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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Faculdade de Medicina
Pós-Graduação em Clínica Médica
Setor de Ciências Pneumológicas
Tese de Doutorado
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Orientadores:
Dr. Adalberto Rezende Santos
Pesquisador Titular – Lab. de Biol. Mol. Aplicada a Micobactérias
Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ
Prof
a
. Dra. Fernanda Carvalho de Queiroz Mello
Professora Adjunta – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Doenças do Tórax
Unidade de Pesquisa em Tuberculose
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – UFRJ
Rio de Janeiro
Fevereiro 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
JOSEANE DA FONSECA COSTA
ESTUDO DESCRITIVO DAS ISOFORMAS DE CYP P450 EM PACIENTES COM
TUBERCULOSE (TB) DO PROGRAMA DE CONTROLE DE TUBERCULOSE
HOSPITALAR (PCTH) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO (UFRJ)
RIO DE JANEIRO
2009
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Joseane da Fonseca Costa
ESTUDO DESCRITIVO DAS ISOFORMAS DE CYP P450 EM PACIENTES COM
TUBERCULOSE (TB) DO PROGRAMA DE CONTROLE DE TUBERCULOSE
HOSPITALAR (PCTH) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO (UFRJ)
Tese de doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Clínica Médica – Setor
Ciências Pneumológicas da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como requisito à obtenção do Grau de
Doutor em Ciências.
Orientadores:
Dr. Adalberto Rezende Santos
Prof
a
. Dra. Fernanda Carvalho de Queiroz Mello
Rio de Janeiro
2009
Fonseca-Costa, Joseane da
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com
Tuberculose (TB) do Programa de Controle de Tuberculose Hospitalar (PCTH)
da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) / Joseane da Fonseca
Costa. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2009.
xxv, 151 f. : il. ; 31 cm.
Orientadores: Adalberto Rezende Santos e Fernanda Carvalho de Queiroz
Mello
Tese (doutorado) – UFRJ / Faculdade de Medicina, Pós Graduação em
Clínica Médica, Pneumologia, 2009.
Referências bibliográficas: f. 123-135
1. Tuberculose - genética. 2. Polimorfismo genético. 3. Farmacogenética.
4. Sistema enzimático do citocromo P-450 - genética . 5. Isoformas de
proteínas - genética. 6. Biotransformação. 7. Comorbidade. 8. Humanos. 9.
Pneumologia – Tese. I. Santos, Adalberto Rezende. II. Mello, Fernanda
Carvalho de Queiroz. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de
Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Pneumologia. IV.
Título.
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Joseane da Fonseca Costa
ESTUDO DESCRITIVO DAS ISOFORMAS DE CYP P450 EM PACIENTES COM
TUBERCULOSE (TB) DO PROGRAMA DE CONTROLE DE TUBERCULOSE
HOSPITALAR (PCTH) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO (UFRJ)
Tese de doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Clínica Médica – Setor
Ciências Pneumológicas da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como requisito à obtenção do Grau de
Doutor em Ciências.
Aprovada em 03 de fevereiro de 2009.
______________________________________
Adalberto Rezende Santos, PhD, FIOCRUZ
______________________________________
Harrison Magdinier Gomes. PhD, FIOCRUZ
______________________________________
Luiz Cláudio Lazzarini de Oliveira, PhD, UFRJ
______________________________________
Marcus Barreto Conde, PhD, UFRJ
______________________________________
Maria Armanda Monteiro da Silva Vieira, PhD, UFRJ
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
“Para Cleuza, João, Josué, Ricardo e Maria Victória.”
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
AGRADECIMENTOS
A parte dos agradecimentos de uma tese é a parte mais difícil. Tentar resumir em algumas
linhas uma jornada de mais de quatro anos não é fácil. Ninguém consegue desenvolver
uma tese sozinho, na verdade, na vida, ninguém faz nada sozinho. Seria muita pretensão
minha tomar este tipo de conclusão. A ajuda dos profissionais, amigos e principalmente da
família é de suma importância, sem esses três elementos, juntos, não sei se conseguiria. Ao
finalizar esta tese fecho um ciclo, que começou na universidade, com a iniciação científica
realizada na FIOCRUZ, com o mestrado realizado na UPT e, agora, com o doutorado,
também realizado na UPT. A partir de agora, a única certeza que tenho é que irei me
dedicar ao meu bebê que está chegando, ao meu marido e a minha família. Deixo o meu
futuro nas mãos de Deus, pois tenho certeza que ele tem algo reservado para mim. Desejo
muito continuar a fazer ciência, pois é e sempre será a minha paixão. Agradeço a todos que
passaram na minha vida e também a todos os obstáculos que encontrei ao longo desta
jornada, pois com eles aprendi a ser uma pessoa melhor e a olhar os meus próprios defeitos
e limitações. Aprendi, principalmente, a valorizar o ser humano e as amizades, pois isto
não tem preço, não há nada que pague um abraço e uma palavra de afeto em um momento
difícil.
Inicialmente, peço desculpas caso esqueça de citar alguém, não gostaria de cometer este
erro, mas como sou humana, é inevitável.
Agradeço a Deus pela vida, pois sem ela não estaria aqui e pela oportunidade de estar em
uma família maravilhosa que sempre me mostrou o caminho correto e me deu os meios
para que eu pudesse chegar aqui.
Ao meu pai João, que através do seu jeito rigoroso, ensinou-me disciplina para nunca
desistir dos meus objetivos e tentar sempre fazer o melhor.
A minha mãe Cleuza, que sempre está pronta para me amparar e me dar colo, mesmo
naqueles momentos que nem eu me aguento.
Ao meu irmão Josué pelos seus conselhos nas horas mais apropriadas.
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Ao Ricardo, que mesmo com a distância, não permitiu que eu me sentisse só, sempre me
apoiando e me amando.
A minha família e agregados, por toda ajuda e apoio.
Aos meus orientadores, Adalberto e Fernanda, agradeço a oportunidade e a confiança.
Ao Afrânio pela oportunidade de fazer parte da equipe da UPT.
Aos companheiros de laboratório, Alexandre, Martha, Fábio Queiroz e Elizângela.
Aos amigos da UPT, do PCTH e da Multidicliplinar, Adriana, Alessandra, Armanda,
Beatriz, Érika, Marcelo, Lígia, Patrícia, Pedro, Raquel e Sandra. Agradeço pelos momentos
alegres e as boas gargalhadas na hora do café. Um agradecimento em especial a Adriana
pela coleta das amostras, a Érika por sua disposição em estar sempre ajudando, ao Marcelo
e ao Pedro pela disponibilidade.
Aos meus alunos de Iniciação, Gustavo e Luciene.
Aos meus amigos da FIOCRUZ, Amanda, Harrison, Ida, Lisânia, Mara, Marcinha, D.
Neiva e Raquel. Um agradecimento especial a Marcinha que está sempre a disposição para
ajudar e sempre pronta a apoiar-me.
Aos meus amigos de hoje e sempre, Bianca, Renata e Wagner, que apesar da distância e da
vida atribulada a nossa amizade continua.
A Banca pela disponibilidade e atenção!
A Teresa por sua dedicação aos alunos da Pós Graduação!
O meu muito obrigado a todos!
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
"Procure ser uma pessoa de valor,
em vez de procurar ser uma
pessoa de sucesso. O sucesso é
consequência".
Albert Einstein
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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ESQUEMA 1 – Relação entre Farmacocinética e Farmacodinâmica ................................ 34
ESQUEMA 2 – Principais enzimas e vias ......................................................................... 36
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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GRÁFICO 1 – Distribuição dos indivíduos segundo a idade ............................................ 84
Joseane da Fonseca Costa
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Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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FIGURA 1 – Fórmula estrutural da Rifampicina .............................................................. 32
FIGURA 2 – Diferente possibilidade de alterações na biotransformação de fármacos
causados por mudanças genéticas ...................................................................................... 37
FIGURA 3 – Percentual de contribuição de algumas enzimas que compõem o sistema
CYP P450 presentes no fígado humano adulto .................................................................. 43
FIGURA 4 – Nomeando uma isoenzima do citocromo P450 ............................................ 44
FIGURA 5 – Alelos do gene CYP2D6 ..............................................................................
48
FIGURA 6 – Frequência de indivíduos que carregam o alelo que apresentam múltiplas
cópias do gene CYP2D6 ..................................................................................................... 49
FIGURA 7 – AmpliChip™ CYP450 .................................................................................
52
FIGURA 8 – Distribuição das mutações no gene CYP3A4 .............................................. 53
FIGURA 9 – Distribuição das mutações no gene CYP3A5 .............................................. 57
FIGURA 10 – Cálculo amostral para diferentes proporções populacionais e tamanhos de
amostras .............................................................................................................................. 66
FIGURA 11 – Gene CYP2D6, com estratégia de sequenciamento ................................... 69
FIGURA 12 – Gene CYP3A5*3, com estratégia amplificação e representação do resultado
obtido através da digestão utilizando a enzima Dde I em gel de agarose 3% .................... 70
FIGURA 13 – Gene CYP3A5*6, com estratégia de amplificação e representação do
resultado obtido através da digestão utilizando a enzima Dde I em gel de agarose 3% .... 71
FIGURA 14 – Representação de uma placa de sequenciamento ....................................... 73
FIGURA 15 – Página inicial do Software SeqScape ........................................................ 75
FIGURA 16 – Ilustração da utilização do Software v.2.6 .................................................
76
FIGURA 17 – Ilustração da utilização do Software SeqScape v.2.6 ................................
76
FIGURA 18 – Identificação de SNP através da visualização do cromatograma no
programa SeqScape ............................................................................................................ 77
FIGURA 19 – Gel de agarose 3% ilustrando a amplificação da variante G e da variante A
para a genotipagem do alelo CYP3A4*1B ......................................................................... 86
FIGURA 20 – Gel de agarose 1,5% ilustrando a amplificação dos alelos CYP3A5*3 e
CYP3A5*6 ......................................................................................................................... 87
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
FIGURA 21 – Digestão do material amplificado do sistema CYP3A5*3 ......................... 88
FIGURA 22 – Digestão do material amplificado do sistema CYP3A5*6 ......................... 88
FIGURA 23 – Estratégia de amplificação e sequenciamento de parte do gene CYP2D6
............................................................................................................................................. 90
FIGURA 24 – Gel de agarose 2% mostrando a padronização do sistema para a
amplificação do gene CYP2D6 .......................................................................................... 91
FIGURA 25 – Identificação de SNPs no gene de CYP2D6 através da visualização do
cromatograma apresentado pelo programa SeqScape ................................................ 97-103
FIGURA 26 – Mapeamento dos SNPs encontrados no gene CYP2D6 na população de
estudo ................................................................................................................................ 104
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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QUADRO 1 – Fármacos de diferentes classes terapêuticas que são biotransformadas pelo
CYP2D6 ............................................................................................................................. 50
QUADRO 2 – Fármacos de diferentes classes terapêuticas que são biotransformados pelas
enzimas codificadas por CYP3A4, CYP3A5 e CYP3A7 ................................................... 55
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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TABELA 1 – Distribuição dos indivíduos segundo suas características ........................... 83
TABELA 2 – Distribuição dos indivíduos segundo suas co-morbidades .......................... 85
TABELA 3 – Distribuição genotípica do alelo CYP3A4*1B (-290
A→G
) .......................... 92
TABELA 4 – Frequência alélica da variantes A>G CYP3A4*1B (-290
A→G
) ................... 92
TABELA 5 – Características demográfica x alelo.............................................................. 93
TABELA 6 – Características Clínica x Genótipo .............................................................. 93
TABELA 7 – Distribuição genotípica do alelo CYP3A5*3 (22893
A→G
) .......................... 94
TABELA 8 – Frequência alélica do alelo CYP3A5*3 (22893
A→G
) .................................. 94
TABELA 9 – Características demográfica x alelo ............................................................. 95
TABELA 10 – Características clínica x genótipo .............................................................. 95
TABELA 11 – Distribuição genotípica do alelo CYP3A5*6 (30597
G→A
) ........................ 96
TABELA 12 – Frequência alélica do gene CYP3A5*6 (30597
G→A
) ................................. 96
TABELA 13 – Características demográfica x alelo ........................................................... 96
TABELA 14 – Características clínica x genótipo .............................................................. 97
TABELA 15 – Distribuição genotípica e alélica dos SNPs encontrados no gene CYP2D6
.................................................................................................................................... 105-110
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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A Adenina
AC Antes de Cristo
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
BAAR Bacilos Álcool-Ácido Resistentes
BCG Bacilo de Calmette-Guérin
BSA Albumina de Soro Bovino
C Citosina
CoA Coenzima A
CYP Citocromo
DAO Diamino-oxidases
DMSO Dimethil Sulfoxide
DNA Ácido Desoxiribonucléico
dNTP Deoxinucleotídeos Trifosfato
E Etambutol
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
EM Biotransformadores Extensivos
FDA Food and Drug Administration
FMO Sistema de Monooxigenases Contendo Flavina
FUNASA Fundação Nacional de Saúde
G Guanina
G6PD Glicose-6-Fosfato-Dehydrogenase
H Isoniazida
HIV Vírus da Imunodeficiência Adquirida
HMG-CoA redutase 3-Hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A Redutase
HUCFF Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
IDT Instituto de Doenças do Tórax
IM Biotransformadores Intermediários
MAO Monoamino-Oxidases
Mg
++
Magnésio
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
MgCl
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Cloreto de Magnésio
mRNA RNA mensageiro
MS Ministério da Saúde
Mtb Mycobacterium tuberculosis
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
OMS Organização Mundial de Saúde
pb Pares de Base
PCR Reação de Polimerização em Cadeia
PCTH Programa de Controle da Tuberculose Hospitalar
PM Biotransformadores Fracos
PXR Pregnane X Receptor
R Rifampicina
RFLP Polimorfismos dos Tamanhos de Fragmentos de Restrição
RNA Ácido Ribonucléico
RPM Rotações Por Minuto
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SNPs Polimorfismos de Base Única
T Timina
Taq Thermus aquaticus
TB Tuberculose
TBE Tris-Bórico-EDTA
TB-MR TB-Multi-Resistente
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TE Tris-EDTA
TM Temperatura de Dissociação
Tris Trishidroximetilamino Metano
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
UM Biotransformadores Ultra-rápido
UPT Unidade de Pesquisa em Tuberculose
UV Ultravioleta
Z Pirazinamida
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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FONSECA-COSTA, Joseane. Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em
pacientes com tuberculose (TB) do Programa de Controle de Tuberculose Hospitalar
(PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Rio de Janeiro, 2009.
Tese (Doutorado em Ciências Pneumológicas) – Faculdade de Medicina, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
Introdução: Os genes que codificam para as isoenzimas CYP3A4, CYP3A5 e CYP2D6
humanas pertencentes a superfamília do citocromo P450 presentes no fígado humano
adulto são polimórficos e apresentam diferentes variantes alélicas normalmente designadas
pela presença de alguns polimorfismos de base única (SNPs). Ambas as enzimas estão
envolvidas na biotransformação de vários componentes endógenos e xenobióticos. A
Rifampicina (R), fármaco utilizado no tratamento da Tuberculose (TB) é um poderoso
indutor destes genes. Sua ação resulta na redução da concentração plasmática de fármacos
co-administrados.
O gene CYP3A4 apresenta um SNP na região regulatória 5' (posição -290), onde ocorre
uma substituição A-G (CYP3A4*1B). Como consequência fenotípica, este alelo tem sido
associado a uma diminuição na atividade do promotor. Já a ausência da expressão do gene
CYP3A5 foi associada com os alelos *3 e *6 localizados na região codificante do gene. O
CYP2D6 é altamente polimórfico.
Objetivo: Estimar a frequência dos alelos CYP3A4*1B, CYP3A5*3 e CYP3A5*6 e a
presença de polimorfismos novos e os já descritos do gene CYP2D6 entre voluntários
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
brasileiros recrutados no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
Método: O DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico utilizando o Kit
flexigene DNA. A genotipagem do CYP3A4 foi realizada através de PCR alelo-específico,
descrito por Rivory e outros (2000). Para a genotipagem do CYP3A5 foi realizada a
técnica de PCR-RFLP, descrito por Fukuen e outros, (2002). Já para o CYP2D6 foi
realizada a técnica de sequenciamento de uma região específica.
Resultados: Após a genotipagem das amostras de DNA de 444 indivíduos, a frequência
alélica do gene CYP3A4 foi de 0,82 (A) e 0,18 (G). Já para o gene CYP3A5, 451
indivíduos foram tipados para a variante *3 e a frequência alélica da variante selvagem foi
de 0,47 (*1), enquanto que a frequência da variante mutante foi de 0,53 (*3). Para a
variante *6, 439 indivíduos foram tipados e a frequência alélica encontrada foi 0,93 (*1)
para o alelo selvagem e 0,07 (*6) para o alelo mutante. Para o CYP2D6, foram tipados 117
indivíduos e foram encontrados 35 polimorfismos, sendo que nove já foram descritos na
literatura e onze apresentaram frequência menor que 1%.
Conclusões: Nossos achados estão de acordo com Ball e outros (1999), Sata e outros
(1999) e Kuehl e outros (2001) que encontraram resultados similares em negros
americanos. Isto, possivelmente, deve-se ao fato da população brasileira apresentar uma
grande mistura étnica. Esses achados pioneiros no nosso meio, quando associados a outros
estudos a respeito do CYP3A4, CYP3A5 e CYP2D6 humano, contribuirão para um melhor
entendimento das bases moleculares das diferenças étnicas à resposta aos fármacos
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
fornecendo as bases preliminares para o uso racional dos fármacos que são substratos desta
isoenzimas na população brasileira.
Palavras-chave: Tuberculose, Polimorfismo, CYP P450, Farmacogenética.
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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FONSECA-COSTA, Joseane. Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em
pacientes com tuberculose (TB) do Programa de Controle de Tuberculose Hospitalar
(PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Rio de Janeiro, 2009.
Tese (Doutorado em Ciências Pneumológicas) – Faculdade de Medicina, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
Rationale: The genes that codify for the human iso-enzymes CYP3A4, CYP3A5 e
CYP2D6 belong to the super-family of the cytochrome P450 present on human liver are
polymorphic and show different allelic variation normally designed by the presence of
some single nucleotide polymorphisms (SNPs). Both enzymes are involved on
biotransformation of some endogen and xenobiotic components. Rifampicin (R) used on
Tuberculosis (TB) treatment, is a powerful inductor of these genes. Your actions results on
reduction of plasmatic concentration of the drugs co-administrated.
CYP3A4 gene shows a SNP on regulatory region 5’ (position -290), where happens the
replacement A-G (CYP3A4*1B). As a phenotype consequence, this allele has been
associated to a reduction of activity from the promoter. Therefore, the absence of CYP3A5
gene expression was associated with the alleles *3 and *6 located on gene’s codifying
region. CYP2D6 is highly polymorphic.
Objective: Estimate the frequency of CYP3A4*1B, CYP3A5*3 and CYP3A5*6 alleles and
the presence of new polymorphisms and the ones described on CYP2D6 gene among
Brazilian volunteers recruited on Clementino Fraga Filho Hospital on the Federal
University of Rio de Janeiro.
Joseane da Fonseca Costa
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Methods: The genomic DNA was extracted from periphery blood using Flexigene DNA
Kit. The genotyping of CYP3A4 was made thru allele-specific PCR, described by Rivory
et al (2000). For CYP3A5 genotyping, the PCR-RFLP technique was used, described by
Fukuen et al (2002). And, for CYP2D6, sequencing technique of a specific region was
used.
Results: After genotyping of DNA samples of 444 individuals, the allelic frequency of
CYP3A4 gene was 0.82 (A) and 0.18 (G). For CYP3A5 gene, 451 individuals were typed
for *3 variant and the allele frequency of wild variant was 0.47 (*1) and the mutant variant
frequency was 0.53 (*3). For *6 variant, 439 individuals were typed and the discovered
allele frequency was 0.93 (*1) for wild allele and 0.07 (*6) for the mutant allele. For
CYP2D6, 117 individuals were typed and 35 polymorphisms were discovered, on which 9
were previously described on literature and 11 show frequencies lower than 1%.
Conclusions: The results of this research agree with Ball et al (1999) and Kuehl et al
(2001) that found similar results in afro-descendents in USA. Possibly, this is related to the
miscegenation in Brazilian population. These pioneer discoveries on our environment,
when associate to other studies related to human CYP3A4, CYP3A5 and CYP2D6 genes,
will contribute to a better understanding on molecular bases of ethnic differences in
response to drugs providing the preliminary bases to the rational usage of drugs which are
subtract of these iso-enzymes on Brazilian population.
Keywords: Tuberculosis, Polymorphism, CYP P450, Pharmacogenetic.
Joseane da Fonseca Costa
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Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................26
2 REVISÃO DA LITERATURA ...............................................................................30
2.1 GÊNERO Mycobacterium .....................................................................................30
2.2 Mycobacterium tuberculosis..................................................................................30
2.3 TRATAMENTO PARA TUBERCULOSE............................................................30
2.3.1 Rifampicina....................................................................................................31
2.4 MODO DE AÇÃO DOS FÁRMACOS .................................................................33
2.5 BIOTRANSFORMAÇÃO DE FÁRMACOS ........................................................34
2.5.1 Fatores modificadores da biotransformação ....................................................37
2.5.2 Interações entre fármacos................................................................................38
2.5.3 Polimorfismos de base única (SNPs)...............................................................38
2.6 BREVE HISTÓRICO............................................................................................39
2.6.1 Farmacogenômica x Farmacogenética ............................................................40
2.7 CITOCROMO P450..............................................................................................41
2.7.1 Nomenclatura .................................................................................................43
2.7.2 Isoformas do CYP P450..................................................................................44
2.7.3 Distribuição das variantes alélicas de acordo com diferentes grupos étnico-
raciais.......................................................................................................................58
3 JUSTIFICATIVA....................................................................................................63
4 OBJETIVOS GERAIS ............................................................................................64
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................64
5 PACIENTES E MÉTODOS ....................................................................................65
5.1 MODELO DO ESTUDO.......................................................................................65
5.2 LOCAL DO ESTUDO ..........................................................................................65
5.3 CÁLCULO AMOSTRAL .....................................................................................65
5.4 PERÍODO DE ESTUDO.......................................................................................66
5.5 POPULAÇÃO REFERÊNCIA..............................................................................66
5.6 POPULAÇÃO DE ESTUDO ................................................................................66
5.7 SELEÇÃO DE PACIENTES.................................................................................67
Joseane da Fonseca Costa
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5.7.1 Critérios de elegibilidade ................................................................................67
5.7.2 Critérios de inclusão .......................................................................................67
5.7.3 Critérios de exclusão.......................................................................................67
5.8 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS..............................................................67
5.8.1 Extração de DNA ...........................................................................................67
5.8.2 Amplificação do DNA por PCR......................................................................68
5.8.3 Estratégias de Amplificação............................................................................68
5.8.4 Purificação do produto amplificado ................................................................71
5.8.5 Detecção do produto amplificado....................................................................72
5.8.6 Reação de Sequenciamento.............................................................................72
5.8.7 Sequenciamento automatizado........................................................................74
5.8.8 Análise das sequências obtidas através do sequenciamento.............................74
5.9 MATERIAIS.........................................................................................................77
5.9.1 Amplificação do DNA por PCR......................................................................77
5.9.2 Detecção do produto amplificado....................................................................81
5.9.3 Digestão do produto amplificado dos alelos 3A5*3 e 3A5*6 ...........................81
5.9.4 Reação de sequenciamento .............................................................................82
5.10 ANÁLISE DOS DADOS E ESTATÍSTICA........................................................82
5.11 ASPECTOS ÉTICOS..........................................................................................82
5.12 SUPORTE FINANCEIRO ..................................................................................82
6 RESULTADOS.......................................................................................................83
6.1 CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES ESTUDADOS.....................................83
6.2 PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DO GENE
CYP3A4 ......................................................................................................................86
6.2.1 Sistema CYP3A4*1B .....................................................................................86
6.2.2 Sistemas CYP3A4*4, *5 e *6.........................................................................87
6.2.3 Sistemas CYP3A5*3 e *6...............................................................................87
6.2.4 Sistema CYP2D6............................................................................................88
6.3 ANÁLISE DESCRITIVA DOS POLIMORFISMOS.............................................92
6.3.1 CYP3A4*1B ..................................................................................................92
6.3.2 CYP3A5*3.....................................................................................................94
6.3.3 CYP3A5*6.....................................................................................................95
Joseane da Fonseca Costa
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6.3.4 CYP2D6.........................................................................................................97
7 DISCUSSÃO ........................................................................................................112
7.1 CARACTERÍSTICA DA POPULAÇÃO ESTUDADA.......................................113
7.2 PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO..........................113
7.3 ANÁLISE DAS FREQUÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS 3A4*1B, 3A5*3 e *6
..................................................................................................................................116
7.4 ANÁLISE DAS FREQUÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS DO GENE CYP2D6
..................................................................................................................................118
7.5 LIMITAÇÕES DO ESTUDO..............................................................................120
7.6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................120
8 CONCLUSÕES ....................................................................................................122
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................123
10 APÊNDICE...........................................................................................................136
APÊNDICE 1 – TERMO DE CONSENTIMENTO....................................................136
APÊNDICE 2 – QUESTIONÁRIO PADRONIZADO ...............................................139
APÊNDICE 3 – ARTIGO..........................................................................................140
11 ANEXO ................................................................................................................151
ANEXO 1 – FOLHA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA151
Introdução
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A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa de evolução crônica que tem como
agente etiológico Mycobacterium tuberculosis (Mtb), uma bactéria álcool-ácido resistente,
aeróbica e de crescimento lento (BROOKS et al, 1998). Segundo Rosemberg (1999), a TB
assola a humanidade desde a antiguidade, com relatos que datam de 5.000 AC.
Devido à gravidade e facilidade de propagação, a TB foi considerada, nos últimos dois
séculos, um sério problema de saúde pública, principalmente na época da Revolução
Industrial iniciada na Inglaterra (BATES; STEAD, 1993). A partir de 1970, com a
introdução de esquemas terapêuticos encurtados contendo rifampicina (R), de elevada
eficácia, obtendo-se cura em 95% dos casos, acreditou-se efetivamente na erradicação da
TB e a mesma deixou de receber a merecida importância. Nos anos 80, contudo, em nível
mundial, ocorreu um aumento da incidência de TB devido a piora das condições sócio-
econômicas, desestruturação dos sistemas de saúde e o aparecimento da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (RODRIGUES; SMITH, 1990; KOCHI, 1991). Nesta
mesma época, iniciou-se a Reforma no Setor da Saúde em diferentes países, passando de
uma estrutura vertical para uma horizontal na área assistencial (KRITSKI; RUFFINO-
NETTO, 2000). Em decorrência destas modificações realizadas de modo desordenado,
ocorreu o não cumprimento das metas assistenciais estabelecidas pelos Programas de
Controle de TB, principalmente em países em desenvolvimento, em seus diferentes níveis,
federal, estadual e municipal. Houve um aumento nas taxas de abandono ao tratamento
bem como o aparecimento da TB-multidroga-resistente (TB-MR). Este cenário levou a
Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1993, a considerar a TB como um problema de
saúde pública a nível mundial (RAVIGLIONE et al, 1995; KRITSKI; RUFFINO-NETTO,
2000).
Segundo a OMS, apesar de existir um tratamento com elevada taxa de cura, estima-se que
entre 2000 e 2020, um bilhão de pessoas se infectarão com o Mtb, cerca de 200 milhões
desenvolverão a doença ativa e 35 milhões irão a óbito no mundo se não forem
identificados novos métodos diagnósticos, novas vacinas, novos medicamentos e
desenvolvidas atividades mais apropriadas para um controle eficaz do paciente com TB
Introdução
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ativa e seus contatos (WHO, 2000). Dados provenientes da mesma organização referentes
ao ano de 2006 estimam um número de 9,2 milhões de novos casos de TB no mundo sendo
330.724 nas Américas. Em 2006, no Brasil, a OMS estimou a ocorrência de 93.933 novos
casos de TB sendo, 59.371 com baciloscopia positiva (WHO REPORT 2008).
No Brasil a TB é um grave problema de saúde pública. No estado do Rio de Janeiro, em
2006, foram relatados mais de 14.000 casos, sendo 7.734 (46,8%) destes oriundos do
município do Rio de Janeiro. Além da alta incidência da TB, principalmente em grandes
centros urbanos, a multidroga-resistência é outro fator que vem contribuindo bastante para
o agravamento da panorâmica geral da TB no país. No final da década de 90, em estudos
realizados na cidade do Rio de Janeiro, foi observada uma taxa de TB-MR primária de 7%
em hospitais gerais e somente 1% nos centros municipais de Saúde (FANDINHO et al,
1999; BRITO et al, 1998; BARRETO et al, 1998). Com o aumento da resistência aos
antimicrobianos ora em uso, novas estratégias são necessárias para evitar uma “catástrofe
global”, prevista pela OMS.
A concentração dos casos, nas áreas urbanas de países industrializados, e em particular nas
unidades hospitalares, local de elevada prevalência de pacientes com co-morbidades
(incluindo pacientes infectados pelo HIV, diabéticos, hipertensos entre outros), também
propiciou um aumento do risco de transmissão da infecção e do adoecimento por TB entre
os pacientes atendidos nestas unidades, além de complicações mais frequentes na condução
terapêutica da TB, como as reações adversas aos fármacos e/ou o descontrole terapêutico
das co-morbidades presentes (GRAM et al, 2002).
O tratamento para a TB é altamente eficaz se usado adequadamente, em doses corretas e
pelo tempo determinado (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). No Brasil, o tratamento é
inteiramente gratuito. O Esquema Básico (Esquema I) adotado pelo Ministério da Saúde é
baseado na multidrogaterapia e utiliza três fármacos: Rifampicina (R), Isoniazida (H) e
Pirazinamida (Z). Caso ocorra abandono do tratamento ou recidiva após cura é utilizado o
esquema 1R, ao qual, além dos três fármacos citados acima, é acrescido do Etambutol (E)
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).
Introdução
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A partir da introdução da rifampicina no uso clínico foi observada uma diminuição da
eficácia do tratamento das co-morbidades, comprovada laboratorialmente pela redução da
concentração plasmática dos fármacos co-administrados, como por exemplo, inibidores de
protease (indinavir, ritonavir e saquinavir), hipoglicemiantes (glibenclamida e repaglinida)
e anti-hiperlipêmicos (inibidores das HMG-CoA redutases) (RAE et al, 2001). No entanto,
o mecanismo de interação do fármaco com a R ainda não era conhecido. Hoje, sabe-se que
algumas interações da R com alguns fármacos podem ser explicadas pela indução de um
receptor chamado PXR (Pregnane X Receptor) que, ao ser ativado, induz algumas
isoenzimas do Citocromo P450 (CYP P450) (NIEMI et al, 2003).
O Sistema P450 compreende uma superfamília de hemo-proteínas (conjunto de enzimas)
que desempenham papel central no metabolismo oxidativo de numerosos substratos
endógenos e xenobióticos (RODRIGUES; RUSHMORE, 2002). Vários fatores podem
afetar a atividade das diferentes isoformas do CYP P450, como por exemplo, fatores
ambientais, genéticos e fisiológicos, refletindo, desta maneira, na farmacocinética e na
biotransformação do fármaco (CHOLERTON et al, 1992; GONZALEZ, 1992).
Polimorfismos genéticos podem ser críticos para determinar variações interindividuais na
expressão de diversas enzimas importantes do sistema CYP P450. Dentre as subfamílias de
enzimas que compõem o sistema multienzimático CYP P450, os citocromos
biotransformadores de fármacos mais relevantes são o CYP2 e CYP3. Estas famílias são
responsáveis pela biotransformação da maior parte dos fármacos que são dependentes do
sistema CYP P450 (GARCÍA-MARTÍN et al, 2001).
O termo Farmacogenética foi proposto pela primeira vez por Vogel em 1959. Desde então
tem sido utilizado para descrever diferenças genéticas interindividuais encontradas na
biotransformação de xenobióticos, as quais, frequentemente, acarretam diferenças na
biotransformação de determinados fármacos (GONZALEZ, 1992). Estas variações se
refletem na expressão diferencial do sistema CYP P450, e podem afetar tanto a eficácia
como a toxidade do fármaco. Portanto, a identificação de fatores responsáveis por estas
variações na biotransformação dos fármacos que apresentam importantes implicações
terapêuticas seria de grande vantagem, principalmente em uma população tão miscigenada
como a brasileira, onde a miscigenação étnico/racial provavelmente favorece o
Introdução
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aparecimento de novos haplótipos genéticos diferentes dos já descritos e possivelmente
associados com o desfecho de modificações na farmacocinética dos fármacos. A
determinação de tais variações genéticas é importante em vários contextos e poderia não
somente predizer o nível de expressão das diferentes isoformas do sistema CYP 450, como
também funcionarem como marcadores genéticos de um desfecho conhecido, permitindo
uma intervenção direta no esquema terapêutico de forma precoce, principalmente para o
paciente sujeito à terapia com certos fármacos concomitantes a R, no caso das co-
morbidades previamente exemplificadas (BURMAN et al, 2001; FINCH et al, 2002;
NIEMI et al, 2003).
A adaptação do regime terapêutico baseado em genotipagem pode ajudar a evitar efeitos
adversos e falha terapêutica, ajustando as doses de acordo com a classificação do indivíduo
(CASCORBI, 2003).
O presente estudo pretendeu estimar a prevalência de diferentes isoformas do CYP P450
(CYP 2D6, CYP3A4 e CYP3A5) na população atendida em um Hospital de Referência, na
cidade do Rio de Janeiro.
Revisão da Literatura
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2.1 GÊNERO Mycobacterium
As micobactérias fazem parte do grupo das Eubactérias que por sua vez, pertencem ao grande
grupo das bactérias Gram-positivas, podendo também ser chamadas de Actinomicetos
(BRENNAM; NIKAIDO, 1995). Do ponto de vista da taxonomia, estão muito próximas aos
membros dos gêneros Nocardia, Rhodococcus e Corynebacterium. Sua principal
característica tintorial é a álcool-ácido-resistência, pois resistem à descoloração pelo álcool e
ácido, normalmente utilizados na coloração de Ziehl-Neelsen. São aeróbias, não apresentam
motilidade, não formam esporos e nem cápsula (WAYNE; KUBICA, 1986). Sua distribuição
na natureza é ampla, podendo ser encontradas em ambientes aquáticos, no solo como espécie
saprófita ou em ambiente intracelular de vertebrados superiores (HERMANS; BONT, 1996).
Apresentam seu material genético rico em bases nitrogenadas guanina-citosina (G-C).
2.2 Mycobacterium tuberculosis
Em 1882, Robert Koch descobriu que o agente etiológico causador da TB era o Mtb.
Morfologicamente, Mtb possui a forma de bastonetes retos e finos, medindo entre 0,3-0,6 x 1-
4µm e apresenta um crescimento em forma de corda (fator corda), com uma disposição em
serpentina. Tal característica só está presente em micobactérias virulentas. O tempo de
geração, in vitro, sob condições ótimas, varia de 14 a 15 horas. São aeróbios estritos e
intracelulares facultativos (WAYNE; KUBICA, 1986).
O Mtb pertence ao complexo M. tuberculosis do qual também fazem parte o Mycobacterium
africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium bovis subsp.
caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipeddi e Mycobacterium canettii
(SOOLINGEN et al, 1997; BROSCH et al, 2002; COUSINS et al, 2003).
2.3 TRATAMENTO PARA TUBERCULOSE
No Brasil, o tratamento utilizado para a tuberculose varia de acordo com a classificação do
paciente. Basicamente, o esquema mais utilizado é o Esquema I (Esquema Básico), sendo
Revisão da Literatura
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usado para o tratamento dos novos casos. O esquema I utiliza a R, H e Z. Quando o paciente
abandona o tratamento ou apresenta recidiva após cura, o tratamento indicado é o esquema
básico reforçado com o E, denominado de Esquema 1R (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002):
No total de casos notificados, a cura para a TB é obtida em, aproximadamente, 70% dos casos
utilizando o esquema I. Já o esquema 1R é utilizado em, aproximadamente, 20% dos
pacientes que relataram abandono do tratamento prévio ou cura no episódio anterior da
doença (PCTMRJ, 2003).
2.3.1 Rifampicina
A R (figura 1), desenvolvida nos anos 60, foi o primeiro derivado da rifamicina B que,
quando administrada por via oral, apresentava atividade contra patógenos (NIEMI et al 2003).
É um dos mais potentes antibióticos existentes e apresenta um amplo espectro de ação. É
extremamente eficaz contra patógenos intracelulares, sendo introduzida, em 1968, no
tratamento encurtado da TB (CAMPBELL et al, 2001). É biotransformada no fígado
resultando em dois metabólitos, a formilrifampicina, que se apresenta em menor quantidade e
a desacetilrifampicina em maior quantidade. A formilrifampicina é inativa, sendo excretada
na urina. Já a desacetilrifampicina apresenta atividade antimicrobiana e é excretada na bile
junto com a R remanescente que não foi biotransformada (LAUNAY-VACHER et al, 2005).
O mecanismo de ação da R restringe-se a inibição da RNA polimerase da bactéria
(responsável pela transcrição), bloqueando assim a síntese de RNA mensageiro (mRNA) pela
bactéria (CAMPBELL, et al, 2001).
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Figura 1: Fórmula estrutural da Rifampicina (Campbell et al, 2001).
A R é um potente indutor de várias enzimas biotransformadoras de fármacos, tais como as do
sistema citocromo P450, especialmente a CYP3A4, presente no fígado e no intestino,
reduzindo as concentrações plasmáticas e os efeitos de vários substratos desta enzima (RAE et
al, 2001; NIEMI et al, 2003). Segundo Rae e outros, dentre os genes estudados do sistema
P450 o CYP3A4 é o mais induzível. No entanto, a R também induz outros membros da família
CYP3A, os gene CYP3A5 e CYP3A7, além do CYP2D6 (LEE et al, 2006).
A significância clínica dos efeitos da R sobre outros fármacos depende da magnitude da
interação e das características de farmacocinética e farmacodinâmica do fármaco co-
administrado. Na maior parte dos casos, a R reduz a biodisponibilidade do fármaco co-
administrado devido à ativação de enzimas que tem o mesmo substrato, resultando na redução
dos efeitos farmacodinâmicos (NIEMI et al, 2003).
A farmacocinética da rifampicina raramente é afetada por interações metabólicas pois sua
biotransformação não é mediada pelo sistema citocromo P450 (BURMAN et al, 2001).
Revisão da Literatura
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2.4 MODO DE AÇÃO DOS FÁRMACOS
O efeito de qualquer fármaco se dá em relação a três variáveis: Farmacodinâmica,
Farmacocinética e Variabilidade Biológica.
A variabilidade biológica é o fator específico de cada paciente que apresenta diferentes níveis
de expressão das enzimas metabolizadoras ou transportadoras dos fármacos. Estes fatores
normalmente são determinados com base no background genético de cada indivíduo e estão
diretamente relacionados a resposta ao fármaco. A Farmacodinâmica é a área da farmacologia
que estuda o efeito (potência) de um determinado fármaco em seu tecido alvo e a
Farmacocinética é o caminho que o fármaco percorre no organismo, não se tratando do
mecanismo de ação do fármaco, mas sim das etapas que esse fármaco sofre desde a
administração até a excreção, que são: absorção, distribuição, biotransformação e excreção
(KATZUNG, 2006).
A relação entre a farmacodinâmica e a farmacocinética pode ser resumida segundo o esquema
abaixo (Esquema 1).
Revisão da Literatura
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Esquema 1 – Relação entre Farmacocinética e Farmacodinâmica
2.5 BIOTRANSFORMAÇÃO DE FÁRMACOS
A biotransformação dos fármacos normalmente ocorre com o objetivo de eliminar
xenobióticos do organismo. Deste modo, modificações bioquímicas são realizadas de modo a
alterar a atividade farmacológica e a sua velocidade de excreção. Há formação de metabólitos
polares que apresentam menor solubilidade lipídica, resultando em uma reabsorção reduzida
e, consequentemente, uma maior velocidade de excreção. Enzimas responsáveis pela
biotransformação de muitos fármacos estão localizadas no retículo endoplasmático liso do
Dosagem
D
ose
I
ntervalo entre doses
Vias de administração
A
bsorção
D
istribuição
E
liminação
Metabolismo
Excreção
Concentração Plasmática
Concentração no local de ação
(receptores)
Efeito em nível tecidual
Efeito clínico observado
FARMACOCINÉTICA
FARMACODINÂMICA
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hepatócito (fração microssômica). Tais enzimas também são encontradas em outros órgãos,
como rins, pulmões e epitélio gastrointestinal, embora em menor concentração (GREGHI;
GREGHI, 1999).
As reações de Biotransformação de fármacos são classificadas em reações de funcionalização
(ou Fase I) e reações de conjugação (ou Fase II). As reações de Fase I têm como objetivo
converter o fármaco original em um metabólito mais polar através de reações de oxidação,
redução e hidrólise. As reações de fase II envolvem síntese e conjugação (KATZUNG, 2006).
Nas reações de fase I, o metabólito resultante pode ser farmacologicamente inativo, menos
ativo ou, às vezes, mais ativo que a molécula original. Quando o próprio metabólito é a forma
ativa, o composto original é denominado pró-fármaco (KATZUNG, 2006).
Diversas enzimas participam das principais vias de biotransformação de fármacos, e podem
ser divididas segundo o esquema abaixo (Esquema 2).
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Esquema 2 – Principais enzimas e vias
Sistema de monooxigenases do citocromo P450
Sistema de monooxigenases contendo flavina (FMO)
Oxidação Álcool desidrogenase e aldeído desidrogenase
Monoamino-Oxidase
Co-oxidação por peroxidases
NADPH-P450 redutase
Ferro em sua forma reduzida
Esterases e Amidases
Epóxido hidrolase
Glutationa s-transferases
Biossíntese de ácido mercaptúrico
N-acetiltransferases
UDP-glicuronil transferase
Aminoácido da enzima N-aciltransferases
Sulfotransferases
A maioria das reações oxidativas é realizada por um grupo de hemo-proteínas estreitamente
relacionadas denominadas de Citocromo P450. Outras enzimas oxidativas incluem as
Monoaminooxidases (MAO) e as Diaminooxidases (DAO) que são enzimas mitocôndriais e
desaminam oxidativamente aminas primárias e aldeídos. As MAO estão envolvidas na
biotransformação das catecolaminas e alguns antidepressivos (GREGHI; GREGHI, 1999).
R
edução
H
idrólis
e
Fase I
Fase II
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2.5.1 Fatores modificadores da biotransformação
A variação interindividual na biotransformação de fármacos é um ponto crítico na resposta
das terapias empregadas. Sabe-se que tais variações são multifatoriais, no entanto, fatores
genéticos representam uma importante fonte destas variações (Figura 2).
Figura 2: Diferente possibilidade de alterações na biotransformação de fármacos causados por
mudanças genéticas.
Mutações existentes nos genes que codificam para enzimas que biotransformam fármacos
podem resultar em um aumento, diminuição ou na perda da atividade enzimática, e até mesmo
na ausência da enzima. Polimorfismos genéticos e influências ambientais, que incluem o uso
concomitante de outras substâncias que induzam ou inibam enzimas biotransformadoras de
fármacos, além de doenças hepáticas são fatores modificadores da biotransformação
(KALANT; ROUSCHLAU, 1991). No entanto, o principal fator de alteração na
biotransformação é a interação entre fármacos na indução ou inibição enzimática, onde um
fármaco pode aumentar ou diminuir a biotransformação de outro (FONSECA, 1991).
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2.5.2 Interações entre fármacos
A interação entre fármacos ocorre quando dois ou mais fármacos competem pela mesma
enzima e quando a reação metabólica catalisada por esta enzima é o principal caminho de
eliminação. Esta interação também pode ocorrer quando a enzima responsável pela
biotransformação de um fármaco é induzida por um tratamento a longo prazo por outro
fármaco. Na maioria dos casos, a indução das enzimas do sistema CYP P450 é consequência
do aumento da transcrição do gene (LIN; LU, 1998).
Geralmente, os metabólitos de um fármaco são menos ativos do que o próprio fármaco e,
consequentemente, a indução enzimática resulta na redução dos efeitos farmacológicos devido
ao aumento da biotransformação do fármaco. Em alguns casos, o metabólito formado durante
a biotransformação pode ser quimicamente reativo, deste modo, a indução enzimática pode
resultar em um aumento de toxidade causado pela produção de metabólitos tóxicos. Porém,
existem alguns fármacos que não apresentam atividade, somente tornam-se ativos e eficazes
quando ocorre a formação do metabólito.
Além da indução, o sistema CYP P450 pode ser inibido e o mecanismo de inibição deste
sistema pode ser dividido em três categorias: inibição reversível, inibição quase irreversível e
inibição irreversível. Dentre estas, a inibição reversível é comumente o mecanismo
responsável por interações entre fármacos (HALPERT, 1995) e são resultantes da competição
do fármaco pelo sítio ativo da enzima envolvendo, provavelmente, só o primeiro passo do
ciclo catalítico na biotransformação (LIN; LU, 1998).
2.5.3 Polimorfismos de base única (SNPs)
O projeto do Genoma Humano, que iniciou em outubro de 1990, e continua até os dias de
hoje, promoveu uma enorme gama de novos conhecimentos, o qual tem sido altamente
benéfico ao entendimento da genética humana. O termo “substituição de nucleotídeos” vinha
sendo utilizado por geneticistas por várias décadas. A partir dos anos 90, este termo ficou
conhecido como polimorfismos de base única (SNPs), começando assim a febre por SNPs. Os
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) são as variações genéticas mais comuns em
humanos (COLLINS et al, 1997).
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Em 1967, Morton propôs uma classificação de alelos de acordo com a sua frequência
populacional, onde alelos com frequência entre 1% a 99% foram denominados polimórficos.
Logo, os SNPs são pequenas substituições de apenas um nucleotídeo no DNA genômico que
geram sequências alternativas diferentes (alelos) existentes em indivíduos normais de uma
população em que a frequência deste alelo é maior que 1% (BROOKES, 1999).
Os SNPs podem ser encontrados ao longo da sequência de um determinado gene em qualquer
região, contudo, os encontrados na região regulatória e na região codificante são os mais
comuns. Aproximadamente, metade dos SNPs localizados na região codificante apresenta
mutações (“missense”) que levam a troca do aminoácido correspondente, enquanto que a
outra metade são mutações silenciosas. Mutações “missense” podem ser neutras, não
alterando o fenótipo. No caso dos genes que codificam para enzimas envolvidas na
biotransformação de fármacos, tais mutações podem resultar em diferenças nas características
individuais de resposta terapêutica originadas por alterações na farmacocinética e/ou na
farmacodinâmica do fármaco (WANG; MOULT, 2001).
2.6 BREVE HISTÓRICO
Os estudos no campo da farmacogenética iniciaram-se poucos anos depois dos estudos
fundamentais de genética humana. No entanto, as primeiras observações sobre determinadas
variações ocorreram bem antes. No vilarejo de Croton (sul da Itália), em torno de 510 A.C.,
Pitágoras foi o primeiro a indicar que existia perigo quando se ingeria semente de fava. Hoje
já se sabe que o favismo é causado pela deficiência em glicose-6-fosfato-dehydrogenase
(G6PD), uma herança ligada ao X prevalente em um de cada três homens no sul da Itália e
Sardínia (NEBERT et al, 1999). A ausência de G6PD é incompatível com a vida, visto que
uma deficiência de 80-95% da atividade desta enzima pode levar a uma anemia hemolítica
induzida por sementes de fava (NEBERT et al, 1999).
Em 1932, Larry Snyder, reconhecido como o precursor da era da farmacogenética,
demonstrou que a diferença existente na resposta a um determinado produto químico era
devido a uma herança autossômica recessiva, similarmente ao que Garrod reportou para o
albinismo e outras desordens monogenéticas, há três décadas. Em 1957, Arno Motulsky
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propôs que a herança genética poderia explicar porque diferentes indivíduos diferem entre si
em relação à eficácia e a reação adversa de um determinado fármaco (NEBERT et al, 2008).
2.6.1 Farmacogenômica x Farmacogenética
A farmacogenética contemporânea foi estabelecida por volta dos anos 50 através de relatos de
toxidade de um metabólito secundário de um fármaco por defeito em uma enzima
biotransformadora de fármacos e tinha como foco o resultado do efeito de um único gene. O
conceito da farmacogenômica foi introduzido no final dos anos 90 para tentar explicar as
bases hereditárias das variações existentes na resposta aos fármacos. Similar a
farmacogenética, o objetivo da Farmacogenômica é determinar as bases moleculares e
genéticas que variam entre a eficácia do fármaco e sua segurança. Entretanto, a
farmacogenômica amplia o conceito da farmacogenética que, em vez de abordar um único
gene, engloba todos os genes do genoma humano, incluindo as enzimas biotransformadoras
de fármacos (OZDEMIR et al, 2001).
Segundo Nebert (1999), os estudos em farmacogenética e farmacogenômica apresentam a
possibilidade de se desenvolver trabalhos em vários níveis do conhecimento que podem ir
desde o campo molecular até o campo clínico. Esses trabalhos incluem a farmacologia, a
toxicologia, a biologia molecular e a genética humana, a medicina interna, a endocrinologia, a
fisiologia, a epidemiologia, a estatística, a bioinformática e a biologia computacional.
Dentre os possíveis campos de atuação, a farmacogenética clínica é a área onde se tem maior
interação com o paciente, logo, a proposta da farmacogenética clínica é distinguir entre
aqueles pacientes que respondem melhor ou pior ao fármaco ou aqueles que têm mais ou
menos riscos de desenvolver efeito adverso. Com essas informações, é possível adequar uma
terapia que maximize as chances de eficácia minimizando os riscos de reações adversas
(SPEAR et al, 2001). Entretanto, se faz necessário relacionar a resposta ao fármaco (fenótipo)
ao genótipo, necessitando para tal que se defina uma resposta ao fármaco clinicamente
confiável e que se identifique os SNPs relacionados. Além disto, é fundamental que a relação
entre o genótipo e o fenótipo observado seja estatisticamente significante (NEBERT, 1999).
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2.7 CITOCROMO P450
O citocromo P450 (CYP P450) é uma hemo-proteína que foi descrita por Garfinkel e
Klingenberg em 1958. É amplamente distribuído em todos os cinco reinos biológicos. Nos
humanos, pode ser encontrado no trato gastro-intestinal, no pulmão, nos rins, na próstata, no
epitélio nasal e da pele, nas gônadas, nas mamas, na placenta, no baço, no pâncreas e no
cérebro. No entanto, é no fígado que se encontra a maior quantidade de enzimas do sistema
CYP P450 (LEWIS, 2001). Estima-se que todo o retículo endoplasmático presente no fígado
contém, aproximadamente, 25.000 nmol de isoenzimas que compõe o Sistema CYP P450
(THUMMEL et al, 1997), no entanto, essas enzimas também são encontradas nas membranas
mitocondriais dos hepatócitos.
Nos seres humanos, aproximadamente, 80% do metabolismo oxidativo e mais de 50% de toda
eliminação dos fármacos utilizados em algum regime terapêutico pode ser atribuído a uma ou
mais isoenzimas do sistema CYP P450, as quais apresentam também um importante papel na
síntese de hormônios, na síntese de colesterol e no metabolismo da vitamina D (PAINE et al,
2006).
Segundo Ingelman-Sundberg (2004), o CYP P450 humano é dividido em três grupos
principais:
• aqueles pertencentes à família CYP 5-51 que normalmente apresentam alta afinidade
ao substrato e se mantiveram bem conservados durante a evolução;
• Aqueles da família CYP 1-3, que apresentam uma menor afinidade por seus
substratos, e são menos conservados evolutivamente, exibindo polimorfismos
genéticos importantes;
• E os da família CYP 4 relacionados à metabolização de ácidos e de alguns
xenobióticos.
As isoenzimas que compõe o sistema CYP P450 são mono-oxigenases que catalisam a
transformação de componentes lipofílicos em intermediários hidrofílicos e estão envolvidas
no metabolismo de fase I (CASCORBI, 2003). Em essência, a reação (abaixo) mediada pelo
sistema CYP P450 envolve a combinação de uma molécula de oxigênio com um substrato
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orgânico (RH) com o objetivo de produzir uma molécula de água e um metabólito mono-
oxygenado (LEWIS, 2001).
RH + O
2
ROH + H
2
O
(R= Substrato; RO= Produto)
Cerca de 200.000 substâncias químicas são biotransformadas pelas enzimas da família do
citocromo P450, catalisando diferentes tipos de reações químicas. Através da utilização de
técnicas mais refinadas, cerca de 1200 enzimas do citocromo P450 foram isoladas e
sequenciadas. (LEWIS, 2001).
Com o término do sequenciamento do genoma humano foi demonstrado a presença de cerca
de 107 genes do Sistema CYP P450 humano, sendo 59 ativos e 48 pseudogenes
(INGELMAN-SUNDBERG, 2004). Dos 59 genes ativos, é sabido que doze desempenham
um importante papel no metabolismo de vários xenobióticos, incluindo vários fármacos
utilizados clinicamente (LEWIS, 2004; INGELMAN-SUNDBERG, 2004). Neste contexto,
alguns fármacos são substratos de somente uma enzima do sistema CYP P450 enquanto
outros são biotransformados por várias enzimas deste sistema.
As famílias 1-3 do CYP P450 são responsáveis por 70-80% de toda a biotransformação dos
fármacos usados clinicamente mediada por enzimas de fase I, participando também do
metabolismo de um grande número de xenobióticos (BERTZ; GRANNEMAN, 1997;
EVANS; RELLING, 1999).
Shimada e outros, (1994) em um estudo pioneiro utilizando Euro-descendentes americanos e
japoneses caracterizaram as isoenzimas mais abundantes do sistema CYP P450 encontradas
no fígado humano adulto (Figura 3).
2e
-
2H
+
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Figura 3: Percentual de contribuição de algumas enzimas que compõem o sistema CYP P450
presentes no fígado humano adulto.
Para identificar qual isoenzima do sistema P450 é responsável pela biotransformação de um
determinado fármaco, várias abordagens têm sido desenvolvidas, incluindo: metabolismo
derivados de microssomos de enzimas de cDNA expressas; uso de inibidores seletivos com
microssomos; imunoinibição do CYP por anticorpos anti-P450 de isoformas específicas em
microssomos; correlação entre a formação de metabólitos de fármacos candidatos com várias
atividades das isoformas específicas do P450 em um painel de microssomos do fígado
(KALRA, 2007).
2.7.1 Nomenclatura
O sistema de nomenclaturas das proteínas pertencentes ao sistema P450 é baseado na
sequência protéica e na filogenia e foram nomeadas em ordem cronológica de acordo com a
submissão ao comitê de nomenclaturas (NELSON et al, 1996) (Figura 4).
As isoformas do P450 pertencentes à mesma família usualmente compartilham 40% de
identidade e os membros pertencentes à mesma subfamília compartilham 55% de identidade.
Estes dados são baseados na filogenia e na organização gênica (WERCK-REICHHART et al,
CYP2C (2C8; 2C9;
2C18; 2C19)
25%
CYP34 (3A4 e 3A5)
39%
CYP2D6 (
2%
)
CYP2B6 (
<1%
)
CYP2A6 (
6%
)
CYP2E1 (
9%
)
CYP1A2 (
18%
)
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2002; KALRA, 2007). No caso do gene apresentar o mesmo número, ele deverá ter a mesma
função e exibir um alto grau de conservação (INGELMAN-SUNDBERG, 2004).
Figura 4: Nomeando uma isoenzima do citocromo P450.
2.7.2 Isoformas do CYP P450
As famílias do sistema CYP P450 de mamíferos podem ser subdivididas, funcionalmente, em
duas classes maiores, aquelas que envolvem a biossíntese de esteróides e ácidos biliares, e
aquelas que realizam a biotransformação de xenobióticos. As três principais famílias de genes
do sistema CYP P450 (CYP1, CYP2 e CYP3) são responsáveis pela maioria da
biotransformação hepática de fármacos. Embora a família dos genes que codificam para as
enzimas do sistema CYP1 e CYP3 (CYP1A; CYP1B; CYP3A) seja relativamente simples, a
que codifica para as enzimas do sistema CYP2 é dividida em muitas subfamílias (CYP2A,
CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, etc.). Essas isoformas têm o mesmo centro oxidativo, mas
diferem em suas estruturas protéicas (LIN; LU, 1998).
Aproximadamente, 70% do CYP presente no fígado humano é composto pelas enzimas
CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C, CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A. Dentre as quais,
CYP3A (CYP3A4 e CYP3A5) e CYP2C (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18 e CYP2C19) são as
mais abundantes, alcançando os percentuais de 35% e 25% do total de CYP, respectivamente.
As outras isoformas contribuem em menor quantidade em relação a todas as isoenzimas do
CYP.
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A família CYP3A foi primeiramente caracterizada por Elshourbagy e Guzelian em 1980.
Existe uma rica literatura sobre CYP3A. Isto ocorre, em parte, por causa da importante
contribuição do CYP3A no primeiro passo da biotransformação de xenobióticos, e, como
consequência, a sua suscetibilidade aos efeitos de numerosos fármacos que induzem ou
inibem sua atividade catalítica (KALRA, 2007). Esta família é responsável pela
biotransformação de, aproximadamente, 60% dos fármacos utilizados. No entanto, a família
2C e 2D também desempenham importante função na biotransformação de fármacos. A
família CYP3A apresenta quatro membros, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 e CYP3A43. Em
adultos, o CYP3A4 e o CYP3A5 são encontrados no fígado e no intestino delgado (LAMBA
et al, 2002). Já o CYP3A7 é a maior isoenzima detectada no embrião humano, no feto e no
fígado de recém-nascidos, podendo ser detectado no fígado humano adulto, no entanto, em
concentração bem menor se comparado ao CYP3A4 (DE WILDT et al, 1999). O CYP3A43
foi recentemente descrito, sendo detectado no fígado, rins, próstata e pâncreas, sendo que a
concentração de RNAm no fígado é muito menor que o encontrado de CYP3A4
(DOMANSKI et al, 2001). O CYP3A4 é a isoenzima melhor estudada entre os membros da
família CYP3A, sendo descrita com uma alta variação interindividual na atividade enzimática
tanto in vivo quanto in vitro (SHIMADA et al, 1994; WESTLIND et al, 1999; THUMMEL;
WILKINSON, 1998). Apesar dos genes da família CYP3A estarem presente no mesmo
cassete, eles apresentam diferentes mecanismos de regulação pois são expressos em locais
diferentes (MATSUMURA et al, 2004).
2.7.2.1 CYP2D6
A enzima CYP2D6 é responsável pela biotransformação de vários fármacos, dentre os quais:
antidepressivos, antipsicóticos, beta bloqueadores, etc (DALY, 2003), além de
aproximadamente 25% dos fármacos biotransformados no fígado humano. O gene que
codifica para esta enzima é altamente polimórfico e, até o momento, setenta e três variantes
alélicas já foram identificadas (CASCORBI, 2003). O mesmo está localizado no cromossomo
22q13.1 e contém nove exons, gerando um RNAm de 1383 pb e uma proteína com 461
aminoácidos (debrizoquina hidroxilase) (ZANGER et al, 2004). É importante ressaltar que
este gene encontra-se em uma região (locus) onde estão localizados mais dois genes,
CYP2D7P, o qual é homólogo ao CYP2D6, porém apresenta uma inserção no primeiro exon
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que causa uma mudança na fase de leitura e o CYP2D8P, que é um pseudogene, com
múltiplas deleções e inserções, não apresentando uma fase aberta de leitura (CHOLERTON et
al, 1992; ZANGER et al, 2004). Um fato interessante é que o cromossomo 22 foi o primeiro a
ser totalmente sequenciado no Projeto do Genoma Humano, no entanto, CYP2D6 estava
ausente na sequência publicada, indicando que o DNA utilizado foi oriundo de um indivíduo
com deleção neste gene (IDLE et al, 2000).
O primeiro polimorfismo do CYP2D6 foi descrito nos anos 70 em estudos do metabolismo de
debrisoquina (anti-hipertensivo) e esparteína (anti-arritimico), onde dois grupos, um inglês e
outro alemão, observaram que alguns voluntários que participavam de um estudo de
farmacocinética sofreram reações adversas não esperadas (MAHGOUB et al, 1977;
EICHELBAUM et al, 1979). Dentre as variantes alélicas geradas em função da variabilidade
genética deste gene, as mais prevalentes são: CYP2D6*1 que é considerado o tipo selvagem,
CYP2D6*2, CYP2D6*9, CYP2D6*10 e CYP2D6*17, sendo que a maioria deles não apresenta
função (XIE et al, 2001).
De acordo com Xie e outros (2001), dentre as variações genéticas encontradas no CYP2D6,
inclui-se: deleções de um fragmento do gene; duplicação ou multiplicação de genes; SNPs e
inserções. Assim, com base na relação genotípica-fenotípica, quatro subgrupos foram criados
para representar o tipo de biotransformação de fármacos: os Biotransformadores Ultra-rápidos
(UM), os Biotransformadores Extensivos (EM), os Biotransformadores Intermediários (IM) e
os Biotransformadores Fracos (PM). Teoricamente, UM carrega pelo menos, três alelos
funcionais, enquanto que EM é definido pela presença de dois alelos funcionais. IM carrega
somente um alelo ativo e PM apresenta a ausência de dois alelos funcionais.
Os alelos não funcionais, ou alelos nulos, não codificam para uma proteína funcional e,
consequentemente, não há atividade enzimática. Estes alelos podem ser divididos em três
categorias: a) os que apresentam mutação em um único nucleotídeo ou uma pequena
deleção/inserção que interrompe a sequência de leitura resultando em uma proteína prematura
(2D6*3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44); b) os alelos que codificam para
uma proteína completa, mas não funcional (2D6*7, *12, *14, *18); c) aqueles alelos que são
oriundos de uma grande deleção cromossomial, resultando na perda do gene por completo do
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gene de CYP2D6 (2D6*5) ou uma interrupção na sequência aberta de leitura (2D6*13, *16).
Os alelos *9, *10, *17, *36 e *41 são funcionais, no entanto, apresentam uma moderada
diminuição da atividade enzimática. Os indivíduos que demonstram aumento na concentração
protéica de CYP2D6 apresentam duplicação deste gene, podendo resultar em mais de duas
cópias (Figura 5) (ZANGER et al, 2004). A figura 6 mostra a frequência de indivíduos que
carregam o alelo que apresenta múltiplas cópias do gene CYP2D6 em diferentes partes do
mundo. Uma alta frequência pode ser observada na população da Etiópia e da Arábia Saudita.
Pode-se observar também que não há dados em relação à frequência na América do Sul.
Segundo Meijerman e outros (2007), o alelo CYP2D6*2xN, que apresenta a duplicação ou
multiplicação do CYP2D6, teve origem em um desequilíbrio no “crossover” entre duas
cromatinas irmãs. Como consequência deste “crossover” errôneo, uma cromatina “pegou” o
gene de CYP2D6 da outra, causando a duplicação deste gene em uma cromatina e a deleção
em outra.
O alelo mais comum associado com o fenótipo PM é o CYP2D6*4, que apresenta uma
transição G
1846
→A que causa um erro de “splicing” no terceiro “íntron”, resultando na
mudança da fase de leitura, a qual gera um códon de parada prematuro. Grande parte da
população oriental apresenta falta deste alelo, o que explica a baixa incidência do fenótipo PM
nesta população (DAHL, 2002; ZANGER et al, 2004). Mais de 40 fármacos utilizados no uso
clínico, como antidepressivos, antipisicóticos, codeinas e algumas outras são dependentes da
biotransformação pelo CYP2D6. Em geral, PM alcançam uma alta concentração do fármaco
em doses convencionais e apresentam um maior risco de toxidade. No caso de pró-fármacos
que precisam ser ativadas pelo metabolismo oxidativo, PM causa uma diminuição na sua
eficácia.
O alelo CYP2D6*9 expressa de uma enzima com atividade catalítica reduzida e o alelo
CYP2D6*10 apresenta mutação não-sinônima no exon 1 (C
100
→T) gerando uma enzima
instável (DAHL, 2002; ZANGER et al, 2004).
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Figura 5: Alelos do gene CYP2D6. Os nove exons são indicados pelo número de quadrados, com o
polimorfismo correspondente indicado na parte superior (del= deleção; ins= inserção). Mudança de aminoácido e
codon de terminação (ter) estão indicados (Zanger et al, 2004).
Alelos Funcionais de CYP2D6
Alelos não-funcionais de CYP2D6
Alelos com fun
ç
ão normal:
Alelos com fun
ç
ão diminuída:
Alelos com fun
ç
ão
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Figura 6: Frequência de indivíduos que carregam o alelo que apresentam múltiplas cópias do gene CYP2D6.
Embora a enzima codificada por CYP2D6 se apresente em menor concentração hepática se
comparado as outras do complexo CYP P450, ela faz parte de numerosas vias metabólicas de
fármacos e xenobióticos (EVANS; RELLING, 1999). O Quadro 1 apresenta uma lista destes
fármacos pertencentes a várias classes terapêuticas que são biotransformados pelo CYP2D6
(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).
Vários estudos prospectivos e retrospectivos têm demonstrado o potencial da genotipagem do
CYP2D6, não só para estudos da farmacocinética, mas também para o risco de efeitos
adversos e no desfecho do tratamento. Um exemplo destes foi o estudo prospectivo com
pacientes com câncer que receberam quimioterapia e tratamento antiemético (indicado para
prevenção ou tratamento de náuseas e vômitos), com um fármaco que era substrato do
CYP2D6. Kaiser e outros, (2002) descobriram que pacientes que foram definidos
geneticamente como UM reagiram negativamente à terapia com o antiemético, sugerindo que
a dose ajustada baseada na genotipagem poderia aumentar o efeito do antiemético. Em outro
estudo prospectivo, realizado com pacientes psiquiátricos tratados com o fármaco anti-
psicótico haloperidol, o grupo que foi definido, genotipicamente, como PM apresentaram
aumento significativo dos efeitos adversos e baixo efeito terapêutico (BROCKMOLLER et al,
2002).
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Quadro 1 – Fármacos de diferentes classes terapêuticas que são biotransformadas pelo
CYP2D6
CLASSE TERAPÊUTICA F ÁRMACO
Analgésico Codeína
Dextrometorfano
Dihidrocodeína
Etilmorfina
Hidrocodona
Norcodeìna
Oxicodona
Anti-transtorno do déficit de atenção/hiperatividade Atomoxetina
Anti-arritmicos Aprindina
Encainida
Flecainida
Mexiletina
N-propylajmalina
Procainamida
Propafenona
Esparteína
Anti-demência Galantamina
Nicergolina
Anti-depressivos Amitriptilina
Clomipramina
Desipramina
Imipramina
Nortriptilina
Citalopram
Desmetilcitalopram
Fluoxetina
Fluvoxamina
Maprotilina
Mianserina
Minaprima
Paroxetina
Venlafaxina
Anti-diabético Fenformina
Anti-estrogênio Tamoxifem
Anti-hipertensivos Debrisoquina
Guanoxam
Indoramina
Antiemético Dolasetrom
Revisão da Literatura
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51
Ondansetron
Tropisetron
Anti-histamínicos Mequitazina
Prometazina
Anti-psicóticos Haloperidol
Perfenazina
Risperidona
Tioridazina
Zuclopentixol
Supressor de apetite Dexfenfluramina
Beta Bloqueador Alprenolol
Bufuralol
Bunitrolol
Bupranolol
Carvedilol
Metoprolol
Propanolol
Timolol
Antagonista de cálcio Perhexilina
Inibidor de MAO Amiflamina
Brofaromina
Fármaco Recreacional Metoxianfetamina
MDMA (ecstasy)
Vasodilatador Cinarizina
Flunarizina
Visto a importância desta informação em estado precoce ao tratamento com estes fármacos, já
existe disponível no mercado um método comercial já foi desenvolvido para a genotipagem
de CYP2D6, além do CYP2C19, o AmpliChip™ CYP450 (Figura 7). Basicamente, este teste
é composto por cinco processos: a) amplificação por PCR de DNA purificado; b)
fragmentação e rotulação dos produtos amplificados; c) hibridação, por microarranjos
(microarray), dos produtos amplificados e coloração dos produtos ligados; d) escaneamento
dos microarranjos; e) determinação dos genótipos do CYP2D6 e CYP2C19 e predição do
fenótipo. Os dois primeiros passos são similares ao PCR alelo-específico realizado nos
laboratórios de pesquisa. O teste apresenta várias sondas de oligonucleotídeos específicos
depositados na lâmina sob áreas específicas que permite testar múltiplos alelos. Desta maneira
é possível determinar quatro fenótipos, UMs, EMs, IMs e PMs. Em janeiro de 2005 o FDA
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52
(Food and Drug Administration) aprovou o uso deste teste, sendo o primeiro teste de
farmacogenética aprovado por este órgão (LEON et al, 2006). No Brasil, somente em 2008 a
Roche Diagnostics registrou o AmpliChip™ CYP450. A grande desvantagem deste método é
que ele não é capaz de detectar a duplicação do gene CYP2D6, além de não detectar alguns
alelos raros ou aqueles que ainda não foram descritos.
Figura 7: AmpliChip™ CYP450.
2.7.2.3 CYP3A4
A isoenzima 3A4 do citocromo P450 (CYP3A4) é a mais abundante isoenzima humana do
sistema P450, sendo responsável pelo metabolismo oxidativo de, aproximadamente, 50% de
todos os fármacos. No fígado humano, o CYP 3A4 compõe cerca de 30% do total de
proteínas hepáticas do Sistema CYP P450 e altas concentrações foram achadas no epitélio do
duodeno e nos rins (GASHAW et al, 2003). Este gene foi o primeiro representante da família
CYP3A a ser identificado, sendo clonado por dois laboratórios separados (MOLOWA et al,
1986; BEAUNE et al, 1986). Inicialmente, acreditavam que um destes clones representava um
novo membro da família CYP3A, mas hoje sabe-se que é simplesmente uma variação alélica
do CYP3A4 (NELSON et al, 1996).
O gene que codifica para o CYP3A4 está localizado no cromossomo 7q22.1 e possui 13 exons
(BURK; WOJNOWSKI, 2004). Sua indução é mediada pelo receptor PXR que interage com
o receptor RXR (Retinoide X Receptor) e outros fatores transcricionais que se ligam ao
promotor permitindo a transcrição do gene. A indução desta isoenzima pode ser mensurada
Revisão da Literatura
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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53
através da concentração plasmática, através da quantificação da proteína e de sua atividade,
ou através da quantificação do RNAm diretamente nos hepatócitos, no entanto, esta fase
requer uma etapa invasiva, a biópsia de um fragmento do fígado (GASHAW et al, 2003).
Apesar de ser uma enzima extremamente importante na biotransformação de fármacos, sendo
desta maneira extremamente conservada, algumas variações genéticas são encontradas no
gene que codifica para o CYP3A4. Até o momento, trinta e cinco polimorfismos foram
descritos, sendo oito encontrados na região promotora e vinte sete na região codificante (19
Exons, 8 Íntrons) (Figura 8) (http://www.cypalleles.ki.se/cyp3a4.htm). No entanto, vários
alelos presentes em Euro-descendentes (*8, *9, *11, *12, *13 e *15) aparecem em uma
frequência alélica menor que 1%. O alelo mais frequente descrito para indivíduos Euro-
descendentes é o CYP3A4*2 (2,7%) (SATA et al, 2000). Em comparação com outras enzimas
do sistema P450, o CYP3A4 apresenta uma limitação em termos de variação pelo fato de
metabolizar vários componentes endógenos. Vários estudos têm sido realizados em busca de
novas variantes alélicas e dentre as já descritas, algumas codificam para proteínas com
atividade diminuída (*6, *17 e *20). No entanto, a baixa frequência destes alelos, bem como a
baixa variabilidade interindividual na atividade enzimática sugere que a variação genética
responsável pela variabilidade deve estar localizada em outra parte do gene de CYP3A4 ou em
fatores transcricionais (INGELMAN-SUNDBERG et al, 2007).
Figura 8: Distribuição das mutações no gene CYP3A4 (Lamba et al, 2002).
Existe uma variação substancial na expressão do CYP3A4 em humanos (10-100 vezes)
(SHIMADA et al, 1994), mas as base moleculares que regulam tal diferença ainda não foram
totalmente esclarecidas, podendo ser atribuídas as variação genética e/ou ambientais.
*1K, *1L, *1T
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O alelo CYP3A4*1B é caracterizado por uma substituição (transição) A→G na posição -290
da região promotora. Segundo Rebbeck e outros (1998), este polimorfismo está localizado em
uma região específica para a nifedipina. Na ocasião, os autores Rebbeck e outros (1998)
sugeriram que esta variante estaria associada a uma diminuição da expressão ou a uma
diminuição da atividade enzimática. No entanto, estudos farmacocinéticos não confirmaram
estes achados (BALL et al, 1999; SATA et al, 2000; MOLTKE et al, 2000).
O alelo CYP3A4*2 apresenta, na região codificante do gene, a troca do aminoácido serina por
uma prolina na posição 222 (Ser
222
Pro). Esta substituição está presente no exon 7 e pode
causar alterações na estrutura tridimensional da enzima já que a prolina é, sabidamente, não
formadora de hélice. Estudos sugerem que esta variante apresenta diferenças quantitativas na
atividade enzimática frente a nifedipina. No entanto, nenhuma diferença significativa foi
encontrada na hidroxilação da testosterona quando comparada com o tipo selvagem (HSIEH
et al, 2001).
O polimorfismo que caracteriza o alelo CYP3A4*3, substituição (transição) T
1432
→ C, está
localizado no exon 12 e resulta na troca do aminoácido Metionina por uma Treonina
(Met
445
Thr). Esta mutação está localizada em uma região conservada que contém um resíduo
Cys
442
que serve como ligante da região Heme-Fe no sítio ativo da molécula (SATA et al,
2000).
O Quadro 2 apresenta uma lista de fármacos pertencentes a várias classes terapêuticas que são
biotransformados por CYP3A4, CYP3A5 e CYP3A7 (FLOCKHART, 2007 -
http://medicine.iupui.edu/flockhart/table.htm).
Revisão da Literatura
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Quadro 2 – Fármacos de diferentes classes terapêuticas que são biotransformados pelas
enzimas codificadas por CYP3A4, CYP3A5 e CYP3A7
CLASSE TERAPÊUTICA F ÁRMACO
Antibióticos Claritromicina
Eritromicina (Exceto 3A5)
Anti-arritmicos Quinidina (Exceto 3A5)
Benzodiazepinas Alprazolam
Diazepam
midazolam
Triazolam
Moduladores Imunológicos Ciclosporina
Tacrolimis
Anti-retrovirais Indinavir
Nelfinavir
Ritonavir
Saquinavir
Pró-cinéticos Prometazina
Anti-histamínico Astemizola
Clorfeniramina
Terfenidina
Bloqueador de canal de cálcio Anlodipino
Diltiazem
Delodipino
Lercanidipino
Nifedipino
Nisoldipino
Nitrendipino
Verapamil
HMG Côa Reductase
Inibidores de CoA Redutase Atorvastatina
Cerivastatina
Lovastatina
Sinvastatina
Esteroides Estradiol
Hidrocortizona
Progesterona
Testosterona
Miscelânia Alfentanil
Buspirona
Cafergot
Cafeína
Revisão da Literatura
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Cocaína
Dapsona
Codeína
Dextrometorfam
Eplerenona
Fentanil
Glevec
Haloperidol
Irinotecam
LAAM
Lidocaína
Metadona
Nateglinida
Odanestron
Pimozida
Propanolol
Quinina
Salmeterol
Sildenafil
Sirolimus
Tamoxifem
Taxol
Terfenadina
Trazodona
Vincristina
Zaleprom
Zolpidem
2.7.2.4 CYP3A5
A isoenzima 3A5 do citocromo P450 (CYP3A5), juntamente com CYP3A4 são as isoenzimas
humanas mais abundantes do sistema P450 localizadas no fígado. A sobreposição de
especificidade dos substratos entre CYP3A4 e CYP3A5 dificulta a distinção em termos de
biotransformação destas duas enzimas (HIRATSUKA et al, 2002), além disto, somente 10 a
30% de indivíduos adultos expressam esta isoenzima no fígado (AOYAMA et al, 1989;
WRIGHTON et al, 1990). No entanto, uma vez expressa, representa cerca de 50% do total
proteína hepática da subfamília CYP3A (KUEHL et al, 2001). O gene que codifica para o
CYP3A5 está localizado na mesma região que o CYP3A4, no cromossomo 7q22.1, juntamente
com mais dois genes da subfamília CYP3A, o CYP3A7 e CYP3A43 (BURK; WOJNOWSKI,
2004).
Revisão da Literatura
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O alelo selvagem (CYP3A5*1A) apresenta uma alta expressão da enzima CYP3A5. No
entanto, vários SNPs tem sido descritos no gene que codifica para o CYP3A5 caracterizando
outros alelos. O alelo CYP3A5*3 foi descrito por KUEHL e outros (2001) e é caracterizado
por uma substituição (transição) A22893G no íntron 3. Esta mutação leva a um “splicing”
defeituoso, o qual origina um códon de parada prematuro, formando uma proteína truncada
com 109 aminoácidos. Indivíduos que apresentam o alelo *3 apresentam uma baixa expressão
hepática da enzima, resultando em uma diminuição da atividade hepática de CYP3A5 em
comparação com indivíduos com, pelo menos, um alelo selvagem (BALRAM et al, 2003).
Existem mutações dentro do íntron 4 e 5 do gene de CYP3A5 que também podem criar um
sítio errôneo de “splicing” afetando a produção de RNAm funcional. No entanto, essas
mutações, até o momento, sempre estão em combinação com o SNP localizado no íntron 3,
representando desta maneira haplótipos de CYP3A5*3 (*3A, *3B, *3C, *3D, *3E, *3F, *3G,
*3H, *3I, *3J, *3K e *3L) (http://www.cypalleles.ki.se/cyp3a5.htm). Um outro alelo
(CYP3A5*6) que apresenta uma transição na posição 30597 (G
30597
A) no exon 7, também
origina um códon de parada (KUEHL et al, 2001). Existem ainda outros alelos descritos (*4,
*5, *7, *8 e *9), porém a frequência dos mesmos é muito baixa (Figura 9) (CHOU et al, 2001;
SCHAIK et al, 2002; HIRATSUKA et al, 2002).
Figura 9: Distribuição das mutações no gene CYP3A5 (Lamba et al, 2002).
Para a maioria dos CYPs, a designação *1 é dada à sequência referência que é definida como
sendo o primeiro alelo sequenciado. Frequentemente, esta sequência é o alelo mais frequente
na população. No entanto, para o gene CYP3A5, a sequência de cDNA original que foi
designada como referência é a menos comum. O alelo CYP3A5*3 é o mais frequente e é
comumente associado com a ausência da proteína CYP3A5 (DALY, 2006).
CYP3A5 é o principal, se não exclusivo, membro da família CYP3A expresso fora do fígado
e do intestino (Ex: rim, pulmão, próstata, seios e leucócitos polimorfonucleares). Este fato
Revisão da Literatura
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sugere que o CYP3A5 pode apresentar uma importante função nestes tecidos, como por
exemplo, a mediação deste gene no metabolismo do cortisol para 6β-hidroxicortisol, um
regulador fisiológico do transportador de Na
+
no epitélio renal. Variação da expressão renal
de CYP3A5 pode contribuir para diferenças individuais no nefron, gerando, por exemplo,
uma hipertensão causada pelo aumento de retenção renal de Na
+
(LAMBA et al, 2002).
2.7.3 Distribuição das variantes alélicas de acordo com diferentes grupos étnico-raciais
2.7.3.1 CYP2D6
Vários estudos foram realizados para avaliação da frequência dos alelos encontrados no gene
de CYP2D6 em diversas populações. Estas frequências encontram-se descritas nas tabelas
abaixo.
TAMMINGA et al, 2001
População
*1 *3 *4 *6 *7
Euro-descendentes
Holandeses
0,793 0,184 0,004 0,001 0,00
GRIESE et al, 2001
População
*1 *2 *3 *4 *5 *6 *7
Aborígines
Australianos
0,858 0,038 0,00 0,015 0,075 0,00 0,00
Euro-descendentes
0,356 0,320 0,010 0,195 0,041 0,013 0,003
Orientais
0,350 0,200 0,00 0,00 0,090 -------- --------
Afro-descendentes 0,437 0,106 0,00 0,070 0,060 0,00 0,00
Revisão da Literatura
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População
*8 *9 *10 *16 *17 *2xN
Aborígines
Australianos
0,00 0,00 0,008 0,004 0,002 0,00
Euro-descendentes
0,003 0,020 0,020 0,003 0,00 0,016
Orientais
-------- -------- 0,340
-------- --------
0,020
Afro-descendentes 0,00 -------- 0,033 0,00 0,278 0,016
BOZINA et al, 2003
População
*1 *2 *3 *4 *6 *7
Euro-descendentes
Croatas
0,765 0,040 0,027 0,140 0,010 0,060
LUO et al, 2005
População
*1 *2 *3 *4 *5 *6 *7
Americanos
Mexicanos
0,551 0,180 0,02 0,100 0,017 0,004 0,00
População
*8 *9 *10 *11 *14 *17 *29
Americanos
Mexicanos
0,00 0,011 0,028 0,00 0,00 0,002 0,002
População
*41 *45 *46 *2xN
Americanos
Mexicanos
0,055 0,00 0,00 0,008
2.7.3.2 CYP3A4
Vários estudos foram realizados para avaliação da frequência dos alelos encontrados no gene
de CYP3A4 em diversas populações. Estas frequências encontram-se descritas nas tabelas
abaixo.
Revisão da Literatura
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SATA et al, 2000
População
CYP3A4*1A CYP3A4*1B CYP3A4*2
Chineses 1,00 0,00 0,00
Euro-descendentes 0,958 0,042 0,027
Afro-descendentes 0,333 0,667 0,00
BALL et al, 1999
População
CYP3A4*1A CYP3A4*1B
Euro-descendentes
Americanos
0,964 0,036
Hispano-Américos 0,907 0,093
Afro-descendentes
Americanos
0,391 0,609
Japoneses
Americanos
1,00 0,00
Chineses
Americanos
1,00 0,00
AHSEN et al, 2001
População
CYP3A4*1A CYP3A4*1B
Euro-descendentes
Alemães
0,900 0,100
SCHAIK et al, 2003
População
CYP3A4*1A CYP3A4*1B CYP3A4*3
Euro-descendentes
Holandês
0,959 0,041 0,011
Revisão da Literatura
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FLOYD et al, 2003
População
CYP3A4*1A CYP3A4*1B
Euro-descendentes
Americanos
0,957 0,043
Afro-descendentes
Americanos
0,338 0,662
REYES-HERNANDEZ et al, 2004
População
CYP3A4*1B CYP3A4*2
Mexicanos 0,058 0,00
2.7.3.3 CYP3A5
Vários estudos foram realizados para avaliação da frequência dos alelos *3 e *6 encontrados
no gene de CYP3A5 em diversas populações. Estas frequências encontram-se descritas nas
tabelas abaixo.
HIRATSUKA et al, 2002
População
CYP3A5*1 CYP3A5*3 CYP3A5*6
Japoneses 0,256 0,740 0,00
Euro-descendentes 0,092 0,908 --------
SCHAIK et al, 2002
População
CYP3A5*3 CYP3A5*6
Euro-descendentes
Holandeses
0,917 0,010
Revisão da Literatura
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FUKUEN et al, 2002
População
CYP3A5*1 CYP3A5*3 CYP3A5*6
Japoneses 0,232 0,767 0,00
KING et al, 2003
População
CYP3A5*1 CYP3A5*3
Euro-descendentes
Britânicos
0,065 0,935
FLOYD et al, 2003
População
CYP3A5*1 CYP3A5*3 CYP3A5*6
Euro-descendentes
Americanos
-------- 0,870 0,00
Afro-descendentes
Americanos
-------- 0,279 0,162
BALRAM et al, 2003
População
CYP3A5*1 CYP3A5*3 CYP3A5*6
Chineses 0,245 0,755 0,00
Malaios 0,390 0,610 0,00
Indianos 0,410 0,590 0,00
SUAREZ-KURTZ et al, 2007
População
CYP3A5*1 CYP3A5*3
Euro-descendentes
Brasileiros
0,220 0,780
Pardos Brasileiros 0,360 0,640
Afro-descendentes
Brasileiros
0,680 0,320
Justificativa
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V
V
A
A
No Hospital Clementino Fraga Filho, local de realização deste estudo, o percentual de
notificação de casos de TB com outras co-morbidades é elevado. A farmacogenética
mostra-se como relevante campo de estudo dentro do contexto da tuberculose no momento
atual, principalmente na interação entre fármacos no tratamento de paciente com TB e
outras co-morbidades. De fato, a diversidade genética sob a forma de SNPs pode contribuir
efetivamente na resposta a diversos fármacos contribuindo para uma ampla variabilidade
interindividual na efetividade e segurança dos mesmos. Os polimorfismos
farmacogenéticos de importância clínica foram descobertos com base nas diferenças
fenotípicas, em resposta a um fármaco entre indivíduos. Estudos de polimorfismos
impõem-se como de extrema relevância para escolha apropriada de associação
medicamentosa a fim de obter o controle adequado de co-morbidades com redução das
reações adversas. A perspectiva futura de novos fármacos/dosagens/associações
específicas com efeitos terapêuticos maximizados, de acordo com perfis genéticos,
auxiliará o controle desta pandemia e das co-morbidades associadas de forma significativa.
Objetivos
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G
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Identificar a prevalência dos polimorfismos dos genes CYP3A4, CYP3A5 e CYP2D6
pertencentes ao complexo citocromo P450 humano em pacientes com TB.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a
a
.
.
Identificar os polimorfismos presentes nos genes CYP3A4, CYP3A5 e CYP2D6 na
população estudada;
b
b
.
.
Identificar, através de sequenciamento do DNA, novos SNPs (não descritos na
literatura), presentes no gene CYP2D6.
Pacientes e Métodos
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É
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D
O
O
S
S
5.1 MODELO DO ESTUDO
Estudo transversal de prevalência.
5.2 LOCAL DO ESTUDO
O estudo foi realizado no complexo hospitalar: Instituto de Doenças do Tórax (IDT) e
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF) da Universidade Federal do Rio
de Janeiro (UFRJ). Trata-se de um complexo hospitalar universitário, centro nacional de
referência para AIDS e Tuberculose e hospital terciário de referência estadual para doenças
em geral.
5.3 CÁLCULO AMOSTRAL
Foram realizadas simulações para o cálculo amostral (Figura 10). O gráfico mostra cinco
diferentes tamanhos amostrais e oito diferentes possíveis prevalências populacionais. Para
cada tamanho de amostra, um intervalo de confiança de 95% foi calculado e plotado.
Como esperado, com o aumento do tamanho amostral, uma melhor precisão foi obtida.
Para o nosso proposto, o n= 400 foi satisfatório permitindo distinguir diferenças menores
de 0,1 dentro de um intervalo de confiança de 95%.
Pacientes e Métodos
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66
Figura 10: Cálculo amostral para diferentes proporções populacionais e tamanhos de amostras.
5.4 PERÍODO DE ESTUDO
A duração total do estudo foi de 36 meses. A inclusão de pacientes para o estudo ocorreu
de forma consecutiva, de março de 2005 a dezembro de 2005.
5.5 POPULAÇÃO REFERÊNCIA
Pacientes com diagnóstico de TB.
5.6 POPULAÇÃO DE ESTUDO
Pacientes com TB atendidos no programa de controle de TB hospitalar (PCTH) do
complexo hospitalar IDT-HUCFF-UFRJ, atendidos no período de outubro de 1998 a abril
de 2004.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.01
0
.05
0.1
0.15
0
.2
0.25
0.3
0
.35
0.01
0.05
0
.1
0.15
0.2
0
.25
0.3
0.35
0
.01
0.05
0.1
0
.15
0.2
0
.25
0
.3
0.35
0
.01
0.05
0.1
0
.15
0.2
0.25
0
.3
0.35
0.01
0
.05
0.1
0.15
0
.2
0.25
0.3
0
.35
Population Proportions
Sample Proportions
n = 50 n = 100 n = 200 n = 300 n = 400
Pacientes e Métodos
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67
5.7 SELEÇÃO DE PACIENTES
5.7.1 Critérios de elegibilidade
Foram considerados elegíveis para o estudo todos os pacientes com TB confirmada que
foram atendidos ambulatorialmente ou internados no IDT-HUCFF-UFRJ no período de
outubro de 1998 a abril de 2004.
5.7.2 Critérios de inclusão
Foram incluídos neste estudo, de modo sistemático, pacientes com TB, de ambos os sexos,
independente de cor, atendidos no IDT-HUCFF-UFRJ no período de outubro de 1998 a
abril de 2004 que, aceitaram participar do estudo, respondendo ao questionário próprio e
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 1).
5.7.3 Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo pacientes em cuja amostra não foi possível a realização dos
testes moleculares.
5.8 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
O sangue coletado em tubo apropriado (contendo EDTA como anticoagulante) foi
encaminhado para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UPT/DP/IDT/UFRJ,
onde foi identificado, catalogado e estocado a -20º C para posterior utilização.
5.8.1 Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada utilizando o Kit FlexiGene (Qiagen). Basicamente,
250µL de tampão de lise (FG1) foi adicionado a 100µL de sangue total, homogeneizado
por inversão (5x) e centrifugado por 20 segundos a 10.000 rpm. O sobrenadante foi
descartado e ao precipitado foi adicionado 50µL do tampão de desnaturação (FG2), sendo
homogeneizado por inversão (3x) e depois incubado por 5 minutos a 65ºC. Cinquenta
microlitros de isopropanol foi adicionado à mistura. Após precipitação do DNA, o tubo foi
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68
submetido à centrifugação por 3 minutos a 10.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado seco. Cinquenta microlitros de etanol 70% foi adicionado, posteriormente
centrifugado por 3 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante descartado. Após seco, ao
precipitado foi adicionado 100µL de tampão de hidratação (FG3) e posteriormente
incubado por 5 minutos a 65ºC. Após esta etapa, o material foi usado para amplificação.
5.8.2 Amplificação do DNA por PCR
Para amplificação por PCR, diferentes pares de oligonucleotídeos foram utilizados para
amplificação do fragmento de interesse dos genes a serem estudados (CYP2D6, CYP3A4 e
CYP3A5).
A padronização das condições de amplificação para cada gene foi realizada em um
termociclador (Eppendorf) com utilização de um bloco com a possibilidade de formação de
um gradiente de temperatura, permitindo uma variação de até 15ºC.
5.8.3 Estratégias de Amplificação
5.8.3.1 CYP2D6
Tendo em vista o tamanho do produto amplificado (1224 pb) a ser sequenciado, para o
gene de CYP2D6 foram utilizados quatro iniciadores para a realização de duas reações de
modo a cobrir toda a região de interesse no gene conforme esquematizado na figura 11.
Com esta estratégia foi possível sequenciar os exons 3, 4 e 5 e parte dos íntrons 2 e 5 e
todo o íntron 3 e 4.
Pacientes e Métodos
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69
Figura 11: Gene CYP2D6, com estratégia de sequenciamento.
5.8.3.2 CYP3A4
A genotipagem deste gene foi realizada através de PCR alelo-específico, utilizando
iniciadores específicos, onde a presença do alelo A foi representada pela amplificação de
um fragmento de 187 pb e o alelo G pela amplificação de um fragmento de 186 pb. Em
ambas as reações, um iniciador genérico foi utilizado (RIVORY et al, 2000).
5.8.3.3 CYP3A5
A genotipagem dos alelos *3 e *6 foi realizada através de PCR-RFLP, onde um erro na
sequência é criado. Desta maneira, as amostras que apresentarem o alelo mutante, criam
um sítio de restrição para a enzima Dde I (FUKUEN et al, 2002).
O alelo *3 (A
22893
→ G) muda a sequência CTCAA criando um sítio de reconhecimento
para a enzima Dde I (CTCAG) (Figura 12).
4290 pb
Sense Externo
Anti-Sense Externo
Sense Interno
Anti-Sense Interno
700 pb
737 pb
1224 pb
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Figura 12: (A) Gene CYP3A5*3, com estratégia amplificação, (B) Representação do resultado obtido através
da digestão utilizando a enzima Dde I em gel de agarose 3%.
O alelo *6 (G
30597
→ A) muda a sequência CTAAG destruindo um sítio de reconhecimento
para a enzima Dde I (CTAAA) (Figura 13).
*3 Sense
*3 Anti-Sense
200 pb
Exon 3 Exon 4
22 pb 107 pb 71 pb
D
de I
(alelo *3)
D
de I
(alelo *1 ou *3)
(
A
)
(
B
)
*1/*1 *1/*3 *3/*3
129 pb
107 pb
71 pb
22 pb
Pacientes e Métodos
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71
Figura 13: (A) Gene CYP3A5*6, com estratégia de amplificação, (B) Representação do resultado obtido
através da digestão utilizando a enzima Dde I em gel de agarose 3%.
5.8.4 Purificação do produto amplificado
A purificação do DNA foi realizada utilizando o Kit Charge Swith® PCR Clean-Up
(Invitrogen). Basicamente, 25µL de produto de PCR foi transferido para tubo de 1,5mL
estéril, onde, posteriormente foram adicionados 25µL de tampão de purificação (NS). Ao
tubo, foram adicionados 3µL de esferas magnéticas (Charge Swith Magnetic Beads). Após
(
A
)
*6 Sense
*6 Anti-Sense
237 pb
Exon 7
74 pb 103 pb 25 pb 35 pb
D
de I
(alelo *1 ou *6)
D
de I
(alelo *1)
D
de I
(alelo *1 ou *6)
(
B
)
*1/*1 *1/*6 *6/*6
128 pb
103 pb
74 pb
35 pb
25 pb
Pacientes e Métodos
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72
homogenização, a solução foi mantida a temperatura ambiente por 1 minuto. O tubo,
contendo a amostra foi colocado em uma estante imantada (Rack) por 1 minuto ou até as
esferas formarem um precipitado firme. Sem remover o tubo da estante, o sobrenadante foi
retirado e descartado, mantendo-se o precipitado com as esferas. Após este passo, o tubo
foi retirado da estante e a ele foi adicionado 65µL de tampão de Lavagem (WB) e após
homogeneização, sem permitir a formação de bolhas, o tubo foi colocado novamente na
estante por 1 minuto até o reagrupamento das esferas. Em seguida, o procedimento de
lavagem foi repetido por mais uma vez.
O tubo foi removido da estante e a ele foi adicionado 20µL de tampão de eluição (ES),
sendo homogeneizado gentilmente, misturado com a pipeta. Foi incubado por 1 minuto a
temperatura ambiente. Posteriormente, este tubo foi re-colocado na estante, por 1 minuto
ou até as esferas formarem um precipitado firme. Sem remover o tubo da estante, foi
transferido, com cuidado, 15µL do sobrenadante contendo o produto de PCR purificado
para microtubos de 0,5mL. Este tubo foi armazenado a -20ºC. A visualização do produto
purificado foi realizada através da coloração do DNA com brometo de etídeo (0,5 µg/mL)
e visualização em transiluminador de ultravioleta após eletroforese em gel de agarose 3%.
5.8.5 Detecção do produto amplificado
O produto amplificado foi detectado através de eletroforese em gel de agarose.
Posteriormente, o DNA foi corado com brometo de etídeo e transiluminado em luz
ultravioleta para visualização e fotodocumentação.
5.8.6 Reação de Sequenciamento
A reação de sequenciamento foi realizada em placa específica de acordo com o esquema
apresentado na figura 14, onde a metade correspondia as amostra de PCR purificado
contendo o iniciador sense e a outra metade apresentava as mesmas amostras só que
contendo o iniciador anti-sense. A reação de sequenciamento foi toda realizada sem a
incidência de luz sobre o mix e na placa. As condições de amplificação foram realizadas
em um termociclador.
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73
Figura 14: Representação de uma placa de sequenciamento.
Após amplificação, o produto amplificado contido na placa foi precipitado através da
adição de 30µL de isopropanol a 75%. Posteriormente essa placa foi agitada rapidamente
por 10 segundos, incubada por 15 minutos a temperatura ambiente, sempre protegida da
luz (coberta com papel laminado) e em seguida centrifugada a 4.000 rpm por 45 minutos a
20ºC.
Após centrifugação, a placa foi invertida sob papel toalha, para a retirada do sobrenadante
e posteriormente centrifugada na posição invertida, por 30 segundos a 300 rpm. 50µL de
etanol 75% foi adicionado a placa e depois foi submetida a centrifugação por 15 minutos a
4.000 rpm, a 20ºC. A placa foi, novamente, invertida sob papel toalha e centrifugada na
posição invertida, por 30 segundos a 300 rpm. O precipitado foi seco a 60ºC por 10
minutos. Posteriormente, as amostras foram ressuspensas em 10µL de formamida Hi-Di e
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Sense Anti-Sense
Pacientes e Métodos
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74
deixada por 3 minutos a 95ºC para desnaturação. Após essa etapa, a placa foi colocada
imediatamente no gelo (choque-térmico) para evitar o anelamento e depois levada para o
sequenciador.
5.8.7 Sequenciamento automatizado
Os métodos de sequenciamento automático utilizam os nucleotídeos de terminação e um
tipo de marcação que permite a identificação das cadeias resultantes. A marcação
empregada neste processo é feita com moléculas fluorogênicas, ou seja, compostos capazes
de emitir fluorescência quando excitados por uma fonte de luz. No sistema utilizado
(Plataforma PDTIS/FIOCRUZ [sistema da Applied Biosystems]), a fonte de luz
empregada para excitação dos fluoróforos é um laser de argônio acoplado a um sofisticado
sistema ótico, capaz de direcionar o feixe laser precisamente sobre as amostras a serem
analisadas. O sinal fluorescente gerado pela excitação com laser é direcionado pelo sistema
ótico a um sistema digital, capaz de decodificar o sinal eletrônico, transmitindo-o ao
computador acoplado o qual, através de softwares específicos irá traduzir este sinal numa
sequência de DNA.
As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando-se o “kit ABI PRISM
Big
Dye
Terminator v3.1” (PE Applied Biosystems) de acordo com as instruções do
fabricante, posteriormente adaptadas. Neste sistema a marcação fluorescente encontra-se
na extremidade 3’ do nucleotídeo de terminação, com cada cor correspondendo à uma base
específica. Em cada reação de sequenciamento, foi utilizado, aproximadamente, 20ng do
produto amplificado e os iniciadores utilizados nas respectivas reações de PCR. As reações
foram analisadas no sequenciador de 48 capilares “ABI PRISM
®
3730 Genetic Analyzer”
(Applied Biosystems), situado no Laboratório de Biologia Molecular da FIOCRUZ/
Plataforma PDTIS.
5.8.8 Análise das sequências obtidas através do sequenciamento
As sequências foram analisadas pelo programa SeqScape versão 2.6 da Applied
Biosystems (figuras 15). Este software é uma ferramenta de alinhamento e comparação de
Pacientes e Métodos
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75
sequências que permite uma rápida identificação de variantes na sequência (figura 16A e
B). O software permite alinhar e comparar sequências obtidas diretamente do sequenciador
automático contra uma sequência referência (figura 17). Ele é capaz de alinhar e comparar
múltiplas amostras mostrando o eletroferograma e o índice de qualidade de cada sequência
e o índice de qualidade do alinhamento e da comparação (figura 18), sendo assim permite
dois tipos de análise:
∗ Identificação de variantes nucleotídicas e aminoacídicas. O software identifica
posições que diferem da sequência referência e as classifica como variantes
conhecidas ou desconhecidas.
∗ Identificação de genótipos, alelos ou haplótipos de uma biblioteca. Além da
identificação de variantes, o software busca em bibliotecas e bases de dados de
genótipos, alelos, ou haplótipos e identifica o alelo que mais rigorosamente se
iguala com a sequência consenso.
Para facilitar a análise, o software gera um relatório das variantes encontradas na
comparação.
Figura 15: Página inicial do Software SeqScape.
Pacientes e Métodos
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76
Figuras 16 A e B: Ilustração da utilização do Software v.2.6. Nesta janela podem ser observadas as
sequências obtidas a partir de cada iniciador bem como a região de aproveitamento de cada uma
delas (verde). Nesse indivíduo foi detectado 1 SNP, ou seja, 1 base se apresentou distinta da
sequência referência (16B).
Figura 17: Ilustração da utilização do Software SeqScape v.2.6. Nessa janela pode ser observado o
alinhamento das amostras bem como as sequências referência.
Pacientes e Métodos
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77
Figura 18: Identificação de SNP através da visualização do cromatograma no programa SeqScape. A figura
mostra os três possíveis genótipos. (A) amostra mutante homozigota, (B) amostra mutante heterozigota e (C)
amostra homozigota tipo-selvagem.
Além de identificar mutações pontuais na sequência, o programa SeqScape fornece o
genótipo do referido polimorfismo, uma vez que estamos analisando os dois alelos através
da estratégia escolhida: sequenciamento a partir de produto de PCR.
5.9 MATERIAIS
5.9.1 Amplificação do DNA por PCR
5.9.1.1 CYP2D6
♦ Iniciadores
2D6-S-Ext 5’ ATA GGG TTG GAG TGG GTG GT 3’
2D6-AS-Int 5’ AGA GAC CGA GGA GTC TCT GC 3’
2D6-S-Int 5’ AGA GTC CTT GGC CTC TCC TG 3’
2D6-AS-Ext 5’ CTC CAA TTC TGC ACC TGT CA 3’
Pacientes e Métodos
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♦ Reação de amplificação Sense Externo x Anti-Sense Interno e Sense Interno x
Anti-Sense Externo
MgCl
2
1,5 mM
dNTPs 0,2 mM
Tampão 1x
2D6-S-Ext 50 pmoles
2D6-AS-Int 50 pmoles
Taq Polimerase (Invitrogen) 1,00 U
♦ Condições de amplificação Sense Externo x Anti-Sense Interno (700 pb)
94º C 5 minutos
Desnaturação 94º C 30 segundos
Anelamento 64º C 30 segundos 35x
Extensão 72º C 30 segundos
72º C 10 minutos
4º C ∞
♦ Condições de amplificação Sense Interno x Anti-Sense Externo (737 pb)
94º C 5 minutos
Desnaturação 94º C 30 segundos
Anelamento 60º C 30 segundos 35x
Extensão 72º C 30 segundos
72º C 10 minutos
4º C ∞
5.9.1.2 CYP3A4
♦ Iniciadores
3A4*1B-G 5’ TGA GGA CAG CCA TAG AGA CAA GGG TAG 3’
3A4*1B-A 5’ ATG AGG ACA GCC ATA GAG ACA AGG GCA A 3’
3A4*1B-GEN 5’ GAA TCA CAC ACA CAC CAC TCA CTG ACC TC 3’
Pacientes e Métodos
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79
♦ Reação de amplificação Alelo G
MgCl
2
1,5 mM
dNTPs 0,2 mM
Tampão 1x
Glicerol 10%
3A4*1B-G 50 pmoles
3A4*1B-GEN 50 pmoles
Taq Polimerase (Invitrogen) 1,00 U
♦ Reação de amplificação Alelo A
MgCl
2
1,5 mM
dNTPs 0,2 mM
Tampão 1x
Glicerol 10%
3A4*1B-A 50 pmoles
3A4*1B-GEN 50 pmoles
Taq Polimerase (Invitrogen) 1,00 U
♦ Condições de amplificação Alelo G e Alelo A
94º C 2 minutos
Desnaturação 94º C 30 segundos
Anelamento 67º C 30 segundos 35x
Extensão 72º C 20 segundos
72º C 5 minutos
4º C ∞
Pacientes e Métodos
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80
5.9.1.3 CYP3A5
♦ Iniciadores
3A5*3-S 5’ CTT TAA AGA GCT CTT TTG TCT CTC 3’
3A5*3-AS 5’ CCA GGA AGC CAG ACT TTG AT 3’
3A5*6-S 5’ GTG GGT TTC TTG CTG CAT GT 3’
3A5*6-AS 5’ GCC CAC ATA CTT ATT GAG AG 3’
♦ Reação de amplificação Alelo 3A5*3
MgCl
2
1,5 mM
dNTPs 0,2 mM
Tampão 1x
3A5*3-S 50 pmoles
3A5*3-AS 50 pmoles
Taq Polimerase (Invitrogen) 1,00 U
♦ Reação de amplificação Alelo 3A5*6
MgCl
2
1,5 mM
dNTPs 0,2 mM
Tampão 1x
3A5*6-S 50 pmoles
3A5*6-AS 50 pmoles
Taq Polimerase (Invitrogen) 1,00 U
♦ Condições de amplificação Alelo 3A5*3
95º C 10 minutos
Desnaturação 94º C 30 segundos
Anelamento 56º C 30 segundos 37x
Extensão 72º C 20 segundos
72º C 5 minutos
4º C ∞
Pacientes e Métodos
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
81
♦ Condições de amplificação Alelo 3A5*6
95º C 10 minutos
Desnaturação 94º C 30 segundos
Anelamento 58º C 30 segundos 37x
Extensão 72º C 20 segundos
72º C 5 minutos
4º C ∞
5.9.2 Detecção do produto amplificado
♦ Tampão de corrida Tris/Borato/EDTA (TBE) (5x)
Tris-base 54,00 g/L
Ácido bórico 27,50 g/L
EDTA 4,70 g/L
♦ Tampão para aplicação de amostra (5x)
Azul de Bromofenol 0,25 %
Xileno Cianol 0,25 %
Ficoll 400 15,00 %
♦ Solução de Brometo de Etídeo (1x)
Brometo de Etídeo 0,50 µg/mL
5.9.3 Digestão do produto amplificado dos alelos 3A5*3 e 3A5*6
♦ Enzima Dde I
Produto amplificado 12 µL
Tampão NB3 1 x
Dde I 5,00 U
O tubo contendo a digestão permaneceu por 12 horas a 37º C.
Pacientes e Métodos
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82
5.9.4 Reação de sequenciamento
♦ Isopropanol 75%
Isopropanol Absoluto 75,0 mL
H
2
O 25,0 mL
♦ Etanol 75%
Etanol Absoluto 75,0 mL
H
2
O 25,0 mL
5.10 ANÁLISE DOS DADOS E ESTATÍSTICA
As informações contidas no questionário padronizado (anexo 2) dos pacientes que
participaram do estudo foram incluídas em um banco de dados, especialmente criado no
programa “Microsoft Access” onde foram codificadas para posterior análise. O pacote
estatístico utilizado para as análises foi o SPSS 10.0. Para análise estatística foi utilizado o
teste χ
2
, considerando significativo um p-valor ≤ 0,05. A classificação de etnia foi
realizada de acordo com o observado pelo entrevistador.
5.11 ASPECTOS ÉTICOS
O presente estudo foi aprovado no Comitê de Ética do HUCFF-UFRJ no dia 18 de março
de 2005, com o número 046/04 (anexo 3).
5.12 SUPORTE FINANCEIRO
Este projeto foi financiado pelo:
CNPq (Edital Universal);
UFRJ (Programa de Apoio a Docente Recém-Doutor Antônio Luís Vianna -
ALV’2003)
FAPERJ (Programa Primeiros Projetos EDITAL MCT/CNPq/CT INFRA/FAPERJ
N
o
05 /2003)
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
83
6
6
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
6.1 CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES ESTUDADOS
No período de março de 2005 a dezembro de 2005 foram elegíveis 686 pacientes, e
incluídos no estudo 460. Foram excluídos do estudo 4 pacientes, pois apresentaram
problemas na genotipagem, não podendo ser amplificados.
As características sócio-demográficas da população estudada estão representadas na Tabela
1. A média de idade da população foi de 45 anos (gráfico 1).
Tabela 1 – Distribuição dos indivíduos segundo suas características.
Características N %
Sexo Feminino 159 34,9
Masculino 297 65,1
Etnia Branca 234 51,3
Negra 89 19,5
Parda 126 27,6
Outras 3 0,70
Ignorado 4 0,90
Instrução Alfabetizado 354 77,6
Analfabeto 12 2,60
Ignorado 90 19,7
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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84
Gráfico 1 – Distribuição dos indivíduos segundo a idade.
IDADE
85,0
80,0
75,0
70,0
65,0
60,0
55,0
50,0
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
Frequência
70
60
50
40
30
20
10
0
As características clínicas dos indivíduos incluídos no estudo estão representadas na
Tabela 2. Na amostra estudada, 10,7% apresentavam diabetes mellitus, dos quais, 57,1%
utilizavam antiglicemiantes, 13,6% apresentavam hipertensão arterial e 23,5% eram HIV
positivo. As frequências genotípicas esperadas na população estudada foram calculadas a
partir das frequências alélicas simples e foram consistentes com o equilíbrio de Hardy-
Weinberg segundo o teste do χ
2
.
Média= 45,40
DP*= 15,02
* DP= Desvio Padrão
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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85
Tabela 2 – Distribuição dos indivíduos segundo suas co-morbidades.
Características N %
Hepatite
Sim
90 19,7
Não 336 73,7
Ignorado 30 6,60
Diabetes
Sim
49 10,7
Não 393 86,2
Ignorado 14 3,10
Tipo de Diabete Insulino-dependente 7 14,3
Antiglicemiante 28 57,1
Ignorado 14 28,6
Hipertensão Sim 62 13,6
Não 282 61,8
Ignorado 112 24,6
Alcoolismo Sim 107 23,5
Não 340 74,6
Ignorado 9 2,00
HIV Positivo 107 23,5
Negativo 289 63,4
Recusado 19 4,20
Não oferecido 2 00,4
Ignorado 39 8,60
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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86
6.2 PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DO GENE CYP3A4
6.2.1 Sistema CYP3A4*1B
Tendo em vista os problemas para a amplificação do gene CYP3A4*1B utilizando as
condições de amplificação descritas por Rivory e outros (2000), testes adicionais foram
realizados no laboratório, para a padronização do sistema. Foram testadas: a) diferentes
concentrações de magnésio, b) a utilização de aditivos (BSA, Triton X-100, Glicerol e
DMSO) e c) a temperatura de anelamento através de gradiente de temperatura, cuja faixa
foi estabelecida de acordo com a temperatura de dissociação para cada gene.
Vários testes foram realizados, no entanto, os problemas com a amplificação continuaram.
Foi testado um novo lote de iniciadores com objetivo de verificar se os antigos
apresentavam problemas. Além disto, dois lotes de glicerol e termocicladores diferentes
foram testados.
Baseado em todos os testes realizados, o sistema CYP3A4 foi padronizado utilizando a
temperatura de anelamento de 67ºC, 1,5mM de MgCl
2
e 10% de glicerol e o
Termociclador da Marca Appollo e Eppendorf (Figura 19).
Figura 19: Gel de agarose 3% ilustrando a amplificação da variante G e da
variante A para a genotipagem do alelo CYP3A4*1B. M= marcador molecular
(DNA ladder 50pb). A= variante alélica A, G= variante alélica G.
M
G
G
A A M A A
AA AA AG AG
186 bp (CYP3A4-G)
187 bp (CYP3A4-A)
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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87
6.2.2 Sistemas CYP3A4*4, *5 e *6
Similarmente ao acontecido para o sistema de amplificação do gene CYP3A4*B, As
condições de amplificação descritas para os alelos *4, *5 e *6 de CYP3A4, Hsieh e outros
(2001) não funcionaram com as nossas amostras e os sistemas foram então re-
padronizados. Embora todos os testes descritos anteriormente para CYP3A4*B tenham sido
realizados, por motivos desconhecidos não obtivemos sucesso na tentativa de padronização
das condições de amplificação para estes alelos.
6.2.3 Sistemas CYP3A5*3 e *6
Para a amplificação deste gene e especificamente destes alelos (*3 e *6), As condições de
amplificação descritas por Fukuen e outros (2002) foram perfeitas, não sendo necessário
padronizar nenhuma das condições descritas (Figura 20).
Figura 20: Gel de agarose 1,5% ilustrando a amplificação dos alelos CYP3A5*3
e CYP3A5*6. M= marcador molecular (DNA leadder 100pb).
A digestão do material amplificado dos sistemas CYP3A5*3 (figura 21) e *6 (figura 22) foi
realizada conforme descrito por Fukuen e outros (2002), onde foi utilizado 5 unidades de
enzima/amostra.
M
M
200 bp (CYP3A5*3)
237 bp (CYP3A5*6)
Resultados
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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88
Figura 21: Digestão do material amplificado do sistema CYP3A5*3. Marcador
molecular 50pb ladder.
Figura 22: Digestão do material amplificado do sistema CYP3A5*6. Marcador
molecular 50pb ladder.
6.2.4 Sistema CYP2D6
Tendo em vista a grande variabilidade do gene que codifica para a enzima CYP2D6,
escolhemos a estratégia de sequenciamento de produto de PCR em relação ao custo-
*3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*1 M
129 bp
107 bp
71 bp
*1/*6 *1/*1 *1/*1 *1/*6 M *1/*1 *1/*6
128 bp
103 bp
74 bp
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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89
efetividade, ser o padrão ouro para qualquer genotipagem e ainda permitir a identificação
de SNPs novos, ainda não descritos na literatura. Para a realização dos experimentos, a
estratégia de sequenciamento desenvolvida baseou-se no desenho de dois iniciadores que
flanqueando os exons 3, 4 e 5, parte dos íntrons 2 e 5 e todo o íntron 3 e 4. A escolha desta
região foi embasada nos dados da literatura, que mostram uma grande concentração de
polimorfismos já descritos, (http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). A figura 23 mostra a
estratégia de sequenciamento em detalhes com os oligonucleotídeos externos, utilizados
para amplificação da região de interesse, os iniciadores internos, para o sequenciamento, a
posição dos SNPs já descritos na literatura assinalados no texto.
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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90
Figura 23: Estratégia de amplificação e sequenciamento de parte do gene CYP2D6 (sequência referência
AY545216) com a região de anelamento dos iniciadores externos e internos, os exons e as mutações já
descritas.
Inicialmente, a estratégia de amplificação foi desenvolvida para amplificação de um único
fragmento de 1224 pb, utilizando iniciadores externo e posteriormente, a utilização de
iniciadores internos no sequenciamento para a produção de dois fragmentos de 700 pb e
737pb. No entanto, a amplificação do fragmento de 1224 pb não foi possível.
1501 agccagggac tgcgggagac cagggggagc atagggttgg agtgggtggt ggatggtggg
1561 gctaatgcct tcatggccac gcgcacgtgc ccgtcccacc cccaggggtg ttcctggcgc
1621 gctatgggcc cgcgtggcgc gagcagaggc gcttctccgt gtccaccttg cgcaacttgg
1681 gcctgggcaa gaagtcgctg gagcagtggg tgaccgagga ggccgcctgc ctttgtgccg
1741 ccttcgccaa ccactccggt gggtgatggg cagaagggca caaagcggga actgggaagg
1801 cgggggacgg ggaaggcgac cccttacccg catctcccac ccccaggacg cccctttcgc
1861 cccaacggtc tcttggacaa agccgtgagc aacgtgatcg cctccctcac ctgcgggcgc
1921 cgcttcgagt acgacgaccc tcgcttcctc aggctgctgg acctagctca ggagggactg
1981 aaggaggagt cgggctttct gcgcgaggtg cggagcgaga gaccgaggag tctctgcagg
2041 gcgagctccc gagaggtgcc ggggctggac tggggcctcg gaagagcagg atttgcatag
2101 atgggtttgg gaaaggacat tccaggagac cccactgtaa gaagggcctg gaggaggagg
2161 ggacatctca gacatggtcg tgggagaggt gtgcccgggt cagggggcac caggagaggc
2221 caaggactct gtacctccta tccacgtcag agatttcgat tttaggtttc tcctctgggc
2281 aaggagagag ggtggaggct ggcacttggg gagggacttg gtgaggtcag tggtaaggac
2341 aggcaggccc tgggtctacc tggagatggc tggggcctga gacttgtcca ggtgaacgca
2401 gagcacagga gggattgaga ccccgttctg tctggtgtag gtgctgaatg ctgtccccgt
2461 cctcctgcat atcccagcgc tggctggcaa ggtcctacgc ttccaaaagg ctttcctgac
2521 ccagctggat gagctgctaa ctgagcacag gatgacctgg gacccagccc agcccccccg
2581 agacctgact gaggccttcc tggcagagat ggagaaggtg agagtggctg ccacggtggg
2641 gggcaagggt ggtgggttga gcgtcccagg aggaatgagg ggaggctggg caaaaggttg
2701 gaccagtgca tcacccggcg agccgcatct gggctgacag gtgcagaatt ggaggtcatt
Iniciadores Externos
Iniciadores Internos
Mutações descritas (substituição)
Mutações descritas (deleção)
Mutações descritas (inserção)
Exons
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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91
Como a estratégia inicial não apresentou resultados, foi decidido amplificar dois
fragmentos distintos, utilizando os iniciadores internos, os quais produzem uma banda de
700 pb e outra de 737 pb. Para a padronização do sistema de amplificação da região de
interesse foi realizado um gradiente de magnésio e temperatura os quais foram
padronizados como descrito a seguir: temperatura de anelamento de 64ºC, 1,5mM de
MgCl
2
para o fragmento de 700 pb (sense externo – anti-sense interno) e 60ºC, 1,5mM de
MgCl
2
para o fragmento de 737 pb (sense interno – anti-sense externo) (figura 24).
Figura 24: Gel de agarose 2% mostrando a padronização do sistema para a amplificação do
gene CYP2D6. M= marcador molecular DNA ladder 100pb.
6.2.4.1 Sistema CYP2D6 duplicação x deleção
Com objetivo de verificar a presença de duplicação do gene CYP2D6 ou deleção do
mesmo, a padronização de um PCR longo baseado nas condições de amplificação descritas
por Roberts e Kennedy (2006) foi testada, porém, sem sucesso. Também foi testada a
concentração da enzima responsável pela amplificação, o uso de Glicerol 10% e a
temperatura de anelamento. No entanto, apesar de todos os esforços, não foi possível a
padronização destes sistemas, impossibilitando a obtenção da frequência destes alelos em
nossa população.
700 bp
737 bp
M M
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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92
6.3 ANÁLISE DESCRITIVA DOS POLIMORFISMOS
6.3.1 CYP3A4*1B
De um total de 456 amostras, somente 444 foram amplificadas. A tabela 3 mostra a
distribuição genotípica dos indivíduos testados e na tabela 4 a frequência alélica.
Tabela 3 – Distribuição genotípica do alelo CYP3A4*1B (-290
A→G
).
Genótipo N= 444 Frequência
AA 299 0,67
AG 134 0,30
GG 11 0,03
Tabela 4 – Frequência alélica da variantes A>G CYP3A4*1B (-290
A→G
).
Alelo N= 888 Frequência
A 732 0,82
G 156 0,18
Podemos observar que embora a frequência da variante selvagem (A) seja predominante na
amostra estudada, a frequência da variante mutante (G) foi relativamentemente alta (19%).
Após a genotipagem, para verificar a possível influência das variantes alélicas A>G nas
variáveis demográficas de gênero e etnia, procedemos à comparação das frequências
observadas entre os grupos. Foi observada uma diferença significativa para etnia (tabela 5).
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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93
Tabela 5 – Características demográfica x alelo.
Características Alelo p-valor
Sexo A G
Masculino
477 101
Feminino
255 55 0,920
Etnia A G
Branco
402 56
Pardo
122 52
Negro
199 45 0,00000107
A tabela 6 mostra a análise de associação entre os carreadores e não carreadores da
variante mutante G e as características clínicas de hipertensão arterial e infecção com o
vírus HIV. Dos indivíduos que apresentaram hipertensão, 9,46% apresentaram o genótipo
AA e dos indivíduos que são positivos para o HIV, 18,24% apresentaram o genótipo AA.
Tabela 6 – Características Clínica x Genótipo.
Características Genótipo N %
Hipertensão AA 42 09,46
AG / GG 19 04,28
HIV AA 81 18,24
AG / GG 22 04,95
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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94
6.3.2 CYP3A5*3
Para a amplificação deste gene e determinação deste alelo, de um total de 456 amostras,
somente 451 foram amplificadas com sucesso. A tabela 7 mostra a distribuição genotípica
dos indivíduos testados e na tabela 8 a frequência alélica.
Tabela 7 – Distribuição genotípica do alelo CYP3A5*3 (22893
A→G
).
Genótipo N= 451 Frequência
*1/*1 86 0,19
*1/*3 255 0,57
*3/*3 110 0,24
Tabela 8 – Frequência alélica do alelo CYP3A5*3 (22893
A→G
).
Alelo N= 902 Frequência
*1 427 0,47
*3 475 0,53
Após a genotipagem das amostras, o alelo *3 foi testado contra as variáveis demográficas
de gênero e etnia. Foi observado uma diferença significativa para etnia (tabela 9).
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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95
Tabela 9 – Características demográfica x alelo.
Características Alelo p-valor
Sexo *1 *3
Masculino
284 306
Feminino
143 169 0,510
Etnia *1 *3
Branco
195 267
Pardo
105 71
Negro
119 131 0,00041
Dos indivíduos que apresentam hipertensão, 3,21% apresentaram o genótipo *1/*1 e dos
indivíduos que apresentavam HIV; 2,85% apresentaram o genótipo *1/*1 (Tabela 10).
Tabela 10 – Características clínica x genótipo.
Características Genótipo N %
Hipertensão *1/*1 18 03,21
*1/*3 - *3/*3 61 10,87
HIV
*1/*1 16 02,85
*1/*3 - *3/*3 90 16,04
6.3.3 CYP3A5*6
No total de 456 amostras, somente 439 puderam ser amplificadas. Na tabela 11 podemos
observar a distribuição genotípica dos indivíduos testados e na tabela 12 a frequência
alélica.
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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96
Tabela 11 – Distribuição genotípica do alelo CYP3A5*6 (30597
G→A
).
Genótipo N= 439 Frequência
*1/*1 374 0,85
*1/*6 65 0,15
Tabela 12 – Frequência alélica do gene CYP3A5*6 (30597
G→A
).
Alelo N= 878 Frequência
*1 813 0,93
*6 65 0,07
Após a genotipagem das amostras, o alelo *6 foi testado contra as variáveis demográficas
de gênero e etnia. Foi observado uma diferença significativa para etnia (tabela 13).
Tabela 13 – Características demográfica x alelo.
Características Alelo p-valor
Sexo *1 *6
Masculino
521 49
Feminino
292 16 0,066
Etnia *1 *6
Branco
428 24
Pardo
155 17
Negro
217 23 0,047
Dos indivíduos que apresentam hipertensão, 11,62% apresentaram o genótipo *1/*1 e dos
indivíduos que apresentavam HIV; 19,59% apresentaram o genótipo *1/*1 (Tabela 14).
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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97
Tabela 14 – Características clínica x genótipo.
Características Genótipo N %
Hipertensão *1/*1 51 11,62
*1/*6 - *6/*6 10 02,28
HIV
*1/*1 86 19,59
*1/*6 - *6/*6 16 03,64
6.3.4 CYP2D6
Após o sequenciamento, verificamos que cerca de 105pb iniciais e os 60pb finais eram
perdidos devido à má qualidade na sequência obtida (dados não mostrados). Entretanto,
conseguimos obter a sequência relativa a toda extensão do produto amplificado
(aproveitamento de aproximadamente 1000pb).
Os resultados foram analisados no programa de bioinformática SeqScape v.2.6 (Applied
Biosystems). Através da utilização da sequência referência AY545216 e posterior
alinhamento das sequências obtidas foi possível identificar (figura 25) e mapear (figura 26)
35 SNPs diferentes na região estudada do gene CYP2D6 na população em questão.
(A) (B) (C)
1649 G → A 1651 G → A 1653 T → A
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro verde (Adenina).
(heterozigoto)
Resultados
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98
1655 C → A 1657 C → A
(D) (E)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
1659 G → A
(F)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Um pico: um verde
(Adenina).
(homozigoto)
1661 G → C 1672 G → C
(G) (H)
Um pico: um azul
(Citosina).
(homozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
azul (Citosina).
(heterozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
azul (Citosina).
(heterozigoto)
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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99
1688 C → A 1704 C → G 1716 G → A
(I) (J) (L)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
preto (Guanina).
(heterozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
1763 G → A 1764 T → A 1810 G → A
(
P
)
(Q)
(
R
)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
vermelho (Timina).
(heterozigoto)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro preto (Adenina).
(heterozigoto)
1731 C → T 1744 T → A 1760 T → G
(M) (N) (O)
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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100
1816 G → A 1827 C → T
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
vermelho (Timina).
(heterozigoto)
(S) (T)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
1846 G → A
(U)
Um pico: um verde
(Adenina).
(homozigoto)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro verde (Adenina).
(heterozigoto)
1857 T → A 1914 C → T 1966 G → C
(V) (X) (Z)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
vermelho (Timina).
(heterozigoto)
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
azul (Citosina).
(heterozigoto)
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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101
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
azul (Citosina).
(heterozigoto)
1992 G → C 1998 T → C 2031 T → C
(Y) (W) (A’)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro azul (Citosina).
(heterozigoto)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro azul (Citosina).
(heterozigoto)
2097 A → G
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
(B’)
Um pico: um preto
(Guanina).
(homozigoto)
2123 C → T
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
vermelho (Timina).
(heterozigoto)
(C’)
Um pico: um vermelho
(Timina).
(homozigoto)
Resultados
_________________________________________________________________________________________________
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102
2236 T → C 2256 T → G 2257 C → A
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro azul (Citosina).
(heterozigoto)
(D’) (E’) (F’)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro preto (Guanina).
(heterozigoto)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
2291 G → A 2385 T → G
Dois picos: um preto
(Guanina) e outro
verde (Adenina).
(heterozigoto)
(G’) (H’)
Um pico: um verde
(Adenina).
(homozigoto)
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro preto (Guanina).
(heterozigoto)
2470 T → C 2575 C → T
Dois picos: um
vermelho (Timina) e
outro azul (Citosina).
(heterozigoto)
(I’) (J’)
Dois picos: um azul
(Citosina) e outro
vermelho (Timina).
(heterozigoto)
Resultados
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103
Figura 25: Identificação de SNPs no gene de CYP2D6 através da visualização do cromatograma
apresentado pelo programa SeqScape (A) 1649 G → A; (B) 1651 G → A; (C) 1653 T → A; (D) 1655 C
→ A; (E) 1657 C → A; (F) 1659 G → A; (G) 1661 G → C; (H) 1672 G → C; (I) 1688 C → A; (J)
1704 C → G; (L) 1716 G → A; (M) 1731 C → T; (N) 1744 T → A; (O) 1760 T → G; (P) 1763 G → A;
(Q) 1764 T → A; (R) 1810 G → A; (S) 1816 G → A; (T) 1827 C → T; (U) 1846 G → A; (V) 1857 T →
A; (X) 1914 C → T; (Z) 1966 G → C; (Y) 1992 G → C; (W) 1998 T → C; (A’) 2031 T → C; (B’) 2097
A → G; (C’) 2123 C → T; (D’) 2236 T → C; (E’) 2256 T → G; (F’) 2257 C → A; (G’) 2291 G → A;
(H’) 2385 T → G; (I’) 2470 T → C e (J’)2575 C → T.
Resultados
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104
Figura 26: Mapeamento dos SNPs encontrados no gene CYP2D6 na população de estudo. O
esquema mostra a região de anelamento dos iniciadores externos e internos utilizados para
amplificação, as mutações já descritas e as mutações encontradas ainda não descritas.
1501 agccagggac tgcgggagac cagggggagc atagggttgg agtgggtggt ggatggtggg
1561 gctaatgcct tcatggccac gcgcacgtgc ccgtcccacc cccaggggtg ttcctggcgc
1649 51 53 55 57 59 61 1672
1621 gctatgggcc cgcgtggcgc gagcagaggc gcttctccgt gtccaccttg cgcaacttgg
1688 1704 1707 1716 1724 1731
1681 gcctgggcaa gaagtcgctg gagcagtggg tgaccgagga ggccgcctgc ctttgtgccg
1744 1749 1757 58 60 63 64
1741 ccttcgccaa ccactccggt gggtgatggg cagaagggca caaagcggga actgggaagg
1810 1816 1827 1846 1857 58
1801 cgggggacgg ggaaggcgac cccttacccg catctcccac ccccaggacg cccctttcgc
1863 64 69 1914
1861 cccaacggtc tcttggacaa agccgtgagc aacgtgatcg cctccctcac ctgcgggcgc
1943 1966 1973 74 76 78 79
1921 cgcttcgagt acgacgaccc tcgcttcctc aggctgctgg acctagctca ggagggactg
1992 1998 2031
1981 aaggaggagt cgggctttct gcgcgaggtg cggagcgaga gaccgaggag tctctgcagg
2097
2041 gcgagctccc gagaggtgcc ggggctggac tggggcctcg gaagagcagg atttgcatag
2123 2129
2101 atgggtttgg gaaaggacat tccaggagac cccactgtaa gaagggcctg gaggaggagg
2161 ggacatctca gacatggtcg tgggagaggt gtgcccgggt cagggggcac caggagaggc
2236 2256 57
2221 caaggactct gtacctccta tccacgtcag agatttcgat tttaggtttc tcctctgggc
2291
2281 aaggagagag ggtggaggct ggcacttggg gagggacttg gtgaggtcag tggtaaggac
2385
2341 aggcaggccc tgggtctacc tggagatggc tggggcctga gacttgtcca ggtgaacgca
2401 gagcacagga gggattgaga ccccgttctg tctggtgtag gtgctgaatg ctgtccccgt
2470 2483
2461 cctcctgcat atcccagcgc tggctggcaa ggtcctacgc ttccaaaagg ctttcctgac
2539 40 41 42 2549 2556 2573 74 75
2521 ccagctggat gagctgctaa ctgagcacag gatgacctgg gacccagccc agcccccccg
2616 17 18
2581 agacctgact gaggccttcc tggcagagat ggagaaggtg agagtggctg ccacggtggg
2661
2641 gggcaagggt ggtgggttga gcgtcccagg aggaatgagg ggaggctggg caaaaggttg
2701 gaccagtgca tcacccggcg agccgcatct gggctgacag gtgcagaatt ggaggtcatt
Iniciadores Externos
Iniciadores Internos
Mutações já descritas e que foram encontradas
Mutações já descritas e que não foram encontradas
Mutações não descritas e que foram encontradas
Resultados
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105
Após o sequenciamento, somente 117 amostras puderam ser aproveitadas. Das 117
amostras, após análise através do software SeqScape, nove SNPs já descritos na literatura
foram identificados. Os outros vinte e seis não foram encontrados em banco de dados
(GenBank – Entrez SNP) podendo, portanto serem considerados como SNPs novos. A
tabela 15 mostra as frequências genotípica e alélicas dos SNPs encontrados na população
de estudo.
Tabela 15 – Distribuição genotípica e alélica dos SNPs encontrados no gene CYP2D6.
Posição Genótipo N Frequência (%) Alelo Frequência (%)
1649 GG 111 94,87 G 97,44
GA 6 05,13 A 02,56
AA 0 0,00
1651 GG 115 98,29 G 99,15
GA 2 01,71 A 0,85
AA 0 0,00
1653 TT 115 98,29 T 99,15
TA 2 01,71 A 0,85
AA 0 0,00
1655 CC 115 98,29 C 99,15
CA 2 01,71 A 0,85
AA 0 0,00
Resultados
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106
1657 CC 114 97,44 C 98,72
CA 3 02,56 A 01,28
AA 0
1659 GG 106 90,60 G 94,87
Já descrito
GA 10 08,55 A 05,13
AA 1 0,85
1661 GG 48 41,03 G 55,98
Já descrito
GC 35 29,91 C 44,02
CC 34 29,06
1672 GG 101 86,32 G 93,16
GC 16 13,68 C 06,84
CC 0 0,00
1688 CC 116 99,15 C 99,57
CA 1 0,85 A 0,43
AA 0 0,00
1704 CC 116 99,15 C 99,57
Já descrito
CG 1 0,85 G 0,43
GG 0 0,00
Resultados
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107
1716 GG 113 96,58 G 98,29
Já descrito
GA 4 03,42 A 01,71
AA 0 0
1731 CC 114 97,44 C 98,72
CT 3 02,56 T 01,28
TT 0
1744 TT 116 99,15 T 99,57
TA 1 0,85 A 0,43
AA 0 0,00
1760 TT 107 91,45 T 95,73
TA 10 08,55 A 4,27
AA 0 0,00
1763 GG 114 97,44 G 98,72
GA 3 02,56 A 01,28
AA 0
1764 TT 115 98,29 T 99,15
TA 2 01,71 A 0,85
AA 0 0,00
Resultados
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108
1810 GG 112 95,73 G 97,86
GA 5 04,27 A 02,14
AA 0 0
1816 GG 116 99,15 G 99,57
GA 1 0,85 A 0,43
AA 0 0,00
1827 CC 115 98,29 C 99,15
CT 2 01,71 T 0,85
TT 0 0,00
1846 GG 85 72,65 G 82,91
Já descrito
GA 24 20,51 A 17,09
AA 8 06,84
1857 TT 116 99,15 T 99,57
TA 1 0,85 A 0,43
AA 0 0,00
1914 CC 116 99,15 C 99,57
CT 1 0,85 T 0,43
TT 0 0,00
Resultados
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109
1966 GG 113 96,58 G 98,29
GC 4 03,42 C 01,71
CC 0 0
1992 GG 114 97,44 G 98,72
GC 3 02,56 C 01,28
CC 0
1998 TT 116 99,15 T 99,57
TC 1 0,85 C 0,43
CC 0 0,00
2031 TT 114 97,44 T 98,72
TC 3 02,56 C 01,28
CC 0
2097 AA 84 71,80 A 82,91
Já descrito
AG 26 22,22 G 17,09
GG 7 05,98
2123 CC 111 94,87 C 97,01
CT 5 04,27 T 02,99
TT 1 0,86
Resultados
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110
2236 TT 96 82,05 T 91,03
TC 21 17,95 C 08,97
CC 0 0,00
2256 TT 91 77,78 T 88,89
TG 26 22,22 G 11,11
GG 0 0,00
2257 CC 87 74,36 C 87,18
CA 30 25,64 A 12,82
AA 0 0,00
2291 GG 109 93,16 G 96,15
Já descrito
GA 7 05,98 A 03,85
AA 1 0,86
2385 TT 100 85,47 T 92,74
TG 17 14,53 G 07,26
GG 0 0,00
2470 TT 87 74,36 T 87,18
Já descrito
TC 30 25,64 C 12,82
CC 0 0,00
Resultados
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111
2575 CC 90 76,92 C 88,46
Já descrito
CT 27 23,08 T 11,54
TT 0 0,00
Dos SNPs encontrados, 11 deles apresentam-se em uma frequência menor que 1%, sendo
que destes, 1 SNPs já foi descrito (Tabela 15).
Dos SNPs já descritos, o SNP 1659 está associado ao alelo 2D6*29 e com função
diminuída do gene, o SNP 1661 está associado a alguns alelos com função diminuída. O
SNP 1704 está associado ao alelo 2D6*28 e que, aparentemente, não apresenta nenhuma
função alterada. O SNP 1716 está associado aos alelos 2D6*45 e 2D6*46 e que,
aparentemente, não apresenta nenhuma função alterada. Já o alelo 1846 está associado ao
alelo 2D6*4, sendo que este alelo é o mais comum associado ao fenótipo PM pois
apresenta um defeito no “splicing”. O SNP 2097 está associado ao alelo 2D6*4M e
2D6*4N e também apresenta defeito no “splincing”. O SNP 2291 está associado ao alelo
2D6*59 que apresenta a função do gene diminuída. O SNP 2470 está associado ao alelo
2D6*2C e, aparentemente não apresenta nenhuma função. Já o SNP 2575 está associado ao
alelo 2D6*1D e também, aparentemente, não apresenta nenhuma função (Tabela 15).
Dos SNPs ainda não descritos, somente dois apresentam frequência maior que 10%. Dos já
descritos, cinco apresentam frequência maior que 10%, sendo que um deles, o 1661
apresenta uma frequência bem elevada, 44,02% (Tabela 15).
Discussão
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112
7
7
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
Os avanços ocorridos nos últimos 30 anos na área da biologia molecular tem tido um
grande impacto no entendimento da biologia humana, incluindo a ação de fármacos e
outros xenobióticos. As ferramentas que têm sido desenvolvidas para permitir esses
avanços e o conhecimento dos princípios fundamentais das funções celulares básicas tem
se tornado indispensável para as pesquisas biológicas, incluindo o progresso da
biomedicina e do cuidado com a saúde.
Os conhecimentos moleculares e genéticos das doenças e a perspectiva epidemiológica de
como estes conhecimentos afetam a saúde são de vital importância na melhora da saúde
dos pacientes. Com o término do Projeto Genoma, a farmacogenética aflorou, e uma das
questões fundamentais nas pesquisas farmacogenéticas é avaliar o impacto no cuidado da
saúde e nas práticas médicas pela possibilidade de seleção do fármaco correto, para o
paciente correto, com a dose correta baseada em testes diagnósticos genéticos. Existem
várias razões do porquê um paciente responde ou não ao tratamento ou sofre efeitos
adversos. No entanto, a predisposição genética individual do paciente é a maior razão para
uma resposta terapêutica inapropriada. Os polimorfismos encontrados em enzimas
biotransformadoras de fármacos tem sido o foco nas pesquisas farmacogenéticas. A
maioria dos genes que codificam para enzimas envolvidas na metabolização ou
biotransformação de fármacos utilizados na prática clínica são polimórficos e as variações
genéticas ocorrem com bastante frequência.
O sistema CYP P450 humano está envolvido na biotransformação de diversos fármacos,
sendo que este sistema apresenta 55 diferentes genes, que estão classificados em diferentes
famílias e subfamílias. Os membros da família CYP3A, mais abundantemente encontrado
no fígado e no intestino e o CYP2D6 são os mais polimórficos.
A TB é um grande problema em nível nacional, principalmente nos grandes centros
urbanos. Na cidade do Rio de janeiro, 33% dos casos de TB são diagnosticados em nível
hospitalar e a maioria dos pacientes de TB apresenta uma ou mais co-morbidades, como
diabetes, hipertensão, dislipidemia e HIV. O tratamento da TB é realizado com esquemas
Discussão
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113
de multidrogaterapia, sendo rifampicina um dos fármacos mais importantes no esquema de
primeira linha. A rifampicina é forte indutora do sistema CYP P450, e, dependendo do
gene induzido, pode influenciar diretamente na resposta terapêutica paralelamente
administrada para o controle das co-morbidades eventualmente presentes. Portanto, o
conhecimento da prevalência das variantes genéticas envolvidas na biotransformação de
fármacos que são induzidos pela rifampicina na nossa população é de suma importância.
7.1 CARACTERÍSTICA DA POPULAÇÃO ESTUDADA
Neste estudo, os sujeitos da pesquisa arrolados pertenceram a uma coorte de pacientes com
as diferentes apresentações clínicas de TB (pulmonar ou extrapulmonar). Os dados
demográficos coletados demonstram que, aproximadamente, 23% desta população
apresentam algum tipo de co-morbidade, sendo que as maiores prevalências são de
pacientes HIV positivos. Os dados obtidos segundo a característica sexo, reflete a
porcentagem que é notificado pelo Ministério da Saúde.
No contexto dos genes que codificam para as enzimas biotransformadoras de fármacos,
vale ressaltar que a família CYP3A é composta por enzimas envolvidas na
biotransformação de vários fármacos utilizados no tratamento do HIV, os inibidores de
protease (indinavir, nelfinavir, ritonavir e saquinavir). Como a prevalência das variantes
presentes nestes genes, não havia sido determinada em nossa população em um grande
número de indivíduos e ainda não existem testes diagnósticos comerciais para
determinação do genótipo do paciente, é prática médica que pacientes que apresentam TB
e HIV mudem o coquetel de medicamentos antiretrovirais. No entanto, o mesmo não
ocorre no tratamento da Hipertensão Arterial.
7.2 PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO
A padronização dos sistemas de amplificação é de suma importância para a realização dos
testes de genotipagem. No entanto, muitas vezes, nos deparamos com problemas na
amplificação. Os métodos de amplificação utilizados neste estudo foram descritos pelos
autores criadores das técnicas. Porém, nem sempre as condições preconizadas funcionam a
Discussão
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114
contento. Com o sistema CYP3A5 não ocorreram problemas, a técnica foi reprodutível e a
genotipagem foi realizada sem problemas, porém, com o sistema CYP3A4 não ocorreu o
mesmo.
Todos os sistemas de amplificação apresentaram problemas e tiveram que ser re-
padronizados. O sistema de amplificação para a determinação dos alelos *1B, *4, *5 e *6
foram exaustivamente testados em relação as variáveis: temperatura de anelamento, a
concentração de magnésio, e o uso de aditivos. A temperatura de anelamento é uma das
etapas mais importantes para a amplificação do DNA, pois é a partir dela que se é
permitido a hibridação dos iniciadores no DNA alvo e a determinação da estringência do
sistema (SUGGS et al, 1981). A temperatura de anelamento baseia-se na temperatura de
dissociação (TM) do iniciador, que é uma relação entre a quantidade de nucleotídeos GC e
AT. Normalmente, a temperatura de anelamento ideal varia de 2 a 5º C abaixo da TM dos
iniciadores (ERLICH, 1989). Nos sistemas para determinação dos alelos *4, *5 e *6 não
foi possível determinar qual a temperatura de anelamento ideal pois a amplificação de um
fragmento inespecífico não conseguiu ser resolvida através da modificação destas
variáveis. Já em relação ao sistema para determinação do alelo *1B, a temperatura de
anelamento foi facilmente selecionada a partir de experimentos de gradiente, sendo a
temperatura de 67ºC identificada como a ideal. Outro fator de suma importância na
determinação da estringência do sistema é a concentração de magnésio (ERLICH, 1989). O
magnésio tem função primordial na qualidade de amplificação, pois a atividade da Taq
DNA polimerase (sensibilidade) e o anelamento dos iniciadores (especificidade) ao DNA
alvo são influenciados por ele. A combinação da temperatura de anelamento ideal com a
concentração ideal de magnésio faz com que o sistema torne-se mais específico para a
amplificação do fragmento esperado.
Algumas substâncias quando usadas concomitantemente na reação de amplificação
apresentam um aumento na qualidade de amplificação (BACHMANN et al, 1990). O BSA,
o triton x-100, o glicerol e o DMSO são alguns dos aditivos mais utilizados para
padronização, para a melhora do rendimento, especificidade e sensibilidade de alguns
sistemas. No entanto nenhuma destes foi capaz de melhorar a eficiência de amplificação
dos sistemas para determinação dos alelos *4, *5 e *6. Em contrapartida podemos verificar
Discussão
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115
que o glicerol foi fundamental no sistema para determinação do alelo *1B, aumentando a
especificidade do sistema. Como este sistema utiliza uma técnica de amplificação alelo-
específica a introdução deste aditivo foi fundamental para evitar resultados falso-positivos,
o que certamente comprometeria a descrição da prevalência. O uso do glicerol foi de suma
importância, pois aumentou a especificidade do sistema. Porém, a qualidade deste glicerol
também foi fator limitante na amplificação. Somente a utilização de um glicerol ultra-puro
permitiu a correta amplificação de ambos os alelos.
Outros fatores também foram importantes na qualidade de amplificação. O termociclador
utilizado e o local de síntese dos iniciadores foram determinantes. A troca de empresa
responsável pela síntese permitiu que os problemas fossem minimizados além do uso de
um único termociclador. As possíveis causas de problemas na utilização dos iniciadores
devem-se a forma de precipitação e a liofilização dos mesmos. Já o termociclador, a
provável instabilidade de aquecimento do bloco pode ser o motivo das divergências
encontradas.
A estratégia de amplificação do sistema CYP2D6 para o sequenciamento foi desenvolvida
em nosso laboratório. Inicialmente idealizamos a amplificação de um fragmento único de
1224pb. No entanto, esta estratégia não funcionou a contento, nos levando a opção
alternativa de amplificação de dois fragmentos menores (700pb e 737pb).
Da mesma maneira que os sistemas de amplificação para os alelos CYP3A4*4, *5 e *6, o
sistema para determinação da duplicação e deleção também não apresentou o fragmento
esperado. O tamanho esperado do fragmento amplificado seria de 4,7kb e 3.5kb. A técnica
utilizada para a amplificação de fragmentos grandes é chamada de PCR-longo e não é de
fácil reprodução, dentre os problemas mais comumente encontrados com este tipo de PCR
estão: a dificuldade para a desnaturação dos fragmentos de DNA (devido ao tamanho) e a
instabilidade da Taq DNA polimerase (SAMBROOK; RUSSELL, 2001). Para tentarmos
solucionar este problema, introduzimos uma troca na Taq polimerase utilizada passando a
realizar os experimentos com a enzima elongase da Invitrogen. Apesar de um alto custo, a
Elongase apresenta bons resultado, no entanto, em nosso sistema, mesmo com a utilização
de uma enzima específica, não tivemos sucesso.
Discussão
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116
7.3 ANÁLISE DAS FREQUÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS 3A4*1B, 3A5*3 e *6
A presença de polimorfismo nos genes do sistema P450 tem sido descrita por vários
autores (BALL et al, 1999; BALRAM et al, 2003; BOZINA et al, 2003; CHOU et al, 2001;
FLOYD et al, 2003; FUKUEN et al, 2002; GARCÍA-MARTÍN et al, 2001; GRIESE et al,
2001; HIRATSUKA et al, 2002; HSIEH et al, 2001; KING et al, 2003; RIVORY et al,
2000; ROBERTS; KENNEDY, 2006; SATA et al, 2000; SCHAIK et al, 2002, 2003;
SUAREZ-KURTZ et al, 2007; TAMMINGA et al, 2001). Contudo, sabe-se também que a
frequência dos polimorfismos já descritos varia muito de acordo com a etnia da população
estudada. A maioria dos autores trabalha com populações etnicamente homogêneas e,
portanto, muitas das associações descritas para uma determinada variante alélica pode não
representar fator genético de risco em outras populações. No Brasil, país com uma
população etnicamente mista, poucos são os dados referentes à frequência de
polimorfismos de base única nestes genes e os poucos estudos existentes, prendem-se a um
ou dois SNPs somente.
A família CYP3A humana apresenta a expressão de quatro membros, CYP3A4, CYP3A5,
CYP3A7 e CYP3A43. No entanto, somente os genes CYP3A4 e CYP3A5 apresentam uma
expressão significativa no fígado humano. A expressão desses genes pode variar de 10 a 40
vezes, e estas variações podem ser causadas por polimorfismos genéticos.
Para o sistema CYP3A4, foi analisada a frequência de somente um alelo na região
promotora do gene, a variante alélica CYP3A4*1B. Esta variante se apresenta em maior
frequência em negros americanos se comparado aos caucasianos americanos (KUEHL et
al, 2001). Somente um estudo realizado na população brasileira descreve a frequência do
alelo CYP3A4*1B (ALMEIDA et al, 2005), entretanto seu número amostral é menor (212),
se comparado ao nosso estudo, além das frequências encontradas (8,0%) diferirem das
encontradas em nosso estudo (18,0%.). Esta diferença pode estar relacionada ao fato da
população utilizada no estudo ser representada por mulheres com descendência européia.
Embora este alelo apresente-se em maior frequência em afro-descendentes americanos se
comparado aos euro-descendentes americanos, a frequência deste alelo em nossa
população foi de 18%, superior a qualquer outro estudo já realizado, normalmente em
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populações fechadas, onde os euro-descendentes apresentaram uma frequência de
aproximadamente, 4% e os afro-descendentes uma frequência de aproximadamente 66%
(SATA et al, 1999; BALL et al, 1999; AHSEN et al, 2001; SCHAIK et al, 2003; FLOYD
et al, 2003; REYES-HERNANDEZ et al, 2004). Esta divergência encontrada em nossa
população deve-se ao fato histórico de nossa colonização. A população do Brasil é muito
diversa e tem uma característica parental tri-hibrida, composta de afro-descendentes, euro-
descendentes e a população ameríndia. Esta miscigenação deu origem a outros tipos raciais
como o Mulato originado da miscigenação do branco com o negro; o Caboclo ou
Mameluco, do branco com o índio; o Cafuzo, do negro com o índio. Com o estímulo da
imigração, vieram, principalmente, italianos, espanhóis, austríacos, húngaros, eslavos,
germânicos, japoneses, sírios, libaneses e suíços alemães que se instalaram,
principalmente, na Região Sudeste e Sul. Mas a base do povo brasileiro é o elemento
português, que colonizou o país após 1500. A população indígena original do Brasil foi,
em grande parte, exterminada ou assimilada pela população portuguesa. Desde o início da
colonização, a mistura entre portugueses e nativos foi comum. O Brasil tem uma grande
população negra, descendente dos escravos africanos trazidos para o país do século XVI ao
século XIX. A população africana no Brasil misturou-se em larga escala com os
portugueses, criando uma grande população mestiça no país. Esta divergência étnica
também é observada nos alelos *3 e *6 do gene CYP3A5. A frequência do alelo *3 foi de
53% enquanto que do alelo *6 foi de 7%. Nos estudos realizados em populações fechadas,
as frequências encontradas em euro-descendentes foram de, aproximadamente, 94% (*3) e
1% (*6), enquanto que em afro-descendentes americanos foram de, aproximadamente,
28% (*3) e 16% (*6) (HIRATSUKA et al, 2002; SCHAIK et al, 2002; FUKUEN et al,
2002; KING et al, 2003; FLOYD et al, 2003; BALRAM et al, 2003).
Analisando-se a frequência dos polimorfismos 3A4*1B, 3A5*3 e 3A5*6 em indivíduos
que foram classificados fenotipicamente como pardos, afro-descendentes e euro-
descendentes, observa-se uma diferença significativa entre esses grupos (p-valor=
0,00000107, 0,00041 e 0,047, respectivamente). No entanto, esta análise apresenta alguns
fatores confundidores já que nenhum tipo marcador de etnia foi genotipado nestes
indivíduos para determinar com precisão a etnia predominante. Essa classificação foi
realizada de acordo com o entrevistador, onde o fator subjetividade prevalece.
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Em recente estudo realizado por Suarez-Kurtz e outros (2007), o impacto da distribuição
do alelo CYP3A5*3 na população brasileira foi determinado. Neste estudo, os autores
caracterizaram a etnia com base no consenso brasileiro, onde os indivíduos se alto
identificavam como euro-descendentes, pardos (cor castanha, intermediária) e afro-
descendentes. Paralelamente, uma outra categorização, baseada no método ACA
(componente de ancestralidade africana) também foi feita. Os autores concluem que
nenhuma diferença significativa foi encontrada comparando-se os dois métodos de
classificação. Visto que nossos resultados diferem completamente dos encontrados por
Suarez-Kurtz e outros (2007), possivelmente, a classificação basicamente fenotípica é
muito subjetiva e não possa ser utilizada como critério de definição de etnia. Contudo,
somente a genotipagem utilizando os marcadores de etnia ora aceitos para tal classificação
poderia dar uma resposta a esta questão baseada em fatos concretos.
Outro dado que corrobora a importância da utilização dos marcadores de etnia para a
definição da mesma refere-se ao fato do alelo *6, até então específico de afro-
descendentes, ter sido, em nossa população, encontrado numa prevalência de 2,6%. Este
resultado sugere que, mesmo os indivíduos que fenotipicamente são euro-descendentes,
provavelmente, têm origem afro-descendente.
7.4 ANÁLISE DAS FREQUÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS DO GENE CYP2D6
A isoforma CYP2D6 apresenta 2% do total das enzimas pertencentes ao sistema CYP
P450 expressas no organismo humano (SHIMADA et al,1994) e é altamente polimórfica.
É uma das isoformas do sistema P450 mais bem investigadas e apresenta uma lacuna de
informação em populações mistas. Mais de 80 fármacos utilizados na clínica são
biotransformados por esta isoforma, dentre estes, vários anti-psicóticos. Indivíduos
classificados como PM apresentam um maior risco de falha terapêutica e efeitos adversos.
Em nosso trabalho, analisando o fragmento sequenciado, encontramos diversos
polimorfismos (35 SNPs), sendo que destes, nove já haviam sido descritos. No entanto,
nove apresentaram frequência menor que 1%, não podendo ser considerado um SNP, já
que a premissa para um alelo ser considerado polimórfico é que apresente frequência maior
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que 1%. Entretanto, somente 117 amostras apresentaram qualidade, no sequenciamento,
suficiente para serem analisadas. A dificuldade encontrada no sequenciamento deve-se ao
fato deste gene apresentar algumas características bem peculiares, um alelo que apresenta
deleção tornando-o não funcional, um alelo que apresenta duplicação do gene em mais de
uma cópia e dois pseudogenes que apresentam alta homologia com o gene CYP2D6.
Algumas amostras apresentaram um padrão no sequenciamento que difere das outras
amostras. Este padrão poderia ser relacionado com algum tipo de contaminação ou poderia
estar relacionado à homologia encontrada nos pseudogenes 2D7 e 2D8.
Uma limitação da análise deste gene foi a impossibilidade de não conseguirmos identificar
a frequência de indivíduos que apresentavam o alelo com duplicação ou com deleção. Esta
limitação poderia estar influenciando na frequência dos SNPs encontrados e na descrição
dos novos. Os novos SNPs descritos poderiam estar associados ao gene deletado e por isso
a sua frequência ser baixa. Outro fator limitante destas frequências é que não foi possível
obter o sequenciamento com qualidade suficiente em todas as amostras, impossibilitando
alcançar o “N” desejável para o estudo. Entretanto, trata-se de um estudo pioneiro
realizado na população brasileira, mostrando o mapeamento desta região através da
utilização de sequenciamento (padrão ouro), capaz não somente de identificar SNPs já
existentes como também polimorfismos ainda não descritos na literatura. Somente um
estudo foi realizado na população brasileira, onde foram analisados 102 mulheres,
diagnosticadas com câncer de mama e que foram classificadas com descendência européia.
Neste estudo somente foi avaliado o alelo 2D6*4, que está relacionado com o fenótipo PM.
A frequência obtida deste alelo, neste estudo, foi de 20% (TORRESAN et al, 2008). Esta
frequência é a mesma encontrada por Griese e outros, (2001), que avaliou este alelo em
caucasianos. No entanto, nosso estudo encontrou o SNP relacionado ao alelo 2D6*4 (1876)
em uma frequência de 15,74%. Esta diferença poderia estar relacionada a diferença étnica
já que Torresan et al, (2008) somente avaliaram mulheres com descendência européia.
Outra limitação deve-se ao fato de que somente uma parte do gene foi sequenciado,
impossibilitando o rastreamento de todos os SNPs já descrito e a determinação dos alelos,
já que os alelo do gene CYP2D6 é composto por mais de um SNP.
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7.5 LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Este estudo apresenta alguns tipos de limitações. A maior limitação refere-se ao viés de
seleção, já que os indivíduos incluídos neste estudo são pacientes que são encaminhados a
um hospital terciário, podendo não representar a população de pacientes com TB que são
atendidos nos postos de saúde, entretanto, esses pacientes se caracterizam por
apresentarem uma forma de TB mais grave, o que não interferiria no perfil genético. Outra
limitação refere-se à obtenção dos dados clínicos, já que trata-se de um estudo que
utilizou-se dados retrospectivos. Uma outra limitação estaria relacionada ao viés de
aferição, já que as mutações encontradas no gene de CYP2D6 devem ser confirmadas por
um novo sequenciamento.
7.6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo se mostra pioneiro em nossa população, já que contempla a análise de vários
polimorfismos, sendo que os alelos CYP3A5*6 e o gene CYP2D6 (com exceção do alelo
*4) ainda não foram descritos em nossa população. Certamente estes dados serão de grande
valia para futuros estudos de associação na população brasileira, onde há uma alta
prevalência de TB apresentando co-morbidade (Diabetes, hipertensão e HIV) que
necessariamente têm que receber tratamento concomitante.
Tecnologias avançadas para identificar rapidamente polimorfismos genéticos, com
acurácia e economicamente viável são uma prioridade para implementação de testes
farmacogenéticos úteis e para o desenvolvimento de novos fármacos, triagens clínicas e o
monitoramento clínico da eficácia e toxicidade destes fármacos, sendo que a
implementação de um sistema de monitorização farmacométrica para estabelecimento do
nexo causal entre falhas terapêuticas / intoxicações, biodisponibilidade de fármacos e
associação com a prevalência dos diversos polimorfismos dos genes responsáveis pela
biotransformação de fármacos se faz necessário.
No futuro, as análises farmacogenéticas deverão ser integradas em todos os tipos de
pesquisa clínica, em estudos observacionais e nos estudos de intervenção. Além de que
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nenhuma discussão sobre o uso dos métodos genéticos no cuidado da saúde pode ser
completa sem as considerações de seu impacto nas questões éticas, sociais e legais.
Conclusões
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Neste estudo foi possível estimar e descrever o perfil dos polimorfismos de CYP3A4*1B,
CYP3A5*3, CYP3A5*6 e de nove SNPs já descritos no gene de CYP2D6 na população
estudada.
Foi possível identificar neste estudo 26 novas mutações ainda não descritas na literatura,
entretanto, somente 17 mutações podem ser classificadas como SNPs.
Referências Bibliográficas
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F
F
I
I
C
C
A
A
S
S
AHSEN, N. V.; RICHTER, M.; GRUPP, C.; RINGE, B.; OELLERICH, M.;
ARMSTRONG, V. W. No Influence of the MDR-1 C3435T Polymorphism or a CYP3A4
Promoter Polymorphism (CYP3A4-V Allele) on Dose-adjusted Cyclosporin a Trough
Concentrations or Rejection Incidence in Stable Renal Transplant Recipients. Clinical
Chemistry, v. 47, n. 6, p. 1048–1052, 2001.
ALMEIDA, S.; ZANDONA, M. R.; FRANKEN, N.; CALLEGARI-JACQUES, S. M.;
OSÓRIO-WENDER, M. C.; HUTZ, M. H. Estrogen-metabolizing gene polymorphisms
and lipid levels in women with different hormonal status. The Pharmacogenomics Journal,
v. 5, n. 346–351, 2005.
AOYAMA, T.; YAMANO, S.; WAXMANLL, D. J.; LAPENSON, D. P.; MEYER, U. A.;
FISCHER, V.; TYNDALE, R.; INABA, T.; KALOW, W.; GELBOIN, H. V.;
GONZALEZ, F. J. Cytochrome P-450 hPCN3, a Novel Cytochrome P-450 IIIA Gene
Product That Is Differentially Expressed in Adult Human Liver. The Journal Of Biological
Chemistry, v. 264, n. 18, p. 10388-10395, 1989.
BACHMANN, B.; LÜKE, W.; HUNSMANN, G. Improvement of PCR amplified DNA
sequencing with the aid of detergents. Nucleic Acids Research, v. 18, n. 5, p. 1309, 1990.
BALL, S. E.; SCATINA, J.; JOHN KAO; FERRON, G. M.; FRUNCILLO, R.; MAYER,
P.; WEINRYB, I.; GUIDA, M.; HOPKINS, P. J.; WARNER, N.; HALL, J. Population
distribution and effects on drug metabolism of a genetic variant in the 59 promotor region
of CYP3A4. Clinical Pharmacology and Therapeutics, v. 66, n. 3, p. 288-294, 1999.
BALRAM, C.; ZHOU, Q.; CHEUNG, Y. B.; LEE, E. J. D. CYP3A5*3 and *6 single
nucleotide polymorphisms in three distinct Asian populations. European Journal of
Clinical Pharmacology, v. 59, n. 2, p. 123-126, 2003.
BARRETO, C. E. N.; BRAVIN, Y.; PEREIRA, M. M.; CAVALCANTE, S.; SILVA, L. F.
D.; KRITSKI, A. L. Perfil de tuberculose resistente entre pacientes atendidos em 14
Centros Municipais de Saúde da cidade do Rio de Janeiro. Jornal de Pneumologia, v. 24, n.
supl 1, p. S165, 1998.
BATES, J. H.; STEAD, W. W. The history of tuberculosis as a global epidemic. The
Medical clinics of North America, v. 77, n. 6, p. 1205-1217, 1993.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
124
BEAUNE, P. H.; UMBENHAUER, D. R.; BORK, R. W.; LLOYD, R. S.;
GUENGERICH, F. P. Isolation and sequence determination of a cDNA clone related to
human cytochrome P-450 nifedipine oxidase. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, v. 83, n. 21, p. 8064-8068, 1986.
BERTZ, R. J.; GRANNEMAN, G. R. Use of in vitro and in vivo data to estimate the
likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. Clinical Pharmacokinetics, v. 32, n.
3, p. 210-258, 1997.
BOZINA, N.; GRANIC, P.; LALIC, Z.; TRAMIŠAK, I.; LOVRIC, M.; STAVLJENIC-
RUKAVINA, A. Genetic Polymorphisms of Cytochromes P450: CYP2C9, CYP2C19, and
CYP2D6 in Croatian Population. Croatian Medical Journal, v. 44, n. 4, p. 425-428, 2003.
BRENNAM, P. J.; NIKAIDO, H. The envelope of mycobacteria. Annual review of
biochemistry, v. 64, p. 29-63, 1995.
BRITO, R. C.; LIMA, D. B.; SIQUEIRA, H.; PAES, L. A. C.; CAVALCANTI, H. R.;
SILVA, I. S. V.; KRITSKI, A. L. Drug resistant Mycobacterium tuberculosis in a general
hospital, AIDS reference center in Rio de Janeiro, Brazil. In: 12th World AIDS conference,
Geneva. 1998. p.294.
BROCKMÖLLER, J.; KIRCHHEINER, J.; SCHMIDER, J.; WALTER, S.; SACHSE, C.;
MÜLLER-OERLINGHAUSEN, B.; ROOTS, I. The impact of the CYP2D6 polymorphism
on haloperidol pharmacokinetics and on the outcome of haloperidol treatment. Clinical
Pharmacology & Therapeutics, v. 72, n. 4, p. 438–452, 2002.
BROOKES, A. J. The essence of SNPs. Gene, v. 234, n. 2, p. 177–186, 1999.
BROOKS, G. F.; BUTEL, J. S.; ORNSTON, L. N. Micobacterias. Microbiologia Médica,
1998.
BROSCH, R. et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis
complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, v. 99, n. 6, p. 3684–3689, 2002.
BURK, O.; WOJNOWSKI, L. Cytochrome P450 3A and their regulation. Naunyn-
Schmiedeberg's archives of pharmacology, v. 369, p. 105–124, 2004.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
125
BURMAN, W. J.; GALLICANO, K.; PELOQUIN, C. Comparative pharmacokinetics and
pharmacodynamics of the rifamycin antibacterials. Clinical pharmacokinetics, v. 40, n. 5,
p. 327-341, 2001.
CAMPBELL, E. A.; KORZHEVA, N.; MUSTAEV, A.; MURAKAMI, K.; NAIR, S.;
GOLDFARB, A.; DARST, S. A. Structural Mechanism for Rifampicin Inhibition of
Bacterial RNA Polymerase. Cell, v. 104, n. 6, p. 901-912, 2001.
CASCORBI, I. Pharmacogenetics of cytochrome P4502D6: genetic background and
clinical implication. European Journal of Clinical Investigation, v. 33, n. Suppl. 2, p. 17-
22, 2003.
CHOLERTON, S.; DALY, A. K.; IDLE, J. R. The role of individual human cytochromes
P450 in drug metabolism and clinical response. Trends in Pharmacological Sciences, v. 13,
n. 1, p. 434-439, 1992.
CHOU, F.-C.; TZENG, S.-J.; HUANG, J.-D. Genetic polymorphism of cytochrome P450
3A5 in Chinese. Drug Metabolism Disposition, v. 29, n. 9, p. 1205-1209, 2001.
COLLINS, F. S.; GUYER, M. S.; CHAKRAVARTI, A. Variations on a Theme:
Cataloging Human DNA Sequence Variation. Science, v. 278, n. 5343, p. 1580-1581, 28
November 1997.
COUSINS, D. V. et al. Tuberculosis in seals caused by a novel member of the
Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp. International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 53, p. 1305-1314, 2003.
DAHL, M.-L. Cytochrome P450: Phenotyping/Genotyping in patients receiving
antipsychotics. Clinical pharmacokinetics, v. 41, n. 7, p. 453-470, 2002.
DALY, A. K. Pharmacogenetics of the major polymorphic metabolizing enzymes.
Fundamental & Clinical Pharmacology, v. 17, p. 27-41, 2003.
DALY, A. K. Significance of the Minor Cytochrome P450 3A Isoforms. Clinical
Pharmacokinetics, v. 45, n. 1, p. 13-31, 2006.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
126
DOMANSKI, T. L.; FINTA, C.; HALPERT, J. R.; ZAPHIROPOULOS, P. G. cDNA
Cloning and Initial Characterization of CYP3A43, a Novel Human Cytochrome P450.
Molecular Pharmacology, v. 59, n. 2, p. 386-392, 2001.
EICHELBAUM, M.; .SPANNBRUCKER, N.; STEINCKE, B.; DENGLER, H. J.
Defective N-oxidation of sparteine in man: a new pharmacogenetic defect. Eur J Clin
Pharmacol, v. 16, n. 3, p. 183-187, 1979.
ELSHOURBAGY, N. A.; GUZELIAN, P. S. Separation, purification, and characterization
of a novel form of hepatic cytochrome P-450 from rats treated with pregnenolone-16
alpha-carbonitrile. The Journal of Biological Chemistry, v. 255, n. 4, p. 1279-1285, 1980.
ERLICH, H. A. Polymerase chain reaction. Journal of Clinical Immunology, v. 9, n. 6, p.
437-447, 1989.
EVANS, W. E.; RELLING, M. V. Pharmacogenomics: Translating Functional Genomics
into Rational Therapeutics. Science, v. 286, n. 5439, p. 487-491, 1999.
FANDINHO, F.; KRITSKI, A. L.; HOFER, C.; CONDE, H. J.; FERREIRA, R.; SILVA,
L. F. M. Drug resistance patterns among hospitalized tuberculous patients in Rio de
Janeiro, Brazil, 1993-1994. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 94, n. 4, p. 543-547,
1999.
FINCH, C. K.; CHRISMAN, C. R.; BACIEWICZ, A. M.; SELF, T. H. Rifampin and
Rifabutin Drug Interactions. Archives of Internal Medicine, v. 162, p. 985-992, 2002.
FLOCKHART, D. A. Drug Interactions: Cytochrome P450 Drug Interaction Table.
Indiana University School of Medicine, 2007.
FLOYD, M. D.; GERVASINI, G.; MASICA, A. L.; MAYO, G.; GEORGE, A. L. J.;
BHAT, K.; KIM, R. B.; WILKINSON, G. R. Genotype-phenotype associations for
common CYP3A4 and CYP3A5 variants in the basal and induced metabolism of
midazolam in European- and African-American men and women. Pharmacogenetics, v. 13,
n. 10, p. 595-606, 2003.
FONSECA, A. L. D. Interações Medicamentosas. Rio de Janeiro: Publicações científicas,
1991.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
127
FUKUEN, S.; FUKUDA, T.; MAUNE, H.; IKENAGA, Y.; YAMAMOTO, I.; INABA, T.;
AZUMA, J. Novel detection assay by PCR-RFLP and frequency of the CYP3A5 SNPs,
CYP3A5*3 and *6, in a Japanese population. Pharmacogenetics, v. 12, n. 4, p. 331-334,
2002.
GARCÍA-MARTÍN, E.; MARTÍNEZ, C.; LADERO, J. M.; GAMITO, F. J. G.;
AGÚNDEZ, J. A. G. High frequency of mutations related to impaired CYP2C9
metabolism in a Caucasian population. European Journal of Clinical Pharmacology, v. 57,
n. 1, 2001.
GASHAW, I.; KIRCHHEINER, J.; GOLDAMMER, M.; BAUER, S.; SEIDEMANN, J.;
ZOLLER, K.; MROZIKIEWICZ, P. M.; ROOTS, I.; BROCKMO¨LLER, J. R.
Cytochrome P450 3A4 messenger ribonucleic acid induction by rifampin in human
peripheral blood mononuclear cells: Correlation with alprazolam pharmacokinetics.
Clinical Pharmacology & Therapeutics, v. 74, n. 5, p. 448-457, 2003.
GONZALEZ, F. J. Human cytochromes P450: problems and prospects. Trends in
Pharmacological Sciences, v. 13, n. 1, p. 346-352, 1992.
GRAM, K. R.; RIBEIRO, C.; LOREDO, C.; MELLO, F. C. D. Q.; KRITSKI, A. L.;
GONÇALVES, J. S. C. Farmacovigilância do uso de medicamentos associados a
rifampicina no tratamento da Tuberculose, em Hospital Geral. In: Workshop Rede TB.
2002.
GREGHI, C. M.; GREGHI, M. C. R. Interações medicamentosas. 1999.
GRIESE, E.-U.; ILETT, K. F.; KITTERINGHAM, N. R.; EICHELBAUM, M.; POWELL,
H.; SPARGO, R. M.; LESOUEF, P. N.; MUSK, A. W.; MINCHIN, R. F. Allele and
genotype frequencies of polymorphic cytochromes P4502D6, 2C19 and 2E1 in Aborigines
from Western Australia. Pharmacogenetics, v. 11, p. 69-76, 2001.
HALPERT, J. R. Structural basis of selective cytochrome P450 inhibition. Annual review
of pharmacology and toxicology, v. 35, p. 29-53, 1995.
HERMANS, J.; BONT, J. A. M. D. Techniques for genetic engineering in mycobacteria.
Antonie Van Leeuwenhoek, v. 69, p. 243-256, 1996.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
128
HIRATSUKA, M.; TAKEKUMA, Y.; ENDO, N.; NARAHARA, K.; HAMDY, S. I.;
KISHIKAWA, Y.; MATSUURA, M.; AGATSUMA, Y.; INOUE, T.; MIZUGAKI, M.
Allele and genotype frequencies of CYP2B6 and CYP3A5 in the Japanese population.
European Journal of Clinical Pharmacology, v. 58, p. 417–421, 2002.
HSIEH, K.-P.; LIN, Y.-Y.; CHENG, C.-L.; LAI, M.-L.; LIN, M.-S.; SIEST, J.-P.;
HUANG, J.-D. Novel Mutations of CYP3A4 in Chinese. Drug Metabolism and
Disposition, v. 29, n. 3, p. 268-273, 2001.
IDLE, J. R.; CORCHERO, J.; GONZALES, F. J. Medical implications of HGP's sequence
of chromosome 22. Lancet, v. 355, n. 9200, p. 319, 2000.
INGELMAN-SUNDBERG, M. Human drug metabolizing cytochrome P450 enzymes:
properties and polymorphisms. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology, v. 369,
p. 89–104, 2004.
INGELMAN-SUNDBERG, M.; OSCARSON, M.; MCLELLAN, R. A. Polymorphic
human cytochrome P450 enzymes: an opportunity for individualized drug treatment.
Trends in Pharmacological Science, v. 20, n. 8, p. 342-349, 1999.
INGELMAN-SUNDBERG, M.; SIM, S. C.; GOMEZ, A.; RODRIGUEZ-ANTONA, C.
Influence of cytochrome P450 polymorphisms on drug therapies: Pharmacogenetic,
pharmacoepigenetic and clinical aspects. Pharmacology & Therapeutics, v. 116, n. 3, p.
496-526, 2007.
KAISER, R.; SEZER, O.; PAPIES, A.; BAUER, S.; SCHELENZ, C.; TREMBLAY, P.-B.;
POSSINGER, K.; ROOTS, I.; BROCKMÖLLER, J. Patient-Tailored Antiemetic
Treatment With 5-Hydroxytryptamine Type 3 Receptor Antagonists According to
Cytochrome P-450 2D6 Genotypes. Journal of Clinical Oncology, v. 20, n. 12, p. 2805-
2811, 2002.
KALANT, H.; ROUSCHLAU, W. H. E. Princípios de Farmacologia Médica. 5. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1991.
KALRA, B. S. Cytochrome P450 enzyme isoforms and their therapeutic implications: an
update. Indian Journal Medical Science, v. 61, n. 1, p. 102-116, 2007.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
129
KATZUNG, B. G. Biotransformação de Drogas. In: KOOGAN, G. (Ed.). Farmacologia:
Básica e Clínica, 2006.
KING, B. P.; LEATHART, J. B. S.; MUTCH, E.; WILLIAMS, F. M.; DALY, A. K.
CYP3A5 phenotype-genotype correlations in a British population. British Journal of
Clinical Pharmacology, v. 55, p. 625-629, 2003.
KOCHI, A. The global tuberculosis situation and the new control strategy of the World
Health Organization. Tubercle and lung disease, v. 72, n. 1, p. 1-6, 1991.
KRITSKI, A. L.; RUFFINO-NETTO, A. A Health Sector Reform in Brazil: impact on
Tuberculosis Control and perspectives. International Journal of Tuberculosis and Lung
Disease, v. 4, n. 7, p. 622-626, 2000.
KUEHL, P. et al. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the
genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nature Genetics, v. 27, n. 4, p. 383-391,
2001.
LAMBA, J. K.; LIN, Y. S.; SCHUETZ, E. G.; THUMMEL, K. E. Genetic contribution to
variable human CYP3A-mediated metabolism. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 54, p.
1271-1294, 2002.
LAUNAY-VACHER, V.; IZZEDINE, H.; DERAY, G. Pharmacokinetic considerations in
the treatment of Tuberculosis in patients with renal failure. Clinical Pharmacokinetics, v.
44, n. 3, p. 221-235, 2005.
LEE, H.-K.; LEWIS, L. D.; TSONGALIS, G. J.; MCMULLIN, M.; SCHUR, B. C.;
WONG, S. H.; YEO, K.-T. J. Negative urine opioid screening caused by rifampin-
mediated induction of oxycodone hepatic metabolism Clinica Chimica Acta, v. 367, n. 1-2,
p. 196-200, 2006.
LEON, J. D.; SUSCE, M. T.; MURRAY-CARMICHAEL, E. The AmpliChip CYP450
genotyping test: Integrating a new clinical tool. Molecular Diagnosis & Therapy, v. 10, n.
3, p. 135-151, 2006.
LEWIS, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics, v. 5, n. 3, p.
305-318, 2004.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
130
LEWIS, D. F. V. Guide to Cytochromes P450 - Structure and Function. London: Taylor &
Francis, 2001.
LIN, J. H.; LU, A. Y. H. Inhibition and Induction of Cytochrome P450 and the Clinical
Implications. Clinical pharmacokinetics, v. 35, n. 5, p. 361-390, 1998.
LUO, H.-R.; GAEDIGK, A.; ALOUMANIS, V.; WAN, Y.-J. Y. Identification of CYP2D6
impaired functional alleles in Mexican Americans. European Journal of Clinical
Pharmacology, v. 61, n. 11, p. 797-802, 2005.
MAHGOUB, A.; IDLE, J. R.; DRING, L. G.; LANCASTER, R.; SMITH, R. L.
Polymorphic hydroxylation of Debrisoquine in man. Lancet, v. 17, n. 2, p. 584-586, 1977.
MATSUMURA, K.; SAITO, T.; TAKAHASHI, Y.; OZEKI, T.; KIYOTANI, K.;
FUJIEDA, M.; YAMAZAKI, H.; KUNITOH, H.; KAMATAKI, T. Identification of a
Novel Polymorphic Enhancer of the Human CYP3A4 Gene. Molecular Pharmacology, v.
65, n. 2, p. 326-334, 2004.
MEIJERMAN, I.; SANDERSON, L. M.; SMITS, P. H. M.; BEIJNEN, J. H.;
SCHELLENS, J. H. M. Pharmacogenetic Screening of the Gene Deletion and Duplications
of CYP2D6. Drug Metabolism Reviews, v. 39, n. 1, p. 45-60, 2007.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual Técnico para o Controle da Tuberculose. Caderno de
Atenção Básica. Brasília, p.3-64. 2002
MOLOWA, D. T.; SCHUETZ, E. G.; WRIGHTON, S. A.; WATKINS, P. B.; KREMERS,
P.; MENDEZ-PICON, G.; G. A. PARKER, A.; GUZELIAN, P. S. Complete cDNA
sequence of a cytochrome P-450 inducible by glucocorticoids in human liver. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 83, n. 14, p.
5311-5315, 1986.
MOLTKE, L. L. V.; TRAN, T. H.; COTREAU, M. M.; GREENBLATT, D. J. Unusually
low clearance of two CYP3A substrates, Alprazolam and Trazodone, in a volunteer subject
with wild-type CYP3A4 promoter region. Journal of Clinical Pharmacology, v. 40, p. 200-
204, 2000.
MORTON, N. E. The detection of major genes under additive continuous variation.
American Journal of Human Genetics, v. 19, n. 1, p. 23-34, 1967.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
131
NEBERT, D. W. Pharmacogenetics and pharmacogenomics: why is this releant to the
clinical geneticist? Clinical Genetics, v. 56, p. 247-258, 1999.
NEBERT, D. W.; ZHANG, G.; VESELL, E. S. From human genetics and genomics to
pharmacogenetics and pharmacogenomics: past lessons, future directions. Drug
Metabolism Reviews, v. 40, p. 187-224, 2008.
NELSON, D. R.; KOYMANS, L.; KAMATAKI, T. P450 superfamily: update on new
sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Pharmacogenetics, v. 6,
n. 1, p. 1-42, 1996.
NIEMI, M.; BACKMAN, J. T.; FROMM, M. F.; NEUVONEN, P. J.; KIVISTÖ, K. T.
Pharmacokinetic Interactions with Rifampicin. Clinical Pharmacokinetics, v. 42, n. 9, p.
819-850, 2003.
OZDEMIR, V.; SHEAR, N. H.; KALOW, W. What will be the role of pharmacogenetics
in evaluating drug safety and minimizing adverse effects? Drug Safety, v. 24, n. 2, p. 75-
85, 2001.
PAINE, M. F.; HART, H. L.; LUDINGTON, S. S.; HAINING, R. L.; RETTIE, A. E.;
ZELDIN, D. C. THE HUMAN INTESTINAL CYTOCHROME P450 “PIE”. Drug
Metabolism and Disposition, v. 34, n. 5, p. 880-886, 2006.
PCTMRJ, P. D. C. D. T. D. M. D. R. D. J. Situação epidemiológica da tuberculose entre
1998 e 2002. Boletim Informativo do PCTMRJ, p. 3-31, 2003.
RAE, J. M.; JOHNSON, M. D.; LIPPMAN, M. E.; FLOCKHART, D. A. Rifampin is a
Selective, pleiotropic inducer of drug metabolism genes in human hepatocytes: studies
with cDNA and oligonucleotide expression arrays The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics, v. 299, n. 3, p. 849-857, 2001.
RAVIGLIONE, M. C.; JR, D. E. S.; KOCHI, A. Global Epidemiology of Tuberculosis.
JAMA, v. 273, n. 3, p. 220-226, 1995.
REBBECK, T. R.; JAFFE, J. M.; WALKER, A. H.; WEIN, A. J.; MALKOWICZ, S. B.
Modification of clinical presentation of prostate tumors by a novel genetic variant in
CYP3A4. Journal of the National Cancer Institute, v. 90, n. 16, p. 1225-1229, 1998.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
132
REYES-HERNÁNDEZ, O. D.; ARTEAGA-ILLÁN, G.; ELIZONDO, G. Detection of
CYP3A4*1B and CYP3A4*2 polymorphisms by RFLP. Distribution frequencies in a
Mexican population. Clinical genetics, v. 66, n. 2, p. 166-168, 2004.
RIVORY, L. P.; QIN, H.; CLARKE, S. J.; ERIS, J.; DUGGIN, G.; RAY, E.; TRENT, R.
J.; BISHOP, J. F. Frequency of cytochrome P450 3A4 variant genotype in transplant
population and lack of association with cyclosporin clearance. European Journal of
Clinical Pharmacology, v. 56, n. 5, p. 395-398, 2000.
ROBERTS, R. L.; KENNEDY, M. A. Rapid detection of common cytochrome P450 2D6
alleles in Caucasians. Clinica Chimica Acta, v. 366, n. 1-2, p. 348-351, 2006.
RODRIGUES, A. D.; RUSHMORE, T. H. Cytochme P450 pharmacogenetics in drug
development: in vivo studies and Clinical consequences. Current Drug Metabolism, v. 3, n.
3, p. 289-309, 2002.
RODRIGUES, L. C.; SMITH, P. G. Tuberculosis in developing countries and methods for
its control. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 84, n.
5, p. 739-44, 1990.
ROSEMBERG, J. Tuberculose - Aspectos históricos, realidades, seu romantismo e
transculturação. Boletim de Pneumologia Sanitária, v. 7, n. 2, p. 5-29, 1999.
SAMBROOK, J.; RUSSELL, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. Third
Edition. ed.: Cold Spring Harbor Laboratoty Press, 2001.
SATA, F.; SAPONE, A.; ELIZONDO, G.; STOCKER, P.; MILLER, V. P.; ZHENG, W.;
RAUNIO, H.; CRESPI, C. L.; FRANK J. GONZALEZ. CYP3A4 allelic variants with
amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered
catalytic activity. Clinical Pharmacology & Therapeutics, v. 67, n. 1, p. 48-56, 2000.
SCHAIK, R. H. N. V.; HEIDEN, I. P. V. D.; ANKER, J. N. V. D.; LINDEMANS, J.
CYP3A5 Variant Allele Frequencies in Dutch Caucasians. Clinical Chemistry, v. 48, n. 10,
p. 1668-1671, 2002.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
133
SCHAIK, R. V.; WERF, M. V. D.; HEIDEN, I. P. V. D.; DORRESTEIN, S.; BROSENS,
R.; THIADENS, A.; IPEREN, N. V.; FESSEM, M. V.; VLIET, M. V.; WILDT, S. N. D.;
ANKER, J. V. D.; LINDEMANS, J. CYP3A4, CYP3A5 and MDR-1 Variant Alleles in the
Dutch Caucasian Population. Clinical Pharmacology & Therapeutics, v. 73, n. 2, p. P42,
2003.
SHIMADA, T.; YAMAZAKI, H.; MIMURA, M.; INUI, Y.; GUENGERICH, F. P.
Interindividual variations in human liver Cytochrome P-450 enzymes involved in the
oxidation of drugs, carcinogens and toxic chemicals: studies with liver microsomes of 30
Japanese and 30 Caucasians. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,
v. 270, n. 1, p. 414-423, 1994.
SOOLINGEN, D. V.; HOOGENBOZEM, T.; HAAS, P. E. W. D.; HERMANS, P. W. M.;
KOEDAM, M. A.; TEPPEMA, K. S.; BRENNAM, P. J.; BESRA, G. S.; PORTAELS, F.;
TOP, J.; SCHOULS, L. M.; EMBDEN, J. D. A. V. A novel pathogenic taxon of the
Mycobacterium tuberculosis Complex, Canetti: Characterization of an exceptional isolate
from Africa. International Journal of Systematic Bacteriology, v. 47, n. 4, p. 1236-1245,
1997.
SPEAR, B. B.; HEATH-CHIOZZI, M.; HUFF, J. Clinical application of
pharmacogenetics. TRENDS in Molecular Medicine, v. 7, n. 5, p. 201-204, 2001.
SUAREZ-KURTZ, G.; PERINI, J. A.; BASTOS-RODRIGUES, L.; PENA, S. D.;
STRUCHINER, C. Impact of population admixture on the distribution of the CYP3A5*3
polymorphism. Pharmacogenomics, v. 8, n. 10, p. 1299-1306, 2007.
SUGGS, S. V.; WALLACE, R. B.; HIROSE, T.; KAWASHIMA, E. H.; ITAKURA, K.
Use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes: isolation of cloned cDNA
sequences for human beta 2-microglobulin. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, v. 78, n. 11, p. 6613-6617, 1981.
TAMMINGA, W. J.; WEMER, J.; OOSTERHUIS, B.; ZEEUW, R. A. D.; LEIJ, L. F. M.
H. D.; JONKMAN, H. H. G. The prevalence of CYP2D6 and CYP2C19 genotypes in a
population of healthy Dutch volunteers. European Journal of Clinical Pharmacology, v. 57,
p. 717-722, 2001.
THUMMEL, K. E.; KUNZE, K. L.; SHEN, D. D. Enzyme-catalyzed processes of first-
pass hepatic and intestinal drug extraction. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 27, p. 99-
127, 1997.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
134
THUMMEL, K. E.; WILKINSON, G. R. In vitro and in vivo drug interactions involving
human CYP3A. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 38, p. 389-430,
1998.
TORRESAN, C.; OLIVEIRA, M. M. C.; TORREZAN, G. T.; OLIVEIRA, S. F. V. D.;
ABUÁZAR, C. S.; LOSI-GUEMBAROVSKI, R.; LIMA, R. S.; URBAN, C. A.;
CAVALLI, I. J.; RIBEIRO, E. M. S. F. Genetic polymorphisms in oestrogen metabolic
pathway and breast cancer: a positive association with combined CYP/GST genotypes
Clinical and Experimental Medicine, v. 8, n. 2, p. 65-71, 2008.
WANG, Z.; MOULT, J. SNPs, Protein Structure and Disease. Human Mutation, v. 17, n.
4, p. 263-270, 2001.
WAYNE, L. G.; KUBICA, G. P. The Mycobacteria. Bergey's Manual of systematic
bacteriology. 9th Ed. Baltimore: Williams e Wilkins, 1986. p. 1436-1457.
WERCK-REICHHARTA, D.; BAKB, S.; PAQUETTEBC, S. Cytochromes P450. The
Arabidopsis Book, 2002.
WESTLIND, A.; LÖFBERG, L.; TINDBERG, N.; ANDERSSON, T. B.; INGELMAN-
SUNDBERGA, M. Interindividual Differences in Hepatic Expression of CYP3A4:
Relationship to Genetic Polymorphism in the 5′-Upstream Regulatory Region.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 259, n. 1, p. 201-205, 1999.
WHO. Tuberculosis - World Health Organization. World Health Organization, v. Fact
Sheet 104, 2000.
WHO, W. H. O.-. Global Tuberculosis Control: WHO Report. 2008
WILDT, S. N. D.; KEARNS, G. L.; LEEDER, J. S.; ANKER, J. N. V. D. Cytochrome
P450 3A: Ontogeny and Drug Disposition. Clinical Pharmacokinetics, v. 37, n. 6, p. 485-
505, 1999.
WRIGHTON, S. A.; BRIAN, W. R.; SARI, M. A.; IWASAKI, M.; GUENGERICH, F. P.;
RAUCY, J. L.; MOLOWA, D. T.; VANDENBRANDEN, M. Studies on the expression
and metabolic capabilities of human liver cytochrome P450IIIA5 (HLp3). Molecular
Pharmacology, v. 38, n. 2, p. 207-213, 1990.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
135
XIE, H.-G.; KIM, R. B.; WOOD, A. J. J.; STEIN, C. M. Molecular basis of ethnic
differences in drug disposition and response. Annual Review of Pharmacology and
Toxicology, v. 41, p. 815–850, 2001.
ZANGER, U. M.; RAIMUNDO, S.; EICHELBAUM, M. Cytochrome P450 2D6:
overview and update on pharmacology, genetics, biochemistry. Naunyn-Schmiedeberg's
archives of pharmacology, v. 369, p. 23–37, 2004.
Apêndice
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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APÊNDICE 1 – TERMO DE CONSENTIMENTO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
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Nos próximos meses será realizado um estudo em pacientes que apresentarem tuberculose.
Neste estudo, pretende-se avaliar os genes (DNA) responsáveis pela eliminação de
fármacos envolvidos no tratamento da tuberculose e de outras enfermidades crônicas como
a diabetes mellitus, a hipertensão arterial, a infecção pelo HIV, dentre outras; e
correlacioná-los com possíveis falhas no tratamento destas doenças ou com o surgimento
de efeito colaterais aos medicamentos empregados. Este estudo será coordenado pela Prof
a
.
Dra. Fernanda Queiroz Mello, Prof. Dr. Afrânio Kritski, Enf. Soraia de Souza, Biol.
Joseane F. Costa, profissionais em atividades no Hospital Universitário Clementino Fraga
Filho da UFRJ e Dr. Adalberto Rezende do Departamento de medicina Tropical –
Laboratório de Hanseníase – FioCruz. Este termo de consentimento explica o estudo,
portanto leia-o cuidadosamente. Pergunte o que achar necessário. Você deverá ter
compreendido adequadamente o estudo antes de assinar este termo de consentimento.
1
1
)
)
Procedimentos
Se eu concordar em participar deste estudo, responderei a um questionário padronizado
que investigará alguns aspectos da minha saúde que possam está relacionados aos genes
(DNA) a serem estudados. Após a limpeza (assepsia) do meu antebraço, serão coletados
10ml de sangue, com agulha e seringa descartáveis. O sangue será utilizado para
estudarmos os genes (DNA). O estudo do DNA servirá para pesquisarmos a presença de
diferenças genéticas que são responsáveis pela eliminação de diferentes fármacos, além de
servir para estudos farmacológicos que poderão ser úteis para o tratamento de outros
pacientes. A mesma amostra de sangue servirá para realizarmos o teste de HIV. Esse
material ficará guardado em um local apropriado para futuras análises farmacogenéticas
também. Os resultados destas análises genéticas (do DNA) serão divulgados em forma de
números e minha identidade será preservada.
2
2
)
)
Local do estudo
Este estudo será realizado no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF –
UFRJ.
3
3
)
)
Riscos/Desconfortos
Algumas das questões incluídas no questionário podem ser impróprias e produzirem
sentimentos desagradáveis, mas, caso eu ache necessário, poderei interromper a entrevista
a qualquer momento. Os riscos da retirada de sangue incluem introdução da agulha,
Apêndice
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
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desconforto temporário, pequena ferida e, raramente, infecção local. Não haverá risco
financeiro e todos os testes de rotina para tuberculose serão realizados.
4
4
)
)
Tratamento e compensação por danos
Se eu tiver algum problema de saúde causado por este estudo, o tratamento será fornecido
pela instituição que está realizando o estudo. Portanto, o custo deste tratamento será
totalmente coberto pelo HUCFF. O HUCFF não prevê nenhuma forma de pagamento por
possíveis danos.
5
5
)
)
Alternativas
Se eu decidir não participar deste estudo, ou interromper a minha participação a qualquer
momento, o meu tratamento médico será mantido no HUCFF.
6
6
)
)
Custos para os participantes
Não haverá custos para mim, caso decida pela minha participação neste estudo, nem para o
tratamento que venha a necessitar.
7
7
)
)
Benefício
A retirada do meu sangue ajudará no entendimento da ação dos fármacos antituberculose
no organismo das pessoas. Com isso, espera-se que mais conhecimentos científicos sejam
obtidos e consequentemente, possamos determinar aqueles com maior risco de
desenvolverem efeitos colaterais ou falhas de tratamento com o uso dos fármacos
antituberculose.
8
8
)
)
Reembolso
Não haverá benefícios financeiros para mim devido a minha participação no estudo.
9
9
)
)
Confidenciabilidade dos dados
Os procedimentos serão realizados pelos responsáveis por este estudo na intenção de
manter o sigilo das informações que eu forneça. As informações serão transformadas em
códigos e mantidas num local reservado o tempo todo. Somente os pesquisadores
envolvidos neste estudo terão acesso às informações e aos questionários. Após o término
deste estudo, as informações serão transferidas dos questionários para arquivos no
computador e esses questionários serão mantidos em local reservado. Os dados deste
estudo poderão ser discutidos com pesquisadores de outras instituições, mas nenhuma
identificação será fornecida, portanto serão confidenciais como a lei determina, a não ser
que eu conceda permissão para isso. Os resultados serão discutidos comigo e poderão ser
enviados para o meu médico.
CONSENTIMENTO
A Dra. Fernanda e outros pesquisadores discutiram as informações comigo e responderam
as minhas perguntas. Receberei uma cópia deste consentimento para mantê-lo comigo. Nos
próximos dias, se tiver qualquer dúvida sobre a minha participação neste estudo, poderei
utilizar os seguintes números de telefone: (21) 2550-6903 ou (21) 2562-2446, para
contactar a Dra. Fernanda Mello ou Bióloga Joseane F. Costa.
Apêndice
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
138
A PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA É VOLUNTÁRIA
Eu tenho o direito de não concordar em participar ou mesmo de me retirar do estudo em
qualquer momento que eu queira, sem riscos para o meu tratamento médico. Se eu desejar
e concordar em participar, devo assinar na linha abaixo. Isso significa que eu compreendi
todas as informações fornecidas e que este termo de consentimento ficou claro para mim.
Se eu desejar participar do estudo, permitirei também que meu endereço e telefone sejam
anotados em uma folha separada, para facilitar o contato comigo, quando necessário.
Como já foi esclarecido anteriormente, todas as informações pessoais serão mantidas em
sigilo.
______________________ ______________________ ________________
Assinatura do voluntário Nome completo N
o
do prontuário
(ou responsável legal)
______________________ ______________________ ___/___/_____
Assinatura do entrevistador Nome do entrevistador Data
Apêndice
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Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
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APÊNDICE 2 – QUESTIONÁRIO PADRONIZADO
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APÊNDICE 3 – ARTIGO
Genetic Polymorphisms of Cytochromes P450: CYP3A4 and CYP3A5 in a
Brazilian population living in Rio de Janeiro
Fonseca-Costa, Joseane
1
; Kritski, Afrânio Lineu
1
; Mello, Fernanda Carvalho de Queiroz
1
;
Santos, Adalberto Rezende
2
1: Unidade de Pesquisa em Tuberculose, Instituto de Doenças do Tórax, HUCFF, UFRJ,
Rio de Janeiro, Brazil
2: Laboratório de Biologia Molecular aplicada a Micobactérias, Instituto Oswaldo Cruz –
IOC, FioCruz, Rio de Janeiro, Brazil
Abstract
INTRODUCTION
The cytochrome P450 (CYP) constitutes a superfamily of isoforms that play an important
role in the metabolism of drugs (Ingelman-Sundberg, 2004; Gorski et al. 2003). The CYP
P450 in families 1-3 are responsible for 70-80% of all the clinically used drugs
metabolized by phase I enzymes (Bertz and Granneman, 1997). The human CYP3A
subfamily, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 and CYP3A43, is one of the most versatile of the
biotransformation systems for elimination of drugs, other xenobiotic compounds, and
endogenous molecules from body (Shimada et al. 1994). Among adults, CYP3A4 is the
dominant CYP3A enzyme in liver and small intestine. CYP3A5 is also fund in the adult
liver and small intestine (Lamba et al. 2002). CYP3A7 is the major CYP isoform detected
in human embryonic, fetal and newborn liver, but is also detected in adult liver, although at
a much lower level than CYP3A4 (de Wildt et al. 1999). The CYP3A43 was detected in
liver, kidney, prostate and pancreas, but the levels of mRNA in liver was much less than
that for CYP3A4 (Domanski et al. 2001).
The CYP3A4 is the best-estudied enzyme among the CYP3A gene products, and high
interindividual variation on enzyme activity in vivo and in vitro has been reported
(Shimada et al. 1994; Westlind et al. 1999; Thummel and Wilkinson, 1998). It has been
suggested that mutation of the CYP3A4 coding gene may be responsible for interindividual
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variation on enzyme activity. In this regard, diverse allele variants of the CYP3A4 have
been described, some of them associated with low enzyme activity in vitro. These include a
single nucleotide polymorphism located at the 5’-upstream region (A-392G), designated as
CYP3A4*1B (Yoshizawa et al. 1998).
CYP3A4 has been considered the most abundant hepatic and intestinal CYP3A isoform.
Although the substrate specificity of CYP3A5 is similar to CYP3A4, its contribution to
drug metabolism was thought to be minor as it accounted for only a small proportion of the
total hepatic CYP3A content and was detectable in only about 20-30% of human livers
(Wrighton et al. 1989). In 2001, Kuehl et al. described two functional SNPs in CYP3A5
and provided a molecular explanation for the absence of the CYP3A5 protein from some
people. The CYP3A5*3C (6986A → G) allele in intron 3 presents a splicing defect
resulting in a severe decrease of the enzyme activity in vitro (Kuehl et al.,2001; Wong et
al., 2004; Josephson et al., 2007) and the CYP3A5*6 (14690G → A) allele in exon 7
results in a deletion of exon 7 from the splice variant and is associated with none or
severely decreased enzyme activity in vitro.
The importance of interethnic differences in drug disposition has been recognized. Because
of ethnic differences in the representation, one racial group may be more sensitive to drug
inhibition than another. Thus, interethnic variability should be taken into consideration
when drug interaction data are extrapolated from one racial population to another group.
The aim of this study was to establish the frequency of CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and
CYP3A5*6 in admix population.
METHODS
Subjects
Five hundred and thirty three consanguineously unrelated healthy Brazilian volunteers
living in Rio de Janeiro and comprising (213 females and 320 males) were enrolled in this
study. A written informed consent prior to enrolment was obtained from each subject, and
the protocol was approved by the Ethics Committee of the Clementino Fraga Filho
University Hospital.
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Sample collection and handling
Five mL of peripheral blood was collected in vacutainer tubes containing ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA) and stored at -20oC for further processing. Genomic DNA was
isolated from 100 µl of frozen whole blood using a FlexiGene DNA Kit (QIAGEM Inc.,
USA), according to the manufacturer’s specifications. After extraction, DNA samples were
stored at -20°C.
Genotyping
CYP3A4*1B genotyping was performed by allele-specific polymerase chain reaction
(PCR) of a 186-bp (CYP3A4-G) or 187-bp (CYP3A4-A) using CYP3A4 specific primers
(Rivory et al. 2000). The sequences of the wild-type and variant forward primers were 5’-
ATGAGGACAGCCATAGAGACAAGGGCAA-3’ (CYP3A4-A) and 5’-
TGAGGACAGCCATAGAGACAAGGGTAG-3’ (CYP3A4-G), respectively.
Sequence of the common reverse primer was 5’-
GAATCACACACACACCACTCACTGACCTC-3’ (CYP3A4-Rev). For PCR
amplification 10 ng of genomic DNA were added to a reaction mixture containing 200 ng
of each primer, 0.2 mM of each dNTP, 1,5 mM MgCl
2
, 10% of glycerol and 1.0U of Taq
DNA polymerase. Samples were incubated at 94
o
C for 2 min, followed by 35 cycles of
94
o
C for 30 s, 67
o
C for 30 s, and 72
o
C for 20 s; final extension took place at 72
o
C for 5
min. Evaluation of the PCR product was achieved by electrophoresis on 2% agarose gel
followed by ethidium bromide staining (0.5µg/ml).
Genotyping was accomplished using polymerase chain reaction-restriction fragment length
polymorphism (PCR-RFLP) methods previously described by (Fukuen et al. 2002). For the
CYP3A5*3C and CYP3A5*6 alleles, the respective forward and reverse primers for
genotyping CYP3A5*3C were 5’-CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTCTC-3’ and 5’-
CCAGGAAGCCAGACTTTGAT-3’ and for CYP3A5*6 were 5’-
GTGGGTTTCTTGCTGCATGT-3’ and 5’-GCCCACATACTTATTGAGAG-3’.
Amplification of CYP3A5*3C and CYP3A5*6 were performed by the addition of 10 ng of
genomic DNA in a reaction mix containing 200 ng of each primer, 0.2 mM of each dNTP,
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1,5 mM MgCl
2
, and 1.0U of Taq DNA polymerase. The PCR cycling conditions consisted
of a denaturation step of at 95
o
C for 10 min, followed by 37 cycles of 94
o
C for 30 s, 56
o
C
(*3) or 58
o
C (*6) for 30 s, and 72
o
C for 30s, final extension was done by 5 min at 72
o
C. A
volume of 12 µL of each PCR product was digested for at least 2 h at 37
o
C with 5 U of
DdeI. Analysis of the digested product was achieved by electrophoresis on 3% agarose gel
followed by ethidium bromide staining (0.5µg/ml) and direct visualization under UV light.
RESULTS
Genotyping data were available from a total of 533 healthy subjects from Rio de Janeiro,
Brasil. The frequency of polymorphic CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and CYP3A5*6 alleles
were 0.191, 0.533 and 0.067, respectively (Table 1). Genotype frequency analysis of
CYP3A4 showed that homozygosis for the wild type allele was predominant been 1.9 times
higher than the heterozygosis (64 versus 34%). Homozygous for the mutant allele was the
less frequent genotype (Table 2). All the observed genotypes were in Hardy-Weinberg
equilibrium.
DISCUSSION
The presence of polymorphism on genes coding for proteins of the P450 system has been
described by several studies performed in different populations, showing the high genetic
diversity of these genes along different ethnic groups (Ball et al., 1999, Balram et al.,
2003, Bozina et al.., 2003, Chouo et al., 2001, Floyd et al., 2003, Fukuen et al., 2002,
Garcia-Martin et al., 2001, Griese et al., 2001, Hiratsuka et al., 2002, Hsieh and col., 2001,
King et al., 2003, Rivory et al., 2000; Roberts and Kennedy, 2006; Satã et al., 2000;
Schaik et al., 2002 – 2003, Suarez-Kurtz et al., 2007; Tamminga et al., 2001). This
variability is the main problem of using genetic polymorphisms in these genes as markers
in admixed population. In Brazil – a country characterized by the high degree of admixed
ethnicities, the available data concerning the frequency of single nucleotide
polymorphisms (SNPs) is scarce and refers to one or sometimes two SNPs only.
The CYP3A human family is expressed by four members: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 and
CYP3A43. However, only CYP3A4 and CYP3A5 are significantly expressed on human
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liver. The expression on these genes may vary from 10 to 40 times, and these variations
might be caused by genetic polymorphisms.
In this study, the frequency of CYP3A4 was evaluated only by the presence of
polymorphism in the promoter region, allele CYP3A4*1B. According to the literature, this
variant is more frequent on afro-American than on Caucasian-American (Kuehl et al.,
2001). Description of the CYP3A4*1B allele frequency in Brazilian population cames from
Almeida et al., 2005, who describe a 2.2 lower frequency of this allele variant in
comparison to the one described here (18,0 vs. 8,0%). This difference could be related to
the population studied, mainly represented by Euro-descents or to the smaller sample used.
To our knowledge, the observed frequency of the CYP3A4*1B allele in our study (18%),
however in other studies that described date for others ethnic groups, approximately 4% for
euro-descents and 66% for afro-descents (Sata et al., 1999; Ball et al., 1999; Ahsen et al.,
2001; Schaik et al., 2003; Floyd et al., 2003; Reyes-Hernandez et al., 2004). These
ethnical divergences, represented by the discrepancies in the frequency of this allele
variant can be explained by the Brazil’s tri-hybrid parental characteristics, which includes
Afro-descents, Euro-descents and Amerindian population. Upon analysis of CYP3A5,
alleles *3C and *6, the observed frequencies were respectively 53 and 7%. Literature data
concerning these frequencies for “closed” populations, refers 94% (*3) and 1% (*6) for
euro-descents and 28% (*3) and 16% (*6) afro-descents (Hiratsuka et al., 2002; Schaik et
al., 2002; Fukuen et al., 2002; King et al., 2003; Floyd et al., 2003; Balram et al., 2003).
On a recent study, the impact of the distribution of CYP3A5*3C on Brazilian population,
from Rio de Janeiro city, was determined (Suarez-Kurtz et al., 2007). In this study, the
authors characterized the ethnic group based on general consensus, where the individual
self-titled him/herself as euro-descendent, dun skin-colored (brown skin-colored or any
other intermediary) and afro-descendent (when black skin-colored). In parallel, another
classification, based on AAC (African Ancestral Component) method was also applied.
The authors concluded that no significant difference comparing these two classification
methods was observed. As our results are completely different from the ones found in
Suarez-Kurtz et al. (2007) (78%, 64%, 32% in euro-descendent, dun skin-colored and afro-
descendent, respectively), possibly, the oneself ethnic classification should not be used.
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145
Nonetheless, only genotyping using ethnic markers so-know accepted for such a
classification method could give an answer to this questions based on facts.
Another adding data to the importance of using the ethnic markers to define itself refers to
the fact that the allele *6, so-far specific to afro-descendents, has been, on Brazilian
population, discovered to be 6.7%. This result suggests that even the phenotypic
individuals described as euro-descendents probably are African descendant.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by CNPq/Universal Proc: 476046/2003-3, Premio Alvin and
Faperj/Pronex Proc: E-26 / 170.558/2004. Adalberto R. Santos is supported by CNPq
Grant number 308786/2005-0. We thank the nursing service of the Hospital Tuberculosis
Control Program/Thoracic Diseases Institute/Clementino Fraga Filho University Hospital,
for sample collection.
REFERENCES
AHSEN, N. V.; RICHTER, M.; GRUPP, C.; RINGE, B.; OELLERICH, M.;
ARMSTRONG, V. W. No Influence of the MDR-1 C3435T Polymorphism or a CYP3A4
Promoter Polymorphism (CYP3A4-V Allele) on Dose-adjusted Cyclosporin A Trough
Concentrations or Rejection Incidence in Stable Renal Transplant Recipients. Clinical
Chemistry, v. 47, n. 6, p. 1048–1052, 2001.
ALMEIDA, S.; ZANDONA, M. R.; FRANKEN, N.; CALLEGARI-JACQUES, S. M.;
OSÓRIO-WENDER, M. C.; HUTZ, M. H. Estrogen-metabolizing gene polymorphisms
and lipid levels in women with different hormonal status. The Pharmacogenomics Journal,
v. 5, n. 346–351, 2005.
BALL, S. E.; SCATINA, J.; JOHN KAO; FERRON, G. M.; FRUNCILLO, R.; MAYER,
P.; WEINRYB, I.; GUIDA, M.; HOPKINS, P. J.; WARNER, N.; HALL, J. Population
distribution and effects on drug metabolism of a genetic variant in the 59 promotor region
of CYP3A4. Clinical Pharmacology and Therapeutics, v. 66, n. 3, p. 288-294, 1999.
Apêndice
_________________________________________________________________________________________________
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Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
146
BALRAM, C.; ZHOU, Q.; CHEUNG, Y. B.; LEE, E. J. D. CYP3A5*3 and *6 single
nucleotide polymorphisms in three distinct Asian populations. European Journal of
Clinical Pharmacology, v. 59, n. 2, p. 123-126, 2003.
BERTZ, R. J.; GRANNEMAN, G. R. Use of in vitro and in vivo data to estimate the
likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. Clinical Pharmacokinetics, v. 32, n.
3, p. 210-258, 1997.
CHOU, F.-C.; TZENG, S.-J.; HUANG, J.-D. Genetic polymorphism of cytochrome P450
3A5 in Chinese. Drug Metabolism Disposition, v. 29, n. 9, p. 1205-1209, 2001.
DOMANSKI, T. L.; FINTA, C.; HALPERT, J. R.; ZAPHIROPOULOS, P. G. cDNA
Cloning and Initial Characterization of CYP3A43, a Novel Human Cytochrome P450.
Molecular Pharmacology, v. 59, n. 2, p. 386-392, 2001.
FLOYD, M. D.; GERVASINI, G.; MASICA, A. L.; MAYO, G.; GEORGE, A. L. J.;
BHAT, K.; KIM, R. B.; WILKINSON, G. R. Genotype-phenotype associations for
common CYP3A4 and CYP3A5 variants in the basal and induced metabolism of
midazolam in European- and African-American men and women. Pharmacogenetics, v. 13,
n. 10, p. 595-606, 2003.
FUKUEN, S.; FUKUDA, T.; MAUNE, H.; IKENAGA, Y.; YAMAMOTO, I.; INABA, T.;
AZUMA, J. Novel detection assay by PCR-RFLP and frequency of the CYP3A5 SNPs,
CYP3A5*3 and *6, in a Japanese population. Pharmacogenetics, v. 12, n. 4, p. 331-334,
2002.
GORSKI, J. C.; VANNAPRASAHT, S.; HAMMAN, M. A.; AMBROSIUS, W. T.;
BRUCE, M. A.; HAEHNER-DANIELS, B.; HALL, S. D. The effect of age, sex and
rifampin administration on intestinal and hepatic cytochrome P450 3A activity. Clinical
Pharmacologic Therapy, v. 74, p. 275-287, 2003.
Apêndice
_________________________________________________________________________________________________
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Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
147
HIRATSUKA, M.; TAKEKUMA, Y.; ENDO, N.; NARAHARA, K.; HAMDY, S. I.;
KISHIKAWA, Y.; MATSUURA, M.; AGATSUMA, Y.; INOUE, T.; MIZUGAKI, M.
Allele and genotype frequencies of CYP2B6 and CYP3A5
in the Japanese population. European Journal of Clinical Pharmacology, v. 58, p. 417–421,
2002.
HSIEH, K.-P.; LIN, Y.-Y.; CHENG, C.-L.; LAI, M.-L.; LIN, M.-S.; SIEST, J.-P.;
HUANG, J.-D. Novel Mutations of CYP3A4 in Chinese. Drug Metabolism and
Disposition, v. 29, n. 3, p. 268-273, 2001.
INGELMAN-SUNDBERG, M. Human drug metabolizing cytochrome P450 enzymes:
properties and polymorphisms. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, v. 369, p. 89-
104, 2004.
KING, B. P.; LEATHART, J. B. S.; MUTCH, E.; WILLIAMS, F. M.; DALY, A. K.
CYP3A5 phenotype-genotype correlations in a British population. British Journal of
Clinical Pharmacology, v. 55, p. 625-629, 2003.
KUEHL, P. et al. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the
genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nature Genetics, v. 27, n. 4, p. 383-391,
2001.
LAMBA, J. K.; LIN, Y. S.; SCHUETZ, E. G.; THUMMEL, K. E. Genetic contribution to
variable human CYP3A-mediated metabolism. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 54, p.
1271-1294, 2002.
REYES-HERNÁNDEZ, O. D.; ARTEAGA-ILLÁN, G.; ELIZONDO, G. Detection of
CYP3A4*1B and CYP3A4*2 polymorphisms by RFLP. Distribution frequencies in a
Mexican population. Clinical genetics, v. 66, n. 2, p. 166-168, 2004.
Apêndice
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
148
RIVORY, L. P.; QIN, H.; CLARKE, S. J.; ERIS, J.; DUGGIN, G.; RAY, E.; TRENT, R.
J.; BISHOP, J. F. Frequency of cytochrome P450 3A4 variant genotype in transplant
population and lack of association with cyclosporin clearance. European Journal of
Clinical Pharmacology, v. 56, n. 5, p. 395-398, 2000.
SATA, F.; SAPONE, A.; ELIZONDO, G.; STOCKER, P.; MILLER, V. P.; ZHENG, W.;
RAUNIO, H.; CRESPI, C. L.; FRANK J. GONZALEZ. CYP3A4 allelic variants with
amino acid substitutions in exons 7 and 12: evidence for an allelic variant with altered
catalytic activity. Clinical Pharmacology & Therapeutics, v. 67, n. 1, p. 48-56, 2000.
SCHAIK, R. H. N. V.; HEIDEN, I. P. V. D.; ANKER, J. N. V. D.; LINDEMANS, J.
CYP3A5 Variant Allele Frequencies in Dutch Caucasians. Clinical Chemistry, v. 48, n. 10,
p. 1668-1671, 2002.
SCHAIK, R. V.; WERF, M. V. D.; HEIDEN, I. P. V. D.; DORRESTEIN, S.; BROSENS,
R.; THIADENS, A.; IPEREN, N. V.; FESSEM, M. V.; VLIET, M. V.; WILDT, S. N. D.;
ANKER, J. V. D.; LINDEMANS, J. CYP3A4, CYP3A5 and MDR-1 Variant Alleles in the
Dutch Caucasian Population. Clinical Pharmacology & Therapeutics, v. 73, n. 2, p. P42,
2003.
SHIMADA, T.; YAMAZAKI, H.; MIMURA, M.; INUI, Y.; GUENGERICH, F. P.
Interindividual variations in human liver Cytochrome P-450 enzymes involved in the
oxidation of drugs, carcinogens and toxic chemicals: studies with liver microsomes of 30
Japanese and 30 Caucasians. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,
v. 270, n. 1, p. 414-423, 1994.
SUAREZ-KURTZ, G.; PERINI, J. A.; BASTOS-RODRIGUES, L.; PENA, S. D.;
STRUCHINER, C. Impact of population admixture on the distribution of the CYP3A5*3
polymorphism. Pharmacogenomics, v. 8, n. 10, p. 1299-1306, 2007.
Apêndice
_________________________________________________________________________________________________
Estudo descritivo das isoformas de CYP P450 em pacientes com Tuberculose (TB) do Programa de Controle de
Tuberculose Hospitalar (PCTH) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
149
THUMMEL, K. E.; WILKINSON, G. R. In vitro and in vivo drug interactions involving
human CYP3A. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 38, p. 389-430,
1998.
WESTLIND, A.; LÖFBERG, L.; TINDBERG, N.; ANDERSSON, T. B.; INGELMAN-
SUNDBERGA, M. Interindividual Differences in Hepatic Expression of CYP3A4:
Relationship to Genetic Polymorphism in the 5′-Upstream Regulatory Region.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 259, n. 1, p. 201-205, 1999.
WILDT, S. N. D.; KEARNS, G. L.; LEEDER, J. S.; ANKER, J. N. V. D. Cytochrome
P450 3A: Ontogeny and Drug Disposition. Clinical Pharmacokinetics, v. 37, n. 6, p. 485-
505, 1999.
WRIGHTON, S. A.; RING, B. J.; WATKINS, P. B.; VANDENBRANDEN, M.
Identification of a polymorphically expressed member of the human cytochrome P-450III
family. Molecular Pharmacology, v. 36, n. 1, p. 97-105, 1989.
YOSHIZAWA, K.; WILLETT, W. C.; MORRIS, S. J.; STAMPFER, M. J.;
SPIEGELMAN, D.; RIMM, E. B.; GIOVANNUCCI, E. Modification of clinical
presentation of prostate tumors by a novel genetic variant in CYP3A4. Journal of the
National Cancer Institute, v. 90, n. 16, p. 1225-1229, 1998.
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_________________________________________________________________________________________________
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Table 1. Frequencies of wild type (*1) and mutant alleles of CYP3A4 e
CYP3A5 in the study group.
Gene N
o
of alleles
CYP3A4
*1 0.809
(80.9%)
*1B 0.191
(19.1%)
CYP3A5
*1 0.467
(46.7%)
*3C 0.533
(53.3%)
*1 0.933
(93.3%)
*6 0.067
(06.7%)
Table 2. Frequencies of CYP3A4 e CYP3A5 genotype in the study group.
Genotype No of subjects %
CYP3A4
wt/wt 341 64.0
wt/mut 181 34.0
mut/mut 11 2.0
Total 533 100.0
CYP3A5
*1/*1 93 17.5
*1/*3C 312 58.5
*3C/*3C 128 24.0
Total 533 100.0
*1/*1 461 86.5
*1/*6 72 13.5
Total 533 100.0
Anexo
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1
1
1
1
A
A
N
N
E
E
X
X
O
O
ANEXO 1 – FOLHA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
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