24
Glicerol, 0,5% Sulfato de amônio, 0,004% Histidina), MGA-2 (0,34% YNB, 4x10
-5
%
Biotina, 1% Glicerol, 0,5% Sulfato de amônio, 0,004% Histidina), MGA-3 (item 8.2.7)
(1,34% YNB, 0,02%
Biotina, 2% Glicerol, 0,5% Sulfato de amônio, 0,004% Histidina); e
um de composição complexa BMGH (item 8.2.9) (1% Extrato de levedura, 2% Peptona,
100mM Tampão Fosfato pH 6,0, 1,34% YNB, 4x10
-5
%
Biotina, 1% Glicerol, 0,004%
Histidina) . As culturas foram colocadas em erlenmeyers de 250 mL e mantidas em
agitação de 250 rpm, 30ºC. Para avaliar o crescimento dos clones de leveduras
transformados foram realizadas medições da densidade óptica a 600 nm (DO
600
) nos
intervalos de 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 36h, 48h, 60h e 72h.
4.9- Delineamento experimental para determinar o perfil de crescimento na fase
de indução
Os clones anteriormente avaliadas, contendo apenas o vetor pFLDα foram
novamente cultivados e além deles um outro clone de P. pastoris transformado com o
vetor pFLDα contendo o inserto do gene da glicoproteína S1 do VBI . Inicialmente foram
cultivados em YPD (item 8.2.3) nas mesmas condições descritas anteriormente.
Durante a pré indução foram cultivados em volumes de 25 mL contidos em erlenmeyes
de 250 mL por 36h. Foram realizadas leituras da DO
600
nos intervalos de 0h, 12h, 18h,
24h e 36h. Após isso as células foram centrifugadas e ressuspendidas em 50 mL dos
meios de indução MMA (item 8.2.8) (1,34% YNB, 0,02% Biotina, 1% Metanol, 1%
Sulfato de amônio, 0,004% Histidina) e BMMH (item 8.2.10) (1% Extrato de levedura,
2% Peptona, 100mM Tampão Fosfato pH 6,0, 1,34% YNB, 4x10
-5
%
Biotina, 0,5%
Metanol, 0,004% Histidina) em erlenmeyers de 250 mL cobertos com uma camada de
gaze. Foram realizadas leituras da DO
600
com 0h, 24h, 48h, 72h e 96h de cultivo. A
cada 24h foi realizada a separação de proteínas de 50 mL de cultura do clone
transformado com o vetor pFLDα contendo o gene de glicoproteína S1 para a avaliação
do intervalo de maior expressão da proteína recombinante