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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS - UNIMONTES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - PPGCS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
_______________________________________________________________
Shirlene Barbosa Pimentel Ferreira
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE DE PACIENTES PORTADORES DE CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO: ÊNFASE EM ASPECTOS FENOTÍPICOS
CELULARES DE LINFÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO
Montes Claros - Minas Gerais - Brasil
Março - 2009
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1
Shirlene Barbosa Pimentel Ferreira
Bacharel em Odontologia
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE DE PACIENTES PORTADORES DE
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO: ÊNFASE EM
ASPECTOS FENOTÍPICOS CELULARES DE LINFÓCITOS DO SANGUE
PERIFÉRICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
PPGCS, da Universidade Estadual de
Montes Claros/UNIMONTES, como parte
das exigências para a obtenção do Título
de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Prof. Dra. Mariléia Chaves Andrade
Co-orientador: Prof. Dr. Alfredo Maurício Batista DE-Paula
Banca Examinadora:
Profª. Drª. Mariléia Chaves Andrade
Profª. Drª. Elaine Speziali de Faria
Prof. Dr. Paulo Rogério Ferreti Bonan
Suplentes:
Profª. Drª. Renata Aline Andrade
Prof. Dr. João Felício Rodrigues
Montes Claros – Minas Gerais – Brasil
Março – 2009
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3
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu marido Renato,
presença eterna em minhas conquistas e amparo
nos momentos de angústia. À minha filha
Fernanda, a razão da minha vida, onde renovo as
minhas forças. Sinto-me feliz em dizer que esta
conquista é nossa!
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida, por manter sempre viva a minha fé.
Aos meus pais José Omar e Maria da Conceição, pela paciência e apoio.
Aos meus irmãos André e Leonardo, pela amizade. Ao meu irmão Jomar,
especialmente, por não estar mais aqui entre nós, mas a sua presença permanece
em todos os momentos da minha vida.
Ao meu marido Renato, pelo seu amor, sua paciência, seu incentivo, e pelo profundo
respeito às minhas escolhas. Agradeço ao seu silêncio nos momentos em que foi
necessário, ao seu amparo tornando as dificuldades possíveis de serem vencidas.
À minha filha Fernanda pelo seu enorme amor, carinho e compreensão em todos os
momentos, mesmo com tão pouca idade. Agradeço à Nanda, por todas as palavras
de força e incentivo ditas durante todo o tempo.
Ao Roberto Rodney, meu sogro e à Maria do Carmo, minha sogra, pelo apoio e por
sempre incentivarem a luta pelos ideais que cada pessoa possui.
Aos amigos Suelleng Cunha e Janir Soares, pela atenção, pelo grande apoio, e
pelas palavras de incentivo constantes. Agradeço pela motivação a mim oferecida,
diante dos períodos de angústias, de fundamental importância para que eu
continuasse a caminhada.
5
À amiga Maryane Campos, pelo seu apoio e amizade.
Ao amigo Paulo Melillo, pela atenção, pelas palavras de apoio, por sanar algumas
de minhas dúvidas relacionadas ao trabalho científico e pela pronta disposição em
me ajudar.
À Ana Teresa Fernandes Carvalho, eterna amiga, pelas palavras incentivadoras, e
por me ouvir todas as vezes que precisei de um ombro amigo.
À Daniella Reis Martelli, pelo coleguismo, amizade e pelos muitos momentos de
atenção, um apoio indescritível.
Ao professor Dr. Hercílio Martelli Júnior, pela confiança em mim depositada, por
todos os momentos de atenção, pela eterna disponibilidade em me atender. Suas
palavras foram essenciais para que eu prosseguisse pelo caminho certo diante das
dificuldades e angústias.
À professora Dra. Ana Cristina Botelho pela presteza e respostas às minhas dúvidas.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Pesquisa em Saúde, pela atenção, boa
convivência e disponibilidade em ajudar inesgotável, durante todo o tempo dedicado
aos experimentos. Ajudas gratuitas que tornaram os períodos de experimentos
menos árduos. Obrigada pela paciência e receptividade oferecidas a uma iniciante.
6
Aos funcionários do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário
Clemente Faria, em especial ao Júnior, Marcos, Técio e Sérgio pela atenção em
todos os momentos e cuidados com o material biológico. E à Luçandra Ramos,
minha colega de mestrado, pela gentileza em permitir a minha entrada no laboratório
quando foi necessário.
Aos médicos, Dr. Cláudio Marcelo Cardoso e Dr. Francis Balduíno Guimarães
Santos, pela confiança, receptividade e atenção. Agradeço pelo notável
compromisso na inclusão dos pacientes. Obrigada pela agradável convivência.
Às recepcionistas do Ambulatório de Radiologia da Fundação de Saúde Dílson de
Quadros Godinho, pela atenção e pelos sorrisos a cada manhã de coletas.
Aos funcionários do Ambulatório de Oncologia da Santa Casa de Misericórdia de
Montes Claros, a Danuza, em especial, pela disposição em colaborar com os
procedimentos de coleta de material.
À Diretoria Clínica da Fundação Hospitalar Dílson de Quadros Godinho e à Diretoria
Clínica da Santa Casa de Misericórdia de Montes Claros, por permitirem
prontamente a nossa entrada e a coleta de material em suas dependências.
À professora Dra. Andréa Teixeira de Carvalho, à Roberta Félix, pela atenção
quando estive presente no Instituto René Rachou, em especial ao Dr. Renato
Sathler Avelar, pela gentileza e conselhos.
7
À professora Dra. Mariléia Chaves Andrade, pela orientação.
Ao professor Dr. Alfredo Maurício Batista De-Paula, pela co-orientação e pela
atenção a mim dispensada.
Ao professor Dr. Olindo Assis Martins Filho, pela colaboração ao trabalho.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Maria do
Carmo Mendes Nobre e Kátia Silene Maia Azevedo, pela atenção, dedicação e
pelas palavras de amizade que tornaram a convivência agradável.
Aos coordenadores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
(PPGCS), Prof. Dr. Paulo Rogério Ferreti Bonan e Prof. Dr. João Felício Rodrigues
Neto, por proporcionarem a minha realização pessoal e profissional. Agradeço ainda
pela confiança e por todos os momentos de atenção a mim dispensados.
Ao Reitor da Universidade Estadual de Montes Claros – UNIMONTES, Prof. Paulo
César Gonçalves de Almeida pela estrutura oferecida aos alunos da universidade e
também pela qualidade dos cursos oferecidos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG, pela
bolsa se estudos concedida a mim durante todo o período do mestrado.
8
Finalmente, o meu sincero e humilde agradecimento aos pacientes portadores da
doença em estudo e aos doadores saudáveis, pela disposição em colaborar com a
pesquisa, voluntariamente, no âmbito dos atores fundamentais à concretização do
trabalho.
Sei que posso ter me esquecido de alguém. Mas sinto-me aliviada em saber que ao
longo do tempo não poupei agradecimentos e que sempre há tempo para agradecer.
9
SUMÁRIO
1. Introdução.............................................................................................................21
1.1. Epidemiologia do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço....................... 21
1.2. Etiopatogenia do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço....................... 22
1.3. Manifestações clínicas e história natural do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço......................................................................................................................23
1.4. Diagnóstico e estadiamento do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço 24
1.5. Tratamento e prognóstico do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.....25
1.6. Aspectos imunológicos celulares antitumorais da imunidade adaptativa
relacionados ao carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.................................27
1.6.1. Aspectos imunológicos antitumorais relacionados aos linfócitos T..................28
1.6.2. Aspectos imunológicos antitumorais relacionados aos linfócitos B..................30
2.
Objetivos...............................................................................................................32
2.1. Objetivo Geral.....................................................................................................32
2.2. Objetivos Específicos..........................................................................................32
3. Justificativa.......................................................................................................... 33
4. Casuística e métodos...........................................................................................34
4.1. Tipo de estudo...................................................................................................34
4.2. Casuística..........................................................................................................34
4.2.1. Cálculo do tamanho amostral..........................................................................34
4.2.2. Descrição da casuística...................................................................................35
4.2.3. Critérios de inclusão e exclusão......................................................................35
4.2.4. Caracterização da casuística.......................................................................... 36
4.2.4.1. Características referentes a todos os grupos.............................................. 37
10
4.2.4.2. Características particulares ao grupo D........................................................38
4.2.4.3. Características relativas ao grupo NDH........................................................40
4.3. Métodos........................................................................................................... 41
4.3.1. Aquisição de dados epidemiológicos, dados clínicos e amostras de sangue 41
4.3.2. Análise do fenótipo celular em linfócitos do sangue periférico.........................42
4.3.3. Estratégias de análises dos dados...................................................................45
4.3.3.1. Análise convencional.....................................................................................46
4.3.3.2. Análise de células T reguladoras..................................................................47
4.3.3.3. Análise combinada “gated”............................................................................48
4.3.4. Análise estatística.............................................................................................49
4.3.5. Aspectos éticos................................................................................................50
5. Resultados............................................................................................................51
5.1. Resultados da imunofenotipagem de linfócitos por citometria de fluxo... .51
5.1.1. Freqüência de populações e subpopulações linfocitárias do sangue periférico
em cada grupo...........................................................................................................52
A) Estudo da freqüência da população e subpopulações de linfócitos do sangue
periférico....................................................................................................................52
B) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T.......................................53
C) Análise da freqüência de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
).........................54
D) Análise do percentual de subpopulações de linfócitos B na população de linfócitos
totais do sangue periférico.........................................................................................55
E) Análise da razão entre linfócitos T e linfócitos B circulantes.................................56
5.1.2. Estudo da freqüência de linfócitos ativados e da expressão de moléculas de
ativação e adesão celular em populações e subpopulações linfocitárias do sangue
periférico em cada grupo............................................................................................57
11
A) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR
+
)......57
B) Expressão da molécula HLA-DR em linfócitos T auxiliares e linfócitos T
citotóxicos.............................................................................................................58
C) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (CD18
+
)..........59
D) Expressão da molécula CD18 em linfócitos Tauxiliares e linfócitos Tcitotóxicos 60
E) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (CD38
+
)..........61
F) Expressão da molécula CD38 em linfócitos Tauxiliares e linfócitos Tcitotóxicos 62
G) Análise do percentual de linfócitos T expressando a molécula CD28..................63
H) Análise da freqüência de subpopulações de linfócitos T expressando a molécula
de adesão CD62L.................................................................................................64
5.2. Artigo Científico.................................................................................................66
6. Discussão..............................................................................................................88
7. Conclusões...........................................................................................................93
8. Perspectivas.........................................................................................................94
9. Referências...........................................................................................................95
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
de populações celulares por citometria de fluxo........................................................47
Figura 2 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
de células T reguladoras (CD4+CD25
HIGH
) por citometria de fluxo............................48
Figura 3 - Seqüência de passos utilizados para as análises de subpopulações de
células T CD4+ ou CD8+ ativadas (HLA-DR+) por citometria de fluxo......................49
Figura 4 - Análise do percentual de linfócitos T circulantes em cada grupo.............52
Figura 5 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares (A) e de linfócitos T
citotóxicos (B) no sangue periférico em cada grupo..................................................53
Figura 6 - Análise da razão entre linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos no
sangue periférico em cada grupo...............................................................................54
Figura 7 - Análise do percentual de células T reguladoras (células T CD4+CD25
High
)
do sangue periférico por grupo...................................................................................55
Figura 8 - Análise do percentual de linfócitos B convencionais (A) e linfócitos B1 (B)
circulantes e linfócitos B totais no sangue periférico por grupo................................56
Figura 9 - Análise da razão entre linfócitos T e linfócitos B circulantes em cada
grupo..........................................................................................................................57
Figura 10 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados e linfócitos T
citotóxicos ativados circulantes por grupo..................................................................58
Figura 11 - Análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos T auxiliares
ativados (A) e em linfócitos T citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo.............59
Figura 12 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados (A) e do
percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo...................60
13
Figura 13 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados (A) e do
percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo...................61
Figura 14 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados (A) e do
percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo...................62
Figura 15 - Análise da expressão da molécula CD38 em linfócitos T auxiliares ativa-
dos (A) e em linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por grupo.....63
Figura 16 - Análise da freqüência da molécula CD28 em linfócitos T auxiliares ativa-
dos (A) e em linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por grupo.....64
Figura 17- Análise da freqüência da molécula CD62L em linfócitos T auxiliares
ativados (A) e em linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por
grupo..........................................................................................................................65
Figuras referentes ao artigo científico:
Figura 1 - ..................................................................................................................84
Figura 2 - ..................................................................................................................85
Figura 3 - ..................................................................................................................86
Figura 4- ...................................................................................................................87
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dados epidemiológicos referentes aos grupos em estudo.......................37
Tabela 2 - Dados epidemiológicos referentes ao grupo D.........................................38
Tabela 3 - Dados epidemiológicos referentes ao grupo D.........................................38
Tabela 4 - Dados epidemiológicos referentes ao grupo D.........................................39
Tabela 5 - Localização das lesões de CECP referente ao grupo D..........................39
Tabela 6 - Estadiamento do CECP referente ao grupo D..........................................40
Tabela 7- Dados epidemiológicos referentes ao grupo NDH.....................................40
Tabela 8 - Dados epidemiológicos referentes ao grupo NDH....................................41
Tabela 9 - Dados epidemiológicos referentes ao grupo NDH
................................................
41
Tabela 10 - Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para
análise de populações e subpopulações linfocitárias e moléculas de superfície.......44
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AJCC American Joint Committeé on Cancer
CD “Cluster differentiation” – Grupo de diferenciação
CECP Carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
CHP Complexo de histocompatibilidade principal
D Indivíduos portadores de CECP
EBV Vírus de “Epstein-Barr”
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
FITC Isotiocianato de fluoresceína
FL Fluorescência
FSC “Foward Scatter”; distribuição puntual de tamanho.
HLA Antígeno leucocitário humano
HPV “Human papillomavirus”
IFN
Interferon
IL Interleucina
MHC Complexo maior de histocompatibilidade
ND Indivíduos portadores de CECP
NDH Indivíduos não doentes e portadores de hábitos de risco
NK “Natural killer”
PAAF Punção aspiratória por agulha fina
PBS Tampão fosfato salínico
PE Ficoeritrina
R1 Região1
SSC “Side Scatter”; distribuição puntual de granulosidade
TC “Tree color”
16
T CD8+ LinfócitoT expressando marcador CD8
T CD4+ LinfócitoT expressando marcador CD4
TNM Tamanho, Linfonodos, Metástase
TNF Fator de necrose tumoral
17
Resumo
FUNDAMENTOS: A resposta imunológica na presença do carcinoma epidermóide
de cabeça e pescoço (CECP) não se encontra elucidada. No entanto, sabe-se que o
sistema imune desempenha importante papel na carcinogênese, curso da doença,
tratamento e prognóstico, no contexto do CECP. OBJETIVO GERAL: Investigar a
resposta imune em pacientes portadores de CECP com ênfase em aspectos
fenotípicos de linfócitos do sangue periférico. MATERIAL E MÉTODOS: Foram
incluídos no estudo: 8 indivíduos sadios (grupo ND), 11 indivíduos sadios e
portadores de hábitos de risco para o CECP (grupo NDH) e 24 indivíduos portadores
de CECP (grupo D). Os leucócitos do sangue periférico foram marcados por
anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos, seguindo-se a análise de
imunofluorescência por citometria de fluxo (FACScan-BD
®
). O programa
CELLQuest
TM
foi utilizado para aquisição e análise dos dados. RESULTADOS:
Demonstrou-se uma maior freqüência de células T citotóxicas no grupo D (p=0,093).
Razão CD4
+
/CD8
+
revelada maior no grupo NDH (p=0,0226). Percentual maior de
linfócitos T ativados (TCD4
+
HLA
+
, TCD8
+
HLA
+
, TCD4
+
CD28
+
, TCD8
+
CD28
+
),
inversamente a um menor percentual de células TCD4
+
CD38
+
e TCD8
+
CD38
+
, foram
identificados no grupo D. No grupo D, o percentual de células que expressaram a
molécula CD18 foi maior para as células TCD4
+
, enquanto que para a molécula
CD62L houve um maior percentual de células CD8
+
CD62L
+
(p=0,0324), em relação
aos demais grupos. Adicionalmente, a expressão das moléculas HLA, CD18 e CD38
mostrou-se mais elevada no grupo D, tanto para as células TCD4
+
como para as
células TCD8
+
. Uma maior freqüência de células TCD4+CD25
HIGH
foi identificada no
grupo D (p=0,0178). Demonstrou-se um menor percentual celular no compartimento
18
de linfócitos B, possivelmente decorrente da menor freqüência de linfócitos B e
linfócitos B1 paralelamente a uma maior razão CD3
+
/CD19
+
, no grupo relativo aos
indivíduos portadores de CECP (p=0,0005). CONCLUSÃO: Os resultados revelaram
um perfil fenotípico da resposta imune em indivíduos portadores de CECP, distinto
do perfil imunofenotípico em indivíduos sadios, caracterizado por um aumento da
ativação de linfócitos T CD8
+
em associação com um aumento de linfócitos T
reguladores CD4+CD25
HIGH
.
Palavras-chave: carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, citometria de fluxo,
imunologia, leucócitos periféricos.
19
Abstract
BACKGROUND: The immune response in the head and neck squamous cell
carcinoma (HNSCC) is not completely understood. However, the immune system
plays a key role in the carcinogenesis, evolution of the disease, treatment and
prognostic of the HNSCC. OBJECTIVE: To investigate the profile of the immune
response focusing on phenotypic features of peripheral blood lymphocytes in
HNSCC. PATIENTS AND METHODS: The study included: 8 healthy individuals (HI
group), 11 healthy individuals with habits of risk (HIHR group) and 24 HNSCC
patients (HNSCC group). Peripheral blood white cells were labeled with
fluorochrome-conjugated specific monoclonal antibodies following
immunofluorescence analysis by flow cytometry (FACScan-BD
®
). CELLQuest
TM
software was used for data acquisition and analysis. RESULTS: Our results
demonstrated a higher frequency of T cytotoxic cells in HNSCC group (p=0,093).
Reason CD4+/CD8+ higher in HIHR group (p=0,0226). Higher percentage of
activated T-lymphocytes (TCD4
+
HLA
+
, TCD8
+
HLA
+
, TCD4
+
CD28
+
, TCD8
+
CD28
+
),
opposite to lower percentage of T-cells (TCD4
+
CD38
+
and TCD8
+
CD38
+
), were
observed in HIHR group. The HNSCC group appeared a higher percentage of CD4+
T cells expressing CD18, while CD8+ T cells showed a higher frequency of cells
expressing CD62L(p=0,0324). In addition, higher expression of HLA, CD18 e CD38
appeared in HNSCC group in the CD4+ T-cells as well as CD8+ T-cells. Higher
frequency of CD4+CD25
HIGH
T-cells was observed in HNSCC group (p=0,0178).
Lower percentage of cells in B-cell compartment was observed, that suggests
association with a lower frequency of B-lymphocytes and B1-lymphocytes besides
higher reason CD3+/CD19+, in HIHR group (p=0,0005). CONCLUSION: These
findings suggest an immune profile on phenotypic features in HNSCC patients,
20
distinct of immunophenotipic profile in healthy individuals, characterized by increase
of activated T CD8+ T lymphocytes in association with increase regulatory T
CD4+CD25
HIGH
cells.
Keywords: head and neck cancer, flow cytometry, immunology, peripheral
leukocytes.
21
1. Introdução
1.1. Epidemiologia do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP), também
denominado carcinoma de células escamosas ou carcinoma espinocelular, é uma
neoplasia maligna que se origina no epitélio de revestimento que surge a partir de
superfícies mucosas do sistema aerodigestório superior: cavidade oral, orofaringe,
hipofaringe, laringe, nasofaringe, e seios paranasais (1).
Cerca de 95% de todas as malignidades da região de cabeça e pescoço
correspondem ao carcinoma epidermóide. É uma doença associada a altas taxas de
mortalidade e morbidade e representa um grande problema de saúde pública (2).
O CECP é o 6º tipo de câncer mais comum, representando cerca de 6% de
todos os casos e possui uma estimativa de 650.000 novos casos e 350.000 mortes
pela doença em todo o mundo a cada ano (3).
Nos Estados Unidos, foram estimados 45.660 novos casos e 11.210 mortes
causadas pelo CECP ocorridos no ano de 2007 (4).
A Oceania, o noroeste da Austrália, a Ásia Central, o sul da Europa e o sul da
África são consideradas regiões de alta prevalência para o câncer da cavidade oral.
A Europa Oriental, América do sul e Ásia Ocidental são identificadas como regiões
de alta prevalência para o câncer de laringe (3).
No Brasil, o câncer de cavidade oral é considerado a neoplasia maligna mais
comum na região de cabeça e pescoço, excluindo-se o câncer de pele, e ocupa o 7º
lugar como o câncer mais freqüente na população brasileira (6). O câncer de laringe
representa cerca de 25% dos tumores malignos da mesma região (5). O Instituto
Nacional do Câncer (INCA/MS) estimou para o ano de 2008, 10.380 casos novos de
22
câncer de cavidade oral em homens e 3.780 casos novos da doença em mulheres,
segundo localização primária (6).
A doença é mais comum no homem branco da 5ª e da 6ª década de vida,
tendo como principais fatores de risco o tabagismo e o etilismo. O CECP é
considerado três vezes mais comum em homens do que em mulheres (7).
A epidemiologia do CECP é complexa devido à natureza multigênica da
doença e ao número de agentes ambientais a que os indivíduos estão expostos (2).
1.2. Etiopatogenia do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
Os fatores etiológicos e de risco mais importantes para o CECP
correspondem aos produtos do tabaco e álcool. Produtos irritantes do tabaco
aumentam o risco de câncer local. O álcool, além de carcinógeno, pode aumentar o
potencial carcinogênico de outros fatores etiológicos relacionados à doença (1).
O refino de metais e exaustão de diesel, irritantes crônicos, deficiência de
vitamina A, exposição à irradiação ultravioleta solar e imunossupressão constituem
fatores de risco importantes para o CECP (1). Dentre os fatores nutricionais de
importância para a etiopatogenia da doença, considera-se a síndrome de Plummer-
Vinson em que há uma anemia ferropriva (8).
O vírus HPV, especialmente o subtipo HPV16, se encontra diretamente
relacionado com o desenvolvimento da doença. O HPV pode ser detectado em mais
de 72% dos casos de câncer de orofaringe (9). A associação entre HPV e CECP é
também significativa para o câncer de cavidade oral e laringe (10). Relatos da
existência do vírus HPV em CECP revelam maior freqüência do vírus em indivíduos
não fumantes e não etilistas ou imunossuprimidos, o que sugere uma associação
independente de outros carcinógenos (9).
23
Doenças hereditárias e anormalidades genéticas estão associadas com o
CECP. O distúrbio genético anemia de Fanconi está associado com o
desenvolvimento de câncer de língua. A inativação do gene supressor do tumor p16
pode ser um evento primário na carcinogênese do CECP (11). Mutações do gene
TP53 são observadas em 50% dos casos da doença, e estão associadas a uma
redução do tempo de sobrevida após o tratamento cirúrgico (12).
A leucoplasia e a eritroplasia constituem condições de alto risco de
desenvolvimento do CECP. A leucoplasia, diagnosticada como uma placa branca na
mucosa, pode progredir para uma lesão maligna em 30% dos doentes. Além de ser
considerada uma lesão potencialmente maligna, a leucoplasia representa um
aumento do risco de câncer do trato aerodigestivo (13). Em torno de 90% das lesões
eritroplásicas apresentam-se histopatologicamente como displasia epitelial grave ou
carcinoma de células escamosas superficialmente invasivo (14).
1.3. Manifestações clínicas e história natural do carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço
As manifestações clínicas do CECP são consideradas de grande importância
para o diagnóstico da doença. Geralmente as anormalidades se apresentam dentro
da região de cabeça e pescoço, o que caracteriza a doença como locorregional (1).
Um nódulo indolor, uma úlcera dolorosa ou um espessamento da mucosa
constituem manifestações clínicas do CECP da cavidade oral. O comprometimento
da fala pode ser notado quando a mobilidade da língua sofre restrição. Uma
mobilidade dos dentes é apresentada quando há invasão da mandíbula e alvéolo
dentário pelos tumores gengivais. Na região de orofaringe pode ser observada uma
massa ou ulceração. A rouquidão e outras formas de mudança de voz são comuns
24
na presença do câncer de laringe. Obstrução das vias aéreas pode ocorrer em
indivíduos com tumores da região supraglótica, tumores subglóticos e do seio
piriforme. Hemoptise e epistaxe podem indicar câncer de nasofaringe e do seio
paranasal (5,15).
1.4. Diagnóstico e estadiamento do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço
Após a observação dos sinais e sintomas da doença, exames de avaliação
são necessários para a confirmação diagnóstica e determinação da extensão da
doença. Um bom exame clínico faz-se necessário com palpação de lesões, quando
possível, seguida da palpação de cadeias linfáticas cervicais (5).
O diagnóstico definitivo é obtido pelo exame anatomopatológico através da
realização de uma biópsia. A biópsia incisional faz-se necessária com pinça de saca-
bocado sob anestesia local em lesões de orofaringe. Na presença de metástase
cervical, pode ser realizada a punção aspiratória de agulha fina (PAAF) de
linfonodos cervicais (5).
De acordo com os aspectos histopatológicos, os tumores diferenciados
mostram ninhos, colunas e cordões de células oriundas do epitélio pavimentoso;
pleomorfismo celular e nuclear; hipercromatismo nuclear; mitoses atípicas em
pequeno número; formação de pérolas de ceratina e invasão subepitelial. Nos casos
mais indiferenciados, a semelhança com o epitélio pavimentoso é menos acentuada,
apresentando menor ceratinização e maior número de mitoses atípicas (14,16,17).
Uma resposta inflamatória significativa é possível de ser encontrada com a presença
de linfócitos, plasmócitos e macrófagos (16).
25
O sistema de estadiamento do CECP se baseia em avaliações clínicas para a
determinação da extensão da lesão antes do tratamento. O estadiamento da doença
baseia-se no Sistema de Estadiamento TNM, que se refere ao tamanho do tumor,
acometimento ou não de linfonodos e presença ou ausência de metástase,
respectivamente. A Classificação por Estadiamento do American Joint Committee on
Câncer (AJCC) é amplamente utilizada, e o critério de classificação varia de acordo
com o sítio primário (18). Embora o sistema TNM do AJCC seja aplicável na
definição da extensão anatômica do câncer, os parâmetros patológicos e biológicos
referentes ao comportamento do tumor não são abordados (15).
1.5. Tratamento e prognóstico do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
O tratamento proposto para o CECP pode ser cirúrgico, radioterápico
quimioterápico ou uma combinação destas terapêuticas. A seleção do tratamento
para o paciente portador da doença está baseada em três fatores: localização e
estádio do tumor primário, as co-morbidades e a biologia do tumor (5,19,15).
O Instituto Nacional do Câncer (INCA/MS) propõe o tratamento de acordo
com os estádios da doença, que dependerá do local e extensão do tumor primário e
do grau de acometimento dos linfonodos cervicais (5).
A cirurgia constitui o tratamento padrão para o CECP, mas se encontra
limitada pela extensão anatômica do tumor e a preservação do órgão no qual a
lesão está localizada (5,15).
A radioterapia é um tratamento de ampla utilização em pacientes com CECP.
Entretanto, pode produzir alterações importantes na qualidade de vida desses
pacientes devido aos seus efeitos colaterais durante e após o tratamento (20). O
tratamento radioterápico pode ser integral ou um tratamento adjuvante para o CECP.
26
Existem relatos de que somente o tratamento radioterápico pode resultar em um
controle do tumor e com taxas de cura para estádios iniciais de câncer de glote,
base de língua e tonsilas (15).
O tratamento quimioterápico para o CECP está envolvido no cuidado paliativo
direcionado à doença localizada e em estado avançado (19). Para o Instituto
Nacional do Câncer (INCA/MS), a quimioterapia associada à radioterapia é
empregada nos casos mais avançados da doença, quando a cirurgia não é possível,
o que leva a um prognóstico desfavorável tendo em vista a impossibilidade de
controle total das lesões extensas (5).
O potencial de tratar os pacientes pela abordagem imunológica tem sido
empregado. A imunoterapia no tratamento de tumores aumenta a resposta imune
ativamente pela vacinação com células tumorais mortas ou com antígenos tumorais
e pela administração sistêmica de citocinas. A administração de anticorpos
antitumorais ou células T tumor-específicos correspondem à imunoterapia passiva
(20). Na literatura, tem sido relatado o uso de anticorpos monoclonais no tratamento
do CECP (15). O tratamento imunoterapêutico para o carcinoma epidermóide de
cavidade bucal tem sido utilizado anteriormente à cirurgia com admnistrações locais
de IL-2. Considera-se a existência de uma resposta clinicopatológica tumoral
induzida pela administração locorregional de interleucina (21).
O prognóstico para o CECP se encontra diretamente relacionado com o
estádio da doença e a resposta ao tratamento. Para o estabelecimento do
prognóstico, vários fatores são considerados: estadiamento TNM, graduação
histopatológica e localização anatômica do tumor, idade avançada, estado de saúde
geral e do sistema imunológico do paciente (22,15). Após três anos do término do
tratamento a cura e a sobrevida são possíveis de serem definidas. O indicador
27
prognóstico mais importante de recidiva é o estado dos linfonodos (N), seguido do
tamanho do tumor (T). Para os pacientes que apresentam a doença no estádio I (T1
N0) a probabilidade de controle da doença é superior a 90%. No estádio II (T2 N0) o
controle da doença supera 85% dos casos da doença. No estádio III (T1-2 N1, T3
N0-1) há uma variação de 50% a 75% de controle da doença na totalidade dos
casos. A sobrevida específica ao tumor, em três anos, é de 20% a 50% da totalidade
dos casos da doença no estádio VI (T1-4, N2-3 ou T4 N0) (5).
1.6. Aspectos imunológicos celulares antitumorais da imunidade adaptativa
relacionados ao carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
O sistema imune parece desempenhar um papel importante no
reconhecimento e destruição de células tumorais. Como postulado na década de 50
por Macfarlane Burnet, uma das funções fisiológicas do sistema imune é reconhecer
e destruir clones de células transformadas, antes que elas desenvolvam em
tumores, e de matar os tumores depois de formados (20). Células do sangue
periférico participam dos mecanismos relacionados à imunidade antitumoral e
desempenham um importante papel no desenvolvimento e proteção frente às
malignidades. Células malignas podem escapar da destruição imuno-mediada não
somente pela evasão imune de reconhecimento, mas também pela inibição direta
das defesas imunes antitumorais (15).
A seguir serão descritos aspectos imunológicos antitumorais relacionados aos
linfócitos T e aos linfócitos B, células alvo do estudo envolvidas na imunidade
adaptativa e os perfis específicos de resposta dessas células na presença do CECP.
28
1.6.1. Aspectos imunológicos antitumorais relacionados aos linfócitos T
A imunidade mediada por células é observada no sangue periférico,
linfonodos regionais e no tecido tumoral de pacientes com atividade inflamatória. O
envolvimento da subpopulação de linfócitos T com atividade citotóxica, expressando
o marcador CD8 (linfócitos TCD8
+
) na imunidade antitumoral parece ser um evento
já bem estabelecido. Essas células normalmente constituem a principal população
do infiltrado inflamatório em atividades imunológicas desencadeadas por antígenos
tumorais. Linfócitos T citotóxicos CD8
+
podem induzir a morte de células malignas,
após ativação mediada pela interação do seu receptor da célula T (TCR, T Cell
Receptor) com peptídeos derivados de proteínas celulares mutantes apresentadas
pela célula-alvo em associação com as moléculas do Complexo de
Histocompatibilidade Principal (CHP ou MHC, Major Histocompatibility Complex)
(23). Entretanto, Hadden (1997) demonstrou que pacientes com carcinoma de
células escamosas de cabeça e pescoço apresentaram uma particularidade em
relação à imunidade celular, com uma linfocitopenia associada à progressão da
doença (24). Esses resultados reforçam a idéia de que ainda há muito que se
esclarecer sobre os mecanismos imunológicos celulares antitumorais e o exato
envolvimento de linfócitos T na resposta imune antitumoral.
Apesar dos linfócitos T CD4
+
não serem citotóxicos, eles também
desempenham uma atividade fundamental na resposta imune antitumoral por
produzirem citocinas que contribuem para o desenvolvimento e ativação de linfócitos
T CD8
+
, além de cooperarem com macrófagos para a efetiva eliminação de células
cancerígenas (25,26). Linfócitos T CD4
+
ativados por antígenos tumorais podem
secretar interferon-γ
(IFN-γ), que induz o aumento da expressão de MHC de classe I
pela célula tumoral, tornando-a mais sensível à lise mediada pelos linfócitos T CD8
+
.
29
Entretanto, está demonstrada na literatura a necessidade de um maior entendimento
a respeito da indução da resposta imunológica das células T CD4
+
em pacientes
com CECP (27)
Snyderman e colaboradores (1991) demonstraram que linfócitos isolados do
infiltrado inflamatório apresentaram um menor número da subpopulação T CD4
+
em
comparação com linfócitos isolados do linfonodo e do sangue periférico de pacientes
com CECP. Essa maior razão CD4
+
/CD8
+
encontrada no linfonodo e sangue
periférico, em comparação com o infiltrado inflamatório tecidual pode estar
relacionada tanto com o enriquecimento de linfócitos T CD4
+
quanto com a
diminuição da subpopulação de linfócitos T CD8
+
. Esse desequilíbrio pode
comprometer a atividade imune antitumoral resultando em uma deficiente função
efetora citotóxica com conseqüente evolução do quadro patológico (28). Em outro
estudo, Snyderman e colaboradores (1989), analisando o perfil fenotípico de
linfócitos do infiltrado inflamatório de pacientes com CECP, observaram uma razão
de linfócitos T CD4
+
/CD8
+
maior que um (>1) em pacientes com metástases
cervicais, o que sugere um importante indicador de prognóstico (29).
Em estudo realizado com pacientes portadores de CECP (30), observou-se
uma significativa redução do número absoluto de linfócitos T CD3
+
, T CD4
+
e T CD8
+
no sangue periférico dos doentes, quando comparado aos indivíduos controle.
A habilidade do indivíduo em controlar a resposta imune frente aos danos
inflamatórios se deve aos mecanismos reguladores. Tem sido descrito que existem
vários tipos de células reguladoras, entretanto a população celular mais estudada
corresponde às células T CD4
+
CD25
HIGH
(31). As células T co-expressando o
marcador CD4 e altos níveis de CD25 (IL-2R), assim denominadas de células T
reguladoras, se caracterizam pela anergia em respostas a estímulos policlonais,
30
associada à elevada capacidade de suprimir a produção de citocinas, em especial a
IFN-γ
,
e a proliferação de células T CD4+ e T CD8+, através de um mecanismo
complexo de contato célula-célula (32).
1.6.2. Aspectos imunológicos antitumorais relacionados aos linfócitos B
Não diferentemente da população de linfócitos T, a participação de linfócitos B
na imunidade antitumoral ainda não está completamente elucidada. Acredita-se que
a relação dessa população celular na imunidade antitumoral esteja relacionada com
dois aspectos fundamentais: participação na ativação de linfócitos T e produção de
anticorpos, que são importantes mediadores da morte de células tumorais pela
ativação da citotoxicidade de células NK e de macrófagos. Os antígenos que
estimulam a resposta imune humoral são limitados a moléculas que não são
expressas em tecidos normais (33). Entretanto, um trabalho demonstrou que a
depleção de células B pode auxiliar a terapêutica, devido ao aumento da resposta
imune antitumoral em conseqüência da diminuição de IL-10, produzida por linfócitos
B, sendo essa uma importante citocina que regula a produção de IFN-γ (34). Ao
estudarem a desregulação das funções imunológicas em pacientes portadores de
CECP, Bose e colaboradores (2008) observaram um percentual de células B um
pouco menor nos pacientes portadores da doença em relação aos indivíduos sadios
(35).
As células B não possuem apenas um papel central na produção e
amplificação da resposta imune humoral. Estas células exercem também uma
função importante como células apresentadoras de antígenos favorecendo a
resposta imune mediada por células T (36).
31
Duas subpopulações de linfócitos B são identificadas no sangue periférico:
linfócitos B convencionais (CD19
+
CD5
-
) e linfócitos B1 (CD19
+
CD5
+
). Os linfócitos
B1 representam uma subpopulação de linfócitos B envolvida, principalmente, em
fenômenos de imunidade e produção de IgM, sendo suprimida por citocinas do tipo 1
(IFN-
γ
) e estimulada por citocinas do tipo 2 (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10) (37).
No CECP é importante considerar que o vírus Epstein-Barr (EBV) exerce
profundos efeitos sobre o aumento do número de linfócitos B in vitro. O vírus EBV é
um importante ativador de proliferação policlonal das células B, o que é
independente das células T, atuando assim nas células infectadas pelo mesmo. A
infecção pelo EBV está implicada como um dos fatores etiológicos para o
desenvolvimento do carcinoma epidermóide de nasofaringe (20).
Ressalta-se que pacientes portadores de tumores podem produzir anticorpos
contra vários antígenos tumorais. Entretanto, a capacidade dos anticorpos de
eliminarem células tumorais tem sido na maioria das vezes demonstrada in vitro, e
pouca evidência tem sido apresentada quanto à imunidade humoral específica
contra tumores (20). Ainda tem sido demonstrado que a indução da
imunossupressão pela presença de tumor maligno está correlacionada com a perda
de função dos linfócitos T e dos linfócitos B, proveniente de um mecanismo
molecular de modulação do sistema imune (38).
32
2.
Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar de forma descritivo-analítica o perfil imunofenotípico dos linfócitos do
sangue periférico em indivíduos portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço (CECP).
2.2. Objetivos Específicos
2.2.1. Caracterizar a freqüência de populações e subpopulações de linfócitos T;
2.2.2. Analisar a frequência de subpopulações de linfócitos B;
2.2.3. Analisar a freqüência de linfócitos T ativados;
2.2.4. Analisar a intensidade de expressão dos marcadores de ativação celular em
linfócitos;
2.2.5. Comparar, entre os grupos em estudo, os dados referentes às populações e
subpopulações linfocitárias.
33
3. JUSTIFICATIVA
Embora haja um grande número de trabalhos sobre imunofenotipagem celular
de leucócitos do sangue periférico envolvendo pacientes portadores de carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço, poucos analisam diversos marcadores
fenotípicos em um só estudo e apresentam dois grupos controles: negativos
(indivíduos sem hábitos de risco para CECP) e positivos (indivíduos com hábitos de
risco para CECP).
Diante da complexidade das interações imunológicas desencadeadas nos
indivíduos portadores de carcinoma de cabeça e pescoço, ainda são necessários
esclarecimentos mais detalhados a respeito das populações e subpopulações
celulares diretamente envolvidas nos mecanismos de resistência e morbidade da
doença.
Através da citometria de fluxo, com o uso de sistemas de análises mais
elaborados e protocolos experimentais mais atuais, é possível a análise simultânea
de um grande número de eventos, permitindo identificar e/ou caracterizar
populações e subpopulações de interesse, o que proporciona a obtenção de
informações adicionais relevantes para o conhecimento a cerca da imunologia
relacionada ao carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.
A investigação do fenótipo de leucócitos circulantes representa um importante
instrumento para a busca de informações relacionadas ao estado geral da
imunidade celular. Portanto, consideram-se de grande valor os estudos do fenótipo
celular no contexto ex vivo, para uma maior compreensão dos mecanismos imunes
associados às diferentes manifestações clínicas e cursos da doença em estudo.
34
A contribuição científica que esta pesquisa oferece é o conhecimento de
aspectos fenotípicos de células envolvidas na resposta imune adaptativa de
pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Considera-se
de grande interesse científico a busca de marcadores imunofenotípicos de
morbidade e prognóstico.
4. Casuística e métodos
4.1. Tipo de estudo
Trata-se de um estudo descritivo, analítico, transversal, realizado entre julho
de 2007 a janeiro de 2009, envolvendo as seguintes instituições: Universidade
Estadual de Montes Claros – UNIMONTES, Centro de Pesquisas René-Rachou –
FIOCRUZ/Belo Horizonte, Santa Casa de Misericórdia de Montes Claros e
Fundação de Saúde Dilson de Quadros Godinho.
4.2. Casuística
4.2.1. Cálculo do tamanho amostral
A amostra foi estimada através de uma amostragem de conveniência, em que
todos os pacientes portadores de CECP que obedecessem aos critérios de inclusão
e exclusão (detalhados em itens posteriores), surgidos durante o tempo estimado
para as coletas de material e dados clínicos com início em julho de 2007 e
finalização em setembro de 2008. O número de indivíduos controle foi obtido pela
maior aproximação possível ao número de pacientes portadores de CECP incluídos
no estudo, pareados segundo ausência ou ocorrência dos hábitos tabagista e
etilista.
35
4.2.2. Descrição da casuística
O estudo compreendeu três grupos de indivíduos, totalizando 43
participantes, incluídos de acordo com a seguinte distribuição:
1. Pacientes: 24 portadores de CECP, provenientes da Santa Casa de
Misericórdia de Montes Claros e da Fundação de Saúde Dílson de Quadros
Godinho, identificados como doentes (grupo = D);
2. Controles positivos: 11 indivíduos assintomáticos para CECP e sem sinais
clínicos de outra enfermidade, portadores de hábitos de risco para a doença (grupo
= NDH – Não Doentes com Hábitos);
3. Controles negativos: 08 indivíduos assintomáticos para CECP e sem sinais
clínicos de outra enfermidade, não portadores de hábitos de risco para a doença
(grupo = ND – Não Doentes);
4.2.3. Critérios de inclusão e exclusão
São critérios de inclusão a todos os grupos: idade superior a 18 anos,
indivíduos de ambos os sexos, concordância em participar do estudo após leitura e
assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.
São critérios de exclusão pertencentes a todos os grupos: idade inferior a 18
anos e não concordância em participar do estudo.
A – Participantes do grupo D:
Critérios de inclusão:
- Indivíduo portador de CECP com confirmação do diagnóstico, após realização de
biópsia e obtenção dos dados histopatológicos.
- Indivíduo portador de CECP que ainda não tenha sido submetido a nenhum tipo de
tratamento prévio à realização de coleta de material.
36
Critérios de exclusão:
- Critérios comuns a todos os grupos, acima descritos.
B – Participantes do grupo NDH:
Critérios de inclusão:
- Indivíduos saudáveis.
- Indivíduos que tenham sido submetidos à consulta médica e/ou odontológica por
um período igual ou inferior a 1 (um) ano.
- Indivíduos portadores de hábitos de risco para o CECP (tabagismo e/ou etilismo).
Critérios de exclusão:
- Critérios comuns a todos os grupos, acima descritos.
C – Participantes do grupo ND:
Critérios de inclusão:
- Indivíduos saudáveis.
- Indivíduos que tenham sido submetidos à consulta médica e/ou odontológica por
um período igual ou inferior a 1 (um) ano.
- Indivíduos não portadores de hábitos de risco para o CECP (tabagismo e/ou
etilismo).
Critérios de exclusão:
- Critérios comuns a todos os grupos, acima descritos.
4.2.4. Caracterização da casuística
O perfil epidemiológico da amostra foi abordado, através do registro de dados
epidemiológicos relevantes a cada grupo em estudo.
37
4.2.4.1. Características referentes a todos os grupos
A amostra envolvida no estudo compreendeu um total de 43 indivíduos, cujos
dados epidemiológicos referentes à idade e gênero, se encontram sumarizados na
tabela 1. O grupo D foi constituído por 24 pacientes, 22 pertencentes ao gênero
masculino (91,7%) e 2 pertencentes ao gênero feminino (8,3%). A idade variou entre
28 e 75 anos, com média de 55,8 anos. No grupo NDH constituído de 11 indivíduos,
verificou-se 4 indivíduos do gênero masculino (36,4%) e 7 indivíduos do gênero
feminino (63.6%), com média de idade de 38,4 anos. Em relação ao grupo ND, dos 8
indivíduos incluídos neste grupo, 3 pertencem ao gênero masculino (37,5%) e 5
pertencem ao gênero feminino (62,5%), sendo que a idade variou entre 21 a 51 anos
com média de 35,9 anos.
A variável cor/raça não foi considerada pala dificuldade de caracterização e
pouca relevância para o presente estudo, uma vez que não se encontra entre os
objetivos do estudo a correlação entre dados epidemiológicos e os resultados da
imunofenotipagem celular. .
Tabela 1 – Dados epidemiológicos referentes aos grupos em estudo
Gênero
Grupos n
M
n (%)
F
n (%)
Idade
#
Mediana Variação
D 24 22 (91,7)
02 (08,3) 55,8 (28-75)
NDH 11 04 (36,4)
07 (63,6) 38,4 (26-45)
ND
08
03 (36,7)
05 (62,5)
35,9 (21-51)
D= doentes; NDH= não doentes e portadores de hábitos de risco para o CECP; ND= não doentes e não
portadores de hábitos de risco para o CECP; M= masculino; F= feminino; # mediana e variação (em anos).
38
4.2.4.2. Características particulares ao grupo D
O grupo D relativo aos indivíduos portadores da doença apresentou dados
epidemiológicos descritos na tabela 2, que demonstra ainda os principais hábitos de
risco para o CECP.
Tabela 2 – Dados epidemiológicos referentes ao grupo D
Epidemiologia
Grupo D
n %
Hábito tabagista (fumantes) 16 66,7
Hábito tabagista (ex-fumantes) 08 33,3
Hábito etilista (etilistas) 13 54,2
Hábito etilista (ex-etilistas) 11 45,8
D= doentes.
O tempo decorrido entre o abandono dos hábitos de beber e de fumar e a
data da coleta de dados para a pesquisa variou entre 2 a 16 anos e entre 3 a 8 anos,
respectivamente.
O hábito tabagista e o hábito etilista referentes aos indivíduos pertencentes ao
grupo D foram registrados considerando-se ainda o tempo de consumo do tabaco
(tabela 3) e o tempo de consumo da bebida alcoólica (tabela 4).
Tabela 3 – Dados epidemiológicos referentes ao grupo D
Tempo de consumo do tabaco
Grupo D
n %
Abaixo de 5 anos 0 0
Entre 5 e 10 anos 02 08,3
Entre 10 e 15 anos
0 0
Entre 15 e 20 anos 01 04,2
Acima de 20 anos 21 87,5
Total 24 100,0
D= doentes.
39
Tabela 4 – Dados epidemiológicos referentes ao grupo D
Tempo de consumo da bebida alcoólica
Grupo D
n %
Abaixo de 5 anos 0 0
Entre 5 e 10 anos 02 08,3
Entre 10 e 15 anos
01 04,2
Entre 15 e 20 anos
0 0
Acima de 20 anos 21 87,5
Total 24 100,0
D= doentes.
A tabela 5 descreve a localização das lesões de CECP identificadas nos
indivíduos do grupo D, após a realização do diagnóstico.
Tabela 5 – Localização das lesões de CECP referente ao grupo D
Localização do CECP
Grupo D
n %
Cavidade oral 18 75,0
Orofaringe 04 16,7
Hipofaringe 0 0
Laringe 02 08,3
Nasofaringe 0 0
Seios paranasais 0 0
Total 24 100,0
D= doentes
Durante o registro da localização das lesões de CECP, um indivíduo
apresentou a doença localizada na cavidade oral acometendo em adição a região
de nasofaringe e seios paranasais (T4 N2 MX), classificada como lesão de cavidade
oral na tabela 5 acima.
40
O estadiamento da doença (tabela 6) foi definido através dos dados TNM
obtidos no momento do diagnóstico, de acordo com o Sistema de Estadiamento de
Malignidades do AJCC e INCA/MS (17,5), descritos anteriormente.
Tabela 6 – Estadiamento do CECP referente ao grupo D
Estadiamento do CECP
Grupo D
n %
Estadio I
(T1 N0 M0)
02 08,3
Estadio II
(T2 N0 M0)
04 16,7
Estadio III
(T3 N0 M0, T1 N1 M0, T2 N1 M0, T3 N1
M0)
06 25,0
Estadio IV
(T4 N0 M0, T4 N1 M0, T1 N2 M0, T2 N2 M0,
T3 N2 M0, T4 N2 M0)
12 50,0
Total 24 100,0
D= doentes.
4.2.4.3. Características relativas ao grupo NDH
Os dados epidemiológicos e fatores de risco para o CECP, referentes ao
grupo NDH, estão descritos na tabela 7.
Tabela 7 – Dados epidemiológicos referentes ao grupo NDH
Epidemiologia
Grupo NDH
n %
Hábito tabagista (fumantes) 09 81,8
Hábito tabagista (não fumantes) 02 18,2
Hábito etilista (etilistas) 10 90,9
Hábito etilista (não etilistas) 01 09,1
NDH= não doentes e portadores de hábitos de risco para o CECP
O tempo de consumo do tabaco e o tempo de consumo da bebida alcoólica
relacionados ao grupo NDH foram registrados e encontram-se relacionados nas
41
tabelas 8 e 9. Dois (n=2) indivíduos deste grupo não fizeram uso do tabaco, e um
(n=1) indivíduo do mesmo grupo relatou nunca ter consumido bebida alcoólica.
Tabela 8 – Dados epidemiológicos referentes ao grupo NDH
Tempo de consumo do tabaco
Grupo NDH
n %
Abaixo de 5 anos 01 0
Entre 5 e 10 anos 02 18,2
Entre 10 e 15 anos
0 0
Entre 15 e 20 anos 01 9,1
Acima de 20 anos 05 45,5
Total 09 81,8
NDH= não doentes e portadores de hábitos de risco para o CECP
Tabela 9 – Dados epidemiológicos referentes ao grupo NDH
Tempo de consumo da bebida alcoólica
Grupo NDH
n %
Abaixo de 5 anos 0 0
Entre 5 e 10 anos 02 18,2
Entre 10 e 15 anos
03 27,3
Entre 15 e 20 anos
03 27,3
Acima de 20 anos 02 18,2
Total 10 90,9
NDH= não doentes e portadores de hábitos de risco para o CECP
4.3. Métodos
4.3.1. Aquisição de dados epidemiológicos, dados clínicos e amostras de
sangue
Uma entrevista foi realizada pelo pesquisador, previamente à coleta das
amostras de sangue, diretamente com os indivíduos que concordaram em participar
42
do estudo após a leitura e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.
A partir desta entrevista foram obtidos, além da verificação do preenchimento dos
critérios de inclusão e exclusão, os dados epidemiológicos e os dados clínicos de
acordo com o grupo em estudo, conforme descrito anteriormente.
A coleta das amostras de sangue foram realizadas por um profissional de
análises clínicas devidamente qualificado. A coleta de sangue do grupo D foi
realizada nos próprios hospitais já referidos após a consulta médica dos pacientes.
Os indivíduos pertencentes aos grupos ND e NDH foram submetidos à coleta de
sangue em ambiente hospitalar em sala própria destinada a coletas de material
biológico do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário Clemente
Faria. Uma amostra de 5mL de sangue total através da punção venosa em veia
periférica de cada participante do estudo, em tubos contendo EDTA como
anticoagulante, a partir da qual o protocolo foi desenvolvido.
Após a coleta, as amostras de sangue foram encaminhadas para o
Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário Clemente Faria para
realização do hemograma (dados não incluídos nessa dissertação). Em seguida,
estas amostras foram transportadas até o Laboratório de Pesquisa em Saúde, do
mesmo hospital, para a realização da imunofenotipagem de linfócitos do sangue
periférico.
4.3.2. Análise do fenótipo celular em linfócitos do sangue periférico
Os ensaios de imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico foram
realizados segundo protocolo proposto pelo fabricante, modificado conforme descrito
a seguir:
43
Em tubos de poliestireno 12x75mm, foram adicionados 15µL da diluição
constituída pelo anticorpo monoclonal específico para o marcador de superfície
celular de interesse marcado com o fluorocromo, diluído em PBS (0,015M pH7,4),
nas concentrações descritas (Tabela 10). Combinações específicas de anticorpos
monoclonais marcados com fluorocromos distintos foram utilizadas para a análise
simultânea de marcadores de superfície celular necessários para a caracterização
de subpopulações celulares de interesse. Para cada combinação de anticorpos
monoclonais, foram adicionadas alíquotas de 100µL de sangue periférico total
coletado em EDTA. Após homogeinização em vórtex, as preparações foram
encubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após o
período d incubação , as amostras foram submetidas à lise dos eritrócitos, utilizando-
se 2ml de solução de lise comercial (FACS
®
Lysing solution – Becton Dickson)
diluída 10 vezes em água destilada. Após nova homogeneização em vórtex, as
preparações foram incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente e então
submetidas à centrifugação (7min-1300rpm-18
0
C). O sobrenadante foi descartado
por inversão e as amostras foram lavadas com 2ml de PBS (0,05M pH 7,4),
empregando-se as mesmas condições de centrifugação supracitadas e descarte do
sobrenadante por inversão. Numa etapa final, os leucócitos foram fixados com
200µL de solução fixadora (10g/L de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio,
6,67g/L de cloreto de sódio, pH7,2). Após fixadas, as amostras foram
acondicionadas em condições ideais de temperatura e armazenamento em caixas
de isopor contendo gelo em seu interior com os tubos devidamente fechados e
dispostos em estantes próprias, para o transporte até o Instituto René
Rachou/FIOCRUZ-BH. A leitura dos parâmetros fenotípicos e morfométricos das
células presentes em cada tubo por imunofluorescência foi realizada com o auxílio
44
do um citômetro de fluxo (FACScalibur
®
– Becton Dickson), utilizando-se o programa
CELLQuest
®
para aquisição e análise dos dados empregando diferentes estratégias,
conforme descrito nos próximos itens.
Tabela 10 – Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações
e subpopulações linfocitárias e moléculas de superfície.
Anticorpos
Diluição em
PBS*
Fluorocromo
Clone
Células Alvo
Anti-CD3 1:10 FITC
2
UCHT1 Linfócitos T
Anti-CD4 1:5, 1:20 FITC
2
, PE
3
RPA-T4,S3.5 Linfócitos T auxiliares
Anti-CD5 1:5 FITC
3
L17F12 Linfócitos B1
Anti-CD8 1:64 TC
3
RPA-T8 Linfócitos T citotóxicos
Anti-CD18 1:5 FITC YF118.3 Linfócitos T ativados
Anti-CD19 1:5, 1:8 PE
3
, TC 4G7, SJ25-C1 Linfócitos B
Anti-CD25 1:5 PE
3
3G10 Linfócitos T reguladores
Anti-CD28 1:5 FITC 15E8 Linfócitos T ativados
Anti-CD38 1:5 PE AT13/5 Linfócitos T ativados
Anti-CD62L 1:5 FITC DREG-56 Linfócitos T ativados
Anti-HLA-DR
1:10 PE
4
Tü36 Linfócitos T ativados
*(0,015M pH 7,4); Fabricante:
1
Sigma;
2
BD Pharmigen;
3
Caltag;
4
Serotec;
Para alcançar os objetivos propostos descritos anteriormente, foram traçados tópicos
de investigação visando à ordenação da metodologia de pesquisa:
A) Caracterização da freqüência de populações e subpopulações de linfócitos do
sangue periférico envolvidos na resposta imune adaptativa:
A.1. Populações de linfócitos:
- linfócitos T, linfócitos B
A.2. Subpopulações de linfócitos T:
- T CD4
+
, T CD8
+
45
A.3. Subpopulações de linfócitos B
- linfócitos B convencionais (B2) e linfócitos B não convencionais (B1)
B) Análise do percentual de linfócitos T ativados pela avaliação de marcadores de
ativação:
B.1. Expressão de HLA-DR em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
B.2. Expressão de CD18 em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
B.3. Expressão de CD28 em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
B.4. Expressão de CD38 em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
B.5. Expressão de CD62L em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
C) Análise da regulação da resposta imune em linfócitos:
C.1. Freqüência de células T reguladoras:
- linfócitos T CD4
+
CD25
HIGH
D) Análise da razão entre o percentual de populações de linfócitos:
D.1. Razão entre linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
(razão CD4
+
/CD8
+
)
D.2. Razão entre linfócitos T e linfócitos B convencionais (razão CD3
+
/CD19
+
)
4.3.3. Estratégias de análises dos dados
Os dados obtidos através da imunofenotipagem dos leucócitos do sangue
periférico foram analisados através de diversas estratégias, dependendo do fenótipo
celular a ser analisado. Assim, empregando-se os recursos múltiplos do programa
46
CELLQuest
®
, foram adotadas diferentes estratégias para análise fenotípica,
baseadas em propostas disponíveis na literatura vigente, denominadas: análise
convencional (39); análise de células T reguladoras (32); análise combinada “gated”
(39).
Ressalta-se que esta análise foi feita em caráter cego, desconhecendo, o
pesquisador, as características dos indivíduos avaliados. Cada análise foi reavaliada
por um segundo pesquisador (orientador) e as discordâncias criticamente
reavaliadas. Segue abaixo a descrição a título de ilustração:
4.3.3.1. Análise convencional
A análise convencional foi realizada segundo proposto por Satlher-Avelar
(2003) (39). A figura 1 ilustra a seqüência de passos para a análise convencional.
Este tipo de análise consiste na seleção da população celular de interesse baseada
em aspectos morfométricos, realizada através de gráficos de distribuição pontual de
tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (figura 1A). Após a seleção da região de
interesse (R1), o percentual de subpopulações celulares fluorescentes, dentro da
população selecionada, foi obtido em gráficos bidimensionais de distribuição pontual
de fluorescência, incluindo as modalidades FL1 versus FL2, FL2 versus FL3 ou FL1
versus FL3 (figura 1B).
47
FL3/CD19
FL2/CD5
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
82.38% 0.37%
2.57%14.69%
Figura 1 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de populações celulares por
citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população de interesse, nesse
caso linfócitos pequenos – R1. (B) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o
percentual das populações ou subpopulações celulares específicas, confinadas em R1.
4.3.3.2. Análise de células T reguladoras
A análise de células T reguladoras foi realizada segundo método proposto por
Baecher-Allan et al, (2001) (32). A figura 2 ilustra a seqüência de procedimentos
para a análise de células T reguladoras com fenótipo CD4
+
CD25
HIGH
. Após a seleção
da região de interesse (R1), baseada em aspectos morfométricos, realizada através
de gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC)
(figura 2A), gráficos de FL1/CD4 versus FL2/CD25 foram construídos, permitindo
identificar a segregação da população CD4
+
em 3 subpopulações: CD4
+
CD25
-
(R2),
CD4
+
CD25
LOW
(R3) e CD4
+
CD25
HIGH
(R4). A fração celular confinada em R4
representa o valor percentual de células T reguladoras na população de linfócitos
totais (figura 2B).
48
FL1/CD4
FL2/CD25
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
1.98%
25.74%
23.37%
R2
R3
R4
Figura 2 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de células T reguladoras
(CD4+CD25
HIGH
) por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população de interesse, nesse
caso linfócitos pequenos – R1. (B) Gráfico de distribuição pontual FL1/CD4 versus FL2/CD25 utilizado para
quantificar o percentual de células T reguladoras (CD4+CD25
HIGH
), confinadas em R4.
4.3.3.3. Análise combinada “gated”
As análises de células CD4
+
e CD8
+
ativadas (HLA-DR
+
) foram realizadas
segundo proposto por Sathler-Avelar (2003) (39). A figura 3 ilustra a seqüência de
procedimentos para a análise das subpopulações de células T ativadas. Após a
seleção da região de interesse, baseada em aspectos morfométricos, realizada
através de gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade
(SSC) (figura 3A), foram construídos histogramas individuais de FL1/CD4 ou
FL1/CD8, onde uma nova região R2 foi construída, confinando a população CD4
+
ou
CD8
+
(figura 3B). O próximo passo consiste na combinação das regiões R1 e R2
através da fórmula “G2=R1 and R2”, onde “and” designa a interseção dos eventos
presentes simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, histogramas unidimensionais
de FL2/HLA-DR, contendo as células presentes em G2, foram utilizados para
quantificar os percentuais das subpopulações CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+
ou CD8
+
HLA-
DR
+
/CD8
+
(figura 3C).
49
A
Tamanho
Granulosidade
R1
B
C
FL1/ CD4
Nº de células
FL2/ HLA-DR
Nº de células
11.78%
Figura 3 - Seqüência de passos utilizados para as análises de subpopulações de células T CD4+ ou CD8+
ativadas (HLA-DR+) por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população de interesse, nesse
caso linfócitos pequenos – R1. (B) Histogramas individuais de FL1/CD4 ou FL1/CD8, onde uma nova região R2
será construída, confinando a população CD4
+
ou CD8
+
. (C) Após a combinação das regiões R1 e R2 através da
fórmula “G2=R1 and R2”, onde “and” designa a interseção dos eventos presentes simultaneamente em R1 e R2,
histogramas unidimensional de FL2/HLA-DR, contendo as células presentes em G2, serão utilizados para
quantificar os percentuais das subpopulações CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+
ou CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+
.
4.3.4. Análise estatística
As análises estatísticas dos dados provenientes da imunofenotipagem de
leucócitos do sangue periférico foram realizadas através do programa GrafhPad
Software – Prism 3.0. Para comparação entre grupos foi empregado o teste não-
paramétrico Kruskal-Wallis, seguido do pós-teste de Dunns. As diferenças foram
consideradas estatisticamente significantes quando p<0.05.
50
4.3.5. Aspectos éticos
A pesquisa foi conduzida de acordo com os preceitos determinados pela
resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde e de acordo com o Código de
Ética Médica.O início dos trabalhos de coleta de material (sangue e informações
clínicas) foi realizado mediante a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos da Universidade Estadual de Montes Claros –
UNIMONTES: Parecer Consubstanciado N
o
. 739/07.
A participação dos indivíduos
portadores de CECP e dos indivíduos sadios, no presente estudo, foi realizada de
forma voluntária após a leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido.
51
5. Resultados
Os resultados do estudo encontram-se descritos em duas partes: a primeira
parte compreende os resultados da imunofenotipagem de linfócitos por citometria de
fluxo e a segunda parte corresponde à inserção do artigo científico que intitula-se:
“AN INCREASE IN PERCENTUAL OF ACTIVATED CD8+ T LYMPHOCYTES IS
ACOMPAINED OF ELEVETED LEVELS OF CD4+CD25
HIGH
REGULATORY T
CELLS IN HEAD AND NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA (HNSCC).”
5.1. Resultados da imunofenotipagem de linfócitos por citometria de fluxo
Cabe esclarecer inicialmente, que não foi objetivo desse estudo fazer uma
correlação entre dados epidemiológicos e clínicos dos indivíduos incluídos no estudo
com as análises imunofenotípicas. Entretanto, esse aspecto será devidamente
abordado em artigos científicos complementares dessa dissertação.
Os resultados obtidos através das estratégias de análises da
imunofenotipagem dos linfócitos do sangue periférico encontram-se apresentados
conforme descrito em material e métodos. A exposição através de gráficos torna a
exposição dos dados mais clara e objetiva. Nos gráficos, as letras a e b localizadas
acima da representação dos grupos em estudo têm por objetivo demonstrar que
houve diferença estatisticamente significativa de um grupo específico (marcado com
a letra a ou com a letra b) em relação ao grupo ND (letra a), ou em relação ao grupo
NDH (letra b).
Para as análises de todas as comparações foi empregado o teste não-
paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido por pós-teste de Dunns, visto que os dados
analisados não preencheram as suposições exigidas para distribuição normal.
52
5.1.1. Freqüência de populações e subpopulações linfocitárias do
sangue periférico em cada grupo
A) Estudo da freqüência da população e subpopulações de linfócitos do sangue
periférico:
A análise dos resultados referentes à freqüência de linfócitos T circulantes
(CD3
+
) revelou que não houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos em estudo (p=0,9121) (figura 4 ).
Figura 4 - Análise do percentual de linfócitos T circulantes em cada grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatiscamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: ND x
NDH, ND x D, NDH x D – (p>0,05).
0
50
100
ND
NDH
D
Grupos
% Linfócitos T CD3+
P=0,9121*
0
50
100
ND
NDH
D
Grupos
% Linfócitos T CD3+
P=0,9121*
53
B) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T:
A análise do percentual de linfócitos T auxiliares (CD4
+
) mostrou que não
houve diferença significativa entre os grupos analisados (p=0,2113) (figura 5A).
Entretanto foi observado um aumento significantivo referente ao percentual de
linfócitos T citotóxicos (CD8
+
) no grupo D em relação ao grupo NDH (p=0,0093)
(figura 5B). A análise dos resultados da razão entre linfócitos T auxiliares e linfócitos
T citotóxicos (razão CD4
+
/CD8
+
) entre os grupos do estudo demonstrou diferença
significativa entre os grupos NDH e ND (p=0,0226) (figura 6).
A B
Figura 5 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares (A) e de linfócitos T citotóxicos (B) no
sangue periférico em cada grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: –
ND x NDH, ND x D, NDH x D p>0,05 (% células T CD4
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: NDH x D - p<0,05 (% células T CD8
+
).
P=0,2113*
0
50
100
ND
NDH
D
Grupos
% Linfócitos T CD4+
0
25
50
ND
NDH
D
Grupos
% Linfócitos T CD8+
b
P=0,0093*
P=0,2113*
0
50
100
ND
NDH
D
Grupos
% Linfócitos T CD4+
0
25
50
ND
NDH
D
Grupos
% Linfócitos T CD8+
b
P=0,0093*
54
Figura 6 - Análise da razão entre linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos no sangue periférico
em cada grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatiscamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NDH x
ND – (p<0,05).
C) Análise da freqüência de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
):
Os resultados referentes à análise de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
)
no sangue periférico, revelaram um aumento significativo no grupo D comparado ao
grupo ND (p=0,0178) (figura 7).
0
2.5
5
P=0,0226*
ND
NDH
D
Grupos
Razão CD4+ / CD8+
a
0
2.5
5
P=0,0226*
ND
NDH
D
Grupos
Razão CD4+ / CD8+
a
55
Figura 7 - Análise do percentual de células T reguladoras (células T CD4
+
CD25
HIGH
) do sangue
periférico por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
ND x D - p<0,05 (%CD4
+
CD25
HIGH
).
D) Análise do percentual de subpopulações de linfócitos B na população de linfócitos
totais do sangue periférico:
Os resultados do percentual de células B convencionais e linfócitos B1 na
população de linfócitos totais circulantes, mostraram que em relação aos linfócitos B
convencionais (CD19
+
CD5
-
) houve uma diminuição estatisticamente significativa no
grupo D em relação em relação aos grupos ND e NDH (p=0,0002) (figura 8A). Em
relação aos linfócitos B não convencionais (B1 CD19
+
CD5
+
), os resultados
mostraram também uma redução do percentual dessas células no grupo D em
relação ao grupo ND (p=0,0025) (figura 8B).
Grupos
% CD4+CD25+ / CD4+
0
10
20
P=0,0178*
a
ND
NDH
D
56
A B
Figura 8 - Análise do percentual de linfócitos B convencionais (A) e linfócitos B1 (B) circulantes e
linfócitos B totais no sangue periférico por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
ND x D, NDH x D - p<0,05 (%CD19
+
CD5
-
/CD19
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis,
pós-teste de Dunns: ND x D - p<0,05 (%CD19
+
CD5
+
/CD19
+
).
E) Análise da razão entre linfócitos T e linfócitos B circulantes:
O resultado da análise da razão entre linfócitos T (CD3+) e linfócitos B
(CD19+) no sangue periférico, revelou um aumento significativo dessa razão no
grupo D em relação a ambos os grupos controle: ND e NDH (p=0,0005) (figura 9).
Grupos
% CD19+CD5-
0
10
20
P=0,0002*
a,b
Grupos
% CD19+CD5+
0
2.5
5
P=0,0025*
a
ND
NDH
D
ND
NDH
D
57
Figura 9 - Análise da razão entre linfócitos T e linfócitos B circulantes em cada grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
ND x D, NDH x D - p<0,05.
5.1.2. Estudo da freqüência de linfócitos ativados e da expressão de moléculas
de ativação e adesão celular em populações e subpopulações linfocitárias do
sangue periférico em cada grupo
A) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR
+
):
A análise do percentual de células T ativadas (HLA-DR
+
) nas subpopulações
de linfócitos T CD4
+
e linfócitos T CD8
+
mostrou um aumento significativo no grupo D
em relação ao grupo controle ND, tanto para análise de linfócitos T CD4
+
HLA-DR
+
(p=0,0149) (figura 10A), quanto para análise de linfócitos T CD8
+
HLA-DR
+
(p=0,0213) como demonstrado na figura 10B) .
Grupos
Razão CD3+ / CD19+
0
20
40
P=0,0005*
ND
NDH
D
a,b
58
A B
Figura 10 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados e linfócitos T citotóxicos ativados
circulantes por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: ND X D
– p<0,05 (%CD4
+
HLA-DR/CD4
+
) e p<0,05 (%CD8
+
HLA-DR/CD8
+
).
A título de esclarecimento, vale ressaltar que quando possível foi também
analisada a intensidade de expressão de alguns marcadores de ativação na
superfície celular.
B) Expressão da molécula HLA-DR em linfócitos T auxiliares e linfócitos T
citotóxicos:
Em relação à intensidade de expressão da molécula HLA-DR na superfície de
linfócitos T, foi observada uma diferença estatisticamente significativa entre os
grupos ND e D, tanto para as células T CD4
+
HLA-DR
+
(p=0,0260) (figura 11A) como
para as células T CD8+HLA-DR+ (p=0,0361) (figura 11B).
0
7.5
15
ND
NDH
D
Grupos
% CD4+HLA-DR+ / CD4+
P=0,0149*
a
0
7.5
15
ND
NDH
D
Grupos
P=0,0213*
a
% CD8+HLA-DR+ / CD8+
0
7.5
15
ND
NDH
D
Grupos
% CD4+HLA-DR+ / CD4+
P=0,0149*
a
0
7.5
15
ND
NDH
D
Grupos
P=0,0213*
a
% CD8+HLA-DR+ / CD8+
59
A B
Figura 11- Análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos T auxiliares ativados (A) e em
linfócitos T citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: ND X D
– p<0,05 (%CD4
+
HLA-DR/CD4
+
) e p<0,05 (%CD8
+
HLA-DR/CD8
+
).
C) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (CD18
+
):
Os percentuais de linfócitos T CD4
+
CD18
+
e T CD8
+
CD18
+
na população de
linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
, respectivamente, foram analisados. Os resultados não
mostraram diferença estatisticamente significativa entre os grupos em estudo em
relação aos linfócitos T CD4
+
CD18
+
(p=0,8635) (figura 12A). Entretanto observou-se
um aumento no percentual de linfócitos T CD8+CD18+ circulantes no grupo D em
comparação com o grupo ND (p=0,0170) (figura 12B).
P=0,0361*
0
80
160
ND
NDH
D
Grupos
Expressão de HLA-DR em Linfócitos
T CD4+
P=0,0260*
a
0
2500
5000
ND
NDH
D
Grupos
Expressão de HLA-DR em Linfócitos
T CD8+
a
P=0,0361*
0
80
160
ND
NDH
D
Grupos
Expressão de HLA-DR em Linfócitos
T CD4+
P=0,0260*
a
0
2500
5000
ND
NDH
D
Grupos
Expressão de HLA-DR em Linfócitos
T CD8+
a
60
A B
Figura 12 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados (A) e do percentual de linfócitos T
citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: ND
x NDH, ND x D, NDH x D - p>0,05 (%CD4
+
CD18
+
/CD4
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: ND x D - p<0,05 (%CD8
+
CD18
+
/CD8
+
).
D) Expressão da molécula CD18 em linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos:
A análise dos resultados da expressão da molécula CD18 em linfócitos T
auxiliares (células CD4
+
CD18
+
) mostrou que não houve diferença significativa entre
os grupos em estudo (p=0,0791) (figura 13A). Entretanto, em linfócitos T citotóxicos
houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos ND e D (p=0,0114),
quando observado o resultado da análise da expressão da molécula CD18 nestas
células (figura 13B).
0
7.5
15
ND
NDH
D
Grupos
% CD4+CD18+ / CD4+
P=0,8635*
0
15
30
ND
NDH
D
Grupos
% CD8+CD18+ / CD8+
a
P=0,0170*
0
7.5
15
ND
NDH
D
Grupos
% CD4+CD18+ / CD4+
P=0,8635*
0
15
30
ND
NDH
D
Grupos
% CD8+CD18+ / CD8+
a
P=0,0170*
61
A B
Figura 13 - Análise da expressão da molécula CD18 em linfócitos T auxiliares ativados (A) e em
linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
ND x NDH, ND x D, NDH x D - p>0,05 (%CD4
+
CD18
+
/CD4
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: ND x D - p<0,05 (%CD8
+
CD18
+
/CD8
+
).
E) Estudo da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (CD38
+
):
A análise dos resultados não identificou diferença significativa no percentual
de linfócitos T CD4
+
expressando a molécula CD38 (linfócitos T CD4
+
CD38
+
) entre
os grupos avaliados (p=0,4002) (figura 14A). Com relação ao percentual de linfócitos
T CD8
+
que expressaram a molécula CD38 (linfócitos T CD8
+
CD38
+
) houve
diferença significativa entre os grupos ND e D (p=0,0013), quando os dados foram
analisados (figura 14B).
Grupos
0
250
500
Expressão de CD18 em Linfócitos
T CD4+
ND
NDH
D
P=0,0791*
0
1000
2000
Expressão de CD18 em Linfócitos
T CD8+
ND
NDH
D
Grupos
P=0,0114*
a
Grupos
0
250
500
Expressão de CD18 em Linfócitos
T CD4+
ND
NDH
D
P=0,0791*
0
1000
2000
Expressão de CD18 em Linfócitos
T CD8+
ND
NDH
D
Grupos
P=0,0114*
a
62
A B
Figura 14 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares ativados (A) e do percentual de linfócitos T
citotóxicos ativados (B) circulantes por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: ND
x NDH, ND x D, NDH x D - p>0,05 (%CD4
+
CD38
+
/CD4
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: ND x D - p<0,05 (%CD8
+
CD38
+
/CD8
+
).
F) Expressão da molécula CD38 em linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos:
O resultado da análise da expressão da molécula CD38 nas subpopulações
de linfócitos T revelou que não houve diferença significativa entre os grupos em
estudo quanto às células CD4
+
CD38
+
(p=0,9119) (figura 15A). Entretanto, uma
diferença estatisticamente significativa foi observada entre os grupos ND e D em
relação à expressão da molécula CD38 em linfócitos T citotóxicos (células
CD8
+
CD38
+
) (p=0,0164) (figura 15B).
Grupos
0
10
20
ND
NDH
D
% CD4+CD38+ / CD4+
P=0,4002*
0
25
50
P=0,0013*
a
ND
NDH
D
Grupos
% CD8+CD38+ / CD8+
Grupos
0
10
20
ND
NDH
D
% CD4+CD38+ / CD4+
P=0,4002*
0
25
50
P=0,0013*
a
ND
NDH
D
Grupos
% CD8+CD38+ / CD8+
63
A B
Figura 15 - Análise da expressão da molécula CD38 em linfócitos T auxiliares ativados (A) e em
linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
ND x NDH, ND x D, NDH x D - p>0,05 (%CD4
+
CD38
+
/CD4
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: ND x D - p<0,05 (%CD8
+
CD38
+
/CD8
+
).
G) Análise do percentual de linfócitos T expressando a molécula CD28:
A análise dos resultados identificou diferença significativa no percentual de
linfócitos T CD4
+
CD28
+
entre os grupos ND e D (p=0,0338) (figura 16A). Em relação
à expressão da molécula CD28
+
em linfócitos T CD8
+
observou-se que não houve
diferença significativa entre os grupos (p=0,2466) (figura 16B), quando analisados
estatisticamente.
0
250
500
P=0,9119*
Expressão de CD38 em Linfócitos
T CD4+
ND
NDH
D
Grupos
0
2000
4000
P=0,0164*
Expressão de CD38 em Linfócitos
T CD8+
ND
NDH
D
Grupos
a
0
250
500
P=0,9119*
Expressão de CD38 em Linfócitos
T CD4+
ND
NDH
D
Grupos
0
2000
4000
P=0,0164*
Expressão de CD38 em Linfócitos
T CD8+
ND
NDH
D
Grupos
a
64
A B
Figura 16 - Análise da frequência da molécula CD28 em linfócitos T auxiliares ativados (A) e em
linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
ND x D - p<0,05 (%CD4
+
CD28
+
/CD4
+
). Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste
de Dunns: ND x NDH, ND x D, NDH x D - p>0,05 (%CD8
+
CD28
+
/CD8
+
).
H) Análise da freqüência de subpopulações de linfócitos T expressando a molécula
de adesão CD62L:
A análise dos resultados da freqüência de linfócitos T CD4
+
expressando a
molécula CD62L não identificou diferença estatisticamente significativa entre os
grupos estudados (p=0,2046) (figura 17A). Em adição, a análise do percentual de
células TCD8
+
CD62L
+
revelou uma diferença significante entre os grupos ND e D
(p=0,0324) (figura 17B).
Grupos
P=0,0338*
ND
NDH
D
% CD4+CD28+ / CD4+
0
50
100
a
Grupos
% CD8+CD28+ / CD8+
50
100
0
P=0,2466*
ND
NDH
D
65
A B
Figura 17 - Análise da frequência da molécula CD62L em linfócitos T auxiliares ativados (A) e em
linfócitos T citotóxicos ativados (B) do sangue periférico por grupo:
ND = controle-não doentes; NDH = controle-não doentes portadores de hábitos de risco; D =
doentes; *Kruskal-Wallis. Estatisticamente não significante - *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: ND
x NDH, ND x D, NDH x D-p>0,05 (%CD4
+
CD62L
+
/CD4
+
). Estatisticamente significante - *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: ND x D - p<0,05 (%CD8
+
CD62L
+
/CD8
+
).
Grupos
% CD4+CD62L+ / CD4+
0
50
100
P=0,2046*
% CD8+CD62L+ / CD8+
0
50
100
P=0,0324*
Grupos
a
ND
NDH
D
ND
NDH
D
66
5.2. Artigo Científico
AN INCREASE IN PERCENTUAL OF ACTIVATED CD8+ T LYMPHOCYTES IS
ACOMPAINED OF ELEVETED LEVELS OF CD4+CD25
HIGH
REGULATORY T CELLS
IN HEAD AND NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA (HNSCC).
Ferreira, SBP
§
, Gonçalves, LC
§
, De Paula, AMB
§
, Martins-Filho, OA*, Andrade,
MC
§
.
§
Universidade Estadual de Montes Claros, UNIMONTES, Montes Claros, MG, Brasil,
39401-089; * Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG,
Brazil, 30190-002.
Running title: T lymphocytes and head and neck squamous cells carcinoma.
Corresponding author: Mariléia Chaves Andrade
Centro de Pesquisa René Rachou - Fundação Osvaldo Cruz - FIOCRUZ
Av. Augusto de Lima, 1715, Barro Preto, Belo Horizonte – MG – Brazil – 30190-002.
Tel: +55 31 3349-7764 Fax: +55 31 3295-3115
e-mail:[email protected].br
67
SUMMARY
The cause of immune depression in patients with head and neck squamous cell carcinoma
(HNSCC) is multifactorial and the mechanisms underlying the impaired immune response
frequently observed in cancer patients are poorly understood. Herein we report the results of
a descriptive flow cytometric immunophenotyping investigation of peripheral blood
lymphocytes subsets of patients with primary HNSCC (n=24) and individuals with (negative
controls, n=8) and without (positive controls, n= 11) risk factors for disease. Our results
indicated significant alterations by comparison with negative controls, including increased
values of high values of CD8+ T lymphocytes and lower values of conventional
(B2/CD19+CD5-) and unconventional (B1/CD19+CD5+) B cells. We also demonstrated high
frequency of activation phenotypes among circulating CD8+ T cells, including higher
percentage of circulating HLA-DR+ and CD18+ cells besides increased frequency of
circulating CD4+CD25
HIGH
T cells. In conclusion, our data documenting a potential capacity
of CD8+ T lymphocytes activation in patients with HNSCC that could mediate killing of
tumor cells by cytotoxic mechanisms. However, the parallel establishment of a strong
activation of regulatory CD4+ T lymphocytes could interferes in an efficient control of
disease in patients, leading a chronic damage in inflammatory tissues.
Key words:
Squamous cell carcinoma, head and neck, cellular immunity,
immunophenotyping, peripheral blood lymphocytes, flow cytometry.
68
BACKGROUND
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a disease associated with major
morbidity and mortality and represents a major worldwide public health problem in many
countries, including Brazil [1], [2]. HNSCC arises as a consequence of multiple molecular
events induced by the effects of various carcinogens from habits such as tobacco and alcohol
use, influenced by other environmental factors in a background of inherited resistance or
susceptibility [3], [4]. Genetic influences on HNSCC have been found in certain cases but the
components are not yet entirely clear [5], [6].
The HNSCC that become clinically evident are apparently resistant to the antigen-
specific and non-specific arms of the cell mediated immune response [7]. Alterations in the
immune functions of patients with HNSCC have been documented [7], [8], [9]. These
immunologic defects are predominantly caused, on the one hand by outside factors, like
smoking, alcohol and malnutrition, and on the other hand by immunosuppressive factors
resulting from, or produced by the tumor itself [7]. It is not clear at all if the incapacity of the
immune system to deal with tumor growth is the direct result of these so-called ‘defects’ in
the function of the immune system in its various components and cells, or that the cancers
possess yet other more important mechanisms to escape the presumed immuno-surveillance.
Deficiencies in lymphocytes subpopulations responses have been reported in patients
with HNSCC [8]-[15]. The results of these studies indicate significant reduction in the
absolute number of T cells and B cells is found in HNSCC patients, suggesting abnormalities
of lymphocyte subsets and of the absolute lymphocyte counts in these patients during oral
carcinogenesis, which is possibly related to the disease status, metastasis, tumor size, and
perhaps the differences in environmental exposure of risk factors, tobacco smoking, alcohol
drinking, and virus infection. However, a decrease or no change in the percentages of
peripheral blood lymphocytes (PBL) subsets in HNSCC patients compared with those in
69
healthy control subjects has been observed. So, it is evident that the relationship between
lymphocyte subpopulations in HNSCC and control patients merits further exploration.
The cause of immune depression in patients with head and neck cancer is
multifactorial and the mechanisms underlying the impaired immune response frequently
observed in cancer patients are poorly understood. Homeostasis of circulating T cells is
regulated in complex ways that have not yet been well defined. Meanwhile, CD4+CD25+
regulatory T cells (Treg), which are potent inhibitors of antitumor immune responses, also
play an invaluable role in maintaining immune homeostasis [16]. Chikamatsu and colleagues
demonstrated that Treg are increased in proportion in the circulation of patients with SCCHN.
These cells appear to downregulate cytokine expression in both Tc1 and Tc2 subsets of CD8+
effector T cells, which may be responsible for antitumor responses [16]. In a recent study,
Bose and collaborators clearly defined that all classes of cytotoxic cells are significantly
downregulated, with enhancement of the suppressor regulatory T cells [17]. This situation
reduces the tumor cell killing by immune cells and inactivates those cells still available for
tumor killing.
In this line of investigation, our aim was assess, in a single research, multiple
parameters related with the evaluation of populations, subpopulations, activation and
regulation profile in lymphocytes of Brazilian patients with HNSCC as well as two control
groups, subdivided in positive controls, including individuals with risk habits important to
HNSCC development, such as smoking and alcohol and negative controls, including
individuals without risk factors for disease described above.
70
PATIENTS, MATERIALS AND METHODS
Study population
In this cross-sectional study, consisted of negative and positive control groups
composed of 11 normal individuals’ whit positive tabagism and alcohol drinking habits,
known risk factors for HNSCC, and 08 normal individual without history of these risk factors
and a study group . The study group was a series of 24 fully reviewed cases of primary
HNSCC confirmed histologically of patients who were treated between 2007 and 2008, in
head-and-neck surgery public services in Montes Claros city - Minas Gerais state, Brazil.
Both groups (study and control) were matched by sex, and age. HNSCC cases were classified
according to the primary site as described in the International Classification of Diseases (ICD-
10) for Oncology [18]. The anatomical sites reviewed in this study included 1- Mouth and
perioral region (C00, C01, C02, C04, C05, C06.0, C06.2); 2- Oropharynx (C09-C10), 3-
Hypopharynx-Larynx (C12, C13, C32)
.
The exclusive protocol for majority of HNSCC
patients included surgical resection together with postoperative radiotherapy. Ethical approval
for this study was obtained from the local ethics committees (Unimontes/COEP, 739/2007).
In the positive control group, the male-to-female ratio was 4:7 and the mean age was
38 years (ranging from 26 to 45 years). In the negative control group, the male-to-female ratio
was 3:5 and the mean age was 35 years (ranging from 21 to 51 years). In the HNSCC group,
the male-to-female ratio was 22:2 and the mean age was 55 years (ranging from 28 to 75
years).
71
Blood samples
A 5-ml sample of peripheral blood was collected from each subject using
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as the anticoagulant. The samples were collected by
trained professionals. After the collection, the whole peripheral blood was analysed by flow
cytometry.
Specific monoclonal antibodies used for immunophenotyping
In this study, we used anti-human FITC conjugated monoclonal antibodies (mAbs)
including anti-CD3 (UCHT1), anti-CD4 (RPA-T4), anti-CD5 (L17F12), anti-CD8 (B9·11),
anti-CD18 (YF118·3) and mouse IgG1 as the isotypic control (679·1Mc7). The following
second-colour reagents were used: anti-human PE-conjugated mAbs anti-CD3 (UCHT1),
anti-CD4 (RPA-T4), anti-CD25 (3G10), anti-CD38 (AT13/5), anti-HLA-DR (TÜ36) and
mouse IgG2a as the isotypic control (UCTH-1). All antibodies were purchased from Becton-
Dickinson (Mountain View, CA, USA). The third color parameter was evaluated using TC-
conjugated mAbs and included anti-CD8 (M-L233) and anti-CD4 (TüK4), both purchased
from Caltag Laboratories (Burlingame, CA,USA).
Flow cytometric analysis of peripheral blood
White blood cell phenotypes were analysed following an immunofluorescence
procedure recommended by Becton-Dickinson, modified as follows: 100
µ
l peripheral blood
which had been collected in Vacutainer tubes containing EDTA (Becton Dickinson) was
mixed in 12×75 mm tubes with 5
µ
l undiluted mAbs specific for several cell surface markers;
the tubes were incubated in the dark for 30 min at room temperature. Following the
incubation, erythrocytes were lysed with 2 ml FACS lysing solution (Becton Dickinson
Biosciences Pharmigen, San Diego, CA, USA). The remaining cells were then washed twice
with 2 ml phosphate-buffered saline containing 0·01% sodium azide. Cell preparations were
72
fixed in 200
µ
l FACS Fix solution (10 g/l paraformaldehyde, 1% sodium-cacodylate, 6·65 g/l
sodium-chloride, 0·01% sodium azide). Cytofluorimetric data acquisition was performed with
a Becton-Dickinson FACScalibur
®
instrument. Cellquest
TM
software provided by the
manufacturer was used for data acquisition and analysis.
Statistical analysis
Differences between groups were first evaluated by minitab software (release 13·20) to
evaluate the independence, normality and variance of data sets. Those data sets meeting the
three criteria were considered parametric and were compared further by analysis of variance
(anova) followed by the Tukey test, using the prism 3·0 program. Non-parametric data were
analysed by the Kruskal–Wallis test followed by Dunn’s test. Correlation analysis was
performed by Pearson’s and Spearman’s tests, respectively. Significance was defined in both
cases at p<0.05.
73
RESULTS
Besides no difference in CD3+ T lymphocytes, subpopulations analysis demonstrated high
values of CD8+ with no changes in CD4+ T lymphocytes are observed in Head and Neck
Squamous Cell Carcinoma patients.
The percentage of T cell populations and the major subsets CD4+ and CD8+ are
shown in Figure 1. Statistical analysis demonstrated no significant difference of circulating
CD3+ T lymphocytes (A) and mean values of circulating CD4+ T cell subset (B) in patients
compared with negative and positive controls. However, a significant increase in the CD8+ T
lymphocyte subset (P = 0·0093) was observed in patients as compared with positive controls
(C).
Lower values of B lymphocytes are observed in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
patients.
Phenotypic analysis at the single-cell level was used to analyze the frequency of B cell
subsets (conventional B lymphocytes-B2/ CD19+ CD5– and unconventional B lymphocytes-
B1/CD19+ CD5). Our findings showed a decrease in the mean percentage of the major
subsets of B cells in patients in comparison with controls (Figure 2 A, B).
Head and Neck Squamous Cell Carcinoma patients demonstrated high frequency of activation
phenotypes among circulating CD8+ T cells.
In order to quantify the frequency of circulating T cell subsets co-expressing activation
molecules such as HLA-DR, CD38 and the integrin CD18, a three-color flow cytometry
analysis was carried out using a cocktail of monoclonal antibodies, including anti-HLA-DR,
anti-CD18 or anti-CD38 FITC, plus anti-CD4 PE and anti-CD8 TC. Our results indicated
CD8+ T cell activation in patients with HNSCC in comparison with negative controls,
demonstrated by the higher percentage of circulating HLA-DR+ cells and CD18+ (Figure 3
A,B). Phenotypic changes signaling the activation of CD4+ T cells was only evidenced by
74
high levels of circulating HLA-DR+ cells (Figure 3A). On the other hand, lower level of
circulating CD8+ CD38+ T cells was observed in patients in comparison to negative controls
(Figure 3C).
These data demonstrated increased migratory potential of the activated cytotoxic
population, which is important in controlling tissue inflammation in cancer events.
Increase of circulating CD4+CD25
HIGH
T cells highlights the immunostimulation in Head and
Neck Squamous Cell Carcinoma patients.
In humans, it has been proposed that only the CD4+ CD25
HIGH
population, comprising
∼
1–2% of circulating CD4+ T cells, exhibits regulatory functions [19]. Enumeration of CD4+
CD25
HIGH
regulatory T cells was carried out by first gating on lymphocytes based on their
morphometric features on forward-
versus
side-scatter dot plots, followed by the selection of
CD4+ cells presenting high expression of CD25 [19]. Our results demonstrated that higher
values of CD4+ CD25
HIGH
regulatory T cells are observed in patients with HNSCC when
compared with negative controls (Figure 4).
75
DISCUSSION
There is cumulative evidence suggesting that cells of the immune system recognize
and participate in eradicating neoplastic cells. The cytotoxicity of tumor cell, mediated by
CD8+ T lymphocytes, is the major mechanism in immune response against a great variety of
cancer [20]. Therefore, the complexity of interactions between the tumor and the host immune
system establish the fate of antitumor inflammatory process which in general is almost not is
controlled. Some researchers have proposed that apoptosis of circulating CD8+ T
lymphocytes might be expected to contribute to tumor progression [21], [22], [23],[24]. CD8+
T cells in the circulation of patients with head and neck cancer were previously shown to be
significantly more sensitive to, and preferentially targeted for apoptosis than CD4+ T cells
[23].
The immune deficiency that permits tumor growth may be associated, in part, to
alterations in immunoregulatory functions [25]. Investigations about this issue can elucidate
the immune mechanisms triggered by tumor cells contributing to clinical significance for
prognostic and therapy of cancer diseases.
Is known that head and neck squamous cell carcinoma is a type of malignancy more
immunosuppressive than other types of cancers and some authors have investigate the role of
regulatory T lymphocytes supporting this aggressive facet [16], [17]. In this line of
investigation, the present study involved a cross-sectional investigation of major changes in
blood peripheral T lymphocytes populations in HNSCC patients, focusing in the evaluation,
by quantitative flow cytometry analysis, of activation molecules expressed on membrane
surface of CD8+ and CD4+ cells and analysis of T regulatory cells CD4+CD25
HIGH
. The
subjects included patients with HNSCC as well as two control groups, subdivided in positive
controls, including individuals with risk habits important to HNSCC development, such as
76
smoking and alcohol and negative controls, including individuals without risk factors for
disease described above.
Our findings showed that besides no significant difference among groups relative to
the total T lymphocytes, a higher percentage of circulating CD8+ cells in patients as
compared with positive controls was evidenced. We presume that the reduction in percentage
of CD8+ cells in positive controls can be associated with immunosuppressive effects from
abuse drugs itself, which is supplant by strong variety of immune activation triggered during
inflammatory events in patients with active HNSCC. We believe that T cell-mediated
immunity during active HNSCC may represent a not phenomenon restricted to the
inflammatory sites, being detectable in the peripheral blood.
Humoral immune response seems to be also affected by immunosuppressive events in
patients with HNSCC demonstrated by a drop in the values of conventional B cells
(B2/CD19+CD5-) when compared such negative as positive controls. Unconventional B cells,
characterized by expression of the CD5 cell surface glycoprotein (B1/CD19+CD5+),
represent a small portion (5%) of the total adult B cell pool associated with autoantibodies
production [26] and implicated in immunological process in a vast group of diseases [27].The
importance of B1 in HNSCC has not been reported but our data demonstrate lower percentage
of B1 cells in patients when compared with negative controls. The clinical importance of this
result will be analyzed in supplementary reports to examine the activation profile of this
population.
Once determined the profile of lymphocytes circulating populations during HNSCC
disease, we then investigate the major molecules associated with activation
immunophenotypic profile in T lymphocytes.
In general, our analyses concern in molecules involved in T lymphocytes activation
demonstrated an upregulation of HLA-DR and CD18 by increase in percentage of CD8+ T
77
lymphocytes in patients in comparison with negative controls. CD38 is a glycoprotein
expressed distinctly in subpopulations of activated T lymphocytes. This molecule has an
increase in their expression in CD8+ T lymphocytes from patients with AIDS, being a potent
marker for prognostic disease [28]. The downregulation of CD38 in CD8+ T lymphocytes
from patients with HNSCC will be clarify in further analyses.
We believe that our data reveal an increased migratory potential of the cytotoxic
population, which is important in controlling tissue inflammation in cancer events. However,
in parallel we also observe an enhancement of the suppressor regulatory T cells
(CD4+CD25
HIGH
). This mixed activated/modulated immunological status can explain
partially incapacity of cytotoxic T lymphocytes in tumor killing, probably by
immunosuppressive effects from these cells by cytokine action in site of inflammation. It is
important to point out that the control of CD8+ T lymphocytes activity by immunoregulatory
CD4+ T lymphocytes may contribute to tissue damage in HNSCC diseases.
78
CONCLUSION
In conclusion, our data documenting a potential capacity of CD8+ T lymphocytes
activation in patients with HNSCC that could mediate killing of tumor cells by cytotoxic
mechanisms. However, the parallel establishment of a strong activation of regulatory CD4+ T
lymphocytes can interferes in an efficient control of disease in patients, leading a chronic
damage in inflammatory tissues.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by CPqRR/FIOCRUZ, Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and Universidade Estadual de Montes Claros
(UNIMONTES).
79
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26
: 1-7
82
Legend of Figures
Figure 1. Analysis of T subsets in the peripheral blood of patients and controls individuals
(negative and positive). Phenotypic studies were performed by a double-labelling protocol
using anti-CD3 fluorescein isothiocyanate (FITC) and anti-CD4 phycoerythrin (PE) or anti-
CD8-PE for T cell analysis. The results are expressed as percentage values of T cells (A) and
T cell subsets (B, C) within gated lymphocytes. The results are expressed in box-plot format.
The box stretches from the lower hinge (defined as the 25th percentile) to the upper hinge (the
75th percentile) and therefore contains the middle half of the scores in the distribution. The
median is shown as a line across the box. Therefore 1/4 of the distribution is between this line
and the top of the box and 1/4 of the distribution is between this line and the bottom of the
box. Significant differences comparing patients with negative or positive controls are
indicated by letter a and b, respectively, at P < 0·05.
Figure 2- Analysis of B cell subsets in the peripheral blood of patients and controls
individuals (negative and positive). Phenotypic studies were performed by a double-labelling
protocol using anti-CD19 FITC and anti-CD5-PE to identify B cell subsets. B lymphocyte
subsets, including conventional (A) B2/CD19+CD5- and unconventional (B)
B1/CD19+CD5+ were analyzed within gated CD19+ lymphocytes. The results are expressed
in box-plot format. The box stretches from the lower hinge (defined as the 25th percentile) to
the upper hinge (the 75th percentile) and therefore contains the middle half of the scores in
the distribution. The median is shown as a line across the box. Therefore 1/4 of the
distribution is between this line and the top of the box and 1/4 of the distribution is between
this line and the bottom of the box. Significant differences comparing patients with negative
or positive controls are indicated by letter a and b, respectively, at P < 0·05.
Figure 3. Analysis of activated CD4+ and CD8+ T lymphocytes in the peripheral blood of
patients and controls individuals (negative and positive). To identify activated T lymphocytes
83
subpopulation analysis was performed by a triple-labelling platform using anti-CD3 FITC,
anti-CD4 or anti-CD8 TC and anti-HLA-DR, anti-CD18 and anti-CD38 phycoerythrin (PE).
The results are expressed as percentage values of T cells within gated lymphocytes. The
results are expressed in box-plot format. The box stretches from the lower hinge (defined as
the 25th percentile) to the upper hinge (the 75th percentile) and therefore contains the middle
half of the scores in the distribution. The median is shown as a line across the box. Therefore
1/4 of the distribution is between this line and the top of the box and 1/4 of the distribution is
between this line and the bottom of the box. Significant differences comparing patients with
negative or positive controls are indicated by letter a and b, respectively, at P < 0·05.
Figure 4. Analysis of regulatory T cells [CD4+CD25
HIGH
] in the peripheral blood of patients
and controls individuals (negative and positive). Regulatory T cells were identified through a
double staining procedure with anti-CD4 FITC and anti- CD25 PE monoclonal antibodies to
identify regulatory CD4+ CD25
HIGH
T cells within gated lymphocytes. The results are
expressed as percentage values of T cells within gated T CD4+ lymphocytes. The results are
expressed in box-plot format. The box stretches from the lower hinge (defined as the 25th
percentile) to the upper hinge (the 75th percentile) and therefore contains the middle half of
the scores in the distribution. The median is shown as a line across the box. Therefore 1/4 of
the distribution is between this line and the top of the box and 1/4 of the distribution is
between this line and the bottom of the box. Significant differences comparing patients with
negative or positive controls are indicated by letter a and b, respectively, at P < 0·05.
84
Figura 1
0
Negative
50
100
% CD3
+
gated lymphocytes
Positive Patients
0
50
100
% CD4
+
T lymphocytes
Patients
0
25
50
% CD8
+
T lymphocytes
Patients
Controls
Negative Positive
Controls
Negative Positive
Controls
A
B
C
b
85
Figura 2
a
0
25
50
% CD19
+
CD5
-
/ CD19
+
cells
Patients
0
2.5
5
Patients
% CD19
+
CD5
+
/ CD19
+
cells
Negative Positive
Controls
Negative Positive
Controls
A
B
a,b
86
Figura 3
a
15
7.5
0
Patients
Negative Positive
Controls
% CD4
+
HLA-DR
+
/ CD4
+
cells
15
7.5
0
Patients
Negative Positive
Controls
% CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
cells
a
Patients
Positive
Controls
% CD4
+
CD18
+
/ CD4
+
cells
15
7.5
0
Negative
Patients
Positive
Controls
30
15
Negative
0
% CD8
+
CD18
+
/ CD8
+
cells
a
Positive
Controls
20
10
0
Negative
Patients
% CD4
+
CD38
+
/ CD4
+
cells
Patients
Positive
50
25
0
Negative
Controls
a
% CD8
+
CD38
+
/ CD8
+
cells
(A)
(B)
(C)
87
Figura 4
% CD4
+
CD25
HIGH
/ CD4
+
cells
0
10
20
a
Patients
Positive
Controls
Negative
88
6. Discussão
A compreensão do papel da resposta imune contra as neoplasias malignas
constitui um grande desafio na determinação de mecanismos que possam contribuir
para as respostas imunes protetoras contra os tumores, e facilitar os mecanismos
efetores de modo que estes sejam tumor-específicos.
Na literatura, diversos estudos avaliam os mecanismos imunológicos
associados ao CECP com a participação de diferentes populações celulares nos
eventos protetores e/ou patológicos da doença a fim de demonstrar o envolvimento
e a interligação da imunidade inata e adaptativa.
No presente trabalho, foi realizado um estudo detalhado de aspectos
fenotípicos celulares e moleculares do sangue periférico de pacientes portadores de
CECP a fim de contribuir para o conhecimento científico sobre a doença. Foram
demonstradas, através dos resultados encontrados, alterações fenotípicas
relevantes em células envolvidas na imunidade adaptativa e imunidade humoral,
sugestivas do envolvimento destas populações celulares nos eventos imunológicos
de ativação e modulação no CECP.
Nossos achados revelaram que não houve diferença entre os grupos
estudados quanto à freqüência de linfócitos T CD3
+
e à freqüência de linfócitos T
CD4
+
. Todavia, o percentual de linfócitos T citotóxicos (CD8
+
) mostrou uma diferença
entre os grupos NDH e D, com um percentual de células T CD8
+
significativamente
maior no grupo D. Esse resultado poderia indicar uma hegemonia da atividade de
linfócitos T citotóxicos em detrimento dos linfócitos T auxiliares em processos
cancerígenos, devido à sua atividade funcional de indução de morte de células
cancerígenas transformadas já demonstrado pela literatura científica (25,40). Uma
explicação para o aumento de células T CD8
+
no sangue periférico de pacientes
89
portadores de CECP poderia ser pela apoptose preferencial de células T CD8
+
, o
que ocasionaria uma diminuição do número destas células e uma compensação
desta perda celular pelo mecanismo homeostásico (41). Portanto, o mecanismo
homeostásico promoveria uma compensação da apoptose seletiva através de uma
rápida expansão de células T CD8
+
no sangue periférico de indivíduos que
apresentam CECP, o que sugere uma regulação do número de linfócitos através da
sobrevida e proliferação homeostásica dos linfócitos maduros (42). Vale ressaltar
que um estudo realizado por Kuss e colaboradores revelou números absolutos
significantemente baixos de células T (CD3
+
, CD4
+
e CD8
+
) identificados em
pacientes portadores de CECP, quando comparados aos indivíduos sadios (30). No
mesmo estudo (30), porém, não foram observadas diferenças significantes nos
percentuais das mesmas células T analisadas entre doentes e indivíduos sadios.
Antes de considerarmos a contradição de nossos resultados com o estudo em
questão, devemos esclarecer que variáveis não discutidas nesse estudo, podem
estar relacionadas com os esses dados discordantes.
A razão CD4
+
/CD8
+
para linfócitos T CD4
+
e linfócitos T CD8
+
revelou um
aumento significativo no grupo NDH em relação ao grupo ND, e houve uma
tendência, apesar de não haver uma diferença estatisticamente significativa, de uma
maior razão CD4
+
/CD8
+
no grupo D em comparação com o grupo ND. Em
concordância com a literatura, a elevação da razão CD4
+
/CD8
+
observada em
indivíduos portadores de CECP ocorreria devido ao aumento de células T CD4
+
ao
contrário de uma diminuição de células T CD8
+
no sangue periférico (28).
Os resultados do presente estudo demonstram uma diferença significativa
entre os grupos ND e D, quando analisada a freqüência de células T reguladoras
(CD4
+
CD25
HIGH
). Um maior percentual de células TCD4
+
CD25
HIGH
foi observado no
90
grupo D em relação aos demais grupos do estudo. Bose e colaboradores (2008)
demonstraram um aumento de células T reguladoras significantemente maior entre
os pacientes portadores de CECP quando comparados aos indivíduos sadios. No
mesmo estudo, os autores consideram que o decréscimo percentual e funcional de
células imunocompetentes pode estar influenciada pela atividade reguladora
aumentada das células T CD4
+
CD25
HIGH
(35). Está demonstrado que as células T
reguladoras periféricas suprimem a produção de INF-γ por linfócitos T citotóxicos,
comprometendo a atividade efetora dessas células.
Considerando a abordagem das subpopulações de linfócitos B, observa-se
um percentual de linfócitos B convencionais (CD19
+
CD5
-
) menor no grupo D em
relação aos demais grupos estudados. Observa-se ainda um percentual de linfócitos
B1 (CD19
+
CD5
+
) também menor no grupo D em relação aos grupos ND e NDH. Já
foi observado que em pacientes com CECP ocorre uma diminuição do percentual de
células B, quando comparados a indivíduos sadios (35). Portanto, os resultados
referentes aos linfócitos B sugerem um comprometimento do segmento humoral,
determinado pela presença da doença. A literatura científica relata alterações no
percentual de linfócitos B1 em muitas doenças, principalmente aquelas com um
componente auto-imune (37). Entretanto, parece não existirem estudos relatando
efetivamente o papel de linfócitos B1 em doenças cancerígenas, como o CECP.
Nesse contexto, nossos resultados trazem informações iniciais relevantes a respeito
dos linfócitos B1 na presença do CECP, necessitando de avaliações posteriores de
atividade celular para uma maior elucidação dos dados.
Em síntese, nossos resultados demonstraram uma maior razão entre
linfócitos T (CD3
+
) e linfócitos B (CD19
+
) identificada no grupo D em relação aos
demais grupos em estudo. Esta maior razão CD3
+
/CD19
+
no grupo D parece estar
91
relacionada à redução significativa do percentual de linfócitos B, decorrente da
diminuição do percentual de linfócitos B convencionais e linfócitos B1 no sangue
periférico dos indivíduos portadores de CECP.
O estudo do percentual de células T CD4
+
e células T CD8
+
em seu estado
ativado assim como o estudo da intensidade de expressão de moléculas de ativação
nas superfícies destas células, revelaram a presença de ativação celular no contexto
da resposta imune na presença de CECP. Notou-se, através dos resultados obtidos,
uma maior expressão das moléculas de ativação no grupo D, principalmente em
relação às células T CD8
+
. Observou-se ainda que no grupo D as células T
CD8
+
HLA-DR
+
, T CD8
+
CD18
+
e T CD8
+
CD38
+
apresentaram um percentual maior de
células ativadas em relação às mesmas células pertencentes ao grupo ND. O
marcador CD18 é parte do complexo protéico de adesão (LFA1) envolvido em
processos de migração e infiltração linfocitária (43). A quantificação do marcador de
ativação CD38 refere-se ao número de moléculas de anticorpo ligado às células T
CD4
+
ou às células T CD8
+
, sendo que nos indivíduos saudáveis estes valores são
mais baixos em comparação aos indivíduos doentes em ambas as subpopulações
de linfócitos T. Um achado interessante revelou um percentual de células T
CD4
+
HLA-DR
+
maior no grupo D em relação ao grupo ND, o que implicaria a
presença de ativação celular significante de células T CD4
+
do sangue periférico de
portadores de CECP, quando analisadas por um fidedigno marcador de células T em
humanos.
As moléculas co-estimulatórias atuam na interação célula-célula e na ativação
de suas várias vias efetoras. Martin-Fontecha et al. (1999), consideram que a
molécula CD28 desempenha uma importante função na indução da atividade
citotóxica e secreção de citocinas pelas células NK , quando em contato com CD80
92
e CD86, seus ligantes em outras células (44). Neste contexto, a análise do
percentual de linfócitos T expressando a molécula CD28 revelou um percentual
significativamente maior de células T CD4
+
expressando a molécula CD28 no grupo
D em relação aos grupos ND e NDH. Em adição, foi observado um percentual de
células T CD8
+
CD28
+
um pouco mais elevado nos indivíduos pertencentes ao grupo
D, mesmo não havendo diferença significativa entre os grupos.
Um ponto interessante em nossos dados é a diferença significativa de
linfócitos T citotóxicos expressando a molécula de adesão CD62L entre os grupos
ND e D, com um percentual maior de células T CD8
+
CD62L
+
no grupo D. Considera-
se que exista uma associação entre moléculas de adesão e gravidade da doença
em se tratando de doenças parasitárias (45). Os mesmos autores consideram ainda
que após o tratamento dessas doenças, haja uma redução do percentual de células
T CD8
+
CD62L
+
e também uma diminuição na expressão de moléculas de adesão no
sangue periférico dos indivíduos infectados (45). Portanto, ressalta-se a possível
correlação existente entre o percentual de células T CD8
+
expressando a molécula
CD62L, assim como a expressão da mesma molécula em células T CD8
+
, e a
gravidade da doença em fase crônica e após o tratamento.
Nossos dados revelaram um aumento do potencial migratório da população
citotóxica, de grande importância no controle da inflamação tecidual na presença de
malignidades. Portanto, paralelamente, nós observamos um aumento da atividade
supressora das células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
). Este estado imunológico
ativado/modulado pode explicar, em parte, a inabilidade dos linfócitos T citotóxicos
frente à destruição de células tumorais, provavelmente pelos efeitos
imunossupressores dessas células por ação de citocinas presentes no local da
inflamação. Torna-se importante destacar que o controle da atividade dos linfócitos T
93
citotóxicos pelas células T reguladoras propiciando a diminuição dos danos teciduais
em portadores de CECP.
Assim, nossos dados documentaram uma potencial capacidade de ativação
de linfócitos T CD8
+
em pacientes com CECP, podendo mediar a destruição de
células tumorais por mecanismos citotóxicos. Em adição, o estabelecimento da
ativação de células T reguladoras pode interferir no controle eficiente da doença,
evitando danos teciduais na presença da inflamação.
Finalmente, diante das alterações fenotípicas celulares que envolvem o
sistema imune de pacientes portadores de CECP, o nosso trabalho envolveu a
análise de aspectos da resposta imune dos grupos em estudo através de uma
investigação imunofenotípica por citometria de fluxo.
7. Conclusões
1. A análise do perfil imunofenotípico dos leucócitos do sangue periférico em
indivíduos portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, permitiu
identificar alterações relacionadas à participação da imunidade adaptativa mediada
por linfócitos T e linfócitos B no tocante à resposta imune antitumoral.
2. Nossos achados revelaram não somente alterações no percentual correspondente
a cada célula específica, mas também revelaram alterações em moléculas de
ativação presentes na superfície celular, tanto em relação ao percentual de células
ativadas quanto à expressão dessas moléculas em linfócitos T incluídos no estudo.
94
3. As moléculas de superfície mostraram uma maior expressão em células
pertencentes aos indivíduos portadores da doença, principalmente em células T
CD8
+
.
4. Quanto às alterações a nível percentual, nossos resultados mostraram alterações
em subpopulações celulares, sugerindo ser esta uma possível causa das alterações
na freqüência de populações linfocitárias do sangue periférico de indivíduos
portadores de CECP.
5. Uma maior compreensão do papel da resposta imune adaptativa e o estudo de
linfócitos T e linfócitos B, com suas respectivas subpopulações, apresentam-se
como uma importante abordagem no esclarecimento de fatores intrínsecos na
presença do CECP, fornecendo alguns subsídeos que poderiam explicar, em parte,
alguns aspectos relacionados à patogenia da doença. Um maior entendimento da
resposta imune que envolve a doença poderia favorecer ao desenvolvimento de
estratégias imunoterapêuticas contribuindo para o tratamento da doença.
8. Perspectivas
Cabe ressaltar a importância de novos estudos que envolvam, em adição, os
aspectos relacionados à resposta imune inata a fim de um entendimento mais
abrangente dos mecanismos imunológicos antitumorais relacionados ao CECP. A
imunologia dos tumores abrange uma vasta área de conhecimentos que podem
levar a uma maior compreensão a cerca da carcinogênese e do desenvolvimento de
novas terapias para o CECP.
95
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