ads:
Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Análise da incidência de Fusarium spp. toxigênico e de níveis de
fumonisinas em grãos ardidos de milho híbrido
Júlia Ronzella Ottoni
Dissertação apresentada para obtenção de título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Microbiologia Agrícola
Piracicaba
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Júlia Ronzella Ottoni
Bacharel em Ciências dos Alimentos
Análise da incidência de Fusarium spp. toxigênico e de níveis de fumonisinas
em grãos ardidos de milho híbrido
Orientador:
Prof. Dr. LUIS EDUARDO ARANHA CAMARGO
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Microbiologia Agrícola
Piracicaba
2008
ads:
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Ottoni, Júlia Ronzella
Análise da incidência de Fusarium spp. toxigênico e de níveis de fumonisinas em grãos
ardidos de milho híbrido / Júlia Ronzella Ottoni. - - Piracicaba, 2008.
54 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. ELISA 2. Fusarium 3. Micotoxinas 4. Milho 5. Reação em cadeia por polimerase 6. Sement
e
- Patologia I. Título
CDD 633.15
O91a
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Dedico
Dedico ao meu pai João Batista Ottoni, que sempre me apoiou incondicionalmente,
me ouve e me orienta em todos os aspectos da minha vida. Ao meu irmão João Evangelista
Ottoni, que apesar das brigas e discussões sei que sempre estará por perto me ajudando com o
que eu precisar. A minha mãe, Maria de Fátima Ronzella Ottoni (in memorian) que mesmo
muito diferente de mim, me deu a vida. A minha tia Maria José Ottoni Bueno da Silva que
sempre participou da minha vida como se fosse minha mãe. Ao meu tio Paulo Roberto Ottoni
(in memorian) que sempre me aconselhou nos momentos de indecisão sobre a vida acadêmica.
4
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai João Batista Ottoni por estar ao meu lado em todos os momentos
sempre com muito carinho.
Ao Prof. Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo pela orientação no mestrado e por
todas as oportunidades durante os quase sete anos de laboratório.
À ESALQ/USP, instituição que me acolhe desde a graduação e que
possibilitou mais essa experiência.
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia que permitiu que eu
aprendesse mais sobre microbiologia nesses 2 anos e meio.
À Dow AgroScience e Roberto Carvalho pela parceria, à CAPES pela
concessão da bolsa de estudos e à FAPESP pelo auxílio financeiro.
Aos colegas do programa, pelos churrascos, viagens e momentos divertidos.
À todos os amigos do LGM: Alexandre, Aninha, Bruno, Carol, Cynthia, Daniel,
Danilo, Erikinha, Fátima, Fernanda, Geovana, Juliana, Lara, Leandro, Márcia,
Neiva, Osmar, Raphaelle, Reinaldo, Thayne, Vyvian. Pela convivência diária,
almoços, festas, churrascos, apoio e auxílio prático e teórico, paciência e por
proporcionarem um ambiente de trabalho leve e aconchegante.
Às minhas estagiárias Marília, Luiza, e Thais. Pela grande ajuda no projeto,
pelo companheirismo, pela dedicação cedida, compreensão comigo e pela amizade
que já deixa saudades.
Ao departamento Fitopatologia: Adriana, Alderi, Ana Paula, Anne, Alessandra,
Barbara, Carmen, Diogo, Edivaldo, Ely, Fabrício, Fernanda e Rodolfo, Helô,
Jefferson, Julio, Liliane, Linda, Luciano, Luana, Moro, Natália, Pastora, Paulo, Thais,
Vanessa. Pela disponibilidade em me auxiliar, amizade, companheirismo.
Ao professor Dr. José Otávio Machado Menten pelo auxílio inicial, pelas
conversas e pela disposição em preservar a união entre todos mesmo estando um
pouco distante. Ao Prof. Dr. Nelson Massola Jr. Pelos ensinamentos da área e
disponibilidade em auxiliar nas dúvidas. Ao Dr. Welington Araújo, Dr. Fernando
Andreoti, Dr. Eduardo Micotti, Dra. Maria Antônia C. Domingues, Prof. Dr. Marcio
Lambais, Dr. Tiago Zucchi, que de alguma forma me ajudaram nesta etapa.
Ao Mario Aguiar pelo auxílio com a tradução.
Aos meus amigos: Flávia e Catarina, Paula Prezotto (D-lícia), Ana Paula
Sanches Loureiro (Aipo), Roberta (1/2 Kilo), Carlos Manocchio, Polé, Manoela,
5
Fernanda, Maíra, Gerusa, I Turma de Ciências dos Alimentos, por fazerem parte da
minha vida, estarem sempre presentes e pela paciência que sempre tiveram comigo.
À minha família: João Batista Ottoni (pai), Maria de Fátima Ronzella Ottoni
(mãe – in memorian), João Evangelista Ottoni (irmão), Mika, tia Zezé, tio Toninho,
Augusto, Gisleiva e Henrique, Andréa, tio André, tia Tereza, Ricardo, Lídia, tio Paulo
(in memorian) e tia Marlene. Pelo apoio incondicional, estrutura e por comporem a
melhor família que alguém pode ter.
Às minhas companheiras de mestrado Cristiane Cipolla Fasanella (Kit), Laura
de Castro Assumpção (Laurinda) e Lilian Luzia Beloti (Bíbian) por todos os
momentos. Por terem se tornado pessoas especiais e essenciais nesses anos. Pela
grande amizade que surgiu e que carregarei pra sempre comigo. Pelas risadas,
discussões e telefonemas diários. Por me consolarem nos momentos difíceis. Pelo
simples fato de estarem por perto.
6
SUMÁRIO
RESUMO..........................................................................................................................8
ABSTRACT......................................................................................................................9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES.............................................................................................10
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................11
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................12
2. DESENVOLVIMENTO ...............................................................................................13
2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.....................................................................................13
2.1.1 A cultura do milho..................................................................................................13
2.1.2 Grãos ardidos........................................................................................................14
2.1.3 Fungos micotoxigênicos........................................................................................15
2.1.4 Fumonisinas..........................................................................................................16
2.1.5 Micotoxicoses........................................................................................................19
2.1.6 Micotoxicoses causadas por fumonisinas .............................................................20
2.1.7 Doenças relacionadas ao consumo de fumonisinas no mundo.............................21
2.1.8 Doenças relacionadas ao consumo de fumonisinas no Brasil...............................22
2.1.9 Recomendações máximas aceitáveis de consumo de fumonisinas nos E.U.A e
Comunidade Européia....................................................................................................23
2.1.10 Detecção imunológica de micotoxinas ................................................................23
2.2 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................24
2.2.1 Material vegetal.....................................................................................................24
2.2.2 Avaliação da incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos................................25
2.2.3 Obtenção de isolados monospóricos de Fusarium spp.........................................25
2.2.4 Extração de DNA de isolados monospóricos de Fusarium spp.............................26
2.2.5 Reações polimerásicas em cadeia (PCRs) para confirmação de gênero e
espécie e para avaliação do potencial toxigênico em isolados monospóricos de
Fusarium spp..................................................................................................................27
2.2.6 Identificação morfológica de Fusarium spp. ..........................................................28
2.2.7 Quantificação de fumonisinas em amostras de grãos ardidos..............................29
2.2.8 Incidência de Fusarium spp. toxigênico e concentração de fumonisinas em
grãos assintomáticos......................................................................................................30
2.3 RESULTADOS.........................................................................................................30
7
2.3.1 Incidência de Fusarium spp.em grãos ardidos......................................................30
2.3.2 Reações polimerásicas em cadeia (PCRs) para confirmação de gênero e
espécie e para avaliação do potencial toxigênico em espécies de Fusarium spp..........34
2.3.3 Quantificação de fumonisinas em amostras de grãos ardidos..............................41
2.3.4 Incidência de Fusarium spp. com potencial toxigênico e quantificação de
fumonisinas em grãos assintomáticos de milho híbrido .................................................42
2.4 DISCUSSÃO ............................................................................................................44
3 CONCLUSÕES ...........................................................................................................49
REFERÊNCIAS..............................................................................................................50
8
RESUMO
Análise da incidência de Fusarium spp. toxigênico e de níveis de fumonisinas
em grãos ardidos de milho híbrido
O milho (Zea mays) é um cereal amplamente cultivado no Brasil e no mundo. Sua
produtividade pode ser afetada por diversos fatores incluindo a colonização fúngica.
Em Fitopatologia, grãos afetados por fungos são denominados “grãos ardidos” e os
gêneros mais encontrados em milho são Stenocarpella e Fusarium. Espécies de
Fusarium podem causar podridões nas espigas e também podem produzir
fumonisinas, toxina esta tóxica para animais e humanos e associadas ao
desenvolvimento de diversas doenças. O presente trabalho teve como objetivo
analisar a incidência de Fusarium ssp. com potencial toxigênico em amostras de
grãos ardidos através da identificação da presença do gene fum5, responsável pela
produção de fumonisinas pelo fungo, bem como quantificar os níveis de fumonisinas
encontrados nessas amostras e comparação com os resultados obtidos de grãos
assintomáticos. Um total de 100 amostras dos anos de 2006 e 2007 provenientes das
principais regiões produtoras do Brasil foram submetidas à três análises. A primeira
avaliou a incidência de Fusarium spp. nos grãos através do método do papel de filtro
com congelamento e em 100% das amostras foi encontrado o fungo em níveis que
variaram de 34 a 91%. A segunda análise utilizou a PCR para confirmação do
gênero, identificação de espécies (F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans)
e identificação da presença do gene fum5. A PCR confirmou 93% dos isolados como
pertencentes ao gênero Fusarium. Os isolados negativos passaram por análise
morfológica e todos foram confirmados. As PCRs para espécies identificaram 82%
dos isolados como F. verticillioides, 3% como F. subglutinans e nenhum como F.
proliferatum. A PCR para potencial toxigênico foi positiva para 81% dos isolados. A
terceira análise consistiu na quantificação de fumonisinas (B
1
, B
2
e B
3
na proporção
5:3:1) através do método de ELISA e os níveis variaram de 4,4 a mais de 90 µg/g.
Grãos assintomáticos da segunda safra de 2007 foram analisados separadamente
para comparação. Em 100% das amostras houve incidência de Fusarium spp,
variando de 74 a 87%. A PCR para confirmação do gênero foi positiva para 87% dos
isolados e os demais passaram por análise morfológica e então confirmados. As
PCRs para identificação de espécies mostrou 60% dos isolados como sendo F.
verticillioides, 3% como F. subglutinans e nenhum como F. proliferatum. A maior
concentração de fumonisinas nos grãos assintomáticos foi de 2,1 µg/g e em 53% das
amostras não foram detectadas fumonisinas. Os resultados mostraram que há uma
alta incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos e assintomáticos. Grãos ardidos e
assintomáticos têm Fusarium spp. com potencial toxigênico mas os níveis de
fumonisinas encontrados nos grãos assintomáticos foram muito baixos em
comparação com os encontrados nos grãos ardidos mostrando que, em condições
adversas, esse fungo deixa de ser endofítico e passa a ser patogênico, podendo
causar doenças na planta e produzir toxinas. Pelo fato das fumonisinas estarem
concentradas nos grãos ardidos, a redução dessas toxinas da dieta deve ser
baseada na eliminação dos mesmos através do controle do beneficiamento.
Palavras-chave: Micotoxinas, Patologia de sementes, PCR, ELISA
9
ABSTRACT
Incidence of toxigenic Fusarium spp. and levels of fumonisins in hybrid maize
rot grains
Maize is a cereal widely cultivated in Brazil and worldwide. Its productivity can be
affected by numerous factors including fungal colonization. In pathological terms,
affected grains by fungi are denominated “rot grains” and the two most prevalent
genera found in maize are Stenocarpella and Fusarium. Species of Fusarium can
cause rotting in the stalks and also produce fumonisins, which are toxic both for
animals and humans since their occurrence is associated to many diseases. The
present work aimed to analyse the incidence of Fusarium ssp. with toxigenic potential
in rot grains samples through the identification of the presence of the gene fum5,
responsible for the production of fumonisins, as well as to quantify the levels of
fumonisins found in these samples and compare with the results obtained in
asymptomatic grains. A total of 100 samples from the 2006 and 2007 harvests were
collected from the main producing regions of Brazil and were submitted to three
analyses. The first evaluated the incidence of Fusarium ssp. in the grains through the
method of filter paper and freezing, which revealed incidences that varied from 34 to
91%. The second analysis used specific primers and PCR to confirm the genus and
species (F. verticillioides, F. proliferatum and F. subglutinans) and to detect the
presence of the fum5 gene. The results indicated that 93% of the isolates belonged to
the genus Fusarium. The PCR - negative isolates were confirmed as Fusarium after
morphological analysis. Eigthy two percent of the isolates were classified as F.
verticillioides, 3% as F. subglutinans and none as F. proliferatum using species-
specific PCR. The fum5 gene was detected in eighty one percent of the isolates. The
third analysis consisted in the quantification of the fumonisins (B
1
, B
2
e B
3
in the
proportion of 5:3:1) through the ELISA method and the levels varied from 4,4 to more
than 90 µg/g. Asymptomatic grains from the second cropping season of 2007 were
analyzed separately for comparison purposes. The incidence of Fusarium spp. in
these varied from 74 to 87%. The PCR for confirmation of the genus was positive for
87% of the isolates. The PCRs for species identification showed 60% of the isolated
as being F. verticillioides, 3% as F. subglutinans and none as F. proliferatum. The
greater concentration of fumonisins in the asymptomatic grains was of 2,1 µg/g and in
53% of the samples fumonisins were not detected. Rot and asymptomatic grains
presented Fusarium spp. with toxigenic potential but the levels of fumonisins found in
the asymptomatic grains were much lower compared with rot grains, showing that, in
adverse conditions, this fungus changes from endophytic to pathogenic, being able to
parasitize the plant and to produce toxins. The fact that fumonisins levels are much
higher in rot grains, a simple measure to reduce the levels of these toxins in the
animal diet would be to eliminate them during processing.
Keyword: Mycotoxins, Seed pathology, PCR, ELISA
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos das primeira e segundas
safras de 2006 e 2007...................................................................................33
Figura 2 - Porcentagens de reações positivas de PCR com primers específicos para
gênero de isolados de Fusarium spp. obtidos de grãos ardidos ...................34
Figura 3 - Porcentagens de reações positivas de PCR com primers específicos para
F. verticillioides de isolados de Fusarium spp. obtidos de grãos ardidos ......35
Figura 4- Porcentagens de reações positivas de PCR com primers específicos para o
gene fum5 de isolados de Fusarium spp. obtidos de grãos ardidos..............36
Figura 5 - Reações polimerásicas em cadeia de isolados de Fusarium spp. isolados
de grãos de milho com primers específicos para gênero Fusarium (A);
espécie F. verticillioides (B); espécie F. subglutinans (C) e para o gene
fum5 (D). .......................................................................................................41
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Incidência de Fusarium spp. (%Fusarium) e concentração de fumonisinas
(µg/g) em grãos ardidos coletados em amostras de grãos de armazéns
comerciais segundo safra/ano e local de coleta e respectivas
porcentagens de grãos ardidos nas amostras comerciais.............................30
Tabela 2 - Isolados monospóricos de Fusarium spp. coletados em grãos ardidos nas
duas safras de 2006 e 2007 segundo amostra de origem e resultados das
PCRs com primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o gene
fum5 (fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F. Proliferatum (FP)
e F. subglutinans (FS). ..................................................................................37
Tabela 3 - Incidência de Fusarium spp. (%fus) e concentração de fumonisinas (µg/g)
em amostras de grãos assintomáticos. .........................................................42
Tabela 4- Isolados de Fusarium spp. coletados em grãos assintomáticos na segunda
safra de 2007 segundo amostra de origem e resultados das PCRs com
primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o gene fum5
(fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F. Proliferatum (FP) e F.
subglutinans (FS) .........................................................................................43
12
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é o terceiro maior produtor de milho do mundo, ficando atrás dos
Estados Unidos e da China. Atualmente, o milho é uma das culturas de grãos mais
importantes, com uma produção anual de cerca de 637 milhões de toneladas
(OKLAHOMA STATE UNIVERSITY, 2007).
A produção de milho pode ser afetada de diversas maneiras, dentre elas
podemos citar a ação patogênica de fungos. Em fitopatologia, grãos afetados por
fungos são denominados “grãos ardidos” e, dentre os fungos mais comumente
encontrados, estão os dos gêneros Stenocarpella e Fusarium (EMBRAPA, 2005;
DESJARDINS, 2006). Algumas espécies do gênero Fusarium, além de causarem
podridões de colmo e espiga, também produzem substâncias tóxicas denominadas
micotoxinas.
O milho é um cereal amplamente consumido em todo o mundo por animais e
humanos e a presença de micotoxinas nos grãos pode levar ao consumo inadvertido
desses metabólitos que, por sua vez, estão associados a diversas doenças. As
principais toxinas produzida por espécies de Fusarium em milho são as fumonisinas,
toxinas associadas a enfermidades como leucoencefalomalácia em cavalos
(MARASAS et al., 1988) e edema pulmonar em suínos (COLVIN; HARRISON,
1992), dentre outras. Em humanos, o consumo de fumonisinas pode estar associado
à ocorrência de câncer esofágico (MARASAS, 1993 e 1996), má formação do tubo
neural (MARASAS et al., 2003) e câncer hepático em locais onde o consumo de
grãos de baixa qualidade é elevado (UENO, 2000).
Este estudo objetivou realizar um levantamento da incidência de Fusarium
spp. com potencial toxigênico em amostras de grãos ardidos de milho híbrido
provenientes de diferentes regiões do Brasil bem como avaliar os níveis de
contaminação dessas amostras por fumonisinas .
13
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 A cultura do Milho
O milho (Zea mays L.) é uma cultura de grande importância e cerca de 637
milhões de toneladas de grãos são produzidos por ano mundialmente. É o cereal
mais cultivado, produzido em 77 países, principalmente devido à sua facilidade de
adaptação que permite o cultivo em regiões de clima tropical a temperado, desde o
nível do mar a altitudes de 3600 m (FIGUEIRA et al., 2003). O Brasil, que participa
com 7% da produção mundial, é o terceiro maior produtor mundial, ficando atrás dos
Estados Unidos (maior produtor) e China (FIGUEIRA et al., 2003). Anualmente no
Brasil são produzidas cerca de 50 milhões de toneladas de grãos, sendo que no ano
de 2007 essa produção alcançou 51 milhões de toneladas (IBGE, 2008). Cerca de
66% do milho produzido no país é destinado à fabricação de ração animal, enquanto
20% é utilizado para consumo humano direto, principalmente em propriedades rurais
e 8% é destinado à indústria. O restante constitui a somatória de perdas e produção
de sementes (FIGUEIRA et al., 2003).
Em países desenvolvidos, o consumo “per capita” anual de grãos atinge
aproximadamente 1000 kg, sendo 70 kg ingeridos diretamente na dieta e 930 kg
indiretamente na forma de ração utilizada na produção de carne e leite. Em países
asiáticos em desenvolvimento, o consumo “per capita” é de 150 kg, sendo quase
totalmente ingerido sob forma de grãos “in natura” (FIGUEIRA et al., 2003). As
propriedades nutritivas do milho, aliados à presença de micronutrientes e à proteína
de alto valor nutricional, explicam sua ampla aplicação como principal ingrediente de
rações animais, além do uso na culinária humana (MUNKVOLD; DESJARDINS,
1997).
Na indústria, o milho pode originar diversos subprodutos. Seu óleo pode ser
usado diretamente para consumo humano ou ainda compor margarina e maionese.
O amido pode ser transformado em dextrina para adesivos e xaropes, dextrose para
utilização em produtos enlatados, ou ainda em forma de frutose, utilizado como
principal adoçante da indústria de doces e bebidas. (SEEDNEWS, 2007). A
14
importância do milho como ingrediente da dieta é evidente por participar em mais de
500 produtos alimentícios, tendo maior diversidade de aplicação em relação a outros
cereais (FIGUEIRA et al., 2003). Em países desenvolvidos, como os Estados
Unidos, o milho atualmente pode ser encontrado em quase todos os produtos, desde
alimentícios até cosméticos, roupas, revistas, tintas, remédios, material escolar entre
outros. (SEEDNEWS, 2007).
A produção do milho pode ser afetada de diversas maneiras, como pela
utilização de cultivares pouco produtivas ou suscetíveis a doenças e pragas, por
condições desfavoráveis de clima e solo e manejo inadequado da cultura e
qualidade sanitária das sementes. Dentre as doenças, estas podem ser causadas
por vírus, nematóides, bactérias e fungos. Grãos de milho podem ser infectados por
fungos sob duas condições específicas: em pré-colheita, a partir de infecções da
espiga, e em pós-colheita, durante o beneficiamento, armazenamento e transporte
(EMBRAPA, 2005).
2.1.2 Grãos ardidos
O termo “grãos ardidos”, em fitopatologia, se refere aos grãos atacados por
fungos. Porém, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA define
“grãos ardidos” de uma forma mais abrangente, como sendo grãos atacados por
patógenos e/ou que sofreram algum tipo de injúria que levou a alteração de cor,
fermentação em toda área do germe ou em qualquer outra parte do endosperma. Os
fungos podem causar redução do potencial de germinação, geração de focos de
aquecimento e de migração de umidade na massa de grãos, aceleração das trocas
químicas (DINIZ, 2002), redução nos conteúdos de carboidratos, proteínas e
açúcares, perda de peso, descoloração e necrose (JULIAN et al., 1995). Dentre os
fungos produtores de grãos ardidos em milho, estão Drechslera zeicola,
Cladosporium herbarum, Ustilago maydis, Nigrospora oryzae, Colletotricum
graminicola, Cephalosporium sp., Penicillium oxalicum, Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus, Alternaria alternata, Bipolaris sp., Fusarium spp., entre
outros. Alguns fungos, além de produzirem grãos ardidos, também são capazes de
produzir micotoxinas em grãos infectados no campo ou durante o armazenamento,
como Stenocarpella maydis, Stenocarpella macrospora, Fusarium verticillioides, F.
proliferatum, F. subglutinans, F. graminearum, F. sporothichioides, Penicillium
15
oxalicum, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, entre outros (EMBRAPA, 2005 e
2006; DESJARDINS, 2006). Estima-se que cerca de 10 a 30% dos grãos colhidos se
percam por infecções promovidas pelo desenvolvimento de fungos anualmente
(LINO et al., 2004).
2.1.3 Fungos micotoxigênicos
Micotoxinas são metabólitos secundários de baixo peso molecular produzidos
naturalmente por fungos filamentosos e que podem ser tóxicos para plantas,
vertebrados e microorganismos (BENNET; KLICH, 2003). Esses compostos podem
estar presentes no micélio ou nos esporos do fungo e têm sido associados à
ocorrência de efeitos adversos em animais e humanos (BULLERMAN, 1979;
D´MELLO; MacDONALD, 1997), cuja severidade depende da toxicidade do
metabólito, da extensão à exposição ao mesmo, do estado nutricional do indivíduo e
de efeitos sinergísticos com outros compostos aos quais o indivíduo está exposto
(PERAICA et al., 1999). A presença de micotoxinas está principalmente associada
a grãos como amendoim, pistache, nozes, castanhas, semente de algodão, milho,
trigo, soja, arroz, feijão, cacau, sorgo, centeio, café, cevada, entre outras, mas
também podem ser encontradas em frutas, leite e produtos lácteos, ovos, produtos
cárneos curados e embutidos, frutas secas, chás e pimentas (DINIZ, 2002). É
importante ressaltar que a presença de um fungo toxigênico no grão não implica
necessariamente na produção de micotoxinas, uma vez que a produção destes
compostos está intimamente relacionada à capacidade de biossíntese do fungo e
das condições ambientais predisponentes, como alternância das temperaturas
diurna e noturna (EMBRAPA, 2005). O fator umidade é considerado o mais
relevante para o desenvolvimento de fungos e produção de micotoxinas, uma vez
que a presença de água disponível é uma condição essencial para o crescimento
destes organismos. Desse modo, na conservação de grãos é empregado o processo
de secagem, que visa reduzir o teor de umidade para 14 a 22%. Os fungos crescem
numa faixa de pH que varia de 2 a 8 e algumas micotoxinas são produzidas em pH
entre 5 e 7. Outro fator que influencia na produção de micotoxinas é a composição
química do alimento. Em geral, alimentos com alto teor de carboidrato são mais
favoráveis para a produção de micotoxinas, embora outros compostos como lipídios,
presença de glicerina e traços de metais como molibdênio, zinco, manganês e ferro
16
também favoreçam a produção de algumas toxinas. Condições microaerofílicas
retardam o crescimento do fungo e podem chegar a inibir completamente seu
desenvolvimento. Outro importante fator que influencia na produção de toxinas é a
temperatura. A temperatura ótima para o crescimento do fungo geralmente coincide
com a de mais alta produção de toxina, em geral variando de 20 a 30°C, podendo-se
considerar a temperatura mínima de 3 a 7°C. Em caso s de armazenamento de
produtos agrícolas a baixas temperaturas, fungos psicrófilos poderão crescer e
assim elevar a temperatura em determinados pontos, oferecendo condições
propícias para uma contaminação secundária (DINIZ, 2002).
Dentre as espécies de fungos produtoras de micotoxinas estão aquelas
afiliadas aos gêneros Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus), Penicillium
(P. viridicatum, P. cyclopium, P. expansum), Fusarium (F. culmorum, F.
graminearum, F. sporotrichioides, F. poae, F. verticillioides, F. proliferatum, F.
oxysporum), Acremonium (A. coenophialum, A. lolii), Phomopsis leptostromiformis,
Pithomyces chartarum, Alternaria sp. (D´MELLO; MacDONALD, 1997). Essas
espécies sintetizam diferentes micotoxinas, sendo que as mais importantes sob
ponto de vista da saúde humana, saúde animal e produtividade são os tricotecenos,
zearalenona, aflatoxinas, ocratoxinas e fumonisinas (GONZALEZ et al., 2001), estas
últimas objeto de estudo do presente projeto.
A FAO / World Health Organization (WHO) estima que 25% de toda a
produção de grãos do mundo esteja contaminada com micotoxinas (LINO et al.,
2004) e os principais fungos envolvidos pertencem aos gêneros Aspergillus,
Penicillium e Fusarium (ONO et al., 2006).
2.1.4 Fumonisinas
As principais micotoxinas da cultura do milho são as fumonisinas (RICHARD,
2007), toxinas estas produzidas principalmente por fungos do gênero Fusarium mas
também por Alternaria alternata f. sp. lycopersici (CHEN et al., 1992, RHEEDER et
al., 2002). As fumonisinas foram descritas pela primeira vez em 1988 por W. C. A.
Gerderblom et al., e desde então foram identificados 28 análogos de fumonisina,
divididos em quatro grupos principais identificados como séries A, B, C e P
(RHEEDER et al., 2002).
17
O nome fumonisina deriva de Fusarium moniliforme (atualmente denominado
F. verticillioides), de onde o primeiro membro desta classe de compostos tóxicos,
fumonisina B
1
(FB
1
), foi caracterizado. Trata-se de um diester de propano-1,2,3-
ácido tricarboxílico e 2-amino-12, 16-dimetil-3, 5, 10, 14, 15-pentahidroxieicosano. A
esta classe pertencem também outros dois membros, FB
2
e FB
3
, que se distinguem
pela ausência de grupos livres de hidroxila (DESJARDINS, 2006). Dentre as
fumonisinas, as da série B (FB
1
, FB
2
e FB
3
) são as de ocorrência mais freqüente e
as mais importantes do ponto de vista toxicológico. Já dentro da série B, a FB
1
é a
fumonisina mais encontrada e em maiores níveis, sendo responsável por 70 a 80%
do total de fumonisinas (RHEEDER et al., 2002). Fumonisina B
4
, a qual apresenta
falta dos dois grupos de hidroxila livre na ponta da cadeia é um metabólito de menor
importância. As fumonisinas da série C (C
1
, C
2
e C
3
), as quais não apresentam o
grupo metil terminal das fumonisinas do grupo B, são as fumonisinas
predominantemente produzidas por uma cepa de Fusarium oxysporum mas também
são produzidas em quantidades mínimas por outras espécies. Outros metabólitos
menores incluem as fumonisinas da série P (P
1
, P
2
e P
3
), nas quais o grupo amino é
substituído por um grupo -3 hidroxipiridínio; as fumonisinas da série A, as quais são
N-acetil amidos das fumonisinas da série B; e a AK- fumonisina B
1
, a qual contém
um grupo N-acetil e um grupo keto C-15. A maioria das fumonisinas que não
pertencem à série B são metabólitos menores que podem ser produzidos sob
condições ótimas de cultivo no laboratório, porém não ocorrem em níveis
significativos em grãos naturalmente contaminados (DESJARDINS, 2006).
A via biossintética de fumonisina em Fusarium verticillioides começa com a
síntese de um composto policetônico e condensação com um aminoácido, seguida
de cinco oxigenações e duas esterificações. A biossíntese de fumonisina também
requer a expressão de uma rede de genes regulatórios, porém estes ainda não
foram relatados. Tanto a biossíntese de fumonisina como o crescimento de F.
verticillioides são afetados pelo gene fcc1, que codifica um fator de transcrição,
como pelo gene pac1, que é um regulador de pH. Análise genética mendeliana de F.
verticillioides sugere que pelo menos três loci envolvidos na biossíntese de
fumonisina estão fortemente ligados. Esta hipótese preliminar foi confirmada em
1999, quando um cluster de 15 genes co-reguladores da biossíntese de fumonisina
foi identificado no grupo 1 de ligação do mapa genético de F. verticillioides
(DESJARDINS, 2006).
18
Um cluster de genes responsáveis pela biossíntese de fumonisina foi
identificado recentemente em F. proliferatum. Os clusters de genes de F.
proliferatum e F. verticillioides possuem similaridade, no que tange a conservação do
número de genes, ordem e orientação. Por outro lado, os 15 genes apresentam
média similaridade entre espécies, com 77-89% de identidade em nível de
aminoácido. As regiões das extremidades dos agrupamentos gênicos são
completamente diferentes, exceto por 2 kb adjacentes ao gene fum1.
O gene fumonisina policetônico sintase (fum1) de F. verticillioides foi
primeiramente isolado como fum5 por meio de PCR com primers degenerados de
policetônico sintase (PKS) e cDNA preparado de cultura produtora de fumonisina.
Embora fum5 tenha sido o primeiro gene de produção de fumonisina a ser clonado,
ele foi designado fum5 devido aos locos fum1-4 previamente identificados por
análise genética mendeliana de variantes de F. verticillioides não produtores de
fumonisina B
1
. Subseqüentemente, análises complementares revelaram que fum5 e
o meioticamente definido locus fum1 de variantes naturais não produtoras de
fumonisina do Nepal e dos Estados Unidos eram o mesmo gene, agora designado
fum1.
Fumonisina policetônico sintase é uma policetônico sintase interativa tipo 1,
com sete domínios funcionais (cetoacilsintase, aciltransferase, acil carregadora de
proteína, cetoacilredutase, deidratase, metiltransferase e enoilredutase) presente em
um único produto de tradução. O fum1 contém todos os três domínios funcionais
(cetoacilredutase, deidratase e enoilredutase) requerida para reduzir completamente
β-carbonis em carbonos saturados. A desativação do gene fum1 resulta em uma
redução de mais de 99% de produção de fumonisina na cultura, sem o acúmulo de
intermediários de fumonisina detectáveis. Isso mostra que a policetônico sintase
decodificada pelo gene fum1 catalisa o primeiro passo da biossíntese de fumonisina.
A desativação de outros genes que também estão envolvidos em diferentes etapas
da formação da fumonisina promove a redução da mesma, porém em menores
quantidades do que a promovida pela desativação do gene fum1 (DESJARDINS,
2006).
Quinze espécies de Fusarium foram relatadas como produtoras de
fumonisinas, sendo oito pertencentes à Seção Liseola (F. verticillioides mating
population A; F. sacchari, F. fujikuroi, F. proliferatum, F. subglutinans, F.
subglutinans sensu lato isolado de semente de teosinte, F. thapsinum thophilum e F.
19
globosum). Outras cinco espécies estão na Seção proposta Dlaminia (intimamente
ligada à Seção Liseoa): F. nygamai MP-G, F. dlamini e F. napiforme. Traços de
fumonisina foram detectados em cultivos de materiais de duas espécies
recentemente descritas, F. andiyazi e F. pseudonygamai. As duas espécies
produtoras de fumonisina restantes se encontram uma na seção Elegans (F.
oxysporum) e uma na Seção Arthrosporiella (F. polyphialidicum). Os registros de que
algumas espécies de F. oxysporum var. redolens e F. polyphialidicum produzem
fumonisinas precisam ser confirmadas por verificação taxonômica das espécies em
questão assim como a verificação da fumonisina produzida (RHEEDER et al., 2002).
A produção de fumonisina é aparentemente ausente em espécies do complexo F.
solani e de todas as espécies produtoras de tricotecenos: F. acuminatum, F.
armeniacum, F. camptoceras, F. compactum, F. crookwellense, F. culmorum, F.
equiseti, F. graminearum, F. kyushuense, F. poae, F. pseudograminearum, F.
sambucinum, F. semitectum, F. sporotrichioides e F. venenatum (DESJARDINS,
2006).
Os principais produtores de fumonisinas FB
1
, FB
2
e FB
3
são F. verticillioides e
F. proliferatum devido ao alto nível de produção total, ampla distribuição geográfica,
ocorrência freqüente em milho e associação com conhecidas micotoxicoses animais
(RHEEDER et al., 2002). Espécies de Fusarium produtoras de fumonisina podem
infectar uma ampla variedade de culturas e também podem ocorrer em alimentos e
ração. Na prática, o milho é a fonte mais importante de contaminação por fumonisina
em dietas humanas e animais. Fumonisinas podem contaminar o grão no campo
quando as condições ambientais são favoráveis à infecção por fungo e seus níveis
podem aumentar se as condições de armazenamento forem favoráveis ao
crescimento do fungo e à produção de fumonisina (DESJARDINS, 2006).
2.1.5 Micotoxicoses
As micotoxicoses (doenças causadas por micotoxinas) são conhecidas há
mais de 2000 anos, sendo que a micotoxicose mais notória é o ergotismo, causada
pelo consumo de cereais (principalmente cevada) infectados com escleródios de
Claviceps purpúrea, que produz alcalóides de ergot. Na Idade Média, o ergotismo
alcançou proporções epidêmicas, mutilando e matando milhares de pessoas na
Europa. A toxicose também era conhecida como “fogo de Santo Antônio”, pois
20
naquela época acreditava-se que uma peregrinação ao santuário de Santo Antônio
traria alívio para a intensa sensação de queimação que as pessoas doentes
experimentavam. As vítimas eram expostas ao ácido lisérgico (LSD), um
alucinógeno, produzido durante o preparo de pães feitos com farinha contaminada
com ergot (PERAICA et al., 1999).
O interesse pelas micotoxinas aumentou em 1960, quando 100.000 perus
morreram de necrose aguda do fígado e hiperplasia do ducto da bile na Inglaterra
após consumirem amendoins infectados com Aspergillus flavus. A pesquisa que
seguiu esse evento levou à identificação e isolamento das aflatoxinas (D´MELLO;
MacDONALD, 1997).
2.1.6 Micotoxicoses causadas por fumonisinas
A contaminação de alimentos e rações por fumonisina tem sido associada a
doenças de origem hepatotóxicas e nefrotóxicas para a maioria das espécies
animais testadas. Estão associadas à leucoencefalomalácia (ELEM) em cavalos,
edema pulmonar em suínos (PPE) e toxicidade renal e hepatotoxidade em ovelhas,
ratos e coelhos. Epidemiologicamente, as fumonisinas têm sido relacionadas ao
câncer esofágico, sendo classificadas pela International Agency for Research on
Cancer (IARC) como possíveis carcinogênicos para o homem (grupo 2B). Essas
micotoxinas têm uma estrutura química análoga à da esfinganina, e essa
semelhança sugeriu inicialmente que o efeito tóxico das fumonisinas poderia estar
relacionado com alterações no metabolismo dos esfingolipídeos, compostos
presentes nas membranas celulares onde desempenham papel importante no
crescimento, diferenciação e morte das células. Além disso, são citotóxicas, inibem a
síntese protéica e do DNA e interrompem o ciclo celular (LINO et al., 1999 e 2006).
De fato, hoje se sabe que estas toxinas inibem a enzima dihidroceramida sintase,
responsável pelo terceiro passo da via da biossíntese de novo dos esfingolipídeos
que catalisa a conversão de acetil-CoA e esfinganina em dihidroceramida. Esta
inibição leva ao acúmulo de esfinganina, que é altamente tóxica, e a uma depleção
de esfingolipídeos complexos, resultando em alterações nas estruturas de
membranas e nas funções de receptores, como por exemplo de receptor de folato
(MERRIL, 2002).
21
2.1.7 Doenças relacionadas ao consumo de fumonisinas no mundo
Estudos mostram que em algumas regiões do mundo a incidência de câncer
esofágico em humanos é maior que em outras e isso possivelmente se deve à alta
freqüência de Fusarium e fumonisinas em alimentos básicos das populações dessas
áreas. Desde 1955, uma alta incidência de câncer esofágico tem sido observada em
populações rurais na região de Transkei (África do Sul), onde o milho é a principal
fonte de alimento. No distrito de Kentani, entre 1955 e 1990, a incidência de câncer
esofágico (incidência em idade padronizada por 100,000 indivíduos por ano) variou
entre 16 a 30 para mulheres e de 40 a 56 para homens. Para Kentani e outros três
distritos adicionais, a incidência média foi de 36 para mulheres e 77 para homens.
Para comparação, a incidência média de câncer esofágico para mulheres e homens
nos Estados Unidos tem sido consistentemente menor que 10 para 100,000
habitantes por ano (DESJARDINS, 2006). Fumonisina B
1
também foi encontrada
mais freqüentemente e em maiores concentrações em milho de regiões da China e
Itália. Nessas regiões o milho é alimento base e onde foram relatadas maiores
incidências de câncer esofágico em comparação a outras regiões. Outro estudo,
realizado comparando concentrações de aflatoxina B
1
, deoxinivalenol e fumonisinas
B
1
, B
2
e B
3
de duas diferentes regiões da China e suas incidências de câncer
hepático, mostrou que a incidência da doença foi maior nas áreas onde as
concentrações de fumonisina e deoxinivalenol foi maior nas amostras de milho
analisadas e, apesar dos resultados serem inconclusivos, os autores do estudo
levantaram a hipótese de que as fumonisinas, as quais conhecidamente têm
atividade promotora de câncer de fígado em ratos, junto com o deoxinivalenol,
promovem a lesão inicial causada por aflatoxina B
1
(PERAICA et al., 1999).
Altos níveis de consumo de fumonisinas também podem estar associados à
defeitos no tubo neural em recém nascidos. Um estudo realizado na região do Vale
do Rio Grande, no estado do Texas e na divisa dos Estados Unidos com o México,
constatou a alta incidência de leucoencefalomalácia em cavalos da região.
Coincidentemente, na mesma região e na mesma época (1990 e 1991), muitas
mulheres americanas de origem mexicana deram a luz a crianças com defeitos no
tubo neural. Foi constatado que nos anos do estudo o milho continha altos níveis de
fumonisina e, devido ao fato de culturalmente os hispano-americanos consumirem
grande quantidade de milho, os problemas com os recém-nascidos poderiam estar
22
associados à exposição das gestantes ao consumo de milho contaminado com
fumonisinas. A média da incidência de defeitos no tubo neural, incluindo espinha
bífida e anencefalia, foi de 29 por 10.000 nascimentos na região estudada, enquanto
a incidência típica nos Estados Unidos é de 9-16 para americanos de origem
mexicana e 5-6 para brancos não-hispânicos e afro-americanos (DESJARDINS,
2006). Em 1995, um levantamento sobre o consumo de tortilhas e quantidades de
fumonisina foi conduzido na Guatemala, com comunidades Maias tipicamente rurais
localizadas em região montanhosa central. Os níveis encontrados foram bastante
altos e, em 2000, estudos clínicos conduzidos em hospitais nacionais e regionais
constataram altos índices de defeitos no tubo neural em recém nascidos. Em
algumas regiões, a incidência foi extremamente alta, como em Quetzaltenango,
onde a média de ocorrências foi de 106 em 10,000 nascimentos. Na região rural de
Transkei, África do Sul, foram encontradas incidências de defeitos no tubo neural de
61 a cada 10,000 nascimentos, contrastando com as incidências de regiões urbanas
como Cidade do Cabo (1,06/10,000), Pretoria (0,99/10,000) e Johanesburgo
(1,18/10,000). Alta incidência também foi observada em províncias de regiões rurais
da China (57 a 73/10,000). Os habitantes dessas regiões possivelmente são
expostos periodicamente a uma contaminação causada por fungos presentes no
milho (MARASAS et al., 2003).
2.1.8 Doenças relacionadas ao consumo de fumonisinas no Brasil
No Brasil, as primeiras análises sobre níveis de contaminação de amostras de
ração de milho associados à epidemia de leucoencefalomalácia eqüina se deram
entre 1985 e 1990 (SYDENHAM et al., 1992), evidenciando que contaminação por
fumonisinas é um problema também no Brasil. Trabalhos posteriores, embora em
número reduzido, confirmaram a extensão do problema. Orsi et al. (2000) relataram
freqüências de 90,2% e 97,4% de contaminação por FB
1
e FB
2
em amostras de
grãos armazenados de milho híbrido. Vargas et al. (2001) analisaram 214 amostras
de milho não processado coletadas em armazéns de diferentes localidades do país
e encontraram níveis variando de 200 a 6100 µg/kg de FB
1
em 99% das amostras.
Ono et al. (2006) chegaram a resultados similares ao relatarem níveis de 130 a
20.380 µg/kg de fumonisinas em 109 amostras de milho coletadas no Paraná.
Finalmente, de Castro et al. (2004) mostraram que a contaminação não se restringe
23
a grãos e se estende aos produtos processados derivados de milho. Os autores
analisaram teores de FB
1
e FB
2
em diferentes produtos coletados em 13 cidades do
estado de São Paulo e encontraram contaminação em 100% de amostras de cereal
infantil tipo C (composto por farinha de milho, açúcar, amido, sal e outros sais
minerais, aromatizantes e traços de glúten), de alimento infantil instantâneo à base
de milho e de mingau de milho. Os valores médios totais variaram de 437 a 2.242
µg/kg.
2.1.9 Recomendações máximas aceitáveis de consumo de fumonisina nos
E.U.A e Comunidade Européia
O Food and Drug Administration (FDA) recomenda que milho moído, limpo e
seco destinado para consumo humano não contenha mais de 2 a 4 µg de
fumonisinas totais (FB
1
, FB
2
e FB
3
) por grama (FAO). As orientações para níveis
aceitáveis de fumonisinas (somatória de FB
1
, FB
2
) propostos recentemente pela
Comunidade Européia variam de acordo com os diferentes destinos do milho. O teor
aceito de fumonisinas em milho não transformado é de 4 µg/g; em milho ou
alimentos à base de milho para consumo direto humano é de 1 µg/g; em cereais e
pequenas refeições à base milho é de 0,8 µg/g; em alimentos transformados à base
de milho e alimentos destinados para lactentes e crianças jovens é de 0,2 µg/g. O
teor de fumonisinas em frações de moagem do milho e outros produtos da moagem
do milho não destinados ao consumo humano direto com partículas de dimensões
maiores de 500 mícron (35 mesh) é de 1,4 µg/g e para partículas maiores de 500
mícron é de 2 µg/g (CE, 2007).
2.1.10 Detecção imunológica de micotoxinas
Os métodos analíticos convencionais para micotoxinas incluem cromatografia
de camada delgada, cromatografia líquida de alta performance e cromatografia
gasosa. Estes métodos analíticos podem ser usados em amostras de alimentos ou
rações e seus resultados são obtidos após horas ou dias. Devido à alta
competitividade entre as indústrias de alimentos e rações, estas são forçadas a
adotar métodos mais econômicos, simples e que forneçam resultados rápidos. Desta
forma, os métodos rápidos de análise de micotoxina têm se tornado importantes
24
(ZHENG et al., 2006). A indústria alimentar utiliza ensaios imunológicos devida à sua
relativa simplicidade, boa reprodutibilidade e elevada sensibilidade (LINO et al.,
2006). A tecnologia empregada no método ELISA é baseada na habilidade de um
anticorpo específico distinguir a estrutura tri-dimensional de uma micotoxina
específica. O ELISA competitivo direto é o mais comumente utilizado para análise de
micotoxina. A maioria dos kits comerciais disponíveis para micotoxinas trabalha com
a fase cinética da ligação anticorpo – antígeno, o que reduz o tempo de incubação
normalmente de 1 a 2 horas para alguns minutos. A redução do tempo de incubação
pode levar a alguma perda de sensibilidade do ensaio, no entanto, o kit pode prover
resultados precisos e reproduzíveis. Os kits de teste de ELISA são satisfatórios, pois
requerem pouco volume de amostra e normalmente poucos procedimentos de
purificação quando comparados aos métodos de cromatografia de camada delgada
e cromatografia líquida de alta performance. São rápidos, simples, específicos,
sensíveis e portáteis para uso no campo ou para detecção de micotoxinas em
alimentos e rações (ZHENG et al., 2006).
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1 Material Vegetal
Amostras de aproximadamente 1 kg de grãos de milho híbrido da primeira e
segunda safra dos anos de 2006 e 2007 foram obtidas junto a armazéns de
diferentes regiões do Brasil através da rede de Técnicos de Desenvolvimento de
Produtos da empresa Dow AgroSciences S.A. A umidade dos grãos foi reduzida
para 13% e as amostras foram mantidas em câmara fria a 4ºC até o momento do
processamento.
As amostras foram identificadas de acordo com o nome do armazém de
origem, localização, ano de produção e a estimativa de grãos ardidos em
porcentagem no momento da coleta. A classificação dos grãos ardidos foi baseada
na definição do Ministério da Agricultura e Pecuária – MAPA, que define grãos
ardidos como grãos atacados por patógenos e/ou que sofreram algum tipo de injúria
que leva a alteração de cor, fermentação em toda área do germe ou em qualquer
25
outra parte do endosperma. Desta forma, os grãos que apresentaram essas
características foram separados para o trabalho.
2.2.2 Avaliação da incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos
A primeira etapa do trabalho consistiu na avaliação da incidência de Fusarium
spp. nas amostras através do método do papel de filtro com congelamento (LUCCA
FILHO, 1987; BRASIL, 1992). Duzentos grãos ardidos de cada amostra foram
analisados em placas de petri de plástico de 9 cm de diâmetro (10 grãos por placa)
sobre três folhas de papel de filtro previamente umedecidas em água destilada e
incubados em câmara de germinação a uma temperatura de 20
o
± 2°C por 24 horas
sob luz branca fluorescente e regime de 12 h de luz/12 h de escuro. Em seguida, os
grãos foram colocados em congelador a -18°C por mai s 24 horas para impedir a
germinação do embrião. Após o tratamento térmico, as amostras foram colocadas
novamente em câmara de germinação por mais 5 dias sob as mesmas condições
(MORAES, et al., 2003). Ao final, os grãos foram analisados individualmente sob
microscópio estereoscópico, avaliando-se a incidência de Fusarium spp. com base
em suas características morfológicas: coloração do micélio (branca ou rosada) e
formato dos conídios.
2.2.3 Obtenção de isolados monospóricos de Fusarium spp.
Isolados primários de Fusarium spp. foram obtidos de grãos ardidos através
da transferência de estruturas fúngicas para meio BDA e incubação por
aproximadamente 5 dias. Os isolados foram transferidos para novas placas para
eliminar contaminações. Culturas monospóricas foram obtidas a partir destas
colônias após o cultivo do fungo por um período de 7 a 10 dias a 20 ± 2°C sob
regime de 12h luz/12h escuro. Com o auxílio de uma agulha previamente
esterilizada, as colônias foram levemente tocadas para obtenção de alguns esporos
e em seguida esses foram diluídos em tubos eppendorf de 1,5mL contendo 1,0mL
de água destilada estéril. Após agitação dos tubos, 20µL da suspensão de esporos
26
foram plaqueados com auxílio de alça de drigalsky em novas placas de petri
contendo meio ágar-água. Após aproximadamente 24 horas, os conídios
começaram a germinar espaçadamente, possibilitando que, com auxílio de
microscópio esteroscópico, apenas um deles fosse retirado e transferido para nova
placa contendo meio BDA. Estes foram incubados a 20°C sob regime de 12h luz/12h
escuro por 7 – 10 dias e, após o período de crescimento, de 4 a 5 discos de 5 mm
de diâmetro de meio contendo micélio e esporos foram retirados da placa e
transferidos para vidros de penicilina contendo água destilada esterilizada para
armazenamento. O micélio restante foi utilizado para extração de DNA.
2.2.4 Extração de DNA de isolados monospóricos de Fusarium spp.
DNA dos isolados monospóricos foi extraído segundo o protocolo de Edward
et al. (1991) com modificações. Após o cultivo em placas de petri por
aproximadamente 7 -10 dias, micélio foi retirado com auxílio de agulha previamente
esterilizada e transferido para tubo eppendorf de 1,5mL contendo 600 µL de tampão
de extração (200 mM de Tris – HCl pH 8,5; 200 mM de NaCl; 25 mM de EDTA e
0,5% de SDS). A solução foi agitada em vortex por 1 minuto e em seguida
centrifugada por 5 minutos a 20°C e 13.000 rpm em m icrocentrífuga. Após a
centrifugação, 300 µL do sobrenadante foram retirados com auxílio de micropipeta e
transferidos para novo tubo, contendo 600 µL de isopropanol 100% gelado, para a
precipitação do DNA. O tubo foi então invertido delicadamente por 2-4 vezes e
deixado em congelador a -20ºC por 30 minutos. Após este período, o tubo foi
novamente centrifugado por mais 15 minutos em microcentrífuga refrigerada a 5°C e
13.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pelete lavado com 600 µL de etanol
100%. Após 1 minuto, o etanol foi descartado e o tubo contendo DNA foi colocado
em estufa a 37°C por aproximadamente 20 minutos par a secagem do álcool (ou
aproximadamente 1 hora em temperatura ambiente). Depois de seco, o DNA foi
ressuspenso em uma solução de TE pH 8,0 com RNAse (10mM de Tris – HCl pH
8,0; 1mM EDTA pH 8,0, 10 µg / mL RNAse) e incubado novamente em estufa a
37°C, por uma hora, para digestão do RNA.
27
2.2.5 Reações polimerásicas em cadeia (PCRs) para confirmação de gênero e
espécie e para avaliação do potencial toxigênico em isolados monospóricos
de Fusarium spp.
Todos os isolados foram submetidos a cinco reações de PCR. A primeira teve
o propósito de confirmar se os isolados obtidos pertenciam ao gênero Fusarium
através de primers desenvolvidos baseados em seqüências inter-gênicas. Três
outras reações tiveram como objetivo identificar as espécies Fusarium verticillioides,
Fusarium proliferatum e Fusarium subglutinans através de pares de primers
desenvolvidos baseados na seqüência parcial do gene calmodulina. A quinta
objetivou identificar isolados com potencial de produção de fumonisinas através de
primers específicos para identificação do gene FUM5. Todas as amostras que
tiveram resultado negativo em qualquer uma das PCRs foram submetidas a uma
nova reação para confirmação dos resultados.
O PCR para confirmação de gênero seguiu o protocolo proposto por Jurado et
al. (2006) com modificações. O volume total das reações de amplificação foi de 20
µL, contendo 3,0 µL de DNA (200 ng), 1,0 µL de cada primer a uma concentração de
10 µM (FUS-R: 5’ GGCGAAGGACGGCTTAC 3’ e Fps-F: 5’
CGCACGTATAGATGGACAAG 3’), 0,2 µL de Taq DNA polimerase 5U/µL
(Fermentas), 2,0 µL de Buffer 10X (Fermentas), 1,6 µL de MgCl
2
25mM, 0,4 µL de
dNTPs 10mM e 10,8 µL de água. O protocolo de amplificação para a PCR foi de 1
ciclo inicial de 2 minutos a 95°C (desnaturação), s eguido de 30 ciclos de 30
segundos a 95°C (desnaturação), 1 minuto a 53°C (an elamento) e 45 segundos a
72°C (extensão), e um ciclo final de 5 minutos a 72°C. Para essa reação, o tamanho
do produto de PCR esperado é de 200 pb (JURADO et al., 2006).
As reações para identificação de espécies seguiram o protocolo proposto por
Mulè et al. (2004) com modificações. O volume total das reações de amplificação foi
de 15 µL, contendo 1,0 µL de DNA (5 ng), 0,45 µL de cada primer a uma
concentração de 10 µM (F. verticillioides - VER1: 5’ CTTCCTGCGATGTTTCTCC 3’
e VER2: 5’ AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA 3’; F. proliferatum - PRO1:
CTTTCCGCCAAGTTTCTT 3’ e PRO2: 5’ TGTCAGTAACTCGACGTTGTTG 3’; F.
subglutinans – SUB1 5’ CTGTGCCTAACCTCTTTATCCA 3’ e SUB2 5’
CAGTATGGACGTTGGTATTATATCTAA 3’), 0,125 µL de Taq DNA polimerase
28
5U/µL (Fermentas), 1,5 µL de Buffer 10X (Fermentas), 1,2 µL de MgCl
2
25mM, 0,3
µL de dNTPs 10mM e 9,9 µL de água. O protocolo de amplificação foi de 1 ciclo
inicial de 5 minutos a 95°C (desnaturação), seguido de 35 ciclos de 50 segundos a
94°C (desnaturação), 50 segundos a 55°C (anelamento ) e 1 minuto a 72°C
(extensão), e um ciclo final de 7 minutos a 72°C. P ara essas reações, o tamanho do
produto de PCR esperado para Fusarium verticillioides é de 578pb, para Fusarium
proliferatum é de 585pb e para Fusarium subglutinans é de 631pb (MULÈ et al.,
2004).
A reação polimerásica PCR para identificar os isolados com potencial de
produção de fumonisina seguiu o protocolo proposto por Bluhm et al. (2002) com
modificações. O volume total das reações foi de 20 µL, contendo 2,0 µL de DNA
(200 ng), 0,8µL de cada primer a uma concentração de 10 µM (Fum5F: 5’
GTCGAGTTGTTGACCACTGCG 3’ e Fum5R: 5’ CGTATCGTCAGCATGATGTAGC
3’), 0,5 µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Fermentas), 2,0 µL de Buffer 10X
(Fermentas), 1,6 µL de MgCl
2
25mM, 0,4 µL de dNTPs 10mM e 11,9 µL de água.
O protocolo de amplificação para a PCR foi de 1 ciclo inicial de 2 minutos a 94°C
(desnaturação), seguido de 35 ciclos de 45 segundos a 93°C (desnaturação), 1
minuto a 56°C (anelamento) e 1 minuto a 72°C (exten são), finalizando com 1 ciclo
de 10 minutos a 72°C. Para essa reação, o tamanho d o produto de PCR esperado é
de 850 pb (BLUHM et al., 2002).
2.2.6 Identificação morfológica de Fusarium spp.
Embora todos os isolados tenham sido submetidos à identificação genética
para gênero e para espécies através de PCR, alguns foram negativos em todas as
reações e, por esse motivo, estes foram analisados com base em características
morfológicas sob duas condições: crescimento em meio SNA (synthetic nutrient-poor
agar) e em microcultura (COUTO; GONÇALVES, 2007). Nestes casos, os isolados
preservados foram plaqueados em meio BDA e mantidos em câmara de crescimento
por 3 dias a 20 ± 2°C sob regime de 12h luz/12h esc uro. Ao final do terceiro dia,
estruturas fúngicas foram transferidas para placas de petri contendo meio SNA e
também utilizadas para inoculação no preparo de microculturas. A microcultura foi
29
feita utilizando-se 1 cubo de meio SNA disposto em lâmina de microscopia óptica.
Em cada lado dos cubos, esporos fúngicos foram inoculados com auxílio de agulha
esterilizada, cobertos com lamínula e mantidos dentro de placa de petri de vidro
fechada contendo papel de filtro umedecido por 3 dias em câmara de crescimento
sob as mesmas condições descritas anteriormente. Passado o período de
incubação, as estruturas fúngicas produzidas em microcultura foram visualizadas
sob microscópio óptico.
2.2.7 Quantificação de fumonisinas em amostras de grãos ardidos
Os testes para quantificação dos níveis de fumonisinas foram feitos pelo
método ELISA, utilizando-se o kit Myco Fumonisin
TM
(Strategic Diagnostics Inc.,
E.U.A.). Este kit é aprovado pelo GIPSA (Grain Inspection, Packers and Stokyards
Administration), agência atrelada ao USDA (United States Department of Agriculture)
nos Estados Unidos. O teste consiste em um ensaio competitivo imuno-solvente
onde a toxina livre extraída da amostra compete com a toxina conjugada à enzima
(horseradish peroxidase – HRP) na ligação com anticorpos nos poços da placa. O
teste é calibrado para uma mistura de fumonisina B
1
, B
2
e B
3
na razão 5:2:1,
respectivamente.
O primeiro passo para essa análise consistiu na moagem das amostras a 20
mesh. Após mistura para homogeneização, uma sub-amostra de 500g foi separada
e, a partir desta, uma alíquota de 20g foi pesada em erlenmeyers para a realização
do teste. A extração das fumonisinas das amostras foi realizada em 100 mL de uma
solução de metanol 70%. Em seguida, as amostras foram agitadas em agitador
orbital a 28 rpm por 25 minutos e, ao término dessa etapa, os extratos
permaneceram sem
agitação por
2 a 3 minutos, para decantação. Passado esse
tempo, 15 mL do extrato foi filtrado com filtro tipo Whatman® #1 e recolhido em tubo
Falcon de 50 mL. O teste foi realizado com o filtrado final.
Alíquotas de 50 µL dos filtrados foram transferidos para poços de placa ELISA
revestidos com anticorpos anti-fumonisina. Estas foram brevemente agitadas e
incubadas por 5 minutos. Após essa etapa, os poços foram lavados e secos. Uma
solução contendo fluoróforo foi adicionada para reagir e se ligar com o conjugado
enzima-toxina e nova agitação e incubação de 5 minutos foi realizada. Ao término da
30
incubação, uma solução de NaOH foi adicionada para parar a reação. Essas
reações produziram uma coloração azul, sendo que quanto mais escura a reação,
menos fumonisinas na amostra. Os resultados dos testes foram quantificados em
leitor de ELISA Expert Plus da Asys Hitech GmbH (Áustria) com filtro de 650 nm.
Todas as amostras foram feitas em duplicata e foi tirada uma média dos resultados.
2.2.8 Incidência de Fusarium spp. toxigênico e concentração de fumonisinas
em grãos assintomáticos
Grãos assintomáticos da 2ª safra de 2007 foram analisados separadamente
para posterior comparação de resultados com os obtidos de grãos ardidos, uma vez
que os grãos assintomáticos podem ser infectados com Fusarium spp. que, por sua
vez, podem ou não produzir fumonisinas. Assim como com os grãos ardidos, os
grãos assintomáticos foram analisados quanto à incidência de Fusarium spp, foram
submetidos aos PCRs de gênero, espécies e potencial toxigênico e quantificação de
fumonisinas conforme descrito anteriormente.
2.3 RESULTADOS
2.3.1 Incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos
Um total de 100 amostras das primeiras e segundas safras dos anos de 2006
e 2007 foram recebidas das regiões Sul (52 amostras), Sudeste (18 amostras) e
Centro-Oeste (30 amostras). Os resultados da avaliação da incidência de Fusarium
spp., concentração de fumonisinas e porcentagem de grãos ardidos em todas as
amostras se encontram na Tabela 1.
Tabela 1 - Incidência de Fusarium spp. (%Fusarium) e concentração de fumonisinas
(µg/g) em grãos ardidos coletados em amostras de grãos de armazéns
comerciais segundo safra/ano e local de coleta e respectivas
porcentagens de grãos ardidos nas amostras comerciais
(continua)
Amostra Origem Safra % Fusarium % grãos ardidos [ ] Fumonisinas
LGM 1-1/06 Campo Mourão PR 1ª safra 2006 14 0,30 36
31
Tabela 1 - Incidência de Fusarium spp. (%Fusarium) e concentração de fumonisinas
(µg/g) em grãos ardidos coletados em amostras de grãos de armazéns
comerciais segundo safra/ano e local de coleta e respectivas
porcentagens de grãos ardidos nas amostras comerciais
(continuação)
Amostra Origem Safra % Fusarium % grãos ardidos [ ] Fumonisinas
LGM 2-1/06 Ivaiporã PR 1ª safra 2006 29 nd* 19,6
LGM 3-1/06 Pitanga PR 1ª safra 2006 39 0,5 > 90
LGM 4-1/06 Mamborê PR 1ª safra 2006 32 0,3 8,8
LGM 5-1/06 Palmeiras de Goiás GO 1ª safra 2006 56 14 22,3
LGM 6-1/06 Boa Esperança MG 1ª safra 2006 78 6 > 90
LGM 7-1/06 Rio Verde GO 1ª safra 2006 48 nd > 90
LGM 8-1/06 Machado MG 1ª safra 2006 56 nd > 90
LGM 9-1/06 Chapadão do Sul MS 1ª safra 2006 61 8 **
LGM 10-1/06 Chapadão do Sul MS 1ª safra 2006 42 6,3 > 90
LGM 11-1/06 Uberaba MG 1ª safra 2006 42 nd
> 90
LGM 12-1/06 Iraí de Minas MG 1ª safra 2006 53 nd
> 90
LGM 13-1/06 Primavera do Leste MT 1ª safra 2006 5 nd
**
LGM 14-1/06 Primavera do Leste MT 1ª safra 2006 85 nd
**
LGM 15-1/06 Campo Verde MT 1ª safra 2006 46 nd
41,6
LGM 16-1/06 Uberlândia MG 1ª safra 2006 54 nd
> 90
LGM 17-1/06 Campo Erê SC 1ª safra 2006 47 nd
**
LGM 18-1/06 Palmas PR 1ª safra 2006 62 nd
**
LGM 19-1/06 Rio Verde GO 1ª safra 2006 65 nd
**
LGM 20-1/06 Boa Esperança MG 1ª safra 2006 37 nd
> 60
LGM 21-1/06 Unaí MG 1ª safra 2006 65 nd
> 60
LGM 22-1/06 Tangará SC 1ª safra 2006 44 nd
12,2
LGM 23-1/06 Cristalina GO 1ª safra 2006 61 nd
> 60
LGM 24-1/06 Cristalina GO 1ª safra 2006 67 nd
> 60
LGM 25-1/06 Unaí MG 1ª safra 2006 90 nd
> 60
LGM 26-1/06 São Gabriel do Oeste MS 1ª safra 2006 84 nd
**
LGM 27-1/06 Capão Bonito SP 1ª safra 2006 100 nd
11,1
LGM 28-1/06 Capão Bonito SP 1ª safra 2006 22 nd
9,8
LGM 29-1/06 Capão Bonito SP 1ª safra 2006 58 nd
**
LGM 30-1/06 Capão Bonito SP 1ª safra 2006 20 nd
14,8
LGM 31-1/06 Uberaba MG 1ª safra 2006 58 nd
31,7
LGM 1-2/06 Sapezal MT 2ª safra 2006 47 nd
15,5
LGM 2-2/06 Sapezal MT 2ª safra 2006 82 nd
13,7
LGM 3-2/06 Londrina PR 2ª safra 2006 31 2 12,8
LGM 4-2/06 São Sebastião da Amoreira PR 2ª safra 2006 69 2 **
LGM 5-2/06 Campo Mourão PR 2ª safra 2006 26 5 22,9
LGM 6-2/06 Rondonópolis MT 2ª safra 2006 86 nd
**
LGM 7-2/06 Alto Graças MT 2ª safra 2006 79 nd
9,7
LGM 8-2/06 Guaira PR 2ª safra 2006 80 nd
**
LGM 9-2/06 Assis SP 2ª safra 2006 30 nd
8,9
LGM 10-2/06 Maracaí SP 2ª safra 2006 38 nd
**
LGM 11-2/06 São Gabriel do Oeste MS 2ª safra 2006 63 nd
**
LGM 12-2/06 Maracaú MS 2ª safra 2006 74 nd
**
LGM 13-2/06 Maracaú MS 2ª safra 2006 77 nd
**
LGM 14-2/06 Sindrolândia MS 2ª safra 2006 82 nd
**
LGM 1-1/07 Uberaba MG 1ª safra 2007 91 74 > 60
32
Tabela 1 - Incidência de Fusarium spp. (%Fusarium) e concentração de fumonisinas
(µg/g) em grãos ardidos coletados em amostras de grãos de armazéns
comerciais segundo safra/ano e local de coleta e respectivas
porcentagens de grãos ardidos nas amostras comerciais
(continuação)
Amostra Origem Safra % Fusarium % grãos ardidos [ ] Fumonisinas
LGM 2-1/07 Rio Verde GO 1ª safra 2007 63 46 17,1
LGM 3-1/07 Primavera do Leste MT 1ª safra 2007 55 49 20,3
LGM 4-1/07 Campo Erê SC 1ª safra 2007 43 37 14,3
LGM 5-1/07 Cleverlândia PR 1ª safra 2007 50 50 23
LGM 6-1/07 Palmasola SC 1ª safra 2007 26 46 11,9
LGM 7-1/07 Pitanga PR 1ª safra 2007 57 41 12,6
LGM 8-1/07 Tangará SC 1ª safra 2007 80 44 28,2
LGM 9-1/07 Água Santa RS 1ª safra 2007 9 55 6,2
LGM 10-1/07 Ciriaco RS 1ª safra 2007 20 64 12
LGM 11-1/07 Muitos Capões RS 1ª safra 2007 61 55 22,8
LGM 12-1/07 Rachadinho RS 1ª safra 2007 10 44 19,5
LGM 13-1/07 Santa Rosa RS 1ª safra 2007 12 67 9
LGM 14-1/07 São José do Ouro RS 1ª safra 2007 56 43 11,1
LGM 15-1/07 Serrania Cirrêia RS 1ª safra 2007 25 25 22,4
LGM 16-1/07 Vacaria RS 1ª safra 2007 10 87 14,9
LGM 17-1/07 Vila Maria RS 1ª safra 2007 20 46 8,7
LGM 18-1/07 Chapadão do Sul MS 1ª safra 2007 47 82 10,1
LGM 19-1/07 Campo Mourão PR 1ª safra 2007 68 62 9,8
LGM 20-1/07 São Sebastião da Amoreira PR 1ª safra 2007 42 67 5,6
LGM 21-1/07 Santa Mariana PR 1ª safra 2007 46 48 6,6
LGM 22-1/07 Ivaí PR 1ª safra 2007 70 86 4,4
LGM 23-1/07 Tibagi PR 1ª safra 2007 12 85 6,6
LGM 24-1/07 Cornélio Procópio PR 1ª safra 2007 46 73 4,4
LGM 25-1/07 Teixeira Soronez PR 1ª safra 2007 40 63 10
LGM 26-1/07 Quitandinha PR 1ª safra 2007 69 61 6,6
LGM 27-1/07 Ponta Grossa PR 1ª safra 2007 32 41 11,4
LGM 28-1/07 Cornélio Procópio PR 1ª safra 2007 1 47 > 60
LGM 29-1/07 Maringá PR 1ª safra 2007 63 70 6,85
LGM 30-1/07 Ponta Grossa PR 1ª safra 2007 39 59 6,85
LGM 31-1/07 Lapa PR 1ª safra 2007 40 32 8,8
LGM 32-1/07 Piraí do Sul PR 1ª safra 2007 58 45 5,7
LGM 33-1/07 Araucária PR 1ª safra 2007 63 73 5,5
LGM 34-1/07 Ventania PR 1ª safra 2007 58 42 10,5
LGM 35-1/07 Tibagi PR 1ª safra 2007 37 57 4,3
LGM 36-1/07 Missal PR 1ª safra 2007 43 82 4,8
LGM 37-1/07 Guarapuava PR 1ª safra 2007 31 37 27,4
LGM 38-1/07 Palmeira PR 1ª safra 2007 37 58 4,6
LGM 39-1/07 Araucária PR 1ª safra 2007 65 75 4,9
LGM 40-1/07 Quitandinha PR 1ª safra 2007 50 83 8,5
LGM 1-2/07 Rio Verde GO 2ª safra 2007 74 55 13,2
LGM 2-2/07 Rio Verde GO 2ª safra 2007 69 42 8,4
LGM 3-2/07 Santa Juliana MG 2ª safra 2007 87 41 5,2
LGM 4-2/07 Santa Juliana MG 2ª safra 2007 85 37 8,7
LGM 5-2/07 Chapadão do Céu GO 2ª safra 2007 80 50 4,6
LGM 6-2/07 São Gabriel do Oeste MS 2ª safra 2007 99 55 4,4
33
Tabela 1 - Incidência de Fusarium spp. (%Fusarium) e concentração de fumonisinas
(µg/g) em grãos ardidos coletados em amostras de grãos de armazéns
comerciais segundo safra/ano e local de coleta e respectivas
porcentagens de grãos ardidos nas amostras comerciais
(conclusão)
Amostra Origem Safra % Fusarium % grãos ardidos [ ] Fumonisinas
LGM 7-2/07 Chapadão do Sul MS 2ª safra 2007 96 52 9
LGM 8-2/07 Ponta Porã MT 2ª safra 2007 96 44 15,1
LGM 9-2/07 São Gabriel do Oeste MS 2ª safra 2007 99 51 19,5
LGM 10-2/07 Dourados MS 2ª safra 2007 80 55 6,5
LGM 11-2/07 Itambé PR 2ª safra 2007 79 51 10,7
LGM 12-2/07 Marialva PR 2ª safra 2007 70 52 46
LGM 13-2/07 Astorga PR 2ª safra 2007 80 43 11,9
LGM 14-2/07 São Sebastião da Amoreira PR 2ª safra 2007 69 45 6,5
LGM 15-2/07 Atalaia PR 2ª safra 2007 90 58 8,1
* nd = porcentagem de grãos ardidos na amostra original de não foi determinada.
** - concentração de fumonisinas não foi determinada.
Os resultados das incidências de Fusarium ssp. foram agrupados de acordo com as
safras e anos de produção (Figura 1).
Figura 1 - Incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos das primeira e segundas safras de 2006 e
2007. Os números sobre as barras representam a quantidade de amostras analisadas por
safra
A incidência de Fusarium spp. variou entre as primeira e segundas safras do
mesmo ano e entre as respectivas safras nos dois anos de estudo. Nos dois anos de
34
estudo a incidência média de Fusarium spp. foi maior na segunda safra em
comparação com a primeira. No ano de 2006, a incidência na primeira safra foi de
52% e na segunda foi de 62%. No ano de 2007, a incidência na primeira safra foi de
45% na primeira safra e de 83% na segunda. Com relação às safras, na primeira
safra de 2006 a incidência de Fusarium spp. foi maior do que a mesma safra de
2007 (52 e 45% respectivamente). Já nas segundas safras foi observado um
aumento do ano de 2006 para 2007, de 62% para 83%.
2.3.2 Reações polimerásicas em cadeia (PCRs) para confirmação de gênero e
espécie e para avaliação do potencial toxigênico em espécies de Fusarium
spp.
As PCRs para gênero Fusarium, para as espécies F. verticillioides, F.
proliferatum e F. subglutinans e para potencial de produção de fumonisina (gene
FUM5) foram feitas com repetição (duplicata). Isolados que não puderam ser
identificados com base em PCR foram analisados para características morfológicas.
Os resultados de todas as PCRs estão na Tabela 2. Os resultados das PCRs para
gênero estão na figura 2. A figura 5 exibe exemplos de reações polimerásicas em
cadeia para gênero, F. verticillioides e F. sublutinans e presença do gene fum5.
Figura 2 - Gráfico das porcentagens de reações positivas de PCR com primers específicos para
gênero de isolados de Fusarium spp. obtidos de grãos ardidos. Os números acima das
barras correspondem ao número de amostras analisadas
35
As PCRs para confirmação de gênero não foram positivas para todos os
isolados. Os isolados que não foram identificados como sendo do gênero Fusarium
pela PCR, passaram por análise morfológica e todos foram confirmados, resultando
em 100% de isolados de Fusarium spp. (dados não apresentados).
A identificação da espécie Fusarium verticillioides através de PCR foi
agrupada por safras e anos de estudo e os gráficos das porcentagens de reações
positivas para essa espécie estão na figura 3.
Figura 3 - Gráficos das porcentagens de reações positivas de PCR com primers específicos para F.
verticillioides de isolados de Fusarium spp. obtidos de grãos ardidos. Os números acima
das barras correspondem ao número de isolados analisados
A incidência de isolados confirmados como sendo Fusarium verticillioides
através de PCR foi elevada em todas as safras analisadas. Na primeira safra de
2006, 84% dos isolados foram confirmados e na segunda safra de 2006, 80% dos
isolados foram positivos para F. verticillioides. A maior incidência foi encontrada na
primeira safra de 2007, que apresentou 97% dos seus isolados como sendo F.
verticillioides. Na segunda safra de 2007, 67% dos isolados foram confirmados como
pertencentes a essa espécie.
Nenhum dos isolados foi positivo para as PCRs para identificação de F.
proliferatum. As PCRs conduzidas para a identificação de F. subglutinans confirmou
6 isolados no total, sendo 2 da primeira safra de 2006 (LGM-Fus 077 e LGM-Fus
36
133), 1 da segunda safra de 2006 (LGM-Fus 160), 2 da primeira safra de 2007
(LGM-Fus 314 e LGM-Fus 340) e 1 da segunda safra de 2007 (LGM-Fus 398).
A incidência do gene fum5 nos isolados confirmada por meio de PCR foi
agrupada por safras e anos de estudo e os gráficos das porcentagens de reações
positivas para o potencial toxigênico estão na figura 4.
Figura 4 - Gráfico das porcentagens de reações positivas de PCR com primers específicos para o
gene fum5 de isolados de Fusarium spp. obtidos de grãos ardidos. Os números acima das
barras correspondem ao número de isolados analisados
As médias dos isolados cuja PCR identificou potencial toxigênico variou entre
safras e anos. Na primeira safra de 2006 a média de isolados contendo o gene fum5
foi de 80% e na segunda safra do mesmo ano foi de 53%. Na primeira safra de
2007, 72% dos isolados foram positivos para a presença do gene e na segunda
safra de 2007 a média foi de 93%, a mais alta de todas as safras.
37
Tabela 2 - Isolados monospóricos de Fusarium spp. coletados em grãos ardidos nas
duas safras de 2006 e 2007 segundo amostra de origem e resultados das
PCRs com primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o gene
fum5 (fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F. Proliferatum (FP)
e F. subglutinans (FS)
(continua)
Isolado Amostra de origem FUS fum5 FV FP FS
LGM-Fus 005 LGM 1-1/06 + + + - -
LGM-Fus 007 LGM 1-1/06 + - + - -
LGM-Fus 009 LGM 2-1/06 + + + - -
LGM-Fus 011 LGM 2-1/06 - - - - -
LGM-Fus 013 LGM 3-1/06 - + + - -
LGM-Fus 015 LGM 4-1/06 + + + - -
LGM-Fus 017 LGM 4-1/06 - - - - -
LGM-Fus 021 LGM 5-1/06 + + + - -
LGM-Fus 027 LGM 6-1/06 + + + - -
LGM-Fus 029 LGM 6-1/06 + - + - -
LGM-Fus 031 LGM 7-1/06 + + + - -
LGM-Fus 035 LGM 8-1/06 + + + - -
LGM-Fus 037 LGM 8-1/06 + + + - -
LGM-Fus 043 LGM 9-1/06 - - + - -
LGM-Fus 045 LGM 9-1/06 + + + - -
LGM-Fus 047 LGM 10-1/06 - + + - -
LGM-Fus 051 LGM 11-1/06 + + + - -
LGM-Fus 053 LGM 11-1/06 + + + - -
LGM-Fus 055 LGM 12-1/06 + + + - -
LGM-Fus 057 LGM 12-1/06 + + + - -
LGM-Fus 059 LGM 14-1/06 + + + - -
LGM-Fus 061 LGM 14-1/06 + + + - -
LGM-Fus 063 LGM 15-1/06 + + + - -
LGM-Fus 065 LGM 15-1/06 + + + - -
LGM-Fus 067 LGM 16-1/06 + + + - -
LGM-Fus 069 LGM 16-1/06 - + + - -
LGM-Fus 071 LGM 17-1/06 + + + - -
LGM-Fus 073 LGM 17-1/06 + + + - -
LGM-Fus 075 LGM 18-1/06 + - + - -
LGM-Fus 077 LGM 18-1/06 - - - - +
LGM-Fus 079 LGM 19-1/06 + + + - -
LGM-Fus 081 LGM 19-1/06 + + + - -
LGM-Fus 095 LGM 20-1/06 + + + - -
LGM-Fus 097 LGM 20-1/06 + + + - -
LGM-Fus 099 LGM 21-1/06 - + + - -
LGM-Fus 101 LGM 21-1/06 + - + - -
LGM-Fus 103 LGM 22-1/06 + - + - -
LGM-Fus 105 LGM 22-1/06 + + - - -
LGM-Fus 107 LGM 23-1/06 + + + - -
LGM-Fus 109 LGM 23-1/06 + + + - -
LGM-Fus 111 LGM 24-1/06 + + + - -
38
Tabela 2 - Isolados monospóricos de Fusarium spp. coletados em grãos ardidos nas
duas safras de 2006 e 2007 segundo amostra de origem e resultados das
PCRs com primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o gene
fum5 (fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F. Proliferatum (FP)
e F. subglutinans (FS)
(continuação)
Isolado Amostra de origem FUS
fum5
FV FP FS
LGM-Fus 113 LGM 24-1/06 + + + - -
LGM-Fus 115 LGM 25-1/06 + + + - -
LGM-Fus 117 LGM 25-1/06 + + - - -
LGM-Fus 119 LGM 26-1/06 - + - - -
LGM-Fus 123 LGM 27-1/06 + + + - -
LGM-Fus 129 LGM 29-1/06 + + - - -
LGM-Fus 131 LGM 30-1/06 + + + - -
LGM-Fus 133 LGM 30-1/06 - - - - +
LGM-Fus 143 LGM 31-1/06 + + + - -
LGM-Fus 145 LGM 31-1/06 + + + - -
LGM-Fus 147 LGM 1-2/06 + + + - -
LGM-Fus 149 LGM 1-2/06 + + + - -
LGM-Fus 154 LGM 3-2/06 + + + - -
LGM-Fus 156 LGM 3-2/06 + - + - -
LGM-Fus 158 LGM 4-2/06 + + + - -
LGM-Fus 160 LGM 4-2/06 + + - - +
LGM-Fus 165 LGM 5-2/06 + - - - -
LGM-Fus 167 LGM 6-2/06 + + + - -
LGM-Fus 169 LGM 6-2/06 + - + - -
LGM-Fus 171 LGM 7-2/06 + + + - -
LGM-Fus 173 LGM 7-2/06 + - - - -
LGM-Fus 179 LGM 9-2/06 + + + - -
LGM-Fus 181 LGM 9-2/06 - - + - -
LGM-Fus 183 LGM 10-2/06 + - + - -
LGM-Fus 185 LGM 10-2/06 + - + - -
LGM-Fus 271 LGM 1-1/07 + - + - -
LGM-Fus 272 LGM 1-1/07 + - + - -
LGM-Fus 273 LGM 2-1/07 + + + - -
LGM-Fus 274 LGM 2-1/07 + + + - -
LGM-Fus 275 LGM 3-1/07 + + + - -
LGM-Fus 276 LGM 3-1/07 + + + - -
LGM-Fus 277 LGM 4-1/07 + + + - -
LGM-Fus 278 LGM 4-1/07 + - + - -
LGM-Fus 279 LGM 5-1/07 + - + - -
LGM-Fus 280 LGM 5-1/07 + + + - -
LGM-Fus 281 LGM 6-1/07 + + + - -
LGM-Fus 282 LGM 6-1/07 + + + - -
LGM-Fus 283 LGM 7-1/07 + + + - -
LGM-Fus 284 LGM 7-1/07 + + + - -
LGM-Fus 285 LGM 8-1/07 + + + - -
LGM-Fus 286 LGM 8-1/07 + + + - -
LGM-Fus 287 LGM 9-1/07 + + + - -
39
Tabela 2 - Isolados monospóricos de Fusarium spp. coletados em grãos ardidos nas
duas safras de 2006 e 2007 segundo amostra de origem e resultados das
PCRs com primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o gene
fum5 (fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F. Proliferatum (FP)
e F. subglutinans (FS)
(continuação)
Isolado Amostra de origem FUS
fum5
FV FP FS
LGM-Fus 288 LGM 10-1/07 + + + - -
LGM-Fus 289 LGM 10-1/07 + + + - -
LGM-Fus 290 LGM 11-1/07 + + + - -
LGM-Fus 291 LGM 11-1/07 + + + - -
LGM-Fus 292 LGM 12-1/07 + + + - -
LGM-Fus 293 LGM 13-1/07 - - + - -
LGM-Fus 294 LGM 13-1/07 + + + - -
LGM-Fus 295 LGM 14-1/07 + - + - -
LGM-Fus 296 LGM 14-1/07 + + + - -
LGM-Fus 297 LGM 15-1/07 + + + - -
LGM-Fus 298 LGM 15-1/07 + + + - -
LGM-Fus 299 LGM 16-1/07 + + + - -
LGM-Fus 300 LGM 16-1/07 + + + - -
LGM-Fus 301 LGM 17-1/07 + + + - -
LGM-Fus 302 LGM 17-1/07 + - + - -
LGM-Fus 303 LGM 18-1/07 + + + - -
LGM-Fus 304 LGM 18-1/07 + + + - -
LGM-Fus 305 LGM 19-1/07 + + + - -
LGM-Fus 306 LGM 19-1/07 + - + - -
LGM-Fus 307 LGM 20-1/07 + + + - -
LGM-Fus 308 LGM 20-1/07 + - + - -
LGM-Fus 309 LGM 21-1/07 + + + - -
LGM-Fus 310 LGM 21-1/07 + - + - -
LGM-Fus 311 LGM 22-1/07 + + + - -
LGM-Fus 312 LGM 22-1/07 + - + - -
LGM-Fus 313 LGM 23-1/07 + + + - -
LGM-Fus 314 LGM 23-1/07 + - - - +
LGM-Fus 315 LGM 24-1/07 + + + - -
LGM-Fus 316 LGM 25-1/07 + + + - -
LGM-Fus 317 LGM 25-1/07 - + + - -
LGM-Fus 318 LGM 26-1/07 + + + - -
LGM-Fus 319 LGM 27-1/07 + - + - -
LGM-Fus 320 LGM 27-1/07 + - + - -
LGM-Fus 321 LGM 29-1/07 + - + - -
LGM-Fus 322 LGM 29-1/07 + - + - -
LGM-Fus 323 LGM 30-1/07 + + + - -
LGM-Fus 324 LGM 30-1/07 + + + - -
LGM-Fus 325 LGM 31-1/07 + + + - -
LGM-Fus 326 LGM 31-1/07 + + + - -
LGM-Fus 327 LGM 32-1/07 + + + - -
LGM-Fus 328 LGM 32-1/07 + + + - -
LGM-Fus 329 LGM 33-1/07 + + + - -
40
Tabela 2 - Isolados monospóricos de Fusarium spp. coletados em grãos ardidos nas
duas safras de 2006 e 2007 segundo amostra de origem e resultados das
PCRs com primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o gene
fum5 (fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F. Proliferatum (FP)
e F. subglutinans (FS)
(conclusão)
Isolado Amostra de origem FUS
fum5
FV FP FS
LGM-Fus 330 LGM 33-1/07 + + + - -
LGM-Fus 331 LGM 34-1/07 + + + - -
LGM-Fus 332 LGM 34-1/07 + - + - -
LGM-Fus 333 LGM 35-1/07 + + + - -
LGM-Fus 334 LGM 35-1/07 + + + - -
LGM-Fus 335 LGM 36-1/07 + - + - -
LGM-Fus 336 LGM 36-1/07 + + + - -
LGM-Fus 337 LGM 37-1/07 + + + - -
LGM-Fus 338 LGM 37-1/07 + + + - -
LGM-Fus 339 LGM 38-1/07 - - + - -
LGM-Fus 340 LGM 39-1/07 + - - - +
LGM-Fus 341 LGM 40-1/07 + + + - -
LGM-Fus 396 LGM 1-2/07 + - - - -
LGM-Fus 397 LGM 1-2/07 + + + - -
LGM-Fus 398 LGM 2-2/07 + + - - +
LGM-Fus 399 LGM 2-2/07 + + + - -
LGM-Fus 400 LGM 3-2/07 + + + - -
LGM-Fus 401 LGM 3-2/07 + - + - -
LGM-Fus 402 LGM 4-2/07 + + + - -
LGM-Fus 403 LGM 4-2/07 + + - - -
LGM-Fus 404 LGM 5-2/07 + + - - -
LGM-Fus 405 LGM 5-2/07 + + + - -
LGM-Fus 406 LGM 6-2/07 + + + - -
LGM-Fus 407 LGM 6-2/07 + + + - -
LGM-Fus 408 LGM 7-2/07 + + + - -
LGM-Fus 409 LGM 7-2/07 + + - - -
LGM-Fus 410 LGM 8-2/07 + + + - -
LGM-Fus 411 LGM 8-2/07 + + + - -
LGM-Fus 412 LGM 9-2/07 - + + - -
LGM-Fus 413 LGM 9-2/07 + + + - -
LGM-Fus 414 LGM 10-2/07 + + + - -
LGM-Fus 415 LGM 10-2/07 + + + - -
LGM-Fus 416 LGM 11-2/07 + + + - -
LGM-Fus 417 LGM 11-2/07 + + - - -
LGM-Fus 418 LGM 12-2/07 + + - - -
LGM-Fus 419 LGM 12-2/07 + + + - -
LGM-Fus 420 LGM 13-2/07 + + - - -
LGM-Fus 421 LGM 13-2/07 + + - - -
LGM-Fus 422 LGM 14-2/07 + + + - -
LGM-Fus 423 LGM 14-2/07 + + - - -
LGM-Fus 424 LGM 15-2/07 + + + - -
LGM-Fus 425 LGM 15-2/07 + + + - -
41
(A) (B)
(C) (D)
Figura 5 - Exemplos de reações polimerásicas em cadeia de isolados de Fusarium spp. isolados de
grãos de milho com primers específicos para gênero Fusarium (A); espécie F. verticillioides
(B); espécie F. subglutinans (C) e para o gene fum5 (D)
2.3.3 Quantificação de fumonisinas em amostras de grãos ardidos
Em todas as amostras de grãos ardidos de 2006 e 2007 foram encontradas
fumonisinas (tabela 1). As maiores concentrações foram de amostras provenientes
da primeira safra de 2006. Das 23 amostras analisadas, 8 tiveram níveis maiores de
90 µg/g, 5 tiveram níveis maiores de 60 µg/g e as demais apresentaram níveis que
variaram de 11,1 a 41,6 µg/g Na segunda safra de 2006 foram quantificadas 6
amostras e os níveis encontrados variaram de 8,9 a 22,9 µg/g, os mais baixos de
todas as safras estudadas. Na primeira safra de 2007 foram analisadas 40 amostras
42
e 2 apresentaram níveis acima de 60 µg/g. Nas demais, os níveis de fumonisinas
variaram de 4,3 a 28,2 µg/g. Na segunda safra de 2007 foram analisadas 15
amostras e os níveis de fumonisinas variaram de 2,1 a 24 µg/g.
2.3.4 Incidência de Fusarium spp. com potencial toxigênico e quantificação de
fumonisinas em grãos assintomáticos de milho híbrido
Os resultados da avaliação da incidência de Fusarium spp. e concentração de
fumonisinas em grãos assintomáticos encontram-se na Tabela 3:
Tabela 3 - Incidência de Fusarium spp. (%fus) e concentração de fumonisinas (µg/g)
em amostras de grãos assintomáticos
Amostras Local % fus % Grãos Ardidos
Fumonisinas (
µg/g
)
LGM 1-2/07 A Rio Verde – GO 90 55 0,0
LGM 2-2/07 A Rio Verde – GO 71,5 42 1,1
LGM 3-2/07 A Santa Juliana - MG 81,5 41 0,0
LGM 4-2/07 A Santa Juliana - MG 80 37 0,9
LGM 5-2/07 A Chapadão do Céu – GO 81 50 1,4
LGM 6-2/07 A S. Gabriel do Oeste - MS 71,5 55 1,1
LGM 7-2/07 A Chapadão do Sul – MS 99,5 52 0,0
LGM 8-2/07 A Ponta Porã – MT 88,5 44 0,0
LGM 9-2/07 A S. Gabriel do Oeste - MS 76 51 1,7
LGM 10-2/07 A Dourados – MS 65,5 55 1,3
LGM 11-2/07 A Itambé – PR 75 51 0,0
LGM 12-2/07 A Marialva – PR 69 52 0,0
LGM 13-2/07 A Astorga – PR 77,5 43 0,0
LGM 14-2/07 A S. S. da Amoreira – PR 70,5 45 0,0
LGM 15-2/07 A Atalaia – PR 75 58 2,1
A incidência de Fusarium spp. nos grãos assintomáticos de uma forma geral
foi menor do que a observada nos grãos ardidos das mesmas amostras (Tabela 1) ,
com exceção das amostras LGM 2-2/07 A e LGM 14-2/07 A, que tiveram uma
incidência maior em grãos assintomáticos do que em grãos ardidos. A incidência
média nos grãos assintomáticos foi de 78%, menor do que a observada em grãos
ardidos (83%).
As PCRs para gênero Fusarium, para as espécies F. verticillioides, F.
proliferatum e F. subglutinans, e para potencial de produção de fumonisina (gene
fum5) foram feitas com repetição (duplicata). Os isolados cuja identificação de
43
espécie não foi obtida por meio de PCR foram submetidos à análise com base em
características morfológicas. Os resultados de todas as PCRs estão na Tabela 4.
Tabela 4 - Isolados de Fusarium spp. coletados em grãos assintomáticos na
segunda safra de 2007 segundo amostra de origem e resultados das
PCRs com primers específicos para gênero Fusarium (FUS), para o
gene fum5 (fum5) e para as espécies F. verticillioides (FV), F.
Proliferatum (FP) e F. subglutinans (FS)
Amostra Isolado FUS fum5 FV FP FS
LGM 1-2/07 A LGM-Fus 426 + + + - -
LGM-Fus 427 + + + - -
LGM 2-2/07 A LGM-Fus 428 + + + - -
LGM-Fus 429 + + + - -
LGM 3-2/07 A LGM-Fus 430 + - - - -
LGM-Fus 431 + + + - -
LGM 4-2/07 A LGM-Fus 432 + + + - -
LGM-Fus 433 + + + - -
LGM 5-2/07 A LGM-Fus 434 + + - - -
LGM-Fus 435 + - - - -
LGM 6-2/07 A LGM-Fus 436 - + - - -
LGM-Fus 437 + + + - -
LGM 7-2/07 A LGM-Fus 438 + + - - -
LGM-Fus 439 + - - - -
LGM 8-2/07 A LGM-Fus 440 + + + - -
LGM-Fus 441 + + - - -
LGM 9-2/07 A LGM-Fus 442 - + - - -
LGM-Fus 443 + + + - -
LGM 10-2/07 A LGM-Fus 444 + + + - -
LGM-Fus 445 + + + - -
LGM 11-2/07 A LGM-Fus 446 + + - - -
LGM-Fus 447 + + - - -
LGM 12-2/07 A LGM-Fus 448 + + + - -
LGM-Fus 449 + - - - +
LGM 13-2/07 A LGM-Fus 450 + + + - -
LGM-Fus 451 + + + - -
LGM 14-2/07 A LGM-Fus 452 + - + - -
LGM-Fus 453 + - + - -
LGM 15-2/07 A LGM-Fus 454 + - - - -
LGM-Fus 455 + + + - -
Assim como nos grãos ardidos, as PCRs para confirmação de gênero não
foram positivas para todos os isolados. Os isolados que não foram identificados
como sendo do gênero Fusarium pela PCR passaram por análise morfológica e
todos foram confirmados, resultando em 100% de isolados de Fusarium spp.
44
As PCRs realizadas com os isolados obtidos de grãos assintomáticos
confirmou 93% dos isolados como pertencentes ao gênero Fusarium. A PCR para
espécie F. verticillioides foi positiva para 60% dos isolados, para F. proliferatum
nenhum isolado mostrou amplificação e para F. subglutinans apenas 1 isolado foi
positivo. A PCR para identificação dos isolados com potencial toxigênico foi positiva
para 70% dos isolados.
As PCRs conduzidas para identificação da espécie F. proliferatum não foram
positivas para nenhum dos isolados. Foram feitas reações com um controle positivo,
mostrando que os primers utilizados funcionam e, desta forma, nenhum dos isolados
pode ser caracterizado como F. proliferatum.
As concentrações de fumonisinas foram obtidas por meio de teste de ELISA.
Em 8 amostras não foram detectadas fumonisinas e nas demais amostras os níveis
variaram de 0,9 a 2,1 µg/g (maior nível encontrado).
2.4 DISCUSSÃO
A alta incidência de Fusarium spp. encontrada nas amostras tanto de grãos
ardidos como de grãos assintomáticos concorda com outros trabalhos já realizados,
os quais também descrevem esse gênero como o mais freqüentemente associado a
grãos de milho no Brasil. Em 2000, por exemplo, Orsi et al. analisaram 195 amostras
de milho de 3 diferentes híbridos do estado de São Paulo e registraram incidências
que variaram de 84,6 a 92,3%. Em outro trabalho realizado com amostras do
Paraná, Ono et al (2008) analisaram um total de 615 amostras de duas safras de
anos diferentes e detectaram Fusarium sp. em 100% das amostras nas duas safras.
De acordo com Munkvold e Desjardins,(1997), a presença de algumas espécies de
Fusarium (principalmente F. verticillioides, antes denominado F. moniliforme) em
milho (planta e grãos) é muito comum, tanto em grãos assintomáticos como ardidos.
A relação entre o microrganismo e a planta é referida como endofítica e alguns
estudos relatam que a infecção por F. verticillioides pode estimular o crescimento e
desenvolvimento da planta devido à produção de hormônios promotores de
crescimento. Alguns relatos associaram a infecção por F.verticillioides à proteção da
planta contra patógenos mais severos e insetos (MUNKVOLD & DESJARDINS,
4
5
1997) ao passo que outros relataram a redução de infecção por Aspergillus flavus e
produção de aflatoxina em espigas co-inoculadas com Fusarium sp.(ONO et al.
1999, ZUMMO; SCOTT, 1992).
A identificação dos isolados com oligonucleotídeos gênero e espécie-
específicos não foi positiva para todos os isolados, tendo sido necessária a análise
morfológica dos mesmos, que confirmou se tratarem de organismos pertencentes ao
gênero Fusarium. Dois isolados foram negativos para todos os primers testados,
mas na maioria dos casos, isolados negativos para o primer específico de gênero
(FUS) foram positivos para o primer VER, específico para F. verticillioides. Somente
em um caso o isolado foi positivo para o primer SUB, de Fusarium subglutinans.
Desta forma, conclui-se que estes oligonucleotídeos não são universais e que
devem ser validados quando testados em populações diferentes daquelas em que
foram produzidos. Por outro lado, a identificação em nível de espécie destes
isolados PCR-negativos poderá ser definida por meio do seqüenciamento do gene
que codifica para o fator de elongamento 1-alfa, já que este tem sido utilizado para
propósitos classificatórios relativos a este gênero (GEISER et al., 2004). De acordo
com os autores, este gene oferece excelente representação dos produtores de
tricotecenos Tipo-B e dos complexos Giberella fujikuroi, F. oxysporum e F. solani.
Esta abordagem é de interesse, pois poderá revelar novas variantes de Fusarium
ainda não descritas na literatura, haja vista que este foi um dos primeiros trabalhos
que empregou reações polimerásicas com primers espécie-específicos com isolados
de milho no Brasil.
A identificação molecular de espécies mostrou que 162 dos 197 isolados
(82%) pertenciam à espécie F. verticillioides e somente 6 pertenciam a F.
subglutinans. A PCR com primers específicos para F.proliferatum não foi positiva
para nenhum isolado. Os 28 isolados não identificados por PCR espécie-específico
foram submetidos a análise morfológica e foram identificados como sendo F.
verticillioides. No entanto essa análise não é conclusiva pois a diferenciação
morfológica de espécies de Fusarium muitas vezes é complicada pela semelhança
das estruturas. Espécies como F. verticillioides e F. proliferatum possuem tênues
diferenças estruturais e é preciso muito treino e estudo para diferenciá-los. A
principal característica que diferencia F. verticillioides de F. proliferatum é que o
último, além de possuir monofiálides, também tem polifiálides como estrutura
46
reprodutiva, uma característica de difícil visualização. De qualquer maneira, espera-
se uma menor incidência de F. proliferatum em relação a F. verticillioides em grãos
de milho no Brasil, por ser uma espécie comumente encontrada em clima temperado
(MUNKVOLD; DESJARDINS, 1997).
A diferenciação molecular de espécies de Fusarium requer mais estudos
regionais. O desenvolvimento de primers gênero ou espécie-específicos para essa
finalidade deve levar em consideração as diferenças genéticas entre populações de
regiões distintas.
Os resultados da identificação molecular de isolados de Fusarium com
potencial toxigênico (gene fum5) foi, em sua grande maioria, positivo para ao menos
1 isolado de cada amostra de grãos ardidos. A presença do gene também foi
detectada em isolados de grãos assintomáticos, o que implica na possibilidade
desses grãos conterem fumonisinas, o que foi confirmado na prática. A quantificação
de fumonisinas em grãos assintomáticos já foi realizada em outro estudo no Brasil,
no entanto a identificação molecular do potencial toxigênico dos isolados
provenientes desses grãos e também dos grãos ardidos de amostras do Brasil é
inédita.
A quantificação de fumonisinas em grãos ardidos revelou alta concentração
da toxina nas amostras, variando de 4,4 µg/g a mais de 90 µg/g. Levando em
consideração que foram utilizados apenas grãos ardidos separadamente e
guardando a proporção com relação à quantidade de grãos ardidos por amostra, os
níveis variaram de 2,1 a acima de 44,4 µg/g quando extrapolados para amostras de
armazéns coletadas sem distinção entre grãos ardidos ou não. Estudo feito por
Hirooka et al. (1996) constatou níveis médios de 5,490 µg/g em amostras de milho
provenientes do Paraná, Mato Grosso do Sul e Goiás. Ono et al. (1999) verificaram
níveis que variaram de 7,0 a 13,460 µg/g em amostras do Paraná e Orsi et al. (2000)
observaram níveis que variaram de 0,87 a 49,32 µg/g em amostras de São Paulo.
No presente estudo, foram encontrados diferentes níveis de fumonisinas em
diferentes regiões. No entanto, todas as amostras tiveram níveis que excederam 4
µg/g, nível este proposto como máximo recomendado pelo FDA que é um órgão
mais tolerante que a rígida Comunidade Européia. Ao fazer a proporção de
concentração de fumonisinas em relação à quantidade de grãos assintomáticos nas
amostras cuja porcentagem de grãos ardidos foi fornecida, esses valores são
47
reduzidos e mesmo assim aproximadamente 50% das amostras ultrapassam 4 µg/g.
Esse resultado mostra que o milho produzido no Brasil, além poder apresentar um
risco para a saúde humana e animal, não se encaixa nos padrões exigidos por
países importadores, o que implica diretamente em perdas para a economia.
A quantificação de fumonisinas em grãos assintomáticos também identificou a
presença das toxinas, embora em níveis muito mais baixos, sendo o maior valor
encontrado de 2,1 µg/g. Os resultados para grãos assintomáticos desse trabalho
foram menores que os relatados por Ono et al, 2006, que também analisou grãos
ardidos e assintomáticos separadamente quanto à presença de FB
1
e FB
2
e
encontrou níveis de 0,57 a 20,38 µg/g em grãos assintomáticos. Comparando os
resultados com os obtidos de grãos ardidos, Ono verificou que as concentrações de
fumonisinas dos grãos ardidos chegaram a ser 166 vezes mais altas que as
quantificadas em grãos assintomáticos indicando assim que grãos ardidos
representam quase a totalidade de contaminação por fumonisinas. Assim como no
trabalho citado, os níveis de fumonisinas encontrados nos grãos ardidos foram
maiores que os níveis encontrados nos grãos assintomáticos, e variaram de 4,4 a
19,5 µg/g. Os resultados indicam a impossibilidade de eliminar esta toxina da dieta
humana e de outros animais e que medidas devem ser tomadas para reduzir suas
concentrações em alimentos e rações, tais como a utilização de sementes de
qualidade, utilização de híbridos resistentes, manejo adequado da cultura, controle
de condições do solo, entre outros.
O presente trabalho analisou amostras das principais regiões produtoras de
grãos de milho híbrido quanto à incidência de Fusarium ssp. e quanto aos níveis de
fumonisinas. As altas incidências de Fusarium spp. encontradas eram esperadas,
uma vez que fungos deste gênero são constantemente associados a grãos de milho.
A alta incidência de Fusarium spp. com potencial toxigênico não se mostrou
diretamente relacionada às altas concentrações de fumonisinas encontradas nas
amostras de grãos assintomáticos. Pode-se inferir que, por ser um metabólito
secundário, as fumonisinas são produzidas pelo fungo quando as condições
ambientais ou de armazenamento não são favoráveis. Em condições favoráveis, o
Fusarium spp. é classificado como endofítico e estabelece uma relação de simbiose,
podendo trazer benefícios para a planta como proteção contra patógenos e insetos,
liberação de hormônios que estimulam o crescimento e desenvolvimento da planta,
48
inibição de infecção por outros fungos. Isolados de Fusarium spp. com potencial
toxigênico foram encontrados tanto em grãos ardidos como assintomáticos e a alta
concentração de fumonisinas em grãos ardidos e baixa concentração em grãos
assintomáticos mostra que o fungo deixa de ser endofítico e passa a ser patogênico
sob certas condições, podendo causar danos na planta (como podridões) e produzir
micotoxinas. Nas diferentes regiões foram encontradas altas concentrações de
fumonisinas, mostrando que não se trata de um problema isolado ou regional e que,
portanto, são necessárias medias de controle em âmbito nacional. Levando-se em
consideração os limites máximos tolerados pelo FDA e pela Comunidade Européia,
poucas amostras analisadas seriam aceitas e liberadas para consumo humano.
Nossos resultados indicam que as fumonisinas nunca serão totalmente eliminadas
da nossa dieta haja vista que estas foram detectadas, embora em níveis baixos, em
amostras de grãos assintomáticos. Os maiores níveis foram encontrados em grãos
ardidos, responsáveis por quase a totalidade de fumonisinas nas amostras e dessa
forma, para reduzir as fumonisinas da dieta, o primeiro passo a ser tomado é
estabelecer um controle rigoroso no beneficiamento dos grãos. Os programas de
melhoramento genético e o desenvolvimento de híbridos resistentes devem ser
continuados, mas estes devem ser combinados com outros procedimentos para
obtenção de melhores resultados.
49
3 CONCLUSÕES
Foram encontradas altas incidências de Fusarium spp. e fumonisinas nas
principais regiões produtoras de milho no Brasil.
Potencial toxigênico para produção de fumonisinas (presença do gene FUM5)
foi detectado em isolados de Fusarium spp. provenientes de populações do Brasil.
A alta incidência de Fusarium spp. não está diretamente associado a altos
níveis de fumonisinas.
Grãos ardidos são responsáveis pela maior parte da contaminação por
fumonisinas.
A completa eliminação das fumonisinas da dieta não é possível. A redução
deve ser baseada na eliminação dos grãos ardidos através do controle rigoroso no
beneficiamento.
50
REFERÊNCIAS
AGROLINK. Disponível em:
<http://www.agrolink.com.br:8888/agrolinkfito/artigos_pg_detalhe_noticia.asp?cod=>.
Acesso em: 20 dez de 2007.
BENNET, J. W., KLICH, M. Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews,
Philadelphia, v. 16, n. 3, p. 497 – 516, 2003.
BLUHM, B. H., FLAHERTY, J E., COUSIN, M. A., WOLOSHUK, C. P. Multiplex
polymerase chain reaction assay for the differential detection of trichothecene- and
fumonisin- producing species of Fusarium in cormeal, Journal of Food Protection,
Des Moines, v. 66, p 1955-1961, 2002.
BRASIL, Ministério da Agricultura. Regras para análise de sementes. Brasília,
1992. 365p.
BULLERMAN, L.B. Significance of mycotoxins to food safety and human health.
Journal of Food Protection, Des Moines, v. 42, p. 65–86, 1979.
CASTRO, M. F. P. M., SHEPHARD, G. S., SEWRAN, V., VICENTE, E.,
MENDONÇA, T. A., JORDAN, A. C. Fumonisins in brazilian corn-based foods for
infant consumption. Food Additives and Contaminants, London, v. 21, n. 7, p. 693-
699, 2004.
CHEN, J., MIROCHA, C. J., XIE, W., HOGGE, L., OLSON, D. Production of the
mycotoxin fumonisin B
1
by Alternaria alternata f. sp. lycopersici. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, v. 58, p. 3928-3931, 1992.
COLVIN, B. M., HARRISON, L. R. Fumonisin – indiced pulmonary edema and
hidrotorax in swine. Mycopathologia, New York, v. 117, p. 79-82, 1992.
COUTO, A. A., GONÇALVES, R. M. Métodos em fitopatologia. Viçosa: Ed.
Universidade Federal de Viçosa. 2007. p. 213 – 214.
DESJARDINS, A. E. Fusarium Mycotoxins. Chemistry, Genetics and Biology. St.
Paul: The American Phytopathological Society.2006. 260p,
DINIZ, S. S. de S. Micotoxinas. Maringá: Livraria e Editora Rural. 2002. 181p.
51
D´MELLO, J. P. F., MACDONALD, A. M. C. Mycotoxins. Animal Feed Science and
Technology, Nottingham, v. 69, p. 155-166, 1997.
EDWARDS, K., JOHNSTONE, C., THOMPSON, C. A simple and rapid method for
the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research,
Oxford, v. 19, n. 6, p. 1349, 1991.
EMBRAPA. Grãos ardidos em milho. Sete Lagoas, 2005. (Circular Técnica n. 66).
EMBRAPA. Podridão branca da espiga de milho. Sete Lagoas, 2006. (Circular
Técnica n.141).
FAO. Disponível em: www.fao.org. Acesso em: 23 jan.2008.
FIGUEIRA, E. L. Z., COELHO, A. R., ONO, E. Y. S., HIROOKA, E. Y. Milho: riscos
associados à contaminação por Fusarium verticillioides e fumonisina. Semina:
Ciências Agrárias, Londrina, v. 24, n. 2, p. 359-378, 2003.
FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). Disponível em:
<http://www.cfsan.fda.gov/~dms/fumongu2.html>. Acesso em: 23 jan. 2008.
GEISER, D. M., JIMÉNEZ-GASCO, M. M., KANG, S., MAKALOWSKA, I.,
VEERARAGHAVAN, N., WARD, T. J., ZHANG, N., KULDAU, G. A., O´DONNELL, K.
FUSARIUM-IS v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European
Journal of Plant Pathology, Wageningen, v. 110, p. 473-479, 2004.
GELDERBLOM, W. C. A., JASKIEWICZ, J., MARASAS, W. F. O., THIEL, P. G.,
HORAK, R. M., VLEGGAR, R.; KRIEK, N. P. J. Fumonisins – mycotoxins with
cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme. Applied
Environmental Microbiology, Washington, v. 54, p. 1806-1811, 1988.
GONÇALEZ, E., FELÍCIO, J. D., PINTO, M. M. Bioflavonoids inhibit the production of
aflatoxin by Aspergillus flavus. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, Ribeirão Preto, v. 34, p. 1453, 2001.
HIROOKA, E. Y., YAMAGUCHI, M. M., AOYAMA, S., SUGIURA, Y., UENO, Y. The
natural occurrence of fumonisins in Brazilian corn kernels. Food Additives and
Contaminants, Bari, v. 13, p. 173-183, 1996.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE). Disponível em:
<www.ibge.gov.br>. Acesso em: 11 nov. 2008.
52
JULIAN, A. M., WAREING, P. W., PHILLIPS, S. I., MEDLOCK, V. F. P.,
MACDONALD, M. V., DEL RÍO, L. E. Fungal contamination and selected mycotoxins
in pre-and-post-harvest maize in Honduras. Mycopathologia, New York, v. 129, p.
5-16, 1995.
LINO, C. M., SILVA, L. J. G., PENA, A. S. Fumonisinas: presença em alimentos,
implicações na saúde e aspectos legislativos. Revista Portuguesa de Ciências
Veterinárias, Lisboa, v. 99, n. 552, p. 181-192, 2004.
LINO, C. M., SILVA, L. J. G., PENA, A. S. Metodologias para determinação das
fumonisinas em milho e alimentos à base de milho. Química Nova, São Paulo, v.
29, n. 2, p. 293-299, 2006.
LUCCA FILHO, O. A. Metodologia dos testes de sanidade de sementes. In: SOAVE,
J.; WETZEL, M. V. S. Patologia de sementes, Campinas: Fundação Cargill, 1987,
p. 176-198
MARASAS, W. F. O. Occurrence of Fusarium moniliforme and fumonisins in maize in
relation to human health. South African Medical Journal, Cape Town, v. 83, p. 382-
383, 1993.
MARASAS, W. F. O. Fumonisins: hystory, world-wide occurrence and impact. In:
JACKSON, L. S., DelVRIES, J. W., BILLERMAN, L. B. (Ed.), Fumonisins in food.
New York: Plenum Press, 1996. p. 1-17.
MARASAS, W. F. O., KELLERMAN, T., S., GELDERBLOM, W. C. A., COETZER, J.
A. W., THIEL, P. G., LUGT, J. J. Leukoencephalomalacia in a horse induced by
fumonisin B
1
isolated from Fusarium moniliforme. Onderstepoort Journal of
Veterinary Research, Pretoria, v. 55, p. 197 – 203, 1988.
MARASAS, W. F. O., RILEY, R. T., HENDRICKS, K. A., STEVENS, V. L., SADLER,
T. W., WAES, J. G., MISSMER, S. A., CABRERA, J., TORRES, O., GELDERBLOM,
W. C. A., ALLEGOOD, J., MARTÍNEZ, C., MADDOX, J., MILLER, J. D., STARR, L.,
SULLARDS, ROMAN, A. V., VOSS, K. A., WANG, E., MERRIL, A. H. Jr. Fumonisins
Disrupt Sphingolipid Metabolism, Folate Transport, and Neural Tube Development in
Embryo Culture and In Vivo: A Potential Risk Factor for Human Neural Tube Defects
among Populations Consuming Fumonisin-Contaminated Maize. Journal of
Nutrition, Bethesda , v. 134, p. 711 – 716, 2003.
MERRIL, A. H. Jr. De novo sphingolipid biosynthesis: A necessary, but dangerous,
pathway. Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 277, p. 25843-25846,
2002.
53
MORAES, M. H. D., MENTEN, J. O. M., GRAVENA, J. C., ALVES, C. A. Controle
químico de Fusarium moniliforme em sementes de milho: metodologia de avaliação
e efeitos sobre a qualidade fisiológica. Fitopatologia Brasileira, Lavras, v. 28, p.
626-632, 2003.
MUNKVOLD, G. P., DESJARDINS, E. A. Fumonisins in Maize. Can We Reduce
Their Occurrence? Plant Disease, St. Paul, v. 81, n 6, p. 556-565, 1997.
OKLAHOMA STATE UNIVERSITY. Disponível em:
<http://nue.okstate.edu/Crop_Information/World_Wheat_Production.htm>. Acesso
em: 19 dez. 2007.
ONO, E. Y. S., SUGIURA, Y., HOMECHIM, M., KAMOGAE, M., VIZZONI, E., UENO,
Y., HIROOKA, E. Y. Effect of climatic conditions on natural mycoflora and fumonisins
in freshly harvest corn of State of Paraná. Mycopathologia, New York, v. 147, p.
139-148, 1999.
ONO, E. Y. S., BIAZON, L., SILVA, M., VIZZONI, E., SIGIURA, Y., UENO, Y.,
HIROOKA, E. Y. Fumonisin in Corn: Correlation with Fusarium sp. Count, Damaged
Kernels, Protein and Lipid Content. Brazilian Archives of Biology and
Technology, Curitiba, v. 49, n. 1, p. 63-71, 2006.
ONO, E. Y. S., SILVA, M., HASHIMOTO, E. H., VIZONI, E., KAWAMURA, O.,
SUGIURA, Y., HIROOKA, E. Y. Mycotoxicological quality evaluation of corn samples
used by processing industries in the Northern region of Paraná state, Brazil. Food
Additives and Contaminants, London, v. 25, n. 11, p. 1392-1399, 2008.
ORSI, R. B., CORREA, B., POSSI, C. R., SHAMMASS, E. A., NOGUEIRA, J. R.,
DIAS, S. M. C. Mycoflora and occurrence of fumonisins in freshly harvest and stored
hybrid maize. Journal of Stored Products Research, São Paulo, v. 36, p. 75-87,
2000.
PERAICA, M., RADIĆ, B., LUCIĆ, A., PAVLOVIĆ, M. Toxic effects of mycotoxins in
humans. Bulletin of the World Health Organization, Geneva, v. 77, p. 754-766,
1999.
RHEEDER, J. P., MARASAS, W. F. O.; VISMER, H. F. Production of Fumonisin
Analogs by Fusarium Species. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 68, n. 5, p. 2101-2105, 2002.
RICHARD, J. L. Some major mycotoxins and their mycotoxicoses – An overview.
International Journal of Food Microbiology, Oxford, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.
2007.07.019, 2007.
SEEDNEWS. Disponível em:
<http://www.seednews.inf.br/portugues/seed62/milho62.shtmL> Acesso em: 19 dez.
2007.
54
SYDENHAM, E. W., MARASAS, W. F. O., SHEPHARD, G. S., THIEL, P. G.,
HIROOKA, E. Y. Fumonisin concentrations in brazilian feeds associated wiyh field
outbreaks of confirmed and suspected animal mycotoxicoses. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 40, p. 994-997, 1992.
UENO, Y. Risk os multi-exposure to natural toxins, Mycotoxins, Bilthoven, v. 50, p.
13-22, 2000.
VARGAS, E. A., CASTRO, P. L.; SILVA, C. M. G. Co-occurrence of aflatoxins B
1
, B
2
,
G
1
G
2
, zearalenona and fumonisin B
1
in brazilian corn. Food Additives and
Contaminants, London, v. 18, n. 11, p. 981-986, 2001.
ZHENG, M. Z., RICHARD, J. L., BINDER, J. A review of rapid methods for the
analysis of mycotoxins. Mycopathologia, New York, v. 161, p. 261-273, 2006.
ZUMMO, N., SCOTT, G. E. Interaction of Fusarium moniliforme and Aspergillus
flavus on kernel infection and aflatoxin contamination in maize ears. Plant Disease,
St. Paul, v. 76, p. 771-773, 1992.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
