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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Rogério Fraga Troian
CARACTERIZAÇÃO DA ISOCITRATO LIASE E METILISOCITRATO LIASE
DO FUNGO PATOGÊNICO HUMANO Paracoccidioides brasiliensis
Orientadora:
Dra. Maristela Pereira
Goiânia – GO, 2009
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Troian, Rogério Fraga.
R845c Caracterização da isocitrato liase e metilisocitrato
liase do fungo patogênico humano Paracoccidioides
brasiliensis [manuscrito] Rogério Fraga Troian. – 2009.
102 f.: il., figs.
Orientadora: Dr
a
Maristela Pereira.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de
Goiás, Insti-
tuto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2009.
Bibliografia: f.63-82.
Anexos.
1. Ascomicetos - Paracoccidioides brasiliensis 2.
Isocitrato liase 3. Adesão I. Pereira, Maristela. II.
Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública III. Título.
CDU:
582.282
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Rogério Fraga Troian
CARACTERIZAÇÃO DA ISOCITRATO LIASE E METILISOCITRATO LIASE
DO FUNGO PATOGÊNICO HUMANO Paracoccidioides brasiliensis
Orientadora:
Dra. Maristela Pereira
Dissertação submetida ao PPGMT/UFG como requisito parcial para a obtenção do
Grau de Mestre, na área de concentração de Microbiologia
Este trabalho foi realizado com o auxilio financeiro do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e International Foundation for
Science (IFS), processo número 23070.017710/08-14 e CNPq: 481600/2007-8.
Goiânia – GO, 2009
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e
Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de
Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e
Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº
9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura,
impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir
desta data.
11. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese
12. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a): Rogério Fraga Troian
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gatício do autor
Agência de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Sigla: CNPq
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título:
CARACTERIZAÇÃO DA ISOCITRATO LIASE E METILISOCITRATO LIASE DO FUNGO PATOGÊNICO HUMANO
Paracoccidioides brasiliensis
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, Isocitrato liase Adesão
Título em outra língua:
Palavras-chave em outra língua:
Área de concentração: Microbiologia
Data defesa: (dd/mm/aa) 26/02/2009
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical
Orientador(a): Prof. Maristela Pereira
Co-orientador(a):
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________________________________________ Data: 11/03/2009 Assinatura do(a) autor(a)
1
Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa
junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.
AGRAD ECI M E N T OS
Agradeço primeiramente a Deus, pois em minha vida sempre pude contar com
uma força maior que guiou o meu caminho, conduzindo à mim, oportunidades que
aproveitei.
Faço um agradecimento especial ao CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico), pelo apoio financeiro concedido, através
da bolsa de mestrado, sem a qual não seria possível a conclusão deste trabalho
científico.
Faço um agradecimento especial a minha orientadora Prof° Dr. Maristela Pereira
que me recebeu em seu laboratório e me deu a oportunidade de iniciar minha vida
acadêmica em um laboratório bem equipado e preocupado com o bem público, onde se
procura sempre justificar, em forma de publicações de qualidade, todo o suporte
financeiro recebido.
Agradeço aos professores, Célia Maria de Almeida Soares, Cirano José Ulhoa e
Kênya Silva Cunha pela contribuição no exame de qualificação.
Agradeço em especial minha família, que sempre colocou os estudos em
primeiro lugar. Especialmente minha mãe, que sempre me deu apoio emocional e
principalmente financeiro antes de eu conseguir a bolsa de mestrado.
Agradeço a Ana Flávia, minha namorada, essa sim esteve presente na maioria do
dias (dias inteiros) durante quase toda minha graduação e o meu mestrado.
Aos professores Luis Arthur, Ivan, Chico, Kênia, Cirano e Kátia pelas inúmeras
“discussões de protocolo e coletas de materiais ” depois de um longo dia de trabalho.
À professora Kátia Flávia, minha co-orientadora por sempre me receber muito
bem em seu laboratório e me ajudar nos momentos difíceis.
À Aline que com certeza foi uma das pessoas que mais me ajudou durante esse
mestrado e também seus pais pela paciência que tiveram comigo durante os dias e as
madrugadas em que passávamos estudando.
Aos meus companheiros de laboratório: Patrícia Kott (brother), Sabrina,
Nathalie (Nat), Rodrigo, Juju, Elisa Flávia, Mirele, Patrícia Lima, Mariana, Neto
(grande parceiro), Tereza Cristina, Kelly, e Patrícia Zambuzzi, Sarah, Daciene, Ronney,
Leandro, Clayton, Alexandre (agora professor), Daiane, Hellen, Ademar, Ivian, Renata,
Regilda, Aline, Kesser, Amanda, Raquel, Hérika, João Guilherme, Martha, Lidiane e a
todos os alunos com quem convivi durante todo esse tempo.
Aos meus amigos Wesley e Luis Augusto por sempre me ajudarem nas
discussões de artigos e resultados e também por sempre estarem dispostos a estender
essas discussões na chácara nos fins de semana (Dias que não esqueço).
Ao Cláudio, Yves e ao Professor Paulo Roberto por sempre me mostrarem a
importância de uma pós-graduação.
Finalmente, gostaria de agradecer a todas as pessoas que sempre acreditaram em
mim e que sempre me incentivaram com palavras amigas e animadoras com os quais
sempre posso contar.
O meu muito obrigado a todos!!!
Sumário
Abreviaturas-------------------------------------------------------------------------------01
Resumo-------------------------------------------------------------------------------------03
Abstract-------------------------------------------------------------------------------------04
I-Introdução--------------------------------------------------------------------------------05
1.1 - Paracoccidiodomicose--------------------------------------------------------------05
1.2 - O Fungo Paracoccidioides brasiliensis------------------------------------------07
1.3 - Matriz Extracelular-----------------------------------------------------------------11
1.4 - Moléculas Envolvidas na Adesão de Fungos Patogênicos--------------------13
1.5 - Adesinas de P. brasiliensis--------------------------------------------------------15
1.6 - Transcriptomas de P. brasiliensis------------------------------------------------17
1.7 - Ciclo do Glioxalato e a enzimas Isocitrato Liase e Malato Sintase----------21
II - Justificativa----------------------------------------------------------------------------28
III - Objetivos------------------------------------------------------------------------------30
IV - Manuscrito ---------------------------------------------------------------------------32
V - Conclusões ----------------------------------------------------------------------------61
VI - Perspectivas--------------------------------------------------------------------------62
VII - Referências Bibliográficas--------------------------------------------------------63
VIII - Anexos------------------------------------------------------------------------------83
Lista de abreviaturas
BCIP 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato
BSA soroalbumina bovino
cDNA DNA complementar
CG Ciclo do glioxalato
GAPDH Gliceraldeído-3- fosfato deidrogenase
ICL Isocitrato liase
IDH Isocitrato deidrogenase
IgG
IPTG
Imunoglobulina G
Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
MEC Matriz extracelular
MLS Malato sintase
MgCl2 Cloreto de magnésio
NBT azul de nitrotetrazólio
Pb Paracoccidioides brasiliensis
PbICL isocitrato liase de P. brasiliensis
PbICLr isocitrato liase de P. brasiliensis recombinante
PBS Tampão salina fosfato
PBS-T Tampão salina fosfato com 0,05% de tween-20
PBS-T-BSA Tampão salina-fosfato acrescido de Tween20 e soroalbumina bovina
PCM Paracoccidioidomicose
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
TCA Ciclo do ácido tricarboxílico
1
RESUMO
Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da
paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica prevalente da América Latina. A
patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da
fase de micélio para levedura presente no hospedeiro. Para suprir a deficiência de
nutrientes durante o processo de infecção, alguns patógenos empregam o ciclo do
glioxalato (CG) na utilização de ácidos graxos como fontes de carbono. Os genes que
constituem esta via têm sido relacionados à patogênese. Um aspecto importante na
interação entre P. brasiliensis e seu hospedeiro é a habilidade do fungo em aderir aos
componentes da matriz extracelular. Nesse trabalho foi demonstrado que a isocitrato
liase de P. brasiliensis (PbICL) está localizada na parede celular e também no
citoplasma. PbICL recombinante (PbICLr) e o seu respectivo anticorpo policlonal
foram capazes de inibir a interação de P. brasiliensis às culturas de células epiteliais in
vitro. Foi avaliada também a capacidade da PbICLr de se ligar a componentes da matriz
extracelular, como laminina, fibronectina, colágeno tipo I e IV. Esses resultados
sugerem que PbICL é necessária para interação entre P. brasiliensis e moléculas da
matriz extracelular, sendo essa interação fundamental na aderência e invasão do fungo
às células do hospedeiro. Os parâmetros cinéticos da PbICLr foram determinados. A
sequência que codifica para a metilisocitrato liase de P. brasiliensis (PbmeICL), bem
como a proteína recombinante PbmeICLr foram obtidas.
2
ABSTRACT
Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of
paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America.
Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the
hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to
the temperature of the mammalian host. To cope with nutrient deprivation during the
infection process, a number of pathogens employ the glyoxylate cycle (GC) to utilize
fatty acids as carbon sources. The genes which constitute this pathway have been
implicated in pathogenesis. An important aspect in the interaction between
P.brasiliensis and your host is the ability to adhere to matrix extracelular components.
In this work has shown that the isocitrate lyase of P. brasiliensis (PbICL) is located in
the cell wall and also in the cytoplasm. PbICL recombinant and polyclonal antibody
were able to inhibit the interaction of P. brasiliensis to epithelial cell cultures in vitro.
Was also evaluated the ability of PbICL recombinant to connect the components of the
extracellular matrix such as laminin, fibronectin, collagen type I and IV. These results
suggest that PbICL is necessary to interaction between molecules of the extracellular
matrix and P.brasiliensis, and that this interaction is crucial in adhesion and invasion of
the fungus to the host cells. The kinetic parameters of PbICLr were determined. The
sequence coding for methylisocitrate lyase of P. brasiliensis (PbmeICL) and the
recombinant protein PbmeICLr were obtained.
3
1- INTRODUÇÃO
1.1 – Paracoccidiodomicose
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose humana sistêmica
granulomatosa, causada pelo fungo P. brasiliensis, sendo inicialmente denominada
hifoblastomicose pseudococcidióica (Lutz 1908). A paracoccidioidomicose e seu agente
etilógico foram relatados pelo pesquisador brasileiro Adolpho Lutz (Lutz 1908). A
paracoccidioidomicose apresenta distribuição heterogênea, havendo áreas de baixa e
alta endemicidade (Shikanai-Yasuda et al. 2006). No Brasil, a doença causa
aproximadamente 200 mortes por ano, sendo o país considerado o maior centro
endêmico dessa micose (Coutinho et al. 1998).
A paracoccidioidomicose é adquirida através da via respiratória quando
propágulos da fase miceliana do fungo são inalados (McEwen et al. 1987). A partir dos
pulmões, o fungo pode se disseminar por todo o corpo através da corrente sanguínea ou
linfática (Franco 1987). Raramente a pele e mucosas, através de implantação traumática,
são sítios de inoculação do microrganismo (Castro et al. 1975). Após a penetração no
hospedeiro, o fungo se converte da forma miceliana para a forma patogênica de
levedura, sendo esse processo considerado um passo fundamental para o
estabelecimento bem sucedido da infecção (Franco 1987), e fase inicial da interação
fungo-hospedeiro (Camargo et al. 2000).
A paracoccidioidomicose é uma doença granulomatosa, caracterizada
histologicamente pela formação de tubérculos epiteliais com áreas centrais de necrose,
agregados de leucócitos polimorfonucleares, um halo linfomononuclear e fibrose (Brito
4
et al. 1994). O progresso da patologia e a diversidade das formas clínicas dependem dos
fatores imunológicos do hospedeiro (Franco 1987) e dos diferentes níveis de virulência
dos diversos tipos de isolados do fungo (San-Blas & Nino-Vega, 2001)
A paracoccidioidomicose pode ser classificada em crônica (tipo adulto) e
aguda ou subaguda (tipo juvenil). A forma aguda ou subaguda pode ser moderada ou
severa, envolvendo o sistema reticuloendotelial, havendo hipergamaglobulinemia,
depressão da resposta imune celular, resposta granulomatosa inflamatória difusa e
disseminação concomitante do fungo. A forma crônica corresponde a mais de 90% dos
casos e pode ser uni ou multifocal dependendo da evolução e da localização das lesões;
apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas com lesões predominantes no
pulmão, mucosa orofaríngea. Essa forma induz a uma resposta imunológica do
hospedeiro (Franco et al. 1987; Arango et al. 1982). A forma crônica grave multifocal
da PCM também pode causar lesões granulomatosas no sistema nervoso central
(Almeida et al. 2004). Relatos de PCM em pacientes imunocomprometidos já foram
observados (Corti et al. 2003).
A paracoccidioidomicose não é uma doença de notificação compulsória,
portanto, sua real prevalência não pode ser calculada. No entanto, estima-se que a taxa
anual de incidência entre a população brasileira seja de 1-3 por 100.000 habitantes e a
de mortalidade, de 0,14 por 100.000 habitantes (Coutinho et al. 2002). Foram estudados
3.181 óbitos por PCM no Brasil, por um período de 15 anos, demonstrando a grande
magnitude e baixa visibilidade da doença, destacando-a como oitava causa de
mortalidade por doença predominantemente crônica ou repetitiva, entre as infecciosas e
parasitárias, superior à leishmaniose, e a mais elevada taxa de mortalidade entre as
micoses sistêmicas (Coutinho et al. 2002). Estima-se que nas regiões endêmicas
5
existam, aproximadamente, 10 milhões de pessoas infectadas por P. brasiliensis. No
entanto, a maioria não apresenta sintomas clínicos (Restrepo et al. 2001).
A paracoccidioidomicose atinge preferencialmente trabalhadores rurais do
sexo masculino, entre 30 a 60 anos de idade (Villar et al. 2000). O trabalho com solo e
plantações em área rural é fator ocupacional predisponente para a aquisição da PCM
(Franco 1987). A incidência da doença até a puberdade é a mesma em ambos os sexos,
porém na fase adulta, mais de 80% dos pacientes são do sexo masculino (Martinez
1997). Acredita-se que esse fato seja explicado pela ação protetora que os hormônios
estrógenos conferem à mulher (Sano et al. 1999), e pela ausência ou menor contato com
as fontes de infecção (Marques et al. 1983).
1.2- O Fungo Paracoccidioides brasiliensis
P. brasiliensis pertence ao Reino: Fungi, Filo ou Divisão: Ascomycota,
Subdivisão: Euascomycotina, Classe: Plectomyceto, Subclasse: Euascomycetidae,
Ordem: Onygenales, Família: Onygenaceae, Subfamília: Onygenaceae anamórficos,
Gênero: Paracoccidioides, Espécie: brasiliensis (Margulis & Scharwatz, 1998)
Baseado em análises filogenéticas em 65 isolados de P. brasiliensis,
verificou-se a existência de pelo menos três diferentes espécies filogenéticas de P.
brasiliensis: S1 (espécie 1), PS2 (espécie filogenética 2) e PS3 (espécie filogenética 3).
A S1 está distribuída no Brasil, Argentina, Paraguai, Peru e Venezuela. Alguns isolados
da PS2 foram encontrados no Brasil nos estados de São Paulo e Minas Gerais e ainda na
Venezuela enquanto a PS3 está geograficamente restrita à Colômbia (Matute et al.
2006). Análises das sequências de genes de 21 isolados de P. brasiliensis através do
método de comparação filogenética sugerem a existência de mais do que três espécies
6
dentre os isolados estudados, visto que o isolado Pb01 apresentou significativas
diferenças nas comparações com outros isolados (Carrero et al. 2008).
O habitat natural de P. brasiliensis ainda não está bem definido (Lacaz et al.
1999). No entanto, alguns autores sugerem que o fungo viva saprobioticamente na
natureza (Montenegro et al. 1996; Restrepo et al. 2001), em áreas subtropicais da
América Central e do Sul (Restrepo et al. 2001). As condições favoráveis destas áreas
incluem: temperaturas que oscilam de 10 a 24°C, com alta umidade, invernos secos e
verões chuvosos (Restrepo 1985), vegetação rica e economia baseada principalmente na
agricultura e pecuária (Blotta et al. 1999). O fungo já foi isolado de amostras de solo, de
fezes de morcegos, Artibens lituratus (Grose & Tamsitt, 1965), de pinguins, Pygoscelis
adeliae (Camargo & Taborda, 1993), de macaco, Saimir sciureus (Johnson & Lang,
1977) e de tatus, Dasypus novemcinctus (Naiff et al. 1986) e Cabassous centrales
(Corredor et al. 2005). Bagagli et al. (1998) sugerem que esses animais não são
hospedeiros intermediários no processo de infecção no homem, embora possam
desenvolver a doença, comportando-se como hospedeiros silvestres.
Em temperaturas entre 35 e 36°C, e nos tecidos do hospedeiro, esse fungo
apresenta forma leveduriforme; quando cultivado in vitro em temperaturas entre 22 e 27
°C apresenta-se na forma miceliana. As leveduras de P. brasiliensis são caracterizadas
por apresentarem brotamentos múltiplos, formados pela evaginação da célula-mãe, onde
uma célula central é circundada por várias células periféricas, conferindo um aspecto de
roda de leme. A forma miceliana pode ser identificada por filamentos septados com
conídeos terminais ou intercalares (Queiroz-Telles, 1994; Restrepo-Moreno, 2003).
Lutz (1908) observou as diferentes formas de P. brasiliensis no hospedeiro e
em culturas à temperatura ambiente, descrevendo assim, o dimorfismo do fungo. O
7
processo de transição in vitro de levedura para micélio e vice-versa, induzido pela
alteração de temperatura de incubação, foi descrito por Negroni (1931).
A caracterização in vitro do processo de diferenciação do isolado Pb 01
(ATCC-MYA-826), padrão em nosso laboratório, mostrou que a diferenciação de
micélio para levedura ocorreu em 20 dias e a de levedura para micélio em 15 dias, após
a alteração da temperatura de cultivo. Em ambos, ocorre um período de latência que se
dá entre 48 e 72 horas, atingindo 70-80% de diferenciação no décimo dia,
caracterizando o processo de dimorfismo in vitro de P. brasiliensis como sendo lento e
gradual (Silva et al. 1994).
O processo de dimorfismo também é descrito para outros fungos patogênicos
humanos como, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides
immitis e Sporothrix schenckii; Acredita-se que essa capacidade de alteração
morfológica seria um importante mecanismo de virulência e patogenicidade desses
fungos (Kurokawa et al. 1998). O dimorfismo, também é considerado um mecanismo
de defesa importante para a adaptação de fungos às condições adversas do hospedeiro
humano, à invasão de tecidos e ao estabelecimento da doença (San-Blas et al. 2002).
A forma miceliana de P. brasiliensis, apresenta crescimento lento (Lacaz
1994). Macroscopicamente, o fungo produz colônias pequenas, duras, planas,
irregulares, de coloração bege, cobertas por micélio aéreo e curto que frequentemente
aderem-se ao ágar (Brummer et al. 1993). Quando examinadas ao microscópio óptico,
observam-se hifas finas e septadas, com clamidoconídios terminais ou intercalares
(Franco et al. 1989). Ao microscópio eletrônico, as hifas apresentam um envoltório
celular constituído de três camadas: uma interna, a membrana plasmática; uma camada
mais espessa, a parede celular; e uma externa de aspecto finamente granular (Minguetti
et al. 1985). As hifas são multinucleadas, com cromatinas finas dispersas no
8
nucleoplasma. No citoplasma podem ser vistos ribossomos, mitocôndrias esféricas ou
alongadas, retículo endoplasmático e vacúolos (Samsonoff et al. 1991).
As colônias leveduriformes apresentam-se macroscopicamente com
coloração creme, de aspecto cerebriforme, não aderidas ao meio e com crescimento
evidente após sete dias de incubação a 37°C (Carbonell & Rodrigues, 1965). As células
leveduriformes apresentam morfologia oval ou alongada, em diferentes tamanhos (4 a
30 μm), contendo múltiplos núcleos (2 a 5 por células), nucléolo e cromatina evidentes
(Lacaz, 1994). A parede celular da levedura é espessa (Lacaz et al. 1991), a membrana
plasmática apresenta múltiplas invaginações que constituem vesículas e estruturas
tubulares; também apresenta escasso retículo endoplasmático, vários vacúolos, gotas de
lipídios proeminentes, ribossomos e mitocôndrias (Brummer et al. 1993). Células com
blastoconídios simples ou múltiplos gerados por germinação conferem ao fungo a
característica primordial em sua identificação (Lacaz et al. 1991).
Vários fungos patogênicos, como P. brasiliensis (Mendes-Giannini et al.
2008), Candida albicans (Sheppard et al. 2004), Histoplasma capsulatum (McMahon et
al. 1995), Sporothrix schenckii (Figueiredo et al. 2004) e Coccidioides immitis (Hung et
al. 2002) apresentam moléculas capazes de interagir com componentes da matriz
extracelular. A aderência de microrganismos é considerada indispensável para o início
da colonização e futura disseminação. O processo de adesão se dá quando o patógeno
reconhece proteínas ou carboidratos ligantes na superfície da célula do hospedeiro ou
proteínas que façam parte da membrana basal (Patti et al. 1994). O grande número de
tecidos que os fungos podem colonizar e infectar sugere que esses agentes possuam uma
variedade de moléculas de superfície de adesão (Sullivan et al. 2004).
9
1.3- Matriz Extracelular
A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa de macromoléculas que
proporciona um arcabouço físico para a estabilização da estrutura tecidual e modula o
comportamento celular. Essa matriz é composta por uma grande variedade de proteínas
e de polissacarídeos que são secretados localmente e formam uma rede organizada, em
estreita associação com a superfície celular que os produz. A matriz extracelular do
tecido conectivo é rica em polímeros fibrosos, especialmente colágeno, suportando a
maioria dos estresses mecânicos sofridos pelo tecido.
No tecido epitelial, as células estão ligadas fortemente formando diferentes
camadas, uma delas é a matriz extracelular a qual consiste basicamente de uma
cobertura fina chamada lâmina basal, responsável por dar suporte ao tecido. A matriz
extracelular possui um importante papel nas interações entre as células, fornecendo
condições às mesmas para aderirem e proliferarem, modulando diretamente a forma e
funções celulares. As principais classes de macromoléculas presentes na matriz
extracelular são as cadeias de polissacarídeos da classe das glicosaminoglicanas,
encontradas normalmente ligadas às proteínas formando proteoglicanas, e as proteínas
fibrosas, as quais desempenham funções estruturais como o colágeno e as proteínas
adesivas, incluindo nessa classe, fibronectina e laminina (Verstrepen & Klis, 2006).
Fibronectina é uma glicoproteína de 440 kDa, presente na forma solúvel no
plasma sanguíneo, bem como em outros fluídos corporais, ativando a coagulação, e na
forma fibrilar, como componente essencial da matriz extracelular de diversos tecidos
(Mohri 1996). Essa glicoproteína atua como adesina contribuindo para a organização da
matriz extracelular no processo que envolve a ligação de receptores específicos da
10
superfície celular com domínios presentes na molécula de fibronectina (Butler et al.
2008).
Laminina é uma glicoproteína encontrada na matriz extracelular, possui
massa molecular em torno de 900 kDa, apresenta diferentes isoformas, é um dos
principais constituintes da membrana basal, e está presente em quase todos órgãos,
principalmente nos pulmões (Lebleu et al. 2007). A laminina associa-se à receptores da
superfície celular interligando a membrana basal à camada de células adjacentes
(Schéele et al. 2007). Células que são capazes de migrar da corrente sanguínea para os
tecidos, como os macrófagos, leucócitos e células tumorais metastáticas, também
podem exibir esses receptores (Wright et al. 2008).
A interação da laminina com outras macromoléculas da matriz é importante
para definição da forma, movimento celular, sendo também crucial em vários processos
biológicos que requerem adesão celular, tais como, diapedese, coesão celular dentro do
tecido, metástase de células cancerosas e infecções (Beck et al. 1990; Colognato &
Yurchenco, 2000).
Colágeno é a proteína mais abundante em mamíferos sendo o principal
constituinte da matriz extracelular e representando um importante alvo para a adesão de
muitas espécies de microrganismos (Vakonakisa & Campbell, 2007). Existem
atualmente mais de vinte tipos de colágeno caracterizados, sendo os mais importantes
nos processos de adesão de patógenos o colágeno tipo IV, que é encontrado
principalmente na lâmina basal, um dos componentes da membrana basal dos epitélios e
o colágeno tipo I que é o mais abundante na constituição da matriz intersticial de vários
tecidos, sempre formando fibras e feixes resistentes (Gil et al. 1996). Como
constituintes das matrizes extracelulares, os colágenos já foram descritos como alvos
para adesão de células tumorais (Kazarian et al. 2003) e de proteínas de microrganismos
11
como Leptospira (Atzingen et al. 2008), Bartonella henselae (Dabo et al. 2006), P.
brasiliensis (Barbosa et al. 2006), aumentando sua capacidade de invasão.
1.4- Moléculas Envolvidas na Adesão de Fungos Patogênicos
Os fungos dimórficos utilizam uma variedade de moléculas de superfície
para se ligar à matriz extracelular da célula hospedeira e estabelecer a infecção
(Lengeler et al. 2000). As moléculas de adesão celular são glicoproteínas expressas na
superfície celular, onde mantém o contato entre duas células ou entre células e a matriz
extracelular. Um grande número de moléculas que se comportam como adesinas em
fungos patogênicos têm sido estudadas, uma vez que o processo de adesão de
microrganismos às proteínas da matriz extracelular é bastante importante para o
estabelecimento do processo infectivo nos tecidos do hospedeiro (Patti et al. 1994).
C. albicans possui uma família gênica denominada ALS (Agglutinin-Like
Sequence), composta por oito genes, os quais codificam para proteínas capazes de
influenciar na aderência do fungo (Sheppard et al. 2004; Filler 2006). A deleção dos
genes ALS1 e ALS3 ocasionaram na redução da capacidade de aderência dos mutantes
às células endoteliais da veia umbilical humana e células de epitélio bucal, em relação
ao tipo selvagem (Zhao et al. 2004). No genoma de C. glabrata foram encontrados vinte
e três membros da adesina epitelial (EPA), que são responsáveis pela aderência do
fungo às células do hospedeiro (Kaur et al. 2005). A função de adesina foi confirmada
para três membros da família EPA (EPA1, EPA6, EPA7); essas proteínas continham
ligantes que se aderiram ao resíduo terminal galactose contribuindo para a aderência de
células epiteliais e endoteliais in vitro (Zupancic et al. 2008).
12
Penicillium marneffei é o agente etiológico de uma micose conhecida como
peniciliose, a qual apresenta manifestações clínicas como febre, anemia, perda de peso,
linfadenopatia e hepatoesplenomegalia. A habilidade de P. marneffei em iniciar a
infecção está relacionada com a capacidade de adesão de seus esporos às moléculas da
MEC e ao tecido epitelial pulmonar. Ensaios de adesão, demonstraram a participação de
uma proteína de 20 kDa, caracterizada como um ligante de laminina e fibronectina,
potencialmente relevante no processo de adesão de P. marneffei ao tecido hospedeiro
(Srinouprasert et al. 2006).
A capacidade do Histoplasma capsulatum interagir com a laminina é um
importante mecanismo para estabelecer a histoplasmose. Estudos onde o fungo foi
colocado em contato com laminina imobilizada demonstraram que H. capsulatum
interage com a proteína de maneira rápida e específica. A presença do anticorpo anti-
laminina inibiu significantemente a adesão do fungo. Essa adesão é mediada
possivelmente por uma glicoproteína de 50 kDa identificada na parede celular de H.
capsulatum. O anticorpo anti-proteína de 50 kDa e o peptídeo IKVAV presente na
molécula de laminina foram capazes de inibir a adesão do fungo à laminina (McMahon
et al. 1995).
O fungo S. schenckii, o qual comumente acomete indivíduos
imunocomprometidos é o causador da esporotricose, uma micose subcutânea, que pode
se disseminar por vários tecidos e órgãos. Estudos de interação entre S. schenckii e
proteínas da MEC mostraram que o fungo foi capaz de se aderir à laminina, colágeno e
fibronectina, e que essa interação foi mediada por moléculas de 90 e 135 kDa
localizadas na superfície do fungo. A interação entre S. schenckii e proteínas da matriz
extracelular foi avaliada através de experimentos de competição entre peptídeos
presentes nas moléculas de fibronectina e laminina. Os peptídeos RGD, presente na
13
fibronectina, e YIGSR, presente na laminina, interagem com as adesinas localizadas na
superfície de S. schenckii, uma vez que esses inibiram significativamente a ligação do
fungo às proteínas da matriz extracelular (Lima et al. 2004).
1.5 - Adesinas de P. brasiliensis
A colonização eficiente dos tecidos por fungos patogênicos é um evento
complexo, que envolve geralmente adesinas codificadas pelo patógeno. P. brasiliensis
tem a capacidade de atravessar rapidamente as células endoteliais e provavelmente
alcançar tecidos mais profundos do hospedeiro (Silva et al. 2005). Os componentes da
MEC envolvidos na interação de P. brasiliensis com o hospedeiro têm sido
recentemente caracterizados (Mendes-Giannini et al. 2006).
Uma glicoproteína de 43 kDa (gp43) tem sido descrita como uma importante
adesina determinante da patogenicidade de P. brasiliensis (Carvalho et al. 2005;
Cisalpino et al.1996), e com a capacidade de interagir com fibronectina (Mendes-
Giannini et al. 2006) e com laminina (Vicentini et al. 1994). Foi demonstrado que a
interação da gp43 com a laminina foi inibida in vivo e in vitro por anticorpos anti-gp43
(Vicentini et al. 1994; Gesztesi et al. 1996). A laminina é uma das principais moléculas
que promovem a adesão de P. brasiliensis, facilitando a sua patogenicidade (Mendes-
Giannini et al. 2008).
Andreotti et al (2005) descreveram moléculas de P. brasiliensis
provavelmente envolvidas no processo de adesão do fungo. Esses autores isolaram uma
adesina de P. brasiliensis de 30 kDa com a capacidade de se ligar à laminina. O
tratamento de células epiteliais em cultura com as adesinas de laminina de P.
brasiliensis de 30 kDa, inibem a adesão desse fungo às células epiteliais. Em outro
14
estudo, outras duas proteínas de superfície celular de P. brasiliensis com massas
moleculares de 19 e 32 kDa apresentaram interação com diferentes proteínas da matriz
extracelular, tais como laminina, fibrinogênio e fibronectina (González et al. 2005).
Estudos experimentais de PCM utilizando camundongos BALB/c, com o
tratamento prévio de conídeos (forma infectante) do fungo com laminina, fibronectina e
fibrinogênio promoveram um menor dano tissular nos pulmões, baço e fígados
analisados por exame histopatológico no período pós-infecção, comparado aos órgãos
de animais não tratados. Assim, os componentes da matriz extracelular bloqueariam
moléculas na superfície dos conídeos de P. brasiliensis que estariam atuando como
fatores de adesão, diminuindo o potencial do patógeno de aderir e disseminar no foco
inicial de infecção (González et al. 2008).
No ciclo biológico de P. brasiliensis, as leveduras são expostas ao
hospedeiro, portanto suas proteínas de superfície são fortes candidatas a antígenos e
moléculas de adesão. Barbosa et al. (2006) verificaram que a expressão da
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) recombinante de P.brasiliensis em
leveduras é importante para a adesão do fungo às células do hospedeiro. A GAPDH se
localiza no citoplasma, na camada mais externa da parede celular e interage com
proteínas da matriz extracelular, tais como laminina, fibronectina, desencadeando uma
resposta na célula hospedeira no estágio inicial da infecção.
Dfg5p, uma proteína relacionada com a formação e manutenção da parede
celular de fungos, estando presente na fase leveduriforme de P.brasiliensis. Dfg5p
apresenta motivo RGD em sua sequência predita. Essa proteína liga-se à laminina,
fibronectina e ao colágeno tipo I e IV evidenciando um importante papel da Dfg5p na
interação do P.brasiliensis com as células do hospedeiro (Castro et al. 2008).
15
Outra possível adesina de P.brasiliensis é a triose fosfato isomerase (TPI),
uma enzima da via glicolítica, que está localizada no citoplasma, e também na parede
celular da fase leveduriforme do fungo. Assim, a TPI pode estar envolvida na interação
do P. brasiliensis com componentes da matriz extracelular como laminina e
fibronectina. Essa interação pode ser crucial na aderência e invasão do fungo a tecidos
do hospedeiro (Pereira et al. 2007).
1.6- Transcriptomas de P. brasiliensis
Vários projetos transcriptomas de P. brasiliensis têm sido desenvolvidos no
sentido de identificar um maior número de genes expressos. Goldman et al. (2003)
identificaram 4.692 genes expressos em leveduras de Pb18 após infecção em
camundongos. Esses genes foram categorizados funcionalmente em genes envolvidos
com resposta a estresse (1%), metabolismo celular (8%), metabolismo de proteínas
(4%), síntese de RNA (2%), estrutura celular (5%), divisão celular (1%) e proteínas
hipotéticas (60%).
Costa et al. (2007) realizaram análises comparativas entre as sequências de
P.brasiliensis de células leveduriformes recuperadas a partir de fígado de camundongos
infectados e um banco de dados construído com sequências do transcriptoma de
leveduras e micélios (isolado Pb01) (https://dna.biomol.unb.br/Pb/), bem como com
todos os genes expressos disponíveis no GenBank,
incluindo sequências de transcriptoma da fase leveduriforme de P. brasiliensis (isolado
Pb18) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Foram analisados 4934 genes expressos gerados
a partir de uma biblioteca de cDNA, mostrando que esses genes estão envolvidos em
adaptações metabólicas durante a infecção por P. brasiliensis.
16
Um total de 25.511 clones derivados de bibliotecas de cDNAs das fases
micéliana e leveduriforme foram sequenciados, resultando em 6.022 grupos que
representam cerca de 80% do genoma total do isolado Pb01 (Felipe et al. 2005). Com
esses dados foi possível realizar a identificação e categorização dos genes ortólogos
descritos para outros fungos patogênicos, tais como aqueles relacionados à virulência,
resistência a drogas, alvos para antifúngicos, vias de sinalização celular, entre outros
(Felipe et al. 2003; 2005). Após categorização pelo COG (categorias de ortólogos
funcionais), concluiu-se que 29% desses genes estão envolvidos no metabolismo
celular, 12% na transcrição, 10% na síntese de proteínas, 9% na produção de energia e
4% no controle da organização celular. Cerca de 4% do número total de genes anotados
estão envolvidos em mecanismos de transdução de sinal e comunicação celular, vias
que têm sido relacionadas com a diferenciação celular de fungos dimórficos e
patogênicos (Felipe et al. 2005).
Um projeto genoma comparativo foi realizado visando examinar a
diversidade entre três isolados de Paracoccidioides e determinar os genes únicos e
comuns entre eles. Nesse projeto, os genomas dos isolados Pb01, Pb03 e Pb18 foram
sequenciados,(http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasilien
sis/MultiHome.html) sendo que Pb01 apresentou um tamanho de 32.94 Mb com um
total de 9.132 genes. O isolado Pb03 apresentou o genoma com o tamanho de 29.06
Mb, com 7.875 genes e Pb18 possui um genoma de 29.95 Mb, contendo 8.741 genes.
O perfil transcricional de P. brasiliensis durante a diferenciação morfológica
de micélio para levedura foi avaliado por Bastos et al. (2007). Vários genes
potencialmente relacionados com a síntese de membrana e parede celular mostraram-se
aumentados durante a diferenciação celular de micélio para levedura, sugerindo que P.
brasiliensis favorece o remodelamento da membrana e da parede celular nos estágios
17
iniciais da morfogênese. Durante a transição também foi verificada a presença de
transcritos que codificam enzimas que participam do ciclo do glioxalato (CG) como a
isocitrato liase (ICL) e malato sintase (MLS), malato desidrogenase, citrato sintase e
aconitase, sugerindo que a transição morfológica em P. brasiliensis é mediada pela
ativação de vias metabólicas alternativas que influenciam na adaptação ao ambiente, o
que provavelmente garantiria a sobrevivência do fungo dentro do hospedeiro.
Marques et al. (2004) identificaram genes que são preferencialmente
expressos na fase leveduriforme de P. brasiliensis quando comparado com a fase
miceliana. Os genes CDII (cisteína dioxigenase), α-1,3-glucana sintase, CIT1 (citrato
sintetase) e ERG25 (esterol dessaturase) apresentaram elevados níveis de transcritos na
fase leveduriforme de P. brasiliensis. Os genes TAS1 e GST1, que codificam para a
tiredoxina peroxidase e uma glutamina-S-transferase, respectivamente, possuem uma
expressão preferencial na fase leveduriforme de P. brasiliensis. Os produtos desses
genes poderiam atuar como antioxidantes reduzindo os níveis de espécies reativos com
oxigênio durante o crescimento da levedura, visto que sistemas antioxidantes em P.
brasiliensis podem ser extremamente importantes, não somente para a sobrevivência em
macrófagos, mas também para detoxicação das espécies reativas com oxigênio.
Análises do RNA de P. brasiliensis isolado de camundongos infectados
mostraram que proteínas envolvidas nos processos de síntese protéica, fatores de
elongação, processos pós-traducionais são super expressas nessa condição e o perfil
transcricional das células leveduriformes são influenciadas pelo plasma humano (Bailão
et al. 2006; 2007). Transcritos que codificam tirosinase e aminoácido L-aromático
descarboxilase (DDC) foram induzidos, sugerindo a ocorrência da síntese ativa de
melanina durante o processo infectivo. A tirosinase é a enzima responsável pela
primeira etapa da síntese de melanina (Arredondo et al. 2005), a qual está associada
18
com a patogenicidade de algumas infecções microbianas, como a criptococose, causada
pelo fungo Cryptococcus neoformans (Walton et al. 2005).
Derengowski et al. (2008) observaram a indução de genes em P. brasiliensis
recuperados a partir de macrófagos murinos. Esses genes codificam para as enzimas
isocitrato liase e malato sintase do ciclo do glioxalato, e fosfoenolpiruvato
carboxiquinase a enzima chave e regulatória da gliconeogênese mostrando que o
patógeno é capaz de utilizar compostos de dois carbonos para a síntese de novo de
glicose. A co-regulação de genes do CG e da via da gliconeogênese observada por
Derengowski et al. (2008) é consistente com a importância dessas vias no fornecimento
de energia a partir de compostos de dois carbonos e metabolismo de ácidos graxos
(Lorenz et al. 2002; Barelle et al. 2006). Em P. brasiliensis, o gene da isocitrato liase é
induzido durante a infecção em modelos murinos, indicando que o ciclo do glioxalato
pode ser induzido em células leveduriformes durante o processo de infecção (Costa et
al. 2007).
Em geral, o padrão dos genes que são induzidos na fase miceliana sugere que
essa forma possua um metabolismo aeróbico, ao contrário da forma leveduriforme, que
apresenta metabolismo anaeróbico. Os genes isocitrato dehidrogenase e succinil-CoA
sintetase, os quais são os principais pontos regulatórios do ciclo do ácido tricarboxílico
(TCA) são induzidos em micélio (Felipe et al. 2005). Na fase leveduriforme, o
metabolismo é desviado para a produção de etanol, refletindo seu comportamento
anaeróbico (Restrepo et al. 1981). Várias vias que fornecem substratos para o ciclo do
glioxalato são induzidas em células leveduriformes de P. brasiliensis. A enzima
isocitrato liase redireciona o fluxo metabólico utilizando etanol e acetato como fonte
com dois carbonos para gerar oxaloacetato, que pode levar à produção de glicose
(Felipe et al. 2005).
19
1.7-Ciclo do Glioxalato e a enzimas Isocitrato Liase e Malato Sintase
Para muitos organismos, a fonte de carbono preferencial é a glicose. Essa
pode ser convertida em um açúcar contendo cinco carbonos, tais como ribose e
desoxirribose, através da via pentose fosfato ou ser catabolisada para acetil-CoA através
da glicólise. O acetil-CoA entra para o ciclo do ácido tricarboxílico (figura 01), onde é
convertido através de oito passos enzimáticos, em intermediários que alimentam
numerosas vias, incluindo as vias de biossíntese de aminoácidos, ácidos graxos e
glicose (Komberg 1966). O ciclo do ácido tricarboxílico resulta na geração de
moléculas produtoras de energia, e também atua como reservatório de precursores
metabólicos essenciais para a síntese de aminoácidos, ácidos graxos e açúcares (Hamel
& Appanna, 2001).
Entretanto, não é sempre que a glicose está disponível como fonte de carbono
para os organismos, sendo necessária a atuação de outras vias metabólicas para suprir as
necessidades energéticas de acordo com a fonte de carbono disponível no ambiente. O
ciclo do glioxalato é uma via alternativa ao ciclo de Krebs que permite a oxidação de
acetato (acetil-CoA) para a formação de ácidos dicarboxílicos (succinato, malato e
oxaloacetato) (Flavel & Woodward, 1970). Nesse processo participam enzimas comuns
ao ciclo do ácido tricarboxílico e também as específicas do ciclo do glioxalato, a
isocitrato liase e a malato sintase. A enzima isocitrato liase catalisa a reação de
clivagem do isocitrato a succinato e glioxalato, que é importante na gliconeogênese, a
partir da acetil-CoA derivado da β-oxidação dos triglicerídeos armazenados (Carpenter
1959; Vanni 1990). Em seguida, a enzima malato sintase condensa o glioxalato com
acetil-CoA formando malato (Kornberg 1966).
20
Carboxiquinase
Desidrogenase
Desidrogenase
Desidrogenase
Desidrogenase
Figura 01 – Esquema representativo do ciclo do ácido tricarboxílico, ciclo do glioxalato
e gliconeogênese. Estão evidenciados os passos enzimáticos básicos no ciclo do ácido
tricarboxílico (linhas finas), o qual é comum para todos os organismos; passos no ciclo
do glioxalato (linhas tracejadas), que é comum para microrganismos e plantas, e os
passos compartilhados pelos dois ciclos (linhas grossas) e a reação inicial de
gliconeogênese (linhas sombreadas). Fonte: LORENZ & FINK (2002). Life and Death
in a Macrophage: Role of the Glyoxylate Cycle in Virulence. Eukaryotic Cell. 657-662.
21
Segundo Lorenz & Fink (2002), o ciclo do glioxalato possui duas etapas
críticas. A primeira é justamente o processo em que o isocitrato (seis carbonos) é
hidrolizado em succinato (quatro carbonos) e glioxalato (dois carbonos) pela isocitrato
liase. A segunda etapa é quando acetil-CoA (dois carbonos) é condensado com
glioxalato para produzir malato (quatro carbonos) pela malato sintase. A partir deste
momento, as próximas etapas são enzimaticamente idênticas às do ciclo do ácido
tricarboxílico. Malato é convertido em oxalacetato, esse em citrato, pela adição de outra
molécula de acetil-CoA, e então o isocitrato é novamente formado (Kornberg 1966)
(Figura 1).
O ciclo do glioxalato é bastante importante na gliconeogênese (Kornberg &
Beevers, 1957), visto que o primeiro passo dessa via (Figura 01) é a conversão de
oxaloacetato a fosfoenolpiruvato através da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase
(PEP carboxinase). Essa enzima e a frutose-1,6-bifosfatase (FBP) são as mais
importantes na gliconeogênese por atuarem como regulatórias na síntese de glicose. Em
S. cerevisiae, Fbp1 é um gene altamente induzido em leveduras sob fagocitose,
validando a idéia de que a finalidade primária da indução do ciclo do glioxalato é a
produção de glicose (Lorenz & Fink, 2001).
Em plantas, o ciclo do glioxalato é processado para a conversão do acetil-
CoA produzido pela β-oxidação de ácidos graxos, em oxaloacetato, e subsequentemente
em carboidrato (Smith 2002). Durante o processo de germinação das sementes o ciclo
do glioxalato é essencial para que fontes de carbono armazenadas, tais como lipídios,
sejam convertidos em metabólitos solúveis que podem ser transportados dentro da
semente e utilizados nos processos de crescimento e respiração (Eastmond & Graham,
2001).
22
Em fungos, o ciclo do glioxalato é normalmente processado nos
peroxissomos. A enzima malato sintase está localizada nos peroxissomos em todos os
organismos eucariotos estudados até momento. Entretanto a localização peroxissomal
da isocitrato liase não é conservada evolutivamente (Kunze et al. 2006). As isocitrato
liases de Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Colletotrichum lagenarium e
Magnaporthe grisea estão localizadas em peroxissomos (Ebel et al. 2006; Gainey et al.
1992; Valenciano et al. 1996; Asakura et al. 2006), entretanto, a isocitrato liase de
Saccharomyces cerevisiae é encontrada no citosol (Chaves et al. 1997).
O ciclo do glioxalato e as enzimas isocitrato liase e malato sintase são
importantes para a virulência de patógenos como C. albicans (Lorenz & Fink, 2002),
Cryptococcus neoformans (Rude et al. 2002) e o fungo fitopatogêncio Leptosphaeria
maculans (Idnurm & Howlett, 2002). Em C. albicans e S. cerevisiae após fagocitose, as
principais enzimas do ciclo do glioxalato, são induzidas. Dessa forma, esses
microrganismos são capazes de sobreviver no interior de macrófagos utilizando lipídeos
para produção de glicose, molécula rara nesse ambiente (Lorenz & Fink, 2001; 2002).
Segundo Cozzone (1998), o macrófago é pobre em compostos carbônicos complexos, e
ricos em ácidos graxos e seus produtos de degradação, primeiramente acetil-CoA, sendo
esses assimilados somente através do ciclo do glioxalato, confirmando ser a única rota
de síntese de glicose nesse ambiente.
Estudos recentes utilizando isolados de C. albicans coletados de três grupos
de pacientes apresentando candidíase em regiões diferentes do corpo, mostraram a
atividade das enzimas isocitrato liase e malato sintase em todos os casos analisados,
confirmando a presença do ciclo do glioxalato como fator de virulência para o fungo.
Entre os três grupos de pacientes analisados, os níveis de atividade dessas enzimas do
fungo se mostraram alterados dependendo do local da infecção. Estudos utilizando
23
isolado de C. albicans proveniente de pacientes diabéticos desenvolvendo candidíase
vulvovaginal apresentaram níveis de atividade de isocitrato liase e malato sintase mais
elevados quando comparado a isolado obtido da cavidade orofaríngea dos pacientes
HIV/AIDS e da pele de pacientes queimados (Lattif et al. 2006).
A isocitrato desidrogenase (IDH) e a isocitrato liase são enzimas que utilizam
o mesmo substrato, o isocitrato. Em E. coli crescida em acetato, o fluxo de carbono se
divide entre o ciclo do glioxalato e o ciclo do ácido tricarboxílico. Essa divisão é
regulada pela inativação da IDH através de fosforilação reversível. Esse processo
proporciona ao ciclo do glioxalato a utilização do isocitrato em diferentes condições,
como variações de fontes de carbono (Cozzone 1998).
Muitos estudos sugerem que isocitrato liase e ciclo do glioxalato estão
envolvidos na virulência de bactérias, como Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas
aeruginosa (McKinney et al. 2000; Lindsay et al. 2008) e fungos como C. albicans,
Magnaporthe grisea e Leptosphaera maculans (Lorenz & Fink, 2001; Muñoz-Elías &
McKidnney, 2005; Idnurm & Howlett, 2002). A importância do ciclo do glioxalato para
a sobrevivência de C. albicans e Mycobacterium no interior de macrófagos sugere que a
utilização de inibidores desse ciclo pode impedir a sobrevivência desses
microrganismos nesse ambiente, através da impossibilidade de utilização dos nutrientes
disponíveis (Lorenz & Fink, 2001).
As isocitrato liases apresentam comportamento diferenciados durante o
processo de infecção. Em C. albicans e M. tuberculosis, a isocitrato liase é induzida
após o microrganismo ser fagocitado por macrófagos. Durante testes in vivo com
Cryptococus neoformans e S. cerevisae a ausência de isocitrato liase não afetou a
adaptação e virulência desses microrganismos, sugerindo assim que a isocitrato liase e o
24
ciclo do glioxalato são importantes para a virulência desses microrganismos, mas nem
sempre são essenciais nesse processo (Lorenz & Fink, 2002).
As isocitrato liases da maioria dos microrganismos são induzidas na presença
de etanol e têm sua expressão inibida na presença de glicose. Em A. fumigatus, a
presença ICL e conídios, sugerem que lipídios podem servir como fonte de carbono
durante a germinação. A presença de ICL em organelas foi observada no fungo apenas
durante o crescimento em condições que requerem o ciclo do glioxalato, como por
exemplo a presença de acetato (Ebel et al. 2006).
A fosforilação da isocitrato liase também tem sido associada a mecanismos
regulatórios. Em E. coli, a fosforilação da enzima resultou na ativação da mesma, e após
ser desfosforilada a enzima tornou-se inativa (Robertson et al. 1988). De forma
contrária, em S. cerevisiae a isocitrato liase fosforilada na presença de glicose
apresentou um decréscimo na atividade enzimática tendendo à inativação (Lopez-Boado
et al. 1988).
A enzima isocitrato liase de P. brasiliensis (PbICL) apresenta uma ORF de
1614 bp, foi realizada também a expressão heteróloga da PbICL, determinando uma
massa molecular de 60 kDa, sendo que, a PbICL predita apresenta homologia com ICLs
de outros fungos. Análises da atividade de PbICL confirmam a indução da enzima na
presença de acetato de potássio, ácido glicólico, etanol e reprimida na presença de
glicose, principalmente após 24h de crescimento do fungo nestas condições. A presença
de proteínas com diferentes valores de pIs nas análises de Western blot sugerem
regulação pós-traducional da proteína PbICL em nível de fosforilação (Cruz et al,
submetido).
As isocitrato liases têm sido descritas em bactérias, arqueobactérias, fungos,
plantas (Nakazawa et al. 2005; Wang et al. 2003; Maharjan et al. 2004; Ebel et al.
25
2006; Ying et al. 2005) e também em animais invertebrados e vertebrados (Morgunov
et al. 2005; Popov et al. 1998; Van Eyk et al. 1993). Essas enzimas apresentam um
hexapeptídeo conservado, K(KR) CGH (LMQR), descrito como motivo característico
das isocitrato liases (Wang et al. 2003). As isocitrato liases geralmente são compostas
por quatro subunidades idênticas tanto em procariotos como em eucariotos. As
isocitrato liases possuem massas moleculares consideravelmente diferentes nesses
organismos; bactérias possuem isocitrato liases com subunidades de aproximadamente
47 kDa e eucariotos possuem subunidades com massas moleculares variando entre 60 e
64 kDa (Nakazawa et al. 2005).
Munoz-Elias & McKinney (2005), através de análises de bioinformática,
mostram a presença de três grupos de proteínas isocitrato liases que se diferem em
relação ao tamanho e organização do domínio. O grupo I, representado pelas
eubactérias, compreende as isocitrato liases pequenas; o grupo II, composto por fungos
e plantas, as isocitrato liases médias; o grupo III, identificado somente em
Mycobacterium, é formado por isocitrato liases grandes. O grupo II apresenta uma
região central ausente no grupo I, e o grupo III possui uma sequência C-terminal
ausente nos grupos I e II.
26
II. JUSTIFICATIVA
Paracoccidioidomicose é uma micose humana sistêmica que afeta
principalmente a população rural da Américas Latina, sendo no Brasil registrados 80%
dos casos da doença. A PCM possui importância em saúde coletiva, pois está
relacionada a custos sociais e econômicos, derivados não apenas de seu caráter
endêmico e da atividade da doença, mas também por afetar indivíduos em fase
produtiva e por frequentemente deixar sequelas.
A habilidade do fungo P. brasiliensis em provocar uma micose sistêmica
com grande variedade de manifestações clínicas, depende de complexos fatores de
interação entre o fungo e o hospedeiro humano. Um importante grupo de proteínas de
superfície são as proteínas com características de adesinas, que são capazes de interagir
com proteínas da MEC do hospedeiro, tais como laminina, fibronectina, colágeno e
fibrinogênio (Andreotti et al. 2005).
As adesinas são essenciais para a interação com o hospedeiro humano por
permitir a aderência e invasão do fungo aos tecidos do hospedeiro e a evasão da
resposta imune. Mecanismos de adesão e infecção de P. brasiliensis ainda permanecem
pouco esclarecidos. É aceito atualmente que a capacidade de P. brasiliensis de aderir
aos tecidos do hospedeiro seja um fator importante para o estabelecimento da doença.
Em alguns fungos e bactérias tem sido demonstrada a importância do ciclo do
glioxalato e de suas enzimas após o processo de fagocitose. Em P. brasiliensis,
transcritos de isocitrato liase foram detectados em micélio e levedura, sendo super
expressos em leveduras (Felipe et al. 2005; Nunes et al. 2005). Embora níveis
constantes de transcritos de isocitrato liase tenham sido encontrados durante a transição
de micélio para levedura, uma alteração desses níveis foi observada durante a
27
diferenciação da fase leveduriforme para a miceliana (Goldman et al. 2003), sugerindo
que a isocitrato liase atua durante esse processo. A funcionalidade do ciclo do glioxalato
em células leveduriformes de P. brasiliensis é evidente, pois, isocitrato liase e malato
sintase são induzidas nessa forma (Felipe et al. 2005; Nunes et al. 2005) .
A ausência do ciclo do glioxalato em mamíferos elege as enzimas
envolvidas nesse último como potentes alvos para agentes antimicrobianos. Genes
codificantes para as enzimas do ciclo do glioxalato, têm se mostrado importantes para a
virulência de microrganismos patogênicos, propiciando a sobrevivência dos mesmos
dentro de macrófagos (Muñoz-Elias et al. 2006).
Diante do exposto, o interesse de descrever novas moléculas potencialmente
relacionadas à interação do fungo ao hospedeiro, e visto que, outras moléculas
constituintes do proteoma do fungo P.brasiliensis tem apresentado comportamento de
adesina, resolvemos analisar a capacidade de PbICLr apresentar um provável
comportamento de adesina ligando-se a componentes da matriz extracelular e também
determinar sua localização subcelular. Também foi realizada a caracterização
enzimática PbICL recombinante.
28
III – OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho são:
Localização da ICL em células leveduriformes de P. brasiliensis;
Avaliar a capacidade de PbICL recombinante se ligar a componentes da
matriz extracelular;
Avaliar a influência da PbICL recombinante purificada e do anticorpo
policlonal anti-PbICL, nos processos de adesão e invasão de P. brasiliensis à
culturas celulares;
Determinar os parâmetros cinéticos da PbICL recombinante;
Obter a sequência de cDNA da PbmeICL;
Obter a proteína recombinante PbmeICL através de expressão heteróloga;
29
Microbiology); 4/19 (Mycology)
Impact Factor: 2.812
The isocitrate lyase of Paracoccidioides brasiliensis is located in the cell
wall and act as an adhesin
Rogério Fraga Troian
a
, Benedito Rodrigues da Silva Neto
a
, Julhiany de Fátima da
Silva
b
, Maria José Soares Mendes-Giannini
b
, Sônia Nair Báo
c
, Célia Maria de Almeida
Soares
a
, Maristela Pereira
a
∗
a
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, C.P. 131,
74001-970, Goiânia, GO, Brazil.
b
Universidade Estadual Júlio de Mesquita Melo,
Araraquara, SP, Brazil.
c
Laboratório de Microscopia, Universidade de Brasília, Brasília,
DF, Brazil.
Corresponding author
Maristela Pereira
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Instituto de Ciências Biológicas, Campus II, Universidade Federal de Goiás, C.P. 131,
74001-970 Goiânia, GO, Brazil.
E-mail address: [email protected]
Tel./fax: +55 62 35211110.
31
Abstract
Paracoccidioides brasiliensis is the causal agent of paracoccidioidomycosis, one of the
most important deep systemic and endemic mycosis in Latin America. The natural
infection is assumed to be the inhalation of airborne propagules produced by the fungal
mycelium form, which then change into the pathogenic yeast form in the lung,
subsequently can disseminate to the other organs. The glyoxylate cycle play an
important role during pathogenesis of several microorganisms. Isocitrate lyase of P.
brasiliensis (PbICL) localizes at the cell wall and in the cytoplasmic compartment.
PbICL and the respective polyclonal antibody inhibited the interaction of P. brasiliensis
to in vitro cultured epithelial cells. The recombinant PbICL binds to fibronectin and
type IV collagen. All these results suggest that PbICL is required for interactions
between P. brasiliensis and extracellular matrix molecules and that this interaction may
play an important role in the fungal adherence and invasion of host cells.
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis, Isocitrate Lyase, Adhesin
32
Introduction
The glyoxylate cycle (CG) is a modified form of the tricarboxilic acid cycle
(TCA), which enables plants, animals, and microrganisms to utilize two-carbon
compounds such as acetate, ethanol, or fatty acids as the sole carbon sources (Kornberg
& Krebs, 1957). The glyoxylate bypass of the TCA cycle comprises two enzymes,
isocitrate lyase (ICL) and malate synthase (MLS). The first enzyme, ICL, catalyzes the
cleavage of isocitrato to succinate and glyoxylate. The second enzyme, MLS, catalyzes
the condensation of acetyl-CoA with glyoxylate to form malate (Cozzone 1998).
The glyoxylate pathway in fungi is often a component of the peroxisome
function, but whereas MLS is peroxisomal in all eukaryotic organisms known so far, the
peroxisomal localization of ICL is not conserved evolutionarily (Kunze et al., 2006).
For example, ICLs from Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Colletotrichum
lagenarium and Magnaporthe grisea all localize in peroxisomes (Ebel et al., 2006;
Gainey et al., 1992; Valenciano et al., 1996; Asakura et al., 2006), while ICL from
Saccharomyces cerevisiae is cytosolic (Chaves et al., 1997).
Many studies have suggested that ICL and GC are involved in the virulence of
bacteria like Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa (McKinney et al.,
2000; Lindsay et al., 2008) and fungi such as Candida albicans, Magnaporthe grisea
and Leptosphaera maculans (Lorenz & Fink, 2001; Muñoz-Elías & McKidnney, 2005;
Idnurm & Howlett, 2002).
Transcripts of Paracoccidioides brasiliensis isocitrato lyase (PbICL) are
induced on yeast phase, and during infection of fungus in mice model (Felipe et al.,
2005; Costa et al., 2007). In addition, it shifts during transition from mycelium to yeast
33
(Bastos et al., 2007; Goldman et al., 2003). These finds suggest the significance of
PbICL on host-pathogen interaction.
Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, causing of the
paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most frequent systemic mycoses affecting
the rural population of Latin America. Infection is believed to occur by inhalation of
conidia produced by the saprophytic phase of the fungus living in nature (Bagagli et al.,
2006). In the lungs, the infectious particles readily transform into the yeast pathogenic
form (McEwen et al., 1987) to cause an asymptomatic infection, or active disease in a
small percentage of the infected individuals. The different clinical forms of the disease
and the occurrence of asymptomatic infection may be a result of host-related factors,
such as sex, age, and immunological status, as well as characteristics of the infecting
agent, especially its virulence (Franco et al., 1994).
The molecules of adherence are essential for the interaction host pathogen.
These are usually exposed surface structures that facilitate adherence to host cells, or
target host serum proteins from extracellular matrix (ECM). During this interaction, the
fungal cell wall is in continual contact with the host and acts as a sieve and reservoir of
molecules such as adhesins (Gonzalez et al., 2005).
Structural and molecular analysis of molecules of adhesion has helped to
understand the P. brasiliensis cell-surface structures and the basic mechanisms
underlying their interaction with host receptor molecules (Gonzalez et al., 2005;
Moreira et al., 2006). Colonization efficient tissue by pathogenic fungi is a complex
event, generally involving adhesin encoded by the pathogen. P. brasiliensis has the
ability to shoot the endothelial cells and probably reach deeper tissues of the host (Silva
et al., 2005). The components of ECM involved in the interaction of P. brasiliensis to
the host have been characterized (Mendes-Giannini et al., 2006).
34
The adhesion of P. brasiliensis to cells is seen as an important determinant of
pathogenesis. Only now the fungal proteins functioning as adhesins in P. brasiliensis
are being better understood. Some proteins including a glycoprotein of 43 kDa (gp43), a
30 kDa protein, proteins of 19 and 32 kDa, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH) and triosephosphate isomerase (TPI) have been identified as mediator of
adhesion to ECM components and human cells (Vicentini et al., 1994; Andreotti et al.
2005; Gonzales et al. 2005; Barbosa et al. 2006; Mendes-Giannini et al. 2006; Pereira
et al. 2007).
In this work we detected PbICL on cell wall and cytoplasm of P. brasiliensis
yeast cells, and characterized it’s interaction with ECM components.
35
Materials and Methods
P. brasiliensis isolate and growth conditions
The P. brasiliensis Pb01 isolate (ATCC MYA-826) has been previously
investigated by our laboratory and was cultivated in semisolid Fava-Neto’s medium as
yeast cells for 7 days at 36°C as described (Zambuzzi-Carvalho et al., 2009).
Antibody production
The purified recombinant PbICL was used to produce anti-PbICL polyclonal
antibodies in New Zealand rabbits. The immunization protocol consisted of an initial
injection of 300 µg of purified recombinant protein in complete Freund´s adjuvant and
three subsequent injections of the same amount of the antigen in incomplete Freund´s
adjuvant. Each immunization was followed by an interval of 15 days. After the third
immunization, the serum containing the anti-PbICL polyclonal antibodies was collected
and stored at -20ºC. The reactivity of the serum against the recombinant PbICL was
tested by Western blot analysis.
Western blotting analysis
SDS–PAGE was performed in 12% polyacrylamide gels according to Laemmli
(1970). The proteins were electrophoresed and stained with Coomassie brilliant blue or
transferred to a nylon membrane and checked by Ponceau S to determine equal loading.
PbICL, as well as the recombinant protein, PbICLr were detected with the polyclonal
antibody raised against the PbICLr (diluted 1: 1000). After reaction with alkaline
36
phosphatase anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) or alkaline phosphatase anti-human
IgG, the reaction was developed with 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate–nitroblue
tetrazolium (BCIP–NBT).
Cell wall protein extractions
Yeast cells were frozen in liquid nitrogen and disrupted by using a pestle and
mortar, the material was ground to a fine powder. This procedure was carried out until
complete cell rupture verified by microscopic analysis and by the failure of cells to
grow on Fava Netto`s medium. Ground material was lyophilized, weighed, and
resuspended in 25 μL Tris buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.8) for each milligram of dry
weight as described (Damveld et al., 2005). The supernatant was separated from the cell
wall fraction by centrifugation at 10,000 g for 10 min at 4°C. A new protein extraction
was performed with Tris buffer as described above. To remove noncovalently linked
proteins and intracellular contaminants isolated cell wall fraction was washed
extensively with 1M NaCl and then to remove covalent linked proteins was boiled three
times in SDS-extraction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 2% [w/v] SDS, 100 mM Na-
EDTA, and 40 mM β-mercaptoethanol).
Preparation of Culture Filtrate proteins
The Culture Filtrate (CF) were processed as described previously (Singh et al.,
2005; Samanich et al., 2000 and 2001) with modifications. Shortly, 14 days of growth
at 37°C with gentle agitation, the culture supernatant were removed from the cells by
filtration and the CFs were concentrated for dialyzed and dried by lyophilization. The
protein content of the concentrated culture filtrate was quantitated according to
Bradford (Bradford, 1976).
37
Transmission electron microscopy of PbICL from P. brasiliensis yeast cells
P. brasiliensis yeast cells were fixed overnight at 4°C in solution containing 2%
(vol/vol) glutaraldehyde, 2% (wt/vol) paraformaldehyde, and 3% (wt/vol) sucrose in 0.1
M sodium cacodylate buffer at pH 7.2. After fixation, the yeast cells were rinsed in the
same buffer and postfixed for 1h in solution containing 1% (wt/vol) osmium tetroxide,
0.8% (wt/vol) potassium ferricyanide, and 5 mM CaCl
2
in sodium cacodylate buffer, pH
7.2. The material was dehydrated in a series of ascending acetones (30 to 100%)
(vol/vol) and embedded in Spurr resin (Electron Microscopy Sciences, Washington, Pa).
Ultrathin sections were stained with uranyl acetate, 3% (wt/vol), and lead citrate
(Reynolds, 1963). The material was observed with a Jeol 1011 transmission electron
microscope (Jeol, Tokyo, Japan). For the ultrastructural and immunocytochemistry
studies, we employed the protocols previously described in Barbosa et al., (2006).
Affinity ligand assays
Far-Western assays were carried out as previously described (Guichet, 1997).
PbICLr was submitted to SDS-PAGE and blotted onto nitrocellulose membranes, which
were assayed for laminin, fibronectin, type I and type IV collagen binding as follows.
After being blocked for 4 h with 1.5% (wt/vol) bovine serum albumin (BSA) in 10 mM,
phosphate buffered saline (PBS) and then washed three times (for 10 min each time) in
10 mM PBS containing 0.05% (vol/vol), the membranes were incubated with laminin
(20 μg mL
-1
), fibronectin (20 μg mL
-1
), or type I and IV collagen (30 μg mL
-1
) diluted in
PBS-BSA with Tween 20 for 90 min and then washed three times (for 10 min each
time) in 10 mM PBS containing 0.05% (vol/vol) Tween 20 (PBS-T). The blots were
38
incubated for 18 h with rabbit antibodies antilaminin, antifibronectin, or anti-type I and
IV collagen in PBS-BSA-T (diluted 1:100). The blots were washed with PBS-T and
incubated with peroxidase-labeled goat anti-rabbit immunoglobulin (diluted 1:1000).
The blots were washed with PBS-T, and the reactive bands were developed with
hydrogen peroxide and diaminobenzidine (Sigma-Aldrich Co.) as the chromogenic
reagent. The positive control was obtained by incubating the PbICLr with the anti-
PbICLr polyclonal antibody (diluted 1:500), and the reaction was developed as
described above.
ELISA Analysis
The analyses for ELISA were accomplished as having described for Mendes-
Giannini et al. (2006), with modifications. Briefly, Corning polypropylene 96-well
microtiter ELISA plates (Corning, NY, USA) were sensitized with ECM proteins (10 μg
mL
-1
), overnight at 4°C. After blocking with 1% BSA, the incubation was followed with
the PbICLr protein in the concentration of 5μg mL
-1
for 2 h at 37°C in triplicate wells.
The reaction was developed using na buffer citrate pH 4.9 conjugated with o-
phenylenediamine as chromogenic substrate. In all the assays were made the following
controls: of the conjugated, of the protein, of the ECM and positive control with
antibody of the protein.
Interaction of P. brasiliensis with in vitro-cultured pneumocytes: inhibition of
adherence and infection by PbICLr and by the antibody anti-PbICLr
A549 pneumocytes were incubated for 1 h at 37°C with PbICLr at 50 μg mL
-1
in
10 mM PBS. After washing the cells three times in Dulbecco's Modified Eagle Media
DMEM and 10
6
yeast cells of P. brasiliensis were added to the epithelial cells.
39
Incubation was performed for 2 and 5 h at 37°C to allow the processes of adhesion and
infection, respectively, as described previously (Barbosa et al., 2006; Mendes- Giannini
et al., 2004). Additionally, 10
6
yeast cells of P. brasiliensis were incubated for 1 h at
37°C with the polyclonal antibody anti-ICL (diluted 1:100). Cells were washed three
times in 10 mM PBS and allowed to interact with the A549 pneumocytes. Three types
of control experiments were performed with A549; yeast cells not preincubated with the
PbICLr, yeast cells not preincubated with the anti-ICL antibody, and pneumocytes
preincubated with BSA at 25 μg mL
-1
. The percentages of infected cells were
determined by randomly counting a minimum of 10
3
yeast cells on each triplicate
coverslip. The adhesion and infection indices were calculated as described previously
(Mendes-Giannini et al., 2004). Results are presented as the means of counts performed
three times with standard deviations included. The inhibition of the adhesion and
invasion was obtained for flow cytometry, adhesion index was obtained by multiplying
the mean number of attached yeast cells per pneumocyte by the percentage of infected
cells. All flow cytometry analyses were performed on an EPICS XL (Coulter Eletronics,
Hialeah, FL, USA) using an air-cooled argon-ion laser tuned at 488 nm and 115 mW.
The flow rate was kept at approximately 1 x 10
4
events (cells), and green fluorescence
was amplified logarithmically. Ten thousand events were collected as monoparametric
histograms of log fluorescence, as well as list mode data files. The data were analyzed
by Scatchard GraphPad Prism®. Analysis of the data provided the dissociation
constants (Kd).
40
Results
Detection of PbICLr on cell wall extracts and CF
To determine the subcellular distribution of PbICL a cell wall-enriched fraction
of P. brasiliensis yeast cells was obtained. The cell wall fraction was analyzed by
Western blot using the polyclonal antibody against PbICLr. A higher quantity of
PbICLr protein could be observed in the cell wall from extract from yeast cells. The
PbICLr seems to be covalently linked to the cell wall since the protein was present in
the SDS-soluble fraction (Fig. 1A, lane 1). PbICL was also found in the crude extract of
P. brasiliensis (Fig. 1A, lane 3). The presense of PbICL was determined in culture
filtrate harvested from P. brasiliensis. (Fig. 1B, lane 2)
Detection of the PbICL by immunoelectron microscopy of P. brasiliensis yeast cells
To define the cellular localization of the PbICL in P. brasiliensis, we performed
immunocytochemistry experiments using ultrathin sections of LR Gold-embedded yeast
cells of P. brasiliensis. Electron microscopy of conventionally embedded cells revealed
the ultrastructure of the P. brasiliensis yeast form (Fig. 2A). An electron-dense cell wall
and the plasma membrane appear as defined structures. The contour of the nucleus is
relatively smooth and appears with condensed chromatin that is homogeneously
distributed. The immunocytochemistry assays revealed gold particles detected in the
cytoplasm and extending through the cell wall, indicating the double localization of
PbICLr in P. brasiliensis (Fig. 2B and C). Control samples obtained by incubation of
the yeast cells with the rabbit preimmune serum were free of label (Fig. 2D).
41
Binding of the PbICLr to ECM proteins
The ability of the PbICLr to bind laminin, fibronectin and type I and IV
collagen was determined by far western blotting assays, as shown on Figure 2. The
results show that the PbICLr bind to fibronectin (Fig 3, lane 3) and type IV collagen
(Fig 3,lane 5), but it does not bind to laminin (Fig 3, lane 2) and type I collagen (Fig 3,
lane 4). The reaction between PbICLr and its polyclonal antibody was used as positive
control (Fig 3, lane 1). The negative controls were obtained incubating the recombinant
molecule with just the secondary antibody or in the absence of the extracellular matrix
proteins (data not shown). These results were confirmed by ELISA assays.
Inhibitory effects of PbICLr and polyclonal antibody on P. brasiliensis interaction
to cells and A549 pneumocytes evaluate by flow cytometry
The infection index was determined by interactions between P. brasiliensis yeast
cells and A549 pneumocytes, as shown in Fig. 4 A. P. brasiliensis yeast cells were
treated with the antibody anti-ICL prior to interaction with the pneumocytes, or
pneumocytes were treated with PbICLr prior to the interaction with P. brasiliensis. The
controls (non treated cells) were used to calculate the percentages of both adhesion and
infection inhibitions. The interaction was assayed by indirect immunofluorescence and
analyzed by flow cytometry (Fig.4 B). Ten thousand events were collected as
monoparametric histograms of log fluorescence, as well as list mode data files. When P.
brasiliensis yeast cells were incubated with the anti-ICL polyclonal antibody, a decrease
in the adhesion index was observed to occur. Similarly, when the pneumocytes were
treated with PbICLr the adhesion index was reduced compared to the values of non
treated cells. Additionally, the infection index was decreased when P. brasiliensis yeast
42
cells were treated with the anti-ICL polyclonal antibody and when pneumocytes were
treated with the PbICLr. Controls were performed by incubating the pneumocytes with
BSA prior to the addition of yeast cells. Through the flow cytometry it was possible
also to calculate the values of inhibition of the adhesion and invasion in 2 hours and 5
hours. The inhibition of adhesion and invasion were approximately 25.5 % (P < 0.05)
and 62.5 % (P < 0.05) after 2 h of contact, and 31 % (P < 0.05) and 83 % (P < 0.05)
after 5 h of infection, respectively.
43
Discussion
In this communication, our purpose was investigate the role of PbICL as an
adhesin putatively involved in host cell binding. Molecules of adherence are
fundamental in the pathogen-host interaction. Normally these are exposed surface
structures that facilitate adherence to host cells, or target host serum proteins from
ECM. Successful host tissue colonization by a fungus is a complex event, generally
involving a ligand (adhesin) encoded by the pathogen and a cell receptor. The
microrganism can interact with three types of host components: secreted cell products,
host cell surface, or ECM proteins, such as laminin, types I and IV collagen, fibronectin
and fibrinogen (Mendes-Giannini et al., 2008).
The PbICL on the surface of cells and on the subcellular fractions representing
the surface of the fungus, SDS-extracted cell-wall, provide evidence it is found
extracellular protein. The glyoxylate pathway is generally considered to be localized
within the peroxisomes of plants, bacteria and fungi (Olsen et al., 1993; Kunze et al.,
2002; Idnurm et al., 2007). Studies recents in our laboratory identified P. brasiliensis
MLS (PbMLS) as an immunodominant protein in culture filtrate (CF) from mid-log
phase cultures (Neto et al., in preparation). The presence of PbICLr was determined in
CF harvested from P. brasiliensis. These results suggested that PbICLr is actively
secreted in P. brasiliensis. GAPDH and TPI of P. brasiliensis are enzymes of glycolytic
pathway and were recently characterized as an adhesin and were detected in the
cytoplasm and on the cell wall of the yeast cells (Barbosa et al., 2006; Pereira et al.,
2007).
The presence of these cytoplasmic housekeeping enzymes in unusual locations
often correlates with their ability to perform alternative functions such as adherence and
44
invasion of the host cells (Dallo et al., 2002; Pancholi & Chhatwal, 2003). Together
these results provide confirmation that the PbICL may be unique in its ability to be
transported out of the cytoplasm through the cell wall and to be localized on the outer
surface of the cell and be released extracellularly. Some of those nonconventionally
secreted proteins are involved in binding to host components (Gozalbo et al., 1998).
An interface between the host and the pathogen, the cell wall plays a crucial
role for colonization and infection. Western blot analysis of the cell extracts that
correspond to the most superficial components of the fungal cell wall was initially
employed to define the cellular localization of PbICL at the fungus cell wall.
Subsequently, the polyclonal antibody produced against PbICLr allowed the definition
of the protein subcellular localization by immunoelectron microscopy, showing the
double localization of PbICL in the cytoplasm and cell wall. In silico analysis revealed
the lack of an N-terminal signal peptide in PbICL. Evidence has been accumulating
using as current models S. cerevisiae and C. albicans, clearly showing that many
proteins that lack an N-terminal peptide also reach the cell surface. Of special note,
many of those surface proteins lacking the N-terminal signal peptide are also found in
the cytoplasm, where they perform well-known functions (Nombela et al., 2006).
Studies have demonstrated the capacity of P. brasiliensis for adhesion and
invasion (Andreotti et al., 2005; Mendes-Giannini et al., 2004). In some microrganisms
the adherence of conidia to the epithelial cells or to the underlying basement membrane
was thought to play a crucial role in the establishment of the fungus and the initiation of
the disease in a receptive host (Tronchin et al., 2008). P. brasiliensis yeast cells interact
with several other ECM proteins, laminin, fibronectin, fibrinogen and type I and type IV
collagens (Mendes-Giannini et al., 2006; Gonzalez et al., 2005). In this work, we
showed that PbICLr bind to fibronectin and type IV collagen by far-Western blot
45
assays, these data were confirmed by ELISA. The PbICLr and the polyclonal antibody
raised against molecule were able to interfere with the interaction of P. brasiliensis to in
vitro cultured ephitelial cells inhibiting the adhesion and internalization. All these
results show a behavior of adhesin for PbICL and can play an important role in
adhesion and colonization of the fungus to the host tissue.
Acknowledgements
This work at Universidade Federal de Goiás was supported by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and International Foundation for
Science (IFS), Stockholm, Sweden, through a grant to M.P. R.F.T. was supported by a
fellowship from CNPq.
46
Legends
Figure 1 (A) Localization of PbICLr. Cell wall fraction was obtained and analysed by
Western blot with the anti-PbICL polyclonal antibody. Lane 1, SDS-extracted cell wall
proteins. Lane 2, extracted cell wall proteins without SDS. Lane 3, protein crude extract
from yeast cells. (B) Localization of PbICLr. Western blot of SDS-PAGE fractionated
culture filtrate of P. brasiliensis harvested on control negative (lane 1) and secreted
(lane 2). Molecular markers are indicated.
Figure 2 Immunoelectron microscopy detection of PbICL on yeast cells. (A)
Transmission electron microscopy of P. brasiliensis yeast cells, showing the nucleus
(n), intracytoplasmic vacuoles (v). The plasma membrane (arrow) and cell wall (w) are
also shown. (B and C) Gold particles (arrow) are observed at the fungus cell wall (w)
and in the cytoplasm (double arrows). (D) Negative control exposed to the rabbit
preimmune serum.
Figure 3 Binding PbICLr to extracellular matrix components. PbICLr (0,5 μg) was
subjected to SDS-PAGE and electroblotted. Negative control was obtained by
incubating the PbICLr with peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (data not show), the
positive control was obtained by incubating the recombinant protein with anti-ICL
polyclonal antibody (lane 1). Membranes were reacted with laminin (lane 2), fibronectin
(lane 3) and types I and IV collagen (lanes 4 and 5, respectively) and subsequently
incubated with rabbit IgG antilaminin, antifibronectin, and mouse anti-type I and anti-
type IV collagen antibodies, respectively. Use of peroxidase-conjugated anti-rabbit and
anti-mouse IgG reveal the reactions.
47
Figure 4 Interaction of P. brasiliensis yeast forms with pneumocytes. The interaction
was assayed by indirect immunofluorescence and analyzed by flow cytometry. (A)
Binding of PbMLS to A549 cells as visualized by fluorescence microscope (1000x). (B)
Control negative. (C) Histograms showing the interaction of P. brasiliensis yeast cells
to pneumocytes A549 and analyzed by flow cytometry. Prior to each assay, the yeast
cells were treated for 1 h with the anti-ICL polyclonal antibody (1 : 1000 diluted). In
another set of experiments the pneumocytes A549 were pretreated for 1 h with 25 mg
mL
-1
of the PbICLr. Adhesion of P. brasiliensis to pneumocytes was analyzed 2 h after
the treatments. Infection (adhesion plus internalization) of P. brasiliensis to
pneumocytes was analyzed 5 h after the treatments. Black bars, control; light grey bars,
cells treated with BSA; dark grey bars, epithelial cells treated with the PbICLr; white
bars, P. brasiliensis yeast cells treated with the anti-ICL polyclonal antibody.
48
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54
Fig. 1 A
Fig. 1B
55
Fig. 2
56
Fig.3
57
Fig.4 A
Fig. 4 B
58
Fig. 4 C
59
CONCLUSÕES
As conclusões finais do trabalho são:
Com o intuito de se definir a localização celular da PbICL, realizamos
inicialmente experimentos de Western blotting, utilizando extrato de proteínas presentes
na parede do fungo. Os resultados mostraram a presença da PbICL no extrato de parede
e também no extrato cru obtido de células leveduriformes de P. brasiliensis. A
evidência da localização desta proteína na superfície do fungo foi confirmada
posteriormente com a realização de experimentos de imunocitoquímica associada à
microscopia eletrônica de transmissão de células leveduriformes, mostrando que a
PbICL esta presente na parede, bem como no citoplasma do fungo.
Apesar de P. brasiliensis não ser considerado um organismo intracelular
obrigatório, foi relatado que o fungo pode aderir e invadir células epiteliais in vitro e in
vivo. Aceita-se que a adesão do patógeno às células do hospedeiro seja um pré-requisito
para o estabelecimento da infecção. Neste trabalho foi mostrado através dos resultados
de experimentos de Far Western blotting que a PbICLr foi capaz de ligar a fibronectina
e colágeno tipo IV, condição observada também em outras proteínas de P. brasiliensis,
caracterizadas com possíveis adesinas.
Ensaios com células leveduriformes do isolado Pb 01 pré-incubadas com
anticorpo policlonal anti-PbICL mostraram inibição da adesão e consequentemente
internalização do fungo em culturas celulares de pneumócitos, sugerindo sua influência
na adesão e invasão do fungo a tecidos, etapas primordiais no processo infectivo de P.
brasiliensis. Neste sentido a molécula pode ser compreendida como um possível fator
de virulência do fungo.
60
PERSPECTIVAS
Avaliação da interação da PbICL com outras proteínas utilizando a técnica de
Duplo Híbrido;
Produção do anticorpo anti- PbmeICL;
Analisar a expressão de PbmeICL em diferentes fontes de carbono;
Caracterização dos parâmetros cinéticos da PbmeICL;
Avaliar inibidores em potencial para PbICL;
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80
81
Anexos
Caracterização da Isocitrato liase e Metilisocitrato liase do fungo
patogênico Paracoccidioides brasiliensis
Introdução
Paralelamente ao estudo do comportamento da enzima isocitrato liase de
Paracoccidioides brasiliensis como uma molécula de adesão, determinamos os
parâmetros cinéticos desta enzima.
82
Uma reação análoga à da isocitrato liase na conversão de isocitrato em
glioxalato e succinato ocorre na mitocôndria durante o metabolismo de propionil-Coa
através do ciclo do 2- metilcitrato. Esse ciclo inicia-se pela síntese de 2-metilcitrato a
partir de oxaloacetato e propionil-CoA. A molécula de 2-metilcitrato é então convertida
em 2-metilisocitrato que é clivado em piruvato e succinato pela 2-metilisocitrato liase
(Luttik 2000).
A ausência do ciclo do glioxalato em mamíferos, bem como sua inter-relação
com o ciclo do 2-metilcitrato, elege as enzimas envolvidas nesse último como potentes
alvos para agentes antimicrobianos. Genes codificantes para as enzimas do ciclo do
glioxalato e do ciclo do 2-metilcitrato tem se mostrado importantes para a virulência de
microrganismos patogênicos, propiciando a sobrevivência dos mesmos dentro de
macrófagos (Munoz-Elias et al. 2006).
Diante do exposto, determinamos a caracterização enzimática da isocitrato liase
de P. brasiliensis (PbICL) recombinante. Em adição foi obtida a sequência de cDNA de
metilisocitrato liase de P.brasiliensis (PbmeICL) e realizada a expressão heteróloga da
mesma.
Resultados e Discussão
As enzimas isocitrato liase e metilisocitrato liase de Paracoccidioides
brasiliensis foram caracterizadas. Os parâmetros cinéticos de PbICL recombinante
foram determinados mostrando que a enzima é mais ativa na temperatura de 30°C (Fig.
1) e pH 7.0 (Fig.2). A presença de íons Mg
2+
é conhecida por ser essencial na atividade
de isocitrato liase (Khan et al. 1992). Nós também demonstramos a importância que o
íon Mg
2+
possui nos ensaios de atividade, mostrando que em sua ausência, a PbICL
83
recombinante
não possui atividade (tabela 1). Os valores de Km e Vmax foram de 3.8
mM e 3.4 mM/min/mg respectivamente (Fig. 3 A e 3 B).
O cDNA de PbmeICL foi obtida a partir da biblioteca de cDNA derivada de
infecção de P. brasiliensis em camundongos (Costa et al. 2007). A sequência de cDNA
consiste de 1815 pb. A tradução da ORF até a sua respectiva sequência de aminoácidos
origina 605 resíduos de aminoácidos com um PI predito de 8.52 (Compute pI/Mw).
Análises computacionais usando o software Target P
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) (Emanuelsson et al., 2000) sugerem a
presença de PbmeICL na mitocôndria.
O hexapeptídeo K[K/R]CGH[L/M/Q/R] descrito como uma assinatura para a
família das isocitrato liases foi encontrado em PbmeICL e foi representado por
KKCGHL (Fig 4). Nessa assinatura um resíduo de cisteína está presente, e é um
componente do sítio ativo em sequências de isocitrato liases de fungos, plantas e
bactérias. Análises de Blast p (Altschul et al. 1990) revelaram que a PbmeICL
apresentou alta identidade e (84%) para a 2-metilisocitrato liase mitocondrial de
Ajellomyces capsulatus NAm1 (accession: gb|EDN08590.1|), 77% para Coccidioides
immitis RS (accession: EAS27532.1|) e 76% para A. fumigatus (accession:
EAL85752.1|) e 74% para A. terreus (accession: EAU32547.1).
A sequência de aminoácidos [GF(V/T)(L/M)QL(I/V)SLAG(L/V)H (Brock,
2005) é característica e fornece o local para o grupo metil, são indicadas para serem
metilisocitrato liases específicas de fungos e está presente como GFVLQLISLAGH
(caixa em traços).
O cDNA que codifica a PbmeICL foi clonado em um vetor de expressão pLysS
para obter a proteína recombinante. Após indução com IPTG, uma proteína com uma
aparente massa molecular de 55 kDa foi detectada nos lisados com cauda de histidina e
84
uma massa molecular de 42 kDa sem a cauda de histidina (Fig 5), para a fusão da
metilisocitrato liase com a tiredoxina N-terminal com a cauda de histidina do vetor de
expressão. A proteína de fusão foi purificada através cromatografia por coluna de níquel
Ni-NTA.
Conclusão
Os parâmetros cinéticos da PbICL recombinante foram avaliados, demonstrando
que essa enzima possui uma atividade máxima a uma temperatura de 30°C e um pH de
7.0. Demonstramos também que a PbICL recombinante é uma enzima metalo
dependente, necessitando do íon Mg
2+
para sua atividade.
85
A sequência do cDNA que codifica para PbmeICL foi determinada, mostrando
que possui motivos presentes em isocitrato liase e metilisocitrato liase. A expressão
heteróloga e purificação da PbmeICL na sua forma ativa foi obtida.
Legendas
Figure 1: Effect of temperature on recombinant ICL activity from P. brasiliensis.
Results are mean values of three replicates.
86
Figure 2: Effect of pH on recombinant ICL from P. brasiliensis. Phosphate/citrate
buffer (5.0-7.0), phosphate buffer (6.0-8.0), Tris buffer (7.0-9.0). Results are mean
values of three replicates.
Figure 3: Determination of Michaelis-Menten constant. (A) The value of K
m
for
PbICLr was given for the change of concentration of three-D, L-isocitrate of 0.5 mM to
3.75 mM in the trial of activity as all other components remained constant (Mg
2+
, 5 mM,
pH 7.0 and temperature 30°C). (B) The values of K
m
and V
max
were determined using a
double reciprocal Lineweaver-Burke.
Figure 4: Nucleotide and deduced amino acid sequences of P. brasiliensis cDNA
encoding the PbICL and PbmeICL The deduced amino acid sequence is shown above
the nucleotide sequence. The codon of the initiation methionine and the termination
codon are underlined. The arrows mark the oligonucleotides ICL-S, ICL-A, ICL-PS,
and ICL-PA, which were used for sqRT-PCR analysis and heterologous protein
production, respectively. The putative phosphorylation sites are indicated by (*). The
conserved hexapeptide, K[K/R]CGH[L/M/Q/R], corresponding to the signature pattern
of the ICL family, is boxed. The cysteine at the putative active site within the conserved
hexapeptide is indicated by (•). Amino acids, predicted to be involved in catalysis, are
shown in bold. Methyl group are indicate to be specific for fungal methylisocitrate
lyases, is present how GFVLQLISLAGLH (in dashed box)
Figure 5: Expression and purification of recombinant PbmeICL. SDS-PAGE
analysis of P. brasiliensis recombinant PbmeICL. E. coli cells harboring the pET-32a-
meICL plasmid were grown at 37°C to an OD
600
of 0.6 and harvested before (lane 1)
and after induction with 1 mM IPTG (lane 2). Recombinant PbmeICL was isolated by
87
affinity chromatography with his-tag (lane 3). Recombinant PbmeICL without his-tag
(lane 4).
Fig. 1
88
Fig. 2
0
20
40
60
80
100
120
4 5 6 7 8 9 10
pH
Relative activity (%))
Fig. 3 (A)
89
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Vmax 3.44065 ±0.10642
Km 3.79909 ±0.19369
Abs 324 nm
mmol L
-1
Fig. 3 (B)
Fig. 4
90
91
Fig.5
92
Table 1 Effect of metal ions on enzymatic activity of PbICLr enzyme.
U = 1µmol/min
1 U is definided as the formation of 1 µmol of glyoxylate
phenylhydrazone per minute using isocitrate as a substrate.
Results are mean values of three replicates.
93
Sample studied Activity (U) Specific activity (%)
MgCl
2
1,24 x 10
-3
100
MnCl
2
3,70 x 10
-4
29,8
BaCl
2
5,50 x 10
-4
4
CaCl
2
1,30 x 10
-4
0,96
ZnCl
2
0 0
NiCl
2
HgCl
2
0
0
0
0
Normas da revista
FEMS Yeast Research
Published on behalf of the Federation of European Microbiological Societies
Edited by:
Teun Boekhout
Print ISSN: 1567-1356
Online ISSN: 1567-1364
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Instructions for the submission procedure can be found under 'FEMS Submission Instructions', reached via the
'Instructions and Forms' button at the top right of all Manuscript Central pages.
FEMS Microbiology Reviews
95
Manuscripts reach FEMS Microbiology Reviews by one of the following routes. Reviews may be solicited from
international leading investigators by one of the Editors; alternatively proposals for reviews may be sent to the
Chief Editor or one of the Editors with appropriate interests. Editors' contact details and fields of interest are
listed in each issue. Authors are encouraged to contact Editors directly by e-mail.
Such proposals should contain:
a) an outline (1-3 pages);
b) a short statement describing the aim, scope and relevance of the review, and an indication of why the review
is timely;
c) information on whether there has been any review covering this or a related field in the past few years, and,
if so, the specific importance of the proposed review;
d) a statement as to when the completed review might be expected;
e) full contact details of four experts in the field who are familiar with the topic;
f) a list of recent key references showing the contributions to the field made by the author(s).
The proposals will be evaluated and authors may be invited to submit the review, if the material is satisfactory
and of general interest.
Revision
Manuscripts may be returned to authors for modification of the scientific content and/or for shortening and
language corrections. Revised versions must be submitted online through Manuscript Central. You will need to
go to the list ''Manuscripts with Decisions'' (under My Manuscripts) and from there you need to click ''create a
revision'' at the right-hand side (under Actions). At this stage, we require a source file of your text and tables
(.doc or .rtf format, but not .pdf). You must clearly indicate in the designated place and/or cover letter the
changes that have been made. Figures should be uploaded in separate files and at sufficient resolution (see
section on Preparation of data). All obsolete files of the previous version should be deleted from the revised
submission. If a paper that is returned to the authors for amendment is not resubmitted in revised form within
one month (FEMS Microbiology Letters) or two months (other journals) it will be regarded as withdrawn. Any
revised version received subsequently will be treated as a newly submitted manuscript and the date of receipt
will be altered accordingly.
PREPARATION OF MANUSCRIPTS
Language
Manuscripts should be in English (consistent with either British or American spelling). Authors who are unsure
of correct English usage should have their manuscripts checked by someone proficient in the language. You are
strongly advised to ensure that the English is of a publishable standard prior to submission. Manuscripts that
are deficient in this respect may be returned to the author without peer review.
Pre-submission English-language editing
Authors for whom English is a second language may choose to have their manuscript professionally edited
before submission to improve the English. A list of independent suppliers of editing services can be found at
http://www.blackwellpublishing.com/bauthor/english_language.asp. All services are paid for and arranged by
the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or preference for publication.
Layout of manuscripts
FEMS strongly recommends that you compile your manuscript in MS Word and save it as a .doc file, using the
following layout.
a) Title page, followed by the abstract, main text in one single column and references.
b) Tables, each on a separate page.
c) Figure legends.
d) Figures, putting each figure on a separate page and ensuring that the figure is at least the size it will be in
the printed document. Include the figure number (e.g. Fig. 1) and legend well outside the boundary of the
space occupied by the figure. If you wish to upload separate figure files, Manuscript Central will combine your
manuscript main body and figure files into one online .pdf file. Please ensure that you upload the figures only
once, i.e. either embedded at the end of the text document or as separate files.
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e) Include page and line numbering (continuous).
f) The right-hand margin justification should be switched off. Artificial word breaks at the end of lines must be
avoided.
g) If you do not use MS Word then save in MS Word format in the word processor that you use. Rich text (.rtf)
format may also be used.
h) Use standard fonts (Arial, Times New Roman, Symbol, Helvetica, Times). In your Word document, on the
Tools menu, click Options, select the Embed TrueType fonts check box and then click the Save tab.
Length
One journal page is about three manuscript pages, each table is about 0.3 of a printed page and each figure is
about 0.25 of a printed page.
FEMS Microbiology Letters
Priority will be given to short papers. The majority of papers will occupy only four to six pages of the journal.
The text (including abstract but excluding the title page, references in text and as list, and figure legends)
should not exceed 3000 words. References should be kept to a minimum and a combined total of six figures
and tables are permitted. If the paper exceeds these guidelines, the manuscript will be returned for
condensation without review unless the authors have provided compelling reasons for the exceptional length.
FEMS Microbiology Reviews
The length of the review should be at least eight pages upon publication in the journal. High quality colour
figures, diagrams or photographs are encouraged and will be printed free of charge providing the Editor agrees
that the use of colour adds value to the Review.
Other FEMS journals
There is no maximum length for papers, but the length should be justified by the content and authors are urged
to be concise. Excessively long reference lists should be avoided. Repetition of information in the text and
illustrations should not occur. Very short papers (Short Communications) may be published in these journals
only if they offer a significant, though small, increase in knowledge or understanding of the field.
Title, authors, keywords and running title
The manuscript should not form part of a numbered series but should be headed by a concise, informative title.
Authors are reminded that titles are widely used in information-retrieval systems. The title should be followed
by the name(s) of the author(s) (with first or middle names in full and including all initials) and by the name(s)
and address(es) of the institute(s) where the work was performed. For multiple authors with different
affiliations, please indicate the relevant affiliations. The name, full postal address, telephone and fax numbers,
and e-mail address of one corresponding author should be provided in a footnote. FEMS journals have one
corresponding author. Shared or equal contribution of authors should be mentioned at the end of the article. A
list of three to six keywords must be included on the first page. Authors are requested to consult the subject
indices of the individual journals or the list of subject headings from Index Medicus for preferred synonyms and
standard abbreviations. Plural terms should be avoided. The title is not used for preparing the index, so
important words and phrases may appear in both the title and keywords. General terms, such as 'Enzyme',
'Membrane', 'Transport', etc., should not be used unless qualified, e.g. 'Enzyme activation', 'Membrane
phosphorylation', 'Ion transport'.
Please supply a short running title of up to 60 characters (including spaces).
General organisation of manuscripts
Materials and methods and Results are normally written in the past tense and the present tense is occasionally
used in the Introduction and Discussion.
a) Abstract. This should be a single paragraph of fewer than 200 words and must be intelligible without
reference to the full paper. Ideally, references are not cited.
b) Abbreviations should be avoided, but if necessary, they must be defined the first time they are used in the
main text. Do not abbreviate genus in the title, keywords, or at first use in the Abstract and Introduction.
c) Introduction. This should state the aims and objectives, but should not contain a summary of the results.
d) Materials and methods. Sufficient detail must be provided to allow the work to be repeated. Suppliers of
materials and a brief address should be mentioned if this might affect the results.
97
e) Results (the presentation of data is described below).
f) Discussion. This should not simply recapitulate the Results. Combined Results and Discussion sections are
encouraged when appropriate.
g) Acknowledgements can be made to funding agencies, colleagues who assisted with the work or the
preparation of the manuscript, and those who contributed materials or provided unpublished data.
h) References.
FEMS Microbiology Reviews
The review should contain the items listed above, excepting that the Materials and methods and Results
sections will not be relevant. The Discussion section is preferably replaced by Concluding remarks, which do not
repeat the Introduction or main sections but may, for example, point to future directions.
Preparation of Supporting Information
Electronic Supporting Information may be provided to support and enhance your manuscript with, e.g.
supporting applications, movies, animation sequences, high-resolution images, background datasets or sound
clips. Supporting files will be published, subject to editorial approval, online alongside the electronic version of
your article. Authors should submit the Supporting Information at the same time as the manuscript, but in
separate file(s). Select 'Supplemental files', 'Supporting Document' or 'MultiMedia' for the file designation when
uploading through the online submission system. Upload a separate .doc file listing concise and descriptive
captions for each file uploaded as Supporting Information. Please indicate that you have uploaded these files in
your cover letter and state clearly whether they are intended for eventual online publication as Supporting
Information, or are for peer review purposes only.
Presentation of data
Do not tabulate or illustrate points that can be adequately and concisely described in the text. Do not repeat
information in both tables and figures. Figures and tables, along with their legend (and/or footnote), should be
understandable in their own right without having to refer to the main text. Tables should be supplied in Word or
Excel format, and must be editable (not pasted in as a picture).
(a) Tables. Explanatory footnotes should be related to the legend or table using superscript, lower-case letters.
All abbreviations should be defined after the footnotes below the table.
(b) Line art.
- Figures should be supplied at twice their final size with wide margins.
- A single column figure is 80 mm, two-thirds page width is 114mm and two-column width is 168 mm.
- All lines should be drawn at 1.5 point (0.5 mm wide), broken line styles may be used to differentiate multiple
plot lines if desired.
- Letters and numbers should be 16 point (capitals 4mm high) non-serif.
- Symbols in the figure itself should be 3mm in diameter. Lines drawn to accompany the points should not go
through hollow symbols.
- Grid lines should not be used.
- Numbers used as axis labels should have minimum significant figures; amounts less than unity must carry a
preceding zero (e.g. 0.5 not .5).
- Larger composite figures may be designed to occupy two columns when this can achieve an overall saving in
space. The character, line and symbol sizes should be adjusted accordingly to achieve the same sizes on the
printed page.
(c) Half-tone and colour figures. Magnification should be indicated where appropriate by inclusion of a bar
marker. Photographs of electropherograms, etc., in which there is poor contrast may be better replaced by line
drawings, but in this case the photographs should be submitted for scrutiny by the Editor. If photographs have
been digitally processed to enhance their quality, this should be stated. Colour illustrations will be
published free of charge provided that the colour is deemed essential for interpretation of the
figure. Please note that colour figures will appear in colour in the online article, regardless of whether colour
was deemed essential for the print copy. Suggestions for cover illustrations for the journal are also welcome.
98
(d) Electronic submission of figures. High-quality figures are required when the final version of the manuscript
is uploaded through Manuscript Central, and should be prepared using the following guidelines.
- Please use high-quality graphics programs such as Adobe Photoshop or Adobe Illustrator.
- Figures should be at the desired size for the printed article, i.e. 80mm wide for single column, 114mm for
two-thirds page width and 168mm for double column.
- For halftones, the resolution should be a minimum of 300 dpi; combination artwork at a minimum of 500 dpi;
and for line figures preferably 1000 to 1200 dpi.
- Combination artwork (artwork containing half-tone and line art elements, e.g. electrophoresis gels or
Southern blots with lane and fragment sizes labeled) must be in EPS. If the combination artwork is scanned,
the preferred format is .tif with a resolution of at least 500 dpi using LZW compression.
- Colour artwork should be saved as CMYK, not RGB.
- The following figure formats are acceptable (as long as they are created with the instructions given above):
- .tif and .eps (please be sure to embed all fonts used)
- Illustrator (.ai) or Photoshop files (.psd)
- One file must be submitted for each figure.
- Save files with LZW compression.
You will find further helpful and simplified guidelines by clicking the 'Preferred FEMS format for revised
manuscripts' icon, reached via the 'Instructions and Forms' button at the top right of all Manuscript Central
pages. Detailed information can be found at http://www.blackwellpublishing.com/bauthor/illustration.asp. In
principle, the electronic files will be used for producing the final publication, but the Publisher may request a set
of highquality printouts of your figures for production purposes.
(e) Figure legends. Legends should consist of a preliminary sentence constituting a title, followed by a brief
description of the way the particular experiment was carried out, and any other necessary description of
symbols or lines. All abbreviations must be defined.
Reproducibility of results and statistical tests (except for FEMS Microbiology Reviews)
Authors should state how many times experiments were repeated and whether mean or representative results
are shown. Variability should be indicated statistically wherever possible as part of, but not in place of, a proper
statistical analysis. If results are expressed as percentages, the absolute value corresponding to 100% must be
stated. Avoid values with unjustified numbers of significant figures; in most cases three significant figures is
consistent with the accuracy attained in microbiological experiments.
Results of statistical tests should be presented wherever possible as evidence for conclusions reached. Such
information must be presented concisely to illuminate the results, but not to dominate them. The tests used
should be briefly described in the Materials and methods section. Details of the diagnostic checks made for the
assumptions of the statistical tests and for the validity of any transformations used should be stated clearly.
Further information can be found in the following references: (a) Sokal, R.R. and Rohlf, F.J. (1981) Biometry.
W.H. Freeman, San Francisco; (b) Fry, J.C. (1993) Biological Data Analysis: A Practical Approach. IRL Press,
Oxford.
Nomenclature, abbreviations and units
Authors should follow internationally accepted rules and conventions. Authors should provide evidence for the
thorough identification of new isolates and use the most recent acceptable name.
Prokaryotes. The spelling of bacterial names should follow the list of Prokaryotic Names with Standing in
Nomenclature http://www.bacterio.cict.fr/. If there is a reason to use a name that does not have standing in
nomenclature, the name should be printed in roman type and enclosed in quotation marks and an appropriate
statement concerning the nomenclatural status of the name should be made in the text (for an example, see
Int. J. Syst. Bacteriol. (1980) 30: 547-556).
Fungi. The authors should use recently accepted binomials controlled by the International Code of Botanical
Nomenclature (http://www.bgbm.fu-berlin.de/iapt/nomenclature/code/SaintLouis/0000St.Luistitle.htm).
Scientific names of yeasts can be found in: The Yeasts: a Taxonomic Study, 4th ed. (C. P. Kurtzman and J.W.
Fell, ed., Elsevier B.V., Amsterdam, The Netherlands, 1998). Taxonomic texts should cite nomenclatural
authorities at the first time a name is mentioned. For abbreviation of authors' names, see
http://www.indexfungorum.org/AuthorsOfFungalNames.htm. All bacterial taxa should be italicized.
99
Viruses. Names used for viruses should be those approved by the International Committee on Taxonomy of
Viruses (ICTV) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/. If desired, synonyms may be added parenthetically when
the name is first mentioned. Approved generic (or group) and family names may also be used.
Enzymes. For enzymes, use the recommended (trivial) name assigned by the Nomenclature Committee of the
International Union of Biochemistry and Molecular Biology as described in Enzyme Nomenclature
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ enzyme/.
Genes. Genetic nomenclature should essentially follow the recommendations of Demerec et al. (Genetics
(1966) 54: 61-76), and those given in the instructions to authors of the Journal of Bacteriology and Molecular
and Cellular Biology (January issues). Biochemical compounds. Consult the European Journal of Biochemistry or
the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/).
Abbreviations. Abbreviations should only be used as an aid to the reader and their use should be strictly
limited. Define each abbreviation and introduce it in parentheses the first time it is used: e.g. 'cultures were
grown in Eagle minimal essential medium (MEM)'. Eliminate abbreviations that are not used at least six times in
the manuscript. In addition to abbreviations to the international system of units of measurements, other
common units (e.g., bp, kb, Da), chemical symbols for the elements, and the standard biochemical
abbreviations (see Eur. J. Biochem.) should be used without definition. Standard chemical symbols and trivial
names or their symbols (folate, Ala, Leu, etc.) may be used for terms that appear in full in the neighbouring
text. Abbreviations other than those recommended by the IUPAC-IUB (Biochemical Nomenclature and related
Documents, 1978) should be used only when a case can be made for necessity, such as in tables and figures. A
short guide on the use of common abbreviations can be found on the Author page on the FEMS website
(http://www.fems-microbiology.org/website/nl/page125.asp).
Reporting numerical data. The international system of units (SI) should be used; mL is acceptable in place of
cm
3
for liquid measures. The form for units is mg mL
_1
and not mg/mL, parentheses should be used to improve
clarity, e.g. mL (g drywt soil)
_1
h
_1
. The prefixes k, m, m, n, and p should be used in combination with the
standard units for reporting length, weight, volume and molarity for 10
3
, 10
_6
, 10
_9
, and 10
_12
, respectively. Use
mg mL
_1
or mg g
_1
instead of the ambiguous ppm. Units of temperature are presented as follows: 37 1C or 324
K.
References
Reference citations in the text follow the name and date system. References should be inserted in parentheses
in date order, as follows: (Brown, 1996; Brown & Smith, 1997; Smith et al., 1998). The reference list itself
must be in alphabetical order according to the first-named author, then by number of authors, then
chronologically within the one-author group, alphabetically within the two-author group and chronologically
within the three or more author group. The title of the article must be included. For papers with ten or fewer
authors, all authors must be listed. For papers with eleven or more authors, the first three names should be
listed, followed by 'et al.'. Standard abbreviations of journal titles should be used, as in the Index Medicus. The
following formats should be followed:
O'Donnell CM & Edwards C (1992) Nitrosating activity in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 95: 87-94.
Dinter Z & van Morein B (1990) Virus Infections in Ruminants. Elsevier, Amsterdam.
McCarthy AJ (1989) Thermomonospora. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4 (Williams ST,
Sharpe ME & Holt JG, eds), pp. 2552-2572. Williams and Wilkins, Baltimore, MD.
Tang CR (2001) Cloning of a new ice nucleation active gene for insect pest control. PhD Thesis, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Beijing.
Reference should not be made to work 'in press' unless it has been accepted for publication; a DOI number
should then be provided. Unpublished results and personal communications may be mentioned within the text
itself provided that (a) the names and initials of all the persons involved are listed, and (b) they have all
granted permission for the citation. In the case of an online journal publication the DOI number of the reference
should be used.
Nucleotide and amino acid sequences
Any new nucleotide or amino acid sequences must be deposited in an appropriate data bank. Authors are
encouraged to use the EMBL Data Library but can also use other archives, such as GenBank. An accession
number must be obtained before submission to the Editors and this fact should be mentioned in the
covering letter. Authors should include the accession number in the appropriate figure legend. Authors
wishing to enable other scientists to use the accession numbers cited in their papers via links to these sources,
should type this information in bold, underlined text. Letters in the accession number should always be
capitalised (e.g. GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198 and BF223228). Authors are
advised to check accession numbers very carefully. An error in a letter or number can result in a dead
link. In the final version of the printed article, the accession number text will not appear bold or underlined. In
100
the final version of the electronic copy, the accession number text will be linked to the appropriate source in the
NCBI databases enabling readers to go directly to that source from the article.
COPYRIGHT AND ONLINEOPEN
Upon acceptance of an article, the corresponding author should sign either a Copyright Assignment formor
OnlineOpen form. OnlineOpen is a pay-to-publish service from Wiley-Blackwell that offers authors whose papers
are accepted for publication the opportunity to pay up-front for their manuscript to become open access (i.e.
free for all to view and download) via the Wiley InterScience website. Each OnlineOpen article will be subject to
a one-off fee to be met by or on behalf of the Author in advance of publication. Upon online publication, the
article (both full-text and PDF versions) will be available to all for viewing and download free of charge. The
print version of the article will also be branded as OnlineOpen and will draw attention to the fact that the paper
can be downloaded for free via the Wiley InterScience service. Any authors wishing to use the OnlineOpen
service will be required to complete the relevant combined payment and copyright licence form available from
the links at the end of these notes.
Once complete the Copyright assignment form or OnlineOpen form should be sent to the Editorial Office along
with the rest of the manuscript materials as soon as possible after the acceptance. Prior to acceptance there is
no requirement to inform an Editorial Office that you intend to publish your paper OnlineOpen.
The copyright statement for OnlineOpen authors will read:
©[date] The Author(s) Journal compilation
©[date] Federation of European Microbiological Societies. Published by Blackwell Publishing Ltd
PROOFS AND AUTHOR SERVICES
Author Services enables authors to track their article - once it has been accepted - through the production
process to publication online and in print. Authors can check the status of their articles online and choose to
receive automated e-mails at key stages of production. The author will receive an e-mail with a unique link that
enables them to register and have their article automatically added to the system. Please ensure that a
complete e-mail address is provided when submitting the manuscript. Visit
http://www.blackwellpublishing.com/bauthor for more details on online production tracking and for a wealth of
resources including FAQs and tips on article preparation, submission and more.
When proofs have been produced, the corresponding author will receive an e-mail alert from the Publisher
containing a link to a web site. It is therefore essential that the e-mail address of the corresponding author is
working and current. The proof can be downloaded as a PDF file from this site Acrobat Reader will be required
in order to read this file. This software can be downloaded (free of charge) from the following web site:
http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. This will enable the file to be opened, read on screen
or printed out. Further instructions will be sent with the proof regarding how to indicate and communicate any
changes to the Publisher. Hard copy proofs will be posted if no e-mail address is available. Queries will be
addressed to the corresponding author. Excessive changes made by the author in the proofs, excluding
typesetting errors, may be charged for separately. The Editors reserve the right to make minor alterations to
the text without altering the scientific content.
For FEMS Microbiology Letters, the Publisher reserves the right to proceed with publication if
corrections are not communicated within three days.
OFFPRINTS
A PDF offprint of the online published article will be provided free of charge to the corresponding author, and
may be distributed subject to the Publisher's terms and conditions. Paper offprints of the printed published
article may be purchased if ordered via the method stipulated on the instructions that will accompany the
proofs. Printed offprints are posted to the correspondence address given for the paper unless a different
address is specified when ordered. Note that it is not uncommon for printed offprints to take up to eight weeks
to arrive after publication of the journal.
ETHICAL AND RELATED ASPECTS
The Editors expect that new and variant organisms, viruses and vectors described in FEMS journals will be
made available, under written request and for their own use, to all qualified members of the scientific
community. If delays in strain or vector distribution are anticipated or if they are available from sources other
than the authors, this should be indicated. The Editors encourage authors to deposit important strains in
publicly accessible culture collections and to refer to the collections and strain numbers in the text. In the case
of materials that have been distributed by individuals, authors should indicate the laboratory strain designations
and name and address of the donor as well as the original culture collection identification number, if any.
Papers describing experimental work with humans must include a statement that the Ethical Committee of the
institution in which the work was done has approved it, and that the subjects gave informed consent to the
work. Experiments with animals or with genetically manipulated organisms must have been undertaken in
101
accordance with the legal requirements of the relevant local or national authority. Procedures must be such that
experimental animals do not suffer unnecessarily. Submission of a manuscript implies that the work described
has not been published before (except in the form of an abstract or as part of a published lecture, review or
academic thesis, in which case reference should be made in a footnote to the title) and that it is not under
consideration for publication elsewhere. The corresponding author must ensure that its publication has
been approved by all co-authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities in the
laboratories where the work was carried out and that all persons entitled to authorship have been
named. If accepted, the article must not be published elsewhere in the same form in either the same or
another language, without the consent of the Editor and Publisher. Each named author must be responsible for
at least the part describing his or her contribution and must have seen the entire final text before submission
and any substantial subsequent revisions. Authorship should be dealt with carefully and all authors should
agree with it at the submission stage. FEMS journals do not permit adding or removing of authors or
rearranging their order after acceptance. The Editors must be notified in writing by the corresponding author of
any deviation from these rules. Should any author become aware of a breach of ethics he/she should contact
the Chief Editor of the journal who will endeavour to retract the article. Articles published in FEMS journals
represent the scientific findings and opinions of the authors.Whilst the Editors and Publisher make every effort
to ensure the accuracy of all published matter, they can accept no responsibility or liability, collectively or
individually, for any erroneous, misleading or unintentionally damaging statements, which may appear in the
journal. Authors must draw attention in the Materials and methods to any chemical or biological hazards that
may be involved in the experiments described.
PERMISSION TO REPRODUCE MATERIAL
Individuals wishing to reproduce material (not exceeding 250 words of text) from articles published in FEMS
journals for non-commercial purposes may do so providing the original publication is acknowledged accordingly
and the authors' approval is obtained, and in this case no special permission is needed from the Publisher.
Authors may also include the article in a thesis without special permission. In all other cases, permissions may
be sought directly from the Journal Rights Department: e-mail [email protected].
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