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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
-
UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
Vanessa Paes da Cruz
Estudos citogenéticos em raias do gênero
Potamotrygon
(
Chondrichthyes: Myliobatiformes: Potamotrygonidae
)
na
bacia superi
or do rio Paraná
.
Botucatu
–
SP
200
9
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ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO
-
CAMPUS DE BOTUCATU
-
UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jes
us
Cruz, Vanessa Paes da.
Estudos citogenéticos em raias do gênero
Potamotrygon
(Chondrichthyes:
Myliobatiformes: Potamotrygonidae) na bacia superior do rio Paraná /
Vanessa Paes da Cruz.
–
Botucatu : [s.n.], 2009.
Dissertação (mestrado)
–
Un
iversidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Botucatu, 2009.
Orientador: Fausto Foresti
Assunto CAPES: 20204000
1.
Raia (Peixe) -
Paraná, Rio, Bacia 2. Peixe
-
Genética 3. Zoologia
CDD 597.55
Palavras
-
chave: Genes ribossômicos;
Potamotryg
on
; Raias; Técnicas
citogenéticas
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iii
iv
Aos meus pais, que sempre se
dedicaram, me incenti
varam e estiveram
presentes em todas as etapas da minha
vida...
v
Qual o sentido da vida
Viver por mera falta do que fazer
Viver por insistir em ter algo pra fazer
Viver apenas por confundir
Vida com sobrevivência
O sentido da vida
É mais complexo do que
se pode imaginar
Nossa imaginação é limitada apenas ao que vemos
E se nunca vemos nada além da vida
É porque não vivemos nada mais do que permitiram
Viver é mais do que respirar
É sentir o amor brotar com o nascer do sol
É deixar escorrer pelo rosto o orv
alho do amanhecer
É querer mais do que apenas querer
Queimar o sol que existe dentro de nós
A vida não se mede em tempo
O tempo é curto para que uma vida seja vivida
A qualquer momento o relógio para
E o tempo que tínhamos chega ao final
E o final acaba c
hegando antes do que deveria
Vivo os momentos da vida
Os bons e os maus, os duros e os fáceis
A cada sentimento que eu deixo para trás
Eu arranco um pedaço de minha alma
Por pura ignorância de querer ser feliz
A vida não é só alegria
É dor, lágrimas, amo
r e compaixão
Viva cada momento como se fosse acordar
Bom ou ruim logo irá passar
E irá perceber que nada passou de um sonho
Autor: Alan Pooh
vi
AGRADECIMENTOS
Primeiram
ente a Deus,
por
me abençoar sempre, por me enviar em uma
bela família e por ter amig
os inesquecíveis!!!
Ao Prof. Dr. Fausto Foresti, por orientar-me, pela oportunidade de
trabalhar em seu laboratório, pelo exemplo, pela paciência e pelo incentivo em
todos os momentos deste trabalho. “O saber se aprende com os mestres. A
sabedoria, só co
m o corriqueiro da vida
”. Cora Coralina.
Ao Prof. Dr. Cláudio de Ol
iveira
pelo exemplo como pesquisador e
dedicação aos alunos.
A Dra. Cristiane Shimabukuro Dias, pelas risadas, amizade, e é claro
pelas longas discussões, que ajudaram imensamente
no
desenvolvimento desse
trabalho.
Muito Obrigada!
“A dúvida é o princípio da sabedoria”.
Aristóteles
.
Ao grande colega de trabalho Renato Devidé, sempre presente e disposto
a ajudar nas coletas e nas pre
parações cromossômicas.
Ao Mrs. Marlon F. Pazian, pela amizade, discussões de teimosias e vários
conselhos profissionais.
Ao Mrs. Gustavo L.R. Pescatori, pelo apoio desde a primeira
prática de
citogenética de raias realizada.
Aos companheiros de risadas e
distrações
,
Mestrando
s Fábio Roxo
,
Guilherme, Jefferson, e
Doutorandos
Kell
y, Marlon, Emanuel Luiz. “A amizade,
depois da sabedoria, é a mais bela dádiva feita aos homens”.
François
La
Rochefoucauld
.
À Doutoranda Lessandra De Rosa pela “sempre” disponibilidade em
ajudar e à
Mestranda Natália pela
amizade
e muitas risadas
.
Ao Doutorando Ricado Paiva pelas várias sugestões e discussões sobre
melhorias na citogenética.
vii
Agradeço o apoio, carinho e amizade dos inúmeros companheiros
do Departamento de Morfologia
:
Tatiane,
Juliana, Gueodai, Prof. Celso, C
onr
ado,
Zeca, Patrícia, Luiz (japonês), Marhmoud, Ricardo (Iniciação),
Gleysi,
Daniela,
Claudinha, Juliana Mazzuks
,
Alfe,
Márcio
,
Da
nillo, Diogo e
Kbelo
.
À Universidade Estadual Paulista, ao Instituto de Biociências (Botucatu-
SP) e ao Departamento de Morfologia que proporcionaram a oportunidade e as
condições para a realização desse estudo.
Aos pro
fessores
Drs. Artur Antônio And
reata
e Rodrigo Brás de Castilho
Almeida, pelos exemplos na área de pesquisa e ensinamentos ao longo da
faculdade
.
Aos funcion
ár
ios, t
écnico
s Zé e Ricardo Texeira (pelas risadas), Dona
Yolanda
, Vanda e D
ona
Tera (que sem seu café seria extremamente difícil ficar
acordada após os al
moços)
.
Às amigas de faculdade: Érica, Verônica e Syrilla pela amizade
há
mais
de 4 anos. Às amiga
s
Renata,
Carol
, Manu (irmã de coração) e Glaura, pelas horas
de descanso, descontração e companhei
rismo.
À Vanessinha, que apesar da
distân
cia, a amizade não desapareceu; ao contrário, só tende a se fortalecer
.
“Para
ganhar conhecimento, adicione coisas todos os dias. Para ganhar sabedoria, elimine
coisas todos os dias”
.
Lao
-
Tsé
.
Ao
meu namorado Jefferson, pelo companherismo, por “toda”
a
paciência
(principalmente nesses últimos meses) e
todo
o carinho dedica
do
!
A toda minha família, meus pais: José A. Paes e D. Yolanda, e irmãos:
Anderson e Andresa, pelo apoio finaceiro, amizade, churrascos e
,
é claro
,
a
confiança
.
Muito obrigada!
viii
RESUMO
As raias da família Potamotrygonidae são importantes componentes da
ictiofauna Neotropical, sendo este grupo de organismos completamente restrito aos
sistemas fluviais da América do Sul. Três gê
neros
são relacionados nessa familia:
Plesiotrygon, Paratrygon e Potamotrygon e são encontrados nos principais sistemas
fluviais n
a
região Neotropical. No presente projeto, foi realizada a análise
citogenética em representantes de duas espécies de
raias,
Potamotrygon motoro e
P. falkneri
,
que
apresentaram número
s diplóide de 2n=65
nos machos
e NF= 66
nas
fêmeas
,
caracterizando a ocorrência de heteromorfismo cromossômico sexual do
tipo
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y.
Em
P. motoro a população de Porto Rico apresen
tou
número
fundamental de 116 (22m+8sm+20st+6a
)
nas fêmeas, e 114 (21m+9sm+19ST+16a)
nos machos. A população de Ilha solteira apresent
ou
número fundamental 122
(20m+10sm+26st+10a
) nas fêmeas e 114 (22m+20sm20+st+10a) nos machos. Em
P. falkneri, a população de Porto Rico apresenta número fundamental 110
(20m+10sm+14st+22
a) nas fêmeas e 108 (19m+20sm+11st+22a) nos machos. A
população de Ilha Solteira
apresen
ta número fundamental de 114
(20m+10sm+18st+18a
).
A heterocromatina constitutiva (Banda C) foi identificada na
forma de blocos heterocromáticos nas regiões centroméricas de quase todos os
cromossomos do complemento. As regiões organizadoras de nucléolos (RONs)
caracterizadas nesta
imp
regnação com nitrato de Prata, se apresentaram em
marcaçõesm
múltiplas e em posiçõa
term
inal nos cromossomos das duas espécies.
O emprego do fluorocromo CMA3 evidenciou, além das Ag-RONs, marcações
adicion
ais nas duas espécies em estudo, caracterizando outras regiões no genoma
também ricas em GC. Foram identificados também cístrons ribossômicos através da
hibridação
in situ fluorescente (FISH) com a sonda de DNAr 18S, que coincidiu com
as mesmas marcações evidenciadas pela impregnação da Prata nas duas
espécies.
ix
Um sítio adicional foi encontrado para a espécie P. falkneri, população de Ilha
Solteira. A sonda de DNAr 5S revelou quatro sítios em regiões terminais nas duas
populações de
P. motoro, em alguns casos coincidentes com os sítios de DNAr 18S,
revelando regiões sintênicas. Em P. falkneri, foram encontrados sítios de DNAr 5S
nas regiões terminais de três cromossomos, dois deles coincidentes com os sítios de
DNAr 18S, portanto
sintênicos.
Duas classes de DNAr 5S foram identificadas em P.
motoro, uma consistindo de repetições de 350 pb (tipo I) e outra com repetições de
19
00 p
b (tipo II). A localização cromosômica dos genes DNAr 5S, mostrou que estes
estão localizados em dois loci cromossomicos, um menor, presente em um par
cromossô
mico metacentrico, e outro maior, presente em um par de cromossomos
submetacentricos. Estes resultados caracterizam duas subfamílias gênicas de DNAr
5S que têm evoluído independentemente e podem estar sendo governadas por
forças evolutivas distintas e expressando dois tipos de DNAr 5S nos peixes.
Os
dados obtidos, além de revelarem apectos citogenéticos e moleculares destas
espécies, podem fornecer subsídios para futuros estudos que visem a compreensão
das relações entre as espécies deste grupo.
x
ABSTRACT
Stingrays of the family Potamotrygonidae are important components of the
Neotropical ichthyofauna, being the only group of elasmobranchs completely
restricted to fluvial systems of South America. Three genera are recognized within
the family:
Paratrygon
,
Plesiotrygon
, and
Potamotrygon.
In the present project
cytogenetic analysis were accomplished in representative species of two
populations of P. motoro and P. falkneri, presented a male karyotype 2n=65 and
female 2n=66, constituting a case of sexual chromosomal heteromorphism of the
type X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y.
In
P. motoro the population of Porto Rico presented
fundamental number 116 (11m +4 SM +10 ST +8 A). The population of Ilha
Solteira presented fundamental number 122 (10M +5 SM +13 ST +5 A). In
P.
falkineri
, the population of Porto Rico presents fundamental number 110 (10M +5
SM +7 ST +11 A). The population of Ilha Solteira presents fundamental number of
114 (+9 ST 10M +5 SM +9 A). Constitutive heterochromatin (C Band) revealed
heterochromatic blocks in the centromeric regions of almost all the chromosomes
of the complement. The nucleolar organizer regions (NORs) by impregnation with
silver nitrate, showed multiple and terminals NORs in the two species. The use of
fluorochrome CMA3 showed, in addition to the Ag-NORs, additional marks in the
two studied species. Cístrons ribossômicos were identified by fluorescent in situ
hybridization (FISH) with the probe of 18S rDNA, which coincided with the same
markings evidenced by the impregnation of silver in the two species, and one
additional site was found for the species P. falkineri, population of Ilha Solteira.
The probe of 5S rDNA revealed four sites in terminal regions in two populations of
P. motoro, coinciding with the sites of 18S rDNA, revealing regions of co-
localization
. In
P.
falkneri
, sites of 5S rDNA were found in terminal regions of three
chromosomes, two of them coincide with the sites of 18S rDNA, therefore is also
co
-
localization.
Two classes of 5S rDNA were identified for P. motoro, one
consistin
g of repeat units around (350) (Class I) and another one with (1
900
) bp
(
Class
II). The 5S rRNA genes were clustered in two chromosome loci, a minor
xi
one localized at metacentric chromosome pair, and a major one at submetacentric
chromosome pair. The present work characterized two 5S rDNA subgene families
that have been evolving separately and have been governed by distinct
evolutionary forces and might be expressing two different types of 5S rDNAs.
The
obtained data, besides revealing cytogenetic aspects and molecular of these
specie,
can give base to future studies that look for the understanding the
relationship between species of this group.
xii
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura
1 – Exemplar da espécie Potamotrygon motoro (fêmea) de ocorrência
na
bacia superior do rio Paraná
................................................................
......................
04
Figura
2 – Exemplar da espé
cie
Potamotrygon falkneri (macho) de ocorrência na
bacia superior do rio Paraná
................................................................
......................
04
MATER
IA
IS
E M
É
TODOS
Figura
3 –
Mapa hidrográfico da América do Sul,
mostrando
em destaque a bacia do
rio Paraná
................................................................................................
..................
20
Figura
4 – Mapa da bacia hidrográfica do rio Paraná, evidenciando os locais de
coleta das espécies
Potamotrygon mo
toro
e
Potamotrygon falkneri
........................
20
Figu
ra
5 –
Foto do
local de coleta no rio Paraná, no município de Porto Rico
.........
21
Figura
6 –
Foto
do local de coleta no rio Paraná, n
o m
unicípio de Ilha Solteira.
......
21
CAPÍTULO 1
Figura
01 – Cromossomos meióticos de Potamotrygon falkneri , população de Ilha
Solteira, (a) metáfase esp
er
matog
onial (2n=65 cromossomos) após coloração com
Giemsa e metáfase I (b), com 30 bivalentes (aproximadamente) e um trivalente
(indicado pela seta).
................................................................................................
...
57
Figura
02
–
Cariótipo
s de
Potamotrygon
motoro
(fêmea) da população de Porto
Rico,
evidenciando os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
................................................................................................
...........
58
Figura
03
–
Cariótipo
s de
Potamotrygon
motoro
(macho) da população de Porto
Rico,
evidenciando os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C
..
................................................................................................
..........
59
Figura
04
–
Cariótipo
s de
Potamotrygon
motoro
(fêmea) da população de Ilha
Solteira,
evidenciando
os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C
..
................................................................................................
..........
60
Figura
05
–
Cariótipo
s de
Potamotrygon
motoro
(macho) da população de Ilha
Solteira,
evidenciando
os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
xiii
Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C
............................................................................................................
61
Figura
06
–
Cariótipo
de Potamotrygon falkneri (fêm
ea
) da população de
Porto
Rico
, evidenciando os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
G
iensa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva,
após
realização da técnica de
bandamento C
...
................................
................................
................................
.........
62
Figura
07
–
Cariótipo
s de Potamotrygon falkneri (macho) da população de Porto
Rico,
evidenciando os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
G
iensa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C
..
..
........................................................................................................
63
Figura
08
–
Cariótipo
s de Potamotrygon falkneri (
fêmea
) da população de Ilha
Solteira
, evidenciando os cromossomos sexuais,
(a) com
coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina co
nstitutiva,
após realização da técnica de
bandamento C
...
................................
................................
................................
.........
64
Figura
09
–
Cariótipo
s
de
Potamotrygon falkneri (
Macho
) da população de
Ilha
Solteira, evidenciando os cromossomos sexuais,
(
a)
com coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e
análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C
....
........................................................................................................
65
Figura
10
– Metáfases somáticas, após tratamento com coloração por nitrato de
Prata, as setas e os asteriscos indicam os sítios Ag-RONs ativos. (a) P. motoro -
população de Porto Rico e Ilha solteira (b), P. falkneri população de Porto Rico (c) e
Ilha Solteira (d).
....
................................................................................................
......
66
CAPÍTULO 2
Figura
01
–
Cariótipo
de
Potamotrygon motoro
,
fêmea
(a) e macho (b) da população
de
Porto Rico, evidenciando os cromossomos sexuais, após coloração conv
encional
por G
ie
m
sa
......
................................................................................................
...........
82
Figura
02
–
Cariótipo
de
Potamotrygon motoro, fêmea (a) e macho (b) da população
de Ilha Solteira, evidenciando os cromossomos sexuais, após coloração
convencional por Giemsa
....
................................................................
.......................
83
Figura
03
–
Cariótipo
de
Potamotrygon falkn
eri,
fêmea (a) e macho (b) da população
de Porto Rico, evidenciando os cromossomos sexuais, após coloração convencional
por Giem
sa
......
................................................................................................
...........
84
Figura
04 –
Cariótipo
s
de
Potamotrygon falkneri
,
fêmea
(a) e macho (b) da
população de Ilha Solteira, evidenciando os cromossomos sexuais, após coloração
convencional por
G
ie
m
sa
.....
................................................................
......................
85
Figura
05 –
Metáfases
somáticas de
Potamotrygon
motoro
(fêmea), da população
de Porto Rico, (a) após coloração convencional com Giemsa, análise seqüencial da
xiv
heterocromatina constitut
iva (b),
Potamotrygon motoro
(macho) da população de Ilha
Solteira após coloração convencional com Giemsa (c), e identificação da
heterocromatina constitutiva (d).
....
............................................................................
86
Figura 06 –
Metáfases
somáticas de
Potamotrygon
falkneri
(fêmea), da população
de Porto Rico, (a) após coloração convencional com Giemsa, análise seqüencial da
heterocromatina constitutiva (b),
Potamotrygon
falkneri
(macho) da população de Ilha
Solteira após coloração convencional com Giemsa (c), e identificação da
heterocromatina consti
tutiva (d).
....
............................................................................
87
Figura
07 –
Cariótipos
parciais de: a) Potamotrygon motoro (Porto Rico), após
emprego da técnica de Ag-RON; b) P. motoro (Porto Rico), após coloração com o
fluorocromo CMA
3
; c) P. motoro (Ilha Solteira), após emprego da técnica de Ag-
RON; d) P. motoro (Ilha Solteira), após coloração com o fluorocromo CMA
3
; e)
P
otamotrygon
falkneri (Porto Rico), após emprego da técnica de Ag-RON; f)
P.
falkneri
(Porto Rico), após coloração com o fluorocromo CMA
3
; g) P. falkneri (
Ilha
Solteira
),
após emprego da técnica de Ag-RON; h) P. falkneri (Ilha Solteira), após
coloração com o fluorocromo CMA
3
.....
................................................................
......
88
Figura
08 – Metáfases somáticas, após coloração com o Fluorocromo CMA
3
, de
Potamotrygon motoro (a) população de Porto Rico, (b) população de Ilha Solteira, e
Potamotrygon falkneri
(c) população de Porto Rico, (d) população de Ilha Solteira. as
setas e os asteriscos representam os sítios GC
-positivos.....
................................
...
89
Figura
09 – Metáfase somática de Potamotrygon motoro (fêmea), após hibridação
in situ fluoresce
nte,
da população de Porto Rico, evidenciando a localização dos
genes ribossomais 5S (a), 18S (b), e localização simultânea das sondas (c).
Potamotrygon motoro (fêmea) da população de Ilha Solteira, evidenciando a
localização dos genes ribossomais 5S (d), 18S (e) e localização simultânea das
sondas (f). As setas e asteriscos indicam a localização dos sítios ribossomais
.......
90
Figura
10 – Metáfase somática de Potamotrygon falkneri (fêmea), após hibridação
in situ fluorescente, da população de Porto Rico, evidenciando a localização dos
genes ribossomais 5S (a), 18S (b), e localização simultânea das sondas (c).
Potamotrygon falkneri (fêmea) da população de Ilha Solteira, evidenciando a
localização dos genes ribossomais 5S (d), 18S (e) e localização simultânea das
sondas (f). As setas e asteriscos indicam a localização dos sítios ribossomais
.......
91
CAPÍTULO
3
Figura 01 – A
mplificação
de repetições de DNAr 5S de Potamotrygon motoro,
população de Porto Rico, visualizadas em gel de agarose 2%.
(M
) cor
re
sponde a
uma amostra de DNA de um exemplar macho,
(F
) corresponde a uma amostra de
DNA de um exemplar fêmea, (L) marcador de peso molecular 1Kb (Invitrogen Life
Technologies)..................................................................................
.........................
1
05
Figura
02 –
Metáfases
de
Potamotrygon motoro da população de Porto Rico
,
(a)
após hibridação in situ com a sonda DNAr 5S de 300pb (Classe I) (verde); (b) após
hibridação
in situ com a sonda DNAr 5S de 1900pb (Classe II) (vermelho); (c)
xv
resultado de Double-FISH demonstrando marcação com as duas sondas
simultaneamente
.
.....................................................................................................
1
06
Figura
03 –
Seqüências
consenso de DNAr 5S Classe I (5S I) e Classe II (5S II
)
alinhadas da espécie
Potamotrygon motoro
. A região de transcrição se inicia no +1 e
termina no +120 (está em negrito). As sequencias TATA-like estão contornadas por
retângulos. A sequência nucleotídica grifada indica uma região microssatélite GCT
10
.
Os pontos indicam nucleotídeos idênticos e gaps estão indicados pelos traços....107
LISTA DE TABELAS
INTRODUÇÃO
Tabela
1 – Sumário das informações citogenéticas disponíveis para espécies de
raias de água salgada e água doce
................................................................
...........
07
Tabela
2 –
Sistemas cromossômicos s
exuais descritos em peixes Neotropicais
....
15
MATERI
A
IS
E MÉTODOS
Tabela
3 – Espécies do gênero
Potamotrygon
utilizadas
durante
as análises
citogenética
s
e locais de coleta ....................
.................................
............................
18
RESULTADOS E DISCUSS
ÃO
CAPÍTULO 3
Tabela
1 – Análise da d
ist
ância genética entre os clones da Classe I e os clones da
Classe II;
NC
- número de clones;
PB
- número de bases; DG -
divergência
gen
ética, DP
-
desvio padrão.
..................................................................................104
xvi
SUMÁRIO
1 Introdução
Geral
....................................................................................................
01
1.1
Família Potamotrygonidae: aspectos taxonômicos e citogenéticos
....................
01
1.2
Breve histórico da Citogenética de Peixe
s
com ênfase
em Elasmobrânquios
....
05
1.3
DNAs ribossômicos 45S e 5S
................................................................
..............
08
1.
4
Evolução de mecanismos cromossômicos de determinação sexual
...................
11
1.
5
Cromossomos sexuais em peixes Neotropicais
................................
..................
12
2 Objetivos
................................................................................................................
17
3 Materiais
................................
................................
................................
.................
18
3
.1
Área de estudo
................................
................................
................................
.....
18
4
Métodos
................................................................................................
..................
22
4.1 Métodos Citog
enéticos
................................
................................
.........................
22
4.1.1 Estimulação de mitoses
................................
................................
.....................
22
4.1
.2 Preparação de cromossomos mitóticos
............................................................
22
4.1.3
Obtenção de
cromossomos meióticos
................................
..............................
23
4.1.4
Coloração convencional com Giem
sa
................................
...............................
24
4.1
.5
Caracterização
das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)
.................
24
4.1.
6
Detec
ção da heterocromatina constitutiva (Banda C)
................................
......
25
4.1.
7
Bandamento com o fluorocromo base
-
específico Cromomicina A3 (CMA3
)
...
26
4.1
.8
Estudos cariotípicos
................................................................
..........................
26
4.1.9
Medidas cromossô
micas
................................................................
...................
27
4.1.
10
Montagem dos cariótipos
................................................................................
27
4.2 Métodos Moleculares
................................................................
...........................
27
4.2.1 E
xt
ração de DNA genômico
................................................................
..............
27
xvii
4.2.2
Caracterização do DNAr 5S
................................................................
..............
28
4.2.2
.1
Isolamento do DNAr 5S por PCR
................................................................
...
28
4
.2.3
Purificação dos fragmentos DNA em gel de agarose
................................
.......
29
4.2.
4
Quantificação do DNA purificado
................................................................
......
30
4.2.
5 Clonagem das sequências de DNAr 5S obtidas por PCR
................................
30
4.2.
5.1 Ligação de fragmentos de DNA ao plasmídeo pGEM
-T
................................
30
4.2.
5.2 Transformação de células competentes bacterianas
....................................
31
4.2.6 PCR para confirmação da presença de insertos
................................
..............
31
4.2.
7 Crescimento e estocagem dos clones recombinantes
................................
.....
32
4.2.
8
Sequ
ê
nciamento
do DNA
................................................................
..................
32
4.2.
9
Hibridação
in situ
fluorescente
(FISH)
................................
..............................
34
5
Resultados
e Discussão
................................................................
.......................
38
5
.1
Capítulo 1 - Descrição cariotípica e evidências de s
istema
múltiplo de
cromossomo
s sexuais X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y em Potamotrygon motoro e
Potamotrygon
falkneri
(Chondricht
h
yes: Potamotrygonidae)
na bacia superior do alto Paraná
......
39
5
.2
Capítulo 2 - Mapeamento físico dos genes ribossomais
5S
e 18S em
Potamotrygon motoro e Potamotrygon falkneri (Chondrichth
yes:
Potamotrygonidae)na bacia superior do alto Paraná
................................
.................
65
5
.3
Capít
u
lo
3
- Organização molecular
e
mapeamento genômico de duas classes
do gene do gene ribossomal 5S em Potamotrygon motoro (Chondrichthyes:
Potamotrygonidae)
................................
................................
................................
.....
84
6 Discussão Geral
................................................................................................
..
102
7
Conclusões
................................................................................................
..........
107
8
Referências Bibliográficas
................................................................
.................
109
ntrodução
C
olôn
ia de Pescadores
–
Porto Rico
-
PR
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1
FAMÍLIA POTAMOTRYGON
IDAE
: ASPECTOS TAXONÔMIC
OS E
CITOGENÉTICOS
Os Chondrichthyes são peixes caracterizados por apresentarem esqueleto
cartilaginoso, estando o grupo atualmente organizado em duas Subclasses:
Elasmobranchii, formada pelos tubarões e raias e Holocephali que abrange as
quimeras (
ORR
, 1986;
STORER
et al
.
1991).
Dentre os elasmobrânquios, as raias da família Potamotrygonidae, cuja
classificação pode ser verificada a seguir, representam uma importante parte da
ictiofauna neotropical, sendo os únicos componentes deste grupo totalmente
restritos ao ambiente dulcícola (
THORSON
et al.
1978
; COMPAGNON & COOK,
1995
).
FILO: Chordata
SUB FILO
: Vertebrata
CLASSE: Chondrichthyes
SUB
CLASSE: Elasmobranchi
i
ORDEM: Myliobatiformes
FAMÍLIA: Potamotrygonidae
A família Potamotrygonidae compreende cerca de
21
espécies
,
distribuídas nos
gêneros Potamotrygon
, sendo para este gênero o maior em número
de espécies
descritas,
Potamotrygon
boesemani, P. brachyura, P. castexi, P.
costellata, P. dumerilli, P. falkneri, P. henlei, P. histrix, P. humerosa, P. leopoldi, P.
magdalenae, P. motoro, P. ocellata, P. orbignyi, P. shroederi, P. schuemacheri, P.
scobina, P. signata, P. yepezi (ROSA, 1985, 2008), e os gêneros monotípicos,
Paratrygon
(Paratrygon aiereba
,
ROSA, 1985) e
Plesiotrygon
(Plesiotrygon iwamae
,
GARMAN,
1913
apud
ROSA, 1985
).
Os potamotrigonídeos apresentam boca, narinas e fendas branquiais
totalmente ventrais e corpo achatado dorso-
ventralmente,
características estas
2
compartilhadas com os demais representantes de Myliobatiformes. A boca de
Potamotrigonídeos possui dentes pequenos e pavimentosos (
BRITSKI
et al.
1999).
Os olhos estão inseridos na face superior do disco, voltados lateralmente. As
nadadeiras peitorais são carnosas e superdimensionadas, unindo-se anteriormente
e formando um disco circular ou subcircular. As nadadeiras pélvicas têm formato
triangular e ficam quase completamente escondidas pelas pei
to
rais quando o animal
repousa,
exceção feita para Plesiotrygon iwamae (
CARVALHO
et al. 2003). Os
machos dispõem de um par de cláspere
s,
apêndices das nadadeiras pélvicas
utilizados para a introdução do sêmen na cloaca da fêmea durante a cópula. Na
cauda, superiormente, inserem-se os ferrões, em número variando de um a quatro,
todos implantados no mesmo local. Os ferrões têm origem dérmica e parecem ser
freq
u
entemente substituídos (
CARVALHO
et al.
2003).
As raias da família Potamotrygonidae são restritas aos principais sistemas
fluviais da América do Sul, incluindo rios da Venezuela, Guiana, Suriname, Guiana
Francesa, Colômbia, Peru, Bolívia, Paraguai, Argentina, Uruguai e Brasil
(ACHENBACH & ACHENBAC
H, 1976; ROSA, 1985;
CARVALHO
et al
.
2003).
No Brasil, a maior diversidade é encontrada na Bacia Amazônica, com
cerca de 13 espécies
(
CHARVET
-
ALMEIDA
et al
.
2002). A região Nordeste do Brasil
apresenta registros pontuais de representantes deste grupo, com referências de
capturas nos Estados do Maranhão e Piauí (
ROS
A, 1985). Nas regiões Centro-
Oeste e Sudeste, a Bacia Paraguai-Paraná abriga cerca de sete espécies nominais.
Contudo, considera-se que esse número possa variar devido à possibilidade de
existirem espécies sinônimas e/ou outras ainda não descritas (ROSA, 1
985;
CARVALHO
et al
.
2003
).
No
rio Paraná, até o final dos anos 70, a ocorrência de raias era
assinalada apenas para os trechos situados à jusante das Cachoeiras de Sete-
Quedas, uma importante barreira geográfica situada no Município de Guaíra, Estado
do
Paraná (
VILELA
et al.
2004
). Com o fim do enchimento do reservatório da Usina
Hidrelétrica de Itaipu, no ano de 1982, esse obstáculo natural, que isolou por muito
tempo a maioria dos componentes da ictiofauna do Alto Rio Paraná da fauna
3
remanescente dos sistemas à jusante, deixou de existir, possibilitando a colonização
do trecho situado à montante de Guaíra por novas espécies. Nesse novo e extenso
ambiente
,
as raias (Potamotrygon motoro e P. falkn
eri
) e outras espécies locais,
além de espécies exóticas introduzidas posteriormente, como o tucunaré (
Cichla
ocellaris
) e a corvina (Plagioscion squamosissimus), passaram a desempenhar o
papel de espécies invasoras, provocando impactos de diferentes dimensões sobre a
fauna aquática nativa
,
que ainda necessitam ser
em
mais estudados e
dimensionado
s
(
BRASIL, 1998; VILELA
et al.
2004).
A captura de algumas espécies de raias já foi registrada nas proximidades
da Usina Hidrelétrica de Jupiá (foz do rio Tietê no Estado de São Paulo) e na regi
ão
do baixo Paranapanema (
BRI
TTO, 2004)
e em Três Lagoas
(
Estado do Mato Grosso
do Sul), sendo as espécies Potamotrygon motoro e P. falkneri as de maior
ocorrência (GARRONE, 200
7).
Nes
se período recente, o rio Paraná vem sendo intensamente modificado
pela ação do homem, o que tem determinado sérias alterações na composição
original da fauna e da flora desse ambiente. Dessa forma, estudos sobre o papel
desempenhado por espécies invasoras como as raias, tornam-
se
relevantes, pois as
informação obtidas possibilitariam a implantação de sistemas adequados de manejo
des
ses ecossistemas e a própria preservação das espécies originais. Assim, o
conhecimento sobre os potamotrigonídeos poderia ser utilizado como ferramenta
importante para a adoção de medidas de conservação no alto curso do rio Pa
raná,
com o desenvolvimento das metodologias necessárias nesses programas (SMITH &
MARCIANO
, 2000).
Na bacia do rio Paraná, a espécie
Potamotrygon
motoro
(F
igura
1
),
popularmente conhecida como “arraia-
de
-fogo” ou “arraia-
pintada”,
é atualmente
considerada a mais abundante e amplamente distribuída, enquanto P. falkneri
,
(Figura 2) espécie de ocorrência também comum
e
denominada de “a
rraia
b
ranca”
ou “a
rraia
clarinha”, também vem sendo capturada em componentes hidrográficos
dos Estados do Paraná, Mato Grosso do Sul (
CÂNDIDO
-
SILVA,
2006) e Estado de
São Paulo (BRITTO, 2004;
GARRONE, 2007).
4
Figura 1 – Exemplar da espécie Potamotrygon motoro (Fêmea) de ocorrência na
bacia superior do rio Paraná
.
Figura
2 – Exemplar da espécie Potamotrygon falkneri (Macho) de ocorrência na
bacia superior do rio Paraná.
10
cm
10 cm
5
As
raias de água doce são peixes com pouca importância alimentar no
Brasil
. No entanto, o
seu
comércio
como
peixes orn
amentais
tem promovido um
expressivo movimento na comercialização d
as
espécies
desse grupo, sendo
exportadas anualmente cerca de 30.000 unidades de
raias (
ARAÚJO,
1999).
Seis espécies do gênero
Potamotrygon
(família Potamotrygonidae) são
comercializadas regularmente como pe
ixe
s ornamentais no estado do Amazonas:
P.
motoro; P. orbignyi; P. schroederi; P. leopoldi; P. henlei
e
Potamotrygon
sp
.
(
ARAÚJO,
1998). Os principais mercados para as espécies citadas são os
Estados
Unidos, Japão e Taiwan, onde são vendidas em lojas espec
ializadas
,
usando um
sistema de código denominado sistema - P (“P-number”). Neste
sistema
, cada
código representa geralmente um padrão de coloração e não uma espécie nominal
(ARAÚJO
, 1999). Estima-se que a demanda internacional de exportação d
es
s
as
espécie
s seja de 50.000 unidades/ano, tendo países como a Venezuela, Equador e
Colômbia participação
cada vez mais significativa
nesse comércio (
ARAÚJO,
1999).
1.2
BREVE HISTÓRICO DA CITOGENÉTICA DE PEIXES COM ÊNFASE EM
ELASMOBRÂNQUIOS
Nas
últimas décadas vários trabalhos vêm sendo d
esenvolvido
s
em
diferentes grupos de peixes
utilizando
diferentes técnicas c
itogen
é
tica
s como
coloração com Giemsa, localização de regiões organizadoras de nucléolo (RONs) e
bandamento C. A
lia
da
s a estas técnicas de citogené
tica
clássica, as análises
citogenéticas
molecular
es através da técnica de hibridação in situ, levaram a
um
avanço
na caracterização citogenética de muitas espécies no grupo dos peixes.
Através das técnicas de obtenção de cromossomos mitóticos,
inicialmente
adaptadas e descritas por
BERTOLLO
et al. (1978) e por
FORESTI
et al. (1981;
1993),
tornou
-se possível a implementação de técnicas de bandeamento
cromossômicos em peixes, possibilitando identificar alterações numéricas e
estruturais
e possíveis relações evolutivas entre os
diferentes
grupos de espécies de
peixes.
6
Estudos citogenéticos recentes vêm demonstrando a enorme variabilidade
cariotípica dos peixes, tanto em relação ao número de cromossomos quanto à
morfologia. Segu
ndo
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. (2000b), dentre as espécies de
peixes neotropicais já estudadas citogeneticamente, o número cromossômico pode
variar de 2n=20 à 2n=134, podendo ser identificados tanto grupos de espécies com
cariótipos bastante conservados, quanto grupos com cariótipos bastante variáveis.
Dentre os peixes neotropicais, cerca de 706 espécies já foram cariotipadas
(
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al
. 2000). Porém, levando
-
se em consideração que o número
estimado de espécies de peixes para a região Neotropical pode chegar a 5000
(OLIVEIRA et al. 2006), estudos citogenéticos adicionais devem ser realizados
visando maior conhecimento e caracterização da ictiofauna desta região.
Os
Elasmobrânquios
constituem provavelmente a classe de vertebrados
menos estudada do ponto de vista da evolução sistemática
(ROCCO
et al. 2004).
Apesar dos estudos citogenéticos nos peixes terem aumentado consideravelmente
nos últimos tempos, os Chondrichthyes permanecem entre os
grupos
menos
estudados, havendo poucos dados citogenéticos em peixes cartilaginosos, se
considerarmos o fato de ser conhecida a morfologia cariotípica de apenas 6% das
cerca de 1.100 espécies desse grupo viventes atualmente (STINGO & ROCCO,
2001).
Os dados citogenéticos sobre
raias
marinhas indicam a existência de uma
variação no número diplóide de 2n=28 em Narcine brasilians (DONAHUE, 1974
)
à
2n=104 em
Raja
meerdervoortei
(
MAKINO, 1937
)
.
Já os
poucos
dados citogenéticos
encontrados na literatura sobre raias de água doce da família Potamotrygonidae
indicam que as espécie
s
Potamotrygon motoro
e
P. orbignyi possuem o mesmo
número diplóide de 2n=66 cromossomos, enquanto a espécie Paratrygon aiereba
apresenta 2n=90 cromossomos
(VALENTIN
et al
.
2006)
(Tabela 1).
Tabela
1
– Sumário das informações citogenéticas disponíveis para espécies de
raias de água salgada e água doce.
7
Espécies
2N
Fórmula Cromossômica
N. F.
Referência
Torpedinidae
Torpedo ocellata
66
12M/SM+54A
78
Stingo, 197
9
Torpedo marmorata
86
86A
86
Stingo, 197
9
Torpedo californica
82
4M/SM+78ST
/A
86
Ida
et al.
1985
Torpedo tokionis
86
86A
86
Asahida & Ida,1990
Narcinidae
Narcines brasiliensis
28
28M/SM
56
Donahue, 1974
Myliobatidae
Myliobatis
Áquila
52
32M/SM+20A
84
Stingo & Capriglione
1986
Potamotrygon motoro
66
18M+12SM+10ST+26A
106
Valentim, F.C.S.
et
al
.
2006
Potamotrygon orbignyi
66
22M+10ST+8ST+26A
106
Valentim, F.C.S.
et
al
. 2006
Paratrygon aireba
90
4M+2SM+10ST
+74A
106
Valentim, F.C.S.
et
al
. 2006
Dasyatidae
Taeniura lymma
64
38M/
SM+26A
102
Rocco
et al.
,2002
a
Dasyatis akajei
72
34M/SM+38A
106
Asahida
et al.
1987
Dasyatis americana
78
9M/SM+69ST/A
87
Asahida
et al.
1993
Dasyatis matsubari
64
40M/SM+24ST/A
104
Asahida
et al.
1990
Dasyatis
Sabina
68
28M/SM+40ST/
A
96
Donahue, 1974
Dasyatis sayi
68
34M/SM+34ST/A
102
Donahue, 1974
Dasyatis
violácea
58
30M/SM+28ST/A
88
Olmo
et al.
1982
Rhinobatidae
Rhinobatos products
92
44M/SM+48A
136
Schwartz and
Maddock, 1986
Rajidae
Raja asterias
98
6M/SM+92A
104
Stingo and
Capriglione, 1986
Raja polystigma
96
18M/SM+78ST/A
114
Rocco
et al.
2006
Raja batis
98
98A
98
Nygren
et al
. 1971
Raja clavata
98
4M/SM+94ST/A
102
Stingo, 1979
Raja eglanteria
58
30M/SM+28ST/A
88
Schwartz
and
Maddock, 1986
Raja radiata
98
98ST/A
98
Nygren
et al.
1971
8
Estudos recentes sobre a localização das regi
ões
organizadoras de
nucléolo
s com o uso da técnica de impregnação pelo nitrato de Prata evidenciaram
Ag
-RONs múltiplas e terminais n
as
espécies P
otamotrygon
m
otoro
(7
cromossomos)
,
Potamotrygon
orbignyi (8 cromossomos) e
Paratrygon
aiereba
(7
cromossomos)
(
VALENTIM
et al. 2006). A mesma característica já havia sido
e
videnciada em outras espécies de raias
,
como
T
orpedo
ocellata
e
T. mar
morata
por
STINGO
et al. (
1995)
e ROCCO et al. (2002b), indicando que esta poderia ser uma
característica específica e conservada das espécies pertencentes à superordem
Batoidea (
ROCCO
et al
.
2004).
Um dos mais efetivos métodos de estudo
citogenético
de pe
ixes
cartilaginosos
tem sido a combinação de técnicas clássicas de banda
mento
cromoss
ômico,
técnicas citogenéticas moleculares e hibridação in situ
(ROCCO
et
al
. 2006). Entre os peixes, tem sido verificado que, de modo bastante generalizado,
os genes para
RNAr
18S e
RNAr
5S podem ser localizados em mais de um par de
cromossomos (
SCHMID
et al. 1987;
MARTINS
& GALETTI, 1999; ALME
IDA
-
TOLEDO
et al
. 200
0b
; ROCCO
et al
.
2004, 200
6)
.
1.3
DNAS RIBOSSÔMICOS 45
S E 5S
Em eucariotos superiores, os genes para RNA ribossômicos (RNAr)
encontram
-se organizados como duas famílias multigênicas distintas, representadas
pelo DNAr 45S e pelo DNAr 5S, compostas por unidades repetidas “in tandem” com
centenas a milhares de cópias (
LONG & DAVID,
1980).
O DNAr 45S consiste de unidades transcricionais que codificam os RNAs
ribossômicos 18S, 5.8S e 28S separadas por espaçadores internos transcritos (ITS1
e ITS2) e flanqueadas por espaçadores externos transcritos (ETS1 e ETS2) e não-
transcritos (NTS) (LONG & DAVID, 1980). Múltiplas cópias destas unidades
correspondem às regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Diversos trabalhos
têm demonstrado que várias espécies de peixes apresentam somente dois
cromossomos portadores de regiões organizadoras de nucléolos (
GALETTI
et al.
9
1984;
VENE
RE & GALETTI, 1989; PAULS & BERTOLLO, 1990; MARTINS &
GALETTI, 1997; entre outros), enquanto outras possuem múltiplos cromossomos
portadores de RONs
(GALETTI
et al
.
1985; FORESTI et al. 1989; SOLA et al
.
1990,
1992; WASKO & GALETT
I, 1999).
Como as regiões organizadoras de nucléolos podem constituir excelentes
marcadores citogenéticos em peixes (
GALETTI
et al. 1984), estas têm sido
comumente detectadas em várias espécies utilizando a técnica de coloração com
nitrato de Prata (Ag-RON) e com os fluorocromos GC específicos mitramicina (MM)
e cromomicina A
3
(CMA
3
) (AMEMIYA & GOLD,
1988;
PHILLIPS
et al. 1988;
GALETTI & RASCH,
1993;
SOLA
et al. 1997). A impregnação com nitrato de Prata
tem sido a técnica mais utilizada em estudos de localização das regiões
organiz
adoras de nucléolos, embora esta evidencie somente RONs
transcricionalmente ativas (
HOFGATNER
et al
. 1979;
HOWELL & BLACK, 1980). Os
fluorocromos MM e CMA
3
, ao contrário, geralmente detectam tanto RONs ativas
quanto inativas em peixes e anfíbios (
MAYR
et al. 1986; SCHMID & GUTTENBACH,
1988;
PHILLIPS & HARTLEY, 1988), provavelmente como consequência do maior
conteúdo de bases GC no DNAr (SCHMID & GUTTENBACH, 1988). Mais
recentemente, a localização das regiões organizadoras de nucléolos tem sido
confirmada através de hibridação
in
situ
utilizando sondas de RNAr ou de DNAr 18S
e DNAr 28S em cromossomos fixados de vários vertebrados, incluindo anfíbios,
mamíferos (LONG & DAVID, 1980) e algumas espécies de peixes
(PENDÁS
et al
.
1994a;
CASTRO
et al
. 1996;
VIÑAS
et
al
. 1996;
ABUÍN
et al
. 1996;
MARTÍNEZ
et al.
1996;
GORNUNG
et al. 1997, MARTINS &
GALETTI,
1998;
FISCHER
et al. 2000
entre outros), uma vez que as regiões ricas em G-C, detectadas com MM e CMA
3
nem sempre identificam apenas regiões organizadoras de nucléo
los.
O DNA ribossômico 5S, ao contrário do DNAr 45S, não está relacionado à
formação dos nucléolos (LONG & DAVID, 1980). Este apresenta repetições que
consistem de uma sequência codificante de 120 pares de bases e de um espaçador
não
-transcrito (NTS) que é comumente variável em sua sequência nucleotídica
devido
a inserções/deleções, mini-repetições e pseudogenes (LONG & DAVID,
10
1980). Embora a sequência nucleotídica do gene RNAr 5S seja altamente
conservada mesmo entre espécies não relacionadas, as variações nos NTSs
geralmente são espécie-específicas (
SUZUKI
et al.
1994;
PENDÁS
et al. 1995) e
têm sido utilizadas com sucesso em estudos evolutivos (S
UZUKI
et al.
1994;
UDOVICIC
et al. 1995; CRONN et al. 1996;
SAJDAK
et al. 1998;
CRISP
et al. 1999;
BAKER
et al
.
2000
).
Em vários organismos, os genes RNAr 5S estão localizados em um único
par cromossômico, enquanto as regiões organizadoras de nucléolos geralmente
encontram
-se presentes em múltiplos cromossomos (
SUZUKI
et al. 1996), e
m
anfíbios (
SCHMID
et al.
1987;
LUCCHINI
et al. 1993) e algumas espécies de peixes
(
MORÁN
et al
.
1996;
MURAKAMI & FUJITANI,
1998;
MARTINS & GALETTI,
1999,
2000;
WASKO
et al. 2000 entre outros). Além disso, em peixes, os locos de DNAr
45S e DNAr 5S podem assumir uma organização sintênica no mesmo cromossomo
(
PENDÁS
et al.
1994;
MORÁN
et al.
1996
, ALMEIDA-
TOLEDO
et al. 2002), ou
podem estar localizados em distintos pares cromossômicos (
MARTÍNEZ
et al. 1996;
SAJDAK
at al.
1998;
MARTINS & GALETTI,
1999;
BORN & BERTOLLO, 2000), o
que parece ser a característica mais comumente observada entre os vertebrados
(
SUZUKI
et al
. 1996).
A localização cromossômica do DNAr 5S também tem sido reportada em
muitas
espécies de peixes (
PENDÁS
et al
.
1994;
MORÁN
et al.
1996;
MARTÍNEZ
et
al
. 1996;
FUJIWARA
et al. 1998;
SAJDAK
et al. 1998; MARTINS & GALETTI, 1999,
2001;
MURAKAMI & FUJITANI, 1998;
GORNUNG
et al.
2000;
ROCCO
et al. 2004;
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al.
2002
),
bem como as características da sua organização
molecular (
MARTINS
et al.
2000;
MESSIAS
et al.
2003;
ROCCO
et al.
2004;
MARTINS & WASKO, 2004;
PICHIRI
et al.
2006
;
PASO
LINI
et al.
2006
;
MORESCALCHI
et al. 2008; entre outros). Assim, a ampliação de estudos
envolvendo estes marcadores em espécies de peixes neotropicais mostra-se de
grande interesse
, tendo e
m vista a diversidade de espécies existentes nesta região.
11
1.4 EVOLUÇÃO DE MECANISMOS CROMOSSÔMICOS DE DETERMINAÇÃO
SEXUAL
Os mecanismos de determinação sexual são variados e têm se mostrado
bastante dinâmicos evolutivamente, provavelmente tendo se originados múltiplas
vezes independentemente nos principais grupos de organismos
(CHALESWORTH,
199
1;
VALLENDER & LAHN, 2006). Sobretudo nos grupos de vertebrados mais
primitivos fica evidente a variabilidade evolutiva da determinação sexual, dada a
ocorrência
de
diferentes sistemas múltiplos e formas de determinação sexual
(BULL, 1980; EGGERT, 2004; VOLFF, 2005).
A ocorrência de cromossomos morfologicamente diferenciados na
determinação sexual é relativamente comum em animais e rara em grupos vegetais.
Em mamíferos, as fêmeas são homogaméticas por apresentarem duas cópias do
cromossomo X, ao passo que os machos são heterogaméticos por possuírem um
cromossomo X e um Y. Em aves, de modo geral, as fêmeas são heterogaméticas,
portadoras de cromossomos designados Z e W e os machos são homogaméticos,
portadores de dois cromossomos Z. Em nematóides, as fêmeas são XX e os machos
apresentam apenas uma cópia do cromossomo sexual X, sendo este sistema
designado X0 (RICE, 1996).
Peixes é o grupo mais diverso de vertebrados e é também o que possui
maior variedade de mecanismos de determinação sexual (SCHARTL, 2004). A forma
mais comum de reprodução sexuada em vertebrados envolve a produção de apenas
um tipo de gameta por indivíduo, com a presença de dois sexos separados
(gono
corismo), mas mesmo o hermafroditismo, raro nos demais vertebrados, é
relativamente frequente em peixes, tendo sido observado em vinte e cinco famílias
(DEVLIN & NAGAHAMA, 2002). O sexo é definido por uma ampla gama de
mecanismos ambientais e/ou genéticos de determinação sexual (DEVLIN &
NAGAHAMA, 2002). A determinação sexual ambiental pode depender de fatores
físicos que definem o sexo já nas primeiras fases do desenvolvimento (como a
temperatura ou pH) (JANZEN & PHILLIPS, 2006) ou mesmo de circunstâncias
12
sociais, como o estabelecimento de relações de dominância advindas do tamanho
na época de maturação sexual (FRANCIS & BARLOW, 1993).
Em alguns grupos animais, notadamente em espécies de peixes, são
observados mais de uma par de cromossomos sexuais, indicando a existência de
mecanismos denominados múltiplos de determinação sexual, os quais acredita-
se
que sejam derivados dos sistemas simples XX/XY, ZZ/ZW ou XX/X0 (BULL, 1980;
MOREIRA
-
FILHO
et al
. 1993).
Tem sido postulada a existência de dois mecanismos básicos no processo
de origem e desenvolvimento de cromossomos sexuais diferenciados em
vertebrados, a partir de cromossomos indiferenciados (BEÇAK e BEÇAK, 1969). Um
primeiro, no qual a diferenciação desses cromossomos está relacionada
primariamente à ocorrência de alterações cromossômicos estruturais (OHNO, 1967;
BEÇAK e BEÇAK, 1969; MENGDEN e STOCK, 1980; BEÇAK, 1983) e um outro, no
qual a diferenciação é resultado de um processo inicial de heterocromatinização em
um dos cromossomos homólogos do par sexual (
SCHIMID
et al. 1979; SCHIMID,
1980).
Em ambos os casos, esses eventos evitariam, ou pelo menos restringiriam a
ocorrência da permuta entre os homólogos ou entre parte deles, o que constitui uma
etapa essencial no processo de diferenciação dos cromossomos envolvidos na
determinação sexual.
1.5
CROMOSSOMOS SEXUAIS EM PEIXES NEOTROPICAIS
Os peixes representam um grupo extremamente heterogêneo quanto à
determinação do sexo, apresentando desde determinação sexual em nível gênico,
sem a distinção de cromossomos diferenciados, até a presença de cromossomos
heteromórficos, representando complexos sistemas de determinação sexual
(MORESCALCHI, 1992). A grande diversidade de sistemas cromossômicos
relacionados ao sexo pode ser observada em estudos de peixes neotropicais, onde
mais
de
40 casos de cromossomos heteromórficos identificados, nada menos que 8
sistemas diferentes puderam ser detectados, ZZ/Z0, XX/X0, ZZ/ZW, XX/XY,
13
Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
/Z
1
Z
2
W
1
W
1
, ZZ/ZW
1
W
2
,
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y E XX/XY
1
Y
2
(MOREIRA-
FILHO
et
al
. 1993; ALMEIDA-
TOL
EDO
et al. 2000
b;
ALMEIDA-TOLEDO e FORESTI, 2001
;
CENTOFANTE
et al.
2002; ALVES
et a
l.
2006;
OLIVEIRA
et al
.
2006).
O número de espécies que apresentam cromossomos sexuais
diferenciados tem aumentado significativamente nos últimos anos em decorrência
tanto
de um maior número de estudos citogenéticos em espécies neotropicais,
quanto ao emprego de técnicas de bandamento cromossômico que permitem uma
melhor identificação dos cromossomos homólogos.
Na literatura, os relatos de alterações cromossômicas estrutur
ais
envolvidas na formação de cromossomos sexuais são menos freqüentes que as
ocorrências de eventos de heterocromatinização cromossômica.
Mecanismos primários de diferenciação morfológica de cromossomos
sexuais em serpentes, segundo BEÇAK (1983), estariam relacionados a inversões
pericêntricas, associadas ou não a eventos de deleção ou duplicação. MENGDEN &
STOCK (1980) identificaram em Acrantophis dumereli, através da aplicação da
técnica de Bandamento G, um sistema ZZ/ZW no qual o W corresponde a um
crom
ossomo subtelocêntrico que poderia ter surgido de uma inversão pericêntrica
em um dos elementos de um par de cromossomos metacêntricos homomórficos
ancestral.
Em peixes encontramos algumas espécies da família Loricariidae que
apresentam o sistema de determinação sexual ZZ/ZW e processos similares na
formação do cromossomo W. Em Loricariichthys platymetopon, o surgimento do
cromossomo W parece ter sido decorrente de uma inversão pericêntrica em um dos
cromossomos de um par homomórfico (SCAVONE & JULIO Jr., 1995). Em
Hypostomus sp., o W é um cromossomo metacêntrico, menor que o cromossomo Z
(acrocêntrico), podendo ter-se originado a partir da ocorrência do mesmo evento
anterior, seguido da deleção de um grande bloco de heterocromatina constitutiva
(ARTONI
et
al
. 1998).
Exemplos da ocorrência de processos de heterocromatinização na
formação de cromossomos sexuais são relativamente freqüentes nos peixes.
14
Mecanismos nos quais a diferenciação sexual se dá pela presença de
heterocromatina constitutiva no cromossomo Y ou W compõem a maioria dos casos
nesse grupo animal. Entretanto, alguns estudos relatam em sistemas XX/XY, a
presença de blocos de heterocromatina no cromossomo X e sua ausência no Y,
como observado em Salvelinus namaycush (PHILLIPS & IHSSEN, 1985), em
Hoplias malabaricus (BORN e BERTOLLO, 2000) e em Eigenmannia virescens
(ALMEIDA
-
TOLEDO
et al
.
2001).
Os sistemas múltiplos de determinação sexual provavelmente se
originaram a partir de sistemas simples. Os mecanismo envolvidos em tal processo
seriam a ocorrência de translocação recíproca envolvendo um dos cromossomos
sexuais e um autossomo e a ocorrência de um rearranjo cromossômico denominado
translocação Robertsoniana (GUERRA, 1988).
Casos de
rearranjos
cromossômica resultando em sistemas múltiplos do
ti
po X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y foram descritos em uma espécie de Cyprinodontidae (UYENO
& MILLER, 1971) em uma espécie de Goobeidae (UYENO & MILLER, 1972), em
Hoplias
sp
. (Erythrinidae) (BERTOLLO et al. 1983), em Eigenmania sp. 2
(Sternopygidae) (ALMEIDA
-
TOLEDO
et al
.
1984).
A diversidade e a origem dos sistemas de cromossomos sexuais em
peixes neotropicais têm sido geralmente associadas com a distribuição geográfica
das espécies e com eventos geomórficos da América do Sul.
(MOREIRA
-
FILHO
et
al.
1980; ALMEIDA-
TOLEDO
et
al
. 2000b; ARTONI et al. 2001; CENTOFANTE et al
.
2001).
A Tabela 2, apesar de não caracterizar uma revisão completa das
ocorrências de cromossomos sexuais em peixes Neotropicais, permite uma
visualização geral da grande diversidade de sist
emas existentes e
ntre os peixes.
15
Tabela 2
-
Sistemas
c
romossômicos
s
exuais descritos em peixes Neotropicais.
ORDEM/FAMÍLIA/ESPÉCIE
2n
SISTEMA
REF.
F M
CROMOSSÔMICO
CHARACIFORMES
Anostomidae
Leporinus elongatus
54
54
ZZ/ZW
1,2
Leporinus obtusidens
54
54
ZZ/ZW
1,2
Leporinus reinhardti
54
54
ZZ/ZW
1,2
Leporinus macrocephalus
54
54
ZZ/ZW
2
Leporinus trifasciatus
54
54
ZZ/ZW
3, 4
Leporinus conirostris
54
54
ZZ/ZW
4
Leporinus
cf.
elongatus
54
54
ZZ/ZW
1
Leporinus
cf.
brunneus
54
54
ZZ/ZW
3
Leporinu
s
sp.
54
54
ZZ/ZW
5
Characidae
Triportheus albus
52
52
ZZ/ZW
6
Triportheus signatus
52
52
ZZ/ZW
6
Triportheus elongatus
52
52
ZZ/ZW
6
Triportheus
cf.
elongatus
52
52
ZZ/ZW
7, 8
Triportheus guentheri
52
52
ZZ/ZW
7, 8, 9
Triportheus flavus
52
52
ZZ/ZW
6
Triportheus paranense
(MT)
52
52
ZZ/ZW
7, 8
Triportheus paranense
(MS)
52
52
ZZ/ZW
7, 9
Triportheus paranense
(Argentina)
52
52
ZZ/ZW
10
Gasteropelecidae
Thoracocharax
cf.
stellatus
52
52
ZZ
-
ZW
11
Crenuchidae
Characidium
sp. aff.
C.
gomesi
50
50
ZZ/ZW
12
Characidium
sp. cf.
C. alipioi
50
50
ZZ/ZW
13
Characidium gomesi
50
50
ZZ/ZW
14
Erythrinidae
Erythrinus erythrinus
52
51
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
15, 16
Hoplias
cf.
lacerdae
(rio Pardo)
50
50
XX/XY
17
Hoplias
cf.
malabaricus
(Vale R.
Doce)
42
42
XX/XY
18, 19
Hoplias
cf.
malabaricus
(rio Ribeira)
42
42
XX/XY
18
Hoplias
cf.
malabaricus
(Alto Parana)
40
39
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
20, 21, 22
Hoplias
cf.
malabaricus
(rio Aripuana)
40
41
XX/XY
1
Y
2
20
Parodontidae
Apareiodon affinis
55
54
ZZ/Z
W
1
W
2
23,24
Parodon hilarii
54
54
ZZ/ZW
25, 26
Parodon
sp.
54
54
ZZ/ZW
27
Curimatidae
Potam
orhina squamoralevis
102
102
ZZ/ZW
28
Prochilodontidae
Semaprochilodus taeniurus
54
54
ZZ/ZW
29
Cheirodontidae
Cheirodon notomelas
52
52
ZZ/ZW
52
Cheirodon sp.
52
52
ZZ/ZW
52
Odontostilbe cf. microcephala
52
52
ZZ/ZW
30
SILURIFORMES
Loricariidae
16
Tabela 2
-
Sistemas c
romossômicos
s
exuais d
escritos em peixes Neotropicais.
(Continuação)
ORDEM/FAMÍLIA/ESPÉCIE
2n
SISTEMA
REF.
F M
CROMOSSÔMICO
Hisonotus
sp. A
54
54
ZZ/ZW
31
Hypostomus ancistroides
68
68
XX/XY
32
Hypostomus
sp.
64
64
ZZ/ZW
33
Hvpostomus macrops
68
68
XX/XY
32
Microlepdogaster leucofrenatus
54
54
ZZ/ZW
34
Pseudotocinclus tietensis
54
54
XX/XY
35
Loricariicht
hys platymetopon
54
54
ZZ/ZW
36
Ancistrus
sp.
40
39
XX/X0
37
Doradidae
Opsodoras
sp.
58
58
ZZ/ZW
39, 3
Pimelodidae
Steindachneridion
sp.
56
56
XX/XY
40
Pimelodella
sp.
46
46
XX/XY
41
GYMNOTIFORMES
Sternopygidae
Eigenmannia viresce
ns
XX/XY
42
Eigenmannia virescens
38
38
ZZ/ZW
43
Eigenmannia
sp.
32
31
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
44, 45
Brachyhypopomus pinnicaudatus
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
53
Hypopomus
sp.
42
41
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
46
CYPRINODONTIFORMES
Cyprinodontidae
Mexican anonymous speci
es
48
47
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
47
Goodeidae
Mexican anonymous species
48
46
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
48
Poeciliidae
Poecilia reticulata
46
46
XX/XY
49
Gambusia puncticulata
48
48
ZZ/ZW
50
PERCIFORMES
Gobiidae
Awaous strigatus
46
45
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
54
Eleotridae
Dormitator maculatus
48
48
XX/XY
55
CLUPEIFORMES
Clupeidae
Brevoortia aurea
46
45
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
51
Observação: Tabela adaptada de ALMEIDA
-
TOLEDO
et al
.
(2001) e CENTOFANTE
et al
.
(2002).
Referências:
1. MOLINA
et al.
(1998); 2. GAL
ETTI Jr. e FORESTI (1987); 3.
VENERE
et al
.
(1998); 4. GALETTI Jr.
et al.
(1995); 5. VENERE et al. (2004); 6. FALCÃO (1988); 7. ARTONI et al. (2001); 8. ARTONI (1999); 9. BERTOLLO e
CAVALLARO (1992); 10. SANCHEZ et al. (1999); 11. CARVALHO (2001); 12. MA
ISTRO
et al. (1998); 13.
CENTOFANTE et al. (2003); 14. CENTOFANTE et al. (2001); 15. MOLINA e BERTOLLO (1993); 16. SILVESTRO e
MARGARIDO (2001); 17. BERTOLLO et al. (1978); 18. BERTOLLO et al. (1979); 19. BORN e BERTOLLO (2000); 20.
BERTOLLO
et al. (1983); 21. BERTOLLO et al
.
(1997); 22. BERTOLLO e MESTRINER (1998); 23. MOREIRA-
FILHO
et
al.
(1980); 24. JESUS (1996); JESUS et al. (2000); 25. MOREIRA-
FILHO
et al. (1993); 26. VICENTE (2001); 27.
CENTOFANTE
et al. (2002); 28. NAVARRETE e JULIO Jr. (1996); 29. FELDBERG et al. (1987); 30. SATO e MARTINS-
SANTOS (1999); 31. ANDREATA (2002); 32. MICHELE et al. (1997); 33. ARTONI et al. (1998); 34. ANDREATA et a/.
(1993); 35. ANDREATA et al. (1992); 36. SCAVONE e JULIO Jr. (1995); 37. ALVES et al. (2006); 38. VISSO
TO
et al
.
(199
9); 39. VENERE e GALETTI Jr. (1998); 40. SWARÇA et al. (2003); 41. DlAS e FORESTI (1993); 42. ALMEIDA-
TOLEDO
et al.
(1988); 43. FORESTI (1987); 44. ALMEIDA
-
TOLEDO
et al.
(1984); 45. ALMEIDA
-
TOLEDO
et al.
(2000
b
);
46. ALMEIDA-
TOLEDO
et al. (1995); 47. UYENO e MILLER (1971); 48. YENO e MILLER (1972); 49. NANDA et al.
(1990); 50. RAB (1984); 51.
BRUM
et al
.
(1992); 52. NISHIYAMA e MARTINS-SANTOS (1976); 53. ALMEIDA-
TOLEDO
(1998); 54. SOUZA (1998); 55. OLIVEIRA e ALMEIDA
-
TOLEDO (1985).
bjetivos
Rio P
araná
–
Próximo ao município de Ilha Solteira
-
SP.
17
2
OBJETIVOS
Considerando
-se a relativa insuficiência de dados citogenéticos de
representantes da família Potamotrygonidae e tendo em vista que as informações
geradas nesta área poderiam servir de base para estudos populacionais e do
processo de colonização desenvolvido pelas espécies deste grupo, o presente
trabalho visa:
a) caracterizar citogeneticamente exemplares das espécies atualmente
identificadas como P. motoro e P. falkneri, de ocorrência recente em
componentes
da bacia hidrográfica superior do rio Paraná, identificando seus números diplóides
e fórmulas cariotípicas;
b)
identificar o sistema de cromossomo
s
s
exua
is
em
P
. motoro
e
P.
falkneri;
c) identificar os padrões de distribuiç
ão
de heterocromatina constitutiva (Bandas C)
nos cromossomos des
s
as espécies;
d) estabelecer a distribuição das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) nos
cariótipos dos representantes dessas espécies, através da técnica de impregnação
com nitrato de Prata (técnica Ag-
RON);
e) identificar regiões ricas em G
-
C
com o uso
do fluorocromo CMA
3
;
f)
localizar
os sítios de DNAr 5S e
DNA
r
18S
nos cromossomos do complemento
cariotípico das espécies com o uso da técnica de hibridação “in situ” fluorescente
(FISH);
g) caracterizar a organização genômica do DNAr 5S através de clonagem
e
sequênciamento, dos fragmentos moleculares obtidos;
h) contribuir com informações cariotípicas para a taxonomia desse grupo, bem
como para o conhecimento dos mecanismos envolvidos no processo de
diversificação, no sentido de esclarecer possíveis relações evolutivas entre as
espécies.
17
aterial e étodos
Pescador Gilmar, coletando raias com tarrafa, próximo ao
município de Porto Rico
-
PR.
18
3 MATERIAIS
Foram
estudados exemplares em diferentes amostragens das espécies
Potamotryg
on motoro
e
P. falkneri
na bacia superior do rio Paraná.
Os exemplares
coletado
s
foram submetidos aos procedimentos citogen
éticos
para obtenção de preparações
cromossômicas destas espécies. Sua posição taxonômica, localidade de coleta, o
número e sexo dos
exemplares analisados são mostrados na Tabela
3.
Após o processamento, todos os exemplares coletados foram fixados em
formol 4%, conservados em álcool 70% e depositados na coleção de peixes do
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (LBP), Instituto de Biociências,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil.
Tabela
3 - Espécies do gênero
Potamotrygon
utilizadas
durante
as análises
citogenéticas
e locais de coleta.
Gênero/Espécie
Número LBP
Número de
espécimes
/
Localidade
Latitude/Longitude
Potamotrygon
P.
motoro
5203
/
6716
10
/
13
rio Paraná, Alto Paraná, Porto Rico
-
PR
S 22° 47’42.4”
W 53° 20’29.7”
7503
3 / 4
rio Paraná, Alto Paraná, Ilha Solteira
-
SP
S
20
°
47
’42.4”
W 5
1
°
3
8’29.7”
P. falkner
i
5202
/
6717
12 /14
rio Paraná, Alto Paraná, Porto Rico
-
PR
S 22° 47’42.4”
W 53° 20’29.7”
7503
3/5
rio Paraná, Alto Paraná, Ilha Solteira
-
SP
S 20° 47’42.4”
W 51° 38’29.7”
3.1
ÁREA DE ESTUDO
No presente trabalho, as coletas foram realizadas no alto curso do r
io
Paraná
(Figuras 3 e 4), nas regiões próxim
as
ao município de Porto Rico-
PR
(22 º47’
de latitude e 53º 20’ de longitude) (F
igura
5) e
na
região do reservatório da Usina
Hidrelétrica Engenheiro Souza Dia (UHE Jupiá),
situada
na divisa entre os Estados de
São Paulo e Mato Grosso do Sul (20º 47’ de latitude e 51º38’ de longitude), próxim
as
ao município de
Ilha Solteira
(SP)
(Figura 6).
19
As esp
écies
foram coletadas utilizando fisga (arpão), espinhel e tarrafa.
Indivíduos maiores,
foram
frequentemente
capturados pelos espinhéis, nos quais
foram utilizados anzóis maiores. A pesca com arpão, por motivos claros, só é
possível em ambientes rasos e co
m elevada transparência.
A falta de resultados na captura de Potamotrygonidae com redes de
espera pode ser explicada em parte pela forma do corpo dos indivíduos. O formato
discóide, com amplas expansões laterais, dificulta ou impede a passagem do animal
pe
la malha. Além disto, estas raias têm potencial para realizar movimentos laterais
sobre um eixo vertical quando tocam uma rede. Desta forma, somente redes com
grande distância entre nós poderiam capturar indivíduos pequenos, ainda assim com
eficácia questi
onável.
Após serem coletados, os animais foram mantidos em piscinas aeradas
até
o momento de serem sacrificados para coleta do material de análise. Os
tecidos utilizados para obtenção de preparações de cromossomos metafásicos
foram
rim, fígado, brânquias
,
baço
e gônadas. Estudos anteriores demonstraram
ser o baço o órgão com maior índice
mitótico
(
VALENTIM
et al. 2006). Os
exemplares utilizados
foram
fixados em formol a 10%
,
posteriormente
conservados em álcool etílico a 70%, fotografados para serem
identif
icados pelo
Prof. Dr. Marcelo Carvalho
e
depositados na coleção de peixes do Laboratório de
Biologia e Genética de Peixes
,
Departamento de Morfologia, Instituto de
Biociências,
Universidade Estadual Paulista
,
Botucatu
(
SP
).
20
Figura
3
–
Mapa hidrográfico
da América do Sul
,
mostrando
em destaque a bacia
do rio Paraná.
Popula
ç
ão
de
Ilha
Solteira
-
SP
Popula
ç
ão
de Porto Rico
-PR
Popula
ç
ão
de
Ilha
Solteira
-
SP
Popula
ç
ão
de Porto Rico
-PR
Figura 4 – Mapa da bacia hidrográfica do
Alto
Paraná, evidenciando os locais de
coleta das espécies
Potamotrygon
motoro
e
P
otamotrygon falk
neri
.
21
Figu
r
a
5 –
Foto
do
local de coleta no rio Paraná, no m
unicípio de P
orto Rico
-
PR
Figura
6 –
Foto do local de coleta no rio Paraná, no
m
unicípio de Ilha Solteira
-
SP.
22
4
MÉTODOS
4.
1 MÉTODOS CITOGENÉTI
COS
4.1.1 ESTIMULAÇÃO D
E MITOSES
Para obtenção de um maior índice mitótico foi utilizada uma técnica de
estimulação celular através da injeção de uma solução de fermento bioló
gico,
descrita inicialmente por
COLE
e
LEAVENS
(1971) para anfíbios e répteis, utilizada
por
LEE E ELDER
(1980) para pequenos mamíferos e
adaptada
por
OLIVEIRA
et al.
(1988a) para peixes. O procedimento utilizado foi o seguinte:
1. Preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte
proporção: 0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 7ml de água destilada.
2. Incubar a solução em banho
-
maria (40
C) por cerca de 20 minutos.
3. Injetar a solução dorso-lateralmente no peixe na proporção de 1ml por
1
00g de peso do animal.
4. Deixar o animal em aquário bem aerado por 48 ou 72 horas.
4.1.2 PREPARAÇÃO DE
CROMOSSOMOS MITÓTICO
S
A técnica utilizada para obtenção de figuras mitóticas foi a descrita por
FORESTI
et al
.
(1981
), com algumas modificações, que
consiste em:
1. Injetar, intraperitonealmente, uma solução de colchicina 0,016% na
proporção de 1ml para cada 100g de peso do animal. D
eixá
-lo nadando livremente
por 4 horas
.
2. Sacrificar o animal, retirando rins e brânquias.
3. Colocar os tecidos retirados em placa de Petri contendo cerca de 7ml
de solução hipotônica (KCl 0,075M).
4. Dissociar o material, procurando obter uma suspensão de células. Para
tal, primeiro deve-se dissociar o material com pinças de ponta fina e, depois,
homogeneizar com auxílio
de uma pipeta Pasteur.
23
5. Retirar a suspensão celular da placa de Petri e colocá
-
la em um tubo de
centrífuga. Deixar o tubo no interior de uma estufa a 37 C por 30
minutos.
6. Retirar a suspensão celular da estufa, colocar 7 gotas de fixador gelado
(metano
l e ácido acético na proporção de 3:1, respectivamente). Agitar levemente a
mistura. Deixar em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente.
7. Adicionar mais cerca de 7ml de fixador e novamente agitar a mistura.
Levar à centrífuga (1000
100rpm) por 10 m
inutos.
8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 7ml de
fixador. Centrifugar por 7 minutos a 1000
100rpm.
9. Repetir o item 8 mais uma vez.
10. Descartar o sobrenadante, ressuspender o precipitado em cerca de
1ml de fix
ador
para preparo da suspensão final. Depositar 2 a 3 gotas da suspensão
celular em lâminas de vidro limpas, deixar secar e corar com Giemsa.
11.
Dividir a suspensão celular em duas alíquotas (cerca de 500
µl),
colocando
-as em tubos de 1ml. Centrifugar (1000
100rpm por 7 minutos) uma das
alíquotas, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em metanol
absoluto. Estocar ambas as alíquotas
a
-
80
C
, para estudos posteriores.
4.1.
3
OBTENÇÃO DE CR
OMOSSOMOS MEIÓTICOS
Para estudo dos cromossomos meióticos em suas diferentes fases foram
utilizadas células gonadais masculinas, empregando-se a técnica descrita por
KLINGERMAN & BLOOM (1977), adaptada para peixes por
BERTOLLO
et al.
(1978). Após o seu sacrifício, os testículos são seccionados em fragmentos bem
pequenos e colocados em solução hipotônica de KCL a 0,075M por 30 minutos.
O material é transferido para uma cubeta contendo fixador Carnoy 3:1
(Metanol:ácido acético), por 30 minutos. Após este período o fixador é substituído e
este processo de fixação será repetido por mais duas vezes. Em seguida, o material
é guardado em refrigerador a 4 C, em tubos tipo “Eppendorf”, com fixador Carnoy
24
pa
ra ser processado posteriormente. A preparação do material para análise consiste
em retirar os fragmentos do fixador, secar em papel de filtro, colocar sobre uma
lâmina limpa e macerá-la em 1 mL de ácido acético 50%, com o auxílio de um
bastão
de vidro.
E
m seguida, a lâmina é colocada sobre uma placa aquecedora a 40°C
para secar. Posteriormente, a preparação é corada com Giemsa 5% em tampão
fosfato 0.06M e pH 6.8 por 10 minutos, lavada em água destilada e seca diretamente
ao ar. Podem ser utilizados também indivíduos colchicinizados, porém a observação
das fases da meioses será restrita as metáfases espermatogoniais, prófase I,
metáfase I e prófase e metáfase II, uma vez que a colchicina bloqueara as demais
fases.
4.1.4 COLORAÇÃO CON
VENCIONAL COM GIEMSA
As preparações cromossômicas depositadas nas lâminas passaram pelo
seguinte processo de coloração:
1. hidrolisar o material contido na lâmina em HCl 1 N a 60 C por cerca de
3 minutos;
2. corar com solução de Giemsa a 5 % em tampão fosfato (pH=6,7) por
10 m
inutos.
4.1.5 CARACTERIZAÇÃO DAS REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLO
(RONS)
Para obtenção das Regiões Organizadoras de Nucléolo, empregou-se a
té
cnica de impregnação pela prata descrita por HOWELL E BLACK (1980), com
algumas modificações. Foram utilizad
as duas soluções:
Solução A: solução coloidal reveladora: 1g de gelatina muito bem
dissolvida em 50 ml de água destilada. Acrescenta-
se 0,5 ml de ácido fórmico.
25
Solução B: solução de nitrato de prata: 1g de AgNO3 dissolvida em 2 ml
de água destilada.
Es
sas soluções, uma vez preparadas, devem ser mantidas em frascos
escuros, a 4 º C.
O procedimento para coloração das NORs é o seguinte:
1. hidrolisar o material por 3 minutos em HCl 1N a 60ºC;
2. secar as lâminas, pingar sobre o material uma gota da solução A, duas
gotas
da solução B e cobrir com lamínula;
3. deixar as lâminas sobre um suporte, no interior de um banho-maria a
60ºC por alguns minutos até que a mistura das soluções se torne marrom dourada.
4. lavar a lâmina em água destilada, deixar secar e corar com Giemsa 5%
em tampão fosfato (pH = 6,7) por 30 segundos.
4.1.6 DETECÇÃO DA HE
TEROCROMATINA CONSTI
TUTIVA (BANDA C)
Para obtenção de bandas C foi usada a técnica descrita originalmente por
SUMNER (1972), que consiste em:
1. hidrolisar as lâminas por 30 minutos em HCl 0,2N à temperatura
ambiente e lavar em água destilada;
2. passar por uma solução de Ba(OH)2 por cerca de 15 segundos e lavar
em água destilada;
3. lavar em HCl 1N a 60ºC, lavando, em seguida, em água destilada;
4. incubar por 20 minuto
s em 2xSSC (pH = 6,8), a 60ºC;
5. corar por aproximadamente 30 minutos com Giemsa a 5% em tampão
fosfato (pH = 6,7).
26
4.1.7 BANDAMENTO COM O FLUOROCROMO BASE-ESPECÍFICO
CROMOMICINA A3 (CMA3
)
Para a detecção de regiões cromossômicas ricas em pares de bases GC
foi utilizada a técnica descrita por SCHWEIZER (1976) que emprega o corante
Cromomicina A3 (CMA3). A técnica consiste em:
1.Colocar sobre as lâminas uma solução de tampão McIIvaine + MgCl2 e
cobrir com lamínula. Incubar em placa de Petri umidecida com o mesmo tampão por
10 minutos
;
2. retirar o tampão da lâmina cm pipeta Pasteur e, sem lavar as lâminas,
secar a parte de trás das mesmas
;
3. depositar as lâminas em placa de Petri, colocar 150 ml de cromomicina
(0,5 mg/ml), cobrir com lamínulas lavadas em etano no momento do uso e deixar o
conjunto dentro de uma caixa escura por 15 minutos;
4.
retirar as lamínulas em tampão McIIvaine, lavando as lâminas
vagarosamente nesta solução
;
5.
incubar as lâminas em solução methyl
-
green/hepes por 15 minutos;
6. La
var as lâminas em solução de hepes/NaCl;
7. Secar as lâminas, pingar sobre elas uma gota de glicerol com
propilgalato e depositar uma lamínula para montagem de uma lâmina permanente;
8. deixar as lâminas no escuro e na geladeira por pelo menos 20 dias
ante
s da análise;
9. observar e fotografar em microscopia de fluorescência.
4.1.8 ESTUDOS CARIO
TÍPICOS
A partir dos dados obtidos através das análises e contagens dos
cromossomos em cerca de 20 metáfases em cada indivíduo estudado, foi
estabelecido um número diplóide modal para os exemplares de cada espécie.
27
Assim sendo, as melhores metáfases, bem como as que apresentaram
uma melhor dispersão e morfologia mais nítida dos cromossomos, foram
fotografadas em fotomicroscópio óptico Olympus
,
com objetiva de
imers
ão de 100x,
do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da UNESP-
Botucatu
. As
imagens foram capturadas com o uso do programa Image Pro Plus versão 6.0 para
Windows (Media Cybernetics)
.
4.1.9
MEDIDAS
CROMOSS
Ô
MICAS
Os
cariótipos foram montados com o auxílio do programa Adobe
Photoshop versão 7.0.1. Os cromossomos tiveram sua morfologia estabelecida de
acordo com a relação de braços (RB), segundo as proporções propostas por LEVAN
et al. (1964), e foram classificados em : metacêntricos (RB de 1,00 a 1,70),
submetacêntricos (RB de 1,70 a 3,00), subtelocêntricos (RB de 3,01 a 7,00) e
acrocêntricos (RB maior que 7,00).
4.1.10 MONTAGEM DOS
CARIÓTIPOS
Feitas as medidas cromossômicas e estabelecido o numero de
cromossomos metacêntricos (m), submetac
êntri
cos (sm), subtelocêntricos (st) e
acrocêntricos (a), emparelhados com seus prováveis homólogos e organizados em
ordem decrescente de tamanho, para a disposição final do cariótipo.
4.2
MÉTODOS MOLECULARES
4.2.1 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
O DNA genômico foi obtido a partir de amostras de fígado ou músculo
preservadas em etanol, utilizando-se o Kit Wizard Genomic DNA Purification
(PROMEGA).
28
4.2.
2
CARACTERIZAÇÃO DO D
NAR 5S
Seqüências de DNAr 5S foram isoladas do DNA genômico de exemplares de
Potamotrygon mo
toro
, clonadas, submetidas ao
sequênciamento
nucleotídico, e
usadas
como sondas para hibridação
in situ
fluorescente (FISH).
4.2.2
.1 ISOLAMENTO DO DNA
R 5S POR PCR
O DNAr 5S foi isolado por PCR com o uso dos
primers
5SA (5’-TAC GCC
CGA TCT CGT CCG ATC-
3’
) e 5SB (5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-
3’),
propostos por
PENDÁS
et al. (1994). Esses
primers
amplificam os genes DNAr 5S e
seus espaçadores não transcritos (NTS).
Para cada amostra a ser amplificada, foi preparada a seguinte reação (
mix
):
Primer
F (10µ
M)
0,5
l
Primer
R (10µM)
0,5
l
dNTP (8mM)
0,5
l
Taq (5U/
l)
0,1
l
Tampão (10x)
2,5
l
MgCl
2
(50mM)
0,5
l
DNA (cerca de 50ng de DNA genômico)
1,0
l
Água estéril
19,4
l
Volume total
25
l
As amplificações foram realizadas num termociclador PTC-
200
TM
Peltier
Thermal Cycler (MJResearch, Inc.). O programa utilizado para a amplificação do
gene DNAr 5S consiste em:
29
94
o
C
----
5 min
95
o
C
----
45 seg
35
ciclos
65ºC
----
30 seg
72ºC
----
1
min
72
o
C
----
7 min
Manutenção a
4
o
C
Checar o produ
to do PCR em gel de agarose a 1,0 %.
4.2.3
PURIFICAÇÃO DOS
FRAGMENTOS DNA EM G
EL DE AGAROSE
A purificação dos fragmentos de DNA de interesse em gel de agarose foi
realizada, para posterior clonagem dos mesmos, utilizando o Kit GE – Amersham
Bioscience
s
(Promega), de acordo com o protocolo do fabricante.
Processamento dos fragmentos de DNA em gel de agarose
1. Pesar um tubo de 1,5ml vazio e anotar o peso.
2. Cortar a banda de interesse do gel de agarose e colocá-la no tubo. Cortar o
pedaço de gel em v
ários pedaços menores, utilizando uma tesoura ou uma pinça.
3. Pesar novamente o tubo e calcular o peso da amostra. Adicionar
10
µl de
Capture
Buffer
para cada 10mg de gel, misturar no vórtex e incubar a 60
o
C em banho-
maria
até que a esteja dissolvida.
Ligação do DNA
4. Colocar a minicoluna no tubo de coleta.
5. Transferir a banda processada para a minicoluna. Incubar a temperatura ambiente
por 1 minuto.
6. Centrifugar a 13000xg por 1 minuto. Retirar a minicoluna do tubo de coleta e
descartar o conteúdo desse. Colocar novamente a minicoluna no tubo de coleta.
30
Lavagem
7. Adicionar 700µl de Wash Buffer. Centrifugar a 16000xg por 1 minuto. Retirar a
minicoluna do tubo de coleta e descartar o conteúdo desse. Colocar novamente a
minicoluna no tubo de coleta.
8. Repetir o passo anterior com 500µl de Wash Buffer. Centrifugar a 16000xg por 1
minuto.
9. Esvaziar o tubo de coleta e centrifugar novamente por 1 minuto para permitir
evaporação de qualquer resíduo de etanol.
Eluição
10. Transferir cuidadosamente a minicoluna para um tubo de 1,5ml limpo.
11. Adicionar 20µl de água livre de nuclease à minicoluna. Incubar a temperatura
ambient
e por 1 minuto. Centrifugar a 16000xg por 1 minuto.
12. Descartar a minicoluna e estocar o DNA a 4
o
C ou
-
20
o
C.
4.2.4
QUANTIFICAÇÃO DO DN
A PURIFICADO
A concentração das amostras de DNA purificadas foi estimada em um
Nanodrop ND
-
1000 Espectophotometer.
4
.2.5 CLONAGEM DAS SE
QUÊ
NCIAS DE DNAR 5S OBT
IDAS POR PCR
A clonagem do DNAr 5S foi realizada para a posterior caracterização destes
segmentos de DNA. O kit de ligação
pGEM
-T Easy Vector System I (Promega) foi
utilizado para ligação dos fragmentos de interesse ao plasmídeo pGEM-T, seguindo
as especificações do fabricante. Posteriormente foi realizada a transformação de
células competentes de
Escherichia coli
DH5
a
preparadas no próprio laboratório.
4.2.5.1
Ligação de fragmentos de DNA ao plasmídeo pGEM
-T
Em um tubo de 0.5mL, adicionar 2µl do inserto de interesse (fragmento de
DNA), 1µl de T4 DNA ligase, 1µlde tampão de reação 10X, 1µl do plasmídeo pGEM-
31
T (50ng) e 5µlde água destilada autoclavada. Misturar cuidadosamente com uma
micropipeta e incubar a reação a 4
o
C durante 12-16 horas. Utilizar nas reações de
transformação bacteriana.
4.2.5.2
Transformação de células competentes bacterianas
Colocar 50µl de bactérias competentes (acondicionadas a -
70
o
C) em um tubo
de 1.5ml e, posteriormente, adicionar 10µl da reação de ligação (inserto-
plasmídeo),
misturando cuidadosamente com uma micropipeta. Manter o tubo no gelo por 30
minutos. Aplicar um choque térmico, aquecendo o tubo a 37
o
C em banho-maria por
exatamente 45 segundos. Colocar o tubo imediatamente no gelo e manter por 2
minutos. Adicionar 950µl de meio LB líquido (peptona 1%, NaCl 0,17M, extrato de
levedura 0.5%, pH 7,5) a temperatura ambiente e incubar a 37
o
C por 1 hora, sob
agitação a 225 rpm. Centrifugar por 5 segundos a 13.000 rpm e descartar o
sobrenadante. Espalhar o produto de transformação em placas de Petri estéreis com
meio LB sólido (peptona 1%, NaCl 0,17M, extrato de levedura 0,5%, ágar 1,5%, pH
7,5), contendo 2µl de ampicilina (50mg/ml) por mililitro de meio LB e 50µl de X-
Gal
(5
-
bromo
-4-
cloro
-3-
indolil
-(-Dgalactoside) (50mg/ml), para posterior seleção dos
plasmídeos recombinantes (colônias brancas). Incubar as placas, com o meio de
cultura voltado para cima, em estufa a 37ºC durante 12-16 horas. A presença de
insertos de interesse nos plasmídios recombinantes foi checada por PCR e os
clones recombinantes resultantes estocados em glicerol 70% e armazenados em
freezer a
-
70
o
C.
4.2.
6
PCR PARA CONFIRMAÇÃ
O DA PRESENÇ
A DE INSERTOS
Para verificar a presença de insertos de interesse nos clones obtidos, as
colônias brancas (potencialmente portadoras do inserto de interesse) foram
repicadas em meio sólido LB e submetidas a reações de amplificação (PCR) com o
uso dos
prim
ers
M13F (5’-
AGCGGATAACAATTTCACACAGG
-3’) e M13R (5’-
CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG
-3’). Em um tubo de 0.5m
l,
adicionar
ao
mix
de
reagentes descrito abaixo uma fração de DNA obtido diretamente da colônia com
auxílio de um
a ponteira.
32
Primer
F (10µM)
0,5
l
Prim
er
R (10µM)
0,5
l
dNTP (8mM)
0,5
l
Taq (5U/
l)
0,1
l
Tampão (10x)
2,5
l
MgCl
2
(50mM)
0,5
l
Água estéril
20,4
l
Volume total
25
l
Realizar o PCR de acordo com o seguinte programa:
95
ºC
----
3 min
95
ºC
----
3
0 seg
34
ciclos
50
ºC
----
1 min
72
ºC
----
2
min
72
o
C
----
5 min
Checar os produtos em
gel de agarose
a 1%
.
4.2.7
CRESCIMENTO E ESTOC
AGEM DOS CLONES RECO
MBINANTES
As bactérias transformadas foram plaqueadas em meio L.B - sólido contendo
ampicilina e X-gal. A placa foi deixada na estufa a 37°C
overnight
. As colônias
recombinantes de interesse foram retiradas com tips estéreis e inoculadas em 5ml
de meio L.B. líquido contendo ampicilina
.
4.2.
8
SE
QUÊ
NCIAMENTO DO DNA
Os
primers
utilizados na reação de PCR de
sequênciamento
fora
m o
M13
F e
M13R
para os produtos clonados. Foram feitas duas réplicas do
primer
forward para
cada produto de PCR purificado.
33
PCR de sequênciamento
O kit de sequênciamento utilizado o
DYEnamic
TM
ET Terminator Cycle
Sequencing (Amersham Bioscience)
, como
descrito a seguir:
Para cada amostra a ser seqüenciada
,
preparar a reação (
mix
):
Pré
-
Mix (Kit)
2
l
Primer
F ou R (3,3 mMol)
1
l
DNA*
a
té 5
l
Água estéril
X
l
V
olume total
9 l
*Concentração final = 200-
500
g para plasmídeo ou 40-
100
g para DNA
purificado
O
s parâmetros utilizados para o
PCR de sequênciamento
são:
96ºC
----
2 min
96
ºC
----
45
seg
34
ciclos
50
ºC
----
30 seg
60ºC
----
4 min
4
o
C
----
manutenção
Purificação do DNA amplificado na reação de
seq
uênciamento
Após o final da amplificação procedeu-se, como descrito abaixo, a purificação
das amostras visando a eliminação dos nucleotídeos terminadores não
incorporados:
1. Adicionar 2 l de acetato de sódio 3M e 80 l de etanol 95% em temperatura
ambien
te em cada tubo contendo o produto de
sequênciamento
.
2. Misturar no vórtex rapidamente e centrifugar a 20
o
C por 30 minutos a 14000g.
Remover o sobrenadante cuidadosamente por aspiração.
3. Adicionar 400 l de etanol 70% em temperatura ambiente e, em segu
ida
centrifugar a 20
o
C por 5 minutos a 14000g.
34
4. Descartar cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e deixar o
pellet
secar
por uma hora em temperatura ambiente protegido da luz. O
pellet
seco pode ficar
guardado por um mês a 4
C protegido da luz.
Aná
lise das amostras em seqüenciador ABI prism 377
As amostras amplificadas e purificadas foram analisadas
num
seqüenciador
automático ABI PRISM
TM
377 DNA Sequencer (Perking-
Elmer).
Edição das seqüências
As seqüências foram processadas retirando-se as regiões dos plasmídios e
uma busca por similaridades foi realizada através do sistema de pesquisa B
LASTN
(ALTSCHUL
et al.,1990) do National Center for Biotechnology Information (NCBI)
website (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
). As seqüências obtidas foram alinhadas
utilizando
-se os programas BIOEDIT (
HALL
, 1999) e DAMBE (
XIA
& XIE, 2001
),
sendo o alinhamento checado manualmente.
4.2.
9
HIBRIDAÇÃO
IN SITU
FLUORESCENTE
(FISH)
As sondas utilizadas na
hibricação
in situ foram: seqüências do DNAr 5S,
isoladas por PCR a partir do DNA nuclear de Leporinus elongatus (MARTINS &
GALETTI JR, 1999) e sequências de DNAr 18S, obtida por PCR a partir do DNA
nuclear de
Prochilodus argenteus
(
HATANAKA E GALETTI J
R
, 2005).
Marcação da sonda
As sondas de DNAr 5S isoladas por PCR, foram marcadas pelo método de
nick translation
com o uso do
kit
“
BioNick
TM
Labeling System” (Invitrogen).
Para cada lamina
, prepar
a
r a seguinte reação:
35
dNTP mix (Kit)
1 l
Enzima mix
(
Kit
)
1
l
DNA
(200
g/
l)
1 l
Água estéril
X
l
v
olum
e total
9 l
Misturar bem, centrifugar brevemente e incubar por 30 minutos a 16
o
C.
Parar a reação com a adição de 1 l de Stop Buffer. Acrescentar à reação,
1/10 do volume (1 l) de acetato de Sódio 3M e o dobro do volume (22 l) de etanol
100% gelado. Misturar invertendo o tubo, centrifugar rapidamente e colocar no
freezer
–
70º C por 1 hora. Centrifugar por 15 minutos a 15.000rpm a 4º C. Descartar
o sobrenadante e adicionar 50 L de etanol 70% gelado. Centrifugar por 5 minutos a
15.000rpm a 4º C. Descartar sobrenadante com cuidado e deixar secar.
Ressuspender em 6
L de água
Milli Q.
A sonda de DNAr 18S foi marcada por PCR de acordo com a seguinte
reação:
Água milli
-Q autoclavada para marcação com biotina
ou
Água milli
-
Q autoclavada para marcação com digox
igenina
29,5
l
ou
29,2
l
Tampão da enzima (10x)
5,0
l
MgCl
2
(50mM)
4,0
l
dATP (2mM)
1,0
l
dCTP (2mM)
1,0
l
dGTP (2mM)
1,0
l
dTTP (2mM) para marcação com biotina
ou
dTTP (2mM) para marcação com digoxigenina
0,5
l
ou
0,6
l
Biotina
-
16
-
dUTP (1mM)
ou
Dig
oxigenina
-
11
-
dUTP (1mM)
0,5
l
ou
0,7
l
Primer
F
(
2mM
)
2,5
l
Primer R (2mM)
2,5
l
Taq (5U/ l)
0,5
l
Produto da 2ª PC
2,0
l
36
O programa de PCR utilizado apresentou as seguintes condições:
94ºC
----
5 min
95ºC
----
1 min
34 ciclos
63ºC
----
1 min
72º
C
----
1 min e 30 seg
72
o
C
----
5 min
4
o
C
----
manutenção
O prod
ut
o de PCR (cerca de 1800pb) foi digerido com 3µl de DNase (0,005U/
µl) por 15 minutos a 15
o
C, incubado por 10 minjutos a 90
o
C para a inativação da
DNase
e em seguida precipitado
, como consta no protocolo de SCOMP.
Preparação das lâminas
Lavar as lâminas contendo as preparações cromossômicas em PBS 1x por 5
minutos
a temperatura ambiente. Des
idrata
r
em uma série de etanol a 70%, 85% e
100%
por 5 minutos em cada banho a temperatura ambiente
.
Tratar
com
uma
solução de RNAse (100
µg/ml)
por
1 hora em câmara úmida a 37
o
C. Lavar d
uas
vezes em solução de 2xSSC por 10 minutos e em PBS
1x
por 5 minutos.
Tratar
com
pepsina 0,005% em 10 mM de HCl por 10 minutos a
37
o
C. Lavar em PBS
1x
à
temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida
,
fixa
r
com formaldeído 1%/PBS
1x/M
gCl2 50mM por 10 minutos a tem
pe
ratura
ambiente. Lavar em PBS 1x por 5
minutos e desidratar em série de etanol a 70%, 85% e 100% por 5 minutos
em
cada
banho
a temperatura ambiente. Desnaturar as
lâminas
em formamida 70%
dissolvida em 2xSSC a 70
o
C por 2-5 m
inutos
. Desidratar novamente em série de
etanol a 70%, 85% e 100%
por
5
minutos
em
cada banho.
Hibridação e detecção dos sinais correspondentes
1. Preparar a solução de hibridação. Em um tubo de 0,6ml contendo 6 ul da sonda,
adicionar 15 l de formamida (concentração final 50%), 6 l de sulfato de dextrano
50% (concentração final 10%) e 3 l de 20xSSC (concentração final de 2xSSC).
Desnaturar a sonda a 100º C por 10 minutos e passar imediatamente ao gelo.
37
2. Colocar 30 L de solução de hibridação sobre a lamínula e inverter a lâmina sobre
a lamínula. Manter as lâminas com o material voltado para baixo em câmara úmida
(2xSSC) a 37º C overnight.
3.
Decorrido este tempo,
lavar
as lâminas 2 vezes em solução de formamida
15%
em
0,
2xSSC pH 7,0 por
1
0 minutos
cada (c
om agitação).
4. Lavar as lâminas 3 vezes em solução de 0,1xSSC a 60
o
C por 5 minutos cada
(com agitação).
5. Lavar
Tween
0,5% em 4xSSC por 5 minutos a temperatura ambiente (com
agitação).
6. I
ncuba
r as lâminas
NFDM 5%
em 4xSSC por 15 minutos.
7. Lavar as lâminas 2 vezes em
Tween
0,5% em 4xSSC a temperatura ambiente
(com agitação).
8. Detectar as sondas marcadas com biotina com 30
µl
de avidina-FITC (4
µl
de FITC
10ng/
µl
+ 26
µl
de NDFM) ou com digoxigenina com 30
µl
de antidigoxigenina
rodamina (4
µl
de antidigoxi 10ng/
µl
+ 26
µl
de NDFM) por 30 minutos a
37
o
C
em
câmara úmida
. Detectar a dupla FISH com 4
µl
de FITC + 4
µl
de antidigoxi + 22
µl
de
NDFM por 1 hora a
37
o
C
em câmara úmida.
9. Lavar as lâminas 3 vezes em Tween 0,5% em 4xSSC por 5 minutos (com
agitação).
10. Desidratar as lâminas em série de álcool 70%, 85% e 100% por 5 minutos em
cada
banho. Secar.
11. Montar a lâmina com 20 l de antifade (VectaShield, Vector Laboratories, Inc.) +
0,7 de iodeto de propídio (50 g/mL) ou com antifade/DAPI (VectaShield, Vect
or
Laboratories, Inc.) e cobrir com lamínula. Guardar a +4
o
C por poucos dias, ou então
a
–
20
o
C permanentemente antes ou após a análise.
esultados e iscussão
Técnico de laboratório coletando raias com fisga, próximo ao
município de P
orto Rico
-
PR.
38
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os
resultados e as discussões especificas dos dados obtidos
dados
obtidos
encontram
-
se apresentados na forma de Capítulos, referentes a possíveis
trabalhos que serão submetidos à publicação em revistas científicas.
Cap
ítulo
1 –
Descrição
cariotípica e evidências de sistema múltiplo de
c
romossomo
s s
exua
is
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
em
Potamotrygon
motoro e Potamotrygon
falkneri
(Chondricht
h
yes: Potamotrygonidae) na bacia superior do alto Paraná.
Capítulo 2 – Mapeamento físico dos genes ribossomais 18S e 5S em
Potamotrygon motoro e Potamotrygon falkneri (Chondricht
hyes:
Potamotrygonidae).
Capítulo 3 – Organização molecular e mapeamento genômico de duas classes de
DNAr 5S em
Potamotrygon motoro
(Chondricht
hyes: Potamotry
gonidae).
39
CAPÍTULO
1
DESCRIÇÃO
CARIOTÍPICA E EVIDÊN
CIAS
DE
SISTEMA
MÚLTIPLO
DE CROMOSSOMO
S SEXUAIS
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y
EM
Potamotrygon
motoro
e
Potamotrygon
falkneri
(CHONDRICHT
H
YES: POTAMOTRYGONIDA
E) NA BACIA
SUPERIOR
DO
ALTO
PARANÁ.
40
RESUMO
As raias da família Potamotrygonidae são encontradas nos principais
sistemas fluviais da América do Sul. No Brasil, o maior número de espécies é
encontrado na Bacia Amazônica (cerca de 13 espécies), além de outras em
des
crição e/ou ainda não descritas
.
Considerando a escassês de informações
cariotípicas de
representantes da família Potamotrygonidae
,
o presente estudo teve
como objetivo a descrição cariotípica de populações de Potamotrygon motoro e
P.
falkneri
da
bacia hidrográfica do Alto
Paraná
, nas regiões de Porto Rico
–
PR e Ilha
Solteira
–
SP.
As técnicas citogenéticas utilizadas foram a estimulação mitótica e
meiótica, coloração convencional com Giemsa, detecção das regiões
organizadoras de nucléolos pela impregnação com nitrato de prata (Ag-
RONs),
e
identificação dos padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva (Banda
C)
. As duas espécies em estudo apresentaram um heteromorfismo cromossômico,
sendo as fêmeas portadoras de 2n=66 cromossomos e os machos 2n=65
cromossomos,
identificando a ocorrência de um sistema múltiplo de cromossomo
s
sexuais do tipo X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y confirmada com estudos citogenéticos da meiose.
As regiões organizadoras de nucléolos identificadas pela reação Ag-R
ON,
evidenciaram marcações múltiplas em ambas as espécies, com variações de 5 a 7
RONs.
A técnica de bandamento C, revelou a presença de blocos
heterocromáticos localizados nas regiões centromérica em quase todos os
cromossomos
nas duas espécies em estudo. Através do presente estudo foi
evidenciada
uma heterogeneidade nos cariótipos
,
permitindo
sugerir que rearranjos
cromossômicos, como inversões e/ou translocações, ocorreram durante a evolução
cromossômica
nas duas espécies
desse gênero
.
41
INTRODUÇÃO
Os
Elasmobrânquios
constituem provavelmente a classe de vertebrados
menos estudada no ponto de vista da evolução sistemática
(ROCCO
et al
.
2004).
Apesar dos estudos citogenéticos nos peixes terem aumentado consideravelmente
nos últimos tempos, os Chondrichthyes permanecem entre os
grupos
menos
estudad
os, havendo poucos dados citogenéticos em peixes cartilaginosos, se
considerarmos o fato de ser conhecida a morfologia cariotípica de apenas 6% das
cerca de 1.100 espécies desse grupo viventes atualmente (STINGO & ROCCO,
2001).
Os dados citogenéticos sobre
raias
marinhas indicam a existência de
uma variação no número diplóide de 2n=28 em Narcine brasilians (
DONAHUE,
1974
)
à 2n=104 em
Raja
meerdervoortei
(MAKINO, 1937)
.
Já os poucos
dados
citogenéticos encontrados na literatura sobre raias de água doce da fa
mília
Potamotrygonidae indicam que as espécies Potamotrygon motoro
e
P. orbignyi
possuem o mesmo número diplóide de 2n=66 cromossomos, enquanto a espécie
Paratrygon aiereba
apresenta 2n=90 cromossomos (VALENTIN
et al
.
2006)
Os estudos citogenéticos com raias de água doce não relatam a
ocorrência de sistemas de cromossomo sexual heteromórficos neste grupo,
embora os peixes representem um grupo extremamente heterogêneo quanto a
determinação do sexo, ocorrendo desde a determinação sexual em nível gênico,
sem a distinção de cromossomos diferenciados, até a presença de cromossomos
heteromórficos, representando complexos sistemas de determinação sexual
(MORESCALCHI, 1992; SCHARTL, 1995). Entretanto, as espécies que
apresentam cromossomos morfológicamente distintos demonstram uma grande
variabilidade de sistemas que ocorrem principalmente, em peixes da região
Neotropical (
MOREIRA
-
FILHO
et al.
1993;
ALMEIDA
-
TOLEDO
e
FORESTI,
2001).
O presente estudo teve como objetivo investigar a estrutura cariotípica de
populaçõe
s de
P.
motoro e P. falkneri, bem como identificar as diferenças
42
cromossômicas envolvidas no processo de diversificação destas espécies com a
aplicação de metodologias de band
amento cromossômico.
MATERIAL E M
ÉTODOS
Foram
realizados estudos citogenéticos em exemplares das espécies de
raias
P.
motoro
e
P.
falkneri
provenientes da bacia hidrográfica do alto Paraná, nas
regiões de Porto Rico – PR (S 22° 47’ 42.4” W 53° 20; 29.7”) e Ilha Solteira – SP
(20°47’42.4” W 51° 38’29.7”). Foram coletados 30 exemplares de P. motoro, tendo
sido analisados 10 fêmeas e 13 machos da região de Porto Rico e 3 fêmeas e 4
machos de Ilha Solteira. Foram coletados 34 exemplares de P. falkneri, sendo 12
fêmeas e 14 machos capturados em Porto Rico e 3 fêmeas e 5 machos em Ilha
Sol
teira, coletados entre os anos de 2007 e 2008.
Cromossomos mitóticos foram obtidos segundo o protocolo descrito por
FORESTI
et al. (
1981),
com algumas adaptações para raias de água doce.
Metáfases meióticas foram obtidas pela
técnica
descrita
e
adaptada para peixes
por
BERTOLLO
et al.
(1978),
com
algumas modificações. A montagem do cariótipo
foi realizada de acordo com LEVAN
et al
. (1964).
Regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram identificadas no
complemento cromossômico utilizando a técnica de coloração por nitrato de Prata
desenvolvida por HOWELL & BLACK (1980) e os padrões de heterocromatina
constitutiva nas preparações cromossômicas foram obtidos segundo o método
proposto por
SUMMER
(1972).
RESULTADOS
As espécies Potamotrygon motoro e P. falkne
ri
apresentaram 2n=66
cromossomos nas fêmeas e 2n=65 cromossomos nos machos, este
heteromorfismo cromossômico encontrado, é devido à ocorrência de sistema de
cromossomos sexuais do tipo X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y, como evidenciado também pelos
43
dados de meiose. As duas populações analisadas de P. motoro apresentaram
números fundamentais diferentes (Tabela 4), sendo que as fêmeas da população
de Porto Rico apresentaram número fundamental de 116, constituído por 22
cromossomos metacêntricos, 8 cromossomos submetacêntricos, 20 cromossomos
subtelocêntricos e 16 cromossomos acrocêntricos (Figura 7), os machos da
população de Porto Rico apresentaram número fundamental de 114, constituído
por 21 cromossomos metacêntricos, 9 cromossomos submetacêntricos, 19
cromossomos subtelocêntricos e 16 cromossomos acrocêntricos (Figura 8). Na
população de Ilha Solteira as fêmeas apresentaram número fundamental de 122,
constituído por 20 cromossomos metacêntricos, 10 cromossomos
submetacêntricos, 26 cromossomos subtelocêntricos e 10 cr
omossomos
acrocêntricos (Figura 9), os machos apresentaram número fundamental de 120,
constituído por 19 cromossomos metacêntricos, 11 cromossomos
submetacêntricos, 25 cromossomos subtelocêntricos e 10 cromossomos
acrocêntricos (Figura 10).
A espécie Potamotrygon falkneri também apresentou números
fundamentais diferentes em ambas as populações (Tabela 4). Na população de
Porto Rico o número fundamental encontrado nas fêmeas é 110, constituído por
20 cromossomos metacêntricos, 10 cromossomos submetacêntricos, 14
cromossomos subtelocêntricos e 22 cromossomos acrocêntricos (Figura 11), os
machos da população de Porto Rico apresentaram número fundamental de 108,
constituído por 19 cromossomos metacêntricos, 10 cromossomos
submetacêntricos, 14 cromossomos subtelocêntricos e 22 cromossomos
acrocêntricos (Figura 12). Na população de Ilha Solteira o número fundamental
encontrado nas fêmeas é 114, constituído por 20 cromossomos metacêntricos, 10
cromossomos submetacêntricos, 18 cromossomos subtelocêntricos e 1
8
cromossomos acrocêntricos (Figura 13), os machos apresentaram número
fundamental de 112, constituído por 19 cromossomos metacêntricos, 10
cromossomos submetacêntricos, 18 cromossomos subtelocêntricos e 18
cromossomos acrocêntricos (Figura 14).
44
As análises em preparações meióticas de indivíduos machos de
P.
falkneri
revelaram a presença de um trivalente, além dos 30 bivalentes, na figura
de metáfase I (Figura 15), indicando a ocorrência de heteromorfismo
cromossômico ligado ao sexo.
A análise do padrão de bandamento C, mostrou que as espécies
P.
motoro
(Figura 7b,8b,9b,10b) e P. falkneri (Figura 11b,12b,13b,14b) apresentam
grandes segmentos banda C positivos localizados em posição centromérica na
maioria dos cromossomos do complemento.
As análises realizadas com a aplicação
da
técnica de Ag-
RONs
mostraram a presença de marcações
nucleolares
múltiplas nas duas espécies. Em
P. motoro
a popu
lação de Porto Rico evidenciou
marcações nas posições terminais
de sete cromossomos,
identificadas
no braço curto do par dois, no braço curto em
um dos homólogos do par quatro, nos braços longos do par seis, no braço longo
em um dos homólogos do par dezesseis, e em um dos homólogos do par vinte e
seis (Figura 16a). A população de Ilha Solteira evidenciou marcações nas posiç
ões
terminais de seis cromossomos, sendo no braço curto do par dois, no braço longo
em um dos homólogos do par seis, nos braços longos do par vinte, e em um dos
homólog
os do par vinte e seis (Figura 16b). Em P. falkneri a população de Porto
Rico apresentou marcações nas posições terminais em seis cromossomos
metacêntricos e um cromossomo acrocêntrico (Figura 16c). Na população de Ilha
Solteira, as marcações foram encontradas também nas posições terminais em
cinco cromossomos metacêntricos e dois cro
mossomo
s acrocêntricos (Figura 16
d).
DISCUSSÃO
Apesar de muitas espécies de vertebrados apresentarem cromossomos
sexuais morfológicamente diferenciados entre fêmeas e machos, a maioria das
espécies de peixes não apresenta qualquer diferença cromossômica entre os sexos
e, como consequência, existe grande dificuldade de se proceder à identificação dos
sexos por meio de análises cariotípicas.
45
No presente estudo, ambas as populações de Potamotrygon motoro e P.
falkneri
, apresentaram o número diplóide de 2n=66 cromossomos nas fêmeas, e
2n=65 cromossomos n
os machos. E
ssa alteração no número cromossômico
é devido
à ocorrência de
um sistema múltiplo de determinação sexual do tipo
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y.
As duas espécies de raias, apesar de apresentarem o mesmo número
diplóide,
apresentam cariótipos bem heterogêneos, e com
distribuição
comparável
de segmentos banda C positivos nas regiões centroméricas de quase todos os
cromossomos, como já evidenciado por
VALENTIM
et al. (2006) em P. motoro, P.
orbignyi e Paratrygon aiereba
.
Em
algumas espécies de peixes como em Hoplias malabaricus
(
BETOLLO
et al. 1997, 1998) e em
Characidium
sp. (ARTONI & BERTOLLO,
2002;
PANSONATO, J.C. 2006), os cromossomos sexuais são facilmente
identificados através de técnicas como bandamento C. Contudo, no presente
estudo não foi possível identificar os cromossomos envolvidos na determinação
sexual através dos padrões de heterocromatina constitutiva obtidos para P. motoro
e P. falkneri
.
As populações de P. motoro analisadas apresentaram
fórmula
s
cariotípic
as e números fundamenta
is
diferentes, sendo que a população de Ilha
Solteira mostrou u
ma
fórmula cariotípica
bastante
distinta das demais populações,
devido
à presença de diferentes números de cromossomos subtelocêntricos e
acrocêntricos.
Nas comparações
do
cariótipo de P. falkneri em relação ao cariótipo de
P. motoro
,
a primeira
apresentou um número maior de cromossomos acrocêntricos
.
As variações encontradas no número fundamental (NF) podem ser resultados de
rearranjos cromossômicos, principalmente do tipo fusão, fissão, translocações,
inversões pericêntricas, que podem ser considerados como mecanismos
importante de diversificação e evolução cariotípica em peixes (
WASKO
et al. 1996;
WASKO
e
GALETTI
,
1998; entre outros).
As RONs analisadas em P. motoro e P. falkneri, apresentaram-
se
variando de cinco à sete cromossomos, sempre em regiões terminais e de
46
tamanhos semelhantes entre si, sendo portanto homomórficas quanto a esse
caráter
.
Casos de RONs múltiplas já foram evidenciados em outras espécies
de
raias (
VALENTIN
et al. 2006) e em outras espécies de peixes, como em
Serrasalminae (GALETTI, SILVA e CERMINARO, 1985b; CESTARI & GALETTI,
1992a;
NAKAYAMA
et al.
1997;
entre outros
).
As RONs podem ser encontradas
de forma
simples
e
múltiplas
em espécies de um mes
mo gênero,
como é o caso
do
gênero
Astyanax
; onde tem sido descrita a presença de RONs simples e
múltiplas
com até 15 cromossomos marcados (
ROCON
-STANGE, ALMEIDA-
TOLEDO,
1993).
As variações de sítios de RONs encontradas nessas populações, poderiam
ser explicadas através de rearranjos cromossômicos, como translocações,
deleções, resultando na dispersão e/ou perda de genes ribossômicos (GALETTI
et
al
.
1995;
CASTRO
et al
.
1996;
MANTOVANI
et al.
2000).
A ocorrência de
DNA
ribossômico em cromossomos sexuais tem sido
observada em vários grupos de organismos. Os cístrons de genes ribossômicos
5,8S, 18S e 28S, que formam as
RON
s em animais, as quais são também
marcadas pelo nitrato de Prata, foram observados em cromossomos sexuais de
insetos, como em
Drosophila
(
PE
LLEGRINI
et al. 1977), (
PARISE
-MALTEMPI e
AVANCINI
, 2001)
,
besouro
s (
JUAN
et al. 1993); mamíferos (
YONENAGA
-
YASSUDA
et al
.
1983;
OSHIDA
et al
. 1999) e em
plantas (
NAKAYAMA
et al
.
2001).
Em peixes, os relatos de RONs em cromossomos sexuais se restringem a
Fundulus diaphanus (
HOWELL
e
BLACK,
1979),
Salvelinus alpinus (
REED
e
PHILLIPS
, 1995), Triportheus guentheri (
ARTONI
, 1999), Hoplias malabaricus
(
BORN e
BERTOLLO
, 2000) e
Hisonotus
sp. A (
ANDREATA
et al.
2002)
.
A formação de um sistema múltiplo de cromossomo sexual em peixes
geralmente é decorrente de um sistema simples preexistente em um determinado
grupo, como
ZZ/Z0, XX/X0, ZZ/ZW, XX/XY. Nestas espécies de raias estudadas, o
sistema
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y encontrado, poderia ter surgido a partir translocações
recíprocas, de um ancestral com sistema simples, como por exemplo XY,
se
ocorrer uma quebra no cromossomo X e, ao mesmo tempo, ocorre outra quebra
em um autossomo, quando um cromossomo se fragmenta ele tende imediatamente
47
a se fundir com outra extremidade cromossômica recém-rompida. Se um dos
segmentos do X se fundir com o autossomo e a outra parte do X se unir com o
outro segmento desse cromossomo autossômico, serão formados dois
cromossomos X diferentes, um deles (X
1
) com a maior parte do X original e o
fr
agmento do autossomo e o outro (X
2
), com o fragmento do X original e a maior
parte do autossomo. Em algumas espécies de peixes, a origem do Y é claramente
evidenciada, pois este possui as mesmas características dos cromossomos (X1) e
(X2), como em
Hoplias
malabaricus
, (
BERTOLLO
et al.
1983,
1997),
em espécies
de
Eigenmannia
(
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. 1984,
2000),
em
Erythrinus erythrinus
(
BERTOLLO
et al
. 2004), entre
outros.
VALENTIN
(2001) relatou um possível sistema de cromossomo sexual
do tipo XX/X0 em raias da espécie Potamotrygon sp. provenientes do médio rio
Negro (AM), onde a fêmea apresentou 2n=68 cromossomos e o macho 2n=67
cromossomos, devido a ausência de um dos homólogos do par 2 (metacêntrico) no
macho. Porém quando realizada a análise cariotípica de indivíduos da espécies
P.
motoro
desta localidade (médio rio Negro), todos os exemplares de ambos os sexo
apresentaram 2n=66 cromossomos, não sendo identificado nenhum
heteromorfismo cromossômico. Por outro lado, a ocorrência de diferentes
mecanismos de determinação sexual em grupos filogenéticamente relacionados é
um fato comum em peixes Neotropicais. Esse aspecto é evidenciado em vários
grupos como em Paradontidae (
MOREIRA
-
FILHO
et al. 1993;
JESUS
et al. 1999)
em Erythrinidae (
BERTOLLO
et al
.
1983
;
DE
RGAN
e
BERTOLLO
, 1990;
BORN
e
BERTOLLO
, 2000) e em Gymnotiformes (
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. 1984,
2000,
2001),
nos quais diferentes sistemas de cromossomos sexuais foram identificados
entre seus representantes.
Através do presente
estudo
, pode ser observado que há uma grande
homogeneidade
em relação aos números diplóides dessas espécies. Contudo, as
variações nos números de braços cromossômicos permitem sugerir
que
a
ocorrência de extensivos rearranjos cromossômicos como inversões e/ou
translocações, ocorreram durante a evolução cromossômica nas duas espécies
48
desse gênero, determinando variações nas fórmulas cariotípicas sem alterar os
números diplóides. Se, de um lado, a homogeneidade nos números diplóides e
mecanismos de heteromorfismos cromossômicos ligado ao sexo mostraram uma
relação de proximidade entre o que se mostra como P. motoro e P. falkneri
,
pode
-
se supor que, a ocorrência de tal polimorfismo cromossômico pode estar refletindo
não apenas a existência de duas espécies de raias de água doce neste ambi
ente,
mas sim de um complexo de espécies, que necessita ser melhor estudado.
Um
entendimento consistente das relações evolutivas existentes entre os cariótipos
variáveis e os mecanismos de cromossomos sexuais de P. motoro e P. falkneri
dependerá de
novas
informações
citogenéticas e moleculares de outras espécies e
populações de raias de água doce.
REFERÊ
NCIAS
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F
.,
FORESTI
F. and
TOLEDO
-
FILHO
S.A. Complex sex
chromosome system in
Eigenmannia
sp. (Pisces, Gymnotiformes).
Genetica,
v.64, p.
165
-
169, 1984.
ALMEI
DA
-TOLEDO, L.F. and FORESTI, F. Morphologically differentiated sex
chromosomes in Neotropical freshwater fish. Genetica,
v.111, p.
1
-
3, 2001.
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F. & TOLEDO-FILHO, S.A
.
Karyotipic
evolution in Neotropical freshwater fish. In Chromosome Today, v.13.
Switzerland
: Birkhauer Verlag, p. 169
-
182,
2000b.
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F., FORESTI, F., PÉQUIGNOT, E.V., DANIEL-
SILVA,
M.F.Z.
XX:XY sex chromosome system with X heterocromatinization: an early
stage of sex chromosome differentiation in the Neotropic electric eel
Eigenmannia virescens.
Citogenet. Cell Genet
., v. 95, p. 73
-
78, 2001.
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F. and FORESTI, F. Morphologically differentiated sex
chromosomes in Neotropical freshwater fish.
Genetica,
v.111, p. 1
-
3,
2001.
49
ANDREATA, A.A. Estudos citogenéticos no gênero Microlepidogaster (Pisces,
Loricariidae, Hypoptopomatinae). Tese de Doutorado. Instituto de Biociências,
Universidade de Estadual Paulista, UNESP, Botucatu, SP, 196p, 2002.
ARTONI, R.F., BERTOLLO, L.A.C. Nature and distribution of constitutive
heterochromatin in fishes, genus
Hypostomus
(Loricariidae). Genetica, v.106,
p. 209
-
214, 1999.
ARTONI, R.F., BERTOLLO, L.A.C. Evolutionary aspects of the ZZ/ZW sex
chromosome system in the Characidae fish, genis Triportheus. A
monophyletic state and NOR location on the chromosome. Heredity, v.89, p.
15
-
19, 2002.
BERTOLLO, L.A.C.; TAKAHASHI, C.S. & MOREIRA-FILHO, O.
Cytotaxonomic
consideration on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Revista Brasileira de
Genétic
a
1
: 103
-
120, 1978.
BERTOLLO, L.A.C., TAKAHASHI, C.S., MOREIRA-FILHO, O. Multiple sex
chromosomes in the genus
Hoplias
(Pisces, Erythrinidae). Cytologia, v.48, p.
1-
12, 1983.
BERTOLLO
, L.A.C., FONTES, M.S., FENOCCHIO, A.S., CANO, J. The X1X2Y sex
chromosom
e system in the Hoplias malabaricus. I. G-, C and chromosome
replication banding.
Chromosome Res 5: 493
-
499, 1997.
BERTOLLO, L.A.C. & MESTRINER, C.A
.
The X1X2Y sex chromosome system in
the fish Hoplias malabaricus. II. Meiotic analyses. Chromosome Res 6: 1
41
–
147, 1998.
BERTOLLO LAC, OLIVEIRA, C., MOLINA, W.F.; MARGARIDO, V.P.; F
ONTES,
M.S. PASTORI, M.C.; FALCÃO,J.N. AND FENOCCHIO, A.S.
Chromosome
evolution in the erythrinid fish, Erythrinus erythrinus (Teleostei:
Characiformes)
. Heredity, 93, 228
-
233, 2004.
BORN, G.G. and
BERTOLLO,
L.A.C.
An
XX/XY sex chromosome system in a fish
species,
Hoplias malabaricus, with a polymorphic NOR-bearing X
chromosome.
Chromosome Res., v.8, p. 111
-
118,
2000.
50
CASTRO, J.; VIÑA, A.; SÁNCHES, L.; MARTINEZ
, P
. Caracterization o
f na atypical
NOR site polymorfism in Brown trout (Salmo trutta) with Ag and CMA3-
staining, and fluorescent in situ hybridization. Cytogenet. Call Genet, v.75,
p.234
-
239, 1996.
CESTARI, M. M.; GALLETTI Jr., P. M. Chromosome studies of
Serrasalmus
spilopleu
ra
(Characidae, Serrasalminae) from the Paraná-Paraguai rivers:
evolution
and cytotaxonomic considerations.
Copeia
. (1): 108
-
112.
1992a
DERGAN, J. & BERTOLLO, L.A.C.
Karyotypic diversification in Hoplias malabaricus
(Osteichthyes, Erythrinidae) of the S
ão
Francisco and Alto Paraná Basins,
Brazil. Brazilian Journal of Genetics, 13: 755
-
756.
1990.
DONAHUE, W.H. A karyotypic study of three species of Rajiformes
(Chondrichthyes, Pisces). Can. J. Genet. Cytol. 16: 203
-
211.
1974.
FORESTI F, TOLEDO FS, ALMEIDA-TOLEDO LF. Polymorphic nature of the
nucleolus organizer regions in fishes.
Cy
togenet Cell Genet 31: 134-
141,
1981.
GALETTI
Jr
, P.M., LIMA,
N. R. W. and VENERE, P.C.
A monophyletic ZW sex
chromosome system in
Leporinus
(Anostomidae, Characiformes). Cytolo
gia,
v.60, p. 375
-
382,
1995.
GALETTI JR., P.M., SILVA, E.B., CERMINARO, R.T. A multiple NOR system in the
fish
Serrasalmus spilopleura
(Serrasalminae
, Characidae).
Rev Brasil Genet 8
:
479
-
484.
1985.
HOWELL, W.M., BLACK, D.A. Location of the nucleolus organizer regions on the
sex chromosomes of the banded killifish, Fundulus diaphanus. Copeia, v.3, p.
544
-
546, 1979.
HOWELL
, W.M. & BLACK, D.A
.
Controlled silver-staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36:
1014
-
1015.
1980.
51
JESUS C.M., BERTOLLO, L.A.C., MOREIRA-FILHO, O. Comparative cytogenetics
in
Apareiodon affinis (Pisces, Characiformes) and considerations regarding
diversification of the group.
Genetica, v.105, p. 63
-
67, 1999.
JUAN, C.; PONS, J.; PETITPIERRE, E. Localization of tandemly repeated DNA
sequences in beetle chromosomes by fluorescence in situ hybridization.
Chromosome Res., v.1, p.167
-
174, 1993.
LEVAN, A.; FREDGA, K.; SANDBREG, A.A. Nomeclature for centromeric position
on chrom
osomes. Hereditas, v.52, p.201
-
220.
1964.
MAKINO, S.The chromosomes of two elasmobranch fishes. Cytologia 2: 867-
876.
1937.
MANTOVANI, M., ABEL, L.D.S., MESTRINER, C.A., MOREIRA-FILHO, O.
Accentuated polymorphism of heterochromatin and nucleolar organizer
regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): tools for understanding
karyotypic evolution. Genetica, v.109, p. 161
-
168, 2000.
MOREIRA
-FILHO, O.; BERTOLLO, L.A.C.; GALETTI JR.; P.M. Distribution of sex
chromosome mechanisms in Neotropical fish and description of a ZZ/ZW
system in Paradon hilarii (Paradontidae). Caryologia, v.46, p.115
-
125, 1993.
MORESCALCHI, A. Chromosomes, sex determination and environment in
teleostens. In: Dallai R. (Ed.) Sex Origin and Evolution. Selected Symposia
and Monograph
s U.Z.I., Modena: Mucchi, p. 137
-
149, 1992.
NAKAYAMA, C. M
.
Caracterização Cariotípica de Peixes da Subfamília
Serralminae (Characiformes) da Bacia Amazônica. Dissertação de Mestrado.
Curso
de Biologia de Água Doce e Pesca Interior. Programa de Pós-
graduaç
ão em Biologia tropical e Recursos Naturais. Instituto Nacional de
Pesquisa da Amazônia. Manaus,
Am. 60p.
1997
.
NAKAYAMA, S., FUJISHITA, M., SONE, T., OHYAMA, K. Additional locus of rDNA
sequence specific to the X chromosome of the liverwort,
Marchantia
po
lymorpha
.
Chromosome Research, v.9, p. 469
-
473, 2001.
52
OSHIDA, T., SHINDO, J., YOSHIDA, M.C. NOR-bearing Y chromosome in
american beaver, Castor canadensis (Rodentia, Castoridae).
Chromosome
Science, v.3, p.117
-
118, 1999.
PASONATO, J.C. Estudos citogenéticos em espécies de
Characidium
(Teleostei,
Characiformes, Crenuchidae) e ocorrência de sistema ZZ-ZW de
cromossomos sexuais.
Dissertação de mestrado. UNESP
–
Botucatu,
2006.
PARISE
-MALTEMPI, P.P.; AVANCINI, R.M.P. C-banding and FISH in
chromosomes of the blow flies Chrysomya megacephala and Chrysomya
putoria (Diptera, Calliphoridae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz, .96, p.371-
377,
2001.
PELLEGRINI, M.; MANNING, J.; DAVIDSON, N. Sequence arrangement of the
rDNA of Drosophila melanogaster. Cell, v.10, p.213
-
214, 19
77.
REED, K. M. AND PHILLIPS, R. B. Molecular cytogenetic analysis of the double-
CMA
3
chromosome of lake trout, Salvelinus namaycush
.
Cytogenet Cell
Genet
,
70
:
104
–
107, 1995.
ROCCO
, L.; COSTAGLIOLA, D.; FIORILLO, M.; TINTI, F. & STINGO, V. Molecular
and chromosomal analysis of ribosomal cistrons in two cartilaginous fish,
Taenura lymma and Raja montagui (Chondrichthyes, Batoidea).
Genetica
123: 245
–
253, 2004.
ROCON
-STANGE, E.A. & ALMEIDA-TOLEDO, L.F. Supernumerary B
chromosomes restrited to males in Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae). Rev. Brasil. Genet. 16 (3): 601-
615,
1993.
SCHART, M.; NADA, I.; SCHLUPP, I.; WILDE, B.; EPPLEN, J.T.; SCHI IDT, M.;
PARZEFALL, J. Incorporation of subgenomic amounts of DNA as
compensation for mutational load in a gynogenetic fish. Nature v.373, p. 68-
71, 1995.
STINGO, V. & ROCCO, L. Selachian cytogenetics: a review. Genetica 111: p. 329-
347, 2001
.
53
SUMNER, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin.
Experiment
al Cell Research 75: p. 304
-
306,
1
972.
VALENTIM, F.C.S. Caracterização cromossômica em espécies de peixes da
família Potamotrygonidae (CHONDRICHTHYES, RAJIFORMES) do médio rio
Negro. Dissertação de mestrado, UFSCAR,
2001.
VALENTIM, F.C.S.; FALCÃO, J.N.; PORTO, J.I.R. & FELDBERG, E.
Chromos
omes of three freshwater stingrays (Rajiformes, P
otamotrygonidae)
from the Rio negro basin, Amazon,
Brazil.
Genetica, 128: p.33
–
39, 2006.
WASKO, A.P. & GALETTI, JR.,P.M. Karyotype diversity in the neotropical fish
Bryconamericus (Characidae).
Cytologia 64:
63
-
67,
1998.
WASKO, A.P. Estudos citogenéticos no gênero Bryconamericus (Pisces,
Characidae). Uma abordagem citotaxonômica evolutiva. Masters Thesis.
Universidade Federal de São Carlos, SP, Brasil, 1996.
YONENAGA
-YASSUDA, Y., ASSIS, M.F.L., KASAHARA, S., L’ABBATE, M.L.,
SOUZA, M.J. Nucleolar organizer regions in Akodon arviculoides (Cricetidae,
Rodentia): evidence for the activity of rDNA genes in both X chromosomes of
females.
Cytogenet. Cell Genet., v.35, p. 143
-
147, 1983.
54
Tab
ela 4 – Dados citogenéticos e fórmulas cariotípicas dos exemplares analisados nas populações das espécies de raias
Potamotrygon motoro
e
Potamotrygon falkneri.
Espécie
Localidade
ND
NF
Fórmula cariotípica
Ag
-
RONs
Bandamento C
Figuras
P. motoro
Porto Rico
–
PR
66
116
22m+8sm+20st+16a
7
Centromérica
Figura 7
65
114
21m+9sm+19st+16a
7
Centromérica
Figura 8
P. motoro
Ilha Solteira
–
SP
66
122
20m+10sm+26st+10a
6
Centromérica
Figura 9
65
120
19m+11sm+25st+10a
6
Centromérica
Figura 10
P. falkneri
Porto Ri
co
–
PR
66
110
20m+10sm+14st+22a
6
Centromérica
Figura 11
65
108
19m+10sm+14st+22a
6
Centromérica
Figura 12
55
P. falkneri
Ilha Solteira
–
SP
66
114
20m+10sm+18st+18a
7
Centromérica
Figura 13
65
112
19m+10sm+18st+18a
7
Centromérica
Figura 14
(N
D=
número diplóide, NF= n
úmero fundamental)
55
m
sm
st
a
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25
26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
Figura 7 – Cariótipos de
Potamotrygon
motoro
(fêmea) da população de Porto Rico,
evidenciando
os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
56
Figura 8
–
Cariótipo
s de
Potamotrygon
motoro
(macho) da população de Porto Rico,
evidenciando
os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
11 12 13 14
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
11 12 13 14
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32
33
X
1
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32
33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
11 12 13 14
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
11 12 13 14
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32
33
X
1
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31 32
33
X
1
X
2
a
b
Y
12
13
14
15
57
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
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1
X
1
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2
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2
m
sm
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a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
1
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2
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2
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
Figura 9
–
Cariótipo
s de
Potamotrygon
motoro
(fêmea) da população de Ilha Solteira,
evidenciando
os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por Giem
sa,
(
b)
e
análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
58
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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29 30 31 32 33
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1
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24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
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1
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2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 26 27 28
29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
Figura 10 – Cariótipos de
Potamotrygon
motoro
(macho) da população de Ilha
Solteira,
evidenciando
os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
G
iem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
59
Figura 11
–
Cariótipo de
Potamotrygon falkneri
(fêm
ea
) da população de
Porto Rico
,
evidenciando os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por G
iensa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
60
Figura 12 – Cariótipos de Potamotrygon falkneri (macho) da população de Porto
Rico,
evidenciando os cromossomos sexuais, (a) com coloração convencional por
G
iensa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
61
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
1
X
2
X
2
Figura 13 – Cariótipos de Potamotrygon falkneri (
fêmea
) da população de Ilha
Solteira
, evidenciando os cromossom
os sexuais,
(a) com
coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
62
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
2
Y
m
sm
st
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31
32 33
X
1
X
2
Figura
14 – Cariótipos de Potamotrygon falkneri (
Macho
) da população de
Ilha
Solteira, eviden
ciando os cromossomos sexuais,
(
a)
com coloração convencional por
Giem
sa,
(
b)
e
análise da heterocromatina constitutiva, após realização da técnica de
bandamento C.
a
b
63
Figura 15 – Cromossomos meióticos de Potamotrygon falkneri , população de
Ilha
Solteira, (a) metáfase esp
er
matog
onial (2n=65 cromossomos) após coloração com
Giemsa e metáfase I (b), com 30 bivalentes e um trivalente (indicado pela seta).
a
b
64
Figura 16 – Metáfases somáticas, após tratamento com coloração por nitrato de
Prata, as setas indicam os sítios Ag-RONs ativos. (a) P. motoro - população de
Porto Rico e Ilha solteira (b), P. falkneri população de Porto Rico (c) e Ilha Solteira
(d).
a
b
c d
65
CAPÍTULO
2
MAPEAMENTO FÍSICO D
OS GENES RIBOSSOMAIS
5S E
18S EM
Potamotrygon
motoro
E
Potamotrygon
falkneri
(CHONDRICHTYES: POTA
MOTRYGONIDAE).
66
RESUMO
O acesso a hibridação “in situ” nos cromossomos com as duas classes
distintas de genes que codificam o RNA ribossômico, nos eucariontes identificadas
como Classe maior do DNA ribossomal 45S e a Classe menor de DNAr 5S
apresenta estes segmentos como marcadores interessantes para o estudo das
relações entre espécies próximas de peixes. No presente estudo, foi realizada a
identific
ação da localização cromossômicas dos genes ribossomais 5S e 18S em
representantes de duas populações de Potamotrygon motoro e duas populações de
P. falkneri
, de ocorrência na
bacia hidrográfica do Alto Paraná, nas regiões de Porto
Rico (PR) e Ilha Solteira (SP). Os exemplares coletados foram submetidos à técnica
de obtenção de cromossomos mitóticos, coloração convencional com Giemsa,
Banda C, Ag-RON, CMA
3
, FISH. As duas espécies em estudo, apresentaram
número diplóide de 2n=66 cromossomos nas fêmeas e 2n=65 cromossomos nos
machos. A heterocromatina constitutiva (Banda C) foi identificada nas regiões
centroméricas de quase todos os cromossomos do complemento e as regiões
organizadoras de nucléolos (RONs) foram caracterizadas como RONs múltiplas e
localizad
as nas regiões terminais dos cromossomos nas duas espécies. O emprego
do fluorocromo CMA
3
evidenciou, além das Ag-RONs, marcações adicionais nas
duas espécies em estudo. Os cístrons ribossômicos através da hibridação in situ
fluorescente (FISH) com a sonda de DNAr 18S, foram coincidentes com as mesmas
marcações evidenciadas pela impregnação da Prata nas duas espécies, e um sítio
adicional foi encontrado em
P. falkneri,
nos indivíduos da população de Porto Rico. A
sonda de DNAr 5S revelou marcações em quatro sítios nas regiões terminais dos
cromossomos, em sintenia com os sítios de DNAr 18S, nas duas populações de
P.
motoro
. Em P. falkneri foram encontrados sítios de DNAr 5S nas regiões terminais
de três cromossomos, sendo apenas um deles coincidente com os sítios de DNAr
18S. Os dados obtidos, além de revelarem aspectos citogenéticos destas espécies,
podem também ser utilizados em interpretações evolutivas, na inferência da
estrutura genética das espécies e/ou populações de P. motoro e P. falkneri
,
67
fornecendo
subsídios a futuros estudos que visem à compreensão das relações
entre as espécies deste grupo.
PALAVRAS-
CHAVE:
Peixes cartilaginosos, banda RON, banda C, cromomicina A
3
,
genes ribossômicos.
INTRODUÇÃO
Os estudos citogenéticos têm evidenciado a ocorrência de uma grande
variabilidade cariotípica nos peixes, tanto em relação ao número de cromossomos
quanto à morfologia. Segundo
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. (2000b), dentre cerca de
706 espécies de peixes neotropicais já estudadas citogenéticamente, o número
cromos
sômico pode variar de 2n=20 à 2n=134, podendo ser identificados grupos de
espécies bastante conservados em relação ao número e à morfologia dos
cromossomos e grupos bastante variáveis.
Os Elasmobrânquios constituem provavelmente a classe de vertebrados
me
nos estudada no ponto de vista da evolução sistemática (
ROCCO
et al
.
2004).
Apesar dos estudos de cariótipos de peixes terem aumentado consideravelmente
nos últimos tempos, os Chondrichthyes permanecem entre os menos estudados,
havendo poucos dados citogenéticos em peixes cartilaginosos, se considerarmos o
fato de ser conhecida a morfologia cariotípica de apenas 6% das cerca de 1.100
espécies deste grupo viventes atualmente (
STINGO & ROCCO
, 2001).
Os dados citogenéticos sobre raias marinhas indicam a existência de uma
variação no número diplóide de 2n=28 em Narcine brasilians (
DONAHUE
, 1974) à
2n=104 em Raja meerdervoortei (
MAKINO
, 1937). E
ntre as
raias de água doce da
família Potamotrygonidae os dados citogenéticos indicam que as espécies
Potamotrygon motor
o e
Potamotrygon orbignyi possuem o mesmo número diplóide
de 2n=66 cromossomos, enquanto a espécie Paratrygon aiereba apresenta 2n=90
cromossomos (
VALENTIN
et al.
2006).
68
Um dos mais efetivos métodos de estudo
citogenético
de peixes
cartilaginosos
tem sido a combinação de técnicas clássicas de banda
mento
cromoss
ômico,
técnicas citogenéticas moleculares e hibridação in situ fluorescente
(ROCCO
et al. 2006). Desta forma, o presente estudo teve como objetivo,
identificar a
distribuição cromossômica dos genes ribossômicos 5S e 18S nas espécies de raias
Potamtrygon motoro e P. falkneri
,
e estabelecer as particularidades estruturais e
moleculares dos cromossomos com a aplicação de metodologias
citogenéticas
específicas
(Giemsa,
Banda C,
Ag
-
RONs
, CMA
3
, FISH).
Mate
rial e métodos
Foram analisadas 30 exemplares de Potamotrygon motoro e
34
exemplares de P. falkneri provenientes da bacia hidrográfica do alto Paraná, nas
regiões de Porto Rico – PR e Ilha Solteira – SP, coletados entre os anos de 2006 à
2008.
Cromossom
os mitóticos foram obtidos por meio da técnica descrita por
FORESTI
et al. (
1981)
,
com algumas adaptações para raias de água doce. A
montagem do cariótipo foi realizada de acordo com
LEVAN
et al. (1964). Regiões
organizadoras de nucléolo (RONs) foram identificadas no complemento
cromossômico utilizando a técnica de coloração por nitrato de Prata, desenvolvida
por
HOWELL & BLACK (1980) e os padrões de heterocromatina constitutiva nas
preparações cromossômicas foram obtidos segundo o método proposto por
SUMN
ER
(1972). A detecção de regiões ricas em pares de bases G-C foram
identificadas através da técnica descrita por
SCHWEIZER
(1976), utilizando o
fluorocromo CMA
3
.
A hibridação in situ fluorescente foi realizada de acordo com
procedimentos descritos por
PINK
EL
et al. (1986), com modificações, utilizando
sondas de DNAr 5S
obtida
s de uma sequência do DNA 5S da espécie
Leporinus
elongatus
(MARTINS & GALETTI JR, 1999) e a sonda DNAr 18S foi obtida de uma
69
sequência do DNAr 18S da espécie Prochilodus argenteus (HATANAKA & GALETTI
JR, 2005). As sondas foram marcadas pelo método de nick translation utilizando o
Kit BioNick
TM
Labeling System (Invitrogen).
A hibridação “in situ” foi realizada utilizando os fluorocromos avidina-
fluoresceína. As sondas 18S e 5S foram desnaturadas em formamida a 62%:
2XSSC por 5 minutos. O DNA foi hibridado a 37°C overnight em uma câma
ra úmida.
A sonda foi detectada pela anti-avidina. Posteriormente as lâminas foram cora
das
com DAPI e fotografadas com fotomicroscópio Olympus, modelo BX50 e
quipado
com Epi
-
Fluorescência.
Resultados
As espécies Potamotrygon motoro e P. falkneri apresentaram 2n=66
cromossomos nas fêmeas e 2n=65 cromossomos nos machos, identificando a
ocorrência de heteromorfismo cromossômico que caracteriza o sistema de
cromo
ssomo sexual do tipo X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y (como descrito no Capítulo 1).
Diferenças no número fundamental foram encontradas entre as populações
e espécies analisadas (como descrito no Capítulo 1), o padrão de bandamento C,
mostrou que as espécies P. motoro (Figura 17) e P. falkneri (Figura
18
) apresentam
grandes segmentos banda C positivos localizados em posição centromérica na
maioria
dos cromossomos do complemento (assim como já descrito no Capítulo 1).
A coloração dos cromossomos com o fluorocromo CMA
3
, nas
duas
espécies evidenciou marcações consistentes e coincidentes com as reveladas pelo
emprego da técnica de Ag-RONs (Figuras 19 e 20). Além das Ag-RONs, outros
segmentos CMA
3
posi
tivos foram encontrados
.
A hibridação
in situ
nas espécies
P. motoro
(Figura 2
1
) e
P. falkneri
(Figura
22
), confirmou a presença de DNAr 18S coincidente com as Ag-RONs. Contudo, a
espécie P. falkneri apresentou marcações em mais 1 cromossomo acrocêntrico na
população de Porto Rico.
70
Os sítios de DNAr 5S em P. motoro, população de Porto Rico foram
localizados nas regiões terminais dos cromossomos dos braços curtos do par 02 e
nos braços longos do par 06, em sintenia com a região de DNAr 18S
(Figura
s
21a
,
21b, 21c), o mesmo encontrado na população de Ilha Solteira (Figuras 21d, 21e
,
21f)
. Em P. falkneri os sítios de DNAr 5S foram encontrados nas regiões terminais
dos braços longos do par 04, também associados às regiões de DNAr 18S, além de
marcação no braço curto em um dos homólogos do par 12 (Figuras 22a, 22b, 22c),
os mesmos cromossomos também foram identificados na população de Ilha Solteira
(Figuras 22d, 22e, 22f).
DISCUSSÃO
Os estudos recentes dos genes ribossomais em espécies de raias
marinhas tem sido desenvolvidos com a associação de técnicas citogenéticas
clássicas e moleculares, principalmente com o uso da técnica de hibridação “in situ
”
flurescente (FISH). Em contra partida, em espécies de raias de água doce, os
trabalhos realizados se restringem basicamente à aplicação de técnicas de
citogenética clássicas, de modo geral envolvendo genes ribossomais na região
nucleolar.
Neste estudo, como já evidenciado no Capítulo 1, as duas espécies de
raias do gênero
Potamotrygon
estudadas apresentaram o mesmo número diplóide
,
porém
com diferenças em suas fórmulas cariotípicas, apresentando a mesma
distribuição de segmentos banda C positivos nas regiões centroméricas de quase
todos os cromossomos
.
Uma limitação apresentada pelo uso desta técnica de RON refere-se ao
fato de que a Prata não se liga às regiões de DNAr, mas sim às proteí
nas
associadas à estrutura nucleolar, limitando-se a identificar somente as RONs que
estiverem ativas na interfase procedente (
MILLER
et al
.
1976).
Entretanto, estas
RONs também podem ser evidenciadas, independentemente de sua atividade
71
transcricional com o uso de corantes GC-específicos como a cromomicina (CMA
3
) e
a mitramicina (MM) (HOWELL, 1982; SCHIMID
et
al
. 1982; ROCCHI, 1982; SATYA-
PRAKASH & PATHAK, 1984; entre outros). Em
P.
motoro
e P. falkneri, a coloração
com o fluorocromo CMA
3
também
identifico
u segmentos marcados nos mesmos
cromossomos envolvidos com as RONs. Esta correspondência entre as regiões de
RONs positivas e CMA3 positivas indica uma composição rica em bases GC na
região das RONs, provavelmente presentes nas regiões espaçadoras dos gene
s
ribossomais ou entre sequências de DNA repetitivos adjacente (SCHIMID, 1980).
Contudo, este tipo de abordagem deve ser feito com certas ressalvas, visto que
podem ocorrer regiões cromossômicas igualmente ricas em GC, sem
correspondência com as RONs (ARTO
NI
et al. 1999), como também observado
neste estudo.
Para a
caracterização
efetiva das regiões organizadoras de nucléolo em
P. motoro e P. falkneri, foi realizada a técnica de hibridação “in situ”
utilizando
sondas os genes ribossomais DNAr 5S e 18S. A hibridação “in situ” do gene
ribossomal 18S em P. motoro evidenciou as mesmas regiões encontradas pela
impregnação por nitrato de Prata n
as duas populações analisadas.
O mesmo também ocorreu em P. falkneri nos exemplares da população
de Porto Rico que,
apó
s as análises por hibridação in situ mostraram
também
a
presença de um lócus de DNAr 18S em adição aos seis cromossomos coincidentes
detectados pelo nitrato de Prata. Tal região específica também foi identificada pela
CMA
3.
Na população de Ilha Solteira, as regiões encontradas pela Prata foram
coincidentes com as evidenciadas pela sonda DNAr 18S e o fluorocromo CMA
3
,
sendo que este último marcador também evidenciou sítios adicionais. É
relativamente comum a ocorrência de um número maior de sítios identificados pela
hibridação
in situ com a sonda de DNAr 18S, que os identificados pela técnica de
impregnação por nitrato de Prata, como já observado em Hoplias malabaricus
(
BORN
& BERTOLLO, 2000) Astyanax scabripinnis (
FERRO
et al.
2001;
KAVALCO
e
MOREIRA
-
FILHO
, 2003),
Prochilodus lineatus
(
JESUS
e
MOREIRA
-
FILHO
, 2003),
72
entre outros. Isto se deve ao fato de que tais segmentos podem estar presentes no
genoma mas não se encontrarem ativos, produzindo os RNAs correspondentes.
A localizaç
ão cromossô
mica do gene DNAr
5S tem sido descrita em vários
grupos de peixes, como em
Rajidiformes,
Acipenseriformes, Anguilliformes,
Cypriniformes, Characiformes,
Salmoniformes, Perciformes, and Tetraodontiformes e
tem se mostrado de grande importância para a compreensão da estrutura e
organização desses cromossomos (
MARTINS & WASKO
, 2004).
Muitas espécies de peixes apresentam um número máximo de quatro
sítios de DNAr 5S localizados preferencialmente em regiões intersticiais, próximas
ao centrômero dos cromossomos, o que poderia
ser
interpretado como uma
estratégica para a preservação do gene, uma vez que
este
estaria menos sujeito a
rearranjos cromossômicos (MARTINS & GALETTI, 2001). No presente estudo, as
duas espécies de raias analisadas apresentaram uma variação de 3 a 4
cromossom
os apresentando sítios de DNAr 5S, sendo quatro
loci
de DNAr 5S
encontrados
nas duas populações de P. motoro e três
loci
nas duas populações de
P. falkneri estudadas. O aumento dos sítios DNAr 5S poderia estar relacionado com
um processo de dispersão dessas sequências gênicas, levando a um aumento da
variabilidade genética para estas espécies.
A hibridação in situ com as sondas de DNAr 5S e 18S simul
taneamente
permitiu
uma melhor análise da distribuição desses genes nos cromossomos. Os
genes ribossomais 18S foram observados em uma condição de sintenia com o 5S
em ambas as espécies estudadas, e pelo menos um par cromossômico. Em
P.
motoro
o gene ribossomal 5S localizou-se terminalmente no braço longo do par dois
e do par seis adjacente à localização do gene 18S nas duas populações analisadas.
Em
P. falkneri
,
as duas populações apresentaram a localização do DNAr 5S
terminalmente no braço longo do segundo par de um cromossomo metacêntrico
adjacente à localização do gene 18S, e além desse par, o DNAr 5S foi
evidenciado
no braço curto em um dos homólogos do par doze.
A organização sintênica dos genes ribossomais 5S e 18S constitui uma
situação
menos frequente entre os vertebrados. Mas entre os peixes tal
73
relacionamento
cromossômic
o dos segmentos de DNAr 5S e 1
8S
aparecem com
frequência, como observado
em
Salmo solar (
PENDÁS
et al. 1
994),
Oncorhynchus
mykiss
(
MÓRAN
et al. 1996), em espécies do gênero
Astyanax
(
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. 2002). Em peixes cartilaginosos, a espécie de raia de água salgada T
aeniura
lymma
também apresentou um dos dois sítios de
DNAr
5S
co-localizado com os
sítios de DNAr 18S.
MARTINS
e
GALETTI
(2001) sugerem que este tipo de modelo
não é acidental e poderia fornecer alguma vantagem para a organização destes
genes no genoma de verte
brados.
Por outro lado, em várias espécies de peixes, este
loc
us
tem sido
mapeado em distintos cromossomos (
MARTINEZ
et al. 1996;
MÓRAN
et al.
1996;
MARTINS & GALETTI, 2001; BORN & BERTOLLO, 2000;
FERRO
et al.
2001;
VICENTE
et al.
2001;
WASKO
et al.
2001
, entre o
utros
) representando a condição
mais freqüente descrita para vertebrados (DROUIN & MUNIZ DE SÁ, 1995;
SUZUKI
et al.
1996
, entre outros) e, aparentemente, representando um padrão ancestral.
Os dados citogenéticos moleculares obtidos neste estudo, visando um
a
melhor compreensão sobre a distribuição dos genes ribossômicos nas duas
espécies de raias analisadas, representa um contribuição também para a
compreensão do processo de evolução cromossômica nesse gênero de raias de
água doce.
AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos a Renato Devidé pela assistência técnica, ao apoio
financeiro concedido pela FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo) e
pelo
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico).
REFERÊNCIAS
74
ALMEIDA TOLEDO, L.F.; FORESTI, F. & TOLEDO-FILHO, S.A. Karyotipic evolution
in Neotropical freshwater fish. In Chromosome Today, v.13.
Switzerland:
Birkhauer Verlag, p. 169
-
182
. 2000b.
ALMEIDA TOLEDO, L.F.
;OZOUF
-COSTZ.; FORESTI, F.; BONILLO, C.; PORTO-
FORESTI, F.; DA
NIEL
-SILVA, M.F.Z. Conservation of the 5S-
bearing
chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species of
Astyanax
(Pisces, Characidae). Cytogenet Genome Res., v.97, p.229-
233,
2002.
ARTONI, R.F., BERTOLLO, L.A.C. Nature and distribution of constitutive
heterochromatin in fishes, genus
Hypostomus
(Loricariidae). Genetica, v.106, p.
209
-
214, 1999.
BORN, .G.; BERTOLLO, L. A.C. An XX/XY Sex chromosome system in a fish
species, Hoplias malabaricus with apolymorphic NOR bearing X chromosome.
Chromosome Research, v.8, p.111
-
118,
2000
.
DONAHUE, W.H. A karyotypic study of three species of Rajiformes (Chondrichthyes,
Pisces). Can. J. Genet. Cytol. 16
: 203
-
211,
1974
.
DROUIN, G. & MUNIZ DE SÁ, M.The concerted evolution of 5S ribosomal genes
link
ed to the repeat units of other multigene families. Mol. Biol. Evol., v.12,
p.481
-
493, 1995.
FERRO, D.A.M.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L.A. Nucleolar organizing
regions, 18S and 5S in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): Population
distribution an
d functional diversity. Genetica, v.110, p.55-
62, 2001.
FORESTI F, TOLEDO FS, ALMEIDA-TOLEDO LF. Polymorphic nature of the
nucleolus organizer regions in fishes. Cytogenet Cell Genet 31: 134
-
141, 1981.
HATANAKA & GALETTI JR. Mapping of the 18S and 5S ribos
omal RNA genes in the
fish
Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes, Prochilodontidae).
Genetica
.
239
-
244, 2005.
75
HOWELL, W,M, & BLACK, D.A
.
Contro
lled silver-staining of nucleolus
organizer
regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36:
1014
-
1015, 1980.
HOWELL, W.M. Selective staining of nucleolus organizer regions (NORs) In: The call
nucleus. New York-London, Bush H., Roth Blum, I. eds., Vol. XI. Academic
Press p.89
-
142, 1982.
JESUS, C.M.; MOREIRA-
FILHO
, O
.
Chromosomal localiztion of 5S and 18S rRNA
genes in Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae).
Caryologia, v.56,
p.281
-
287,
2003
.
LEVAN,
A.; FREDGA, K.; SANDBREG, A.A. Nomeclature for centromeric position on
chromosomes.
Hereditas, v.52, p.201
-
220, 1964.
KAVALCO, K.F. e MOREIRA-
FILHO,
O.
Cytogenetical analyses in four species of the
genus Astyanax (Pisces, Characidae) from Paraíba do Sul River Basin.
C
aryologia, v.56, n.4, p.453
-
461, 2003.
MAKINO, S. The chromosomes of two elasmobranch fishes. Cytologia 2: 867-
876,
1937
.
MARTINEZ, J.L.; MORÁN, P.; GARCIA-VÁZQUEZ, E.; PENDÁS, A.M.
Chromosomal
localization of the major and 5S rRNA genes in the European eel (Anguilla
anguilla).
Cytogen Cell Genet., v.73; p.149
-
152,
1996.
MARTINS, C. & GALETTI, P.M. Chromosomal localization of 5S rDNA genes in
Leporinus
fish (Anastomidae, Chraciformes). Chromosome Research 7: 363-
367, 1999
.
MARTINS
, C. &
GALETTI
, P.M
.
Organi
zation of 5S rDNA in species of the fish
Leporinus
: two different genomic locations are characterized by distinct
nontranscribed spacers.
Genome 44
: 903
-
910, 2001.
MARTINS
, C. & WASKO, A. P. O
rg
anization and evolution of 5S ribosomal DNA in
the fish genome
. Focus on Genome Research p.335
-
363, 2004.
76
MILLER, D.A.; DEV, V.G.; TANTRAVASHI, R.; MILLER, O.J. Supression of buman
nucleolus organizer activiy in mouse-buman somatic hybrid cells. Expl. Cell
Res, v. 101, p.235
-
243,
1976.
MORÁN, P.; MARTÍNEZ, J.L.; GARC
IA
-VÁSQUEZ, E.; PENDÁS, A.M
.
Sex
chromosome linkage of 5S rDNA in rainbow trout (
Oncor
hynchus mykiss
).
Cytogenetics and Cell Genetics 75
:
145
-
150, 1996.
PENDÁS
, A.M., MORÁN, P., FREIJE, J.P., GARCIA-
VÁSQUEZ
, E. Chromosomal
location and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon
5S rDNA.
Cytogenetics and Cell Genetics 67
:
31
-
36,
1994.
PINKEL, D.; STRAUME, T. e GRAY, J. W. Cytogenetic analysis using quantitative,
high sensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
, 2934
-
2938, 1986.
ROCCHI, A. On the heterogeneity of heterochromatin. Caryologia, 35 (2): 169-
189,
1982.
ROCCO, L.; COSTAGLIOLA, D.; FIORILLO, M.; TINTI, F. & STINGO, V
.
Molecular
and chromosomal analysis of ribosomal cistrons in two cartilaginous fish,
Taenura lymma and Raja montagui (Chondrichthyes, Batoidea). Genetica 123:
245
–
253
,
2004
.
ROCCO, L.; PIZANO, E.; OZOUF COSTAZ, C.; FOSRETI, F. & KAPOOR, B
.
Fish
Cytogenetycs. Editora Science Publishers, England
,
2006
.
SATYA
-PRAKASH, K.L. & PATHAK, S. Silver staining pattern of male meiosis in the
house cricket. J. Hered., 75:319
-
320, 1984.
SCHMID, M. Chromosome banding in Amphibia. V. Highly differentiates ZW/ZZ sex
chromosomes and exceptional genome size in Pyxicephalus adspersus
(Anura,
Ranidae). Chromosoma
, v.80, p. 69
-
96
, 1980.
SCHMID, M. Chromosome bandingin Amphibia. VII. Analysis of the tructure and
variability of NORs in Anura. Chromosoma, 87: 327
-
344, 1982.
77
SCHWEIZER, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and
DAPI. Chromosoma, Be
rlim, v.58, p.307
-
324, 1976.
STINGO, V. & ROCCO, L. Selachian cytogenetics: a review. Genetica 111: p. 329-
347,
2001.
SUMNER, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin.
Experimental Cell Research 75:
p. 304
-
306,
1972.
SUZUKI, H.; SAKURAI, S.; MATSUDA, Y. Rat DNAr spacer sequence and
chromosomal assignment of the genes to the extreme terminal region of
chromosome 19.
Cytogenet. Cell Genet, v. 72, p.1-
4,
1996.
VALENTIM, F.C.S.; FALCÃO, J.N.; PORTO, J.I.R. & FELDBERG, E.
Chromosomes
of three freshwater stingrays (Rajiformes, Potamotrygonidae) from the Rio
negro basin, Amazon, Brazil.
Genetica, 128: p.33
–
39,
2006.
VICENTE, V.E.; JESUS, C.M.; MOREIRA
-
FILHO, O.
Chromosomal localization of 5S
and 18S rDNA genes in three
Paradon
species (Pisces, Parodontidae).
Caryologia, v.4, p.365
-
369, 2001.
WASKO A.P.; MARTINS, C.; WRIGHT, J.M.; GALETTI, JR.,P.M. Molecular
organization of 5S rRNA in fishes of the genus Brycon. Genome, v.44, p.839-
902, 2001.
78
Figura 17
–
Metáfases s
omáticas de
Potamotrygon
motoro
(fêmea), da população de
Porto Rico, (a) após coloração convencional com Giemsa, análise sequencial da
heterocromatina constitutiva (b),
Potamotrygon motoro
(macho) da população de Ilha
Solteira após coloração convencional com Giemsa (c), e identificação da
heterocromatina constitutiva (d).
a
b
c
d
79
Figura 18
–
Metáfases somáticas de
Potamotrygon
falkneri
(fêmea), da população de
Porto Rico, (a) após coloração convencional com Giemsa, análise sequencial da
hete
rocromatina constitutiva (b),
Potamotrygon
falkneri
(macho) da população de Ilha
Solteira após coloração convencional com Giemsa (c), e identificação da
heterocromatina constitutiva (d).
a
b
c
d
80
Figura 19 – Metáfases somáticas, após coloração com o Fluorocromo CMA
3
, de
Potamotrygon motoro (a) população de Porto Rico, (b) população de Ilha Solteira, e
Potamotrygon falkneri
(c) população de Porto Rico, (d) população de Ilha Solteira, as
setas representam os sítios GC
-
positivos.
b a
c
d
81
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
a
c
e
g
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
b
d
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
f
h
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
a
c
e
g
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
a
c
e
g
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
b
d
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
f
h
1 2 4 6 16 20 26 1 2 4 6 16 20 26
2 6 20 26 2 6 20 26
b
d
1 2 4 7 29 1 2 4 7 29
2 4 7 29 2 4 7 29
f
h
Figura
20
– Identidade das marcações Ag-RON e cromomicina (
CMA
3
) em
cromossomos de raias de água doce. Cariótipos parciais de: a)
Potamotrygon
motoro
(Porto Rico), após emprego da técnica de Ag-RON; b) P. motoro (Porto
Rico
), após coloração com o fluorocromo CMA
3
; c)
P.
motoro (Ilha Solteira), após
emprego da técnica de Ag-RON; d) P. motoro (Ilha Solteira), após coloração com o
fluorocromo CMA
3
; e) P
otamotrygon
falkneri (Porto Rico), após emprego da técnica
de Ag-RON; f) P. falkneri (Porto Rico), após coloração com o fluorocromo CMA
3
; g)
P. falkneri (Ilha Solteira
),
após emprego da técnica de Ag-RON; h) P. falkneri (
Ilha
Solteira
), após coloração com o fluorocromo CMA
3
.
82
c
f
a
d
b
e
c
f
c
f
a
d
a
d
b
e
b
e
Figura
21 – Metáfase somática de Potamotrygon motoro (fêmea), após hibridação
in
situ
flu
orescente,
da população de Porto Rico, evidenciando a localização dos genes
ribossomais 5S (a), 18S (b), e localização simultânea das sondas (c).
Potamotrygon
motoro
(fêmea) da população de Ilha Solteira, evidenciando a localização dos genes
ribossomais 5S (d), 18S (e) e localização simultânea das sondas (f). As setas
indicam a localização dos sítios ribossomais.
83
c f
e
b
a
d
c f
e
b
a
d
Figura 22 – Metáfase somática de Potamotrygon falkneri (fêmea), após hibridação
in
situ
fluorescente, da população de Porto Rico, evidenciando a localização dos
genes ribossomais 5S (a), 18S (b), e localização simultânea das sondas (c).
Potamotrygon falkneri (fêmea) da população de Ilha Solteira, evidenciando a
localização dos genes ribossomais 5S (d), 18S (e) e localização simultânea d
as
sondas (f). As setas indicam a localização dos sítios ribossomais.
84
CAPÍTULO
3
ORGANIZAÇÃO MOLECULA
R E MAPEAMENTO
GENÔMICO DE DUAS CLA
SSES DE DNA
r
5S EM
Potamotrygon
motoro
(
CHONDRICHTHYES: POTAMOTRYGONIDAE).
85
RESUMO
A organização de genes ribossômicos 5S tem sido objeto de crescente interesse,
sendo estes segmentos genômicos amplamente caracterizados em eucariotos e
peixes ósseos. Ao contrário, entre os peixes cartilaginosos, tais informações ainda
são muito restritas, com
apenas algumas
espécies
estudadas
.
O DNA ribossômico
5S apresenta repetições geralmente estruturadas na forma de
uma
sequência
codificante e de um espaçador não-transcrito (NTS), que é comumente variável em
sua
sequência
nucleotídica. Embora a
sequên
cia
nucleotídica d
este
gene seja
altamente conservada mesmo entre espécies não relacionadas, as variações nos
NTSs geralmente são espécies-específicas e têm sido utilizadas com sucesso em
estudos evolutivos. Na presente investigação, a partir do DNA total da espécie, o
segmento correspondente ao rDNA foi clonado e sequenciado. Os dados obtidos
evidenciaram que o gene para DNAr 5S em Potamotrygon motoro, é formado por
duas classes de segmentos com diferentes tamanhos, sendo uma menor com
cerca de 342pb (Classe I) e outra maior com 1900pb (Classe II). O
sequenciamento permitiu identificar uma sequencia consenso para cada classe e o
alinhamento dos clones obtidos revelou poucas alterações nas sequências da
região codificadora (5S). Já as sequencias das regiões dos espaçadores não
transcritos
(NTS) mostraram um maior número de alterações, devido às
características destas regiões do NTS que se apresentam sempre muito variáveis.
Sequências TATA-
like foram encontradas nos NTS e u
m micro
ssatélite
(
GCT
10
) foi
identif
icado no segmento genômico do NTS II. A partir de p
reparações
cromossômicas mitóticas obtidas de exemplares de P. motoro foi montado o
cariótipo e, com a aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH),
usando como sondas os segmentos componentes do gene ribossômico 5S
marcados com corantes fluorescentes permitiu mapear o genoma da espécie
caracterizar sua localização nos cromossomos da espécie. Estes segmentos estão
localizados
nas regiões terminais dos braços curtos
dos
cromossomos
do par 2 e
nos braços longos do par 6, sendo sintênicos nos cromossomos do par 2. Por se
tratar do primeiro estudo realizado em espécie de raias de água doce, os
86
resultados obtidos poderão auxiliar na compreensão da organização e distribuição
do DNAr 5S em peixes cartilaginosos e nos processos envolvidos na diversificação
e evolução das espécies neste grupo.
Palavras
-
Chave
: Chondrichthyes, peixes cartilaginosos
,
Potamotrygon motoro
,
DNAr
5S
.
INTRODUÇÃO
Um dos mais efetivos métodos de estudo citogenético de peixe
s
cartilaginosos tem sido a combinação de técnicas clássicas de bandamento
cromossômico, técnicas citogenéticas moleculares e hibridação in situ
(ROCCO
et
al
., 2006). Os genes para RNAs ribossômicos (RNAr) encontram-se organizados
como duas famílias multigênicas distintas, representadas pelo DNAr 45S e pelo
DNAr 5S, compostas por unidades repetidas “in tandem” com centenas à milhares
de cópias (
LONG & DAVID
,
1980).
O DNAr 45S consiste de unidades transcricionais que codificam os RNAs
ribossômicos 18S, 5.8S e 28S, separadas por espaçadores internos transcritos
(ITS1 e ITS2) e flanqueadas por espaçadores externos transcritos (ETS1 e ETS2)
e não-transcritos (NTS) (LONG & DAVID, 1980). Múltiplas cópias destas unidades
correspondem às regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Diversos trabalhos
têm demonstrado que várias espécies de peixes apresentam somente dois
cromossomos portadores de regiões organizadoras de nucléolos (VENERE &
GALETTI, 1989; PAULS & BERTOLLO, 1990; MARTINS & GALETTI, 19
99
),
enquanto outras possuem múltiplos cromossomos portadores de RONs
(GALETTI
et al. 1985; FORESTI et al., 1989; SOLA et al
.,
1990, 1992; WASKO &
GALETTI,
1998).
O DNA ribossômico 5S apresenta repetições que consistem de uma
sequência codificante de 120 pares de bases e de um espaçador não-
transcrito
(NTS) que é comumente variável em sua sequência nucleotídica devido a
87
inserções/deleções, mini-repetições e pseudogenes (LONG & DAVID, 1980).
Embora a sequência nucleotídica do gene RNAr 5S seja altamente conservada
mesmo entre espécies não relacionadas, as variações nos NTSs geralmente são
espécies
-
específicas (SUZUKI
et al. 1994;
PENDÁS
et al. 1995) e têm sido
utilizadas com sucesso em estudos evolutivos (
SUZUKI
et al. 1994;
UDOVICIC
et
al
. 1995; CRONN et al. 1996;
SAJDAK
et al. 1998;
CRISP
et al. 1999; MARTINS &
GALETTI,
1999
; BAKER
et al
. 2000).
A localização cromossômica do DNAr 5S também tem sido reportada em
muitas espécies de peixes (
PENDÁS
et al, 1994;
MORÁN
et al. 1996;
MARTÍNEZ
et al.
1996
; SAJDAK et al
. 1998;
MARTINS
&
GALETTI, 1999, 2001,
MURAKAMI &
FUJITANI
1998; GORNUNG et al. 2000; ROCCO et al. 2004,
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. 2002, entre outros), bem como as características da sua
organização
molecular (
MARTINS
et al. 2000,
MESSIAS
et al.
2003,
ROCCO
et al. 2004
,
MARTIN
S & WASKO 2004,
PICHIRI
et al.
2006
,
PASONALI
et al.
2006
,
FUJIWARA
et al. 2008,
MORESCALCHI
et al. 2008, entre outros). Assim, a
ampliação de estudos envolvendo estes marcadores em espécies de peixes
neotropicais mostra-se de grande interesse, tendo em vista a diversidade de
espécies existentes nesta região
.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram
analisadas 10 exemplares de Potamotrygon motoro provenientes
da bacia hidrográfica do alto Paraná, na região de Porto Rico
–
PR, coletados entre
os anos de 2007 a 2008.
Crom
ossomos mitóticos foram obtidos pela suspensão de células do rim
com
base no método descrito por
FORESTI
et al. (1981), com algumas adaptações.
Um conjunto de
dos
primers
5SA (5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’) e
5SB (5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-
3’),
propostos por
PENDÁS
et al
.
(1994)
, foi utilizado para amplificação dos genes RNAr 5S e seus espaçadores não
88
transcritos. As sondas foram marcadas pelo método de nick translation utilizando o
Kit BioNick
TM
Labeling System (Invitrogen).
Amostras de DNA de interesse isoladas de gel de agarose foram ligadas
aos plasmídeos pGEM-T (utilizando o kit de ligação pGEM-T Vector System I -
Promega)
,
seguindo as especificações dos fabricantes. Posteriormente, foi
realizada a transformação de células competentes de
Esc
herichia coli
DH5
(Gibco.Brl Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante. Para verificar a
presença de insertos de interesse nos clones obtidos, as ligações inserto-
plasmídeo foram submetidas a reações de amplificação (PCR), seguindo o
protoc
olo descrito. Em um tubo de 0.5ml, foi adicionado 50pmol de cada
primer
-
M13F
(5’- 3’) AGCGGATAACAATTTCACACAGG, e M13R (5’- 3’) CCCAGTCAC
GACGTTGTAAAACG
, tampão de reação 1x (KCl 50mM; MgCl
2
1.5mM; Tris-
HCl
10mM
), 2mM de cada dNTP e 0.5U de
Taq
DNA polimerase (Amersham
Pharmacia Biotech), em um volume total de 50 l
.
A metodologia empregada
para a
hibridação
in situ fluorescente (FISH) em cromossomos metafásicos foi
baseada
em procedimentos adotados por
PINKEL
et al. (1986) e em adaptações
apresentadas por MARTINS & GALETTI (1999) e WASKO & GALETTI (2000).
O
sequenciamento
nucleotídico dos clones de interesse foi realizado utilizando o kit
DYEnamic Terminator Cycle Sequencing (GE Healthcare Bio-Sciences) e
seqüenciador automático (Perking-Elmer ABI Prism 377 DNA Sequencer),
seguindo as especificações dos fabricantes. As sequências obtidas foram
alinhadas utilizando os programas BIOEDIT (HALL, 1999) e DAMBE (XIA e XIE,
2001).
Para identificação de possíveis homologias, as
sequência
s nucleotídicas
obtidas foram submetidas a buscas online BLAST (“Basic Local Alignment
Search
Tool”)
(ALTSCHUL
et al. 1990) através do National Center for Biotechnology
Information (NCBI) (USA), “website” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). O
alinhamento das
sequência
s nucleotídicas foi realizado com o programa Clustal W
(
THOMPSON
et al. 1997). Análises de distância genética foram realizadas pelo
par
â
metro Kimura
-
2 (
KIMURA
, 1980).
89
RESULTADOS E DISCUSS
ÃO
Sequência
s de DNAr 5S foram isoladas por PCR a partir do DNA
genômico de exemplares de Potamotrygon motoro da população de Porto Rico,
capturadas no rio Paraná. Em todos os exemplares analisados, os produtos de
PCR apresentaram duas bandas amplificadas, sendo uma com cerca de 342pb e
outra
maior com cerca de 1900pb (Figura 23), de
monstrando
a existência de
duas
classes distintas de DNAr 5S, sendo a menor identificada como Classe I e a maior
Classe II.
A diferença observada entre as duas prováveis classes isoladas deste
DNA ribossomal relaciona-se à diferença de tamanho dos NTSs
e
é vista como
uma tendência generalizada nos grupos dos vertebrados, tornando este
polimorfism
o útil como marcador genético para espécies intimamente
relacionadas
,
subespécies, linhagens e híbridos (
PENDÁS
et al. 1995) e
em
análises evolutivas
(SUZUKI
et al. 1994,
UDOVICI
et al. 1995,
JOFFE
et al. 1995,
CRONN
et al. 1996,
CRISP
et al.
1999,
BAKER
et al
.
2000).
Através da hibridação in situ de sondas específicas de DNAr 5S com
sondas marcadas correspondentes aos segmentos da Classe I (biotina) e Classe II
(digoxigenina), foi possível identificar a localização exata das regiões de DNAr 5S
nos cromossomos de P. motoro
,
d
emonstra
ndo que essas duas classes de rDNA
localizam
-
se
nas regiões terminais dos braços curtos dos cromossomos do par 2 e
nos braços longos do par 6, sendo sintênicas nos cromossomos do par 2
(Figura
24). A co-localização cromossômica de duas classes de DNAr 5S também foi
encontrado em espécies de Astyanax (
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al. 2002). Porém tal
localização mostra-se diversa do padrão mais comumente observado em
outras
espécies de peixes, em que os genes RNAr 5S encontram-se localizados em
vários cromossomos
(MARTINS
e WASKO, 2004), como observado em espécies
de
Leporinus
(
MARTINS
e
GALETTI
, 2001
).
90
A clonagem e sequenciamento dos fragmentos de DNA correspondentes
ao gene RNAr 5S por PCR revelaram um alto grau de conservação em relação o
posicionamento das bases. Essas sequências foram blastadas para confirmação
do fragmento 5S clonado e, devido ao tamanho do fragmento Classe II (1900pb), o
seq
uenciamento foi realizado apenas em uma região flanqueadora, totalizando
912pb.
O
alinhamento
das
sequência
s obtidas permitiu a elaboração de uma
seq
uência consenso
de
342
pb
, com 52
,7
% de AT e outra com 912pb, como 43%
de AT (Figura 25). A divergência genética verificada entre os clones da Classe I
indicaram uma baixa divergência (0,7%), sendo valores compatíveis também
encontrado para a Classe II (0,8%) (Tabela 5). Embora a região gênica seja
extremamente conservada, foi possível identificar substituições nucleotídicas
características de cada um dos tipos de repetições. No entanto, as repetições de
maior tamanho apresentaram-se mais variáveis quando comparadas às repetições
menores qu
e se mostraram mais conservadas.
Estudos realizados em várias espécies de peixes permitiram a
identificação de tipos variantes de repetições
in tande
n
no DNAr 5S, caracterizadas
por marcantes diferenças no NTS. A presença de duas classes de DNAr 5S tem
sido observada em Characiformes (
MARTINS
e GALETTI, 2001;
WASKO
et al
.,
200
1), Symbranchiformes (
MESSIAS
et al., 2003), Perciformes (
MARTINS
e
GALETTI
,
1999
), Salmoniformes (
PENDÁS
et al., 1994;
MORÁN
et al., 1996;
SAJIDAK
et al., 1998), Rajidiformes (
PASOLINI
et al., 2006), Polypteriformes
(
MORESCALCHI
et al., 2008) e em Cypriniformes (
FUJIWARA
et al. 2008),
sendo
uma característica
aparentemente
bastante
comum entre os peixes
.
O uso das repetições do DNAr 5S apresenta algumas vantagens sobre os
demais marcadores disponíveis, pois a presença de
sequência
s codificantes,
conservad
as, flanqueando regiões variáveis dos NTSs, favorecem a aplicação da
técnica de PCR e, conse
qu
entemente, o isolamento dos NTSs das mais diferentes
espécies sem necessidade de um conhecimento prévio do genoma da espécie em
questão (
MARTINS
e
WASKO
, 2004).
91
E
mbora os NTSs parecem não ter função específica, tem sido
encontrada
em diversos mamíferos uma
sequência
denominada TATA-like (modificada por
TTAA e AATT) localizada ao longo dos NTSs desempenhando um papel
importante na regulação de sua expressão (
NEDERBY
-
NIELSEN
et al., 1993;
SUZUKI, SAKURAI & MA
TSUDA
, 1996). Em
peixes
a sequencia TATA-like tem
sido observada a montante do gene 5S (
PENDÁS
et al.
1994;
INAFUKU
et al.
2000
, MARTINS e GALETTI, 2001). Estudos realizados em raias marinhas,
também
apresentaram
sequê
ncias TATA-like ao longo do gene ribossomal 5S
(
ROCCO
et al. 2004,
PASOLINI
et al. 2006) assim como encontrado neste estudo
em
P. motoro, que apresentou tetranucleotídios TATA-
like
ao longo de suas
sequê
ncias
(Figur
a 25
).
MARTINS
e GALETTI (2001) sugerem que esta
sequência
poderia ter alguma influência sobre o nível de transcrição dos genes 5S rRNA
.
O alto dinamismo dos NTS pode ser observado também pela presença
de um micro
ssatélite
(
GCT
10
)
(F
igura 25) neste segmento genômico, que poderia
representar
um potencial marcador genético a ser melhor explorado e utilizado
para análises populacionais nesta espécie. A presença de microssatélites nas
regiões NTS do gene ribossomal 5S também é encontrado em outras espécies de
peixes
, como em Micropterus salmoides (
DEIANA
et al. 2000), Aulopus japonicus
(OTA
et al. 2003), Danio rerio (
GORNUNG
et al. 2000), raias da família Rajidae
(
PASOLINI
et al. 2006), Anguilla anguilla (
PICHIRI
et al. 2006),
Leporinus
macrocephaus (
FERREIRA
et al. 2007)
,
Polypterus senegalus (M
ORESCALCHI
et
al.
2008)
, entre outros.
Em conclusão, o estudo da organização dos genes ribossomais e sua
localização cromossômica, sem dúvida, oferece uma gama de informações úteis,
especialmente quando integrado com avaliações quantitativas e qualitativas
utilizando hibridização in situ e análise de
sequência
s repeti
tivas
, tais como os
microssatélites, presentes na região NTS. Desta forma seria possível obter uma
melhor compreensão sobre o processo de evolução e
especiação
desta espécie.
92
AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos a Renato Devidé pela assistência técnica, ao
apoio financeiro concedido pela FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo) e
pelo
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico).
REFERÊNCIAS
AL
MEIDA
-TOLEDO, L.F.; OZOUF-COSTAZ, C., FORESTI, F.; PORTO-
FORESTI,
F., CÉLINE E. LOPES, DANIEL, M.F.Z., TOLEDO FILHO, S.A. Conservation
of 5S bearing pair and co-localization with major rDNA clusters in five species
of
Astyanax
(Pisces, Characidae). Cytogenetic and Genome Research,
97:229
-
233, 2002.
ALTSCHUL SF, GISH W, MILLER W, MYERS EW, LIPMAN DJ. Basic local
alignment search tool.
J Mol Biol 215: 403
-
410, 1990.
BAKER
WJ, HEDDERSON TA, DRANSFIELD J. Molecular phylogenetic of
Calamus
(Palmae) and related rattan genera based on 5S nrDNA spacer
sequence data. Molecular Phylogenetic Evolution 14
: 218
-
231,
2000
.
CRISP MD, APPELS R, SMITH FM, KEYS WMS
.
Phylogenetic evaluation of 5S
ribosomal RNA gene and spacer in the
Callistachys
group (Fabacea:
Mirbelieae).
Pl
ant Systematics and Evolution 218
:
33
-
42,
1999
.
CRONN RC, ZHAO X, PA
TERSON AH, WENDEL JF
.
Polymorphism and concerted
evolution in a tandemly repeated gene family: 5S ribosomal DNA in diploid
and allopolyploid cottons.
Journal of Molecular Evolution 42
: 685
-
705,
1996
.
DEIANA AM, CAU A, SALVADORI S, COLUCCIA E, CANNAS R, MILIA A
,
TAGLIAVINI J. Major and 5S ribosomal sequences of the largemouth bass
Micropterus salmoides (Perciformes, Centrachidae) are localized in GC-
rich
regions of the genome.
Chromosome Res
8:213
–
218, 2000.
FERREIRA, I.A., OLIVEIRA, A. VENERE, P.C., GALETTI, P.M. E MARTINS, C
.
5S
rDNA variation and its phylogenetic inference in the genus Leporinus
(Characiformes: Ano
stomidae). Genetica 129:253
-
257,
2007.
93
FORESTI F., ALMEIDA-TOLEDO L.F, TOLEDO F.S. Supernumerary chromosome
system, C-banding pattern characterization, and multiple nucleolus organizer
regions in Moenkhausia sanctafilomenae (Pisces, Characidae). Genetica 79:
107
-
114, 1989.
FUJIWARA, M.; INAFUKU, J.; TAKEDA, A.; WATANABE, A.; FUJIWARA, A.;
KOHNO, S.AND KUBOTA, S. Molecular organization of 5S rDNA in bitterlings
(Cyprinidae). Genetica,
DOI 10.1007/s10709
-
008
-
9294
-
2,
2008.
GALETTI JR., P.M., SILVA, E.B., CERMINARO, R.T. A multiple NOR system in the
fish
Serrasalmus spilopleura (Serrasalminae, Characidae). Rev Brasil Genet
8
: 479
-
484, 1985.
GORNUNG E, DE INNOCE
NTIIS
S, ANNESI F, SOLA L
.
Zebrafish 5S rRNA
genes map to the long arms of chromosome 3. Chromosome Res 8:362-
362
,
2000
.
HALL, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-
98,
1999.
INAFUKU J, NABEYAMA M, KIKUMA Y, SAITOH J, KUBOTA S, KOHONO S
.
Chromosomal location and nucleotide sequences of 5S ribosomal DNA of two
cyprinid species (O
steichthyes, Pisces).
Chromosome Res 8:193199
,
2000
.
JOFFE BI, VALIEJO-ROMAN KM, BIRSTEIN VY, TROITSKY AV. 5S rRNA
sequences of 12 species of flatworms: implications for the phylogeny of the
Platyhelminthes
. Hydrobiologia 305
: 37
-
43,
1995
.
KIMURA
, M
.
A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution
through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 16:111-
120
,
1980.
LONG, E.O. & DAVID,
J.B.
Repeated genes in eukaryotes. Ann. Ver. Biochem., v.49,
p.727
-
764,
1980
.
MARTINEZ, J.L.; MORÁN, P.; GARC
IA
-VÁZQUEZ, E.; PENDÁS, A.M.
Chromosomal
localization of the major and 5S rRNA genes in the European eel (Anguilla
anguilla). Cytogen Cell Genet., v.73; p.149
-
152,
1996
.
MARTINS, C. & GALETTI, P.M. Chromosomal localization of 5S rDNA genes in
Leporinus
fish (Anastomidae, Chraciformes). Chromosome Research 7: 363-
367, 1999
.
94
MARTINS C, WASKO AP, OLIVEIRA C, WRIGHT
JM.
Nucleotide sequence of 5S
rDNA and localization of the ribosomal RNA genes to metaphase
chromosomes of the tilapiine cichlid fish, Oreochromis niloticus
.
Hereditas
133: 39
-
46, 2000.
MARTINS, C.; GALETTI, P.M. Organization of 5S rDNA in species of the fish
Leporinus
: two different genomic locations are characterized by distinct
nontranscribed spacers.
Genome 44
: 903
-
910,
2001
.
MARTINS C, WASKO AP
.
Organization and evolution of 5S ribosomal DNA in the
fish genome. In Williams CR (ed) Focus on Genome Research. Nova Science
Publishers, Hauppauge, NY, pp 335
-
363
, 2004.
MESSIAS LH, FERREIRA DC, WASKO AP, OLIVEIRA C, FORESTI F, MARTIN
S
C
.
5S rDNA organization in the fish Synbranchus marmoratus
(Synbranchidae, Synbranchiformes). Hereditas 139:228
-
231, 2003.
MORÁN P, MARTÍNEZ JL, GARCIA-VÁSQUEZ E, PENDÁS AM. Sex chromosome
linkage of 5S rDNA in rainbow trout (
Oncorhynchus mykiss
).
Cytoge
netics and
Cell Genetics 75
:
145
-
150, 1996.
MORESCALCHI, M.A; LIGUORI, L.; ROCCO, L.; ARCHIMANDRITIS, A. &
STINGO, V. Karyotypic characterization and genomic organization of the 5S
rDNA in Polypterus senegalus (Osteichthyes, Polypteridae). Genetica, 132:
179
-
186, 2008.
MURAKAMI M, FUJITANI
H
.
Characterization of repetitive DNA sequences carrying
5S
rDNA of the triploid ginbuna (Japanese silver crucian carp, Carassius
auratus langsdorfi). Genes Genet Syst 73:9
-
20
, 1998.
NEDERBY
-NIELSEN, J., C. HALL
ENBERG,
S. FREDERIKSEN, P.D. SORENSEN,
B. LOMHOLT, ET AL.Transcription of human 5S rRNA genes is influenced by
upstream DNA sequence.
Nucleic Acids Res. 26: 3631
–
3636
,
1993.
OTA
, K., TATENO Y, GOJOBORI T. Highly differentiated and conserved sex
chromosome in fish species (Aulopus japonicus: Teleostei, Aulopidae). Gene
317:187
–
193
, 2003.
PASOLINI
,
P
., COSTAGLIOLA D, ROCCO L, TINTI F
.
Molecular organization of 5S
rDNA in Rajidae (Chondrichthyes): Structural features and evolution of piscine
5S rRNA genes and nontranscribed intergenic spacers. J Mol Evol 62:564-
574
, 2006.
95
PAULS, E. & BERTOLLO, L.A.C. Distribution of a supernumerary chromosome
system and aspects of karyotypic evolution in the genus Prochilodus (Pisces,
Prochilodontidae).
Genetica 81
: 117
-
123, 1990.
PEND
ÁS AM, MORÁN P, FREIJE JP, GARCIA-VASQUEZ E. Chromosomal
mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon
5S rDNA. Cytoge
net Cell Genet 67: 31
-
36, 1994.
PENDÁS AM, MÓRAN P, MARTÍNEZ JL, GARCIA
-
VÁSQUEZ E.
Applications of 5S
rDNA in Atlantic salmon, brow trout, and in Atlantic salmon x brown trout
hybrid identification. Molecular Ecology 4
: 275
-
276, 1995.
PICHIRI, G.; NIEDDU, M.; MANCONI, S.; CASU, C.; CONI, P.; SALVADORI, S.
And MEZZANOTTE, R. Isolation and characterization of two dif
ferent 5S rDNA
in Anguilla anguilla and in Anguilla rostrata: possible markers of evolutionary
divergence.
Molecular Ecology Notes, v.6, 638
-
641, 2006.
PINKEL, D.; STRAUME, T. E GRAY, J. W. Cytogenetic analysis using quantitative,
high sensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
2934
-
2938,
1986
.
ROCCO, L.; COSTAGLIOLA, D.; FIORILLO, M.; TINTI, F. & STINGO, V.
Molecular
and chromosomal analysis of ribosomal cistrons in two cartilaginous fish,
Taenura lymma and Raja montagui (Chondrichthyes, Batoidea). Genetica
123: 245
–
253
,
2004.
ROCCO, L.; PIZANO, E.; OZOUF COSTAZ, C.; FORESTI, F. & KAPOOR, B.
Fish
Cytogenetycs. Editora Science Publishers, England, 2006.
SAJDAK SL, REED KM, PHILLIPS RB. Intraindividual and interspecies variation i
n
the 5S rDNA of coregonid fish. Journal of Molecular Evolution 46: 680-
688,
1998.
SOLA, L., MONACO, P.J., RASCH, E.M. Cytogenetics of bisexual/unisexual
species of
Poecilia
. I. C-bands, Ag-NORs polymorphisms and sex-
chromosomes in three
populations
of
Poe
cilia latipina. Cytogenet Cell Genet
53: 148
-
154,
1990.
SOLA, L., ROSSI, A.R
., IASELLI, V., RASC
H, E.M., MONACO, P.J
.
Cytogenetics of
bisexual/unisexual species of
Poecilia
. II. Analysis of heterochromatin and
nucleolar organizer regions in Poecilia mexicana mexicana by C-
banding,
96
DAPI, quinacrine, chromomycin A
3
and silver staining. Cyt
ogenet Cell Genet
60: p.229
-
235,
1992
.
SUZUKI H, MORIWAKI K, SAKURAI S. Sequences and evolutionary analysis of
mouse 5S rDNAs
. Molecular Biology Evolution
11
: 704
-
710,
1994
.
SUZUKI, H.; SAKURAI, S.; MATSUDA, Y. Rat DNAr spacer sequence and
chromosomal assignment of the genes to the extreme terminal region of
chromosome 19. Cytogenet. Cell Genet, v. 72, p.1
-
4, 1996.
THOMPSON, J.D., GIBSON, T.J., PLEWNIAK, F., JEANMOUGIN, F., H
IGGINS,
D.G
.
The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence
alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 24:4876-
4882,
1997.
UDOVICIC F, MCFADDEN GL, LADIGES PY. Phylogeny of
Eucaliptus
and
Angophora
based on 5S rDNA spacer sequence data. Molecular Phylogeny
and Evolution 4
: 247
-
256,
1995
.
VENERE, P.C. & GALETTI, JR P.M. Chromosome evolution and phylogenetic
relationships of some Neotropical Characiformes of the family Curimatidae.
Revista Bra
sileira de Genética 1
2: p.17
-
25,
1989
.’
XIA, X. & XIE, Z. DAMBE: Data analysis in molecular biology and evolution. J.
Heredity 92:371
-
373, 2001.
WASKO, A.P. & GALETTI, JR.,P.M. Karyotype diversity in the neotropical fish
Bryconamericus (Chara
cidae).
Cytologia 64:63
-
67, 1998.
WASKO AP AND GALETTI JR PM. Mapping 18S ribosomal genes in fish of
the genus Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization
(FISH). Genetics and Molecular Biology 23: 135-138, 2000.
WASKO, A.P.; MARTINS, C.; WRIGHT, J.M.; GALETTI, JR.,P.M.
Molecu
lar
organization of 5S rRNA in fishes of the genus
Brycon
.
Genome, v.44, p.839-
902, 2001.
97
Tabela
5
–
Análise da d
ist
ância gené
tica entre os clones da
Classe I e os clones da
Classe II;
NC
- número de clones;
PB
- número de bases; DG -
diver
gência
gen
ética, DP
-
desvio padrão.
Classe I
Classe II
NC
PB
DG ± DP
NC
PB
DG ± DP
DNAr 5S
P. motoro
09
342
0,007 ± 0,003
08
912
0,008 ± 0,004
98
L M
F
L M
F
Figura
23
– Amplificação de repetições de DNAr 5S de Potamotrygon motoro,
população de Porto Rico, visualizadas em gel de agarose 2%.
(M
) corresponde a
uma amostra de DNA de um exemplar macho,
(F
) corresponde a uma amostra de
DNA de um exemplar fêmea, (L) marcador de peso molecular 1Kb (Invitrogen Life
Technologies).
34
0 pb
(Classe I)
1.
900
pb
(Classe II
)
99
a
c
b
a
c
b
Figura
24 – Metáfases de Potamotrygon motoro da população de Porto Rico
,
(a) após hibridação in situ com a sonda DNAr 5S de
342pb (Classe I) (verde); (b) após hibridação in situ com a sonda DNAr 5S de 1900pb (Classe II) (vermelho); (c) resultado de
Double
-
FISH demonstrando marcação com as duas sondas simultaneamente.
100
+1
5S II
CAGGCTGGTATGGCCGTAAGCTACGCCCGATCTCGTCCGATCTCGGAAGC
[ 50]
5S I ..........................................C.....C. [ 50
]
5S II
TAAGCAGGCTCAGGCCTGGTTAGTACTTGGATGGGAGACCGCCTGGGAAT
[100]
5S I .GG...A..........C...CA.G.C.CTG.A.....T........... [100]
+120
5S II
ACCAGGTGCCGTAGGCTTTT
GCTGTTTT
GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG
[150]
5S I T......T.T...CA..GA.A.ACG
.GA.T.A
-
....T..C.CT..CAAA [150]
5S II
CTGCTGCT
CTGAACAGATGTCCGCAGTAGGAGCTGCTCTCTTCTTTTCAG [200]
5S I T...A.T.
-
....TTC.ATCAT.TTA.GACCA....
------
..C..A.. [200]
5S II TCCGCCTCTGACATACACTGTCGGCACTGCGCTTCTCACTCAGCCCAGAA [250]
5S I
---
.GT...TTT.C...G.AAG.AA.
TTAAA------
GA.T.TGGGGA.. [250]
5S II ACGCAAGCACCCGGCTCCTGCTGTCAAGGCACAGGAATACAAGAATGTGC [300]
5S I .G...G.T.GAT.AA
----....--
.GCTT..G.CC....C..CC..A
-- [300]
5S II TTTTGCGAGGCAGCCAGCTGCACCTGCAGCACTAGCGTCCTCATTGCTTC [350]
5S I
-
C..A..GCCATA.....CAGG.T.A.G
..CA..C.AG...G
-------- [350]
5S II CTCCATACCGCCGCGCATCGCCACTCGCCTACTGTCGCCTCTCCCTCAGT [400]
5S I
--------------------------------------------------
[400]
5S II CTCAGCCAGGCAGCAAGATGCAAGATGCAAGGGGCTCAAGCGTTCTTGCG [450]
5S I
------------------------------
--------------------
[450]
5S II CCTCTCTTCTGCGCTTGCGCAAACCGTCCATTCTCAGTTGAGGCTTTCCT [500]
5S I
--------------------------------------------------
[500]
5S II TTGCCTTCTGAGCAGGCATCAGCAAAGGCGGCAGCTGCTTCCTGCGGCCA [550]
5S I
--------------------------------
------------------
[550]
5S II AGCGGGCTGGCCGAGTATGGCACAAGCAGCTCYGAATAGCCTCTGATGGC [600]
5S I
--------------------------------------------------
[600]
5S II TGAGACTCAGCAGCCTGTTCCTGAGCGAGCCGTCGGCCTGGCAGTGGGCA [650]
5S I
----------------------------------
----------------
[650]
5S II GACTCACCCAGGCCCACCCAGGTCTGAGGACGGTTAGCTCAGCTGGTCAG [700]
5S I
--------------------------------------------------
[700]
5S II AGCGTTGCTAATAACGCCAAGGTCGTGGGTTCGATCCCCATACTGTCCAC [750]
5S I
------------------------------------
--------------
[750]
5S II GCCCCGCATTTCCTTTAATTTCCGCCCACTTTCGTCCAGCAGTCCAGCAC [800]
5S I
--------------------------------------------------
[800]
5S II TTCTCTGGCTATCCAATGTAGGACATGGCTGGATGGCKGGCGCTTCAGCA [850]
5S I
--------------------------------------
------------ [850]
5S II GAAAAGCAGGCCCCGTGCAGTATGCAGCAGCGTAATTCACGGGAACTGAA [900]
5S I
--------------------------------------------------
[900]
5S II TGAATGAACGAA [912]
5S I
------------
[912]
d
101
Figura 25 – Sequências consenso de DNAr 5S Classe I (5S I) e Classe II (5S II
)
alinhadas da espécie
Potamotrygon motoro
. A região de transcrição se inicia no +1 e
termina no +120 (está em negrito). As sequências TATA-like estão contornadas por
retângulos. A sequência nucleotídica grifada indica uma região microssatélite GCT
10
.
Os pontos indicam nucleotídeos idênticos e gaps estão indicados pelos traços.
d
iscussão eral
Rio Paraná
–
Próximo ao município de Porto Rico
-
PR.
102
DISCUSSÃO GERAL
As duas espécies de raias de água doce analisadas apresentaram o
mesmo número diplóide e cariótipos similares, porém não idênticos, e com
diferenças em suas fórmulas cariotípicas, principalmente devido a existência de
diferentes números de cromossomos acrocêntricos.
As
variações cariotípicas
encontrada
s nas populações são resultados de rearranjos cromossômicos,
principalme
nte do tipo fusão e fissão, que podem ser considerados como
mecanismos importante de diversificação e evolução cariotípica dessas espécies.
A existência de diferentes fórmulas cariotípicas pode ser uma indicativa da
existência de um complexo de espécies de raias neste ambiente e que necessita
ser melhor estudado
Foram evidenciadas diferenças cariotípicas entre fêmeas e machos nas
duas espécies analisadas, sendo identificado um heteromorfismo cromossômico
ligado ao sexo, sugerindo a ocorrência do sistema de determinação sexual do tipo
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y. Este poderia ter ocorrido a partir de translocações recíprocas,
com modificações cariotípicas envolvendo os cromossomos de um ancestral com
sistema simples e indiferenciado do tipo XY.
VALENTIN
(2001) relatou um possível
sistema de cromossomos sexuais do tipo XX/X0 em raias da espécie
Potamotrygon
sp
., proveniente do médio rio Negro, que também apresentou heteromorfismo
ligado ao sexo. Porém, quando realizada a análise cariotípica de indivíduos da
espécie
P. motoro (médio rio Negro), todos os exemplares de ambos os sexo
apresentaram o mesmo número cromossômico, não sendo corroborado o
heteromorfismo cromossômico anteriormente descrito e diferentemente do
encontrado neste trabalho.
Em algumas espécies de peixes, os cromossomos sexuais são
facilmente identificados através de técnicas como bandamento C (
BETOLLO
et al.
1997; ARTONI & BERTOLLO, 2002; PANSONATO, J.C. 2006). No caso das
espécies de raias estudadas, contudo, não foi possível identificar os cromossomos
envolvidos na determinação sexual através dos padrões de heterocromatina
constitutiva
obtidos tanto para P. motoro quanto para P. falkneri, pois a
distribuição
103
de segmentos banda C positiv
os
ocorreu
nas regiões centroméricas de quase
todos os cromossomos
do complemento nas duas espécies.
Um outro marcador comumente utilizado para identificação de
cromossomos sexuais, é representado pelos cístrons ribossômicos formadores das
regiões nucleola
res
,
e identificados pelo nitrato de Prata. Tais marcadores
foram
observados em cromossomos sexuais de peixes como em Fundulus diaphanus
(
HOWELL
e
BLACK,
1979),
Salvelinus alpinus (
REED
e
PHILLIPS
, 1995),
Triportheus guentheri (
ARTONI
et al. 1999),
Hoplias
malabaricus (
BORN
e
BERTOLLO
, 2000) e
Hisonotus
sp. A (
ANDREATA
et al.
2002)
.
Em
P. motoro
e
P.
falkneri
, as RONs não foram localizadas nos cromossomos sexuais e
apresentaram marcações que variaram entre sete cromossomos, sempre em
regiões terminais e de tamanhos semelhantes entre si. As RONs também foram
identificadas através do fluorocromo CMA3, que em peixes, geralmente identifica
RONs ativas e inativas. Em vista disso este tipo de abordagem deve ser feito com
certas ressalvas, visto que podem ocorrer regiões cromossômicas igualmente ricas
em GC, sem correspondência com as RONs (ARTONI et al. 1999). Tal situação foi
observada neste estudo, onde além das RONs, outros segmentos cromossômicos
também apresentaram reação positiva ao fluorocromo. As variações de sítios de
RONs encontradas nessas populações, poderiam ser explicadas pela ocorrência
de rearranjos cromossômicos como translocações, deleções, que resultaram na
dispersão e/ou perda de genes ribossômicos (GALETTI et al
.
1995;
CASTRO
et al
.
1996;
MANTO
VANI
et al.
2000).
A técnica de hibridação “in sit
u”
do gene ribossomal 18S em P. motoro
revelou
as mesmas regiões encontradas pela impregnação por nitrato de Prata n
as
duas populações analisadas. O mesmo também ocorreu em P. falkneri n
a
população de Porto Rico, mostraram a presença de um lócus de DNAr 18S em
adição aos seis cromossomos coincidentes detectados pelo nitrato de Prata, o
mesmo foi identificado pela CMA
3.
Na população de Ilha Solteira, as regiões
encontradas pela Prata foram coincidentes com as evidenciadas pela sonda DNAr
18S e o fluorocromo CMA
3
; este último também evidenciou sítios adicionais. É
104
relativamente comum a ocorrência de um número maior de sítios identificados pela
hibridação
in situ
com a sonda de DNAr 18S, que
aqueles visualiza
dos
pela técnica
de impregnação por nitrato de Prata, como já observado em Hoplias malabaricus
(
BORN
& BERTOLLO, 2000) Astyanax scabripinnis (
FERRO
et al.
2001;
KAVALCO
e
MOREIRA
-
FILHO
, 2003), Prochilodus lineatus (
JESUS
e
MOREIRA
-
FILHO
, 2003), entre outro
s.
Tal fato tem sido interpretado como decorrência da
presença de segmentos nucleolares inativos no genoma das espécies.
A localização cromossômica do gene DNAr 5S tem sido descrita em
vários grupos de peixes, como em
Rajidiformes,
Acipenseriformes, Anguil
liformes,
Cypriniformes, Characiformes, Salmoniformes, Perciformes,
e
Tetraodontiformes
e
tem se mostrado de grande importância na compreensão da estrutura e
organização desses cromossomos (MARTINS & WASKO, 2004). As duas espécies
de raias analisadas no presente estudo apresentaram uma variação de 3 a 4
cromossomos apresentando sítios de DNAr 5S, sendo quatro
loci
DNAr 5S
encontrados
nas duas populações de P. motoro, e
três
loci
nas populações de
P.
falkneri
. O aumento dos sítios DNAr 5S, poderia estar correlacionado com uma
dispersão dessas sequências gênicas, levando a um aumento da variabilidade
genética para estas espécies.
A hibridação in situ com as sondas de DNAr 5S e 18S simultaneamente
permitiu
uma melhor análise na distribuição desses genes nos cromossomos. Os
genes ribossomais 5S e 18S foram observados em uma condição de sintenia em
ambas as espécies estudadas. Em P. motoro o gene ribossomal 5S localizou-
se
terminalmente no braço longo do par dois e do par seis, em posição adjacente à
localiza
ção do gene 18S nas duas populações analisadas. Em P. falkneri
,
as duas
populações
apresentaram o segmento de DNAr 5S em posição terminal no braço
longo do segundo par de um cromossomo metacêntrico, também em posição
adjacen
te à localização do gene 18S. Além desse par, o DNAr 5S foi evidenciado
no braço curto em um dos homólogos do par doze.
A organização sintênica dos genes ribossomais 5S e 18S constitui uma
situação
pouco frequente entre os vertebrados. Contudo, entre os peixes tal tipo de
105
associação
crom
ossômica
aparece com frequência, como observado
em
Salmo
solar
(
PENDÁ
S et al. 1994), Oncorhynchus mykiss (
MÓRÁ
N et al. 1996), em
espécies do gênero
Astyanax
(
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al.
2002)
e em
Taenura
lymma
(ROCCO et al. 2004).
MARTINS
e
GALETTI
(2001) suger
em
que este tipo
de modelo não é acidental e que poderia fornecer alguma vantagem para a
organização destes genes no genoma de verte
brados.
As s
eqüê
ncias de DNAr 5S isoladas a partir do DNA genômico de
Potamotrygon motoro da população de Porto Rico apresentaram duas possíveis
classes de DNAr 5S. A diferença observada entre as duas classes isoladas deste
DNA ribossomal relaciona-se à diferença de tamanho dos NTSs
e
é vista como
uma tendência generalizada nos
peixes
, tornando este polimorfismo útil como
marca
dor genético para espécies intimamente
relacionadas
, subespécies, linhagens
e híbridos (
PEND
ÁS et al. 1995) e
em
análises evolutivas (
SUZUKI
et al. 1994,
UDOVICI
et al. 1995,
JOFFE
et al. 1995,
CRONN
et al. 1996,
CRISP
et al. 1999,
BAKER
et al
.
2000).
At
ravés da hibridação “in situ” de sondas específicas de DNAr 5S
utilizando sondas marcadas correspondentes aos segmentos da Classe I e Classe
II, foi possível identificar a localização exata das regiões de DNAr 5S
nos
cromossomos
de P. motoro
,
d
emonstra
n
do
que essas duas classes de rDNA estão
em sintenia em apenas um dos pares cromossômicos envolvidos. A co-
localização
cromossômica de duas classes de DNAr 5S também foi encontrado em espécies
de
Astyanax
(
ALMEIDA
-
TOLEDO
et al.
2002).
O
alinhamento
das seqüências obtidas permitiu a elaboração de uma
seq
uência consenso, onde foi possível analisar a divergência genética entre os
clones de cada Classe, indicando uma baixa divergência entre eles. No entanto, a
Classe II (de maior tamanho) mostrou-se mais variável quando comparada
à
Classe I
(menor)
qu
e se mostrou mais conservada. A presença de duas classes de
DNAr 5S tem sido observada em outras espécies de raias, como descrito por
ROCCO
et al. 2004 e
PASOLINI
et al. 2006, sendo uma característica
aparentemente
comum entre os peixes
cartilaginosos.
106
Estud
os realizados em raias marinhas apresentaram sequências TATA-
like ao longo do gene ribossomal 5S (
ROCCO
et al. 2004,
PASOLINI
et al. 2006)
.
Do mesmo modo foi encontrado no presente estudo em P. motoro. Esta espéc
ie
apresentou tetranucleotídios TATA-
like
ao longo de suas sequencias (modificada
como AATT e TTAA). Um micro
ssatélite
(
GCT
10
) também foi encontrado
neste
segmento genômico, que poderia representar um potencial marcador genético a
ser melhor explorado e utilizado para análises populacionais nesta espécie. A
presença de microssatélites nas regiões NTS do gene ribossomal 5S já foi descrita
para
outras espécies de peixes, como em Micropterus salmoides (D
EIANA
et al.
2000),
Aulopus japonicus (
OTA
et al. 2003), Danio rerio (
GORNUNG
et al. 2000),
raias da família Rajidae (
PASOLINI
et al. 2006), Anguilla anguilla (
PICHIRI
et al.
2006),
Leporinus macrocephaus (
FERREIRA
et al. 2007)
,
Polypterus senegalus
(
MORESCALCHI
et al.
2008)
, entre outros.
Os dados de citogenética clássica e molecular obtidos de P. motoro e
P.
falkneri
contribuem com informações de interesse para uma melhor compreensão
cariotípica das espécies e como análise de distribuição dos genes ribossômicos.
Além disso, a identificação das Classes de DNAr 5S, no gênero
Potamotrygon
,
fornecem dados sobre a estrutura de segmentos cromossômicos específicos nesta
espécie, contribuindo para uma melhor compreensão da estrutura genômica dos
peixes.
onclusão
Rio Paraná
–
Próximo ao município de Porto Ric
o-
PR.
107
CONCLUSÕES
Os dados obtidos no estudo das características cromossômicas, nos seus
aspectos estruturais e moleculares, realizadas em espécies e populações de
peixes pertencentes ao gênero
Potamotrygon
, capturadas na bacia superior do rio
Paraná, pe
rmitem concluir que:
1)
As espécies analisadas P. motoro e P. falkneri apresentaram o número
diplóide conservado, com 2n=66 cromossomos as fêmeas e 2n=65
cromossomos os machos. No entanto, nota-se uma heterogeneidade do
ponto de vista citogenético nas populações analisadas, com variações na
sua estrutura cariotípica. Tais modificações estruturais permitem sugerir a
ocorrência de rearranjos cromossômicos como inversões e translocações,
como responsáveis pelas modificações nas fórmulas cariotípicas durante o
processo de diversificação cromossômica que poderiam estar dando origem
a um complexo de espécie neste grupo
.
2)
As análises citogenéticas realizadas permitiram de
mo
n
strar
a ocorrência de
heteromorfismo
cromossômico
ligado
ao sexo em ambas as espécies,
caracterizando um sistema múltiplo de cromossomos sexuais do tipo
X
1
X
1
X
2
X
2
/X
1
X
2
Y.
3)
A análise da heterocromatina constitutiva através do bandeamento C
revelou um padrão bastante semelhante para todas as populações
analisadas nas duas espécies de raias, com blocos heterocromáticos
centroméricos em quase todos os cromossomos.
4)
A impregnação por nitrato de Prata identificou RONs múltiplas com
localização terminal nos cromossomos, variando de 5 a 7 RONs em todas
108
as populações analisadas. O tratamento com o fluorocromo CMA
3
mostrou
marcações correspondentes com as posições das RONs em todas as
populaçõe
, evidenciando também a presença de sítios adicionais. Os
diferentes números de marcações encontradas nas duas espécies se deve
ao fato da ação dos elementos transponíveis que auxiliam na dispersões
das RONs.
5)
A apllicação da técnica de hibridação ”in situ” com a sonda de DNAr 18S
revelou uma variação de 6 a 7 cromossomos com marcações terminais nas
populações analisadas, revelando as mesmas regiões identificadas pela
Prata. A sonda de DNAr 5S apresentou de 3 a 4 cromossomos marcados,
localizado também em regiões terminais, sendo algumas destas marcações
sintênicas com as regiões de DNAr 18S.
6)
A espécie P. motoro apresentou duas classe de DNAr 5S e podem ser
interpretada
s como unidades genômicas distintas, sendo denominadas
Classe I (menor) e Classe II (maior), demonstrando grande variação nas
regiões de NTSs entre as duas Classes.
7)
A técnica de hibridação
”in situ”
com a sonda da Classe I revelou marcações
em 4 cromossomos nas regiões terminais, já a hibridação ”in situ” com a
sonda da Classe II mostrou 2 marcações nas regiões terminais dos
cromossomos, sendo sintênicas com a Classe I.
8)
Estudos citogenéticos no gênero
Potamotrygon
, principalmente no que diz
respeito ao uso da hibridação ”in situ” com as sondas de DNAr 18S e 5S,
ainda são totalmente escassos e os dados obtidos no presente trabalho
poderão colaborar com informações para o entendimento dos padrões de
diversificação, especiação e evolução deste grupo de peixes.
eferências ibliográficas
Rio Paraná
–
Próximo ao município de Porto Rico
-
PR.
109
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGR
ÁFICAS
ABUÍN, M.; CLABBY, C.; MARTÍNEZ, P.; GOSWAMI, U.; FLAVIN, F.; WILKINS,
N.P.; HOUGHTON, J.A.; POWELL, R.; SÁNCHES, L. A NOR associated
repetitive element present in the genome two Salmo species (Salmo solar and
Salmo truta). Genome 39:671
-
679, 1996.
ACHENBACH, G.M. & ACHENBACH, S.V.M. Notas acerca de algumas espécies
de “raya fluvial” (Batoidei, Potamotrygonidae) que frecuentan el sistema
hidrográfico del rio Paraná médio em el departamento La Capital (Santa Fé –
Argentina).
Comunicaciones del Museo Provincial de Ciências Naturales, 8: 1-
34, 1976.
AGOSTINHO, A.A.; JÚLIO JR., H.F.; GOMES, L.C.; BINI, L.M.; AGOSTINHO, C.S.
(1997). Composição, abundância e distribuição espaço-temporal da
ictiofauna. In: Vazzoler, A.E.A.M.; Agostinho, A.A.; Hahn, N.S. (Eds.). A
planície de inundação do alto rio Paraná: Aspectos físicos, biológicos e
socioeconômicos.
Maringá, EDUE , 179
-
208.
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F.
,
FORESTI
F. and
TOLEDO
-
FILHO
S.A. Complex sex
chromosome system in
Eigenmannia
sp. (Pisces, Gymnotiformes).
Genetica,
v.64, p.165
-
169, 1984.
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F. & TOLEDO, S.A. Diferenciação de regiões
ricas em AT e GC em Eigenmannia sp. (Pisces, Sternopygidae), através da
coloração por quinacrina e mitracina. Rev. Brasil Genet. 14 (3): 56, 1991.
ALMEIDA
-TOLEDO, L. F. FORESTI, F., OLIVEIRA, C. A citogenética de Peixes no
Brasil.
X encontro brasileiro de ictiologia. Universidade São Paulo, pp.
347
-
363, 1993.
ALMEIDA
-
TOLEDO,
L.F., DANIEL-SILVA, M.F.Z., LOPES, C.E. and
TOLEDO
-
FILHO
S. A.
Sis
tema de cromossomos sexuais com heterogametia masculina
do tipo X1X1X2X2/X1X2Y em
Hypopomus
sp. (Gymnotoidei, Hypopomidae).
In: Resumos do 41° Congresso Nacional de Genética, Caxambu, MG, p. 465,
1995.
110
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F. Cytogenetic markers in neotropical freshwater fishes.
In:
MALABARBA, L.R.; REIS, R.E.; VARI, R.P.; LUCENA, Z.M.; LUCENA, C.A.S.
Phylogeny and classification of neotropical fishes, EDIPUCRS. Porto Alegre,
p. 583
-
588, 1998.
ALMEIDA TOLEDO, L.F.; FORESTI, F. & TOLE
DO
-FILHO, S.A. Karyotipic
evolution in Neotropical freshwater fish. In Chromosome Today, v.13.
Switzerland: Birkhauer Verlag, p. 169
-
182, 2000b.
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F. and FORESTI, F. Morphologically differentiated sex
chromosomes in Neotropical freshwater fish. Genetica,
v.111, p. 1
-
3, 2001.
ALMEIDA
-TOLEDO L.F., OZOUF-COSTAZ C., FORESTI F., BONILLO C.,
PORTO
-FORESTI F. E DANIEL-SILVA M.F.Z. Conservation of the 5S-
bearing
chromosome pair a
nd colocalization with major rDNA
cluster
s in five species of
Astyanax
(Pisces, Characidae). Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4): 229-
233,
2002.
ALMEIDA, M.P. Pesca, policromatismo e aspectos sistemáticos de Potamotrygon
scobina Garman, 1913 (Chondrichthyes: Potamotrygonidae) da região da Ilha
de Colares – Baía de Marajó – Pará. Dissertação de mestrado. Universidade
Federal do Pará e Museu Paranaense Emílio Goeldi.
145p., 2003.
ALTSCHUL SF, GISH W, MILLER W, MYERS EW, LIPMAN DJ. Basic local
alignment search t
ool. J Mol Biol 215: 403
-
410, 1990.
ALVES, A. L. ; OLIVEIRA, CLAUDIO DE ; FORESTI, FAUSTO ; GRANADO, A ;
NIRCHIO, M. Karyotypic relationships among tribes of Hypostominae
(Siluriformes: Loricariidae) with description of XO sex chromosome system in a
Neotr
opical fish specie .. Genetica (The Hague), v. 128, p. 1
-
9, 2006.
AMEMIYA C.T. e GOLD J.R. Chromomycin A3 stains nucleolus organizer regions
of fish chromosomes
. Copeia, 1: 226
-
231, 1986.
AMEMIYA, C. T., GOLD, J. R. Chromosomal NORs as taxomic and systemat
ic
characters in North American cyprinidae fishs.
Genetica 76
: 81
-90, 1988..
111
ANDREATA, A. A., ALMEIDA-TOLEDO, L. F., OLIVEIRA, C., ALMEIDA-
TOLEDO
FILHO, S. Studies in Hypoptopomatinae (Pisces, Siluriformes, Locariidae).
I.
XX/ XY Sex chromossome heteromorphims in Pseudotocinclus tietensis
.
Citologia
57
:369
-
372
,
1992.
ANDREATA, A.A., ALMEIDA-TOLEDO, L.F., OLIVEIRA, C., TOLEDO-FILHO, S.A.
Chromosome studies in Hypoptopomatinae (Pisces, Siluriformes, Loricariidae).
II. ZZ/ZW Sex-chromosome system, B chromosomes, and constitutive
heterochromatin differentiation in Microlepidogaster leucofrenatus.
Cytogenet.
Cell Genet., v.63, p. 215
-
220, 1993.
ANDREATA, A.A. Estudos citogenéticos no gênero Microlepidogaster (Pisces,
Loricariidae, Hypoptopomatinae). Tese de
Dou
torado. Instituto de Biociências,
Universidade de Estadual Paulista, UNESP, Botucatu, SP, 196p, 2002.
ARAÚJO, M.L.G. Biologia Reprodutiva e pesca de Potamotrygon sp.
(Chondrichthyes
- Potamotrygonidae) no médio Rio Negro, Amazonas
.
Dissertação
de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisa da Amazonia/
Universidade do
Amazonas. 164 p, 1998.
ARAÚJO, M.L.G. Primeiro relatório parcial da situação dos estoques de arraia da
família Potamotrygonidae utilizadas como Peixe Ornamental.
Relatório
apresentado
ao IBAMA
-
AM
, p. 25, 1999.
ARTONI, R.F
, VENERE, P.C. and
BERTOLLO, L.A.C
.
A heteromorphic ZZ/ZW
sex chromosome system in fish, genus
Hypostomus
(Loricariidae).
Cytologia,
v.63, p. 421
-
425,
1998.
ARTONI R.F., MOLINA W.F., BERTOLLO L.A.C. e GALETTI JR. P. M.
Heterochr
omatin analysis in the fish species Liposarcus anisitsi
(Siluriformes)
and Leporinus elongatus (Characiformes). Genet. Mol. Biol., 22: 39-
44, 1999.
ARTONI, R.F., FALCÃO, J.N., MOREIRA-FILHO, O., BERTOLLO, L.A.C. An
uncommon condition for a sex chromosome system in Characidae fish.
Distribution and differentiation of the ZZ/ZW system in
Triportheus
.
Chromosome Research, v.9, p. 449
-
456, 2001.
112
ARTONI, R.F., BERTOLLO, L.A.C. Evolutionary aspects of the ZZ/ZW sex
chromosome system in the Characidae fish, genis Triportheus. A
monophyletic state and NOR location on the chromosome. Heredity, v.89, p.
15
-
19, 2002.
ASAHIDA, T., IDA, H., INOUE, S. Karyotypes of three rays in the order
Myliobatiformes. Jpn. J. Ichthyol. 33, 426
–
430, 1987.
ASAHIDA, T. & IDA, H. Karyotypes of two Rays, Torpedo tokionis and Dasyatis
matsubarai, and Their Systematic Relationships. Japanese Journal of
Ichthyology, V.37, n.8. 71
-
75, 1990.
ASAHIDA, T., IDA, H., TERASHIMA, H., CHANG, H.Y. The karyotype and cellular
DNA content of a ray, Mobula
japonica. Jpn. J. Ichthyol. 40, 317
–
322, 1993.
BAKER WJ, HEDDERSON TA, DRANSFIELD J. Molecular phylogenetic of
Calamus
(Palmae) and related rattan genera based on 5S nrDNA spacer
sequence data. Molecular Phylogenetic Evolution 14
: 218
-
231,
2000.
BEÇAK, W.; BEÇAK, M.L. Cytotaxonomy and chromosomal evolution in
Serpentes. Cytogenetics, 8: 247
-
262,
1969.
BEÇAK, W. Evolution and differentiation of sex chromosomes in lower Vertebrates.
Differentiation, v.23, suppl., p. S3
-
S12, 1983.
BERNARDI, G. (1993). The vertebrate Genome: Isochores and Chromosomal
Bands. In: Chromosomes Today, A.T. Summer and A.C. Chandle (eds).
Chapman and Hall, London. Vol. 11, pp. 49-
60.
BERTOLLO, L.A.C. Estudos citogenéticos no gênero Hoplias Gill, 1903 (PISCES,
ERYTHRINIDAE). Tese de Doutorado, Departamento de Genética e
Matemática Aplicada, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade
de São Paulo. 164p, 1978.
BERTOLLO, L.A.C.; TAKAHASHI, C.S. & MOREIRA-FILHO, O.
Cytotaxonomic
consideration on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythri
nidae).
Revista Brasileira de
Genética
1
: 103
-
120, 1978.
113
BERTOLLO, L.A.C., TAKAHASHI, C.S., MOREIRA-FILHO, O. Karyotypic studies of
two allopatric populations of the genus
Hoplias
(PISCES, ERYTHRINIDAE).
Rev. Bras. Genet., v.2, p. 17
-
37, 1979.
BERTOLLO, L.A.C., TAKAHASHI, C.S., MOREIRA-FILHO, O. Multiple sex
chromosomes in the genus
Hoplias
(Pisces, Erythrinidae). Cytologia, v.48, p.
1-
12, 1983.
BERTOLLO,
L.A.C. and CAVALLARO, Z. I.
A
highly differentiated ZZ/ZW sex
chromosome system in a Characidae fish
,
Triportheus guentheri
.
Cytogenet.
Cell Genet
.
, v.60, p. 60
-
63
, 1992.
BERTOLLO,
L.A.C., FONTES, M.S.,
FENOCCHIO, A.S. and GANG, J.
The
X1X2Y sex chromosome system in the fish Hoplias malabaricus. I. G-, C- and
chromosome replication banding.
Chromo
some R
es., v.5, p. 493
-
499, 1997.
BERTOLLO,
L.A.C
. and MESTRINER, C.A. The X1X2Y sex chromosome system
in the fish
Ho
plias malabaricus. II. Meiotic analysis.
Chromo
some Res., v.6, p.
141
-
147, 1998.
BORN, G.G. and
BERTOLLO,
L.A.C.
An
XX/XY sex chromosome system in a fish
species,
Hoplias malabaricus, with a polymorphic NOR-bearing X
chromosome.
Chromosome Res., v.8, p. 111
-
118,
2000.
BRASIL. Portaria nº 145/98, de 29 de outubro de 1998: dispõe sobre introduções,
re
-introduções e transferências de espécies aquáticas no Brasil. Diário Oficial
da União, Brasília, 1998.
BRITSKI, H.A.; SILIMON, K.Z.S. & LOPES, B.S
.
Peixes do Pantanal. Manual de
identificação.
Brasília, Embrapa
-
SPI. 184p.,
1999.
BRITTO, S.G.C. Peixes do Rio Paranapanema. 1ª ed. Horizonte Geográfico, São
Paulo, 2004. BRITSKI, H.A.; SILIMON, K.Z.S. & LOPES, B.S
.
Peixes do
Pantanal. Manual de
identificação.
Brasília, Embrapa
-
SPI. 184p.,
1999.
BRUM, M.J.I., GALETTI JR., P. M. CORREA, M. M. O.
and AGUILAR, C.T. M
ultiple
sex chromosomes in South Atlantic fish, Brevoortia aurea (Clu-
peidae).
Brazil.
J. Genet, v.15, p. 547
-
553, 1992.
114
BULL, J.J. Sex Determination in Reptiles. The Quarterly Review of Biology, 55 (1):
3-
21, 1980.
CÂNDIDO
-SILVA, A.G. Morfometria e ecologia de Potamotrygon motoro e
Potamotryg
on falkneri (Chondrichthyes:Potamotrygonidae) da planície de
inundação do alto rio Paraná, Brasil. Tese de Mestrado. Universidade
Estadual de Maringá, 2006.
CARVALHO, M. L. Avaliação do conteúdo de DNA nuclear em células de peixes
Characiformes da região N
eotropical
. Tese de Doutorado, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, SP, 2001.
CARVALHO, M.R.; LOVEJOY, N.R. & ROSA, R.S. Family Potamotrygonidae (river
stingrays).
In:
Reis, R.E.; Kullander, S.O. & Ferraris Jr., C.J. (orgs.). Check
List the Freshwater Fishes of South and Central America. Porto Alegre:
Edipucrs.
329
-
347p.,
2003.
CASTELLO, H.P. & YAGOLKOWSKI, D. R. (1969). Potamotrygon castexi n. sp.,
una nueva especie de raya de agua dulce del rio Paraná. Acta Scientifica.
ILAFIR. 21p.
CASTRO, J.; VIÑA
, A.; SÁNCHES, L.; MARTINEZ, P. Caracterization of na atypical
NOR site polymorfism in Brown trout (Salmo trutta) with Ag and CMA3-
staining, and fluorescent in situ hybridization. Cytogenet. Call Genet, v.75,
p.234
-
239, 1996.
CENTOFANTE, L., BERTOLLO, L.A.C. and MOREIRA FILHO, O. Comparative
cytogenetics among sympatric species of
Characidium
(Pisces,
Characiformes). Diversity analysis with the description of a ZW sex
chromosome system and natural triploidy. Caryologia, v.54, p. 253-
260, 2001.
CENTOFANTE, L., BERTOLLO, L.A.C. and MOREIRA FILHO, O. A ZZ-ZW sex
chromosome system in a new species of the genus
Parodon
(Pisces,
Parodontidae). Caryologia, v.55, p. 139
-
150, 2002.
CENTOFANTE, L., PORTO, J. I. R., FELDBERG, E. Chromosomal polymorphism
in
Serrasalmus
spilopleura
Kner, 1858 (Characidae, Serrasalminae) from
Central Amazon basin.
Caryologia 55 (1)
: 37
-
45, 2002.
115
CENTOFANTE, L., BERTOLLO, L.A.C., BUCKUP, P.A. and MOREIRA FILHO, O.
Chromosomal divergence and maintenance of sympatric
Characidium
fish
species
(Crenuchidae, Characidiinae).
Hereditas, v.138, p. 213
-
218, 2003.
CESTARI A.N. (1973). Métodos de estudo dos cromossomos de vertebrados. In:
Exercícios práticos de genética. Companhia Editora Nacional - Editora da
Universidade de São Paulo, São Paulo. p. 2
9-
31.
CESTARI, M. M. (1996)
.
Estudos citogenéticos bioquímicos em peixes do gênero
Serrasalmus
(Characiformes). Tese de doutorado. Universidade Federal de
São
Carlos, SP. 232p.
CESTARI, M. M.; GALLETTI Jr., P. M. (1992a). Chromosome studies of
Serrasalmus
spilopleura
(Characidae, Serrasalminae) from the Paraná-
Paraguai rivers: evolution and cytotaxonomic considerations.
Copeia
. (1): 108-
112.
CHARLESWORTH, B. The evolution of sex chromosomes. Science 251(4997):
1030
-
3, 1991.
CHARVET
-ALMEIDA, P.; ARAÚJO, M.L.G.; ROSA, R.S. & RINCÓN, G.
Neotropical freswater stingrays: diversity and conservation status. Shark
News, 14: 47
-
51, 2002.
COLE CJ, LEAVENS CR. Chromosome preparations of amphibians and reptiles:
improved technique.
Herpetology
3: 102, 1971.
COMPAGNO, L.J.V. & COOK, S.F. The exploitation and conservation of freshwater
elasmobranches: status of taxa and prospects for the future. Journal of
Aquariculture & Aquatic Sciences, 7: 62-
90, 1995.
CRISP MD, APPELS R, SMITH FM, KEYS WMS. Phylogenetic evaluation of 5
S
ribosomal RNA gene and spacer in the
Callistachys
group (Fabacea:
Mirbelieae).
Plant Systematics and Evolution 218
: 33
-
42,
1999.
CRONN RC, ZHAO X, PA
TERSON AH, WENDEL JF
.
Polymorphism and concerted
evolution in a tandemly repeated gene family: 5S ribosomal DNA in diploid
and allopolyploid cottons.
Journal of Molecular Evolution 42
: 685
-
705,
1996.
116
DEVLIN R.H
and NAGAHAMA, Y. Sex determination and sex differentiation in fish: an
overview of genetic, physiological, and environmental influences. Aquaculture,
208: 191
-
364, 2002.
DIAS, A. L. and FORESTI, F. Cytogenetic studies on fishes of the family
Pimelodidae (Siluroidei).
Brazil. J. Genet, v.16, p. 585
-
600,
1993.
DONAHUE, W.H. A karyotypic study of three species of Rajiformes
(Chondrichthyes, Pisces). Can.
J. Genet. Cytol. 16: 203
-
211, 1974.
EGGERT, C. Sex determination: the amphibian models. Reprod. Nutr. Dev. 44 (6):
539
-
49, 2004.
EGOZCUE Y (1971
) Técnicas em citogenética. Editora Espaxs, Barcelona. 144p.
EVANS, H. J.; BUCKLAND, R. A. & PARDUE, M. L. (1974). Localization of the
genes coding for 18s and 28s ribosomal RNA in the human genome.
Chromosoma,
48: 405
-
426.
FALCÃO, J. N. Caracterização cariotípica em peixes do gênero
Triportheus
(Teleostei, Characiformes, Characidae). Tese de Doutorado. Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 1988.
FELDGERG, E., BERTOLLO, L.A.C.,
ALMEIDA
-
TOLEDO,
L.F, FORESTI, F. and
MOREIRA
-FILHO, O. Biological aspects of Amazonian fishes. IX. Cytogenetic
studies in two species of the genus
Semaprochilodus
(Pisces,
Prochilodon
tidae).
Genome., v.29, p. 1
-
4,
1987.
FELDBERG, E., PORTO, J. I. R., SANTOS, E. B. P., VALENTIM, F. C. S. (1999).
Cytogenetic studies of two freshwater Scianids of the genus
Plagioscion
(Perciformes, Sciaenidae) from the central Amazon. Genet. and mol. Biol.
22
(3): 351
-
356.
FERREIRA, I.A., OLIVEIRA, A. VENERE, P.C., GALETTI, P.M. E MARTINS, C
.
5S
rDNA variation and its phylogenetic inference in the genus Leporinus
(Characiformes: Anostomidae). Genetica 129:253
-
257,
2007.
FERRO, D.A.M.; MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, L.A. Nucleolar organizing
regions, 18S and 5S in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): Population
distribution and functional diversity. Genetica, v.110, p.55
-
62, 2001.
117
FISCHER, C., OZOUF-COSTAZ, C., CROLLIUS, H.R., DASILVA, C., JAILLON, O.,
BOUNEAU, L., BONILLO, C., WEISSENBACH, J., BERNOT, A. Karyotype and
chromosomal location of characteristic tandem repeats in the pufferfish
Tetraodon nigroviridis. Cytogenet Cell Genet 88: 50
-
55, 2000.
FORESTI F, ALMEIDA-TOLEDO LF AND TOLEDO SA – Polymorphic nature of
nucleolus organizer regions in fishes.
Cytogen. Cell Genet. 31: 137
-
144, 1981.
FORESTI, F. Estudos cromossômicos em Gymnotiformes (Pisces, Ostariophysi).
Tese de Livre Docência. Instituto Básico de Biologia Médica e Agrícola,
Universidade Esta
dual Paulista.
Botu
catu, SP, 1987.
FORESTI, F., ALMEIDA-TOLEDO, L.F., TOLEDO, S.A. Supernumerary
chromosome system, C-banding pattern characterization and multiple
nucleolus organizer regions in Moenkhausia sanctaefilomenae (Pisces,
Characidae). Genetica
79: 107
-
114, 1989.
FORESTI, F., OLIVEIRA, C. AND
ALMEIDA
-TOLEDO, L.F. A method for
chromosome preparationsfrom large fish specimens using in vitro short-
term
treatment with colchicine.
Experientia 49
: 810
-
813, 1993.
FRANCIS, R.C. & BARLOW, G.W. Social control of primary sex differentiation in
the Midas Cichlid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 90 (22): 10673
-
75, 1993.
GALETTI Jr., P. M. Aspectos citogenéticos da família Anostomidae (Pisces,
Characiformes)
. Tese. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade
Federal
de São Carlos
–
SP. 204p, 1984.
GALETTI Jr., P. M., FORESTI, F., BERTOLLO, L. A. C., MOREIRA-FILHO, O.
Characterization of eight species of. Anostomidae (Cypriniformes) fish on the
basis of the n
ucleolar organinzing region.
Caryologia
,
37 (4)
: 401
-
406, 1984.
GALETTI JR., P.M., SILVA, E.B., CERMINARO, R.T. A multiple NOR system in the
fish
Serrasalmus spilopleura
(Serrasalminae, Characidae).
Rev Brasil Genet 8
:
479
-
484, 1985.
118
GALETTI Jr., P.M., FORESTI, F. Two new cases of ZZ/ZW heterogamety in
Leporinus (Pisces, Anostomidae) and their relationships in the phylogeny of
the group.
Brazil. J. Genet, v.1, p.
135
-
140,
1987.
GALETTI Jr., P. M., CESAR, A. C. G., VENERE, P. C (1991a).
Heterochromatin
and
NORs variability in
Leporinus
fish (Anostomidae, Characiformes).
Caryologia, 44
(3
-
4):287
-292. GALETTI Jr., P.M., FORESTI, F. Two new
cases of ZZ/ZW heterogamety in Leporinus (Pisces, Anostomidae) and their
relationships in the phylogeny of the group.
Bra
zil. J. Genet, v.1, p.
135
-
140,
1987.
GALETTI JR. P.M. e RASCH E.M. Chromosome studies in Poecilia latipunctata
with NOR polymorphism as shown by silver nitrate and chromomycin A3
(Teleostei: Poeciliidae)
. Ichthyol. Explor. Freshwaters, 4: 269
-
277, 1993.
GALETTI Jr., P. M., MESTRINER, C. A., VENERE, P. C., FORESTI, F. (1991b).
Heterochromatin and karyotypic reorganization in fish of the family
Anostomidae (Characiformes).
Cytogenet. Cell Genet
.
, 56
: 116
-
121.
GALETTI
Jr
, P.M., LIMA,
N. R. W. and VENERE,
P.C.
A monophyletic ZW sex
chromosome system in
Leporinus
(Anostomidae, Characiformes).
Cytologia,
v.60, p. 375
-
382,
1995.
GARCIA
–PARRA, W. J. (2000). Citogenética Comparativa de Peixes da Subfamília
Myleinae (Serrasalmidae, Characiformes) da Amazônia Cent
ral
. Tese de
Doutorado
–
INPA: 156p.
GARRONE NETO, D.; HADDAD JR., V.; VILELA, M.J.A.; UIEDA, V.S. Registro de
ocorrência de duas espécies de potamotrigonídeos na região do Alto Rio
Paraná e algumas considerações sobre sua biologia.
Biota Neotropica v7 (n1
),
2007.
GORNUNG, E., GABRIELLI, I., CATAUDELLA, S., SOLA, L. CMA
3
-banding pattern
and fluorescence in situ hybridization with 18S rRNA genes in zebrafish
chromosomes.
Chromos Res 5
: 40
-
46, 1997.
119
GORNUNG E, DE INNOCENTIIS S, ANNESI F, SOLA L. Zebrafish 5S rRNA
genes map to the long arms of chromosome 3. Chromosome Res 8:362-
362,
2000.
GRUBER, S.H.; HAMASAKI, D. I. & DAVIS B.L. (1975). Window to the epiphysis in
sharks Copeia.
378
–
380p.
GUERRA, M.
Introdução à Citogenética de Geral
.
Ed. Guanabara, pg. 142
,
1988.
HALL, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-
98,
1999.
HATANAKA & GALETTI JR. Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in
the fish
Prochilodu
s argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes,
Prochilodontidae).
Genetica
.
239
-
244, 2005.
HOFGATNER, F.J., KRONE, W., JAIN, K. Correlated inhibition of ribosomal RNA
synthesis and silver staining actinomycin D.
Hum Genet
47
: 329
-
333, 1979.
HOWELL, W.M., BLACK, D.A. Location of the nucleolus organizer regions on the
sex chromosomes of the banded killifish, Fundulus diaphanus. Copeia, v.3, p.
544
-
546, 1979.
HOWEL
L WM & BLACK DA. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions
with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: 1014-
1015, 1980.
IDA, H., I. SATO AND N. MIYAWAKI. Karyotypes of two species in the order
Torpediniformes.
Ja
p. J. Ichthyol. 32: 107
–
111,
1985.
JAZEN, F.J. & PHILIPS, P.C. Exploring the evolution of environmental sex
determination, especially in reptiles. Journaul of evolutionary biology, 19 (6):
17775
-
84, 2006.
JESUS C.M. Contribuições aos estudos citogenéticos da família Parodontidae
(Pisces, Characiformes). Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de
São Carlos. São Carlos, SP, 1996.
JESUS C.M. and
MOREIRA
-FILHO, O. Karyotipes of three species of Parodon
(Teleostei, Parodontidae).
Ichthyol. Explor. Freshw
ater, v.11, p. 75
-
80,
2000.
120
JESUS, C.M.; MOREIRA-FILHO, O. Chromosomal localiztion of 5S and 18S rRNA
genes in Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae). Caryologia,
v.56, p.281
-
287, 2003.
JOFFE BI, VALIEJO-ROMAN KM, BIRSTEIN VY, TROITSKY AV. 5S rRNA
sequences of 12 species of flatworms: implications for the phylogeny of the
Platyhelminthes
. Hydrobiologia 305
: 37
-
43, 1995.
KAVALCO, K.F. e MOREIRA
-FILHO, O. Cytogenetical analyses in four species of the
genus Astyanax (Pisces, Characidae) from Paraíba do Sul River Basin.
Caryologia, v.56, n.4, p.453
-
461, 2003.
KEMP, N.E. (1999). Integumentary system and teeth. In:Hamlett, W.C. (ed.)
Sharks, Skates and Rays. The Johns Hopkins University Press. Baltimore. 02-
42p.
KLIGERMAN, A.D. & BLOOM, S.E. Rapid chromosome preparations from solid
tissues of fishes. Journal of the Fisheries Research Board of Canada 34: 266-
269, 1977.
KLINKHARDT, M. B. (1998). Some aspects of karyoevolution in fishes.
Animal
Research and development.
Volume 47.
LEE MR, ELDER FFB. Yeast simulation for bone marrow mitosis for cytogenetic
investigation.
Cytogenet Cell Genet
26: 36
-
40, 1980.
LEVAN, A., FREDGA, K. and SANDBERG, A.A. Nomenclature for centromeric
position on chromosomes. Hereditas, v.52, p. 201
-
220, 1964.
LONG, E.O. & DAVID, I.D. Repeated genes in eukaryotes. Ann Rev Biochem 49:
727
-
764, 1980.
LOWE, C.; GOODMAN-LOWE, G. (1996). Suntanning in hammerhead sharks.
Nature. 383. 677p.
LUCCHINI, S.; NARDI, I.; BARSACCHI, G.; BATISTONI, R.; ANDRONICO, F
.
Molecular cytogenetics of the ribosomal (18S + 28S and 5S) DNA loci in
primitive and advanced urodele amphibians.
Genome, v.36, p.762
-
773, 1993.
121
MAISTRO, EL. (1996). Caracterização morfológica e estrutural de cromossomos
supranumerários em peixes. Tese de Doutorado. Instituto de Bioc
iências,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu (SP).
MAISTRO, E.L., MATA, E.P., OLIVEIRA, C. and FORESTI, F. Unusual occurrence
of a ZZ-ZW Sex-chromosome system and supernumerary chromosomes in
Characidium
cf.
fasciatum
(Pisces. Characiformes, Characidiinae). Genetica,
v.104, p. 1
-
7, 1998.
MAKINO, S. The chromosomes of two elasmobranch fishes. Cytologia 2: 867-
876,
1937.
MANIGLIA, T.C.; BONI, T.A.; BIGNOTTO, T.S.; CARLOS, V.A.; GOMES, V.N.;
LÚCIO, L.C.; MACHADO, S.A.; PRIOLI, S.M.A.P.; PRIOLI, A.J. (2007
).
Caracterização molecular de duas espécies de raias (Chondrichthyes,
Potamotrygonidar) da planície de inundação do Alto Rio Paraná. XVII
Encontro Brasileiro de ictiologia
–
EBI 2007.
MANTOVANI, M., ABEL, L.D.S., MESTRINER, C.A., MOREIRA-FILHO, O.
Accentu
ated polymorphism of heterochromatin and nucleolar organizer
regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): tools for understanding
karyotypic evolution. Genetica, v.109, p. 161
-
168, 2000.
MARGARIDO V.P. e GALETTI JR. P.M. (2000). Amplification of a GC-
rich
heterochromatin in the freshwater fish Leporinus desmotes (Characiformes,
Anostomidae). Genet. Mol. Biol., 23: 569-
573.
MARTINEZ, J.L.; MORÁN, P.; GARCIA-VÁZQUEZ, E.; PENDÁS, A.M. Chromosomal
localization of the major and 5S rRNA genes in the European eel (Anguilla
anguilla). Cytogen Cell Genet., v.73; p.149
-
152, 1996.
MARTINS, C. & GALETTI JR., P.M. Narrow chromosome diversity in fishes of the
genus
Schizodon
(Characiformes, Anostomidae).
Cytobios 92
: 139
-
147, 1997.
MARTINS, C., GALETTI Jr., P.M. Karyotype similarity between two sympatric
Schizodon
fish species (Anostomidae, Characiformes) from the Paraguay
River basin. Genetics and Molecular Biology, v. 21, p. 355-
360, 1998.
122
MARTINS, C. & GALETTI, P.M. Chromosomal localization of 5S rDNA genes in
Leporinus
fish (Anastomidae, Chraciformes). Chromosome Research 7: 363-
367, 1999.
MARTINS C, WASKO AP, OLIVEIRA C, WRIGHT
JM.
Nucleotide sequence of 5S
rDNA and localization of the ribosomal RNA genes to metaphase
chromosomes of the tilapiine cichlid fish
,
Oreochromis niloticus
.
Hereditas
133:
39
-
46,
2000.
MARTINS C, GALETTI PM. Organization of 5S rDNA in species of the fish
Leporinus
: two different genomic locations are characterized by distinct
nontranscribed spacers.
Genome 44
: 903
-
910, (2001a).
MARTINS
C, WASKO AP. Organization and evolution of 5S ribosomal DNA in the
fish genome. In Williams CR (ed) Focus on Genome Research. Nova Science
Publishers, Hauppauge, NY, pp 335
-
363, 2004.
MAYR, B., KALAT, M., RAB, P. Localization of NORs and counterstain-
enha
nced
fluorescence studies in Salmo gairdneri and Salmo trutta
.
Theor Appl Genet
71
: 703
-
707, 1986.
MEDRANO, L.; BERNARDI, G.; COUTIRIER, J. & DUTRILLAUX, B. (1988).
Chromosome banding and genome compartmentalization in fishes.
Chromosoma 96: 178
-
183.
MENGD
EN, G. A., AND A. D. STOCK. Chromosomal evolution in Serpentes; a
comparison of G and C banding patterns of some colubrid and boid genera.
Chromosoma 79:53–64.MICHELLE, J. L., TAKAHASHI, C. S. and FERRARI I.
(1997). Karyotypic studies of some species of the family Loricariidae (Pisces).
Cytologia, v.42, p. 539
-
546,
1980.
MESSIAS LH, FERREIRA DC, WASKO AP, OLIVEIRA C, FORESTI F, MA
RTINS
C. 5S rDNA organization in the fish Synbranchus marmoratus
(Synbranchidae, Synbranchiformes). Hereditas 139:228
-
231, 2003.
MICHELLE, J. L., TAKAHASHI, C. S. and FERRARI I. Karyotypic studies of some
species of the family Loricariidae (Pisces).
Cytologia, v.42, p. 539
-
546,
1997.
123
MOLINA, W. F. (1995). Cromossomos sexuais e polimorfismo cromossômico no
gênero
Leporinus
(Pisces,
Anostomidae)
. Dissertação de Mestrado,
Universidade Federal de São Carlos. 177p.
MOLINA, W.F. and BERTOLLO L.A.C. Cromossomos sexuais múltiplos em
Erythrinus erythrinus (Pisces, Erythrinidae). In: XXIV Congreso Argentine de
Genetica,
Posadas, Misiones, A
rgentina, p.126,
1993.
MOLINA, W.F., SCHMID M. and GALETTI Jr., P.M. Heterochromatin and sex
chromosomes in Neotropical fish genus
Leporinus
(Characiformes,
Anostomidae).
Cytobios, v.94, p. 141-
149, 1998.
MORÁN P, MARTÍNEZ JL, GARCIA-VÁSQUEZ E, PENDÁS AM
.
Sex chromosome
linkage of 5S rDNA in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss
).
Cytogenetics and
Cell Genetics 75
:
145
-
150, 1996.
MOREIRA
-FILHO, O., BERTOLLO, L.A.C., GALETTI Jr., P.M. Evidences for a
multiple sex system with female heterogamety in Apareiodon af
finis
(Pisces,
Parodontidae). Caryologia, v.33, p. 83
-
91, 1980.
MOREIRA
-FILHO, O., BERTOLLO, L.A.C., GALETTI JR., P.M. Distribution of sex
chromosome mechanisms in Neotropical fish and description of a ZZ/ZW
system in
Parodon hilarii
(Parodontidae). Caryol
ogia, v.46, p. 115
-
125, 1993.
MORESCALCHI, A. Chromosomes, sex determination and environment in
teleostens
.
In
: Dallai R. (Ed.) Sex Origin and Evolution. Selected Symposia
and Monographs U.Z.I., Modena: Mucchi, p. 137
-
149, 1992.
MORESCALCHI, M.A; L
IGUORI,
L.; ROCCO, L.; ARCHIMANDRITIS, A. &
STINGO, V. Karyotypic characterization and genomic organization of the 5S
rDNA in Polypterus senegalus (Osteichthyes, Polypteridae). Genetica, 132:
179
-
186, 2008.
MURAKAMI M, FUJITANI
H
. Characterization of repetitive
DNA sequences carrying
5S rDNA of the triploid ginbuna (Japanese silver crucian carp, Carassius
auratus langsdorfi).
Genes Genet Syst 73:9
-
20, 1998.
NAKAYAMA, C. M. (1997). Caracterização Cariotípica de Peixes da Subfamília
Serralminae (Characiformes) da Bacia Amazônica. Dissertação de Mestrado.
124
Curso
de Biologia de Água Doce e Pesca Interior. Programa de Pós-
graduação em Biologia tropical e Recursos Naturais. Instituto Nacional de
Pesquisa da Amazônia. Manaus,
Am. 60p.
NAKAYAMA, C. M., JÉGU, M., PORTO, J. I. R., FELDBERG, E. (2001).
Karyological evidence for a cryptic species of Piranhas within
Serrasaumus
rhombeus
(Characidae, Serrasalminae) in the Amazon.
Copeia 3
: 866
-
869.
NANDA I., FEICHTINGER, W., SCHMID M., SCHRODER J.H., ZISCHLER H. and
EPPLEN J.F.
S
im
ple repetitive sequences are associated with dif
ferentiation of
the sex chromosomes in guppy fish.
J. Mol. Evol., v.30, p. 456
-
462, 1990.
NAVARRETE M.C. and JÚLIO Jr. H.F. Polimorfismo cromossômico e
cromossomos sexuais em Curimatideos do pantanal Sul-
Matogrossense
(Characiformes).
In:
VI Simpósio
de Citogenética Evolutiva e Aplicada de
Peixes Neotropicais, p. 57. Universidade Federal de São Carlos, São Paulo,
1996.
NYGREN, A., NILSSON, B. AND JAHNKE, M. Cytological studies in Salmo trutta
and
Salmo al
pinus.
Hereditas,
67: 259
-
268, 1971.
OHNO, S. Sex-chromosome and sex linked genes. Springer-
Verlag.
New York.
192p., 1967.
OLIVEIRA C, ALMEIDA-TOLEDO LF, FORESTI F, TOLEDO FILHO SA
.
Supernumerary chromosomes, robertsonian rearrangements and multiple NORs
i
n
Corydoras aeneus (Pisces, Siluriformes, Callichthyidae).
Caryologia
41: 227-
236, 1988a.
OLIVEIRA,C.; ALMEIDA-TOLEDO, LF.; FORESTI, F. Karyotipic Evolution in
Neotropical Fishes. (Pisano, E.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Kaapoor, B.G.).
Fish cytogenetic
s. USA, Science Publisher, p.11-
152, 2006.
OLMO, E.; STINGO, V.; COBROR, O.; CAPRIGLIONE, T. & ODIERNA, G.
Repetitive DNA and polyploidy in selachians. Comp. Biochem. Physiol. B 73:
739
-
745,
1982.
ORR, R.T.
Biologia dos vertebrados.
São Paulo, Editora Roca
.508 p., 1986.
125
OTA, K., TATENO Y, GOJOBORI T. Highly differentiated and conserved sex
chromosome in fish species (Aulopus japonicus: Teleostei, Aulopidae). Gene
317:187
–
193, 2003.
OZOUF
-COSTAZ, C.; PISANO, E.; BONILLO, C.; AND WILLIAMS, R. (1996).
Ribosom
al RNA location in the Antarctic fishChampsocephalus gunnari
(Notothenioidei, Channichthyidae) using banding and fluorescencein situ
hybridization.
Journal: Chromosome Research, Volume 4, Number 8: 557-
561.
PASONATO, J.C. Estudos citogenéticos em espécies de
Characidium
(Teleostei,
Characiformes, Crenuchidae) e ocorrência de sistema ZZ-ZW de
cromossomos sexuais.
Dissertação de mestrado. UNESP
–
Botucatu, 2006.
PASOLINI, P., COSTAG
LIOLA D, ROCCO L, TI
NTI F
. Molecular organization of 5S
rDNA in Rajidae (Chondrichthyes): Structural features and evolution of piscine
5S rRNA genes and nontranscribed intergenic spacers. J Mol Evol 62:564-
574, 2006.
PAULS, E. & BERTOLLO, L.A.C. Distribution of a supernumerary chromosome
system and aspects of karyotypic evolution in the genus Prochilodus (Pisces,
Prochilodontidae).
Genetica 81
: 117
-
123, 1990.
PENDÁS AM, MORÁN P, FREIJE JP, GARCIA-VÁSQUEZ E. Chromosomal
location and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon
5S rDNA.
Cytogenetics and Cell Gene
tics 67
:
31
-
36, 1994a.
PENDÁS AM, MÓRAN P, MARTÍNEZ JL, GARCIA
-
VÁSQUEZ E.
Applications of 5S
rDNA in Atlantic salmon, brow trout, and in Atlantic salmon x brown trout
hybrid identification. Molecular Ecology 4
: 275
-
276, 1995.
PHILLIPS, R.B. & HARTLEY, S.E. Fluorescent banding patterns of the
chromosomes of the genus
Salmo
.
Genome
30
: 193
-
197, 1988.
PHILLIPS, R.B. & IHSSEN, P.E. Identification of sex chromosomes in lake trout
(
Salvelinus namaycush
). Cytogenetic Cell Genet, v.39, p. 14
-
18, 1985.
PHILLIPS, R. B. & REED, K. M. (1996). Application of fluorescence in situ
hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture,
140(1996): 197
-
216.
126
PICHIRI, G.; NIEDDU, M.; MANCONI, S.; CASU, C.; CONI, P.; SALVADORI, S.
And MEZZANOTTE, R. Isolation a
nd characterization of two different 5S rDNA
in Anguilla anguilla and in Anguilla rostrata: possible markers of evolutionary
divergence.
Molecular Ecology Notes, v.6, 638
-
641, 2006.
PORTO, J. I. R., FELDBERG, E., NAKAYAMA, C. M., FALCÃO, J. N. (1992).
A
ch
ecklist of chromosome number and karyotypes of Amazonian freshwater
fishes.
Rev.
Hidrobiol. Trop. 25 (4)
: 287
-
299.
RÀB P., MAYR B. e ROTH P. (1991) - Chromosome banding study of European
catfish,
Silurus glanis
(Pisces, Siluridae)
. Genética, 83: 153
-
157.
RAB, P. Chromosome study of four poeciliid fishes from Cuba. Folia Zool., v.33, p.
229
-
234, 1984.
REED, K. M. AND PHILLIPS, R. B. Molecular cytogenetic analysis of the double-
CMA
3
chromosome of lake trout, Salvelinus namaycush
.
Cytogenet Cell
Genet
,
70
:
1
04
–
107, 1995.
RICE, W.R. Evolution of the Y sex chromosome in animals. BioScience, v.46, p.
331
-
343, 1996.
ROCCO, L.; COSTAGLIOLA, D.; FIORILLO, M.; TINTI, F. & STINGO, V. Molecular
and chromosomal analysis of ribosomal cistrons in two cartilaginous fish,
Taenura lymma and Raja montagui (Chondrichthyes, Batoidea). Genetica 123:
245
–
253, 2004.
ROCCO, L.; COSTAGLIOLA, D.; MARSILIO, A. & STINGO, V. Localizzazione
cromosomica dei cistroni ribosomali in due Batoidea. Atti 63 Convegno UZI:
120, 2002b.
ROCCO, L.; MORESCALCHI, M.A.; COSTAGLIOLA, D. & STINGO, V. Karyotype
and genome characterization in four cartilaginous fishes. Gene 295: 289-
298,
2002a.
ROCCO, L.; PIZANO, E.; OZOUF COSTAZ, C.; FOSRETI, F. & KAPOOR, B. Fish
Cytogenetycs. Editora Science Publishers, E
ngland, 2006.
127
ROCCO, L.; STINGO, V. & BELLITI, M. (1996). Cloning and characterization of a
repetitive DNA detected by HinIII in the genome of Raja montagui (Batoidea,
Chondrichthyes).
Gene 176: 185-
189.
ROCHA, G. T. (1987). Estudos do complemento cromossômico e da região
organizadora de nucléolos em algumas espécies de aves. Dissertação de
mestrado. Universidade Estadual Paulista, Instituto Básico de Biologia Médica
e Agrícola, Botucatu
–
São
Paulo.
ROSA, R.S. A systematic revision of the South American freshwater stingrays
(Chondrichthyes:Portamotrygonidae). PhD thesis. The College of William and
Mary, Williamsburg. 523p, 1985.
ROSA, R.S., Carvalho, M.R., and Wanderley, C.A. Potamotrygon boesemani
(Chondrichthyes: Myliobatiformes: Potamotrygonidae), a new species of
Neotropical freshwater stingray from Surinam. Neotropical Ichthyology, 6(1):1-
8, 2008.
SAJDAK SL, REED KM, PHILLIPS RB. Intraindividual and interspecies variation in
the 5S rDNA of coregonid fish. Journal of Molecular Evolution 46: 680-
688,
1998
.
SANCHEZ, S., and JORGE, L.C. A new report of the ZZ/ZW sex chromosome
system in the genus Triportheus (Pisces, Triportheinae).
Cytologia
, v.64, p.
395
-
400,
1999.
SATO, E.R. and MARTINS-SANTOS, I.C. Análise citogenética em
Odontostilbe
cf.
microcephala
(Pisces, Cheirodontinae) do Rio Paraná. In: 45°Congresso
Nacional de Genética, Gramado, RS, Brazil, p. 81, 1999.
SCAVONE, M.D. and JULIO Jr. H.F. Cytogenetics analysis and heterochromatin
distribuition in ZZ/ZW sex chromosome of the mailed catfish
Loricariic
hthys
platymetopon (Loricariidae, Siluriformes), Brazil. J. Genet., v.18, p. 31-
35,
1995.
SCHARLT, M. Sex chromosome evolution in non-mammalian vertebrates. Current
Opinion in Genetics and development, 14 (6): 634
-
41, 2004.
128
SCHMID, M. Chromosome banding in
Amphibia. V. Highly differentiates ZW/ZZ sex
chromosomes and exceptional genome size in Pyxicephalus adspersus
(Anura, Ranidae). Chromosoma, v.80, p. 69-
96, 1980.
SCHMID, M., OLERT, J., KLETT, C. Chromosome banding in Amphibia. III. Sex
chromosomes in
Tri
turus
. Chromosoma, v.71, p. 29
-
55, 1979.
SCHMID, M.; VITELLI, L. & BATISTONI, R. Chromosome banding in Amphibia. IV.
Constitutive heterochromatin, nucleolus organizers, 18S + 28S and 5S
ribosomal RNA genes in Ascaphidae, Pipidae, Discoglossidae and
Pelob
atidae. Chromosoma 95: 271
-
284, 1987.
SCHMID, M. & GUTTENBACH, M. Evolutionary diversity of reverse (R) fluorescent
chromosome bands in vertebrates.
Chromosoma
97
: 101
-
114, 1988.
SCHWEIZER, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and
DAP
I. Chromosoma, Berlim, v.58, p.307
-
324, 1976.
SCHWARTZ, F.J., MADDOCK, M.B. Comparisons of karyotypes and cellular DNA
contents within and between major lines of elasmobranch. In: Uyeno, T., Arai,
R., Tuniuchi, T., Matsuura, K. (Eds.), Indo-Pacific Fish Biology Ichthyological.
Society Japan, Tokyo, p. 148, 1986.
SILVESTRO, M. and MARGARIDO, V.P. Sistema de cromossomos sexuais
X1X1X2X2/X1X2Y
em
Erythrinus erythrinus (Pisces, Erythrinidae) do al
to
Paraná, com a descrição de cromossomos supranumerários restritos ao sexo
feminino.
In:
47° Congresso Nacional de Genetica. Águas de Lindóia. SP,
Brazil,
2001.
SOLA, L., MONACO, P.J., RASCH, E.M. Cytogenetics of bisexual/unisexual
species of
Poecilia
. I. C-bands, Ag-NORs polymorphisms and sex-
chromosomes in three populations of Poecilia latipina. Cytogenet Cell Genet
53: 148
-
154, 1990.
SOLA, L., ROSSI, A.R
., IASELLI, V., RASC
H, E.M., MONACO, P.J
.
Cytogenetics of
bisexual/unisexual species of
Poecilia
. II. Analysis of heterochromatin and
nucleolar organizer regions in Poecilia mexicana mexicana by C-
banding,
129
DAPI, quinacrine, chromomycin A
3
and silver staining. Cytogenet Cell Genet
60: p.229
-
235,
1992.
SOUZA, I.A.(2000). Geografia física do Rio Paraná, Brasil. Dissertação de
mestrado. Instituto de Geociências da Univers
idade Estadual de Londrina.
SOUZA I.L., MOREIRA-FILHO O. e GALETTI JR. P.M. (1996).
Heterochromatin
differentiation in the characid fish
Astyanax scabripinnis
. Bras. J. Genet., 19: p.
405
-
410.
STINGO, V. New developments in vertebrate citotaxonomy. II. The chromosomes
of the cartilaginous fishes. Genetica 50, 227–
239, 1979.
STINGO, V., CAPRIGLIONE, T. DNA and chromosomal evolution in cartilaginous
fish. In: Ueno, T., Arai, R., Taniuchi, T., Matsuura, K. (Eds.), Indo-Pacific Fish
Biology. Ichthyological Soci
ety Japan, Tokyo, pp. 140
–
147, 1986.
STINGO, V. & ROCCO, L. Selachian cytogenetics: a review. Genetica 111: p. 329-
347, 2001.
STINGO, V.; ROCCO, L.; & IMPROTA, R. (1989). Chromosome markers and a
karyology of Selachians. J. Exp. Zool. Suppl. 2: p.175
-
185.
STINGO, V.; ROCCO, L.; ODIERNA, G. & BELLITI, M. NOR and heterochromatin
analysis in two cartilaginous fishes by C-
Ag
- and RE (restriction
endonuclease)
-
bading. Cytogenet. Cell. Genet. 71: p.228
-
234, 1995.
STORER, T.; USINGER, R.L; STEBBINS, R.C.
&
NIBAKKE
N, J.W.
Zoologia Geral
.
São
Paulo, Companhia Editora Nacional, 6ª edição. p.816,
1991.
SMITH, W.S. & MARCIANO, F.T. A ictiofauna da Floresta de Ipanema – Iperó, São
Paulo, Brasil, como base para adoções de manejo, conservação e educação
ambiental. II Congresso Brasileiro de Unidades de Conservação: p. 409-
417,
2000.
SUMNER, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin.
Experimental Cell Research 75: p. 304
-
306, 1972.
SUZUKI H, MORIWAKI K, SAKURAI S. Sequences and evolutionary analysis of
mouse 5S rDNAs
. Molecular Biology Evolution
11
: 704
-
710, 1994.
130
SUZUKI, H.; SAKURAI, S.; MATSUDA, Y. Rat DNAr spacer sequence and
chromosomal assignment of the genes to the extreme terminal region of
chromosome 19. Cytogenet. Cell Genet, v. 72, p.1
-4
, 1996.
SWARÇA, A.C., FENOCCHIO, A.S., CESTARI, M.M., DIAS, A.L. Analysis of
heterochromatin by combination of C-banding and CMA3 and DAPI staining in
two species (Pimelodidae, Siluriformes). Genetica, v.119, p. 87
-
92, 2003.
THORSON, T.B.; WOOTON, R. M. & GEORGI, T.D. Rectal gland of freshwater
stingrays, Potamotrygon spp. (Chondrichthyes: Potamotrygonidae), 1978.
UDOVICIC F, MCFADDEN GL, LADIGES PY. Phylogeny of
Eucaliptus
and
Angophora
based on 5S rDNA spacer sequence data. Molecular Phylogeny
and Evoluti
on 4
: 247
-
256, 1995.
UYENO, T. and MILLER, R.R. Multiple sex chromosomes in mexican cyprinodontid
fish.
Na
ture, v.231, p. 452
-
453, 1971.
UYENO T. and MILLER R.R.
Second discov
ery of multiple sex chromosome among
fishes.
Experientia
, v.28, p. 223
-
225,
197
2.
VALENTIM. F.C.S. Caracterização cromossômica em espécies de peixes da
família Potamotrygonidae (CHONDRICHTHYES, RAJIFORMES) do Médio Rio
Negro. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de São Carlos,
2001.
VALLENDER, E.J. & LAHN, B.T. Multiple independent origins of sex chromosomes
in amniotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 103 (48): 18031
-
2, 2006.
VALENTIM, F.C.S.; FALCÃO, J.N.; PORTO, J.I.R. & FELDBERG, E.
Chromosomes of three freshwater stingrays (Rajiformes, Potamotrygonidae)
from the Rio negro basin, Amazon, Brazil. Genetica, 128: p.33
–
39, 2006.
VENERE, P.C. & GALETTI, JR P.M. Chromosome evolution and phylogenetic
relationships of some Neotropical Characiformes of the family Curimatidae.
Revista Brasileira de Genética 12: p.17-
25, 1989.
VENERE, P.C., and GALETTI Jr. P.M.
Cro
mossomos sexuais em
Opsodoras
sp.
(Siluri
formes, Doradidae) do médio rio Araguaia.
In:
VII Simpósio de
131
Citogenética Evolutiva e Aplicada de Peixes Neotropicais, Londrina, PR, p.
10,
1998.
VENERE, P.C., FERREIRA, I.A., MARTINS, C., GALETTI Jr, P.M. A novel ZZ/ZW
sex chromosome system for the genus
Leporinus
(Pisces, Anostomidae,
Characiformes).
Genetica, v.121, p. 75
-
80, 2004.
VERMULM, H. J.; DUARTE-GIAMAS. M.T. (2006). Algumas considerações sobre a
ictiofauna do alto rio Paraná.
VlCENTE, V.E. Estudos citogenéticos e moleculares em Parodon hilarii e
correlações com outras espécies da família Parodontidae (Pisces,
Characiformes).
Tese de Doutorado, Universi
dade Federal
de São Carlos, SP,
Brasil, 96p, 2001.
VILELA, M.J.A., FRANCO, R.A.M. & ALMEIDA, N.V.A. Monitoramento da pesca no
reservatório de Porto Primavera (UHE Engº Sérgio Motta), no Rio Paraná.
Relatório Final (Agosto/2000-Novembro/2003), CESP/FAPEC/UFMS, Três
Lag
oas, 2004.
VISCONTI, M.A.; RAMANZINI, G.C.; CAMARGO, C.R. & CASTRUCCI, A.M.L.
(1999).
Elasmobranchii color change: A short review and novel data on
hormone regulation. J. Exp. Zool. 284: p.485
-
491.
VISSOTTO, P.C., FORESTI, F., OLIVEIRA, C. Supernumerary chromosomes in
two species of the family Pimelodidae (Teleostei, Siluriformes). Chromosome
Science, v.3, p. 9
-
13, 1999.
VIÑAS A, GÓMEZ C, MARTÍNEZ P, SÁNCHEZ L. Localization of rDNA genes in
European eel (
Anguilla anguilla
) by FISH.
Genome
39
: 1220
-1223, 199
6.
VOLFF, J.N. Genome evlution and biodiversity in Teleost fish. Heredity 94 (3): 280-
94, 2005.
XIA, X., XIE, Z. DAMBE: Data analysis in molecular biology and evolution. J.
Heredity 92:371
-
373, 2001.
WASKO, A.P. & GALETTI JR., P.M. Extensive NOR variability in fishes of
the genus Bryconamericus (Characidae, Tetragonopterinae). Cytologia
64:p. 63-67, 1999.
132
WASKO AP AND GALETTI JR PM. Mapping 18S ribosomal genes in fish of
the genus Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization
(FISH). Genetics and Molecular Biology 23: 135-138, 2000.
WASKO, A.P.; MARTINS, C.; WRIGHT, J.M.; GALETTI, P.M. 2001. Molecular
organization of 5S rDNA in fishes of the genus
Brycon
.
Genome 44: p.893-
902.
WILSON, J.F. & DOOD, J.M. 1973. The role of the pineal complex and lateral eyes
in the colour change response of the dogfish. J. Endocrinol. 58: p.303
-
312.
WHITE, T.J.; BRUNS, T.; LEE, S.; TAYLOR, J. 1990. Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in PCR
protocols: a guide to methods and applications. Academic Press Inc., San
Diego, p.315-
322.
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