ou de comunidades; o biomonitoramento permite uma avaliação mais

ampla das condições naturais às quais os organismos estão sujeitos, o que de fato

pode colaborar na discussão da efetividade de conservação de uma área protegida.

O monitoramento que combina diferentes testes em sistemas biológicos

(biomarcadores) propicia, por sua vez, promissores instrumentos para a identificação

de impactos no ambiente (DA SILVA et al., 2003).

Concomitante à realização do estudo dos biomarcadores citados no Capítulo

I, a proposta deste trabalho foi, portanto, subsidiar uma discussão sobre o manejo

das RPPN em relação ao seu entorno. Em linhas gerais, os tópicos aqui discutidos

poderão ser aplicados em duas diferentes esferas: (1) divulgação e discussão dos

resultados e recomendações de manejo na RPPN Estadual Fazenda Barbacena e

na comunidade do entorno; (2) apresentação em congressos e encontros de

proprietários de RPPN, fortalecendo a idéia de um manejo integrado das reservas

com seu entorno, considerando, inclusive, a implantação de “zonas de

amortecimento” para essa categoria de unidade de conservação, salvo as

particularidades do uso desse instrumento em áreas particulares e sem o caráter de

obrigatoriedade.

A proposta é criar, deste modo, subsídios para a gestão integrada da RPPN

Fazenda Barbacena com sua área de entorno produtora de cana de açúcar, sem, no

entanto, descaracterizar o objetivo de conservação que norteia essa UC.

2.1 Zonas de Amortecimento em RPPN

A criação de unidades de conservação é a forma mais tradicional de se

proteger ecossistemas. Contudo, o entorno, em muitas destas áreas, vem sendo

manejado sem critérios de conservação, determinando a formação de “ilhas”, as

quais permitem que as UC possam sofrer mais diretamente os impactos das

atividades externas. Uma das soluções para esta questão, segundo Orlando (1997),

é o estabelecimento de zonas de amortecimento ou tampão (buffer zones) com

restrições ou proibições de atividades no entorno das unidades.

A Lei Federal nº 9.985, de 18 de julho de 2000, que institui o Sistema

Nacional de Unidades de Conservação – SNUC, define zona de amortecimento

como sendo “o entorno de uma unidade de conservação onde as atividades

humanas estão sujeitas às normas e restrições específicas, com o propósito de

minimizar os impactos negativos sobre a unidade”. O SNUC determina a

obrigatoriedade das UC, exceto na Área de Proteção Ambiental – APA e na Reserva

Particular do Patrimônio Natural - RPPN, em possuir uma zona de amortecimento e

que o órgão da administração da unidade é o responsável pela regulamentação da

ocupação e do uso dos recursos desta área.

O tema central aqui, contudo, não é entrar no mérito da obrigatoriedade da

implantação de uma área de entorno com restrições específicas, e sim discutir a

importância dos instrumentos “Zona de Amortecimento” e “Biomonitoramento” no

manejo de reservas particulares. A implantação de medidas nesse sentido em

fragmentos de RPPN no sul e sudeste do país é particularmente importante devido

ao processo de insularização ocorrido principalmente no início da década de 70.

Este período coincidiu com a fase de mecanização da agricultura no estado do

Paraná, que se caracterizou pelo uso intensivo de agrotóxicos e fertilizantes

químicos.

Primeiramente, acreditava-se que as ações em UC deveriam ser realizadas

dentro de seus limites, fato este que vem sofrendo mudanças considerando que

freqüentemente as ameaças originam-se fora dos limites dessas unidades.

Atualmente, Planos de Manejos caracterizam-se por ser contínuos, gradativos e

flexíveis, abordando novos enfoques, como a proteção integrada com o entorno.

Nesse enfoque e de acordo com Orlando (1997), zona de amortecimento "é

uma zona periférica às áreas protegidas, onde são feitas restrições no uso dos

recursos ou nas medidas de desenvolvimento para melhorar os valores de

conservação dessas áreas". Segundo MMA/IBAMA (1997), o conceito de zona de

amortecimento é análogo ao existente sobre a zona de transição ou zona tampão, e

esta proposta apóia-se, ainda, na Convenção sobre Diversidade Biológica (1994),

que afirma que cada parte responsável, na medida do possível e conforme o caso,

deve promover o desenvolvimento sustentado e ambientalmente sadio nas áreas

adjacentes às áreas protegidas a fim de reforçar a proteção destas áreas. Este

documento descreve os principais problemas nas UC vizinhas a áreas agrícolas,

problemas estes causados principalmente pela contaminação ocasionada por

defensivos agrícolas e pela prática das queimadas.

Outro conceito importante é o de “Área de Influência”, que significa “área que

exerce alguma influência direta sobre a unidade, considerando-se principalmente as

microbacias onde a mesma está inserida, bem como quaisquer outras áreas onde

outros atores interfiram na unidade ou que a unidade possa interferir sobre elas”

(MMA/IBAMA, 1996). Esta expressão se apoiou na Resolução do Conselho Nacional

do Meio Ambiente (CONAMA) nº 13/90, que determinou uma faixa de 10 km em

torno das unidades de conservação, na qual qualquer atividade que possa afetar a

biota deve ser obrigatoriamente licenciada pelo órgão ambiental competente.

No caso específico das RPPN não há a intenção de caracterizar uma faixa de

entorno e/ou uma zona de amortecimento de fato, mas sim apontar possibilidades

para a gestão de reservas particulares inseridas em mosaicos produtivos, em

especial a RPPN Fazenda Barbacena, utilizando esse conceito de área de

influência.

Ao trazer outros conceitos de zonas de amortecimento, fica mais evidente a

relação destas com programas de biomonitoramento. Segundo Padovan (2000),

para se implantar uma área de menor impacto no entorno de áreas protegidas, é

importante considerar se a intervenção humana é direta ou indireta, é real ou

potencial, onde o desenho e manejo devem considerar as interelações entre

pessoas e recursos, identificar áreas ou situações críticas nestas inter-relações,

além de orientar o manejo segundo a demanda real destas áreas ou situações

críticas. Conforme Cerqueira et al. (2003), entorno é a área circunvizinha a uma UC,

onde o uso do solo pode influenciar, tanto positiva como negativamente o ambiente

natural desta. Morsello (2001) define essa zona como uma porção adjacente à área

protegida, no qual o uso da terra é parcialmente restringido para incorporar uma

camada a mais de proteção para a UC. Pode ter a função de ampliar a presença na

área protegida de certo tipo de habitat e pode servir a propósitos sociais. Já Britez et

al. (2003) afirmam que o estabelecimento de UC por si só não assegura a efetiva

manutenção de comunidades, haja visto que essas áreas podem ser verdadeiras

ilhas que, isoladas em meio à paisagem, sofrem deterioração progressiva de seus

ambientes, na maioria das vezes, partindo da borda.

No biomonitoramento, por sua vez, tem-se que estudos que consideram a

biota nativa de um local (os bioindicadores) por meio de testes em sistemas

biológicos podem ser utilizados como excelentes ferramentas para a identificação de

ameaças ao ambiente. Em estudos ecotoxicológicos, o maior objetivo é a detecção

da causa-efeito entre sistemas biológicos e as misturas complexas de poluentes aos

quais organismos podem estar expostos. Daí a relação com o manejo de áreas

protegidas, considerando a ecotoxicologia como um dos instrumentos capazes de

diagnosticar ameaças da área de entorno.

Atualmente no Brasil, já existem instrumentos que auxiliam o planejamento

considerando as atividades do entorno de um RPPN. Em 2004, em uma iniciativa

que reuniu diferentes profissionais que trabalham com reservas particulares, de

órgãos ambientais públicos, universidades e organizações não-governamentais, foi

criado o roteiro metodológico para elaboração de plano de manejo para Reservas

Particulares do Patrimônio Natural. O roteiro trás, entre outras características, os

itens “caracterização da área de entorno” e “pesquisa e monitoramento” nas RPPN.

Quando trata da caracterização do entorno, há indicação para descrição do uso da

terra, bem como os impactos e ameaças, tratando das atividades e situações que

estejam em desenvolvimento no entorno da RPPN que conflitem com seus objetivos

de criação. Já no item de pesquisa, o roteiro indica, quando possível e quando de

interesse do proprietário, o desenvolvimento de estudos e parcerias para o

monitoramento da área e das possíveis alterações na biota da reserva.

Além desse instrumento, hoje bastante utilizado, o Paraná, pelo decreto

estadual n°4890 de 2005, dispõe sobre as RPPN como sendo unidades de

conservação de proteção integral, e coloca o órgão estadual como um dos

responsáveis pelo controle e monitoramento da qualidade ambiental das reservas

instituídas e presentes no sistema estadual de unidades de conservação. Um dos

mecanismos desenvolvidos para esse auxílio na gestão e efetividade de

conservação das RPPN, descrito nesse decreto, é o uso de recursos provindos da

Lei do ICMS Ecológico (Lei n° 59/91), pleiteado jun to aos Municípios beneficiários

desse aporte, para que realizem ações concretas de apoio, consolidação e proteção

das RPPN. A RPPN Fazenda Barbacena é, atualmente, beneficiária desse recurso e

o utiliza no desenvolvimento de ações de pesquisa, de educação e turismo na área,

porém atividades ligadas diretamente ao monitoramento de impactos do entorno

ainda não são desenvolvidas.

2.2 Plano de Manejo da RPPN Fazenda Barbacena

Segundo o Plano de Manejo para a RPPN Fazenda Barbacena, a elaboração

do planejamento desta foi baseada nos “dados que se encontram já disponíveis

sobre a unidade e visitas de campo, destacando-se os diagnósticos procedidos da

avifauna local, abrangendo observações e apontamentos sobre outros grupos

animais, e da flora da área realizado no último trimestre de 2003, além das

observações e anotações procedidas em entrevistas com funcionários da Fazenda

Barbacena e da Vale do Ivaí S/A – Açúcar e Álcool sobre as características físicas e

ocupacionais da área e do seu entorno”.

A partir desses levantamentos, foram criados os seguintes programas para

reserva: (1) Programa de Interpretação e Educação Ambiental; (2) Programa de

Controle Ambiental; (3) Programa de Manejo do Meio Ambiente e (4) Programa de

Operacionalização.

Os resultados do biomonitoramento desenvolvido por esse estudo podem,

portanto, ser incorporados por esses programas, conforme os tópicos que se

seguem.

2.2.1 Recomendações para o Plano de Manejo da RPPN Fazenda Barbacena e

gestão da área de entorno

2.2.1.1 Subprograma de Monitoramento da Qualidade das Águas e Subprograma de

Controle do Entorno

Esses programas indicam o monitoramento ambiental dos cursos d´água da

reserva, apontando o controle dos processos erosivos e de carreamento exagerado

de sedimentos nos talvegues; o monitoramento de gramíneas exóticas nas bordas; o

controle dos canais de vinhaça e de descarte de lixo. Não indicam, por outro lado, o

monitoramento dos corpos hídricos em relação às possíveis alterações causadas

pelo uso contínuo de pesticidas na área de entorno.

Além da sugestão para que o plano englobe o conceito de biomonitoramento

trabalhado nesse estudo, cabe aqui a discussão da recuperação da mata ciliar da

área de cultivo de cana e o trabalho diferenciado da área de influência da RPPN, por

meio de ações de controle na aplicação de pesticidas e/ou na prática de um manejo

diferenciado da cana-de-açúcar.

Segundo Nery (2000), o rápido crescimento da cana é considerado como

ponto positivo no manejo dessa produção por permitir uma boa cobertura do solo,

facilitando o controle da erosão e da lixiviação de pesticidas, por exemplo. Por outro

lado, o uso constante de herbicidas e fertilizantes é mostrado pelo mesmo autor

como um dos maiores problemas dessa atividade. Nesse contexto, deve-se

considerar também a problemática ocasionada pela supressão das matas ciliares, o

que pode acarretar, em diferentes graus, aumento no impacto sobre os recursos

hídricos adjacentes, mesmo que a cana possibilite na maior parte do tempo a

cobertura do solo.

Diferentes estudos mostram que em áreas onde não há mata ciliar, córregos

e rios adjacentes à área de plantio de cana sofrem impacto de diferentes classes de

pesticidas, em especial no sedimento e na água após processo de lixiviação

(SANTOS, 1999; OLIVEIRA e TORNISIELO, 2000). O estudo de Corbi (2006)

mostrou que corpos hídricos com ausência de mata ciliar, localizados em áreas de

plantio de cana, apresentam maior impacto quando investigadas as concentrações

de metais e de pesticidas, quando comparadas com área florestadas e/ou com mata

ciliar.

Nesse contexto, a recuperação das matas ciliares da Fazenda Barbacena

pode ser uma das possibilidades de melhoria da qualidade ambiental do entorno da

RPPN em questão e, consequentemente, das comunidades biológicas da reserva.

Além disso, a implantação e recuperação dessas áreas de proteção permanente

podem propiciar o desenvolvimento e incremento de corredores biológicos da RPPN

Fazenda Barbacena com outros fragmentos da região.

Quanto ao manejo diferenciado do cultivo de cana no entorno imediato da

RPPN, vale destacar, aqui, a possibilidade de o plano de manejo incorporar uma

“zona de amortecimento” ou “zona de transição” no que diz respeito ao uso de

técnicas ambientalmente corretas da agricultura convencional, desenvolvimento de

uma área com sistemas agroflorestais (que podem também ser utilizados no

programa de educação ambiental) e/ou ainda na implementação de uma faixa de

produção livre de pesticidas.

No caso da produção livre de pesticidas, a proposta seria difundir técnicas

agrícolas compatíveis com um modelo ambiental mais durável, que valoriza os

aspectos econômicos e pode agregar renda diferencial ao produtor. Segundo

UNILIVRE (1999), para a área do entorno do Parque Nacional do Iguaçu, por

exemplo, o zoneamento da unidade recomenda o cultivo orgânico de diferentes

culturas, inclusive a de cana-de-açúcar.

A Instrução Normativa 007/99 do Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA, 1999), considera “sistema orgânico de produção

agropecuária e industrial todo aquele em que se adotam tecnologias que otimize o

uso dos recursos naturais e socioeconômicos, tendo como um dos objetivos a

eliminação do emprego de agrotóxicos e outros insumos artificiais tóxicos”. Oliveira

et al. (2007) mostram em seu trabalho que as condições físico-químicas e

bioquímicas do solo de uma área com cultivo orgânico de cana apresenta melhores

índices quando comparados à área de plantio convencional.

2.2.1.2 Programa de Interpretação e Educação Ambiental

Rodriguez e Gomez (1992), em estudo no Parque Nacional Cerro Corá, no

Paraguai, sugeriram um programa de educação ambiental que enfoque também os

problemas que afetam a manutenção dos recursos naturais na zona de

amortecimento, a relação que existe entre os produtos diariamente utilizados e sua

origem nos recursos naturais e soluções ao alcance dos gestores para minimizar os

problemas.

No ano de 2005, a Vale do Ivaí realizou um trabalho de interpretação

ambiental com alunos do ensino fundamental e médio das escolas municipais e

estaduais de São Pedro do Ivaí, além de uma atividade com trabalhadores rurais

que participaram de um curso de Bolsa de Qualificação. No ano de 2006, foram

realizadas visitas com trilhas interpretativas e atividades de sensibilização para

alunos do PETI e grupos da 3ª. Idade do município, durante a II Semana do Meio

Ambiente. Em 2007, por sua vez, a RPPN recebeu a Faculdade Integrada de Campo

Mourão, FAFIJAN de Jandaia do Sul e ainda escolas do município. Durante a III

Semana do Meio Ambiente realizada pela empresa, a comunidade também teve

oportunidade de conhecer a reserva.

Apesar desses trabalhos de caráter mais pontual e do Plano de Manejo

indicar o uso do instrumento educativo “interpretação de trilhas”, não há indicação

direta de público alvo a ser trabalhado no programa de educação ambiental da

RPPN. A proposta, a partir disso seria, então, desenvolver um programa contínuo de

educação ambiental para os trabalhadores rurais da empresa, não apenas com

interpretação de trilhas, mas com a aproximação efetiva destes à RPPN. Em um

primeiro momento, o programa poderia ser direcionado aos trabalhadores que

realizam aplicação dos pesticidas, por exemplo, mostrando a relação do entorno

com a área protegida e a importância da conservação dos recursos hídricos locais.

Esse programa poderia colaborar, ainda, para a ação prevista no Plano de Manejo

em relação à fiscalização de despejo de lixo no entorno da área, provocado por

trabalhadores rurais em períodos de intervalo de suas atividades no cultivo de cana-

de-açúcar.

Vale ressaltar que a integração entre a Educação Ambiental e as demais

ciências foi considerada fundamental pelo MMA (2000) para a eficácia na

conservação dos biomas, pois pode alavancar processos participativos que

favoreçam a conservação. Nesse contexto, a comunidade científica e os gestores

das unidades têm uma grande responsabilidade em divulgar as informações às

comunidades locais.

II.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Para Milano (1998), o plano, como instrumento de planejamento, deve contar

com três aspectos fundamentais: deve tratar do futuro, deve implicar em ação e deve

identificar as pessoas ou organizações que realizarão as atividades.

É necessária, nesse contexto, a compreensão de que a gestão de áreas

protegidas não é estanque, é processo, o que implica em estágios de transição onde

ocorrem contínuas avaliações e correções de direção e sentido. Para Ducros (1988),

algumas ilhas de proteção de nada servem, se no exterior tem-se uma degradação

dos recursos naturais, uma alienação dos indivíduos e uma uniformização das

culturas, portanto é preciso ser objetivo para seguir com a gestão de unidades de

conservação.

Em linhas gerais, o presente projeto vem contribuir, portanto, para o

desenvolvimento de estratégias que visem um efetivo controle das alterações em

RPPN inseridas em um mosaico agropecuário, aprimorando metodologias de

manejo e possibilitando a criação de ferramentas para a realização de ações de

proteção nas regiões de entorno dessas unidades, amortizando alterações e

colaborando para evitar a insularização das áreas protegidas.

CONCLUSÕES GERAIS

− O lambari Astyanax sp. mostrou-se um organismo capaz de expressar efeitos

de contaminação ambiental e, apesar das dificuldades para identificação em campo,

pode ser considerado um bom bioindicador;

− Os resultados das análises bioquímicas demonstram aumento da atividade da

Catalase (CAT) em Astyanax sp. no interior da RPPN na estação de seca; aumento

da atividade da Glutathiona S-transferase (GST) em Astyanax sp. na cana de açúcar

na estação de chuva; e aumento da concentração de Peroxidação Lipídica (LPO) em

Astyanax sp. no entorno da reserva em ambas as coletas. A avaliação da atividade

da Acetilcolinesterase (AchE) em Astyanax sp. não demonstrou diferença para os

pontos amostrais cana de açúcar, entorno e RPPN;

− Os resultados do estudo de histopatologia do fígado de Astyanax sp

demonstram lesões em todos os pontos amostrais, em ambas as estações

estudadas. Os dados encontrados podem indicar uma exposição cumulativa da

RPPN a contaminantes aquáticos. Os indivíduos coletados imediatamente no

entorno, por outro lado, parecem apresentar alterações agudas;

− Os resultados da análise do micronúcleo písceo em Astyanax demonstram

um aumento no número de alterações nucleares no entorno da reserva, na estação

de chuva, seguindo os dados encontrados para a enzima GST e para a LPO;

− Os resultados encontrados nas análises realizadas para os peixes coletados

na Fazenda Barbacena e RPPN parecem ter relação com a aplicação de pesticidas

(como o glifosato e diuron) na região de cultivo de cana-de-açúcar;

− Os resultados encontrados podem nortear a elaboração de estratégias de

minimização de alterações causadas por pesticidas em áreas do entorno da RPPN

Fazenda Barbacena, São Pedro do Ivaí, Paraná.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABUJA, P. M.; ALBERTINI, R. Methods for monitoring oxidative stress, lipid

peroxidation and oxidation resistance of lipoproteins. Clin. Chemis. Acta, v. 306, p.

1-17, 2001.

AEBI, H. Catalase in vitro. Acad. Press, v. 105, p. 121-126, 1984.

ACWORTH; B., 1995 In: RODRIGUES, L. C. Estudo das glutation S-transferases

hepáticas solúveis do peixe Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Pacu).

Tese de doutorado em Bioquímica, Instituto de Biologia Roberto Alcantara

Gomes/UERJ, Brasil, 2003.

ADLER, V.; YIN, Z.; FUCHS, S. Y. Regulation of JNK signaling by GSTp. Embo. J.,

v. 18, p. 1321–1334, 1999.

AKAISHI, F. M.; SILVA DE ASSIS, H. C.; JAKOBI, S. C. G.; STJEAN, S.;

COUTERNAY, S. C.; LIMA, E.; WAGNER, A. L. R.; SCOFIELD, A.; OLIVEIRA

RIBEIRO, C. A. Morphological and neurotoxicological findings in tropical freshwater

fish (Astyanax sp.) after waterborne and acute exposure to water soluble fraction

(WSF) of crude oil. Arch. Environ. Contam. Toxicol., v. 46, p. 244–253, 2004.

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.

Molecular Biology of The Cell, 4a.ed, Garland, New York, 2002.

AL-SABTI, K. Clastogenic effects of live carcinogenic-mutagenic chemicals on the

cells of the commom carp (Cyprinus carpio L.). Comp. Biochem. Physiol., v. 85, p.

5–9, 1986.

AL-SABTI, K.; METCALFE, C. D. Fish micronuclei for assessing genotoxicity in

water. Mutat. Res., v. 343, p. 121–135, 1995.

AMADO, L. L.; DA ROSA, C. E.; LEITE, A. M.; MORAES, L.; PIRES, W. V.; LEÃES

PINHO, G. L.; MARTINS, C. M. G.; ROBALDO, R. B.; NERY, L. E. M.;

MONSERRAT, J. M. Biomarkers in croakers Micropogonias furnieri (Teleostei:

Sciaenidae) from polluted and non-polluted areas from the Patos Lagoon estuary

(Southern Brazil): Evidences of genotoxic and immunological effects. Mar. Pollut.

Bull., v. 52, n. 2, p. 199-206. 2006.

AMARANTE JUNIOR, O. P.; SANTOS, T. C. R. Glifosato: Propriedades, Toxicidade,

Usos e Legislação. Quím. Nov., v. 25, n. 4, p. 589-593, 2002.

ANDRIAN, I. F. Dieta de Astyanax bimaculatus (Linnaeus, 1758) (Characiformes,

Characidae), da área de influência do reservatório de Corumbá. Estado de Goiás,

Brasil. Acta Scient., Maringá, v. 23, n. 2, p. 435-440, 2001.

ANVISA. Agrotóxicos e Toxicologia: Programa de análise de resíduos de agrotóxicos

em alimentos: relatório anual 2004. Citação e referências a documentos

eletrônicos. Disponível em <http://www.anvisa.gov.br> Acesso em: 22 abril, 2006.

ANVISA. Agrotóxicos e Toxicologia: Monografia de produtos agrotóxicos. Citação e

referências a documentos eletrônicos. Disponível em <http://www.anvisa.gov.br>

Acesso em: 18 novembro, 2006.

ARMAS, E. D.; MONTEIRO, R. T. R.; AMANCIO, A. V. The use of pesticides in sugar

cane at the Corumbataí river basin and the risk of water pollution. Quím. Nov., v. 28,

n. 6, p. 975-982, 2005.

AYLLON, F.; GARCIA-VAZQUEZ, E. Induction of micronuclei and other nuclear

abnomalities in European minnow Phoxinus phoxinus and molie Poecilia latipinna: an

assessment of the fish micronucleus test. Mutat. Res., v. 467, p. 177-186, 2001.

AYLLON, F.; GARCIA-VAZQUEZ, E. Micronuclei and other lesions as genotoxicity

indicators in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 79,

p. 221-225, 2003.

BAKER, R. C.; KRAMER, R. E. Cytotoxicity of short-chain alcohols. Annu. Rev.

Pharmacool. Toxicol., v. 39, p. 127-150, 1999.

BAINY, A. C. D.; SAITO, E.; CARVALHO, P. S. M.; JUNQUEIRA, V. B. C. Oxidative

stress in gill, erythrocytes, liver and kidney of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from

a polluted site. Aquat. Toxicol., v. 34, p.151-162, 1996.

BARATA, C.; DAMÁSIO, J.; LÓPEZ, M. A.; KUSTER, M.; LÓPEZ DE ALDA, M.;

BARCELÓ, D.; RIVA, M. C.; RALDÚA, D. Combined use of biomarkers and in situ

bioassays in Daphnia magna to monitor environmental hazards of pesticides in the

field. Environ. Toxicol. Chem., v. 26, p. 370-379, 2006.

BENZIE, I. F. Lipid peroxidation: a review of causes, consequences, measurement

and dietary influences. Int. J. Food Sci. Nut., v. 47, p. 233–261, 1996.

BERNET, D.; SCHIMIDT, H.; MEIER, W.; BURKHRADT-HOLM, P.; WAHLI, T.

Histopatology in fish: proposal for a protocol to assess aquatic pollution. J. Fish

Diseas., v. 22, p. 25-34, 1999.

BETTERIDGE, D. J. What is oxidative stress? Metab., v. 49, p. 3-8, 2000.

BLUS, L. J. Organochlorine pesticides. In: HOFFMAN, D. J.; RATTNER, B. A.;

BURTON, G. A.; CAIRNS, J. (Eds.). Handbook of Ecotoxology. Boca Raton: Lewis.

p. 275-300, 1995.

BOMBAIL, V.; AW, D.; GORDON, E.; BATTY, J. Application of the comet and

micronucleus assays to butterfish (Pholis gunnellus) erythrocytes from the Firth of

Forth, Scotland. Chem., v. 44, p. 383–392, 2001.

BRADFORD, M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., v.

72, p. 248-254, 1976.

BRITEZ, R. M. Manejo do Entorno. In: MMA. Fragmentação de Ecossistemas –

Causas, Efeitos sobre a Biodiversidade e Recomendações de Políticas Publicas,

Brasília: MMA, 508p, 2003.

BRITSKI, H. A.; SATO, Y.; ROSA, A. B. S. 1972. Manual de identificação de

peixes da região de Três Marias: (com chaves de identificação para os peixes da

bacia do São Francisco). Brasília: CODEVASF, 1988.

BUSCHBACHER, R. 2000. Expansão agrícola e perda da biodiversidade no

cerrado (Origens históricas e o papel do comércio internacional). Brasília, DF: WWF

- Fundo Mundial para a Natureza, 98p.

BUTTERFIELD, D. A.; KOPPAL, T.; HOWARD, B.; SUBRAMANIAM, R.; HALL, N.;

HENSLEY, K.; YATIN, S.; ALLEN, K.; AKSENOV, M.; AKSENOV, A.; CAI, J.;

JONES, D. P. Superoxide in apoptosis: mitochondrial generation triggered by

cytochrome C loss. J. Biol. Chem., v. 273, p. 11401-11404, 1998.

CAMARGO, M. M. P.; MARTINEZ, C. B. R. Biochemical and physiological

biomarkers in Prochilodus lineatus submitted to in situ tests in an urban stream in

southern Brazil. Environ. Toxicol. Pharmacol., v. 21, p. 61-69, 2006.

CARRASCO, K. R.; TILBURY, K. L.; MYERS, M. S. Assessment of the piscine

micronucleus test as an in situ biological indicator of chemical contaminants effects.

Can. J. Fish. Sci., v. 47, p. 2123–2136, 1990.

CAVENAGUI, A. L.; NEGRISOLI, E.; TOFOLI, G. R.; VELINI, E.; COSTA, E. A. D.;

COSTA, A. G. F. Dinâmica de herbicidas em palhada de cana-de-açúcar. In: Anais

8°Congresso Nacional da STAB , p. 170-174. 2002.

CERQUEIRA, R. Glossário. In: MMA. Fragmentação de Ecossistemas – Causas,

Efeitos sobre a Biodiversidade e Recomendações de Políticas Publicas, Brasília:

MMA, 508p, 2003.

CESTARI, M. M.; LEMOS, P. M. M.; OLIVEIRA-RIBEIRO, C. A.; COSTA, J. R. M. A.;

PELLETIER, E.; FERRARO, M. V. M.; MANTOVANI, M. S.; FENOCCHIO, A. S.;

Genetic damage induced by trophic doses of lead in the neotropical fish Hoplias

malabaricus (Characiformes, Erythrinidae) as reveled by the comet assay and

chromosomal aberrations. Gen. Mol. Biol., v. 27, p. 270–274, 2004.

CHO J. R.; KIM Y. J.; HONG K. J.; YOO J. K.; LEE J. O.; AHN Y. J.; CHO J. R.; KIM

Y. J.; HONG K. J.; YOO J. K.; LEE J. O.; AHN Y. J. Resistance monitoring and

enzyme activity in field-collected populations of the spiraea aphid, Aphis citricola Van

der Goot. J. Asian Pac. Entomol., v. 2, p.113-119, 1999.

CORBI, J. J. Influência de práticas de manejo de solo sobre os

macroinvertebrados aquáticos de córregos: ênfase para o cultivo de cana-de-

açúcar em áreas adjacentes. Tese doutorado, Universidade Federal de São

Carlos, 92p, 2006.

CORSI, I.; MARIOTTINI, M.; SENSINI, C.; LANCINI, L.; FOCARDI, S. Fish as

biomarkers of brackish ecosystem health: integrating biomarker responses and target

pollutant concentrations. Oceanol. Acta, v. 26, p. 129-138, 2003.

COSTA, J. R. M. A. Biomarcadores de contaminação em peixes de água doce,

por exposição ao chumbo (II): ensaios laboratorias e estudo de caso preliminar

no rio Ribeira (SP/PR). Dissertação mestrado, Universidade Federal do Paraná.

2001.

CUI, K.; LUO, X.; XU, K.; VEN MURTHY, M. R. Role of oxidative stress in

neurodegeneration: recent developments in assay methods for oxidative stress and

nutraceutical antioxidants. Biol. Psych., v. 28, p. 771-799, 2004.

DAMEK-PROPRAWA, M.; SAWICKA-KAPUSTA, K. Damage to the liver; kidney and

testis with reference to burden of heavy metals in yellow-necked mice from areas

around steelworks and zinc smelters in Poland. Toxicol., v. 186, p. 1–10, 2003.

DA SILVA, J. HEUSER, V.; ANDRADE, V. Biomonitoramento Ambiental. Gen.

Toxicol., p.167-178, 2003.

DAVIES, P. E.; COOK, L. S. J. Catastrofic macroinvertebrate drift and sublethal

effects on brown trout, Salmo trutta, caused by cypermethrin spraying on a

Tasmanian stream. Aquat. Toxicol., v. 27, p. 201- 224, 1993.

DI GIULIO, R. T.; HABIG, C.; GALLAGHER, E. P. Effects of Black Rock Harbor

sediments on indices of biotransformation, oxida-tive stress, and DNA integrity in

channel catfish. Aquat. Toxicol., v. 26, p. 1–22, 1993.

DIPLOCK, T. A.; CHARLEUX, J. L.; CROZIER-WILLI, G.; KOK, F. J.; RICE-EVANS,

C.; ROBERFROID, M.; STAHL, W.; VIÑA-RIBES, J. Functional food science and

defense against reactive oxidative species. Br. J. Nutr., v. 80, p. 77–112, 1998.

DORAN, W. J.; COPE, G. W.; RADA, R. G.; SANDHEINRICH, M. B.

Acetylcholinesterase inhibition in the threeridge mussel (Amblema plicata) by

chlorpyrifos: implications for biomonitoring. Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 49, p. 91-

98, 2001.

DUARTE, N. F. Potenciais Impactos Ambientais da Monocultura da Cana-de-açúcar.

In: Valadão, R. C.; Landau, E. C. (eds.) Análise Integrada do Meio Ambiente –

Lagoa da Prata, MG. Belo Horizonte, MG. 2003.

DUCROS, JEAN J. Les experiences de divulgation dans la réserve de la biosphère

des Cévennes. In: Seminario Internacional Sobre Reservas De La Biosfera

Mediterraneas, Montseny. Montseny: UNESCO,1988.

EGAAS, E.; SANDVICK, M.; FJELD, E.; KALLQVIST, T.; GOKSOYR, A.; SVENSEN,

A. Some effects of the fungicide propiconazole on cytochrome P450 and glutathione

S-transferase in brown trout (Salmo trutta). Comp. Biochem. Physiol. C;

Pharmacol. Toxicol. Endocrinol., v. 122, p. 337-344, 1999.

ELLMANN, G. L.; COURTNEY, K. D.; ANDREAS, V. J.; FEATHERSTONE, R. M. A

new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem.

Pharmacol., v. 7, p. 88, 1961.

EVANS, P.; LYRAS, L.; HALLIWELL, B. Measurement of protein carbonyls in human

brain tissue. Meth. Enzymol., v. 300, p. 145–156, 1999.

FATIMA, M.; MANDIKI, S. N. M.; DOUXFILS, J.; SILVESTRE, F.; COPPE, P.;

KESTEMONT, P. Combined effects of herbicides on biomarkers reflecting immune–

endocrine interactions in goldfish Immune and antioxidant effects. Aquat. Toxicol., v.

81, p. 159-167, 2006.

FANTA E.; RIOS, F. S.; ROMÃO, S.; VIANNA, A. C. C.; FREIBERGER, S.

Histopathology of the fish Corydoras paleatus contaminated with sublethal levels of

organophosphorus in water and food. Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 54, p. 119-130,

2003.

FENECH, M. The in vitro micronucleus technique. Mutat. Res., v. 455, p. 81-95,

2000.

FENT, K. Ecotoxicology of organotins compounds. Crit. Rev. Toxicol., v.26, n.1, p.

3-10, 1996.

FERNANDES, C. A,; MARTINS-SANTOS, I. C. Cytogenetic studies in two

populations of Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hered., v. 141, p. 1-5,

2004.

FERRARO, M. V. M.; FENOCCHIO, A. S.; MANTOVANI, M. S.; CESTARI, M. M.;

OLIVEIRA RIBEIRO, C. A. Mutagenic effects of tributyltin (TBT) and inorganic lead

(PbII) on the fish H. malabaricus as evaluated of using the Comet Assay, Piscine

Micronucleous and Chromosome Aberrations tests. Gen. Mol. Biol., v. 27, p. 103–

107, 2004.

FEUSSNER, I.; KÜHN, H.; WASTERNACK, C. The lipoxygenase dependent

degradation of storage lipids. Tren. Plant Sci., v. 6, p. 268–273, 2001.

FEUSSNER, I.; WASTERNACK, C.; KINDL, H.; KÜHN, H. Lipoxygenase catalysed

oxygenation of storage lipids is implicated in lipid mobilization during germination of

cucumber. Proc. Natl. Acad. Sci. v. 92, p. 11849–11853, 1995.

FILHO, O. G.; BRAGA, F. M. S. Fecundidade e desova de Astyanax bimaculatus e

Astyanax schubarti (Characidae, Tetragonopterinae) na represa Barra Bonita, Rio

Piracicaba, São Paulo. Unimar, v. 18 (2), p. 241-254, 1996.

FINK, S. V.; FINK, W. L. interrelationships os the Ostariophysan fishes (teleostei).

Zool. J. Linnean Soc., v. 72, p. 297-353, 1981.

FOLMAR, L. C.; SANDERS, H. O.; JULIN, A. M. Toxicity of the herbicide glyphosate

and several of its formulations to fish and aquatic invertebrates. Arch. Environ.

Cont. Toxicol., 1979.

FRANÇA, P. P. Uso de biomarcadores na avaliação do impacto do acidente do

navio Vicuna/2004 na Baía de Paranaguá, Pr. Análises Preliminares. Monografia,

Departamento Biologia Celular, Universidade Federal do Paraná, 2005.

FUNATURA (FUNDAÇÃO PRÓ-NATUREZA). Sistema Nacional de áreas naturais

protegidas – SISNANP (4º relatório parcial). Brasília, FUNATURA, 24p, 1989.

GALLOWAY, T. S.; MILLWARD, N.; BROWNE, M. A.; DEPLEDGE, M. H. Rapid

assessment of organophosphorus / carbamate exposure in the bivalve mollusc

Mytilus edulis using combined esterase activities as biomarkers. Aquat. Toxicol., v.

61, p. 169-180, 2004.

GASPAR DA LUZ, K. D.; OKADA, E. K. Diet and dietary overlap of three sympatric

fish species in lake of the upper Paraná river floodplain. Braz. Arch. Biol. Tech., v.

42, n. 4, p. 441-447, 1999.

GAYNOR, J. D.; MACTAVISH, D. C.; FINDLAY, W. I. Atrazine and metolachlor loss

in surface and subsurface runoff from three tillage treatments in corn. J. Environ.

Qual., v. 24, p. 246-256, 1995.

GEHIN, A.; GUYON, C.; NICOD, L. Glyphosate-induced antioxidant imbalance in

HaCaT: The protective effect of Vitamins C and E. Environ. Toxicol. Pharmacool.,

v. 22, p. 27-34, 2006.

GEISSBUHLER, H.; MARTIN, H.; VOSS, G. Phenylureas. In: KEARNEY, P. C.;

KAUFMAN, D. D. (Ed.). Herbicides: chemistry, degradation and mode of action.

New York: Marcel Dekker, v. 1, p. 216-218, 1975.

GEORGE, S. G. Enzymology and molecular biology of phase II xenobiotic –

conjugating enzymes in fish. In: Aquat. Toxicol., 1993.

GIESY, J. P.; GRANEY, R. L. Recent developments in and intercomparisons of acute

and chronic bioassays and bioindicators. Hydrobiol., v. 188, p. 21-60, 1989.

GILL, T. S.; PANDE, J.; TEWARI, H. Enzyme modulation by sublethal concentrations

of aldicarb, phosphamidon and endosulfan pesticides in fish tissues. Comp.

Biochem. Physiol., v.97, p. 244-287, 1990a.

GILL, T. S.; TEWARI, H.; PANDE, J. Use of the fish enzyme system in monitoring

water quality: effects of mercury on tissue enzymes. Comp. Biochem. Physiol., v.

97, p. 287-292, 1990b.

GIROTTI, A. W. Serial Review: Regulatory and Cytoprotective Aspects of Lipid

Hydroperoxide Metabolism. Free Radic. Biol. Med., v. 33, p. 154–172, 2002.

GLUSCZAK, L.; MIRON, D. S.; MORAES, B. S.; SIMÕES, R. R.; CHITOLINA

SCHETINGER, M. R.; MORSCH, V. M.; LORO, V. L. Acute effects of glyphosate

herbicide on metabolic and enzymatic parameters of silver catfish (Rhamdia quelen).

Comp. Biochem. Physiol., p. 519-524, 2007.

GOKSOYR, A.; FÖRLIN, L. The cytochrome P-450 system in fish, aquatictoxicology

and environmental monitoring. Aquat. Toxicol., v. 22, p. 287-312, 1992.

GRISOLIA, C. K.; CORDEIRO, C. M. T. Variability in micronucleus induction with

differten mutagens applied to several species of fish. Gen. Mol. Biol., v. 23, p. 235-

239, 2000.

GUILLOUSO, A.; MOREL, F.; RATANASAVANH, D.; CHESNE, C.; GUGUEN-

GUILLOUSO, C. Long-term culture of functional hepatocytes. Toxic vit., v. 4, p. 415-

427, 1990.

GÜL, S.; BELGE-KURUTAS, E.; YILDIZ, E.; SAHAN; A.; DORAN, F. Pollution

correlated modifications of liver antioxidant systems and histopathology of fish

(Cyprinidae) living in Seyhan Dam Lake. Turk. Environ. Int., v. 30, n. 5, p. 605-609,

2004.

HABIG W. H.; JAKOBY, W. B. Assays for differentiation of glutathione S

transferases. Meth. Enzymol., v. 77, p. 398-405, 1981.

HABIG, W. H.; PABST, M. J.; JAKOBY, W. B. Glutathione S-transferases. The first

enzymatic step in mercapturic acid formation. Biol. Chem., v. 249, p. 7130-7139,

1974.

HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free Radic. Biol. Med., 3a. ed. Oxford

Science Publications, Oxford, 1999.

HANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M.; MOORE, P. K. Farmacologia. 5ed. Rio

de Janeiro, Guanabara Koogan. P. 159-161, 2004.

HARTLEY, W.R. THIYAGARAJAH, A. & TREINIES, A.M. Liver lesions in the gar fish

(lepisosteidae) as biomarker of exposure. Mar. Environ. Res., v. 42, p. 217-221,

1996.

HAYES, J. D.; MCLELLAN, L. I. Glutathione and glutathione-de-pendent enzymes

represent a co-ordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic

Res., v. 31, p. 273– 300, 1999.

HEDDLE, J. A. A rapid in vivo test for chromosomal damage. Mutat. Res., v. 18, p.

187-190, 1973.

HEDDLE, J. A.; CIMINO, M. C.; HAYASHI, M.; ROMAGNA, M. D.; TUCKER, J. D.;

VANPRAIS, P. H.; MCGREGOR, J. T. Micronuclei as a index of Citogenetic Damage:

past, present and future. Environ. Mol. Mutag., v. 18, p. 277–291, 1991.

HENDRICKS, E. E.; SHAEFFER, D. J.; PERRY, J. A. In: LEVIN, S. A.; HARWELL,

M. A.; KELLY, J. R.; KIMBALL, K. D. Ecotoxicology: Problems and Appoaches,

Springer-Verlag, New York; cap. 13, p. 351-364, 1989.

HERMES-LIMA M.; WILLMORE, W. G.; STOREY, K. B. Quantification of lipid

peroxidation in tissue extracts based on Fe(III) xylenol orange complex formation.

Free Radic. Biol. Med., v. 19, p. 271-280, 1995.

HIGUCHI, Y. Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced by

oxidative stress. Biochem. Pharmacol., v. 66, p. 1527-1535, 2003.

HOOFTMAN, R. N.; de RAAT, W. K. Induction of nuclear anomalies (micronulei) in

the peripheral blood erythrocytes of the eastern mudminnow Umbra pygmea by ethyl

methanesulphonate. Mutat. Res., v. 104, p. 147-152, 1982.

HUGGETT, R. J.; KIMERIE, R. A.; MEHRIE, J. P. M.; BERGMAN, H. L. Biomarkes:

Biochemical, Physiological and Histological Markers of Antropogenic Stress. Boca

Raton: Lewis Publishers, 1992.

IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Disponível em:

http://www.ibge.gov.br/. Acesso em: 15 de setembro de 2007.

JIANG, Z. Y.; HUNT, J. V.; WOLF, S. P. Ferrous ion oxidation in the presence of

xylenol orange for detection of lipid hydroperoxide in low density lipoprotein. Analyt.

Biochem., v. 202, p. 384-389, 1992.

JONSSON, C. M.; FERRACINI, V. L.; PARAÍBA, L. C.; RANGEL, M.; AGUIAR, S, R.

Alterações bioquímicas e acúmulo em pacus (metynnis argenteus) expostos ao

paclobutrazol. Sci. Agricol., v. 59, n. 3, p. 441-446, 2001.

KEHRIG, H. A.; PINTO, F. N.; MOREIRA, I.; MALM, O. Heavy metals and

methylmercury in a tropical coastal estuary and a mangrove in Brazil. Org.

Geochem., v. 34, n. 5, p. 661-669, 2003.

KÖNEMANN, H. Fish toxicity tests with mixtures of more than two chemicals: A

proposal for a quantitative approach and experimental results. Toxicol., v. 19, p.

229-238, 1981.

KOZAR, R. A.; MCKEONE, B. J.; POWNALL, H. J. Free radical induced alterations in

endothelial cell function. J. Surg. Res., v. 56, p. 32–36, 1994.

KÜHN, H.; BORCHERT, A. Regulation of enzymatic lipid peroxidation: the interplay

of peroxidizing and peroxide reducing enzymes. Free Radic. Biol. Med., v. 33, p.

154-172, 2002.

LANGE, C. R.; SCOTT, S. R.; TANNER, M. Biomonitoring. Water Environ. Res.; v.

68, n. 4, p. 801-818, 1996.

LEMAIRE, P. ; LIVINGSTONE, D. R. Pro-oxidant/antioxidant pro-cesses and organic

xenobiotics interactions in marine organisms, in particular the flounder Platichthys

.esus and mussels Mytilus edulis. Trends Comp. Biochem. Physiol. v.1, p. 1119–

1150, 1993.

LIMA, F. C. T.; MALABARBA, . R. In: REIS, R. E.; KULLANDER, S. O.; FERRARIS

Jr. C. J. Check list of the freswater fishes of South and Central America. Porto

Alegre, 2003.

LIONETTO, M. G.; CARICATO, R.; GIORDANO, M. E.; PASCARIELLO, M. F.;

MARINOSCI, L.; SCHETTINO, T. Integrated use of biomarkers (acetylcholinesterase

and antioxidant enzymes activities) in Mytillus galloprovincialis and Mullus barbatus

in an italian coastal marine area. Mar. Pollut. Bull., v. 46, p. 324-330, 2003.

LIVINGSTONE, D. R. Contaminant-stimulated reactive oxygen species production

and oxidative damage in aquatic organisms. Mar. Pollut. Bull., v. 42, p. 656–666,

2001.

LIVINGSTONE, D. R.; LEMAIRE, P.; MATTHEWS, A.; PETERS, L. D.; BUCKE, D.;

LAW, R. J. Pro-oxidant, antioxidant and 7-ethoxyresorufin O -deethylase (EROD)

activity responses in liver of dab limanda ) exposed to sediment contaminated with

hydrocarbons and other chemicals. Mar. Pol. Bull., v. 26, p. 602–606, 1993.

LOPES, P. A.; PINHEIRO, T.; SANTOS, M. C.; DA LUZ MATHIAS, M.; COLLARES-

PEREIRA, M. J.; VIEGAS-CRESPO, A. M. Response of antioxidant enzymes in

freshwater fish populations (Leuciscus alburnoides complex) to inorganic pollutants

exposure. Sci. Total Environ., v. 280, p. 153–163, 2001.

MANNICK, J. B.; SCHONHOFF, C. M. Nitrosylation: the next phosphorylation? Arch.

Biochem. Biophysics, v. 408, p. 1-6, 2002.

MASON, R. P.; WALTER, M. F.; MASON, P. E. Effect of oxidative stress on

membrane structure: small-angle X-ray diffraction analysis. Free Radic. Biol. Med.,

v. 23, p. 419–425, 1997.

MATSUI, K.; SHIBATA, Y.; TATEBA, H.; HATANAKA, A.; KAJIWARA, T. Changes of

lipoxygenase and fatty acid hydroperoxide lyase activities in bell pepper fruits during

maturation. Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 61, p. 199–201, 1997.

MCCARTHY, J. F.; SHUGART, L. R. Biological markers of environmental. Boca

Raton: Lewis Publishers, p. 3-16, 1990.

MEAGHER, E. A.; FITZGERALD, G. A. Indices of lipid peroxidation in vivo: Strengths

and limitation. Free Radic. Biol. Med., v. 26, p. 202–226, 2000.

MESEGUER, J.; LÓPEZ-RUIZ, A.; ESTEBAN, M.A. Melano-macrophages of the

seawater teleosts, sea bass (Dicentrarcus labrax) and gilthead seabream (Sparus

aurata): morphology, formation and possible function. Cell Tissue Res., v. 277, p 1-

10, 1994.

MINISSI, S.; CICCOTTO, E.; RIZZONI, M. Micronucleus test in erythrocytes of

Barbus plebejus (Teleostei, Pisces) from two natural environments: a bioassay for

the in situ detection of mutagens in freshwater. Mutat. Res., v. 367, p. 245–251,

1996.

MIKICH, S. B. A dieta dos morcegos frugívoros (Mammalia, Chiroptera,

Phyllostomidae) de um pequeno remanescente de Floresta Estacional Semidecidual

do sul do Brasil. Rev. Bras. Zool., v. 19, p. 239-249, 2002.

MIKICH, S. B.; BIANCONI, G. V.; MAIA, B. H. L. N. S.; TEIXEIRA, S. D. Attraction of

the fruit-eating bat Carollia perspicillata to Piper gaudichaudianum essential oil. J.

Chem. Ecol.., v. 10, p. 2379-2383, 2003.

MILANO, Miguel S. Mitos e manejo de unidades de conservação no Brasil, ou a

verdadeira ameaça. In: Congresso Brasileiro de Unidades de Conservação, 2., 2000,

Campo Grande. Anais do Congresso. Campo Grande: Rede Nacional Pró-

Unidades de Conservação; Fundação O Boticário de Proteção à Natureza, 2000.

MMA/IBAMA. Marco conceitual das unidades de conservação federais do

Brasil. Brasília: IBAMA; GTZ, 1997.

MMA/IBAMA. Roteiro metodológico para o planejamento de unidades de

conservação de uso indireto. Brasília: IBAMA, 1996.

MONSERRAT, J. M.; BIANCHINI, A. Anticholinesterase effect of eserine

(physostigmine) in fish and crustacean species. Braz. Arch. Biol. Technol., v. 44, n.

1, p. 63-68, 2001.

MONSERRAT, J. M.; BIANCHINI A.; BAINY, A. C. D. Kinetic and toxicological

characteristics of acetylcholinesterase from the gills of oysters (Crassostrea

rhizophorae) and other aquatic species. Mar. Environ. Res., v. 54, n. 3-5, p. 781-

785, 2002.

MONTEIRO, M.; QUINTANEIRO, C.; MORGADO, F.; SOARES, A. M. V. M.;

GUILHERMINO, L. Characterization of the cholinesterases present in head tissues of

the estuarine fish Pomatoschistus microps: Application to biomonitoring. Ecotoxicol.

Environ. Saf., v. 62, n. 3, p. 341-347, 2005.

MOUCHET, F.; GAUTHIER, L.; MAILHES, C.; JOURDAIN, M. J.; FERRIER, V.;

TRIFFAULT, G.; DEVAUX, A. Biomonitoring of the genotoxic potential of aqueous

extracts of soils and bottom ash resulting from municipal solid waste incineration,

using the comet and micronucleus tests on amphibian (Xenopus laevis) larvae and

bacterial assays (Mutatox® and Ames tests). Sci. Total Environ., v. 355, n. 1-3, p.

232-246, 2006.

MURPHY, S. D. Pesticides. In: DOUL, J., KLASSEN, C.D., ANDERS, M. O. (Eds.)

The Basic Science of Poisons. Macmillan, New York, pp. 519-581, 1986.

MUSUMECI, M. P.; NAKAGAWA, L. E.; LUCHINI, L. C.; MATALLO, M. B.; ANDREA,

M. M. Degradação do diuron-

C em solo e em plantas de cana-de-açúcar

(Saccharum spp.). Pesq. Agrop. Bras., v. 30, p. 775-778, 1995.

NASCI, C.; NESTO, N.; MONTEDURO, R. A.; DA ROS, L. Field application of

biochemical markers and a physiological index in the mussel, Mytilus

galloprovincialis: transplantation and biomonitoring studies in the lagoon of Venice

(NE Italy). Mar. Environ. Res., v. 54, n. 3-5, p. 811-816, 2002.

NEBEKER, A. V.; SCHUYTEMA, G. S. Chronic effects of the herbicide diuron on

freshwater Cladocerans, Amphipods, Midges, Minnows, Worms and Snails. Arch.

Environ. Cont. Toxicol., v.35, 1998.

NIEDERER, C.; BEHRA, R.; HARDER, A.; SCHWARZENBACH, R. P; ESCHER, B.

I. Mechanistic approaches for evaluating the toxicity of reactive organochlorines and

epoxides in green algae. Environ. Toxicol. Chem., v. 23, p. 697-704, 2001.

NORDBERG, J.; ARNÉR, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the

mammalian thioredoxin system. Free Radic. Biol. Med., v. 31, p. 1287-13121, 2001.

NOREÑA-BARROSO, E.; SIMÁ-ÁLVAREZ, R.; GOLD – BOUCHOT, G.; ZAPATA-

PÉREZ, O. Persistent organic pollutants and histological lesions in Mayan catfish

Ariopsis assimilis from the the Estuary of Chetumal, Mexico. Mar. Poll. Bull., v. 48,

p. 263- 269, 2004.

OBE, G.; PFEIFFER, P.; SAVAGE, J. R .K.; JOHANNES, C., GOEDECKE, W.;

JEPPESEN, P.; NATARAJAN, A. T.; MARTÍNEZ-LOPEZ, W., FOLLE, G .A.; DRETS,

M. E. Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. Mutat.

Res., v. 504, p. 17–36, 2002.

ODUM, E. P. Ecologia. Ed. Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro. 1ª Ed., 434p,

1988.

OLGUN, S.; GOGAL, R. M. Jr.; ADESHINA, F.; CHOUDHURY, H.; MISRA, H. P.

Pesticide mixtures potentiate the toxicity in murine thymocytes. Toxicol., v. 196, p.

181-195, 2004.

OLIVEIRA, F. R. A.; VALARINI, P. J.; POPPI, R. J. Indicadores de qualidade do solo

e área de mato e cultivado com cana orgânica e convencional. Ver. Bras.

Agroecol., v. 2, p. 1299-1302, 2007.

OLIVEIRA RIBEIRO, C. A.; PELLETIER, É.; PFEIFFER, W. C.; ROULEAU, C.

Comparative uptake, bioaccumulation, and gill damages of inorganic mercury in

tropical and nordic freshwater fish. Environ. Res., v. 83, p. 286-292, 2000.

OLIVEIRA RIBEIRO, C. A.; ROULEAU, C.; PELLETIER, É.; AUDET, C. E TJÄLVE,

H. Distribution kinetics of dietary methylmercury in the Artic charr (Salvelinus

alpinus). Environ. Sci. Technol., v. 33, p. 902-907, 1999.

OLIVEIRA RIBEIRO, C. A.; BELGER, L.; PELLETIER, É.; ROULEAU, C.

Histopathological evidence of inorganic mercury and methyl mercury toxicity in the

arctic charr (Salvelinus alpinus). Environ. Res., v. 90, p. 217-225, 2002.

OLIVEIRA RIBEIRO, C. A.; VOLLAIRE, Y.; SANCHEZ-CHARDI, A.; ROCHE, H.

Bioaccumulation and the effects of organochlorine pesticides, PAH and heavy metals

in the Eel (Anguilla anguilla) at the Camargue Nature Reserve, France. Aquat.

Toxicol., v. 74, p. 53-69, 2005.

ORLANDO, H. Unidades de conservação e manejo da zona de entorno. In:

CONGRESSO BRASILEIRO DE UNIDADES DE CONSERVAÇÃO, 1., 1997,

Curitiba. Anais do Congresso. Curitiba: IAP, UNILIVRE, Rede Nacional Pró-

Unidades de Conservação, 1997.

ORSI, M. L.; CARVALHO, E. D.; FORESTI, F. Biologia populacional de Astyanax

altiparanae Garutti & Britski (Teleostei, Characidae) do médio Rio Paranapanema,

Paraná, Brasil. Ver. Bras. Zool., v. 21, p. 207-218, 2004.

PADOVAN, Maria P. Implantacion de la zona de amortiguamiento en el Parque

Nacional Pico Bonito, Honduras. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE UNIDADES DE

CONSERVAÇÃO, 2., 2000, Campo Grande. Anais do Congresso. Campo Grande:

Rede Nacional Pró-Unidades de Conservação; Fundação O Boticário de Proteção à

Natureza, 2000.

PACHECO, M.; SANTOS, M. A. Biotransformation, genotoxic, and histopathological

effects of environmental contaminants in European eel (Anguilla anguilla L.).

Ecotoxicol. Environ. Saf., v.53, n. 3, p. 331-347, 2002.

PADROS, J.; PELLETIER, E.; OLIVEIRA RIBEIRO, C. A. Metabolic interactions

between low doses of benzo[a]pyrene and tributyltin in artic charr (Salvelinus

alpinus): a long-term in vivo study. Toxicol. Appl. Pharmacol, v. 192, p. 45–55,

2003.

PALMER, R. M. J.; FERRIGE, A. G.; MONCADA, S. Nitric oxide release accounts for

the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, v. 327, p. 524-

526, 1987.

PASTORE, A.; GIORGIO, F.; BERTINI, E.; PIEMONTE, F. Analysis of glutathione:

implication in redox and detoxification. Clinic. Chim. Acta, v. 333, p. 19–39, 2003.

PASTRO, M. A. Avaliação de risco do produto rodeo (princípio ativo glifosato)

para o ambiente aquático. Universidade Federal de Viçosa. Dissertação mestrado,

1995.

PEAKALL, D. B. The use of biomarkers in hazard assessment. In: Biomarkers: A

Pragmatic Basis for Remediation of Severe Pollution in eastern Europe. 1 ed.

Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. Parte 1, cap. 9, p.123-133, 1999.

PORTE, C.; SOLE, M.; ALBAIGES, J.; LIVINGSTONE, D. R. Responses of mixed-

function oxygenase and antioxidase enzyme systym of Mytilus sp. to organic

pollution. Comp. Biochem. Physiol., v. 100, p. 183-186, 1991.

RABITTO, I.; ALVES COSTA, J. R. M.; AKAISHI, F. M.; SILVA DE ASSIS, H. C.;

PELLETIER, E.; OLIVEIRA RIBEIRO, C. A. Dietary Pb(II) and TBT (tributyltin)

exposures to neotropical fish Hoplias malabaricus: histopatological and biochemical

findings. Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 60, p. 147–156, 2005.

RADTKE, R. The mummichog: a fish for all reasons. Sea Front., v. 5, p. 145-149,

1979.

RAINBOW, P. S. Biomonitoring of heavy metal availability in the marine environment.

Mar. Pollut. Bull., v. 31, n. 4-12, p. 183-192, 1995.

RAND E PETROCELLI, S. R. Fundamentais of Aquatic Toxicology: Methods and

aplications. Washington USA, Hemisph. Publ., 666p, 1985.

RANK, J.; JENSEN, K.; JESPERSEN, P. H. Monitoring DNA damage in indigenous

blue mussels (Mytilus edulis) sampled in costal sites from Denmark. Mutat. Res., v.

585, p. 33-42, 2005.

RAO, P. S. C.; DAVIDSON, J. M. Retention and transformation of selected pesticides

and phosphorus in soil-water systems: a critical review. Washington: US-EPA, 1982.

RAO, S. S.; NEHELI, T.; CAREY, J. H.; CAIRNS, V. W. Fish hepatic micronuclei as

an indication of exposure to genotoxic environmental contaminants. Environ.

Toxicol. Water Qual., v. 12, p. 217–222, 1997.

REDDY, D. C.; VIJAYAKUMARI, P.; KALARANI, V.; DAVIES, R. W. Changes in

Erythropoietic activity of Sarotherodon mossambicus exposed to sublethal

concentrations of the herbicide diuron. Bull. Environ. Contam. Toxicol., v. 49, p.

730-737, 1992.

REGOLI, F.; NIGRO, M.; BENEDETTI, M.; FATTORINI D.; GORBI, S. Antioxidant

efficiency in early life stages of the antarctic silverfish, Pleuragramma antarcticum:

Responsiveness to pro-oxidant conditions of platelet ice and chemical exposure.

Aquat. Toxicol., v. 75, p. 43-52, 2005.

REMEO, M.; GNASSIA-BARELLI, M. Effect of heavy metals on lipid peroxidation in

the Mediterranean Clam Ruditapes decussatus. Comp. Biochem. Physiol., v. 118,

p. 33–37, 1997.

RIBEIRO, L. R. Testes do micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo.

Mutag. Amb., Botucatu, p. 173 – 176, 2003.

ROCHE, H.; BUET, A.; RAMADE, F. Accumulation of lipophilic microcontaminants

and biochemical responses in eels from the Camargue Biosphere Reserve.

Ecotoxicol., v. 11, p.155-164, 2002.

RODRIGUEZ-ARIZA, A.; PEINADO, J.; PUEYO, C.; LOPEZ-BAREA, J. Biochemical

indicators of oxidative stress in fish from polluted littoral areas. Can. J. Fish. Aquat.

Sci., v. 50, p. 2568–2573, 1993.

RODRIGUEZ-FUENTES, G.; GOLD-BOUCHOT, G. Environmental monitoring using

acethylcholinesterase inhibition in vitro. A case study in two Mexican lagoons. Mar.

Environ. Res., v. 50, p. 357-360, 2000.

RODRIGUEZ, L. C.; GÓMEZ, C. A. Parque Nacional Cerro Corá: educación

ambiental en su zona de influencia. In: UICN. Espacios sin habitantes? Parques

Nacionales de América del Sur. Nueva Sociedad, 1992.

RODRIGUES, L. C. Estudo das Glutation S-Transferases Hepáticas Solúveis do

Peixe Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Pacu). Tese de doutorado em

Bioquímica, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes/UERJ, Brasil, 2003.

SCHEWE, T.; RAPOPORT, S. M.; KÜHN, H. Enzymology and physiology of

reticulocyte lipoxygenase: comparison with other lipoxygenases. Adv. Enzymol.

Relat. Areas Mol. Biol., v. 58, p. 191–272, 1986.

SCHWAIGER, J.; WANKE, R.; ADAM, S.; PAWERT, M.; HONNEN, W.;

TRIEBSKORN, R. The use of histopathological indicators to evuluate contaminant-

related stress in fish. J. Aquat. Ecosyst. Stress Rec., v. 6, p. 75-86, 1997.

SEMA – Secretaria de Estados e Meio Ambiente e Recursos Hídricos. Citação e

referências a documentos eletrônicos. Disponível em: http://www.pr.gov.br/sema.

Acesso em: 14 de setembro de 2007.

SCHMITT, C. J.; ZAJICEK, J. L.; MAY, T. W. E COWMAN, D. F. Organochlorine

residues and elemental contaminants in U.S. freshwater fish, 1976-1986: National

Contaminant Biomonitoring Program. Rev. Environ. Cont. Toxicol., v. 162, p. 43-

104, 1999.

SEVANIAN, A.; URSINI, F. Lipid peroxidation in membranes and lowdensity

lipoproteins: similarities and differences. Free Radic. Biol. Med., v. 29, p. 306–311,

2000.

SHUGART, L. R.; McCARTHY, J. F.; HALBROOK, R. S. Biological markers of

environmental and ecological contamination: an overview. Risk. Anal., v. 12, p. 353-

360, 1992.

SIES, H. Oxidative stress: Introdutory remarks Academic Press, London, UK. In:

SIES, H. Oxidative Stress, London: Academic Press, p. 1-8, 1985.

SILVA, C. A. R.; RAINBOW, P. S.; SMITH, B. D.; SANTOS, Z. L. Biomonitoring of

trace metal contamination in the Potengi estuary, Natal (Brazil), using the oyster

Crassostrea rhizophorae, a local food source. Water Res., v. 35, n. 17, p. 4072-

4078, 2001.

SILVA, C. L. Análise da Vulnerabilidade Ambiental aos Principais Pesticidas

Recomendados para os Sistemas de Produção de Algodão, Arroz, Café, Cana-

De-Açúcar, Citros, Milho e Soja. Dissertação mestrado, Universidade Estadual de

Campinas, 2004.

SILVA DE ASSIS, H. C. Der Einsatz von Biomarkern zur summarischen

Erfassung von Gewässerverschmutzungen. Tese doutorado, Universidade

Técnica de Berlim, Alemanha, 99 pp, 1998.

SILVA FILHO, M. V; OLIVEIRA M. M.; CUNHA BASTOS, V. L. F.; ALVES, M. V. E.

C.; CUNHA BASTOS, J. Validação de espécies sentinelas para a Biomarcação com

Colinesterase de Peixe. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, UERJ.

Ecotoxicologia Perspectivas para o século XXI, ed. RIMA, São Carlos, p.147-154,

2000.

SILVA, M. D. Biomonitoramento de uma reserva particular do patrimônio

natural – RPPN – através do estudo de biomarcadores em Astyanax sp.

Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal do

Paraná, 2004.

SINDAG (Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola):

Defensivo Agrícola: O que é? Citação e referências a documentos eletrônicos.

Disponível em: www.sindag.com.br. Acesso em: 24 julho de 2006.

SMITH, E. A.; OEHME, F. W. The biological activity of gliphosate to plants and

animals: a literature review. Vet. Hum. Toxicol., v. 34, n. 6, p. 531-543, 1992.

SRIDEVI, B.; REDDY, K. V.; REDDY, S. L. N. Effect of trivalent and hexavalent

chromium on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in a freshwater field

crab, Barytelphusa guerini. Bull. Environ. Contam. Toxicol., v. 61, 384–390, 1998.

STEGEMAN, J. J.; BROUWER, M.; DI GIULIO, R. T.; FÖRLIN, L.; FOWLER, B. A.;

SANDERS, B. M.; VAN VELD, P. A. Molecular reponses to enzyme and protein

systems as indicators of chemical exposure and effect. Environ. Res., p. 235-335,

1992.

STEHR, C. M.; MYERS, M. S.; JOHNSON, L. L.; SPENCER, S.; STEIN, J. E.

Toxicopathic liver lesions in English sole and chemical contaminant exposure in

Vancouver Harbour, Canada. Mar. Environ. Res., v. 57, p. 55-74, 2003.

STENTIFORD, G. D.; LONGSHAW, M.; LYONS, B. P.; JONES, G.; GREEN, M.;

FEIST, S. W. Histopathological biomarkers in estuarine fish species for the

assessment of biological effects of contaminants. Mar. Environ. Res., v. 55, n. 2, p.

137-159, 2003.

STOREY, K. B. Oxidative stress: animal adaptations in nature. Braz. J. Med. Biol.

Res., v. 29, p. 1715-1733, 1996.

STRMAC, M.; BRAUNBECK, T. Cytological and biochemical effects of a mixture of

20 pollutants on isolated rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes.

Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 53, p. 293-304, 2002.

STURM, A.; SILVA DE ASSIS, H. C.; HANSEN, P. D. Cholinesterases of marine

teleost fish: enzymological characterization and potencial use in the monitoring of

neurotoxic contamination. Mar. Environ. Res., v. 47, p. 1-10, 1999.

STURM, A.; WOGRAM, J.; SEGNER, H.; LIESS, M. Different sensitivity to

organophosphates of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase from three-

spined stickleback (Gasterosteus aculeatus ): application in biomonitoring. Environ.

Toxicol. Chem. 19, 1607-1615, 2000.

SUZUKI, H. I.; AGOSTINHO, A. A. Reprodução de peixes do reservatório de

Segredo. In: AGOSTINHO, A. A. & GOMES, L. C. Reservatório de Segredo: bases

ecológicas para manejo. Maringá: EDUEM, p.163-182, 1997.

SVÄRDH, L. Tissue sampling from live blue mussels, Mytilus edulis. A field study

from the Swedish west coast. J. Sea Res., v. 322, p. 1-5, 2003.

TAKASHIMA, F.; HIBIYA T. An atlas of fish histology: normal and pathological

features. New York, 1995.

TEISSEIRE, H.; VERNET, G. Is the “Diuron Effect” Due to a Herbicide Strengthening

of Antioxidative Defenses of Lemna minor? Pestic. Biochem. Physiol., v. 66, p.153-

160, 2000.

TEJEDA-VERA, R.; LÓPEZ-LÓPEZ, R.; SEDEÑO-DÍAZ, J. E. Biomarkers and

bioindicators of the health condition of Ameca splendens and Goodea atripinnis

(Pisces: Goodeaidae) in the Ameca River, Mexico. Environ. Int., v. 33, p. 521-531,

2007.

TEW, K. D.; RONAI, ZEEV. GST function in drug and stress response. Drug Resist.

Upd., v. 2, p. 143–147, 1999.

THOMAS, P.; WOFFORD, H. W. Effects of cadmium and Aroclor 1254 on lipid

peroxidation, glutathione peroxidase activity, and selected antioxidants in Atlantic

croaker tissues. Aquat. Toxicol., v. 27, p. 159–178, 1993.

TOMITA, R. Y. Toxicologia em ambientes aquáticos. O Biológico, São Paulo, v. 64,

n. 2, p. 135-142, 2002.

TORTELLI, V.; COLARES, E. P.; ROBALDO, R. B.; NERY, L. E. M.; PINHO, G. L. L.;

BIANCHINI, A.; MONSERRAT, J. M. Importance of cholinesterase kinetic parameters

in environmental monitoring using estuarine fish. Chemosph.. v. 65, p. 560-566,

2006.

TORRES, M. A.; TESTA, C. P.; GÁSPARI, C. Oxidative stress in the mussel Mytella

guyanensis from polluted mangroves on Santa Catarina Island, Brazil. Mar. Pollut.

Bull., v. 44, p. 923-932, 2002.

UIEDA, V. S.; BARRETO, M. G. Composição da ictiofauna de quatro trechos de

diferentes ordens do rio Capivara, bacia do Tietê, Botucatu, São Paulo. Ver. Bras.

Zooc., v. 1. p. 55-67, 1999.

VAN DER OOST, R.; OPPERHUIZEN, A.; SATUMALAY, K.; HEIDA, H.;

VERMEULEN, N. P. E. Biomonitoring aquatic pollution with feral eel (Anguilla

anguilla) I. Bioaccumulation: biota-sediment ratios of PCBs, OCPs, PCDDs and

PCDFs. Aquat. Toxicol., v. 35, p. 21-46, 1996.

VAN DER OOST, R.; BEYER, J.; VERMEULEN, N. P. E. Fish bioaccumulation and

biomarkers in environmental risk assessment. Envir. Toxicol. Pharmacol., v. 13, p.

57-149, 2003.

VAN LEYEN, K.; DUVOISIN, R. M.; ENGELHARDT, H.; WIEDMANN, M. A. Function

for lipoxygenase in programmed organelle degradation. Nature, v. 395, p. 392–395

1998.

VASSUER, P.; COSSU-LEGUILLE, C. Biomarkers and community indices as

complementary tools for environmental safety. Environ. Int., v. 28, p. 711–717,

2003.

VENTURA, E. C.; GAELZER, L. R.; ZANETTE, J.; MARQUES, M. R. F.; BAINY, A.

C. D. Biochemical indicators of contaminant exposure in spotted pigfish (Orthopristis

ruber) caught at three estuarys of Rio de Janeiro coast. Mar. Environ.l Res., v. 54,

p. 775-779, 2002.

WALKER, C. M.; HOPKIN, S. P.; SIBLY, R. M.; PEAKALL, D. B. Principles of

Ecotoxicology. Bristol, PA: Taylor e Francis, 1996.

WATANABE, R.; COLER, A.; PAZ, R. J. The implementation of a regional

biomonitoring program in northeast Brazil. Aquat. Ecosyst. Health Manag., v. 2, p.

187-189, 1999.

WESTER, P. W; CANTON, J. H. The usefulnes of histophatology in aquatic toxicity

studies. Comp. Biochem. Physiol., v. 100, p.115-117, 1991.

WESTER, P. W.; VAN DER VEN, L. T. M.; VETHAAK, A. D.; GRINWIS, G. C. M.;

VOS, J. G. Aquatic toxicology: opportunities for enhancement through

histopathology. Environmental Toxicol. Pharmacol., v. 11, p. 289-295, 2002.

WILHELM FILHO, D.; TORRES, M. A.; TRIBESS, T. B.; PEDROSA, R. C.; SOARES,

C. H. L. Influence of season and pollution on the antioxidant defenses of the cichlid

fish acará (Geophagus brasiliensis). Brazil. J. Med. Biol. Res., v. 34, p. 719-726,

2001.

WHO (World Health Organization). Environmental heath criteria. Gliphosate. 177p,

1994.

XIA, C; HU, J.; KETTERER, B.; TAYLOR, J. B. The organization of the human GSTP

1-1 gene promoter and its response to retinoic acid and cellular redox status.

Biochem. J., v. 313, p. 155-61, 1996.

ZANETTE, J.; MONSERRAT, J. M.; BIANCHINI, A. Biochemical biomarkers in gills of

mangrove oyster Crassostrea rhizophorae from three Brazilian estuaries. Comp.

Biochem. Physiol., v. 143, p. 187-195, 2006.

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