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Centro de Ciências Exatas
Departamento de Química
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E
ANÁLISE EXPLORATÓRIA DA COMPOSIÇÃO
QUÍMICA DOS EXTRATOS DAS FOLHAS DE
VERNONIA CONDENSATA BAKER
Wagner Ezequiel Risso
Dissertação de Mestrado em Química dos Recursos Naturais
Orientadora: Prof
a
. Dra. Ieda Spacino Scarminio
Co-orientadora: Profª Dra. Estefânia Gastaldello Moreira
Londrina
2008
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WAGNER EZEQUIEL RISSO
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANÁLISE
EXPLORATÓRIA DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS EXTRATOS DAS
FOLHAS DE VERNONIA CONDENSATA BAKER
Dissertação apresentada ao Programa
de Mestrado em Química dos Recursos
Naturais, da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
Orientação: Prof
a
. Dr
a
. Ieda Spacino Scarminio
Co-orientação: Profª.Drª. Estefânia Gastaldello Moreira
Londrina, 03 de março de 2008
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Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca
Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
R596e Risso, Wagner Ezequiel.
Estudo da atividade antinociceptiva e análise exploratória da composição
química dos extratos das folhas de Vernonia condensata Baker / Wagner
Ezequiel Risso. – Londrina, 2008.
97f. : il.
Orientador: Ieda Spacino Scarminio.
Co-orientador: Estefânia Gastaldello Moreira.
Dissertação (Mestrado em Química dos Recursos Naturais) − Universidade
Estadual de Londrina, Centro de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação
em Química dos Recursos Naturais, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Quimiometria – Teses. 2. Química analítica – Teses. 3. Extração por
solventes – Teses. 4. Plantas – Análise – Teses. 5. Vernonia – Teses. I. Scarminio,
Ieda Spacino. II. Moreira, Estefânia Gastaldello. III. Universidade Estadual de
Londrina. Centro de Ciências Exatas. Programa de Pós–Graduação em Química
dos Recursos Naturais. IV. Título.
CDU 543
PROGRAMA DE MESTRADO EM QUÍMICA DOS RECURSOS NATURAIS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANÁLISE
EXPLORATÓRIA DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS EXTRATOS DAS
FOLHAS DE VERNONIA CONDENSATA BAKER
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof
a
. Dr
a
. Ieda Spacino Scarminio (Orientadora)
Prof
a
. Dr
a
. Juliana Feijó de Souza Daniel
Prof. Dr. Noboru Hioka
Londrina, 03 de março de 2008
A Deus, a minha família, a Fernanda e aos
meus amigos...companheiros de todas as horas...
AGRADECIMENTOS
- A Professora Dra. Ieda Spacino Scarminio pela ótima orientação e principalmente pela
amizade e dedicação na realização de todas as etapas do trabalho.
- A Professora Dra. Estefânia Gastaldello Moreira pela inestimável colaboração na
realização deste trabalho, principalmente na realização dos testes farmacológicos.
- A minha namorada Fernanda Delaroza, pelo seu carinho, paciência, motivação e
companheirismo durante toda esta jornada.
- As professoras Dra. Claudete Faiad Name e Dra. Juliana pela colaboração neste
trabalho.
- A minha família pela confiança e eterna motivação.
- Aos colegas de laboratório: Fábio, Gabriela, Lina, Aline, Raquel e Sabrina.
- Aos amigos e colegas do mestrado: Lilyan, Adriana, Rosa, Patrícia, Alfredo e Priscila.
- A todos do Laboratório de Produção de Medicamentos da UEL pelo auxílio e por ter
gentilmente permitido a utilização do FTIR.
- A todos os professores do Programa de Mestrado em Química dos Recursos Naturais.
- A todo Departamento de Química, professores e técnicos.
- A todo Departamento de Ciências Fisiológicas, professores e técnicos.
- À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/PROAP)
pelo apoio no desenvolvimento do trabalho.
RESUMO
Métodos quimiométricos de planejamento experimental e de análise multivariada
foram associados a dados espectroscópicos para discriminar diferentes extratos das folhas da
espécie Vernonia condensata Baker. No processo de extração foram usados os solventes
etanol, acetato de etila, diclorometano e acetona puros e em misturas binárias, ternárias e
quaternárias. Investigou-se a influência dos diferentes solventes no meio extrator por
planejamento de misturas com quatro componentes na preparação dos extratos. Modelos de
análise de componentes principais (ACP) e análise hierárquica (AH), aplicados aos dados
fornecidos pela espectroscopia de absorção no infravermelho e ultravioleta-visível,
mostraram-se ferramentas úteis na investigação da composição química dos extratos. Além da
análise química, neste estudo também avaliamos em camundongos, a atividade
antinociceptiva dos diferentes extratos através do modelo de contorções abdominais, bem
como a dose letal média, DL
50
, de cada extrato, ou seja, a dose que causa a morte de metade
dos animais teste. Os extratos que mostraram atividade antinociceptiva em todas as doses
utilizadas foram: aquoso, etanol puro, misturas binárias de etanol-acetato de etila e
diclorometano-acetona e misturas ternárias de etanol-acetato de etila-diclorometano e etanol-
diclorometano-acetona. A aplicação de modelos de superfícies de resposta com quatro
componentes mostraram que extratos preparados em misturas binárias de diclorometano-
acetona são recomendados para uma melhor resposta antinociceptiva. Para confirmar a
validade dos modelos, foi preparada uma nova mistura binária de acetona-diclorometano na
proporção 3:2 (v/v) e, após a obtenção do extrato, realizou-se a avaliação da atividade
antinociceptiva que comprovou a validade dos modelos para as doses de 80 e 160 mg/kg.
ABSTRACT
Chemometric methods of experimental design associated with multivariate analysis
were applied to spectroscopic data to discriminate different extracts from the leaves of the
species Vernonia condensata Baker. For the extraction, four solvents (ethanol, ethyl acetate,
dichloromethane and acetone) and their binary, ternary and quaternary mixtures were used.
This approach allowed to determine the influence of the solvent extractor in the preparation of
the extracts. Models of principal component analysis (PCA) and hierarchical analysis (AH),
applied to data from the absorption spectroscopy in the infrared and ultraviolet-visible have
proved to be useful tools in the investigation of the chemical composition of extracts. Besides
the chemical investigation, we also evaluated in mice the antinociceptive activity of the
different extracts through the abdominal constriction model as well as the lethal dose 50%,
LD
50
, i.e., the dose that causes the death of half of the tested animals. The extracts that
presented antinoceptive activity at all doses used were: Aqueous, ethanol pure, ethanol-ethyl
acetate and dichloromethane-acetone binary mixtures and ethanol-ethyl acetate-
dichloromethane and ethanol-dichloromethane-acetone ternary mixtures. The application of
models for areas of response with four components revealed that the extract obtained through
the dichloromethane-acetone binary mixture showed the highest antinociceptive effect. In
order to confirm the validity of the model, a new binary mixture of acetone- dichloromethane
was prepared in the proportion 3:2 (v/v) and its antinociceptive activity was assessed. The
results proved the validity of the model for the doses of 80 and 160 mg/kg.
LISTA DE FIGURAS
1 Espaço experimental para processos com quatro fatores independentes que
inclui todos os pontos dentro do tetraedro.
10
2 Esquema da seqüência usada na análise multivariada dos dados
experimentais, ACP (Análise de Componentes Principais) e AH (Análise
Hierárquica).
15
3 Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas matrizes. 19
4 Procedimento experimental para a obtenção de dados espectroscópicos e
avaliação da DL
50
e atividade antinociceptiva das folhas de Vernonia
condensata Baker.
23
5 Foto da espécie Vernonia condensata Baker e da exsicata depositada no
herbário FUEL.
24
6 Triângulo de solvente seletividade de Snyder. 27
7 Triângulo de seletividade baseado nos dados solvatocrômicos da Tabela 2. 30
8 Planejamento experimental do tipo Centróide simplex com 4 componentes.
32
9 Seqüência do procedimento para o preparo dos extratos para a escolha do
solvente extrator.
34
10 Esquema utilizado para o fracionamento dos extratos. 35
11 Procedimento para a avaliação da DL
50
com dose inicial de 2000 mg/kg. 39
12 Gráfico dos rendimentos obtidos usando planejamento de misturas de
quatro componentes.
42
13 Curvas de nível para o rendimento do extrato das folhas de Vernonia
condensata Baker usando o modelo cúbico especial de misturas de quatro
componentes.
44
14 Resíduos deixados pelo modelo cúbico especial no estudo do rendimento
do extrato das folhas de Vernonia condensata Baker.
45
15 Respostas previstas pelo modelo cúbico especial. 45
16 Espectro no ultravioleta-visível dos 16 extratos obtidos das folhas de
Vernonia condensata Baker.
46
17 Gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 dos extratos no ultravioleta visível,
que explicam 19,05 % da variância total.
47
18 Gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 dos extratos no ultravioleta-visível 48
19 Dendrograma obtido pela análise hierárquica dos 16 extratos de Vernonia
condensata Baker.
49
20 Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e dos loadings do fator 2.
50
21 Espectro no ultravioleta-visível dos 16 extratos obtidos das folhas de
Vernonia condensata Baker, com destaque aos espectros dos extratos 1, 3,
6, 11 e aquoso.
51
22 Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e dos loadings do fator 3.
52
23 Espectro no ultravioleta visível dos 16 extratos obtidos das folhas de
Vernonia condensata Baker, com destaque aos espectros dos extratos 2, 8
e 9.
53
24 Espectro no ultravioleta visível dos 16 extratos obtidos das folhas de
Vernonia condensata Baker, com destaque aos espectros dos extratos 1, 7,
12, 14 e aquoso.
54
25 Espectros no infravermelho das 16 extratos obtidos das folhas de Vernonia
condensata Baker.
55
26 Gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 dos dados espectrais dos 16 extratos
das folhas de Vernonia condensata Baker.
56
27 Dendrograma obtido baseado nos dados dos espectros FTIR dos extratos. 57
28 Gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 para as 16 amostras no
infravermelho.
57
29 Gráfico dos rendimentos em massa das frações obtidas dos extratos das
folhas de Vernonia condensata Baker.
59
30 Espectros no infravermelho da fração intermediária de cada extrato obtido
das folhas de Vernonia condensata Baker.
60
31 Gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 dos dados espectrais obtidos das 15
amostras da fração intermediária.
61
32 Gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 para as 15 amostras da fração
intermediária.
62
33 Espectros no infravermelho da fração polar de cada extrato obtido das
folhas de Vernonia condensata Baker.
65
34 Gráfico dos escores dos fatores 3 e 4 dos dados espectrais obtidos das 15
amostras da fração polar.
66
35 Gráfico dos loadings dos fatores 3 e 4 para as 16 amostras da fração polar. 68
36 Espectros no infravermelho da fração neutra de cada extrato obtido das
folhas de Vernonia condensata Baker.
70
37 Gráfico dos escores dos fatores 1 e 3 dos dados espectrais obtidos das 15
amostras da fração neutra.
71
38 Gráfico dos loadings dos fatores 1 e 4 para as 15 amostras da fração
neutra.
72
39 Spot-test para identificação de alcalóides nos extratos da planta utilizando
o reagente de Dragendorff.
75
40 Teste para identificação de compostos fenólicos. 75
41 Teste para identificação de saponinas. 75
42 Teste para identificação de flavonóides. O tubo A contém o material
vegetal seco em etanol 70% e no tubo B contém o material vegetal seco em
etanol 70%, raspas de magnésio e ácido clorídrico concentrado.
76
43 Teste para identificação de taninos. No tubo A contém o contém o material
vegetal seco puro; no tubo B contém o material vegetal seco com FeCl
3
1%
em metanol.
76
44 Avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos (a) 2 (acetato de etila),
(b) 4 (acetona), (c) 6 (et-dc), (d) 8 (ae-dc) e (e) 13 (et-dc-ac), sobre as
contorções abdominais induzidas por ácido acético. *p < 0,05 em relação
ao grupo controle tratado com solução veículo. # p < 0,05 em relação ao
grupo controle positivo tratado com o analgésico ibuprofeno (ANOVA
complementada com Student-Newman-Keuls).
79
45 Avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos (a) 1 (etanol), (b)
aquoso, (c) 5 (et-ae), (d) 10 (dc-ac), (e) 11 (et-ae-dc) e (f) 12 (et-dc-ac)
sobre as contorções abdominais induzidos por ácido acético. *p < 0,05 em
relação ao grupo controle tratado com solução veículo. # p < 0,05 em
relação ao grupo controle positivo tratado com o analgésico ibuprofeno
(ANOVA complementada com Student-Newman-Keuls).
80
46 Avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos (a) 3 (diclorometano),
(b) 7 (et-ac), (c) 9 (ae-ac) e (d) 14 (ae-dc-ac), sobre as contorções
abdominais induzidos por ácido acético. *p < 0,05 em relação ao grupo
controle tratado com solução veículo. # p < 0,05 em relação ao grupo
controle positivo tratado com o analgésico ibuprofeno. (ANOVA
complementada com Student-Newman-Keuls).
81
47 Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e da porcentagem de inibição nociceptiva pelos
extratos na dose de 40 mg/kg.
84
48 Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e da porcentagem de inibição nociceptiva pelos
extratos na dose de 80 mg/kg.
85
49 Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e da porcentagem de inibição nociceptiva pelos
extratos na dose de 160 mg/kg.
86
50 Avaliação da atividade do extrato otimizado na proporção 3:2 (v/v), sobre
as contorções abdominais induzidos por ácido acético. *p < 0,05 em
relação ao grupo controle tratado com solução veículo.
87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Classificação dos solventes de acordo com a seletividade
normalizada.
29
Tabela 2 -
Matriz de planejamento para a escolha do solvente extrator. 33
Tabela 3 -
Valores de DL
50
para todos os extratos. 77
Tabela 4 -
Porcentagem de inibição nociceptiva obtida para cada extrato. 83
Tabela 5 -
Porcentagem de inibição nociceptiva obtida para o extrato otimizado.
87
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ac
Acetona
ae
Acetato de etila
ACP
Análise de Componentes Principais
AH
Análise Hierárquica
dc
Diclorometano
DL
50
Dose letal 50%
et
Etanol
FTIR
Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier
OMS
Organização Mundial de Saúde
p
Variáveis
P
Matriz dos escores
q
Número de componentes principais
t
Transposta da matriz
T
Matriz dos loadings
UV-Vis
Espectroscopia de absorção molecular no ultravioleta-visível
X
Matriz
α
αα
α
Acidicidade do solvente
β
ββ
β
Basicidade do solvente
ν
νν
ν
as
Vibração de deformação axial assimétrica
ν
νν
ν
s
Vibração de deformação axial simétrica
ε
Resíduos
δ
δδ
δ
as
Vibração de deformação angular assimétrica
δ
δδ
δ
s
Vibração de deformação angular simétrica
π
ππ
π*
Dipolaridade
Marca registrada.
SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 2
CAPÍTULO II
2.
MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS 9
2.1 Modelagem de Misturas 9
2.2 Análise Exploratória de Dados 14
2.2.1 Pré-Processamento das Amostras 16
2.2.1.1 Normalização 16
2.2.1.2 Normalização por Área Unitária 16
2.2.1.3 Normalização por Comprimento do Vetor 16
2.2.2 Pré-Processamento das Variáveis 17
2.2.2.1 Escalamento por Variância 17
2.2.2.2 Centrar na Média 17
2.2.2.3 Autoescalonamento 18
2.2.2.4 Normalização Seguida de Autoescalonamento 18
2.3 Análise de Componentes Principais (ACP) 18
2.4 Análise Hierárquica (AH) 19
CAPÍTULO III
3. DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL 23
3.1 Planta 24
3.2 Características da Espécie Vernonia condensata Baker 25
3.3 Equipamentos 26
3.4 Reagentes e Fármacos 26
3.5 Processo de Extração 26
3.6 Escolha dos Solventes 27
3.7 Preparo do Sistema Extrator 32
3.8 Preparo dos Extratos 33
3.9 Extrato Aquoso 34
3.10 Fracionamento dos Extratos 35
3.11 Análise por Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR)
36
3.12 Análise por Espectrofotometria no Ultravioleta-Visível (UV-Vis) 36
3.13 Identificação de Metabólitos Secundários Presentes na Planta 36
3.13.1 Reagente de Dragendorff 36
3.13.2 Ensaios de Identificação 37
3.13.2.1 Alcalóides 37
3.13.2.2 Saponinas 37
3.13.2.3 Compostos Fenólicos 37
3.13.2.4 Taninos 37
3.13.2.5 Flavonóides 38
3.14 Animais 38
3.15 Determinação da Dose Letal 50% (DL
50
) 39
3.16 Atividade Antinociceptiva 40
CAPÍTULO IV
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 42
4.1 Rendimentos dos Extratos 42
4.2 Análise por Espectrofotometria no Ultravioleta-Visível 46
4.3 Análise por Espectrometria no Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR)
55
4.4 Fracionamento dos Extratos 59
4.4.1 Rendimento das Frações 59
4.4.2 Análise das Frações por Espectrometria no Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)
60
4.4.2.1 Fração Intermediária 60
4.4.2.2 Fração Polar 65
4.4.2.3 Fração Neutra 70
4.5 Teste de Identificação de Metabólitos Secundários: Spot - test 73
4.6 Determinação da Dose Letal 50% (DL
50
) 77
4.7 Avaliação da Atividade Antinociceptiva 78
CAPÍTULO V
5. CONCLUSÃO 90
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
Capítulo I
Introdução
e
Objetivos
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza, muitas vezes, o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas no tratamento e na cura
de enfermidades é tão antigo quanto a espécie humana
1
. As plantas medicinais constituem
fonte imediata e viável de medicamentos para enfermidades com poucos recursos
terapêuticos
2
. Acredita-se que entre os motivos que explicam a opção pelo uso delas estão: a
insatisfação com a eficácia, o custo elevado e os efeitos indesejáveis dos medicamentos
alopáticos, aliados à admiração pelos “produtos naturais”
3
.
A OMS (Organização Mundial de Saúde) define planta medicinal como sendo “todo e
qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas
com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos”. Estas plantas
são comercializadas apoiadas em propagandas que prometem “benefícios seguros, já que são
naturais”. Muitas vezes, entretanto, as supostas propriedades farmacológicas anunciadas não
possuem validação científica, por não terem suas ações farmacológicas comprovadas em
testes científicos pré-clínicos ou clínicos
4
.
Poucos destes produtos foram estudados de acordo com protocolos científicos
modernos. A maioria não pode, portanto, ser aceita como medicamento ético de prescrição
livre porque, em geral, são produtos sem eficácia comprovada na espécie humana, sem
estudos da eventual toxicidade e sem controle de qualidade apropriado
3
. Se a espécie vegetal
medicinal estudada sofreu apenas investigação fitoquímica, deixando de lado a abordagem
farmacológica, são válidos estudos que interliguem áreas multidisciplinares como
etnobotânica, química e farmacologia, buscando resultados que possam validar ou não o uso
da planta como medicinal
1
. Um dos fatores de extrema importância para a descoberta de
princípios ativos naturais consiste, principalmente, na interação entre a química e a
2
farmacologia. Quanto mais estreita for esta colaboração, mais rápidos e consistentes serão os
objetivos
5
.
A etnobotânica é citada na literatura como sendo o caminho alternativo que mais
evoluiu nos últimos anos para a descoberta de produtos naturais bioativos. Esta área de
pesquisa enfoca dois fatores fundamentais: coleta e utilização medicinal da planta
1
. A
etnofarmacologia é definida como "a exploração científica interdisciplinar dos agentes
biologicamente ativos, tradicionalmente empregados ou observados pelo homem". A
etnofarmacologia constitui-se um elemento metodológico fundamental na busca de novas
substâncias bioativas
6
. A etnobotânica aplicada ao estudo de plantas medicinais trabalha em
estreita relação com a etnofarmacologia
1
.
É inegável a contribuição da medicina popular (caboclos, índios, curandeiros) na
busca de novos princípios ativos para o desenvolvimento de novos fármacos. Dificilmente
uma planta é escolhida por acaso para desenvolver uma pesquisa
6
. Dados da literatura
revelam que é muito mais provável encontrar atividade biológica em plantas orientadas pelo
seu uso na medicina popular do que em plantas escolhidas ao acaso. Cerca de 75% dos
compostos puros naturais empregados na indústria farmacêutica foram isolados seguindo
recomendações da medicina popular
7
. Dos 250 medicamentos considerados básicos e
essenciais pela OMS, 11% são exclusivamente obtidos de plantas medicinais e um número
significativo é de fármacos sintéticos obtidos a partir de plantas medicinais
3
.
Várias espécies do gênero Vernonia (Asteraceae = Compositae) são usadas na
medicina tradicional, principalmente na América do Sul, Central, bem como na África. No
Brasil, Vernonia condensata Baker é uma das espécies de Vernonia mais freqüentemente
usadas na medicina popular para várias indicações, tais como distúrbios gastrintestinais, dor
de cabeça e estimulante do apetite
8
. A espécie Vernonia condensata Baker é nativa
possivelmente da África e trazida ao Brasil ainda nos tempos coloniais pelos escravos
9
. Os
3
nomes populares mais comuns são ‘boldo’, ‘boldo grande’, ‘assa-peixe’, ‘figatil’, ‘macelão’,
‘alumã’, etc. Muitas pessoas acreditam erroneamente que cultivam o boldo-do-chile (Peumus
boldus), porém, esta planta é muito rara no Brasil. Outras plantas são também conhecidas
como boldo, principalmente as plantas do gênero Plectranthus (Lamiaceae), conhecidas
popularmente como boldo-da-terra (Plectranthus barbatus) e boldo-miúdo (Plectranthus
neochilus)
10
. Na composição química de Vernonia condensata Baker são documentadas as
presenças de saponinas, glicosídeos cardiotônicos (vernonina), flavonóides, ácido
clorogênico, óleos essenciais e lactonas sesquiterpênicas
8,10
.
Alguns usos tradicionais das folhas de Vernonia condensata Baker podem ser
justificados por dados fornecidos por estudos farmacológicos. Recentemente, demonstrou-se
que extratos aquosos de suas folhas possuem propriedades analgésicas e inibem dose-
dependentemente as contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,6% em
camundongos
11
. O extrato aquoso mostrou também ação protetora da mucosa gástrica dos
efeitos ulcerogênicos provocados pelos antiinflamatórios não-esteroidais indometacina e
ácido acetilsalisílico. O pré-tratamento com extrato aquoso também foi capaz de inibir o
edema da pata e a hiperalgesia, induzidos por carragenina em ratos, assim como a peritonite
induzida por caulim em camundongos
11
.
Com o desenvolvimento de novas técnicas espectroscópicas, os químicos orgânicos
têm conseguido elucidar estruturas moleculares complexas de constituintes naturais, até há
pouco tempo difíceis de serem identificadas
7
. A espectroscopia na região do infravermelho é
uma técnica de inestimável importância na análise orgânica qualitativa, sendo amplamente
utilizada nas áreas de química de produtos naturais, síntese e transformações orgânicas
12.
A identificação dos compostos orgânicos pode ser feita através da espectroscopia na
região do infravermelho, que é interpretado em termos de presença ou ausência de grupos
funcionais, e da espectroscopia na região do ultravioleta-visível (UV-Vis), que define a
4
presença de compostos que possuem ligações insaturadas em conjugação
1
. A aplicação destes
métodos aos extratos de plantas possibilitaria discriminá-los e correlacioná-los com suas
respectivas atividades farmacológicas.
A atividade antinociceptiva feita através do modelo de contorções abdominais
induzidas por ácido acético em camundongos foi desenvolvida por Koster et al (1957) e
modificado por vários pesquisadores ao longo dos anos
13
. A dose letal 50%, DL
50
, ou seja, a
dose que causa a morte de metade do número de animais teste,
foi realizada de acordo com o
guia editado pela Organização para o Desenvolvimento e Cooperação Econômicos
14
.
A extração de informações dos resultados de um experimento químico envolve a
análise de um grande número de variáveis. Muitas vezes, um pequeno número dessas
variáveis contém as informações químicas mais relevantes, enquanto que a maioria das
variáveis adiciona pouco ou nada à interpretação dos resultados em termos químicos. A
decisão sobre quais variáveis são importantes, é feita, geralmente, com base na intuição
química ou na experiência, ou seja, é baseada em critérios mais subjetivos do que objetivos
15
.
A análise de dados é uma parte essencial em todo experimento, sendo univariada
quando somente uma variável é medida sistematicamente por várias amostras. Há muito
tempo a estatística univariada vem sendo aplicada a problemas químicos, mas sua utilização
tornou-se limitada. Nas últimas décadas, a análise multivariada foi introduzida no tratamento
de dados químicos, ganhando rapidamente popularidade e dando origem a uma nova
disciplina, batizada de Quimiometria. O modelo estatístico dos métodos multivariados
considera a correlação entre muitas variáveis analisadas simultaneamente, permitindo extrair
maior quantidade de informações dos dados que estão sendo analisados
16
.
De uma maneira geral, um conjunto de dados químicos consiste de vários objetos,
descritos por um determinado número de variáveis. Os objetos químicos típicos são amostras
analíticas ou compostos químicos. As variáveis são, muitas vezes, derivadas das quantidades
5
de constituintes químicos nos objetos, por exemplo, concentrações de elementos mais
importantes, altura de picos em perfis cromatográficos, comprimentos de onda em perfis
espectroscópicos. As variáveis medidas devem ser as mesmas para todos os objetos
15
.
O objetivo da análise exploratória é extrair informações dos dados, estabelecendo
relações entre objetos e variáveis. A análise exploratória não estabelece modelos à priori, mas
permite que, a partir das relações observadas nos dados, sejam levantadas hipóteses e
propostos modelos
15
. Dois métodos de análise exploratória foram usados neste trabalho, a
análise de componentes principais e análise hierárquica.
A análise por componentes principais reduz as variáveis através de critérios objetivos
permitindo a construção de gráficos bidimensionais contendo maior informação estatística.
Este método tem por finalidade básica a redução de dados a partir de combinações lineares
das variáveis originais, com o objetivo de reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados,
detectar amostras anômalas, selecionar variáveis e fazer modelagens de classificação,
enquanto simultaneamente retém a informação contida nos dados
15
.
A técnica de agrupamento hierárquico interliga as amostras por suas associações,
produzindo um dendrograma no qual as amostras semelhantes, segundo as variáveis
escolhidas, são agrupadas entre si. A suposição básica de sua interpretação é que, quanto
menor for a distância entre os pontos, maior a semelhança entre as amostras
17
.
O objetivo geral deste trabalho foi utilizar métodos quimiométricos de planejamento
experimental e de análise multivariada associados a dados espectroscópicos para discriminar
diferentes extratos das folhas da espécie Vernonia condensata Baker e avaliar a atividade
antinociceptiva e a DL
50
. Os objetivos específicos foram:
6
Investigar a influência de diferentes solventes no meio extrator por planejamento de
misturas com quatro componentes na preparação dos extratos das folhas de Vernonia
condensata Baker;
Aplicar métodos quimiométricos de análise multivariada associados a dados
espectroscópicos para comparar a variação composicional dos extratos das folhas de
Vernonia condensata Baker;
Identificar a DL
50
de todos os extratos das folhas de Vernonia condensata Baker;
Avaliar a atividade antinociceptiva dos extratos das folhas de Vernonia condensata
Baker.
7
Capítulo II
Métodos
Quimiométricos
2. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS
2.1 Modelagem de Misturas
Mistura é o ato ou efeito de associar vários ingredientes para formar um produto. O
produto resultante de uma mistura tem características que dependem da natureza de seus
ingredientes e das proporções relativas dos mesmos, não da quantidade total da mistura. A
soma das proporções dos diversos componentes de uma mistura é sempre 100%. Para uma
mistura qualquer de q componentes, pode-se escrever:
∑
=
==
q
1i
i
1 % 100 x , (1)
no qual
i
x
representa a proporção do i-ésimo componente. Esta equação retira um grau de
liberdade das proporções. Para especificar a composição da mistura, só precisam fixar as
proporções de
1
−
q
componentes. A proporção do último componente será sempre o que falta
para completar 100%
18
.
Como resultado da restrição da Equação 1 os valores de
i
x
(proporção do i-ésimo
ingrediente), o espaço torna-se uma região simplex. Um simplex é uma configuração espacial
determinada por um número de pontos uma a mais do que o número de dimensões do espaço.
Cada um dos q pontos que determinam o simplex representam uma mistura no qual um dos q
componentes assume a proporção 1.
Para sistemas com quatro fatores independentes, pode-se realizar experimentos
correspondentes a qualquer ponto dentro do tetraedro da Figura 1.
9
As composições da mistura quaternária são representadas pelos pontos pertencentes ao
tetraedro. Os vértices correspondem aos componentes puros e os lados às misturas binárias,
em cada face do tetraedro os pontos representam misturas ternárias e no ponto central do
tetraedro temos a mistura quaternária
18
.
Figura 1: Espaço experimental para processos com quatro fatores independentes que inclui
todos os pontos dentro do tetraedro.
Além da restrição natural mostrada na Equação 1, pode-se também ter restrições dos
limites superiores e inferiores dos teores dos componentes na mistura, por motivos
tecnológicos ou econômicos, entre outros. Obviamente a soma de todos esses limites tem de
ser menor que um, senão será impossível de preparar a mistura. Tais restrições para um caso
geral de q componentes são escritas conforme a Equação 2. Estes pontos são chamados os
vértices do simplex
18
.
i
c0
≤
≤
α
e ,1
q
1i
i
<α
∑
=
.q,...,2,1i
=
(2)
no qual
i
α
são os limites inferiores não nulos.
1
1
=
x
1
4
=
x
1
3
=
x
1
2
=
x
31
421
=
=
=
xxx
31
431
=
=
=
xxx
31
432
=
=
=
xxx
31
321
=
=
=
xxx
41
4321
=
=
=
=
xxxx
10
O modelo mais simples para uma mistura é o modelo linear ou aditivo, que procura
explicar o comportamento de uma propriedade apenas com os resultados obtidos com a
utilização de cada componente individualmente, isto é, prever o comportamento de qualquer
mistura sem realizar nenhuma mistura:
i443322110i
εxβxβxβxββy
+
+
+
+
+
=
, (3)
no qual
i
y é um valor experimental da resposta de interesse,
0
β ,
1
β
,
2
β
,
3
β e
4
β
são os
parâmetros do modelo e
i
ε
representa o erro aleatório associado à determinação do valor de
i
y . Ajustando o modelo às observações feitas com essa finalidade, obtém-se a expressão:
443322110
xbxbxbxbby
ˆ
+
+
+
+
=
, (4)
que permite estimar a resposta média num ponto qualquer de composição
(
)
4321
xxxx
+
+
+
.
O acento circunflexo é para diferenciar um valor populacional de uma estimativa.
Substituindo o termo
0
b por
(
)
43210
xxxxb
+
+
+
e agrupando os termos em
i
x ,
obtém-se:
44332211
xbxbxbxby
ˆ
∗
+
∗
+
∗
+
∗
= , (5)
sendo
i0i
bbb +=
∗
, para i = 1, 2, 3 e 4.
11
Caso o modelo linear não se mostre satisfatório, deve-se tentar ajustar um modelo
quadrático. Para misturas de quatro componentes, a expressão geral do modelo quadrático
contém 15 termos:
2 2 2 2
0 1 1 2 2 3 3 4 4 11 1 22 2 33 3 44 4
12 1 2 13 1 3 14 1 4 23 2 3 24 2 4 34 3 4
ˆ
y b b x b x b x b x b x b x b x b x
b x x b x x b x x b x x b x x b x x
= + + + + + + + + +
+ + + + +
. (6)
Substituindo as relações
(
)
043210
bxxxxb1
×
+
+
+
=
×
e
(
)
432111
2
111
xxx1xbxb −−−=
, além de expressões análogas para
2
222
xb
,
2
333
xb
e
2
444
xb
tem-
se:
(
)
(
)
( ) ( ) ( )
433442243223411431132112
321444421333431222
4321114433221143210
xxbxxbxxbxxbxxbxxb
xxx1xbxxx1xbxxx1xb
xxx1xbxbxbxbxbxxxxby
ˆ
+++++
+−−−+−−−+−−−
+
−
−
−
+
+
+
+
+
+
+
+
=
. (7)
Agrupando os termos, obtém-se finalmente:
433442243223
41143113211244332211
xxbxxbxxb
xxbxxbxxbxbxbxbxb y
ˆ
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
=
, (8)
no qual
iii0i
bbbb ++=
∗
e
jjiiijij
bbbb −−=
∗
, com
ji
≠
.
Se o modelo quadrático se mostrar insuficiente, precisa acrescentar-lhe termos
cúbicos. O modelo cúbico completo para uma mistura de quatro componentes é dado pela
Equação 9:
12
q21q12kji
q
ji
q
kj
q
k
ijk
q
ji
q
j
jiij
q
1i
ii
...xx...b...xxxbxxbxby
ˆ
∗
< <
∗
<
∗
=
∗
++++=
∑∑∑∑∑∑
. (9)
Usando a identidade
4321
xxxx1
+
+
+
=
e fazendo as substituições apropriadas, pode-
se chegar à expressão:
( ) ( ) ( ) ( ) ( )
( )
43211234432234431134421124321123434334
424224323223414114313113212112
43344224322341143113211244332211
xxxxbxxxbxxxbxxxbxxxbxxxxd
xxxxdxxxxdxxxxdxxxxdxxxxd
xxbxxbxxbxxbxxbxxbxbxbxbxb y
ˆ
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+−+
−+−+−+−+−+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
=
. (10)
Como esta equação tem 21 termos, ter-se-ia de fazer no mínimo 21 ensaios diferentes
para determinar os valores de todos os seus coeficientes. Muitas vezes, basta introduzir um
único termo cúbico para que o modelo passe a descrever satisfatoriamente toda a região
experimental. Eliminando os termos em
ij
d
na Equação 10, chega-se à expressão do modelo
cúbico especial:
43211234432234431134421124321123
43344224322341143113211244332211
xxxxbxxxbxxxbxxxbxxxb
xxbxxbxxbxxbxxbxxbxbxbxbxb y
ˆ
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
+
∗
=
. (11)
O planejamento experimental normalmente empregado para determinar os valores dos
coeficientes do modelo cúbico especial é o chamado centróide simplex, que se obtém
acrescentando ao simplex em rede um ponto central correspondendo à mistura quaternária em
partes iguais,
( )
+++=
4
1
4
1
4
1
4
1
x,x,x,x
4321
.
13
2.2 Análise Exploratória de Dados
A seqüência básica da análise de dados multivariados de dados experimentais por
métodos quimiométricos está ilustrada na Figura 2. Antes de proceder à análise dos dados é
feita uma inspeção visual para verificar problemas de variação da linha de base, sobreposição
de picos e ruídos. Os dados são convertidos na forma de uma matriz (tabela de dados), no qual
será representada por X. As n linhas da matriz representam as amostras (ou objetos), no qual
cada valor corresponde a uma propriedade medida para uma amostra específica, enquanto que
as p colunas são variáveis que correspondem a uma propriedade medida para cada amostra.
Em seguida é realizada uma pré-seleção das variáveis quando necessário para definir a região
do espectro ou cromatograma que contém a informação que será utilizada no cálculo.
O pré-processamento é uma etapa importante da análise, pois os dados de uma forma
geral contêm fontes de variação, como erros aleatórios ou sistemáticos ou unidades diferentes.
Ele é definido como qualquer manipulação matemática nos dados com o objetivo de remover
ou reduzir estas fontes irrelevantes de variação
15
. Pode ser dividido em dois tipos básicos,
dependendo se são operados nos valores relacionados às amostras ou às variáveis, e a sua
escolha vai depender do conjunto de dados e do objetivo
15
.
A seguir, são apresentados os fundamentos dos dois principais métodos de análise
exploratória.
14
Figura 2: Esquema da seqüência usada na análise multivariada dos dados experimentais,
ACP (Análise de Componentes Principais) e AH (Análise Hierárquica).
x
ACP
=
npnn
p
p
xxx
xxx
xxx
X
...
::::
...
...
21
22221
11211
AH
PRÉ-PROCESSAMENTO
15
2.2.1 Pré-Processamento das Amostras
2.2.1.1 Normalização
A normalização nas amostras é feita dividindo cada variável por uma constante. Os
dois tipos mais comuns são a normalização por área unitária ou por comprimento do vetor
unitário.
2.2.1.2 Normalização por Área Unitária
Esta normalização é feita dividindo cada valor original pela soma de todos os valores
absolutos das medidas, Equação 12. Este procedimento para os dados cromatográficos tem a
finalidade de corrigir a variação do volume da amostra injetado no cromatógrafo, sem destruir
a proporcionalidade das substâncias orgânicas
15
,
∑
=
=
p
1j
xj/
ij
x
ij
'x , (12)
no qual x'
ij
refere-se aos dados normalizados, da amostra i e variável j.
2.2.1.3 Normalização por Comprimento do Vetor
Esta normalização é feita dividindo cada valor original pela raiz da soma dos
quadrados de todos os valores das variáveis da mesma linha, Equação 13. A finalidade é
remover a variação sistemática, normalmente associada com a quantidade total da amostra
15
.
16
∑
=
=
p
1j
2
ijij
x/x'x
. (13)
2.2.2 Pré-Processamento das Variáveis
2.2.2.1 Escalonamento por Variância
Os valores originais da variável j são divididos pelo desvio padrão da variável,
Equação 14.
j
ij
ij
s
x
x' = . (14)
2.2.2.2 Centrar na Média
Corresponde a subtrair o valor de cada elemento da coluna pelo valor médio dos
elementos dessa coluna, Equação 15, resultando em uma matriz, no qual todas as colunas
passarão a ter média zero. Esta operação corresponde a mover a origem do sistema de
coordenadas para o centro dos dados
15
,
j
x
ij
x
ij
'x
−
=
, (15)
no qual
N
i
x
j
x
∑
= .
17
2.2.2.3 Autoescalonamento
Neste caso os valores originais em cada coluna são subtraídos pelas respectivas médias
e divididos pelo desvio padrão, Equação 16. Este procedimento transforma as variáveis
originais em novas variáveis com média zero e variância igual a um,
j
s
j
x
ij
x
ij
'x
−
=
, (16)
no qual s
j
é o desvio padrão para a variável j.
2.2.2.4 Normalização Seguida de Autoescalonamento
Neste procedimento os dados são primeiro normalizados por área unitária ou por
comprimento do vetor. Em seguida, esses valores são subtraídos das respectivas médias
(colunas) e divididos pelo desvio padrão.
2.3 Análise de Componentes Principais (ACP)
A ACP é um método que tem por finalidade básica, a redução de dados a partir de
combinações lineares das variáveis originais
15
. Na ACP, a decomposição é calculada através
da diagonalização da matriz X
t
X e XX
t
. A matriz X (n x p), formada por n objetos e p
variáveis é decomposta no produto de duas matrizes menores:
X = T x P’ + ε, (17)
18
no qual T é a matriz dos escores das componentes principais, P é a matriz “loadings” (pesos)
das componentes principais, ε é a matriz dos resíduos. O sobrescrito t indica a transposta da
matriz e q é um escalar que indica o número de componentes principais que descreve a maior
parte da variância dos dados. Este procedimento está representado esquematicamente na
Figura 3.
Figura 3: Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas matrizes.
Após os cálculos, os resultados são utilizados para interpretar a distribuição das
amostras num gráfico bidimensional das componentes principais e posteriormente identificar
e julgar a importância das variáveis originais escolhidas, pois as variáveis originais com
maiores valores de loadings na combinação linear das componentes principais são as mais
importantes no ponto de vista estatístico.
2.4 Análise Hierárquica (AH)
A “análise hierárquica de agrupamentos” é um nome coletivo dado a uma grande
variedade de técnicas que permitem a separação dos objetos ou variáveis em grupos
diferentes. O método mais utilizado é a análise hierárquica de agrupamentos (AH)
19
.
A AH descreve a estrutura dos dados interligando as amostras por suas associações,
revelando os agrupamentos naturais existentes no conjunto de dados, com base na informação
q
.
p
p
n
X
n
q
T
P
t
n
p
ε
=
+
19
das variáveis medidas. Graficamente, a hierarquia pode ser representada na forma de um
gráfico bidimensional chamado de dendrograma, no qual as amostras semelhantes, segundo as
variáveis escolhidas, são agrupadas entre si.
Existem muitas maneiras de procurar agrupamentos no espaço p-dimensional. A
maneira matematicamente mais simples consiste em agrupar os pares de pontos (amostras)
que estão mais próximos, usando a distância Euclidiana definida na Equação 18, e substituí-
los por um novo ponto, localizado na metade da distância entre eles.
(
)
[
]
2
1
p
1j
2
kjijik
xxd
∑
=
−= . (18)
Nesta equação, d
ik
é a distância Euclidiana entre os pontos i e k. O procedimento
descrito é repetido até que todos os pontos sejam agrupados em um só ponto, levando à
construção do dendrograma, no qual no eixo horizontal são colocadas as amostras e no eixo
vertical a distância. Considera-se que quanto menor a distância entre os pontos, maior a
similaridade entre as amostras representadas por eles. A similaridade é convenientemente
definida pela Equação 19,
−=
máxik
ik
ik
)(d
d
1s , (19)
no qual s
ik
é a similaridade entre as amostras i e k e (d
ik
)
máx
é a distância máxima entre dois
pontos de um conjunto de dados no espaço p-dimensional. Para amostras idênticas, s
ik
= 1,
enquanto que s
ik
= 0 corresponde a dois pontos separados pela maior distância constatada no
conjunto estudado.
20
Os valores de similaridade são colocados na forma de uma matriz. Os pontos mais
similares são agrupados e o resultado é representado na forma de um dendrograma. Os valores
correspondentes a estes pontos são substituídos na matriz na forma de grupos, os quais
correspondem aos pares de pontos mais similares. Calcula-se uma nova matriz de
similaridade, cuja dimensão é menor que a original. Este processo continua até que todos os
pontos estejam contidos em um agrupamento, no qual se pode visualizar as similaridades
entre as amostras ou variáveis. A análise de agrupamentos complementa a análise de
componentes principais, sendo uma outra forma de visualizar as semelhanças e diferenças na
composição das amostras.
21
Capítulo III
Descrição
Experimental
3. DESCRIÇÃO EXPERIMENTAL
Neste capítulo, serão abordados os aspectos relacionados aos procedimentos
experimentais para a obtenção de dados espectroscópicos e avaliação da DL
50
e atividade
antinociceptiva das folhas de Vernonia condensata Baker. Um resumo do procedimento
experimental está apresentado na Figura 4.
Figura 4: Procedimento experimental para a obtenção de dados espectroscópicos e avaliação
da DL
50
e atividade antinociceptiva das folhas de Vernonia condensata Baker.
Obtenção do extrato
Análise exploratória da
composição química dos
extratos
UV-Vis, FTIR
Testes
farmacológico
e toxicológico
200 300 400 500 600 700 800 900
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
5 00 1 000 15 00 20 00 2 50 0 3 000 3 500 4 000
20
30
40
50
60
70
80
90
1 00
% Tra nsm itância
Núm ero de on da (c m
-1
)
Amo stra
Diclo rometan o
Etanol
Análise dos dados
23
3.1 Planta
A espécie estudada foi Vernonia condensata Baker, classificada pelo taxonomista
Manuel R.C. Paiva do Departamento de Biologia Animal e Vegetal da Universidade Estadual
de Londrina. A planta foi coletada no jardim experimental do Departamento de Química e a
exsicata foi depositada no herbário da Universidade Estadual de Londrina com o número de
registro 38.694. A Figura 5 mostra as fotos da espécie Vernonia condensata Baker e da
exsicata depositada no herbário FUEL.
Figura 5: Foto da espécie Vernonia condensata Baker e da exsicata depositada no herbário
FUEL.
24
3.2 Características da Espécie Vernonia condensata Baker
9
Nome popular: boldo, alumã, figatil, boldo-goiano, boldo-baiano, heparém, árvore-do-
pinguço;
Família: Asteraceae (Compositae);
Gênero: Vernonia;
Características botânicas relevantes: Arbusto grande ou arvoreta, pouco ramificada, de
ramos quebradiços de 2-4 metros de altura. Folhas simples, membranáceas, glabras, de
5-12 centímetros de comprimento. Flores discretas, de coloração esbranquiçada,
reunidas em pequenas panículas terminais e axilares de capítulos alongados;
Folhas com sabor amargo seguido de doce quando mastigadas.
3.3 Equipamentos
Os equipamentos utilizados neste trabalho foram: balança analítica Adventurer
OHAUS; evaporador rotativo FISATOM 802; desumidificador Pyrex 40/35; liquidificador
Britânia; sonicador Ultra Cleaner 750; espectrômetro de infravermelho OMNIC Nexus 470
FT-IR Thermo Nicolet; espectrofotômetro OCEAN OPTICS modelo CHEM 2000 UV-Vis.
3.4 Reagentes e Fármacos
Os reagentes utilizados na extração e análise no UV-Vis foram: álcool etílico absoluto
P.A. (99,5%) da marca VETEC; acetato de etila P.A. (99,5%) da marca VETEC;
diclorometano P.A. (99,5%) da marca VETEC; acetona P.A. (99,5%) da marca VETEC. Para
análise no FTIR foram usados: clorofórmio P.A-ACS da marca Synth (99,85%) e brometo de
25
potássio P.A-ACS da marca Synth (99%). Para a identificação de metabólitos secundários
foram utilizados: nitrato de bismuto (III) P.A. da marca VETEC; ácido nítrico P.A. da marca
Nuclear; iodeto de potássio P.A-ACS da marca VETEC; cloreto férrico P.A. da marca
BIOTEC; ácido clorídrico P.A. da marca VETEC; hidróxido de sódio P.A-ACS da marca
ECIBRA e hidróxido de amônio da marca CHEMCO.
Para a realização dos testes de antinocicepção foram usados: ácido acético glacial P.A.
da marca BIOTEC; ibuprofeno (Spidufen
®
400) 400 mg/envelope, granulado, do laboratório
Zambon Switzerland Ltda; óleo de castor (cremophor
®
) da marca Basf.
3.5 Processo de Extração
Uma das preocupações no processo de extração é a manutenção das substâncias da
planta, portanto deve ser realizada de maneira cuidadosa. Na extração nem sempre se utiliza
um único solvente, mas misturas de diferentes solventes com polaridades diferentes. Por outro
lado, o meio extrativo depende, sobretudo, da solubilidade das substâncias a extrair e de sua
estabilidade, sendo assim a escolha da melhor condição experimental foi feita através de um
planejamento experimental centróide simplex
18
.
Os extratos das folhas foram preparados por turbólise com extração exaustiva. A
turbolização ou turboextração é um método de extração utilizado para a preparação rápida de
extratos vegetais
19
. A técnica baseia-se na redução drástica do tamanho da partícula e a rápida
dissolução dos componentes, devido à aplicação de elevadas forças de cisalhamento, geradas
no pequeno espaço compreendido entre o extrator e um rotor de alta velocidade à temperatura
ambiente. Esta técnica é vantajosa em processamentos de pequena e média escala
19
.
26
3.6 Escolha dos Solventes
Uma alternativa para a escolha do melhor solvente extrator é a utilização do
triângulo de solvente seletividade proposta por Snyder
20
para cromatografia. Esta
abordagem conduz a uma descrição dos diferentes solventes em termos de sua acidicidade,
basicidade e dipolaridade. A classificação original do triângulo de solvente seletividade foi
feita com base na repartição das diversas interações polares que um solvente é capaz: ácida
(x
d
), básica (x
e
) e dipolar (x
n
). Valores de x
d
é a medida das interações do solvente com o
dioxano, x
e
é a medida das interações com o etanol e x
n
é a medida das interações com
nitrometano.
As interações destes coeficientes x
i
: (i = d, a ou n) estão corretas para interações
apolares (dispersivas) e são normalizados para a polaridade total do solvente, x
d
+ x
e
+ x
n
=
1. Um gráfico usando coordenadas triangulares para exibir os valores de x
i
para diferentes
solventes resultou no triângulo de seletividade mostrado na Figura 6.
Figura 6: Triângulo de solvente seletividade de Snyder.
27
Solventes que estão perto dos vértices do gráfico da Figura 6 possuem essencialmente
um tipo de seletividade que pode ser acidicidade, basicidade ou dipolaridade, enquanto
solventes dentro do triângulo são capazes de todas as três interações.
A vantagem do triângulo de Snyder é o agrupamento de solventes de acordo com o
tipo de interação com os compostos de interesse. Solventes quimicamente semelhantes que
possuem parâmetros de seletividade similares (x
e
, x
d
e x
n
) e fazem parte do mesmo grupo,
embora possam apresentar diferentes valores de polaridade
20
.
Um conjunto de três parâmetros chamados de solvatocrômicos, semelhantes ao x
d
, x
e
e
x
n
, foi concebido para descrever a acidicidade (α), basicidade (β) e dipolaridade (π*). Os
valores destes parâmetros para diferentes solventes foram derivados da espectroscopia (daí o
nome solvatocrômico) e de outras medidas, que foram especificamente designadas para a
medida de uma única interação. Os valores dos parâmetros solvatocrômicos são médias de
resultados obtidos com vários solutos investigados para cada parâmetro, em contraste com os
parâmetros do triângulo de solvente seletividade no qual se baseou na propriedade
termodinâmica de um único soluto
20
.
Estes valores de α, β e π* para cada solvente foram primeiro normalizados pela soma
dos valores de α, β e π* (= Σ) e, em seguida, expressando a acidicidade, basicidade e
dipolaridade de cada solvente como a interação de coeficientes fracionários α/Σ (acidicidade),
β/Σ (basicidade) e π*/Σ (dipolaridade). A Tabela 1 apresenta a classificação dos solventes e
das misturas de solventes de acordo com os parâmetros de seletividade normalizados.
28
Tabela 1: Classificação dos solventes de acordo com a seletividade normalizada
Fatores de Seletividade Normalizados
Solventes e misturas
de solventes
π*/Σ α/Σ β/Σ
1 (etanol) 0,25 0,39 0,36
2 (acetato de etila) 0,55 0,00 0,45
3 (diclorometano) 0,73 0,27 0,00
4 (acetona) 0,56 0,06 0,38
5 (et-ae) 0,4 0,195 0,405
6 (et-dc) 0,49 0,33 0,18
7 (et-ac) 0,405 0,225 0,37
8 (ae-dc) 0,64 0,135 0,225
9 (ae-ac) 0,55 0,03 0,415
10 (dc-ac) 0,645 0,165 0,19
11 (et-ae-dc) 0,51 0,22 0,27
12 (et-ae-ac) 0,45 0,15 0,4
13 (et-dc-ac) 0,51 0,24 0,25
14 (ae-dc-ac) 0,61 0,11 0,28
15 (et-ae-dc-ac) 0,52 0,18 0,3
Água 0,45 0,43 0,18
29
A Figura 7 mostra o triângulo de seletividade baseado nos dados da Tabela 1.
Figura 7: Triângulo de seletividade baseado nos dados solvatocrômicos da Tabela 1.
O posicionamento dos diferentes tipos de solventes ou misturas de solventes na Figura
7 é esperado. Por exemplo, diclorometano é um forte doador de prótons e um fraco receptor,
além de ter um caráter altamente dipolar e por isso está localizado sobre o eixo acidicidade-
dipolaridade. Devido ao alto valor de dipolaridade, o diclorometano extrai preferencialmente
compostos que contém moléculas com grupo funcional polar, tais como éteres, ésteres,
sulfetos, sulfóxidos, tióis, hidroxilas, halogênios, aldeídos, cetonas, compostos com ligação
nitro (-NO
2
) e nitrila (-CN), etc.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Aq
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Basicidade
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acidicidade
0,00 0,25 0,5 0 0,75 1,00
Dipolaridade
β/Σ
β/Σβ/Σ
β/Σ
π
ππ
π
*
/Σ
/Σ/Σ
/Σ
α/Σ
α/Σα/Σ
α/Σ
30
Acetato de etila, acetona e a mistura binária destes solventes (mistura 9) apresentam
um caráter básico e dipolar, sendo fortes receptores de prótons, portanto, estes solventes
interagem preferencialmente com compostos que possuem caráter ácido, ou seja, fortes
doadores de prótons, como ácidos carboxílicos, álcoois, fenóis, etc.
O etanol apresenta altos valores de acidicidade (α) e basicidade (β), e um valor
dipolaridade (π*) um pouco menor (α ≅ β > π), por este motivo ele se encontra próximo ao
centro do triângulo. As misturas binárias do etanol com acetato de etila e acetona, misturas 5 e
7 respectivamente, e a mistura ternária destes três solventes (mistura 12), apresentam um
caráter mais básico e dipolar. Isso ocorre porque o acetato de etila e a acetona apresentam
valores de α ≅ 0. Entretanto a mistura binária etanol-diclorometano (mistura 6) apresenta um
caráter bastante ácido e dipolar devido ao diclorometano apresentar altos valores de π* e α e
um valor de β = 0. Misturas ternárias do etanol com diclorometano e acetato de etila ou
acetona (misturas 11 e 13) apresentam valores de α e β bastante próximos (π* > α ≅ β).
A maior parte das misturas está localizada próxima do eixo de dipolaridade (π*) e
basicidade (β), isso ocorre porque o acetato de etila e a acetona apresentam valores de α ≅ 0 e
o diclorometano β = 0. Em compensação estes três solventes apresentam altos valores de π*,
fazendo com que as misturas que contém estes solventes apresentem principalmente interação
dipolar e no processo de extração estas misturas extraem preferencialmente compostos com
interação dipolo.
Dos solventes puros, somente o etanol e a água são capazes de apresentar as três
interações. Mas água por ser um forte doador de prótons, apresenta um caráter ácido e dipolar
e extraem preferencialmente compostos de natureza básica como ésteres, cetonas, aminas, etc.
31
3.7 Preparo do Sistema Extrator
O sistema extrator foi escolhido seguindo um planejamento experimental do tipo
Centróide-Simplex com quatro componentes
18
. Este planejamento é representado por
tetraedro, mostrado na Figura 8, no qual os pontos 1, 2, 3 e 4 (vértices) correspondem aos
solventes puros: etanol (et), acetato de etila (ae), diclorometano (dc) e acetona (ac). Os pontos
5, 6, 7, 8, 9 e 10 (arestas) correspondem às misturas de volumes iguais dos solventes (et-ae);
(et-dc); (et-ac); (ae-dc); (ae-ac) e (dc–ac), respectivamente. Os pontos 11, 12, 13 e 14 (centro
de cada face) correspondem às misturas de volumes iguais dos solventes (et-ae-dc); (et-ae-
ac); (et-dc-ac) e (ae-dc-ac), respectivamente, e finalmente o ponto 15 (central) que
corresponde à mistura de volumes iguais dos quatro solventes. A Tabela 2 mostra a matriz do
planejamento experimental com quatro componentes, totalizando 15 misturas de solventes.
Figura 8: Planejamento experimental do tipo Centróide simplex com 4 componentes.
2
12
13
(et)
(dc)
(ac)
(et
-
ae)
(et
-
dc)
(et
-
ac)
(ae
-
dc)
(dc
-
ac)
(et
-
ae
-
dc)
(et
-
ae
-
ac)
(ae
-
dc
-
ac)
(et
-
ac
-
dc
-
ac)
1
3
4
5
7
8
9
10
11
14
15
(ae)
(ae
-
ac)
(et
-
dc
-
ac)
6
32
3.8 Preparo dos Extratos
Os extratos foram preparados de acordo com a seqüência apresentada na Figura 9. Os
15 extratos foram preparados pesando-se 3,0 g de folhas previamente desidratadas e trituradas
da Vernonia condensata Baker e submetidas à extração exaustiva com 60 mL de solvente ou
misturas de solventes. Estas misturas ficaram em repouso por 24 horas, em seguida foram
filtradas com algodão e submetidas à concentração num evaporador rotativo a uma
temperatura inferior a 65°C.
Tabela 2: Matriz de planejamento para a escolha do solvente extrator
Solventes
Extrato
Etanol Acetato de etila Diclorometano Acetona
1 1 0 0 0
2 0 1 0 0
3 0 0 1 0
4 0 0 0 1
5 1/2 1/2 0 0
6 1/2 0 1/2 0
7 1/2 0 0 1/2
8 0 1/2 1/2 0
9 0 1/2 0 1/2
10 0 0 1/2 1/2
11 1/3 1/3 1/3 0
12 1/3 1/3 0 1/3
13 1/3 0 1/3 1/3
14 0 1/3 1/3 1/3
15 1/4 1/4 1/4 1/4
33
Ao final do processo de extração, os extratos foram secos em capela à temperatura
ambiente com o auxílio de um ventilador para que pudessem ser calculados os rendimentos.
Ao final do processo de extração foram obtidos 15 diferentes extratos brutos.
Figura 9: Seqüência do procedimento para o preparo dos extratos para a escolha do solvente
extrator.
3.9 Extrato Aquoso
O extrato aquoso foi preparado pesando-se 30 g de folhas previamente desidratadas e
trituradas da Vernonia condensata Baker e submetidas à extração com 600 mL de água
destilada em 60°C por 30 minutos. Esta mistura foi filtrada em algodão, congelada e
liofilizada.
Planta
Extrato bruto
3,0 g de folhas
secas
Extração exaustiva
Secagem e trituração
Maceração com solventes do
planejamento experimental
Secagem do solvente
Remaceração
24 horas
34
3.10 Fracionamento dos Extratos
Para a investigação dos constituintes presentes nos extratos da planta, o extrato foi
submetido a um fracionamento químico prévio das principais classes de metabólitos. Neste
procedimento, a quantidade e os tipos de componentes separados nas diferentes frações
variam com a planta
5
. O fracionamento dos extratos foi feito de acordo com o esquema da
Figura 10.
Figura 10: Esquema utilizado para o fracionamento dos extratos brutos.
Evaporar
Resíduo
Extrair com
Acetato de etila
(3x). Filtrar.
Resíduo
(Polissacarídeos)
Filtrado
Fração neutra
(Gorduras e graxas)
0,1g do extrato bruto
Homogeneizar por 5 minutos com CH
3
OH
–
água
destilada (4:1). Filtrar.
Concentrar para 1/10 do volume.
Acidificar com H
2
SO
4
.
Extrair com CHCl
3
(3 vezes).
Filtrado
Fase orgânica
Fração de polaridade
intermediária
Fase aquosa
Fase CHCl
3
– CH
3
OH
Fração básica
(Alcalóides)
Fase aquosa
Fração polar
(Alcalóides quaternários
e N-óxidos)
Basificar até pH 10
com NH
4
OH
Extrair com CHCl
3
e
CH
3
OH (3:1, 2 vezes)
(Terpenóides e compostos fenólicos)
Fibra
Evaporar
35
3.11 Análise por Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR)
Para a análise, 0,5 mg de cada extrato bruto foi misturado uniformemente com 150 mg
de KBr e algumas gotas de clorofórmio para ajudar a dissolver o extrato. Os espectros foram
registrados na região de 4000-400 cm
-1
, em resolução de 1,93 cm
-1
e média de 40 leituras.
3.12 Análise por Espectrofotometria no Ultravioleta-visível (UV-Vis)
Para a análise por espectrofotometria no UV-Vis foram pesados 50 mg do extrato
bruto e diluídos em 3 mL do solvente extrator. Após uma hora, estas misturas foram filtradas
em filtro de papel. Para a leitura diluiu-se 40 µL desta solução em 1960 µL do solvente. Os
espectros foram registrados no comprimento de onda entre 189-890 nm.
3.13 Identificação de Metabólitos Secundários Presentes na Planta
3.13.1 Reagente de Dragendorff
Solução A: dissolveram-se 8,0 g de nitrato de bismuto (III) em 20 mL de ácido nítrico
diluído 30%.
Solução B: dissolveram-se 22,8 g de iodeto de potássio em um volume mínimo de
água.
Reagente: a solução A foi vertida lentamente sobre a solução B e, após repouso de
uma hora a solução foi filtrada. Em um balão completou-se o volume para 100 mL e a solução
foi guardada ao abrigo de luz.
36
3.13.2 Ensaios de Identificação
3.13.2.1 Alcalóides
A cada 0,1 g de extrato bruto, adicionaram-se 10 mL de seu respectivo solvente
extrator. Em uma placa de toque, adicionaram-se cinco gotas da solução do extrato e duas
gotas do reagente de Dragendorff. Um precipitado de coloração laranja indica a presença de
alcalóides.
3.13.2.2 Saponinas
Pesou-se 0,1 g da planta seca (folhas), acrescentaram-se 5 mL de água destilada e
ferveu-se durante 5 minutos. Logo após o resfriamento, agitou-se vigorosamente por 15
minutos. Classifica-se a presença de saponinas pela formação de espuma persistente.
3.13.2.3 Compostos Fenólicos
Preparou-se uma solução de FeCl
3
a 10%. Em uma placa de toque adicionaram-se
cinco gotas do extrato e de FeCl
3
. O teste é positivo para compostos fenólicos com o
surgimento de coloração verde.
3.13.2.4 Taninos
Pesaram-se 5 g de planta seca e adicionaram-se 100 mL de água destilada e ferveu-se
durante 15 minutos. Filtrou-se a solução e deixou-se esfriar. Transferiram-se 2 mL desta
37
solução e adicionaram-se de 4 gotas de solução de FeCl
3
a 1% em metanol. O surgimento de
coloração azul indica a possível presença de taninos hidrolisáveis e a coloração verde de
taninos condensados.
3.13.2.5 Flavonóides
Pesaram-se 10 g da folha seca e moída e adicionaram-se 90 mL de etanol a 75%.
Deixou-se esta solução no banho ultrassônico por 15 minutos e, logo após, filtrou-se em
algodão e colocou-se 2 mL em uma cápsula de porcelana e deixou-se evaporar em banho-
maria a 45°C até a secura (25 a 40 minutos). Lavou-se o resíduo da cápsula com 0,2 mL de
clorofórmio para eliminação da clorofila, ainda no banho. Solubilizou-se o resíduo da cápsula
com 1 mL de etanol 70% e transferiu-se para um tubo de ensaio. Em seguida adicionou-se ao
tubo de ensaio raspas de magnésio metálico. Verteu-se cuidadosamente, pelas paredes do
tubo, aproximadamente 0,3 mL de HCl concentrado. O surgimento de coloração rósea
confirma a presença de flavonóides.
3.14 Animais
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) da linhagem Swiss albinos, machos
com idade de 70 dias, provenientes do Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Estadual de Londrina. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento
de Ciências Fisiológicas sob condições controladas de temperatura (23±2°C) e iluminação
(ciclo claro-escuro de 12 horas), com livre acesso à água e ração.
38
3.15 Determinação da Dose Letal 50% (DL
50
)
A DL
50
é um teste cujo parâmetro avaliado é a morte do animal. Comitês
internacionais têm desenvolvido protocolos que minimizam o número de animais utilizados.
A determinação da DL
50
foi realizada de acordo com o guia editado pela Organização para o
Desenvolvimento e Cooperação Econômicos
14
. Os extratos foram dissolvidos em uma mistura
contendo água destilada e óleo de castor (cremophor
) 5% (v/v). Uma dose de cada extrato de
Vernonia condensata foi administrada por via oral (método de gavage) a três camundongos
previamente mantidos em jejum de três horas com água a vontade. A mortalidade foi
monitorada por 14 dias. Finalizado este período, outros três camundongos receberam mais
uma dose de cada extrato que foi escolhida dependendo do número de animais mortos na
etapa anterior. Se a mortalidade foi igual ou inferior à obtida na etapa anterior, o teste foi
finalizado e a DL
50
foi estimada. Caso contrário, outros três animais foram utilizados. O
Organograma das etapas encontra-se na Figura 11.
Figura 11: Procedimento para a avaliação da DL
50
com dose inicial de 2000mg/kg.
2-3 0-1
2-3
0-1 2-3 0-1 2-3 0-1
0
0
0-1
2-3 0-1
2-3 0-1
2-3
0-1
2-3
5 mg/kg
3 animais
50 mg/kg
3 animais
300 mg/kg
3 animais
2000 mg/kg
3 animais
Início
5 mg/kg
3 animais
50 mg/kg
3 animais
300 mg/kg
3 animais
2000 mg/kg
3 animais
3 (em 50) no
1º passo
Outro Outro
Outro
3 (em 300)
no 1º passo
3 (em 2000)
no 1º passo
2 (em 2000)
no 1º passo
1
0
25 5
50
30 200 300 500 1000 2000
2500 5000
∞
Categoria
> 0-5
Categoria 2
> 5-50
Categoria 3
> 50-300
Categoria 4
> 300-2000
Categoria 5
> 2000-5000
Categoria 6 ou não
classificada
1
39
3.16 Atividade Antinociceptiva
Para a avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos das folhas de Vernonia
condensata Baker, foi utilizado o modelo de contorções abdominais, o qual é uma
metodologia clássica para tal avaliação
21
. Para o ensaio das contorções abdominais, cada
grupo experimental consistiu de oito animais para cada dose. Os extratos foram dissolvidos
em uma mistura contendo água destilada e óleo de castor (Cremophor
) 5% (v/v). Esta
mistura foi denominada como solução veículo.
Os animais foram mantidos em jejum durante cinco horas antes de receberem, por
gavage, os diferentes extratos da planta nas doses de 40, 80 e 160 mg/kg ou seu veículo. Vinte
minutos após, administrou-se, por via intraperitoneal, ácido acético 0,8%, na razão de 0,1
mL/10 g de massa corpórea do animal. Os animais foram observados por 20 minutos e
anotou-se o número de contorções abdominais que eles apresentaram. Considerou-se uma
contorção abdominal o comportamento do animal de arrastar sua barriga e esticar as patas
traseiras.
Para monitorar a eficácia da metodologia, foi feito um grupo controle positivo para
cada três extratos da planta testados. Os animais deste grupo receberam uma droga de
referência, o analgésico ibuprofeno, na dose de 200 mg/kg via intraperitoneal e, 20 minutos
após, receberam o ácido acético como descrito anteriormente.
40
Capítulo IV
Resultados
e
Discussão
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Rendimentos dos Extratos
A primeira etapa do trabalho foi avaliar o rendimento em massa dos extratos no
processo de extração das folhas de Vernonia condensata Baker. A Figura 12 mostra o gráfico
dos valores da massa em gramas para os 15 extratos.
Figura 12: Gráfico dos rendimentos obtidos usando planejamento de misturas de quatro
componentes.
Observa-se que os maiores rendimentos em massa foram obtidos nas misturas de
solventes com a presença do etanol em sua formulação, como nos extratos 13, 7, 5, 6, 12 e 1
respectivamente. Os menores rendimentos em massa foram observados nas misturas de
solventes que tinham acetato de etila, como nos extratos 2, 8 e 9 respectivamente.
Mas este tipo de análise é um tanto impreciso, pois se perde informação importante
sobre o sistema estudado. Sendo assim estes efeitos foram investigados por modelos de
misturas. Estes experimentos multivariados permitem explorar os efeitos de várias variáveis
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
et-ae-dc-ac
ae-dc-ac
et-dc-ac
et-ae-ac
et-ae-dc
dc-ac
ae-ac
ae-dc
et-ac
et-dc
et-ae
acetona
diclorometano
acetato de etila
Pesos (g)
Pontos do Planejamento
etanol
42
simultaneamente e extrair o máximo de informação do sistema que está sendo investigado, de
uma maneira mais eficiente quando comparado com o procedimento univariado, ou seja, uma
variável por vez
19
.
Para avaliar o efeito dos solventes no rendimento dos extratos, foram testados
diferentes modelos de misturas com quatro componentes que permitem explorar os efeitos dos
quatro solventes simultaneamente no processo de extração.
Os dados foram ajustados ao modelo cúbico especial e a equação obtida para este
modelo está apresentada na Equação 20:
0,552)(0,552)(
0,552)(0,552)(0,083)(0,083)(0,083)(0,083)(
0,083)(0,083)(0,017)(0,017)(0,017)(0,017)(
ac0,8967aedcetdcac
ac0,3941etaedc1,4850etaedcacaeacaedcetac
etdcetaeacdcaeety
ˆ
±±
±±±±±±
±±±±±±
+
++−+−−
+
+
+
+
+
+
+
=
3,2579
0,29860,12370,27660,4900
0,17760,69750,28720,33080,14220,3951
(20)
ŷ é a resposta prevista pelo modelo, et = etanol, ae = acetato de etila, dc =
diclorometano e ac = acetona. Os valores entre parênteses são os erros padrão dos parâmetros.
A equação apresenta 14 termos dos quais 11 são significativos (termos em negrito). Os
valores obtidos mostram que o etanol tem maior poder de extração, seguido pelo
diclorometano e acetona. Os valores dos coeficientes etae (0,6975) e etac (0,4900) sugerem
uma interação sinérgica entre as misturas etanol-acetato de etila e etanol-acetona. O valor do
coeficiente etdcac (3,2579) mostra que a presença simultânea dos três componentes na
extração produzirá um maior rendimento.
O modelo foi investigado examinando os gráficos de contorno das superfícies de
respostas, Figura 13. Esses contornos mostram que os maiores rendimentos, em torno de 0,55
g, são obtidos perto do ponto central do triângulo (Figura 13c), isto é, quando a mistura de
solventes é mais rica em etanol, diclorometano e acetona.
43
A Figura 14 mostra o gráfico dos resíduos versus resposta de rendimentos prevista
pelo modelo, observa-se que a distribuição dos resíduos não revela tendências. O gráfico da
Figura 15, dos rendimentos previstos versus rendimentos observados (resposta experimental),
confirmam claramente a qualidade do modelo.
Figura 13: Curvas de nível para o rendimento dos extratos das folhas de Vernonia condensata
Baker usando o modelo cúbico especial de misturas de quatro componentes.
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Diclorometano
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de e tila
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de e tila
0,55
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
0, 38
0, 34
0, 3
0, 26
0, 22
0, 18
0, 14
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetato de etila
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorom etano
a) b)
c) d)
44
Figura 14: Resíduos deixados pelo modelo cúbico especial no estudo do rendimento do
extrato das folhas de Vernonia condensata Baker.
Figura 15: Respostas previstas pelo modelo cúbico especial.
12 34
56 78 9 10
11 12 1314
15
0.0 0.1 0.2 0.3 0. 4 0.5 0. 6 0.7
Valores previstos
-0.06
-0.05
-0.04
-0.03
-0.02
-0.01
0.00
0.01
0.02
0.03
Resíduos
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0. 7
Valores observados
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Valores previstos
45
4.2 Análise por Espectrofotometria no Ultravioleta-Visível
Os 16 extratos obtidos usando o planejamento de misturas com quatro componentes e
o extrato aquoso foram analisados por espectrofotometria no UV-Vis. A Figura 16 mostra os
espectros de todos os extratos:
Figura 16: Espectro no UV-Vis dos 16 extratos obtidos das folhas de Vernonia condensata
Baker.
Os dados dos espectros obtidos na região de 188 a 890 nm foram dispostos numa
matriz 16 x 2048. Estes dados foram autoescalonados e sujeitos a análise de componentes
principais e análise hierárquica. Três componentes (fatores) permitem explicar 96,89% da
200 300 400 500 600 700 800 900
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Extrato aquoso
1 Etanol (et)
2 Acetato de etila (ae)
3 Diclorometano (dc)
4 Acetona (ac)
5 et-ae
6 et-dc
7 et-ac
8 ae-dc
9 ae-ac
10 dc-ac
11 et-ae-dc
12 et-ae-ac
13 et-dc-ac
14 ae-dc-ac
15 et-ae-dc-ac
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
46
variância dos dados. A Figura 17 mostra a projeção do fator 2 com o fator 3, no qual é
possível ver a formação de sete grupos. O fator 2 separa os grupos I, II e III, extraídos em
acetona, acetato de etila ou ambos, localizados na parte negativa e os grupos IV, V, VI e VII
extraídos em etanol, diclorometano ou ambos e água pura, localizados na parte positiva. Já o
fator 3 separa os grupos II, III, IV e V na parte positiva e os grupos I e VII na parte negativa.
O grupo VI ficou numa posição intermediária.
Figura 17: Gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 dos extratos no ultravioleta-visível, que
explicam 19,05 % da variância total.
47
AQ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Fator 2
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
Fator 3
Grupo I
Grupo V
Grupo VII
Grupo VI
Grupo IV
Grupo III
Grupo II
O gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3, Figura 18, mostra as variáveis com maior
influência na discriminação dos extratos.
Figura 18: Gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 dos extratos no UV-Vis.
Os resultados da análise de componentes principais sugerem que existem diferenças
nas composições químicas das amostras com relação ao agente extrator. Observa-se que os
valores positivos do fator 2 estão localizados no comprimento de onda de 241,54 e 287,51 nm
e influencia na separação dos grupos IV, V, VI e VII dos demais grupos. Os grupos I, II e III
posicionados na parte negativa do fator 2, são mais influenciados pelas variáveis com
comprimento de onda 409,46 nm.
200 300 400 500 600 700 800 900
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
664,45
248,35
665,9
287,51
454,06
409,46
328,86
241,54
Fator 2
Fator 3
Loadings
Comprimento de onda (nm)
413,08
48
Os valores negativos do fator 3, localizados no comprimento de onda de 328 nm,
influencia na separação dos grupos I e VII. Os grupos II, III, IV e V, posicionados na parte
positiva do fator 3, são mais influenciados pelas variáveis com comprimento de onda de
248,35, 413,8 e 454,06 nm.
A análise hierárquica foi aplicada aos dados de absorvância no ultravioleta-visível. O
resultado da AH concordou com aquele obtido pelo gráfico dos escores mostrado na Figura
17. A Figura 19 apresenta o dendrograma obtido. No valor de 18 é possível observar os sete
grupos formados na projeção do fator 2 com o fator 3.
Figura 19: Dendrograma obtido pela análise hierárquica dos 16 extratos de Vernonia
condensata Baker.
15 14 13 10 12 7 9 4 11 5 3 8 2 6 1 AQ
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Distância de ligação
I
III
II V IV VI
VII
49
As curvas de nível ajustadas à matriz do planejamento de misturas de solventes (não
incluído o extrato aquoso) e aos dados dos loadings do fator 2 utilizando o modelo cúbico
especial estão apresentados na Figura 20. Esses contornos mostram que os maiores valores de
loadings positivos são obtidos em extratos preparados em etanol, diclorometano e mistura
binária etanol-diclorometano, Figuras 20a e 20c.
Figura 20: Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e dos loadings do fator 2.
Estas curvas de nível explicam os valores positivos do fator 2 que influenciam na
separação dos grupos IV, V, VI e VII. Lembrando que a água não foi incluída no modelo. O
grupo IV é formado pelo extrato obtido em diclorometano, Figura 20d. O grupo V é formado
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Diclorometano
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
0,4
0,2
0
-0,2
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
a) b)
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetato de etila
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
c)
d)
50
por extratos obtidos em misturas etanol-acetato de etila e etanol-acetato de etila-
diclorometano, Figura 20a. O grupo VI é formado por extratos obtidos em etanol e mistura de
etanol-diclorometano, Figuras 20a e 20c. Observa-se também que os maiores sinais analíticos
são obtidos nos extratos preparados em água pura, etanol e a mistura etanol-diclorometano.
Com o auxílio da Figura 17, observa-se que a região do espectro que discrimina os
grupos IV, V, VI e VII dos grupos I, II e III está localizada entre 200 e 300 nm, como mostra
a Figura 21.
Figura 21: Espectro no ultravioleta-visível dos 16 extratos obtidos das folhas de Vernonia
condensata Baker, com destaque aos espectros dos extratos 1, 3, 6, 11 e aquoso.
200 300 400 500 600 700 800 900
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Fator 2 (200 - 300 nm)
Comprimento de onda (nm)
Absorvância
Extrato aquoso
1 Etanol (et)
2 Acetato de etila (ae)
3 Diclorometano (dc)
4 Acetona (ac)
5 (et-ae)
6 (et-dc)
7 (et-ac)
8 (ae-dc)
9 (ae-ac)
10 (dc-ac)
11 (et-ae-dc)
12 (et-ae-ac)
13 (et-dc-ac)
14 (ae-dc-ac)
15 (et-ae-dc-ac)
51
Curvas de nível ajustadas à matriz do planejamento de misturas de solventes e aos
dados dos loadings do fator 3 usando o modelo cúbico especial estão apresentados na Figura
22. Os maiores valores de loadings positivos são de extratos obtidos em diclorometano puro,
misturas binárias de acetato de etila-diclorometano e de acetato de etila-acetona.
Figura 22: Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e dos loadings do fator 3.
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Diclorometano
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetato de etila
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
c)
d)
a) b)
52
Os grupos II, III, IV e V, posicionados na parte positiva do fator 3, são mais
influenciados pelas variáveis com comprimento de onda de 350 a 500 nm. O grupo VI fica
numa posição intermediária. Os grupos III e IV, com valores mais positivos de loadings, são
formados por extratos obtidos com misturas ricas em acetato de etila e diclorometano, Figuras
22a e 22d. O grupo II é formado por extratos obtidos com acetona e acetato de etila, Figura
22b. O grupo V é formado por extratos obtidos em etanol, acetato de etila e diclorometano,
Figura 22b. A Figura 23 mostra os espectros obtidos no ultravioleta-visível dos 16 extratos
destacando as amostras e a região do espectro que sofrem maior influência das variáveis que
apresentam valores de loadings mais positivos no fator 3.
Figura 23: Espectro no ultravioleta-visível dos 16 extratos obtidos das folhas de Vernonia
condensata Baker, com destaque aos espectros dos extratos 2, 8 e 9.
200 300 400 500 600 700 800 900
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Comprimento de onda (nm)
Absorvância
Extrato aquoso
1 Etanol (et)
2 Acetato de etila (ae)
3 Diclorometano (dc)
4 Acetona (ac)
5 (et-ae)
6 (et-dc)
7 (et-ac)
8 (ae-dc)
9 (ae-ac)
10 (dc-ac)
11 (et-ae-dc)
12 (et-ae-ac)
13 (et-dc-ac)
14 (ae-dc-ac)
15 (et-ae-dc-ac)
Fator 3 (350 - 500 nm)
53
Os valores dos loadings negativos do fator 3, Figura 18, podem ser explicados
analisando as curvas de nível da Figura 22. Valores mais negativos dos loadings no fator 3
correspondem a região espectral entre 300 e 350 nm, Figura 22b, que influencia na separação
dos grupos I e VII (Figura 17). O grupo I é formado por extratos obtidos em misturas de
solventes contendo acetona. A Figura 24 mostra os espectros obtidos no UV-Vis dos 16
extratos destacando as amostras e a região do espectro que sofrem maior influência das
variáveis que apresentam valores de loadings mais negativos no fator 3.
Figura 24: Espectro no ultravioleta-visível dos 16 extratos obtidos das folhas de Vernonia
condensata Baker, com destaque aos espectros dos extratos 1, 7, 12, 14 e aquoso.
200 300 400 500 600 700 800 900
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Extrato aquoso
1 Etanol (et)
2 Acetato de etila (ae)
3 Diclorometano (dc)
4 Acetona (ac)
5 et-ae
6 et-dc
7 et-ac
8 ae-dc
9 ae-ac
10 dc-ac
11 et-ae-dc
12 et-ae-ac
13 et-dc-ac
14 ae-dc-ac
15 et-ae-dc-ac
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
Fator 3 (300- 350 nm)
54
4.3 Análise por Espectrometria no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
Os 15 extratos preparados com base no planejamento da Figura 8 e o extrato aquoso
foram analisados por FTIR e os dados obtidos foram analisados por métodos quimiométricos.
A Figura 25 mostra os espectros dos 16 extratos registrados na região entre 4000-400 cm
-1
.
Figura 25: Espectros no infravermelho das 16 extratos obtidos das folhas de Vernonia
condensata Baker.
Os dados dos espectros obtidos foram colocados numa matriz 16 x 1866 variáveis.
Estes dados foram autoescalonados e sujeitos a análise de componentes principais, três
componentes (fatores) permitem explicar 98% da variância dos dados. O gráfico dos escores
dos fatores 2 e 3 é mostrado na Figura 26. Observa-se neste gráfico a formação de 6 grupos
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Extrato aquoso
1 Etanol (et)
2 Acetato de etila (ae)
3 Diclorometano (dc)
4 Acetona (ac)
5 (et-ae)
6 (et-dc)
7 (et-ac)
8 (ae-dc)
9 (ae-ac)
10 (dc-ac)
11 (et-ae-dc)
12 (et-ae-ac)
13 (et-dc-ac)
14 (ae-dc-ac)
15 (et-ae-dc-ac)
Absorvância
Número de onda (cm
-1
)
55
distintos. Este resultado sugere que existe diferença na composição química da amostra com
relação ao agente extrator.
Figura 26: Gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 dos dados espectrais dos 16 extratos das
folhas de Vernonia condensata Baker.
O fator 2 separa os grupos III, IV, V e VI localizados na parte negativa e os grupos I e
II, localizado na parte positiva. O fator 3 separa os grupos II, III e IV, localizados na parte
positiva dos grupos I, V e VI localizados na parte negativa. O resultado da AH concordou
com aquele obtido pelo gráfico dos escores mostrado na Figura 26. A Figura 27 apresenta o
dendrograma obtido. No valor de 18 é possível observar os seis grupos formados na projeção
do fator 2 com o fator 3.
56
Aq
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
Fator 2
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
Fator 3
Grupo II
Grupo VI
Grupo V
Grupo III
Grupo IV
Grupo I
Figura 27: Dendrograma obtido baseado nos dados dos espectros FTIR dos extratos.
O gráfico dos valores dos loadings dos fatores 2 e 3 é apresentado na Figura 28. Nesta
figura podemos ver quais os números de onda que explicam a distinção entre os seis grupos
mostrados na Figura 26.
Figura 28: Gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 para as 16 amostras no FTIR.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-2
0
2
4
6
8
10
12
Fator2
Fator3
Loadings
Número de onda (cm
-1
)
2923
2852
3334
1743
1600
1465
1168
670
970
1402
57
7 6 8 3 5 4 15 13 14 10 11 9 2 12 1 Aq
0
10
20
30
40
50
60
Distância de ligação
I
II III
VI
III
V
IV
Os grupos V e VI localizados na parte negativa dos fatores 2 e 3 são mais
influenciados pelas variáveis que apresentam valores de loadings mais negativos,
principalmente no fator 3. As regiões do espectro que caracterizam essas amostras são os
números de onda de 3334, 1600 e 1402 cm
-1
. Os grupos II e III localizados na parte positiva
do fator 3 são influenciados pelas variáveis com loadings mais positivos, sendo que os
números de onda mais significativos são 2923, 2852, 1743, 1465, 1168, 970 e 670 cm
-1
.
A região em torno 3334 cm
-1
é característica de vibrações de deformação axial da
ligação O-H (ν O-H) de álcoois e fenóis (3650-3100 cm
-1
), podem ter contribuições de
absorções provenientes de vibrações de deformação axial da ligação N-H de aminas (3500-
3310 cm
-1
) e amidas (3500-3060 cm
-1
). Os picos na região de 2923 e 2852 cm
-1
são
provenientes das vibrações de deformação axial simétrica e assimétrica de C-H de alcanos
(3000-2840 cm
-1
) e de aldeídos (2830-2695 cm
-1
).
A intensa banda de absorção observada na região de 1743 cm
-1
é característica de
deformação axial de C=O (ν C=O) de ésteres (1750-1735 cm
-1
) ou, de acordo com a relação
entre a posição da carbonila e o tamanho do anel da lactona, pode ser atribuído a γ-lactonas
(1795-1760 cm
-1
) e/ou δ-lactonas (1760-1720 cm
-1
). A banda de absorção ν C=O das γ-
lactamas ocorre entre 1750 e 1700 cm
-1
e as da β-lactamas ocorre entre 1760 e 1730 cm
-1
.
A banda na região de 1600 cm
-1
pode ser proveniente de vibrações de deformação
axial da ligação C=C de alquenos (1670-1600 cm
-1
) ou de hidrocarbonetos aromáticos
mononucleares (1600-1585 cm
-1
) ou banda correspondente à deformação angular simétrica no
plano de N-H (δ
s
NH) de aminas primárias e secundárias (1650-1580 cm
-1
).
A banda na região em torno de 1465 cm
-1
pode ser uma banda de deformação angular
de C-H de alcanos, como deformação angular simétrica da ligação CH
2
(1467 cm
-1
) ou CH
3
(1380 cm
-1
) ou deformação angular assimétrica da ligação CH
3
(1450 cm
-1
). A região de 1168
cm
-1
pode indicar vibrações de deformação axial de C-O, que pode ser associada a grupos
58
funcionais como álcoois e fenóis (1260-1000 cm
-1
), ésteres e lactonas (1300-1000 cm
-1
) entre
outros. Em regiões de baixa freqüência de absorção existem muitas possibilidades, por
exemplo, vibrações de deformação angular fora do plano da ligação C-H de hidrocarbonetos
aromáticos (900-675 cm
-1
) e de alquenos (1000-650 cm
-1
).
4.4 Fracionamento dos Extratos
4.4.1 Rendimento das Frações
O fracionamento dos extratos foi realizado conforme o procedimento descrito na
Figura 10. Para facilitar a discussão dos resultados do fracionamento adotaremos a seguinte
nomenclatura da Figura 10: fração neutra (resíduo), fração intermediária (fase orgânica) e
fração polar (fase aquosa). O rendimento bruto em massa das frações obtidas está apresentado
na Figura 29.
Figura 29: Gráfico dos rendimentos em massa das frações obtidas dos extratos das folhas de
Vernonia condensata Baker.
59
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
Neutra
Polar
Intermediária
Pontos do Planejamento
Peso (g)
Aq
4.4.2 Análise das Frações por Espectrometria no Infravermelho com Transformada de
Fourier (FTIR)
4.4.2.1 Fração Intermediária
As frações intermediárias obtidas dos 15 extratos foram analisadas por FTIR. A Figura
30 mostra o espectro da fração intermediária de cada extrato.
Figura 30: Espectros no infravermelho da fração intermediária de cada extrato obtido das
folhas de Vernonia condensata Baker.
Os dados dos espectros obtidos na região de 400 a 4000 cm
-1
foram colocados numa
matriz 15 x 3700 variáveis. Estes dados foram autoescalonados e sujeitos a análise de
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Absorvância
Número de onda (cm
-1
)
1 Etanol
2 Acetato de etila
3 Diclorometano
4 Acetona
5 (et-ae)
6 (et-dc)
7 (et-ac)
8 (ae-dc)
9 (ae-ac)
10 (dc-ac)
11 (et-ae-dc)
12 (et-ae-ac)
13 (et-dc-ac)
14 (ae-dc-ac)
15 (et-ae-dc-ac)
60
componentes principais. Três componentes (fatores) permitem explicar 98% da variância dos
dados. O gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 é mostrado na Figura 31.
Figura 31: Gráfico dos escores dos fatores 2 e 3 dos dados espectrais obtidos das 15 amostras
da fração intermediária.
O gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 é apresentado na Figura 32. Este gráfico
mostra quais os números de onda que explicam a distinção entre os quatro grupos formados
na Figura 31.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
Fator 2
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Fator 3
Grupo I
Grupo III
Grupo II
Grupo IV
61
Figura 32: Gráfico dos loadings dos fatores 2 e 3 para as 15 amostras da fração intermediária.
A região em torno 3400 cm
-1
é característica de vibrações de deformação axial de O-H
(ν O-H) de álcoois e fenóis (3650-3100 cm
-1
), podem ter contribuições de absorções
provenientes de vibrações ν N-H de aminas (3500-3310 cm
-1
) e amidas (3500-3060 cm
-1
). Os
picos nas regiões de 2920 e 2850 cm
-1
são provenientes das deformações axiais simétricas e
assimétricas de C-H de alcanos (3000-2840 cm
-1
) e ν C-H de aldeídos (2830-2695 cm
-1
).
62
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
Fator2
Fator3
Loadings
Número de onda (cm
-1
)
1010-1100
1260
1775-1725
1630
1450
800
2920
2850
3400
1168
O pico na região entre 1775 e 1725 cm
-1
pode ser atribuído a uma banda de absorção
de carbonila (ν C=O) de ésteres (1750-1735 cm
-1
) ou, de acordo com a relação entre a posição
da carbonila e o tamanho do anel da lactona, pode ser atribuído a γ-lactonas (1795-1760 cm
-1
)
e/ou δ-lactonas (1760-1720 cm
-1
). A banda de absorção ν C=O das γ-lactamas ocorre entre
1750 e 1700 cm
-1
e as da β-lactamas ocorre entre 1760 e 1730 cm
-1
. A banda de absorção na
região em torno de 1630-1600 cm
-1
pode ser atribuída a vibrações de deformação angular (δ
s
N-H) de NH
2
ou de NH de amidas primárias, secundárias e algumas lactamas que têm bandas
entre 1650 e 1580 cm
-1
e pode ser proveniente também de vibrações δ N-H de aminas, que
pode ser observada entre 1650 e 1580 cm
-1
.
A banda de absorção na região de 1446-1370 cm
-1
pode ser proveniente de uma
vibração de deformação axial de C-N de amidas primárias (1400 cm
-1
) ou vibração de
deformação angular C-H de alcanos, com δ
s
CH
3
que ocorre próximo de 1375 cm
-1
ou δ
as
CH
3
próxima de 1450 cm
-1
. A região de 1260-1290 cm
-1
pode indicar a presença de C-N (ν C-N)
de aminas aromáticas primárias (1340-1250 cm
-1
), secundárias (1350-1280 cm
-1
) ou terciárias
(1360-1310 cm
-1
) ou pode ser proveniente de vibrações de deformação axial de C-O de
ésteres que ocorrem entre 1300 e 1000 cm
-1
.
A banda na região 1160 cm
-1
pode ser característica de vibrações de deformação axial
de C-O de álcoois e fenóis (1260-1000 cm
-1
) ou de ésteres de ácidos α,β-insaturados (1300-
1160 cm
-1
). As bandas de absorção observadas na região de 1100 e 1010 cm
-1
correspondem a
vibrações de deformação axial de C-N de aminas alifáticas primárias, secundárias e terciárias,
que ocorrem entre 1250 e 1020 cm
-1
.
A banda na região de 800 cm
-1
pode ser proveniente de vibrações de deformação
angular de N-H de lactamas (800-666 cm
-1
) ou de nitritos, que produzem bandas intensas de
deformação axial de N-O que ocorrem entre 850 e 750 cm
-1
.
63
A fração de polaridade intermediária é composta basicamente por terpenóides e
compostos fenólicos. A diversa, difundida e numerosa família de produtos naturais
construídas a partir do isopreno que compreendem compostos com esqueletos C5, C10, C15,
etc, são chamados terpenóides, terpenos ou isoprenóides
22
. Como subgrupo de toda a classe
dos terpenóides, temos os hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),
diterpenos (C20), e assim por diante. As lactonas sesquiterpênicas são sesquiterpenos que,
após o processo biossintético, apresenta um grupo lactona em seu esqueleto carbônico
22
. A
forte banda em 1760 cm
-1
no espectro corresponde a um estiramento da carbonila de γ-
lactona, indica a presença de lactonas sesquiterpênicas no extrato
23
. Lactonas sesquiterpênicas
de vários tipos são comuns em plantas da espécie Vernonia
24
.
Estudos mostraram que as lactonas sesquiterpênicas podem apresentar uma ampla
variedade de atividades biológicas e farmacológicas. Foram descritos que as lactonas
sesquiterpênicas podem apresentar atividades antimicrobiana, antitumoral e antiinflamatória,
efeitos nos sistemas nervoso central e cardiovascular, assim como potencial alergênico
25
.
Verificou-se que lactonas sesquiterpênicas demonstrou efeito antinociceptivo utilizando-se do
modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos
26
. Estudos de
estrutura-atividade indicam que os grupos γ-lactona e a carbonila α,β,γ,δ-insaturada presentes
nestes compostos estão relacionados com sua atividade antiinflamatória
22
.
Vários estudos têm investigado como lactonas sesquiterpênicas apresenta o seu efeito
antiinflamatório. Foi apresentado que as lactonas sesquiterpênicas modula muitos processos
inflamatórios, por exemplo, a fosforização oxidativa, liberação de histamina e serotonina.
Entretanto, apesar destes resultados, o mecanismo molecular pelo qual eles mostram o seu
efeito de antiinflamatório ainda não foi suficientemente explicado
25
.
64
4.4.2.2 Fração polar
A Figura 33 mostra o espectro obtido da fração polar de cada extrato.
Figura 33: Espectros no infravermelho da fração polar de cada extrato obtido das folhas de
Vernonia condensata Baker.
Os dados dos espectros obtidos na região de 400 a 4000 cm
-1
foram colocados numa
matriz 16 x 1869 variáveis. Estes dados foram sujeitos a análise de componentes principais.
Três componentes (fatores) permitem explicar 95% da variância dos dados. O gráfico dos
escores dos fatores 3 e 4 é mostrado na Figura 34.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Absorvância
Comprimento de onda (cm
-1
)
1 Etanol
2 Acetato de etila
3 Diclorometano
4 Acetona
5 (et-ae)
6 (et-dc)
7 (et-ac)
8 (ae-dc)
9 (ae-ac)
10 (dc-ac)
11 (et-ae-dc)
12 (et-ae-ac)
13 (et-dc-ac)
14 (ae-dc-ac)
15 (et-ae-dc-ac)
Aquoso
65
Figura 34: Gráfico dos escores dos fatores 3 e 4 dos dados espectrais obtidos das 16 amostras
da fração polar.
A distribuição dos pontos na Figura 34 pode ser representado na forma de um
tetraedro, no qual podemos colocar as frações 2 (ae), 7 (et-ac), 8 (ae-dc) e 10 (dc-ac) nos
vértices. Uma maneira de explicar a formação deste tetraedro é utilizando o triângulo de
seletividade da Figura 6 e a Tabela 1, discutidos no item 3.6. Nesta abordagem, os solventes
são agrupados de acordo com o tipo de interação que é capaz de fazer com compostos de
interesse. Os parâmetros de seletividade utilizados são a acidicidade (α), basicidade (β) e
dipolaridade (π*). Os solventes ou misturas que apresentam parâmetros de seletividade
66
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Aq
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Fator 3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Fator 4
π* ≅ β α
π* β α
π* β ≅ α
π* β α
π* β ≅ α
π* ≅ α β
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Aq
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Fator 3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Fator 4
π* ≅ β απ* ≅ β α
π* β απ* β α
π* β ≅ απ* β ≅ α
π* β απ* β α
π* β ≅ απ* β ≅ α
π* ≅ α βπ* ≅ α β
similares são quimicamente semelhantes, embora possam apresentar diferentes valores de
polaridade.
As frações dos extratos 3 (dc) e 8 (ae-dc) foram obtidos de misturas de solventes que
apresentam altos valores de dipolaridade (π*) e valores de basicidade (β) baixos, portanto
estes solventes extraem compostos quimicamente semelhantes, principalmente compostos
capazes de interação dipolar, tais como éteres, ésteres, sulfetos, sulfóxidos, tióis, hidroxilas,
halogênios, aldeídos, cetonas, compostos com ligação nitro (-NO
2
) e nitrila (-CN), etc.
As frações dos extratos 2 (ae), 4 (ac) e 9 (ae-ac) foram obtidos em misturas de
solventes que apresentam altos valores de dipolaridade e basicidade, mas apresenta pouca
acidicidade (α ≅ 0). Sendo fortes receptores de prótons, estes solventes extraem
preferencialmente compostos que são fortes doadores, tais como ácidos carboxílicos, álcoois,
fenóis, etc.
As frações dos extratos 10 (dc-ac), 11 (et-ae-dc), 13 (et-dc-ac) e 14 (ae-dc-ac) foram
obtidas de misturas binárias e ternárias que apresentam altos valores de dipolaridade e valores
de acidicidade e basicidade relativamente próximos (π*>β≅α), portanto estes solventes
extraem preferencialmente compostos capazes de realizar interação dipolo. Entretanto, estes
solventes podem extrair, em menor quantidade, compostos com caráter ácido e/ou básico.
As frações dos extratos 5 (et-ae) e 7 (et-ac) apresentam valores de dipolaridade e
basicidade próximos e valores de acidicidade baixos (π*≅β>α), isto faz com que estes
solventes extraiam preferencialmente compostos de caráter ácido e capazes de interação
dipolo.
As frações dos extratos 1 (et) e Aq (água) foram obtidas de solventes capazes de
apresentar os três parâmetros. O etanol apresenta valores de acidicidade e basicidade
próximos e de dipolaridade menor (β≅α>π*). A água, por ser um forte doador de prótons,
67
apresenta um caráter mais ácido e extrai preferencialmente compostos de caráter básico como
ésteres, cetonas e aminas.
O gráfico dos loadings dos fatores 3 e 4 está apresentado na Figura 35. Este gráfico
mostra quais os números de onda que explicam a distinção entre os seis grupos formados na
Figura 34.
Figura 35: Gráfico dos loadings dos fatores 3 e 4 para as 16 amostras da fração polar.
A região em torno 3378 cm
-1
é característica de vibrações de deformação axial de O-H
(ν O-H) de álcoois e fenóis (3650-3100 cm
-1
), com contribuições de absorções provenientes
de vibrações de deformação axial de N-H de aminas (3500-3310 cm
-1
) ou de amidas (3500-
3060 cm
-1
). Os picos nas regiões de 2954 e 2850 cm
-1
são provenientes das deformações
1250
-
1000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-6
-4
-2
0
2
4
6
Loadings
Número de onda (cm
-1
)
Fator3
Fator4
3378
2954
2850
1760-1720
1630
1400
1300
1250-1000
1000-500
68
axiais simétricas e assimétricas de C-H de alcanos (3000-2840 cm
-1
) ou de aldeídos (2830-
2695 cm
-1
).
A banda de absorção na região entre 1760 e 1720 cm
-1
pode ser atribuído a vibrações
de deformação axial da ligação de C=O de ésteres α,β-insaturados (1730-1715 cm
-1
) ou
indicar a presença de γ-lactonas (1795-1760 cm
-1
), δ-lactonas (1760-1720 cm
-1
), γ-lactamas
(1750-1700 cm
-1
) e β-lactamas (1760 e 1730 cm
-1
). Aldeídos alifáticos (1720-1740 cm
-1
) e
cetonas alifáticas (1715 cm
-1
) também podem apresentar vibrações ν C=O nesta região.
A banda observada em 1630 cm
-1
pode ser atribuída a vibrações de deformação
angular da ligação de NH
2
ou de NH de amidas primárias e secundárias (1650-1515 cm
-1
), de
γ-lactamas (1630 cm
-1
) ou de aminas (1650-1580 cm
-1
). Pode indicar também vibrações de
deformação axial de C=C do anel de hidrocarbonetos aromáticos (1600-1585 cm
-1
) ou de
alquenos lineares não conjugados (1667-1640 cm
-1
).
A banda na região de 1300 cm
-1
pode ser proveniente de vibrações de deformação
axial de C-O de ésteres α,β-insaturados (1300-1160 cm
-1
) ou de lactonas (1250-1111 cm
-1
).
Pode indicar também vibrações de deformação axial de C-N de aminas aromáticas (1342-
1266 cm
-1
). A banda de absorção na região entre 1250-1000 cm
-1
pode ser atribuída a
vibrações de deformação axial ν C-O de álcoois e fenóis (1260-1000 cm
-1
), de ésteres de
álcoois primários ou secundários (1164-1031 cm
-1
) ou de lactonas (1250-1111 cm
-1
). Pode ser
atribuído também a vibrações de deformação axial da ligação C-N de aminas alifáticas (1250-
1020 cm
-1
) e a vibrações de deformação angular da ligação C-H de hidrocarbonetos
aromáticos (1300-1000 cm
-1
).
As bandas na região entre 1000 e 500 cm
-1
podem ser proveniente de vibrações de
deformação angular fora do plano da ligação C-H de hidrocarbonetos aromáticos (1000-650
cm
-1
) ou de alquenos (1000-650 cm
-1
). Podem indicar também vibrações de deformação
69
angular simétrica fora do plano das ligações N-H de aminas (909-667 cm
-1
), amidas (800-667
cm
-1
) e lactamas (800-700 cm
-1
).
4.4.2.3 Fração Neutra
A Figura 36 mostra o espectro obtido da fração neutra de cada extrato.
Figura 36: Espectros no infravermelho da fração neutra de cada extrato obtido das folhas de
Vernonia condensata Baker.
Os dados dos espectros obtidos na região de 400 a 4000 cm
-1
foram colocados numa
matriz 15 x 3736 variáveis. Estes dados foram sujeitos a análise de componentes principais.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1 Etanol
2 Acetato de etila
3 Diclorometano
4 Acetona
5 (et-ae)
6 (et-dc)
7 (et-ac)
8 (ae-dc)
9 (ae-ac)
10 (dc-ac)
11 (et-ae-dc)
12 (et-ae-dc)
13 (et-dc-ac)
14 (ae-dc-ac)
15 (et-ae-dc-ac)
Absorvância
Número de onda (cm
-1
)
70
Três componentes (fatores) permitem explicar 98% da variância dos dados. O gráfico dos
escores dos fatores 1 e 3 é mostrado na Figura 37.
Figura 37: Gráfico dos escores dos fatores 1 e 3 dos dados espectrais obtidos das 15 amostras
da fração neutra.
O gráfico dos loadings dos fatores 1 e 3 está apresentado na Figura 38. Este gráfico
mostra quais os números de onda que explicam a distinção entre os quatro grupos formados
na Figura 37.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
-1,02 -1,00 -0,98 -0,96 -0,94 -0,92 -0,90 -0,88
Fator 1
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Fator 3
Grupo I
Grupo III
Grupo IV
Grupo II
71
Figura 38: Gráfico dos loadings dos fatores 1 e 3 para as 15 amostras da fração neutra.
A região em torno 3400 cm
-1
é característica de vibrações de deformação axial de O-H
(ν O-H) de álcoois e fenóis (3650-3100 cm
-1
), com contribuições de absorções provenientes
de vibrações de deformação axial de N-H de aminas (3500-3310 cm
-1
) ou de amidas (3500-
3060 cm
-1
). A intensa banda de absorção na região entre 3000 e 2800 cm
-1
são provenientes
das deformações axiais simétricas e assimétricas de C-H de alcanos (3000-2840 cm
-1
) ou de
aldeídos (2830-2695 cm
-1
).
A banda de absorção na região entre 1700 e 1750 cm
-1
pode ser atribuída a vibrações
de deformação axial da ligação de C=O de ésteres alifáticos (1750-1735 cm
-1
), ésteres α,β-
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-8
-6
-4
-2
0
2
4
1000-650
1260-1000
1380
1440
1740
3400
2830
Loadings
Número de onda (cm
-1
)
Fator1
Fator3
2950
72
insaturados (1730-1715 cm
-1
), aldeídos alifáticos (1740-1720 cm
-1
) e cetonas alifáticas (1715
cm
-1
).
A banda de absorção na região de 1460-1420 cm
-1
pode ser proveniente de vibrações
de deformação angulares simétricas e assimétricas da ligação de C-H de alcanos, como δ
s
CH
2
que ocorre próximo de 1465 cm
-1
ou δ
as
CH
3
que ocorre próxima de 1450 cm
-1
. Pode ser
atribuída também a vibrações de deformação axial de C=C do anel de hidrocarbonetos
aromáticos que ocorre entre 1500 e 1400 cm
-1
. A região em torno de 1380 cm
-1
pode ser
associada a uma banda de deformação angular no plano de O-H de álcoois e fenóis que ocorre
geralmente entre 1420 e 1330 cm
-1
.
As bandas de absorção na região entre 1300 e 1000 cm
-1
podem ser atribuídas a
vibrações de deformação axial da ligação C-O de ésteres α,β-insaturados que ocorrem entre
1300 e 1160 cm
-1
e vibrações de deformação axial da ligação C-N de aminas aromáticas que
ocorrem entre 1342 e 1260 cm
-1
, podem ser associadas também a vibrações de deformação
axial da ligação C-O de ésteres de álcoois primários (1164-1031 cm
-1
) e secundários (1100
cm
-1
).
Em regiões de baixa freqüência de absorção (1000-650 cm
-1
) existem muitas
possibilidades, por exemplo, vibrações de deformação angular da ligação C-H fora do plano
de hidrocarbonetos aromáticos (900-675 cm
-1
) e de alquenos (1000-650 cm
-1
) ou vibrações de
deformação axial de N-O de nitritos (850-750 cm
-1
).
4.5 Teste de Identificação de Metabólitos Secundários: Spot - test
Para a identificação dos metabólitos secundários, alguns testes foram realizados com o
material vegetal (folhas secas) e outros com os extratos obtidos de acordo com o
planejamento experimental da Figura 8.
73
A Figura 39 mostra os resultados dos testes para alcalóides dos 15 extratos obtidos de
acordo com o planejamento experimental e do extrato aquoso. O resultado mostra a formação
do precipitado alaranjado, confirmando a presença de alcalóides. Pela inspeção visual
observou-se que a maior quantidade de alcalóides foram obtidas nos extratos 1, 2, 3, 4, 7, 12 e
aquoso. Os precipitados escuros comprovam a presença de taninos. Os extratos 3, 4, 6, 7 e 12
apresentaram maior quantidade de taninos.
A Figura 40 mostra os resultados dos testes específicos para compostos fenólicos nos
15 extratos obtidos de acordo com o planejamento experimental da Figura 8 e do extrato
aquoso. O surgimento de coloração verde confirma a presença de compostos fenólicos nos
extratos. Visualmente observa-se que os extratos 4, 5, 7, 12, 13, 15 e aquoso apresentaram
coloração verde mais forte, portanto pode-se afirmar que estes extratos possuem maior
quantidade de compostos fenólicos.
O teste para saponinas foi realizado com as folhas de Vernonia condensata secas e
moídas. Neste teste a presença de saponinas é caracterizada pela formação de espuma
persistente. A Figura 41 mostra o resultado do teste. A marca vermelha no tubo mostra a
altura da espuma.
A Figura 42 mostra o resultado do teste especifico para flavonóides, realizado com o
material vegetal seco. O aparecimento de coloração rósea confirmou a presença de
flavonóides nas folhas da planta.
A Figura 43 mostra resultado do teste especifico para taninos, realizado com o
material vegetal seco. A coloração verde confirma a presença de taninos condensados ou
catéquicos.
74
Figura 39: Spot-test para identificação de alcalóides nos extratos da planta utilizando o
reagente de Dragendorff.
Figura 40: Teste para identificação de compostos fenólicos.
Figura 41: Teste para identificação de saponinas.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Aquoso
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Aquoso
75
Figura 42: Teste para identificação de flavonóides. O tubo A contém o material vegetal seco
em etanol 70% e no tubo B contém o material vegetal seco em etanol 70%, raspas de
magnésio e ácido clorídrico concentrado.
Figura 43: Teste para identificação de taninos. No tubo A contém o contém o material
vegetal seco puro e no tubo B contém o material vegetal seco com FeCl
3
1% em metanol.
Tubo A Tubo B
A B
A
B
76
4.6 Determinação da Dose Letal 50% (DL
50
)
Na primeira etapa da avaliação, cada extrato foi administrado na dose de 2000 mg/kg
e, após os 14 dias de observação, os extratos que causaram a morte de dois ou três animais,
tiveram a dose reduzida para 300 mg/kg.
Para os extratos que apresentaram uma ou nenhuma morte, a dose de 2000 mg/kg foi
repetida. Na segunda etapa da avaliação, após os 14 dias de observação, os extratos nos quais
a dose de 2000 mg/kg foi repetida e que causaram uma ou nenhuma morte, o teste foi
encerrado e a DL
50
foi estimada.
Para os extratos no qual a dose de 2000 mg/kg foi repetida e causou a morte de dois ou
três animais, reduziu-se a dose para 300 mg/kg (extratos 5 e 15). Para os extratos que tiveram
a dose reduzida para 300 mg/kg e que causaram uma ou nenhuma morte, a dose de 300 mg/kg
foi repetida, menos para o extrato 14, que causou a morte de 2 animais e teve a dose reduzida
para 50 mg/kg.
Na terceira etapa não foram constatadas mortes e sinais de intoxicação. As doses
foram repetidas na quarta etapa e também não foram constatadas mortes. A DL
50
foi
determinada para todos os extratos, seguindo o diagrama mostrado na Figura 11. Os valores
de DL
50
obtidos para cada extrato é apresentado na Tabela 3.
Tabela 3: Valores de DL
50
para todos os extratos.
DL
50
> 2000 mg/kg 1000 mg/kg 500 mg/kg 300 mg/kg
1 (etanol) 2 (acetato de etila)
3 (diclorometano) 14 (ae-dc-ac)
6 (et-dc) 4 (acetona) 5 (et-ae)
7 (et-ac) 11 (et-ae-dc) 8 (ae-dc)
12 (et-ae-ac) 15 (et-ae-dc-ac) 9 (ae-ac)
13 (et-dc-ac) 10 (dc-ac)
Extratos
Aquoso
77
4.7 Avaliação da Atividade Antinociceptiva
A Figura 44 mostra os resultados obtidos para os extratos que não foram eficazes na
redução das contorções abdominais. A Figura 45 mostra os resultados obtidos para os extratos
que foram eficazes em reduzir as contorções abdominais em todas as doses utilizadas. A
Figura 46 mostra os resultados para os demais extratos, no qual somente uma ou duas doses
foram eficazes em diminuir de modo significativo as contorções abdominais quando
comparados com os respectivos grupos controles.
ANOVA complementada com o teste de Student-Newman-Keuls mostrou que o pré-
tratamento com todas as doses dos extratos aquoso, 1 (etanol), 5 (et-ae), 10 (dc-ac), 11 (et-ae-
dc) e 12 (et-ae-ac) foram eficazes em diminuir o número de contorções abdominais em
camundongos em comparação com os respectivos grupos controles tratados previamente com
a solução veículo. As doses de 80 e 160 mg/kg do extrato 7 (et-ac), 40 e 80 mg/kg do extrato
9 (ae-dc), 40 mg/kg do extrato 3 e 160 mg/kg do extrato 14 (ae-dc-ac) também foram eficazes
em diminuir o número de contorções abdominais nos camundongos em comparação com os
respectivos grupos controles tratados previamente com a solução veículo. As doses de 80
mg/kg do extrato 5 (et-ae) e 40 mg/kg do extrato 11 (et-ae-dc) foram menos eficazes em
comparação com o controle positivo tratado previamente com o analgésico ibuprofeno na
dose de 200 mg/kg.
78
Figura 44: Avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos (a) 2 (acetato de etila), (b) 4
(acetona), (c) 6 (et-dc), (d) 8 (ae-dc) e (e) 13 (et-dc-ac), sobre as contorções abdominais
induzidas por ácido acético. *p < 0,05 em relação ao grupo controle tratado com solução
veículo. # p < 0,05 em relação ao grupo controle positivo tratado com o analgésico ibuprofeno
(ANOVA complementada com Student-Newman-Keuls).
0
10
20
30
40
50
60
#
#
*
#
Número de contorções
Extrato 2 (acetato de etila)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
Número de contorções
Extrato 4 (acetona)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
#
#
*
#
Número de contorções
Extrato 6 (et-dc)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
#
#
*
#
Número de contorções
Extrato 8 (ae-dc)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
#
Extrato 13 (et-dc-ac)
Número de contorções
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
e)
a)
b)
d)
c)
79
Figura 45: Avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos (a) 1 (etanol), (b) aquoso, (c)
5 (et-ae), (d) 10 (dc-ac), (e) 11 (et-ae-dc) e (f) 12 (et-dc-ac) sobre as contorções abdominais
induzidos por ácido acético. *p < 0,05 em relação ao grupo controle tratado com solução
veículo. # p < 0,05 em relação ao grupo controle positivo tratado com o analgésico ibuprofeno
(ANOVA complementada com Student-Newman-Keuls).
a)
b)
c)
d)
e)
0
10
20
30
40
50
60
Extrato 1 (etanol)
*
*
*
*
Número de contorções
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
*
Extrato aquoso
Número de contorções
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
*
Vernonia condensata (mg/Kg)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Número de contorções
Extrato 10 (dc-ac)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
*
Extrato 12 (et-ae-ac)
Número de contorções
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
*
#
Número de contorções
Extrato 5 (et-ae)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
f)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
#
Vernonia condensata (mg/Kg)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Número de contorções
Extrato 11 (et-ae-dc)
80
Figura 46: Avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos (a) 3 (diclorometano), (b) 7
(et-ac), (c) 9 (ae-ac) e (d) 14 (ae-dc-ac), sobre as contorções abdominais induzidos por ácido
acético. *p < 0,05 em relação ao grupo controle tratado com solução veículo. # p < 0,05 em
relação ao grupo controle positivo tratado com o analgésico ibuprofeno. (ANOVA
complementada com Student-Newman-Keuls).
Com base nos dados obtidos na avaliação da atividade antinociceptiva, calculou-se a
porcentagem de inibição nociceptiva para todos os extratos e seus respectivos controles. Cada
dose do extrato ou do controle ibuprofeno foi comparada com o respectivo controle veículo e
a partir desta comparação, calculou-se a porcentagem de inibição nociceptiva.
a)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
#
*
Número de contorções
Extrato 7 (et-ac)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
Número de contorções
Extrato 9 (ae-ac)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
b)
0
10
20
30
40
50
60
#
#
*
*
Número de contorções
Extrato 3 (diclorometano)
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
Extrato 14 (ae-dc-ac)
Número de contorções
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
c)
d)
81
Para avaliar o efeito dos solventes na atividade antinociceptiva, foram testados
diferentes modelos de misturas com quatro componentes. Estes modelos permitem explorar os
efeitos dos solventes e estimar a melhor mistura no qual será obtido o extrato que trará uma
melhor resposta antinociceptiva. Quanto maior a porcentagem de inibição das contorções
abdominais, melhor a atividade antinociceptiva do extrato. A Tabela 4 apresenta a
porcentagem de inibição obtida para cada extrato na sua respectiva dose.
Ajustando os dados aos modelos linear e quadrático, todos apresentaram falta de
ajuste, sendo assim o modelo cúbico especial foi ajustado aos dados obtidos para todos os
extratos na dose de 40 mg/kg, e a equação para este modelo é dada por:
360,8)(
360,99)(367,55)(361,07)(56,52)(53,52)(56,58)(
54,15)(57,18)(54,15)(10,96)(11,72)(10,96)(11,72)(
ac675,29aedc
ac566,08etdcac356,87etaedc141,54etae64,06dcacaeac7,48aedc
etac70,54etdcetaeacdc13,85aeety
ˆ
±
±±±±±±
±±±±±±±
−
−+++++
−
−
+
+
+
+
+
=
166,06
120,41109,8241,7448,1635,30
. (21)
ŷ é a resposta prevista pelo modelo, et = etanol, ae = acetato de etila, dc =
diclorometano e ac = acetona. Os valores entre parênteses são os erros padrão dos parâmetros.
A equação apresenta 14 termos dos quais 6 são significativos (termos em negrito), ou seja,
possuem coeficientes com valores mais altos em relação ao erro padrão, são eles o etanol
puro, diclorometano puro, acetona pura e a misturas binárias de etanol-acetato de etila, etanol-
acetona, acetato de etila-acetona.
82
Tabela 4: Porcentagem de inibição nociceptiva obtida para cada extrato
Extrato Dose (mg/Kg) % de inibição
40 47,00
80 43,71
Aquoso
160 57,25
40 35,14
80 36,5
1 (etanol)
160 54,57
40 -14,00
80 19,00 2 (acetato de etila)
160 35,00
40 48,00
80 -10,75 3 (diclorometano)
160 28,28
40 41,60
80 38,54 4 (acetona)
160 36,46
40 39,31
80 29,11
5 (et-ae)
160 36,25
40 25,39
80 22,99 6 (et-dc)
160 11,00
40 9,56
80 37,84 7 (et-ac)
160 44,96
40 20,32
80 16,16 8 (ae-dc)
160 8,16
40 56,6
80 41,76
9 (ae-ac)
160 26,08
40 62,27
80 54,82 10 (dc-ac)
160 50,30
40 29,80
80 36,75 11 (et-ae-ac)
160 44,05
40 47,18
80 47,87 12 (et-ae-ac)
160 68,37
40 2,85
80 41,61
13 (et-dc-ac)
160 34,67
40 22,95
80 38,02 14 (ae-dc-ac)
160 43,05
40 35,09
80 38,86 15 (et-ae-dc-ac)
160 -0,97
83
O modelo também indica uma interação entre o diclorometano e a acetona e um efeito
antagônico entre o etanol e a acetona. As curvas de nível para este modelo podem ser vistas
na Figura 47.
Figura 47: Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e da porcentagem de inibição nociceptiva pelos extratos na dose de 40
mg/kg.
Estes contornos mostram que a maior porcentagem de inibição nociceptiva, em torno
de 60%, pode ser alcançada quando o extrato for obtido em uma mistura binária de acetona-
diclorometano.
Para a dose de 80 mg/kg, os dados obtidos para todos os extratos foram ajustados para
o modelo linear e quadrático que apresentaram falta de ajuste, sendo assim o modelo cúbico
especial foi ajustado aos dados e a equação para este modelo é dada por:
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Diclorometano
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Ace tato de etila
48
40
32
24
16
8
0
-8
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Ace tato de etila
56
48
40
32
24
16
8
0
-8
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
60
52
44
36
28
20
12
4
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetato de etila
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
60
48
36
24
12
0
-12
a)
b)
c)
d)
84
08,33557,34346,33215,33506,5044,51
68,5306,5006,5044,5125,1025,1084,1125,10
aedcac43,243etdcac54,133etaeac10,214etaedc46,251dcacaeac94,53
aedc37,50etac23,3etdc41,42etae42,7acdc80,10ae92,18ety
ˆ
±±±±±±
±±±±±±±±
−−++++
+
+
+
+
+
−
+
+
=
165,66
38,4936,44
(22)
A equação apresenta 14 termos dos quais três são significativos, são eles o etanol puro,
acetona pura e a mistura binária diclorometano-acetona. As curvas de nível para este modelo
podem ser vistas na Figura 48.
Figura 48: Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e da porcentagem de inibição nociceptiva pelos extratos na dose de 80
mg/kg.
Estes contornos mostram que a maior porcentagem de inibição nociceptiva, em torno
de 56%, Figuras 48c e 48d, pode ser alcançada quando o extrato é obtido em mistura binária
de acetona-diclorometano, concordando com o modelo obtido para a dose de 40 mg/kg.
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Diclorometano
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
36
28
20
12
4
-4
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
44
40
36
32
28
24
20
a)
b)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
56
48
40
32
24
16
8
0
-8
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetato de etila
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
56
48
40
32
24
16
8
0
-8
c) d)
85
Para a dose de 160 mg/kg, os dados obtidos para todos os extratos foram ajustados
para o modelo cúbico especial e a equação para este modelo é dada por:
339,14)(339,14)(339,16)(339,20)(51,19)(51,19)(
51,19)(51,19)(51,19)(10,48)(10,48)(10,48)(10,48)(10,48)(
ac415,63aedcac623,37etdcac510,16etaec37,43etaed40,91dcac35,07aeac
36,27aedc12,73etac87,53etdc75,56etaeacdc18,10aeety
ˆ
±±±±±±
±±±±±±±±
−−+−++
+
−
−
−
+
+
+
+
=
67,4844,5048,10
.(23)
A equação apresenta 14 termos dos quais três são significativos, são eles o etanol puro,
diclorometano puro e acetona pura. As curvas de nível para este modelo podem ser vistas na
Figura 49. A maior porcentagem de inibição nociceptiva de acordo com o modelo foi de 68%,
Figuras 49c e 49d, que pode ser alcançada quando o extrato for obtido em mistura binária de
acetona-diclorometano, concordando novamente com os modelos obtidos para as doses de 40
e 80 mg/kg.
Figura 49: Curvas de nível do modelo cúbico especial em função do planejamento de
misturas de solventes e da porcentagem de inibição nociceptiva pelos extratos na dose de 160
mg/kg.
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Diclor om e tano
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
48
40
32
24
16
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Acetato de etila
64
56
48
40
32
24
16
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Etanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
68
60
52
44
36
28
20
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetona
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Acetato de etila
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Diclorometano
68
60
52
44
36
28
20
a) b)
c) d)
86
Os modelos apresentados nos dizem que a presença simultânea da acetona e do
diclorometano na mistura produzirá um extrato que trará uma maior porcentagem de inibição
nociceptiva, ou seja, para obtermos extratos com maior atividade antinociceptiva, devemos
usar misturas de solventes extratores contendo acetona e diclorometano.
Para confirmar a validade dos modelos, foi preparada uma mistura binária de acetona e
diclorometano na proporção 3:2 (v/v) e realizou-se o processo de extração conforme descrito
no esquema da Figura 9. Após a obtenção do extrato, que foi denominado como extrato
otimizado, realizou-se a avaliação da DL
50
, conforme procedimento descrito no item 3.15
sendo o valor estimado de 300 mg/kg.
A avaliação da atividade antinociceptiva do extrato otimizado foi feita conforme os
procedimentos descritos no item 3.16. A Figura 50 apresenta os resultados obtidos para a
avaliação da atividade antinociceptiva do extrato otimizado e seus respectivos controles
veículo e ibuprofeno.
Figura 50: Avaliação da atividade do extrato otimizado sobre as contorções abdominais
induzidos por ácido acético. *p < 0,05 em relação ao grupo controle tratado com solução
veículo. (ANOVA complementada com Student-Newman-Keuls).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Número de contorções
Veículo Ibuprofeno 40 80 160
Vernonia condensata (mg/Kg)
*
*
*
87
Utilizando as Equações 21, 22 e 23, excluindo os termos não significativos e os que
não contém os coeficientes ac e dc, calculou-se a porcentagem de inibição nociceptiva para
cada dose, considerando as proporções de 60% de acetona e 40% de diclorometano. A tabela
5 apresenta a porcentagem de inibição obtida para o extrato otimizado e os resultados
previstos pelas equações dos modelos.
Tabela 5: Porcentagem de inibição nociceptiva obtida para o extrato otimizado e resultados
previstos pelas equações dos modelos.
Extrato Dose (mg/kg) % de inibição Resultado previsto (%)
40 25,43
44,3
80 50,73
58,52
Otimizado
160 55,8
58,28
Estes resultados mostram que a porcentagem de inibição ficou um pouco abaixo do
previsto pelos modelos para as doses de 80 mg/kg (58,52%) e 160 mg/kg (58,28%) e muito
abaixo para a dose de 40 mg/kg (44,3%). Entretanto, o resultado obtido para o extrato
otimizado ficou muito próximo do atingido pelo extrato 10, que compreende da mistura
binária de diclorometano-acetona (Tabela 4), com exceção da dose 40 mg/kg, no qual o
extrato otimizado obteve um valor bem baixo quando comparado com o extrato 10.
Uma explicação para a diferença entre os resultados previstos pelos modelos e os
obtidos experimentalmente pode ser a alta variabilidade do teste aplicado. O número de
contorções é sujeito a muita variação
21
. Fatores como estresse dos animais, condições do
ambiente, tolerância do animal à dor e comportamento anormal do animal em resposta ao
estímulo, podem influenciar na contagem do número de contorções e dificultar a interpretação
dos dados
21
.
88
Capítulo V
Conclusão
5. CONCLUSÃO
Na avaliação dos efeitos dos solventes extratores no rendimento da extração das folhas
de Vernonia condensata Baker, concluiu-se que:
O maior rendimento em massa foi obtido com uma mistura ternária de etanol,
diclorometano e acetona.
O modelo cúbico especial prevê um rendimento máximo de extrato em torno de 0,55 g
de extrato bruto.
A aplicação dos métodos quimiométricos associados à análise por UV-Vis foi
possível:
Determinar três regiões discriminatórias para distinguir a composição química dos
diferentes extratos.
Identificar qualitativamente sete grupos de composição química diferente.
A aplicação dos métodos quimiométricos associados à análise por infravermelho foi
possível:
Traçar o perfil dos diferentes extratos identificando qualitativamente seis grupos de
composição química diferentes.
Determinar as regiões discriminatórias de grupos funcionais para discriminar a
composição química dos diferentes extratos.
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A aplicação dos métodos quimiométricos associados à análise por infravermelho do
fracionamento químico foi possível:
Traçar o perfil das diferentes frações e identificar qualitativamente os grupos de
composição química diferentes presentes nos extratos da planta.
Determinar as regiões discriminatórias de grupos funcionais para discriminar a
composição química das diferentes frações.
A forte banda de absorção em 1760 cm
-1
, presente nos espectros da fração polar,
corresponde a um estiramento da carbonila de γ-lactona, indicando a presença de
lactonas sesquiterpênicas no extrato, que podem apresentar atividade antinociceptiva.
Na escolha do solvente extrator, de acordo com a sua seletividade, foi possível
concluir que:
Os solventes ou misturas que apresentam parâmetros de seletividade similares são
quimicamente semelhantes, embora possam apresentar diferentes valores de
polaridade.
Nos testes para identificação de metabólitos secundários (Spot–test), foi possível
determinar:
A presença de alcalóides, compostos fenólicos, saponinas, flavonóides e taninos nos
extratos da planta.
Pela inspeção visual observou-se que a maior quantidade de alcalóides foram obtidas
nos extratos 1, 2, 3, 4, 7, 12 e aquoso.
91
Pela inspeção visual observou-se que a maior quantidade de compostos fenólicos
foram obtidas nos os extratos 4, 5, 7, 12, 13, 15 e aquoso.
Visualmente os extratos 3, 4, 6, 7 e 12 apresentaram maior quantidade de taninos.
Na avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos, concluiu-se que:
Todas as doses dos extratos 1 (etanol), aquoso, 5 (et-ae), 10 (dc-ac), 11 (et-ae-dc) e 12
(et-dc-ac) foram eficazes em diminuir o número de contorções abdominais em
camundongos em comparação com os respectivos grupos controles tratados
previamente com a solução veículo.
As doses de 80 e 160 mg/kg do extrato 7 (et-ac), 40 e 80 mg/kg do extrato 9 (ae-dc),
40 mg/kg do extrato 3 e 160 mg/ kg do extrato 14 (ae-dc-ac) foram eficazes em
diminuir o número de contorções abdominais nos camundongos em comparação com
os respectivos grupos controles tratados previamente com a solução veículo.
As doses de 80 mg/kg do extrato 5 (et-ae) e 40 mg/kg do extrato 11 (et-ae-dc) foram
menos eficazes em comparação com o controle positivo tratado previamente com o
analgésico ibuprofeno na dose de 200 mg/kg.
A aplicação dos métodos quimiométricos aos dados obtidos na avaliação da atividade
antinociceptiva, concluiu-se que:
O modelo cúbico especial prevê uma porcentagem de inibição nociceptiva em torno de
60% para a dose de 40 mg/kg, 56% para a dose de 80 mg/kg e 68% para a dose de 160
mg/kg.
92
A maior porcentagem de inibição nociceptiva é atingida quando o extrato utilizado for
obtido em misturas binárias de acetona-diclorometano.
O extrato otimizado, preparado em uma mistura binária de acetona-diclorometano na
proporção 3:2 (v/v), apresentou resultado próximo do previsto pelos modelos para as
doses de 80 e 160 mg/kg. A dose de 40 mg/kg apresentou um resultado abaixo do
previsto.
93
Referências
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