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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Eduardo Martins de Sousa
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA AGUDA DE CAMUNDONGOS
C57BL/6 E BALB/c FRENTE À INFECÇÃO POR Mycobacterium massiliense
.
Orientadora:
Profª Dra Ana Paula Junqueira Kipnis
Dissertação de Mestrado
Goiânia-Go, 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Eduardo Martins de Sousa
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA AGUDA DE CAMUNDONGOS
C57BL/6 E BALB/c FRENTE À INFECÇÃO POR Mycobacterium massiliense
.
Orientadora:
Profª Dra Ana Paula Junqueira Kipnis
Comitê de Orientação:
Profº Drº André Kipnis
Este trabalho foi realizado com o auxílio financeiro do CNPq, CAPES e FUNAPE-UFG.
Goiânia-Go, 2009
Dissertação de mestrado submetida ao
PPGMT/UFG como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em
Medicina Tropical na Área de
Concentração em Imunologia.
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iii
Dedico este trabalho ao meu querido sobrinho
João Pedro que é minha razão de viver, sonhar e lutar.
iv
”...
Nossas dádivas são traidoras e nos fazem perder
o bem que poderíamos conquistar, se não fosse
o medo de tentar."
William Shakespeare
v
AGRADECIMENTOS
Pelos mais variados motivos, este trabalho me é muito caro, e devo agradecer a muitas
pessoas que estiveram comigo durante todo o processo. Para mim mesmo, chamo este
agradecimento de “desabafo de dois anos”, então, não estranhem se o acharem um pouco
longo!
Agradeço em primeiro lugar a Deus que iluminou o meu caminho durante esta caminhada
em busca dos meus objetivos.
Aos meus pais, que me ensinaram a não temer desafios e a superar os obstáculos com
humildade.
A toda minha família, tão normal e tão louca ao mesmo tempo; as figuras mais presentes
(presentes DEMAIS, algumas vezes) na minha vida, meu norte (embora eu sempre prefira o
sul) e, muitas vezes, minha consciência.
À Professora Ana Paula Junqueira-Kipnis, por ter acreditado no meu trabalho desde o
princípio, quando parecia que ninguém acreditava. Por ter sido amiga, orientadora em todos
os momentos de dificuldades e alegrias vividos. A sua disponibilidade irrestrita, sua forma
exigente, crítica e criativa de argüir as idéias apresentadas, creio que deram norte a este
trabalho, facilitando o alcance de seus objetivos.
vi
Ao Professor André Kipnis pelas suas reflexões criativas sobre nosso trabalho, as quais
muito nos ajudaram a compreendê-lo e a realizar uma análise critica sobre o mesmo, meus
sinceros agradecimentos.
À Professora Thereza Liberman Kipnis (in memoriam), que tive a oportunidade de
conhecer e descobrir que pautamos nossas vidas por trabalho, estudo e dedicação. Creio ter
sido esta experiência de vida que a levou ser extremamente generosa comigo em sua
colaboração para realização deste trabalho. Seus exemplos de vida vão além da pequenez
desta tentativa de agradecimento frente à sua nobreza, meus eternos agradecimentos.
Aos professores pelos quais cruzei nesta pós-graduação, que foi tão rica em informações.
Obrigado por me mostrar como um profissional deve agir realmente. Através dos exemplos
vistos em sala e na vida, posso afirmar que aprendi como devo proceder.
Aos meus colegas do Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas: Arioldo,
Ediane, Loanda, Bruna, Fernando, Rafael, Michelle, Mayara, Cinthya, Rogério,
Hidelbrando, João Alves que contribuíram com uma mão a mais para realização dos
experimentos, ou sugestões para a realização dessa dissertação.
Aos colegas do Laboratório de Bacteriologia Molecular Alessandra, Camila, Lorena, Sueli
que contribuíram para realização deste trabalho.
A todos os funcionários do biotério que me auxiliaram na realização deste trabalho.
vii
A todos os funcionários do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública.
Ao amigo Eduardo e demais colegas do Laboratório de Biologia do Reconhecer da
Universidade Estadual do Norte Fluminense pela colaboração na realização dessa
dissertação.
Aos amigos que me apoiaram e agüentaram durante estes anos de curso, e sempre
manifestaram apoio ou estiveram ao menos curiosos a respeito deste trabalho.
Considero que a elaboração de uma dissertação de mestrado é um produto coletivo embora
sua redação, responsabilidade e stress seja predominantemente individual. Várias pessoas
contribuíram para que este trabalho chegasse a um bom termo. A todas elas registro minha
gratidão.
Agradeço a todos os demais que estiveram ao meu lado neste trabalho. Precisei muito do
apoio de todos para que este, que parecia ser apenas um delírio meu, virasse um sonho que
se torna realidade.
viii
ÍNDICE
RESUMO...............................................................................................................................1
ABSTRACT ...........................................................................................................................2
1 – Introdução.......................................................................................................................3
1.1 Gênero Mycobacterium. ...........................................................................................3
1.2 Micobactérias Atípicas..............................................................................................6
1.2.1 Micobactérias Atípicas como Patógenos Emergentes.....................................7
1.2.2 Epidemiologia ........................................................................................................8
1.3 Mycobacterium massiliense...................................................................................10
1.4 Imunopatologia de micobactérias .........................................................................12
1.5 Resposta imune.......................................................................................................15
2 – Justificativa ...................................................................................................................22
3 – Objetivos .......................................................................................................................23
3.1 Objetivo Geral: .........................................................................................................23
3.2 Objetivos Específicos: ............................................................................................23
4 – Material e Métodos......................................................................................................24
4.1 Animais e divisão dos grupos experimentais.....................................................24
4.2 Isolados de Micobactérias atípicas.......................................................................24
4.3 Preparação do bacilo para inoculação em animais de laboratório. ................26
4.4 – Inoculação dos animais.......................................................................................26
4.5 Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC)...........27
4.6 Obtenção de Soro e sobrenadante celular. ........................................................27
4.7 Ensaio Imunoenzimático (ELISA).........................................................................28
4.7.1 Obtenção de extrato protéico de M. massiliense........................................28
ix
4.7.2 Dosagem de Anticorpos.................................................................................28
4.8 Obtenção de RNA total...........................................................................................29
4.8.1 Quantificação de RNA total ............................................................................30
4.9 Síntese de cDNA pelo método de transcrição reversa. ....................................30
4.10 Ensaios de expressão gênica através da reação de polimerase em cadeia
em tempo real.................................................................................................................31
4.11 Obtenção de macrófagos peritoneais de camundongos. ...............................33
4.12 Cultura de macrófagos .........................................................................................34
4.13 Dosagem de Óxido Nítrico...................................................................................35
4.14 Análise Estatística.................................................................................................35
5 – RESULTADOS.............................................................................................................37
5.1 Avaliação da virulência em camundongos..........................................................37
5.2 Avaliação da resposta imune específica. ............................................................39
5.3 Avaliação da produção de Óxido Nítrico .............................................................43
7 – Conclusões:..................................................................................................................49
7.1 Conclusão Geral:.....................................................................................................49
7.2 Conclusões Específicas: ........................................................................................49
8 - Referências Bibliográficas ..........................................................................................51
x
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APCs: Células Apresentadoras de Antígenos
BAAR: Bacilos Álcool-ácidos Resistentes
BCG: Bacilo Calmete-Guérin
C: Citosina
cDNA: Ácido desoxirribonucléico complementar
UFC: Unidades Formadoras de Colônia
CR: Receptor de complemento
dATP: Deoxi adenosina trifosfato
dCTP: Deoxi citosina trifosfato
dGTP: Deoxi guanina trifosfato
DNA: Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Deoxiribonucleotídeo trifosfato
dTTP: Deoxi timidina trifosfato
ELISA: Ensaio Imunoenzimático
eNOS: Óxido Nítrico Sintase endotelial
G: Guanina
GLPs: Glicopeptideolipídeos
GM-SCF: Fator de Crescimento de Colônia de Granulócitos e Monócitos
HPN: Peptídeo de Neutrófilo Humano
IFN-γ
γγ
γ: Interferon gama
xi
IgG : Imunoglobulina
IL: Interleucina
iNOS: Óxido Nítrico Sintase induzível
ip: Intraperitoneal
iv: Intravenoso
kDa: Quilodalton
LAM: Lipoarabinomanama
LB: Linfócito B
LT: Linfócito T
MA: Micobactérias Atípicas
MCP: Proteína Quimioatraente de Monócito
MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade
MIP: Proteína Inflamatória de Monócito
MOTT: Outras micobactérias que não Mycobacterium tuberculosis
mRNA: Ácido ribonucléico mensageiro
NK: Matadoras naturais
nNOS: Óxido Nítrico Sintase neuronal
NO: Óxido Nítrico
NOS: Óxido Nítrico Sintase
NTM: Micobactérias não Tuberculosas
OADC: Complexo Dextrose Albumina e Ácido Oléico
OD: Densidade Óptica
OPD: Ortofenilenodiamino
PAMPs: Padrões Moleculares Associados aos Patógenos
xii
pb: Pares de Base
PBS: Tampão Fosfato Salina
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
PCR-PRA: Análise por restrição de produtos por Reação em Cadeia da Polimerase
rDNA: Ácido Dexosirribonucléico ribossomal
RNA: Ácido Ribonucléico
rpm: Rotações por minuto
TA: Temperatura Ambiente
TACO: Camada de Tryptofano-Aspartato
TGF-β: Fator de Crescimento Tumoral Beta
TLR: Receptor Semelhante ao Toll
TNF-α
αα
α: Fator de Necrose Tumoral Alfa
V-H
+
ATPase: Adenosina Trifosfato Vacuolar
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura da parede celular de micobactérias ......................................................05
Figura 2: Árvore filogenética do gene recA combinado com gene rpoB de M. massiliense e
outras espécies.......................................................................................................................12
Figura 3: Genotipagem dos isolados clínicos por PFGE ....................................................25
Figura 4: Determinação de unidades formadoras de colônias do baço de camundongos
C57BL/6 após 1, 3, 7 e 14 dias de inoculação via intraperitoneal e intravenosa com 10
6
bacilos viáveis de M. massiliense.........................................................................................37
Figura 5: Determinação de unidades formadoras de colônias do baço de camundongos
C57BL/6 e BALB/c após 1, 3, 7 e 14 dias de inoculação via intravenosa com 10
6
bacilos
viáveis de M. massiliense......................................................................................................38
Figura 6: Detecção de IgG1 e IgG2a específicos anti-extrato protéico de M. massiliense no
soro de camundongos C57BL/6 e BALB/c após 14 dias de infecção com M.
massiliense............................................................................................................................39
Figura 7: Expressão de mRNA de citocinas em relação a expressão de mRNA de β-actina
em camundongos C57BL/6 e BALB/c após 3, 7 e 14 dias de infecção com 10
6
bacilos
viáveis de M.
massiliense............................................................................................................................42
Figura 8: Produção de Óxido Nítrico (NO) por macrófagos peritoneais de camundongos
C57BL/6 e BALB/c após estimulação com M.
massiliense............................................................................................................................44
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Genes analisados por qRT-PCR...........................................................................33
xv
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 : Classificação das espécies de MA de acordo com a
patogenicidade.........................................................................................................................8
Quadro 2: Investigação de Surto por Micobactérias Atípicas no
Brasil.....................................................................................................................................11
1
RESUMO
Micobactérias atípicas são microrganismos distintos dos agentes etiológicos responsáveis
pela tuberculose e pela lepra (Hanseníase). São considerados atualmente como patógenos
emergentes associados a procedimentos cirúrgicos simples, e são resistentes aos
antibióticos convencionais. As infecções por micobacterias atípicas atingem três em cada
10 mil pessoas por ano, porém a incidência vem aumentando à medida que cresce o número
de indivíduos infectados por HIV. A baixa virulência das micobactérias atípicas condiciona
a sua patogenicidade à diminuiçäo da resistência do hospedeiro, por isso faz-se necessário
uma melhor investigação da interação do microrganismo com o hospedeiro. Nesta
dissertação, a resposta imune celular e humoral de camundongos BALB/c e C57BL/6 frente
à infecção por M. massiliense isolada de surto hospitalar na cidade de Goiânia foi avaliada.
O isolado de M. massiliense utilizado neste estudo foi capaz de infectar camundongos
imunocompetentes, que controlaram completamente a carga bacteriana antes dos 30 dias de
infecção. Os mecanismos pelos quais estes animais eliminaram as micobactérias foram:
produção de NO por macrófagos peritoneais, presença de IgG1 específica e indução de
mRNA para citocinas inflamatórias, assim como de citocinas reguladoras da inflamação.
Palavras-chave: Citocina, Micobactéria Atípica, Óxido Nítrico, Resposta imune inata.
2
ABSTRACT
Atypical mycobacteria are microorganism’s appart from the etiological agents responsible
for tuberculosis and leprosy. They are currently considered as emerging pathogens
associated with simple surgical procedures, and are resistant to conventional antibiotics.
The atypical mycobacterial infections is responsible for three in every 10 thousand people
per year, but the incidence has been increasing as the number of individuals infected with
HIV also increases. The low virulence of atypical mycobacteria associates its pathogenicity
to decreased resistance of the host, and consequently it is necessary to better understand the
interaction between host and microorganism. The cellular and humoral immune response of
BALB/c mice and C57BL/6 mice infected with M. massiliense isolated from an outbreak of
hospitals in the city of Goiania was evaluated. The isolate of M. massiliense used in this
study was able to infect immunocompetent mice, which completely controlled the bacterial
load before the 30 days of infection. The mechanisms by which these animals cleared the
mycobacteria were: production of NO by peritoneal macrophages, presence of specific
IgG1 and induction of mRNA for inflammatory cytokines, as well as regulatory cytokines
in inflammation.
Key-words: Atypical mycobacteria, Cytokines, nitric oxide, innate immune response.
3
1 – Introdução
1.1 Gênero Mycobacterium.
A definição taxonômica do gênero Mycobacterium se baseia em marcadores
quimiotaxonômicos sob três critérios, a saber: a álcool-ácido resistência, o conteúdo de G-C
(guanina-citosina) do seu DNA, presente em 61 a 71% das cepas, e, a síntese de ácidos
micólicos de peso molecular entre 60 a 90 Kda (Hance et al, 1989; Saito et al, 1990).
O gênero Mycobacterium pertence à família Mycobacteriaceae (o único gênero
desta família), ordem Actinomycetales e classe Actinomycetes e se caracteriza como bacilos
delgados, levemente curvados ou retos, com tamanho de 0,2 a 0,4 x 2 a 4 µm. São
microrganismos aeróbicos, embora algumas espécies possam crescer em ambientes com
baixa concentração de oxigênio, imóveis e não formadores de esporos (Vossler, 2000). Seu
crescimento se dá, em geral, sob forma de micélios ou filamentosa, dando origem a
elementos bacilares. Sua patogenicidade está relacionada com sua parede celular, cuja
camada externa contém ácido micólico (Shinnick & Good, 1994), que forma uma camada
cérea, resistente à água.
A parede celular das micobactérias contém glicopeptídeos unidos a polissacarídeos
de cadeia ramificada denominado arabinogalactana, por meio de ligações fosfodiéster. As
terminações distais da arabinogalactana estão esterificadas com o ácido micólico. Os ácidos
4
micólicos são ácidos graxos complexos, β-hidroxilados e α-substituídos, que ocorrem como
ésteres. O complexo glicopeptídeo-ácido micólico-arabinogalactana forma o esqueleto da
parede celular micobacteriana. As cadeias de carbono dos ácidos micólicos estão
intercaladas com as de numerosos lipídios e glicolipídios associados à parede. Estes ácidos
graxos são importantes para a análise e para a caracterização das espécies de
micobactérias. Outros lipídios complexos, como ácidos graxos de cadeias curtas,
fenolglicolipídios, peptidoglicolipídeos também são bons marcadores para a identificação
de numerosas espécies (Vincent et al, 1992). Outra característica de micobactérias
conferida por estas moléculas de ácidos micólicos-arabinogalactana é a chamada álcool-
ácido-resistência (Nolte & Metchock, 1995, Koneman et al, 2001).
Os lipídios são responsáveis por 60% do peso seco da parede celular das
micobactérias (Figura 1) (Koneman et al, 2001; Rastogi et al, 2001). Quando as
micobactérias são inseridas em um ambiente que favoreça a ruptura da parede celular,
componentes como: lipoarabinomananas (LAM), fosfatidilinositol, manosídeos,
lipomananas entre outros se solubilizam, mas o complexo formado pelo ácido micólico,
arabinogalactanas e peptideoglicanas permanece intacto. Tal característica permite que a
camada superior participe na infecção do hospedeiro enquanto a camada inferior garante a
viabilidade da bactéria (Brennan, 2003; Sinha et al, 2005).
O gênero Mycobacterium compreende 125 espécies (Euzéby, 2006), sendo que
Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M. canetti, M. bovis, M.bovis BCG (Bacilo
Calmette Guéri), M. microti e M. pinnipedii (Cousins et al, 2003) formam um complexo
5
conhecido como Complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) os quatro primeiros
representantes desse grupo causam tuberculose em humanos e juntos com o M. leprae são
as únicas micobactérias que são transmitidas de pessoa para pessoa (Vossler, 2000). Este
complexo pertence a um grupo de micobactérias de crescimento lento com um tempo de
duplicação entre 12 – 20 h., crescem em uma temperatura entre 34 – 38ºC, e formam
colônias visíveis de duas a seis semanas (Roberts, 1991).
Figura 1. Estrutura da parede celular de micobactérias. Fonte: Adaptado de
http://oregonstate.edu/%7Emahmudt/pictures/Mycobacterium%20cell%20envelope.jpg.
O complexo M. avium (MAC) inclui diversas espécies de micobactérias entre elas
M. avium, M. intracellulare. Estes microrganismos são freqüentemente relacionados às
complicações da aids, por razões ainda desconhecidas (Ramos et al, 2000).
6
1.2 Micobactérias Atípicas
Micobactérias, exceto as compreendidas no complexo M. tuberculosis e M. leprae,
tem recebido ao longo do tempo diferentes denominações, em 1899 Moeller lhes chamou
de “bacilos pseudotuberculosis”, Borrel e Marmoreck em 1901 lhes chamou de “bacilos
paratuberculosos”, posteriormente Pinner em 1932 e Timpe e Runyon em 1954 lhes
denominaram de “micobactérias atípicas” (Timpe & Runyon, 1954; Runyon, 1959),
Haudoroy em 1955 “micobactérias anormais”, em 1963 Corpe Runyon e Lester
“Micobactérias inclassificadas”, em 1963 receberam a denominação inglesa "MOTT"
(mycobacteria other than tuberculosis) outras micobactérias que não Mycobacterium
tuberculosis, assim como em 1969 Marks e Selkon as englobam num grupo de
“micobactérias oportunistas”, Wolinskyi em 1972 lhes chamam de “micobactérias não
tuberculosas”, Wayme e Sramek em 1992 “PPEM” (Pontentialy Pathogenic Enviromental
Mycobacteria) Micobactérias ambientais potencialmente patogêncicas.
Por questões clínicas, utilizaremos à denominação: Micobactérias atípicas para
referirmos a outras micobactérias que não sejam do complexo M. tuberculosis ou M.
leprae, que são consideradas espécies típicas do gênero. Em um exame microscópico todas
as micobactérias apresentam a mesma aparência, porém se estudarmos do ponto de vista
bacteriológico de maneira mais detalhada com cultivos, provas bioquímicas e provas
genéticas, várias difenças podem ser observadas entre micobactérias atípicas e M.
tuberculosis ou M. leprae (Casal & Picazzo, 1999).
7
1.2.1 Micobactérias Atípicas como Patógenos Emergentes
Devido ao aparecimento da aids, uma série de novas espécies de micobactérias
passou a atuar como agentes oportunistas. A identificação dessas novas espécies de
micobactérias deve-se ao desenvolvimento de sistemas de diagnósticos moleculares que
permite o isolamento e identificação de espécies de difícil cultivo (Howard et al, 2002;
Taylor & Palmer, 2006).
A infecção cutânea geralmente, é secundária a um trauma cirúrgico, onde o
debridamento cirúrgico da área afetada é suficiente para eliminação do agente. As MA são
resistentes à maioria dos antibióticos tradicionais e em infecções, recomenda-se o
tratamento intravenoso com amicacina e claritromicina via oral durante 4 a 6 meses
(McKenna, 2001; Jenkins et al, 2008).
As MA são também classificadas conforme sua capacidade de causar doença no
homem como potencialmente patogênicas e raramente patogênicas ou saprófitas (Quadro
1), (Davidson, 1989). As MA potencialmente patogênicas podem causar uma variedade de
doenças em humanos e animais que diferem em severidade e importância em saúde pública,
podem causar patologias pulmonares, ganglionares, linfoadenites, cutâneas e também
doenças disseminadas em pacientes portadores do vírus HIV (Barreto et al, 1993; ATS,
1997), assim como infecções pós-cirúrgicas (Freitas et al. 2003; Winthrop et al. 2003).
8
Quadro 1 - Classificação das espécies de MA de acordo com a patogenicidade
MA POTENCIALMENTE
PATOGÊNICAS
MA RARAMENTE
PATOGÊNICAS
M. abscessus
M. asiaticum
M. avium
M. avium subsp. Paratuberculosis
M. celatum
M. chelonae
M. fortuitum
M. genavense
M. haemophilum
M. immunogenum
M. intracellulare
M. kansasii
M. lentiflavum
M. malmoense
M. marinum
M. mucogenicum
M. peregrinum
M. scrofulaceum
M. shimoidei
M. simiae
M. szulgai
M. ulcerans
M. xenopi
M. agri
M. aurum
M. branderi
M. chitae
M. duvalli
M. fallax
M. flavescens
M. gastri
M. gordonae
M. hassiacum
M. mageritense
M. neoaurum
M. nonchromogenicum
M. phlei
M. porcinum
M. pulveris
M. smegmatis
M. terrae
M. triviale
M. vaccae
Fonte: Leão et al., 2004
1.2.2 Epidemiologia
A incidência de infecções humanas por MA depende principalmente de dois fatores:
sua ubiquidade no meio ambiente e do estado imune do hospedeiro. Micobactérias de
crescimento rápido, como M. fortuitum, M. chelonae e M. abscessus podem ser encontrados
na terra e na água. No entanto, a causa mais comum destas infecções é a transmissão
nosocomial. O reservatório da maioria das MA são as torneiras, uma vez que estas
9
micobactérias resistem à cloração da água e são capazes de crescer mesmo em condições de
baixo suprimento nutricional, formando assim um biofilme (Howard & Byrd, 2000). As
bactérias contidas nestes biofilmes contaminam a água de lavagem dos equipamentos
cirúrgicos que se não forem esterelizados transmitem as micobactérias aos pacientes
(Phillips & Von Reyn, 2001).
Surtos hospitalares com MA já ocorreram (Wallace-Jr et al, 1998), nos Estados
Unidos da América principalmente nos estados do sul e costeiros, casos foram relatados na
Carolina do Norte (Lowry et al,1988), Louisiana, Geórgia, Flórida e Texas (Wallace-Jr et al
1989) e quase a totalidade dos estados do sul têm relatos de doenças com M. abscessus
(Hector et al, 1992; Zhang et al, 1997), outros países como: França, Itália, Suécia,
Austrália, Bélgica, Suiça, Colombia, (Villanueva et al, 1997). Japão, Alemanha (Bange et
al, 2001), também apresentaram surtos hospitalares com MA devido à transmissão
nosocomial destes microrganismos.
No Brasil vários casos de infecções por MA já foram notificados, uma epidemia
ocorreu na cidade do Rio de Janeiro envolvendo grandes hospitais, incluindo
principalmente cirurgias por videolaparoscopias. Neste caso, foram oficialmente divulgados
pela ANVISA 100 casos confirmados em 2007 (Quadro 2). Estas infecções foram
associadas ao uso de glutaraldeído para esterelização de instrumentais cirúrgicos de difícil
limpeza (Petrini, 2006a).
Em Belém, no estado do Pará, também ocorreram surtos associados a cirurgias por
videolaparoscopia, assim como por mesoterapia, onde 311 pacientes foram infectados entre
10
2004 e 2005. Todos os isolados de micobactérias eram de crescimento rápido e não
produziam pigmento, dentre as quais se destacaram M. bolleti, M. abscessus e M.
massiliense (Viana-Niero et al, 2008).
Na cidade de Goiânia, no estado de Goiás, também ocorreu um surto associado a
procedimentos cirúrgicos por laparoscopia e artroscopia em vários hospitais, onde foram
isoladas 18 micobactérias de crescimento rápido. Estas micobactérias, de uma maneira
geral, causaram a formação de eritema e edema associados à formação de abscessos
localizados, restritos a região do joelho ou do abdomêm (Cardoso et al, 2008).
Todos os isolados de micobactérias foram identificados por PCR-PRA e pelo
sequenciamento parcial do gene rpoB como Mycobacterium massiliense. Foi interessante
notar que, embora os isolados tenham sido obtidos de pacientes de hospitais diferentes,
todos foram geneticamente idênticos (Cardoso et al, 2008).
1.3 Mycobacterium massiliense
Recentemente Adékambi et al. (2004) isolaram uma nova espécie de MA em um
paciente que apresentava há oito anos hemoptise e bronquiectasia, sem história prévia de
tuberculose ou uso de corticóides, e através de técnicas moleculares descobriram que esta
espécie apresentava 96% de similaridade com a sequência gênica de M. abscessus. Porém
investigando as sequências dos genes hsp65 e sodA, demonstraram que esta bactéria diferia
11
de M. abscessus por três a cinco posições de 441 pares de base (pb). Esta nova espécie foi
denominada M. massiliense (Figura 02).
Quadro 2 – Investigação de Surto por Micobactérias Atípicas no Brasil.
Estados Casos confirmados (2004) Casos cumulativos (2007)
SP
GO
DF
PA
MT
RJ
14
01
01
69
01
0
14
37
01
312
02
100
Fonte: Casos de Micobacterioses confirmados e divulgados pela ANVISA.
http://www.anvisa.gov.br/divulga/informes/2007/070307.htm
Mycobacterium massiliense é uma micobactéria de crescimento rápido que não se
distingue de M. abscessus e M. chelonae pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA. Com o
seqüenciamento dos genes rpoB, sodA e hsp65 Simmon et al, (2007) classificaram a partir
de 51 isolados clínicos, originalmente caracterizados como M. abscessus quatro isolados
que eram M. massiliense. Este foi o primeiro relato de isolamento e identificação de M.
massiliense nos Estados Unidos, sugerindo que M. massiliense pode ser mais comumente
encontrado, porém erroneamente classificado como M. abscessus.
12
Figura 2. Árvore filogenética do gene recA combinado com gene rpoB de M. massiliense e outras espécies.
A barra de escala representa uma diferença de 2% nas seqüências nucleotídicas. Fonte: Adékambi et al, 2004.
1.4 Imunopatologia de micobactérias
Pouco se conhece sobre os mecanismos de patogenicidade de MA, a presença de
lipídios parece favorecer a infecção, pela necessidade de uma fonte de triglicérides para o
seu crescimento ou talvez como um elemento de proteção frente aos mecanismos de
fagocitose do hospedeiro (Brown-Elliot & Wallace, 2002; Brown-Elliot et al, 2002). No
entanto, um aspecto característico e que contribui para a virulência do M. tuberculosis, por
exemplo, é a sua habilidade de crescer dentro de macrófagos (Kawamura, 2008), acredita-
se que esse mecanismo possa ser observado em MA devido a várias semelhanças
observadas entre as espécies.
13
De maneira geral, a interação entre a micobactéria e o macrófago é um fator crítico
que determina se a infecção por MA irá estabelecer-se no organismo. As micobactérias são
patógenos intracelulares facultativos, penetram nos macrófagos e se replicam dentro dos
mesmos. Estes microrganismos no interior de fagossomas impedem a acidificação destas
vesículas, assim evadindo dos mecanismos microbicidas dos macrófagos (Sturgill-kosycki
et al, 1994). Se o microrganismo persiste e se multiplica dentro do macrófago, podem
induzir uma resposta imune específica mediada por linfócitos TCD4
+
, TCD8
+
e células
Natural Killer (NK)
(Thomssen et al, 1995).
Os macrófagos infectados e os linfócitos estimulados produzem fatores solúveis,
que incluem quimiocinas e citocinas, que modulam uma complexa resposta imune. Alguns
componentes para o controle da infecção são: Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α),
Interferon gama (IFN-γ) e Interleucina 12 (IL-12) (Cooper et al, 1993; Cooper et al, 2002).
O TNF-α é produzido pelos macrófagos infectados e pelas células NK, sendo
provavelmente o componente imunomodulador mais importante para o controle da infecção
micobacteriana. Em contraste, a IL-4 e IL-10 modulam negativamente a resposta
inflamatória, em especial o efeito do TNF-α, e desta forma são fatores permissivos para a
proliferação intracelular micobacteriana (Sturgill-kosycki et al, 1994; Flynn and Chan,
2001).
A parede celular de micobactérias é formada basicamente por 85% de
glicopeptideolipídeos (GLPs) (Etienne et al, 2002), e estes GLPs estão relacionados com a
14
morfologia da colônia (Barrow & Brennan, 1982; Belisle et al, 1993). Catherinot et al
(2007) analisou a virulência de duas cepas de M. abscessus, uma com morfologia de
colônia lisa e outra com colônia rugosa em camundongos C57BL/6. Estes autores
mostraram que a morfologia da colônia relaciona-se diretamente com a virulência. Colônias
de bactérias rugosas apresentaram maior letalidade com maior produção de TNF-α quando
comparadas com colônias lisas de bactérias. A bactéria de colônia lisa apresenta grande
quantidade de GLPs na parede celular. Existe uma associação direta entre a quantidade de
GLP e a formação de biofilme e de fator corda. Quanto maior a expressão de GLP maior a
capacidade para formar biofilmes que se contrapõe a formação de fator corda. O fator corda
correlaciona-se diretamente com a virulência de micobactérias, pois M. abscessus pode
alternar a morfologia de sua colônia entre lisa e rugosa que permite a transição para um
fenótipo mais virulento e invasivo (Howard et al, 2006).
No fagossoma, a micobactéria executa vários processos a fim de impedir a fusão
fago-lisossoma, dentre eles destaca-se a retenção da molécula denominada TACO (do
inglês Tryptophane-aspartate-containing coat protein) e o sequestro de íons de Ferro, por
moléculas especializadas em sua captação como o receptor de transferrina, pois tal íon é
essencial para sobrevivência intracelular do bacilo (Anand and Kaul, 2005). Estes
processos também são corroborados pela inibição da acidificação fagossomal, devido à
ligação das lipoarabinomananas à proteínas de superfície do lisossoma que suprimem o
sinal de fusão entre o lisossoma e o fagossoma (Fratti et al, 2003), pelo impedimento da
bomba de próton dependente de adenosina trifosfato vacuolar (V-H
+
ATPase) transportar
15
íons hidrogênio para o meio intrafagossomal (Kaufmann, 2001; Pollock et al, 2001;
Sturgill-kosycki et al, 1994).
Outros fatores de virulência são: a resistência aos constituintes inibitórios do soro, a
diminuição da produção de TNF-α pelas células infectadas do hospedeiro, diminuição da
expressão de receptores celulares para IFN-γ e a produção de receptores para união com os
macrófagos (Cooper et al, 1993; Falkinham, 1996; Flynn and Chan, 2001; Cooper et al,
2002).
1.5 Resposta imune
Ainda não foi elucidado como as micobactérias atípicas desencadeiam uma resposta
imune no hospedeiro, porém acredita-se que o mecanismo de defesa seja semelhante ao
estabelecido para Mycobacterium tuberculosis.
O desenvolvimento da infecção pela micobactéria depende do seu encontro inicial
com as células do hospedeiro, macrófagos e células dendríticas. E esta interação ocorre por
meio dos receptores de reconhecimento de padrões moleculares, tais como receptores do
sistema complemento (CR1, CR2, CR3, CR4), receptores de manose, CD14 (Ernest, 1998)
e receptores do tipo Toll (do inglês “Toll Like Receptors”) expressos na superfície celular,
com os padrões moleculares associados aos patógenos, PAMPs (do inglês “Pathogen
Associated Molecular Pattern”) expressos na superfície de micobactérias (Abel et al, 2002;
Kaufmann & Shaible, 2003Drennan et al, 2004; Flynn et al, 2005). Outra via alternativa de
16
infecção, é via lectina presente na superfície de células dendríticas, CD209, que se liga à
lipoarabinomanana da micobactérias (Herrmann & Lagrange, 2005).
Considera-se que a proteção contra micobactéria provêm preferencialmente de uma
reposta imune celular, com interações entre células apresentadoras de antígenos (APCs) e
linfócitos T (Kaufmann, 2001). Na resposta imune celular, os linfócitos T secretam
citocinas que ativam macrófagos para eliminação de micobactérias (Stabel, 2000). Os
macrófagos apresentam antígenos de micobactérias para os linfócitos T, que liberam IL-2.
Esta interleucina estimula a proliferação de linfócitos TCD8
+
citolíticos e linfócitos T CD4
+
Th1 (Chiodini & Davis, 1992), e estes últimos, liberam mais IL-2, TNF–α, IFN–γ e Fator
de Crescimento de Colônias de Granulócitos de Monócitos (GM-SCF), com o objetivo de
ativar e aumentar o poder bactericida dos macrófagos (Kaufmann, 1995; Stabel, 1995; Lee
et al, 2001; Zur et al, 2003).
A IL-12 é uma citocina secretada precocemente, sendo produzida principalmente
pelos monócitos, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas. Estruturalmente, a IL-12 se
encontra constituída por duas subunidades, a p35 e a p40 que se unem covalentemente para
formar a molécula biologicamente ativa p70. Sua produção é induzida por algumas
citocinas como IFN-γ, TNF-α e GM-CSF, enquanto que IL-10, IL-4 e TGF-β têm um efeito
antagonista sobre as células que produzem estas citocinas (Cooper et al, 1993; Flynn et al,
1993; Salgame, 2005).
17
A produção de IL-12 ocorre logo após a fagocitose da micobactéria por macrófago
ou células dendríticas. A IL-12 tem um papel importante no controle da infecção, pois
favorece uma resposta imune celular contra micobactérias tendo funções importantes como:
1) induzir a produção de IFN-γ, pelos linfócitos T CD4, CD8 e NK (Fenton et al, 1997); 2)
induzir a proliferação de linfócitos T CD4; 3) favorecer a expansão clonal de células Th1 e
4) aumentar a citotoxicidade dos linfócitos CD8 e das células NK (Trinchieri 1995; Sano et
al, 1999; Xing & Santosuosso, 2000). Além desses efeitos, a IL-12 ativa células do sistema
imune inato, mais diretamente as células NK que aumentam a secreção de IFN-γ
(Maheshwari et al, 2002; Junqueira-Kipnis et al, 2003).
A produção de TNF-α por macrófagos, células dendríticas e linfócitos são
importantes para a modulação da migração celular, influenciando a expressão de moléculas
de adesão e quimiocinas, contribuindo para a contenção da infecção induzindo entre outras
coisas a formação de granuloma, bem como aumentando o poder microbicida dos
macrófagos para eliminação das micobactérias intracelulares (Flynn et al, 1995; Rook et al,
2005). Sendo que uma falha na produção de TNF-α, incluindo baixas de intermediários do
nitrogênio, aumenta a susceptibilidade a infecções micobacterianas (Flynn et al, 1995).
O IFN-γ produzido por diferentes populações de linfócitos T e células NK interage
com seu receptor, IFN-γ R, expresso na membrana dos macrófagos. O receptor do IFN-γ é
formado por uma cadeia α e uma cadeia β (IFN-γ R1 e IFN-γ R2 respectivamente) e são
responsáveis em iniciar os sinais intracelulares, o qual disparará a expressão de genes
envolvidos na ativação dos mecanismos bactericidas das células fagocíticas. O IFN-γ induz
18
à produção de intermediários do oxigênio; intermediários do nitrogênio; a acidificação do
fagossoma e a fusão do fago-lisossoma; a expressão de iNOS2; a redução de ferro
intracelular para limitar o desenvolvimento da micobactéria através da desregulação do
receptor para transferrina; o aumento das moléculas MHC I e II envolvidas na apresentação
de antígenos; e o aumento da capacidade de fagocitar, além de induzir a produção de IL-12
(Boehm, 1997; Flynn & Chan, 2001).
Um dos mecanismos de citotoxicidade de macrófagos mediados por IFN-γ e TNF-
α é a produção de Óxido Nítrico (NO) (Witte & Barbul, 2002). O NO é um radical livre,
sintetizado a partir do grupo guanidino da L-arginina por enzimas denominadas óxido
nítrico sintase (NOS) (Marietta, 1993). Estas existem em três isoformas: duas constitutivas
(endotelial e neuronal, eNOS e nNOS respectivamente) e uma induzida (iNOS). Esta última
se expressa em macrófagos e em células ativadas por citocinas. O NO tem função
microbicida, de inibição de agregação plaquetária e de favorecer adesão leucocitária dentre
outros (Moncada et al, 1991; Marietta 1994).
O NO resultante da ativação de iNOS possui ação citotóxica e citostática levando a
morte de microrganismos. Esta citotoxicidade resulta da sua ação direta ou reação com
outros compostos químicos liberados durante o processo inflamatório. Tais como: íons
superóxidos (O
2
-
), formando um agente altamente tóxico e oxidante o peroxinitrito
(ONOO
-
), que pode ser protonado a ácido peroxinitroso (ONOOH) dissociando-se
posteriormente em dióxido de nitrogênio (NO2) e radical hidroxila e íon NO
2
+
, aumentando
efetivamente a ação tóxica do NO e do O
2
-
(Beckman & Koppenol, 1996).
19
Está bem estabelecido que o NO resultante da eNOS tem um papel importante na
proteção do vaso sanguíneo, sendo associado à manutenção do tônus vascular pela
liberação de pequenas quantidades de NO sempre que há aumento do atrito entre as células
circulantes no vaso sanguíneo, resultando numa discreta vasodilatação (Wennmalm, 1994).
Além disso, a pressão sanguínea contribui para regular a liberação de NO em condições
fisiológicas, pois a inibição de NO resulta no aumento da pressão arterial (Nava & Luscher,
1995).
Outras populações celulares também estão envolvidas na resposta imune contra
micobactérias como linfócitos Tγδ (Thomssen et al,1995) e células NKT reconhecedoras de
antígenos lipídicos apresentados por moléculas CD1 (T CD1 restritas), todas elas secretam
IFN- γ e possuem atividades citotóxicas (MacGregor et al, 1998). Acredita-se que as
células TCD4
+
, CD8
+
, Tγδ e células NKT sejam as principais responsáveis pela proteção
contra micobactérias, pois quando ativadas secretam IFN-γ o qual tem papel fundamental
na ativação de macrófagos, que são descritas como as principais células efetoras da resposta
imune contra micobactérias (Holland 1995; Dorman & Holland 1998; Liu 2003).
Durante infecções micobacterianas são ativadas populações celulares: IFN-γ e IL-17
positivas. Enquanto os linfócitos T IFN-γ
+
atuam na ativação do macrófago e na formação
do granuloma, as células IL-17
+
regulam as atividades dos mesmos, além de induzir a
migração de neutrófilos. Foi demonstrado nas infecções micobacterianas, que tanto em
humanos quanto em camundongos, as principais células produtoras de IL-17 são linfócitos
Tγδ (Cruz et al, 2006; Lockhart et al, 2006; Peng et al, 2008). As células IL-17
+
atuam
20
principalmente induzindo a produção de: CXC, IL-6, IL-8. GM-CSF e TNF (Jovanovic et
al, 1998; Shwarzenberger et al, 2000).
Depois de ativados, os neutrófilos fagocitam as micobactérias que, assim como nos
macrófagos, as micobactérias podem inibir a fusão do fagossoma com o lisossoma (Neufert
et al, 2001). Mesmo não sendo capazes de formar o fagolisossoma, os neutrófilos são
capazes de produzir e liberar moléculas bactericidas no sítio da infecção (Sharma et al,
2000), promovendo assim a morte das micobactérias (Kisich et al, 2002). Algumas destas
moléculas bactericidas podem ser os peptídeos secretados por neutrófilos, por exemplo: α-
defensinas (HPNs) 1-3, catelicidinas e um terceiro peptídeo lipocalina dois, que se liga aos
siderofóros micobacterianos solúveis impendindo a captação de ferro pela bactéria
(Kasahara et al, 1998; Martineau et al, 2007).
Os linfócitos CD4
+
Th2 numa fase crônica de infecção por M. tuberculosis
produzem citocinas (IL-4, IL-10 entre outras) que ativam a resposta imune humoral, com o
aumento de linfócitos B (LB) e a produção de anticorpos estabelecendo assim uma resposta
humoral (Burrells et al, 1999; Ostrowski et al 2003; Langelaar et al, 2005).
Com relação à resposta imune induzida por MA em camundongos, Ordway et al
(2008) demonstraram que a resposta imune do camundongo C57BL/6 está relacionada à via
de inoculação e quantidade de bactéria, e que as células T CD4
+
, T CD8
+
e células NK são
importantes populações celulares no controle da infecção com M. abscessus. Os autores
demonstraram que camundongos C57BL/6 e com deficiência de leptina, infectados com
21
baixa dose de M. abscessus, via aerossol não desenvolviam infecção. No entanto, quando
desafiados com alta dose de M. abscessus, via aerossol camundongos C57BL/6 e com
deficiência de leptina desenvolviam infecção, que envolvia o influxo de células TCD4
+
IFN-γ
+
para os pulmões, embora a eliminação da bactéria fosse mais demorada nos
camundongos deficientes em leptina. Mostraram ainda que, em contraste, aos camundongos
C57BL/6 e com deficiência de leptina, camundongos IFN-γ ”knockout” desafiados com
baixa e alta dose de bactéria desenvolviam infecção pulmonar progressiva, apesar de um
alto influxo de células T, macrófagos e células dendríticas. E quando camundongos IFN-γ
”knockout” eram desafiados com alta dose de bactéria surgiam nos pulmões células TCD4
+
produzindo IL-10 e IL-4.
Para o nosso conhecimento não existe na literatura, trabalhos que descrevam a
resposta imune induzida na infecção por Mycobacterium massiliense.
22
2 – Justificativa
Conforme demonstrado a resposta imune a infecções micobacterianas envolve
vários aspectos inerentes tanto ao microrganismo quanto ao hospedeiro. No caso de
micobactérias atípicas a infecção humana ocorre principalmente em indivíduos
imunocomprometidos. O surto ocorrido na Cidade de Goiânia envolveu indivíduos
saudáveis, que após cirurgias apresentaram lesões com presença de abscesso decorrentes de
infecção por Mycobacterium massiliense. Então, diante destes fatos, justifica-se avaliar a
patogenicidade de um isolado clínico, para analisar a virulência do microrganismo e sua
capacidade de infectar um hospedeiro imunocompetente.
23
3 – Objetivos
3.1 Objetivo Geral:
Avaliar a resposta imunológica aguda de camundongos C57BL/6 e BALB/c após
infecção com M. massiliense por via intravenosa.
3.2 Objetivos Específicos:
Analisar a virulência de M. massiliense em modelos murinos através da contagem
de unidades formadoras de colônias do baço de animais infectados;
Quantificar os anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para antígenos de M.
massiliense no soro de animais infectados;
Determinar os níveis de citocinas inflamatórias e antiinflamatórias produzidas pelas
células do baço após infecção com M. massiliense;
Avaliar a produção de óxido nítrico produzidos por macrófagos peritoneais
infectados “in vitro” com M. massiliense.
24
4 – Material e Métodos
4.1 Animais e divisão dos grupos experimentais
O estudo foi realizado em camundongos C57BL/6 e BALB/c, proveniente do
biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG, divididos em grupos de
cinco em gaiolas com água e dieta ad libitum. Grupo I (n=20) camundongos C57BL/6 .
Grupo II (n=20) camundongos BALB/c, fêmeas, com idade entre 4-8 semanas. Os
resultados representam três experimentos independentes.
4.2 Isolados de Micobactérias atípicas.
Foram caracterizados 18 isolados clínicos de infecções pós-cirúrgicas, recebidas
pelo LACEN-GO, de diferentes laboratórios e hospitais, entre Maio e Dezembro de 2006,
na cidade de Goiânia-Go. Estes isolados clínicos foram caracterizados como sendo
micobactérias de crescimento rápido e identificados como sendo M. abscessus. Através de
estudos moleculares, inclusive com o seqüenciamento parcial do gene rpoB, concluiu-se
que os isolados pertenciam a um único clone que foram identificados como M. massiliense
(Figura 03); (Cardoso et al, 2008).
25
Figura 03. Genotipagem dos isolados clínicos por PFGE. Fonte: Cardoso et al, 2008.
Para avaliar a resposta imunológica de camundongos C57BL/6 e BALB/c foi
escolhida aleatoriamente uma amostra dos 18 isolados clínicos, a qual foi utilizada para
realização de todos os experimentos. A utilização do isolado clínico mediante assinatura de
termo de consetimento livre e esclarecido, conforme aprovado pelo CEP HC/UFG.
26
4.3 Preparação do bacilo para inoculação em animais de
laboratório.
A cepa foi cultivada em meio 7H11 enriquecido com OADC e incubada por três a
quatro dias em estufa a 37ºC. Após o crescimento bacteriano a cultura foi coletada e
ressuspendida em 5 ml de solução salina 0,9% estéril e sonicada por 3 minutos. Após
sedimentação para remoção dos grumos, a suspensão foi agitada vigorosamente, e sua
concentração foi ajustada para uma densidade óptica (OD) de 0,20 em comprimento de
onda de 625ηm. Para a determinação das unidades formadoras de colônia (UFC), alíquotas
de 100 µl foram plaqueadas no final da preparação em meio 7H11 enriquecido com OADC
e contadas após 7 dias de crescimento.
4.4 – Inoculação dos animais.
Um inóculo correspondendo a 2x10
6
bactérias em salina estéril foi utilizado.
Camundongos da linhagem C57BL/6 e BALB/c, durante os procedimentos para inoculação
de 100µL de suspensão de bactérias por via venosa ou intraperitoneal, foram manejados e
contidos de acordo com as orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório (SBCAL/COBEA). Após a inoculação, alíquotas de 100µL das suspensões
bacterianas foram plaqueadas em meio sólido 7H11 enriquecido com OADC para a
confirmação da UFC.
27
4.5 Determinação do número de unidades formadoras de colônia
(UFC).
Animais infectados foram sacrificados de acordo com os pontos experimentais e
tiveram seus baços retirados e colocados em tubos contendo 2 mL de solução salina 0,9%
estéril. Para obter uma suspensão celular, o baço foi transferido para um homogeneizador e
macerado. A partir desta suspensão celular foram feitas diluições em salina 0,9% estéril de
10, 100, 1000 e 10000 vezes. Uma alíquota de 100µL de cada diluição foi plaqueada em
meio sólido 7H11 enriquecido com OADC. As placas foram vedadas e incubadas a 37ºC
por 7 dias. Após o período de incubação as colônias foram contadas e as UFCs expressas
em Log
10
do Baço, foram determinadas após correção com as diluições e volumes
semeados.
4.6 Obtenção de Soro e sobrenadante celular.
Amostras de soro foram obtidas por punção retro-orbital, 14 dias após a infecção.
As amostras foram incubadas por uma hora a 37ºC e centrifugadas a 1200 xg, a 4ºC por 15
minutos para retração do coágulo e separação do soro, e posteriormente armazenadas a
menos 20ºC. Os níveis de anticorpos anti-proteínas de M. massiliense (IgG2a e IgG1)
foram determinados através da técnica de ELISA.
28
4.7 Ensaio Imunoenzimático (ELISA).
4.7.1 Obtenção de extrato protéico de M. massiliense.
As cepas foram inoculadas em 10 mL de caldo Muller-Hinton e após incubação por
três a quatro dias em incubadora a 37ºC com agitação, foram centrifugadas por 15 minutos
a 1200 xg a 4ºC. Após desprezar o sobrenadante, o sedimento foi ressuspendido em 5 mL
de solução salina 0,9% estéril. Para obtenção do extrato protéico a suspensão bacteriana foi
sonicada por 20 minutos seguidos de 3 minutos de incubação em gelo, foram realizados 20
ciclos, em seguida a suspensão foi centrifugada por 30 minutos a 3000 xg a 4ºC e o
sobrenadante foi filtrado em peneira de nylon 0,22 µm (Millipore
). A concentração
protéica foi determinada pelo método de Bradford (Pierce BSA Protein Assay Kit) e
armazenadas a -20ºC.
.
4.7.2 Dosagem de Anticorpos
Placas de poliestireno (Nunc) de 96 poços foram inicialmente sensibilizadas com
proteínas totais de M. massiliense (5 µg/mL) diluída em tampão carbonato / bicarbonato de
sódio 0,05M (pH 9,6), e incubadas a 4ºC por 16 horas. Posteriormente a placa foi lavada e
incubada por uma hora a 37ºC com tampão carbonato de sódio (PBS) 1X contendo 1%
gelatina. A essa etapa seguiu-se a adição das amostras, incubando-se por 1 hora a 37ºC. Os
anticorpos conjugados à biotina, diluídos a 1:5000, foram adicionados: anti-IgG1 e anti-
IgG2a de camundongo (Pharmingen). As placas foram incubadas por 1 hora a 37ºC. Foi
29
adicionada estreptoavidina peroxidase, diluída a 1:1000 foi adicionada e as placas foram
novamente incubadas por 1 hora a 37ºC. A reação foi então revelada com o substrato orto-
fenilenodiamina (OPD) e bloqueada adicionando-se ácido sulfúrico a 4N. A leitura da
absorbância foi realiza em 492 ηm em leitor de ELISA (Multiskan Thermo Labsystems
).
Entre cada uma das etapas, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS 1X Tween 20-
0,05%.
4.8 Obtenção de RNA total
Ácidos ribonucléicos (RNA) do baço foram obtidos utilizando reagente TRIZOL
®
.
Foi usado 1 mL de TRIZOL
®
para cada 300 µg de tecido. As amostras de tecido foram
colocadas diretamente no TRIZOL
®
e armazenadas a – 70ºC. Para proceder à extração do
RNA total as amostras foram descongeladas e maceradas com nitrogênio para lise celular.
Então foram homogeneizadas incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente (TA) para
completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas.
Adicionou-se 200 µL
de clorofórmio para cada mL de TRIZOL
®
e o material foi
agitado vigorosamente por 15 segundos e incubados por 10 minutos a TA. As amostras
foram centrifugadas a 11000 xg, a 4ºC durante 10 minutos. Após a centrifugação a fase
aquosa foi cuidadosamente recuperada, transferida para um novo tubo e o RNA foi
precipitado pela adição de 500 µL de isopropanol. Após 10 minutos a -20ºC, o material foi
centrifugado a 11000 xg, a 4ºC durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e 1 mL
30
de etanol a 70% gelado foi adicionado ao sedimento. A amostra foi homogeneizada e
centrifugada a 7500 xg, a 4ºC durante 5 minutos. O precipitado foi ressuspendido em 30 µL
de água milli-Q livre de RNAse e DNAse.
4.8.1 Quantificação de RNA total
As amostras de RNA total obtidas foram diluídas 250 vezes em água Milli-Q e
analisadas por espectrofotometria para quantificação e determinação da razão
RNA/proteína (r=A260/A280).
4.9 Síntese de cDNA pelo método de transcrição reversa.
A síntese de DNA complementar (cDNA) a partir do volume de 10µl (2µg aprox.)
do RNA total foi realizada pelo método de transcrição reversa (RT) utilizando a enzima
transcriptase reversa. A reação foi feita em volume final de 20µl na presença dos seguintes
reagentes: 0,8µl de dNTP mix 100nM (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), 2µl de tampão de
reação 10x (Tris-HCl 100nM, KCl 150mM e MgCl 6mM), 2µl do oligonucleotídeo
iniciador randômico Oligo dT, 1µl da enzima transcriptase reversa MultiScrib
TM
50U/µl
(Kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription – Applied Biosystems) e 10µl de
RNA
total
. A amostra foi homogeneizada por pipetagem, evitando a formação de bolhas.
31
A reação de transcrição reversa foi realizada no termociclador com as seguintes
etapas: ativação 25ºC, 10 min; síntese, 37ºC, 120 min; inativação, 85ºC, 5 seg;
resfriamento, 4ºC, ∞. Após a reação de transcrição reversa, as amostras de cDNA foram
conservadas a -20ºC até o uso.
4.10 Ensaios de expressão gênica através da reação de
polimerase em cadeia em tempo real
Na tabela 01 encontram-se os oligonucleotídeo iniciador para as citocinas IL-12, IL-
17, TNF-α, iNOS, IFN-γ, IL-10, IL-4 e TGF-β utilizados na reação de polimerase em
cadeia quantitativo em Tempo Real (qRT_PCR).
Foi feita padronização prévia dos oligonucleotídeo iniciador, utilizando ensaios
como Curva de Diluição do Oligonucleotídeo iniciador, para conhecer a concentração ideal
de reação de cada oligonucleotídeo iniciador com cDNA em uma concentração fixa, e
Eficiência do Oligonucleotídeo iniciador, a fim de avaliar a eficiência da amplificação do
cDNA em diferentes concentrações.
Para iniciar a PCR foi preparado um Master Mix contendo, a Taq DNA polimerase,
tampão de reação, dNTP mix, SYBR Green I dye e MgCl
2
. Para o preparo do Mix para a
reação foram adicionados no capilar de vidro: 5µl de H
2
O RNAse free, 1µl de cada
oligonucleotídeo iniciador (sense e antisense), 2µl do Master Mix e 1µl de cDNA (na
32
concentração de 360ηg de cDNA
total
). O capilar, então, foi fechado e centrifugado, a fim de
concentrar a solução da amostra no fundo da coluna de vidro. Estes procedimentos foram
realizados em gelo.
O programa empregado para a amplificação iniciava com uma incubação por 10min
a 95°C, seguidos de 40 ciclos de incubação para desnaturação por 10 seg a 95°C,
anelamento com temperatura 5ºC abaixo da temperatura de desnaturação característico de
cada oligonucleotídeo iniciador (tabela 01) e extensão a 72°C, com o tempo de extensão
baseado na equação Te=[(C+G)x4s]/25. A fluorescência do reagente “SYBR Green”
emitida à medida que a polimerização do cDNA específico era realizada, foi capturada
empregando o aparelho LightCycler 1.0 (ROCHE). A especificidade da amplificação foi
determinada através da análise das curvas de amplificação e dissociação na altura do
crossing point (Cp), geradas pelo próprio programa. O cálculo da expressão relativa dos
produtos amplificados para cada gene foi realizada empregando o gene da β-actina como
gene referencial (gene de expressão constitutiva: β-actina), através do método do
Ratio=E
target
∆CP
/E
ref
∆CP
(Pfaffl, 2001; Pfaffl et al, 2002). As seqüências dos oligonucleotídeo
iniciador desenhados e as características do amplicon estão detalhadas na Tabela 1.
33
Tabela 1. Genes analisados por qRT-PCR. A tabela mostra a seqüência dos
oligonucleotídeos iniciadores desenhados.
Gene GeneBank Sequência Oligonucleotídeo iniciador
T°
°°
°A Tm°
°°
°
Teº
Pb
β-actina
095208
S: GACGGCCAGGTCATCACTAT
AS: ATGCCACAGGATTCCATACC
54 59 3 92
IL12 008351
S:CCACTGGAACTACACAAGAACG
AS: GCACAGGGTCATCATCAAAG
55 59 4
11
1
IL17 43088
S: AACATGAGTCCAGGGAGAGC
AS: GCTGAGCTTTGAGGGATGAT
54 59 4
10
4
TNF-α
013693
S: ATGGCCTCCCTCTCATCAGT
AS: CACTTGGTGGTTTGCTACGA
54 59 4
10
7
iNOS 010927
S: TCAAGTGGCATAGATGTGGAAG
AS:TGGGTCCTCTGGTCAAACTC
54 59 4
10
1
IFN- 1809553
S: CAAGTGGCATAGATGTGGAAG
AS: TGGCTCTGCAGGATTTTCAT
55 60 3 92
IL10 010548
S: TCAGCCAGGTGAAGACTTTCT
AS: TCATTTCCGATAAGGCTTGG
54 59 4
11
7
IL4 021283
S: GCAACGAAGAACACCACAGA
AS: CTGCAGCTCCATGAGAACAC
54 59 5
12
6
TGF-β 011577
S: GCTGAACCAAGGAGACGGAAT
AS:GCTGATCCCGTTGATTTCCA
53 58 4
10
0
G.I.=número de acceso ao “GeneBank”; S=”oligonucleotídeo iniciador” senso 5’-3’;
AS:”oligonucleotídeo iniciador” antisenso 5’-3’; T°A=Temperatura da anelamento da
reação; Tm=Temperatura melting; Te=Tempo de extensão; Pb=Tamanho do amplicon em
pares de bases
.
4.11 Obtenção de macrófagos peritoneais de camundongos.
Os camundongos foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical, e feito
uma anti-sepsia do camundongo com álcool 70%. Os procedimentos seguintes foram
34
realizados em câmara de fluxo laminar. Para obtenção dos macrófagos dos camundongos,
utilizou-se seringa e agulha descartáveis e esterilizadas, introduziu-se na cavidade
abdominal 5,0ml de solução salina 0,9% estéril e gelada. Após massagem da cavidade
abdominal, o conteúdo foi recuperado com seringa e agulha, e transferido para tubo de
centrífuga, esterilizado, com capacidade para 15 ml. O lavado peritoneal de cada animal,
foi centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos a 4ºC. Após o desprezo do sobrenadante, 1 mL
de solução de lise de hemácias foi acrescentada e incubada por 5 minutos a temperatura
ambiente, completou-se o volume para 10 mL com solução salina 0,9% estéril feita nova
homogeneização e centrifugação a 1500 rpm por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
desprezado e as células ressuspensas em 1 ml de meio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis,
USA), contendo 100U/ml de penicilina (Sigma), 100 µg/ ml de estreptomicina (Sigma),
2µg de L-glutamina (Sigma) e 5,0% de soro fetal bovino A contagem das células foi
realizada em câmara de Neubauer, para obtenção de uma concentração de 1x10
6
células/mL.
4.12 Cultura de macrófagos
Alíquotas de 100µl da suspensão contendo as células na concentração de 1x10
6
células/mL foram colocadas em placa de cultura de tecido estéreis com 96 poços (Corning,
New York 14831, USA) fez-se incubação por 2 horas, a 37ºC, em 5% de CO
2
, retirou 90µl
do sobrenadante, adicionando imediatamente 90µl de meio RPMI completo. Em seguida
adicionou-se 100 µl de solução de bactérias contendo 1x10
6
bacilos viáveis à placa de
cultura e incubou-se por 48 horas, a 37ºC, em 5% de CO
2
.
35
4.13 Dosagem de Óxido Nítrico.
Após estimulação dos macrófagos com M. massiliense por 48hs, 50µl do
sobrenadante da cultura de células foram removidos e colocados em outra placa de 96
poços (Corning, New York 14831, USA), para quantificação do produto de oxidação
estável do óxido nítrico o nitrito. A concentração de nitrito (NO
2
-
) foi mensurada pelo
método colorimétrico de Griess (Green et al, 1982), por comparação com uma curva
padrão contendo diluições seriadas de solução de nitrato de sódio (NaNO
2
) em
duplicatas de 50 µL em placa de 96 poços (Corning, New York 14831, USA). A
revelação foi feita através da adição de solução de Greiss (1:1) contendo 50 µL
sulfanilamida a 1% e 50 µL N.naftil-etilenodiamina a 0,1% em ácido fosfórico a 2,5%.
Após dez minutos à temperatura ambiente, procedeu-se à determinação da concentração
de óxido nítrico utilizando um leitor ELISA (Multiskan Thermo Labsystems
)
automático com um filtro de 595 nanômetros.
4.14 Análise Estatística
Nos casos com distribuição normal foram utilizados testes paramétricos, na
comparação entre dois grupos, o teste "t" de Student. Nos outros casos foram utilizados
testes não-paramétricos, na comparação entre dois grupos, o teste de Mann-Whitney.
36
As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando a
probabilidade de rejeição da hipótese de nulidade foi menor que 5%.
37
5 – RESULTADOS
5.1 Avaliação da virulência em camundongos.
Inicialmente foi analisada a virulência, comparando diferentes vias de inoculação,
através da recuperação de bactérias viáveis a partir dos baços de camundongos C57BL/6.
Os resultados expressos na Figura 04 mostram as unidades formadoras de colônia de
bactérias recuperadas do baço, comparando-se a via intraperitoneal (I.P.) e a via
intravenosa (I.V.). A carga bacteriana foi de 4,75±0,09 Log
10
quando inoculada por I.V. e
de 3,01±0,04 Log
10
quando inoculado I.P após um dia de infecção. A partir do 3º dia a UFC
em ambas as vias de inoculação foram decrescendo regularmente até o 14º dia (3,38±0,03
Log
10
por via I.V. e 2,24±0,1 Log
10
por via I.P). Em todos os pontos experimentais a via
intravenosa apresentou maior número de UFCs (p<0,05).
Figura 4. Determinação de unidades formadoras de colônias do baço
de camundongos C57BL/6 após 1, 3, 7, 14 e 21 dias de inoculação
via intraperitoneal e intravenosa com 10
6
bacilos viáveis de M.
massiliense.∗ p<0,05.
38
Utilizando a via intravenosa para comparar a virulência de Mycobacterium
massiliense em camundongos BALB/c e C57BL/6, as unidades formadoras de colônias
foram determinadas no baço. Após um dia de infecção, os baços apresentaran
respectivamente: 5,74±0,01 e 5,61±0,01 Log
10,
para BALB/c e para C57BL/6. No 3º dia
foram recuperados no baço 5,65 ±0,01 Log
10
em camudongos BALB/c e 5,53±0,005 Log
10
em camundongos C57BL/6. No 7º dia foram recuperados no baço 5,80±0,005 Log
10
em
camudongos BALB/c e 5,61±0,0 Log
10
em camundongos C57BL/6. No 14º dia foram
recuperados no baço 4,78±0,02 Log
10
em camudongos BALB/c e 4,39±0,01 Log
10
em
camundongos C57BL/6. Com 30 dias após a infecção os baços apresentaram
respectivamente: 0,5±0,02 Log
10
em camundongos
BALB/c e 0,3±0,01 Log
10
em
camundongos C57BL/6. Os camundongos BALB/c apresentaram durante o período
estudado maior número de bactérias viáveis no baço do que os camundongos C57BL/6
(p<0,05).
Figura 5. Determinação de unidades formadoras de colônias do baço de
camundongos C57BL/6 e BALB/c após 1, 3, 7, 14 e 30 dias de inoculação via
intravenosa com 10
6
bacilos viáveis do isolado clínico dois de M. massilienses. ∗ p<
0,05
0 5 10 15 20 25 30
0
1
2
3
4
5
6
7
8
BALB/c
C57BL/6
Dias após infecção
Log
10
CFU / Baço
∗
∗
∗
∗
39
5.2 Avaliação da resposta imune específica.
A resposta imune humoral foi caracterizada avaliando-se os níveis séricos de
imunoglobulinas IgG1 e IgG2a específicas para o extrato protéico de micobactérias
atípicas. Os níveis de IgG1 em camundongos BALB/c foram maiores que nos
camundongos C57BL/6 após quatorze dias de infecção (OD=1,394±0,01; e
OD=0,693±0,008, respectivamente, p=0,001). As duas linhagens de camundongos
apresentaram níveis séricos tanto de IgG1 e de IgG2a maiores que o controle (0,072±0,03)
foi observada diferença estatística significante (p<0,05). Em relação a IgG2a tanto os
camundongos BALB/c quanto os camundongos C57BL/6 apresentaram níveis similares
(BALB/c = 0,576±0,2; C57BL/6 = 0,436±0,08) (Figura 6).
Figura 6. Detecção de IgG1 e IgG2a específicos anti-extrato protéico
de M. massiliense no soro de camundongos BALB/c e C57BL/6 após
14 dias de infecção com M. massilienses. (∗ p< 0,05).
40
Para avaliar a capacidade funcional das células do baço em produzir citocinas em
resposta à inoculação com 10
6
bacilos procedemos a PCR em tempo real. Observou-se
entre as linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6 um perfil misto (Th1 e Th2) na
produção de citocinas (Figura 7).
As citocinas e quimiocinas induzidas no baço foram determinadas durante a fase
aguda da infecção. No terceiro dia após a infecção, tanto em camundongos BALB/c quanto
em C57BL/6, foi possível detectar a presença de mRNA para IL-17, TGF-β, TNF-α, IL-10,
sem distinção entre as linhagens de camundongos. O nível relativo de IFN-γ e iNOS foram
maiores nos camundongos C57BL/6 que nos camundongos BALB/c (p=0,001). Já para IL-
12 os níveis de mRNA foram maiores nos camundongos BALB/c que nos camundongos
C57Bl/6. (p=0, 001). Foi interessante notar que para a IL-4, os camundongos C57BL/6
apresentaram os maiores níveis de mRNA (BALB/c = 0,346±0,04; C57BL/6 = 1,205±0,11;
p = 0,005).
No sétimo dia após a infecção observou-se os maiores níveis de mRNA do
experimento, onde os camundongos C57BL/6 ultrapassavam dez mil unidades relativas
para IFN-γ, seguidos dos níveis relativos de IL-4 e iNOS. Os níveis relativos de mRNA
para IL-17 triplicaram nesses camundongos. Os camundongos BALB/c apresentaram no
baço baixos níveis de mRNA para as citocinas neste período.(p = 0,0001).
No décimo quarto dia de infecção, no baço dos camundongos BALB/c detectou-se
altos níveis de mRNA para IL-12 quando comparados as outras citocinas, e aos baços dos
41
camundongos C57BL/6 infectados (p=0,001; p = 0,007). Nesta fase observou-se no baço
dos camundongos BALB/c, níveis maiores de todas as citocinas testadas do que aos três
dias de infecção (p=0,01).
42
Figura 7: Expressão de mRNA de citocinas em relação a expressão de mRNA de β-actina
em camundongos BALB/c e C57BL/6 após 3, 7 e 14 dias infecção com 10
6
bacilos viáveis
de M. massilienses (∗ p < 0,05).
43
5.3 Avaliação da produção de Óxido Nítrico
Macrófagos peritoneais de camundongos foram estimulados com M. massiliense e
depois de 48 horas de cultura o NO foi quantificado. Macrófagos de camundongos BALB/c
e C57BL/6 controles e infectados “in vitro” com M. massiliense produziram NO (0,73±0,
005 e 2,51±0, 007; p = 0,01), respectivamente (Figura 8). A quantidade de NO produzida
pelos macrófagos peritoneais também foi avaliada após a infecção com M. massiliense, e
cultivo por 48 horas na presença de M. massiliense. Tanto camundongos BALB/c quanto
camundongos C57BL/6 dobraram a quantidade de NO produzida pelos macrófagos
peritoneias em relação à produção de NO produzida pelas células dos animais controles, um
dia após a infecção (BALB/c=3,88±0,03; C57BL/6=5,75±0,005).
44
Figura 8. Produção de Óxido Nítrico (NO) por macrófagos peritoneais de camundongos
BALB/c e C57BL/6 após estimulação com M. massaliense.
∗
p=0,01 quando comparado a
produção de NO entre as linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6. ∗ p< 0,05 quando
comparada a produção de NO pela linhagem de camundongo BALB/c e C57BL/6, entre os
camundongos controles (sem infecção) com camundongos após a infecção. MA:
Micobactéria Atípica; LPS: Lipopolissacárides; Meio: Meio RPMI completo.
45
6 – Discussão
O presente trabalho apresentou o perfil da resposta imune frente à infecção
intravenosa com M. massiliense em camundongos BALB/c e C57BL/6. Os resultados
mostraram que a infecção via intravenosa apresentava maior quantidade de bactérias que a
infecção por via intraperitoneal e devido a isto a via intravenosa foi utilizada para avaliação
da virulência. Outros trabalhos, utilizando diferentes espécies de micobactérias, também
demonstraram a importância da via de inoculação no estabelecimento da infecção e na
indução da resposta imune (Lyons & Byrd, 1999; Roupie et al, 2008).
Também demonstrou-se que os camundongos da linhagem C57BL/6 controlavam
melhor a carga bacteriana no baço que os camundongos BALB/c. No entanto, apesar da
redução da UFC no baço ser estatisticamente significante, esta diferença não refletiu em
resistência à infecção, pois as duas linhagens controlaram o crescimento bacteriano no
período estudado.
Rottman et al.(2007) demonstraram que micobactérias atípicas como o M. abscessus
e o M. chelonae quando inoculados por via intravenosa em camundongos C57BL/6
apresentavam perfil de recuperação de bactérias viáveis no baço próximo ao encontrado no
presente trabalho. Vários trabalhos mostram que a via de inoculação pode interferir
diretamente com a patogenicidade da micobactéria, Cardona et al (1999) e Ordway et al
(2008) sugeriram que a patogenicidade do agente apresenta uma relação inversa a indução
da resposta imune. Portanto, a via intravenosa induziria uma rápida resposta imune que
eliminaria o agente infeccioso de forma mais eficaz.
46
A resposta imune humoral apesar de não desempenhar papel fundamental na defesa
do hospedeiro frente às infecções por micobactérias exerce uma função auxiliar no
clearance dos microrganismos. Ao avaliar os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a contra M.
massiliense, observou-se um predomínio de IgG1 (Figura 5), anticorpos correlacionados ao
padrão Th2 de resposta imune. Na fase aguda da infecção murina por M. massiliense, a
resposta imune do tipo Th2 contribuiu para a proteção dos camundongos, uma vez que a
carga bacteriana diminuiu com 30 dias de infecção. Bai et al. (2008), Wang et al. (2008),
embora avaliando candidatos a vacina para M. tuberculosis, também demonstraram que
após 2 semanas da estimulação com antígenos micobacterianos, os camundongos
apresentavam altos níveis de IgG específicas, que se mantinham após o desafio.
A presença de citocinas tem papel no recrutamento e ativação de células durante
reações inflamatórias às infecções micobacterianas. No presente estudo foi detectada a
expressão relativa de citocinas nas células do baço de camundongos infectados com M.
massiliense durante a fase aguda da infecção. Nos camundongos C57BL/6 observou-se no
baço, precocemente (aos 3 dias de infecção), altos níveis de IL-12, TNF-α, iNOS, IL-4, IL-
17 e IL-10, enquanto que em camundongos BALB/c notou-se esta indução mais
tardiamente (7 dias após a infecção).
Apesar de não haver muitos trabalhos caracterizando a resposta imune para
infecções experimentais por micobactérias atípicas, a resposta elucidada por estes agentes
se assemelha à tuberculose, onde de acordo com Orme & Cooper (1998) citocinas do tipo
Th1 desempenham um papel importante na proteção. Em um dos trabalhos com
47
micobacterias atípicas Rottman et al (2007) demonstraram a participação e a importância
dos linfócitos TCD4
+
e TCD8
+
e das citocinas IFN-γ e TNF-α na infecção murina por M.
abscessus e M. chelonae. Ordway et al (2008) também demonstrou que células T CD25
+
INF-γ
+
expressando CD4 ou CD8 e células NKT estão envolvidas no controle e eliminação
de infecção por M. abscessus.
No presente estudo observou-se que os níves de citocinas do perfil Th1 como IL-12,
iNOS aumentaram com o decorrer da infecção podendo estar relacionados ao controle da
micobactéria. Cooper et al. (2002) mostraram que o aumento na secreção de IL-12 em
camundongos C57BL/6 é fundamental para o controle da infecção por M. tuberculosis e
uma vez que esta citocina ativa células NK, células TCD4
+
e TCD8
+
para produzirem IFN-
γ, conferem resistência frente a infecções por micobactérias pela ativação secundária dos
macrófagos, as células efetoras principais.
A indução de mRNA para IL-10 foi semelhante em todo o período estudado, o que
pode explicar a susceptibilidade a infecção por M. massiliense. Junqueira-Kipnis et al,
(2005) demonstraram que, quando camundongos BALB/c são infectados com M.
tuberculosis observa-se a secreção de IL-10 e esta relaciona-se com a susceptibilidade na
fase inicial da infecção. Esta susceptibilidade deve-se a inibição da ativação de macrófagos,
o que contribuiu para um aumento da carga bacteriana no início da infecção, não
influenciando, no entanto, na evolução da doença. Sullivan et al, (2005) e Beamer et al,
(2008), entretanto, relacionam a IL-10 com a reativação de infecção por M. tuberculosis na
fase crônica.
48
A principal citocina produzida pelos animais com três dias de infecção foi a IL-17.
Cruz et al, (2006) observaram que camundongos C57BL/6 IFN-γ “knockout” quando
infectados via IV com BCG, apresentaram células T que secretaram IL-17 que foram
responsáveis pela infiltração neutrófílica. Neste trabalho não observou alterações
histopatológicas no baço que pudessem ser correlacionadas com o aumento da secreção de
IL-17 (dados não mostrados). No entanto não podemos descartar esta hipótese uma vez que
bacilos álcool-ácido resistentes foram observados, mas de maneira difusa neste órgão
linfóide (polpa vermelha, dados não mostrados).
Segundo Davis et al. (2007) o NO é um poderoso mecanismo de defesa
antimicobacteriana. Foi avaliado os níveis de NO liberado pelos macrófagos após o desafio.
Observou-se que os macrófagos das duas linhagens de camundongos produziram NO de
maneira similar e que após a infecção dos camundongos por via IV estes animais dobraram
a produção de NO. De acordo com Neufert et al. (2001) este aumento na produção de NO
pelos macrófagos peritoneais dos animais previamente infectados, talvez seja devido à
ativação prévia dos mesmos através de TLR2 por lipopeptídeos bacterianos como a
lipoproteína de 19 kDa. Estas lipoproteínas são capazes de induzir iNOS e
consequentemente a produção de NO nos macrófagos. Em consonância com a idéia de que
NO é fundamental na eliminação de micobactérias, MacMicking et al. (1997) e Darwin et
al. (2003) demonstraram que camundongos com deleção de NOS2
-
/
-
são mais susceptíveis
as infecções por M. tuberculosis e de acordo com Chan et al. (1995) a inibição da produção
de NO também induz aumento exponencial na carga bacteriana .
49
7 – Conclusões:
7.1 Conclusão Geral:
O isolado de M. massiliense utilizado neste estudo foi capaz de infectar
camundongos imunocompetentes, que controlaram completamente a carga
bacteriana antes dos 30 dias de infecção. Os mecanismos pelos quais estes
animais eliminaram as micobactérias foram: produção de NO por
macrófagos peritoneais, presença de IgG1 específica e indução de mRNA
para citocinas inflamatórias, assim como de citocinas reguladoras da
inflamação.
7.2 Conclusões Específicas:
O isolado clínico analisado apresentou alta infectividade e baixa virulência
em ambas as linhagens de camundongos.
A infecção induziu maiores níveis dos anticorpos da classe IgG1 específicos
para M. massiliense do que anticorpos da classe IgG2a tanto para os
camundongos BALB/c quanto para os camundongos C57BL/6.
Independente da linhagem de camundongo aos três dias após a infecção
houve indução de mRNA para IL-17 A infecção de camundongos C57BL/6
induziu aumento dos níveis relativos de mRNA de todas as citocinas
inflamatórias avaliadas aos três dias de infecção, com predomínio de IFN-γ.
50
Camundongos BALB/c quando infectados produziram principalmente IL-12
e somente aos quatorze dias de infecção.
A maior produção de NO pelos macrófagos peritoneais de camundongos
BALB/c e C57BL/6 foi observada após um dia de infecção.
51
8 - Referências Bibliográficas
Abel B, Thieblemont N, Quesniaux VJ, Brown N, Mpagi J, Miyake K, Bihl F & Ryffel B.
2002. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium
tuberculosis infection in mice. J Immunol. Sep 15;169(6):3155-62.
Adékambi T, Reynaud-Gaubert M, Greub G, Gevaudan MJ, La Scola B, Raoult D &
Drancourt M. 2004. Amoebal Coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the
Sputum of a Patient with Hemoptoic Pneumonia. J Clin Microbiol. Dec; 42(12): 5493–
5501.
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) 2007. Disponível em
http://www.anvisa.gov.br/divulga/informes/2007/070307.htm, acessado em 26 de
dezembro de 2007.
Anank PK & Kaul D. 2005. Downregulation of TACO gene transcription restricts
mycobacterial entry/survival within human macrophages. FEMS Microbiol Lett. Sep
1;250(1):137-44.
Bai Y, Xue Y, Gao H, Wang L, Ding T, Bai W, Fan A, Zhang J, An Q & Xu Z. 2008.
Expression and purification of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and MPT64 fusion
protein and its immunoprophylactic potential in mouse model. Protein Expression and
Purification 59: 189–196.
52
Bange FC, Brown BA, Smaczny C, Wallace-Jr RJ & Bottger FC. 2001. Lack of
transmission of Mycobacterium abscessus among patients with cystic fibrosis attending a
single clinic. Clin. Infect. Dis. 32:1648–1650.
Barrow WW & Brennan PJ. 1982. Isolation in high frequency of roughvariants of
Mycobacterium intracellulare lacking C-mycoside glycopeptidolipid antigens. J. Bacteriol.
150:381–384.
Beamer GL, Flaherty DK, Assogba BD, Stromberg P, Gonzalez-Juarrero M, de Waal
Malefyt R, Vesosky B & Turner J. 2008. Interleukin-10 promotes Mycobacterium
tuberculosis disease progression in CBA/J mice. J Immunol. 15;181(8):5545-50.
Beckman IS & Koppenol WH. 1996. Nitric oxide, superoxide, and peroxinitrite: the good,
the bad, and the ugly. Am. J. Physiol., 271:C1424-37.
Belisle JT, McNeil MR, Chatterjee D, Inamine JM & Brennan PJ.1993. Expression of the
core lipopeptide of the glycopeptidolipid surface antigens in rough mutants of
Mycobacterium avium. J. Biol. Chem. 268: 10510–10516.
Boehm U, Klamp T, Groot M & Howard JC. 1997. Cellular response to interferon-γ, Annu
Review Immunology: 15:749-795
53
Brennan PJ. 2003. The Emb proteins of mycobacteria direct arabinosylation of
lipoarabinomannan and arabinogalactan via an N-terminal recognition region and a C-
terminal synthetic region. Mol Microbiol. 50(1):69-76.
Brown-Elliott BA, Griffith DE & Wallace RJ. 2002. Newly described emerging human
species of nontuberculosus mycobacteria. Infect Dis Clin N Am. 16:187-220.
Brown-Elliott BA & Wallace RJ Jr. 2002. Clinical and taxonomic status of pathogenic
nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clin Microbiol Rev.
15(4): 716-46.
Burrells C, Clarke CJ, Colston A, Kay JM, Porter J, Little D & Sharp JM. 1999. Interferon-
gamma and interleukin-2 release by lymphocytes derived from the blood, mesenteric lymph
nodes and intestines of normal sheep and those affected with paratuberculosis (Johne's
disease). Vet.Immunol.Immunopathol. 68:139-48.
Byrd TF & Lyons CR. 1999. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus
mutant in human and murine models of infection. Infect Immun 67(9):4700.
Cardona PJ, Cooper A, Luqui M, Ariza A, Filipos , Orme IM & Ausuna V. 1999. The
intravenous model of murine tuberculosis is less pathogenic than the aerogenic model
owing to a more rapid induction of systemic immunity. Scand. J. Immunol. 49,362-366
54
Cardoso AM, Sousa EM, Viana-Niero C, Bortoli FB, Neves ZCP, Leão SC, Junqueira-
Kipnis AP & Kipnis A. 2008. Emergence of nosocomial Mycobacterium massiliense
infection in Goiás, Brazil. Microbes and Infection. Nov-Dec; 10(14-15):1552-7.
Casal M & Picazzo JJ. 1999. Procedimientos en microbiologia clínica. Recomendacion de
la Sociedad Española de Enfermidades Infecciosas y Microbiologia Clinica.
Catherinot E, Clarissou J, Etienne G, Ripoll F, Emile J-F, Daffé M, Perronne C, Soudais C,
Gaillard JL & Rottman M. 2007. Hypervirulence of a Rough Variant of the Mycobacterium
abscessus Type Strain. Infection and Immunity, 1055–1058.
Chan J, Tanaka K, Carroll D, Flynn J & Bloom BR. 1995. Effects of nitric oxide synthase
inhibitors on murine infection with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun.
Feb;63(2):736-40
Chiodini RJ & Davis W. 1992. The cellular immunology of bovine paratuberculosis: the
predominant response is mediated by cytotoxic gamma/delta T lymphocytes wich prevent
CD4+ activity. Microb. Pathog,.13:447-63.
Cooper AM, Dalton DK, Stewart TA, Griffin JP, Russell DG & Orme IM. 1993.
Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. Dec
1;178(6):2243-7 .
55
Cooper AM, Kipnis A, Turner J, Magram J, Ferrante J & Orme IM. Mice lacking bioactive
IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection
only if the IL-12 p40 subunit is present. 2002. Journal of Immunol. 168:1322-27.
Cousins DV, Bastida R, Cataldi A, Ouse V, Redrobe S, Dow S, Duignan P, Murray A,
Dupont C, Ahmed N, Collins DM, Butler WR, Dawson D, Rodriguez D, Loureiro J,
Romano MI, Alito A, Zumarraga M & Bernardelli A. 2003. Tuberculosis in seals caused by
a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii
sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 53: 1305-14.
Cruz A, Khader SA, Torrado E, Fraga A, Pearl JE, Pedrosa J, Cooper AM & Castro AG.
2006. IFN-γ regulates the induction and expasion of IL-17-producing CD4 T cells during
Mycobacterial Infection. Journal of Immunology, 177:1416-20.
Darwin KH, Ehrt S, Gutierrez-Ramos JC, Weich N & Nathan CF. 2003. The proteasome of
Mycobacterium tuberculosis is required for resistance to nitric oxide. Science.
12;302(5652):1963-6
Davidson PT. 1989. The diagnosis and management of disease caused by M. avium
complex, M. kansasii, and other mycobacteria. Clin Chest Med. 10(3):431-43.
56
Davis AS, Vergne I, Master SS, Kyei GB, Chua J & Deretic V. 2007. Mechanism of
Inducible Nitric Oxide Synthase Exclusion from Mycobacterial Phagosomes. PLoS Pathog
3(12): e186.
Dorman SE & Holland SM. 1998. Mutation in the signal-transducing chain of the
interferon-gamma receptor and susceptibility to mycobacterial infection. J Clin Invest. 1;
101(11):2364-9.
Drennan MB, Nicolle D, Quesniaux VJ, Jacobs M, Allie N, Mpagi J, Frémond C, Wagner
H, Kirschning C & Ryffel B. 2004.Toll-like receptor 2-deficient mice succumb to
Mycobacterium tuberculosis infection Am J Pathol;164(1):49-57.
Ernest, JD. 1998. Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun.:
66; 1277-81.
Eruslanov EB, Lyadova IV, Kondratieva TK, Majorov KB, Scheglov IV, Orlova MO &
Apt AS. 2005. Neutrophil responses to Mycobacterium tuberculosis Infection in genetically
susceptible and resistant mice. Infection and Immunity, 1744-1753.
Etienne GC, Villeneuva H, Billman-Jacobe C, Astarie-Dequeker MA, Dupont & M. Daffe.
2002. The impact of the absence of glycopeptidolipids on the ultrastructure, cell surface
and cell wall properties, and phagocytosis of Mycobacterium smegmatis. Microbiology
148:3089–3100.
57
Euzéby JP. List of procaryotic names with standing in nomenclature: genus
Mycobacterium. Disponível em: http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html,
Acessado em: 23 de novembro de 2006.
Falkinham JO, 1996: Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin.
Microbiol. Rev. 9, 177-215.
Fenton MJ, Vermeulen MW, Kim S, Burdick M, Strieter RM & Kornfeld H. 1997.
Induction of gamma interferon production in human alveolar macrophages by
Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun;65(12):5149-56.
Flynn JL & Chan J. 2005. What's good for the host is good for the bug. Trends Microbiol.
13(3):98-102. Review.
Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA & Bloom BR. 1993. An essential
role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp
Med 1;178(6):2249-54
Flynn JL, Goldstein MM, Chan J, Triebold KJ, Pfeffer K, Lowenstein CJ, Schreiber R,
Mak TW & Bloom BR. 1995.Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective
immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity;2(6):561-72.
Flynn JL & Chan J. 2001. Inmunology of tuberculosis. Annu Review Immunology; 19: 93-
129
58
Fossiez, F., O. Djossou, P. Chomarat, L. Flores-Romo, S. Ait-Yahia, C. Maat, J. J. Pin, P.
Garrone, E. Garcia & S. Saeland. 1996. T cell interleukin-17 induces stromal cells to
produce proinflammatory and hematopoietic cytokines. J. Exp. Med. 183: 2593–2603.
Fratti RA, Chua J & Deretic V. 2003. Mycobacterium tuberculosis glycosylated
phosphatidylinositol causes phagosome maturation arrest. Proc Natl Acad Sci U S A.
29;100(9):5437-42.
Freitas D, Alvarenga L, Sampaio J, Mannis M, Sato E, Sousa L, Vieira L, YuMC, Martins
MC, Hofling-Lima A & Belfort R Jr 2003. An outbreak of Mycobacterium chelonae
infection after LASIL. Ophtalmology, 110:276-285.
Green LC, Wagner DA, Glogwski J, Skipper PL, Wishnok JS & Tannenbaum SR. 1982.
Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal biochem, 126: 131-
138.
Griffith DE, Girard WM & Wallace RJ, Jr. 1993: Clinical features of pulmonary disease
caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. Am. Rev Respir Dis
147(5):1271.
Guidry TV, Hunter RL Jr & Actor JK. 2007. Mycobacterial glycolipid trehalose 6,6'-
dimycolate-induced hypersensitive granulomas: contribution of CD4+ lymphocytes.
Microbiology;153 (Pt 10):3360-9
59
Hance AJ, Grandchamp B & Vincent LF.1989. Detection and identification of
mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. Molecul Microbiol 1989; 3:843-49.
Happel K, Zheng E, Young LJ, Quinton E, Lockhart AJ, Ramsay JE, Shellito JR, Schurr
GJ, Bagby S, Nelson & Kolls JK. 2003. Roles of Toll-like receptor 4 and IL-23 in IL-17
expression in response to Klebsiella pneumoniae infection. J. Immunol. 170: 4432–4436.
Hector JSR, Pang Y, Mazurek GH, Zhang Y, Brown BA & Wallace-Jr RJ. 1992. Large
restriction fragment patterns of genomic Mycobacterium fortuitum DNA as strain-specific
markers and their use in epidemiologic investigation of four nosocomial outbreaks. J. Clin.
Microbiol. 30:1250–1255.
Herrman JL & Lagrange PH. 2005. Dendritic cells and Mycobacterium tuberculosis: which
is the Trojan horse? Pathol. Biol. 53: 35-40.
Hines ME, Kreeger JM & Herron AJ. 1995. Mycobacterial infections of animals: pathology
and pathogenesis. Laboratory Animal Science, 45(4):334-351.
Holland SM. 1995. Host defense against nontuberculous mycobacterial infections. Semin
Respir Infect; 11(4):217-30.
Howard ST, Byrd TF & Lyons CR. 2002. A polymorphic region in Mycobacterium
abscessus contains a novel insertion sequence element. Microbiology 148, 2987–2996.
60
Howard ST, Rhoades E, Recht J, Pang X, Alsup A, Kolter R, Lyons CR & Byrd TF. 2006.
Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus from a smooth to a rough morphotype
is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive
phenotype. Microbiology.152, 1581-1590
http://oregonstate.edu/%7Emahmudt/pictures/Mycobacterium%20cell%20envelope.jpg,
acessado em agosto de 2008.
Chan J, Tanaka K, Carroll D, Flynn J & Bloom BR. 1995. Effects of nitric oxide synthase
inhibitors on murine infection with Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63,736–
740.
Jenkins PA, Campbell IA, Banks J, Gelder CM, Prescott RJ & Smith AP. 2008.
Clarithromycin vs ciprofloxacin as adjuncts to rifampicin and ethambutol in the treatment
of Opportunist Mycobacterial pulmonary diseases and an assessment of the value of
immunotherapy with M.vaccae: a pragmatic, randomised trial by The British Thoracic
Society. Thorax. Feb 4 [Epub ahead of print]
Jovanovic DV, Di Battista JA, Martel-Pelletier J, Jolicoeur FC, He Y, Zhang M, Mineau F,
& Pelletier JP. 1998. IL-17 stimulates the production and expression of proinflammatory
cytokines, IL-1β and TNF-α, by human macrophages.J. Immunol. 160: 3513–3521.
61
Junqueira-Kipnis AP, Kipnis A, Jamieson A, Juarrero MG, Diefenbach A, Raulet DH,
Turner J & Orme IM. 2003. NK cells respond to pulmonary infection with Mycobacterium
tuberculosis, but play a minimal role in protection. J Immunol. 1;171(11):6039-45.
Junqueira-Kipnis AP, Kipnis A, Tamayo MH, Harton M, Gonzalez-Juarrero M, Basaraba
RJ & Orme IM. 2005. Interleukin-10 production by lung macrophages in CBA xid mutant
mice infected with Mycobacterium tuberculosis. Immunology. 115:246-252.
Kasahara K, Sato I, Ogura K, Takeuchi H, Kobayashi K & Adachi M. 1998. Expression of
chemokines and induction of rapid cell death in human blood neutrophils by
Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis. 178: 127–137.
Kaufmann SH & Schaible UE. 2003. A dangerous liaison between two major killers:
Mycobacterium tuberculosis and HIV target dendritic cells through DC-SIGN. J Exp Med.
197(1):1-5.
Kaufmann SH. 1995. Immunity to intracellular microbial pathogens. Immunol Today,
16(7):338-42.
Kaufmann SH. 2001. How can immunology contribute to the control of tuberculosis? Nat.
Rev. Immunol., 1(1): 20-30.
Kawamura I. 2008. Advances in understanding of the virulence mechanism of
Mycobacterium tuberculosis. Nihon Hansenbyo Gakkai Zasshi; 77(3):219-24.
62
Khoor A, Leslie KO , Tazelaar HD, Helmers RA & Helmers TV. 2001. Diffuse Pulmonary
Disease Caused by Nontuberculous Mycobacteria in Immunocompetent People (Hot Tub
Lung). Am J Clin Pathol ;115:755-762
Kisich KO, Higgins M, Diamond G & Heifets L. 2002. Tumor necrosis factor alpha
stimulates killing of Mycobacterium tuberculosis by human neutrophils. Infect Immun;
70(8):4591-9.
Koneman EW et al 2001. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5. ed. Rio de
Janeiro: MEDSI.
Langelaar MF, Weber CN, Overdijk MB, Muller KE, Koets AP & Rutten VP. 2005.
Cytokine gene expression profiles of bovine dendritic cells after interaction with
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (M.a.p.), Escherichia coli (E. coli)
orrecombinant M.a.p. heat shock protein 70. Vet.Immunol.Immunopathol. 107(1-2):153-
61.
Lee H, Stabel JR & Kehrli ME, Jr. 2001. Cytokine gene expression in ileal tissues of cattle
infected with Mycobacterium paratuberculosis. Vet. Immunol. Immunopathol. 82(1-2): 73-
85.
63
Lepper AWD & Corner LA 1983. Naturally occurring mycobacterioses of animals. In.:
Ratledge C, Stanford J. The biology of the mycobacteria. London:Academic Press, 2.417 –
521.
Liu MA. 2003. DNA vaccines: a review. J. Intern. Med., 253(4): 402-10.
Lockhat E, Green AM & Flynn JL. 2006. IL-17 production is dominated by gammadelta T
cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J
Immunol.177(7):4662-9.
Lowry PW, Jarvis WR, Oberle AD, Bland LA, Silberman R, Bocchini-Jr JA, Dean HD,
Swenson JM & Wallace-Jr RJ. 1988. Mycobacterium chelonae causing otitis media in an
ear-nose-and-throat practice. N. Engl. J. Med. 319:978–982.
MacGregor RR, Boyer JD, Ugen KE, Lacy KE, Gluckman SJ, Bagarazzi ML, et al. 1998.
First humans trial of a DNA-based vaccine for treatment of human immunodeficiency virus
type 1 infection: safety and host response. J. Infect. Dis., 178(1): 92-100.
MacMicking JD, North RJ, LaCourse R, Mudgett JS, Shah SK & Nathan CF. 1997.
Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against tuberculosis. Proc Natl
Acad Sci U S A; 94(10): 5243–5248.
64
Maheshwari A, Han S, Mahato RI & Kim SW. 2002. Biodegradable polymer-based
interleukin-12 gene delivery: role of induced cytokines, tumor infiltratingcells and nitric
oxide in anti-tumor activity. Gene Therapy 9: 1075–1084.
Marietta MA. 1993. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J. Biol. Chem.,
268(17): 12231-4.
Marietta MA. 1994. Nitric oxide synthase: aspects concerning structure and catalysis. Cell.,
78: 927-30.
Martineau AR, Newton SM, Wilkinson KA, Kampmann B, Hall BM, Nawroly N, Packe
GE, Davidson RN, Griffiths CJ & Wilkinson RJ. 2007. Neutrophil-mediated innate
immune resistance to micobactéria. J Clin Invest; 117(7): 1988–1994.
McKenna S & Evans G. 2001. Canadian Infectious Disease Society Antimicrobial Agents
Committee. Macrolides: A Canadian Infectious Disease Society position paper. Can J
Infect Dis.; 12(4):218-31.
Moncada S. 1991. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology.
Pharmacol. Rev., 43(2):109-42.
Nakae, S., Y. Komiyama, A. Nambu, K. Sudo, M. Iwase, I. Homma,K. Sekikawa, M.
Asano & Y. Iwakura. 2002. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-
65
deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity
17: 375–387.
Nava E & Luscher TF. 1995. Endothelium-derivated vasoactive factors in hypertnsion:
nitric oxide and endothelin. J. Hypert., 13(2):39-48.
Neufert C, Pai RK, Noss EH, Berger M, Boom WH & Harding CV. 2001. Mycobacterium
tuberculosis 19-kDa lipoprotein promotes neutrophil activation. J. Immunol. Aug
1;167(3):1542-9.
Nolte FS & Netchock B 1995. Mycobacterium. In: MURRAY, P. R. et al. Manual of
clinical microbiology. 6th. ed. Washington: ASM PRESS, . p. 400-437.
Ordway D, Henao-Tamayo M, Smith E, Shanley C, Harton M, Troudt J, Bai X, Basaraba
RJ, Orme IM & Chan ED. 2008. Animal Model of Mycobacterium abscessus lung
infection. Journal of Leukocyte Biology. 83:1502-09.
Orme IM & Cooper AM. 1999. Cytokine/chemokine cascades in immunity to tuberculosis.
Immunol Today. 20(7):307-12.
Ostrowski M, Mundo SL, Harris NB, Barletta RG & Lopez OJ. 2003. B-cell epitopes in the
immunodominant p34 antigen of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis recognized
by antibodies from infected cattle. Scand.J.Immunol., 58(5):511-21.
66
Pedrosa J, Saunders BM, Appelberg R, Orme IM, Silva MT & Cooper AM 2000.
Neutrophils play a protective nonphagocytic role in systemic Mycobacterium tuberculosis
infection of mice. Infect Immun 68: 577-583
Peng M, Wang Z, Yao C, Jiang L, Jin Q, Wang J & Li B. 2008. Interleukin 17-producing
γδ T cells increased in patients with active pulmonary tuberculosis. Cellular & Molecular
Immunology, 5(3):203-08.
Petrini B 2006. Mycobacterium abscessus: an emerging rapid-growing potential pathogen.
Apmis 114(5):319.
Pfaffl MW,Horgan GW & Dempfle L. 2002. Relative expression software tool (rest) for
group-wise comparison and statistical analysis relative expression results in real-time PCR.
Nucleic Acids Research .30 (9):1-10.
Pfaffl MW. 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-
PCR. Nucleic Acids Research.29 (9): 2002-07.
Phillips MS &Von Reyn CF. 2001. Nosocomial infections due to nontuberculous
mycobacteria. Clin Infect Dis; 33: 1363-74.
Pollock JM, McNair J, Welsh MD, Girvin RM, Kennedy HE, Mackie DP & Neill SD.
2001. Immune response in bovine tuberculosis. Tuberculosis: 103-107.
67
Ramos MC, Moraes MJ, Calisni AL, Roscani GN & Picolli EA.2000. A retrospective
bacteriological study of mycobacterial infections in patients with acquired immune
deficience syndrome (AIDS). Br J Infect. 4:86-90.
Rastogi N, Legrand E & Sola C. 2001. The mycobacteria: an introduction to nomenclature
and pathogenesis. Rev.- Off. Int.Epizoot.,20(1):21-54.
Roberts GD. 1991. Manual of clinical microbiology. Mycobaterium. Washington DC.
Book; 304-39.
Rook GA, Dheda K & Zumla A. 2005. Do successful tuberculosis vaccines need to be
immunoregulatory rather than merely Th1-boosting? Vaccine;23(17-18):2115-20. Review.
Rottman M, Catherinot E, Hochedez P, Emile JF, Casanova JL, Gaillard JL & Soudais C.
2007. Importance of T cells, gamma interferon, and Tumor Necrosis Factor in Immune
Control of the Rapid Grower Mycobacterium abscessus in C57BL/6 mice. Infection and
Immunity.75(12): 5898-5907.
Roupie V, Rosseels V, Piersoel V, Zinniel DK, Barletta RG & Huygen K. 2008, Genetic
resistance of mice to Mycobacterium paratuberculosis is influenced by Slc11a1 at the early
but not at the late stage of infection. Infection and Immunity. 76:2099-2105.
68
Runyon EH. 1959. Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med. Clin. North
Am.43: 273-290.
Saito H, Tomioka H, Sato K et al 1990. Identification of various serovar strains of
Mycobacterium avium complex using DNA probes specific for M.avium and M.
intracellulare. J Clin Microb ;28 (8):1694-7.
Salgame P. 2005. Host innate and Th1 responses and the bacterial factors that control
Mycobacterium tuberculosis infection. Curr Opin Immunol. Aug;17(4):374-80. Review.
Sano K, Handea K, Tamura G & Shirato K. 1999. Ovoalbumin (OVA) AND
Mycobacterium tuberculosis bacilli coopoeratively polarize anti-OVA T-helper cells
forward a Th1-dominant phenotype and ameliorate murine tracheal eosinophilia. Am J
Resp Cell Mol Biol, v.20, p.1260-1267.
Schwarzenberger, P., W. Huang, P. Ye, P. Oliver, M. Manuel, Z. Zhang, G. Bagby, S.
Nelson, & J. K. Kolls. 2000. Requirement of endogenous stem cell factor and granulocyte-
colony-stimulating factor for IL-17-mediated granulopoiesis. J. Immunol. 164: 4783–4789.
Sharma S, Verma I & Khuller GK. 2000. Antibacterial activity of human neutrophil
peptide-1 against Mycobacterium tuberculosis H37Rv: in vitro and ex vivo study. Eur
Respir J.;16(1):112-7.
69
Shinnick TM & Good RC 1994: Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
13(11):884.
Simmon KE, Pounder JI, Greene JN, Walsh F, Anderson CM, Cohen S & Petti CA. 2007. J
Clin Microbiol.; 45(6):1978-80. Epub 2007 Apr 4.
Sinha S, Kosalai K, Arora S, Namane A, Sharma P, Gaikwad AN, Brodin P & Cole ST.
2005. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed
by proteomics. Microbiology.;151(Pt 7):2411-9.
Stabel JR. 1995. Temporal effects of tumor necrosis factor-alpha on intracellular survival
of Mycobacterium paratuberculosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 45(3-4):321-32.
Stabel JR. 2000. Transitions in immune responses to Mycobacterium paratuberculosis. Vet.
Microbiol., 77(3-4):465-73.
Sturgill-Kosycki S, Schlesinger PH, Chakraborty P, Haddix PL, Collins HL, Fok AK, et al
1994. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the
vesicular proton-ATPase. Science. 263:678-81.
Sullivan BM, Jobe O, Lazarevic V, Vasquez K, Bronson R, Blimcher LH & Kramnil I.
2005. Increased Susceptility of Mice Lacking T-bet to infection with Mycobacterium
70
tuberculosis Correlates with Increased IL-10 and Decrease IFN-γ Production. J. Immunol.
175:4593-4602.
Taylor JL & Palmer SM 2006: Mycobacterium abscessus chest wall and pulmonary
infection in a cystic fibrosis lung transplant recipient. J Heart Lung Transplant 25(8):985.
Thomssen H, Ivanyi J, Espitia C, Arya A & Londei M. 1995. Human CD4-CD8- alpha beta
+ T-cell receptor T cells recognize different mycobacteria strains in the context of CD1b.
Immunology.;85(1):33-40.
Timpe A & Runyon EH. 1954. Relationship of atypical acid-fast bacilli to human disease:
Preliminary report. J. Lab. Clin. Med.44:202-209.
Trinchieri G 1995. Interleukin-12: A proinflammatory cytokine with inmunoregulatory
functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity. Annu Rev
Inmunol; 13:251-276.
Turner J, Gonzalez-Juarrero M, Ellis DL, Basaraba RJ, Kipnis A, Orme IM & Cooper
AM.2002. In vivo IL-10 production reactivates chronic pulmonary Tuberculosis in
C57BL/6 mice. The Jounal of Immunology. 169:6343-6351.
Umemura M, Yahagi A, Hamada S, Begum MD, Watanabe H, Kawakami K, Suda T, Sudo
K, Nakae S, Iwakura Y & Matsuzaki G. 2007. IL-17 mediated regulation of innate and
71
acquired immune response against pulmonary Mycobacteium bovis Bacille Calmette-
Guérin infection. Journal of Immunology, 178:3786-96.
Vasconcelos SA 1979. Epidemiologia da tuberculose. Comunicações Científicas da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, 3(1/2): 81-
89.
Viana-Niero C, Lima KVB, Lopes ML, Rabello MCS, Marsola LR, Brilhante VCR,
Durham AM & Leão SC. 2008. Molecular characterization of Mycobacterium massiliense
and Mycobacterium bolletii in isolates collected from outbreaks of infections after
laparoscopic surgeries and cosmetic procedures. Journal of Clinical Microbiology.46:850-
55.
Villanueva A, Calderon RV, Vargas BA, Ruiz F, Aguero S, Zhang Y, Brown BA &
Wallace-Jr RJ. 1997. Report on an outbreak of post-injection abscesses due to
Mycobacterium abscessus, including manage-ment with surgery and clarithromycin therapy
and comparison of strains by random amplified polymorphic DNA polymerase chain
reaction. Clin. Infect. Dis. 24:1147–1153.
Vincent VLF & Portaels F 1992. Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium
and for the description of new slowly growing Mycobacterium species. Int J Syst Bacteriol
;42:315-23.
72
Vossler JL 2000. Mycobacterium tuberculosis and other nontuberculous mycobacteria. In :
MAHON, C. R. ; MANUSELIS, G. Textbook of diagnostic microbiology. 2nd. ed.
Philadelphia : W.B. Saunders Company, 667-707.
Wallace-Jr RJ, Brown BA & Griffith DE. 1998. Nosocomial outbreaks/pseudo outbreaks
caused by nontuberculous micobacteria. Annual Review of Microbiology. 52: 453-490
Wallace-Jr RJ, Musser JM, Hull SI, Silcox VA, Steele JC, Forrester GD, Labidi A &
Selander RK. 1989. Diversity and sources of rapidly growing mycobacteria associated with
infections following cardiac bypass surgery. J. Infect. Dis. 159:708–716.
Wang JL, Qie Yq, Zhu Bd, Zhang Hm, Xu Y, Wang Qz, Chen Jz, Liu W & Wang Hh.
2008. Evaluation of a recombinant BCG expressing antigen Ag85B and PPE protein
Rv3425 from DNA segment RD11 of Mycobacterium tuberculosis in C57BL/6 mice. Med
Microbiol Immunol.
Wayne LG & Sramek HA.1992. Agents of newly recognized or infrenquently encountered
mycobacterial diseases. Clin. Microbiol. Rev.5:1-25.
Wennmalm A. 1994. Endothelial nitric oxide and cardiovascular disease. J. Int. Med., 235:
317-27.
73
Winthrop KL, Steinberg EB, Holmes G, Kainer MA, Werner SB, Winquist A & Vugia DJ.
2003. Epidemic and sporadic cases of nontuberculous mycobacterial keratitis associated
with laser in situ keratomileusis. Am J Ophthalmol ;135: 223-4.
Witte MB & Barbul A. 2002. Role of nitric oxide in wound repair. Am. J. Surg., 183:406-
12.
Wolinsly E. 1992. Mycobacterial Diseases Other Than Tuberculosis (State-of-the-art). Clin
Infect Dis ;15:1-12.
Xing Z & Santosuosso M. 2000. Role of IL-12 in macrophage activation during
intracellular infection: IL-12 and mycobacteria synergistically release TNF-alpha and nitric
oxide from macrophages via IFN-gamma induction. J Leukoc Biol,897-902.
Zhang Y, Rajagopalan M, Brown BA & Wallace-Jr RJ. 1997. Randomly amplified
polymorphic DNA PCR for comparison of Mycobac-terium abscessus strains from
nosocomial outbreaks. J. Clin. Microbiol. 35:3132–3139.
Zur LS, Goethe R; Darji A; Valentin-Weigand P & Weiss S. 2003. Activation of
macrophages and interference with CD4+ T-cell stimulation by Mycobacterium avium
subspecies paratuberculosis and Mycobacterium avium subspecies avium. Immunology,
108(1): 62-9.
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