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PRISCILA VENDRAMINI SILVA
EXPRESSÃO GÊNICA EM FOLÍCULOS E TECIDO OVARIANO
DURANTE O CICLO ESTRAL DE SUÍNOS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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PRISCILA VENDRAMINI SILVA
EXPRESSÃO GÊNICA EM FOLÍCULOS E TECIDO OVARIANO
DURANTE O CICLO ESTRAL DE SUÍNOS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
APROVADA: 28 de julho de 2008.
___________________________ ___________________________
Pesq. Marta F. M. Guimarães Prof. José Domingos Guimarães
(Co-orientadora) (Co-orientador)
____________________________ ___________________________
Prof. Paulo Sávio Lopes Pesq. Marco Antonio Machado
_____________________________
Profª. Simone Eliza Facioni Guimarães
(Orientadora)
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ii
Ao meu querido avô Morbello Vendramini (in memoriam),
Dedico.
iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de realização
do curso e à CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
À professora Simone, que desde a iniciação científica sempre me deu
grande apoio e tem me auxiliado na busca do conhecimento, pela
orientação, confiança e amizade.
À Dra. Marta, pelos ensinamentos e conselhos, por ser sempre tão
solícita. Ao professor JD, pela grande colaboração e pelas importantes
sugestões para a realização deste trabalho.
Aos funcionários da Granja de Melhoramento de suínos da UFV, pela
grande ajuda e disponibilidade durante a condução do experimento na
granja. Ao Maurício, Hugo, Alberto e Miguel, pela colaboração na coleta de
dados e manejo dos animais na granja de suínos.
Aos professores Paulo Sávio Lopes e Robledo de Almeida Torres, do
Departamento de Zootecnia, pelos ensinamentos que auxiliaram na minha
formação acadêmica.
A toda a equipe do Labtec, pela agradável convivência em grupo. Aos
amigos Isabela, Katiene, Marcos Yamaki, Bruna, Nicola, Mário, Débora,
Jairo, Fernanda, Rose e Juliana, pela amizade, pelos momentos de
descontração e incentivo.
Aos meus tios Marcelo e Sylvia, pelo carinho e apoio durante toda a
minha jornada em Viçosa.
Aos meus pais, em especial à minha mãe, pelos valiosos
ensinamentos, por estar sempre comigo em pensamento, torcendo por mim
e me fortalecendo com suas palavras e seu exemplo de vida.
Aos meus queridos avôs Inah e Morbello, pelo amor, pelo amparo e
por tudo o que eles representam na minha vida. Às minhas irmãs Daniela,
Juliana e Érica e aos meus sobrinhos queridos, pelo estímulo, atenção e
carinho.
iv
BIOGRAFIA
Priscila Vendramini Silva, filha de Décio Evandro da Silva e Lívia
Vendramini, nasceu em São Paulo – SP, em 05 de abril de 1982.
Em maio de 2002, ingressou no curso de Bioquímica, na
Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais, concluindo a
graduação em outubro de 2006.
Em outubro do mesmo ano, iniciou o Mestrado pelo Programa de
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal da Universidade
Federal de Viçosa, submetendo-se à defesa de dissertação para obtenção
do título de Magister Scientiae, em Genética e Melhoramento, dia 28 de julho
de 2008.
v
SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................... vi
ABSTRACT ................................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 3
2.1. Morfologia Ovariana e Ciclo Estral em suínos ........................................ 3
2.2. Dinâmica do Desenvolvimento Folicular ................................................. 5
2.2.1. Origem e formação do folículo primordial ......................................... 5
2.2.2 Foliculogênese .................................................................................. 6
2.2.3 Atresia Folicular e Apoptose da célula da granulosa ......................... 8
2.3 Estudo da expressão gênica no ovário .................................................. 11
2.3.1 IGFs e IGFBPs ................................................................................ 11
2.3.2 EGF ................................................................................................. 14
2.3.3 Caspases ........................................................................................ 15
2.3.4 p53 ...................................................................................................... 16
2.4. PCR quantitativo em Tempo Real ......................................................... 18
3.3 Quantificação das células ...................................................................... 22
3.4 Extração do RNA total ........................................................................... 23
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 21
3.1. Indução do Estro em fêmeas pré-púberes ............................................ 21
3.2 Coleta de material .................................................................................. 22
3.5 Síntese da primeira fita de cDNA ........................................................... 24
3.6 Desenho dos primers ............................................................................. 24
3.7 Cálculo da eficiência de amplificação .................................................... 25
3.8 Reação de RT-PCR em tempo real ....................................................... 26
3.9 Análise dos resultados de expressão gênica ......................................... 27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 28
5. CONCLUSÕES ........................................................................................ 46
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 47
vi
RESUMO
SILVA, Priscila Vendramini; M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, Julho de
2008. Expressão gênica em folículos e tecido ovariano durante o
ciclo estral de suínos. Orientadora: Simone Eliza Facioni Guimarães.
Co-orientadores: Marta Fonseca Martins Guimarães e José Domingos
Guimarães.
Durante o ciclo estral, uma rede de eventos hormonais e de fatores de
crescimento celular atua de maneira autócrina e parácrina para regular o
desenvolvimento folicular. Esses eventos são caracterizados por grande
dinamismo na expressão gênica e no acúmulo de transcritos gerados. No
presente estudo, avaliou-se a expressão dos genes IGF-I, EGF, IGFBP (1, 2,
3 e 5) e dos genes da cascata de apoptose celular (caspase 3 e p53) em
células foliculares e no tecido ovariano de fêmeas suínas nos dias 0, 6, 12 e
18 do ciclo estral por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real
(qPCR). O RNA total das células foliculares e do tecido ovariano foi extraído
para cada animal e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de
cDNA. O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno. Os resultados
da expressão gênica foram analisados por regressão linear, considerando os
dados de expressão gênica variável dependente e os dias do ciclo estral
variáveis independentes (0, 6, 12 e 18 dias). Todos os genes analisados
apresentaram expressão, sendo que o gene IGFBP2 apresentou perfil de
expressão linear aumentando durante o ciclo estral (P<0,02), e o gene
IGFBP3 apresentou perfil de expressão quadrático (P<0,01). Para os demais
genes estudados, não foi verificado efeito da expressão gênica em função
dos dias do ciclo estral. A técnica de qPCR mostrou-se eficiente na detecção
de transcritos de baixa abundância e no maior entendimento da dinâmica
folicular ovariana. Estudos devem ser ampliados para outros genes
relacionados e de outras vias metabólicas para melhor entendimento dos
estádios fisiológicos envolvidos na foliculogênese em suínos.
vii
ABSTRACT
SILVA, Priscila Vendramini; M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, July,
2008. Gene expression on follicles and ovarian tissue during estrous
cycle from swine. Adviser: Simone Eliza Facioni Guimarães. Co-
advisers: Marta Fonseca Martins Guimarães and José Domingos
Guimarães.
During a regular estrous cycle, a network of hormonal events, which
consist of hormones and growth factors, interact to regulate ovarian follicular
growth through autocrine and paracrine mechanisms. These events are
marked by a high dynamism of gene expression and level of transcripts in the
ovary tissue. Therefore, the objective of the present study was to
characterize the expression of genes IGF-I, IGFBP (1, 2, 3 e 5), EGF and
genes related to follicular atresia (caspase 3 and p53) in follicle cells and
ovary tissue in sows during 0, 6, 12 e 18 days of estrous cycle through real-
time quantitative PCR (qPCR) technique. The total RNA was extracted from
follicle cells and ovary tissue for each animal, and used to synthesize the first
strand cDNA. The GAPDH gene was used as endogenous control. The
results of gene expression were analyzed using linear regression with gene
expression as dependent variable and days of estrous cycle as independent
variables. The expression of each gene was detected on follicle cells and
ovary tissue, IGFBP2 gene increased sequentially during the estrous cycle
(P<0,02) and IGFBP3 gene shows a quadratic expression pattern (P<0,02).
For others genes the level of expression did not change during estrous cycle.
The qPCR showed to be efficient for detection of low levels of transcripts and
leads to a better understanding of follicle development dynamics. Studies
should be done to examine the expression of other related genes as well
genes of other metabolic pathways in order to broaden our understanding
about the follicular stages of folliculogenesis in the pig.
1
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, os programas de melhoramento genético de suínos
têm alcançado progresso próximo ao desejado para as características de
desempenho e carcaça, tais como taxa de crescimento, percentual de carne
e eficiência alimentar. Esse progresso tem se refletido na cadeia produtiva
de carne suína no Brasil, que apresenta um dos melhores desempenhos
econômicos internacionais, ocupando a quarta posição mundial, com uma
produção de 3,0 milhões de toneladas em 2007 (ABIPECS, 2007).
Atualmente, maiores esforços têm sido direcionados para aumentar a
eficiência produtiva por meio do melhoramento do desempenho reprodutivo
das fêmeas suínas. Dentre as características reprodutivas, o tamanho da
leitegada é um componente importante na redução de custos e na
produtividade da atividade suinícola. Apesar da variabilidade genética
existente, o tamanho da leitegada é uma característica complexa formada
por muitos componentes (taxa de ovulação, capacidade uterina,
sobrevivência embrionária e pós-natal), apresentando baixa herdabilidade,
com expressão limitada pelo sexo e medida somente após a maturidade
sexual.
A taxa de ovulação é um dos principais componentes que determinam
o tamanho da leitegada, sendo definida como o número de oócitos liberados
por estro (Knox, 2005). Durante o ciclo estral, hormônios e fatores de
crescimento celular atuam de maneira autócrina e parácrina para regular o
desenvolvimento folicular. Esses eventos são caracterizados por grande
dinamismo na expressão gênica e no acúmulo de transcritos gerados.
Nesse sentido, o entendimento do controle de características
reprodutivas requer, além do conhecimento da seqüência de DNA, a
integração dos aspectos genéticos e fisiológicos que incluem o conjunto de
transcritos, de proteínas e dos dados fenotípicos, a partir de uma grande
variedade de técnicas, tais como seqüenciamento, avaliação da expressão
gênica e análises mutacionais e transgênicas (Pomp et al., 2001).
Devido à importância da foliculogênese no sucesso reprodutivo em
suínos e com o objetivo de melhor compreender os mecanismos
moleculares envolvidos durante o desenvolvimento e a degeneração folicular
2
de porcas, alguns genes, cujos produtos são mediadores da dinâmica de
desenvolvimento folicular, como o fator de crescimento semelhante à
insulina (IGF-I), proteínas de ligação do IGF (IGBFP 1, 2, 3 e 5), fator de
crescimento epidérmico (EGF), caspase 3 e p53, foram selecionados para
caracterização de seu perfil de expressão, visando à detecção de genes que
possam ser testados e validados como marcadores do desenvolvimento e da
atresia folicular.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Morfologia Ovariana e Ciclo Estral em suínos
Os ovários são estruturas pares localizadas na cavidade abdominal e
pélvica do sistema reprodutor feminino (Coffey, 1997). Desempenham dupla
função no organismo: estimulam o desenvolvimento e a liberação de óvulos
e a síntese de hormônios esteróides. Ambas as funções são
interdependentes, complementares e necessárias para o sucesso
reprodutivo (Pineda, 1989).
A forma dos ovários varia de acordo com a espécie e o estádio do
ciclo estral. Nos suínos, os ovários se assemelham a cachos de uvas, em
decorrência do grande número de folículos e corpos lúteos salientes (Hafez
e Hafez, 2004). O ovário é composto por uma região cortical e uma medular.
A camada superficial do ovário é revestida por um epitélio denominado
túnica albugínea, abaixo da qual está situado o córtex que contém grande
massa de folículos em vários estádios de desenvolvimento, corpos lúteos e
elementos do estroma (Reece, 2005). A região medular, responsável pela
nutrição e sustentação do ovário, consiste de tecido conectivo frouxo, vasos
sanguíneos, vasos linfáticos e terminações nervosas que atingem o ovário
mediante seu hilo (Hafez e Hafez, 2004).
O estro e a ovulação são decorrentes de um fenômeno que envolve o
eixo hipotálamo-hipófise-ovário. O hormônio liberador das gonadotrofinas
(GnRH) secretado pelo hipotálamo atua na hipófise levando à liberação dos
hormônios gonadotróficos folículo-estimulantes (FSH) e luteinizantes (LH). O
FSH estimula o desenvolvimento folicular e a síntese de estrógenos pelas
células da granulosa. O LH estimula a ovulação, o desenvolvimento, a
manutenção e a função do corpo lúteo. Os estrógenos são responsáveis
pelos sintomas do estro e pelo pico de LH que desencadeará a ovulação
(Coffey, 1997).
A espécie suína atinge a puberdade entre seis e sete meses de idade.
As taxas de ovulação são mais pronunciadas no terceiro estro após a
puberdade (Reece, 2005). A duração do período do cio puberal geralmente é
4
mais curta (47 horas) que as posteriores (56 horas) e as porcas jovens
(marrãs) têm um período de cio mais curto. Os oócitos são liberados entre
42 e 48 horas após o início do cio, e a duração do processo ovulatório é de
aproximadamente 3,8 horas (Anderson, 2004).
Após a ovulação, cada tecido folicular rompido forma o corpo lúteo
responsável pela produção e secreção de progesterona. Esse hormônio tem
influência negativa sobre o desenvolvimento folicular, inibindo a secreção de
FSH e LH por meio da supressão da liberação do hormônio liberador de
gonadotrofina (GnRH) pelo hipotálamo (Coffey, 1997). O período de
atividade do corpo lúteo é chamado de fase luteínica com duração de 16 a
17 dias em porcas. A fase folicular compreende o período de regressão do
corpo lúteo até a ovulação, com duração de três a seis dias (Pineda, 2003).
Durante a fase folicular, os folículos em crescimento secretam quantidades
cada vez maiores de estrogênio que produz a liberação de LH por meio da
atuação sobre o hipotálamo e a hipófise anterior, resultando na ovulação e
na formação do corpo lúteo. Com a regressão do corpo lúteo, a secreção de
progesterona é reduzida e o ciclo se repete (Coffey, 1997).
O ciclo estral é o período que compreende dois estros consecutivos,
caracterizado por mudanças fisiológicas e no padrão de comportamento da
fêmea, resultando na liberação de óvulos capazes de ser fertilizados e na
formação do corpo lúteo (Hafez et al., 2004). Na espécie suína, o ciclo estral
dura aproximadamente 21 dias, variando entre 17 e 25 dias e pode ser
dividido em quatro fases distintas: proestro (fase folicular), estro
(receptividade sexual), metaestro (desenvolvimento inicial do corpo lúteo) e
diestro (período da fase madura do corpo lúteo) (Dukes, 1993). As fêmeas
suínas são poliéstricas contínuas e somente prenhez ou disfunção endócrina
interrompem sua ciclicidade (Hafez et al., 2004).
O estro (dia 0 a 2 do ciclo) é o período de receptividade das fêmeas,
caracterizado por modificações comportamentais como inquietação, redução
do apetite, aceitação da monta, hiperemia e edema vulvar, com duração
média de 2 dias (Dukes, 1993). É determinado, principalmente, pelo nível de
estrógeno circulante, ocorrendo a ovulação, durante ou pouco depois desse
período, induzida pela redução dos níveis séricos de FSH e aumento dos
níveis de LH, culminando com a ruptura do folículo ovariano e liberação do
5
folículo de Graaf (Frandson, 1979).
O metaestro (dia 2 a 6 do ciclo) é a fase pós-ovulatória caracterizada
pela atividade secretória de esteróides pelo corpo lúteo (Frandson, 1979).
Nessa fase, a concentração de progesterona aumenta abruptamente após o
dia 2, alcançando valores máximos entre os dias 8 e 12 do ciclo, cuja função
principal nessa espécie é manter a gestação (Foxcroft e Van de Wiel, 1982).
O diestro (dia 6 a 16) é período relativamente curto em animais
poliéstricos. Nessa fase, o endométrio suíno sintetiza PGF2α durante a
metade final da fase luteínica, provocando a regressão do corpo lúteo.
Nesse período, os pulsos de LH e FSH estimulam o desenvolvimento de
novos folículos e posterior ovulação (Foxcroft e Van der Wiel, 1982).
O proestro (dia 16 a 21) caracteriza-se pela fase de preparação do cio
quando ocorre a maturação folicular e o desenvolvimento dos folículos sob o
estímulo do FSH secretado pela hipófise anterior (Foxcroft e Van der Wiel,
1982). Durante essa fase, o folículo ovariano aumenta de diâmetro, devido
ao aumento do líquido folicular que contém estrógeno. As concentrações de
estrógeno no plasma periférico aumentam com o declínio e o
desaparecimento da progesterona, atingindo valores máximos dois dias
antes do cio, refletindo o rápido crescimento e maturação dos folículos de
Graaf durante o final do proestro (Anderson, 2004).
2.2. Dinâmica do Desenvolvimento Folicular
2.2.1. Origem e formação do folículo primordial
Em mamíferos, a oôgenese ocorre no início da vida fetal,
permanecendo estacionada no dictióteno da primeira prófase meiótica até a
fase adulta sexualmente madura (Picton et al., 1998).
A oôgenese tem início com a formação das células germinativas
primordiais (PGCs), precursoras móveis dos oócitos, que migram do seu
sítio de origem para o ovário em desenvolvimento em resposta a estímulos
quimiostáticos, como citocinas e fatores de sinalização (Gosden, 1995). Uma
vez estabelecidas, essas células perdem a mobilidade e são referidas como
oogônias (Picton et al., 1998). A população de oogônia prolifera por meio de
divisões mitóticas por tempo determinado de acordo com a espécie. Após o
6
início da meiose, as células germinativas, agora chamadas de oócitos
primários, continuam a fase de divisão passando pelas fases de leptóteno,
zigóteno e paquíteno da prófase I da meiose antes de atingir a fase de
diplóteno (Gosden e Bownes, 1995). Em suínos, a transição de oogônia a
oócito estende-se por pelo menos até 35 dias de vida pós-natal. A meiose
começa ao redor do 40° dia do desenvolvimento embrionário. O estádio de
diplóteno inicia-se por volta do 50° dia e quase todas as células estão nessa
fase cerca de 20 dias após o nascimento. A pequena quantidade de
oogônias e a ausência de mitose oogonial indicam a conclusão da oogênese
por volta do dia 100 do desenvolvimento fetal (Hafez, 2004).
Na fase de diplóteno, os oócitos continuam a aumentar de volume,
com intensa replicação e reorganização das organelas citoplasmáticas.
Nessa fase, os oócitos primários permanecem em um estado inativo até a
puberdade quando os folículos selecionados estão aptos a ovular (Picton,
2001). Durante esse processo, os oócitos da região medular do ovário
perdem a ligação com pontes intercelulares e são envolvidos por uma única
camada plana ou poliédrica de células pré-granulosas, dando origem ao
folículo primordial (Gosden e Bownes, 1995). A estrutura do folículo se torna
completa com o surgimento de muitas camadas de células do estroma que
se diferenciam em células da teca após o início do crescimento folicular.
Uma vez estabelecida, a unidade folicular promove um ambiente controlado
e isolado de substâncias que possam danificar o oócito. Oócitos não
incorporados em folículos primordiais tendem a degenerar (Gandolfi, 2005).
Uma das modificações mais visíveis que ocorrem durante a oogênese
em mamíferos é a formação da Zona Pelúcida (ZP), matriz extracelular
constituída por glicoproteínas que circundam o oócito, estabelecendo
regiões de contato com a camada interna das células da granulosa (as
células do cumulus) (Richards, 1994). O contato intracelular permite a
passagem de pequenas moléculas (<1500 M
r
) envolvidas no metabolismo
do oócito e na regulação da meiose (Gosden e Bownes, 1995).
2.2.2 Foliculogênese
A foliculogênese pode ser definida como o processo de
desenvolvimento dos folículos ovarianos que tem início no recrutamento dos
7
folículos primordiais e termina com a formação do folículo de Graaf ou pré-
ovulatório (Picton, 2001) ou morte celular (atresia). O processo de
desenvolvimento folicular e de sobrevivência depende da sinalização
endócrina e parácrina envolvendo fatores de crescimento secretados pelas
células da granulosa, células da teca, células intersticiais do estroma e
oócitos (Manabe et al., 2004).
Quando os folículos primordiais atingem a fase de crescimento, as
células da granulosa começam a se dividir, o oócito se torna maior e
circundado pela zona pelúcida. Gradualmente, os folículos se tornam
secundários e são definidos como folículos pré-antrais. A fase inicial de
crescimento é considerada independente de estímulos gonadotrópicos
(Hafez, 2004), entretanto, alguns estudos sugerem a presença de receptores
de FSH nesses folículos imaturos (Nussey e Whitehead, 2001).
Dentre as espécies animais, a suína destaca-se pela presença de
grande número de folículos, compreendendo 30-90 folículos com 1 a 2 mm
de diâmetro e 30-50 folículos com 2 a 7 mm de diâmetro durante a fase lútea
do ciclo estral (Guthrie et al., 1995). Durante a fase folicular, o número de
folículos pequenos e médios decresce dramaticamente, restando 10 a 20
folículos (Guthrie et al., 1995; Hafez, 2004). Os folículos destinados a ovular
aumentam de tamanho entre os dias 14 e 16 do ciclo estral, atingindo 7 a 10
mm antes da ovulação (Cox, 1997). O padrão de desenvolvimento folicular
de suínos é caracterizado pela ativação contínua, crescimento lento até o
estádio de folículo antral, e rápido crescimento de 4 a 5 mm seguido por
atresia (Guthrie, 2005). A ausência de ondas foliculares durante a fase lútea
nas porcas poderia ser explicada pela atuação de hormônios (inibinas e
estradiol) sintetizados pelo seu corpo lúteo, regulando negativamente os
níveis de FSH e mantendo a concentração necessária para o recrutamento
folicular (Driancourt, 2001).
A maturação dos folículos ovarianos envolve os seguintes estádios:
iniciação, crescimento, seleção, ovulação e luteinização. Esses eventos
estão sob controle endócrino. Uma vez que o folículo inicia seu crescimento,
concentrações basais de gonadotrofinas, FSH e LH mantêm seu
crescimento até o estádio de folículo antral. Os pequenos folículos antrais
são selecionados para continuar crescendo por aumentos sutis nas
8
concentrações basais de gonadotrofinas. Uma vez selecionados, os folículos
crescentes dominantes adquirem características funcionais específicas que
lhes permitem diferenciar-se e passar para o estádio pré-ovulatório e
sintetizar estradiol. Elevados níveis desse hormônio induzem a síntese de
gonadotrofinas, que, por sua vez, estimulam a ovulação e a luteinização de
folículos pré-ovulatórios (Richards, 1994). Entretanto, a maior parte dos
folículos antrais se degenera e durante cada ciclo estral apenas uma parte é
selecionada para a ovulação (Guthrie, 2005).
2.2.3 Atresia Folicular e Apoptose da Célula da Granulosa
Nos ovários de mamíferos, mais de 99% dos folículos, considerando a
concepção até sua formação, sofrem um processo degenerativo conhecido
como atresia que pode ocorrer em vários estádios do desenvolvimento
folicular (Tilly, 1996). Em suínos, a maior taxa de ovulação e o tamanho da
leitegada são verificados nas porcas da raça Meishan, que apresentam
maior número de folículos terciários no dia 16 do ciclo estral e menor número
de folículos atrésicos em relação às raças européias. A atresia limita o
número de oócitos disponíveis para fertilização (Matsui et al., 2003). Dessa
forma, a alta prolificidade da raça Meishan pode estar relacionada a
diferenças no recrutamento folicular e na atresia (Manabe et al., 2004).
A degeneração folicular pode ser reconhecida pela presença das
seguintes mudanças morfológicas: presença de núcleo picnótico e de corpos
apoptóticos na célula da granulosa, seguida pela retração da camada de
células da granulosa da membrana basal do folículo e fragmentação da
membrana basal (Hirshfield, 1989).
A degeneração folicular nos ovários de mamíferos é primeiramente
induzida pela apoptose das células da granulosa, que constitui um
componente essencial para a função e para o desenvolvimento ovariano
(Manabe et al., 1996). Durante a vida fetal, a apoptose ocorre principalmente
nos oócitos, enquanto na vida adulta é detectada nas células da granulosa
de folículos secundários e antrais (Hussein, 2005).
Em suínos, as células da granulosa situadas na superfície interna da
parede folicular são as primeiras a sofrer apoptose (Sugimoto et al., 1998). A
9
identificação de diferenças em relação ao sítio de início desse processo em
diferentes espécies sugere que os estímulos que induzem a via da
sinalização da apoptose podem diferir entre as espécies (Manabe et al.,
2004).
A apoptose ou morte celular programada é um mecanismo celular
essencial para o desenvolvimento embrionário e para a homeostase de
tecidos adultos, visando a eliminar células desnecessárias, infectadas ou
danificadas geneticamente pela ativação de um programa de autodestruição
celular intrínseco e controlado (Vaux, 1993). A morte da célula apoptótica
pode ser induzida por estímulos ambientais ou fisiológicos, envolvendo gasto
de energia pela célula e é freqüentemente regulada durante a transcrição ou
a tradução (Guthrie, 1995).
A ativação bioquímica da apoptose pode ocorrer por duas vias de
sinalização principais: a via extrínseca (citoplasmática) e a via intrínseca
(mitocondrial). A via extrínseca é desencadeada pela ligação de ligantes
específicos a um grupo de receptores de membrana da superfamília dos
receptores de morte, tais como Fas/APO-1/CD95, receptores 1 e 2 do fator
de necrose tumoral (TNFR), interferon (IFN) e receptores 4 e 5 do fator de
necrose tumoral relacionado à apoptose (TRAIL) (Nagata, 1997). Esta
ligação é capaz de ativar a cascata de caspases intracelulares, com pelo
menos 14 caspases já identificadas (Grutter, 2000).
A via intrínseca ou mitocondrial é freqüentemente ativada em
resposta a danos no DNA, envolvendo a ativação de um membro pró-
apoptótico da família Bcl-2 (principalmente Bax) (Hussein, 2005). Os
membros pró e anti-apoptóticos da família Bcl-2 regulam a liberação do
citocromo c a partir da membrana mitocondrial interna. O citocromo c
liberado e a protease ativadora do fator 1 (Afap-1) ligam-se à caspase-9,
formando o apoptossomo. A caspase 9 ativada inicia o processo e cliva as
caspases efetoras subseqüentes (2, 3, 7, 8, 9 e 10) ativando a cascata de
caspases que leva à morte celular por apoptose (Budihardjo, 1999).
Matsui et al. (2003) demonstraram que a via apoptótica dependente
da mitocôndria contribui para a amplificação e propagação da morte por
apoptose das células da granulosa em suínos. A via de apoptose mediada
por receptor nas células da granulosa em suínos, proposta por Manabe et al.
10
(2004), está ilustrada na Figura 1 e pode ser descrita da seguinte maneira:
(1) ligantes específicos se ligam ao domínio extracelular dos receptores de
morte celular, resultando na trimerização e ativação dos seus domínios de
morte intracelulares (DD); (2) os DD dos receptores interagem com o
domínio DD da proteína adaptadora Fas associada ao domínio de morte
(FADD) por meio de uma interação homofílica; (3) a FADD ativa uma
caspase iniciadora (pró-caspase 8 ou FLICE), uma molécula bipartida
contendo um domínio efetor de morte N-terminal (DED) e um domínio C-
terminal (DD); (4) a pro-caspase 8 é ativada por auto-proteólise e a caspase
8 ativa cliva a proteína Bid, sua forma truncada libera o citocromo c da
mitocôndria, e o citocromo c se liga ao fator de ativação de protease (Apaf-
1), cuja oligomerização é dependente de ATP, recrutando a caspase 9 e
formando um complexo multiprotéico denominado apoptosomo; e (5) a
caspase 9 é ativada por mudanças conformacionais e ativa as caspases
efetoras downstream (caspase 3) induzindo a morte celular (Manabe et al.,
2004). Entretanto, a interação ligante-receptor de morte não resulta
necessariamente na morte celular, indicando a importância de inibidores da
via de sinalização apoptótica (Matsuda-Minehata, 2006), como as proteínas
inibitórias intracelulares conhecidas como FLICE (cFLIPs e cFLIP
L
, formas
curta e longa, respectivamente) que são altamente expressas nas células da
granulosa, onde atuam como fatores anti-apoptóticos de sobrevivência (Goto
et al., 2004). Além disso, alguns sistemas de receptores de morte celular
possuem receptores “decoy” que atuam como inibidores da morte celular
induzida por ligantes na célula da granulosa (Manabe et al., 2004).
11
Figura 1. Ilustração esquemática da via de sinalização da apoptose mediada por receptores
de morte nas células da granulosa dos folículos ovarianos de porcas, proposta por
Manabe et al. (2004).
2.3 Estudo da expressão gênica no ovário
Com o intuito de compreender melhor os mecanismos moleculares
envolvidos no desenvolvimento e na degeneração folicular de porcas, alguns
genes cujos produtos são mediadores da dinâmica de desenvolvimento
folicular foram selecionados para estudo nesta dissertação. A seguir, será
feita a descrição dessas moléculas e de sua participação no
desenvolvimento ovariano.
2.3.1 IGFs e IGFBPs
Diversos estudos têm mostrado que o sistema IGF, formado pelos
fatores de crescimento semelhante à insulina (IGFs, Insulin-like Growth
Factors) e proteínas de ligação do IGF (IGFPBs, Insulin-like Growth Factor
Binding Proteins), exerce importante função no controle do desenvolvimento
folicular e atresia em animais domésticos (Monget et al., 2002). O sistema
IGF é composto por diferentes elementos: dois ligantes (IGF-I e IGF-II), dois
tipos de receptores (IGFR-I e IGFR-II) e seis proteínas de ligação do IGF
(IGFBP1, 2, 3, 4, 5 e 6), que se ligam ao IGF-I e IGF-II com alta afinidade
(Jones e Clemmons, 1995; LeRoith et al., 1995; Rajaram et al., 1997).
12
Entretanto, a maior parte dos efeitos celulares dos IGFs no ovário é mediada
pela ligação com o receptor tipo I (LeRoith et al., 1995).
A expressão do receptor tipo I parece ser modulada pela ação de
gonadotrofinas e estrógenos nas células da granulosa (Adashi, 1998). A
capacidade de o FSH induzir os receptores tipo I foi confirmada em estudos
com camundongos hipofisectomizados tratados com esse hormônio. Esse
tratamento resultou em um aumento significativo no acúmulo de transcritos
para esse receptor (Adashi, 1998).
Os IGFs são hormônios peptídicos secretados por diferentes tecidos.
Devido à sua reconhecida atividade promotora do crescimento celular, esses
fatores também são conhecidos como somatomedinas (mediador dos efeitos
da somatrotofina) (Jones e Clemmons, 1995). Os efeitos do IGF-I na
proliferação e na diferenciação das células da granulosa foram verificados
em camundongos (Adashi et al., 1990), ovinos (Campbell et al., 1995),
suínos (Samaras et al., 1993) e humanos (Giudice, 1992). Entretanto, a
resposta ao estímulo de proliferação ou de diferenciação das células da
granulosa pelo IGF-I é variável de acordo com a espécie, com o estádio de
desenvolvimento folicular e com as mudanças no perfil de expressão dos
diferentes elementos do sistema IGF durante o crescimento folicular e a
atresia (Mazerbourg et al., 2003).
Em ovários de suínos e roedores, transcritos do IGF-I estão
localizados nas células da granulosa de folículos saudáveis, enquanto
transcritos do IGF-II são encontrados nas células da granulosa de folículos
saudáveis e atrésicos (Samaras et al., 1993; Zhou et al., 1996). Em suínos, o
IGF-I exerce importante papel na foliculogênese, atuando na supressão da
apoptose e na promoção da replicação das células da granulosa dos
folículos pré-antrais, com potencial aplicação no desenvolvimento destes
folículos in vitro, cujos oócitos estejam aptos para fertilização e
desenvolvimento embrionário (Mao et al., 2004).
Embora a concentração da proteína IGF-I seja constante durante a
fase folicular, sua biodisponibilidade pode ser regulada pela presença das
proteínas de ligação do IGF no tecido folicular (Guthrie, 2005). As IGFBPs
modulam os efeitos dos IGFs por mecanismos de regulação parácrinos e
autócrinos. A origem dessa regulação pode depender do reconhecimento de
13
IGFBPs, que podem ser glicosiladas ou sofrer modificações pós-traducionais
como fosforilação (Monget e Bondy, 2000). As IGFBPs modificam os efeitos
dos IGFs por meio da regulação de seu transporte, de sua concentração nos
compartimentos celulares e de sua interação com receptores celulares
específicos, potencializando ou inibindo suas funções (Kostecká e Blahovec,
2002). O sistema IGF intra-ovariano está, dessa forma, envolvido na
amplificação do sinal hormonal de gonadotrofinas (Adashi, 1998).
A IGFBP1 é uma proteína não glicosilada de 30 kDa, primeiramente
isolada do fluido amniótico em humanos (Drop et al., 1979). É produzida
pelas células do endométrio e decídua em humanos sob regulação do
hormônio progesterona (Seppala et al., 1994). Está presente no fluido
amniótico em concentrações 100 a 500 vezes superiores às do soro
sanguíneo (Rajaram et al., 1997). O transcrito da IGFBP1 não foi detectado
no ovário de camundongos e de suínos e não demonstra padrão consistente
de expressão no ovário de humanos e de outros primatas (Zhou et al.,
1996).
A IGFBP2 é uma proteína não glicosilada de 29 a 40 kDa,
primeiramente identificada no fluido cérebro-espinhal de humanos e de
camundongos (Spicer e Echternkamp,1995). Sua expressão tem sido
observada nas células da granulosa e nas células da teca em ovinos
(Besnard et al., 1996), bovinos (Armstrong et al., 1998) e suínos (Samaras et
al., 1992). Em muitas espécies, o aumento e o decréscimo na expressão do
mRNA de IGFBP2 durante as fases de crescimento e de atresia,
respectivamente, parecem explicar mudanças nos níveis intrafoliculares
dessa proteína (Mazerbourg et al., 2003).
A IGFBP3 é uma proteína glicosilada de 150 kDa composta de duas
subunidades de 28 e 53 kDa. É produzida pelas células lúteas da granulosa
de suínos, camundongos e pelas células da teca e da granulosa em
humanos (Spicer e Echternkamp, 1995). Sua concentração parece não
mudar durante a foliculogênese na maioria das espécies, com exceção de
ovinos. Nos folículos ovarianos, sua expressão é considerada baixa e parece
não estar associada ao crescimento ou à atresia (Mazerbourg et al., 2003).
A IGFBP4 foi identificada primeiramente no soro sanguíneo de
camundongos, possuindo peso molecular entre 24 a 30 kDa. Sua expressão
14
tem sido verificada em folículos pré-antrais de camundongos, células da teca
humana (Spicer e Echternkamp, 1995) e células da teca e da granulosa em
suínos (Mazerbourg et al., 2003).
A IGFPB5 é uma proteína de 29 a 31 kDa identificada primeiramente
em folículos antrais e pré-antrais de camundongos e células do corpo lúteo
em humanos (Spicer e Echternkamp, 1995). Em suínos, sua expressão
ocorre nas células da granulosa. Os níveis e os sítios de expressão da
IGFBP4 e da IGFBP5 diferem entre as espécies de mamíferos estudadas
durante o crescimento folicular, sugerindo que essas proteínas possam ter
funções específicas ou secundárias na foliculogênese ovariana. As
mudanças nas concentrações dessas proteínas durante a foliculogênese
podem ser atribuídas a dois processos: mudanças na expressão do mRNA e
mudanças na degradação proteolítica (Mazerbourg et al., 2003).
2.3.2 EGF
O fator de crescimento epidérmico (EGF) é um polipeptídeo com
potente atividade mitogênica em diversos tipos celulares in vivo e in vitro
(Gospodarowicz e Bialecki, 1979). O EGF modula a diferenciação das
células da granulosa de maneira parácrina ou autócrina, atuando como
supressor do receptor de LH nas células da granulosa e como inibidor da
produção de estradiol pelas células da teca em ratos (Mondschein e
Schomberg, 1981).
O EGF atua por meio da ligação de alta afinidade com seu receptor
transmembrana (EGF-R). O EGF-R pertence à classe dos receptores
tirosina quinase e sua ligação ao EGF implica ativação da tirosina quinase
do seu domínio intracelular e início da sinalização celular (Boonstra et al.,
1995). A atividade de tirosina quinase do receptor adiciona grupos fosfatos
aos resíduos de tirosina na cadeia vizinha. Proteínas sinalizadoras dentro da
célula se ligam as tirosinas fosforiladas iniciando a cascata de transdução de
sinal, resultando na ativação da síntese de DNA e no crescimento celular
(Goodsell, 2003).
O EGF é membro da família das proteínas EGF com características
estruturais e funcionais similares, que incluem o fator de crescimento de
transformação-α (TGF-α), anfiregulina (AREG), epiregulina (ERG),
15
neuregulinas, betacelulinas (BTC) e fatores de crescimento semelhantes à
EGF ligantes de heparina (HB-EGF) (Dreux et al., 2006). Dentre esses
fatores, o EGF e TGF-α têm sido os mais investigados como reguladores da
função ovariana (Singh et al., 1995). O EGF foi um dos primeiros fatores de
crescimento identificados, como indutor da expansão das células do cumulus
circundantes do oócito em camundongos (Dekel e Sherizly, 1985).
Posteriormente, outros estudos verificaram que esse fator estava envolvido
no processo de maturação de oócitos nos mamíferos em geral (Downs,
1989; Coskun e Lin, 1995; Lonergan et., 1996).
Em suínos, o EGF e o fator de crescimento de transformação-β (TGF-
β) podem modular a esteroidogênese em células da teca e da granulosa
executando importante papel no crescimento e na diferenciação celular
(Hafez et al., 2004). A regulação da proliferação das células da granulosa
nas porcas é resultado da ação combinada de fatores de crescimento
adicionais, uma vez que a atividade mitogênica não é verificada sob o
estímulo único de EGF (Keel e Davis, 1999). Fujinaga et al. (1992)
demonstraram que receptores das células da granulosa dos folículos antrais
e pré-antrais possuem maior capacidade de ligação ao EGF em relação às
células lúteas, com ausência de ligação nas células da teca. Além disso,
verificaram pequeno número de receptores específicos e de alta afinidade
para o EGF nas células da granulosa. Esse número parece mudar durante o
processo de diferenciação celular, indicando que o FSH pode influenciar na
foliculogênese por meio da regulação de receptores de EGF nessas células.
2.3.3 Caspases
As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)
constituem uma família de cisteína proteases, peptidases com císteína no
sítio ativo, capazes de reconhecer e clivar substratos após resíduos de ácido
aspártico. As caspases são sintetizadas como precursoras inativas ou pró-
enzimas devendo ser ativadas por clivagem proteolítica (Nicholson e
Thornberry, 1997). A presença de ligações Asp-X entre os seus domínios
sugere que sua ativação é autocatalítica, mediada por enzimas com
especificidades similares, como outras caspases (Thornberry, 1998).
Estudos sugerem que há distintas rotas de ativação de caspases na célula,
16
variando de acordo com o estímulo que inicia a apoptose (Slee et al., 1999).
As caspases são as principais moléculas efetoras da apoptose no
ovário (Hussein, 2005). Pelo menos 14 caspases humanas já foram
identificadas e classificadas em três grupos de acordo com sua
especificidade: grupo I (caspases 1, 4, 5, 13); grupo II (caspases 2, 3 e 7); e
grupo III (caspases 6, 8, 9, 10) (Grutter, 2000). Dentre estas, as caspases (3,
6, 7, 8, 9, 10) participam da apoptose (Boatright e Salvesen, 2003), enquanto
um subgrupo dessa família está envolvido nos mecanismos de defesa inata,
atuando como ativador de pró-citocinas (1, 4, 5) (Denault e Salvesen, 2002).
As caspases apoptóticas são classificadas como iniciadoras ou
efetoras, de acordo com seu papel na cascata apoptótica. Caspases
iniciadoras (8 e 9) são as primeiras a serem ativadas e constituem o primeiro
passo da cascata de caspases, enquanto as efetoras (3, 6 e 7) são ativadas
posteriormente e são responsáveis pela clivagem dos substratos (Boatright e
Salvesen, 2003).
A Caspase 3 é uma caspase efetora da cascata apoptótica,
responsável pela clivagem proteolítica total ou parcial de proteínas
estruturais e funcionais em diferentes sistemas apoptóticos (Cohen, 1997). A
caspase 3 é requerida para a ativação de quatro outras caspases (2, 6, 8 e
10) nessa via (Slee et al., 1999). Estudos em camundongos sugerem que a
atividade da caspase 3 seja essencial para o desenvolvimento neural do
embrião (Kuida et al., 1996) e regressão normal do corpo lúteo em
camundongos (Carambula et al., 2002). Nessa espécie, a caspase 3 é
expressa nas células da teca de corpos lúteos saudáveis assim como nas
células da granulosa de folículos atrésicos, estando ausente em células da
granulosa de folículos saudáveis. Sua expressão é regulada por
gonadotrofinas e pode ser alterada durante o processo apoptótico nas
células da granulosa (Boone e Tsang, 1998).
2.3.4 p53
O gene supressor de tumor p53 é um gene de resposta ao estresse
que codifica uma proteína nuclear onco-supressora de 53 kDa (Hussein.,
2005). A proteína p53 acumula-se no citoplasma durante a fase G1
participando da regulação do ponto de checagem e da transição para a fase
17
S. Está envolvida na manutenção da integridade do genoma, permitindo a
ação de mecanismos de reparo do DNA ou remoção de células danificadas
por meio do processo de apoptose (Lemoine, 1990).
A p53 atua como fator transcricional anti-proliferativo estimulando a
taxa de transcrição de genes importantes para as funções celulares, como
ilustrado no Quadro 1 (Levine, 1997). Possui muitas propriedades funcionais,
podendo ativar 20 promotores diferentes, reprimir 26 diferentes promotores e
enhancers e interagir com mais de 35 proteínas celulares e virais (Hussein,
2005). Os componentes que interagem com o p53 na via de apoptose
incluem proteínas cinases que fosforilam a p53, gene mdm2 (murine of
double minute 2) e as proteínas GADD45 (growth arrest and DNA damage
inducible protein) e p21Cip1/Waf (wild-type p53-activated fragment 1)
(Haapajarvi et al., 1999).
Quadro 1 – Produtos de genes cuja transcrição é ativada pela p53.
Produtos de genes Função celular
p21, WAF1, Cip1
Inibem cinases dependentes de ciclina, ligam-se a ciclinas e ao
antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), promovendo a
parada do ciclo celular.
MDM2
Produto de oncogenes, inativa a transcrição mediada pela p53 e
forma uma alça de auto-regulação com atividade de p53.
GADD45
Induzida por danos no DNA liga-se à PCNA promovendo a parada
no ciclo celular, envolvida diretamente na excisão de nucleotídeos e
reparo.
Ciclina G Ciclina de função desconhecida, não dependente de quinase.
Bax
Membro da família Bcl2 que promove apoptose, não sendo induzida
pela p53 na célula.
IGFBP3
Proteína de ligação do IGF que bloqueia a sinalização de fatores de
crescimentos mitogênicos.
Fonte: Adaptado de Levine (1997).
A expressão da proteína p53 nas células da granulosa de folículos
atrésicos em camundongos foi verificada por Kim et al. (1999). Estudos têm
sugerido que o sistema da proteína de membrana Fas com seu ligante FasL
estão envolvidos no processo de apoptose dessas células atuando como
mediadores da atresia folicular em ratos, por meio da via antígeno Fas/p53.
Embora a proteína Fas e seu ligante sejam expressos em vários tecidos,
somente a proteína Fas e seu transcrito têm sido descritos nas células da
granulosa de roedores (Hakuno et al., 1996).
18
Tilly et al. (1995), com base em estudos de expressão da p53 durante
a atresia folicular, verificaram que a inibição da expressão da p53 está
associada à redução significativa do número de células apoptóticas da
granulosa e de folículos atrésicos. Além disso, a superexpressão da proteína
p53 é capaz de induzir a apoptose na presença de AMP cíclico, sugerindo
sua possível função na atresia.
2.4. PCR quantitativo em Tempo Real
O PCR quantitativo em tempo real (qPCR) é um método eficiente para
a quantificação dos níveis de transcritos de mRNA devido à sua acurácia,
sensibilidade e reprodutibilidade (Nygard et al., 2007). Requer quantidades
mínimas de RNA e dispensa manipulações após a reação (Radonic et al.,
2004). É um método rápido e promove medidas simultâneas de expressão
gênica em diferentes amostras para um número limitado de genes,
auxiliando no entendimento de redes regulatórias complexas e identificação
de genes relevantes nos processos biológicos e nos mecanismos de
doenças (Hendriks-Balk et al., 2007).
A cinética da reação de amplificação é monitorada em cada ciclo, e os
dados do sinal de fluorescência são coletados à medida que a reação
ocorre, combinando a amplificação e a detecção em um único passo (Schefe
et al., 2006). Vários sistemas de detecção têm sido desenvolvidos para uso
no qPCR, variando na especificidade do alvo de amplificação, no custo, no
tipo de dye e na precisão. O SYBR green é um fluoróforo intercalante capaz
de se ligar a qualquer fita dupla de DNA e emitir fluorescência, de forma que
a intensidade do sinal emitido seja proporcional à quantidade de produto
gerado na qPCR (Bustin e Nolan, 2004).
Existem dois diferentes métodos para a análise dos dados do PCR
em tempo real: a quantificação absoluta e a relativa. A quantificação
absoluta determina o número de cópias iniciais do transcrito de interesse,
em função de uma curva padrão (Wong e Medrano, 2005). A quantificação
relativa ou método comparativo se baseia na comparação da expressão do
gene alvo com a referência interna por meio dos valores de C
t
(threshold
cycle) de cada amostra (Pfaffl et al., 2002). O valor de C
t
é o número de
ciclos de PCR requerido para que cada curva de amplificação alcance o
19
limiar de detecção. Esses valores são representativos do número de cópias
do molde inicial, sendo usados para cálculo dos resultados experimentais
(Heid et al., 1996; Ginzinger, 2002).
O método de quantificação relativa tem a vantagem de não necessitar
da construção de curva padrão. Entretanto, as eficiências de amplificação do
alvo e da referência endógena devem ser aproximadamente iguais para uma
quantificação acurada. Para o cálculo da eficiência, utilizam-se, como molde,
diluições seriadas do cDNA. Os resultados são representados em um gráfico
(log
10
concentração x C
t
), e a inclinação da reta é utilizada para determinar a
eficiência de reação (Livak e Schimittigen, 2001).
Em ambos os métodos, recomenda-se a normalização do gene alvo
com um gene de referência ou endógeno para ajustar diferenças na
quantidade de material inicial e na variação da eficiência de amplificação
(Bustin et al., 2005). Os genes de referência selecionados devem apresentar
expressão constitutiva entre as amostras, por exemplo, β-actina, GAPDH
(gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase), RNA ribossomal, entre outros, e não
devem sofrer influência do tratamento experimental (Giulietti et al., 2001;
Ginzinger, 2002).
A qPCR tem contribuído para melhor entendimento da complexidade
fisiológica do transcriptoma suíno, permitindo a identificação de genes
candidatos para características de interesse, tais como as reprodutivas
(Rothschild, 2003). Estudos têm sido realizados visando a estabelecer o
perfil de expressão de genes que codificam fatores de crescimento e
citocinas, envolvidos no crescimento e na apoptose celular nos tecidos
reprodutivos de fêmeas suínas. Sakumoto et al. (2006) detectaram, por meio
do qPCR, transcritos da IL-6 e da IL-4 e de seus receptores no corpo lúteo
durante o ciclo estral de fêmeas suínas da raça Meishan, sugerindo que a IL-
6 e a IL-4 são localmente produzidas, atuando na inibição da produção de
esteróides pelas células luteínicas, por meio de seus receptores específicos.
Wen et al. (2006) verificaram que o mRNA da proteína Stat3 (signal
transducer and activator of transcription 3) é altamente expresso no ovário,
no oviduto e no útero, sugerindo que esta proteína atua na dinâmica
ovariana em suínos. Outros estudos têm investigado o perfil da expressão
dos genes envolvidos na atresia folicular, tais como IL-6 (Maeda et al., 2006)
20
e conexina 43 (Cheng et al., 2005). A expressão do mRNA para a IL-6 no
tecido ovariano decresce durante a atresia folicular em suínos, sugerindo
sua participação nas vias de transdução de sinal nas células ovarianas. O
mRNA do gene da conexina 43 foi detectado nas células da granulosa de
folículos secundários saudáveis e folículos terciários atrésicos, com ausência
de expressão em folículos primordiais e primários, sugerindo sua
participação na apoptose das células da granulosa durante a atresia folicular
nessa espécie.
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Indução do Estro em fêmeas pré-púberes
O experimento foi conduzido na Granja de Melhoramento Genético de
Suínos da Universidade Federal de Viçosa, MG. Foram utilizadas 16 fêmeas
das linhagens comerciais (Landrace x Large White x Pietrain), aos
203,81±13,57 dias de idade e peso médio de 98,90±12,09 kg no início do
experimento.
A indução do estro em leitoas pré-púberes foi realizada pela
administração de uma dose única (5 mL) de P.G 600 (Intervet América,
Millsboro, D.E) de acordo com Estill (1999). Cada dose de P.G 600 é
composta por 400 UI de eCG (gonadotrofina coriônica eqüina) e 200 UI de
hCG (gonadotrofina coriônica humana). A detecção do estro foi realizada
duas vezes ao dia, pela manhã e à tarde, na presença do varrão.
As fêmeas foram pesadas no primeiro e segundo cios e apresentaram
peso médio entre 120,10±12,52 kg e 129,50±10,51 kg, respectivamente. O
primeiro cio foi diagnosticado aos 3,12±0,83 dias, em média, após a
administração de P.G 600, em nove (56,25%) das 16 fêmeas. Quatro
(25,0%) das fêmeas não apresentaram sinais de proestro em até 10 dias
após a administração de P.G 600 e foram tratadas com Preloban (Intervet
América, Millsboro, D.E), apresentando cio após 5,75±1,89 dias em média. A
indução não foi necessária em três animais (18,75%), que apresentaram o
cio naturalmente, no intervalo de 22,00±1,00 dias e duração de 3,00±1,73
dias no primeiro e de 2,66±0,57 no segundo cio.
O ciclo estral durou em média 21,00±1,50 dias, e as durações médias
do estro no cio induzido e no cio subseqüente foram de 2,56±1,09 dias e
2,72±0,46 dias, respectivamente. No segundo ciclo estral, os animais foram
abatidos nos dias pré-determinados do ciclo, uma vez que o primeiro cio
pode estar sujeito a flutuações hormonais que normalmente ocorrem nesta
fase.
22
3.2 Coleta de material
As porcas foram abatidas após o segundo estro consecutivo em
quatro grupos nos dias 0 (zero), 6, 12 e 18 do ciclo estral, considerando 0
(zero) o primeiro dia do cio. Cada grupo foi composto por quatro fêmeas,
marcando dessa forma o estro (fase1, dia 0), metaestro (fase 2, dia 6),
diestro (fase 3, dia 12) e proestro (fase 4, dia 18), respectivamente.
O abate foi feito por atordoamento elétrico e sangria. Em seguida, os
ovários foram coletados e transportados em isopor com gelo para o
Laboratório de Biotecnologia Animal (LABTEC) no Departamento de
Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, onde foi realizada a aspiração
do líquido folicular dos folículos de 2-10mm de diâmetro com um aspirador
de células a vácuo. Após a aspiração, as células foliculares foram
peletizadas por centrifugação do líquido folicular a 5.000 x g, durante 6
minutos. As células foram ressuspendidas com 500µL de tampão fosfato
salino 1X (PBS 1X - Phosphate Buffered Saline) para lavagem e contagem
do seu número. Em seguida, o córtex ovariano foi cortado e armazenado
em RNA holder (BioAgency, São Paulo, SP, Brasil) e congelado a -20ºC
para posterior extração do RNA total deste tecido. A extração do RNA do
córtex ovariano e das células da granulosa foi feita separadamente.
3.3 Quantificação das células
A contagem do número de células foliculares foi realizada utilizando o
método hemocitométrico. A contagem, necessária para ajuste do volume de
tampão utilizado na extração do RNA total, foi feita de acordo com a
seguinte fórmula:
Para obter o número de células por mL de solução, multiplica-se o
valor encontrado por 1.000, pois 1 mL equivale a 1.000 mm
3
e multiplica-se
o resultado por 10, pois na câmara é obtido o número de células por 0,1
milímetro cúbico (mm
3
), e, assim, o valor foi multiplicado por 10.000.
23
3.4 Extração do RNA total
O RNA total das amostras de células foliculares e de tecido ovariano
foi extraído separadamente, utilizando-se o Kit RNeasy Mini Kit (Qiagen,
Valencia, CA, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. As
células em suspensão foram peletizadas e ressuspendidas em tampão RLT
contendo β-mercaptoetanol (1%) para lise celular. O tampão RW1 contendo
etanol foi adicionado ao lisado para promover condições favoráveis de
ligação do RNA à membrana de sílica-gel. Foi realizado tratamento adicional
com a enzima DNase I para remoção de resquícios de DNA que poderiam
interferir na análise de PCR em Tempo Real. Nesse passo, foram
adicionados à membrana o mix contendo 10 µL de DNase I e 70 µL de
tampão RDD, fornecidos pelo Kit RNase-Free DNase set (Qiagen, Valencia,
CA, EUA). A coluna foi lavada com o tampão RPE por duas vezes e o RNA
ligado à coluna foi eluído em 50 µL de água livre de RNase por
centrifugação a 5.000 x g, durante três minutos.
O RNA total das amostras de tecido ovariano foi extraído utilizando-
se em média 30mg do tecido previamente estocado em RNA holder
(BioAgency, São Paulo, SP, Brasil). Após pesado, o tecido foi
homogeneizado em tampão RLT, contendo β-mercaptoetanol (1%),
utilizando o homogeneizador de tecidos Homomixer (Homomix). O lisado foi
então centrifugado a 5.000 x g por 3 minutos para precipitação dos restos
celulares, e somente o sobrenadante foi transferido para a coluna seguindo
o mesmo procedimento descrito acima para a extração de RNA total das
células foliculares.
A concentração de RNA das amostras de células foliculares e de
tecido ovariano foi determinada em espectrofotômetro, e a qualidade e
integridade foram verificadas pela razão OD
260
/OD
280
e em gel de agarose
1,2% corado com brometo de etídeo. O RNA total foi armazenado a –70ºC
até o momento de uso.
Foram utilizados como molde para a síntese da primeira fita de cDNA
quantidades equivalentes de RNA provenientes das células foliculares e do
tecido ovariano para o mesmo animal, com o objetivo de avaliar a expressão
e o acúmulo de mensageiros das duas fontes, uma vez que a expressão
24
gênica pode variar de acordo com o tipo e compartimento celular.
3.5 Síntese da primeira fita de cDNA
A síntese da primeira fita do DNA complementar (cDNA) foi feita com
o Kit SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EUA). As reações foram feitas com o mix de RNA para cada animal e
continham 1 µg de RNA total, 1µL do primer oligo(dT)
20
50µM e 1µL de
Anneling Buffer. A reação foi incubada a 65ºC por 5 minutos e transferida
para um recipiente com gelo por 1 minuto. Em seguida, foram adicionados
10 µL de 2X First-Strand Reaction Mix e 2 µL de SuperScript III/RNaseOUT
Enzyme Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A reação foi incubada a 50ºC
por 50 minutos, a 85ºC por 5 minutos e resfriada no gelo. As concentrações
de cDNA das amostras foram estimadas por espectrofotometria, e o cDNA
fita simples foi estocado a –20ºC até o uso na reação de qPCR.
3.6 Desenho dos primers
Os primers utilizados para amplificação dos fragmentos dos genes
cujos produtos participam do desenvolvimento ovariano e do controle
endógeno foram desenhados por meio do programa PrimerQuest
(www.idtdna.com/Scitools/Applications/PrimerQuest) fornecido pela
Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA) a partir de seqüências de
nucleotídeos obtidas do banco de dados do GeneBank
(htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov).
A especificidade dos primers foi verificada em gel de agarose 2% e a
análise das curvas de dissociação possibilitou verificar a temperatura de
desnaturação do produto amplificado, permitindo diferenciar produtos
inespecíficos dos produtos esperados. Os conjuntos de primers utilizados
podem ser visualizados na Tabela 1.
25
Tabela 1 - Seqüências de nucleotídeos, tamanho do amplicon e temperatura de anelamento
(TA) dos primers utilizados para as reações de qPCR.
GAPDH: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, IGF-I: fator de crescimento semelhante à
insulina, IGFBPs: proteínas de ligação do IGF, EGF: fator de crescimento epidérmico.
3.7 Cálculo da eficiência de amplificação
A eficiência de amplificação de cada gene foi calculada por meio da
construção de uma curva de diluição em série de cDNA nas concentrações
de 1, 10, 100 e 200 ng por reação. Foram consideradas eficientes aquelas
reações em que a eficiência de amplificação do gene alvo e do gene
referência foram aproximadamente iguais, com tolerância de 10% de
variação em relação ao controle endógeno, tal como descrito por Livak e
Schmittgen (2001).
A partir dos dados obtidos, um gráfico de C
t
(threshold cycle) versus o
log
10
da quantidade de cDNA utilizada na reação foi produzido. Foi utilizadaa
regressão linear para determinação do coeficiente angular da reta para
determinar a eficiência de amplificação, de acordo com a equação
Gene
Seqüência de oligonucleotídeos
Amplicon (pb)
TA (ºC)
GAPDH
F: CAAAGTGGACATTGTCGCCATCA
R: AGCTTCCCATTCTCAGCCTTGACT
124 60
IGF-I
F: TGCCCAAGGCTCAGAAGGAAGTA
R: GGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA
146 59
IGFBP1
F: CCCATCCTTTGGAACGCCATCAAT
R: TGGCTAGTCTGTCCAGCACTTTGT
121 60
IGFBP2
F:AGCATGGCCTGTACAACCTCAAAC
R: CTGCTGCTCGTTGTAGAAGAGAT
156 59
IGFBP3
F: GTCCACACCAAGATGGACGTGAT
R: CATGTTCAGGAACTTGAGGTGGT
188 60
IGFBP4
F: GGGCGTGTTCATTCAGCACACATT
R: GGGAATGAGTGCTTTCTCTGGGT
95 60
IGFBP5
F: GCAAGCCAAGATCGAGAGAGACT
R: TCAGCTTCTTTCTGCGGTCCTTCT
159 60
EGF
F: TGTATTGGTGCGATGCCAAGCAG
R: AACACAGCTACCGCAAATGGGTG
114 60
Caspase 3
F:ATGCTGCAAATCTCAGGGAGACCT
R:CACCATGGCTTAGAAGCACGCAAA
159 60
p53
F: GAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTT
R: ATACTCGCCATCCAGTGGCTTCTT
182 60
26
desenvolvida por Pfaffl (2001):
Depois de verificada a eficiência para cada gene alvo e para o
controle endógeno, foram escolhidas a diluição de cDNA e a concentração
de primer que apresentavam maior eficiência para preparar as reações de
quantificação relativa.
3.8 Reação de RT-PCR em tempo real
As reações foram efetuadas em termociclador ABI Prism 7300
Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Foster City, C.A., EUA),
utilizando o kit de SYBR Green
®
PCR Master Mix (Applied Biosystems,
Foster City, C.A., EUA), de acordo com as recomendações do fabricante.
Este kit contém todos os componentes (exceto primer e molde), necessários
para as reações de PCR: tampão 2X, dNTPs, MgCl
2
, SYBR Green I Dye,
AmpliTaq Gold
®
DNA polimerase e ROX como referência passiva. As
reações continham 12,5 µL desse mix, 5 µL de cDNA, primer e água,
totalizando um volume final de 25 µL. As concentrações de primer e de
cDNA foram otimizadas anteriormente para cada gene.
As condições de amplificação para todos os sistemas foram: 95ºC
durante 5 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 15 segundos;
anelamento; e extensão a 60ºC durante 60 segundos. Ao final dos 40 ciclos
de amplificação, um passo adicional com elevação gradual da temperatura
de 60ºC a 94ºC foi utilizado para obtenção da curva de dissociação.
A amplificação dos genes alvo e da referência endógena foi realizada
em diferentes canaletas na mesma placa de reação. Todas as reações para
um mesmo gene alvo foram feitas em duplicatas em placas ópticas de 96
poços, seladas com filme adesivo.
Os dados obtidos na reação de qPCR foram gerados pelo
equipamento na forma de valores de C
t.
, que representam o ciclo de início
da detecção do produto amplificado. Os valores médios de C
t
foram
subtraídos entre si para o cálculo de C
t
(C
t
do alvo - C
t
da referência
27
endógena)
,
a fim de minimizar as possíveis variações quanto à quantidade
de mRNA inicial e à eficiência na transcrição reversa. A quantidade de alvo,
normalizada para a referência endógena, foi calculada pela fórmula 2
-∆Ct
(Pfaffl, 2001; Livak e Schmittgen, 2001).
3.9 Análise dos resultados de expressão gênica
Para a análise dos dados de expressão gênica, foi utilizado o
programa SAEG – Sistemas de Análises Estatísticas e Genéticas (v 8,0). Os
resultados foram analisados por meio de regressão linear, considerando os
dados de expressão de cada gene como variável dependente e os dias 0, 6,
12 e 18 do ciclo estral como variáveis independentes.
A normalidade dos dados de expressão de cada gene foi verificada
por meio do Teste de Lilliefors, e a homogeneidade das variâncias pelo teste
de Cochran e Bartlett. Para o caso de falta de normalidade ou variância
heterogênea, foi realizado o teste não paramétrico de Kruskal - Wallis.
28
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O RNA total isolado das amostras de células foliculares e de tecido
ovariano foi quantificado por espectrofotometria com razão OD
260
/OD
280
média de 2,1±0,028. A integridade das amostras de RNA total foi verificada
por eletroforese em gel de agarose 1,2%. A presença das bandas de RNA
ribossomal 28S e 18S indica boa qualidade do RNA, como pode ser
observado na Figura 2.
Figura 2 – Amostras de RNA total após eletroforese em gel de agarose 1,2% corado com
brometo de etídeo. Colunas 1 a 4 correspondem ao RNA extraído a partir de
amostras de células foliculares. Colunas 5 a 8 correspondem ao RNA extraído a
partir de amostras de tecido ovariano.
A curva de amplificação obtida a partir da diluição seriada de cDNA
permitiu a determinação da melhor condição de amplificação para cada
gene, na qual a eficiência de amplificação do gene alvo e a do controle
endógeno foram aproximadamente iguais. As concentrações de
oligonucleotídeos iniciadores e de cDNA utilizados nas reações de
amplificação podem ser vistas na Tabela 2. Como a eficiência de
amplificação para o gene IGFBP4 se mostrou abaixo do valor recomendado
pela literatura, ele foi descartado da análise de expressão.
29
Tabela 2 - Concentração de primer, cDNA, temperatura de dissociação (TD) e eficiência da
reação (E) para os genes analisados.
Gene
Primer
(nM)
c
DNA (ng
/reação
)
TD (°C)
E
IGF-I 400 100 78,9ºC 0,986
IGFBP1 400 200 81,8ºC 0,937
IGFBP2 400 100 85,2ºC 0,967
IGFBP3 400 100 85,2ºC 0,893
IGFBP4 200 100 76,2ºC 0,480
IGFBP5 200 100 85,5ºC 0,813
EGF
200 100 81,0ºC 0,940
Caspase 3
400 100 75,8ºC 0,810
p53 200 100 86,5ºC 0,820
GAPDH 200 100 80,5 ºC 0,910
IGF-I: fator de crescimento semelhante à insulina, IGFBPs: proteínas de ligação do
IGF, EGF: fator de crescimento epidérmico, GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase.
A curva de dissociação gerada ao final dos ciclos de amplificação
demonstrou que todos os oligonucleotídeos amplificaram um único
fragmento, com ausência de amplificação inespecífica e dímeros de primer.
Exemplos da curva de dissociação para os genes GAPDH e IGF-I são
ilustrados nas Figuras 3 e 4.
Figura 3 - Curva de dissociação para o gene GAPDH gerada a partir do equipamento ABI
Prism 7300 Sequence Detection System.
30
Figura 4 - Curva de dissociação para o gene IGF-I gerada a partir do euipamento ABI Prism
7300 Sequence Detection System.
O coeficiente de variação (CV) das duplicatas de C
t
de cada amostra
foi inferior a 5% para todos os genes analisados, indicando boa precisão e
reprodutibilidade dos ensaios (dados não mostrados). Entretanto, observou-
se maior variação no CV dos valores de C
t
entre os animais de cada fase do
ciclo estral, indicando variação individual existente entre os animais, como
pode ser visto na Tabela 3.
31
Tabela 3 – Número de animais (N), média de C
t
, desvio-padrão de C
t
(DP) e coeficiente de
variação (CV) para os genes analisados durante o ciclo estral.
Gene
Dias
do ciclo estral
N
Média de C
t
DP
CV(%)
IGF-I
0
4 25,676 1,502 5,851
6
4 27,210 1,367 5,024
12
4 25,427 0.961 3,780
18
4 25,867 0,886 3,424
IGFBP1
0
4 36,133 1,534 4,247
6 4 31,476 1,904 5,221
12 4 35,275 0,891 2,525
18 4 34,799 0,689 1,981
IGFBP2
0
4 28,074 0,978 3,484
6 4 28,368 0,827 2,915
12 4 27,234 1,133 4,161
18 4 26,135 1,000 3,825
IGFBP3
0 4 29,847 1,817 6,087
6 4 27,374 2,151 7,860
12 4 25,751 1,226 4,760
18 4 27,725 1,580 5,690
IGFBP5
0 4 26,259 0,716 2,727
6 4 27,612 0,741 2,684
12 4 27,029 0,334 1,238
18 4 26,325 0,572 2,174
EGF
0 4 34,011 1,273 3,742
6 4 34,765 1,142 3,284
12 4 33,634 2,226 6,618
18 4 33,839 0,894 2,642
caspase 3
0 4 26,257 2,164 8,242
6 4 27,287 1,992 7,301
12 4 26,132 1,259 4,817
18 4 26,279 1,241 4,724
p53
0 4 28,935 1,467 5,071
6 4 29,300 1,773 6,053
12 4 28,416 1,504 5,292
18 4 28,203 1,868 3,078
0 4 22,323 1,505 6,741
GAPDH
6 4 22,913 1,755 7,658
12 4 22,250 1,109 4,985
18 4 22,179 1,066 4,808
IGF-I: fator de crescimento semelhante à insulina, IGFBPs: proteínas de ligação do IGF,
EGF: fator de crescimento epidérmico, GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
32
Os resultados da expressão gênica obtidos foram interpretados por
meio da análise de regressão utilizando-se os valores individuais de
expressão gênica em função dos dias 0, 6, 12 e 18 do ciclo estral. Para isso,
foram verificadas a normalidade e a homogeneidade de variância dos dados
de expressão para cada gene. Não foi verificado efeito dos dias do ciclo
estral na expressão do gene IGF-I (P>0,07). Os valores médios de
expressão por fase para esse gene podem ser visualizados na Tabela 4 e
estão ilustrados na Figura 5.
Tabela 4 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene IGF-I
Gene
Dias d
o ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV
(%)
IGF-I
0 107,07 51,52 48,12
6
59,26
39,09 65,96
12
113,25
27,86 24,60
18
85,36
47,88 56,09
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
Figura 5 – Quantidade relativa de mRNA do IGF-I (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano em função dos dias do ciclo estral.
Nesse estudo foi detectada abundância de transcritos do IGF-I nas
células da granulosa e tecido ovariano de fêmeas suínas nos dias (0, 6, 12 e
18) referentes às fases estro, metaestro, diestro e proestro do ciclo estral,
respectivamente. Os resultados obtidos corroboram os achados por Liu et al.
(2000) que, por hibridização in situ, identificaram o transcrito do IGF-I nas
0
20
40
60
80
100
120
140
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
33
células da granulosa e nas células da teca externa durante a fase folicular
na espécie suína, não havendo efeito do tipo celular (P>0,1) e do estádio de
desenvolvimento folicular (2, 4, 6 ou 8mm) (P>0,1) na expressão desse
gene.
Outros estudos demonstraram que a quantidade de mRNA de IGF-I
na célula da granulosa na espécie suína aumenta aproximadamente 4,5
vezes (P<0,01) entre os dias 1 e 5 da fase folicular, estando positivamente
correlacionada ao diâmetro folicular e à concentração de estradiol-17β; r>0,7
(Samaras et al., 1993).
Os resultados observados para a expressão relativa de mRNA para o
IGF-I no presente trabalho podem estar relacionados com o caráter
constitutivo dessa proteína ou devido aos transcritos não serem
dependentes dos níveis de FSH (Zhou et al.,1997; Liu et al., 2000). Apesar
de sua reconhecida importância biológica na foliculogênese, o IGF-I
apresenta expressão constante durante o ciclo estral, com disponibilidade
biológica regulada pelas IGFBPS no tecido folicular (Mazerbourg et al.,
2003), não constituindo, a princípio, um bom indicador para o
desenvolvimento folicular.
Os valores médios de expressão por fase para o gene IGFBP2 podem
ser visualizados na Tabela 5 e estão ilustrados na Figura 6.
Tabela 5 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene IGFBP2
Gene
Dias do
ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV
(%)
IGFBP2
0 21,55 10,18
47,24
6 34,49 38,92
112,84
12 37,62 17,40
46,25
18 65,91 15,45 23,44
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
34
Figura 6 – Quantidade relativa de mRNA do IGFBP2 (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano nos dias do ciclo estral.
O comportamento da curva da expressão gênica (y) em função dos
dias do ciclo estral (x) foi descrito pelo modelo linear, equação ŷ= 19,46 +
2,271x; R
2
=0,348 (P<0,02), como pode ser visto na Figura 7.
Figura 7 – Quantidade relativa de mRNA do IGBP2 nas células foliculares e no
tecido ovariano de suínos em função dos dias do ciclo estral.
O perfil de expressão em função dos dias do ciclo estral obtido no
presente estudo foi linear (P<0,02), com aumento da expressão ao longo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
0
10
20
30
40
50
60
70
0 6 12 18
Dia s d o c ic lo e stra l
Un id ades arb itrárias
ŷ = 19,46 + 2,271x
R ² = 0,348
35
dos dias do ciclo estral. Outros estudos (Liu et al., 2000; Yuan et al., 1996)
detectaram transcritos do IGFBP2 no tecido ovariano em porcas por meio da
técnica de hidridização in situ.
Os dados de expressão da IGFBP2 no tecido ovariano em suínos
obtidos no presente trabalho diferem daqueles obtidos anteriormente nessa
espécie. Liu et al. (2000) verificaram, por meio de hibridização in situ,
decréscimo na abundância de transcritos entre os dias 1 e 5 da fase
folicular. Com a mesma abordagem técnica, Samaras et al. (1993)
observaram que o mRNA do IGFBP2 decrescia durante o desenvolvimento
folicular. Outros estudos também verificaram decréscimo da concentração
da proteína no fluido folicular à medida que os folículos se tornavam maiores
(Howard e Ford, 1992).
Os resultados obtidos no presente trabalho diferem do perfil de
expressão esperado. Considerando a expressão do IGF-I constante durante
o ciclo e sabendo-se que a IGFBP2 tem ação inibitória sobre o IGF-I, era
esperado que, com o desenvolvimento folicular, a quantidade de mRNA para
o IGFBP2 decrescesse, resultando no aumento da biodisponibilidade de
IGF-I e conseqüente maturação dos folículos pré-ovulatórios. Entretanto, a
aparente discordância com os dados da literatura pode ser devida à variação
do diâmetro dos folículos coletados (2 a 10mm), ao alto coeficiente de
variação observado entre os animais da mesma fase e ao emprego de
diferentes técnicas de análise. Além disso, a existência de formas variadas
de controle da expressão da IGFBP2 intrafolicular, ocasionada pela
combinação da atividade de transcrição/tradução gênica no tecido folicular e
mudanças na degradação proteolítica em folículos ovulatórios em
crescimento (Mazerbourg et al., 2003; Guthrie, 2005), pode estar
contribuindo para a divergência dos resultados obtidos.
Os valores médios de expressão por fase para o gene IGFBP3 podem
ser visualizados na Tabela 6 e na Figura 8.
36
Tabela 6 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene IGFBP3
Gene
Dias
do ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV(%)
IGFBP3
0 0,56 0,15 26,79
6 50,62 28,15 55,61
12 92,98 32,30 34,74
18 44,70 64,07 143,33
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
Figura 8 – Quantidade relativa de mRNA do IGFBP3 (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano em função dos dias do ciclo estral.
O comportamento da variável dependente (y) em função da variação
da variável independente (x) foi descrito pelo modelo quadrático, equação
estimada ŷ= -3,587 + 15,20x - 0,682x
2
; R
2
=0,92 (P<0,01). O comportamento
da curva pode ser visto na Figura 9.
0
20
40
60
80
100
120
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
37
Figura 9 – Quantidade relativa de mRNA do IGBP3 nas células foliculares e no
tecido ovariano de suínos em função dos dias do ciclo estral.
A expressão do IGFBP3 foi detectada nas células foliculares e no
tecido ovariano suíno, nos dias 0, 6, 12 e 18 do ciclo estral, apresentando-se
baixa no estro e aumentando ao longo do ciclo, apresentando expressão
máxima no dia 11. Os dados presentes indicam que o perfil de expressão do
IGFBP3 está de acordo com o verificado por Zhou et al. (1996), que, por
meio de hibridização in situ, verificaram expressão alta e constante no corpo
lúteo de porcas durante a fase lútea (dias 6 a 12), com ausência de
transcritos em folículos em crescimento e em folículos pré-ovulatórios.
No presente estudo, é possível observar que a expressão do IGFBP3
tende a aumentar durante a fase lútea, atingindo valor máximo na fase de
diestro (dia 11) e decrescendo com a regressão do corpo lúteo e com o
desenvolvimento folicular. Pode-se observar que, entre as fases de diestro e
proestro, a quantidade de mRNA desse gene foi reduzida à metade,
sugerindo que as células endoteliais luteínicas no corpo lúteo maduro sejam
as principais responsáveis por sua expressão (Wandji et al., 2000).
A diferença na expressão do IGFBP3 entre as fases estro e diestro
observada nesse estudo sugere que a regulação da expressão do IGFBP3
pode ter papel autócrino ou parácrino no processo de seleção folicular, uma
vez que esta diferença parece neutralizar a ação das gonadotrofinas e do
IGF-I, provavelmente por meio de sua capacidade de seqüestrar IGFs.
Dessa forma, o menor acúmulo de transcritos da IGFBP3 detectados no
ŷ = -3,58 + 15,20x - 0,682x
2
R² = 0,919
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
38
estro seria responsável por maior biodisponibilidade de IGF-I, resultando na
proliferação e na diferenciação celular característica dessa fase.
Não foi verificado efeito dos dias do ciclo estral na expressão do gene
IGFBP5, e os modelos de regressão linear, quadrático e cúbico, não se
ajustaram significativamente aos dados da expressão. Os valores médios da
expressão por fase para esse gene podem ser visualizados na Tabela 7 e
estão ilustrados na Figura 10.
Tabela 7 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene IGFBP5
Gene
Dias
do ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV
(%)
IGFBP5
0
187,25 181,12
96,73
6
82,53 59,65
72,28
12
97,73 121,41
124,23
18 132,47 104,86 79,16
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
Figura 10 – Quantidade relativa de mRNA do IGFBP5 (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano nos dias do ciclo estral.
A análise da expressão por meio do qPCR permitiu identificar
abundância de transcritos relativamente alta para o gene IGFBP5 nas
células foliculares e no tecido ovariano, não apresentando diferença
significativa nos estádios do ciclo estral.
Os dados sobre a expressão do IGFBP5 no ovário de porcas obtidos
nesse trabalho diferem daqueles descritos anteriormente nessa espécie.
0
50
100
150
200
250
300
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
39
Zhou et al. (1996), por meio da técnica de hibridização in situ, detectaram os
transcritos do IGFBP5 nas células endoteliais do corpo lúteo com ausência
de expressão nos folículos em crescimento e nos folículos pré-ovulatórios
durante as fases folicular e lútea do ciclo estral. Essa discordância pode ser
devida à diferença de precisão das técnicas anteriormente empregadas em
comparação com a quantificação por qPCR que tem permitido detectar a
expressão local de mRNA de transcritos de baixa abundância em vários
tecidos (Ferré, 1992).
A ausência de variação da expressão do IGFBP5 durante as fases do
ciclo estral verificada nesse trabalho sugere que esse fator pode não ser um
bom indicador da seleção ou da função folicular em suínos, o que
provavelmente pode ser atribuído a outros fatores ainda não investigados.
Os dados de expressão para o gene IGFBP1 não apresentaram
distribuição normal, então foi realizada análise de variância não-paramétrica
pelo teste de Kruskal-Wallis. Não foi observada diferença de expressão entre
as fases (P<0,01). Os valores médios de expressão por fase para esse gene
podem ser visualizados na Tabela 8 e estão ilustrados na Figura 11.
Tabela 8 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene IGFBP1
Gene
Dias
do ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV
(%)
IGFBP1
0 0,04 0,03 78,44
6 0,13 0,24 179,60
12 0,04 0,02 50,54
18 0,08 0,08 97,69
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
40
Figura 11 – Quantidade relativa de mRNA do IGFBP1 (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano nos dias do ciclo estral.
A expressão do mRNA do gene IGFBP1 foi detectada nas células
foliculares e no tecido ovariano em quantidade similar nas quatro fases do
ciclo. Os dados sobre a expressão da IGFBP1 em ovários de porcas obtidos
no presente trabalho diferem daqueles obtidos anteriormente no ovário de
suínos (Grimes et al., 1994; Zhou et al., 1996), de ratos (Nakatani et
al.,1991) e de bovinos (Llewellyn et al., 2007). Esses autores investigaram
por hibridização in situ a expressão do IGFBP1 no ovário dessas espécies,
mas não a detectaram.
Não foi verificado efeito dos dias do ciclo estral na expressão do EGF,
e os modelos de regressão testados não se ajustaram significativamente aos
dados de expressão mostrando comportamento contínuo. Os valores médios
de expressão por fase para esse gene podem ser visualizados na Tabela 9 e
estão ilustrados na Figura 12.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
41
Tabela 9 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene EGF
Gene
Dias
do ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV
(
%
)
EGF
0 0,55
0,25
45,40
6 0,73 0,96
131,41
12 0,62 0,38
60,63
18 0,47 0,21 44,06
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
Figura 12 – Quantidade relativa de mRNA do EGF (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano nas fases do ciclo estral.
A expressão do gene EGF foi detectada no tecido ovariano e nas
células da granulosa não diferindo ao longo do ciclo estral. Os valores de
expressão obtidos no presente estudo para o EGF, apesar de relativamente
baixos, discordam daqueles obtidos por Vaughan et al. (1991), que
verificaram ausência de transcritos no tecido ovariano de porcas por meio de
hibridização in situ e pelo ensaio de proteção de ribonuclease. Essa
discordância pode ser devida à diferença de sensibilidade da técnica
utilizada, já que outros estudos, por meio de RT-PCR semi-quantitativo,
detectaram o mRNA do EGF em oócitos e células do cumulus de suínos
durante a maturação folicular (Yoshida et al., 1998; Vaughan et al., 1992;
Singh et al., 1995).
O perfil de expressão gênica para o EGF verificado no presente
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
42
estudo sugere que o fator de crescimento epidérmico atua em todos os
estádios de desenvolvimento folicular. Entretanto, dada a função desse
peptídeo na modulação da proliferação e esteroidogênese das células da
granulosa e da teca, era esperado que a expressão do EGF aumentasse
entre os dias 12 e 18 do ciclo estral, pois essa fase é marcada por grande
atividade mitogênica. Embora a expressão de transcritos de EGF seja
constante, não implica que este não participe de maneira diferencial durante
o desenvolvimento folicular. Dessa forma, estudos sobre a expressão da
proteína nas fases do ciclo no tecido ovariano devem ser realizados, uma
vez que a abundância de transcrito nem sempre é bem correlacionada com
a abundância da proteína (Binneck, 2004).
Não foi verificado efeito dos dias do ciclo estral na expressão da
caspase 3, e os modelos de regressão testados não se ajustaram
significativamente aos dados de expressão, mostrando comportamento
contínuo. Os valores médios de expressão por fase para esse gene podem
ser visualizados na Tabela 10 e estão ilustrados na Figura 13.
Tabela 10 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene caspase 3
Gene
Dias
do ciclo estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV (%)
Caspase 3
0 84,34
64,61
76,61
6 51,03 18,58
36,41
12 68,79 13,37
19,44
18 59,92 15,86 26,47
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
43
Figura 13 – Quantidade relativa de mRNA da caspase 3 (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano nos dias do ciclo estral.
A expressão da caspase 3 foi detectada no tecido ovariano e nas
células da granulosa, não diferindo durante o ciclo estral. Estudos têm
verificado, por técnicas imunocitoquímicas, maior expressão da proteína
caspase 3 nas células da granulosa em suínos, durante a atresia folicular
(Berardinelli et al., 2004). Como a apoptose está envolvida no recrutamento
folicular e no remodelamento do tecido ovariano durante a regressão do
corpo lúteo, esperava-se que a expressão da caspase 3, mediadora central
da apoptose celular, tivesse aumentado nas fases luteínica e folicular, o que
não foi verificado nesse estudo. Os resultados presentes sugerem que o
acúmulo de transcrito não é um bom indicador da atresia folicular em suínos,
indicando que a regulação primária da caspase 3, provavelmente, ocorre a
nível pós-traducional.
Não foi verificado efeito dos dias do ciclo estral na expressão do p53,
e os modelos de regressão testados não se ajustaram significativamente aos
dados de expressão, mostrando comportamento contínuo. Os valores
médios de expressão por fase para esse gene podem ser visualizados na
Tabela 11 e estão ilustrados na Figura 14.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
44
Tabela 11 – Média da expressão relativa (2
-Ct
x1000), desvio-padrão da média (DP) e
coeficiente de variação (CV) nas fases do ciclo estral para o gene p53
Gene
Dias
do cicl
o estral
Média
(2
-
∆Ct
x1000)
DP
CV (%)
p53
0 18,30
7,56
41,30
6
23,99
19,81
82,60
12 19,52 5,31
27,24
18 23,61 11,29 47,85
2
-Ct
x1000 – Unidades arbitrárias
Figura 14 – Quantidade relativa de mRNA do p53 (Média±EPM) nas células
foliculares e no tecido ovariano nos dias do ciclo estral.
Os dados de expressão obtidos no presente estudo demonstram que
o gene p53 é expresso em quantidades similares no ovário suíno durante o
ciclo estral. Os resultados obtidos diferem daqueles verificados em estudos
em camundongos. Choi et al. (2004) verificaram que a expressão do mRNA
da p53 tende a aumentar durante o desenvolvimento folicular em
camundongos tratados hormonalmente. Embora estudos conduzidos por
Tilly et al. (1995) tenham demonstrado que a indução da apoptose da célula
da granulosa envolvam mecanismos mediados pela p53, a regulação de sua
expressão ainda não foi completamente elucidada em mamíferos,
constituindo uma via de sinalização muito complexa. O padrão de expressão
do p53 verificado nesse estudo sugere que a regulação da atividade da p53
pode ocorrer em nível pós-traducional, sob influência do microambiente
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 6 12 18
Unidades arbitrárias
Dias do ciclo estral
45
celular, extensão dos danos do DNA e interações com outras proteínas da
via de sinalização celular (Vermeulen et al., 2003).
A utilização da transcrição reversa associada à reação de cadeia de
polimerase em tempo real tem possibilitado a detecção de transcritos de
baixa abundância em diversos tecidos (Pfaffl et al., 2002), como
demonstrado no presente trabalho, no qual detectou-se pela primeira vez a
expressão do IGFBP1 nas células foliculares e tecido ovariano em suínos.
Os resultados obtidos nesse experimento demonstram a importância dessa
técnica no entendimento da fisiologia ovariana e na dinâmica do
desenvolvimento folicular. Outros estudos, para determinar o padrão da
expressão temporal e espacial deste e dos outros genes analisados, devem
ser feitos para melhor entendimento de suas funções na dinâmica ovariana.
46
5. CONCLUSÕES
A expressão dos genes IGF-I, IGFBP (1, 2, 3 e 5), EGF, caspase 3 e
p53 foi verificada em células foliculares e tecido ovariano de fêmeas suínas
durante o ciclo estral.
Foi possível descrever o perfil da expressão linear para o gene
IGFBP2, aumentando ao longo do ciclo estral, e quadrático para o IGFBP3,
tendo os demais genes estudados apresentado comportamento contínuo em
função dos dias do ciclo estral.
Não é possível afirmar se os genes estudados estão expressando a
proteína correspondente, tornando-se necessária a realização de estudos
proteômicos para investigar a possível correlação entre os níveis de mRNA e
de proteína.
Estudos devem ser ampliados para outros genes relacionados e
genes de outras vias metabólicas para melhor entendimento dos estádios
fisiológicos envolvidos na foliculogênese em suínos.
47
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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