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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
MARIA CRISTINA SALIMENA DA SILVA
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO DIMORFISMO SEXUAL NA
LESÃO MUSCULAR DE CAMUNDONGO mdx COM
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL
FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM NEUROIMUNOLOGIA
Orientador(as):Thereza Quírico-Santos
Jussara Lagrota-Cândido
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MARIA CRISTINA SALIMENA
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO DIMORFISMO SEXUAL NA
LESÃO MUSCULAR DE CAMUNDONGOS mdx COM
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
Orientadoras
Professora Dr
a
. Thereza Quírico - Santos
Professora Dr
a
. Jussara Lagrota - Cândido
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Tese submetida à Coordenação do curso de pós-graduação de
Neuroimunologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal
Fluminense, como parte dos requisitos necessários para obtenção do
grau de Doutor em Neuroimunologia - área de concentração: Patologia
Celular.
Banca Examinadora:
Profª Dra. Thereza Fonseca Quirico dos Santos (orientadora)
Profª Dra. Andréia Alice da Silva
Profª Dra. Valéria Coelho
Dr. Vinicius Cota de Almeida
Profª Dra. Maria de Fátima Pinho (revisora)
Profª Dra. Márcia Cury El-Cheik (suplente)
Profº Dr. Maurício Verícimo
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A parte experimental deste trabalho foi executada nos Laboratórios de
Patologia Celular e Imunopatologia do Instituto de Biologia da
Universidade Federal Fluminense (UFF), com suporte financeiro da
Coordenação de Apoio ao Pessoal de Ensino Superior (CAPES).
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S 165 SALIMENA, MARIA CRISTINA
Estudo da influência do dimorfismo sexual na lesão muscular de camundongos
mdx com distrofia muscular de Duchenne/ Maria Cristina Salimena. [s.n.];
Niterói, 2008.
185f.
Tese (Doutorado em Neuroimunologia)
Universidade Federal Fluminense, 2008.
1. Distrofia Muscular 2. Distrofia Muscular de Duchenne 3.Músculo
Esquelético 4.Camundongo I.Título
CDD.591.1852
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À minha família, em especial aos meus pais e ao meu marido, que
pacientemente me incentivava e ajudava de forma incondicional e aos meus
filhos, que me alegravam nas horas mais difíceis.
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Às minhas orientadoras Professoras Thereza Quírico e Jussara Lagrota-
Cândido, que alternando momentos de ansiedade e puro entusiasmo,
dedicaram-se com afinco à minha formação científica.
Às amigas Nina e Bartira, pelo apoio e estímulo, compartilhando todos os
momentos difíceis com palavras de incentivo e muito carinho, além da ajuda
fantástica no processamento histológico.
Aos amigos, Douglas e Guilherme, pela disponibilidade no dia-a-dia,
ajudando sempre que eu precisava e prontos para ouvir minhas lamúrias.
A todos os alunos de iniciação científica, estagiários e bolsistas dos
laboratórios de Patologia Celular e Imunopatologia, sempre muito solidários,
ajudando-me a superar as dificuldades e sempre presentes com palavras
de estímulo.
Ao Professor Claudio Serfaty e ao aluno Pablo do Laboratório de
Neuroplasticidade, pela amizade e incrível ajuda na digitalização das
imagens, na utilização do microscópio de fluorescência, do criostato e na
produção do ELVAX.
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A minha grande amiga doutora Sônia de Oliveira Couto que possibilitou o
meu afastamento temporário do trabalho, permitindo que tivesse maior
disponibilidade de tempo para desenvolver e concluir esta tese.
Em especial, ao amigo Wagner, que abriu a primeira porta para o renascer
dos meus conhecimentos e ao amigo Heliomar, que concretizou estes
conhecimentos.
Um sincero agradecimento a todos os colegas do mestrado e doutorado e
professores do curso de pós-graduação em Neuroimunologia, pela
convivência muito agradável e estímulo continuado, através dos quais pude
obter uma nova visão da ciência.
À minha família, que sempre serviu de alicerce para todas as minhas
conquistas.
A DEUS, que fortaleceu o meu espírito, acalmou minha impaciência e
manteve a minha perseverança.
Um agradecimento especial à CAPES que viabilizou o desenvolvimento do
trabalho experimental.
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O excesso de luz cega a vista.
O excesso de som ensurdece o ouvido.
A cobiça do impossível destrói a ética.
Por isto, o sábio em sua alma determina a medida para cada coisa.
Todas as coisas visíveis lhe são apenas setas que apontam para o invisível.
Lao Tse
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1.1 Características gerais do músculo esquelético ...................................... 2
1.2 Regeneração do tecido muscular ........................................................... 7
1.3 Metaloproteases e remodelagem muscular .......................................... 10
1.4 Regulação hormonal do músculo esquelético ...................................... 11
1.5 Influência do sistema imune no músculo esquelético .............................. 19
1.6 Interações do tecido muscular e tecido adiposo ...................................... 22
1.7 Receptores de estrogênios – Moduladores e bloqueadores ............... 26
1.8 Distrofia muscular de Duchenne........................................................... 28
1.9 Camundongo mdx - modelo murino da DMD ...................................... 31
2.0 OBJETIVOS ......................................................................................... 34
2.1 Objetivo geral ....................................................................................... 34
2.2 Objetivos específicos ............................................................................ 34
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 36
3.1 Animais ................................................................................................. 36
3.2 Castração cirúrgica............................................................................... 36
3.3 Análise histológica ................................................................................ 37
3.4 Reação histoquímica da miosina-ATPase ............................................ 38
3.5 Reação histoquímica: tecido adiposo ................................................... 39
3.6 Imunohistoquímica ............................................................................... 39
3.7 Zimografia ............................................................................................ 42
3.8 Preparação da resina Elvax com tamoxifen ......................................... 43
3.9 Implante de elvax no músculo esquelético ........................................... 44
4.0 RESULTADOS...................................................................................... 46
4.1 Efeito da castração no músculo esquelético do mdx ............................ 46
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4.3 Influência da castração no número de mioblastos ativados (NCAM) e de
células-tronco (Sca-1) presentes nos músculos esqueléticos (gastrocnêmio e
solear) do mdx. .............................................................................................. 61
4.4 Efeitos da castração cirúrgica na atividade das metaloproteases 2 e 9
no músculo esquelético ................................................................................. 70
4.5 Efeito do tratamento com tamoxifen no músculo gastrocnêmio do mdx72
4.6 Análise de mioblastos ativados (NCAM) e células-tronco (Sca-1) no
músculo esquelético do camundongo mdx tratado com tamoxifen ............... 76
4.7 Presença de macrófagos: Mac-1 e F4/80 no gastrocnêmio de mdx
tratados com tamoxifen. ................................................................................ 80
4.8 Efeito da castração sobre o número de adipócitos presentes no músculo
gastrocnêmio do mdx .................................................................................... 85
4.9 Efeito do tratamento com e sem tamoxifen no número de adipócitos no
músculo esquelético do mdx ......................................................................... 89
5.0 DISCUSSÃO..........................................................................................93
6.0 CONCLUSÕES ..................................................................................... 99
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................113
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AP-1
BMD
Proteína ativadora tipo 1
Distrofia Muscular de Becker
CS
CAMs
Células satélites
Moléculas de adesão celular
CMD
Distrofia Muscular Congênita
DGC
Complexo de glicoproteínas associadas à distrofina
DMD
Distrofia Muscular de Duchenne
ECM
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ERE
Matriz extracelular
Receptor de estrogênio
Elemento de resposta ao estrogênio
FGF
Fator de crescimento de fibroblasto
FGF-b
Fator de crescimento básico de fibroblastos
GRMD
GH
Distrofia Muscular em cão da raça golden retriever
Hormônio do crescimento
HGF
HSP70
HLA
Fator de crescimento do hepatócito
Proteína de choque térmico 70
Complexo principal de histocompatibilidade humano
ICAM-1
Molécula de adesão intercelular-1
IFN-
Interferon-gama
IL
IGF1
LFA-1
Interleucina
Fator de crescimento do tipo 1 semelhante à insulina
Molécula de adesão do tipo 1 associada a função do linfócito
LGDM
Distrofia Muscular da Cintura e Membros
LIF
Fator inibitório de leucemia
LN
MRF
Laminina
Fatores regulatórios miogênicos
MCP-1
MyHC
MDSC
MMPs
Proteína quimioatraente de macrófagos-1
Miosina de cadeia pesada
Células-tronco derivadas do músculo
Metaloproteases
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eNOS
OVX
OOX
Fator nuclear-κB
Óxido nítrico
Óxido nítrico sintase endotelial
Ovariectomia
Orquiectomia
PAI-1
SERM
Inibidor do ativador do plasminogênio
Receptor seletivo de estrogênio
TGF-
Fator de transformação de crescimento
TI-CL
Colágeno tipo I
TIII-CL
Colágeno tipo III
TIV-CL
Colágeno tipo IV
TNF-
Fator de necrose tumoral-
TN
TIMPs
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Tenascina
Inibidores de metaloproteinases
Triglicerídeos
VCAM-1
Molécula de adesão vascular
VLA
Antígeno de expressão tardia
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Camundongo mdx, o modelo animal da distrofia muscular de Duchenne,
desenvolve uma miopatia inflamatória recessiva ligada ao cromossoma X,
caracterizada por degeneração das miofibras esqueléticas e substituição por
tecido conjuntivo. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma possível
relação do dimorfismo sexual com o padrão da lesão e mudanças no
microambiente do músculo esquelético durante diferentes fases da miopatia.
Foram incluídos camundongos machos e fêmeas das linhagens mdx e controle
C57 (não-distrófico) com 4 e 8 semanas de vida pós-natal. Um grupo de
camundongos mdx foi submetido à castração cirúrgica: ovariectomia (OVX) e
orquiectomia (OOX) e outro grupo foi tratado com tamoxifen, droga agonista do
receptor de estrógeno dissolvida em resina ELVAX, implantada no músculo
esquelético direito, tendo o contralateral como controle não tratado. Secções
transversais de músculo gastrocnêmio incluído em parafina foram processadas
para histoquímica e coradsa pelo picrosírius, Giemsa, oil red e imuno-
histoquímica para identificação de molécula de adesão NCAM, células
progenitoras (SCA-1) e macrófagos (Mac-1+ e F4-80). Fragmentos congelados
de músculo foram processados para determinação da atividade das
metaloproteases MMP-2 e MMP-9. A análise histomorfométrica mostrou nos
camundongos mdx machos não operados e OOX, um percentual maior de
mionecrose e menor regeneração do que nas fêmeas controle e OVX, que
exibiram percentual maior de miofibras regenerando (64%, p<0.0001). Não
houve diferença significativa no número de adipócitos no músculo
gastrocnêmio dos camundongos mdx machos (p>0.05) e fêmeas (p>0.05),
embora mdx machos apresentassem menor número de adipócitos que as
fêmeas pareadas. Camundongos mdx machos e fêmeas, em especial os
castrados (OOX e OVX), apresentaram maior atividade da MMP-2 e -9 do que
o grupo controle C57 não-distrófico. Análise intergrupo mostrou atividade
aumentada da MMP-9 no mdx macho OOX e da MMP-2 nas fêmeas mdx OVX.
Músculo esquelético de camundongos mdx, machos e fêmeas, tratados com a
droga tamoxifen apresentaram maior número de células musculares íntegras e
redução acentuada de macrófagos do que o músculo contralateral. Em
conjunto, os resultados indicam os efeitos benéficos dos hormônios sexuais
femininos endógenos e do modulador do receptor de estrógeno, tamoxifen,
como estratégia de tratamento capaz de minimizar inflamação e mionecrose
(efeito antinflamatório), de funcionar como mantenedores da integridade
estrutural das miofibras esqueléticas (integridade do sarcolema) e de promover
regeneração muscular no camundongo mdx com distrofia de Duchenne.
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Mdx mouse, the animal model of Duchenne muscular dystrophy, lacks
dystrophin and develops an X- linked recessive inflammatory myopathy
characterized by degeneration of skeletal muscle fibers and replacement by
connective tissue. The present work aimed to establish a possible relation of the
sexual dimorphism with changes in the microenvironment of the skeletal muscle
and lesion pattern at distinct phases of the myopathy. Male and female mdx and
control nondystrophic C57 mice with 4 and 8 weeks of postnatal life. A group of
mdx was submitted to the surgical castration: ovariectomy (OVX) and
orchiectomy (OOX), and another group treated with tamoxifen, an agonist of
estrogen receptor dissolved in ELVAX resin implanted locally in the right
gastrocnemius muscle, with corresponding contralateral used as non-treated
control muscle. Transversal sections of gastrocnemius muscle embedded in
paraffin were processed for histochemistry and stained with syrius red, Giemsa,
oil red, ATPase enzyme and also immunohistochemistry for identification of
adhesion molecule NCAM, progenitor cells (SCA) and macrophages (Mac-1+
and F4-80). Frozen muscle fragments were processed for determination of
metalloprotease MMP-2 and MMP-9 activities. Morphometric analysis showed
higher percentage of mionecrose and lesser regeneration in non-operated and
OOX mdx males than in both groups of females non-operated and OVX, which
presented higher percentage of regenerated fibers. Mdx male and female mice
did not show significant difference in the number of adipocytes in the
gastrocnemius muscle, but mdx male presented less adipocytes than
corresponding mdx females. Comparing to control (C57) nondystrophic mice,
both male and female mdx mice, especially the castrated ones (OOX, OVX),
presented higher MMP-2 and -9 activities. However, mdx intergroup analysis
showed augmented MMP-9 activity in OOX males and of MMP-2 in females
OVX. Comparing with the contralateral muscle, male and female mdx muscles
treated with tamoxifen presented increased numbers of myofibers with
membrane integrity and marked reduction of macrophages than the
contralateral muscle of C57 and mdx mice. Altogether, the results indicate a
beneficial effect of endogenous sexual female hormone and also the estrogen
modulator receptor (tamoxifen) as therapeutic strategy capable of mitigating
inflammation e myonecrosis (antiinflammatory effect), functioning as structural
membrane stabilizer (sarcolemma integrity) and promoting muscle regeneration
in mdx mice with Duchenne dystrophy.
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1.1 Características gerais do músculo esquelético
O músculo esquelético estriado ou voluntário é constituído por miofibras,
células cilíndricas de 1 a 300 m de comprimento e 10 a 50 m de diâmetro com
múltiplos núcleos elípticos localizados na periferia do citoplasma. O epimísio é
uma bainha de tecido conjuntivo que envolve o músculo e se estende
internamente formando septos denominados perimísio, que contornam os
fascículos, organizando feixes contendo dezenas de fibras musculares envoltas
individualmente pelo endomísio e com extensa rede vascular e inervação.
No músculo esquelético e cardíaco, os elementos contráteis do
citoesqueleto estão altamente organizados formando padrões característicos
de cruzamento de miosina e actina (bandas clara e escura) alinhadas ao longo
do comprimento, dando uma aparência estriada na microscopia ótica. A faixa
escura (banda A) é anisotrópica e a faixa clara é isotrópica (banda I),
apresentando uma faixa mais escura central, a linha Z (Randall, 2000). A
estriação da miofibrila deve-se à repetição de unidades iguais, os sarcômeros,
constituídos de filamentos de actina e filamentos grossos de miosina dispostos
longitudinalmente. Cada sarcômero é formado pela região da miofibrila
compreendida entre duas linhas Z sucessivas e contém uma banda A
separando duas semibandas I (Tortora, 2003). Essa organização é mantida por
diversas proteínas, como a desmina, que liga as miofibrilas umas às outras e a
distrofina, que liga os filamentos de actina às proteínas integrais da membrana
plasmática (Michele e Campbell, 2003). Para a contração muscular ocorrer, é
necessário que as cabeças das miosinas tracionem os filamentos finos de
3
actina para a direção central, ocasionando o encurtamento do sarcômero
(Maughan, Watson et al., 1983). A contração do músculo esquelético depende
de impulsos nervosos que estimulam a liberação de cálcio estocado pelo
retículo sarcoplasmático. Tropomiosina, uma proteína fibrosa que une os
filamentos de actina, associa-se a um complexo de três polipeptídeos: a
Troponina C (unindo-se com o cálcio), troponina I (inibitório) e a troponina T
(unindo-se com a tropomiosina).
Existem diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas, cada uma
com diferentes isoformas de proteínas e propriedades funcionais. As fibras
musculares lentas (tipo I) são especializadas em contração lenta e as fibras do
tipo II na contração rápida. Um padrão distinto de estimulação elétrica da
inervação da fibra pode regular a expressão de genes e o tamanho da fibra
muscular (Carroll, Nicotera et al., 1999). Com base nas características
funcionais e estruturais, as fibras musculares esqueléticas são classificadas
(Tabela I) em três tipos principais: tipo I, IIA e IIB (Brooke e Kaiser, 1970;
Randall, 2000).
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Tipos de fibra
Tipo I
Tipo IIA
Tipo IIB
Tempo de contração
Lenta
Rápida
Muito rápida
Tamanho do n. motor
Pequeno
Grande
Muito grande
Resistência à fadiga
Alta
Intermediária
Pequena
Atividade
Aeróbica
A. longa duração
A. curta duração
Produção de força
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Alta
Muito alta
Densidade de mitocôndria
Alta
Alta
Pequena
Densidade de capilares
Alta
Intermediária
Pequena
Capacidade oxidativa
Alta
Alta
Pequena
Capacidade glicolítica
Pequena
Alta
Alta
Estocagem de energia
Triglicerídeos
CP, Glicogênio
CP, Glicogênio
Tabela 1 – Tipos de fibras musculares
Referência: http://www.brianmac.demon.co.uk/muscle.htm
(acessado em 14/01/2008) CP = fosfocreatina
5
A diversidade funcional entre os tipos de fibras musculares dos
mamíferos deve-se à presença de várias isoformas de miosina e somente a um
tipo de actina. A molécula de miosina é um hetero-hexímero formado por duas
cadeias pesadas de miosina e dois pares de cadeias leves, considerados
regulatórios por determinarem a velocidade e a força das fibras musculares. A
miosina de cadeia pesada (MyHC), uma proteína sarcomérica usada como
marcador de diferenciação muscular (Fulton e Alftine, 1997), tem várias
isoformas. Esta característica permite classificar as fibras musculares em até 7
tipos diferentes (Weiss e Leinwand, 1996; Scott, Stevens et al., 2001), sendo
quatro delas no músculo esquelético do adulto. A MyHC I, presente nas fibras
musculares vermelhas de contração lenta, possui metabolismo mais oxidativo
pelo maior conteúdo de mitocôndrias e grande resistência à fadiga. Nas fibras
musculares brancas de contração rápida e menor resistência à fadiga
predominam as do tipo IIB (rápida glicolítica), IID/X (rápida intermediária) e IIA
(rápida oxidativa) (Reiser, Moss et al., 1985; Schiaffino e Reggiani, 1996),
todas ricas em MyHC II. As fibras do tipo IIC são consideradas não
diferenciadas (Brooke e Kaiser, 1970). A isoforma MyHC IIB aparece
progressivamente no desenvolvimento do músculo esquelético e é a isoforma
que predomina (70%) no animal adulto, chegando acima de 90% nos músculos
gastrocnêmio e quadríceps (Jansen, Windau et al., 1996). As isoformas IID/X e
IIA são principalmente expressas no diafragma, enquanto a isoforma do tipo I,
nos músculos posturais e solear, porém, dependendo do estímulo, pode
ocorrer mudança no tipo de fibra.
A composição da fibra muscular é influenciada por fatores hormonais e
do microambiente (Ianuzzo, Patel et al., 1977; Nwoye e Mommaerts, 1981;
6
Pette e Staron, 1997). Em resposta a um estímulo, há transição na expressão
da isoforma seguindo o padrão IIB IID/X IIA I. Existem também as fibras
híbridas, coexpressando IIB e IID/X, IID/X e IIA e I e IIA representando talvez
estágios de conversão da fibra (Staron e Pette, 1993). A inatividade do músculo
ocasiona uma mudança no tamanho e na expressão do tipo de fibra, seguindo
obrigatoriamente I IIA IID/X IIB e o sentido oposto com um aumento da
atividade e sobrecarga funcional (Booth e Criswell, 1997). A denervação causa
atrofia e mudança do tipo de fibra lenta para rápida (Sieck, 1994).
7
1.2 Regeneração do tecido muscular
No músculo esquelético, a formação de novos mionúcleos para
crescimento e reparo da fibra depende da disponibilidade de uma população de
células precursoras mononucleares chamadas células satélites (CS). Essas
células estão localizadas internamente entre a lâmina basal e o sarcolema das
fibras musculares. Durante o desenvolvimento, muitas células satélites estão
se dividindo e contribuindo com mionúcleos para o crescimento da miofibra. No
músculo maduro, as células satélites estão quiescentes, mas podem ser
ativadas em resposta injúria (Mouly, Aamiri et al., 2005), sendo identificadas
pela expressão dos marcadores: NCAM , M-Caderina e Pax 7. Estas células
contribuem para a reposição de mioblastos, osteoblastos, adipócitos e
condrócitos (Asakura, Komaki et al., 2001). As células satélites estão presentes
em todos os tipos de fibras musculares, embora com distribuição desigual. A
porcentagem de CS no músculo solear (contração lenta) do adulto é duas
vezes mais alta do que nos músculos de contração rápida (ex: tibial anterior e
extensor longo dos dedos). A população de células satélites varia também com
a idade: ao nascimento, representam uma população de 30%, reduzindo-se de
forma acentuada (menor que 5%) dois meses após o parto, porém mais
lentamente na vida adulta (Bischoff e Heintz, 1994).
Após injúria muscular, ocorre ativação das células mononucleares
inflamatórias e das células com potencial miogênico. Os neutrófilos são as
principais células inflamatórias que migram rapidamente para o tecido após
injúria, enquanto macrófagos representam os maiores responsáveis pela
8
fagocitose de debris celulares e pela ativação de células miogênicas 48 horas
após a lesão. As miofibras regeneradas apresentam nucleação central,
geralmente são basofílicas, refletindo alta síntese protéica e expressam
isoformas de MyHC embrionárias e de desenvolvimento.
Membros da família de fatores regulatórios miogênicos (MRF) possuem
um papel central na miogênese do músculo esquelético (Muntoni, Brown et al.,
2002; Chen e Goldhamer, 2003; Charge e Rudnicki, 2004) e pertencem à
superfamília de fatores de transcrição bHLH (basic helix-loop-helix) (Charge e
Rudnicki, 2004). Os MRFs primários, MyoD e Myf5, são necessários para a
ativação das células satélites, enquanto os MRFs secundários, miogenina e
MRF-4, são essenciais para a diferenciação terminal dos miotubos. A
expressão dos MRFs é modulada por fatores presentes no microambiente da
lesão muscular (Charge e Rudnicki, 2004), como: o fator de crescimento do
hepatócito (HGF), o fator inibitório de leucemia (LIF),interleucina-6 (IL-6) e
interleucina -1 (Cantini e Carraro, 1995; Bisschop, Gayan-Ramirez et al., 1997;
Floss, Arnold et al., 1997; Jiang e Hiscox, 1997; Austin, Bower et al., 2000). O
fator de crescimento de fibroblastos (FGF) aumenta a proliferação de células
satélites, a diferenciação e a fusão com o crescimento de miotubos (Dodson,
Allen et al., 1985; Florini, Ewton e Magri, 1991; Delany, Pash et al., 1994;
Fryburg, Jahn et al., 1995; Goldspink, Cox et al., 1995). O fator de crescimento
transformador beta (TGFβ) age como um fator regulatório da proliferação e
diferenciação de mioblastos (Charge e Rudnicki, 2004).
Células-tronco derivadas do músculo (MDSC) são caracterizadas pela
expressão de marcadores celulares e pela capacidade de diferenciação
miogênica. MDSCs apresentando os fenótipos de superfície Sca-1+CD45+ e
9
Sca-1+CD45- estão localizadas entre as fibras musculares principalmente
associadas a vasos sangüíneos (Asakura, 2003). MDSCs CD45+ isoladas de
músculo normal apresentam potencial miogênico muito limitado in vitro e in
vivo, mas possuem alto potencial hematopoiético. Em contraste, células
MDSCs CD45- se diferenciam prontamente em linhagens miogênicas in vivo e
in vitro (Mckinney-Freeman, Jackson et al., 2002). Alguns estudos mostram que
MDSCs CD45+ também são capazes de originar células miogênicas em alguns
modelos experimentais de lesão muscular, mas não está esclarecida a exata
contribuição das diferentes populações de progenitores durante a regeneração
do tecido muscular (Peng e Huard, 2004). Apesar de as células-tronco
hematopoiéticas circularem e migrarem para diferentes tecidos, existe
evidência indicando que as células-tronco residentes são as responsáveis pela
regeneração e reparo do tecido muscular (Peng e Huard, 2004).
10
1.3 Metaloproteases e remodelagem muscular
A matriz extracelular (ECM) é formada por uma rede complexa de
macromoléculas constituídas de polissacarídeos e proteínas estruturais. ECM é
uma estrutura dinâmica que regula o comportamento celular através de
interações com fatores de crescimento, determinando a ativação de vias
clássicas de transdução de sinais que induzem a proliferação, regulam a
expressão gênica, influenciam na migração e posicionamento no
microambiente (Alberts e Ronca, 1997).
A remodelagem da ECM é mediada por proteases, em especial as
metaloproteases (MMPs), uma família de endopeptidases dependentes de
zinco (Kieseier, Schneider et al., 2001) e classificadas de acordo com a
especificidade do substrato (colagenases, gelatinases, estromelisinas,
matrilisinas e tipo membranar). Estas enzimas possuem características comuns
incluindo o modo de ativação, a seqüência de aminoácidos conservada no sítio
ativo de ligação ao metal e inibição por inibidores específicos conhecidos como
inibidores de metaloproteinases (TIMPs). A maioria das MMPs é secretada
como zimogênio e sua ativação é caracterizada pela perda de
aproximadamente 10-kDa no seu peso molecular (Kherif, Lafuma et al., 1999).
A remodelagem da ECM durante a regeneração e degeneração
muscular sugere uma alta regulação da atividade lítica da matriz durante a
regeneração do músculo, inclusive mioblastos secretam MMP-2 de forma
constitutiva (Kherif, Lafuma et al., 1999). MMP-2 está envolvida na regulação
da integridade e composição da ECM no músculo esquelético, regulando a
proliferação, diferenciação de mioblastos e reparo da miofibra após a injúria (El
11
Fahime, Torrente et al., 2000; Wiendl, Hohlfeld et al., 2005). O tratamento
prévio de mioblastos com concanavalina A, um mitógeno indutor de MMP,
aumenta a migração de mioblastos injetados por via intramuscular (El Fahime,
Torrente et al., 2000). Após injúria muscular, a forma ativa de MMP-2
associada com a regeneração deste tecido está transitoriamente aumentada
dentro de 24 horas. A MMP-9 é produzida por várias células (ex: neutrófilos,
macrófagos, linfócitos, mastócitos) e permanece ativa por vários dias (Kherif,
Lafuma et al., 1999). Durante a remodelagem muscular, algumas proteínas da
ECM promovem sinais estimulatórios ou inibitórios para a migração de células.
A integrina 7 1 influencia a motilidade de mioblastos ao longo da membrana
basal rica em laminina (LN) durante a regeneração muscular (El Fahime,
Torrente et al., 2000).
1.4 Regulação hormonal do músculo esquelético
Existe uma contínua renovação de proteínas, síntese e perda, que
mantém a integridade funcional e a qualidade do músculo esquelético.
Importantes reguladores deste processo são os hormônios como o do
crescimento (GH) e os sexuais (testosterona), que estimulam o crescimento
muscular, principalmente pelos aumento da síntese protéica, pelos hormônios
que diminuem a perda de proteínas (ex: insulina) e pelos hormônios do
estresse, que aumentam o catabolismo muscular (glucagon, glicocorticóides e
catecolaminas). Os hormônios tireoidianos são também essenciais durante o
crescimento muscular, mas o excesso e ou deficiência causam destruição do
músculo. Estudos recentes mostraram que MDSCs originadas de
camundongos fêmeas apresentam maior capacidade regenerativa comparadas
12
com os machos, respondendo a baixos níveis de estresse oxidativo e com
grande proliferação (Deasy, Lu et al., 2007). Compreender os mecanismos que
levam à regulação da síntese e perda de proteínas no metabolismo muscular é
essencial para elucidar os mecanismos de destruição muscular. A perda ou
ganho de proteínas musculares é determinada pelo balanço entre síntese e
degradação de proteínas. As taxas de renovação muscular são afetadas por
muitas condições fisiológicas, como alimentação (Rennie, Edwards et al.,
1982), jejum (Cheng, Pacy et al., 1987), idade (Welle, Thornton et al., 1993;
Yarasheski, Zachwieja et al., 1993) e também doenças (Rennie, 1985). Os
hormônios são os maiores reguladores de renovação de proteínas nestas
condições. Muitas endocrinopatias são caracterizadas por destruição muscular
e perda da função (Ruff e Weissmann, 1988).
Muitos estudos têm mostrado os efeitos da insulina sobre o metabolismo
protéico do músculo. Estes estudos mostram o efeito anabólico da insulina
sobre o músculo, estimulando a captação de aminoácidos, síntese de proteína
e inibição da quebra de proteínas (Florini, 1987; Kettelhut, Wing et al., 1988;
Sugden e Fuller, 1991; Garlick, Essen et al., 1992; Wright e Sutherland, 2008).
O efeito anabólico da insulina é evidente, uma vez que pacientes diabéticos,
deficientes de insulina, têm grande destruição muscular e isto é revertido com o
tratamento de insulina. Outros estudos sugerem que a redução induzida pela
insulina na quebra da proteína muscular ocorre principalmente nas proteínas
não miofibrilares (Arfvidsson, Zachrisson et al., 1991; Moller-Loswick,
Zachrisson et al., 1994).
O efeito anabólico do hormônio do crescimento (GH) em crianças e
adultos deficientes GH é bem estabelecido (Collipp, Thomas et al., 1973;
13
Jorgensen, Pedersen et al., 1989; Cuneo, Salomon et al., 1991; Smith, Barua et
al., 1992; Jorgensen, Moller et al., 1994). Nos idosos, que apresentam
diminuição da secreção GH, a suplementação GH determina o aumento da
massa muscular. Estudos em animais têm mostrado que GH aumenta as taxas
de síntese de proteínas e diminui a quebra de proteínas no tecido muscular
(Florini, 1987; Kettelhut, Wing et al., 1988; Sugden e Fuller, 1991; Ewton, Roof
et al., 1994; Fryburg, Jahn et al., 1995; Di Iorio, Abate et al., 2006).
A infusão de IGF-1 no músculo esquelético de humanos mostrou um
aumento no metabolismo de proteínas, com um aumento na síntese protéica
(Elahi, Mcaloon-Dyke et al., 1993). O efeito estimulatório de IGF-1 sobre a
síntese de proteínas no músculo pode ser atenuado inibindo-se o concomitante
aumento no fluxo de sangue pelo inibidor do óxido nítrico. Isto indica que o
efeito de IGF-1 sobre a síntese de proteína no músculo esquelético depende,
em parte, da produção do óxido nítrico (Fryburg, 1996). A ação metabólica do
GH pode, em parte ou inteiramente, ser secundária à produção de IGF-1.
Assim, o hormônio do crescimento pode atuar diretamente ou indiretamente via
IGF-1, dependendo da ação metabólica e do tecido (Yarasheski, 1994; Pash,
Delany et al., 1995).
Muito pouco é conhecido sobre a interação de vários hormônios e
fatores de crescimento e possíveis efeitos aditivos. Quando os hormônios GH e
insulina foram administrados simultaneamente aumentaram a síntese de
proteínas e não alteram o catabolismo de proteínas (Gore, Honeycutt et al.,
1991; Fryburg, Louard et al., 1992). Em pacientes com distrofia miotônica, a
suplementação com GH exerce efeito positivo sobre a potência muscular,
indicando possível efeito benéfico sobre o metabolismo de proteínas
14
(Vlachopapadopoulou, Zachwieja et al., 1995). Ambos, GH e IGF-1, têm efeitos
sobre a síntese de proteínas quando administrados diretamente, embora estes
efeitos não sejam observados quando administrados sistemicamente. IGF-1
também pode causar hipoglicemia, o que limita a administração sistêmica,
porém o efeito pode ser contornado com a administração simultânea com GH.
A ação metabólica e interação destes hormônios não são ainda inteiramente
conhecidas e mais estudos são necessários, especialmente em relação à
distrofia muscular.
Os efeitos anabólicos da testosterona sobre o músculo esquelético são
bem conhecidos (Mooradian, Morley et al., 1987). A testosterona e derivados
estruturais induzem acréscimo de massa muscular e síntese de proteína em
indivíduos jovens e idosos (Ferrando, Sheffield-Moore et al., 2002). Esteróides
anabólicos são utilizados para melhorar o ganho de massa muscular após
treinamento físico. Dose suprafisiológica de testosterona, especialmente em
combinação com treinamento de potência, aumenta a massa e potência
muscular em homens saudáveis (Bhasin, Storer et al., 1996). A administração
de testosterona aumenta os níveis de IGF-1 em homens normais, sugerindo
que os efeitos deste hormônio podem ser via IGF-1 (Hobbs, Plymate et al.,
1993; Harridge, 2007). Embora seja conhecido que esteróides aumentam a
massa muscular, muito pouco se sabe sobre os efeitos nos processos
diretamente envolvidos no remodelamento muscular, tal como inflamação. A
testosterona e seus análogos modulam a atividade de macrófagos (Brain,
Benton et al., 1976; Keller, Ershler et al., 1996). Citocinas e outras proteínas
secretadas por macrófagos podem regular a proliferação de células satélites
(Merly, Lescaudron et al., 1999). Existem evidências de que a testosterona é
15
crítica tanto no início como na resolução da resposta inflamatória muscular,
contribuindo para o sucesso do crescimento e regeneração (Bondesen, Mills et
al., 2004). A testosterona aumenta a expressão de molécula de adesão e isto
também pode ser um regulador positivo das células satélites (Zhang, Wang et
al., 2002).
Níveis séricos de testosterona e androgênios adrenais declinam com a
idade em machos (Rennie e Millward, 1983; Rennie, Smith et al., 1994). Em
mulheres idosas, os níveis de testosterona também estão diminuídos,
particularmente após a menopausa. Dados epidemiológicos sugerem a
existência de uma relação entre níveis reduzidos de testosterona e declínio na
massa, potência e força do músculo (Rodier, Richard et al., 1984; Robert,
Beaufrere et al., 1985; Bach, Salemi et al., 1995). A reposição de testosterona
resulta no aumento da massa e força muscular em populações de homens
idosos hipogonodais (Ruff e Weissmann, 1988; Salomon, Cuneo et al., 1989;
Sakurai, Aarsland et al., 1995). Outro mecanismo pelo qual a testosterona
aumenta a massa muscular tem sido mostrado através do aumento do número
de células satélites (Stiegler, Rett et al., 1989) que também expressam
receptores de androgênios (Tessari, Biolo et al., 1990). A exposição a
androgênios, de maneira dose dependente, aumenta a expressão de IGF-1 no
músculo diafragma de ratos (Tessari, Inchiostro et al., 1991).
Os efeitos de estrogênios e progesterona sobre o metabolismo de
proteínas é pouco conhecido. A menopausa está associada à perda muscular
acelerada (Mooradian, Morley et al., 1987). Contudo, não está claro se a
reposição de estrogênio pode aumentar ou não a massa muscular. Alguns
estudos têm evidenciado que a terapia de substituição hormonal não previne
16
mudanças promovidas pela menopausa na composição do corpo (Beckett,
1992) ou melhora na massa muscular (Nair, Halliday et al., 1987; Newman,
Heslin et al., 1994), o que é contrariado por outros estudos que mostraram a
melhora da potência muscular (Nair, Garrow et al., 1983; Pacy, Cheng et al.,
1990; Pacy, Bannister et al., 1991). Um mecanismo pela qual a perda de
estrogênio pode contribuir para a sarcopenia relacionada com a idade pode ser
devido ao aumento de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e TNF-alfa
(Palmer, 1990; Pearlstone, Wolf et al., 1994). IL-6 diminui níveis de IGF-1 tanto
in vitro e in vivo (Pozefsky, Felig et al., 1969; Preedy e Garlick, 1985). Baixo
nível de IGF-1 pode estimular a IL-6, sugerindo um elo entre IGF-1 e IL-6
(Preedy e Garlick, 1988). Cappola e colaboradores examinaram os efeitos dos
baixos níveis de IGF-1 e altos níveis de IL-6 (individualmente e combinados)
sobre a mobilidade, habilidade e morte celular (Cappola, Bandeen-Roche et al.,
2001). Estes autores concluíram que a combinação de baixos níveis de IGF-1 e
altos de IL-6 confere um risco progressivo de não habilidade e morte em
mulheres mais velhas, sugerindo um efeito na falta de regulação dos sistemas
imune e endócrino (Ramsay, 1966). Deficiência de estrogênio aumenta vias
pró-inflamatórias, uma vez que o estrogênio diminui a expressão de IL-6 e
apresenta efeitos inibitórios sobre as vias do NF-kB (Reeds e Palmer, 1983;
Reeds, Hay et al., 1985) e AP-1 para a transcrição do gene do TNF-alfa
(Rennie, 1985). Além disto, foi mostrado que o estrogênio afeta a expressão de
HSP70 em diversos tecidos, incluindo a do músculo esquelético (Rennie,
Bennegard et al., 1984). A indução de HSP70 após exercício muscular foi
maior em ratos machos do que em fêmeas (Rennie, Edwards et al., 1982).
17
Glicocorticóides, glucagon e catecolaminas são considerados os mais
importantes hormônios catabólicos. Estes hormônios são elevados em
situações clínicas de estresse intenso (Alberti, Batstone et al., 1980) e a perda
de proteínas é vista resultando no aumento da quebra de proteínas em
excesso.
O tratamento com glicocorticóides induz a um decréscimo da síntese de
proteína e, possivelmente, a um aumento da quebra de proteínas em animais
(Florini, 1987; Garlick, Burns et al., 1988; Sugden e Fuller, 1991). Na síndrome
de Cushing, o aumento da produção glicocorticóide mostra um grande efeito
sobre o músculo esquelético com marcada destruição e fraqueza muscular.
Também o mesmo ocorre com administração intensiva de cortisol numa
variedade de situações clínicas (Horber, Scheidegger et al., 1985). Apesar de o
tratamento com prednisona (glicocorticóide sintético) melhorar a potência e a
função muscular em pacientes com DMD (Distrofia muscular de Duchenne) não
foram encontradas diferenças nas taxas de síntese protéica (Rifai, Welle et al.,
1995). A ação específica dos glicocorticóides sobre o metabolismo de proteínas
musculares é difícil de ser determinada, pois outros hormônios também são
afetados pelo tratamento.
O glucagon atua principalmente no fígado, entretanto, a incubação de
músculo de rato com altas concentrações de glucagon resulta no decréscimo
da síntese de proteínas (Preedy e Garlick, 1985; 1988). A liberação de
aminoácidos a partir do músculo pode estar aumentada (Kraenzlin, Keller et al.,
1989) ou diminuída (Del Prato, Defronzo et al., 1990) em similares protocolos
de infusão da epinefrina.
18
Os hormônios da tireóide, embora essenciais para o crescimento,
exibem efeito catabólico no músculo esquelético durante os estados de
hipotireoidismo e hipertireoidismo (Ramsay, 1966; Kissel e Mendell, 1992),
determinando fraqueza muscular e, posteriormente, perda da massa muscular
(Zurcher, Horber et al., 1989). A tireoidectomia induz à atrofia muscular pela
diminuição da síntese e aumento da degradação de proteínas (Garlick, Burns
et al., 1988), porém também no hipertireoidismo tem sido reportado aumento
do catabolismo protéico (Gelfand, Hutchinson-Williams et al., 1987).
Prostaglandinas e citocinas são importantes reguladoras do
metabolismo de proteínas musculares (Palmer, 1990; Bistrian, Schwartz et al.,
1992), aumentam a síntese de proteínas musculares induzida pela insulina
(Reeds e Palmer, 1983; Reeds, Hay et al., 1985). Contudo, a influência sobre a
ação da insulina pode ser diferente em humanos e em animais, dependendo do
tipo de prostaglandina e da espécie animal (Garlick, Burns et al., 1988; Stiegler,
Rett et al., 1989). Citocinas estão entre os prováveis mediadores da
sarcopenia, observada durante diversos estados de doenças (Bistrian,
Schwartz et al., 1992). Em ratos, estas geralmente induzem destruição
muscular pelo aumento da quebra de proteínas (Kettelhut, Wing et al., 1988;
Flores, Bistrian et al., 1989; Goodman, 1991). Os efeitos diretos e indiretos de
prostaglandinas e citocinas sobre o metabolismo de proteínas no músculo em
humanos ainda precisam ser estabelecidos.
19
1.5 Influência do sistema imune no músculo esquelético
O microambiente tecido muscular esquelético contém, além das células
musculares e respectivos progenitores, vários tipos celulares, como:
fibroblastos, células endoteliais e do sistema imune, que contribuem para a
funcionalidade e manutenção da homeostase.
O sistema imunológico inato é vital para o processo de cicatrização.
Macrófagos e neutrófilos, presentes no processo inflamatório que acompanha a
lesão muscular, apresentam um papel importante na remoção de debris
tissulares. Entretanto, em modelos de lesão muscular já foi mostrado que
neutrófilos podem promover dano muscular através da produção de moléculas
citotóxicas e citolíticas (Tidball, 2005), além de aumentar o estresse oxidativo
(Beray-Berthat, Croci et al., 2003; Tidball e Wehling-Henricks, 2007a; b).
Camundongos deficientes de neutrófilos apresentam uma regeneração tecidual
eficiente sem formação de cicatriz (Wadman, 2005). Além da atividade
fagocítica, os macrófagos secretam citocinas, fatores de crescimento e óxido
nítrico (NO) (Shi, Wakil et al., 1997; Cowin, Brosnan et al., 1998; Oliveira, El-
Cheikh et al., 2000; Sandler, Mentink-Kane et al., 2003; Park e Barbul, 2004).
NO regula a formação de colágeno, a proliferação celular e a contração da
lesão em modelos animais de reparo tecidual (Hesse, Modolell et al., 2001;
Witte e Barbul, 2002; Park e Barbul, 2004). No músculo esquelético já foi
mostrado que macrófagos são essenciais para desencadear o processo de
regeneração após transplante de mioblastos (Lescaudron, Peltekian et al.,
1999). Além disso, o meio condicionado de cultura de macrófagos peritoneais
20
pode aumentar a proliferação de mioblastos in vitro, bem como o número de
células expressando Myo-D. A primeira população de macrófagos que entra no
músculo lesado tem grande capacidade fagocítica e participa na destruição de
restos celulares e, posteriormente, uma população mais regulatória estimularia
a regeneração, promovendo o reparo do sarcolema lesado (Tidball e Wehling-
Henricks, 2007a).
O sucesso da regeneração e crescimento muscular parecem depender
da ativação seqüencial e subseqüente supressão da sinalização de citocinas.
Três citocinas comumente classificadas como inflamatórias, fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1b) e interleucina-6 (IL-6),
apresentam efeitos diversos no músculo esquelético (Tsujinaka, Fujita et al.,
1996; Langen, Schols et al., 2002). Tanto TNF-α como IL-6, em baixas
concentrações, podem atuar como fator de crescimento para o músculo
esquelético (Warren, Hulderman et al., 2002; Li, 2003), mas também podem
induzir destruição em altas concentrações ou com exposições crônicas
(Tsujinaka, Fujita et al., 1996; Langen, Schols et al., 2002). TNF-α está
freqüentemente associado a doenças de destruição muscular. Contudo, este
também é crítico para o sucesso da regeneração muscular a partir de injúria
por cardiotoxina (Chen, Gerken et al., 2005). IL-1b pode suprimir a síntese de
proteínas (Cooney, Maish et al., 1999; Strle, Broussard et al., 2004) e induzir
fibrose cardíaca (Hwang, Lee et al., 2001). Na inflamação do tecido muscular,
várias populações de células do sistema imune expressam e liberam diferentes
citocinas e quimocinas, contudo, recentes descobertas também indicam que
células musculares são fontes destes fatores. Mioblastos humanos produzem
uma variedade de citocinas constitutivamente, tais como, IL-6 e TGF-β. Outras
21
citocinas como IL-4, IL-10 e IFN-γ e também IL-1α, IL-1β e TNF-α são
encontradas em mioblastos somente depois de estimulação. Receptores
específicos de citocinas não têm sido descritos em células musculares,
entretanto, o fato de mioblastos responderem a várias citocinas in vitro sugere
a presença de tais receptores. Diferentes citocinas aumentam a expressão de
quimocinas CXCL8 (IL-8), CXCL9, CXCL10, CCL3 (MIP-1a), CCL20 (MIP-3a) e
CCL5 (RANTES) em miotubos de humanos. Dados sobre a expressão de
receptores de quimocinas sobre células musculares são escassos. CCR1 e
CCR5 são expressos em células musculares não necróticas, porém CCR2B é
detectável em células satélites e fibras regenerando-se (Figarella-Branger,
Civatte et al., 2003).
Mioblastos de humanos podem expressar uma variedade de moléculas
imunológicas, incluindo MHC, moléculas coestimulatórias (Nagaraju, 2001), e
secretam várias citocinas, quimocinas e moléculas de adesão celular (Figarella-
Branger, Civatte et al., 2003) tão bem como receptores do sistema imune
(Mantegazza, Hughes et al., 1991; Roy, Dansereau et al., 1991; Goebels,
Michaelis et al., 1992; Wiendl, Behrens et al., 2000). Em condições
inflamatórias, células musculares expressam moléculas de MHC I e II e,
também, moléculas de adesão, citocinas e receptores de quimocinas e
moléculas co-estimulatórias. Mioblastos de humanos expressam
constitutivamente LFA-1 (molécula de adesão do tipo 1 associada à função do
linfócito), embora LFA-1, LFA-2 e LFA-3 não sejam detectáveis em miotubos.
Depois da estimulação, in vitro, com citocinas pró-inflamatórias, a molécula de
adesão intercelular -1 (ICAM-1) é detectável na superfície de mioblastos
(Marino, Scuderi et al., 2003). Mioblastos não expressam as moléculas co-
22
estimulatórias B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) (Behrens, Kerschensteiner et al.,
1998; Bernasconi, Confalonieri et al., 1998), mas expressam B7-H1, um outro
membro da família B7, durante processos inflamatórios. B7-H1 exerce fortes
propriedades imunoinibitórias sobre as células T CD4 e CD8 . Assim, B7-H1
poderia atuar como um imunorregulador negativo produzido pelas células
musculares para controle da inflamação local (Wiendl, Mitsdoerffer et al., 2003).
1.6 Interações do tecido muscular e tecido adiposo
O tecido adiposo é um tecido conjuntivo especializado e apresenta
várias funções, como: isolamento térmico, barreira física ao trauma,
armazenamento energético e secreção de proteínas e peptídios bioativos com
ação local e à distância, sendo também considerado como um órgão endócrino
ativo (Prins, 2002; Fantuzzi, 2005; Trayhurn e Wood, 2005). Este tecido está
disperso pelo organismo, em depósitos sem ligação física entre si, cuja
atividade secretória é regulada por mecanismos humorais e hormonais não
totalmente esclarecidos. Nestes depósitos individuais de tecido adiposo,
encontram-se vários tipos celulares (macrófagos, fibroblastos, pré-adipócitos e
adipócitos) com atividade secretora variável. O tecido adiposo se comunica
com outros órgãos através de ácidos graxos livres e adipocinas. Este tecido
secreta mais de 50 adipocinas, podendo-se agrupá-las de acordo com as suas
principais funções: imunológica, cardiovascular, metabólica e endócrina. Dentro
do primeiro grupo, incluem-se IL-6, TNF-α e os componentes do sistema
complemento B, C3 e D (adipsina). Estas moléculas têm funções bem definidas
nos estágios inflamatórios, mas também são produzidas pelo tecido adiposo
23
em condições não-inflamatórias. Tanto TNF-α como IL-6 exercem um papel
importante no metabolismo dos lípidios e da glicose, como, por exemplo,
inibindo a lipoproteína lipase, induzindo a lipólise e aumentando a captação de
glicose. Os níveis de IL-6 estão aumentados na obesidade e diminuem com a
perda de peso, sendo também um marcador de resistência à insulina (Prins,
2002; Berg e Scherer, 2005). Os componentes do sistema complemento
adipsina ou fator D foram as primeiras proteínas identificadas como sendo
produzidas pelo adipócito. A presença dos fatores B e D é necessária à síntese
de fator C3a, a partir de C3. O fator C3a é posteriormente clivado em ASP
(proteína estimuladora de acilação) (Prins, 2002; Xu, Barnes et al., 2003). Esta
proteína intervém na síntese e no armazenamento de triglicerídeos (TG). A sua
deficiência (em ratos) está associada à diminuição da gordura corporal e ao
aumento da sensibilidade à insulina (Prins, 2002; Havel, 2004). No grupo das
adipocinas com função predominantemente cardiovascular, destacam-se as
moléculas do eixo renina angiotensina e o inibidor de ativação do
plasminogênio (PAI-1). Há uma forte associação entre obesidade e o risco
cardiovascular, sobretudo da gordura visceral (Gregoire, 2001; Prins, 2002; Xu,
Barnes et al., 2003; Berg e Scherer, 2005). O tecido adiposo influencia
diretamente o metabolismo de lípidios e carboidratos. As adipocinas envolvidas
nestes processos são os ácidos graxos livres (AGL), a adiponectina, a
resistina, o AGRP (agouti related petide) e a visfatina. O paradigma da função
endócrina do tecido adiposo é a leptina. A sua produção é quase exclusiva do
tecido adiposo e desempenha um papel fundamental na regulação dos
depósitos energéticos, da fertilidade e do sistema imunológico (Fantuzzi, 2005;
Mitchell, Armstrong et al., 2005). Além da produção de leptina, o adipócito tem
24
uma função importante no metabolismo dos hormônios esteróides,
predominantemente de interconversão. O tecido adiposo intervém no
metabolismo dos esteróides sexuais em duas vias bioquímicas: a via 17-β
hidroxiesteróide oxireductase, que cataliza a conversão de androstenediona em
testosterona e a de estrona em estradiol e a outra via dependente da
aromatase P450 que cataliza a conversão de androstenediona em estrona e de
testosterona em estradiol. Estas vias contribuem significativamente para os
níveis de esteróides sexuais na mulher (sobretudo na pós-menopausa). Assim,
as adipocinas desempenham um papel importante na homeostasia energética,
sensibilidade à insulina, resposta imunológica e doença vascular (Gregoire,
2001; Prins, 2002; Xu, Barnes et al., 2003; Fantuzzi, 2005).
Os adipócitos podem se expandir dentro e fora das fibras musculares
esqueléticas, influenciando as células musculares via sinalização parácrina e
endócrina. O tecido adiposo comunica-se com o músculo esquelético através
de mediadores metabólicos, incluindo os ácidos de gorduras livres e
adipocinas. Adipocinas, tais como TNF-α, IL-6, leptina, MCP-1, TIMP-1 (inibidor
tipo 1 de metaloproteinase tecidual) e a glicoproteína transportadora de retinol
(RBP-4), estão implicadas no desenvolivimento de resistência à insulina no
músculo (Sartipy e Loskutoff, 2003; Yang, Graham et al., 2005) . A
adiponectina é um hormônio protéico envolvido na manutenção da homeostase
energética nos tecidos metabolicamente ativos através da ativação de
receptores da adiponectina, AdipoR1 e AdipoR2, que sinalizam quinase
dependente de AMP (AMPK) no fígado e no músculo (Bluher, Bullen et al.,
2006). A adiponectina também exerce ações antinflamatórias por reduzir a
25
expressão da molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1), E-selectina, ICAM-1 e
IL-8 em células endoteliais da aorta induzidas por TNF-α (Ouchi, Kihara et al.,
1999; Kobashi, Urakaze et al., 2005). Além disso, a adiponectina também inibe
o fator nuclear-κB (NF-κB) estimulado por TNF-α em células endoteliais e
macrófagos (Ouchi, Kihara et al., 2000; Kobashi, Urakaze et al., 2005;
Yamaguchi, Argueta et al., 2005), estimula a produção da citocina
antinflamatória IL-10 por macrófagos (Wulster-Radcliffe, Ajuwon et al., 2004),
aumenta a produção do inibidor de metalloproteinase-1 em macrófagos de
humanos (Kumada, Kihara et al., 2004) e também atua como um importante
regulador da sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS).
O tecido adiposo, além de contribuir com fatores endócrinos e
metabólicos para o tecido muscular, também pode ser uma origem de células-
tronco com capacidade miogênica (Zuk, Zhu et al., 2002; Mizuno, 2003; Strem,
Hicok et al., 2005). Células-tronco do tecido adiposo podem ser rapidamente
induzidas a diferenciar-se em tecido muscular quando estimuladas por fatores
miogênicos ou ainda em macrófagos a partir de pré-adipócitos (Charriere,
Cousin et al., 2003).
Também fatores derivados do músculo (miocinas) podem afetar as
células adiposas. As miocinas, assim como as adipocinas, fazem parte da
sinalização entre músculo e tecido adiposo, importante na modulação da taxa
de massa de gordura e resistência à insulina. A IL-6 é fortemente produzida no
músculo esquelético durante e após o exercício (Steensberg, Keller et al.,
2002). A estimulação de curta duração de miócitos com IL-6 por concentrações
similares àquelas durante o exercício tem um efeito positivo sobre a
sensibilidade à insulina nas células musculares esqueléticas (Weigert, Hennige
26
et al., 2005), indicando um papel importante no suprimento de energia durante
o exercício porque também ativa a lipólise no tecido adiposo (Van Hall,
Steensberg et al., 2003). Outra miocina, IL-15, secretada por miócitos,
influencia na proliferação de adipócitos e secreção de adiponectina (Quinn,
Strait-Bodey et al., 2005).
1.7 Receptores de estrogênios – Moduladores e bloqueadores
Os efeitos do estradiol são mediados através de receptores localizados
no núcleo e atuam como fatores de transcrição (Aranda e Pascual, 2001;
Klinge, 2001). A expressão do gen é regulada pela união direta de estradiol ao
receptor de estrogênio e se liga a uma seqüência específica do DNA chamada
de elemento de resposta ao estrogênio (ERE) (Klinge, Jernigan et al., 2004).
Receptores de estrogênios também estão localizados na membrana celular e
são importantes nos efeitos metabólicos imediatos (Klinge, Jernigan et al.,
2004). O primeiro receptor de estrogênio foi denominado ER-α em 1986
(Green, Kumar et al., 1986) e somente 10 anos depois foi identificado o
segundo receptor de estrogênio, ER-β (Kuiper e Gustafsson, 1997). Existe uma
grande similaridade entre estes dois receptores, sugerindo que o ER-β pode
reconhecer e unir-se a elementos responsivos ao estrogênio (EREs) tal com o
ER-α, mas cada receptor pode ter distintos espectros de ligantes, sendo
possível que o ER-β antangonize as ações ER-α.
Tecidos-alvo para estrogênio incluem os alvos clássicos, com alto
conteúdo de ER-α: útero, glândulas mamárias, placenta, fígado, sistema
nervoso central, sistema cardiovascular e osso e os alvos não clássicos, como:
a próstata, testículos, ovário, glândula pineal, glândula tireóide, pele,
27
paratireóide, adrenais, pâncreas, tecido linfóide e trato urinário, onde
predomina o ER-β e a expressão do ER-α é muito pouco ou quase
imensurável. O músculo esquelético expressa receptores de estrogênio, sendo
assim, responsivo para estrogênio (Dionne, Lesage et al., 1979; Meyer e Rapp,
1985; Gustafsson, 1999; Lemoine, Granier et al., 2002; Lemoine, Granier et al.,
2003; Wiik, Glenmark et al., 2003). No músculo maduro, o estrogênio ativa a
expressão de cadeia pesada da miosina (MHC), fenótipo do músculo e,
portanto, previne injúria muscular (Warren, Williams et al., 1996; Stupka,
Lowther et al., 2000; Kadi, Karlsson et al., 2002; Tiidus, 2003; Feng, Li et al.,
2004). O estrogênio regula vias de sinalização de receptores acoplados à
proteína G, na qual tem sido identificado como regulador do crescimento
muscular (Kraus, Bernard et al., 1989; Sillence, Reich et al., 1995; Enns, Iqbal
et al., 2008; Enns e Tiidus, 2008). Mioblastos também possuem receptores de
estrogênios funcionalmente competentes e que podem transativar genes
endógenos como c-fos e erg-1 na proliferação de mioblastos (Kahlert, Grohe et
al., 1997).
Mediadores químicos que inibem a função dos estrogênios são
chamados de antiestrogênios. Estes podem ser de dois tipos: moduladores dos
receptores de estrogênio (SERMs) e inibidores da aromatase. Tamoxifen,
raloxifene e ICI 182,780 (faslodex, fulvestrant) são exemplos de SERMs. As
classes de SERMs apresentam atividade dupla de agonista e antagonista,
dependendo do subtipo de receptor no mesmo tecido e/ou em tecidos
diferentes; também podem ser específicos para um subtipo de receptor
(Stewart e Stern, 1986; Rutqvist e Mattsson, 1993; Wenger, 2002; Jensen e
Jordan, 2003; Lewis e Jordan, 2005). O tamoxifen tem sido terapeuticamente
28
usado para mulheres com câncer de mama como um agente antiestrogênico
desde 1970. Este também funciona como um agente estrogênico no osso e no
metabolismo de gordura. O tamoxifen é um modulador seletivo do receptor de
estrogênios (Goldenberg e Froese, 1982; Perry, Kang et al., 1995; Ferlini,
Scambia et al., 1999) que funciona como antagonista em alguns tecidos como
na mama e útero e agonista em outros tecidos tais como coração e osso
(Stewart e Stern, 1986; Love, Mazess et al., 1992; Rutqvist e Mattsson, 1993;
Li, Takahashi et al., 1996; Fitts, Klein et al., 2001; Eugster, Rubin et al., 2003;
Jensen e Jordan, 2003; Fitts, Klein et al., 2004). No músculo, apresenta
propriedades agonistas uma vez que fêmeas ovariectomizadas tratadas com
este agente modulador tiveram destruição muscular reduzida de modo
semelhante aos ratos machos (Koot, Amelink et al., 1991). Os inibidores de
aromatase letrozole, anastrozole e exemestane atuam como antiestrogênios
por bloquearem a conversão de androgênios em estrogênios ativos.
1.8 Distrofia muscular de Duchenne
A distrofia muscular do tipo Duchenne (DMD) é uma miopatia
inflamatória grave de evolução fatal, caracterizada pela destruição progressiva
das fibras musculares esqueléticas e substituição precoce por tecido conjuntivo
e adiposo (Duchenne, 1868; Dubowitz, 1985; Hoffman, Brown et al., 1987;
Deconinck e Dan, 2007; Hopf, Turner et al., 2007). A presença de mutações no
cromossomo X (locus Xp21) é a base genética responsável pela distrofia
muscular de Duchenne (Greenstein, 1977; Emery, 1989; Fayssoil, Orlikowski et
al., 2008). O produto normal do gene DMD é uma proteína de 427 kDa
denominada distrofina, presente nas células musculares esqueléticas estriadas
29
normais, células endoteliais e algumas células do sistema nervoso central
(Mehler, 2000; Cyrulnik e Hinton, 2008) . Nos indivíduos com DMD, a distrofina
está ausente ou é expressa como molécula truncada não-funcional (Mendell,
Sahenk et al., 1995; Van Der Berg, 1995; Den Dunnen e Beggs, 2006). O gene
da distrofina é extremamente grande (3,4 Mb), contém 79 exons e 2,4 milhões
de bases. A sua grande complexidade propicia uma alta taxa de novas
mutações, sendo que, em 65% dos pacientes, ocorre perda de uma parte do
DNA (deleção), em 5%, duplicação do gene e, em 30% dos casos, mutações
pontuais (Hoffman, 1996; Lim e Rando, 2008).
A distrofina é a proteína mais abundante na fibra muscular,
representando aproximadamente 5% das proteínas do citoesqueleto. Tal
proteína apresenta localização na porção interna do sarcolema, formando uma
trama associada a um complexo de glicoproteínas (DGC) constituído pelas
distroglicanas, sarcoglicanas, sintrofinas, distrobrevinas, sarcospana e -
actinina (Watkins, Cullen et al., 2000; Kanagawa e Toda, 2006). Atualmente,
acredita-se que todo esse complexo DGC-distrofina, além do suporte estrutural,
participe na transdução de sinais provenientes da interação da fibra muscular
com a matriz extracelular (Watkins, Cullen et al., 2000; Ervasti, 2007). A
organização desse complexo é essencial para a integridade da fibra muscular,
uma vez que defeitos em outras proteínas do complexo resultam em diferentes
tipos de distrofias musculares (Allikian e Mcnally, 2007).
O papel da distrofina no músculo esquelético ainda não está totalmente
elucidado, embora existam várias hipóteses para sua função como proteína
estrutural de membrana, estabilizadora do sarcolema durante o estresse da
30
contração muscular, proteína estabilizadora de outras proteínas membranares
e proteína moduladora da homeostase dos íons cálcio. Estas hipóteses não
são excludentes entre si, podendo a distrofina exercer mais de uma função no
músculo. A deficiência ou ausência da distrofina leva à fosforilação acentuada,
alteração na homeostase do cálcio intracelular, redução do conteúdo de
triglicerídeos, instabilidade e perda da integridade do sarcolema, culminando
com apoptose e necrose das fibras musculares e liberação de enzimas como
piruvato e creatinaquinase (Tews, Goebel et al., 1997; Infante e Huszagh,
1999; Deconinck e Dan, 2007). Na DMD, o músculo responde com ciclos de
regeneração e degeneração, numa tentativa, sem sucesso, de substituir a
perda das fibras musculares (Cullen e Mastaglia, 1980; Miike, 1983; Brasseur,
Onolfo et al., 1997). Os efeitos epistáticos decorrentes da deficiência de
distrofina são de grande importância, influenciando na gravidade da doença.
Por exemplo, a ausência de distrofina produz uma doença progressiva em
humanos e em gatos, mas uma doença benigna em camundongos que
apresentam expectativa de vida normal. Além disso, o comprometimento
muscular difere entre os músculos, o que ressalta a importância da influência
de fatores epigenéticos (Tidball e Wehling-Henricks, 2004).
As anormalidades histológicas mais comuns na miofibra na DMD são:
desorganização das bandas I e Z; presença de fibras arredondadas com
tamanho variado (fibras gigantes e pequenas) com sarcoplasma
grosseiramente granular; vacuolização e fragmentação; nucleação central;
mionecrose e fibrose intersticial precoce, geralmente associada à deposição de
tecido adiposo. DMD ainda permanece uma doença incurável e os tratamentos
disponíveis clinicamente são todos paliativos. A terapia celular com
31
transferência de mioblastos e células-tronco poderia corrigir os problemas
primários, porém ainda existem várias dificuldades a serem superadas nesse
tipo de tratamento (Rodino-Klapac, Chicoine et al., 2007). A obtenção de um
vetor apropriado para um gene tão grande como o da distrofina, a expressão
limitada de distrofina numa pequena área próxima à inoculação e a meia vida
curta do mioblasto transfectado bem como a rejeição imunológica ainda são
obstáculos a serem superados (Bogdanovich, Perkins et al., 2004; Negroni,
Butler-Browne et al., 2006). Outra esperança é o tratamento como
oligonucleotídeos tanto para correção da tradução como para terapia gênica,
mas o alto custo, a não-disponibilidade sistêmica e a rejeição imunológica
ainda são problemas a serem solucionados para o uso como terapêutica
(Bertoni, 2008).
1.9 Camundongo mdx - modelo murino da DMD
O camundongo distrófico mdx, mutante de uma colônia de
C57BL10/ScSn, apresenta uma mutação pontual na região HqBpa do
cromossomo X (Smith e Schofield, 1994), ocasionando a substituição de uma
Citosina por Timina no par de nucleotídeos 3185 do exon 23 do gene da
distrofina. Isto determina um código de terminação no lugar da Glutamina,
gerando uma proteína truncada com 27% do tamanho normal que não é
expressa (Sicinski, Geng et al., 1989). O camundongo mdx apresenta níveis
muito elevados da enzima creatinaquinase no soro, o que indica extensa
degeneração muscular. Contudo, esses animais desenvolvem fenótipo benigno
da doença com poucos sintomas clínicos aparentes, apresentando uma
32
sobrevida praticamente normal e uma regeneração do tecido muscular eficiente
(Bulfield, Siller et al., 1984).
O músculo do mdx apresenta poucas alterações histológicas no período
pós-natal, porém, logo após o desmame, inicia-se a fase de mionecrose
extensa (Cullen e Mastaglia, 1980) acompanhada por intenso infiltrado
inflamatório constituído principalmente de macrófagos, linfócitos T e raros
linfócitos B (Mcdouall, Dunn et al., 1990; Spencer, Walsh et al., 1997; Lagrota-
Candido, Vasconcellos et al., 2002). Na oitava semana de vida pós-natal, a
mionecrose é parcialmente compensada pela regeneração da miofibra, sendo
evidente um elevado número de fibras regeneradas com nucleação central
(Nonaka, 1998). Nos camundongos mdx mais idosos- com 24 semanas- ainda
ocorre uma discreta mionecrose com redução na regeneração e aumento na
fibrose, porém, após 52 semanas de vida pós-natal, os camundongos mdx
apresentam um declínio significativo do peso corporal e da massa muscular
(Lefaucheur, Pastoret et al., 1995). As fibras musculares do mdx idoso
apresentam grande variação no tamanho, inclusive com miofibras atrofiadas,
fragmentadas e aumento da fibrose no endomísio (Pastoret e Sebille, 1995;
Lagrota-Candido, Vasconcellos et al., 2002).
Resultados da dissertação de mestrado (Salimena, Lagrota-Cândido et
al.,2004) mostraram que camundongos mdx machos e fêmeas apresentavam
diferenças no processo de regeneração muscular nas diferentes fases da
doença. As fêmeas apresentavam menor inflamação e mionecrose, porém
maior regeneração muscular e deposição de tecido adiposo que os
camundongos machos na idade adulto jovem (6 semanas pós-natal), porém as
alterações eram mais graves nas fêmeas idosas (24 semanas). Estes dados
33
sugerem que os hormônios femininos são particularmente responsáveis pelas
diferenças na lesão muscular do camundongo mdx, favorecendo a resolução
da mionecrose e promovendo a regeneração dos músculos esqueléticos.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estudar a influência do dimorfismo sexual na lesão muscular de
camundongos mdx com distrofia muscular de Duchenne.
2.2 Objetivos específicos
Comparar as alterações histomorfológicas presentes nos músculos
esqueléticos (solear e gastrocnêmio) na fase de regeneração nos
camundongos distróficos machos e fêmeas após castração cirúrgica e
tratamento com agonista do receptor de estrógeno (tamoxifen).
Analisar a expressão da atividade das metaloproteinases, MMP-9 e MMP-2,
nos músculos esqueléticos (gastrocnêmio) de camundongos mdx machos e
fêmeas após castração cirúrgica.
35
Diferenciar os tipos de miofibras (I, IIA e IIB) presentes na fase de
regeneração muscular de camundongos mdx machos e fêmeas após
castração cirúrgica.
Analisar nos animais submetidos à castração cirúrgica e tratados com
tamoxifen o fenótipo: das células com marcadores de células-tronco
hematopoiéticas (SCA-1), macrófagos (Mac-1+, F4/80) presentes nos focos
de inflamação; das células regenerando com marcadores de molécula de
adesão NCAM; e dos adipócitos.
Relacionar as diferenças da miopatia entre os gêneros e o possível efeito
benéfico dos agonistas de estrogênio na modulação do microambiente da
lesão muscular do camundongo mdx.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Camundongos distróficos mdx e controle não-distróficos C57BL10/J
(C57) foram mantidos no Biotério de Patologia Celular do Instituto de Biologia
da Universidade Federal Fluminense (UFF) em gaiolas plásticas forradas com
maravalha de pinus autoclavada, em ambiente com temperatura (20
o
C) e ciclo
de luz (12h/12h) controlados, recebendo suplemento vitamínico vitagold
semanalmente, ração (Nuvital, Paraná, Brasil) e água filtrada ad libitum.
3.2 Castração cirúrgica
Camundongos mdx e C57 machos e fêmeas selecionados com idade de
28 dias foram anestesiados com ketamina (50mg/kg) e xilasina (20mg/kg). As
fêmeas
37
foram submetidas à ovariectomia (OVX) através de duas pequenas incisões
para-espinhais na região dorsal entre a crista ilíaca e as costelas mais
inferiores; e já os machos foram submetidos à orquiectomia (OOX) através de
incisão mediana do saco escrotal. O grupo SHAM recebeu apenas a incisão
cirúrgica sem a retirada das gônadas. Camundongos machos e fêmeas, não
operados, pareados também na mesma idade, foram usados como controle.
Os animais foram sacrificados por inalação de éter e, 4 semanas após cirurgia,
na idade correspondente à fase de regeneração muscular (8 semanas), foram
estudados . Após assepsia com solução de álcool iodado, os músculos
gastrocnêmio e solear foram cuidadosamente dissecados e retirados.
3.3 Análise histológica
Os músculos gastrocnêmio e solear foram fixados em formol Millonig
tamponado (pH 7,2) durante 48h na temperatura ambiente. Após lavagem em
água corrente durante 4 h os tecidos foram desidratados em soluções
crescentes de álcool etílico (70%, 95%, 100%) durante 60 minutos em cada
etapa e passados 3 vezes em álcool absoluto. Posteriormente, foram
submetidos a 3 passagens em xilol para a completa retirada do álcool e da
gordura do material. A impregnação e a inclusão com parafina foram
realizadas em duas incubações a 60
o
C por 1 hora. Todo o processamento foi
feito automaticamente por meio de um processador de tecidos (LuPe PT -5,
Brasil). Os blocos foram cortados semi-serialmente em micrótomo Spencer 820
(American Optical, USA) na espessura de 5 m e colocados em lâminas
desengorduradas, previamente filmadas, com solução glicerol-albumina. Em
seguida, os cortes foram desparafinizados em três lavagens de 3 minutos com
38
xilol e hidratados em concentrações decrescentes de etanol (100% I e II, 95% e
70%) durante 3 minutos para cada etapa e submersos em água destilada por
também 3 minutos.
A digitalização dos fragmentos de músculo corados foi obtida por meio
de uma câmera digital Sound Vision (USA) acoplada ao microscópio Axioplan
(Zeiss, Oberkolchen, Germany), sendo analisada a totalidade de cortes
transversais com objetiva 20x. A mionecrose foi identificada pela presença de
fibras degenerando-se e necróticas, com sarcoplasma eosinofílico pálido e
infiltrado inflamatório, enquanto fibras regenerando-se foram identificadas pelo
citoplasma fortemente basofílico e nucleação central. A superfície total e área
ocupada pela mionecrose e fibras regenerando-se foram determinadas com o
Programa de análise de Imagens Scion (National Institute of Health Image
Program, USA). A diferença entre as duas medidas foi expressa como
percentual de área patológica do tecido.
3.4 Reação histoquímica da miosina-ATPase
Cortes congelados de 10 m de espessura de músculo esquelético
(solear, gastrocnêmio) foram processados para coloração da Miosina-ATPase
em pH 9,4 (Hayashi e Freiman, 1966). Os cortes foram incubados em uma
solução de ATP e cloreto de cálcio pH 9,4 por 30 minutos em temperatura
ambiente, deixados no cloreto de cálcio a 1% por 5 minutos e, posteriormente,
no cloreto de cobalto a 5% por 5 minutos. A seguir, os cortes foram lavados em
4 passagens rápidas na água destilada e deixados de 15 a 30 segundos no
sulfeto de amônia a 0,1%; em seguida, os cortes foram desidratados em álcool
absoluto, passados em xilol e montados em bálsamo. Os tipos de miofibras
39
foram classificados segundo o padrão de coloração: cor branca para as fibras
do tipo I, parda para as fibras do tipo IIA e cor escura para fibras do tipo IIB
(Round, Matthews et al., 1980).
3.5 Reação histoquímica: tecido adiposo
Cortes congelados de 10 m de espessura do músculo esquelético-
gastrocnêmio- foram processados para coloração do tecido adiposo segundo o
método Oil Red O (ORO) (Casselman, 1954). Os cortes foram bem lavados em
água destilada, depois rapidamente passados em fosfato triatil (60%). Em
seguida, foram incubados com oil red por 15 minutos. Novamente foram
passados em fosfato tritehyl, em seguida, bem lavados com água destilada. Os
núcleos foram contracorados com hematoxilina de Mayer por 2 minutos. Os
cortes foram desidratados em álcool absoluto, passados em xilol e montados
em bálsamo.
3.6 Imunohistoquímica
Os músculos, gastrocnêmio e solear, de camundongos mdx controle,
SHAM e castrados foram cuidadosamente removidos e congelados em
nitrogênio líquido. Cortes de 8 m de espessura foram colocados em lâminas
desengorduradas e previamente filmadas com poli-L-lisina (Sigma Chemical,
Mo, USA) e mergulhados em PBS por 5 minutos para hidratação. A inibição da
peroxidase endógena foi feita com água oxigenada a 3% por 30 min. As
lâminas foram hidratadas com PBS durante 5 minutos e logo após houve a fase
40
de bloqueio de ligações inespecíficas com PBS/BSA a 2% por 30 minutos a 37
o
C. A seguir, os cortes foram incubados com anticorpo primário diluído em PBS
(1 h, 37
o
C) (Ver Tabela 1). Após três lavagens de 5 minutos com PBS, os
cortes foram incubados com anticorpo secundário apropriado (30 min/ 23
o
C)
em câmara úmida (ver tabela II). Após novas lavagens com PBS/BSA a 0,1%,
a atividade da peroxidase foi revelada com aminoametilcarbazol (AEC, Sigma)
na presença de água oxigenada a 3%. Todos os cortes foram contracorados
suavemente com hematoxilina de Mayer e montados em gelatina, glicerina e
fenol.
41
Tabela 2 - Relação de anticorpos monoclonais utilizados na
imunohistoquímica.
Especificidade
Origem
Formato
Fonte
Diluição
NCAM
rato
purificado
BD -PharMingen
1/200
SCA1
rato
purificado
BD -PharMigen
1/200
F4/80
rato
purificado
Serotec
1/40
Mac 1
rato
biotinilado
BD-PharMingen
1/30
Tabela 3- Relação de conjugados utilizados na imunohistoquímica
Conjugado
Marca
Diluição
Anti-IgG de rato/peroxidase
Sigma
1/400
Anti-IgG de coelho
Zymed
1/400
Estreptoavidina/peroxidase
Sigma
1/200
Foram obtidas imagens digitalizadas da área total do corte transversal
com objetiva 20x. As imagens foram quantificadas no programa Scion.
42
3.7 Zimografia
Os músculos foram dissecados, pesados, imediatamente congelados em
nitrogênio líquido e homogeneizados em tampão de extração 100 mM Tris–
HCl, pH 7.6, 200 mM NaCl, 100 mM CaCl2 e a 1% Triton X-100 a 4°C. Após a
centrifugação a 15000xg, foram preparadas alíquotas de 100μL e procedeu-se
à dosagem de proteína pelo método de Lowry (Lowry, Rosebrough et al.,
1951). As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente
descrito (Heussen e Dowdle, 1980) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a
7,5%, contendo gelatina (Merck do Brasil) na concentração de 2 mg/mL e géis
de entrada poliacrilamida a 5% (w/v). A eletroforese foi realizada com a
concentração de 60 g de proteína para cada uma das amostras aplicadas nos
géis a 165 Volts por um tempo médio de 60 minutos (Power Pac 200 – Bio-
Rad, EUA). Após a eletroforese, os géis foram lavados duas vezes a 2.5%
Triton X-100 para total remoção do SDS, em seguida procedeu-se à incubação
a 37
◦
C em tampão contendo 10 mM Tris–HCl buffer, pH 7.5, 5 mM CaCl2,
ZnCl
2
1μM. SDS é o agente responsável pela ativação das metaloproteinases
mesmo na forma inativa sem clivagem proteolítica (Talhouk, Chin et al., 1991).
Os géis foram corados pelo Coomassie blue R250 (Sigma Chem. Co, USA) e
descorados em solução descorante contendo 50% de metanol, 10% de ácido
acético e 40% de H
2
O.
A atividade da gelatinase foi visualizada por bandas não marcadas em
um fundo azul representando áreas de proteólise no substrato de proteína. As
metaloproteases são secretadas na forma latente e necessitam da clivagem do
terminal peptídico NH2 para ativação. A análise semiquantitativa foi feita
43
usando o programa de análise de imagem (Scion Program National Institutes of
Health, Image Program, EUA).
3.8 Preparação da resina Elvax com tamoxifen
O ELVAX é uma resina industrial composta de acetato de etileno
vinil (também conhecido como EVA), bastante usado em neurociências para
estudos de liberação local de drogas e macromoléculas em geral, como os
antagonistas de receptores glutamatérgicos ou inibidores de cinases (Cline e
Constantine-Paton, 1990; Jablonska, Gierdalski et al., 1999; Colonnese, Shi et
al., 2003). Este trabalho utilizou o protocolo já estabelecido para liberação de
macromoléculas via ELVAX (Smith, Cordery et al., 1995).
Esferas de ELVAX 40W (DuPont, USA) foram lavadas com trocas diárias
de álcool etílico a 95% durante 5 a 7 dias sob agitação constante. Ao final
deste período, os glóbulos foram secos e posteriormente submetidos à
dissolução em diclorometano (100mg/ml) sob agitação durante 5 a 10 minutos.
Após a dissolução completa, foi adicionado a droga tamoxifen (10 l/ml) ao
volume final da solução de ELVAX diluído em diclorometano e homogeneizado
em um agitador de tubos durante 1 minuto. Ao final desta etapa, os tubos
contendo a preparação foram rapidamente imersos em uma mistura de gelo
seco/acetona (com temperatura em cerca de -80ºC) por 30 minutos para que
houvesse a repolimerização do ELVAX. O conteúdo dos tubos, já
repolimerizado, foi removido e transferido para um congelador a -4ºC e mantido
por pelo menos 5 dias. Após este período, as amostras foram liofilizadas a
vácuo por 12 horas. Durante este procedimento o tubo ficou imerso em um
44
uma mistura de gelo e álcool etílico a 95% com temperatura em torno de 4ºC.
A amostra de ELVAX livre de diclorometano, com forma cilíndrica e com
diâmetro relativamente constante, foi armazenada em freezer a -20ºC. Os
cilindros de ELVAX foram incluídos em meio de inclusão (OCT) e cortados em
criostato com espessura 120 m. Os cortes de ELVAX permaneceram a -20ºC
desde o momento da criomicrotomia até o momento exato do implante nos
animais.
3.9 Implante de elvax no músculo esquelético
Camundongos mdx, machos e fêmeas, selecionados com idade de 4
semanas, foram anestesiados intraperitonealmente com injeção de ketamina e
xilasina (70 e 20 mg/kg body weight). Numa pequena incisão cirúrgica
longitudinal feita através da pele e da fáscia na parte posterior da pata traseira,
na altura do músculo gastrocnêmio direito, foi cuidadosamente colocada a
esfera de ELVAX (120μm de diâmetro) contendo tamoxifen (1mM). O grupo
controle recebeu somente o implante de ELVAX com PBS.Todos os grupos de
animais receberam igual alimentação para evitar interferência nos resultados.
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, 8 semanas após
cirurgia, na idade correspondendo a mudanças no microambiente associadas
com regeneração muscular. Após assepsia local com solução de álcool iodado,
os músculos gastrocnêmios foram cuidadosamente dissecados e retirados. O
implante de ELVAX com tamoxifen e com PBS foi colocado no gastrocnêmio
direito (TXGd). O músculo gastrocnêmio esquerdo (TXGe) sem implante
45
(ELVAX), foi também retirado para verificar um possível efeito sistêmico do
tamoxifen neste músculo esquelético.
4. RESULTADOS
4.1 Efeito da castração no músculo esquelético do mdx
Foram estudados os músculos gastrocnêmio e solear dos três grupos de
machos e fêmeas na idade de 8 semanas:
Grupo 1 mdx controle
Grupo 2 mdx SHAM operado, não-castrado
Grupo 3 mdx castrado (macho: orquiectomizado -OOX ou fêmea:
ovariectomizado -OVX).
Foram estudados dois tipos de músculos: o músculo gastrocnêmio, o
mais acometido na distrofia muscular de Duchenne, e o solear. Conforme
publicamos anteriormente (Salimena, Lagrota-Candido et al., 2004), o músculo
gastrocnêmio das fêmeas mdx do grupo controle (não operadas) apresentou
foco inflamatório mais discreto, menor área de mionecrose e maior
regeneração do que os machos mdx pareados (Figura 1D e 1A). Neste trabalho
verificamos que este perfil também é repetido no músculo solear (Figura 2D e
2A).
47
O músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos castrados
(Figura 1C) apresentou maiores infiltrado inflamatório e mionecrose, e menor
área de miofibras com regeneração do que os camundongos mdx machos
controle (Figura 1A). O mesmo foi observado nas fêmeas (Figura 1D, 1E, 1F),
já que as fêmeas castradas (OVX) apresentaram mais mionecrose e focos com
inflamação do que o grupo controle e também em relação ao grupo SHAM
(operado, mas não castrado) (Figura 1F e 1D/1E). Entretanto, os grupos de
camundongo mdx fêmeas controle e castradas apresentaram áreas
regenerando-se maiores que o grupo mdx fêmea SHAM (Figura 1D/1F e 1E).
Este padrão também foi observado de modo semelhante no músculo solear
(Figura 2).
48
Figura 1- Efeito da castração na histologia do músculo gastrocnêmio do mdx.
Coloração de picrosírios nos cortes histológicos do músculo gastrocnêmio de
machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F). Controle não castrado (A, D),
SHAM=operado e não castrado (B, E) e castrado (C, F). Barra = 100 m.
Estrela = infiltrado inflamatório, seta = miofibra em regeneração.
49
Figura 2 - Efeito da castração na histologia do músculo solear do mdx.
Coloração de picrosirius nos cortes histológicos do músculo solear de machos
(A, B, C) e fêmeas (D, E, F). Controle não castrado (A, D), SHAM = operado e
não castrado (B, E) e castrado (C, F). Barra = 100 m. Estrela = infiltrado
inflamatório, seta = miofibra em regeneração.
50
A análise histomorfométrica mostrou que camundongos mdx machos
controle e SHAM apresentavam um aumento significativo (p< 0.001) das áreas
com mionecrose em relação às fêmeas pareadas, tanto no músculo
gastrocnêmio como no solear (Figura 3). Entre os camundongos mdx machos,
os castrados e SHAM apresentaram aumento significativo (p<0.001) das áreas
com mionecrose no músculo gastrocnêmio com relação ao grupo controle.
Padrão semelhante, porém com alterações mais discretas, também foi
observado no músculo solear (Figura 3).
As fêmeas mdx castradas (OVX) apresentaram tanto no músculo
gastrocnêmio como no solear maior área com mionecrose (p<0.001) do que as
fêmeas mdx controle e SHAM, sendo a área de mionecrose no gastrocnêmio
superior à de todos os grupos de mdx machos (Figura 3).
As áreas de regeneração nos músculos gastrocnêmios eram maiores em
todos os grupos de fêmeas comparados com os grupos de machos pareados
(Figura 4). A análise estatística também mostrou que as áreas de regeneração
eram significativamente (p<0.01) mais extensas nos camundongos mdx
machos e fêmeas controle comparados com os outros grupos estudados,
SHAM e castrados (Figura 4).
51
Figura 3- Morfometria do músculo gastrocnêmio e solear das áreas com
mionecrose do mdx.
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Cada barra
representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Azul =controle,
vinho=SHAM operado, sem castração e amarelo=castrado. * p<0,01. Eixo y =
percentual da área total ocupada pela mionecrose.
0
20
40
60
80
%
Machos - gastrocnêmio
0
20
40
60
80
%
Machos -solear
0
20
40
60
80
%
Fêmeas - gastrocnêmio
0
20
40
60
80
%
Fêmeas - solear
*
*
*
*
*
*
52
Figura 4- Morfometria das áreas com miofibras em regeneração do músculo
gastrocnêmio e solear do mdx.
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Cada barra
representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Azul = controle, vinho =
SHAM operado, sem castração e amarelo = castrado. Eixo y = percentual da
área total ocupada pelas fibras em regeneração.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
53
4.2 Distribuição das miofibras segundo atividade ATPase
Foram estudados dois tipos de músculo: o gastrocnêmio, de contração
rápida, composto essencialmente de fibras brancas/glicolíticas, especializado
em velocidade e força; e o solear, de contração lenta, composto por fibras
vermelhas/ oxidativas e com maior resistência à fadiga. Pelo padrão da
atividade da miosina-ATPase em pH 9.6, as miofibras do Tipo I apresentam
coloração branca (baixa atividade da miosina-ATPase), as do Tipo IIB
apresenta coloração escura (alta atividade da miosina-ATPase) e as do Tipo
IIA, uma coloração intermediária correspondendo a uma atividade intermediária
da miosina-ATPase. Para este estudo foram realizados cortes histológicos
transversais de 10 m de espessura dos músculos esqueléticos, gastrocnêmio
e solear, de pelo menos 3 animais e analisados cinco campos de fotografias
com objetiva de 20x.
O músculo gastrocnêmio dos camundongos C57BL10 não-distróficos
(Mccormick, Burns et al., 2004) apresentou predominância de fibras do tipo IIB
(55% - 60%), um percentual menor de fibras do tipo IIA (35% - 32%) e poucas
fibras do tipo I (5% - 8%); enquanto o solear tinha percentual maior de
miofibras do tipo I (80% - 85%), menos IIA (19% - 14%) e poucas do tipo IIB
(1%). Contudo, compararando-se os dados da literatura do percentual do grupo
dos camundongos C57 com os grupos distróficos percebeu-se uma diminuição
significativa das miofibras do tipo IIB e um aumento das miofibras do tipo IIA
em ambos os sexos dos camundongos distróficos. As fêmeas mdx
54
apresentaram um número maior das miofibras IIA e IIB em comparação com os
grupos dos camundongos mdx machos (Figura 5 D, E, F x 5 A, B, C).
No músculo distrófico gastrocnêmio dos grupos mdx machos e fêmeas
controle, SHAM e castrados foi observada (Figuras 5 e 9) pouca perda das
miofibras do tipo I, sem significativa diferença entre os grupos mdx machos.
Entretanto, nos grupos mdx fêmeas, houve diferenças significativas (p<0,05)
entre os grupos mdx controle e OVX e os grupos SHAM e OVX. Em relação às
fibras do tipo IIA e IIB, nos camundongos mdx machos controle (Figura 5A) foi
observado um aumento significativo (p<0.01) em relação aos grupos SHAM e
OOX. (Figura 5B, C). Resultado semelhante também foi observado nas fêmeas
(Figura 5D, E, F).
No músculo solear, nos camundongos distróficos machos e fêmeas
predominavam as fibras do tipo I, como nos camundongos não-distróficos
(C57-dados da literatura). Entretanto, os camundongos mdx, machos e fêmeas,
apresentaram uma pequena perda das miofibras do tipo I e um aumento das
miofibras IIA em relação aos camundongos não distróficos (C57). Os grupos de
camundongos mdx machos (Figura 6A, B, C) apresentaram uma diminuição
significativa (p<0.05) do número de miofibras do tipo I e um aumento do
número de miofibras IIA quando comparados com as fêmeas mdx pareadas
(Figura 6D, E, F). Entre os grupos dos machos distróficos, os camundongos
SHAM e castrados (Figura 6B, C) tiveram sempre um menor número de
miofibras dos tipos I e IIA em relação ao grupo mdx machos controle (Figura
6A). As fêmeas distróficas também apresentaram esta mesma diferença.
55
Figura 5 - Atividade da Miosina-ATPase no músculo gastrocnêmio do mdx.
Fragmentos (10μm) do músculo esquelético gastrocnêmio de mdx machos (A,
B, C) e fêmeas (D, E, F). Foram utilizados pelo menos 3 animais por grupo.
Controle (A, D); SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra = 100 m. Estrela
= fibra de IIA, seta = fibra tipo IIB
56
Figura 6 - Atividade da Miosina-ATPase no músculo solear do mdx após a
castração.
Fragmentos (10μm) do músculo esquelético de mdx machos (A, B, C) e fêmeas
(D, E, F). Foram utilizados pelo menos 3 animais por grupo. Controle (A, D);
SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra-100μm. Estrela = fibra de IIA, seta
= fibra tipo IIB, seta grossa = fibra IA
57
A análise histomorfométrica do músculo gastrocnêmio mostrou (Figura
7) que nos camundongos machos mdx o percentual de miofibras do tipo I foi
muito baixo em relação ao C57: controle (3%) e nos grupos SHAM e OOX
(2%). Contudo, predominaram as miofibras tipo IIA no controle (55,67%),
SHAM (42,67%) e OOX (36,42%). O percentual das miofibras IIB não era muito
alto: controle (35,18%), SHAM (30,91%) e OOX (25,21%). Nas fêmeas mdx
pareadas, a marcação das miofibras do tipo I também era baixa nos grupos
controle (8%), SHAM (7,7%) e OVX (5%) enquanto predominavam miofibras do
tipo IIA nos grupos controle (63,5%), SHAM (49,83%) e OVX (46,32%). O
percentual das miofibras IIB também diminuiu: controle (43,3%), SHAM (35,2%)
e OVX (30%). Todos estes dados foram comparados com o músculo
gastrocnêmio dos camundongos C57BL10 não distróficos - fibras do tipo IIB
(60- 65%), um percentual menor de fibras do tipo IIA (32-35%) e poucas fibras
do tipo I (5-8%).
Também foram observadas diferenças significativas entre controle, SHAM
e castrados no percentual de miofibras do tipo I e IIA no músculo solear dos
camundongos mdx machos e fêmeas. Análise histomorfométrica do músculo
solear mostrou (Figura 8) que nos camundongos machos mdx o percentual de
miofibras do tipo I era muito mais alto no controle (70%) do que nos grupos
SHAM e OOX (65% e 61%), mas quando comparado com o grupo C57(dados
da literatura: miofibras do tipo I – 80-85%) tinha ocorrido uma pequena perda
destas miofibras (5 a 10%). Contudo, aumentaram em média 50% as miofibras
do tipo IIA nos mdx machos controle (35,6%), SHAM (32,67%) e OOX (30,2%)
em relação aos grupos de camundongos machos C57 (IIA -15% a 19%). E o
percentual das miofibras IIB era muito baixo: controle (0,8%), SHAM (0,9%) e
58
OOX (0,5%). Nas fêmeas mdx pareadas, a marcação das miofibras do tipo IIB
também era baixa, controle (1%), SHAM (0,7%) e OVX (1,5%), enquanto
predominavam miofibras do tipo I: controle (78%), SHAM (75,7%) e OVX
(75,8%). O percentual das miofibras IIA dos camundongos mdx fêmeas:
controle (33,8%), SHAM (29,3%) e OVX (26,2%), também aumentou em média
de 50%, comparados aos camundongos C57 (miofibras IIA -14% a 19%)
(Figura 8).
59
Figura 7 - Morfometria da atividade Miosina-ATPase do músculo gastrocnêmio
após a castração em camundongos mdx machos e fêmeas.
As barras representam a média e o desvio padrão (n=3). Azul = controle, vinho
= SHAM, operado e amarelo = castrado.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
2
4
6
8
10
%
Tipo I - Fêmeas
0
2
4
6
8
10
%
Tipo I - Machos
0
20
40
60
80
100
%
Tipo IIA - Machos
0
20
40
60
80
100
%
Tipo IIA - Fêmeas
0
20
40
60
80
100
%
Tipo IIB - Machos
0
20
40
60
80
100
%
Tipo IIB - Fêmeas
60
Figura 8 - Morfometria da atividade Miosina-ATPase do músculo solear de
camundongos mdx machos e fêmeas.
As barras representam a média e o desvio padrão (n=3). Azul = controle, vinho
= SHAM, operado e amarelo = castrado.
0
20
40
60
80
100
%
Tipo I - Fêmeas
0
20
40
60
80
100
%
Tipo IIA - Machos
0
20
40
60
80
100
%
Tipo IIA - Fêmeas
0
1
2
3
4
5
%
TipoIIB - Machos
0
1
2
3
4
5
%
Tipo IIB - Fêmeas
*
*
*
*
*
*
*
61
4.3 Influência da castração no número de mioblastos ativados
(NCAM) e de células-tronco (Sca-1) presentes nos músculos
esqueléticos (gastrocnêmio e solear) do mdx.
A regeneração muscular, evidenciada pelo número de células NCAM,
foi mais significativa no músculo gastrocnêmio em relação ao solear do
camundongo mdx (Figuras 9 e 10). As fêmeas mdx controle apresentaram
maior expressão de NCAM no músculo gastrocnêmio do que os machos mdx
controle (Figura 9D, A). Entretanto, o grupo de camundongos distróficos
operados, mas não castrados (SHAM), mostrou que o estresse da cirurgia
induziu a uma menor expressão de miofibras NCAM em ambos os gêneros
(Figura 9E, B). Estes achados foram confirmados pela morfometria (Figura 11).
Contudo, a castração causou uma redução acentuada da expressão de NCAM
no músculo gastrocnêmio para NCAM nos machos (Figura 9C) e, nas fêmeas,
um intenso aumento (Figura 9F) em relação ao macho pareado castrado
(Figura 9C), porém a expressão de NCAM era semelhante com as fêmeas mdx
controle (Figura 9D).Um padrão similar também foi observado no músculo
solear (Figura 10).
62
Figura 9 - Expressão de NCAM no músculo gastrocnêmio do mdx.
Imunomarcação com anticorpo específico para NCAM em fragmentos
(10μm) do músculo gastrocnêmio de mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F).
Controle (A, D); SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra = 100 m.
63
Figura 10 - Expressão de Sca-1 no músculo solear do camundongo mdx.
Imunomarcação com anticorpo específico para Sca-1 em fragmentos (10μm)
do músculo solear de camundongos mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F).
Controle (A, D); SHAM operado (B, E); castrado (C, F). Barra = 100 m.
A
B
B
64
As análises morfométricas dos músculos gastrocnêmio e solear
mostraram que as fêmeas distróficas controle apresentaram uma
imunomarcação maior do que os machos pareados (fêmea = gastrocnêmio -
300 e solear -89, macho = gastrocnêmio - 238 e solear - 60). Comparando os
grupos controle com os grupos SHAM, nos músculos gastrocnêmio e solear,
nós observamos uma redução (valor de p<0,05) após o estresse da cirurgia
(grupo SHAM) em ambos os gêneros (Figura 11). Contudo, comparando os
grupos controle com os castrados, em ambos os músculos de contração rápida
e lenta, as fêmeas mdx submetidas à castração tiveram números semelhantes
aos do grupo controle (controle= gastrocnêmio - 300 e solear - 89, OVX=
gastrocnêmio - 325 e solear - 95), entretanto ocorreu uma diminuição
significativa (p<0.05) nos machos castrados (OOX = gastrocnêmio - 59 e solear
- 33) comparativamente ao controle (gastrocnêmio - 238 e solear - 60) (Figura
11).
65
Figura 11- Histomorfometria da expressão de NCAM no músculo do mdx após
castração cirúrgica.
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculo esquelético imunomarcados
com anticorpo NCAM de mdx macho e fêmea submetidos ou não à castração.
(n=3). Azul = controle, vinho = SHAM operado, sem castração e amarelo =
castrado. Eixo y = número de miofibras positivas para NCAM.
0
100
200
300
400
Fêmeas - gastrocnêmio
0
100
200
300
400
Machos - gastrocnêmio
0
25
50
75
100
Machos - solear
0
25
50
75
100
Fêmeas - solear
*
*
*
*
*
*
*
66
Independentemente do gênero, a expressão de Sca-1 foi maior no
músculo gastrocnêmio (Figura 12) do que no solear (Figura13). Os grupos de
fêmeas mdx: controle, SHAM e OVX apresentaram mais células Sca-1
positivas no gastrocnêmio do que machos pareados (Figura 12). O estresse da
cirurgia (grupo SHAM) nos músculos gastrocnêmio e solear causou uma
redução na imunomarcação em ambos os gêneros: machos (Figura 14B, 15B)
e fêmeas (Figuras 12E, 13E). Contudo, a castração cirúrgica nas fêmeas
causou um aumento de células Sca-1 positivas no gastrocnêmio e no solear
(Figuras 12F,13F), dado este confirmado pela morfometria (Figura 16). O
oposto ocorreu nos machos mdx castrados, observando-se uma diminuição na
quantidade de células Sca-1 positivas no gastrocnêmio (44%, p <0.05) e solear
(39%, p<0,05) - Figuras 12C, 13C e Figura 14.
67
Figura 12 - Expressão de Sca-1 no músculo gastrocnêmio do mdx.
Fragmentos (10μm) do músculo gastrocnêmio de mdx machos (A, B, C) e
fêmeas (D, E, F) corados com anticorpo anti Sca-1. Animais controles (A, D),
SHAM operados (B, E) e castrados (C, F). Anticorpo monoclonal anti-Sca-1.
Controle, SHAM e castrado. Aumento 200x.
68
Figura 13 - Expressão de Sca-1 no músculo solear do mdx.
Fragmentos (10μm) do músculo solear de mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D,
E, F) corados com anticorpo anti Sca-1. Animais controle (A, D), SHAM
operados (B, E) e castrados (C, F). Anticorpo monoclonal anti-NCAM. Controle,
SHAM e castrado. Aumento 200x.
69
Figura 14 - Morfometria da expressão de Sca-1 no músculo do mdx após
castração cirúrgica.
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculos esqueléticos (gastrocnêmio
e solear) imunomarcados com anticorpo Sca-1 de mdx macho e fêmea
submetidos ou não à castração. (n=3) Azul = controle, vinho = SHAM operado
e amarelo = castrado. Y = percentual da área total ocupada pela
imunomarcação positiva. * p<0,05.
0
20
40
60
80
100
%
Machos - solear
0
20
40
60
80
100
%
Fêmeas - gastrocnêmio
0
20
40
60
80
100
%
Machos - gastrocnêmio
0
20
40
60
80
100
%
Fêmeas - solear
*
*
*
*
*
*
*
*
70
4.4 Efeitos da castração cirúrgica na atividade das
metaloproteases 2 e 9 no músculo esquelético
A atividade da MMP- 9 no músculo gastrocnêmio de camundongos machos
e fêmeas adultos não-distróficos (C57BL10) não foi detectada, entretanto foram
encontrados constitutivamente baixos níveis de MMP-2 (Figura 15A)
compatíveis com a secreção constitutiva no músculo esquelético (Kherif,
Lafuma et al., 1999). Todos os grupos de camundongos distróficos, machos e
fêmeas, apresentaram a atividade da MMP-9, sendo porém mais elevada nos
machos do que nas fêmeas (p<0.001). A castração cirúrgica causou um
aumento significativo (p< 0.001) da atividade da MMP-9 independentemente do
gênero (4,6 vezes nos machos-OOX e 11 vezes nas fêmeas-OVX)
comparativamente ao grupo controle distrófico. As fêmeas mdx (grupo controle)
apresentaram maior percentual (25%) de lise protéica induzida pela MMP-2
ativa do que os machos pareados (13%). A castração cirúrgica também induziu
a um aumento da atividade da MMP-2 tanto em machos (2 vezes, p<0.01)
como nas fêmeas (1,8 vezes, p<0.05), se comparados com o grupo controle
distrófico. O estresse da operação, evidenciado no grupo SHAM operado,
causou, na atividade da MMP-9, um aumento nas fêmeas e uma diminuição
nos machos quando comparados com o grupo controle distrófico, entretanto, as
fêmeas SHAM operadas apresentaram uma diminuição da atividade da MMP-2
(2 vezes, p<0.01) e os machos SHAM uma maior atividade da MMP-2 (1,5
p<0.05) comparativamente ao grupo controle distrófico.
71
Figura 15 - Atividades das MMP-9 e MMP-2 ativas no músculo gastrocnêmio
após a castração cirúrgica.
A- Zimograma ilustrativo: Zimografia de músculo esquelético gsastrocnêmio
após a castração.Cm = controle C57 macho, mdxm = mdx macho, OVX =
Fêmea castrada, SHAMf = fêmea SHAM operada, SHAMm = macho SHAM
operado, OOX = macho castrado. As áreas claras são de lise no fundo
corado com Coomassie R-250.
B- Análise semi-quantitativa das atividades da MMP-9 e MMP-2 no músculo
gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Azul =controle,
vinho=SHAM operado e amarelo=castrado. Os resultados foram expressos
como média ( SD). UA = unidade arbitrária.
Cm mdxm OVX OVX SHAMf SHAMm SHAMm SHAMm OOX OOX
A
B
MMP-9
MMP-9
←MMP-9
←MMP-2 ativa
72
4.5 Efeito do tratamento com tamoxifen no músculo
gastrocnêmio do mdx
Os músculos gastrocnêmios do grupo controle mdx machos apresentaram
menor área de miofibras em regeneração, comparativamente com os grupos
tratados com o tamoxifen (Figura 16A, B, C). O mesmo ocorreu com o grupo
mdx das fêmeas, destacando a maior regeneração nos grupos tratados com
tamoxifen (Figura 16D, E, F). Os grupos de camundongos distróficos, machos e
fêmeas, que receberam tamoxifen local no gastrocnêmio direito apresentaram
mais células musculares basofílicas (Figura 16B, E) do que os grupos mdx,
machos e fêmeas, controle (Figura 16A e D) e tamoxifen não via local
(gastrocnêmio esquerdo - Figura 16C e F).
73
Figura 16 - Efeito do tratamento com tamoxifen na histologia do músculo
gastrocnêmio de mdx machos e fêmeas.
Músculo gastrocnêmio machos (A, B, C) e fêmeas (D, E, F). Controle mdx (A,
D), músculo direito implantado com ELVAX contendo tamoxifen (B, E) e
músculo esquerdo (contralateral) não implantado diretamente com tamoxifen
(C, F). Barra = 100 m. Seta = fibra em regeneração, estrela = infiltrado
inflamatório.
74
Análise histomorfométrica mostrou (Figura 17) que, nos camundongos
machos mdx, o percentual de miofibras em regeneração era menor no grupo
que não recebeu tratamento com tamoxifen (Controle: 180%) e maior nos
grupos com tamoxifen (gastrocnêmio direito: 418% e gastrocnêmio esquerdo:
221%). De modo semelhante, nas fêmeas mdx pareadas, a marcação das
miofibras em regeneração também era baixa no grupo controle (331%), porém
maior nos grupos que receberam tamoxifen (gastrocnêmio direito: 458% e
gastrocnêmio esquerdo: 379%). A média das miofibras em regeneração das
fêmeas mdx dos grupos controle e grupo de tamoxifen (gastrocnêmio
esquerdo) foram 2x maiores que dos grupos de machos mdx pareados (Figura
17A). O percentual da área de miofibras em regeneração dos machos mdx do
grupo tratado com tamoxifen local (gastrocnêmio direito: 418%) foi semelhante
ao do grupo de fêmeas mdx tratadas com tamoxifen local (gastrocnêmio direito:
458%).
Todos os grupos de camundongos fêmeas mdx tiveram maior número
de miofibras íntegras do que mdx machos pareados (Figura 17B). A quantidade
de miofibras íntegras foi maior no gastrocnêmio direito com implante de
tamoxifen nos mdx- machos (254) e fêmeas (326) do que no músculo
contralateral correspondente. Nas fêmeas mdx controle, o número de miofibras
íntegras do gastrocnêmio era menor (106) do que nos grupos tratados com
tamoxifen (gastrocnêmio direito: 326 e gastrocnêmio esquerdo: 261). O mesmo
ocorreu com o grupo dos machos: controle (sem implante): 78; gastrocnêmio
com implante (direito): 254; e gastrocnêmio contralateral (esquerdo): 179.
75
Figura 17 - Morfometria do músculo gastrocnêmio de camundongos mdx
machos e fêmeas após tratamento com tamoxifen
Análise histológica do músculo gastrocnêmio corado por Giemsa. Em A,
representação gráfica do percentual da área ocupada por miofibras se
regenerando basofílicas e com nucleação central. Em B, o número de miofibras
íntegras por corte histológico. Cada barra representa a média de 3 animais e
seu desvio padrão. Branco = mdx (controle), azul = gastrocnêmio direito
implantado com ELVAX sem tamoxifen (PBS) e amarelo= gastrocnêmio
esquerdo não implantado com ELVAX, vermelho = gastrocnêmio direito
implantando com ELVAX contendo tamoxifen e verde = gastrocnêmio esquerdo
não implantado diretamente com ELVAX (contralateral). *p<0.05
*
*
*
*
*
*
*
*
fêmeas
fêmeas
machos
machos
76
4.6 Análise de mioblastos ativados (NCAM) e células-tronco (Sca-
1) no músculo esquelético do camundongo mdx tratado com
tamoxifen
Todos os grupos de mdx fêmeas, controle, ELVAX sem tamoxifen (PBS)
e ELVAX com tamoxifen, tiveram maior área de regeneração do que os
machos mdx pareados (Figura 18D, E, F e 18A, B, C). Apesar de o grupo de
fêmeas mdx controle apresentar grande número de células NCAM positivas no
músculo gastrocnêmio comparado com os machos mdx controle (Figura 18D,
A), os mdx, machos e fêmeas, tratados com tamoxifen apresentaram maior
imunomarcação para NCAM em ambos os músculos gastrocnêmios, direito e
esquerdo (Figura 18E, F, B, C) relativamente a todos os outros grupos
estudados. Estes achados foram confirmados pela morfometria (Figura 20).
Também, independentemente do gênero, a expressão de Sca-1 foi maior no
músculo gastrocnêmio que recebeu tratamento com tamoxifen local (Figura
19). Os grupos de fêmeas mdx: controle, tamoxifen no gastrocnêmio direito e
tamoxifen no gastrocnêmio esquerdo (contralateral), apresentaram de modo
consistente uma quantidade maior de células positivas para Sca-1
comparativamente aos machos pareados (Figura 19).
A análise histomorfométrica (Figura 20), confirmou o aumento significativo
(p<0.05) na expressão de NCAM e Sca-1 no grupo dos camundongos tratados
com tamoxifen, independentemente do sexo. Em ambos os sexos, a
imunomarcação para NCAM e Sca-1 foi maior no grupo que recebeu tamoxifen
no local (músculo direito).
77
Figura 18 - Imunomarcação para NCAM no músculo gastrocnêmio do mdx
após tratamento com tamoxifen
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-NCAM de fragmentos
(10μm) do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C)
e fêmeas (D, E, F) tratados com tamoxifen. Mdx machos e fêmeas: Controle (A,
D); tratamento com ELVAX com tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e
contralateral- gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.
78
Figura 19 - Presença de células Sca-1 no músculo gastrocnêmio do mdx
tratado com tamoxifen.
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-Sca-1 de fragmentos (10μm)
do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C) e
fêmeas (D, E, F) submetidos ao tratamento com tamoxifen. Controle mdx (A,
D); tratamento com ELVAX tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e
contralateral - gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.
79
Figura 20 - Morfometria de NCAM e Sca-1 no músculo do mdx após
tratamento com tamoxifen.
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculo esquelético direito e
esquerdo imunomarcados com anticorpo anti-NCAM ou Sca-1 de mdx machos
e fêmeas submetidos ou não a tratamento com tamoxifen. (n=3)
Branco = mdx controle, azul = gastrocnêmio direito implantando com ELVAX
sem tamoxifen e amarelo= gastrocnêmio esquerdo não implantado com
ELVAX, vermelho = gastrocnêmio direito implantando com ELVAX contendo
tamoxifen e verde = gastrocnêmio esquerdo (contralateral) não implantado com
ELVAX diretamente.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
80
4.7 Presença de macrófagos: Mac-1 e F4/80 no gastrocnêmio de
mdx tratados com tamoxifen.
Todos os grupos de mdx machos, com e sem tratamento com tamoxifen
tiveram maior área de marcação com os anticorpos específicos para Mac-1 e
F4/80 em relação aos grupos de fêmeas mdx pareadas (Figuras 21 e 22). Os
músculos gastrocnêmios (direito e esquerdo) do grupo controle mdx machos
apresentaram maior área com marcação para macrófagos (Mac-1 e F480),
comparados com o grupo tratado com tamoxifen (Figuras 21A e 22A X Figuras
21B, 22B e 21C, 22C). O mesmo ocorreu com o grupo das fêmeas,
destacando-se a maior marcação para macrófagos no grupo controle
comparando com os grupos tratados com tamoxifen (Figuras 23D e 24D x
Figuras 21E, 22E e 21F, 22F). Contudo, os grupos de mdx, machos e fêmeas,
que receberam tamoxifen local, no gastrocnêmio direito, foram os que menos
apresentaram marcação para macrófagos (Figuras 21B, E e 22B, 22E),
comparados com os grupos mdx: controle e gastrocnêmio contralateral
(esquerdo) (Figuras 21A, C, D, F e 22A, C, D, F).
81
Figura 21 - Presença de células Mac-1 no músculo gastrocnêmio do mdx após
tratamento com tamoxifen.
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-Mac-1 de fragmentos
(10μm) do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C)
e fêmeas (D, E, F) submetidos ao tratamento com tamoxifen. Controle mdx (A,
D); tratamento com ELVAX tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e
contralateral - gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.
82
Figura 22 - Presença de células F4/80 no músculo gastrocnêmio do mdx após
tratamento com tamoxifen.
Imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-F4/80 de fragmentos (10μm)
do músculo gastrocnêmio (direito e esquerdo) de mdx machos (A, B, C) e
fêmeas (D, E, F) submetidos ao tratamento com tamoxifen. Controle mdx (A,
D); tratamento com ELVAX tamoxifen local - gastrocnêmio direito (B, E) e
contralateral - gastrocnêmio esquerdo (C, F). Barra = 100 m.
83
A análise morfométrica mostrou (Figura 23) que, nos camundongos
machos mdx controle, o percentual de área com marcação para macrófagos
(Mac-1: 86% e F4/80: 76%) era maior (p<0.01) do que naqueles que receberam
tratamento com tamoxifen via local (gastrocnêmio direito - Mac-1: 61% e F4/80:
50%) e contralateral (gastrocnêmio esquerdo - Mac-1: 70% e F4/80: 58%). De
modo semelhante, nas fêmeas mdx pareadas, a marcação das áreas com
macrófagos era alta (p<0.05) no grupo controle (Mac-1: 50% e F4/80: 52%) e
menor nos grupos que receberam tamoxifen local (gastrocnêmio direito – Mac-
1: 26% e F4/80: 32%) e contralateral (gastrocnêmio esquerdo - Mac-1: 35% e
F4/80: 40%).
Todos os grupos de camundongos tratados com ELVAX sem tamoxifen
(com PBS), tanto machos quanto fêmeas mdx, apresentaram marcação para
macrófagos (Mac-1 e F4/80) semelhante à marcação dos músculos controle. A
quantidade da área com macrófagos foi menor no grupo de mdx machos,
tratados com tamoxifen (Mac-1 = gastrocnêmio direito: 62% e gastrocnêmio
esquerdo: 70% / F4/80 = gastrocnêmio direito: 51% e gastrocnêmio esquerdo:
59%) comparativamente aos tratados com ELVAX sem tamoxifen com PBS
(Mac-1 = gastrocnêmio direito: 82% e gastrocnêmio esquerdo: 84% / F480 =
gastrocnêmio direito: 73% e gastrocnêmio esquerdo: 75%). Ocorreu o mesmo
com os grupos de fêmeas tratadas com tamoxifen, sendo menor nestes grupos
tratados (Mac-1 = gastrocnêmio direito: 26% e gastrocnêmio esquerdo: 35% /
F480 = gastrocnêmio direito: 32% e gastrocnêmio esquerdo: 40%) comparados
com aqueles tratados com ELVAX sem tamoxifen- com PBS (Mac-1 =
gastrocnêmio direito: 44% e gastrocnêmio esquerdo: 45% / F480 =
gastrocnêmio direito: 49% e gastrocnêmio esquerdo: 50%).
84
Figura 23 - Morfometria da quantificação Mac-1 e F4/80 no músculo do mdx
após tratamento com tamoxifen.
Foram analisados fragmentos (10μm) de músculo esquelético direito e
esquerdo imunomarcados com anticorpo Mac-1 e F4/80 de mdx machos e
fêmeas submetidos ao tratamento de ELVAX com tamoxifen. (n=3) Branco =
mdx controle, azul = gastrocnêmio direito implantando com ELVAX sem
tamoxifen (PBS) e amarelo = gastrocnêmio esquerdo (contralateral), vermelho
= gastrocnêmio direito implantando com ELVAX contendo tamoxifen e verde =
gastrocnêmio esquerdo (contralateral). A marcação foi quantificada através do
percentual da área total que foi positiva para Mac-1 ou F4/80. * p < 0,05, ** p <
0,01.
*
*
**
**
*
*
**
**
85
4.8 Efeito da castração sobre o número de adipócitos presentes
no músculo gastrocnêmio do mdx
O estudo do músculo gastrocnêmio dos grupos dos camundongos
mdx machos (Figura 24) mostrou que os camundongos mdx machos controle
(Figura 24A) apresentaram igual o número de adipócitos comparados com os
camundongos mdx machos SHAM (Figura 24B) e mdx machos castrados
(Figura 24C). O mesmo ocorreu com o grupo das fêmeas mdx controle
comparado com os grupos fêmeas mdx SHAM e OVX (Figuras 24D, E, F),
estes últimos sem diferença significativa entre si. Se compararmos os grupos
de camundongos mdx fêmeas com os camundongos mdx machos, todas as
fêmeas de todos os grupos controles (não operadas), SHAM (operadas, mas
não castradas) e OVX (castradas) apresentaram maior número de adipócitos
do que os machos mdx pareados (Figuras 24D, E , F e Figuras 24A, B, C).
86
Figura 24 - Efeito da castração no número de adipócitos no corte histológico do
músculo esquelético do mdx macho e fêmea.
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D, E,
F). Controle não-castrado (A, D), SHAM=operado e não castrado (B, E) e
castrado (C, F). Barra 100 m.
87
A análise histomorfométrica mostrou que não houve diferença
significativa (p> 0.05) entre os grupos de camundongos mdx machos controle,
SHAM e OOX em relação ao número de adipócitos (controle=5, SHAM=7 e
OOX=7). Entre os grupos das fêmeas mdx (controle=16, SHAM=18 e OVX=16)
também não se observou diferença significativa (p>0.05) do número de
adipócitos (Figura 25). Contudo, a análise estatística mostrou que o número de
adipócitos presentes nos músculos das fêmeas mdx (controle, SHAM e OVX)
era maior que nos grupos dos machos mdx pareados (p<0.05).
88
Figura 25 - Morfometria do número de adipócitos presentes no músculo
esquelético do mdx após a castração.
Cada barra representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Azul,
machos e vermelho, fêmeas. Foi quantificado o número de adipócitos por toda
a área do músculo.
0
5
10
15
20
25
ContMdx
ShamMdx
OOXMdx
*
*
*
Número adipócitos
89
4.9 Efeito do tratamento com e sem tamoxifen no número de
adipócitos no músculo esquelético do mdx
O estudo do músculo gastrocnêmio dos grupos dos camundongos
mdx machos controle (Figura 26A) apresentou igual número de adipócitos
comparativamente aos camundongos mdx machos com ELVAX sem tamoxifen
(Figura 26B) e mdx machos com tratamento com tamoxifen (Figura 26C). O
mesmo ocorreu com o grupo das fêmeas mdx controle (Figura 26D),
comparado com os grupos fêmeas mdx com ELVAX sem tamoxifen e com
tamoxifen (Figura 26E, F), não havendo diferença na quantidade de adipócitos.
Se compararmos os grupos de camundongos mdx fêmeas com os
camundongos mdx machos, as fêmeas de todos os grupos controle, ELVAX
sem tamoxifen e com tamoxifen (Figuras 26D, E, F) apresentaram maior
número de adipócitos do que os machos mdx pareados (Figuras 26A, B, C).
90
Figura 26 - Efeito do tratamento com tamoxifen no número de adipócitos.
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos (A, B, C) e fêmeas (D,
E, F). Controle mdx (A, D), ELVAX sem tamoxifen- PBS (B, E) e ELVAX com
tamoxifen (C, F). Barra 100 m.
91
A análise histomorfométrica mostrou não haver diferença significativa
(p> 0.05) entre os grupos de camundongos mdx machos controle, ELVAX sem
tamoxifen-com PBS e ELVAX com tamoxifen com relação ao número de
adipócitos (controle=5, ELVAX sem tamoxifen-PBS = 4 e ELVAX com
tamoxifen = 6). Entre os grupos das fêmeas mdx (controle=16, ELVAX sem
tamoxifen-com PBS=15 e ELVAX com tamoxifen=16), também não se
observou diferença significativa (p>0.05) no número de adipócitos (Figura 27).
Contudo, a análise estatística mostrou que a presença de adipócitos nos
músculos das fêmeas mdx (controle, ELVAX sem tamoxifen-PBS e ELVAX com
tamoxifen) era maior do que os grupos dos machos mdx pareados (p<0.05).
92
Figura 27 - Morfometria do número de adipócitos presentes no músculo
esquelético do mdx após implante do ELVAX com e sem tamoxifen.
Músculo gastrocnêmio de camundongos mdx machos e fêmeas. Cada barra
representa a média de 3 animais e seu desvio padrão. Machos, azul e fêmeas,
vermelho.
0
5
10
15
20
25
N° de adipócitos
Controle Sem TX Com TX
*
*
*
5. DISCUSSÃO
O conjunto de resultados deste trabalho suporta a hipótese da ação
benéfica dos hormônios sexuais femininos endógenos e do tratmento com
tamoxifen, um modulador do receptor de estrogênio, na regeneração muscular
e na integridade das miofibras esqueléticas.
Estudos dos sistemas cardiovascular, neuromuscular e outros
mostraram que estrogênios exercem efeitos moduladores na imunidade, como
exemplo a castração cirúrgica de fêmeas (OVX), que causa imunodepressão e
ativa macrófagos para um estado pró-inflamatório (Mendelsohn e Karas, 1999;
Roof e Hall, 2000; Knoferl, Schwacha et al., 2002), porém administração de
17b-estradiol restaura parâmetros da imunidade celular de fêmeas
ovariectomizadas e machos com baixos níveis de estrogênio circulante após
trauma hemorrágico (Zellweger, Ayala et al., 1995; Kahlke, Dohm et al., 2000;
Knoferl, Diodato et al., 2000; Knoferl, Jarrar et al., 2001; Porter, Wang et al.,
2001; Pfeilschifter, Koditz et al., 2002). Parte dos efeitos protetores do
estrogênio e da regulação da resposta imunológica inata, principalmente sobre
os macrófagos, é dependente da interação de 17β-
94
estradiol com receptores de estrogênios (ER) alfa e beta (Mcdonnell, 2004;
Zhang e Trudeau, 2006). A sinalização de ER beta ativa respostas
antinflamatórias, sendo considerado um fator crítico para a sobrevivência
celular (Baker, Brautigam et al., 2004; Wang, Wang et al., 2006) e para a
manutenção da integridade da miofibra, porque fêmeas deficientes de
estrogênios apresentam altos níveis de creatinafosfoquinase (CK) após
exercícios (Amelink e Bar, 1986; Bar, Amelink et al., 1988). Neste estudo, todos
os grupos de camundongos mdx fêmeas em comparação com os machos
pareados tiveram pequenos focos de mionecrose e menor infiltrado
inflamatório, porém as fêmeas submetidas à castração cirúrgica (OVX)
apresentaram infiltrado inflamatório mais proeminente do que os machos
pareados.
Hormônio do crescimento (GH) e IGF-1 são fatores de crescimento do
músculo esquelético (Ullman e Oldfors, 1989; Johnson, Halstead et al., 1998) e
do músculo cardíaco (Guler, Zapf et al., 1988), importantes na manutenção do
alto índice de regeneração muscular observado nas fêmeas castradas. Como o
tratamento com estradiol aumenta também os níveis de IGF-1 no soro (Breier,
Gluckman et al., 1988; Enright, Quirke et al., 1990), é possível que estradiol
exógeno possa ser primariamente responsável pela indução de níveis
aumentados de IGF-1.
Nos músculos esqueléticos maduros, as células satélites estão
normalmente num estado inativo e podem ser ativadas em resposta à lesão
muscular ou doença (Bischoff e Heintz, 1994; Morgan e Partridge, 2003). As
células satélites quando ativadas proliferam e se fundem no local onde
estavam as miofibras necróticas, formando novos miotubos. Estas células são
95
definidas pela sua posição entre a lâmina basal e o sarcolema e, quando
ativadas, pela expressão de proteínas tais com MyoD, M-caderina; c-Met,
Pax7, molécula de adesão N-CAM, CD34 e o fator regulatório miogênico Myf5
(Negroni, Butler-Browne et al., 2006). No músculo adulto, a expressão de
NCAM é restrita à junção neuromuscular, sendo, porém, reexpressa nas
miofibras se regenerando (Bani, Lagrota-Candido et al., 2008). Todos os
grupos de camundongos mdx fêmeas apresentaram maior regeneração nos
músculos de contração rápida (gastrocnêmio) e de contração lenta (solear).
Proporções semelhantes de células satélites foram encontradas entre
indivíduos jovens e idosos e mulheres e homens, sendo que as células
satélites de mulheres apresentaram áreas celulares e nucleares maiores do
que as dos homens (Roth, Martel et al., 2000). A base fisiológica para esta
diferença é desconhecida. Em relação a esses dados, a castração nos
camundongos mdx machos (OOX) diminuiu o número de miofibras se
regenerando. Em contraste, as fêmeas mdx castradas (OVX) apresentaram o
número de miofibras se regenerando em quantidade maior que as fêmeas mdx
não castradas (controle). A ovariectomia aumenta os níveis de IGF-1 e com a
ausência na produção de estrogênios pelos ovários, os órgãos periféricos,
como músculo e tecido adiposo, podem estar compensando com o aumento
nos níveis locais de estrogênio. O aumento de IGF-1 pode estar associado à
estimulação da proliferação de células satélites como também da diferenciação
e fusão para o crescimento dos miotubos (Dodson, Allen et al., 1985; Florini,
Ewton e Roof, 1991; Delany, Pash et al., 1994; Fryburg, Jahn et al., 1995;
Goldspink, Cox et al., 1995). É claro que existem outros fatores de crescimento
responsáveis pela proliferação de células musculares, entres eles, HGF exerce
96
um efeito direto sobre a proliferação e diferenciação de células satélites (Allen,
Sheehan et al., 1995; Bischoff, 1997), além de ser fator quimioatraente para
células satélites. Além dos fatores de crescimento responsáveis pela
proliferação, diferenciação e fusão das células musculares, citocinas (ex: IL-6)
promovem a proliferação e fusão de células satélites (Cantini e Carraro, 1995).
A IL-15 induz a diferenciação de mioblastos (Quinn, Haugk et al., 1995) e LIF,
uma citocina produzida macrófagos e mioblastos, também influencia a
proliferação e diferenciação de células musculares (Austin, Bower et al., 1992;
Barnard, Bower et al., 1994; Kurek, Nouri et al., 1996). Dentre os principais
hormônios responsáveis pela proliferação e diferenciação de mioblastos,
podemos citar insulina, leptina e testosterona (Florini, 1987; Celotti e Negri
Cesi, 1992; Chandler, Byrne et al., 1994; Joubert e Tobin, 1995; Mcfarland,
Pesall et al., 1995; Doumit, Cook et al., 1996; Chen, Zajac et al., 2005; Isidori,
Giannetta et al., 2005; Chen, Li et al., 2006).
Os hormônios corticosteróides inibem a síntese e estimulam a degradação
de proteínas no músculo esquelético (Haymond e Horber, 1992; Montano e
Lim, 1997; Hasselgren, 1999), mas não alteram o número de mioblastos e nem
o número e tamanho de miotubos formados (Braun, Buschhausen-Denker et
al., 1989). Os corticosteróides usados como terapêutica na DMD são
considerados de grande importância (Brooke, Fenichel et al., 1987; Fenichel,
Florence et al., 1991; Griggs, Moxley et al., 1991) na melhora da função e
potência muscular (Fenichel, Cooper et al., 1990; Fenichel, Florence et al.,
1991), talvez devido ao efeito antinflamatório e imunossupressor (Parrillo e
Fauci, 1979; Kissel, Burrow et al., 1991). Entre os efeitos da prednisona nos
músculos de pacientes com DMD, observa-se aumento da mioglobina (Park,
97
Hill et al., 1979), de células satélites (Schmalbruch e Hellhammer, 1976; Gibson
e Schultz, 1983) e da regeneração (Guerriero e Florini, 1980). Os esteróides
também podem promover estabilização de membrana (Seeman, 1966) e
diminuir o número da apoptose (Sklar, Hudson et al., 1991). Nos camundongos
distróficos sem castração, de ambos os gêneros, porém submetidos ao
estresse da cirurgia, o número de mioblastos proliferando, evidenciados pela
expressão de NCAM, estava reduzido, dado este interpretado como sendo em
parte devido ao estresse da cirurgia, que, embora promovendo uma maior
liberação de corticosteróides, não foi suficiente para manter ou aumentar o
número de células satélites.
Há uma crescente evidência de que diversos tipos de células residentes e
não residentes encontradas no músculo possam reconstituir o reservatório de
células satélites (Grounds, White et al., 2002; Asakura, 2003; Chen e
Goldhamer, 2003). Nas doenças como DMD, onde células satélites entram
rapidamente num estado de exaustão, outra fonte alternativa podem ser as
células-tronco. Numerosos estudos têm confirmado que células-tronco
residentes e não residentes no músculo são capazes de se fundirem com as
miofibras deficientes de distrofina. De fato, uma porcentagem maior de células
de distrofina positivas foram obtidas a partir de células-tronco Sca-1 e CD34+
no camundongo mdx (Gussoni, Soneoka et al., 1999; Asakura, Seale et al.,
2002; Deasy e Huard, 2002; Tamaki, Akatsuka et al., 2002; Tamaki, Akatsuka
et al., 2003). Células oriundas da medula óssea ou do músculo esquelético têm
propriedades similares (80% expressam Sca-1), sendo capazes, quando
injetadas por via intravenosa, de restaurar parcialmente a expressão de
distrofina no músculo do camundongo mdx (Gussoni, Soneoka et al., 1999;
98
Jackson, Mi et al., 1999). A marcação de células-tronco (Sca-1) estava maior
em todos os grupos de fêmeas mdx castradas (OVX) em comparação com os
grupos de machos mdx normais e castrados (OOX). Durante a castração
natural, observada no envelhecimento, a produção de hormônios sexuais
femininos pelos ovários é insignificante sendo, então, compensada pela sua
produção em órgãos periféricos. O estrogênio induz a transcrição de fatores
como c-fos e erg-1, que contribuem para a proliferação de mioblastos (Kahlert,
Grohe et al., 1997) e através de vias ligadas a receptores acoplados à proteína
G foi identificado que estes hormônios regulam o crescimento do músculo
esquelético (Kraus, Bernard et al., 1989; Sillence, Reich et al., 1995). O limitado
impacto de células-tronco na substituição das fibras deficientes de distrofina
nunca excedeu a 1%, talvez seja porque, em camundongos mdx, as células
satélites e as células-tronco residentes sejam capazes de reposição com
precursores miogênicos por toda a vida, o que explicaria também o pobre
recrutamento das células-tronco precursoras da medula óssea.
Na DMD, as miofibras do tipo IIB são mais afetadas que fibras
musculares esqueléticas de pequeno calibre (Karpati e Carpenter, 1986). A
heterogeneidade de tipos de fibras musculares contribui para uma variedade de
capacidades funcionais, que podem se adaptar mudando o tamanho e a
composição do tipo de fibra influenciada pela idade, gênero, exercício e
doenças musculares. Contudo, é importante analisar os tipos de miofibras e a
sua evolução durante a doença e verificar o quanto as suas propriedades
bioquímicas, metabólicas, morfológicas e fisiológicas estão sendo influenciadas
durante o curso de uma determinada doença. Um dos métodos mais
informativos de identificação dos tipos de fibras é a detecção da cadeia pesada
99
da miosina (MHC)(Scott, Stevens et al., 2001; Toniolo, Maccatrozzo et al.,
2007). As miofibras MHC lentas são maiores e estão aumentadas
seletivamente nas populações de miofibras que não se regeneram, enquanto
as fibras de contração rápida IIB, IIX ou IIA estão diminuídas. Em geral, o
aumento de miofibras lentas pode ser devido a respostas adaptativas pelos
sistemas enzimáticos metabólicos e consumo de energia, porque as fibras
lentas têm consumo menor de energia do que as fibras rápidas (Crow e
Kushmerick, 1982). Nossos estudos confirmam os resultados destes autores,
mostrando substituição maior das células musculares glicolíticas (brancas -
contração rápida) por fibras intermediárias (menos rápidas) em ambos os
gêneros do mdx. As miofibras lentas podem ser mais adaptáveis para o
estresse distrófico do que as rápidas para compensar a habilidade reduzida da
função muscular. Dois mecanismos são propostos para explicar o aumento
seletivo das miofibras lentas durante a degeneração muscular progressiva no
mdx: fibras lentas podem ser mais resistentes ao estresse mecânico do que as
miofibras rápidas ou à mudança de isoformas de MHC rápida para tipo lenta
como visto na hipertrofia e exercício (Gregory, Low et al., 1986). A
sobrevivência seletiva de miofibras lentas pode ser conseqüência das fibras
expressarem mais utrofina, proteína homóloga à distrofina, em comparação às
miofibras rápidas (Gramolini, Belanger et al., 2001; Chakkalakal, Stocksley et
al., 2003).
Estrogênios também parecem influenciar no fenótipo do músculo
esquelético (Florini, Ewton e Magri, 1991; Sillence, Reich et al., 1995). Nossos
resultados mostram que camundongos mdx fêmeas tiveram um maior número
de miofibras de contração lenta e intermediária (tipo I e principalmente IIA)
100
comparados com os grupos de machos pareados. O estresse e a castração,
em ambos os gêneros dos camundongos distróficos, também levaram a uma
diminuição do número de todos os tipos de miofibras, principalmente das
miofibras rápidas nos camundongos mdx machos castrados. Dados da
literatura indicam que testosterona aumenta as fibras do tipo II (Gutmann,
Hanzlikova et al., 1970) e estrogênio inibe desenvolvimento de fibras do tipo IIB
e ativa formação de miofibras de contração lenta (Simoneau, Lortie et al., 1985;
Suzuki e Yamamuro, 1985). Outras diferenças têm sido relatadas entre
gêneros, em relação ao fluxo de sangue, temperatura e diferenças na utilização
de energia devido a diferenças nas dimensões do músculo esquelético. O
gênero também interfere na proporção e no tamanho de tipos de miofibras
(Porter, Stuart et al., 2002). Além disso, a deficiência da distrofina pode levar à
mudança para miofibra do tipo lenta via sinalização calcineurina / NFAT no
músculo esquelético porque a calcineurina e o conteúdo de proteína NFATc1
ativado são mais altos nos camundongos mdx do que nos tipos selvagens
(Allen, Sartorius et al., 2001; Stupka, Plant et al., 2006). Contudo, permanece
possível que ambos os mecanismos possam ser ativados ao mesmo tempo,
porque a cascata calcineurina/NFAT pode regular não somente os promotores
de MHC, mas também o promotor da utrofina (Chakkalakal, Stocksley et al.,
2003; Spangenburg e Booth, 2003; Michel, Dunn et al., 2004). A calcineurina,
tem um papel importante influenciando o fenótipo do tipo de fibra (Michel, Dunn
et al., 2004), sendo descrito em ratos e camundongos, a indução da transição
de isoformas MHC a partir de rápidas para lentas (Dunn, Burns et al., 1999;
Allen, Sartorius et al., 2001). Uma possibilidade é a participação do fator de
crescimento IGF-1, importante para o crescimento pós-natal do músculo
101
esquelético (Lupu, Terwilliger et al., 2001) e capaz de ativar múltiplas vias de
sinalização dependentes de cálcio, incluindo a via calcineurina e NFAT (Michel,
Dunn et al., 2004). A administração de estrogênio aumenta os níveis de
calcineurina e da fosfatase de células em cultura (Rider, Foster et al., 1998;
Rider e Abdou, 2001). O aumento na porcentagem das miofibras lentas
também é visto, em outras situações, como treinamento com exercício de alta
intensidade e curta duração e estimulação elétrica crônica de baixa freqüência,
onde se observa mudança nos subtipos de fibras do tipo II devido à fosforilação
de NFATc1, o que contribui para a transformação de fibras rápidas para lentas.
Os exercícios de longa duração mudam o padrão de expressão das miofibras
do tipo II para I (Delp e Pette, 1994; Pette e Staron, 2001). Uma dieta rica,
contendo 35% de proteína, induz mudança na isoforma de MHC II para MHC I
no músculo gastrocnêmio de ratos de modo semelhante aos exercícios de
longa duração. Em conjunto, atividade física (Holloszy, 1967), dieta com alto
conteúdo proteico e hormônios sexuais femininos podem contribuir para a
mudança de miofibras do tipo rápida para lenta (White, Cattaneo et al., 2000;
Brodsky, Suzara et al., 2004).
Dentre as mais importantes metaloproteinases associadas com a função
e disfunção do músculo esquelético, estão as MMP-9 e MMP-2 (Carmeli, Moas
et al., 2004). Nossos estudos mostram que, no músculo de camundongo
normal, a atividade da MMP-9 não era detectada diferentemente daquela da
MMP-2. Estes dados confirmam o reportado na literatura que demonstra que a
MMP-2, mas não a expressão da MMP-9, é constitutiva em músculos normais.
Todos os camundongos mdx, machos e fêmeas, apresentaram uma atividade
aumentada das MMP -2 e -9, em especial os grupos castrados. Sabemos que
102
no camundongo mdx, tanto as formas ativa e pró-ativa da MMP-2 e MMP-9 são
expressas em níveis significativamente elevados (Gosselin, Williams et al.,
2007), mas com variações influenciadas pela fase da doença. A ativação da
MMP-2 ocorre concomitantemente com a regeneração de novas miofibras, mas
da MMP-9 está associada principalmente com a resposta inflamatória,
migração celular e provavelmente com a ativação de células satélites (Kherif,
Lafuma et al., 1999). Nosso estudo apresentou diferenças importantes entre os
gêneros, já que a atividade da MMP-9 estava mais elevada em todos os grupos
de camundongos mdx machos comparados com os grupos mdx fêmeas
pareadas. O contrário ocorreu com a MMP-2, uma vez que camundongos mdx
fêmeas apresentavam atividade mais elevada que os mdx machos pareados.
Se hormônios sexuais são potentes inibidores de respostas inflamatórias no
músculo esquelético do mdx, então, pode-se especular que a secreção e
ativação da MMP-9 são dependentes da modulação hormonal. Outros estudos,
nos modelos de injúria por isquemia e reperfusão, mostram uma redução
marcante da atividade das MMP-2 e MMP-9 duas e quatro horas após
tratamento com estradiol E2 (Liu, Wen et al., 2005). Estudos no músculo
esquelético de pacientes com DMD e mdx mostram haver um aumento dos
inibidores das MMPs (TIMP-1 e TIMP-2) e da atividade MMP-2 e MMP-9
(Kherif, Lafuma et al., 1999; Gosselin, Williams et al., 2007), sugerindo que a
alteração na regulação das MMPs e seus inibidores pode contribuir para a
patogênese do músculo esquelético e que a atividade hormonal possa controlar
o processo de remodelagem tecidual. De fato, dados da literatura indicam que
hormônio sexual feminino é estimulador específico da liberação da MMP-2
(Wingrove e Stevenson, 1997), um fator importante na remodelagem tecidual,
103
por regular a integridade e composição da ECM e do tecido conjuntivo no
músculo esquelético após injúria. Os hormônios corticosteróides inibem a
expressão de genes pró-inflamatórios e podem suprimir a síntese de MMPs.
Este tipo de tratamento pode reduzir a deposição de colágeno subepitelial pela
diminuição da expressão da MMP-9 (Hoshino, Takahashi et al., 1999).
A inibição da atividade das MMPs com hormônios esteróides pode ser
usada como estratégia terapêutica para reduzir a severidade por injúria e
reperfusão (Roach, Fitridge et al., 2002). O estrogênio diminui a produção de
citocinas inflamatórias por diferentes tipos de macrófagos, também bloqueia a
produção de MMP-9, prostaglandina E, induz a síntese de óxido nítrico e
atenua a liberação de superóxido e da atividade fagocítica (Vegeto, Ghisletti et
al., 2004). Espécies reativas de oxigênio têm um papel importante na ativação
de MMPs. Uma vez que o estrogênio diminui a produção de radicais livres,
(Tiidus e Houston, 1993; Bruce-Keller, Barger et al., 2001) é possível modular a
expressão de MMPs e influenciar a remodelagem do tecido muscular.
Atualmente têm sido usados como alvos farmacêuticos os receptores de
estrogênio, que representam uma descoberta potente para uso de drogas
seletivas e específicas para controlar a evolução de diversas doenças (Barrett-
Connor, Mosca et al., 2006). Receptores de estrogênios endógenos
representam uma grande ferramenta de estudo da atividade hormonal sobre as
células inflamatórias e não inflamatórias. Para distinguir os mecanismos de
ação dos hormônios sexuais femininos, usamos tamoxifen, que é capaz de
modular o receptor seletivo de estrogênio (SERM). Esta droga tem efeito
agonista ao do estrogênio nos músculos esqueléticos (Wenger, 2002; Riggs e
Hartmann, 2003). O tratamento com tamoxifen aumentou a regeneração no
104
músculo gastrocnêmio de ambos os sexos, porém maior nos camundongos
mdx fêmeas. Em relação ao tipo de tratamento, a liberação da droga local
sobre o músculo gastrocnêmio (direito) ocasionou maior regeneração das
células musculares do que no músculo contralateral. Estudos mostraram outro
modulador de receptor de estrogênio, o raloxifeno, que diminuiu a expressão
da atividade gelatinolítica e estes efeitos foram acompanhados pela redução do
tamanho da lesão e inibição do acúmulo de macrófagos em células de
musculatura lisa (Bellosta, Baetta et al., 2007). O tratamento com tamoxifen
induziu um aumento no número de células musculares íntegras nos
camundongos mdx machos e fêmeas, comparados com os grupos controle e
sem tamoxifen. O comprometimento da integridade funcional da membrana das
células musculares, comum na DMD, induz um aumento do influxo de cálcio
ativando proteases dependentes de cálcio, tais como calpaínas, aumentadas
em concentração e atividade nos tecidos distróficos. Portanto, é possível que a
redução na destruição da membrana seguida ao tratamento com tamoxifen,
seja, em parte, responsável pela estabilização de membrana, assim como pode
ser explicada pelo tratamento por hormônios esteróides como a prednisona
(Khan, 1993), pelo estrogênio (Bar, Amelink et al., 1988; Koot, Amelink et al.,
1991; Tiidus e Bombardier, 1999) e pelos efeitos antinflamatórios.
Também foi alvo de nossos estudos o efeito do tratamento com
tamoxifen nas células do infiltrado inflamatório, sendo evidenciada por imuno-
histoquímica com os anticorpos F480 e Mac-1+ uma redução acentuada na
população de macrófagos no músculo gastrocnêmio dos camundongos mdx
machos e fêmeas comparados com os grupos controle sem tamoxifen. O
infiltrado inflamatório influencia a fisiopatologia da lesão muscular na DMD
105
(Spencer e Tidball, 2001; Porter, Stuart et al., 2002). Embora mutações da
distrofina sejam a causa primária de DMD, o processo secundário, envolvendo
persistente inflamação, prejudica a regeneração e exacerba a progressão da
doença. Neste sentido, foi evidenciado que a redução no número de
macrófagos em músculos deficientes de distrofina diminui a lesão no sarcolema
(Lundberg, Brengman et al., 1995). Contudo, nem todos os macrófagos são
fagocíticos (St Pierre e Tidball, 1994) e diferentes subpopulações podem
executar funções distintas resultando em efeitos diversos na produção de
citocinas antinflamatórias, efeitos antiapoptóticos e liberação de fatores de
crescimento necessários para um ambiente para favorecer a proliferação e
migração de células satélites para a regeneração da miofibra (Chazaud, Sonnet
et al., 2003). Neste contexto, é importante analisar a função específica de cada
população de macrófago em relação à regulação da inflamação na lesão
muscular na DMD e qual a influência dos hormônios sexuais e drogas
moduladoras (ex., tamoxifen) na função das células do infiltrado inflamatório e
expressão de moléculas de adesão. Existem fortes evidências de que os
estrógenos influenciem as respostas inflamatórias em vários tecidos, inclusive
no músculo esquelético (Amelink, Kamp et al., 1988; Tiidus, Bombardier et al.,
1998). Dados na literatura mostram que os hormônios sexuais femininos
(estrogênios) reduzem o número de células inflamatórias, inibem a expressão
de moléculas de adesão (Schneider e Gallagher, 1999) e também influenciam o
processo de regeneração das miofibras ao induzirem a proliferação de
mioblastos (Schneider e Sannes, 2001). Um achado interessante na lesão
muscular de machos e fêmeas mdx é a presença de tecido adiposo, muito mais
exuberante na fêmea. O tecido adiposo também é visto como um órgão
106
endócrino (Prins, 2002). A adiponectina, hormônio produzido pelo tecido
adiposo, pode funcionar como um modulador atenuando respostas
inflamatórias excessivas numa variedade de tecidos. Esse hormônio reduz a
expressão de molécula de adesão cellular vascular-1 (VCAM-1), E-selectina,
molécula de adesão intracelular-1 e IL-8, a interação de monócitos ativados em
células endoteliais e também inibe a ativação fator nuclear-κB (NF-κB) em
células endoteliais (Ouchi, Kihara et al., 1999; Ouchi, Kihara et al., 2000;
Kobashi, Urakaze et al., 2005). Os hormônios sexuais influenciam nos níveis
plasmáticos de adiponectina e leptina. Assim, o tecido adiposo de mulheres
produz mais adiponectina e leptina do que o tecido adiposo de homens
(Iglesias, Eiras et al., 2006). Experimentos em cultura de células mostram que
a adiponectina tem efeitos antinflamatórios e antiapoptóticos sobre miócitos
cardíacos e fibroblastos (Kobayashi, Ouchi et al., 2004; Lin, Lin et al., 2004;
Shibata, Sato et al., 2005). Camundongos mdx machos apresentaram menor
número de adipócitos do que as mdx fêmeas pareadas, podendo ser este
também outro fator que contribui para o menor infiltrado inflamatório nas
fêmeas, embora não se observem grandes diferenças entre o número de
adipócitos no tecido muscular dos grupos de camundongos mdx tratados com
tamoxifen.
A distrofia muscular de Duchenne ainda não tem cura; porém os
benefícios, melhora da qualidade de vida e aumento da sobrevida, são obtidos
com o atendimento multiprofissional. A fisioterapia e exercícios ajudam na
prevenção da contratura muscular permanente em torno das articulações. Às
vezes, a cirurgia se torna necessária para a liberação de músculos contraídos
e doloridos. Inúmeras pesquisas têm sido feitas nos últimos anos para se obter
107
a cura da doença. As famílias com membros que apresentam DMD são
instruídas a buscar um aconselhamento genético, para avaliação do risco de
transmissão do traço da distrofia muscular aos descendentes. O transplante de
mioblastos não tem tido muito sucesso, uma vez que os mioblastos são
incapazes de migrarem para longe da inoculação e 80% sofrem morte maciça
(Bhagavati e Xu, 2004; Negroni, Butler-Browne et al., 2006). Existem as linhas
de pesquisas que se voltam para a terapia genética ou para a terapia
medicamentosa. A terapia genética utiliza a transferência do gene da distrofina
ou parte dele para cada célula muscular, ou ainda, a correção do defeito
genético por técnicas especializadas. A terapia medicamentosa, realizada com
drogas, não tem ação sobre o gene e atua na célula muscular bloqueando a
sua degeneração. Muitos progressos têm sido feitos nas duas possibilidades
de tratamento. A terapia genética ainda está sob investigação, pois apesar de
facilitar a produção de distrofina pelos músculos, ainda é baixo o nível de
expressão do produto do gene e este estimula uma resposta imune. Contudo,
atualmente, a terapia medicamentosa é a opção mais viável para os pacientes
com DMD. A partir do início da década de 90, alguns trabalhos foram
divulgados relatando benefícios com a corticoterapia (Khan, 1993). A
prednisona, um corticoesteróide, vem sendo investigado como um meio de
alívio temporário para a melhora da fraqueza muscular em DMD. Porém, os
efeitos colaterais dos corticóides são grandes (ganho de peso, hipertensão,
obesidade, osteoporose e catarata).
Atualmente, têm sido usados como alvos farmacêuticos os receptores de
estrogênio, que representam uma descoberta potente para uso de drogas
seletivas e específicas para controlar a evolução de diversas desordens
108
patológicas. Receptores de estrogênios endógenos representam uma grande
ferramenta de estudo da atividade hormonal sobre as células inflamatórias e
não inflamatórias. Recentemente foi mostrado que a combinação de hormônios
esteróides sexuais com tamoxifen no camundongo mdx tem ação
antinflamatória e imunossupressiva resultando numa significativa melhora da
força e função muscular esquelética (A.P.Calvalsan, 2005). O tamoxifen
também tem sido apontado como inibidor de fibroblastos e de sua taxa de
síntese de colágeno (Hu, Hughes et al., 1998), eficiente na melhora da função
mitocondrial e capaz de ter efeito positivo no balanço pró-oxidante e
antioxidante (Ragaz e Coldman, 1998; Zhao, Wang et al., 2006). Aqui
mostramos que o tratamento com tamoxifen induziu um aumento de células
musculares íntegras nos camundongos mdx machos e fêmeas. Embora
mutações da distrofina sejam a causa primária de DMD, o processo
secundário, envolvendo persistente inflamação, prejudica a regeneração e
exacerba a progressão da doença. Neste sentido, é evidenciado que a redução
do número de macrófagos em músculos deficientes de distrofina diminui a
lesão no sarcolema. Assim, a regulação da inflamação e da resposta
inflamatória quanto ao tipo de população de macrófagos precisa ser elucidada
no estudo de DMD. Futuramente, outros estudos serão necessários para
quantificar o número total de macrófagos e suas subpopulações pró e
antinflamatórias, bem como a produção local de citocinas, os efeitos na
integridade estrutural da membrana da célula muscular esquelética e
remodelagem tecidual, para que algo possa ser utilizado como uma estratégia
promisssora no tratamento da DMD.
6. CONCLUSÕES
►Os grupos de camundongos mdx fêmeas apresentaram pequenos focos de
mionecrose e menor infiltrado inflamatório em comparação com os grupos
machos pareados. Entretanto, as fêmeas que sofreram castração cirúrgica
(ovariectomia) tiveram níveis altos de infiltrado inflamatório assim como os
machos, o que sugere a importância do hormônio sexual feminino na
manutenção da integridade estrutural da membrana da célula muscular
esquelética.
► A imunomarcação com NCAM de mioblastos regenerando em todos os
grupos de camundongos mdx fêmeas estava em número maior nos músculos
de contração rápida (gastrocnêmio) e de contração lenta (solear) do que nos
mdx machos pareados. Entretanto, nos camundongos machos distróficos
castrados (OOX), houve um decréscimo significativo do número destas células,
110
mas não nas fêmeas castradas (OVX). Isto indica que a castração nas fêmeas
induza a uma maior produção de hormônios sexuais femininos nos órgãos
periféricos, que continuam protegendo a miofibra. Neste contexto, é importante
monitorar os níveis séricos de hormônios sexuais antes e após a castração.
► A imunomarcação para Sca-1 estava maior em todos os grupos de fêmeas
mdx do que nos machos mdx pareados não-castrados; e menores ainda nos
camundongos machos mdx castrados (OOX). Fêmeas mdx castradas (OVX)
também apresentaram valores mais elevados comparativamente aos grupos de
fêmeas mdx controle e SHAM. Estes resultados sugerem que as células-
tronco contribuem de modo mais efetivo na regeneração do músculo
esquelético das fêmeas.
►Pela atividade da enzima ATPase, predominantemente, houve substituição
das células musculares glicolíticas (brancas- de contração rápida) por fibras
intermediárias (menos rápidas) em ambos os gêneros distróficos. As miofibras
lentas podem ser mais adaptáveis ao estresse da lesão muscular da
distrofinopatia do que as rápidas. Os camundongos mdx fêmeas tiveram um
maior número de miofibras de contração lenta e intermediária (tipo I e
principalmente IIA) do que os machos pareados. O estresse e a castração, em
111
ambos os gêneros dos camundongos distróficos, também levaram a uma
diminuição do número de todos os tipos de miofibras, principalmente das
miofibras rápidas nos camundongos mdx machos castrados. Estes resultados
estão de acordo com a literatura, mostrando que camundongos mdx têm perda
do tipo de miofibras rápida (IIB) e um aumento relativo no percentual de
miofibras intermediárias (IIA).
►No músculo do camundongo normal, a atividade da MMP-9 está ausente,
enquanto a MMP-2 é constitutiva. Todos os camundongos mdx, machos e
fêmeas, apresentaram atividade das MMP-2 e MMP-9 aumentadas, em
especial os grupos castrados. A atividade da MMP-9 era maior em todos os
camundongos mdx machos comparados com as mdx fêmeas pareadas. Em
contraste, a atividade da MMP-2 nos camundongos mdx fêmeas era maior que
nos grupos mdx machos pareados. Estes dados indicam que o aumento da
atividade da MMP-2 nos camundongos mdx fêmeas está associado com maior
regeneração e remodelagem muscular, enquanto o aumento da atividade da
MMP-9 nos machos, com a maior atividade inflamatória e mionecrose.
►Camundongos mdx machos e fêmeas tratados com a droga tamoxifen, com
efeitos agonista ao do hormônio estrogênio no músculo esquelético,
apresentaram maior número de células musculares íntegras do que os grupos
112
controle e sem tratamento com tamoxifen. Isto sugere que esta droga, em
ambos os sexos, pode contribuir para manter a integridade estrutural da
membrana muscular.
► A imunomarcação para população de macrófagos (F4/80 e Mac-1), mostrou
uma maior redução deles no músculo gastrocnêmio dos camundongos mdx
machos e fêmeas tratados com tamoxifen do que nos grupos controle e sem
tamoxifen. Estes dados indicam possíveis efeitos, desta droga com efeitos
antinflamatório e antiapoptótico.
►Não houve diferenças entre o número de adipócitos presentes no músculo
esquelético (gastrocnêmio) dos grupos de camundongos mdx machos e
fêmeas. Entretanto, quando analisamos a diferença entre os gêneros, os
grupos de mdx machos tinham menor número de adipócitos do que os grupos
de mdx fêmeas pareadas. Isto sugere que a maior quantidade de adipócitos
pode favorecer o grupo de fêmeas mdx com liberação local de adipocinas,
exercendo efeitos antinflamatórios, antiapoptóticos, anabólicos e também
promovendo a diferenciação em células miogênicas ou em macrófagos
regulatórios.
113
►Em conjunto, os resultados sugerem que os hormônios sexuais femininos
exercem efeitos benéficos no músculo distrófico, especialmente na
manutenção da integridade estrutural das miofibras esqueléticas, nas
atividades antinflamatória e antiapoptótica, promovendo a regeneração e a
remodelagem muscular.
114
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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