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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FÍSICA E MATEMÁTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FÍSICA APLICADA À MEDICINA E
BIOLOGIA
MARINA APARECIDA PIRES
“Caracterização das monocamadas mistas
(DPPC+BCD) de Langmuir: efeito da estrutura e
concentração do BCD e da força iônica na
subfase”
Ribeirão Preto – SP
2008
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MARINA APARECIDA PIRES
“Caracterização das monocamadas mistas
(DPPC+BCD) de Langmuir: efeito da estrutura e
concentração do BCD e da força iônica na
subfase”
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Física Aplicada à
Medicina e Biologia
Orientador: Prof. Dr. Iouri Borissevitch
Ribeirão Preto – SP
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL
DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA.
Ficha Catalográfica
P746c
Pires, Marina Aparecida.
Caracterização das monocamadas mistas (DPPC+BCD) de Langmuir: efeito da estrutura
e concentração do BCD e da força iônica na subfase. Ribeirão Preto, 2008.
74 f. :il.;
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto-USP. Área de concentração: Física Aplicada à Medicina e Biologia.
Orientador: Borissevitch, Iouri E.
1. Monocamadas de Langmuir. 2. Corantes ciânicos com dois cromóforos. 3. Modelo de
membrana. 4. Fosfolipídio DPPC.
i
FOLHA DE APROVAÇÃO
MARINA APARECIDA PIRES
“Caracterização das monocamadas
mistas (DPPC+BCD) de Langmuir:
efeito da estrutura e concentração do
BCD e da força iônica na subfase.”
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Física Aplicada à
Medicina e Biologia
Banca Examinadora
________________________________________
Prof. Dr(a)
________________________________________
Prof. Dr(a)
________________________________________
Prof. Dr(a)
Trabalho defendido e aprovado pela Banca Examinadora em __/__/2009.
ii
Esta dissertação é dedicada aos meus pais
Germano e Aparecida, que sempre me apoiaram.
Ao meu irmão Matheus, que mesmo longe nunca
deixou de me incentivar. À minha irmã Marisa, pelos
momentos de descontração e ao meu sobrinho Guilherme.
iii
Agradecimentos
À Deus por ter dado ao homem a capacidade de pensar, de criar e de
modificar.
Ao prof. Iouri E. Borissevitch pela dedicação na orientação deste trabalho, pela
confiança em mim depositada, pelo apoio, pelas discussões e ensinamentos.
À profa. Galina pelo carinho, apoio e discussões.
Ao prof. Osvaldo Novais de Oliveira Jr. por ceder sua estrutura e recursos
para realizar este trabalho e à profa. Maria Elisabete Darbello Zaniquelli e à
Thatyane M. Nobre pelas sugestões e discussões.
Agradecimento especial ao técnico Felippe J. Pavinatto, do Grupo de Polímeros
"Prof. Bernhard Gross" – IFSC – USP, pela dedicação para o desenvolvimento
deste trabalho, pelo ensinamento da fabricação das monocamadas, pelas
sugestões e discussões e pelo companheirismo nos longos dias de trabalho.
Aos amigos do grupo de Fotobiofisica (USP-Ribeirão): Lu Xaxá (Luciana),
Moisés, Ernando, Pablo, Wagner, Pudim (Gustavo), Marcelo e Prof.Amando,
pela amizade e convivência neste período e, em especial, à Tia Cássia pelos
conselhos, motivação e palavra amiga nos momentos difíceis.
Agradecimento especial à amiga Gisele Fantacini pelo apoio, pelas palavras
de incentivo, pela paciência e carinho, e, principalmente, pelas “terapias de
mesinha”.
À amiga Roberta Squinca que acompanhou e apoiou todo o desenvolvimento
deste trabalho.
Aos amigos Takeda e Cassiana que me incentivaram na fase final deste
trabalho.
À Simone por me ajudar a finalizar a redação deste trabalho.
À José Luiz Bruçó pela ajuda final para concretizar este trabalho.
Ao DFM, a USP e a Capes pela concessão da bolsa e suporte para pesquisa.
iv
Quem se apaixona pela prática sem ciência é como piloto que
embarca sem leme ou bússola.
(Leonardo da Vinci)
v
Resumo
Neste trabalho foram estudadas as interações entre os corantes ciânicos
com dois cromóforos (BCD) e monocamadas de Langmuir de fosfolipídio (DPPC).
Devido ao alto coeficiente de absorção molar da luz na região λ > 600 nm, ao
alto rendimento quântico do estado tripleto, à alta fotocitotoxicidade e à alta
afinidade com estruturas celulares os BCD são promissores para serem utilizados
em terapia fotodinâmica.
Os estudos das características da interação de BCD com a monocamada
são importantes tanto para esclarecer os efeitos estruturais na interação de
monocamadas com outras moléculas quanto para suas aplicações em terapia
fotodinâmica e em outras áreas tecnológicas tais como nanoeletrônica, fotônica
etc.
As isotermas de pressão superficial (π-A) obtidas mostram que os BCD e
as monocamadas interagem, pois as isotermas (π-A) se expandem conforme é
aumentado à porcentagem de BCD. Esta interação é dependente tanto da
estrutura do BCD quanto da força iônica da subfase. A partir das isotermas (π-A)
foi obtido o módulo de compressibilidade (Cs
-1
=
A
A
π
∂
−
∂
) das monocamadas, do
qual foram analisadas, de maneira mais detalhada, as modificações da
monocamada de DPPC devido à presença dos BCD. Estas modificações
compreendem o aparecimento da fase líquida expandida (LE) e formação dos
domínios antecipada em comparação com a monocamada de DPPC puro. Foi
observado que a área mínima por molécula e a elasticidade da monocamada na
fase condensada (C) aumentam juntos com a porcentagem dos BCD.
Na presença de BCD 180º as isotermas de potencial superficial (ΔV-A)
sofrem uma expansão, no entanto, o valor máximo do potencial permanece
inalterado. Isto indica que os BCD estimulam (antecipam) a orientação das
moléculas de DPPC na interface ar-água e, consequentemente, a co-orientação
das cabeças polares do DPPC, mas não contribuem no potencial superficial.
Foi observado que a presença de NaCl na subfase aumenta o efeito dos
BCD na formação da monocamada DPPC. Acreditamos que este efeito sinérgico é
devido às interações mútuas dos ânions Cl
−
com a carga positiva do grupo
vi
trimetilamônio da cabeça polar do DPPC e das cargas positivas do BCD com a
carga negativa do grupo fosfato do DPPC.
As imagens obtidas pela microscopia de ângulo de Brewster mostram, em
concordância com a análise das isotermas de pressão (π-A) e de potencial (ΔV-
A), que a formação dos domínios, e conseqüentemente da monocamada, é
antecipada na presença de BCD. Entretanto, a presença do BCD não altera o
formato dos domínios, mas diminui seu tamanho.
A análise realizada sobre os espectros de absorção óptica mostrou que os
BCD podem formar agregados tipos H na monocamada e não foram observados
agregados tipo J.
Baseando-se na análise do efeito da estrutura dos BCD, na interação com
a monocamada, e dos espectros de absorção propusemos dois modelos de
interação dos BCD com a monocamada e acreditamos que o seguinte modelo é a
melhor modelagem do sistema:
- BCD se inseri na monocamada, paralelamente ao eixo da molécula de DPPC,
interagindo tanto com a cauda hidrofóbica quanto com a cabeça polar.
Entretanto, os resultados obtidos não permitem excluir completamente o
segundo modelo proposto, no qual o BCD se localiza na parte polar da
monocamada, perpendicular ao eixo da molécula de DPPC.
vii
Abstract
In this work the interaction of cyanine dyes with two chromophores with the
DPPC phospholipid Langmuir monolayers was studied. Due to their high optical
absorption in the region λ > 600 nm, high triplet state quantum yields, high
photocytotoxicity and high affinity with cell structures the BCD are promising for
application in photodynamic therapy.
The study of the interaction of BCD with monolayers is important to clarify the
structural effects on the monolayer interaction with other molecules as well as for
application in photodynamic therapy and in other fields of technology, such as
nanoelectronics, photonics, etc.
The superficial pressure isotherms (π-A) demonstrate that BCD do interact
with monolayers, the (π-A) isotherms being expanded when the BCD relative content
increases. This interaction depends on the BCD structure and the subphase ionic
strength, as well. The curves of the compressibility module (Cs
-1
= A
A
π
∂
−
∂
) of the
monolayers
were obtained from the (π-A) isotherms, which were used for detailed
analysis of the DPPC monolayer formation in the BCD presence. The analysis
demonstrated that the monolayer expanded liquid phase and the domain were
formed earlier in the BCD presence than for pure DPPC. It was observed that
both the minimum area per molecule and the condensed phase elasticity
increased when the BCD
relative content increased.
In the presence of BCD 180
0
the superficial potential isotherms (ΔV-A) were
expanded, but the maximum potential value was unchanged. This indicates that
BCD stimulated the DPPC molecule orientation on the air-water interphase and,
consequently, the co-orientation of the DPPC polar heads, but did not contribute
itself in the surface potential.
It was observed that NaCl in the subphase increased the BCD effects on
the DPPC monolayer formation. We suppose that this synergetic effect is due to
the mutual interaction of Cl
−
anions with positive charges of the
trimethylammonium group of the DPPC polar head and that of positive BCD
charges with its phosphate group negative charges.
viii
Images obtained with the Brewster microscopy confirmed that BCD
stimulated the domain and, consequently, the monolayer formation
in accordance
with the (π-A) and (ΔV-A) analysis. At the same time the BCD did not change the
domain geometry, but reduced their sizes.
The analysis of the BCD optical absorption spectra demonstrate that the BCD
molecules in the monolayer form H aggregates and no J aggregates were observed.
Basing on the analysis of the BCD structure effects on the monolayer
formation we can propose two models of the BCD – monolayer interaction and
we believe that the follow model is better:
- the BCD molecule is inserted in the monolayer interior being parallel with the
DPPC molecule axis and interacting with both hydrophobic and polar DPPC
parts;
However, our data are not sufficient to exclude completely the possibility for the
BCD molecule to be localized just in the polar head monolayer part being
perpendicular to the DPPC molecule axis.
ix
Lista de Figuras
Figura 2.1: estrutura geral dos corantes ciânicos ............................................................................ 5
Figura 2.2: estrutura geral dos BCD, sendo
α
o ângulo entre os cromóforos. ...................................... 6
Figura 2.3: espectros de absorção dos corantes ciânicos com dois cromóforos com ângulos de 180º, 150º
e 90º entre os cromóforos em água. ............................................................................................ 7
Figura 2.4: esquema de níveis para os BCD com os efeitos de tunelamento e interação dipolo-dipolo
entre os cromóforos (Borissevitch, 1978) ...................................................................................... 8
Figura 2.5: esquema dos modelos de membrana lipoid (a) e unit membrane model (b) ....................... 9
Figura 2.6: esquema dos modelos membrana de Sjöstrand (a) e de Green e Benson (b) ..................... 10
Figura 2.7: esquema do modelo de membrana mosaico fluido ......................................................... 10
Figura 2.8: Esquema ilustrativo da balança de Langmuir com a placa de Wilhelmy e as barreiras móveis.
............................................................................................................................................. 12
Figura 2.9: Esquema do princípio da formação de filmes de Langmuir. Figura adaptada de GIRARD-
EGROT et al. 2005. ................................................................................................................... 12
Figura 3.1: exemplos de isotermas (
π
-A) de diferentes fosfolipídios em diferentes fases. Adaptada de
(Girard-Egrot et al. 2005). ......................................................................................................... 14
Figura 3.2: representação do capacitor de três camadas do modelo DF ............................................ 16
Figura 3.3: interação da radiação com uma amostra e a relação entre a intensidade da radiação
transmitida (I
T
) com a incidente (I
0
). ........................................................................................... 17
Figura 3.4: polarização da luz após incidência sobre superfície separadora de dois meios. ................... 19
Figura 3.5: refração total de um raio incidente paralelo polarizado ao plano de incidência ................... 19
Figura 3.6: esquema do arranjo experimental para a BAM .............................................................. 20
Figura 4.1: estrutura molecular dos BCD: (a) 180º, (b) 150º e (c) 90º ............................................. 21
Figura 4.2: Estrutura molecular do fosfolipídio DPPC ...................................................................... 22
Figura 4.3: esquema da montagem experimental, na cuba de Langmuir, para espectroscopia uv-visível.
............................................................................................................................................. 24
Figura 5.1: isoterma de pressão superficial e módulo de compressibilidade do DPPC – subfase aquosa .. 26
Figura 5.2: isotermas (
π
-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD180º - subfase aquosa. ................ 26
Figura 5.3: isotermas (
π
-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD150º - subfase aquosa. ................ 27
Figura 5.4: isotermas (
π
-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD90º - subfase aquosa. .................. 27
Figura 5.5: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD180º - subfase
aquosa. .................................................................................................................................. 28
Figura 5.6: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD150º - subfase
aquosa ................................................................................................................................... 28
Figura 5.7: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD90º - subfase
aquosa. .................................................................................................................................. 29
Figura 5.8: curvas de energia potencial para interação de partículas ................................................ 31
Figura 5.9: aumento do valor mínimo do Cs
-1
na transição de fase LE/LC em função da %
BCD
na
monocamada – subfase aquosa. ................................................................................................. 33
Figura 5.10: dependência da
mm
A em função da %
BCD
- subfase aquosa ........................................ 34
Figura 5.11: dependência do valor máximo do Cs
-1
na fase C, em função da %
BCD
na monocamada –
subfase aquosa. ....................................................................................................................... 34
Figura 5.12: efeito do NaCl (0,2 M) sobre a isoterma (
π
-
Α
) do DPPC. ............................................... 35
Figura 5.13: isotermas (
π
-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD180º - subfase aquosa+NaCl ....... 36
Figura 5.14: isotermas (
π
-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD150º - subfase aquosa+NaCl ....... 37
Figura 5.15: isotermas (
π
-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD90º - subfase aquosa+NaCl ......... 37
Figura 5.16: Valores de
mm
A em função da %
BCD
, em subfase H
2
O + NaCl ..................................... 38
Figura 5.17: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD 180º - subfase
aquosa+NaCl ........................................................................................................................... 39
Figura 5.18: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD 150º - subfase
aquosa+NaCl. .......................................................................................................................... 39
Figura 5.19: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD 90º - subfase
aquosa+NaCl. .......................................................................................................................... 40
Figura 5.20: valor máximo do Cs
-1
, fase C, em função da %
BCD
na monocamada – subfase aquosa+NaCl.
............................................................................................................................................. 40
Figura 5.21: deslocamento do valor máximo do Cs
-1
em função da %
BCD
na monocamada - subfase
aquosa+NaCl ........................................................................................................................... 41
Figura 5.22: isoterma de potencial superficial do DPPC. ................................................................. 42
Figura 5. 23: isotermas (
Δ
V-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD150º - subfase aquosa. .......... 43
Figura 5.24: isotermas (
Δ
V-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD90º - subfase aquosa. ............. 43
Figura 5.25: isotermas (
Δ
V-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD180º - subfase aquosa. ........... 44
x
Figura 5.26: variação do potencial (PS-PS
0
)/PS
0
, em 80 Å
2
, em função da %
BCD
– subfase aquosa. ....... 45
Figura 5.27: isotermas (
Δ
V-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD180º - subfase aquosa+NaCl. .. 45
Figura 5.28: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 84 Å
2
. ..... 47
Figura 5.29: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 61 Å
2
. ..... 48
Figura 5.30: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 53 Å
2
. ..... 48
Figura 5.31: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 50 Å
2
. ..... 49
Figura 5.32: representação esquemática do modelo (1) proposto, BCD inserido na monocamada de DPPC
– (a) BCD 180º, (b) BCD 150º ou 90º ......................................................................................... 50
Figura 5.33: representação esquemática do modelo (2) proposto, BCD na subfase, interagindo somente
com a cabeça polar das moléculas de DPPC. ................................................................................. 51
Figura 5.34: espectros de absorção de BCD180
0
incorporado em monocamada de DPPC em função da
área por molécula – subfase aquosa. ........................................................................................... 52
Figura 5.35: espectros normalizados de absorção óptica do BCD180
0
em solução aquosa em função da
concentração. .......................................................................................................................... 53
Figura 5.36: espectros normalizados do BCD180
0
em diferentes solventes ........................................ 54
Figura 5.37: representação esquemática da geometria de agregados de tipos H, J e HJ ...................... 54
Figura 5.38: Espectros demonstrativos de absorção óptica de um monômero (M) e de seus agregados H
e J ......................................................................................................................................... 55
xi
Sumário
Resumo .............................................................................................................. v
Abstract ............................................................................................................ vii
Lista de Figuras ................................................................................................. ix
Sumário ............................................................................................................. xi
Capítulo 1: Introdução ........................................................................................ 1
Capítulo 2 Base Científica ................................................................................... 5
2.1 Corantes Orgânicos ................................................................................................. 5
2.1.1 Corantes Ciânicos ............................................................................................... 5
2.1.2. Corantes Ciânicos com dois Cromóforos ................................................................ 6
2.2 Membranas Biológicas e Monocamadas de Langmuir .............................................. 8
2.2.1. A evolução dos modelos de membrana ................................................................. 8
2.2.2. Monocamadas de Langmuir ............................................................................... 11
Capítulo 3 Teoria dos Métodos Experimentais .................................................. 13
3.1. Introdução ........................................................................................................... 13
3.2. Técnicas de caracterização das monocamadas de Langmuir................................. 13
3.2.1. Pressão Superficial (π)...................................................................................... 13
3.2.1.1 Módulo de Compressibilidade Superficial (Cs
-1
) ................................................... 15
3.2.2 Potencial Superficial (ΔV) ................................................................................... 15
3.2.3 Espectroscopia de absorção na região de ultravioleta e visível ................................. 17
3.2.4 Microscopia no ângulo de Brewster (BAM) ............................................................ 18
Capítulo 4 Materiais e Métodos ......................................................................... 21
4.1 Introdução ............................................................................................................ 21
4.2 Objetos de estudo ................................................................................................. 21
4.3 Fosfolipídio DPPC .................................................................................................. 22
4.4 Preparação das amostras ...................................................................................... 22
4.5 Fabricação e caracterização das monocamadas de Langmuir ................................ 22
Capítulo 5: Resultados e Discussão................................................................... 25
5.1 Pressão de Superfície (
π
) ...................................................................................... 25
5.1.1 Subfase aquosa ................................................................................................ 25
5.1.2 Subfase aquosa + NaCl ..................................................................................... 35
5.2 Potencial Superficial (V) ........................................................................................ 41
5.2.1 Subfase aquosa ................................................................................................ 42
5.2.2 Subfase aquosa + NaCl ..................................................................................... 45
5.3 Microscopia por Ângulo de Brewster (BAM) .......................................................... 46
5.4 Influência da Estrutura da Molécula de BCD .......................................................... 49
5.5 Espectroscopia de Absorção UV-Visível ................................................................. 52
Capítulo 6 Conclusões ....................................................................................... 57
Referências Bibliográficas ................................................................................ 59
1
Capítulo 1: Introdução
A neoplasia maligna é comumente denominada de câncer ou cancro. Em
2005, de um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer foi
responsável por 7,6 milhões, o que representou 13% de todas as mortes. Do
total de óbitos por câncer ocorridos em 2005, mais de 70% ocorreram em países
de média ou baixa renda (WHO 2006). Estima-se que em 2020 o número de
casos novos anuais seja da ordem de 15 milhões. Cerca de 60% destes novos
casos ocorrerão em países em desenvolvimento.
No Brasil, as estimativas para o ano de 2008 e válidas também para o ano
de 2009, apontam que ocorrerão 466.730 casos novos de câncer, segundo o
Instituto Nacional do Câncer (INCA), órgão do Ministério da Saúde.
As terapias convencionalmente utilizadas para o tratamento do câncer são
a cirurgia, a radioterapia, a quimioterapia e a imunoterapia.
Atualmente a cirurgia é considerada o tratamento mais eficaz do câncer
de tumores localizados, mas é ineficaz contra metástases, tumores disseminados
ou inoperáveis à sua localização e evolução, e geralmente mutila o paciente. A
radioterapia é considerada a segunda melhor forma de tratamento do câncer,
principalmente contra células que se dividem rapidamente e cânceres não
amplamente disseminados, porém apresenta severos efeitos colaterais, tais
como a debilitação do estado geral do paciente. A imunoterapia utiliza-se de
vacinas contra certos tipos de cânceres e sua efetividade tem aumentado quando
combinada com técnicas de biologia molecular, mas atualmente somente é
efetiva contra um pequeno número de células tumorais. A quimioterapia
utiliza-se de fármacos, sendo útil principalmente para cânceres disseminados e
sua efetividade depende do estágio do tumor; possui pequena efetividade contra
metástases ou tumores de crescimento lento, induzindo uma grande toxicidade
às células normais vizinhas e, além disto, o câncer pode desenvolver resistência
aos medicamentos, diminuindo a efetividade do tratamento (Franks e Teich
1990).
Por causa de limitações e efeitos colaterais não desejáveis, que os
métodos convencionais possuem no tratamento, um dos constantes desafios da
ciência moderna é a busca de novos caminhos para o tratamento do câncer.
Dentre estes caminhos a terapia fotodinâmica (TFD) se apresenta como
técnica em uso clínico contra diversas enfermidades, inclusive o câncer, com a
Capitulo 1 Introdução
2
vantagem de não possuir efeitos colaterais negativos. A TFD utiliza-se de
compostos ativados através da luz (fotossensibilizador) e está em
desenvolvimento em diversos países, inclusive no Brasil, onde sua aplicação
clínica já apresenta sucessos no tratamento. A eficiência da TFD está
diretamente relacionada aos fotossensibilizadores (FS) utilizados. Tais compostos
devem possuir algumas características específicas (Bonnett 2001):
a
1
) baixa ou nenhuma toxicidade no escuro;
a
2
) bom comportamento farmacocinético, isto é, seletividade pelo tecido
tumoral;
a
3
) fácil excreção do corpo do paciente;
a
4
) absorção intensa na região espectral visível, preferencialmente na região λ >
600 nm, onde os tecidos biológicos são relativamente transparentes.
Os corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) são compostos fotoativos
promissores para serem utilizados em TFD por apresentarem:
b
1
) absorção óptica intensa (
ε
≈ 10
5
) em
λ
> 580 nm;
b
2
) rendimento quântico do estado tripleto relativamente alto (> 40%) já em
soluções homogêneas (Ochsner 1997; Kuzmin et al. 1976);
b
3
) alta afinidade com moléculas de DNA (Schaberle 2002) e tensoativos;
b
4
) alta fotocitotoxicidade contra várias linhagens de células malignas mostrada
recentemente por nosso grupo de pesquisa.
A ação de muitas drogas é mediada pela membrana biológica. Esta
mediação (interação) pode modificar as características físico-químicas da droga,
afetando sua efetividade nas aplicações. Por isto, o estudo das interações de
drogas com membranas é necessário. Analisando os efeitos da interação nas
características das drogas podem-se determinar suas constantes de ligação e a
localização na estrutura da célula. Por outro lado, a interação com drogas, em
nosso caso com BCD, pode afetar as características da membrana, tais como sua
rigidez mecânica (flexibilidade) ou potencial elétrico de sua superfície. Devido à
complexidade das membranas biológicas, estes estudos são realizados utilizando
modelos de membranas simplificados denominados sistemas modelos
biomiméticos. Estes sistemas modelos podem ser agrupados em monocamadas,
bicamadas planas, lipossomos ou vesículas (Gennis) e micelas, sendo que, cada
modelo apresenta vantagens e desvantagens.
Capitulo 1 Introdução
3
As monocamadas de Langmuir são consideradas um modelo simples, mas
muito eficiente (Phillips e Chapman 1968) que pode mimetizar as principais
características de uma membrana biológica. A vantagem de se utilizar
monocamadas de Langmuir é o controle sobre suas características mecânicas e
elétricas. Isto é possível porque se controla o empacotamento dos fosfolipídios,
que pode assim mimetizar vários estágios da estrutura da membrana (Pavinatto
et al. 2007), além disto, as monocamadas permitem investigar interações entre
moléculas em um arranjo com estrutura bem definida (Miñoes et al. 2002).
Filmes fabricados a partir do processo de deposição Langmuir-Blodgett
(LB) possuem diversas aplicações tecnológicas tais como memórias, sensores,
litografia, dispositivos óticos não lineares, dispositivos eletrônicos (eletrônica
molecular), etc (Oliveira Jr 1990, Yang et al. 1994). A técnica LB consiste na
transferência das monocamadas formadas na interface ar-água para substratos
sólidos (Blodgett 1935; Blodgett e Langmuir 1937). Defeitos como pinholes,
fissuras (cracks) e dobras (folds) da estrutura (Yang et al. 1994), na
monocamada formada na interface ar-água, podem limitar as aplicações dos
filmes LB. Por isto é fundamental conhecer e controlar as propriedades destas
monocamadas.
Os corantes orgânicos, em particular, da classe das cianinas, possuem alta
afinidade com estruturas celulares, principalmente com ácidos nucléicos
(Yarmoluc et al. 2000; Ogulchansky et al. 2000) e por isso são amplamente
utilizadas como agentes de contraste em biologia celular. Além de seu potencial
em aplicações médicas, também são amplamente usados em vários campos
tecnológicos: discos óticos (Tani et al. 2008), fotossensibilizadores em
fotografias (James 1977), ótica não linear (Grishina et al. 2008, Owen et al.
1998) etc.
Devido às vantagens acima listadas, neste trabalho utilizaram-se as
monocamadas como sistema mimético da membrana biológica e como estruturas
importantes da nanotecnologia. O objetivo do estudo é compreender como a
incorporação dos BCD na monocamada formada de um fosfolipídio (DPPC), afeta
o processo da formação da monocamada, como se modificam as características
estruturais e elétricas da monocamada devido à presença de BCD e determinar a
localização dos BCD na monocamada. Os estudos foram realizados em função da
Capitulo 1 Introdução
4
estrutura espacial dos BCD, de sua concentração na monocamada e da influência
da força iônica na subfase (0,2 M de NaCl).
5
Capítulo 2 Base Científica
2.1 Corantes Orgânicos
2.1.1 Corantes Ciânicos
Estruturalmente, os corantes ciânicos (CC), ou simplesmente cianinas, são
corantes polimetínicos que podem ser definidos como sais monoácidos em que
dois núcleos heterocíclicos, possuindo pelo menos um átomo de nitrogênio, estão
ligados por uma cadeia de ligações duplas conjugadas (conjugação-π, figura 2.1).
Embora um átomo de nitrogênio seja terciário e o outro quaternário, o grupo
ácido não pode ser visto como ligado mais a um do que ao outro nitrogênio.
Desta forma, uma cianina é vista como um híbrido de ressonância de duas
estruturas canônicas, pois nenhuma fórmula simples fornece uma representação
completa do composto (Almeida; Armitage 2005).
Figura 2.1: estrutura geral dos corantes ciânicos
A cor intensa apresentada pelas cianinas está associada à interação de
ressonância entre os átomos de nitrogênio nos dois extremos da cadeia
conjugada, envolvendo o “movimento” da carga negativa (Almeida). As cianinas
podem absorver em um intervalo muito extenso do espectro eletromagnético,
desde os 340 nm aos 800 nm, ou seja, desde o ultravioleta até ao infravermelho
próximo, devido às diversas variações estruturais. O comprimento de onda de
absorção é influenciado, em primeiro lugar e, com efeito, mais significativo, pelo
tipo de anel heterocíclico e pelo número de ligações duplas conjugadas entre os
dois nitrogênios, ou seja, pelo comprimento da cadeia metínica. Em segundo
lugar, pela simetria, ou não, dos anéis heterocíclicos presentes, pela natureza do
grupo alquila, pelos substituintes presentes tanto na cadeia metínica, como nos
anéis, etc. Outras variações igualmente importantes são a natureza do contra-
Capítulo 2 Base Científica
6
íon, que vai condicionar a solubilidade e o grau de cristalização das cianinas, e a
rigidez do sistema conjugado que aumenta drasticamente a fluorescência destes.
Os espectros de absorção das cianinas apresentam tipicamente curvas de
absorção estreitas (~ 80 nm na base) e afiladas, o que lhes confere cores
límpidas e brilhantes, com absortividades molares máximas elevadas, desde
3x10
4
M
-1
cm
-1
nas monometinocianinas até 2,5x10
5
M
-1
cm
-1
nas cianinas de
maior cadeia (tri- e pentametinocianinas). No entanto, verifica-se que para
maiores cadeias, a partir das heptametinocianinas, estes valores começam a
diminuir.
2.1.2. Corantes Ciânicos com dois Cromóforos
Para deslocar o espectro de absorção do corante ciânico para região de
maiores comprimentos de onda e aumentar suas absortividades molares é
necessário aumentar o comprimento de sua cadeia polimetínea. Isto torna a
estrutura do corante mais flexível e menos estável, diminuindo os tempos de
vida e rendimentos quânticos dos seus estados excitados e sua estabilidade
química. Outro fator negativo dos CC é o processo de fotoisomerização da sua
cadeia polimetínea, que também diminui os tempos de vida e rendimentos
quânticos dos seus estados excitados, diminuindo assim sua fotoatividade. Os
corantes ciânicos com dois cromóforos (bichromophoric cyanine dye, BCD)
pertence à classe dos CC, sendo uma combinação de dois monômeros de CC
(figura 2.2) que se diferenciam pelo ângulo entre os cromóforos (Kuzmin et al.
1976). A combinação de dois monômeros reduz o tamanho da cadeia
polimetínea, diminuindo assim, os fatores negativos acima listados. A estrutura
do heterociclo central determina o ângulo entre os cromóforos e a interação
entre eles.
Figura 2.2: estrutura geral dos BCD, sendo
α
o ângulo entre os cromóforos.
Capítulo 2 Base Científica
7
Os BCD possuem alta absorção ótica na região visível com ε maior que o
dos CC, e tem rendimento quântico do estado tripleto (
T
φ
) relativamente alto (>
20%) já em soluções homogêneas (Borisevitch et al. 1976). Além disto,
diferentemente dos CC, os BCD não sofrem fotoisomerização e o deslocamento
dos comprimentos de onda da sua banda de absorção pode ser realizado não
pelo aumento do comprimento da cadeia de conjugação-π, mas pela variação da
interação entre os seus cromóforos (Schaberle 2007).
Uma propriedade particular dos BCD é a presença de duas bandas de
absorção (figura 2.3) na região espectral visível, cujas intensidades relativas
dependem do ângulo entre os cromóforos. O aparecimento destas duas bandas
ocorre pela interação entre os cromóforos dos BCD por dois mecanismos:
interação dipolo-dipolo entre os cromóforos e o tunelamento do elétron de um
cromóforo para outro através do heterociclo central (Cantor e Schimmel 1980,
Borissevitch 1978).
450 500 550 600 650 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
BCD
180º
150º
90º
Figura 2.3: espectros de absorção dos corantes ciânicos com dois cromóforos com ângulos de
180º, 150º e 90º entre os cromóforos em água.
Capítulo 2 Base Científica
8
As interações, acima citadas, dependem do ângulo entre os cromóforos, da
estrutura do heterociclo central e do comprimento das cadeias polimetíneas. Os
cálculos mostram que para um corante ciânico com um cromóforo é esperada
apenas uma transição eletrônica S
0
-S
1
, no entanto, para os BCD ocorre o
desdobramento (splitting) deste nível, dando origem a duas transições
eletrônicas. Este desdobramento ocorre pela soma dos efeitos de tunelamento e
de interação dipolo-dipolo (figura 2.4) (Borissevitch 1978).
Figura 2.4: esquema de níveis para os BCD com os efeitos de tunelamento e interação dipolo-
dipolo entre os cromóforos (Borissevitch, 1978)
2.2 Membranas Biológicas e Monocamadas de Langmuir
2.2.1. A evolução dos modelos de membrana
As primeiras idéias sobre a existência de algum tipo de membrana foram
apresentadas por Schleiden e Schwann em 1839. Após este fato, inúmeros
estudos/experimentos se seguiram. É interessante observar que a maioria destes
estudos indicava ou determinava características elétricas das membranas como
diferença de potencial, resistência e capacitância. A partir das medidas de
capacitância, realizadas por Fricke em 1923, foi sugerido que as membranas
teriam dimensões moleculares (Robertson 1981). A hipótese de que a bicamada
lipídica seria uma característica fundamental das membranas foi sugerida pela
primeira vez por Gorter e Grendel em seu trabalho com células vermelhas de
sangue em 1925 (Gorter e Grendel 1925).
Capítulo 2 Base Científica
9
Em 1935, Danielli e Davson apresentaram um modelo da estrutura celular
que posteriormente eles generalizaram na teoria “pauci-molecular”, a qual dizia
que todas as membranas biológicas tinham um núcleo, denominado “lipoid”,
limitado por monocamadas de lipídios com as cabeças polares dos lipídios
apontados para fora e cobertos por monocamadas de proteínas (figura 2.5 a). Na
década de 50, com o advento do microscópio de elétron, um novo modelo de
membrana foi proposto: “unit membrane model” (figura 2.5 b). Neste modelo, as
membranas seriam constituídas de uma bicamada lipídica com as cabeças
polares dos lipídios apontadas para fora e cobertas por monocamadas de
moléculas não lipídicas com uma preponderância de carboidratos na superfície
externa (Robertson 1981). Este modelo foi construído tendo como base o modelo
de Danielli e Davson, diversos trabalhos (Robertson 1957, Robertson 1958) de
Robertson e na teoria da “unit-membrane” também desenvolvida por ele
(Robertson 1960, Robertson 1963). Por estes fatos, o “unit membrane model”,
às vezes é denominado de modelo Danielli-Davson-Robertson (DDR).
(a)
(b)
Figura 2.5: esquema dos modelos de membrana lipoid (a) e unit membrane model (b)
Na década seguinte, modelos alternativos ao modelo da “unit-membrane”
foram propostos. Dentre estes, pode-se citar os modelo de Sjöstrand, Lenard e
Singer (Figura 2.6 a), Green e Benson (Figura 2.6 b). A base destes modelos era
que a bicamada não era a estrutura dominante, mas que as moléculas de lipídios
estavam arranjadas em vários padrões na membrana (Robertson 1981).
Capítulo 2 Base Científica
10
(a)
(b)
Figura 2.6: esquema dos modelos membrana de Sjöstrand (a) e de Green e Benson (b)
O modelo de membrana aceito atualmente e que já passou por algumas
modificações, foi proposto primeiramente em 1972 por Singer e Nicholson e é
denominado modelo mosaico fluido (figura 2.7) (Singer e Nicolson 1972).
Neste modelo, a bicamada é retomada, e as proteínas adquirem uma nova
distribuição. As proteínas encontram-se parcial ou totalmente embebidas na
bicamada, flutuando neste “mar” de moléculas de lipídios (Robertson 1981,
Singer e Nicolson 1972), além de poder se difundir lateral e rotacionalmente
(Jones e Chapman 1995). De acordo com este modelo, os lipídios são
responsáveis pelo isolamento do interior celular e servem como matriz para as
proteínas que regulam as trocas de substâncias e a comunicação entre o meio
intra e extracelular (Wisniewska et al. 2003).
Figura 2.7: esquema do modelo de membrana mosaico fluido
Os lipídios da membrana são moléculas com caráter anfifílico, ou seja,
possuem um grupo apolar (hidrofóbico) e outro pólar (hidrofílico) que pode ou
Capítulo 2 Base Científica
11
não conter cargas. Assim pode-se dizer que a estrutura da membrana é
composta por três regiões distintas, caracterizadas por diferentes constantes
dielétricas (ε) (Tanford 1980):
a
1
) região interna hidrofóbica: formada pela parte apolar das moléculas de
fosfolipídios. Esta região não contém água e é caracterizada por uma baixa
constante dielétrica.
a
2
) região superficial: formada pela parte polar do fosfolipídio.
a
3
) região intermediária: compreendida entre a parte polar da membrana e o
meio aquoso e é caracterizada pelo alto gradiente de constante dielétrica
numa distância que varia de acordo com a força iônica do meio.
Entre os modelos de membrana biológica as monocamadas de Langmuir
apresentam algumas vantagens com relação aos outros modelos: são planas,
homogêneas e estáveis (Eeman et al. 2006).
2.2.2. Monocamadas de Langmuir
As monocamadas são películas monomoleculares formadas na interface ar-
água, podendo ter composição e grau de compactação variável (Caseli 2005).
Algumas vantagens das monocamadas de Langmuir são: ausência do efeito de
curvatura, como ocorre com as vesículas, e o controle preciso do
empacotamento (Brockman 1999).
A denominação monocamada de Langmuir deve-se a técnica mais antiga
empregada para se caracterizar uma monocamada: a balança (cuba) de
Langmuir (Jones e Chapman 1995), mostrada na figura 2.8. A balança de
Langmuir permite controlar a densidade de moléculas na interface através do
controle da área por molécula, ou seja, pelo posicionamento das barreiras. Desta
forma, as propriedades da monocamada são controladas, por isto, a
monocamadas é um modelo de membrana muito útil.
A técnica de Langmuir é baseada no espalhamento de uma substância
anfifílica na interface ar-água, sendo que essa substância deve apresentar
características de insolubilidade e apresentar um coeficiente de espalhamento
favorável à ocorrência desse processo, ou seja, deve se orientar na interface de
forma a minimizar sua energia livre (Langmuir 1917). Na figura 2.9 é mostrado
um esquema da formação de monocamada de Langmuir dividida em três partes:
Capítulo 2 Base Científica
12
b
1
) espalhamento das moléculas na interface ar-água;
b
2
) etapa de compressão;
b
3
) monocamada no estado condensado.
Figura 2.8: Esquema ilustrativo da balança de Langmuir com a placa de Wilhelmy e as barreiras
móveis.
Figura 2.9: Esquema do princípio da formação de filmes de Langmuir. Figura adaptada de
GIRARD-EGROT et al. 2005.
O processo de formação e as técnicas de estudo das monocamadas
Langmuir e suas características, são mais detalhadamente discutidas no Capitulo
3.
13
Capítulo 3 Teoria dos Métodos Experimentais
3.1. Introdução
Neste capítulo são descritos os métodos e técnicas utilizadas para a
caracterização das monocamadas de Langmuir. Para a realização do presente
trabalho foram utilizados equipamentos disponíveis no Instituto de Física de São
Carlos (IFSC-USP), no Departamento de Física e Matemática (DFM) e no
Departamento de Química (DQ) ambos da Faculdade de Filosofia Ciências e
Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP-USP).
3.2. Técnicas de caracterização das monocamadas de
Langmuir
Há várias técnicas que são utilizadas para a caracterização das
monocamadas. Neste trabalho foram utilizadas as técnicas, ditas convencionais,
pressão superficial e potencial superficial, além de microscopia de ângulo
Brewster e absorção ótica. Nesta seção, tais técnicas são descritas de maneira
sucinta.
3.2.1. Pressão Superficial (π)
As moléculas anfifílicas na superfície de uma solução aquosa reduzem sua
tensão superficial de um valor
0
γ
, característico a essa solução, para outro valor
γ
. A diferença entre a tensão superficial na ausência e na presença das
moléculas anfifílicas é definida como pressão superficial (π):
γ
γ
π
−
=
0
(3.1)
Ao comprimir a monocamada através das barreiras móveis (vide figura
2.9), a área média ocupada por uma molécula anfifílica na superfície diminui, e
como conseqüência, aumenta a densidade superficial de moléculas, diminui a
distância e aumenta a interação entre elas. Isto, por sua vez, provoca o aumento
da pressão superficial. Desta forma obtém-se uma curva de pressão superficial
em função da área média por molécula (normalmente na ordem de ângströns
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
14
quadrados (Å
2
), figura 3.1). Esta curva é denominada isoterma de pressão
superficial (π-A) e através dela podem ser identificadas várias fases da
monocamada e transições entre estas fases.
Figura 3.1: exemplos de isotermas (
π
-A) de diferentes fosfolipídios em diferentes fases.
Adaptada de (Girard-Egrot et al. 2005).
Na figura 3.1 estão indicadas regiões distintas que representam as
possíveis fases que uma monocamada pode adquirir. Abaixo segue a
denominação e descrição de cada fase (Ferreira et al. 2005):
a
1
) fase gasosa (G): as moléculas estão muito distantes umas das outras, não
há interação entre elas e a orientação das caudas hidrofóbicas no espaço é
aleatória (podem até estar “deitadas” na superfície). A pressão superficial
nesta fase é aproximadamente zero;
a
2
) fase líquida-expandida (LE): quando as moléculas se aproximam, de tal
modo que uma pode sentir sua vizinha mais próxima, e as caudas ainda
orientadas aleatoriamente possuem menor inclinação em relação à vertical.
No fim desta fase começam aparecer os primeiros domínios da
monocamada;
a
3
) transição de fase líquida expandida/líquida condensada (LE/LC): coexistência
das fases LE e LC. O número de domínios aumenta e ocorre a aproximação
destes;
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
15
a
4
) fase líquida condensada (LC): as moléculas estão mais próximas, podendo
ocorrer o contato físico entre elas (aproximação dos domínios);
a
5
) fase condensada (C) ou sólida (S): o empacotamento das moléculas é tal
que todas as caudas estão orientadas verticalmente. Uma maior compressão
da monocamada provoca o colapso;
a
6
) colapso da monocamada: desorganização da estrutura monomolecular,
podendo formar bicamadas e multicamadas, e também a dissolução do
anfifílico na subfase.
3.2.1.1 Módulo de Compressibilidade Superficial (Cs
-1
)
O módulo de compressibilidade superficial é definido matematicamente
como:
1
A
S
CA
π
−
∂
=−
∂
(3.2)
em que π é a pressão superficial e A é a área considerada.
A magnitude de
1
S
C
−
está relacionada ao estado da formação do filme,
sento tanto maior quanto mais condensada for a monocamada. De acordo com
(Davies e Rideal 1963) existe uma correlação entre os estados da monocamada
e os valores de Cs
-1
.
3.2.2 Potencial Superficial (ΔV)
Medidas de potencial superficial (ΔV) é outra possibilidade de controlar o
estado da monocamada no nível microscópico monitorando as variações das
características elétricas do filme devidas à orientação das moléculas anfifílicas na
superfície. No entanto, é muito difícil discriminar diretamente quais são os
processos microscópicos que contribuem na voltagem macroscópica medida
(Taylor et al. 1990). Devido a estas dificuldades, os modelos encontrados na
literatura ainda são considerados incompletos.
Os modelos mais conhecidos são (Taylor et al. 1990, Demchak e Fort
1974, Vogel e Möbius 1988):
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
16
b
1
) de Helmholtz: relaciona as variações de potencial superficial com as
variações do momento de dipolo médio das moléculas que formam a
monocamada;
b
2
) de Demchak e Fort (DF): considera a monocamada como um capacitor de
três camadas;
b
3
) de Vogel e Möbius (VM): este modelo se difere do anterior por considerar a
monocamada como um capacitor de somente duas camadas.
Neste trabalho utilizou-se o modelo de Demchak e Fort (figura 3.2), pois
até o momento, este modelo tem sido a melhor aproximação para análises
quantitativas de dados do potencial superficial (Taylor et al. 1990). Cada camada
do capacitor é caracterizada por um momento de dipolo (
i
μ ) e pela
permissividade relativa (
i
ε ), conforme mostra figura 3.2.
Figura 3.2: representação do capacitor de três camadas do modelo DF
Matematicamente, o potencial superficial no modelo DF é definido:
03
3
2
2
1
1
321
1
εε
μ
ε
μ
ε
μ
A
VVVV ×
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
++=Δ+Δ+Δ=Δ
(3.3)
em que
A é a área média ocupada por molécula;
1
μ
é o momento de dipolo das
moléculas de água reorientadas na interface devido à presença da monocamada;
2
μ
é o momento de dipolo da cabeça polar do fosfolipídio;
3
μ
é o momento de
dipolo da cauda hidrofóbica do fosfolipídio.
Se a monocamada for ionizada, deve-se somar a contribuição dos
momentos de dipolos das três camadas e o potencial
ψ
, expresso pela teoria de
re
g
ião hidrofóbica
re
g
ião hidrofílica
subfase a
q
uosa
μ , ε
1
1
μ , ε
2
2
μ , ε
3
3
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
17
Gouy-Chapman (Davies e Rideal 1961, Cevc e Marsh 1987). O potencial
ψ
é
dado pela seguinte equação:
2
1
7
1
)10.88.5(
2
TcA
e
hsen
e
kT
ε
α
−
−
=Ψ (3.4)
em que
e é a carga elementar, k é a constante de Boltzmann,
T
é a
temperatura,
α
é o grau de ionização, A é a área média por molécula, c é a
força iônica na subfase em mol/L e
ε
é a constante dielétrica do meio.
3.2.3 Espectroscopia de absorção na região de ultravioleta e visível
Informações sobre a estrutura molecular e sobre a interação de moléculas
com seus vizinhos podem ser obtidas de diversos modos a partir dos espectros
de emissão e/ou de absorção, gerados quando a radiação interage com os
átomos e/ou moléculas da matéria (Alcântara Jr. 2002). A interação da radiação,
que compreende a região do ultravioleta e visível do espectro eletromagnético,
promove transições eletrônicas entre os diferentes níveis de energia da molécula.
Estas transições eletrônicas ocorrem quando um átomo ou molécula absorve um
fóton de energia h
ν
. Desta forma, o átomo ou molécula em um estado inicial i
com energia E
i
pode mudar para um estado final f com energia E
f
pela absorção
da radiação de freqüência ν, então:
ν
hEE
if
=
−
(3.5)
A absorção da radiação é caracterizada pela absorbância da amostra,
determinada pela lei de Lambert-Beer. Essa lei descreve a intensidade de
radiação transmitida I
T
através de uma amostra absorvente a partir da
intensidade de radiação incidente I
0
(figura 3.3).
D
T
II
−
= 10
0
Figura 3.3: interação da radiação com uma amostra e a relação entre a intensidade da radiação
transmitida (I
T
) com a incidente (I
0
).
I
0
I
T
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
18
em que D é a absorbância da amostra. A absorbância D equivale a lC
ε
, em que
C é a concentração do composto na amostra, l é a extensão do caminho óptico e
ε é o coeficiente de absorção molar. O perfil de ε em função de comprimento de
onda, ε(λ) é uma característica intrínseca de cada composto. A unidade do ε é
M
-1
cm
-1
.
Como a intensidade de luz absorvida é I
A
= I
0
– I
T
,
)101(
0
D
A
II
−
−=
(3.6)
Se a amostra contiver mais de uma espécie absorvedora, a absorbância de
cada composto contribui separadamente com a diminuição da intensidade
transmitida I
T
, resultando na forma mais geral da lei de Lambert-Beer:
lCCC
T
nn
II
)...(
0
2211
10
εεε
+++−
=
(3.6)
na qual, a absorbância de uma amostra é a soma de cada absorbância das
espécies individuais. Isso possibilita analisar a presença e o conteúdo de diversas
espécies em equilíbrio dentro de uma amostra.
3.2.4 Microscopia no ângulo de Brewster (BAM)
O grande interesse em se caracterizar/conhecer morfologicamente
monocamadas formadas na interface ar-água, ou seja, identificar os domínios
característicos das fases da monocamada (Miñones Jr. et al. 2002, Patino et al.
1999) conduziram ao desenvolvimento da técnica de microscopia no ângulo de
Brewster (BAM) (Héron e Meunier 1991).
O princípio do método se baseia no fenômeno de Brewster. Quando sobre
uma superfície, que separa dois meios com índices de refração distintos n
1
< n
2
, é
incidida luz sob ângulo de incidência θ
B
, sendo
2
1
()
B
n
tg
n
θ
=
, a luz refletida se torna
totalmente polarizada perpendicularmente ao plano de incidência, conforme
ilustra figura 3.4.
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
19
Figura 3.4: polarização da luz após incidência sobre superfície separadora de dois meios.
Então, se sobre esta superfície for incidida luz polarizada paralela ao plano
de incidência com o mesmo ângulo de incidência θ
B
, a intensidade da luz refletida
torna-se zero, conforme mostra figura 3.5
Figura 3.5: refração total de um raio incidente paralelo polarizado ao plano de incidência
Então, ao incidir uma luz polarizada paralela a interface ar-água, na
ausência da monocamada, não haverá luz refletida. A monocamada possui índice
de refração, distinto em cada fase, devido à formação dos domínios. Então, na
presença da monocamada haverá luz refletida. Em geral, a intensidade da luz
Capítulo 3 Teoria dos métodos experimentais
20
refletida depende da espessura, rugosidade e anisotropia da monocamada que
permite a obtenção de imagens da estrutura dos domínios que formam a
monocamada e alteram o contraste das imagens.
Na figura 3.6 é mostrado, esquematicamente, o arranjo experimental
utilizado para a obtenção das imagens pela BAM.
Figura 3.6: esquema do arranjo experimental para a BAM
Dentre as informações que a técnica de BAM permite obter, pode-se citar:
c
1
) a morfologia de monocamadas formadas por moléculas anfifílicas (Gehlert et
al. 1998, Deschenaux et al. 1997, Vollhardt 1996 );
c
2
) a orientação dos domínios na monocamada (Brezesinskin et al. 1995,
Overberck et al. 1994);
c
3
) estimativa da espessura relativa da monocamada (Patino et al. 1999,
Miñones Jr. et al. 2002).
21
Capítulo 4 Materiais e Métodos
4.1 Introdução
Neste capítulo é apresentada a descrição das técnicas utilizadas na
fabricação e caracterização das monocamadas de Langmuir, assim como, o
fosfolipídio utilizado para formar as monocamadas e o objeto de estudo: corantes
ciânicos com dois cromóforos.
4.2 Objetos de estudo
Os corantes ciânicos com dois cromóforos, BCD, utilizados neste trabalho
foram sintetizados pelo Prof. Felix Mikhailenko no Instituto de Química Orgânica
da Academia de Ciências da Ucrânia na forma de sais de cloreto [
++
2
ClCorante ].
Estes corantes possuem peso molecular de 653 g/mol e são estruturalmente
distintos devido ao ângulo existente entre os cromóforos: 180º, 150º e 90º,
conforme mostra figura 4.1.
(a)
(b)
(c)
Figura 4.1: estrutura molecular dos BCD: (a) 180º, (b) 150º e (c) 90º
Capítulo 4 Materiais e métodos
22
4.3 Fosfolipídio DPPC
Para a formação das monocamadas de Langmuir foi utilizado o fosfolipídio
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC, figura 4.2), obtido da “Sigma Chemical Co”. O
DPPC é um fosfolipídio zwitteriônico e é um dos principais constituintes da
membrana celular. Devido à grande quantidade de estudos realizados com
monocamadas de DPPC, estas podem ser consideradas bem caracterizadas
(Klopfer e Vanderlick 1996), auxiliando assim o entendimento das interações
DPPC-BCD observadas neste trabalho.
Figura 4.2: Estrutura molecular do fosfolipídio DPPC
4.4 Preparação das amostras
As soluções estoques de DPPC e de BCD foram, ambas, preparadas em
clorofórmio obtido da Merk de grade HPLC. Estas soluções estoque foram
preparadas com concentração de aproximadamente 0,7 mg/ml. Para determinar
a concentração dos BCD foi utilizado um espectrofotômetro UV-Vis “Beckman
Coulter – DU 640”
4.5 Fabricação e caracterização das monocamadas de
Langmuir
As monocamadas foram fabricadas utilizando uma cuba de Langmuir,
modelo KSV 5000, de dimensões 530 mm x 150 mm, com duas barreiras móveis
e aparatos para caracterização da monocamada (sensores de pressão e
potencial). Este equipamento estava montado em uma sala limpa, no laboratório
Capítulo 4 Materiais e métodos
23
de Polímeros Prof. Bernhard Gross no Instituto de Física de São Carlos (IFSC-
USP), com temperatura de (24±2)ºC. Como subfase utilizou-se água ultrapura
(Milli-Q) caracterizada por resistividade 18,2 MΩ e pH 5,9 adquirida do sistema
Milli-Q, acoplado a unidade Milli-RO de osmose reversa (Millipore) e água Mili-
Q+NaCl (0,2M).
Foram espalhados 100
μ
L de soluções mistas de DPPC+%BCD a subfase
aquosa. A quantidade de solução de BCD misturada à solução de DPPC foi
calculada a partir da porcentagem de mols de BCD (
%
BCD
), conforme expressão
(4.1):
100 %
BCD
BCD
DPPC
n
n
⎛⎞
×=
⎜⎟
⎝⎠
(4.1)
em que
BCD
n e
D
PPC
n , são respectivamente, o número de mols de BCD e de DPPC.
Foram fabricadas monocamadas com as seguintes porcentagens de BCD: 0, 3, 7,
12, 17, 23.
As isotermas de pressão superficial (
π
-A) e potencial superficial (ΔV-A)
são registrados enquanto as barreiras móveis comprimem a monocamada com
velocidade constante de 20 mm/min. A pressão superficial foi medida com
acurácia de 0,1 mN/m utilizando uma placa de Wilhelmy, tendo como sensor um
filtro de papel de alta qualidade de dimensões 1 cm x 2 cm, conectada a uma
eletrobalança. Para as medidas de potencial superficial foram utilizadas uma
placa vibrante (freqüência 144,3 Hz), método de Kelvin ou do capacitor vibrante,
posicionada aproximadamente a 2 mm acima da superfície da água. Tanto a
placa vibrante quanto o eletrodo de referência imerso na subfase são de platina.
Para cada monocamada fabricada, foram obtidas no mínimo três isotermas (
π
-A)
e (ΔV-A), portanto, os resultados apresentados neste trabalho são as isotermas
médias.
A técnica de absorção ótica foi realizada in situ, ou seja, na própria cuba
de Langmuir (figura 4.3). Para tanto, utilizou-se:
a
1
) um diodo emissor de luz branca (LED), como fonte de radiação, que era
incidida sobre a monocamada;
a
2
) um espelho plano, localizado no fundo da cuba de Langmuir, que tinha por
função refletir a luz do LED;
Capítulo 4 Materiais e métodos
24
a
3
) uma fibra ótica para capturar a luz refletida pelo espelho plano;
a
4
) um espectrômetro ao qual a fibra ótica foi acoplada. O espectrômetro
utilizado é da Ocean Optics, modelo USB2000, que possui 2048 detectores do
tipo CCD dispostos em linha num arranjo que permite uma medição numa
única varredura de todo o espectro visível (~350 nm a 950 nm). A luz
capturada é analisada por meio de um software desenvolvido em LabView.
Figura 4.3: esquema da montagem experimental, na cuba de Langmuir, para espectroscopia
uv-visível.
As medidas de microscopia de Brewster foram feitas em uma cuba NIMA
modelo 702BAM montada na mesma sala lima mencionada acima. A interface ar-
monocamada-água foi irradiada com um ângulo de 52.8º. Para a formação da
monocamada nesta cuba foram espalhados 80μL das soluções mistas de
DPPC+%BCD. A velocidade de deslocamento das barreiras foi de 40 mm/min.
25
Capítulo 5: Resultados e Discussão
5.1 Pressão de Superfície (π)
Nesta seção são apresentadas as isotermas de pressão superficial (π-Α)
das monocamadas mistas (DPPC+BCD) em função da porcentagem de BCD
(
%
BCD
). Estas isotermas foram comparadas com a isoterma de pressão
superficial típica do fosfolipídio DPPC puro.
5.1.1 Subfase aquosa
A isoterma (π-Α) do DPPC, mostrada na figura 5.1, apresenta pressão
superficial próxima de zero para fase gasosa (G), até atingir a área por molécula
de (87±3) Å
2
. Entre (87±3) e (70±2) Å
2
há um aumento de pressão até atingir o
valor de (6,4±0,9) mN.m
-1
, que corresponde a fase líquido expandido (LE). Esta
pressão se mantém no intervalo de (70±2) a (55±2) Å
2
(platô) correspondente à
transição de fase líquida expandida/líquida condensada (LE/LC). Em seguida há
um acréscimo da pressão (π) que corresponde à formação da fase líquida
condensada (LC). A pressão aumenta rapidamente, indicando que a
monocamada atingiu seu estado mais condensado (fase condensada – C), que
antecede o colapso. A área mínima média por molécula (
mm
A ) é obtida através
da extrapolação da isoterma (π-Α), na região da fase C, até o valor zero de
pressão superficial (figura 5.1) (Yang et al 1994, Klopfer e Vanderlick 1996,
Shapovalov 1998, Pavinatto et al. 2007). A
mm
A obtida para o DPPC foi (52±2) Å
2
que concorda com os dados da literatura (Pavinatto et al. 2007, Caseli et al.
2006, Xia et al. 2004).
A transição entre as fases da monocamada é claramente observada na
dependência do módulo de compressibilidade (Cs
-1
) em função da área por
molécula (figura 5.1). Na fase G o valor do Cs
-1
é próximo de zero e começa a
sofrer uma variação a partir de (100±1) Å
2
até (87±3) Å
2
onde atinge o valor de
(29±5) mN.m
-1
. Este valor permanece quase constante (platô) e caracteriza
a
fase LE da monocamada. No intervalo de (77±2) a (70±2) Å
2
, o valor do Cs
-1
diminui até (7±3) mN.m
-1
. Este valor permanece constante até (55±2) Å
2
(“vale”
da curva de Cs
-1
) e caracteriza a transição de fase LE/LC. Na fase C o Cs
-1
atinge
seu valor máximo (300±20) mN.m
-1
em (45,6±0,8) Å
2
.
Capítulo 5 Resultados e discussão
26
40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
DPPC
isoterma de pressão
extrapolação da isoterma de pressão
Área por molécula (Å
2
)
0
50
100
150
200
250
300
350
módulo de compressibilidade
Figura 5.1: isoterma de pressão superficial e módulo de compressibilidade do DPPC – subfase
aquosa
A presença de BCD, independentemente de sua estrutura, manifesta
mudanças em todas as fases da isoterma (π-Α) do DPPC puro, sendo os efeitos
observados maiores para o BCD 180
0
. Estas mudanças são proporcionais à %
BCD
,
conforme isotermas (π-Α) das monocamadas mistas mostradas nas figuras 5.2 a
5.4.
20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Área por molécula Å
2
% BCD 180º
DPPC
3
7
12
17
23
Figura 5.2: isotermas (π-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD180º - subfase aquosa.
Capítulo 5 Resultados e discussão
27
20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 150º
DPPC
3
7
12
17
23
Figura 5.3: isotermas (π-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD150º - subfase aquosa.
20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Á
rea por molécula
(Å
2
)
% BCD 90º
DPPC
3
7
12
17
23
Figura 5.4: isotermas (π-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD90º -
subfase aquosa.
A transformação do platô da isoterma (π-Α) em uma rampa dificulta
identificar em qual fase a monocamada se encontra. Como mencionado
anteriormente, a dependência do Cs
-1
com a área por molécula permite
Capítulo 5 Resultados e discussão
28
identificar estas fases. Nas figuras 5.5 a 5.7, estão mostradas as curvas do Cs
-1
das monocamadas mistas (DPPC+BCD).
20 40 60 80 100 120 140
0
50
100
150
200
250
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 180º
0
3
7
12
17
23
Figura 5.5: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD180º -
subfase aquosa.
20 40 60 80 100 120 140
0
50
100
150
200
250
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Área por molécula Å
2
% BCD 150º
0
3
7
12
17
23
Figura 5.6: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD150º -
subfase aquosa
Capítulo 5 Resultados e discussão
29
20 40 60 80 100 120 140
0
50
100
150
200
250
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 90º
0
3
7
12
17
23
Figura 5.7: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD90º -
subfase aquosa.
A partir das curvas de isoterma (π-A) e de Cs
-1
mostradas nas figuras 5.2
a 5.4 e figuras 5.5 a 5.7, respectivamente, pode-se observar:
a
1
) a fase LE é deslocada para maiores áreas por molécula;
a
2
) o valor do Cs
-1
na região de platô não é alterado, no entanto, compreende
um intervalo maior de área quanto maior é a
%
BCD
na monocamada;
a
3
) o valor da pressão superficial e do Cs
-1
aumentam na região correspondente
a transição de fase LE/LC da monocamada de DPPC;
a
4
) o valor máximo do Cs
-1
(fase C) diminui quando aumenta a %
BCD
;
a
5
) a área por molécula aumenta com o aumento da %
BCD
na monocamada.
Para analisar os efeitos do BCD sobre as monocamadas podemos utilizar a
teoria de agregação, haja visto que as monocamadas são agregados de
moléculas anfifílicas.
As interações responsáveis pela formação dos agregados das moléculas
são:
1 – INTERAÇÃO ELETROSTÁTICA
Moléculas, que possuem carga de mesmo sinal, sofrem repulsão cuja
energia é a energia Coulombiana:
Capítulo 5 Resultados e discussão
30
2
0
4
Q
Q
W
r
π
ε
= (5.1)
em que Q é a carga do monômero, ε
0
é a constante dielétrica do meio e r é a
distância entre os monômeros.
Quando as moléculas possuem momentos de dipolos permanentes a força
entre eles depende da orientação relativa de dipolos. Para dois dipolos iguais
com orientação paralela fixa a força resultante é repulsiva. A energia dessa
interação é:
3
0
2
4 r
W
πε
μ
= (5.2)
em que μ é o momento dipolo do monômero e r é a distância entre os centros de
dipolos.
Para os dipolos distribuídos caoticamente a energia da interação é:
62
0
4
3)4( kTr
W
πε
μ
−= (5.2a)
em que k é a constante de Boltzmann e T é a temperatura absoluta.
A energia da interação entre uma molécula com dipolo permanente e uma
molécula carregada é
2
0
4
cos
r
Q
W
πε
θ
μ
−=
(5.2b)
em que
θ
é o ângulo do eixo do dipolo com a linha que liga o centro do dipolo
com a carga. Assim esta interação pode ser repulsiva ou atrativa, dependendo da
orientação do dipolo.
Além dessas interações, entre duas moléculas sempre existe uma força
atrativa conhecida como “força de London” ou “força de dispersão” ou “força de
dispersão de van der Waals”. A origem dessa força é a interação entre dois
dipolos, que cada partícula induz uma na outra. A energia dessa interação
(energia de dispersão de London) é:
2
26
0
3
4(4 )
L
h
W
r
να
πε
=− (5.3)
em que h é a constante de Planck, ν é a freqüência de absorção eletrônica e α é
a polarizabilidade elétrica da molécula.
Capítulo 5 Resultados e discussão
31
Em distâncias muito pequenas entre as moléculas, mais uma interação
repulsiva se destaca devido, principalmente, à repulsão eletrostática entre os
núcleos dos átomos que compõem as moléculas. Essa interação repulsiva é
proporcional a 1/r
12
.
A energia potencial de interação total pode ser apresentada pelo potencial
de Lennard-Jones mais a energia da repulsão eletrostática, conforme ilustra a
figura 5.8.
Energia potencial
Distância entre as moléculas (r)
Lennard - Jones (-A/r
6
+B/r
12
)
Lennard - Jones + interaçôes
repulsivas
Figura 5.8: curvas de energia potencial para interação de partículas
2 – FORMAÇÃO DE PONTES DE HIDROGÊNIO
Essa ligação se forma entre os átomos eletronegativos de uma molécula e
o átomo de hidrogênio de outra. Para que ocorra a ligação, os monômeros
devem se aproximar para que as nuvens de elétrons dos átomos, que formam
essa ligação, se sobreponham. Essa interação é eficiente em distâncias curtas e
pode aumentar a profundidade do “poço” da energia potencial, favorecendo
assim, a estabilização do agregado.
3 – INTERAÇÃO HIDROFÓBICA
Moléculas hidrofóbicas, quando em solução aquosa, quebram as pontes de
hidrogênio entre as moléculas de água, modificando o arranjo das moléculas de
água. Esse processo é acompanhado pelo aumento da energia livre da solução.
Quando duas moléculas hidrofóbicas se juntam em solução, o número de pontes
quebradas diminui e, consequentemente, o aumento da energia livre se torna
Capítulo 5 Resultados e discussão
32
relativamente menor. Esta descrição é uma maneira simplificada de explicar o
efeito hidrofóbico (interação hidrofóbica). Essa interação é atrativa e é a principal
interação responsável pela formação de membranas biológicas, micelas,
vesículas, etc. Dependendo do tamanho e da hidrofobicidade das moléculas, essa
interação pode ser considerada tanto de longo quanto de curto alcance.
Entretanto, a noção de “hidrofobicidade” não está, ainda, bem determinada.
Para a formação das monocamadas de DPPC pode-se dizer que há três
interações, principais, que favorecem a formação: efeito hidrofóbico, interação
de van der Waals e formação de pontes de hidrogênio (Paterno et al. 2001). A
interação dipolo-dipolo pode tanto favorecer quanto não favorecer a formação da
monocamada, sendo dependente da orientação relativa da cabeça polar das
moléculas. Muitos autores postulam que o grupo fosforilcolina do DPPC está
orientado horizontalmente na interface ar-água (Seelig 1977, Vilallonga et al.
1972, Shah e Schulman 1967). No entanto, Vilallonga (Vilallonga et al. 1972)
sugere três diferentes orientações:
1 – grupo trimetilamônio orientado para a subfase aquosa, abaixo grupo do
fosfato;
2 – grupo trimetilamônio orientado para o ar, acima do grupo fosfato;
3 – ambos os grupos em um plano horizontal à interface ar-água e perpendicular
ao eixo da molécula.
Os resultados obtidos, isotermas (π-A) e Cs
-1
, demonstram uma efetiva
interação entre os BCD e as moléculas de DPPC na interface ar-água. Esta
interação pode ter caráter de interação hidrofóbica, de formação de pontes de
hidrogênio entre os átomos de nitrogênio do BCD e hidrogênio do DPPC e os
átomos de oxigênio do DPPC com o hidrogênio do BCD. Além disso, os BCD
podem diminuir a repulsão entre os dipolos das cabeças polares do DPPC devido
à interação da sua carga com os dipolos das cabeças do DPPC. Neste caso a
carga positiva do BCD deve estar localizada mais perto da carga negativa do
grupo fosfato do DPPC, que significa que o BCD deve se localizar entre a cabeça
polar e a região hidrofóbica do DPPC. Esta interação eletrostática estimula a
expansão da isoterma (π-A) (Jones e Chapman 1995), que está associado à
Capítulo 5 Resultados e discussão
33
formação da fase LE e dos domínios (aumento do intervalo compreendido pelo
platô da curva Cs
-1
) em maiores áreas por molécula, quando comparado com a
monocamada de DPPC puro. A presença de BCD nos domínios formados lhes
confere uma carga líquida que é responsável pelo aumento da repulsão entre os
domínios. Esta repulsão é verificada pela transformação do platô da isoterma (π-
A) em uma rampa e, conseqüentemente, no aumento do valor mínimo do Cs
-1
(vale da curva de Cs
-1
). Este aumento do valor mínimo do Cs
-1
(transição de fase
LE/LC) se aproxima do valor do Cs
-1
da fase LE (figura 5.9) o que nos permite
dizer que os BCD possuem uma tendência de nivelar a diferença entre fases LE e
LC.
0 5 10 15 20 25
5
10
15
20
25
30
Cs
-1
(mN.m
-1
)
% BCD
BCD
180º
150º
90º
Figura 5.9: aumento do valor mínimo do Cs
-1
na transição de fase LE/LC em função da %
BCD
na
monocamada – subfase aquosa.
Outra indicação da repulsão entre os domínios é o aumento da
mm
A . Os
valores de
mm
A crescem linearmente com o aumento da %
BCD
, conforme mostra
figura 5.10. Este crescimento é maior para o BCD 180º, que apresenta um
coeficiente angular de
180
(0,35 0,03)
%
mm
BCD
A
a ==±
, enquanto os BCD 150º e 90º
apresentam valores de coeficiente angular de
150º
(0,17 0,04)a
=
± e de
90º
(0,25 0,04)a =±, respectivamente.
Capítulo 5 Resultados e discussão
34
0 5 10 15 20 25
48
50
52
54
56
58
60
62
A
mm
(Å
2
)
% BCD
Figura 5.10: dependência da
mm
A em função da %
BCD
- subfase aquosa
Na fase C a presença de BCD na monocamada promove uma diminuição
do valor máximo do Cs
-1
, conforme mostram as curvas de Cs
-1
em função da
%
BCD
da figura 5.11, sendo sua posição na escala de áreas por molécula
praticamente inalterada. Esta diminuição no valor do Cs
-1
indica que a presença
de BCD na monocamada, torna-a mais flexível (elástica).
0 5 10 15 20 25
180
200
220
240
260
280
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
%BCD
BCD
180º
150º
90º
Figura 5.11: dependência do valor máximo do Cs
-1
na fase C, em função da %
BCD
na
monocamada – subfase aquosa.
Capítulo 5 Resultados e discussão
35
5.1.2 Subfase aquosa + NaCl
A adição de 0,2 M de NaCl na subfase produz na isoterma (π-Α) do DPPC
puro mudanças semelhantes àquelas produzidas pelos BCD, conforme curvas
mostradas na figura 5.12:
40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
Subfase
H
2
O
H
2
O + NaCl
Figura 5.12: efeito do NaCl (0,2 M) sobre a isoterma (
π
-
Α
) do DPPC.
b
1
) expansão da monocamada, ou seja, aparecimento da fase LE em áreas por
molécula maiores: pressão superficial começa a aumentar em (96±2) Å
2
ao
invés de (90±2) Å
2
como ocorre na monocamada de DPPC formada sobre
subfase aquosa;
b
2
) transformação do platô, que caracteriza a transição de fase LE/LC do DPPC
puro, em uma rampa: pressão superficial em (68±2) Å
2
é (9,3±0,8) mN.m
-1
e atinge (13,8±0,5) mN.m
-1
em (55±2) Å
2
;
b
3
) aumento da
mm
A : o valor desta área se desloca para (53±2) Å
2
.
Entretanto, o efeito do NaCl é muito mais fraco do que o provocado pelos
BCD. A única interação que pode ser responsável pelo o efeito do NaCl é a
interação eletrostática entre os cátions sódio (Na
+
) ou os ânions cloreto (Cl
−
) e
dipolos das cabeças polares das moléculas de DPPC. O efeito do sal, que
observamos, é semelhante ao estudo realizado por Aroti com colaboradores
(Aroti et al. 2004). Além disso, os estudos realizados por (Collins 1995, Collins
Capítulo 5 Resultados e discussão
36
1997) mostram que o cátion Na
+
é indiferente na série liotrópica, confirmando
que devem ser os ânions Cl
-
os responsáveis pelo efeito observado na
monocamada de DPPC. Aroti também obteve, por meio de BAM, que os ânions
Cl
−
não afetam significativamente a morfologia dos domínios da monocamada de
DPPC. Para que a interação atrativa entre os ânions Cl
-
e a cabeça polar do DPPC
seja mais eficiente é necessário que o grupo trimetilamônio (positivo), da cabeça
polar do DPPC, esteja orientado para a subfase aquosa. Pois os ânions Cl
-
chegam na monocamada da subfase. Este é um argumento para esperar que o
grupo de trimetilamônio penetre mais na subfase em concordância com modelo
(1) de (Vilallonga et al. 1972).
A presença de NaCl na subfase intensifica a interação entre as moléculas
de DPPC e de BCD. As isotermas (π-A) das monocamadas mistas obtidas na
presença de NaCl, mostradas nas figuras 5.13 a 5.15, são mais expandidas e a
transformação do platô em rampa é mais acentuada do que as obtidas na
ausência de NaCl (figuras 5.2 a 5.4).
20 40 60 80 100 120 140 160
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 180º
DPPC
DPPC + NaCl (0,2M
)
3
7
12
17
23
Figura 5.13: isotermas (π-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD180º - subfase
aquosa+NaCl
Capítulo 5 Resultados e discussão
37
20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 150º
DPPC
DPPC + NaCl
(
0,2M
)
3
7
12
17
23
Figura 5.14: isotermas (π-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD150º - subfase
aquosa+NaCl
20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pressão Superficial (mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 90º
DPPC
DPPC + NaCL (0,2M)
3
7
12
17
23
Figura 5.15: isotermas (π-A) das monocamadas mista de DPPC+BCD90º - subfase aquosa+NaCl
Capítulo 5 Resultados e discussão
38
Esta maior interação é quantitativamente representada pelo coeficiente
angular obtido das retas (figura 5.16) que mostram a dependência da
mm
A em
função da
%
BCD
. O valor deste coeficiente para o BCD 180º aumenta até
180º
(0,60 0,04)a =±, sendo 1,7 vezes maior do que o obtido na ausência de NaCl;
para o BCD 150º o aumento do coeficiente também é de 1,7 vezes:
150º
(0,30 0,02)a =± e para BCD 90
0
o coeficiente é praticamente inalterado.
0 5 10 15 20 25
48
50
52
54
56
58
60
62
64
66
68
70
corante coeficiente angular
BCD 180º 0,60±0,04
BCD 150º 0,30±0,02
BCD 90º 0,31±0,03
BCD 180º
BCD 150º
BCD 90º
A
mm
(Å
2
)
% BCD
Figura 5.16: Valores de
mm
A em função da %
BCD
, em subfase H
2
O + NaCl
As curvas do Cs
-1
das monocamadas mistas em subfase aquosa+NaCl
estão mostradas nas figuras 5.17 a 5.19. Observa-se que o perfil das curvas e as
modificações ocorridas são semelhantes às obtidas na ausência de NaCl, tendo
como diferencial, um maior efeito na presença de NaCl (observe que para 17 e
23% de BCD 180º na monocamada, figura 5.17, o valor do Cs
-1
na transição de
fase LE/LC equivale ao valor da fase LE).
Capítulo 5 Resultados e discussão
39
20 40 60 80 100 120 140 160
0
50
100
150
200
250
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 180º
DPPC
DPPC+NaCl (0,2M)
3
7
12
17
23
Figura 5.17: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD 180º -
subfase aquosa+NaCl
20 40 60 80 100 120 140 160
0
50
100
150
200
250
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 150º
DPPC
DPPC+NaCl (0,2 M
)
3
7
12
17
23
Figura 5.18: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD 150º -
subfase aquosa+NaCl.
Capítulo 5 Resultados e discussão
40
20 40 60 80 100 120 140 160
0
50
100
150
200
250
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 90º
DPPC
DPPC+NaCl (0,2 M)
3
7
12
17
23
Figura 5.19: módulo de compressibilidade em função da área por molécula: DPPC+BCD 90º -
subfase aquosa+NaCl.
Além da maior intensidade nas mudanças observadas das curvas de Cs
-1
(figuras 5.17 a 5.19), a presença de NaCl na subfase não somente provoca a
diminuição do valor máximo do Cs
-1
da fase C (figura 5.20), em função da %
BCD
,
como desloca este valor para maiores área por molécula (figura 5.21).
0 5 10 15 20 25
140
160
180
200
220
240
260
280
300
Cs
-1
(mN.m
-1
)
%BCD
BCD
180º
150º
90º
Figura 5.20: valor máximo do Cs
-1
, fase C, em função da %
BCD
na monocamada – subfase
aquosa+NaCl.
Capítulo 5 Resultados e discussão
41
0 5 10 15 20 25
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Área por molécula (Å
2
)
% BCD
BCD
180º
150º
90º
Figura 5.21: deslocamento do valor máximo do Cs
-1
em função da %
BCD
na monocamada -
subfase aquosa+NaCl
O efeito conjunto (sinérgico) de BCD e de NaCl, provavelmente, é devido à
interação mútua da carga positiva do BCD e da carga negativa do Cl
-1
com a
carga negativa do grupo fosfato e a carga positiva do grupo trimetilamônio do
DPPC, respectivamente. Em outras palavras, a presença de NaCl aumenta a
interação entre os BCD e as moléculas de DPPC, pois os ânions adsorvidos na
região polar da monocamada (cabeça polar dos fosfolipídios) faz com que a
monocamada adquira um excesso de carga negativa. Este excesso de carga
negativa compensa (“blinda”) as cargas positivas da cabeça polar das moléculas
de DPPC, diminuindo assim a repulsão eletrostática, que por conseqüência facilita
a aproximação das moléculas de BCD e DPPC.
5.2 Potencial Superficial (V)
Nesta seção são apresentadas as isotermas de potencial superficial (ΔV-Α)
das monocamadas mistas (DPPC+BCD) em função da porcentagem de BCD
(
%
BCD
), sendo estas as mesmas porcentagens utilizadas para a obtenção das
isotermas (π-Α). Estas isotermas foram comparadas com a isoterma (ΔV-Α) da
monocamada de DPPC puro.
Capítulo 5 Resultados e discussão
42
5.2.1 Subfase aquosa
A isoterma (ΔV-Α) do DPPC, mostrada na figura 5.22, apresenta potencial
zero para grandes distâncias entre as moléculas (grandes valores de área por
molécula), aumenta abruptamente a partir de (120±5) Å
2
e atinge o valor
máximo de potencial que fica compreendido no intervalo [500;600] mV,
concordando com (Borissevitch et al. 1996). Este rápido aumento tem sido
atribuído, para monocamadas de fosfolipídios e de outros compostos alifáticos, à
diminuição da constante dielétrica efetiva na interface monocamada-água que
ocorre quando uma determinada densidade de empacotamento é atingida
(Borissevitch et al. 1996).
20 40 60 80 100 120 140
0
100
200
300
400
500
600
Potencial Superficial (mV)
Área por molécula (Å
2
)
DPPC
isoterma de potencial
Figura 5.22: isoterma de potencial superficial do DPPC.
A presença dos BCD 150º e 90º na monocamada causa pequenas
flutuações nas isotermas (ΔV-Α) (figuras 5.23 e 5.24) que podem ser
considerados como desvios experimentais. Já a presença do BCD 180º (figura
5.25) provoca um aumento do potencial na isoterma toda, com exceção do valor
máximo. Observa-se que a partir de (60±2) Å
2
o valor do potencial, para cada
%
BCD
converge paro o valor máximo de potencial.
Capítulo 5 Resultados e discussão
43
20 40 60 80 100 120 140 16
0
0
100
200
300
400
500
600
Potencial Superficial (mV)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 150º
DPPC
3
7
12
17
23
Figura 5. 23: isotermas (ΔV-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD150º - subfase aquosa.
20 40 60 80 100 120 140
0
100
200
300
400
500
600
700
Potencial Superficial (mV)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 90º
DPPC
3
7
12
17
23
Figura 5.24: isotermas (ΔV-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD90º - subfase aquosa.
Capítulo 5 Resultados e discussão
44
20 40 60 80 100 120 140 160
0
100
200
300
400
500
600
Potencial Superficial (mV)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 180º
DPPC
3
7
12
17
23
Figura 5.25: isotermas (ΔV-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD180º - subfase aquosa.
Como discutido na seção 5.1.1, a presença do BCD estimula a interação
entre as moléculas de DPPC em grandes áreas por molécula. Esta interação
provoca uma orientação das moléculas de DPPC na interface ar-água e das de
água da subfase (adjacentes à cabeça polar do DPPC), o que explica o aumento
do potencial observado em grandes áreas por molécula. Em 60 Å
2
, a
monocamada encontra-se no final da transição de fase LE/LC, região onde os
domínios estão formados e quando na presença de BCD estes se encontram
próximos (ver seção 5.3). Então, a partir de 60 Å
2
, na presença de BCD,
podemos dizer que as moléculas de DPPC já se encontram, praticamente, em seu
maior ordenamento. Fato que explica a convergência do potencial para o valor
máximo. O fato, do valor máximo do potencial não alterar devido à presença de
BCD, mostra que os BCD não contribuem no potencial superficial, pois não
possuem momento de dipolo.
Na figura 5.26, são mostradas as curvas de variação relativa do potencial
da monocamada em função da %
BCD
em um valor de área fixa, 80 Å
2
. Para os
BCD 150º e 90º a variação do potencial é pequena e oscila em torno do valor
médio de 0,12, confirmando que são desvios experimentais; já o BCD 180º
provoca um aumento inicial de 30% e um aumento máximo de 50%, que
corresponde à saturação do sistema.
Capítulo 5 Resultados e discussão
45
0 5 10 15 20 25
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,12
(PS-PS
0
)/PS
0
% BCD
BCD
180º
150º
90º
Figura 5.26: variação do potencial (PS-PS
0
)/PS
0
, em 80 Å
2
, em função da %
BCD
– subfase
aquosa.
5.2.2 Subfase aquosa + NaCl
A isoterma (ΔV-Α) do DPPC, mostrada na figura 5.27, quando na presença
de NaCl na subfase, é deslocada para valores maiores de potencial com exceção
do valor máximo, sendo este diminuído de aproximadamente 50 mV.
20 40 60 80 100 120 140 160
0
100
200
300
400
500
600
Potencial Superficial (mV)
Área por molécula (Å
2
)
% BCD 180º
DPPC
DPPC+NaCl (0,2M)
3
7
12
17
23
Figura 5.27: isotermas (ΔV-A) das monocamadas mistas de DPPC+BCD180º - subfase
aquosa+NaCl.
Capítulo 5 Resultados e discussão
46
O NaCl, assim como o BCD, diminuem a repulsão entre a moléculas de
DPPC em grandes áreas por molécula, conforme discutido na seção 5.1.2,
antecipando a reorientação da moléculas de DPPC na interface ar-água. Este é o
motivo que faz o potencial apresentar um maior valor em grandes áreas por
molécula. A adsorção dos íons da subfase, em sua maioria os ânions de Cl
-
, pode
gerar uma dupla camada elétrica, que é característica de monocamadas
ionizadas. Esta dupla camada contribui no valor do potencial, conforme equação
3.4 apresentada no capítulo 3. Para monocamadas completamente ionizadas
negativamente, segue da teoria de Gouy-Chapman que a variação do potencial,
devido à dupla camada, varia com a concentração de íons de aproximadamente
-59 mV por cada década modificada na concentração de íons (Oliveira Jr. 1990).
Este fato confirma que a presença dos ânions Cl
-
na monocamada, gera uma
dupla camada elétrica, e a monocamada de DPPC comporta-se como uma
monocamada ionizada quando na presença de NaCl na subfase.
Na figura 5.27, também são mostradas as isotermas (ΔV-Α) das monocamadas
mistas de DPPC+BCD180° na presença de NaCl. Como esperado, os efeitos do
BCD sobre a isoterma (ΔV-Α) é intensificado na presença de NaCl. A isoterma
(ΔV-Α) não apenas é deslocada para maiores valores de potencial como também
para maiores valores de área por molécula. Este resultado está em concordância
com as isotermas (π-A) obtidas para a monocamada mista DPPC+BCD180° na
presença de NaCl (figura 5.13) que mostram que as moléculas de DPPC
começam interagir próximo dos 160 Å
2
, para 23% de BCD na monocamada.
Observe que o valor máximo do potencial é igual ao valor obtido para a
monocamada de DPPC puro com NaCl na subfase, indicando que a diminuição do
valor máximo do potencial deve-se somente ao sal.
5.3 Microscopia por Ângulo de Brewster (BAM)
A técnica de microscopia por ângulo de Brewster permite visualizar as
mudanças da morfologia e do colapso de monocamadas formadas na interface
ar-água (Patino et al. 1999). A forma dos domínios que compõem a
monocamada de DPPC depende da velocidade de compressão e da densidade
superficial (fase da monocamada). Se a velocidade de compressão estiver no
intervalo de 0,2 a 8,0 Å
2
/molécula.min, os domínios da monocamada de DPPC
Capítulo 5 Resultados e discussão
47
são nucleados e com formato semelhante ao de feijão (bean-like shapes) e
crescem progressivamente do formato de feijão à um formato de “S”, atingindo
finalmente o formato de multi-lobos (Klopfer e Vanderlick 1996).
Neste trabalho foram obtidas imagens, por microscopia de ângulo de
Brewster, somente para as monocamadas de DPPC e de DPPC+BCD180°. A %
BCD
na monocamada mista é 8% e ambas as monocamadas foram formadas em
subfase aquosa.
As imagens obtidas para as monocamadas de DPPC e de DPPC+BCD180º,
em diferentes valores de áreas por molécula, estão mostradas nas figuras 5.28 a
5.31.
Na fase LE nenhum domínio pode ser observado quando na ausência de
BCD (figura 5.28 a); na presença de BCD180º (figura 5.28 b) já são observados
algum tipo de agregado, porém, de formato não determinado. Estas primeiras
imagens confirmam a expansão da isoterma (π-A).
(a)
(b)
Figura 5.28: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 84
Å
2
.
Na transição de fase LE/LC são observados domínios com formato feijão
(marcado com um quadrado) e “S” (marcado com um círculo), conforme mostra
figura 5.29 (a), e quando na presença de BCD180º os domínios visualizados são
multilobos. Domínios multilobos são formados em áreas menores que 60
Å
2
,
portanto, a presença de BCD180º antecipa a formação dos domínios e também
diminui seu tamanho (figura 5.29 b). Estes resultados estão em concordância
com a discussão realizada no item 5.1.1. Além disso, observa-se que na
Capítulo 5 Resultados e discussão
48
presença de BCD os domínios estão mais próximos. Isto indica que o processo de
formação da monocamada é mais avançado na presença do BCD do que
ausência, onde os domínios estão ainda separados.
(a)
v
(b)
Figura 5.29: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 61
Å
2
.
Em 53 Å
2
, fase LC, são somente observados os domínios multilobos com
três e quatro “braços” curvados, que surgem devido à quiralidade das moléculas
de fosfolipídios (Krüger e Lösche 2000), conforme mostra figura 5.30 (a), e
quando na presença de BCD 180º estes domínios se encontram justapostos
(figura 5.30 b).
(a)
(b)
Figura 5.30: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 53
Å
2
.
Capítulo 5 Resultados e discussão
49
Na fase C (figura 5.31 a) na ausência de BCD os domínios encontram-se
justapostos formando a monocamada na interface ar-água. Na presença do BCD
não é possível observar os domínios, ou seja, a monocamada está formada
(figura 5.31 b).
(a)
(b)
Figura 5.31: visualização por BAM das monocamadas de DPPC (a) e DPPC+BCD180º (b) em 50
Å
2
.
A seqüência de formação dos domínios na ausência de BCD 180º (figuras
5.28 (a) a 5.31 (a)) e, conseqüentemente, da monocamada estão em
concordância com (Klopfer e Vanderlick 1996). As imagens obtidas sugerem que
a presença de BCD na monocamada não altera a orientação relativa das
moléculas de fosfolipídios na monocamada, isto porque os domínios observados
na presença de BCD possuem o mesmo formato que os de DPPC puro, porém de
menor tamanho.
Pelas imagens, observa-se claramente, que na presença de BCD todas as
fases de formação da monocamada ocorrem em regiões de maiores valores de
área por molécula, concordando e corroborando com os resultados de pressão
superficial.
5.4 Influência da Estrutura da Molécula de BCD
Os resultados de isotermas (π-A) e (ΔV-A) mostram que a interação DPPC-
BCD depende da estrutura dos corantes, sendo que o efeito diminui na seqüência
BCD180º > BCD150º ≥ BCD90º. Este resultado pode estar associado com a
diminuição da afinidade dos corantes com a região entre a parte polar e parte
Capítulo 5 Resultados e discussão
50
hidrofóbica da monocamada. Esta afinidade deveria aumentar quando a
solubilidade de um composto em água diminui. Entretanto, os resultados
mostraram o contrário, uma vez que a solubilidade em água, dos BCD, diminui
na seqüência BCD180º > BCD150º > BCD90º. Assim, associamos a diferença do
efeito dos BCD na monocamada com a estrutura espacial de suas moléculas.
Com base nos resultados apresentados, sugerimos duas possibilidades de
interação entre as moléculas de BCD e DPPC:
- MODELO 1: as moléculas de BCD, que penetram na monocamada, ficam
paralelas às cadeias hidrofóbicas do DPPC, interagindo tanto com a parte
hidrofóbica quanto com a parte polar (cabeça), conforme representação
esquemática mostrada na figura 5.32.
(a)
(b)
Figura 5.32: representação esquemática do modelo (1) proposto, BCD inserido na monocamada
de DPPC – (a) BCD 180º, (b) BCD 150º ou 90º
Podemos ver desta figura que no caso da estrutura linear da molécula de
BCD (ângulo entre cromóforos 180
0
) o contato entre as moléculas do BCD e de
DPPC é maior e a estrutura da monocamada é mais compacta. Se compararmos
com a inclusão na monocamada dos corantes com ângulos 150
0
e 90
0
entre os
cromóforos, estes corantes dificultam os contatos entre as moléculas de DPPC e
Capítulo 5 Resultados e discussão
51
com moléculas do corante, diminuindo a estabilidade da monocamada (aumento
da energia livre do sistema). Isto pode explicar a maior interação entre o DPPC e
o BCD180º do que com os BCD 150º e 90º, observada nos resultados de pressão
e potencial superficial obtidos.
- MODELO 2: as moléculas de BCD se inserem na região polar da monocamada,
conforme representação esquemática mostrada na figura 5.33.
Figura 5.33: representação esquemática do modelo (2) proposto, BCD na subfase, interagindo
somente com a cabeça polar das moléculas de DPPC.
Neste segundo modelo proposto a estrutura espacial dos BCD não deveria
ser um fator relevante na sua interação com o DPPC, como é no modelo 1.
O fato do aumento da área mínima por molécula ser proporcional à
concentração do BCD pode estar associado com a inclusão das moléculas do BCD
entre as cadeias hidrofóbicas da monocamada na direção perpendicular com o
plano da superfície.
Baseando nisso supomos que o modelo 1 é mais adequado para explicar a
interação dos BCD com a monocamada.
Capítulo 5 Resultados e discussão
52
450 500 550 600 650 700
0,000
0,004
0,008
0,012
0,016
0,020
0,024
0,028
Área por molécula ( Å
2
)
173
66,5
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
5.5 Espectroscopia de Absorção UV-Visível
Os espectros de absorção das monocamadas na presença de BCD180
0
foram medidos em função da área por molécula. Devido à baixa sensibilidade do
aparelho foi possível somente medir os espectros das monocamadas mistas com
uma %
BCD
acima das utilizadas nas medidas de pressão superficial, potencial
superficial e BAM. Somente foram obtidos espectros da monocamada mista de
DPPC+BCD180º em subfase aquosa e com número de mols de DPPC igual ao de
BCD, ou seja, para cada molécula de DPPC há uma molécula de BCD 180º.
Alguns espectros obtidos estão mostrados na figura 5.34.
Figura 5.34: espectros de absorção de BCD180
0
incorporado em monocamada de DPPC em
função da área por molécula – subfase aquosa.
A diminuição da área por molécula de 173 Å
2
(fase G) até 66,5 Å
2
(transição de fase LE/LC) induz a redução do pico principal de absorção do
BCD180º em 630 nm e aumenta a absorção na região de “ombro” λ < 600 nm
(figura 5.34). Estas mudanças espectrais podem ser associadas com a mudança
de concentração do BCD 180º enquanto a área diminui, ou com a mudança do
ambiente, onde o BCD se encontra quando se liga aos domínios formados.
Para uma melhor análise dos espectros obtidos do BCD 180º incorporado
na monocamada de DPPC, comparamos estes espectros com espectros
Capítulo 5 Resultados e discussão
53
normalizados do BCD 180º em função de sua concentração e em alguns
solventes com diferente constante dielétrica e capacidade de formar pontes de
hidrogênio.
Na figura 5.35 são mostrados os espectros normalizados de absorção para
BCD180
0
em várias concentrações em solução aquosa. Pode se observar que o
aumento da concentração do BCD180º, diminui a intensidade relativa do pico em
λ = 630 nm enquanto a intensidade relativa na região λ < 620 nm aumenta,
formando um novo pico de absorção em λ = 595 nm.
450 500 550 600 650 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
[BCD] x 10
-7
M
4,65
14,5
53,3
102
Absorbância normalizada
Comprimento de onda (nm)
Figura 5.35: espectros normalizados de absorção óptica do BCD180
0
em solução aquosa em
função da concentração.
Na figura 5.36 são apresentados os espectros normalizados de absorção
do BCD180
0
em solventes próticos e apróticos, que possuem diferentes
constantes dielétricas (ε). Solvente prótico é um solvente que carrega uma ponte
de hidrogênio entre um átomo eletronegativo, por exemplo, o oxigênio em um
grupo hidroxila ou um nitrogênio em um grupo amina, e um átomo de hidrogênio
presente nestes grupos. Convencionalmente, solventes apróticos são aqueles,
que não têm capacidade de formar pontes de hidrogênio. A partir destes
espectros, pode-se observar que em solventes orgânicos a intensidade de
absorção relativa na região λ < 595 nm é menor do que em água. Portanto,
pode-se concluir que as mudanças espectrais do BCD180º incorporado na
Capítulo 5 Resultados e discussão
54
monocamada de DPPC (figura 5.34) são devidas ao aumento de sua
concentração e não devido à mudança de ambiente.
450 500 550 600 650 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Solventes
metanol - ε = 32,6
etanol - ε = 24,3
isopropanol - ε = 18,3
acetonitrila - ε = 36,2
dimetilformamida - ε = 37,6
água - ε = 80,0
Absorbância normalizada
Comprimento de onda (nm)
Figura 5.36: espectros normalizados do BCD180
0
em diferentes solventes
O aparecimento de um novo pico de absorção em menores comprimentos
de ondas é característico da formação de agregados. Na literatura são
considerados dois tipos básicos de agregados de moléculas (Forster e Konig
1957, Kasha 1963):
c
1
) tipo J ou “edge-to-edge“: agregados com ângulo de 180º entre os
monômeros e;
c
2
) tipo H ou “face-to-face”: agregados com 0º entre os monômeros.
Na realidade em muitos casos podem ser observados agregados mistos,
denominado tipo HJ, onde o contato “face-to-face” não é completo. Na figura
5.37 são mostrados esquemas destes possíveis agregados.
Agregados tipo J
Agregados tipo H
Agregados tipo HJ
Figura 5.37: representação esquemática da geometria de agregados de tipos H, J e HJ
Capítulo 5 Resultados e discussão
55
M
J
H
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
A estabilidade do agregado depende da sobreposição das nuvens de
elétrons dos monômeros. Por isso os agregados H, que possuem maior
possibilidade para essa sobreposição, deveriam ser mais estáveis. Contudo,
vários fatores podem atrapalhar a formação de agregados do tipo H, favorecendo
a formação dos do tipo J. Estudos, de diversos sistemas, demonstraram a
formação dos agregados do tipo J tanto experimentalmente quanto teoricamente
(Van der Auweraer e Scheblykin 2002, Shklyarevskiy et al. 2002, von Berlepsch
et al. 2002).
Os níveis de energia dos agregados dependem da orientação relativa entre
os dipolos dos monômeros (Forster e Konig 1957; Kasha 1963). As intensidades
relativas das bandas dos espectros de absorção dependem do ângulo entre os
dipolos das moléculas que formam os agregados. Para os agregados do tipo J a
maior intensidade de absorção é observada na região de comprimentos de onda
maiores que dos monômeros do mesmo composto; para os do tipo H a banda de
absorção é deslocada para comprimentos de onda menores, conforme ilustra os
espectros mostrados na figura 5.38.
Figura 5.38: Espectros demonstrativos de absorção óptica de um monômero (M) e de seus
agregados H e J
Os espectros do BCD, obtidos na monocamada, mostram que a diminuição
da área por molécula aproxima as moléculas de BCD formando agregados tipo H.
Este resultado não está em controvérsia com a nossa sugestão da localização das
moléculas de BCD na monocamada: em posição vertical, paralelo com as cadeias
hidrofóbicas do fosfolipídio. Realmente, neste caso a formação dos agregados de
Capítulo 5 Resultados e discussão
56
tipo J não é possível. Entretanto, se o BCD se localiza na posição horizontal entre
as cabeças polares dos fosfolipídios a formação dos agregados H também é
possível. Então, mesmo que não possamos usar os dados espectroscópicos como
uma comprovante do modelo sugerido, estes resultados, no mínimo, não
contradizem o modelo proposto.
57
Capítulo 6 Conclusões
A partir da análise das isotermas de pressão superficial (π-A), curvas do
módulo de compressibilidade (Cs
-1
), isotermas de potencial superficial (ΔV-A) e
as imagens obtidas através da microscopia por ângulo de Brewster, todos em
função da porcentagem dos BCD na monocamada de DPPC, podemos concluir
que:
- a presença dos BCD estimula a formação dos domínios de DPPC sem mudar seu
formato, mas diminuindo seu tamanho;
- este efeito está associado com uma blindagem da carga negativa da cabeça
polar pela carga positiva do BCD, diminuindo a repulsão entre as moléculas de
DPPC;
- devido à presença da carga positiva do BCD nos domínios, estes adquirem uma
carga líquida positiva, que aumenta a repulsão entre eles. Isto nivela a diferença
entre fases líquida expandida e líquida condensada da monocamada, aumenta a
área mínima por molécula e torna a fase condensada da monocamada mais
elástica;
- a análise das isotermas (ΔV-A) indicou que os BCD não contribuem no valor do
potencial superficial medido;
- a presença de NaCl na subfase aumenta o efeito dos BCD na formação da
monocamada de DPPC. Este efeito sinérgico é devido às interações mútuas dos
ânions Cl
−
com a carga positiva do grupo trimetilamônio da cabeça polar do DPPC
e das cargas positivas do BCD com carga negativa do grupo fosfato do DPPC;
A análise dos espectros de absorção do BCD inserido na monocamada
mostrara que o BCD na monocamada condensada forma agregados do tipo H e
não agregados do tipo J.
Baseando-se na análise do efeito da estrutura dos BCD na sua interação com
a monocamada, e nos espectros de absorção óptica propusemos dois modelos de
Capítulo 6 Conclusões
58
interação dos BCD com a monocamada, e acreditamos que o modelo 1,
apresentado abaixo, represente melhor o sistema:
- modelo 1:as moléculas de BCD se inserem na monocamada, paralelamente ao
eixo da molécula de DPPC, interagindo tanto com a cauda hidrofóbica quanto
com a cabeça polar.
Entretanto, os dados obtidos não são suficientes para excluir o modelo 2
proposto:
- modelo 2: as moléculas de BCD localizam-se na parte polar da monocamada,
perpendicular ao eixo da molécula de DPPC.
Para propor um modelo definitivo para a interação DPPC-BCD é necessário
realizar um trabalho futuro que complemente os resultados apresentados neste
trabalho.
59
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