( PDF ) Avaliação do efeito anti-inflamatório e antibacteriano da Lotus corniculatus v. São Gabriel

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JANAÍNA KOELZER

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antibacteriano da

Lotus corniculatus v. São Gabriel

Florianópolis

2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

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JANAÍNA KOELZER

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antibacteriano da

Lotus corniculatus v. São Gabriel

Dissertação apresentada ao curso de Pós-

graduação em Farmácia do Centro de

Ciências da Saúde da Universidade

Federal de Santa Catarina como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre

em Farmácia, sob a orientação da Profa.

Dra. Tânia Silvia Fröde.

Florianópolis

2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

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"Ser feliz é reconhecer que vale a

pena viver apesar de todos os

desafios, incompreensões e

períodos de crise

Ser feliz é deixar de ser vítima dos

problemas e se tornar um autor da

própria história

É atravessar desertos fora de si, mas

ser capaz de encontrar um oásis no

recôndito da sua alma

É agradecer a Deus a cada manhã

pelo milagre da vida

Ser feliz é não ter medo dos próprios

sentimentos

É saber falar de si mesmo

É ter coragem para ouvir um “Não”

É ter segurança para receber uma

crítica, mesmo que injusta

Pedras no caminho?

Guardo todas, um dia vou construir

um castelo...”

(Fernando Pessoa)

Aos meus pais, Vera e Gilberto, por

todo amor, apoio e confiança em

mim depositada.

Ao meu marido Jerônimo, por todo

amor, apoio, companheirismo e

sacrifício, de ambas as partes, para

a realização desse trabalho.

AGRADECIMENTOS

A Deus, que sempre me guiou a trilhar o caminho do amor, do conhecimento e da

esperança de tentar, com a minha pequena contribuição, construir um mundo

melhor;

Aos meus pais, Vera Lúcia Koelzer e Gilberto Renato Koelzer, pessoas que eu

amo e que me apoiaram em todos os momentos, depositando em mim a confiança

necessária durante esses dois anos de trabalho. Estiveram ao meu lado para me dar

força nos momentos em que eu mais necessitei;

Ao meu marido, Jerônimo Caetano Salazar, pelo amor, confiança, respeito e

principalmente, por acreditar e proporcionar que eu realizasse o meu sonho. Não foi

fácil esse último ano, enfrentamos a saudade e o sofrimento de estarmos separados.

Tenho certeza que esse foi só mais um obstáculo que atravessamos e que serviu

como uma demonstração de amor e admiração mútuos;

À minha orientadora, Profa. Dr. Tânia Silvia Fröde, por me receber de forma tão

aberta, pela dedicação e atenção dedicadas a mim, e principalmente por contribuir

na construção do meu conhecimento;

Aos meus amigos e colegas de laboratório: Ziliani Buss, Rafael de Liz, Jucélia

Benincá, Gustavo dos Reis, Giliard Astolfi, Patrícia Pozzatti, Silvana Zucolotto,

Silvana Vigil, Diana Pereira, Eduardo Dalmarco e Juliana Dalmarco, por me

receberem de forma tão amável e compartilharem comigo o conhecimento,

proporcionarem troca de experiências e uma convivência muito agradável com todos

vocês. Agradeço de forma especial a Ziliani, pessoa que me recebeu de braços

abertos e a quem devo por tudo que aprendi no laboratório, e também à Diana e ao

Eduardo, meus parceiros de experimento e amigos para todas as horas de trabalho.

Jamais esquecerei os dois anos que convivi com todos vocês, agradeço de coração

por tudo;

A todos os meus familiares e amigos que acreditaram em mim, me apoiando e

estimulando a chegar ao final desta caminhada, os meus sinceros agradecimentos

por cada palavra de estímulo;

Obrigada a todos vocês por fazerem parte da minha vida.

SUMÁRIO

Pag.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

LISTA DE FIGURAS 9

RESUMO 10

ABSTRACT 12

1. INTRODUÇÃO 14

1.1. PLANTAS MEDICINAIS 14

1.2. O GÊNERO Lotus

1.3. O PROCESSO INFLAMATÓRIO 16

1.4. MODELOS DE INFLAMAÇÃO 20

1.5. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA 20

2. OBJETIVOS 22

2.1. OBJETIVO GERAL 22

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 22

3. ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO - FOOD CHEMISTRY 23

4. ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO – JOURNAL OF PHARMACY AND

PHARMACOLOGY

5. DISCUSSÃO 66

6. CONCLUSÕES 73

7. PERSPECTIVAS 76

REFERÊNCIAS 77

ANEXO 1: Protocolo de extração do extrato bruto, frações e compostos

isolados da Lotus corniculatus v. São Gabriel

ANEXO 2: Protocolo do estudo anti-inflamatório do mecanismo de ação da

Lotus corniculatus v. São Gabriel

ANEXO 3: Protocolo e cadastro da Comissão de Ética no Uso de Animais

(CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)

LISTA DE ABREVIAÇÕES

, A

e A

Receptores de Adenosina

AcOEt Fração acetato de etila obtida do extrato bruto da Lotus corniculatus v.

São Gabriel

ADA Adenosina-deaminase

AF Fração resíduo aquoso obtido do extrato bruto da Lotus corniculatus v.

São Gabriel

ATCC American Type Culture Collection

B1 Receptor B1 da bradicinina

B2 Receptor B2 da bradicinina

BuOH Fração butanólica obtida do extrato bruto da Lotus corniculatus v. São

Gabriel

CBM Concentração Bactericida Mínima

CD11b/CD18 Molécula de adesão do tipo β2-integrina expressa em neutrófilos

CE Extrato bruto da Lotus corniculatus v. São Gabriel

Cg Carragenina

CGS21680 Agonista seletivo do receptor A

CIM Concentração Inibitória Mínima

ConA Concavalina A

COX-2 Ciclooxigenase tipo 2

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazil

ECCO European Culture Collection Organization

ELISA Enzimaimunoensaio

EPAGRI Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa

Catarina S.A.

EROS Espécies Reativas de Oxigênio

EtOAc Acetato de Etila

EtOH Etanol

GTPase Guanosina trifosfato hidrolase

HEX Fração hexano obtida do extrato bruto da Lotus corniculatus v. São

Gabriel

i.p. Via intraperitoneal

i.pl. Via intrapleural

i.v. Via intravenosa

IFN-γ Interferon gama

IL-4 Interleucina-4

IL-5 Interleucina-5

IL-10 Interleucina-10

IL-12 Interleucina-12

IL-1β Interleucina-1 beta

IL-1 R1 Receptor de interleucina-1

IoM Ionomicina

KC Quimiocina para neutrófilo

LPS Lipopolissacarídeo

MIP-2 Proteína inflamatória de macrófago 2

MK 886 Inibidor de leucotrienos

MPO Mieloperoxidase

NADPH oxidase Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase

NF-

Fator de transcrição nuclear kappa B

NK Célula Natural Killer

NO Óxido nítrico

Concentrações de nitrato/nitrito

NOS

Óxido nítrico sintase

eNOS

Óxido nítrico sintase constitutiva endotelial

iNOS

Óxido nítrico sintase induzida

nNOS

Óxido nítrico sintase constitutiva neuronal

PCA 4248 Inibidor seletivo do fator ativador de plaquetas

PCR Proteína C Reativa

PGE

Prostaglandina E

PMA Forbol-12-miristato-13-acetato

RAW 264.7 Linhagem de macrófagos de camundongos

SC-51 Inibidor seletivo de Inos

SOD Superóxido desmutase

TCC Cloridrato de tetrazolium-trifenil

TNF-

Fator de necrose tumoral alfa

TNF RI Receptor do tipo I do fator de necrose tumoral

TNF RII Receptor do tipo II do fator de necrose tumoral

TPA 12-O-tetradecanoilforbol acetato

ZM241385 Antagonista seletivo do receptor A

WHO World Health Organization

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Lotus corniculatus v. São Gabriel 16

Figura 2 Mecanismo de ação anti-inflamatória proposto para a Lotus

corniculatus v. São Gabriel

Figura 3 Efeito antibacteriano da Lotus corniculatus v. São Gabriel 73

RESUMO

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antibacteriano da Lotus corniculatus v.

São Gabriel

A Lotus corniculatus (Fabaceae) é distribuída em muitas regiões do mundo e possui

grande valor agronômico por seus constituintes: proantocianidinas, flavonoides e ácido

oleanólico. Esta planta é utilizada como alimento para o gado proporcionando o

aumento no ganho de peso e na produção de leite, além do controle de infecções

intestinais parasitárias nos animais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito anti-

inflamatório e antibacteriano do extrato bruto (CE) da Lotus corniculatus v. São Gabriel,

frações (hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanólica (BuOH) e resíduo aquoso

(AF)), e compostos isolados (canferitrin, ácido oleanólico e β-sitosterol). As partes

aéreas da Lotus corniculatus foram secas a temperatura ambiente, e a partir desse

material (620 g), foi extraído o extrato bruto (CE) por maceração com etanol 96% por um

mês. O solvente foi evaporado resultando em 78 g de extrato bruto (CE). O extrato bruto

foi fracionado por extração líquido-líquido utilizando solventes em ordem crescente de

polaridade resultando nas frações hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanólica

(BuOH) e resíduo aquoso (AF). A partir da fração HEX foram isolados o ácido oleanólico

e o β-sitosterol, e a partir da fração AcOEt o canferitrin. Para a avaliação da atividade

anti-inflamatória foi utilizado o modelo de pleurisia induzida pela carragenina, em

camundongos, e foram avaliados os seguintes parâmetros inflamatórios: concentrações

de leucócitos, exsudação, atividade da mieloperoxidase (MPO) e da adenosina-

deaminase (ADA), além das concentrações de nitrito/nitrato (NO

) e interleucina-1 beta

(IL-1β). Nesse protocolo experimental, foram utilizados camundongos albinos suíços, os

quais foram distribuídos em diferentes grupos e tratados com CE (100 – 400 mg/kg),

HEX (50 – 200 mg/kg), AcOEt (100 – 400 mg/kg), BuOH (50 – 200 mg/kg), AF (25 – 200

mg/kg), canferitrin (50 – 100 mg/kg), ácido oleanólico (10 – 100 mg/kg) ou β-sitosterol

(10 – 100 mg/kg) 0,5 h antes da administração da carragenina (1%, i.pl.). Os parâmetros

inflamatórios foram avaliados 4 h após. Todos os animais, exceto nos experimentos que

foram analisadas as atividades enzimáticas, foi administrado previamente (10 min.) Azul

de Evans (25 mg/kg, i.v.) a fim de avaliar a exsudação. Dexametasona e indometacina

foram utilizados como fármacos anti-inflamatórios de referência. Para a avaliação da

atividade antibacteriana, foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo para a

determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida

mínima (CBM). Neste protocolo, o material vegetal, o extrato bruto (CE), frações e

compostos isolados, foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e transferidos para

uma placa em diluição seriada e, a seguir, o inóculo bacteriano foi adicionado.

Gentamicina foi utilizada como fármaco antibacteriano de referência. Diferenças

estatísticas entre os grupos, para os parâmetros inflamatórios, foram determinadas pela

análise dos testes t de Student ou de variância (ANOVA). Valores de P < 0,05 foram

considerados significativos. O extrato bruto da Lotus corniculatus (200 – 400 mg/kg) e

frações (50 – 200 mg/kg), assim como os compostos isolados (25 – 100 mg/kg) inibiram:

leucócitos, neutrófilos, exsudação, a atividade da MPO e da ADA, além das

concentrações de NO e IL-1β (P < 0,05). A indometacina e a dexametasona inibiram

todos os parâmetros inflamatórios estudados (P < 0,05). Em relação à atividade

antibacteriana, somente as frações HEX e AcOEt, e os compostos isolados ácido

oleanólico e canferitrin, revelaram atividade bactericida e/ou bacteriostática. A fração

HEX demonstrou moderada atividade antibacteriana (CIM = 100 µg mL

-1

) para a bactéria

Bacillus cereus, e fraca atividade antibacteriana (CIM = 600 a 1000 µg mL

-1

) para as

bactérias Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,

Staphylococcus epidermidis, Providencia alcalifaciens e Acinetobacter calcoaceticus. A

fração AcOEt demonstrou fraca atividade antibacteriana (CIM = 800 µg mL

-1

) para as

bactérias Enterococcus faecalis, Bacillus cereus e Acinetobacter calcoaceticus. O ácido

oleanólico revelou boa atividade antibacteriana para Staphylococcus aureus meticilina

resistente (CIM = 100 µg mL

-1

), Listeria monocytogenes e Bacillus cereus (CIM = 25 µg

-1

), e o canferitrin demonstrou boa atividade antibacteriana para as bactérias:

Staphylococcus epidermidis, Shigella flexinerii, Salmonella typhimurium e Acinetobacter

calcoaceticus (CIM = 100 µg mL

-1

). Este composto demonstrou excelente atividade

antibacteriana para as bactérias Enterococcus faecalis (CIM = 3.9 µg mL

-1

) e Bacillus

cereus (CIM = 8.5 µg mL

-1

). O extrato bruto, frações e compostos isolados da Lotus

corniculatus v. São Gabriel demonstraram importante atividade anti-inflamatória e

antibacteriana. Os compostos isolados: canferitrin, ácido oleanólico e β-sitosterol podem

ser responsáveis por estes efeitos anti-inflamatório e/ou antibacteriano.

Palavras-chaves: Lotus corniculatus, atividade anti-inflamatória, pleurisia, mediadores

da inflamação, atividade antibacteriana, canferitrin, ácido oleanólico, β-sitosterol.

ABSTRACT

Evaluation of anti-inflammatory and anti-bacterial effects of Lotus corniculatus

v. São Gabriel

The Lotus corniculatus (Fabaceae) is distributed in many regions of the world and has a

high agronomic value for its constituted: proanthocyanidins, flavonoids and oleanolic

acid. This plant is used as food for cattle providing the enhancement of the weight and of

milk production beyond the control of intestinal parasitic infections in the animals. The

aim of this study was to evaluate the anti-inflammatory and anti-bacterial effects of crude

extract (CE), fractions (hexane (HEX), ethyl acetate (AcOEt), n-butanol (BuOH) and

aquous fraction (AF)), and isolated compounds (kaempferitrin, oleanolic acid and β-

sitosterol) from Lotus corniculatus v. São Gabriel. The aerial parts of Lotus corniculatus

were dried at room temperature and this material (620 g) the crude extract (CE) was

extracted by maceration with ethanol 96% for one month. The solvent was evaporated

resulting in 78 g of crude extract (CE). The crude extract was fractionated by liquid-liquid

extraction using solvents in growing order of polarity resulting in hexane (HEX), ethyl

acetate (AcOEt), n-butanol (BuOH) and aqueous fraction (AF). From the HEX fraction it

was isolated the oleanolic acid and the β-sitosterol and from AcOEt fraction the

kaempferitrin. To evaluate the anti-inflamatory activity, it was used the mouse model of

pleurisy induced by carrageenan and the following inflammatory parameters were

evaluated: leukocytes, exudation, myeloperoxidase (MPO) and adenosine-deaminase

(ADA) activities, as well as, nitrite/nitrate (NO

) and interleukin-1 beta (IL-1β) levels. In

this experimental protocol, swiss mice were used in the in vivo experiments, which were

distributed in different groups and they were treated with CE (100 – 400 mg/kg), HEX (50

– 200 mg/kg), AcOEt (100 – 400 mg/kg), BuOH (50 – 200 mg/kg), RA (25 – 200 mg/kg),

kaempferitrin (50 – 100 mg/kg), oleanolic acid (10 – 100 mg/kg) or β-sitosterol (10 – 100

mg/kg) 0,5 h before carrageenan (1%,i.pl.). The inflammatory parameters were

evaluated 4 h after. All animals, except in the experiments that were analyzed enzymatic

activities, the animals were previously pretreated (10 min.) with Evans blue dye (25

mg/kg, i.v.) in order to evaluate the exudation. Dexamethasone and indomethacin were

used as anti-inflammatory reference drugs. To evaluate the anti-bacterial activity, it was

used the microdilution in broth technical to determine the minimal inhibitory concentraton

(MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) methodology. In this protocol the

crude extract (CE), fractions and isolated compounds were dissolved in

dimethylsulfoxide (DMSO) and transferred to plate in serial dilution and, after, the

bacterial inoculum were added. The gentamicin was used as the anti-bacterial reference

drug. To the anti-inflammatory parameters, statistical differences between groups were

determined by Student’s t test and analysis of variance (ANOVA). Values of P < 0.05

were considered significant. The crude extract of Lotus corniculatus (200 – 400 mg/kg)

and fractions (50 – 200 mg/kg), as well as its isolated compound (25 – 100 mg/kg)

inhibited: lekocytes, neutrophils and exudation, the MPO and ADA activities, as well as

NO and IL-1β levels (P < 0.05). Indomethacin and dexamethasone inhibited all the

studied inflammatory parameters (P < 0.05). In regard to the anti-bacterial activity, only

the HEX and AcOEt fractions and the isolated compounds, oleanolic acid and

kaempferitrin, revealed anti-bacterial and/or bacteriostatic activities. The hexane fraction

showed moderate anti-bacterial effect (MIC = 100 µg mL

-1

) on Bacillus cereus and weak

anti-bacterial effect (MIC = 600 to 1000 µg mL

-1

) on Enterococcus faecalis,

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus epidermidis,

Providencia alcalifaciens and Acinetobacter calcoaceticus. The AcOEt fraction

demonstrated a weak anti-bacterial activity (MIC = 800 µg mL

-1

) on Enterococcus

faecalis, Bacillus cereus and Acinetobacter calcoaceticus.The Oleanolic acid, isolated

from hexane fraction, exhibited a good anti-bacterial activity on methycillin-resistant

Staphylococcus aureus (MIC = 100 µg mL

-1

), Listeria monocytogenes and Bacillus

cereus (MIC = 25 µg mL

-1

) and the kaempferitrin, a compound isolated from this fraction,

demonstrated a good anti-bacterial effect on: Staphylococcus epidermidis, Shigella

flexinerii, Salmonella typhimurium and Acinetobacter calcoaceticus (MIC = 100 µg mL

-1

This compound showed an excellent anti-bacterial activity on Enterococcus faecalis (MIC

= 3.9 µg mL

-1

) and Bacillus cereus (MIC = 8.5 µg mL

-1

). The crude extract, fraction and

isolated compound from Lotus corniculatus v. São Gabriel, demonstrated important anti-

inflammatory and anti-bacterial activities. The isolated compounds: kampferitrin,

oleanolic acid and β-sitosterol can be responsible for these anti-inflammatory and/or anti-

bacterial effects.

Keywords: Lotus corniculatus, anti-inflammatory activity, pleurisy, mediators of

inflammation, anti-bacterial activity, kaempferitrin, oleanolic acid, β-sitosterol.

1. INTRODUÇÃO

1.1. PLANTAS MEDICINAIS

A utilização de plantas para o tratamento, cura e prevenção de doenças

ocorreu paralelamente à história da humanidade. No início do século passado, 80%

de todos os medicamentos eram obtidos a partir de raízes, cascas e folhas de

plantas (McCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). Atualmente, os produtos

naturais continuam sendo fontes significantes de medicamentos, sendo a utilização

destes evidente em aproximadamente 60% dos medicamentos antitumorais e 75%

dos medicamentos para o tratamento de doenças infecciosas, que são originários de

produtos naturais ou derivados de produtos naturais (NEWMAN; CRAGG; SNADER,

2003). Nos países em desenvolvimento, assim como nos países desenvolvidos, o

consumo de produtos à base de fontes naturais tem aumentado de forma

significativa (JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). Segundo dados da Organização

Mundial de Saúde (World Health Organization: WHO), 50% da população da Europa

e da América do Norte já utilizaram produtos de origem natural pelo menos uma vez.

No Canadá este percentual sobe para 70%, e na China, 30-50% dos medicamentos

utilizados na terapia são de origem natural (WHO, 2008).

No Brasil, as plantas medicinais da flora nativa são consumidas com pouca

ou nenhuma comprovação das propriedades farmacológicas e muitas vezes essas

plantas são, inclusive, utilizadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados

pelos silvícolas (JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005).

A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem como o

estudo do mecanismo de ação, vem sendo um dos maiores desafios para os

pesquisadores, principalmente nas áreas de bioquímica e de farmacologia

(CALIXTO, 2005). Por exemplo: estudos demonstraram importantes atividades anti-

inflamatória e antioxidantes de plantas comumente utilizadas para o tratamento da

asma, da doença de Alzheimer, da artrite reumatóide e da aterosclerose (KAPLAN et

al., 2007)

Na realidade, a pesquisa relacionada às propriedades químicas e

farmacológicas de plantas medicinais está voltada à procura de substâncias com

atividade biológica, no sentido de promover uma base científica à medicina popular

(GIORGETTI; NEGRI; RODRIGUES, 2007) ou para a obtenção de novas estruturas

químicas de interesse para a indústria farmacêutica, com atividades farmacológicas

específicas, podendo resultar em novos fármacos.

1.2. GÊNERO Lotus

A Lotus corniculatus v. São Gabriel (Fabaceae) é conhecida popularmente

como “Cornichão” no Brasil. Esta planta é uma leguminosa perene hiberno-

primaveril, de origem européia e mediterrânea, porém distribuída, em nível mundial,

em diferentes regiões do mundo, com exceção daquelas muito frias e de áreas

tropicais. No Brasil, o único cultivar disponível está localizado na cidade de São

Gabriel, desenvolvido pela Estação Experimental de São Gabriel, no Estado do Rio

Grande do Sul, tendo seu cultivo expandido para outros países da América do Sul

(SOSTER; SCHEFFER-BASSO; DALL’GNOL, 2004).

A Lotus corniculatus é utilizada como forrageira, no pasto e na silagem, por

possuir grande quantidade de proantocianidinas, também denominada de taninos

condensados (DIXON; XIE; SHARMA, 2005). As proantocianidinas são polímeros de

flavonoides considerados importantes, tendo em vista suas atividades biológicas,

como: antitumoral (KANDIL et al., 2002), antioxidante (BAGCHI et al., 2000),

imunomodulatória (LIN; KUO; CHOU, 2002), analgésica e anti-inflamatória

(SUBARNAS; WAGNER, 2000). Nos animais, as proantocianidinas são importantes

substâncias, uma vez que promovem aumento de: 1) absorção de aminoácidos,

como a metionina e a cisteína, 2) taxa de ovulação, 3) ganho de peso e 4) e

produção de leite (WAGHORN; McNABB, 2003).

Outros constituintes já identificados nas folhas e flores da Lotus

corniculatus foram os flavonoides (kaempferol e quercetina) (REYNAUD;

LUSSIGNOL, 2005). Além disso, existem estudos que demonstraram que os

flavonoides apresentam propriedades antiinflamatória, antitumoral, antimicrobiana,

imunomodulatória e antitrombótica (KIM et al., 2004). Em relação ao efeito anti-

inflamatório destes constituintes, García-Mendiavilla et al. (2007) demonstraram que

estas substâncias inibiram: óxido nítrico sintase induzida (iNOS), a ciclooxigenase-2

(COX-2), a liberação da proteína C reativa (PCR), e o fator nuclear kappa B (NF-κB)

(GARCÍA-MENDIAVILLA et al.,2007).

Outros compostos também já foram isolados da Lotus corniculatus, como o

ácido oleanólico e as saponinas (WALTER, 1961). O ácido oleanólico é um

composto triterpenóide que se encontra distribuído nas plantas e possui atividades:

hepatoprotetoras, antitumoral, cardioprotetora, antioxidante e imunomodulatória (LIU,

2005). As saponinas são conhecidas por exibirem também atividade antiinflamatória

(KANG et al., 2005), antioxidante e antitumoral (RAO; SUNG, 1995).

Na França, o chá das folhas da Lotus corniculatus é utilizado como

sedativo e espasmolítico. Baseados no fato de que a planta possui grande

quantidade de polifenóis, Trouillas et al. (2003) demonstraram que o extrato

hidroalcólico da Lotus corniculatus possui atividade antioxidante e antiproliferativa

(TROUILLAS et al., 2003).

Uma vez que o trabalho teve como objetivo avaliar o efeito anti-inflamatório

e antimicrobiano da Lotus corniculatus v. São Gabriel, é válido comentar sobre o

processo inflamatório e a atividade antimicrobiana de produtos naturais.

www.missouriplants.com

Figura 1. Lotus corniculatus L. var São Gabriel (Cornichão)

1.3. PROCESSO INFLAMATÓRIO

A reação inflamatória é um mecanismo que consiste em uma cascata de

reações celulares e vasculares, que ocorre como resposta a um estímulo e que tem

como objetivo o reparo tecidual ou a geração de novos tecidos, na tentativa de

proteger o organismo (SCHMID-SCHÖBEIN, 2006). A lesão tecidual ou o trauma

promove a liberação de mediadores químicos endógenos que são responsáveis

pelos sinais clínicos da inflamação: dor, calor, rubor e tumor (HOFSETH, 2008).

Os mediadores exógenos da inflamação, como por exemplo, peptídeos

microbianos, agem como agentes quimiotáticos para os neutrófilos. Essas células

fagocíticas formam os fagolisossomos por meio da fusão com grânulos lisossomais,

os quais contêm enzimas e espécies reativas de oxigênio (EROS) (HOFSETH, 2008)

na tentativa de destruir os microorganismos ou degradar células mortas (SERHAN;

CHIANG; DYKE, 2008).

Os neutrófilos são células fagocíticas presentes na resposta imune inata,

constituem a primeira linha de defesa do organismo ao patógeno. Estas células

possuem a habilidade de fagocitar o agente estranho devido aos conteúdos

citoplasmáticos, os quais são lesivos aos patógenos (SEGAL, 2005).

Dentre as principais enzimas relacionadas ao processo inflamatório

destaca-se a mieloperoxidase (MPO), que é sintetizada e secretada pelos neutrófilos

e corresponde a 5% do total de proteínas dessa célula (LAU; BALDUS, 2006). A

MPO também pode ser encontrada em monócitos e macrófagos, mas os monócitos

ao longo do tempo perdem a capacidade de sintetizar a MPO durante o processo de

maturação, quando estas células se diferenciam em macrófagos (FAITH et al.,

2008).

A mieloperoxidase (MPO) é armazenada nos grânulos azurófilos dos

polimorfonucleares e monócitos e durante a ativação celular é liberada dentro do

vacúolo fagocítico, assim como no espaço extracelular (WINTERBOURN; VISSERS;

KETTLE, 2000). Essa enzima cataliza a formação do ácido hipocloroso e radicais

tirosil (LORIA et al., 2008). Essa reação ocorre a partir da liberação de íons cloreto

(Cl

) e de peróxido de hidrogênio (H

) presentes nos fagossomos. Essa substância

é sintetizada, principalmente, no processo do metabolismo oxidativo também

denominado de “burst respiratório” que ocorre nas células fagocíticas, em especial

nos neutrófilos, por meio da enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

(NADPH) oxidase (KLEBANOFF, 2005; ARATANI, 2006). A NADPH oxidase

converte o oxigênio molecular (O

) no ânion superóxido (O

), o qual é convertido em

pela enzima superóxido desmutase (SOD) (WINTERBOURN et al., 2006). Este

radical, juntamente com o HOCl e outras EROS é responsável pela atividade

microbicida da MPO no interior dos fagossomas dos neutrófilos (LAU; BALDUS,

2006). O aumento nas concentrações de MPO, tanto nos tecidos como no plasma, é

utilizado como marcador de leucocitose neutrofílica, em condições de inflamação e

sepse (FAITH et al., 2008). Além disso, a MPO também está envolvida na

modulação da sinalização vascular e nas funções vasodilatadoras, via liberação de

óxido nítrico (NO), durante o processo inflamatório (EISERICH et al., 2002).

Outras células também presentes na resposta imune inata são os

mononucleares, que compreendem os monócitos. Estas células que liberam vários

mediadores, dentre eles as citocinas e EROS. Além disso, estas células, nos

tecidos, diferenciam-se em macrófagos (DALE; BOXER; LILES, 2008). As funções

biológicas dos monócitos/macrófagos ativados são inúmeras: captura,

processamento e morte de antígenos não-específicos e ativação de linfócitos

(HASKO et al., 2007). Os macrófagos pertencem a uma população heterogênea de

fagócitos mononucleares e possuem papel importante no comando e na execução

do processo inflamatório, liberando também citocinas e EROS (STOUT; SUTTLES,

2004).

A enzima adenosina-deaminase (ADA) também merece destaque devido a

sua participação no processo inflamatório. A adenosina-deaminase catalisa a reação

de desaminação da adenosina e 2-desoxiadenosina em inosina e desoxinosina, e

inosina que posteriormente é degradada em ácido úrico (VANNONI et al., 2004).

Várias células são importantes fontes de adenosina, como por exemplo: os

neutrófilos, os mononucleares e as células endoteliais, que liberam grandes

quantidades de adenosina em situações de estresse oxidativo, inflamação e/ou

infecção (CONLON; LAW, 2004; HASKO et al., 2007).

A adenosina foi primeiramente reconhecida como um regulador fisiológico

do tônus vascular coronariano, no entanto descobriu-se que a adenosina regula

funções celulares por meio da ligação ao receptor específico na superfície da

membrana celular (HASKO; CRONSTEIN, 2004; HASKO et al., 2008). Já foram

identificados quatro diferentes subtipos de receptores para adenosina (A

, A

) (JACOBSON; GAO, 2006). Várias atividades anti-inflamatórias já foram descritas

para a adenosina, como: inibição da maturação e proliferação das células

mononucleares (LANDELLS et al., 2000) e inibição do “burst respiratório” em

monócitos/macrófagos (THIELE et al., 2004).

O óxido nítrico (NO) é também um importante mediador liberado na

resposta inflamatória. A enzima óxido nítrico sintase (NOS) converte a L-arginina em

L-citrulina e NO (TRIPATHI et al., 2007). O NO é liberado por várias células:

monócitos, mastócitos, neutrófilos, macrófagos, células endoteliais, epiteliais, da

musculatura lisa vascular e fibroblastos (PERANZONI et al., 2008). O NO é uma

molécula importante e versátil na regulação do tônus vascular, na neurotransmissão

e na inflamação (HOFSETH, 2008). Esta molécula está envolvida também na

imunidade inata como um agente tóxico contra organismos infecciosos. No entanto,

o NO também pode regular a morte e a função dos linfócitos (BOGDAN et al., 2000).

O NO induz a apoptose de macrófagos, a adesão dos neutrófilos e a síntese de

citocinas pelos leucócitos (TRIPATHI et al., 2007).

Estudos já identificaram várias isoformas da enzima óxido nítrico sintase:

eNOS, iNOS e nNOS. A eNOS e a nNOS são expressas em: neurônios, macrófagos,

células dendriticas, células natural killer (NK) e linfócitos B e T, e sua ativação é

dependente da liberação de cálcio calmodulina (GARCIA; STEIN, 2006;

PERANZONI et al., 2008). A iNOS, também expressa em macrófagos, células

dendríticas, células natural killer e linfócitos B e T, é a forma induzida da enzima, e

sua expressão é regulada principalmente através da liberação de citocinas por

células ativadas (TRIPATHI et al., 2007). O NO liberado por essa via possui papel

importante na defesa do organismo por sua atividade antimicrobiana (PACHER;

BECKMAN; LIAUDET, 2007). Estudos revelaram que as espécies reativas de NO

possuem atividade antimicrobiana por meio da formação de metabólitos, como por

exemplo: peroxinitrito, 5-nitrosotiol e dióxido de nitrogênio, que são capazes de

promover lesão ao DNA do microorganismo (GARCIA; STEIN, 2006; PACHER;

BECKMAN; LIAUDET, 2007).

As citocinas são outros importantes mediadores da resposta inflamatória.

Elas interagem com os receptores de membrana específicos nas células na tentativa

de regular a resposta inflamatória (TAYAL; KALRA, 2008). Estes mediadores,

dependendo do estímulo, possuem efeitos pró ou anti-inflamatórios. O balanço entre

as citocinas têm um papel fundamental na defesa do hospedeiro. Entre as principais

citocinas pró-inflamatórias secretadas pelas células fagocíticas ativadas, inclui-se a

interleucina-1 beta (IL-1β) (KIM; MOUDGIL, 2008).

A IL-1β é secretada principalmente por monócitos, macrófagos e linfócitos,

mas também por neutrófilos e células dendríticas, e promove a proliferação e a

diferenciação das células do sistema imune inato e adaptativo (JOOSTEN; VAN

DEN BERG, 2006; OLIVEIRA et al., 2008). Além disso, a liberação da IL-1β está

relacionada a doenças de caráter inflamatório, como a artrite reumatóide

(JOOSTEN; VAN DEN BERG, 2006), a osteoartrite (PUJOL et al., 2008), a

aterosclerose (JAWIEN, 2008) e a sepse (KURT et al., 2007).

1.4. MODELOS DE INFLAMAÇÃO

Para a avaliação do mecanismo de ação anti-inflamatória de diferentes

fármacos e/ou plantas, vários modelos de inflamação já foram descritos, como a

pleurisia, a bolsa de ar, o edema de pata, a artrite e o implante de esponjas

embebidas em agentes irritantes (SEDGWICK; LEES, 1986).

A inflamação local induzida pela carragenina (pleurisia ou edema de pata)

é um modelo muito utilizado para estudar os mediadores envolvidos nas reações

vasculares associadas com a inflamação aguda e/ou crônica (CRISAFULLI et al.,

2006). O modelo de inflamação da pleurisia é caracterizado pelo aumento de

leucócitos do tipo neutrófilos e da exsudação que ocorre 4 h após a administração

da carragenina na cavidade pleural de camundongos. No fluído da cavidade pleural

de animais inflamados por carragenina ocorre a liberação de vários mediadores pró-

inflamatórios como citocinas e espécies reativas de oxigênio (SALEH; CALIXTO;

MEDEIROS, 1999; MARIOTTO et al., 2008).

Neste trabalho, optou-se pelo modelo experimental de pleurisia, uma vez

que esta técnica foi padronizada em nosso laboratório, é de fácil execução e é

considerado um bom modelo para avaliar mecanismo de ação de plantas ou

fármacos que possuem propriedades anti-inflamatórias.

1.5. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

Desde a descoberta dos antimicrobianos, em 1930, até 1980, acreditava-se

que os antibióticos eram capazes de curar todas as infecções bacterianas.

Entretanto, desde 1980, o crescente aumento da resistência aos agentes

antimicrobianos e o surgimento de microorganismos multiresistentes tem sido motivo

de crescente preocupação. Entretanto, a verdadeira magnitude desse problema

somente é observada quando se tornam evidentes as poucas perspectivas para o

desenvolvimento de novos antibióticos a curto e médio prazo (DROND; JUSTRIBÓ,

2007).

Apesar de a indústria farmacêutica produzir um número significativo de

novos antibióticos nas últimas décadas, a resistência microbiana a esses fármacos

também aumentou. Em geral, as bactérias naturalmente induzem o processo de

mutação genética tornando-se resistentes aos antimicrobianos usualmente

utilizados. Além disso, algumas bactérias são capazes de transmitir esta resistência

a outras bactérias (COHEN, 1992). O problema da resistência bacteriana é

crescente e a perspectiva futura do uso de fármacos com propriedades

antibacterianas é incerta. Dessa forma, torna-se, importante adotar medidas para a

resolução desse problema, dentre elas: o controle no uso indiscriminado de

antibióticos, o desenvolvimento de pesquisas para melhor compreensão dos

mecanismos genéticos da resistência microbiana e o desenvolvimento de novos

medicamentos, sintéticos ou de origem natural, com atividade antimicrobiana

(DROND; JUSTRIBÓ, 2007; COS et al., 2006).

A pesquisa direcionada a busca de novas substâncias antimicrobianas

deve ser contínua e várias fontes devem ser exploradas, pois, além das substâncias

químicas, os produtos naturais ainda são as maiores fontes de agentes terapêuticos

inovadores, inclusive para as doenças infecciosas (COS et al., 2006).

É importante ressaltar que quando se pesquisa produtos naturais com

possível atividade antibacteriana, é necessário utilizar microrganismos padronizados

que podem ser adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC), European

Culture Collections Organisation (ECCO), entre outras (VANDEN BERGHE;

VLIETINCK, 1991). Os métodos de triagem atualmente disponíveis para detectar

atividade antibacteriana de produtos naturais enquadram-se dentro de três grupos:

1) métodos de difusão; 2) métodos bioautográficos; e 3) métodos de diluição. Os

ensaios de difusão e/ou bioautográficos são considerados qualitativos. Já os

métodos de diluição podem ser considerados semiquantitativos ou quantitativos

(COS et al., 2006). Nesse trabalho foi utilizada a técnica de Microdiluição em Caldo

para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), uma vez que esta

apresenta como vantagens a possibilidade de: 1) quantificar a potência do materal

teste, 2) avaliar a eficácia de compostos polares e apolares, 3) avaliar a eficácia de

compostos com alto peso molecular, e também, ser uma técnica de fácil execução,

alta reprodutibilidade e sensível (COS et al., 2006; GAUTAM; SAKLANI; JACHAK,

2007).

OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Estudar o mecanismo de ação anti-inflamatória e antibacteriano do extrato

bruto, frações e compostos isolados das partes aéreas da Lotus corniculatus v. São

Gabriel.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

I. Avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato bruto, frações e compostos isolados

sobre a migração dos leucócitos (polimorfonucleares e mononucleares) e a

exsudação no modelo de pleurisia, induzido pela carragenina, em

camundongos.

II. Investigar o efeito do material vegetal sobre a atividade da mieloperoxidase

(MPO) e da adenosina-deaminase (ADA), bem como as concentrações de

nitrito/nitrato (NO

) e da interleucina-1 beta (IL-1β), no modelo de pleurisia,

induzido pela carragenina , em camundongos..

III. Avaliar a atividade antibacteriana do material vegetal.

3. ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO – FOOD CHEMISTRY

Evaluation of the Anti-inflammatory Efficacy of Lotus corniculatus

Janaína Koelzer

, Diana Ana Pereira

, Juliana Bastos Dalmarco

, Moacir

Geraldo Pizzolatti

and Tânia Silvia Fröde

Department of Clinical Analysis, Centre of Health Sciences, Federal University of

Santa Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88040-970, Florianópolis, SC, Brazil.

Department of Chemistry, Centre of Health Sciences, Federal University of Santa

Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88040-970, Florianópolis, SC, Brazil.

* Corresponding author: Tel.: +55 48 99614846, Fax: +55 48 32440936.

E-mail address: [email protected] or [email protected] (T. S. Fröde).

Abstract

The anti-inflammatory effects of the crude extract (CE) of Lotus corniculatus v.

São Gabriel and its derived hexane (HEX), ethyl acetate (AcOEt), n-butanol

(BuOH) and aqueous (AF) fractions, and isolated compounds kaempferitrin,

oleanolic acid and β-sitosterol, in a mouse model of pleurisy induced by

carrageenan were investigated. Swiss mice were used in the in vivo

experiments. The crude extract of Lotus corniculatus and its derived fractions,

and also its isolated compounds, inhibited leukocytes, exudation, and

myeloperoxidase (MPO) and adenosine-deaminase (ADA) activities, as well as

nitrite/nitrate concentration and interleukin-1 beta (IL-1β) level (p < 0.05). Lotus

corniculatus showed important anti-inflammatory activity by inhibition not only of

leukocytes and/or exudation, but also of pro-inflammatory enzymes and

mediators such as MPO, ADA and IL-1β and its constituents kaempferitrin,

oleanolic acid and β-sitosterol may well account for it.

Keywords: Lotus corniculatus, Anti-inflammatory Activity, Pleurisy, Mediators of

Inflammation, Mice.

1. Introduction

Plants are a good source of useful anti-inflammatory agents. The

continuing search for novel anti-inflammatory substances especially from plants

with historically documented or pharmacological properties, holds considerable

nutraceutical and/or pharmaceutical promise (Kaplan, Mutlu, Benson, Fields,

Banan, & Kesshavarzian, 2007). Lotus corniculatus v. São Gabriel (Fabaceae),

also known as “Cornichão” in Brazil, is used for cattle grazing pasture and has a

potential benefit of silage supplementation for increased milksolids yield in

summer when low pasture growth rates and quality may otherwise limit

production (Aerts, Barry, & McNabb, 1999). There are many nutritional effects

of Lotus corniculatus, such as increase of essential amino acid absorption

(Waghorn, Ulyatt, John, & Fisher, 1987), ovulation rate, and production of milk

protein lactose (Wang, Douglas, Waghorn, Barry, & Foote, 1996). This herb is

also used as an important anti-helmintic substance in cattle (Aerts, Barry, &

McNabb, 1999).

Studies had demonstrated that these effects are due to the presence of

secondary metabolites named proanthocyanidins, or condensed tannins (Xie &

Dixon, 2005). The proanthocynidins also have importantaha antioxidant (Kandil

et al., 2002), immunomodulatory (Lin, Kuo, & Chou, 2002), analgesic and anti-

inflammatory effects (Subarnas & Wagner, 2000).

Previous investigations into the chemical composition of this herb have

identified the following compounds: flavonoids (kaempferol and quercetin)

(Reynaud & Lussignol, 2005), oleanolic acid and saponins (Walter, 1961).

Studies have also reported that kaempferol and quercetin modulate the

inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), reactive C-

protein (CRP), and nuclear factor kappa B (NF-κB) (García-Mediavilla et al.,

2007). Other studies have shown that oleanolic acid and saponins possess anti-

inflammatory, (Giner-Larza et al., 2001; Wang, Gao, Kou, Zhu, & Yu, 2008) and

antitumoral properties (Chen et al., 2008; Wang et al., 2008).

Motivated by rare studies of the anti-inflammatory properties of Lotus

corniculatus, the crude extract and derived fractions of this herb was studied by

analyzing its effects upon leukocyte migration, exudation concentration and

myeloperoxidase/ adenosine-deaminase activities, as well as nitrite/nitrate

concentration and interleukin-1 beta levels, in the inflammation induced by

carrageenan in the mouse model of pleurisy. We also isolated and identified

the components from Lotus corniculatus that were responsible for the anti-

inflammatory activity.

2. Material and Methods

2.1 Plant material

Lotus corniculatus L. var. São Gabriel was collected in November 2006

in Lages, Santa Catarina State, Brazil. The material was identified by the

botanist Prof. Dr. Daniel de Barcelos Falkenberg at the Department of Botany of

the Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazil. A voucher

specimen was deposited in the Herbarium at the same university (FLOR

18.770).

2.2 Preparation of plant extracts

The aerial parts of Lotus corniculatus var. São Gabriel were air-dried

protected from light at room temperature (25

C) for one week. Subsequently the

dried aerial parts (620g) was grounded into particles (1.5 mm of diameter) using

a knife mill (Mill TE-651, Tecnal, Piracicaba, SP). The grounded material was

placed into a plastic tube contained 5 L of ethanol 96% (plant 1:8, w/v) at room

temperature for two days. In the next step, the ethanol was removed and

evaporated under reduced pressure (600 mm Hg) (Vacuum Q-355A2, Quimis,

Diadema, SP) using a rotavapor apparatus at 55

C to obtain the crude extract.

This procedure of extraction was done exhaustively more three times in one

week until 12-fold in a one month to obtained the maximal yield of the crude

extract. Finally this procedure yelded 78 g of the crude extract.

The CE was fractionated by liquid-liquid extraction using solvents in growing

order of polarity, resulting in hexane (HEX: 7.82 g), ethyl acetate (AcOEt: 11.4

g), n-butanol (BuOH: 5.24 g) and aqueous (AF: 30.8 g) fractions.

2.3 Preliminary phytochemical analysis

A preliminary phytochemical screening of the crude extract of Lotus

corniculatus was carried out to detect the presence of phenols, tannins,

anthocyanins, anthocyanidins, flavonoids, xanthones, steroids, triterpenes and

saponins using colourimetric reactions following the methodologies described

by WHO, 1984.

2.4 Isolation and identification of the compounds

The hexane fraction was subjected to silica gel column chromatography

and eluted with a gradient of HEX/EtOAc, resulting in the isolation of two

terpenoids: β-sitosterol as colourless crystals, m.p 137-139ºC, 76 mg, from

fraction eluted with HEX/EtOAc (90:10,v/v), and oleanolic acid, as a white

powder, m.p. 279-282

C, 25 mg, from HEX/EtOAc (70:30, v/v) . The

chromatographyc fractionation on silica gel of the EtOAc fraction afforded a

crude flavonoid from EtOAc/EtOH (50:50, v/v) eluate that was further purified by

flash chromatography using ethyl acetate/water/formic acid/acetic acid-

(70:20:3:2, v/v/v/v) as eluent, yielding 45 mg of kaempferitrin as a yellow needle

crystals, m.p. 198.5-201.3

C. The structures of the known compounds were

identified by their spectroscopic data (

H NMR,

C NMR (Varian AS-400 -Palo-

Alto, CA, USA), and IR- Perkin Elmer FTIR 16 PC, Beaconsfield, England)

measurement, comparison with spectral data obtained from the literature (Hung

& Yen, 2001; Urgaonkar & Shaw, 2007), and co-TLC with authentic samples.

2.5 Structure elucidation of the compounds

The chemical structure of each isolated compound was determined on

the basis of its physical characteristics, spectral data produced by infrared

analysis (Perkin Elmer FTIR 16 PC, Beaconsfield, England) and nuclear

magnetic resonance (

H and

C-NMR) recorded on a Varian AS-400 (Palo-

Alto, CA, USA) spectrometer operating at 400 and 100 MHz, respectively. Thyn

Layer Chromatography (TLC) was carried out on silica gel 60 F

254

plates

(Macherey-Nagel, Düren, Germany). Finally, the structures of the compounds

isolated were confirmed by comparing with reference data previously reported

from available reliable sources.

2.6 Animals

Swiss mice, weighing 18-25 g, were housed under standardized conditions

(room at constant temperature (22 ± 2°C) with alternating 12 h periods of light

and darkness), humidity 50-60%, and they were fed on a standard mouse diet

with water ad libitum before use. This study was approved by the Committee for

Ethics in Animal Research of the Federal University of Santa Catarina (Protocol

number – PP00180), and experiments were performed in accordance with the

norms of the Brazilian College of Animal Experimentation.

2.7 Experimental protocol

Initially, for analysis of the dose-response curve, different groups of

animals were treated with different doses of crude extract (CE: 100 - 400

mg/kg) of Lotus corniculatus var. São Gabriel or its derived fractions or isolated

compounds: hexane fraction (HEX: 50 - 200 mg/kg), ethyl acetate fraction

(AcOEt: 100 - 400 mg/kg), n-butanol fraction (BuOH: 50 - 200 mg/kg), aqueous

fraction (AF: 25 - 200 mg/kg), kaempferitrin (50 and 100 mg/kg), oleanoic acid

(10 - 100 mg/kg) or β-sitosterol (10 - 100 mg/kg) administered by intraperitoneal

route (i.p.) 0.5 h before pleurisy induction by carrageenan (Cg 1%) that was

administered by intrapleural route (i.pl.). In parallel, some animals received an

injection of either sterile saline (NaCl, 0.9%) (negative - control group) or

carrageenan (positive - control group) administered by intrapleural (i.pl.) route.

After 4 h the animals were killed with an overdose of ether, the thorax was

opened, and the pleural cavity was washed with 1.0 mL of sterile phosphate

buffered saline (PBS) (pH 7.6), composition: NaCl (130 mmol), Na

HPO

mmol), KH

(1 mmol) and distillated water (1000 ml) containing heparin (20

IU/mL). Leukocytes and exudation were then evaluated.

In another set of experiments employed to establish the time course

profile, different groups of animals were pre-treated with a single dose of CE

(200 mg/kg), HEX (100 mg/kg), AcOEt (200 mg/kg), BuOH (100 mg/kg), AF

(100 mg/kg), kaempferitrim (100 mg/kg), oleanolic acid (50 mg/kg) or β-

sitosterol (50 mg/kg) administered at different time points (0.5 - 4 h) and the

same inflammatory parameters were evaluated 4 h after carrageenan

administration.

After choosing the best dose and period of pre-treatment required for the

crude extract of Lotus corniculatus and its derived fractions, as well as its

isolated compounds, that inhibit leukocytes and/or exudation, different groups of

animals were treated with CE (200 or 400 mg/kg), HEX (100 or 200 mg/kg),

AcOEt (200 or 800 mg/kg), BuOH (100 mg/kg), AF (50 or 400 mg/kg),

kaempferitrin (100 mg/kg), oleanolic acid (50 mg/kg) or β-sitosterol (50 mg/kg)

administered 0.5 h prior to pleurisy induction to analyze their effects upon

myeloperoxidase (MPO) and adenosine-deaminase (ADA) activities, as well as

nitrite/nitrate concentration (NO

) and interleukin-1 beta (IL-1β) levels.

Dexamethasone (potent inhibitor of phospholipase A

, of the expression

of both induced NOS and of COX-2, among others, 0.5 mg/kg) and

indomethacin (cyclooxygenase inhibitors, 5 mg/kg, i.p.) administered by

intraperitoneal route (i.p.) 0.5 h before pleurisy induction, were used as anti-

inflammatory drugs.

2.8 Quantification of leukocyte migration and exudation

After killing the animals, samples of the fluid leakage of the pleural cavity

were collected to determine the total and differential leukocyte contents, and

exudation. Total leukocyte counts were determined in a Newbauer chamber,

and cytospin preparations of fluid leakage were stained with May-Grünwald-

Giemsa for the differential count (Saleh, Calixto, & Medeiros, 1996). The degree

of exudation was determined by measuring the amount of Evans blue dye

extravasation. Thus, in each experimental group, animals were challenged 0.5 h

before the inflammation induction with a solution of Evans blue dye (25 mg/kg)

administered by intravenous route (i.v.) in order to evaluate the exudation in the

pleural cavity. On the day of the experiment, a batch of stored samples was

thawed at room temperature and the amount of dye was estimated by

colourimetric using an Elisa plate reader (Organon Teknika, Roseland, NJ,

USA) at 620 nm, by interpolation from a standard curve of Evans blue dye in the

range of 0.01 to 50 µg/mL.

2.9 Quantification of nitrite/nitrate concentration

Nitric oxide and its breakdown products nitrite (NO

) and nitrate (NO

)

were measured using the Griess method (Green, Wagner, Glowski, Skipper,

Wishnok, & Tannenbaum, 1982). Samples of exudates from the pleural cavity

were collected, separated and stored at -20ºC. Nitrite/nitrate concentration was

determined and the concentrations were estimated by means of colourimetric

measurement at 450 nm on an ELISA plate reader (Organon, Teknika,

Roseland, NY, USA) by interpolation from a standard curve (0-150 µM). The

results were expressed as µM.

2.10 Quantification of myeloperoxidase activity

Standard samples with different concentrations of myeloperoxidase (from

human neutrophils, Sigma: M6908, St. Louis, MO, USA) were prepared in order

to obtain a standard curve in the range of 0.07-140 mU/mL. Pleural cavity fluid

samples (40 µL) and standards were transferred to cuvettes and the reaction

was initiated with the addition of 360 µL of assay buffer (0.167 mg/mL of o-

dianisidine (3, 3’-dimethoxybenzidine; fast blue B) dihydrochloride and 0.0005%

). The reaction was stopped with sodium azide 1%. Afterwards, the

samples were centrifuged at 50 x g for 5 min, the supernatants were separated,

and the rates of changes in absorbance at 520 nm were determined. The

mieloperoxidase activity was estimated by interpolation from the standard curve

by means of colourimetric measurements on an ELISA plate reader (Organon

Teknika, Roseland, NJ, USA) (Rao, Curie, Scaffer, & Isakson, 1993). The

results were expressed as mU/mL.

2.11 Quantification of adenosine deaminase activity

Initially, standard samples (final volume of 500 µL) with different volume

concentrations of NaH

0 (35 mM), Na

HPO

O (15 mM) and NH

(15 mM) were prepared in order to obtain a standard curve in the range of 10-

50 U/L. Pleural cavity fluid samples (20 µL) were transferred to cuvettes and the

reaction was initiated by the addition of adenosine phosphate buffered solution

(pH 6.5, 500 µL, composition: NaH

O (35 mM), Na

HPO

.12H

O (15

mM) and adenosine (0.5 mM)). After incubation for 1 hour at 37°C, the reaction

was halted with the addition of a solution (1000 µL) of phenol (1 mM) and

nitroprussiate (0.17 mM), plus alkaline buffer (1000 µL: NaCl: 11 mM). This

solution (final volume 2000 µL) was also added to the cuvettes with the different

standard samples. Afterwards, the rate of change in absorbance at 620 nm was

determined. ADA activity was estimated by interpolation from the standard

curve by means of colourimetric measurements on an ELISA plate reader

(Organon Teknika, Roseland, NJ, USA) (Giusti & Galanti, 1984). The results

were expressed as U/L.

2.12 Quantification of IL-1β levels

For analysis of IL-1β levels, samples of exudates were collected and

immediately prepared for the analysis of cytokine levels. In this protocol,

commercially available kits were used with monoclonal-specific antibodies for

each cytokine. The cytokine level was measured by enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA), using the kits according to the manufacturers’

instructions. The range of values detected by this assay was: IL-1β (100 - 6400

pg/mL). The intra- and inter-assay coefficients of variation (CV) for IL-1β were:

intra CV: IL-1β = 6.2 ± 0.4%; inter CV: IL-1β = 5.1 ± 0.6%, with a sensitivity

value of IL-1β = 1.7 pg/mL. The cytokine concentration was estimated by

means of colourimetric measurements at 450 nm on an ELISA plate reader

(Organon Teknika, Roseland, NJ, USA) by interpolation from a standard curve.

2.13 Drugs

The following drugs and reagents were used: carrageenan (degree IV),

human neutrophil myeloperoxidase, indomethacin, (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO, USA), dexamethasone, (Ache pharmaceutical laboratories S.A., São

Paulo, SP, Brazil), and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for

quantitative determination of rat IL-1β. Organic solvents: Acetone, Chloroform,

n-Hexane, Ethyl acetate, n-Butanol, Methanol, and Ethanol, all analytical grade,

were purchased from Synth (Diadema, SP, Brazil). Other reagents used were

also of analytical grade and were obtained from different commercial sources.

2.14 Statistical Analysis

The data is reported as the mean ± SEM. Significant differences between

groups were determined by two-way analysis of variance (ANOVA) followed by

Student’s-Newman-Keuls post-hoc tests, and the significant difference was set

at p < 0.05.

3. Results

3.1 Phytochemical Analysis

In this study, preliminary phytochemical analysis showed that the crude

extract of Lotus corniculatus var. São Gabriel contained a significant amount of

flavonoids, steroids and terpenoids. Representing the steroids and terpenoids

classes, we isolated the β-sitosterol (Compound 1) (Fig. 1A) and the oleanolic

acid (Compound 2:) (Fig. 1B) from hexane fraction. In the ethyl acetate fraction,

the flavonoid O-heteroside kaempferitrin (Compound 3) (Fig. 1C) as

representative of flavonoids was isolated. These compounds isolated from the

specie L. corniculatus not reported previously to this variety. β-sitosterol

represented 2,08% and the oleanolic acid 0.67% of the hexane fraction.

Further, the kaempferitrin represented 0.51% of the ethyl acetate fraction.

3.2 Effects of crude the extract of Lotus corniculatus v. São Gabriel, its derived

fractions and isolated compounds upon leukocyte migration and exudation

The crude extract of Lotus corniculatus (CE: 200 and 400 mg/kg)

significantly decreased leukocyte migration from 38.7 ± 5.8 to 48.0 ± 7.7% (p <

0.01), neutrophils from 37.7 ± 5.2 to 46.4 ± 8.4% (p < 0.01), mononuclears from

44.2 ± 9.4 to 57.3 ± 11.6% (p < 0.05), and exudation from 25.4 ± 5.3 to 50.5 ±

2.2% (p < 0.05). CE (100 mg/kg) did not modify the studied inflammatory

parameters (p > 0.05) (Table 1).

The hexane fraction (HEX: 100 and 200 mg/kg) significantly suppressed

leukocytes from 26.1 ± 5.0 to 53.2 ± 12.5% (p < 0.01) and neutrophils from 21.8

± 6.7 to 68.3 ± 17.3% (p < 0.05). HEX (100 mg/kg) also inhibited mononuclears

by 45.5 ± 12.2% (p < 0.05) and at the dose of 200 mg/kg, HEX also inhibited

exudation by 51.7 ± 12.0% (p < 0.05). The HEX fraction (50 mg/kg) did not alter

any of the studied inflammatory parameters (p > 0.05) (Table 1).

The ethyl acetate fraction (AcOEt: 200 and 400 mg/kg) produced a

significant inhibition of leukocyte migration from 21.0 ± 6.5 to 41.9 ± 8.7% (p <

0.05), neutrophils from 20.9 ± 7.4 to 56.1 ± 5.8% (p < 0.05) and exudation from

33.6 ± 6.6 to 34.8 ± 10.9% (p < 0.05). Nevertheless, the AcOEt fraction (100

mg/kg) did not inhibit these inflammatory parameters (p > 0.05). Mononuclears

also were not inhibited by the AcOEt fraction (p > 0.05) (Table 1).

The n-butanol fraction (BuOH: 100 and 200 mg/kg) produced a

significant decrease of leukocytes from 34.9 ± 9.1 to 39.2 ± 4.9% (p < 0.01) and

neutrophils from 36.0 ± 5.8 to 36.3 ± 8.8% (p < 0.01). The BuOH fraction (200

mg/kg) also decreased mononuclears by 54.8 ± 6.2% (p < 0.05), and the dose

of 50 mg/kg did not vary the leukocyte content (p > 0.05), but caused a

significant enhancement of exudation by 50.7 ± 16.0% (p < 0.05) (Table 1).

The aqueous fraction (AF: 50 - 200 mg/kg) caused a significant inhibition

of leukocytes from 31.6 ± 8.1 to 43.0 ± 5.8% (p < 0.05), and neutrophils from

30.7 ± 8.5 to 44.2 ± 6.7% (p < 0.01), but failed to reduce mononuclears (p >

0.05). The AF fraction (200 mg/kg) was also effective in inhibiting exudation by

44.7 ± 3.8% (p < 0.05). The doses of 25 and 50 mg/kg of this fraction increased

exudation from 31.4 ± 12.3% to 38.2 ± 5.9% (p < 0.05). The AF fraction (25

mg/kg) also did not inhibit total and differential leukocytes (p > 0.05) (Table 1).

The study of the effect of the isolated compounds showed that

kaempferitrin, at the dose of 100 mg/kg, was also effective in significantly

inhibiting leukocytes by 35.5 ± 8.0% and neutrophils by 33.7 ± 8.8% (p < 0.05)

(Table 2).This compound (50 and 100 mg/kg) also inhibited mononuclears by

65.2 ± 20.9% and 43.5 ± 5.7%, and exudation by 33.3 ± 9.8% and 37.0 ± 3.3%

(p < 0.05) (Table 2).

The oleanolic acid (25 - 100 mg/kg) significantly suppressed leukocytes

from 21.2 ± 5.8 to 52.4 ± 11.2% (p < 0.05) and neutrophils from 27.9 ± 7.5 to

71.6 ± 2.8% (p < 0.05). This compound failed to change mononuclears (p >

0.05). The dose of 10 mg/kg of this compound did not inhibit the inflammation

caused by carrageenan (p > 0.05). Under the same conditions, oleanolic acid

(25 and 50 mg/kg) reduced exudation levels from 35.3 ± 1.9 to 42.6 ± 3.9% (p <

0.05) (Table 2).

The β-sitosterol (25 - 100 mg/kg) significantly decreased leukocytes from

15.1 ± 1.9 to 33.9 ± 9.4% (p < 0.05) and neutrophils from 19.1 ± 2.9 to 36.7 ±

12.6% (p < 0.05). This compound did not modify mononuclears (p > 0.05), but

at doses of 25 and 50 mg/kg it significantly inhibited the exudation from 28.2 ±

10.0% to 33.1 ± 2.3% (p < 0.05). The dose of 10 mg/kg did not vary the

inflammatory parameters (p > 0.05) (Table 2).

The time course profile for the crude extract of Lotus corniculatus and its

derived fractions, as well as its isolated compounds, showed that they were

effective in inhibiting the studied inflammatory parameters when they were

administered 0.5 h before carrageenan. It is important to note that the BuOH

fraction (100 mg/kg), as well as the AcOEt fraction (200 mg/kg), had a long-

lasting anti-inflammatory effect, since they were able to decrease the

inflammation caused by carrageenan for up to 2 h of pre-treatment (results not

shown).

As expected, dexamethasone (0.5 mg/kg, i.p.) and indomethacin (5.0

mg/kg, i.p.) significantly inhibited leukocytes by 71.7 ± 5.0% and 63.5 ± 5.0% (p

< 0.01), neutrophils by 73.8 ± 4.2% and 64.9 ± 5.0% (p < 0.01), mononuclears

by 60.7 ± 2.0% and 57.1 ±1.0% (p < 0.05), and exudation by 43.3 ± 7.8% and

31.0 ± 5.0% (p < 0.05), in the inflammation response induced by carrageenan,

respectively (Tables 1 and 2).

3.3 Effects of the crude extract of Lotus corniculatus v. São Gabriel, its derived

fractions and isolated compounds upon myeloperoxidase and adenosine-

deaminase activities

The pre-treatment (0.5 h) of animals with crude extract of Lotus

corniculatus and its derived fractions, and also its isolated compounds, caused

a significant decrease in myeloperoxidase activity (% of inhibition: CE (200

mg/kg): 63.7 ± 6.0, HEX (100 mg/kg): 47.4 ± 11.6, AcOEt (200 mg/kg): 57.9 ±

4.4, AF (100 mg/kg): 34.3 ± 12.6, kaempferitrin (100 mg/kg): 90.6 ± 3.4,

oleanolic acid (50 mg/kg): 45.5 ± 21.6 and β-sitosterol (50 mg/kg): 73.0 ± 13.1)

(p < 0.05), and adenosine-deaminase activities (% of inhibition: CE (200 mg/kg):

67.5 ± 6.8, HEX (100 mg/kg): 54.4 ± 15.0, AcOEt (200 mg/kg): 94.0 ± 1.4,

BuOH (100 mg/kg): 67.1 ± 9.0, AF (50 mg/kg): 64.5 ± 8.8, kaempferitrin (100

mg/kg): 77.1 ± 7.9, β-sitosterol (50 mg/kg): 68.7 ± 6.0) (P < 0.01), except for the

BuOH fraction that did not inhibit MPO, and oleanolic acid that did not decrease

ADA activities (p > 0.05) (Table 3).

Dexamethasone and indomethacin were effective in inhibiting

myeloperoxidase by 59.4 ± 7.0% and 64.4 ± 7.0% (p < 0.01), and adenosine-

deaminase activities by 71.4 ± 6.0% and 64.4 ± 6.0%, respectively (p > 0.05)

(Table 3).

3.4 Effects of the crude extract of Lotus corniculatus v. São Gabriel, its derived

fractions and isolated compounds upon IL-1

levels

The crude extract of Lotus corniculatus and its derived fractions, as well

as its isolated compounds, caused a significant decrease of IL-1β (% of

inhibition: CE (200 mg/kg): 24.9 ± 6.9, HEX (100 mg/kg): 43.2 ± 8.6, AcOEt

(200 mg/kg): 36.9 ± 24.0, BuOH (100 mg/kg): 38.1 ± 17.2, AF (100 mg/kg): 35.9

± 2.6, and kaempferitrim (100 mg/kg): 61.1 ± 13.8) (p < 0.05). The oleanolic

acid (50 mg/kg) caused a significant increase of the IL-1β levels by 61.4 ±

19.7% (p < 0.05), and β-sitosterol (50 mg/kg) did not alter the IL-1β level (p >

0.05) (Table 3).

Dexamethasone and indomethacin also significantly inhibited the IL-1β

level by 55.5 ± 6.0% and 49.8 ± 6.0%, respectively (p < 0.05) (Table 3).

3.5 Effects of the crude extract of Lotus corniculatus v. São Gabriel, and its

derived fractions and isolated compounds upon nitrite/nitrate concentration

Although the best dose of the crude extract of Lotus corniculatus and its

derived fractions was determined, only higher doses caused a significant

decrease of nitrite/nitrate concentration (% of inhibition: CE (400 mg/kg): 30.4 ±

5.6, HEX (200 mg/kg): 34.3 ± 9.9, AcOEt (800 mg/kg): 38.4 ± 5.4 and AF (400

mg/kg): 44.1 ± 4.2) (p < 0.05). The isolated compounds also inhibited this

inflammatory parameter (% of inhibition: kaempferitrin (100 mg/kg): 32.9 ± 4.2,

oleanolic acid (50 mg/kg): 35.9 ± 5.6 and β-sitosterol (50 mg/kg): 35.2 ± 3.2) (p

< 0.05). Dexamethasone and indomethacin pre-treatment of animals presented

an inhibitory effect on nitrite/nitrate concentration by 75.6 ± 2.6% and 50.0 ±

1.3%, respectively (p < 0.01) (Table 4).

4. Discussion

Data from this study indicates that the crude extract of Lotus corniculatus

and its derived fractions had an important anti-inflammatory effect in a murine

model of pleurisy. Although different doses of Lotus corniculatus and its derived

fractions were necessary to inhibit this inflammatory reaction. The results show

that this herb exhibits a distinct inhibitory profile when compared to conventional

drugs, such as indomethacin and dexamethasone.

The anti-inflammatory effect of Lotus corniculatus was more pronounced

in relation to the inhibition of leukocytes and exudation. To understand the

modulation of leukocytes by this herb, we also studied its effect upon MPO and

ADA activities, which are known to be markers of activated neutrophils and

mononuclears, respectively (Fröde & Medeiros, 2001). Our results

demonstrated that the crude extract of Lotus corniculatus and its derived

fractions significantly attenuated both MPO and ADA activities. These results

reveled that Lotus corniculatus not only inhibited the leukocyte influx to the site

of the inflammatory response, but also the activated leukocytes (Fröde &

Medeiros, 2001).

The role of IL-1β in the inflammatory response is well known. The effect

of Lotus corniculatus upon IL-1-β levels was also analyzed. In this experiment

we observed a significant inhibition of this important mediator by Lotus

corniculatus and its derived fractions.

Nitric oxide (NO) is another important pro-inflammatory substance that is

released in the acute and chronic inflammatory response and is related to the

exudation and cellular chemotaxis (Tripathi, Tripathi, Kashyap & Singh, 2007).

Once again, Lotus corniculatus showed an anti-inflammatory response, since

the crude extract of this herb and its derived fractions, except for BuOH, caused

a significant decrease of nitrite/nitrate concentration.

All the studied fractions isolated from Lotus corniculatus presented an

important anti-inflammatory effect. The distinct biological effect may be linked to

differences among chemical structures. This fact is observed mainly in the HEX

and AcOEt fractions, which revealed a more pronounced anti-inflammatory

response than the other fractions, since they were able to inhibit all the studied

inflammatory parameters. On the contrary, BuOH did not inhibit either MPO

activity or nitrite/nitrate concentration.

In an attempt to evaluate the anti-inflammatory potential of the isolated

compounds from these fractions, first we isolated kaempferitrin from the AcOEt

fraction, and β-sitosterol and oleanolic acid from the HEX fraction

Likewise, we tested the effects of these compounds upon the same

studied pro-inflammatory parameters. Our results revealed that all compounds

inhibited leukocytes, neutrophils, exsudation, and MPO activity, as well as NO

levels.

Although, β-sitosterol was a main compound isolated from Lotus

corniculatus, kaempferitrin demonstrated a better anti-inflammatory effect since

it was 3.8-fold, 1.5-fold and 1.3-fold more effective in inhibiting MPO, ADA and

IL-1β levels, respectively, than indomethain, and 4.3-fold and 1.2-fold more

effective in inhibiting MPO and ADA activities than dexamethasone.

Similar results have also been observed with kaempferitrin that inhibits

nitric oxide levels, as well as pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-

12, in murine macrophages stimulated by LPS/IFN-γ (Fang, Rao, & Tzeng,

2005).

In relation to oleanolic acid, studies from literature have demonstrated

the anti-inflammatory effect of this substance by reducing the paw edema

induced by dextran, and also inhibiting the nitric oxide release via down-

regulation of NF-κB in murine macrophage cells induced by LPS (Singh, Singh,

Bani, Gupta, & Banerjee, 1992; Suh et al., 2007).

For β-sitosterol, studies have demonstrated important anti-inflammatory

activity not only by inhibiting IL-12 from human Jukart T cells stimulated by

concanavalin (ConA) or by phorbol-12-myristate-13-acetate plus ionomycin

(PMA + IoM) (Aherne & O’Brien, 2008), but also by decreasing the eosinophil

influx, mucus secretion, and IL-4/ IL-5 expression in a murine model of asthma

induced by ovalbumin (Yuk et al., 2007), and the ear oedema induced by

acetone in mice (Mavar-Manga, Haddad, Pieters, Baccelli, Penge, & Quetin-

Leclercp, 2008).

In conclusion, Lotus corniculatus showed an important anti-inflammatory

property, and its constituents kaempferitrin, oleanolic acid and β-sitosterol may

well account for it. These compounds have potential as novel lead compounds

for the future development of therapeutic intervention in the treatment of

patients with inflammatory disorders.

Acknowledgement

We would like to thank MSc researcher MSc Ulisses de Arruda Córdova of

EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa

Catarina S.A, Pesquisa, Estação Experimental de Lages) for the kind donation

of Lotus corniculatus var. São Gabriel. We would also like to thank the

Coordenação de Aperfeiçoamento Docente CAPES, Brazil, for financial

support.

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Compound 1 (β-sitosterol)

COOH

Compound 2 (Oleanolic acid)

Compound 3 (Kaempferitrin)

Fig. 1: The chemical structures of β-sitosterol (A), oleanolic acid (B) isolated from n-

hexane fraction and Kaempferitrin (C) isolated from ethyl acetate fraction of Lotus

corniculatus var. São Gabriel (Fabaceae) aerial parts.

Table 1 – Effects of the crude extract of Lotus corniculatus and its derived fractions upon

leukocyte migration and exudation in the inflammation induced by carrageenan in the

mouse model of pleurisy.

Groups/Doses

(mg/kg)

Leukocytes

(x10

)

Neutrophils

(x10

)

Mononuclears cells

(x10

)

Exudation

(µg/mL)

6.20 ± 0.30 5.08 ± 0.30 1.12 ± 0.20 11.50 ± 1.00

CE 100

5.77 ± 0.60 4.85 ± 0.50 0.91 ± 0.10 9.03 ± 0.50

CE 200

3.80 ± 0.40** 3.17 ± 0.20** 0.63 ± 0.10* 8.58 ± 0.60*

CE 400

3.21 ± 0.50** 2.73 ± 0.40** 0.48 ± 0.10** 5.70 ± 0.20**

HEX 50

5.23 ± 1.20 4.60 ± 1.00 0.63 ± 0.20 8.91 ± 2.10

HEX 100

4.58 ± 0.30** 3.97 ± 0.30* 0.61 ± 0.10* 8.85 ± 1.50

HEX 200

2.90 ± 0.70** 1.62 ± 0.80** 1.28 ± 0.40 5.56 ± 1.40*

AcOEt 100

6.97 ± 0.70 5.56 ± 0.90

1.49 ± 0.10 10.6 ± 1.80

AcOEt 200

4.91 ± 0.40* 4.02 ± 0.30*

0.89 ± 0.10 7.64 ± 0.70*

AcOEt 400

3.38 ± 0.70** 2.26 ± 0.40**

1.12 ± 0.40 7.11 ± 1.40*

BuOH 50

7.04 ± 0.40 6.14 ± 0.40 0.90 ± 0.10 17.30 ±1.80*

BuOH 100

4.07 ± 0.50** 3.36 ± 0.50** 0.71 ± 0.09 9.59 ± 1.10

BuOH 200

3.77 ± 0.30** 3.26 ± 0.30** 0.51 ± 0.07* 9.48 ± 0.60

AF 25

5.70 ± 0.30 5.01 ± 0.20 0.68 ± 0.10 15.90 ± 0.70*

AF 50

4.24 ± 0.50* 3.53 ± 0.40** 0.71 ± 0.10 15.10 ± 1.40*

AF 100

3.73 ± 0.80** 2.84 ± 0.60** 0.90 ± 0.20 10.40 ± 1.20

AF 200

3.52 ± 0.30** 2.83 ± 0.30** 0.68 ± 0.20 6.37 ± 0.40**

Dex 0.5

1.75 ± 0.30** 1.33 ± 0.20** 0.44 ± 0.10** 6.51 ± 0.50**

Indo 5

2.26 ± 0.30** 1.78 ± 0.20** 0.48 ± 0.20* 7.93 ± 0.50*

The crude extract (CE: 100 to 400 mg/kg) of Lotus corniculatus and its derived fractions,

hexane (HEX: 50 - 200 mg/kg), ethyl acetate fraction (AcOEt: 100 - 400 mg/kg), n-butanol

fraction (BuOH: 50 - 200 mg/kg) or aqueous fraction (AF: 25 - 200 mg/kg) administered 0.5

h before the pleurisy induction by carrageenan (1%). C = response in animals treated only

with carrageenan. Dex = response in animals pre-treated with dexamethasone (0.5

mg/kg). Indo = response in animals pre-treated with indomethacin (5.0 mg/kg). * p < 0.05

and ** p < 0.01. The data is reported as the mean ± SEM. a = administered by intrapleural

route, b = administered by intraperitoneal route. N = 5 animals.

Table 2 – Effects of the isolated compounds of Lotus corniculatus upon leukocytes

migration and exudation in the inflammation induced by carrageenan in the mouse model

of pleurisy.

Groups/Doses

(mg/kg)

Leukocytes

(x10

)

Neutrophils

(x10

)

Mononuclear cells

(x10

)

Exudation

(µg/mL)

6.20 ± 0.30 5.08 ± 0.30 1.12 ± 0.20 11.50 ± 1.00

Kaempferitrin 50

7.26 ± 0.80 6.87 ± 0.70 0.39 ± 0.20*

7.68 ± 1.10*

Kaempferitrin 100

4.00 ± 0.50* 3.37 ± 0.40* 0.63 ± 0.10*

7.25 ± 0.40*

Oleanolic acid 10

6.15 ± 0.60 4.83 ± 0.40 1.32 ± 0.20

9.20 ± 1.10

Oleanolic acid 25

4.88 ± 0.30* 3.66 ± 0.40* 1.23 ± 0.30 7.44 ± 0.20*

Oleanolic acid 50

3.08 ± 0.60** 2.42 ± 0.60** 0.66 ± 0.10

6.61 ± 0.40*

Oleanolic acid 100

2.95 ± 0.70** 1.45 ± 0.10** 1.50 ± 0.60

10.80 ± 1.20

β-sitosterol 10

5.63 ± 0.10 4.09 ± 0.60 1.55 ± 0.50 8.42 ± 0.90

β-sitosterol 25

5.27 ± 0.10* 4.11 ± 0.10* 1.16 ± 0.10 7.69 ± 0.20*

β-sitosterol 50

4.42 ± 0.70**

3.66 ± 0.70** 0.76 ± 0.10 8.26 ± 1.10*

β-sitosterol 100

4.10 ± 0.60**

3.22 ± 0.60** 0.88 ± 0.30 9.38 ± 1.70

Dex 0.5

1.75 ± 0.30** 1.33 ± 0.20** 0.44 ± 0.10** 6.51 ± 0.50**

Indo 5

2.26 ± 0.30** 1.78 ± 0.20** 0.48 ± 0.20* 7.93 ± 0.50*

Kaempferitrin (50 and 100 mg/kg), Oleanolic acid (10 - 100 mg/kg) and β-sitosterol (10 -

100 mg/kg) isolated from Lotus corniculatus administered 0.5 h before the pleurisy

induction by carrageenan (1%). C = response in animals treated only with carrageenan.

Dex = response in animals pre-treated with dexamethasone (0.5 mg/kg). Indo = response

in animals pre-treated with indomethacin (5.0 mg/kg). * p < 0.05 and ** p < 0.01. The data

is reported as the mean ± SEM. a = administered by intrapleural route, b = administered

by intraperitoneal route. N = 5 animals.

Table 3 – Effects of crude extract of Lotus corniculatus, its derived fractions and isolated

compounds upon myeloperoxidase and adenosine-deaminase activities, and IL-1β

levels in the inflammation induced by carrageenan in the mouse model of pleurisy.

Groups/Doses

(mg/kg)

MPO (mU/mL)

ADA (U/L)

1β (pg/mL)

334.00 ± 36.7 9.80 ± 0.30 1160.00 ± 119.00

CE 200

121.00 ± 19.90** 3.20 ± 0.60** 871.00 ± 80.00*

HEX 100

176.00 ± 38.80* 4.49 ± 1.40** 659.00 ± 100.00*

AcOEt 200

141.00 ± 14.80** 0.63 ± 0.10** 732.00 ± 279.00*

BuOH 100

303.00 ± 45.70 3.24 ± 0.80** 719.00 ± 200.00*

AF 50

281.00 ± 35.70 3.50 ± 0.80** -

AF 100

220.00 ± 42.10* 3.21 ± 0.90** 744.00 ± 30.00*

Kampferitrin 100

31.50 ± 11.30** 2.25 ± 0.70** 451.00 ± 160.00*

Oleanolic acid

182.00 ± 72.20** 8.23 ± 3.70 1870.00 ± 229.00*

β-sitosterol 50

85.80 ± 56.30** 3.06 ± 0.60** 1040.00 ± 213.00

Dex 0.5

135.80 ± 14.60** 2.80 ± 0.70** 516.00 ± 47.30*

Indo 5

120.10 ± 13.70** 3.48 ± 0.10** 586.00 ± 20.00*

The crude extract (CE: 200 mg/kg) of Lotus corniculatus and its derived fractions, hexane

(HEX: 100 mg/kg), ethyl acetate fraction (AcOEt: 200 mg/kg), n-butanol fraction (BuOH:

100 mg/kg) or aqueous fraction (AF: 50 0r 100 mg/kg), and isolated compounds,

kaempferitrin (100 mg/kg), oleanolic acid (50 mg/kg) and β-sitosterol (50 mg/kg)

administered 0.5 h before the inflammation induction by carrageenan (1%). C =

response in animals treated only with carrageenan. Dex = response in animals pre-

treated with dexamethasone (0.5 mg/kg). Indo = response in animals pre-treated with

indomethacin (5.0 mg/kg). * p < 0.05 and ** p < 0.01. The data is reported as the mean ±

SEM. a = administered by intrapleural route, b = administered by intraperitoneal route. N

= 5 animals.

Table 4- Effects of the crude extract of Lotus corniculatus, its derived fractions and isolated

compounds upon nitrite/nitrate concnetration in the inflammation induced by carrageenan

in the mouse model of pleurisy.

Groups/Doses

(mg/kg)

(µM)

16.40 ± 1.50

CE 400

11.40 ± 0.90*

HEX 200

10.80 ± 1.60*

AcOEt 800

10.10 ± 0.90**

BuOH 100

14.90 ± 0.60

AF 400

9.16 ± 0.70**

Kaempferitrin 100

11.0 ± 0.70*

Oleanolic acid 50

10.5 ± 0.90*

β-sitosterol 50

10.6 ± 0.50*

Dex 0.5

4.00 ±0.76**

Indo 5

8.21 ± 1.48**

The crude extract (CE: 400 mg/kg) of Lotus corniculatus and its derived fractions, hexane

(HEX: 200 mg/kg), ethyl acetate fraction (AcOEt: 800 mg/kg), n-butanol fraction (BuOH:

100 mg/kg), aqueous fraction (AF: 400 mg/kg), and isolated compounds, kaempferitrin

(100 mg/kg), oleanolic acid (50 mg/kg) and β-sitosterol (50 mg/kg) administered 0.5 h

before the pleurisy induction by carrageenan (1%). C = response in animals treated only

with carrageenan. Dex = response in animals pre-treated with dexamethasone (0.5

mg/kg). Indo = response in animals pre-treated with indomethacin (5.0 mg/k). * p < 0.05

and ** p < 0.01. The data is reported as the mean ± SEM. a = administered by intrapleural

route, b = administered by intraperitoneal route. N = 5 animals.

4. ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO –

JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY

Anti-bacterial activity of Lotus corniculatus var. São Gabriel

Juliana Bastos Dalmarco

, Eduardo Monguilhott Dalmarco

Janaína Koelzer

, Moacir

Geraldo Pizzolatti

, Tânia Silvia Fröde

Department of Chemistry, Centre of Mathematical and Physical Sciences, Federal

University of Santa Catarina, Campus Universitário, Trindade, Florianópolis, SC,

Brazil, 88040-970.

Department of Clinical Analysis, Centre of Health Sciences, Federal University of

Santa Catarina, Campus Universitário, Trindade, Florianópolis, SC, Brazil, 88040-

970.

Department of Pharmaceutical Science, Centre of Health Sciences, University

Regional of Blumenau, Itoupava Seca, Blumenau, SC, Brazil, 89030-030.

* Correspondence: T. S. Fröde, Department of Clinical Analysis, Centre of Health

Sciences, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazil, Phone: +55

48 99614846, FAX: +55 48 32440936, E-mail address: [email protected] or

[email protected]

Abstract

Introduction: Lotus corniculatus (Fabaceae) is distributed in many regions and has a

high agronomic value constituted by characteristics such as enhancement of the

weight of ruminants and control of intestinal parasitic infections. In our study we

evaluated the anti-bacterial activity of crude extract, fractions and isolated

compounds from Lotus corniculatus var. São Gabriel using the minimal inhibitory

concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC). Results: The

crude extract did not show any important anti-bacterial activity. On the other hand,

the hexane fraction showed moderate anti-bacterial effect (MIC = 100 µg mL

-1

) on

Bacillus cereus and weak anti-bacterial effect (MIC = 600 to 1000 µg mL

-1

) on

Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,

Staphylococcus epidermidis, Providencia alcalifaciens and Acinetobacter

calcoaceticus. Oleanolic acid isolated from hexane fraction exhibited a good anti-

bacterial activity on methycillin-resistant Staphylococcus aureus (MIC = 100 µg mL

-1

Listeria monocytogenes and Bacillus cereus (MIC = 25 µg mL

-1

). The other fraction,

ethyl acetate, also demonstrated a weak anti-bacterial activity (MIC = 800 µg mL

-1

)

on Enterococcus faecalis, Bacillus cereus and Acinetobacter calcoaceticus, but

Kaempferitrin, a compound isolated from this fraction, demonstrated a good anti-

bacterial effect on Staphylococcus epidermidis, Shigella flexinerii, Salmonella

typhimurium and Acinetobacter calcoaceticus (MIC = 100 µg mL

-1

). Furthermore, this

compound showed an excellent anti-bacterial activity on Enterococcus faecalis (MIC

= 3.9 µg mL

-1

) and Bacillus cereus (MIC = 8.5 µg mL

-1

). Conclusion: These results

qualify Kaempferitrin and oleanolic acid as potential sources for the development a

new anti-bacterial drug.

Introduction

In developing countries, infectious disease remains the cause of high mortality.

This fact is associated with the increase in bacterial resistance to the available

antibiotic agents and also the new opportunistic pathogens, especially those that

infect the immune system-debilitated host population (Planta 2007).

Nowadays, much attention is being paid to determining the anti-bacterial

activities of plant extracts prior to those already found in folk medicine. In this

context, plants produce a variety of compounds named “secondary metabolites” that

have many biological activities such as: analgesic and anti-inflammatory (Roldão et

al 2008; Yam et al 2008), antiviral and anti-fungicidal (Maregesi et al 2008), anti-ulcer

(Roldão et al 2008), anti-cancer (Tong et al 2008), anti-thrombotic and anti-platelet

(Jin et al 2007) and anti-bacterial effects (da Silva et al 2008).

Lotus corniculatus (Fabaceae), also known as “bird’s trefoil”, is distributed in

many regions of the world, and has a high agronomic value since it is used as a

forage plant to increase the weight of ruminants (Sivakumaran et al 2006) and to

control intestinal parasitic infection (Marley et al 2006). In Brazil, Lotus corniculatus

var. São Gabriel is cultivated in the southern region of the country and it is also used

as forage to reduce feed intake and to increase the digestibility in ruminants (Min et

al 2002).

In relation to phytochemical studies of the Lotus species, there are some

reports showing important constituents including flavonoids (Reynaud & Lussignol

2005), anthocyanins (Robbins et al 2003), sterols (Abdel-Ghani et al 2001), tannins

(Hedqvist et al 2000), alkaloids (Rizk et al 1986) and cyanogenic compounds

(Goverde et al 2008). Nevertheless, there are few reports concerning the

investigation of the anti-bacterial activity of the genus Lotus (Mahasneh 2002),

including Lotus corniculatus (Abdel-Ghani et al 2001). In this study we investigated

the anti-bacterial activity of the crude extract, fractions and purified compounds from

Lotus corniculatus var. São Gabriel. We also identified which compounds were

responsible for this biological activity.

Materials and Methods

Plant materials

Lotus corniculatus var. São Gabriel was collected in November 2006, in Lages,

Santa Catarina State, Brazil, at the Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão

Rural de Santa Catarina S.A. (EPAGRI). The material was identified by the botanist

Prof. Dr. Daniel de Barcelos Falkenberg of the Botany Department at the Federal

University of Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazil. A voucher specimen is

deposited in the Herbarium at the same university (FLOR 18.770).

Preparation of plant extracts

The aerial parts of Lotus corniculatus var. São Gabriel were dried at room

temperature with air circulation. The dried and ground material (620 g) was extracted

by maceration with ethanol 96% for one month. The solvent was evaporated under

low pressure at 55

C to dryness, yielding 78 g of crude extract (CE). The CE was

fractionated by liquid-liquid extraction using solvents in growing order of polarity,

resulting in hexanic (HEX: 7.82 g), ethyl acetate (AcOEt: 11.4 g), butanolic (BuOH:

5.24 g) and aqueous (AF: 30.8 g) fractions.

Preliminary phytochemical

In a preliminary phytochemical screening of the crude extract of Lotus

corniculatus, we used a colourimetric reaction according to standard methods and

the presence of phenols, tannins, antocyannin, antocyanidines, flavonoids, xantones,

steroids, triterpenes and saponins was identified (Matos 1997).

Chomatografic separation and isolation of constituents

The hexane fraction was chromatographed using silica gel column

chromatography with a HEX/EtOAc gradient resulting in the isolation of two

terpenoids: a fraction eluted with HEX/EtOAc (90/10) affording 76 mg of a white

crystal powder (Compound 1), and HEX/EtOAc (70/30) producing 25 mg of a white

powder (Compound 2). From ethyl acetate fraction, after silica gel column

chromatography eluted with EtOAc/EtOH (50/50), followed by purification of the

flavonoidic fraction with flash chromatography, 45 mg of a yellow powder (Compound

3) was isolated using a system of solvents (ethyl acetate/water/formic acid/acetic

acid - 70:20:3:2, v/v/v/v).

Structure elucidation of the compounds

The chemical structure of each isolated compound was determined on the basis

of its physical characteristics and spectral data produced by infrared analysis

recorded on a Perkin Elmer FTIR 16PC infrared instrument. Analysis was carried out

with KBr pellets and the results were registered in centimeters

-1

(cm

-1

). Nuclear

magnetic resonance (

H and

C-NMR) was recorded on a Varian AS-400

spectrometer operating at 300 and 100 MHz respectively. Thyl thin layer

chromatography (TLC) was carried out on silica gel 60 F

254

plates (Macherey-Nagel,

Germany). Finally, the structures of the three isolated compounds were confirmed by

comparison with reference data previously reported from available literature (Mahato

& Kundu 1994; Kovganko et al 2000; Pizzolatti et al 2004).

Bacterial strains

The microorganisms used in the anti-bacterial tests were Gram-Positive

bacteria: Bacillus cereus from the American Type Collection Culture (ATCC 11778),

Enterococcus faecalis from ATCC 29912, Listeria monocytogenes from ATCC

35152, Staphylococcus aureus from ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis from

ATCC 12228 and Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from ATCC

43300 and Gram-Negative bacteria; Acinetobacter baumanii from ATCC 17978,

Acinetobacter calcoaceticus from ATCC 19606, Escherichia coli from ATCC 25922,

Klebsiella pneumoniae from ATCC 31488, Pseudomonas aeruginosa from ATCC

27853, Proteus mirabilis from ATCC 25933, Providencia alcalifaciens from ATCC

9886, Salmonella typhimurium from ATCC 14028 and Shigella flexineri from ATCC

12022. The identification of strains was confirmed by the use of biochemical profiles

according to the recommendation of the Manual of Clinical Microbiology (Murray et al

2003).

Anti-bacterial assay

The direct anti-bacterial effect was evaluated by the broth microdilution method

as recommended by the Clinical Laboratory Standards Institute (National Committee

for Clinical Laboratory Standards - CLSI 2008) for determination of the MIC (Minimal

Inhibitory Concentration) and MBC (Minimal Bactericidal Concentration) of the crude

extract of Lotus corniculatus var. São Gabriel and its derived fractions and isolated

compounds. Crude extract, fractions and isolated compounds were dissolved in

Dimethylsufoxide (DMSO) (starting from 10 mg mL

-1

for the crude extract and

fractions and 1 mg mL

-1

for the isolated compounds). These solutions were

transferred to 96-well plates (100 µL/well) and serially diluted in Mueller-Hinton broth

(100 µL/well). The inoculum (5 µL) containing a 5 x 10

colony-forming unit per mL

(CFU/mL) of each microorganism was added to each well. A number of wells were

reserved on each plate for extract sterile control (no inoculum added), positive control

(no extract added) and reference drug control (inoculum with gentamicin from 100 to

0.1 µg mL

-1

) (Sarker et al 2007). Plates were aerobically incubated for 18–24 hr at

C, and 10 µl of methanol solution (5 mg mL

-1

) of 2,3,5 triphenyl-tetrazolium

chloride (TTC, Vetec, São Paulo, Brazil) was added to each well to detect the active

bacterial metabolism.

The MIC was defined as the lowest concentration of crude extract, fractions or

compounds that visibly inhibited growth of bacterial spots detected with TTC

(Rahman et al 2004; Abdillahi et al 2008).

To determine the Minimal Bactericidal Concentration (MBC), 10 µL of aliquots

broth were taken from each well and plated in Muller-Hinton agar for 24 h at 37

MBC represents the concentration necessary to kill 99.9 % or more of the initial

inoculum (Bosio et al 2000).

To evaluate the anti-bacterial activity of the crude extract and fractions, an MIC

below 100 µg mL

-1

was considered as an excellent effect, from 100 to 500 µg mL

-1

moderate, from 500 to 1000 µg mL

-1

as weak, and over 1000 µg mL

-1

as inactive

(Machado et al 2005). For isolated compounds, an MIC below 10 µg mL

-1

was

excellent, 10 to 100 µg mL

-1

was good, and over 100 µg mL

-1

was inactive (Ríos &

Recio 2005). If the MBC was up to three-fold the dilution of the MIC, the anti-bacterial

activity was considered to be bacteriostatic, and if the MBC was lower than three-fold

the dilution of the MIC, the anti-bacterial activity was considered to be bactericidal

(Okusa et al 2007).

Chemicals

Purchases were as follows. Muller Hinton broth and agar from Oxoid

(Hampshire, UK); gentamicine from Laboratório Chile (Santiago, CHILE); 2,3,5-

triphenyltetrazolium chloride TTC fromVetec (São Paulo, SP, Brazil); organic

solvents: acetone, chloroform, n-Hexane, ethyl acetate, n-Butanol, methanol, and

ethanol (all analytical grade) from Synth (Diadema, SP, Brazil); sheep’s blood

(Newprov, Curitiba, PR, Brazil); Dimethylsulfoxide – DMSO from Sigma–Aldrich (St.

Louis, USA). Other reagents used were of analytical grade and were obtained from

different commercial sources.

Results

Phytochemical analysis

Preliminary phytochemical analysis showed that the crude extract of Lotus

corniculatus var. São Gabriel had a significant presence of flavonoids, steroids and

terpenoids. From hexane fraction, we isolated the Compound 1 that was identified as

β-sitosterol (Figure 1A). The second compound (Compound 2), also isolated from the

same fraction, was identified as oleanolic acid (Figure 1B). Finally, from ethyl acetate

fraction we isolated a flavonoid O-heteroside (Compound 3), that was identified as

Kaempferitrin (Figure 1C).

Anti-bacterial analysis

The anti-bacterial activities of the crude extract, aqueous and butanolic fractions

against all bacteria tested were considered inactive since none of them showed anti-

bacterial activity up to 1000 µg mL

-1

. On the other hand, the hexane fraction

demonstrated a moderate anti-bacterial activity (MIC = 100 µg mL

-1

) in the gram-

positive bacteria Bacillus cereus (Table 1) and a weak anti-bacterial effect (MIC =

600, 800 or 1000 µg mL

-1

) on Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes,

Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis and the gram-negative

bacteria Acinetobacter calcoaceticus and Providencia alcalifaciens.

Ethyl acetate fraction (AcOEt) also had a weak anti-bacterial activity (MIC = 800

µg mL

-1

) on the gram-positive bacteria Bacillus cereus and Enterococcus faecalis

and the gram-negative bacterium Acinetobacter calcoaceticus (Table 1).

All these effects were considered to be of bacteriostatic action, since the MBCs

were at a dilution of more than three-fold that of the MICs (Tables 1 and 2). Further,

the hexane and ethyl acetate fractions demonstrated better anti-bacterial activity than

the other studied fractions.

Subsequently, we wondered which active constituents could be responsible for

the anti-bacterial activity of Lotus corniculatus var. São Gabriel. First of all, we

isolated Compound 1 (β-sitosterol) (Figure 1A) and Compound 2 (oleanolic acid)

(Figure 1B) from the hexane fraction and Compound 3 (Kaempferitrin) (Figure 1C)

from the ethyl acetate fraction. The second step was to investigate the anti-bacterial

effect of these three isolated compounds using the same methodology. Compound 1

(Figure 1A) did not show any significant anti-bacterial activity. On the other hand,

Compound 2 (Figure 1B) showed a good anti-bacterial activity (MICs from 25 to 100

µg mL

-1

) on the gram-positive bacteria Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, and

the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Table 1). Compound 3 (Figure 1C)

also showed a good anti-bacterial activity (MICs from 25 to 100 µg mL

-1

) on the

gram-positive bacterium Staphylococcus epidermidis and the gram-negative bacteria

Acinetobacter calcoaceticus, Shiguella flexinerii and Salmonella typhimurium. These

effects were considered to be bacteriostatic (Tables 1 and 2).

Surprisingly, the best activity was observed with this Kaempferitrin against two

gram-positive bacteria, Bacillus cereus and Enterococcus faecalis, with an excellent

anti-bacterial activity (MIC = 8.5 µg mL

-1

and 3.9 µg mL

-1

, respectively). In this case,

the anti-bacterial activity was considered to be bacteriostatic for Bacillus cereus and

bactericidal for Enterococcus faecalis (Tables 1 and 2).

Discussion

There are few reports about the anti-bacterial activity of Lotus corniculatus

concerning the Lotus corniculatus var. ternuifolius that showed anti-bacterial activity

against gram-positive and gram–negative bacteria. Our results demonstrated that

Lotus corniculatus var. São Gabriel exhibited an important anti-bacterial activity and

this effect was more pronounced with hexane and ethyl acetate fractions. The

phytochemical analysis of the crude extract showed the presence of flavonoids,

steroids and tepenoids. Similar results have been presented by other authors who

have also demonstrated these compounds in Lotus corniculatus var. ternuifolis

(Abdel-Ghani et al 2001). One hypothesis to explain the anti-bacterial effect observed

in the hexane fraction could be the presence of terpenoids. This is in accordance with

other studies that have also demonstrated anti-bacterial properties of terpenoids

(Marthanda Murthy et al 2005). Studies have shown that the anti-bacterial effect of

terpenoids is due to their ability to disrupt the membranes of the bacteria which leads

to the death of the microorganisms (Cowan 1999).

After analysis of the hexane fraction we isolated a terpenoid, identified as

oleanolic acid, that showed moderate anti-bacterial activity against three gram-

positive bacteria, a fact that had also been demonstrated by other authors showing

the important anti-bacterial activity of this compound against the same gram-positive

bacteria as those tested in our experiments (Woldemichael et al 2003; Horiuchi et al

2007).

Another substance that revealed important anti-bacterial activity was the

flavonoid isolated from ethyl acetate fraction. Other studies have also demonstrated

the presence of flavonoids in aerial parts of japonicus and alpine varieties of Lotus

(Reynaud & Lussignol, 2005). In addition to their ability to cause DNA damage in

bacteria (Urgaonkar et al 2007), it is well known that flavonoids possess important

anti-bacterial activity that acts via different mechanisms of action, such as

complexing with the bacterial cell wall and decreasing microbial growth (Cushnie &

Lamb 2005), inhibiting the activity of the DNA topoisomerase II (DNA gyrase)

(Piddock et al 1990), promoting the inhibition of bacterial cell division (Vollmer 2006),

and inhibiting the GTPase activity (Urgaonkar et al 2005). The flavonoid O-heteroside

Kaempferitrin showed excellent anti-bacterial activity against two gram-positive

bacteria comparable to the reference antibiotic gentamicine, and this result is also in

accordance with Abdel-Ghani and co-workers (2001) who have also demonstrated

important anti-bacterial activity of Kaempferitrin against both gram-positive and gram

negative bacteria.

Another compound isolated from hexane fraction was β-sitosterol, a sterol that

does not show a significant anti-bacterial activity. These results are also in

accordance with other authors who have shown that this compound has slight anti-

bacterial activity against Escherichia coli and absence of activity against some gram-

positive bacteria (Nazif 2002).

Conclusion

Our results demonstrated a potent anti-bacterial activity of Lotus corniculatus

var. São Gabriel that can be attributed to isolated compounds such Kaempferitrin and

oleanolic acid. Furthermore, Kaempferitrin demonstrated a good anti-bacterial effect

in some gram-negative bacteria and excellent anti-bacterial effect against two gram-

positive bacteria. These results qualify Kaempferitrin and oleanolic acid as being

sources for the development of a new anti-bacterial drug from natural product.

Acknowledgements and funding: We are grateful to researcher MSc Ulisses de

Arruda Córdova of EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural

de Santa Catarina S.A, Pesquisa, Estação Experimental de Lages) for the kind

donation of Lotus corniculatus var. São Gabriel and to Daniel Falkenberg for plant

identification and herbarization. This study was supported by stipends and grants

provided by CAPES and CNPq (Brazil). This work represents a part of Juliana Bastos

Dalmarco’s and Janaína Koelzer’s MSc on the Postgraduate Program at the Federal

University of Santa Catarina (Brazil).

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Compound 1 (β-sitosterol)

COOH

Compound 2 (Oleanolic acid)

Compound 3 (Kaempferitrin)

Figure 1: The chemical structures of β-sitosterol (A), oleanolic acid (B) isolated from

n-hexane fraction and Kaempferitrin (C) isolated from ethyl acetate fraction of Lotus

corniculatus var. São Gabriel (Fabaceae) aerial parts.

Table 1: Minimal inhibitory concentrations (MICs: µg mL

-1

) of crude extract, fractions and isolated compounds of aerial parts from Lotus

corniculatus var. São Gabriel

CE HEX AF BuOH AcOEt Comp. 1 Comp. 2 Comp. 3 GE

Gram-Positive bacteria

Bacillus cereus

ATCC

11778

>1000

100

>1000

800

>1000

8,5

0,2

Enterococcus faecalis ATCC 29912

1000

600 >1000

>1000

800 300 300 3,9 6,0

Listeria monocytogenes ATCC 35152

>1000

800 >1000

>1000

500 25 300 0,2

MRSA

ATCC 43300

>1000

500 100 200 100

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

>1000

800 >1000

>1000

500 600 100 0,1

Staphylococcus aureus ATCC 25923

>1000

1000

>1000

500 800 200 1,0

Gram-Negative bacteria

Acinetobacter baumanii ATCC 17978

>1000

500 6,0

Acinetobacter calcoaceticus ATCC 19606

>1000

600 >1000

>1000

800 800 600 100 6,0

Escherichia coli

ATCC

25922

>1000

500

6,0

Klebsiella pneumoniae ATCC 31488

>1000

500 1,0

Proteus mirabilis ATCC 25933

>1000

500 200 200 12,0

Providencia alcalifaciens

ATCC

9886

>1000

800

>1000

800

500

2,0

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

>1000

800 800 500 1,0

Salmonella typhimurium ATCC 14028

>1000

500 200 100 6,0

Shigella flexinerii ATCC 12022

>1000

400 200 100 3,1

CE = Hidroalchoolic crude extract; HEX = n-Hexane extract; AF = aqueous extract; BuOH = butanol extract; AcOEt = ethyl acetate extract; Comp.

1 = β sitosterol; Comp. 2 = Oleanolic acid and Comp. 3 = Kaempferitrin; GE = Gentamicine; * Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; ATCC

– American type collection culture (data from three experiments).

Table 2 Minimal bactericidal concentrations (MBCs: µg mL

-1

) of crude extract, fractions and isolated compounds of aerial parts from Lotus

corniculatus var. São Gabriel

CE HEX AF BuOH AcOEt Comp. 1 Comp. 2 Comp. 3 GE

Gram-Positive bacteria

Bacillus cereus ATCC 11778

>1000

> 1000

>1000

200 34 0,4

Enterococcus faecalis ATCC 29912

>1000

900 >1000

7,4 12,0

Listeria monocytogenes ATCC 35152

>1000

200 900 0,2

MRSA

ATCC 43300

>1000

800 800 100

Staphylococcus aureus ATCC 25923

>1000

> 1000

800 4,0

Staphylococcus epidermidis

ATCC

12228

>1000

1000

>1000

400

0,2

Gram-Negative bacteria

Acinetobacter baumanii ATCC 17978

>1000

24,0

Acinetobacter calcoaceticus ATCC

19606

>1000

12,0

Escherichia coli

ATCC

25922

>1000

12,0

Klebsiella pneumoniae ATCC 31488

>1000

4,0

Proteus mirabilis ATCC 25933

>1000

24,0

Providencia alcalifaciens ATCC 9886

>1000

8,0

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

>1000

4,0

Salmonella typhimurium ATCC 14028

>1000

800 12,0

Shigella flexinerii ATCC 12022

>1000

800 3,1

CE = Hidroalchoolic crude extract; HEX = n-Hexane extract; AF = aqueous extract; BuOH = butanol extract; AcOEt = ethyl acetate extract; Comp.

1 = β sitosterol; Comp. 2 = Oleanolic acid and Comp. 3 = Kaempferitrin; GE = Gentamicine; *Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; ATCC –

American type collection culture (data from three experiments).

5. DISCUSSÃO

Os resultados deste trabalho demonstraram que o extrato bruto

hidroalcólico (CE), obtido das partes aéreas da Lotus corniculatus v. São Gabriel foi

efetivo em inibir a migração leucocitária, principalmente às custas da inibição de

neutrófilos, células consideradas marcadores da resposta inflamatória aguda

(KELLY et al., 2007).

Além do extrato bruto hidroalcólico, as frações: hexano (HEX), acetato de

etila (AcOEt), butanólica (BuOH) e resíduo aquoso (AF) também demonstraram

importante efeito anti-inflamatório, inibindo a migração dos leucócitos e dos

neutrófilos. É importante salientar que a fração AF demonstrou melhor efeito anti-

inflamatório comparada as frações HEX, AcOEt e BuOH, tendo em vista que dose

inferior (50 mg/kg) foi efetiva em inibir a migração dos leucócitos quando comparada

as outras frações, as quais também inibiram este parâmetro, mas em doses

superiores (100 e 200 mg/kg).

O extrato bruto hidroalcólico e as frações isoladas também inibiram a

atividade da enzima adenosina-deaminase (ADA), a qual está relacionada à ativação

dos mononucleares (FRÖDE; MEDEIROS, 2001; HASKO et al., 2008). Estudos de

biologia molecular realizado por Zhong et al. (2003) identificaram a expressão dos

receptores de adenosina (A

, A

e A

) em mastócitos no pulmão de camundongos

(ZHONG et al., 2003). Fozard et al. (2002) demonstraram o tratamento prévio de

ratos com agonista seletivo do receptor A

(CGS21680), houve diminuição da

infiltração de leucócitos, da atividade da MPO e da peroxidase de eosinófilos, no

lavado broncoalveolar, em modelo de asma alérgica induzido por ovoalbumina.

Esses efeitos foram inibidos quando os animais receberam o tratamento prévio com

o antagonista seletivo para o receptor de adenosina A

(ZM241385) (FOZARD et

al., 2002). Haskó et al. (2006) demonstraram que ratos tratados previamente com o

agonista seletivo do receptor A

(CGS21680) apresentaram diminuição da

infiltração de neutrófilos, edema e atividade da MPO, no lavado broncoalveolar, em

modelo de isquemia/reperfusão induzido por choque hemorrágico (HASKÓ et al.,

2006). Esses resultados sugerem a participação da adenosina na resposta

inflamatória via receptor A

(HASKÓ et al., 2000)

O extrato bruto hidroalcólico e as frações HEX, AcOEt e AF foram efetivos

em inibir também a atividade da MPO, enzima considerada marcador da ativação

neutrofílica (LAU; BALDUS, 2006). As frações HEX e AF demonstraram também

melhor efeito anti-inflamatório com relação a esse parâmetro, uma vez que, a dose

de 100 mg/kg inibiu esta enzima pró-inflamatória quando comparada a fração

AcOEt, a qual foi efetiva em inibir a atividade da MPO somente em dose superior de

200 mg/kg.

Estudos utilizando modelos experimentais, já demonstraram a participação

da MPO no processo inflamatório, inclusive no modelo de pleurisia induzida pela

carragenina (FRÖDE; MEDEIROS, 2001; MENEGAZZI et al., 2008) e no modelo de

inflamação do duodeno, induzida por terenbetina, ambos em camundongos (FAITH

et al., 2008). Lau et al. (2005) também já evidenciaram o envolvimento da MPO no

processo inflamatório. Nesse estudo observou-se que polimorfonucleares humanos

quando estimulados in vitro com a MPO houve aumento na ativação da proteína

quinase ativadora de miógeno (p38), do fator nuclear kappa B (NF-κB) e da

expressão de moléculas de adesão do tipo integrinas (CD11b/CD18). Esses

resultados revelaram que a MPO pode ativar os neutrófilos também via proteina

tirosina quinase (LAU et al., 2005).

É importante ressaltar que a liberação da MPO está relacionada também

com a liberação do NO (LAU; BALDUS, 2006). Aoi et al. (2008) demonstraram o

aumento da atividade da MPO e da concentração de NO por meio da ativação das

enzimas iNOS e eNOS, em modelo de colite induzido por dextran, em ratos (AOI et

al., 2008). Estudos realizados em animais knockout para a MPO, observou-se que a

administração de LPS promoveu o aumento da liberação de NO. Esses resultados

sugerem que tanto a ativação da MPO, como a liberação de NO, podem ter uma via

comum de sinalização (EISERICH et al., 2002).

Em nossos experimentos, os animais tratados previamente com o extrato

bruto hidroalcólico, frações e compostos isolados da Lotus corniculatus v. São

Gabriel apresentaram também a diminuição nas concentrações de nitrito/nitrato.

O óxido nítrico é um importante mediador da resposta inflamatória e é

liberado em grande quantidade por meio da ativação da enzima iNOS (GARCIA;

STEIN, 2006). Muitos estudos já evidenciaram o papel da iNOS em modelos

experimentais de inflamação crônica das vias aéreas. Prado et al. (2006)

demonstraram em modelo de inflamação pulmonar crônica em cobaias, estimulados

com ovoalbumina, que os animais tratados com inibidor seletivo de iNOS (1400W),

ocorreu: 1) diminuição na concentração do óxido nítrico exalado, 2) inibição da

infiltração de eosinófilos e de mononucleares e 3) diminuição da deposição de fibras

de colágeno e elásticas em tecido não cartilaginoso nas paredes das vias aéreas

dos animais (PRADO et al., 2006). Eynott et al. (2002) demonstraram ainda em

modelo de asma alérgica induzido por ovoalbumina em ratos, que quando os

animais foram tratados previamente com inibidor seletivo de iNOS (SC-51), ocorreu

a diminuição de: 1) óxido nítrico exalado, 2) hiperresponsividade brônquica e 3)

infiltração de neutrófilos e de eosinófilos, no lavado broncoalveolar (EYNOTT et al.,

2002).

O efeito anti-inflamatório do material vegetal foi caracterizado também pela

inibição da exsudação, exceto para a fração butanólica (BuOH). A exsudação possui

papel fundamental na resposta inflamatória na mucosa das vias aéreas, pois

consiste no primeiro mecanismo de defesa como um fator potencialmente pró-

inflamatório, e pode ser implicado como um marcador específico da resposta

inflamatória, já que a exsudação reflete o quanto a mucosa é lesada por essa

resposta. Na asma brônquica, a exsudação tem um papel importante, já que este

promove a amplificação da resposta inflamatória . Esta amplificação deve-se ao fato

da liberação a nível local de vários mediadores pró-inflamatórios, como por exemplo:

histamina, bradicinina, leucotrienos, fator ativador de plaquetas e fator de necrose

tumoral (TNF-α) (PERSSON et al., 1998; GREIFF et al., 2003).

Os resultados demonstraram que o extrato bruto hidroalcólico e frações

também inibiram a concentração de IL-1β na inflamação induzida pela carragenina.

Estudos já demonstraram a participação da IL-1β na inflamação em modelos

experimentais. Oliveira et al. (2007) demonstraram que o tratamento prévio de ratos

com inibidor seletivo do fator ativador de plaquetas (PCA 4248), inibidor de

leucotrienos (MK 886) ou dexametasona inibiram a migração de leucócitos e

neutrófilos na cavidade peritoneal, em modelo de peritonite induzido por IL-1β

(OLIVEIRA et al., 2007). Cardell et al. (2008) demonstraram ainda que a inalação de

IL-1β promoveu o aumento na expressão dos receptores IL-1 R1, TNF RI e TNF RII

nas células epiteliais do pulmão, e de TNF RI e TNF RII nas células da musculatura

lisa da traquéia, em modelo de asma, bem como em cultura de células da

musculatura lisa da traquéia de camundongos. Esses resultados evidenciaram a

participação da IL-1β na hiperrresponsividade das vias aéreas, em camundongos

(CARDELL et al., 2008). Zhang, Adner e Cardell (2007) demonstraram em estudo in

vitro, utilizando células da musculatura lisa da traquéia de camundongos

estimuladas com IL-1β e/ou TNF-α, o aumento na expressão dos receptores de

bradicinina B1 e B2 nessas células. A IL-1β aumentou ainda a expressão do RNAm

do TNF-α nas células epiteliais e nas células da musculatura lisa da traquéia de

camundongos. Esses resultados indicam que a IL-1β e o TNF-α participam da

hiperresponsividade no processo inflamatório das vias aéreas, em células da

musculatura lisa e epiteliais da traquéia de camundongos (ZHANG; ADNER;

CARDELL, 2007).

Com relação aos compostos isolados da Lotus corniculatus v. São Gabriel,

o ácido oleanólico e o β-sitosterol, isolados da fração HEX, apresentaram melhor

atividade anti-inflamatória por meio da inibição de leucócitos e da exsudação

comparados ao canferitrin, isolado da fração AcOEt.

Entretanto, o canferitrin demonstrou melhor efeito anti-inflamatório em inibir

a atividade da MPO e da ADA, e as concentrações de IL-1β em relação aos outros

compostos e fármacos de referência, uma vez que o canferitrin inibiu 3,8 vezes mais

a MPO, 1,5 vezes mais a ADA e 1,3 vezes mais a concentração de IL-1β,

comparado à indometacina (P < 0,05). Além disso, este composto inibiu 4,3 e 1,2

vezes mais a atividade da MPO e da ADA, quando comparado à dexametasona,

respectivamente (P < 0,05).

Os resultados encontrados estão de acordo com o trabalho realizado por

Trouillas et al. (2003), o qual demonstraram em estudos in vitro que o extrato

hidroalcólico da Lotus corniculatus na presença dos radicais 2,2-difenil-1-picril-

hidrazil (DPPH), ânion superóxido (O

e radical hidroxil (OH

), inibiu a atividade

oxidante desses radicais por meio do seqüestro dos mesmos, evidenciando a

propriedade antioxidante do extrato (TROUILLAS et al., 2003).

Resultados semelhantes foram encontrados por Fang et al. (2005), os

quais demonstraram que o canferitrin diminuiu as concentrações de NO, TNF-α e IL-

12 em macrófagos peritoneais de camundongos estimulados por LPS/IFN-γ (FANG;

RAO; TZENG, 2005). Estudo in vitro realizado por Regasini et al. (2008),

demonstraram ainda que o canferitrin inibiu a peroxidação do guaiacol na presença

de H

e da MPO. Este resultado indica que o composto inibiu indiretamente a

atividade da MPO (REGASINI et al., 2008).

O ácido oleanólico, um composto triterpenóide, também possui atividade

anti-inflamatória. Singh et al. (1992) demonstraram que este composto inibiu a

exsudação e a infiltração de leucócitos no modelo de pleurisia induzida por

carragenina, em camundongos (SINGH et al., 1992). Esse composto inibiu ainda a

enzima iNOS, via inibição da ativação do NF-κB, em macrófagos de camundongos

(RAW 264.7) estimulados por LPS (SUH et al., 2007).

Em relação ao β-sitosterol, um fitoesterol presente em muitas plantas,

sabe-se que esse composto também possui atividade anti-inflamatória. Gómez et al.

(1999) demonstraram que esse composto inibiu o edema, a migração de neutrófilos

e atividade da MPO, no modelo de inflamação de edema de orelha induzido por 12-

O-tetradecanoilforbol acetato (TPA), em camundongos (GÓMEZ et al., 1999). Yuk

et al. (2007) também demonstraram que o tratamento de camundongos com β-

sitosterol diminuiu o influxo de eosinófilos, a secreção de muco e a expressão de IL-

4 e IL-5, no lavado broncoalveolar, no modelo de asma alérgica induzida por

ovoalbumina (YUK et al., 2007). O β-sitosterol também foi efetivo em inibir a

exsudação, no modelo de edema de orelha induzido por acetona, em camundongos

(MAVAR-MANGA et al., 2008). Essa substância também inibiu a liberação de IL-12

em células T Jukart humanas estimuladas por concavalina (ConA) ou por forbol-12-

miristato-13-acetato e ionomicina (PMA + IoM) (AHERNE; O’ BRIEN, 2008).

Desta forma, os resultados obtidos com a Lotus corniculatus v. São Gabriel

demonstraram importante atividade anti-inflamatória, e seus constituintes, canferitrin,

ácido oleanólico e β-sitosterol podem ser os responsáveis por essa atividade.

Além da atividade anti-inflamatória demonstrada pela Lotus corniculatus v.

São Gabriel, esta planta também apresentou atividade antibacteriana. O extrato

bruto hidroalcóolico, e as frações AF e BuOH foram considerados inativos para as

bactérias testadas, por terem demonstrado CIM superiores a 1000 µg/mL. Segundo

os critérios de Machado et al. (2005), a fração HEX apresentou fraca atividade

antibacteriana para Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis e Listeria

monocytogenes, e atividade moderada para Bacillus cereus, todas estas bactérias

gram-positivas.

O β-sitosterol, segundo Rios e Recio (2005), não demonstrou atividade

antibacteriana significativa para as bactérias testadas. Esses resultados são

corroborados por Hess et al., (1995) que demonstraram que o β-sitosterol não foi

efetivo em inibir o crescimento bacteriano da E. coli e S. aureus (HESS et al., 1995).

O ácido oleanólico demonstrou atividade antimicrobiana considerada

moderada para as bactérias Gram-positivas: Bacilus cereus (CIM = 25 µg/mL) e

Listeria monocytogenes (CIM = 25 µg/mL). Este resultado, em particular, pode ser

explicado, em parte, devido à atividade antibacteriana observada pela fração HEX

para as mesmas bactérias. Segundo Cowan (1999), um dos prováveis mecanismos

para o efeito antibacteriano do ácido oleanólico seria por meio da ruptura da

membrana das bactérias Gram-positivas (COWAN, 1999).

Outra fração que apresentou fraca atividade antibacteriana foi a AcOEt

para as bactérias Gram-positivas: Enterococcus faecalis e Bacillus cereus, e para a

bactéria Gram-negativa: Acinetobacter calcoaceticus com valores de CIM 800

µg/mL. Esta atividade pode ser atribuída à presença significativa de flavonoides

nesta fração, dos quais já se conhece que um dos mecanismos de ação

antimicrobiana é via inibição da parede celular, impedindo o crescimento e a

multiplicação do microrganismo (COWAN, 1999; CUSHNIE; LAMB, 2005).

O composto majoritário da fração AcOEt, o flavonóide canferitrin,

demonstrou excelente atividade antibacteriana (Rios & Récio, 2005) para aos

microrganismos Gram-positivos: Enterococcus faecalis (3,9 µg/mL) e Bacilus cereus

(8,5 µg/mL). Abdel-Ghani et al. (2001) já relataram a atividade antimicrobiana deste

mesmo flavonóide, e segundo os autores, este efeito foi comparado ao cloranfenicol,

a penicilina, a oxitetraciclina e a gentamicina, considerados os mais potentes

antibióticos de uso comercial para o tratamento de infecções induzidas por bactérias

Gram-positivas e Gram-negativas (ABDEL-GHANI et al., 2001). O provável

mecanismo de ação antibacteriano do canferitrin foi proposto por diversos autores,

que demonstraram que esse flavonóide inibiu a enzima topoisomerase II (PIDDOCK;

WALTERS; DIVER, 1991), induziu a lesão do DNA (NORMAN; HANSEN;

SORENSEN, 2006) e inibiu a divisão celular bacteriana (VOLLMER, 2006).

Os resultados encontrados são bastante promissores no que se diz

respeito ao tratamento futuro de infecções bacterianas causadas pelo Enterococcus

faecalis multiresistentes, já que atualmente esta bactéria está entre os principais e

mais preocupantes causadores de infecções hospitalares nos Estados Unidos da

América e outros países desenvolvidos, além de ser também um problema

emergente nos hospitais brasileiros (JUNIOR et al., 2007). O tratamento das

infecções causadas por esta bactéria é bastante limitado, devido à presença de

mecanismos de resistência intrínsecos apresentados por esse microrganismo. Em

geral, os Enterococcus sp. demonstraram resistência intrínseca às cefalosporinas,

lincosamidas, e muitos antibióticos β-lactâmicos sintéticos, como as penicilinas

resistentes as penicilamases. Algumas espécies de Enterococcus também

demonstram resistência às baixas concentrações de aminoglicosídeos, uma vez que

os antibióticos dessa classe são pouco absorvidos no trato gastrointestinal

(GIRAFFA, 2002). É importante salientar que os índices de resistência desta

bactéria frente à vancomicina e a teicoplanina (glicopeptídeos utilizados como última

opção de tratamento em casos de infecções graves causadas por Enterococcus sp.)

estão aumentando significativamente (DESHPANDE et al., 2007; CHOU et al.,

2008). Essas informações tornam os resultados encontrados promissores, já que

não existem muitas opções de tratamento para infecções graves causadas pelo

Enterococcus.

Além disso, o canferitrin apresentou excelente atividade contra à bactéria

Bacillus cereus, o qual é responsável por grande número de intoxicações

alimentares relacionadas ao acondicionamento inadequado de alimentos

processados e cozidos, como por exemplo, carnes e cereais. Embora não seja uma

bactéria que apresente resistência aos antibióticos, a infecção causada por este

microrganismo é uma importante causa de óbitos de crianças em países

subdesenvolvidos (OMBUI; KAGIKO; ARIMI, 2001; OMBUI; NDUHIU, 2005).

6. CONCLUSÕES

I. O mecanismo de ação anti-inflamatório da Lotus corniculatus v. São Gabriel

parece estar relacionado à inibição da infiltração de leucócitos, bem como

diminuição da MPO, ADA, NO e IL-1β.

II. Os compostos canferitrin, ácido oleanólico e o β-sitosterol parecem ser os

responsáveis pelo efeito anti-inflamatório apresentado pela Lotus corniculatus v. São

Gabriel;

III. Dentre os compostos isolados da Lotus corniculatus v. São Gabriel, o canferitrin

demonstrou melhor atividade antibacteriana;

IV. Os compostos, canferitrin, ácido oleanólico, bem como o β-sitosterol, podem ser

importantes candidatos ao desenvolvimento de fármacos com potencial atividade

anti-inflamatória e/ou antimicrobiana.

Carragenina 1%

ESTÍMULO INFLAMATÓRIO

ADA MPO

INFILTRAÇÃO DE

LEUCÓCITOS

EXSUDAÇÃO

CITOCINAS

IL-1β

MONO PMN

MONO

Figura 2: Mecanismo de ação anti-inflamatória proposto para a Lotus corniculatus v.

São Gabriel. ADA: Adenosina-deaminase, MPO: Mieloperoxidase, IL-1β:

Interleucina-1 beta, TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa, NO: Óxido nítrico, ( - ):

efeito de inibição.

Extrato Bruto (CE)

Lotus corniculatus

AcOEt BuOH

Ácido Oleanólico

β-sitosterol Canferitrin

E. faecalis

Inativo

InativoBacteriostática

B. cereus

L. monocytogenes

MRSA

Bactericida Bacteriostática

S. epidermidis

A. calcoaceticus

S. flexinerii

S. typhimurium

B. cereus

Figura 3: Efeito antibacteriano da Lotus corniculatus v. São Gabriel

7. PERSPECTIVAS

I. Avaliar o efeito do extrato bruto, frações e compostos isolados da Lotus

corniculatus v. São Gabriel no modelo de pleurisia, em camundongos, utilizando

diferentes agentes flogísticos, como a bradicinina, substância P e histamina;

II. Avaliar o mecanismo de ação do extrato bruto, frações e compostos isolados

da Lotus corniculatus v. São Gabriel quando administrados oralmente, em modelo

de inflamação;

III. Avaliar a toxicidade do extrato bruto da Lotus corniculatus v. São Gabriel in

vivo;

IV. Avaliar a atividade antimicrobiana do ácido oleanólico e do canferitrin frente

às bactérias em que estes apresentaram ótimos resultados, mas em cepas

isoladas de pacientes que apresentem resistências aos antibióticos

tradicionalmente utilizados para o tratamento das infecções;

V. Realizar modificações estruturais no ácido oleanólico e canferitrin e verificar o

aumento da atividade anti-inflamatória e/ou antimicrobiana.

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ANEXO 1

Protocolo de extração do extrato bruto, frações e isolamento dos compostos

da Lotus corniculatus v. São Gabriel

Anexo 1: Esquema de fracionamento da espécie Lotus corniculatus v. São Gabriel

Maceração em etanol 96%

Suspensão em água

Partição líquido-líquido

Métodos espectroscópicos: RMN

H e C

, IV

Ponto de fusão

Bioensaios

Material vegetal seco e

moído (620g)

Extrato bruto

hidroalcoólico

(78g)

Fração graxa

(resina)

(22,7g)

Fração

Hexano (7,82g)

Fração

Butanol (5,24g)

Fração

Aquosa

(30,8g)

Fração Acetato

de Etila (11.4g)

Compostos

puros

Elucidação

estrutural

ANEXO 2

Protocolo do estudo do extrato bruto, frações e compostos isolados da Lotus

corniculatus v. São Gabriel, no modelo da pleurisia induzida pela carragenina,

em camundongos

Curva dose/tempo-resposta

Melhor dose

Melhor Tempo

Enzimas da Inflamação

Mediadores da

Inflamação

MPO ADA NO CITOCINAS

IL-1β

Anexo 2 - Protocolo do estudo do extrato bruto, frações e compostos isolados da

Lotus corniculatus v. São Gabriel, no modelo da pleurisia induzida pela carragenina,

em camundongos.

ANEXO 3

Protocolo e cadastro da Comissão de Ética no Uso de Animais

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