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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO QuEChERS
E MINI-LUKE MODIFICADOS NA DETERMINAÇÃO DE
RESÍDUOS DE PESTICIDAS PIRETRÓIDES EM
TOMATE EMPREGANDO GC×GC-µECD
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Samile Martel
Santa Maria, RS, Brasil
2008
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ii
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO QuEChERS
E MINI-LUKE MODIFICADOS NA DETERMINAÇÃO DE
RESÍDUOS DE PESTICIDAS PIRETRÓIDES EM
TOMATE EMPREGANDO GC×GC-µECD
por
Samile Martel
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química, Área de Concentração em Química Analítica, da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito
parcial para obtenção do grau de MESTRE EM QUÍMICA
Orientador: Prof. Dr. Renato Zanella
Santa Maria – RS, Brasil
2008
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iii
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Química
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a
Dissertação de Mestrado
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO QuEChERS
E MINI-LUKE MODIFICADOS NA DETERMINAÇÃO DE
RESÍDUOS DE PESTICIDAS PIRETRÓIDES EM
TOMATE EMPREGANDO GC×GC-µECD
elaborada por
Samile Martel
como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química
Comissão Examinadora
___________________________________________
Prof. Dr. Renato Zanella – Orientador
Universidade Federal de Santa Maria
___________________________________________
Profa. Dra. Rosana de Cássia de Souza Schneider
Universidade de Santa Cruz do Sul
___________________________________________
Profa. Dra. Martha Bohrer Adaime
Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, 29 de agosto de 2008
iv
”Envelheço quando me fecho para as
novas idéias e me torno radical;
quando o novo me assusta e minha
mente insiste em não aceitar;
quando me torno impaciente, intransigente
e não consigo dialogar;
quando meu pensamento abandona sua casa e
retorna sem nada acrescentar;
quando penso demasiadamente em mim mesmo
e conseqüentemente, dos outros
completamente me esqueço;
quando penso em ousar e já antevejo o
preço que terei que pagar, mesmo que os fatos
insistam em me contrariar;
quando permito que o cansaço e o
desalento tomem conta de minha alma e
ponho a me lamentar;
enfim quando paro de lutar”
Reinilson Câmara
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Renato Zanella agradeço o apoio neste trabalho, o incentivo e
a amizade sempre. Agradeço pela oportunidade de poder ter convivido com esse
grupo que é o LARP e também pela confiança quando me foi dada a oportunidade
de desenvolver esse trabalho na Free University, em Amsterdã. Obrigada também
pela compreensão e incentivo com relação ao meu ingresso na vida profissional.
À Profa. Dra. Martha Bohrer Adaime, quem me acompanhou desde o início
da minha caminhada, ainda antes de ter ingressado no LARP, e acompanhou
desde o início o desenvolvimento deste trabalho, iniciando comigo os primeiros
rabiscos dessa dissertação. Agora posso dizer que será sempre meu exemplo,
não apenas como profissional, mas principalmente como pessoa.
Ao Dr. René Vreuls e sua equipe da Free University em Amsterdã,
Holanda, pelos ensinamentos e acolhida em seu grupo de pesquisa.
Ao Dr. Ubiratan Flores da Silva, Profa. Dra. Rosana de Cássia de Souza
Schneider e Profa. Dra. Martha Bohrer Adaime pelas valiosas sugestões e
comentários no exame de qualificação e na banca examinadora.
Aos funcionários do PPGQ, Ademir e Valéria, pela atenção e ajuda
dispensada durante a realização deste trabalho.
Aos colegas e amigos do LARP, agradeço por ter conhecido e convivido
com cada um de vocês e por fazerem parte do meu dia-a-dia durante o tempo que
permaneci no LARP. Nunca deixem que o tempo e a correria das nossas vidas
apaguem as boas lembranças que temos uns dos outros.
À Carol e Osmar, companheiros e amigos de viagem, onde surgiu uma
amizade sincera e que, a partir desse momento tornaram-se amigos que tenho
certeza que permanecerão pra sempre em minha vida, independente do rumo que
nossas vidas tomarem.
Às amigas Márcia e Sandra Botega agradeço pela prazerosa e sincera
amizade, por estarem sempre por perto quando precisamos e sempre prontas a
ajudar no que for preciso.
vi
Aos amigos Márcia e Fábio, aos quais agradeço a maior parte dos
conhecimentos que possuo, mas que, além disso, me mostraram uma amizade
como poucas que existem. Apesar da distância, sempre ficarão as lembranças, a
saudade e principalmente, a amizade.
Aos meus pais Ademar e Suelí e meus irmãos André e Daniel que eu sei
que se preocupam e torcem por mim sempre, os quais mesmo distantes sempre
se mostraram bastante presentes em minha vida. Obrigada pela força,
compreensão e carinho. Agradeço em especial a minha mãe por nunca me deixar
desanimar e por me mostrar quais são as coisas mais valiosas nessa vida.
A todos os demais familiares e amigos que de alguma forma torceram por
mim e me apoiaram durante o desenvolvimento deste trabalho.
A Deus, que sempre acreditei ser a base de tudo, agradeço pela
capacidade de desenvolver este trabalho e por colocar tantas pessoas especiais
em meu caminho.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................
xi
LISTA DE TABELAS ..................................................................................
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...............................................
xvii
RESUMO .....................................................................................................
xx
ABSTRACT .................................................................................................
xxi
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................
4
2.1 Pesticidas e suas classificações........................................................
4
2.2 Pesticidas piretróides..........................................................................
8
2.2.1 Propriedades e aplicações..................................................................
9
2.2.2 Classificação.......................................................................................
10
2.2.3 Pesticidas estudados..........................................................................
11
2.2.3.1 Bifentrina..........................................................................................
11
2.2.3.2 Ciflutrina...........................................................................................
12
2.2.3.3 Esfenvalerato...................................................................................
13
2.2.3.4 Fenpropatrina...................................................................................
13
2.2.3.5 Fenvalerato......................................................................................
14
2.2.3.6 Permetrina....................................................................................... 14
2.3 Tomate.................................................................................................. 15
2.3.1 Origem e histórico...............................................................................
15
2.3.2 Importância econômica e social..........................................................
16
2.3.3 Composição química...........................................................................
17
2.3.4 Uso de pesticidas em tomate e Limites Máximos de Resíduos..........
18
2.4 Métodos de extração de resíduos de pesticidas...............................
20
viii
2.4.1 Fundamentos e importância................................................................
20
2.4.2 Principais métodos de extração..........................................................
22
2.4.3 Métodos de extração Luke e mini-Luke..............................................
25
2.4.4 Método de extração QuEChERS........................................................
27
2.4.5 Comparação entre os principais solventes de extração..................... 32
2.5 Métodos para determinação de resíduos de pesticidas
empregando cromatografia gasosa..................................................
34
2.5.1 Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC).............
36
2.5.1.1 Princípios da técnica GC×GC..........................................................
36
2.5.1.2 Sistema de modulação.....................................................................
39
2.5.1.3 Detectores........................................................................................
42
2.5.1.4 Tipos de diagramas para visualização do sinal analítico.................
43
2.5.2 Aplicação da GC×GC na análise de resíduos de
pesticidas.....................................................................................................
45
2.6 Validação de métodos cromatográficos............................................
47
2.6.1 Curva analítica e linearidade...............................................................
48
2.6.2 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ).................
49
2.6.3 Precisão..............................................................................................
50
2.6.4 Exatidão..............................................................................................
51
2.6.5 Efeito matriz........................................................................................
51
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.......................................................
53
3.1 Reagentes e solventes.........................................................................
53
3.2 Materiais................................................................................................
53
3.3 Pesticidas selecionados......................................................................
54
3.4 Instrumentação.....................................................................................
55
3.4.1 Instrumentação geral...........................................................................
55
3.4.2 Sistema cromatográfico GC×GC-µECD..............................................
55
3.5 Gases utilizados...................................................................................
56
3.6 Otimização do sistema GC×GC-µECD para determinação dos
resíduos de pesticidas.......................................................................
56
3.6.1 Coluna cromatográfica e programação de temperatura do forno da
coluna..................................................................................................
56
3.6.2 Estudo da melhor vazão do gás de arraste.........................................
57
ix
3.6.3 Sistema de injeção e de detecção......................................................
57
3.7 Preparo das soluções analíticas.........................................................
58
3.7.1 Método QuEChERS modificado..........................................................
58
3.7.2 Método mini-Luke modificado.............................................................
59
3.8 Ensaios de fortificação e extração.....................................................
59
3.8.1 Método QuEChERS modificado.........................................................
60
3.8.2 Método mini-Luke modificado.............................................................
63
3.9 Análise dos solventes e reagentes.....................................................
66
3.9.1 Método QuEChERS modificado..........................................................
66
3.9.2 Método mini-Luke modificado.............................................................
67
3.10 Validação dos métodos de extração QuEChERS e mini-Luke
modificados para análise de resíduos de pesticidas piretróides
em tomate..........................................................................................
67
3.10.1 Determinação da linearidade das curvas analíticas..........................
68
3.10.2 Limite de detecção e limite de quantificação.....................................
68
3.10.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)............................
69
3.10.4 Ensaios de fortificação para avaliação da recuperação
(exatidão).........................................................................................
70
3.10.5 Avaliação do efeito matriz.................................................................
70
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................
72
4.1 Condições cromatográficas otimizadas para análise dos
resíduos de pesticidas por GC×GC-µECD........................................
72
4.1.1 Coluna cromatográfica e programação de temperatura......................
72
4.1.2 Escolha da melhor vazão do gás de arraste.....................................
72
4.1.3 Condições cromatográficas.................................................................
73
4.2 Análise de resíduos de pesticidas por GC×GC-µECD utilizando
extração pelos métodos QuEChERS e mini-Luke modificados e
utilizando o modulador com ar comprimido.................................
74
4.2.1 Análise dos solventes e reagentes pelos métodos de extração
QuEChERS e mini-Luke modificados.................................................
77
4.3 Validação dos métodos de extração para análise de resíduos de
pesticidas em tomate.........................................................................
77
4.3.1 Linearidade das curvas analíticas.......................................................
77
x
4.3.1.1 Método QuEChERS modificado......................................................
77
4.3.1.2 Método mini-Luke modificado..........................................................
78
4.3.2 Limite de detecção e quantificação.....................................................
82
4.3.2.1 Método QuEChERS modificado..................................................... 82
4.3.2.2 Método mini-Luke modificado..........................................................
83
4.3.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)..............................
86
4.3.3.1 Método QuEChERS modificado..................................................... 86
4.3.3.2 Método mini-Luke modificado..........................................................
87
4.3.4 Recuperação dos analitos.................................................................. 88
4.3.4.1 Método QuEChERS modificado..................................................... 89
4.2.4.2 Método mini-Luke modificado..........................................................
92
4.3.5 Efeito matriz........................................................................................
94
4.3.5.1 Método QuEChERS modificado..................................................... 94
4.3.5.2 Método mini-Luke modificado..........................................................
97
4.4 Comparação entre os resultados obtidos pelo método
QuEChERS e mini-Luke modificados.............................................
101
5. CONCLUSÃO..........................................................................................
104
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS......................................
107
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................
108
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fórmula estrutural do pesticida bifentrina......................................... 12
Figura 2. Fórmula estrutural do pesticida ciflutrina ......................................... 13
Figura 3. Fórmula estrutural do pesticida esfenvalerato...................................
13
Figura 4. Fórmula estrutural do pesticida fenpropatrina ..................................
14
Figura 5. Fórmula estrutural do pesticida fenvalerato...................................... 14
Figura 6. Fórmula estrutural do pesticida permetrina ......................................
15
Figura 7.
Esquema de um sistema GC×GC
(
adaptado de DALLÜGE et al.,
2003; ADAHCHOUR et al., 2006).....................................................
38
Figura 8. (A) Esquema de um modulador criogênico com duplo jato de CO
2
líquido ou N
2
gasoso frio, (B1-B3) Funcionamento de um
modulador criogênico (adaptado de DALLÜGE et al, 2003) ............
41
Figura 9. (A) Esquema do modulador com duplo jato de ar comprimido, (B)
representação tridimensional do modulador (FRIGGI, 2008)............
42
Figura 10.
Representações para o espaço de separação de uma análise
realizada por GC×GC para uma amostra de óleo essencial de
Eucalyptus dunnii, onde: A) diagrama de contorno, B) diagrama de
cores, C) diagrama de bolhas e D) diagrama de ápices (adaptado
de MÜHLEN et al., 2007) .................................................................
45
Figura 11.
Alguns equipamentos e materiais utilizados no método
QuEChERS: (A) evaporador RapidVap, (B) centrífuga e (C) extrato
da matriz em tubos de polipropileno com capacidade de 50 mL......
61
Figura 12.
Esquema do método de extração QuEChERS modificado para
análise de resíduos de pesticidas em tomate...................................
62
Figura 13.
Alguns equipamentos e materiais utilizados no método mini-Luke:
xii
(A) banho de água para evaporação do solvente, (B) centrífuga e
(C) extrato da matriz em erlenmeyer com tampa..............................
64
Figura 14.
Esquema do método de extração mini-Luke modificado para
análise de resíduos de pesticidas em tomate...................................
65
Figura 15.
Diagrama demonstrando a forma de estabelecimento dos valores
de LOD e LOQ...................................................................................
69
Figura 16.
Cromatograma em 1D da solução analítica 0,2 mg L
-1
contendo
uma mistura dos pesticidas estudados preparada em solvente,
obtido com as condições descritas no item 4.1.3..............................
74
Figura 17.
Cromatograma da solução analítica 0,5 mg L
-1
, contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, preparada no extrato da matriz
obtida pelo método QuEChERS modificado, conforme condições
descritas no item 4.1.3 (A) visualização em 1D e (B) visualização
em 2D................................................................................................
75
Figura 18.
Cromatograma da solução analítica 0,5 mg L
-1
,
contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, preparada no extrato da matriz
e obtida pelo método mini-Luke modificado, conforme condições
descritas no item 4.1.3 (A) visualização em 1D e (B) visualização
em 2D................................................................................................
76
Figura 19.
Cromatogramas do “branco” do extrato da matriz obtidos por
GC×GC-µECD utilizando: (A) método QuEChERS modificado e
(B) método mini-Luke modificado......................................................
81
Figura 20.
Cromatogramas da solução analítica 0,5 mg L
-1
, contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, conforme condições descritas
no item 4.1.3 (A) preparada no extrato da matriz pelo método
QuEChERS modificado e (B)
preparada em solvente (acetato de
etila)...................................................................................................
83
Figura 21.
Cromatogramas da solução analítica 0,5 mg L
-1
, contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, conforme condições descritas
no item 4.1.3 (A) preparada no extrato da matriz pelo método mini-
Luke modificado e (B)
preparada em solvente (acetato de
etila)...................................................................................................
85
Figura 22.
Cromatogramas do extrato da matriz “branco” fortificado ao nível
xiii
de 50 µg kg
-1
com os pesticidas analisados por GC×GC-µECD
utilizando o método QuEChERS modificado, conforme condições
descritas no item 4.1.3 (A) visualização em 1D e (B) visualização
em 2D................................................................................................
91
Figura 23.
Cromatogramas do extrato da matriz “branco” fortificado ao nível
de 200 µg kg
-1
com os pesticidas analisados por GC×GC-µECD
utilizando o método mini-Luke modificado, conforme condições
descritas no item 4.1.3 (A) visualização em 1D e (B) visualização
em 2D................................................................................................
93
Figura 24.
Curva analítica do pesticida bifentrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração QuEChERS modificado.....................................................
95
Figura 25.
Curva analítica do pesticida ciflutrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração QuEChERS modificado.....................................................
95
Figura 26.
Curva analítica do pesticida fenpropatrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração QuEChERS modificado.....................................................
96
Figura 27.
Curva analítica dos pesticidas fenvalerato e esfenvalerato
preparados em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz
obtido pelo método de extração QuEChERS modificado.................
96
Figura 28.
Curva analítica dos pesticidas permetrina cis e trans preparados
em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo
método de extração QuEChERS modificado...................................
97
Figura 29.
Curva analítica do pesticida bifentrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração mini-Luke modificado..........................................................
98
Figura 30.
Curva analítica do pesticida ciflutrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração mini-Luke modificado..........................................................
98
Figura 31.
Curva analítica do pesticida fenpropatrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração mini-Luke modificado..........................................................
99
xiv
Figura 32.
Curva analítica dos pesticidas fenvalerato e esfenvalerato
preparado em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz
obtido pelo método de extração mini-Luke modificado.....................
99
Figura 33.
Curva analítica dos pesticidas permetrina cis e trans preparado em
solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo
método de extração mini-Luke modificado........................................
100
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classes toxicológicas dos pesticidas de acordo com a Agência
de Proteção Ambiental (EPA) dos Estados Unidos.......................
08
Tabela 2. Área plantada, produção e produtividade média do tomate nas
regiões brasileiras nas safras 2006 e 2007...................................
17
Tabela 3.
Composição do tomate (variedade Deborah)................................
18
Tabela 4.
Pesticidas analisados e Limites Máximos de Resíduos (MRLs)
em tomate......................................................................................
19
Tabela 5. Pesticidas analisados por GC×GC-µECD.....................................
54
Tabela 6. Programas (P) de temperatura do forno da coluna utilizados na
otimização da separação cromatográfica......................................
57
Tabela 7. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas em
acetato de etila utilizando o método QuEChERS modificado......
78
Tabela 8. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas no
extrato da matriz utilizando o método QuEChERS modificado....
78
Tabela 9. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas em
acetato de etila utilizando o método mini-Luke modificado...........
79
Tabela 10. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas no
extrato da matriz utilizando o método mini-Luke
modificado.....................................................................................
79
Tabela 11. Valores de LOD e LOQ do instrumento e do método no solvente
e no extrato da matriz para os pesticidas estudados utilizando o
método QuEChERS modificado...................................................
82
Tabela 12. Valores de LOD e LOQ do instrumento e do método no solvente
xvi
e no extrato da matriz para os pesticidas estudados utilizando o
método mini-Luke modificado........................................................
84
Tabela 13.
Precisão do instrumento utilizando o método QuEChERS
modificado.....................................................................................
87
Tabela 14. Precisão do instrumento utilizando o Método mini-Luke
modificado.....................................................................................
88
Tabela 15. Recuperação, RSD
r
e RSD
pi
do método para os pesticidas
utilizando o método QuEChERS modificado...............................
89
Tabela 16. Recuperação, RSD
r
e RSD
pi
do método para os pesticidas
utilizando o método mini-Luke modificado...................................
92
Tabela 17. Comparação entre os métodos de extração utilizados:
QuEChERS e mini-Luke modificados ..........................................
103
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µECD - micro Detecção por Captura de Elétrons, do inglês micro-Electron Capture
Detection
1D-GC - Cromatografia Gasosa Monodimensional, do inglês one-Dimensional
Gas Chromatography
1
t
R
- tempo de retenção na primeira dimensão
2
t
R
- tempo de retenção na segunda dimensão
ACAS - Analytical Chemistry & Applied Sciences
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
C
1
- Concentração determinada na amostra fortificada
C
2
- Concentração determinada na amostra não fortificada
C
3
- Concentração usada para fortificação
CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
C
18
- Octadecilsilano
DL50 - Dose Letal 50%
Dispersive-SPE - Extração em Fase Sólida Dispersiva, do inglês Dispersive-Solid
Phase Extraction.
ECD - Detector por Captura de Elétrons, do inglês Electron Capture Detector
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EPA - Agência de Proteção Ambiental, do inglês Environmental Protection Agency
FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação, do inglês
Food and Agriculture Organization of the United
Nations
FDA - Food and Drug Administration
FID – Detecção por Ionização de Chama, do inglês Flame Ionization Detection
FPD - Detecção por Fotometria de Chama, do inglês Flame Photometric Detection
xviii
GARP - Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas
GC - Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography
GC×GC - Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente, do inglês
Comprehensive two-Dimensional Gas Chromatography
GC×GC-µECD - Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada ao
micro Detector por Captura de Elétrons, do inglês
Comprehensive two-Dimensional Gas Chromatography with
micro-Electron Capture Detection
GC-MS - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas, do inglês
Gas Chromatography Mass Spectrometry
GPC - Cromatografia por Permeação em Gel, do inglês Gel Permeation
Chromatography
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance
Liquid Chromatography
IDA - Ingestão Diária Aceitável
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia
LMCS - Sistema Criogênico Longitudinalmente Modulado, do inglês Longitudinally
Modulated Cryogenic System
LOD - Limite de Detecção, do inglês Limit of Detection
LOQ - Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification
LOQ
m
- Limite de Quantificação do Método
LOQ
i
- Limite de Quantificação do Instrumento
MRL - Limite Máximo de Resíduo, do inglês Maximun Residue Limit
MRMs - Métodos Multirresíduos, do inglês Multiresidue Methods
MSPD - Dispersão da Matriz em Fase Sólida, do inglês Matrix Solid-Phase
Dispersion
N - número de medidas
NPD - Detector de Nitrogênio e Fósforo, do inglês Nitrogen and Phosphorus
Detector
p.c. – peso corpóreo
PSA - Amina Primária Secundária, do inglês Primary Secondary Amine
PTFE - Politetrafluoretileno - Teflon
xix
QuEChERS - Rápido, fácil, econômico, robusto e seguro, do inglês Quick, Easy,
Cheap, Rugged and Safe
r - coeficiente de correlação
r
2
- coeficiente de determinação
R - recuperação
RSD - Desvio padrão relativo, do inglês Relative Standard Deviation
RSD
pi
- Desvio Padrão Relativo para Precisão Intermediária
RSD
r
- Desvio Padrão Relativo para Repetitividade
s - estimativa de desvio padrão absoluto
SBSE - Extração Sortiva em Barra de Agitação, do inglês Stir-Bar Sorptive
Extraction
SFE - Extração por Fluido Supercrítico, do inglês Supercritical Fluid Extraction
SPE - Extração em Fase Sólida, do inglês Solid-Phase Extraction
SPME - Microextração em Fase Sólida, do inglês Solid-Phase Micro-Extraction
TOFMS - Detector de Espectrometria de Massas por Tempo de Vôo, do inglês
time-of-flight mass spectrometer
VWA - Food and Product Safety Authority
x
i
- valores individuais
x
m
- média das medidas em replicatas
X
1
- Média das áreas da solução analítica de cada pesticida, preparada em extrato
da matriz, numa dada concentração
X
2
- Média das áreas da solução analítica de cada pesticida, preparada em
solvente, numa dada concentração
xx
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Química
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO QUECHERS E MINI-
LUKE MODIFICADOS NA EXTRAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS
PIRETRÓIDES EM TOMATE EMPREGANDO GC×GC-µECD
AUTOR: SAMILE MARTEL
ORIENTADOR: PROF. DR. RENATO ZANELLA
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 29 de agosto de 2008
Nesse estudo comparou-se dois métodos bastante utilizados na extração
de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais, o método QuEChERS e o método
mini-Luke, de modo a otimizar e validar estes métodos utilizando quantificação
por GC×GC-µECD. Este estudo foi realizado para os pesticidas bifentrina,
ciflutrina, fenpropatrina, fenvalerato, esfenvalerato e permetrina cis e trans em
tomate. No método QuEChERS adicionou-se 10 mL de acetonitrila contendo 1%
(v/v) de ácido acético em 10 g de amostra. No método mini-Luke adicionou-se 30
mL de acetona, seguidos de 60 mL da mistura 1:1 (v/v) de éter de petróleo e
diclorometano em 10 g de amostra. Ao empregar-se o método de extração com
acetonitrila obteve-se recuperações entre 90,2 e 105,5% com RSD menor que
8,7%, enquanto que, utilizando o método de extração com acetona, as
recuperações ficaram entre 86,2 e 110,8% com RSD menor que 9,0%. Em termos
de limite de quantificação (LOQ) o método QuEChERS modificado apresentou
valores entre 0,01 e 0,02 mg kg
-1
, considerados mais satisfatórios que os obtidos
pelo método mini-Luke modificado (LOQ entre 0,02 e 0,05 mg kg
-1
), sendo que,
neste caso, o valor de LOQ encontrado para ciflutrina não foi satisfatório, pois
está acima do limite máximo de resíduos permitido pela ANVISA. Com relação
aos valores de r
2
das curvas analíticas, percebeu-se que, utilizando o método
QuEChERS modificado estes valores foram maiores ou iguais a 0,9992 e para o
método mini-Luke modificado foram maiores ou iguais a 0,9955, ambos para as
curvas no extrato da matriz, demonstrando, portanto, que o método QuEChERS
modificado forneceu valores de r
2
mais apropriados. Além disso, o método
QuEChERS mostrou ser um procedimento mais simples por utilizar agitação
manual, podendo ser aplicado em qualquer laboratório ou a campo. Outra
vantagem importante deste método é a menor quantidade de solvente utilizado.
Este estudo mostrou também que o sistema GC×GC-µECD com modulador de
duplo jato de ar comprimido possibilita a redução dos custos da análise e que esta
combinação pode ser utilizada em análises de pesticidas piretróides em tomate,
pois obteve-se valores satisfatórios de LOD e LOQ, com boa precisão e exatidão.
Palavras Chave: Métodos de extração; GC×GC; pesticidas; alimentos;
multirresíduos
xxi
ABSTRACT
Master Dissertation
Post-Graduate Program in Chemistry
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
COMPARISON BETWEEN MODIFIED QUECHERS AND MINI-LUKE
EXTRACTION METHODS IN PYRETHROID PESTICIDES RESIDUES
EXTRACTION IN TOMATO USING GC×GC-µECD
AUTHOR: SAMILE MARTEL
ADVISOR: PROF. DR. RENATO ZANELLA
Date and place: Santa Maria, August 29
th
, 2008
In this study, two methods frequently used in the extraction of residues of
pesticides in fruits and vegetables, the QuEChERS method and the mini-Luke
method, were compared in order to optimize and validate these methods using
quantification by GC×GC-µECD. This study was carried out for the pesticides
bifenthrin, cyfluthrin, fenpropathrin, fenvalerate, esfenvalerate and permethrin cis
and trans in tomato. In the QuEChERS method, 10 mL of acetonitrile containing
1% (v/v) of acetic acid was added to 10 g of sample. In the mini-Luke method, 30
mL of acetone, followed by 60 mL of a 1:1 (v/v) mixture of petroleum ether and
dichloromethane were added to 10 g of sample. In the extraction method with
acetonitrile, recoveries between 90.2 and 105.5% were obtained with RSD values
lower than 8.7%, whereas, using the extraction method with acetone, the
recoveries were between 86.2 and 110.8% with RSD values lower than 9.0%. In
terms of limit of quantification (LOQ), the QuEChERS method presented values
between 0.01 and 0.02 mg kg
-1
, considered more satisfactory than those obtained
using the modified mini-Luke method (LOQ between 0.02 and 0.05 mg kg
-1
),
where the value of LOQ found for cyfluthrin was above of the maximum limit of
residues allowed by ANVISA, and therefore unsatisfactory. The r
2
values from the
analytical curves in the extract of the matrix were equal or higher than 0.9992 and
0.9955 for the modified QuEChERS method and the modified mini-Luke method,
respectively, demonstrating that the modified QuEChERS method supplied more
appropriate r
2
values. Moreover, the QuEChERS method is a simpler procedure as
it utilizes manual agitation and can be employed in any laboratory or in the field.
Another important advantage of this method is the lower amount of solvent used.
This study also showed that the GC×GC-µECD system using a modulator of
double compressed air jet reduces costs and can be used in analyses of
pyrethroid pesticides in tomato, with satisfactory values of LOD and LOQ, good
precision and accuracy.
Keywords: Methods of extraction; GC×GC; pesticides; foods; multiresidues
1
1. INTRODUÇÃO
Na análise de resíduos de pesticidas há a necessidade de uma etapa prévia
de preparo da amostra devido à complexidade das matrizes, as concentrações
extremamente baixas dos analitos, bem como a grande variedade de propriedades
químicas destes. Devido a estes fatores, as interferências são problemas freqüentes
que precisam ser considerados.
Desta maneira, os objetivos principais do preparo da amostra são remover
interferentes da matriz aumentando assim, a seletividade do método; aumentar a
concentração do analito, quando necessário, e fornecer um método robusto e
reprodutível, o qual deve ser independente de variações no tipo de matriz. Um
método de preparo da amostra ineficiente e incompleto pode resultar numa
considerável restrição no resultado das análises e pode envolver um trabalho
adicional significativo para os analistas (SMITH, 2003).
As técnicas mais eficientes para análise de pesticidas envolvem o uso de
Métodos de Extração Multirresíduos (MRMs, do inglês Multiresidue Methods), que
abrangem diferentes classes de pesticidas e que são alternativas para a alta
demanda por análise de resíduos de pesticidas, pois representam um
monitoramento mais rápido e eficiente, resultando em um aumento na produtividade
dos laboratórios, bem como, uma redução dos custos de análise de pesticidas
(ANASTASSIADES et al., 2003; HERNÁNDEZ et al., 2006). Estes métodos para
serem considerados ideais devem gerar bons resultados de recuperação para
pesticidas de diferentes polaridades; devem ser seletivos, no sentido de evitar a
presença de compostos interferentes da matriz no extrato final; devem separar os
analitos da fase aquosa; além de serem de baixo custo e seguros em termos de
resultados e toxicidade (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
A escolha do solvente é um dos pontos fundamentais no desenvolvimento de
um método de extração multirresíduos. Muitos aspectos devem ser considerados,
incluindo: possibilidade de extração de um amplo espectro de pesticidas com
diferentes polaridades; seletividade durante o procedimento de extração, partição e
clean-up; capacidade de separação da água; baixo custo e baixa toxicidade
(ANASTASSIADES et al., 2003). Além disso, o solvente deve ser compatível com os
2
analitos e, se possível, compatível com o método cromatográfico empregado para
evitar etapa de troca de solvente (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
O método Luke, introduzido em 1975 por LUKE et al., é um método
multirresíduos de pesticidas bastante utilizado para o monitoramento de pesticidas
em alimentos, estudos de avaliação de risco e análises de rotina em amostras não
gordurosas, tais como frutas e vegetais. Neste método utiliza-se 100 g de amostra e
200 mL de acetona na etapa inicial de extração e uma mistura de éter de petróleo e
diclorometano na etapa de partição, sendo utilizados 100 mL de cada um destes
solventes. Para obter melhores recuperações para pesticidas polares, cloreto de
sódio é adicionado na fase aquosa para garantir a transferência dos pesticidas para
a fase orgânica. A água co-extraída ainda presente na fase orgânica é retirada, em
seguida, com sulfato de sódio anidro (SCHENK et al., 2002; DIÉZ et al., 2006).
Nos anos 80, o procedimento de extração denominado mini-Luke, em função
de utilizar menores quantidades de solvente, foi desenvolvido pelo Ministério da
Agricultura da Holanda (Food and Consumer Product Safety Authority) e vem sendo
utilizado até hoje (KOK et al, 1987; HIEMSTRA & KOK, 2007).
O método de extração QuEChERS (do inglês Quick, Easy, Cheap, Rugged
and Safe) foi introduzido em 2003 por ANASTASSIADES et al. com a finalidade
principal de superar limitações práticas de outros métodos de extração
multirresíduos já existentes. O método QuEChERS tem as vantagens principais de
ser um método rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro, as quais são
destacadas no próprio nome QuEChERS. Este método foi desenvolvido para
amostras que possuem em sua composição mais de 75% de água (DÍEZ et al.,
2006).
O procedimento original consiste em pesar 10 g de amostra previamente
homogeneizada em tubo de politetrafluoretileno (PTFE), adicionar 10 mL de
acetonitrila, com agitação vigorosa, que pode ser manual ou utilizando vortex, por 1
minuto. Em seguida, adiciona-se 4 g de sulfato de magnésio e 1 g de cloreto de
sódio, agitando por 1 minuto. O extrato é então centrifugado e transfere-se 1 mL
deste extrato para outro tubo contendo uma mistura de 150 mg de sulfato de
magnésio anidro e 25 mg do sorvente PSA (do inglês Primary Secundary Amine),.
Agita-se novamente por 30 segundos e centrifuga-se (ANASTASSIADES et al.,
2003). O sorvente PSA é bastante utilizado na etapa de clean-up em métodos de
3
extração de resíduos de pesticidas, é formado pelo grupo funcional N-propil
etilenodiamino siloxano, sendo similar ao sorvente amino (NH
2
).
Considerando a grande importância da escolha de um método de extração
adequado para a análise de resíduos de pesticidas e a importância da otimização do
método escolhido, de maneira que os resultados sejam os mais precisos e exatos
possíveis, os objetivos principais deste trabalho são: (i) comparar dois métodos de
extração bastante utilizados na extração de resíduos de pesticidas de amostras de
frutas e vegetais, o método QuEChERS e o método mini-Luke e (ii) otimizar e validar
estes métodos de extração utilizando análise por GC×GC-µECD (do inglês
Comprehensive two-Dimensional Gas Chromatography with micro-Electron Capture
Detection) dos pesticidas piretróides bifentrina, ciflutrina, fenpropatrina, fenvalerato e
esfenvalerato, e permetrina cis e trans em tomate.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Pesticidas e suas classificações
Um país como o Brasil, com tantas variedades climáticas e geográficas,
abriga uma diversidade enorme de insetos e plantas. Além das espécies nativas e
cultivadas para fins comerciais, tanto para consumo interno como para exportação,
historicamente muitas espécies vegetais foram introduzidas por colonizadores e
imigrantes, sendo responsáveis pela introdução de diferentes espécies de
predadores. Durante muitas décadas o Brasil teve sua economia baseada no setor
primário de produção e, ainda hoje, ocupa uma posição de destaque no
abastecimento mundial de cereais, frutas e outros produtos de origem vegetal sendo,
portanto, o controle de pragas um desafio que persiste e tem se agravado ano após
ano (VIEGAS JÚNIOR, 2003). Estes fatores têm levado à busca contínua por novos
pesticidas cada vez mais eficientes, mas que também representem maior segurança
ao homem e ao meio ambiente.
Desde o início de seu desenvolvimento, a produção agrícola está diretamente
relacionada com a aplicação de substâncias químicas para controlar as pestes, que
atacam os produtos agrícolas, prejudicando as colheitas. O uso de compostos
químicos no controle de pragas não é, portanto, invenção da moderna indústria
química, mas data do período clássico da Grécia e Roma, sendo que o mais antigo
registro de uso de pesticida é atribuído aos sumérios que, em 2500 a. C., utilizavam
enxofre para combater insetos. Mais tarde, os romanos modificaram a fórmula com a
adição de óleo ao enxofre, utilizando a mistura como repelente de insetos. No ano
79 da Era Cristã, foi sugerido o uso do arsênio como inseticida, o qual foi utilizado
pelos chineses no século XIV (BARBOSA, 2004).
Segundo a Agência de Proteção Ambiental (EPA, do inglês Environmental
Protection Agency) dos Estados Unidos, um pesticida é qualquer substância ou
mistura de substâncias com capacidade de prevenir, destruir, repelir ou atenuar
qualquer peste. Estes podem ser classificados de acordo com o tipo de peste –
algicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, acaricidas, moluscocidas, nematicidas,
ovicidas, entre outros. Além disso, podem ser incluídas substâncias desfolhantes,
dessecantes ou reguladoras do crescimento de insetos e plantas (EPA, 2008a).
5
O Codex Alimentarius define pesticida como sendo toda e qualquer
substância utilizada com o propósito de prevenir, destruir, atrair, repelir ou controlar
qualquer peste, incluindo espécies indesejáveis de plantas, insetos ou animais,
durante as etapas de produção, armazenamento, transporte, distribuição e
processamento do alimento ou ração animal. O termo inclui substâncias utilizadas
como reguladoras do crescimento das plantas, desfolhantes, dessecantes, ou
inibidores de brotos, e substâncias aplicadas tanto antes como após a colheita, para
proteger a mesma da deterioração durante o armazenamento e transporte. Já o
resíduo de pesticida é definido como sendo qualquer substância específica presente
no alimento, “in natura” ou não, ou ainda em ração animal, proveniente do uso de
pesticidas, como os produtos de conversão, metabólitos, produtos de reações e
impurezas consideradas com alguma significância toxicológica. Este termo inclui
resíduos de substâncias desconhecidas ou de fontes inevitáveis (como o meio
ambiente), bem como o uso de produtos químicos conhecidos (FAO, 2005).
O Decreto Federal nº 4074, de 04 de janeiro de 2002, define como
“agrotóxicos e afins” todos os produtos e agentes de processos físicos, químicos e
biológicos, destinados ao uso no setor de produção, no armazenamento e
beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas,
nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e
industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de
preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as
substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores
e inibidores de crescimento (BRASIL, 2002).
A agricultura é a maior usuária de pesticidas e o seu uso é a principal
estratégia no campo para o combate e prevenção de pragas agrícolas. Tais produtos
melhoram a produtividade agrícola, podendo, eventualmente diminuir os preços dos
alimentos e da mão-de-obra (ROCHA et al., 2004).
Com um número crescente de pessoas para alimentar, a solução mais viável
para a agricultura parece ser aumentar a produtividade por hectare, já que o simples
aumento da área cultivada causaria enorme impacto ambiental com graves
conseqüências, uma vez que, mais florestas seriam derrubadas para dar espaço a
campos cultivados. Portanto, esse aumento de produtividade tem sido conseguido
através do desenvolvimento de novas tecnologias de cultivo e pelo uso de
fertilizantes químicos e de agrotóxicos (BARBOSA, 2004).
6
Mesmo com os benefícios que trazem os pesticidas no controle das pragas, o
problema de intoxicações por estes compostos preocupa as autoridades,
principalmente pelo fato de que essas intoxicações acontecem pela ingestão
gradativa destes produtos que contaminam a água, o solo e uma variedade de
alimentos. O uso de muitos destes compostos foi proibido devido à constatação do
efeito cumulativo e prejudicial, que ocorre pela transferência de pequenas
quantidades ao longo das cadeias alimentares (JORGENSON, 2001).
Os pesticidas podem ser encontrados em diferentes compartimentos
ambientais e também nos alimentos. Nos alimentos, são provenientes da aplicação
em lavouras. No ar, são originários principalmente dos procedimentos de
pulverização na forma de aerossóis. No solo, podem ser encontrados após a
aplicação destes nas lavouras ou devido ao derramamento ou descarte inadequado,
que, por percolação, podem atingir lençóis de águas subterrâneas. Em águas
superficiais podem ser originários do carregamento através de chuvas ou resultados
do descarte de água de culturas irrigadas ou ainda devido a derramamentos
(KOMATSU & VAZ, 2004).
Este tipo de contaminação é a causa de problemas que comprometem a
qualidade de vida tanto das pessoas que trabalham expostas aos pesticidas nas
lavouras, quanto para o consumidor final, caso estes alimentos estiverem
contaminados em níveis acima dos aceitáveis (FRIGGI, 2008).
A preocupação ambiental vem crescendo na comunidade científica e também
na população em geral, aumentando progressivamente o cuidado por parte das
pessoas que trabalham expostas a estes pesticidas, e também por parte de
indústrias e órgãos governamentais na parte de produção e controle de resíduos de
pesticidas, respectivamente.
Os riscos à saúde humana causados por estes compostos são variados e
dependem de alguns fatores relacionados à exposição (como dose, duração e rota),
além de sofrerem influência de acordo com idade, sexo, saúde, estilo de vida e
nutrição do indivíduo exposto. Os efeitos da exposição podem ir desde alergia,
comprometimento do fígado até ataque ao sistema nervoso e sistema reprodutor
(PINTO et al., 2007).
Os pesticidas podem ser classificados de diferentes maneiras, podendo ser
de acordo com o emprego (inseticida, fungicida, herbicidas, entre outros),
formulação (pó, granulado, suspensão, aerossol), modo de ação (sistêmicos ou de
7
contato), estrutura química (piretróides, organofosforados, organoclorados, entre
outros) e toxicidade.
A principal classificação é quanto ao seu emprego: inseticidas (combatem os
insetos), herbicidas (combatem as plantas daninhas), fungicidas (combatem os
fungos), acaricidas (combatem os ácaros), moluscocidas (combatem os moluscos),
rodenticidas (combatem os roedores), bactericidas (combatem as bactérias) entre
outros (BAIRD, 2002).
Quanto ao modo de ação, destacam-se os pesticidas sistêmicos e de contato.
Os sistêmicos são aplicados durante a germinação, entram para o sistema vascular
da planta e contaminam a polpa do alimento. Os pesticidas de contato, também
chamados de protetores, são aplicados externamente, antes ou depois da colheita, e
saem com uma boa lavagem.
Do ponto de vista da composição química, os pesticidas possuem uma
enorme diversidade estrutural, mas muitos apresentam alguma característica em
comum, sendo assim, classificados dentro de um mesmo grupo. Os grupos mais
conhecidos são representados pelos organofosforados, organoclorados, carbamatos
e piretróides. Estes nomes estão relacionados com as características estruturais dos
compostos, ou seja, com a natureza dos elementos químicos presentes em sua
composição, além da maneira como tais elementos estão ligados entre si
(BARBOSA, 2004).
A classificação quanto à toxicidade é fundamental para o conhecimento da
toxicidade aguda ou crônica dos pesticidas, os quais, por sua própria natureza, são
compostos potencialmente perigosos para a saúde humana. Entretanto, esse perigo
varia muito de um composto para outro, assim como os efeitos que eles, ou qualquer
substância química, podem causar em organismos vivos, incluindo o homem
(BARBOSA, 2004). Uma medida freqüente para avaliar a toxicidade aguda de
pesticidas e outras substâncias químicas é a Dose Letal 50% (DL
50
). A DL
50
representa a quantidade (dose única) da substância necessária para matar 50% dos
animais testados nas condições experimentais utilizadas, a qual varia muito com o
tipo de composto. Para efeitos legais, os agrotóxicos, em razão do perigo que
podem representar aos seres humanos, são agrupados em quatro classes
toxicológicas, de acordo com a DL
50
, conforme demonstrado na Tabela 1
(BARBOSA, 2004).
8
Tabela 1 – Classes toxicológicas dos pesticidas de acordo com a Agência de
Proteção Ambiental (EPA) dos Estados Unidos
Classe toxicológica Indicador de
periculosidade
I II III IV
DL
50
oral*
0-50 50-500 500-5000 >5000
DL
50
inalação*
0-0,2 0,2-2 2-20 >20
DL
50
dérmica* 0-200 200-2000 2000-20000 >20000
* Unidade: mg kg
-1
Fonte: BARBOSA, 2004
A identificação dos rótulos desses produtos é feita por meio de faixas
coloridas, de acordo com características toxicológicas. Assim, os rótulos dos
produtos da classe I possuem uma faixa vermelha, os quais são extremamente
tóxicos. Os compostos pertencentes à classe II, identificados por uma faixa amarela
são altamente tóxicos; já os da classe III são representados por uma faixa azul e são
considerados mediamente tóxicos e os da classe IV representados pela cor verde
são pouco tóxicos (SANCHES et al. , 2003).
Sabe-se que os pesticidas são extremamente úteis na produção agrícola e
que há uma crescente demanda por novos produtos, pois os organismos
desenvolvem resistência a tais compostos após certo tempo, no entanto, o seu uso
deve ser corretamente orientado por profissionais da área, respeitando a legislação
vigente e a saúde da população. Para estes fins, as pesquisas na área de pesticidas
vêm caminhando na direção da obtenção de compostos cada vez menos tóxicos
para os seres vivos (SANCHES et al., 2003)
2.2 Pesticidas piretróides
Os piretróides são compostos sintéticos utilizados como inseticidas que agem
de maneira similar as piretrinas, que são compostos naturais extraídos de plantas do
gênero chrysanthemum (EPA, 2008b).
9
O estudo da composição química destas plantas começou logo no início do
século XX e resultou na identificação de seis compostos estruturalmente
relacionados e genericamente denominados piretrinas. Devido à complexidade
estrutural desses compostos e à limitação nas técnicas de análise disponíveis,
apenas na década de 70 é que mais detalhes estruturais das piretrinas foram
elucidados (BARBOSA, 2004).
As piretrinas pertencem à classe química dos ésteres. São líquidas e oleosas
e relativamente instáveis à luz, mesmo nas flores secas da planta. Em meio aquoso,
são hidrolisadas tanto em meio ácido quanto básico (BARBOSA, 2004).
Uma vez conhecida a composição química das piretrinas e as limitações em
relação à aplicação destes compostos devido à sua instabilidade, alguns químicos
começaram a trabalhar no desenvolvimento de novos compostos, os piretróides, os
quais possuem maior fotoestabilidade e ação inseticida, mas também maior
toxicidade aos mamíferos (EPA, 2007).
Diferentemente das piretrinas naturais, que são ésteres formados apenas
pelos elementos químicos carbono, hidrogênio e oxigênio, os piretróides possuem,
em suas estruturas, elementos como cloro, bromo, nitrogênio e flúor (BARBOSA,
2004). Em 1953 foi desenvolvido o primeiro piretróide sintético, bioaletrina, o qual
demonstrou uma maior atividade contra insetos com relação as piretrinas naturais,
porém, ainda apresentava baixa fotoestabilidade. Em 1969, a bioresmetrima foi
lançada, sendo um composto potente contra uma ampla faixa de espécies de
insetos, entretanto, ainda apresentava a fotoestabilidade semelhante às piretrinas.
Sete anos depois, o primeiro piretróide fotoestável foi descoberto, o fenvalerato. Em
seguida, diversos piretróides passaram a ser comercializados, entre eles,
permetrina, cipermetrina e deltametrina, todos por volta do ano de 1977 (CHEN,
1996).
2.2.1 Propriedades e aplicações
Os piretróides são compostos praticamente insolúveis em água e bastante
solúveis em solventes orgânicos. São compostos pouco persistentes no meio
ambiente, podendo ser classificados, de uma maneira geral, como não persistentes.
Estes compostos são mais resistentes ao meio ácido do que ao meio alcalino, com
10
uma estabilidade ótima a pH 4, sendo que em meio alcalino são decompostos por
hidrólise (LARINI, 1999).
O sucesso comercial dos piretróides deveu-se a sua ampla variedade de
atividades, agindo contra a maioria dos grupos de insetos-praga, sua ação rápida,
baixa dosagem necessária e baixo risco para os usuários quando comparado a
outros inseticidas (BARBOSA, 2004). Apesar da baixa toxicidade verificada para
mamíferos, estudos toxicológicos feitos com 243 pesticidas mostraram que os
piretróides estão entre os pesticidas mais tóxicos para organismos aquáticos, como
peixes e crustáceos e também para abelhas (LINDERS et al., 1994). Portanto, o uso
indiscriminado de piretróides pode afetar drasticamente o equilíbrio no meio
ambiente, sendo importante seu monitoramento através da análise de seus resíduos
em diversas matrizes (BARRINUEVO & LANÇAS, 2001).
Os piretróides persistem nas plantações entre 7 e 30 dias, e como os
resíduos são degradados a produtos normalmente polares (solúveis em água), eles
não se acumulam na cadeia alimentar, como ocorre com os organoclorados
(BARBOSA, 2004).
Os compostos piretróides são usados na agricultura, em cultivo de algodão,
arroz, café, soja, milho, trigo, tomate e fumo e na medicina veterinária na eliminação
de ectoparasitas de animais pequenos e em bovinos. São também empregados em
campanhas de saúde pública na erradicação de mosquitos, no armazenamento de
grãos e em uso doméstico para eliminação de insetos em geral. São disponíveis em
formulações do tipo concentrado emulsionável, ultra-baixo-volume, aerossóis, pós,
loções e xampus (LARINI, 1999).
2.2.2 Classificação
Os piretróides são classificados em dois diferentes tipos, de acordo com
sintomas e sinais clínicos, para melhor entendimento de sua ação tóxica. Esta
divisão é baseada na presença ou não do grupo ciano (CN) nas moléculas. Os
piretróides do tipo A não contêm o grupo ciano, ao contrário dos compostos do tipo
B que possuem esse grupo em sua estrutura (ANVISA, 2008a).
Os piretróides do tipo A são compostos que geram, experimentalmente em
ratos, um quadro de tremores, hipersensibilidade e convulsões, sendo este grupo
11
conhecido por “síndrome T“, pela prevalência de tremores. Exemplos de pesticidas
pertencentes a esse grupo são: aletrina, permetrina, resmetrina e fenotrina (ANVISA,
2008a; LARINI ,1999).
Os piretróides do tipo B mostram efeitos como coreoatetose (movimento
involuntário), salivação excessiva, lacrimejamento, hipersecreção nasal,
hipersensibilidade, distúrbios sensoriais cutâneos (formigamento, entorpecimento e
sensação de queimação), irritação cutânea, perda de apetite, fadiga, tonturas, perda
da consciência e convulsões. A intoxicação causada por estes compostos é
conhecida como “síndrome CS”, pela prevalência de coreoatetose e salivação
excessiva (ANVISA, 2008a; LARINI,1999).
Com relação aos pesticidas estudados neste trabalho, classificam-se no
grupo A os pesticidas bifentrina e permetrina, por não apresentarem o grupo ciano,
por outro lado, os pesticidas ciflutrina, esfenvalerato, fenvalerato e fenpropatrina
apresentam o grupo ciano em sua estrutura, pertencendo, portanto, ao grupo B.
2.2.3 Pesticidas estudados
Algumas propriedades e a fórmula estrutural dos pesticidas piretróides,
bifentrina, ciflutrina, esfenvalerato, fenpropatrina, fenvalerato e permetrina cis e
trans, estudados neste trabalho, estão demonstradas a seguir.
2.2.3.1 Bifentrina
O pesticida bifentrina (2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (Z)-(1RS,3RS)-3-(2-chloro-
3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylate) pertence à classe
de inseticida, formicida e acaricida. Sua fórmula estrutural está demonstrada na
Figura 1. Com relação à classificação toxicológica é classificado como altamente
tóxico, ou seja, pertence à classe II (ANVISA, 2007).
É um pesticida autorizado para o uso na aplicação foliar nas culturas de
algodão, citros, couve, crisântemo, feijão, fumo, manga, mamão, melão, pepino,
rosa, soja, tomate e uva. Além disso, é usado em arroz, milho e trigo armazenados,
é aplicado no solo na cultura de cana-de-açúcar e no controle de formigas. A
12
Ingestão Diária Aceitável (IDA) deste pesticida é de 0,02 mg kg
-1
de peso corpóreo
(p.c) (ANVISA, 2007). A IDA é a quantidade do composto que uma pessoa pode
consumir, diariamente, durante toda a sua vida, sem risco significativo à sua saúde e
é determinada para cada ingrediente ativo de agrotóxico com base em estudos
sobre as propriedades físico-químicas, metabólicas, farmacológicas e toxicológicas
dos agrotóxicos, provenientes de estudos conduzidos com animais de laboratórios.
(Z)-(1R)-cis-
(Z)-(1S)-cis-
CH
3
H
2
CO
2
C
CH
3
CH
3
CHC
CF
3
Cl
H
H
CO
2
C
CHC
CF
3
Cl
CH
3
CH
3
H
H
CH
3
H
2
Figura 1 – Fórmula estrutural do pesticida bifentrina
2.2.3.2 Ciflutrina
O piretróide ciflutrina ((RS)-α-cyano-4-fluoro-3-phenoxybenzyl
(1RS,3RS;1RS,3SR)-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylate)).
pertencente à classe de inseticida e classificado toxicologicamente na classe II
(altamente tóxico), é autorizado para o uso na aplicação foliar nas culturas de
algodão, amendoim, arroz, café, feijão, fumo, soja, tomate e trigo. A IDA é de 0,02
mg kg
-1
p.c. (ANVISA, 2007). A fórmula estrutural do pesticida ciflutrina está
demonstrada na Figura 2.
13
O
CH
CN
F
CH
3
CH
3
CHC
Cl
Cl
CO
2
Figura 2 – Fórmula estrutural do pesticida ciflutrina
2.2.3.3 Esfenvalerato
O pesticida esfenvalerato ((S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl (S)-2-(4-chloro
phenyl)-3-methylbutyrate) é classificado como inseticida e pertencente
toxicologicamente a classe II (altamente tóxico). A fórmula estrutural deste pesticida
está demonstrada na Figura 3. Seu uso é autorizado na aplicação foliar nas culturas
de algodão, arroz, café, cebola, crisântemo, feijão, fumo, milho, rosa, soja, tomate e
trigo. A IDA é de 0,02 mg kg
-1
p.c. (ANVISA, 2007).
OC
CN
O
C
CH(CH
3
)
2
Cl
O
H
H
Figura 3 – Fórmula estrutural do pesticida esfenvalerato
2.2.3.4 Fenpropatrina
O piretróide fenpropatrina ((RS)-alfa-cyano-3-phenoxybenzyl 2,2,3,3-
tetramethylcyclopropanecarboxylate) é classificado como inseticida e acaricida e
também pertence toxicologicamente à classe II (altamente tóxico). É autorizado na
aplicação foliar nas culturas de algodão, café, cebola, citros, crisântemo, feijão,
gladíolo, maçã, mamão, morango, repolho, rosa, soja e tomate. O valor da IDA para
este pesticida é de 0,03 mg kg
-1
p.c. (ANVISA, 2007). A Figura 4 demonstra a
fórmula estrutural deste pesticida.
14
CH
CH
CH
3
CH
3
C
O
O
O
CH
CN
Cl
O
CH
CN
CO
2
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
Figura 4 – Fórmula estrutural do pesticida fenpropatrina
2.2.3.5 Fenvalerato
O piretróide fenvalerato ((RS)-α-cyano-3-phenoxybenzyl (RS)-2-(4-chloro
phenyl)-3-methylbutyrate) pertence à classe de inseticida e acaricida e também é
classificado toxicologicamente como altamente tóxico, ou seja, pertence à classe II.
Sua fórmula estrutural está demonstrada na Figura 5. É autorizado para o emprego
domissanitário. O valor da IDA para este pesticida é de 0,02 mg kg
-1
p.c. (ANVISA,
2007).
Figura 5 – Fórmula estrutural do pesticida fenvalerato
2.2.3.6 Permetrina
A permetrina (3-phenoxybenzyl (1RS,3RS;1RS,3SR)-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-
dimethylcyclo propanecarboxylate) é um piretróide pertencente à classe de inseticida
e formicida. Quanto à classificação toxicológica está classificado como mediamente
tóxico, ou seja, classe III (ANVISA, 2007). A Figura 6 demonstra sua fórmula
estrutural.
É autorizado na aplicação foliar nas culturas de algodão, arroz, café, couve,
couve-flor, fumo, milho, repolho, soja, tomate e trigo. Além disso, é usado na
15
aplicação em arroz, fumo, milho e trigo armazenados e no controle de formigas
(ANVISA, 2007).
OCH
2
CO
2
CH
3
CH
3
C
Cl
Cl
CH
Figura 6 – Fórmula estrutural do pesticida permetrina
2.3 Tomate
2.3.1 Origem e histórico
Afirma-se que o tomate é nativo da Região Andina, na parte ocidental da
América do Sul, e também da América Central, havendo discordâncias quanto ao
seu país de origem. Muitos autores situam sua origem em países andinos como o
Peru, a Bolívia e o Equador [FIGUEIRA, 1982].
A mais antiga descrição foi feita por Pietro Andréa Mattioli, em 1544, sendo
que as primeiras plantas produziram frutos amarelos. Porém, a planta não foi
difundida porque era considerada como extremamente venenosa, permanecendo
como uma curiosidade botânica e como planta ornamental, devido aos belos frutos
amarelos. O tomateiro foi mais aceito principalmente pelos espanhóis, que logo o
introduziram em sua alimentação, mas mesmo assim, ficou restrito por quase dois
séculos na região da Espanha [MINAMI & HAG, 1989].
A produção brasileira de tomate para industrialização começou em
Pernambuco, no final do século XVIII. Porém, a cultura teve um grande impulso
apenas a partir de 1950, no estado de São Paulo, viabilizando a implementação de
diversas agroindústrias. Na década de 80, expandiu-se para a região nordeste,
especialmente em Pernambuco e norte da Bahia [EMBRAPA, 2003]. O aumento
verificado na produção de tomate no Brasil na década de 80 deveu-se ao estímulo
das indústrias, que passaram por um crescimento acelerado, tanto na modernização
16
e aumento da capacidade das existentes, como na instalação de fábricas em áreas
novas. Esse aumento no ramo industrial se deve às altas verificadas nos produtos
processados de tomate no mercado internacional [MINAMI & HAG, 1989].
Atualmente, a maior área cultivada com tomate industrial está na região
centro-oeste, onde o clima seco durante os meses de março a setembro favorece o
cultivo do tomateiro [EMBRAPA, 2003].
2.3.2 Importância econômica e social
O tomate é um dos vegetais frescos mais consumidos no mundo, e também
amplamente utilizado por indústrias de alimentos para a obtenção de produtos
derivados. No Brasil, é um dos gêneros alimentícios mais consumidos por pessoas
de todos os níveis sociais [TAVARES & RODRIGUEZ-AMAYA, 1994].
A cultura do tomate é uma das mais difíceis de conduzir para obtenção de
resultados satisfatórios, pois é sensível a numerosas doenças, sua nutrição requer
cuidados especiais e os frutos são de alta perecibilidade. Por isso, a produção é feita
a custos elevados devido à necessidade de altas dosagens de adubo, irrigação
pesada, controle semanal das doenças e pragas, entre outros [MINAMI & HAG,
1989].
O cultivo do tomateiro exige um alto nível tecnológico e intensa utilização de
mão-de-obra. Apesar do elevado índice de mecanização nas operações de preparo
de solo, adubação, irrigação e pulverização, é necessária intensa mão-de-obra na
execução das tarefas de capina e colheitas manuais, o que dá a essa cultura
elevada importância econômica e social [EMBRAPA, 2003].
A Tabela 2 mostra a área plantada, a produção e a produtividade média de
tomate no país por região e o comparativo das duas últimas safras, onde se percebe
que a produção nacional de tomate na safra 2007 apresentou ligeira queda em
relação à safra 2006, segundo levantamento sistemático da produção agrícola,
divulgado pelo IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística).
17
Tabela 2 – Área plantada, produção e produtividade média do tomate nas
regiões brasileiras nas safras 2006 e 2007
Regiões Área plantada (ha) Produção (t) Produtividade (kg ha
-1
)
Safra 2006
Safra 2007
Safra 2006
Safra 2007
Safra2006
Safra 2007
Norte 1.042 1.042 8.113 7.984 8.065 7.936
Nordeste
13.047 12.292 517.784 494.366 39.823 40.219
Sudeste 24.281 22.298 1.569.765
1.417.711 64.725 63.884
Sul 8.204 7.530 393.132 419.888 47.978 55.769
Centro-
Oeste
10.392 10.505 784.133 790.094 75.455 75.211
Total
56.966 53.667 3.272.927
3.130.043 57.574 58.479
Fonte: IBGE, 2007
2.3.3 Composição química
Quanto ao seu valor nutricional, o tomate não é das hortaliças mais ricas em
proteínas, vitaminas e sais minerais, especialmente por conter entre 93 e 95% de
água no fruto ao natural. Nos 5 a 7% restantes, encontram-se lipídeos, proteínas,
açúcares, ácidos orgânicos, minerais e outros compostos [FIGUEIRA, 1982;
EMBRAPA, 2003]. Todavia, por ser consumido em maior quantidade e com maior
freqüência em relação a outras hortaliças mais nutritivas, o tomate torna-se uma
fonte importante de tais nutrientes na dieta dos brasileiros. Também contribui para
isso, a forma como é consumido, geralmente em saladas, evitando-se as perdas
ocasionadas pela cocção [FIGUEIRA, 1982]. A Tabela 3 contém dados sobre a
composição do tomate, referente à variedade Deborah.
18
Tabela 3. Composição do tomate (variedade Deborah)
Composição Valor médio (%)
Água 94,5
Açúcar 3,92
Proteínas 0,87
Lipídeos 0,12
Acidez titulável (% ácido cítrico) 0,28
Outros 0,31
Fonte: TONON et al., 2006
2.3.4 Uso de pesticidas em tomate e Limites Máximos de Resíduos
Uma das maiores preocupações dos consumidores com relação ao uso de
pesticidas nas lavouras é saber se os alimentos estão contaminados com resíduos
tóxicos que possam fazer mal a saúde. Os princípios ativos destes produtos são
desenvolvidos para serem aplicados nas lavouras, controlando o ataque de pragas e
doenças e depois degradarem-se, de modo que o alimento colhido não esteja
contaminado [ANDEF, 2008].
Para garantir que a população não corra o risco de consumir alimentos com
níveis perigosos de pesticidas, para todo produto registrado existe um Limite Máximo
de Resíduo (MRL, do inglês Maximun Residue Limit) permitido por lei para cada
produto agrícola ou processado [BARBOSA, 2004].
O Limite Máximo de Resíduos é definido pela ANVISA como sendo a
quantidade máxima de agrotóxico legalmente aceita no alimento, em decorrência da
aplicação adequada numa fase específica, desde sua produção até o consumo. É
expressa em miligramas de resíduos por quilograma de alimento (mg kg
-1
) [ANVISA,
2006].
Pelo Codex Alimentarius, a definição é muito semelhante, sendo definido
como a concentração máxima do resíduo de um pesticida (expresso em mg kg
-1
)
legalmente permitido no alimento ou na ração animal. Os valores de MRL para
pesticidas, estabelecidos pelo Codex Alimentarius são baseados em dados de
resíduos, obtidos principalmente a partir de testes supervisionados. Esses dados
obtidos podem variar consideravelmente de região para região, por apresentarem
19
diferentes necessidades para o controle local das infestações, resultando em
diferentes quantidades e tipos de resíduos nos alimentos. Dessa maneira, o Codex
Alimentarius considera o máximo possível essas variações para o estabelecimento
de seus MRLs, desde que haja dados disponíveis que possam dar suporte a essa
ação
[FAO, 2005].
A cultura de tomate tem se tornado menos resistente a várias doenças e
condições ambientais adversas, como resultado de processos empregados para
aumentar a produtividade e qualidade desta cultura. Além disso, esta cultura, como
tantas outras, tem se tornado muito dependente de intenso uso de pesticidas
[ENGINDENIZ, 2006]. É importante ressaltar que o tomateiro pode receber
diferentes tipos de pesticidas, entre sistêmicos e de contato.
Na Tabela 4 estão listados os valores de MRLs estabelecidos pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2008b), Codex Alimentarius (2008) e pela
União Européia (2008) para os compostos alvo deste estudo.
Tabela 4 - Pesticidas analisados e Limites Máximos de Resíduos (MRLs) em
tomate
MRL (mg kg
-1
)
Pesticida
ANVISA União Européia Codex Alimentarius
Bifentrina 0,02 0,02 n.e.
Ciflutrina 0,02 0,05 0,5
Esfenvalerato e fenvalerato 0,2 n.e. 1
Fenpropatrina 0,05 0,05 n.e.
Permetrina cis e trans 0,3 0,05 1
n.e. = não estabelecido
20
2.4 Métodos de extração de resíduos de pesticidas
2.4.1 Fundamentos e importância
Métodos cromatográficos são amplamente utilizados para determinação de
resíduos de pesticidas em amostras ambientais, sendo necessário utilizar diferentes
métodos de preparo de amostra, os quais fazem uso de diferentes solventes,
procedimentos e reagentes, cada método com suas vantagens e desvantagens.
Mesmo assim, o preparo da amostra ainda é uma etapa da análise que, muitas
vezes, recebe menos atenção em termos de pesquisa quando comparada aos
métodos cromatográficos ou estágios de detecção (SMITH, 2003).
Na análise de resíduos de pesticidas, há a necessidade de uma etapa prévia
de preparo da amostra, devido à complexidade das matrizes, as concentrações
extremamente baixas dos analitos, bem como, a grande variedade de propriedades
químicas por eles apresentadas. Devido a estes fatores, as interferências são
problemas freqüentes que precisam ser considerados.
Desta maneira, o objetivo principal do preparo da amostra é converter uma
matriz real em uma amostra disponível para análise por cromatografia ou outras
técnicas analíticas. Além disso, o preparo da amostra deve remover interferentes da
matriz, aumentando assim, a seletividade do método, deve aumentar a concentração
do analito, quando necessário, e fornecer um método robusto e reprodutível, o qual
deve ser independente de variações no tipo de matriz (SMITH, 2003).
O emprego de um método de extração adequado pode ser muito valioso e
importante. Uma técnica ineficiente e incompleta pode resultar numa considerável
restrição no resultado das análises e pode envolver um trabalho adicional
significativo para os analistas (SMITH, 2003).
Análises de resíduos de pesticidas em alimentos e amostras ambientais vêm
sendo realizadas em várias instituições governamentais, universidades e
laboratórios privados em todo o mundo há mais de 40 anos. No entanto, os métodos
utilizados para análise estão ainda longe de serem considerados ideais. Alguns
laboratórios de monitoramento de resíduos de pesticidas continuam utilizando
métodos desenvolvidos há 30 anos atrás, quando as necessidades e tecnologias
eram bastante diferentes (ANASTASSIADES et al., 2003).
21
As técnicas mais eficientes para análise de pesticidas envolvem o uso de
Métodos de Extração Multirresíduos, que abrangem diferentes classes de pesticidas
e que são alternativas para a alta demanda por análise de resíduos de pesticidas,
pois representam um monitoramento mais rápido e eficiente, resultando em um
aumento na produtividade dos laboratórios, bem como, uma redução dos custos de
análise de pesticidas (ANASTASSIADES et al., 2003; HERNÁNDEZ et al., 2006).
Estes métodos para serem considerados ideais devem gerar bons resultados de
recuperação para um amplo espectro de pesticidas de diferentes polaridades; devem
ser seletivos, no sentido de evitar a presença de compostos interferentes da matriz
no extrato final; devem separar os analitos da fase aquosa; além de serem de baixo
custo e seguros em termos de resultados e toxicidade (MASTOVSKÁ & LEHOTAY,
2004).
As matrizes mais analisadas em laboratórios de rotina são produtos agrícolas,
como frutas, vegetais e grãos, os quais podem apresentar diferentes tipos de
pesticidas, percebendo-se, dessa maneira, a grande importância de desenvolver
métodos de análise multirresíduos de pesticidas. No entanto, as principais
adversidades a serem encontradas no desenvolvimento destes métodos são as
diferenças de propriedades químicas entre os analitos e a diversidade e
complexidade das matrizes onde estes podem estar presentes (LEHOTAY, 2002).
No geral, a complexidade da matriz resulta em efeitos adversos à análise,
necessitando uma etapa de clean-up antes da análise cromatográfica para remoção
de componentes indesejáveis presentes na matriz. No entanto, esta etapa adicional
pode resultar em pequenas perdas do analito e aumentar o tempo e custo da
análise, além do fato de que etapas adicionais levam a fontes de erros adicionais
(LEHOTAY, 2000).
Em geral, um método de extração para ser considerado adequado deve
apresentar as seguintes propriedades: boa precisão, boa robustez, recuperações
próximas a 100% (boa exatidão), baixo custo, deve ser um método rápido, fácil e
seguro. É muito importante também que o método inclua o maior número de
pesticidas possíveis e remova os possíveis interferentes provenientes da matriz
(HERCEGOVÁ et al., 2007).
A escolha do solvente também é um dos pontos fundamentais no
desenvolvimento de um método de extração multirresíduos. Muitos aspectos devem
ser considerados, incluindo: possibilidade de extração de um amplo espectro de
22
pesticidas com diferentes polaridades; apresentar seletividade durante o
procedimento de extração, partição e clean-up; capacidade de separação da água;
apresentar baixo custo e baixa toxicidade (ANASTASSIADES et al., 2003). Além
disso, o solvente deve ser compatível com os analitos em questão e, se possível,
compatível com o método cromatográfico empregado para evitar etapa de troca de
solvente (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
Normalmente, a maneira mais simples de melhorar a eficiência de um método
analítico é reduzir a quantidade de amostra utilizada para uma quantidade mínima,
que gere resultados estatisticamente satisfatórios. Os métodos que utilizam
quantidades excessivas de amostra requerem maiores volumes de solvente e
conseqüentemente geram mais resíduos e gastos que o necessário
(ANASTASSIADES et al., 2003).
As tendências para os próximos anos, no que diz respeito a métodos
multirresíduos, é o uso de quantidades iniciais de amostras cada vez menores,
técnicas mais seguras e menos agressivas ao meio ambiente, técnicas mais rápidas
e menos laboriosas, mantendo altos valores de recuperação e boa precisão
(HERCEGOVÁ et al., 2007).
2.4.2 Principais métodos de extração
O primeiro importante método multirresíduos para extração de pesticidas foi
desenvolvido por MILLS et al. (1963) nos laboratórios do U.S. Food and Drug
Administration (FDA). Este método comumente chamado de método Mills, faz uso de
acetonitrila como solvente de extração e era utilizado basicamente na extração de
pesticidas organoclorados apolares, provenientes de extratos de alimentos não
gordurosos. Água e sais eram adicionados ao extrato, e depois realizava-se uma
etapa de partição pela adição de solventes apolares, como éter de petróleo ou
hexano. Em seguida, água e componentes da matriz eram separados do extrato
utilizando uma etapa de clean-up (DÍEZ et al., 2006; ANASTASSIADES, et al.,
2003).
A partir do momento que mais pesticidas polares foram sendo desenvolvidos,
novos métodos foram surgindo (SCHENK et al., 2002; DÍEZ et al., 2006). Em 1975,
LUKE et al. desenvolveram o chamado método Luke, o qual faz uso de acetona
23
como solvente de extração, seguida de uma etapa de partição pela adição dos
solventes apolares, éter de petróleo e diclorometano (DÍEZ et al., 2006; SCHENCK
et al., 2002).
KRIJGSMAN & KAMP (1976) introduziram o método de acetato de etila como
uma alternativa para o método Luke na extração de pesticidas provenientes de
amostras não gordurosas. Este método apresentou maior rapidez, simplicidade e
limpeza dos extratos, quando comparado ao método Luke, além de resultados
satisfatórios de recuperação. Estas vantagens fizeram deste método, um método de
extração oficial usado por algumas agências reguladoras européias. O método de
acetato de etila envolve uma extração com este solvente seguida da adição de
sulfato de sódio e uma etapa de clean-up utilizando cromatografia por permeação
em gel (GPC, do inglês Gel Permeation Chromatography). Uma das desvantagens
deste método é a redução na eficiência de extração de pesticidas polares, quando
comparado ao método Luke, e também a quantidade de co-extrativos apolares
provenientes da matriz (DÍEZ et al., 2006).
Mais tarde, foi desenvolvido pelo Food and Consumer Product Safety
Authority (VWA) em Amsterdã, Holanda, um procedimento de extração denominado
mini-Luke. Neste método utilizam-se 30 mL de cada solvente: acetona, éter de
petróleo e diclorometano (KOK et al., 1987).
Durante os anos 90, ocorreu um intenso desenvolvimento de métodos
alternativos de extração, os quais proporcionaram uma diminuição nas etapas
durante o procedimento de preparo da amostra e uma redução no volume de
solvente utilizado, resultando em uma menor quantidade de resíduos gerados
(ANASTASSIADES et al., 2003; RODRIGUEZ et al., 2003). Dentre estes
procedimentos podemos citar a extração em fase sólida (SPE, do inglês, solid phase
extraction), dispersão da matriz em fase sólida (MSPD, do inglês matrix solid phase
dispersion), extração por fluido supercrítico (SFE, do inglês supercritical fluid
extraction), micro extração em fase sólida (SPME, do inglês Solid phase micro
extraction) e mais recentemente, a extração sortiva com barra magnética (SBSE, do
inglês stir bar sortive extraction).
As principais desvantagens destas técnicas são o baixo número de pesticidas
que podem ser extraídos e também a limitada quantidade de amostra que pode ser
empregada. Como a extração é muitas vezes automatizada, é necessário, na
maioria dos casos, manutenção dos instrumentos, que podem resultar em altos
24
custos, e etapas de limpeza constantes antes de uma nova operação, o que muitas
vezes resulta em um maior tempo de análise (ANASTASSIADES et al., 2003).
Em 2003, ANASTASSIADES et al. publicaram um método de extração
multirresíduos chamado de QuEChERS (do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe), cujo nome reflete suas maiores vantagens. Este procedimento
consiste na utilização de amostra previamente homogeneizada e a mesma
quantidade de acetonitrila como solvente de extração. Neste método, o clean-up e a
remoção de água são realizados simultaneamente utilizando um processo
denominado Extração em Fase Sólida Dispersiva (dispersive-SPE, do inglês
Dispersive Solid Phase Extraction).
A adição de sais (“salting out”) para iniciar e/ou influenciar o processo de
partição líquido-líquido tem sido utilizada em vários métodos multirresíduos para
análise de resíduos de pesticidas, pois dependendo da natureza do solvente
utilizado na etapa de partição obtêm-se melhores resultados para analitos polares.
Além disso, esta adição de sais também pode ser utilizada para controlar a
quantidade de água na fase orgânica (SCHENCK et al., 2002).
Atualmente, os métodos multirresíduos mais comumente utilizados para
análises de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais envolvem uma extração
inicial com acetona, acetonitrila ou acetato de etila. Cada um destes solventes de
extração tem suas vantagens e desvantagens em termos de seletividade e
eficiência, dependendo principalmente das características dos pesticidas em análise
e do tipo de matriz onde estes pesticidas serão analisados (HIEMSTRA & KOK,
2007).
Os métodos de extração multirresíduos podem ser afetados por uma
variedade de fatores, incluindo: características da amostra (pH, quantidade de água,
lipídeos, açúcares); solvente utilizado para extração; razão amostra/solvente;
procedimento de extração (método de agitação, por exemplo); temperatura de
extração; princípio de partição (adição ou não de solventes apolares e/ou sais);
tempo gasto nas etapas de agitação, número de repetições e materiais utilizados na
etapa de clean-up. MRMs possuem muitas etapas analíticas, portanto, uma grande
possibilidade de gerar erros. A chance de cometê-los aumenta à medida que
aumenta o número de etapas em um método. Com base nisto, a tendência é o
desenvolvimento de métodos simples e com o mínimo de etapas possíveis
(ANASTASSIADES et al., 2003).
25
2.4.3 Métodos de extração Luke e mini-Luke
O método Luke é um método multirresíduos de pesticidas bastante utilizado
para o monitoramento de alimentos, estudos de avaliação de riscos e análises de
rotina em amostras não gordurosas, tais como frutas e vegetais.
No método de extração Luke, introduzido por LUKE et al. (1975) utiliza-se
100 g de amostra, 200 mL de acetona na etapa inicial de extração e uma mistura de
éter de petróleo e diclorometano na etapa de partição, sendo utilizados 100 mL de
cada um destes solventes. Para obter melhores recuperações para pesticidas
polares, cloreto de sódio é adicionado na fase aquosa para garantir a transferência
dos pesticidas para a fase orgânica. A água co-extraída ainda presente na fase
orgânica é retirada, em seguida, com sulfato de sódio anidro (SCHENK et al., 2002;
DIÉZ et al., 2006).
Nos anos 80, o procedimento de extração denominado mini-Luke, em função
de utilizar menores quantidades de solvente, foi desenvolvido pelo ministério da
agricultura da Holanda (Food and Consumer Product Safety Authority) e vem sendo
utilizado até hoje (KOK et al., 1987; HIEMSTRA & KOK, 2007). O método consiste
na análise de 15 g de frutas ou vegetais já processados, adicionando 30 mL de
acetona seguido de agitação em homogeneizador por cerca de 30 segundos. Em
seguida, 30 mL de éter de petróleo e 30 mL de diclorometano são adicionados,
agitando-se novamente em homogeneizador por cerca de 1 minuto. A água co-
extraída ainda presente na fase orgânica é retirada, em seguida, com sulfato de
sódio anidro. O extrato é centrifugado e a parte líquida é transferida para frasco com
tampa, sendo necessária etapa de evaporação antes da análise no sistema
cromatográfico. A evaporação dos extratos é conduzida por um banho de água já
aquecida a uma temperatura de 40 °C, sendo esta temperatura aumentada até 62
°C até quase secura total, e o restante do solvente é evaporado à temperatura
ambiente (LEHOTAY et al., 2005a).
Como um método de extração alternativo, desenvolveu-se no VWA uma
modificação do método de extração mini-Luke nos anos 90, onde se adicionou
sulfato de sódio na etapa de extração, levando assim, a uma melhor extração dos
pesticidas polares e conseqüentemente, melhores valores de recuperações foram
obtidos para estes pesticidas (HIEMSTRA & KOK, 2007).
26
Desta maneira, desde a década de 80, o laboratório Food and Consumer
Product Safety Authority tem aplicado a miniaturização do método de extração Luke
original (LUKE et al., 1975) onde não realiza-se a etapa de particionamento com
cloreto de sódio, pois a adição dos solventes apolares (diclorometano e éter de
petróleo) já é suficiente para uma separação bem definida entre a fase orgânica e a
fase aquosa (HIEMSTRA & KOK, 2007).
Estudos realizados em 2002 por SCHENK et al., demonstraram que o sulfato
de sódio é muito menos eficiente na remoção de água residual de solventes
orgânicos que o sulfato de magnésio, o qual vem sendo amplamente utilizado em
estudos mais recentes (ANASTASSIADES et al., 2003).
Os solventes clorados, como é o caso do diclorometano utilizado no método
Luke e mini-Luke, constituem um risco ambiental e por isso, um problema no
momento do descarte, representando, portanto, uma importante desvantagem
destes métodos (SCHENK et al., 2002).
Os solventes miscíveis em água, como acetona e acetonitrila, extraem tanto
pesticidas polares quanto apolares de matrizes não gordurosas, promovendo a
extração em uma única fase quando em contato com a matriz. No entanto, devido à
maior dificuldade em separar misturas de água e acetona em relação à separação
de água e acetonitrila, há a necessidade de adição de solventes apolares em
extrações com acetona para que ocorra a separação entre as fases, o que resulta
em uma diluição do extrato (MAROVSKÁ, 2004; SCHENCK et al., 2002).
Outra desvantagem deste método é o emprego de agitação mecânica durante
o procedimento de extração, assim com a maioria dos outros métodos, sendo que o
procedimento de agitação manual possui várias vantagens, como será descrito a
seguir.
As maiores vantagens deste método de extração são a velocidade de
extração, a limpeza relativa dos extratos, embora não seja aplicada uma etapa de
clean-up, e a compatibilidade com ambas as classes de detectores, seletivos e
espectrômetros de massas (HIEMSTRA & KOK, 2007).
27
2.4.4 Método de extração QuEChERS
O método de extração QuEChERS foi introduzido por ANASTASSIADES et al.
(2003) com a finalidade principal de superar limitações práticas de outros métodos
de extração multirresíduos já existentes. O método QuEChERS tem as vantagens
principais de ser um método rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro, as
quais são destacadas no próprio nome QuEChERS. Este método foi desenvolvido
para amostras que possuem em sua composição mais de 75% de água (DÍEZ et al.,
2006).
Durante o desenvolvimento deste método buscou-se a obtenção de um
método simples, rápido, de baixo custo e com um número mínimo de etapas
analíticas, utilizando pequenas quantidades de reagentes, e logicamente, com
resultados satisfatórios de precisão e exatidão. O método desenvolvido tem a
possibilidade de ser aplicado em qualquer laboratório, devido à simplificação de
etapas lentas e trabalhosas (ANASTASSIADES et al., 2003). Estas vantagens do
método QuEChERS possibilitam a tendência do uso deste como um dos principais
métodos empregados na análise de resíduos de pesticidas em alimentos infantis
(HERCEGOVÁ et al., 2007; LEANDRO et al., 2006).
O procedimento original consiste em pesar 10 g de amostra previamente
homogeneizada em tubo de PTFE (politetrafluoretileno) e adicionar 10 mL de
acetonitrila, com agitação vigorosa, que pode ser manual ou utilizando vortex, por 1
minuto. Em seguida, adiciona-se 4 g de sulfato de magnésio e 1 g de cloreto de
sódio, agitando por 1 minuto. O extrato é então centrifugado e transfere-se 1 mL
deste extrato para outro tubo contendo uma mistura de 150 mg de sulfato de
magnésio anidro e 25 mg de PSA. Agita-se novamente por 30 segundos e
centrifuga-se (ANASTASSIADES et al., 2003).
No método QuEChERS, uma combinação apropriada de sais gera uma
separação de fases bem definida, não necessitando a adição de solventes orgânicos
apolares, que resulta na diluição do extrato e possivelmente pode levar à uma menor
recuperação de alguns analitos (ANASTASSIADES et al., 2003; MASTOVSKÁ &
LEHOTAY, 2004).
Quando se utiliza amostras com um conteúdo de água entre 25 e 80% é
necessário adicionar água antes da extração inicial com acetonitrila para conseguir
um total de cerca de 10 mL de água. Quando se utiliza amostras que possuem
28
menos de 25% de água em sua composição, como cereais, por exemplo, a
quantidade de amostra utilizada pode ser reduzida (entre 1 e 5 g, por exemplo) e
uma certa quantidade de água também deve ser adicionada antes da extração inicial
com acetonitrila (QuEChERS, 2006).
Devido à simplicidade do método, o qual evita erros provenientes
principalmente de múltiplas etapas, é necessário cuidado especial nas medidas de
pequenos volumes, pois estes detalhes passam a ser importantes fontes de erro no
método de preparo da amostra. Sendo assim, o analista precisa ter cuidado para
evitar estas fontes de erro, utilizando pipetas, seringas e medidas volumétricas em
geral apropriadas, especialmente quando não se utiliza padrão interno (LEHOTAY,
2007).
Com o emprego do método QuEChERS, recuperações entre 85 e 101%
(sendo a maioria maior que 95%) e repetibilidades menores que 5% foram atingidas
para uma ampla variedade de pesticidas fortificados, incluindo pesticidas muito
polares. Utilizando este método, um único analista pode preparar 6 amostras
previamente homogeneizadas em menos de 30 minutos, com custo aproximado de 1
dólar de materiais por amostra (ANASTASSIADES et al., 2003).
Um grande número de artigos sobre o método QuEChERS vem sendo
publicado a cada ano e estas publicações indicam que diversos profissionais da área
química em todo o mundo estão usando este método para análise de resíduos de
pesticidas em alimentos. Além disso, algumas modificações do método também vêm
sendo publicadas com o intuito de otimizar o processo de extração (LEHOTAY,
2007).
A fim de minimizar problemas de degradação de certos pesticidas, como por
exemplo, folpete, captana e clorotalonil, durante a etapa de extração devido ao meio
básico, uma etapa de tamponamento do extrato foi adicionada, o que promoveu uma
melhora nos resultados obtidos para estes pesticidas. Para isso, um certo volume de
ácido acético foi adicionado à acetonitrila utilizada para extração dos pesticidas. O
método QuEChERS com etapa de tamponamento envolve a extração com
acetonitrila contendo 1% de ácido acético (v/v) e partição líquido-líquido promovida
pela adição de acetato de sódio e sulfato de magnésio
,
o qual é conhecido como
método QuEChERS modificado (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004; LEHOTAY et al.,
2005b). Com esta modificação do método QuEChERS obteve-se valores de
29
recuperações estáveis para pesticidas difíceis de serem analisados em diferentes
tipos de matriz (LEHOTAY, 2005a)
.
Uma importante vantagem do método QuEChERS é a possibilidade de
realizar a agitação da amostra manualmente, enquanto que a maioria dos métodos
de extração emprega agitação mecânica. A agitação manual possui vantagens
como: a amostra não é exposta a nenhuma superfície metálica, ao contrário de
quando se utiliza um homogeneizador; possibilidade de realizar a extração em
qualquer laboratório ou até mesmo a campo; maior rapidez, pois não há a
necessidade de lavagem do homogeneizador entre uma amostra e outra; a extração
é realizada em frasco que permanece fechado, resultando em um método mais
seguro pela menor exposição do analista; menor custo, uma vez que não necessita
de equipamento para agitação e, portanto, não há custos com manutenção deste
(ANASTASSIADES et al., 2003).
Outras importantes vantagens deste método foram descritas por LEHOTAY et
al. (2005a), entre as quais pode-se citar: altas recuperações (maiores que 85%) para
um amplo espectro de pesticidas com diferentes polaridade e volatilidade, incluindo
analitos difíceis de serem analisados; obtenção de resultados bastante precisos;
menor quantidade de solvente é utilizado e conseqüentemente menor quantidade de
resíduo é gerado, não havendo a utilização de solventes clorados; uma única
pessoa pode realizar a extração sem a necessidade de muita habilidade ou
treinamento; mesmo sendo um método rápido e fácil, é robusto o suficiente porque
na etapa de clean-up são removidos ácidos graxos e outros ácidos orgânicos que
são encontrados em alimentos; necessidade de um espaço muito pequeno para
realizar o processo, podendo ser feito em um laboratório móvel, se necessário; a
acetonitrila é adicionada utilizando dispensador em um frasco que é imediatamente
fechado, portanto a exposição do analista ao solvente é mínima e somente um dólar
de material é usado por 10 g de amostra.
Os métodos multirresíduos que utilizam acetonitrila como solvente de
extração não empregam a adição de nenhum tipo de solvente apolar no processo de
partição, uma vez que a adição de sais já é suficiente para promover a separação
entre as fases. No método QuEChERS, após a extração inicial com acetonitrila, uma
combinação dos sais sulfato de magnésio e cloreto de sódio é adicionada para
induzir a separação das fases. A adição de cloreto de sódio resulta no aumento da
recuperação de compostos polares. A adição de quantidades e combinações
30
apropriadas de sais pode ser usada para controlar a quantidade de água na fase
orgânica. Esta adição de sais não é somente muito conveniente, rápida, fácil e de
baixo custo, mas também tem a vantagem de não aumentar o volume do extrato,
não precisando de uma etapa posterior de evaporação para concentrar a amostra
(ANASTASSIADES et al., 2003; DÍEZ et al., 2006).
O sulfato de magnésio anidro foi escolhido para ser utilizado no método
QuEChERS por ser um agente secante muito mais eficiente quando comparado a
outros sais, sendo sua hidratação um processo extremamente exotérmico, tendo
como resultado um aquecimento do tubo utilizado entre 40-45 °C durante as etapas
de extração/partição. Este aquecimento não é suficiente para volatilizar ou degradar
os pesticidas, mas é favorável para extração de alguns pesticidas
(ANASTASSIADES et al., 2003; LEHOTAY, 2000).
A utilização de acetonitrila tem algumas vantagens como, por exemplo,
possibilitar a extração de uma menor quantidade de co-extrativos lipofílicos da
amostra, como ceras, pigmentos e gordura. Além disso, este solvente também
proporciona a extração de uma ampla faixa de pesticidas com diferentes
polaridades, e quando acidificada permite recuperações satisfatórias de pesticidas
que geralmente apresentam problemas de estabilidade (LEHOTAY, 2005).
A principal desvantagem do método QuEChERS comparado a outros
métodos de extração, é que a relação amostra/extrato final, de 1 g mL
-1
, é menor
que a relação obtida pela maioria dos outros métodos de extração, o que pode
conduzir a valores de LOQ mais elevados para o mesmo volume de injeção no
método QuEChERS (LEHOTAY et al., 2005a).
Além disso, pelo fato de lipídeos não serem muito solúveis em acetonitrila e
água, as gorduras geralmente formam um filme na superfície destes solventes ou
uma emulsão durante a extração, portanto, pesticidas lipofílicos permanecem na
gordura não dissolvida, o que resulta em recuperações mais baixas no extrato de
acetonitrila. O nível de perdas depende da quantidade de lipídeos na amostra, bem
como, da polaridade dos analitos. Se a quantidade de gordura na amostra é
pequena, toda ou alta percentagem dessa gordura se dissolve na acetonitrila,
resultando em recuperações mais altas para pesticidas lipofílicos. Por este fato, a
acetonitrila não é muito útil para alimento com alto teor de gordura. No entanto, a
acetonitrila pode ser utilizada para a extração de pesticidas lipofílicos de alimentos
com baixo teor de gordura e na extração de pesticidas polares e pouco polares de
31
uma ampla variedade de alimentos gordurosos ou não (LEHOTAY, 2005;
QuEChERS, 2006).
A etapa de clean-up é um aspecto crítico na análise de resíduos de pesticidas
para promover robustez e confiabilidade aos resultados obtidos pelo sistema
cromatográfico, uma vez que componentes não voláteis da matriz podem ficar
retidos no conjunto injetor-insersor e também na coluna, reduzindo o desempenho
do sistema e aumentando o número de manutenções do mesmo (HERCEGOVÁ et
al., 2007; SAITO et al., 2004). Sendo assim, um novo método de clean-up foi
desenvolvido juntamente com o método QuEChERS, o qual foi chamado de
Extração em Fase Sólida Dispersiva (dispersive-SPE). Neste método, uma alíquota
de 1 mL do extrato é colocada em contato com uma mistura contendo 25 mg do
absorvente PSA e 150 mg de sulfato de magnésio. Os sólidos são então separados
por centrifugação ou filtração e uma alíquota do extrato final é levada para análise
(ANASTASSIADES et al., 2003). Algumas vezes, na etapa de clean-up do método
QuEChERS é conveniente utilizar uma combinação de adsorventes, como por
exemplo, octadecilsilano (C
18
) e PSA, dependendo do tipo de matriz utilizada e das
propriedades químicas dos pesticidas (LEHOTAY, 2005).
A extração em fase sólida dispersiva é baseada na extração em fase sólida
(SPE), mas o adsorvente PSA é adicionado diretamente ao extrato, sem
necessidade de condicionamento em cartuchos. A extração em fase sólida requer
conhecimento da prática e da teoria da técnica e requer treinamento e atenção por
parte do analista. Além disso, a SPE automatizada é relativamente cara e requer
manutenção constante. Os fatores mais comuns que afetam a reprodutibilidade em
SPE são as dificuldades com o ajuste do vácuo (portanto, com a vazão) e a
secagem do absorvente durante a extração (ANASTASSIADES et al., 2003).
Devido ao uso de pequenas quantidades de adsorvente e por não necessitar
o uso de cartuchos, a dispersive-SPE é uma técnica que economiza tempo, dinheiro,
trabalho e também quantidade de solvente, quando comparada à técnica de SPE.
Não há a necessidade de nenhuma etapa de condicionamento de cartuchos, uma
mínima atenção do analista é necessária e também não há problemas de secagem
do adsorvente. Em dispersive-SPE todo o adsorvente interage com a matriz e uma
ótima capacidade por miligrama de adsorvente é atingida (ANASTASSIADES et al.,
2003).
32
A mistura de sulfato de magnésio e PSA permite que a etapa de clean-up e a
redução de água sejam efetuadas simultaneamente. Esta etapa de remoção de
água proporciona um extrato final de menor polaridade, facilitando assim a
precipitação de co-extrativos polares. O adsorvente PSA, por sua vez, retém as
interferências da matriz, removendo ácidos graxos, açúcares, alguns pigmentos e
outros co-extrativos da matriz, sendo que depois de realizada uma etapa de agitação
manual e centrifugação, o extrato está pronto para ser injetado no sistema
cromatográfico (ANASTASSIADES et al., 2003). Por outro lado, o PSA quando
utilizado como adsorvente pode reter pesticidas contendo grupos de ácido
carboxílico em sua estrutura, como 2,4-D, por exemplo, reduzindo o potencial de
recuperação destes compostos (LEHOTAY, 2007).
Uma imperfeição do método QuEChERS original com relação à etapa de
clean-up é que o PSA não remove de forma adequada a clorofila presente no extrato
de alguns vegetais. O PSA retém ácidos graxos e outros ácidos orgânicos que estão
presentes nos alimentos, mas a coloração verde proveniente da clorofila é apenas
ligeiramente reduzida durante a etapa de clean-up. A clorofila pode acumular-se no
sistema de injeção e aumentar a freqüência de trocas do insersor e manutenção da
coluna (LEHOTAY, 2005).
De fato, os métodos de extração muitirresíduos possuem muitas etapas
analíticas, portanto, uma grande possibilidade de gerar erros. No método
QuEChERS, para minimizar a geração de erros, um padrão interno é
freqüentemente adicionado ao processo. No método QuEChERS original foi
utilizado trifenilfosfato como padrão interno por possuir propriedades adequadas
para ser submetido à extração quantitativa para matrizes pouco gordurosas, não
participando da etapa de partição na fase aquosa e não podendo ser retido durante
a etapa de clean-up. Em um sistema formado por acetonitrila, água e sais, 98%
deste padrão interno foi recuperado na fase orgânica, e 99% foi recuperado com a
etapa de clean-up utilizando PSA (ANASTASSIADES et al., 2003).
2.4.5 Comparação entre os principais solventes de extração
Acetonitrila, acetona e acetato de etila são os três solventes mais comumente
usados para isolar e analisar resíduos de pesticidas provenientes de alimentos e
33
cada um deles tem suas vantagens e desvantagens em termos de seletividade e
procedimento prático, sendo que todos têm demonstrado bons resultados de
recuperação para uma ampla faixa de resíduos de pesticidas (ANASTASSIADES et
al., 2003; MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004). Em contraste com acetona e
acetonitrila, acetato de etila é praticamente imiscível com água, sendo que a água
pode ser facilmente removida dos extratos utilizando um agente secante, geralmente
sulfato de sódio (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
Para induzir uma distinta separação da fase aquosa, acetona precisa da
adição de solventes apolares, o que resulta em uma diluição do extrato e
possivelmente perda de alguns analitos. No caso da acetonitrila, o uso de uma
combinação apropriada de sais pode gerar uma separação de fases bem definida
sem diluição e com ótimas recuperações para uma ampla faixa de pesticidas. Além
disso, sulfato de magnésio anidro remove água residual da fase orgânica composta
por acetonitrila com maior eficiência que no caso da acetona. Um simples
experimento demonstrou que sulfato de magnésio é praticamente insolúvel em
acetonitrila, entretanto, aproximadamente 13 mg de sulfato de magnésio podem ser
dissolvidos em 1 mL de acetona à temperatura ambiente. Esta é uma consideração
bastante importante, uma vez que os sais devem ser evitados em análise
cromatográfica (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
Em termos de seletividade de extração, acetonitrila isola muito menos
compostos lipídicos provenientes da amostra em comparação com acetona e
acetato de etila. Acetato de etila é mais eficiente para evitar a co-extração de
açúcares, principalmente comparando com acetona (MASTOVSKÁ & LEHOTAY,
2004).
Com relação à etapa de clean-up, acetato de etila é mais compatível com
cromatografia por permeação em gel (GPC) para remoção de algumas moléculas
lipofílicas e de pigmentos. Acetona e principalmente acetonitrila são solventes
adequados para o uso de extração em fase sólida (SPE), a qual é preferível em
relação ao uso de GPC, devido ao alto consumo de solvente nesta técnica
(MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
Acetona tem um ponto de ebulição (56,1 °C) menor que acetato de etila e
também acetonitrila (77 e 81,6 °C, respectivamente), conseqüentemente sua
volatilidade à temperatura ambiente é também mais alta (CETESB, 2008). Em
alguns casos, um solvente de maior volatilidade representa uma desvantagem no
34
processo de extração, porque o aumento da evaporação durante o preparo da
amostra pode resultar em alterações no volume de extrato e uma maior exposição
do analista aos vapores do solvente. Entretanto, se uma troca de solvente e/ou
concentração do extrato é necessária, o uso de um solvente com maior volatilidade
passa a ser vantajoso, no entanto, sempre que possível, é preferível evitar estas
etapas (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
Em termos de custos, acetonitrila é aproximadamente 1,4 e 1,7 vezes mais
cara que um grau similar de acetato de etila e acetona, respectivamente. Acetonitrila
é um solvente relativamente tóxico, mas seu impacto negativo em humanos e no
ambiente é muito menor que no caso de solventes clorados (como diclorometano,
por exemplo), os quais são ainda usados em práticas de rotina por alguns
laboratórios (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004). De acordo com a Agência de
Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA) acetonitrila não é classificada como
uma substância cancerígena e não é persistente no ambiente (EPA, 2000). Além
disso, sua volatilidade mais baixa reduz a exposição do analista, a qual pode ser
minimizada seguindo procedimento de preparo apropriado (ANASTASSIADES et al.,
2003).
É importante ressaltar que a seleção de um ótimo solvente de extração para
análise por cromatografia depende de muitos fatores, como por exemplo, a facilidade
de extrair um amplo espectro de pesticidas, custos, toxicidade e seletividade durante
o processo de extração e partição (MASTOVSKÁ & LEHOTAY, 2004).
2.5 Métodos para determinação de resíduos de pesticidas empregando
Cromatografia Gasosa
A determinação de pesticidas é um grande desafio considerando as baixas
concentrações destes analitos presentes nos alimentos, as diferentes propriedades
físicas e químicas, bem como a presença de altas concentrações de compostos
interferentes (BIZIUK et al., 1996). Mesmo assim, milhares de análises de resíduos
de pesticidas em alimentos são realizadas em todo o mundo, todos os dias, com o
objetivo de garantir a saúde da população e também garantir que o respectivo
alimento atenda às exigências da legislação. As técnicas analíticas permitem a
35
quantificação dos resíduos em baixos níveis de concentração, fornecendo, muitas
vezes, evidências para confirmar a identificação e a concentração dos resíduos
detectados.
A Cromatografia Gasosa (GC, do inglês Gas Chromatography) com sistemas
clássicos de detecção como Captura de Elétrons (ECD, do inglês Electron Capture
Detection), Nitrogênio-Fósforo (NPD, do inglês Nitrogen and Phosphorus Detection)
e Fotometria de Chama (FPD, do inglês Flame Photometric Detection) ainda é
amplamente utilizada na análise de resíduos de pesticidas em diferentes áreas. A
Cromatografia Gasosa, assim como a Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC, do inglês High Performance Liquid Chromatography) são rotineiramente
usadas para resolver algumas questões do dia-a-dia e para solucionar diferentes
problemas científicos (GÓRECKI et al., 2006).
A Cromatografia vem evoluindo como uma importante ferramenta na
separação e identificação de diversos compostos em diferentes amostras. No
entanto, apesar do alto poder de separação das técnicas cromatográficas
convencionais, algumas amostras são muito complexas para serem analisadas de
forma eficaz por estas técnicas. Alguns exemplos importantes de amostras muito
complexas incluem amostras petroquímicas, de alimentos, ambientais, fragrâncias e
também o setor de química forense. Nestes exemplos de amostras é muito difícil
conseguir uma completa separação de todos os componentes presentes na amostra
utilizando um simples mecanismo de separação (GÓRECKI et al., 2006;
ADAHCHOUR et al., 2006).
A Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS, do
inglês Gas Chromatography Mass Spectrometry) é uma ferramenta bastante
utilizada em análises de resíduos de pesticidas. Isto se deve ao fato desta técnica
permitir que a determinação e a confirmação de um grande número de compostos
sejam realizadas simultaneamente, em um único instrumento e em uma única
análise cromatográfica.
GC-MS tem sido utilizada para determinar resíduos de pesticidas em
amostras de frutas e vegetais. Esta técnica é particularmente utilizada na análise de
amostras complexas, uma vez que permite eficiente separação e sensibilidade, além
de um alto poder de confirmação dos sinais cromatográficos, principalmente para
compostos que possuem estruturas diferentes e iguais tempos de retenção
(HERNANDEZ et al., 2006).
36
Além da GC-MS, a Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente
(GC×GC, do inglês Comprehensive two-Dimensional Gas Chromatography) também
fornece vantagens em termos de separação dos analitos de interesse,
principalmente quando se utiliza amostras complexas.
2.5.1 Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC)
2.5.1.1 Princípios da técnica GC×GC
Para resolver problemas como a separação do sinal dos analitos do
background da matriz e melhorar a separação entre os sinais cromatográficos em
matrizes complexas, LIU & PHILLIPS (1991) introduziram a técnica de Cromatografia
Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC). Esta técnica consiste em duas colunas
conectadas em série, onde a segunda coluna recebe toda a porção separada na
primeira coluna com análise seqüencial. O efluente da primeira coluna é separado
em um grande número de pequenas frações e cada uma dessas frações é separada
novamente na segunda coluna. A separação na segunda coluna é muito mais rápida
do que na primeira, assim, as frações são estreitas e a separação da primeira coluna
pode ser mantida (PHILLIPS & BEENS, 1999).
Dessa maneira, a GC×GC começou a atrair considerável interesse entre
químicos analíticos, existindo atualmente, uma considerável quantidade de
publicações a respeito deste assunto, as quais discutem fundamentos e conceitos
desta tecnologia, além de destacar esta como uma das melhores técnicas de alta
resolução para análise de amostras voláteis e semi-voláteis. A GC×GC tem sido
aplicada, principalmente, em análises de petróleo e óleos, pesticidas, contaminantes
atmosféricos, alimentos, drogas farmacêuticas e polímeros (RYAN & MARRIOT,
2003).
Segundo GIDDINGS (1984), para abreviar o termo bidimensional abrangente,
deve-se usar um sinal de multiplicação “×”, denotando a ortogonalidade entre os
mecanismos de separação. A ortogonalidade em GC×GC está relacionada com a
utilização de colunas com fases estacionárias diferentes, as quais proporcionam
mecanismos independentes de separação na primeira e na segunda dimensão.
37
Para uma separação cromatográfica ser considerada abrangente, a amostra
deve ser submetida a mecanismos independentes de separação; percentagens
iguais de todos os componentes da amostra (100% ou menos) devem passar pelas
colunas e eventualmente chegar ao detector e a separação obtida na primeira
dimensão deve ser mantida (SCHOENMAKERS et al., 2003; GIDDINGS, 1984).
Nos métodos de separação convencionais temos uma linha de retenção, e
com a separação bidimensional, temos a separação em um plano com um poder
maior para acomodar os picos de uma mistura complexa. A identificação dos
componentes é potencialmente mais confiável, pois cada substância tem duas
medidas de retenção identificadas, ao invés de apenas uma, como acontece na
Cromatografia Gasosa convencional (PHILLIPS & BEENS , 1999).
Uma importante diferença entre os dados obtidos por 1D-GC e GC×GC é o
cromatograma gerado. Enquanto que na 1D-GC cada pico representa um composto,
ou mais de um composto, no caso de co-eluição, em GC×GC cada pico primário
obtido por 1D-GC é dividido em vários segmentos, denominados picos modulados,
que são gerados pela separação na segunda coluna, após o processo de
modulação, sendo que estes quando agrupados representam o pico primário.
O componente chave do instrumento que permite a injeção de pequenas e
estreitas frações da primeira para a segunda coluna é a interface de modulação,
localizada entre as duas colunas. A modulação do sinal aplicado permite que um
sinal contínuo de um detector no final da segunda dimensão possa ser transformado
em um sinal bidimensional (PHILLIPS & BEENS, 1999).
Um esquema de um sistema GC×GC é mostrado na Figura 7. Tipicamente,
duas separações cromatográficas baseadas em mecanismos diferentes são usadas,
com a interface denominada modulador entre as duas colunas cromatográficas
(DALLÜGE et al, 2003).
38
Figura 7 - Esquema de um sistema GC×GC
(
adaptado de DALLÜGE et al, 2003;
ADAHCHOUR et al., 2006)
A forma mais tradicional de separação ortogonal em GC×GC é a utilização de
uma coluna apolar, ou de baixa polaridade na primeira dimensão (separação por
ponto de ebulição), com dimensões típicas de 25 m de comprimento, 0,25 mm de
diâmetro interno e 0,25 µm de espessura de filme, acoplada a uma coluna mais
polar e mais curta na segunda dimensão (separação por polaridade) (MÜHLEN et
al., 2007; RYAN & MARRIOT, 2003). A separação subseqüente na segunda
dimensão é tão rápida, entre 1-10 s, que é realizada sob condições essencialmente
isotérmicas, sendo que esta rápida separação resulta em picos com larguras de
base tipicamente de 100 a 600 ms (DALLÜGE et al., 2003). Sendo assim, colunas
curtas e estreitas são comumente usadas na segunda dimensão, com tamanhos
tipicamente de 0,5 a 1,5 m de comprimento, 0,1 a 0,25 mm de diâmetro interno e 0,1
µm de espessura de filme (DALLÜGE et al., 2003; GÓRECKI et al., 2006). Para
analitos com igual volatilidade somente a interação com a fase estacionária
específica governa a retenção na segunda dimensão. Em alguns sistemas, a
segunda coluna é mantida em um forno separado, permitindo uma programação de
temperatura mais flexível e independente, enquanto que outros sistemas GC×GC
usam somente um forno e, portanto, as condições de temperatura são idênticas para
ambas as colunas (DALLÜGE et al., 2003).
A GC×GC é uma técnica relativamente nova, capaz de separar os compostos
de interesse de outros e, mais importante, do background da matriz. Com a
introdução desta técnica, há mais de 15 anos atrás, tornou-se possível a separação
e a identificação de muitos compostos em amostras complexas, além de ocorrer
39
uma melhora na análise de amostras consideradas menos complexas
(ADAHCHOUR et al., 2006; DALLÜGE et al., 2003).
2.5.1.2 Sistema de modulação
O modulador é parte essencial de um sistema GC×GC, por esse motivo,
muito esforço tem sido dedicado para o desenvolvimento de um modulador eficiente
e robusto, com uma ampla variedade de aplicações. Independente do seu design,
um modulador deve desempenhar três funções principais: (1) acumular pequenas
frações do efluente da primeira coluna enquanto procede normalmente a separação
na primeira dimensão, (2) focalizar as frações acumuladas e (3) liberar as frações
acumuladas na forma de pulsos estreitos para a segunda dimensão (DALLÜGE et
al., 2003).
Os moduladores mais utilizados para executar as separações em GC×GC são
os moduladores térmicos (PHILLIPS & BEENS, 1999). Este tipo de modulador
garante a conservação de massa, utilizando gradiente de temperatura para acumular
e liberar pequenas frações do eluente entre a primeira e a segunda dimensão. Entre
os moduladores térmicos está o modulador por varredura térmica, o Sistema
Criogênico Longitudinalmente Modulado (LMCS, do inglês Longitudinally Modulated
Cryogenic System) e moduladores baseados em jatos criogênicos (RYAN &
MARRIOT, 2003; HARYNUK & GÓRECKI, 2003).
O primeiro modulador disponível comercialmente foi o modulador por
varredura térmica, caracterizado pelo uso de um capilar de filme espesso,
posicionado entre a primeira e a segunda coluna para reter e acumular o analito no
final da primeira coluna, empregando razão de fases como efeito de focalização. O
analito é liberado por meio do aquecimento do capilar, que é resultado do
movimento do aquecedor rotativo (DALLÜGE et al., 2003). Este aquecedor rotativo
passa ao longo do capilar de filme espesso (tubo modulador) a uma temperatura
aproximadamente 100 ºC acima da temperatura do forno. A fração acumulada é
então transferida para fora do tubo modulador quando as fendas do aquecedor
passam ao longo deste tubo, resultando na liberação da fração anteriormente
acumulada para dentro da segunda coluna (SHELLIE et al., 2002). Porém,
40
problemas relacionados à instalação e operação, devido à presença de várias partes
móveis limita o uso deste modulador (DALLÜGE et al., 2003).
Mais tarde, surgiu o primeiro sistema criogênico denominado Sistema
Criogênico Longitudinalmente Modulado (LMCS), o qual utiliza expansão de CO
2
líquido como armadilha criogênica para acumular e focalizar os analitos nos
primeiros centímetros da segunda coluna. Logo após um período de tempo pré-
fixado, a armadilha criogênica, a qual é movida por um pistão, é rapidamente
transferida para a posição de liberação. A zona contendo o analito focalizado é
agora exposta ao ar do forno do cromatógrafo e, conseqüentemente, o analito é
rapidamente re-volatilizado e re-injetado como uma banda muito estreita na segunda
coluna. Como vantagem este modulador apresenta uma ampla faixa de aplicação,
embora analitos voláteis não sejam suficientemente retidos.
Mais recentemente, diferentes versões de jatos criogênicos foram
introduzidas. Moduladores semelhantes ao Sistema Criogênico Longitudinalmente
Modulado, entretanto, sem a utilização de partes móveis e utilizando um jato mais
robusto foram propostos. A Figura 8A mostra um modulador criogênico. Este usa
CO
2
líquido ou gás N
2
frio para reter as frações provenientes da primeira coluna. O
CO
2
ou N
2
resfria um intervalo da coluna por alguns milisegundos, retornando, em
seguida, para a temperatura do forno, liberando assim, as substâncias para a
segunda coluna. Em B1 o modulator (jato da direita) retém parte do analito
proveniente da primeira coluna. Em B2, o jato da direita é desligado, então este
ponto rapidamente aquece e os analitos são liberados e lançados para a separação
na segunda coluna. Neste momento, o jato da esquerda é ligado para prevenir que
materiais provenientes da primeira coluna interfiram com a fração que já foi focada.
Em B3 o jato da direita é novamente ligado e o próximo ciclo de modulação é
iniciado (DALLÜGE et al., 2003).
41
Figura 8 – (A) Esquema de um modulador criogênico com duplo jato de CO
2
líquido ou N
2
gasoso frio, (B1-B3) Funcionamento de um modulador criogênico
(adaptado de DALLÜGE et al., 2003)
Os moduladores comumente usados em GC×GC são compostos por duplo
jato de CO
2
. No entanto, devido ao elevado consumo e custo do CO
2
líquido, e a
necessidade de efetuarem-se análises de rotina, é importante o desenvolvimento de
um modulador com custo de operação mais baixo. Portanto, visando esta redução
de custos, um modulador composto por duplo jato de CO
2
foi aprimorado e
modificado para um modulador que utilizasse ar comprimido. A desvantagem deste
modulador é a faixa de trabalho, pois o ar comprimido tem uma capacidade limitada
de resfriamento sobre a coluna (FRIGGI, 2008).
A Figura 10 demonstra um esquema deste modulador em A e sua
representação tridimensional em B.
42
Figura 9 – (A) Esquema do modulador com duplo jato de ar comprimido, (B)
representação tridimensional do modulador (FRIGGI, 2008)
2.5.1.3 Detectores
Como descrito anteriormente, a primeira coluna, em geral, é uma coluna com
filme espesso de fase estacionária apolar, a qual produz picos relativamente largos e
a segunda coluna usada no sistema GC×GC é uma coluna capilar polar. Esse tipo
de coluna na segunda dimensão ajuda na obtenção de uma velocidade rápida para
maximizar a capacidade do pico e minimizar o tempo total requerido para eluição. Na
segunda dimensão, como a eluição produz picos bastante estreitos, são necessários
detectores que tenham velocidade de aquisição de dados de pelo menos 100 Hz
(ADAHCHOUR et al., 2006; PHILLIPS & BEENS, 1999). Apesar de que muitas das
análises em GC×GC sempre foram feitas utilizando Detecção por Ionização em
(B)
(A)
43
Chama (FID, do inglês Flame Ionization Detection), todos os detectores usados em
Cromatografia Gasosa que possuem a característica citada anteriormente podem ser
usados para detecção (PHILLIPS & BEENS, 1999).
Atualmente, a micro Detecção por Captura de Elétrons (µECD, do inglês
micro-Electron Capture Detection) tem sido muito usada em GC×GC, pois além de
sua freqüência de aquisição de dados (5-50 Hz) ser compatível com o sistema
GC×GC, o seu volume interno de 30 a 150 µL, pode proporcionar um aumento do
sinal (DALLÜGE et al., 2003; KRISTENSSON et al., 2003; KORYTÁR et al, 2005).
Por outro lado, o Detector por Captura de Elétrons (ECD) possui um volume interno
aproximadamente dez vezes maior e a freqüencia de aquisição de dados geralmente
varia entre 50 e 200 Hz.
Os detectores acima mencionados permitem, sem dúvida, a quantificação dos
analitos e são bastante utilizados em GC×GC, porém, não fornecem informações
estruturais dos compostos em estudo. Dessa maneira, o uso de um espectrômetro
de massas é indispensável quando se pretende realizar a identificação dos diversos
compostos separados (DALLÜGE et al., 2003). O uso da Espectrometria de Massas
por Tempo de Vôo (TOF-MS, do inglês Time of Fly Mass Spectrometry), combinado
ao sistema GC×GC fornece uma das ferramentas de separação e identificação mais
poderosas disponíveis em química analítica atualmente. Entretanto, o custo elevado
resultante deste acoplamento, restringe o acesso deste instrumento para muitos
laboratórios (GÓRECKI et al., 2006).
2.5.1.4 Tipos de diagramas para visualização do sinal analítico
A interpretação dos resultados produzidos em GC×GC requer um tratamento
de dados mais sofisticado do que em 1D-GC em virtude do aumento da
complexidade de informação analítica. A transformação do sinal analítico em
imagem pode ser realizada por softwares específicos desenvolvidos por diferentes
grupos de pesquisa, ou mais recentemente, por outros softwares comercialmente
disponíveis (GÓRECKI et al., 2006).
A imagem gerada pelos softwares permite a visualização do sinal analítico de
diversas formas, como por exemplo, diagramas tridimensionais, diagramas de cores,
diagramas de contorno, diagramas de bolhas e diagrama de ápices. Em um
44
diagrama tridimensional, o eixo x representa o tempo de retenção na primeira
dimensão, o eixo y o tempo de retenção na segunda dimensão e o eixo z a
intensidade do sinal (MÜHLEN et al., 2007).
Na Figura 9 estão demonstradas diferentes representações para o espaço de
separação de uma análise realizada por GC×GC para uma amostra de Eucalyptus
dunnii. Na Figura 9A tem-se o diagrama de contorno, que é um gráfico bidimensional
que representa uma separação bidimensional abrangente, onde as intensidades de
sinal semelhantes são conectadas por uma linha, resultando em uma forma
geométrica, que representa uma vista superior de parte de um pico cromatográfico.
Neste e nos próximos diagramas, o eixo x representa o tempo de retenção na
primeira dimensão e o eixo y o tempo de retenção na segunda dimensão (MÜHLEN
et al., 2007).
O diagrama de cores (Figura 9B) é um gráfico bidimensional que representa
uma separação bidimensional abrangente, onde as cores representam a intensidade
do sinal de detecção. A escala de cores mostra que a intensidade do sinal
cromatográfico varia de mais intenso (cores próximas ao amarelo) ao menos intenso
(cores próximas ao verde). Cada mancha visualizada no diagrama de cores
representa a vista superior de um pico cromatográfico em três dimensões (MÜHLEN
et al., 2007).
Diagrama de bolhas (Figura 9C) é um gráfico bidimensional que representa
uma separação cromatográfica bidimensional abrangente, onde cada pico é
representado por um círculo. A área de cada círculo correlaciona-se à medida
quantitativa da soma das áreas dos picos modulados que geram o pico
tridimensional (SHELLIE et al., 2003).
O centro de cada círculo representa as
coordenadas de tempo em cada dimensão (MÜHLEN et al., 2007).
Por último, o diagrama de ápices (Figura 9D) é um gráfico bidimensional que
representa uma separação cromatográfica bidimensional abrangente, onde os
máximos de cada pico são representados por símbolos (SHELLIE et al., 2003).
45
Figura 10 - Representações para o espaço de separação de uma análise
realizada por GC×GC para uma amostra de óleo essencial de Eucalyptus
dunnii, onde: (A) diagrama de contorno, (B) diagrama de cores, (C) diagrama
de bolhas e (D) diagrama de ápices (adaptado de MÜHLEN et al., 2007)
2.5.2 Aplicação da GC×GC na análise de resíduos de pesticidas
Beens et at. (2001) compararam o desempenho de dois diferentes
moduladores utilizando uma mistura de 80 contaminantes, incluindo alguns
pesticidas freqüentemente detectados em águas superficiais. Obteve-se boa
separação desses analitos, onde todos os picos foram distribuídos praticamente em
todo o plano GC×GC, no entanto, não foi realizada análise em amostras reais.
Em 2002, Dallüge et al. determinaram 58 pesticidas em extratos de vegetais
usando GC×GC-TOFMS. Os autores demonstraram que o uso do sistema GC×GC
melhora bastante a separação dos analitos. Todos os analitos de interesse puderam
A)
B)
C)
D)
46
ser identificados usando GC×GC-TOFMS, o que não foi possível utilizando 1D-GC-
TOFMS.
Em 2003, Zrostlíková et al. utilizaram GC×GC-TOFMS para a determinação
de resíduos de 20 pesticidas em frutas. Os resultados de validação foram bastante
satisfatórios, sendo que a grande maioria dos analitos testados puderam ser
identificados com confiança em níveis abaixo de 0,01 mg kg
-1
.
Korytár et al. (2005) avaliaram a separação de 12 classes de compostos,
incluindo pesticidas organohalogenados, utilizando GC×GC. Neste estudo avaliou-se
cinco diferentes combinações de colunas cromatográficas para verificar a separação
entre os diferentes grupos estudados. Posteriormente a aplicabilidade da técnica foi
demonstrada em extrato de sedimento.
Em 2006, Khummueng et al. compararam os resultados obtidos utilizando
GC×GC-NPD, GC-NPD e GC×GC-µECD na separação e quantificação de uma
mistura de nove fungicidas em vegetais. Os resultados de linearidade, limite de
detecção, limite de quantificação, precisão e exatidão foram satisfatórios. Devido à
utilização de GC×GC foi possível observar a decomposição de um dos fungicidas
estudados. Além disso, os resultados mostraram que GC×GC-NPD gerou picos mais
estreitos que os gerados utilizando o método convencional GC-NPD, no entanto, a
soma das áreas dos picos obtidos por GC×GC-NPD foi similar às áreas obtidas por
GC-NPD para cada um dos pesticidas estudados.
Em 2008, Banerjee et al. otimizaram o método GC×GC–TOFMS para análise
de resíduos de pesticidas. A técnica otimizada resolveu problemas de co-eluição, os
quais eram observados em 1D-GC-MS e permitiu a separação cromatográfica de 51
pesticidas em 24 minutos. Os valores de LOD melhoraram de 2 a 12 vezes
utilizando GC×GC–TOFMS em comparação a GC–TOFMS, devido aos picos mais
altos e mais estreitos obtidos em GC×GC. O método foi testado para amostras de
uva, onde os resultados de recuperação ficaram dentro da faixa de 70 a 110% no
nível de fortificação de 10 ng g
-1
.
Cochran (2008) utilizou o sistema GC×GC–TOFMS para analisar pesticidas
em extrato de tabaco, percebendo que esta é uma excelente técnica para análise de
resíduos de pesticidas, pois resultou em valores de exatidão e sensibilidade
adequados. No entanto, neste trabalho, maior ênfase foi dada para análise
qualitativa da amostra.
47
Schurek et al. (2008) desenvolveram um novo método para detectar 36
pesticidas em amostras de chás baseado na hifenização HS-SPME–GC×GC-
TOFMS. A repetitividade das medidas, expressa em desvio padrão relativo (RSD) foi
menor que 24% e os valores de LOQ variaram de 1 a 28 µg kg
−1
.
O método foi em
seguida aplicado a amostras reais de chá.
2.6 Validação de métodos cromatográficos
Em geral, a validação de um método envolve a execução e a interpretação de
uma série de experimentos planejados a fim de avaliar as características do método.
Desta forma, todas as variáveis de um método devem ser consideradas, tais como:
procedimento de amostragem, preparação da amostra, separação cromatográfica,
detecção e avaliação dos dados (LANÇAS, 2004).
A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados (BRASIL, 2003). A validação é um processo contínuo que começa no
planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de todo seu
desenvolvimento (RIBANI et al., 2004).
Se um método existente for modificado para atender aos requisitos
específicos, ou um método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve
assegurar que as características de desempenho do método atendam aos requisitos
para as operações analíticas pretendidas. O processo de validação de um método
deve estar descrito em um procedimento, e os estudos para determinar os
parâmetros de desempenho devem ser realizados com equipamentos e
instrumentos dentro das especificações, funcionando corretamente e
adequadamente calibrados. Do mesmo modo, o operador que realiza os estudos
deve ser competente na área de estudo e precisa ter conhecimento suficiente sobre
o trabalho, sendo capaz de tomar as decisões apropriadas durante a realização do
estudo (INMETRO, 2003).
É essencial que os estudos de validação sejam representativos e conduzidos
de modo que a variação da faixa de concentração e os tipos de amostras sejam
adequados. Um método para a determinação de um composto majoritário requer um
48
critério de aceitação e uma abordagem diferente de um método desenvolvido para
análise de traços. A freqüência com que o método será utilizado (muitas vezes em
um dia, uma vez em um dia para um estudo rápido, uma vez em um mês, etc.)
também influencia o tipo de estudo de validação que é necessário. Portanto, os
parâmetros analíticos devem ser baseados na intenção do uso do método (RIBANI
et al., 2004)
.
Os parâmetros para validação de métodos vêm sendo definidos em diferentes
grupos de trabalho de organizações nacionais ou internacionais. Considerando as
inúmeras áreas que necessitam gerar dados confiáveis, é consenso que os
conceitos e definições dos parâmetros de validação não estão completa e
rigidamente estabelecidos, mas continuam a evoluir e aprimorarem-se, no sentido de
se efetuar a validação do método de maneira que atenda os objetivos e
necessidades para os quais o método é proposto
(LANÇAS, 2004). Neste trabalho,
os parâmetros utilizados foram avaliados seguindo as orientações estabelecidas
pelo INMETRO: curva analítica e linearidade, limite de detecção e limite de
quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão.
Atualmente, admite-se que as soluções analíticas dos pesticidas devem ser
preparadas em extrato da matriz ao invés de serem preparadas em solventes puros,
a menos que se prove a insignificância do efeito matriz. Desta forma, é de suma
importância avaliar este efeito, uma vez que este pode influenciar nos resultados das
análises (PRESTES, 2007).
2.6.1 Curva analítica e linearidade
A melhor forma de realizar quantificações em cromatografia é baseada numa
curva analítica, onde se determina as áreas cromatográficas, estabelecendo as
quantidades de analitos nas amostras analisadas. A curva analítica é, portanto, a
relação entre sinais – no caso as áreas – e quantidades do analito a ser quantificado
(AUGUSTO et al., 2003).
Dentro da faixa linear de trabalho há uma relação linear entre a resposta do
sinal (detector) e o valor (concentração) do composto em estudo (INMETRO, 2003).
A equação de regressão linear (Equação (1)) que relaciona as duas variáveis é:
49
y = ax + b (1)
onde:
y = resposta medida (área do pico);
x = concentração;
a = inclinação da curva analítica = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x = 0
Além dos coeficientes a e b, também é possível calcular o coeficiente de
correlação linear (r), o qual é freqüentemente usado para indicar o quanto pode ser
considerada adequada a reta como modelo matemático, fornecendo, portanto, uma
estimativa da qualidade da curva analítica obtida. A curva analítica deve ter alto
coeficiente de correlação, ou seja, r > 0,99 (ANVISA, 2003) ou r > 0,9 (INMETRO,
2003) ou coeficiente de determinação, r
2
> 0,999 (PIMENTEL & NETO, 1996), o que
evidencia um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão.
A linearidade de um método analítico pode ser observada pelo gráfico dos
resultados dos ensaios em função da concentração do analito, sendo definida como
sendo a capacidade deste método em gerar resultados diretamente proporcionais à
concentração do analito, em uma determinada faixa de concentração
(INMETRO,
2003). Na prática, a linearidade é determinada através das curvas analíticas.
Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, 5
concentrações diferentes (INMETRO, 2003; BRASIL, 2003).
2.6.2 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)
Quando são realizadas medidas em amostras com baixas concentrações do
analito, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o menor valor
de concentração do analito que pode ser detectado pelo método (INMETRO, 2003).
O limite de detecção (LOD, do inglês Limit of Detection) é a menor
concentração do analito presente em uma amostra que pode ser detectada, porém
não necessariamente, quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas.
O limite de quantificação (LOQ, do inglês Limit of Quantification) é a menor
quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e
exatidão aceitáveis, nas condições experimentais estabelecidas. Estes limites são
50
estabelecidos por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e
decrescentes do analito e são geralmente expressos em unidades de concentração
(BRASIL, 2003).
2.6.3 Precisão
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série
de medidas de uma mesma amostra (BRASIL, 2003). As duas formas mais comuns
de expressá-la são por meio da repetitividade e precisão intermediária, sendo
usualmente expressa pelo desvio padrão (s) ou desvio padrão relativo (RSD, do
inglês Relative Standard Desviation). A precisão é dependente da concentração do
analito, devendo, portanto, ser determinada para diferentes concentrações
(INMETRO, 2003).
A repetitividade é representada pelo grau de concordância dos resultados de
medições sucessivas de uma mesma amostra, efetuadas sob as mesmas condições
de medição, chamadas de condições de repetitividade, como por exemplo: mesmo
procedimento de medição, mesmo observador, mesmo instrumento usado sob
mesmas condições, mesmo local e repetições em curto espaço de tempo
(INMETRO, 2003).
A precisão intermediária refere-se à precisão avaliada sobre uma mesma
amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo
laboratório ou em laboratórios diferentes, definindo exatamente quais condições a
variar, tais como: diferentes analistas, diferentes equipamentos, diferentes tempos.
Esta medida de precisão é reconhecida como a mais representativa da variabilidade
dos resultados em um laboratório e, como tal, mais aconselhável para ser usada
(INMETRO, 2003). Recomenda-se, para o cálculo da precisão intermediária, um
mínimo de dois dias diferentes com analistas diferentes (BRASIL, 2003).
Em métodos de análise de traços são aceitos RSD de até 20%, dependendo
da complexidade da amostra (GARP, 1999).
51
2.6.4 Exatidão
Exatidão do método é definida como sendo a concordância entre o resultado
de um ensaio e o valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro. A
exatidão, quando aplicada a uma série de resultados de ensaio, implica numa
combinação de componentes de erros aleatórios e sistemáticos, sendo este último,
um dos critérios mais importantes para o julgamento do desempenho de um método
analítico (INMETRO, 2003). A exatidão é sempre considerada dentro de certos
limites, a um dado nível de confiança, ou seja, aparece sempre associada a valores
de precisão. Estes limites podem ser estreitos em níveis de concentração elevados e
mais amplos em níveis de traços (RIBANI et al., 2004).
Os processos normalmente utilizados para avaliar a exatidão de um método
são, entre outros: uso de materiais de referência, participação em comparações
interlaboratoriais e realização de ensaios de recuperação (INMETRO, 2003). Na
análise de compostos orgânicos, a exatidão é avaliada por processos de
recuperação, uma vez que, normalmente, não existem materiais de referência
certificados.
A recuperação dos analitos pode ser estimada pela análise de amostras
fortificadas com quantidades conhecidas deste. As amostras devem ser fortificadas
com os analitos em pelo menos três diferentes concentrações. A limitação desse
procedimento é que o analito adicionado não está necessariamente na mesma
forma que se apresenta na amostra (INMETRO, 2003).
A recuperação geralmente é dependente da concentração, por isso deve ser
avaliada na faixa de concentração esperada para as amostras. Os intervalos
aceitáveis de recuperação para análises de resíduos, geralmente estão entre 70 e
120%, com precisão de até + 20% (GARP, 1999), inclusive para análise de resíduos
de pesticidas (HUBER, 1998).
2.6.5 Efeito matriz
O efeito matriz é observado quando uma diferença de resposta é obtida entre
padrões preparados no solvente e padrões preparados no extrato da matriz. Uma
das maneiras de minimizar e/ou eliminar este efeito é reduzir a quantidade de
52
componentes da matriz que coeluem com os analitos no detector, para isto, métodos
de extração mais seletivos e etapas mais eficientes de clean-up devem ser
desenvolvidos (PICÓ et al., 2004). O efeito matriz pode facilmente tornar-se maior,
em baixas concentrações do analito, pois há um decréscimo na razão de
concentração do analito/concentração da matriz.
O efeito matriz sempre sofre variações ao longo do tempo e também varia
dependendo da condição do instrumento utilizado, devendo, por isso, ser
constantemente avaliado, tanto na etapa de desenvolvimento do método quanto na
aplicação deste método nas análises de rotina (PRESTES, 2007).
Assim, verifica-se se a matriz exerce efeito positivo (aumento de sinal) ou
negativo (decréscimo de sinal) sobre o resultado da análise. Quando o resultado for
acima de 10% considera-se que o efeito matriz começa a exercer influência nas
análises (ZROSTLIKOVA & HAJSLOVÁ, 2003).
53
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Este trabalho foi desenvolvido nos laboratórios do Analytical Chemistry &
Applied Sciences (ACAS) da Free University, Amsterdã, Holanda, com apoio do
laboratório Food and Consumer Product Safety Authority (VWA), Amsterdã, Holanda.
O desenvolvimento experimental consistiu na comparação do desempenho de
dois diferentes métodos de extração, modificações dos métodos QuEChERS e mini-
Luke, para extração de pesticidas piretróides fortificados em amostras de tomate,
sendo em seguida, submetidas à análise por GC×GC-µECD. Estes procedimentos
de extração foram comparados, principalmente, em termos de LOD, LOQ,
linearidade, repetitividade, precisão intermediária, efeito matriz e resultados de
recuperação (exatidão).
A análise cromatográfica foi realizada por cromatografia gasosa bidimensional
abrangente, onde foi avaliado um modulador utilizando ar comprimido, o qual foi
aprimorado no laboratório da Free University, Amsterdã, Holanda.
3.1 Reagentes e solventes
Acetato de etila, grau pesticida (Lab-scan Analytical Science, Irlanda);
Diclorometano, éter de petróleo, acetona, acetonitrila, ácido acético, acetato
de sódio anidro, sulfato de sódio anidro, sulfato de magnésio anidro, todos
grau pesticida (Merck, Alemanha);
Sorvente PSA (Varian, USA)
Padrões sólidos dos pesticidas (fornecedores conforme Tabela 5).
Branco do extrato (tomate), previamente analisado no laboratório Food and
Consumer Product Safety Authotity, confirmando a ausência dos pesticidas
em estudo.
3.2 Materiais
Pipetador Hand Step
(Brand, Alemanha);
Dispensador Optifix, capacidade 50 mL (GS, Alemanha);
54
Seringas de volumes de 10, 25, 50, 100, 250, 500 e 1000 µL (Hamilton,
Suíça);
Tubos de politetrafluoretileno (PTFE) com tampa rosqueável, capacidade de
250 mL fabricado sob medida (Holanda);
Tubos de polipropileno, com tampa rosqueável, capacidade de 15 e 50 mL
(BD Labware, França);
Vidrarias comuns de laboratório.
3.3 Pesticidas selecionados
Os pesticidas piretróides selecionados para este estudo estão listados na
Tabela 5, com seu fornecedor, grau de pureza, fórmula molecular e classificação
toxicológica. As estruturas químicas destes compostos estão demonstradas no item
2.2.3.
Tabela 5 - Pesticidas analisados por GC×GC-µECD
Pesticida
Fornecedores
Grau de
pureza
Fórmula
molecular
Classificação
Toxicológica*
Bifentrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
98,0 C
23
H
22
ClF
3
O
2
II
Ciflutrina Riedel-de Haën (Alemanha) 98,0 C
22
H
18
Cl
2
FNO
3
II
Esfenvalerato Riedel-de Haën (Alemanha) 99,9 C
25
H
22
ClNO
3
II
Fenpropatrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
99,0 C
22
H
23
NO
3
II
Fenvalerato Riedel-de Haën (Alemanha) 99,8 C
25
H
22
ClNO
3
III
Permetrina cis Zeneca (Estados Unidos) 99,4 C
21
H
20
Cl
2
O
3
III
Permetrina trans Zeneca (Estados Unidos) 96,4 C
21
H
20
Cl
2
O
3
III
* conforme descrita no item 2.1
55
3.4 Instrumentação
3.4.1 Instrumentação geral
Sistema de purificação de água Milli-Q
®
- resistividade 18,2 MΩ cm
(MilliPore
®
, EUA);
Balança analítica com 4 casas decimais (Sartorius, Alemanha);
Balança analítica com 2 casas decimais (Sartorius, Alemanha);
Lavadora automática de vidrarias G 7883 CD (Miele, EUA);
Banho de ultra-som M3510 DHT (Branson, México);
Banho de água MP Basis (Julabo, Alemanha);
Homogeneizador Ultraturrax PT 6000 (Polytron, Suíça);
Centrífuga Falcon 6/300, refrigerada (MSE, Inglaterra).
Centrífuga Harrier 18/80, refrigerada (MSE, Inglaterra);
Evaporador RapidVap (Labconco, EUA);
3.4.2 Sistema cromatográfico GC×GC-µECD
Cromatógrafo a gás HP 6890 GC (Agilent Tecnologies, Palo Alto, CA, USA)
composto por:
Amostrador automático série HP 7673;
Injetor split/splitless, com insersor de vidro silanizado, d.i. 4 mm;
Modulador com duplo jato de ar comprimido (desenvolvido no
laboratório da Free University, Amsterdã, Holanda);
1ª coluna capilar VF-5 (5% fenil 95% metilpolisiloxano), de sílica
fundida, 30 m de comprimento, 0,25 mm de d.i. e 0,25 µm de
espessura de filme (Varian, Holanda);
2ª coluna capilar VB-50 (50% metilpolisiloxano e 50% fenilpolisiloxano)
de sílica fundida, 0,5 m de comprimento, 0,1 mm de d.i. e 0,1 µm de
espessura de filme (Valco Bond, Holanda);
Micro Detector por Captura de Elétrons (µECD) com volume de célula
de 150
µL (Agilent Tecnologies);
56
Sistema de aquisição de dados HP Chemstation A.07.01 (Agilent) para
integração dos picos; 2D Converter Program beta version 1.0 (Gerard
Sharp) para converter os dados para 2 dimensões e software
Transform version 3.4 (Fortner software) para interpolar a imagem dos
dados.
3.5 Gases utilizados
Gás de arraste: Hélio 99,9999% de pureza (Praxair, Holanda);
Gás make up do detector µECD: Nitrogênio 99,999% de pureza (Praxair,
Holanda);
Ar comprimido, obtido com compressor industrial.
3.6 Otimização do sistema GC×GC-µECD para determinação dos resíduos de
pesticidas
Em procedimentos analíticos onde se empregam técnicas cromatográficas, tal
como a Cromatografia a Gás, deve-se seguir alguns parâmetros importantes a fim
de se obter maior eficiência, sensibilidade e seletividade na separação dos
compostos.
3.6.1 Coluna cromatográfica e programação de temperatura do forno da coluna
Para a separação por GC×GC dos pesticidas piretróides bifentrina, ciflutrina,
esfenvalerato, fenpropatrina, fenvalerato, permetrina cis e permetrina trans foi
empregada na primeira dimensão uma coluna capilar VF-5 e na segunda dimensão
uma coluna capilar VB-50, as quais foram submetidas a três diferentes rampas de
aquecimento do forno da coluna para se escolher a mais adequada. Estas
programações estão demonstradas na Tabela 6. Para estes testes foi utilizada uma
57
solução analítica contendo 1,0 mg L
-1
de cada pesticida e vazão do gás de arraste
constante em 1 mL min
-1
.
Tabela 6 - Programas (P) de temperatura do forno da coluna utilizados na
escolha dos parâmetros da separação cromatográfica
Programa Etapa
Temperatura
(
o
C)
Rampa
(
o
C min
-1
)
Tempo total
(min)
Inicial
100
P1*
Final 300
3
49,0
Inicial
50
Intermediária 200 67,0
P2*
Final 300
10
3
Inicial
80
P3*
Intermediária 200 25,0
Final 300
20
5
*vazão constante
3.6.2 Estudo da melhor vazão do gás de arraste
Para selecionar a melhor vazão do gás de arraste a ser empregada na
separação cromatográfica dos compostos em estudo, injetou-se 1 µL da solução
contendo 1,0 mg L
-1
da mistura dos pesticidas em estudo. Utilizando-se o programa
de temperatura que proporcionou melhores resultados (P3*), foram testadas três
diferentes vazões: 0,8; 1,0 e 1,2 mL min
-1
.
3.6.3 Sistema de injeção e de detecção
Foi utilizada a temperatura de 280 °C para o injetor e 300 °C para o detector
µECD. Para o detector, utilizou-se N
2
como gás make-up, testando três diferentes
vazões: 60; 100 e 120 mL min
-1
.
A injeção foi efetuada com um injetor automático, utilizando um volume de
injeção de 1 µL no modo splitless.
58
3.7 Preparo das soluções analíticas
Para o preparo da solução analítica estoque (1000 mg L
-1
), os padrões sólidos
foram pesados individualmente e transferidos para balão volumétrico com
capacidade de 20 mL, sendo em seguida, dissolvidos em tolueno, e
homogeneizados por 5 minutos em banho de ultra-som.
Em seguida, preparou-se 10 mL de uma mistura de concentração 100 mg L
-1
contendo todos os pesticidas a serem estudados. Essa mistura foi preparada em
acetato de etila e armazenada em frasco âmbar (tampa contendo batoque de PTFE),
com capacidade de 20 mL.
A partir da solução de 100 mg L
-1
preparou-se uma solução de concentração
10 mg L
-1
em acetato de etila, que também foi armazenada em frasco âmbar (tampa
contendo batoque de PTFE), com capacidade de 20 mL.
Todas as soluções analíticas foram preparadas tanto em solvente orgânico
(acetato de etila) como no extrato da matriz (tomate). Dessa maneira, pôde-se
avaliar o efeito da matriz durante as análises, comparando os resultados obtidos
para ambos os métodos.
As soluções foram armazenadas em freezer a -20 °C, sendo que antes de
serem utilizadas foram retiradas do freezer e deixadas atingir a temperatura
ambiente.
3.7.1 Método QuEChERS modificado
A mistura intermediária de 10 mg L
-1
foi utilizada para preparar as soluções
analíticas para o estudo de linearidade e confecção das curvas analíticas, através de
sua diluição, nas concentrações de 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 e 1,0 mg L
-1
para o
estudo do método QuEChERS modificado. A estabilidade destas soluções é de
cerca de 3 meses (AVRAMIDES, 2005).
A mistura de concentração 10 mg L
-1
também foi utilizada para os ensaios de
fortificação. No caso da modificação do método QuEChERS utilizou-se 20, 50 e 200
µL desta solução para obter os níveis de fortificação de 20, 50 e 200 µg kg
-1
,
respectivamente.
59
3.7.2 Método mini-Luke modificado
Para o estudo do método mini-Luke, partiu-se de uma mistura de
concentração 10 mg L
-1
,
preparou-se as soluções analíticas para o estudo de
linearidade e confeccionaram-se as curvas analíticas nas concentrações 0,02; 0,05;
0,1; 0,2; 0,5 e 1,0 mg L
-1
, com estabilidade de cerca de 3 meses (AVRAMIDES,
2005). Para os ensaios de fortificação, utilizou-se 50, 200 e 500 µL, correspondentes
aos níveis de fortificação de 50, 200 e 500 µg kg
-1
, respectivamente.
3.8 Ensaios de fortificação e extração
Tendo em vista que este trabalho consistiu na comparação de dois diferentes
métodos de extração (métodos QuEChERS e mini-Luke modificados) para
determinação de pesticidas piretróides fortificados em tomate utilizando GC×GC-
µECD, algumas etapas do procedimento foram alteradas para que esta comparação
fosse possível.
Um aspecto importante foi a introdução de uma etapa de clean-up utilizando o
sorvente PSA (amina primária secundária) em ambos os métodos, salientando que a
mesma proporção de PSA foi adicionada tanto no método QuEChERS quanto no
mini-Luke. Outro aspecto importante diz respeito ao solvente final que compõe a
matriz, sendo que, em ambos os métodos, o solvente final foi acetato de etila, além
de manter para ambos os métodos a mesma relação entre a quantidade de amostra
e o volume de extrato final, facilitando, dessa maneira, a comparação entre os
resultados.
O tomate utilizado para este estudo foi previamente analisado no laboratório
Food and Consumer Product Safety Authority (VWA), confirmando a ausência dos
pesticidas, sendo então utilizado como tomate “branco” para avaliação dos métodos
estudados.
Os níveis de fortificação de ambos os métodos foram escolhidos baseados no
limite de quantificação destes, onde o primeiro nível corresponde a 1 LOQ e o último
corresponde a 10 LOQ do respectivo método de extração, o nível restante
corresponde a um valor intermediário a este valores.
60
3.8.1 Método QuEChERS modificado
O tomate foi previamente homogeneizado e em seguida, pesou-se porções de
10,0 ± 0,1 g diretamente em tubos de polipropileno (capacidade de 50 mL) com
tampa rosqueável. Logo após, efetuou-se a fortificação aos níveis de 20, 50 e 200
µg kg
-1
, utilizando-se seringas Hamilton
®
, adicionando-se, respectivamente, 20, 50 e
200 µL de uma solução analítica 10 mg L
-1
, contendo os pesticidas em estudo.
Adicionou-se, através de pipetador Hand Step
, 10 mL de acetonitrila
contendo 1% (v/v) de ácido acético, em cada tubo, e após fechá-los efetuou-se
agitação manual e vigorosa por cerca de 1 minuto. Em seguida, acrescentou-se
2,0 g de sulfato de magnésio anidro e 2,0 g de acetato de sódio anidro, cuidando
para que estes sólidos não ficassem nas bordas superiores dos tubos, prejudicando
o contato com o líquido. Agitou-se novamente manual e vigorosamente durante 1
minuto para garantir a completa interação entre o extrato líquido e os reagentes
sólidos. Em seguida, os tubos tampados foram levados para centrifugação a 4000
rpm, durante 4 minutos. Posteriormente, separou-se a parte sólida e líquida e
acrescentou-se mais 2,0 g de sulfato de magnésio anidro, repetindo-se a agitação e
centrifugação descritas anteriormente. Em seguida, transferiu-se 4 mL do extrato
líquido para outro tubo de polipropileno com capacidade de 15 mL, já contendo uma
mistura de 600 mg de sulfato de magnésio anidro e 500 mg de PSA, sendo
novamente agitados vigorosa e manualmente por cerca de 45 segundos, e também
centrifugados como citado anteriormente. A última etapa consistiu em retirar 2 mL
desse extrato e transferir para frasco de vidro com capacidade de 10 mL e evaporar
até total secura do solvente acetonitrila utilizando evaporador RapidVap, sendo
então reconstituído em 2 mL de acetato de etila e posteriormente analisado por
GC×GC-µECD.
Na Figura 11 tem-se a visualização de alguns equipamentos e materiais
utilizados para a realização do processo de extração pelo método QuEChERS, o
qual está esquematizado na Figura 12.
61
(B)
Figura 11 - Alguns equipamentos e materiais utilizados no método QuEChERS:
(A) evaporador RapidVap, (B) centrífuga e (C) extrato da matriz em tubos de
polipropileno com capacidade de 50 mL
(C)
(A)
62
Figura 12 – Esquema do método de extração QuEChERS modificado para
análise de resíduos de pesticidas em tomate
EXTRAÇÃO
CLEAN
-
UP
agitação manual – 45 s
centrifugação 4 min –
4000 rpm
agitação manual – 1 min
agitação manual
–
1 min
centrifugação 4 min – 4000 rpm
agitação manual
–
1 min
centrifugação 4 min –
4000 rpm
Evaporação completa
Reconstituição em 2 mL de
acetato
de etila
Análise em GC×GC-µECD
10 g
de amostra ou
"
bran
co”
(20, 50 e 200
µ
g kg
-
1
)
Fortificação em 3 níveis
10 mL de acetonitrila com
1% (v/v) de ácido acético
2 g de sulfato de magné
sio
2 g de acetato de sódio
Transferência da parte líquida para
frasco com 2 g de sulfato de magnésio
4 mL de extrato
500 mg de PSA
600 mg de sulfato de magnésio
2 mL de extrato
63
3.8.2 Método mini-Luke modificado
No método mini-Luke modificado, o tomate foi previamente homogeneizado e
em seguida, pesou-se porções de 10,0 ± 0,1 g de tomate diretamente dentro dos
tubos de PTFE com tampa rosqueável. A fortificação foi realizada utilizando-se
seringas de injeção Hamilton
®
. Para fortificação aos níveis de 50, 200 e 500 µg kg
-1
adicionou-se, respectivamente, 50, 200 e 500 µL, de uma solução analítica na
concentração de 10 µg mL
-1
, contendo os pesticidas a serem analisados.
Após a fortificação, as amostras foram levadas para extração, adicionando-se
inicialmente 30 mL de acetona, sendo a mistura levada ao homogeneizador
Ultraturrax por cerca de 30 segundos, a 15.000 rpm. Em seguida, adicionou-se 60
mL da mistura dos solventes éter de petróleo e diclorometano (1:1 v/v), além de 10,0
± 0,1 g de sulfato de sódio anidro, sendo novamente levado ao homogeneizador nas
condições descritas anteriormente. Os tubos foram então levados para centrifugação
a 3600 rpm, durante 3 minutos e, em seguida, o líquido foi transferido para
erlenmeyer com tampa. Uma alíquota de 12 mL foi transferida para tubo de
polipropileno com tampa rosqueável contendo 1,5 g de PSA, realizando agitação
manual por 1 minuto. Os tubos foram novamente submetidos à etapa de
centrifugação.
Um volume de 9 mL dos extratos obtidos foi transferido para tubos graduados
de 10 mL, e colocados em banho de água já aquecida a 45 ºC, sendo que em
seguida, esta temperatura foi aumentada até atingir 62 ºC. Os tubos foram retirados
do banho alguns minutos antes de completa secura e deixados em temperatura
ambiente até secura total. O extrato foi reconstituído com 1 mL de acetato de etila.
Na Figura 13 estão demonstrados alguns equipamentos e materiais utilizados
para a realização do processo de extração pelo método mini-Luke. A descrição
desse procedimento de forma esquemática é demonstrada no fluxograma da Figura
14.
64
Figura 13 - Alguns equipamentos e materiais utilizados no método mini-Luke:
(A) banho de água para evaporação do solvente, (B) centrífuga e (C) extrato da
matriz em erlenmeyer com tampa
(B)
(A)
(
C
)
65
Figura 14 - Esquema do método de extração mini-Luke modificado para análise
de resíduos de pesticidas em tomate
10 g de tomate
30 mL de acetona
10 g de sulfato de sódio
30 mL de éter
de petróleo
30 mL de diclorometano
Transferência do extrato
para erlenmeyer
Evaporação de 9
mL do extrato
(45 – 62 °C)
Reconstituição em 1 mL de acetato de etila
Análise em GC×GC-µECD
Secura total à
temperatura
ambiente
Ultraturrax
30 s
-
15
000 rpm
1,5 g de PSA em 12 mL de extrato
centrif
ugação
3 min
–
3600 rpm
EXTRAÇÃO
Ultraturrax 30 s
-
15
000 rpm
CLEAN
-
UP
10 g de amostra ou “branco”
Fortificação em 3 níve
is
(50, 200 e 500 µg kg
-1
)
30 mL de acetona
10 g de sulfato de sódio
30 mL de éter de petróleo
30 mL de diclorometano
Transferência do extrato para
erlenmeyer
1,5 g de PSA em 12 mL de extrato
Evaporação de 9 mL de
extrato
(45 – 62 °C)
Reconstituição em 1 mL de acetato de etila
Análise em GC×GC-µECD
centrif
ugação
3 min
–
3600 rpm
agitação manual
–
1 min
66
3.9 Análise dos solventes e reagentes
A análise dos solventes e reagentes tem a finalidade de verificar a pureza dos
solventes e reagentes utilizados com relação à contaminação com os resíduos dos
pesticidas estudados. Este procedimento consiste em realizar todo o procedimento
normal de extração das amostras, porém sem o extrato da matriz (tomate),
conseqüentemente, sem a fortificação da mesma.
3.9.1 Método QuEChERS modificado
Adicionou-se, através de pipetador Hand Step
, 10 mL de acetonitrila
contendo 1% (v/v) de ácido acético em cada tubo de polipropileno com tampa
rosqueável (capacidade de 50 mL), e após fechá-los efetuou-se agitação manual e
vigorosa por cerca de 1 minuto.
Em seguida, acrescentou-se 2,0 g de sulfato de magnésio anidro e 2,0 g de
acetato de sódio anidro. Repetiu-se a agitação manual por cerca de 1 minuto,
assegurando-se da completa interação entre o solvente e os reagentes sólidos. Os
tubos tampados foram levados para centrifugação a 4000 rpm, por 4 minutos. Em
seguida, separou-se a parte líquida e acrescentou-se mais 2,0 g de sulfato de
magnésio anidro, repetindo-se a agitação e centrifugação descritas anteriormente.
Posteriormente, realizou-se a etapa de clean-up do extrato, onde transferiu-se
4 mL do extrato líquido para outro tubo de polipropileno (capacidade de 15 mL), já
contendo 600 mg de sulfato de magnésio anidro e 500 mg de PSA, sendo
novamente agitados vigorosa e manualmente por cerca de 45 segundos e
centrifugados como descrito anteriormente.
A última etapa consistiu em retirar 2 mL de extrato e transferir para frasco de
vidro, e então evaporar até total secura do solvente utilizando evaporador RapidVap.
Em seguida foi reconstituído em 2 mL de acetato de etila, sendo posteriormente
analisado por GC×GC-µECD. Esta mistura é chamada de “branco” do solvente, por
não conter o extrato da matriz e os pesticidas em estudo.
67
3.9.2 Método mini-Luke modificado
Adicionou-se através de dispensador 30 mL de acetona dentro de tubo de
PTFE com tampa rosqueável já contendo 10 g de sulfato de sódio anidro, sendo, em
seguida, levado ao homogeneizador Ultraturrax por cerca de 30 segundos, a 15.000
rpm. Posteriormente, adicionou-se 60 mL da mistura dos solventes éter de petróleo e
diclorometano (1:1 v/v), sendo novamente levado ao homogeneizador nas mesmas
condições anteriores.
O tubo foi levado para centrifugação a 3600 rpm, durante 3 minutos. O líquido
foi transferido para erlenmeyer com tampa e, posteriormente, transferiu-se 12 mL
desse conteúdo para tubo de polipropileno com tampa rosqueável contendo 1,5 g de
PSA, realizando-se agitação manual vigorosa por cerca de 1 minuto. Os tubos foram
novamente submetidos à etapa de centrifugação.
Uma alíquota de 9 mL foi transferida para tubo graduado com capacidade de
10 mL e colocado em banho de água aquecida. O solvente é evaporado até
completa secura e reconstituído em 1 mL de acetato de etila, sendo posteriormente
analisado por GC×GC-µECD. Esta mistura é chamada de “branco” do solvente.
3.10 Validação dos métodos de extração QuEChERS e mini-Luke modificados
para análise de resíduos de pesticidas piretróides em tomate
Definidas as melhores condições para a separação dos pesticidas em
GC×GC-µECD e melhores condições com relação aos métodos de extração, foi
realizada a validação dos métodos. A validação deve garantir, através de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados (BRASIL, 2003). A validação é um
processo contínuo que começa no planejamento da estratégia analítica e continua
ao longo de todo seu desenvolvimento (RIBANI et al., 2004).
Esse trabalho foi validado seguindo principalmente os procedimentos
recomendados no Brasil para validação de métodos (INMETRO, 2003; BRASIL,
2003) e envolvem os parâmetros descritos a seguir.
68
3.10.1 Determinação da linearidade das curvas analíticas
Avaliou-se a linearidade das curvas analíticas tanto em solvente, quanto no
extrato da matriz (tomate), obtida para os dois métodos, sendo que a curva analítica
para os pesticidas selecionados foi construída na faixa de concentração de 0,01 a
1,0 mg L
-1
no caso do método QuEChERS modificado, e na faixa de concentração
de 0,02 a 1,0 mg L
-1
no caso do método mini-Luke modificado. Todas as soluções
foram preparadas em acetato de etila e também no extrato da matriz.
A seqüência de injeção consistiu primeiramente na injeção do branco dos
reagentes e em seguida injetou-se 6 vezes a seqüência das soluções analíticas
(cada seqüência foi injetada da menor concentração para a maior e entre cada
seqüência injetou-se o branco dos reagentes). O mesmo foi feito no caso da injeção
da curva no extrato da matriz, ou seja, inicialmente injetou-se o branco do extrato e,
em seguida, 6 vezes a seqüência das soluções analíticas da menor para a maior
concentração, e entre cada seqüência injetou-se o branco do extrato. O gráfico da
área dos respectivos picos x concentração, a equação da reta e o coeficiente de
determinação (r
2
) foram obtidos com auxílio do programa Microsoft Office
®
Excel
2003.
3.10.2 Limite de detecção e limite de quantificação
Neste trabalho, o LOD corresponde à concentração que produz uma relação
sinal-ruído igual a 3 e o LOQ uma relação igual a 10 (Figura 15). Para isso, mediu-se
a altura do ruído próximo ao tempo de retenção dos compostos e determinou-se a
concentração que corresponde a 3 e 10 vezes essa altura.
No caso do método QuEChERS modificado utilizou-se uma solução analítica
de concentração 0,02 mg L
-1
e no método mini-Luke modificado, uma solução
padrão de concentração 0,05 mg L
-1
, que representam concentrações onde a
integração dos picos de todos os pesticidas pôde ser realizada com segurança. Este
procedimento foi realizado com padrões preparados tanto no solvente acetato de
etila, quanto no extrato da matriz.
69
Figura 15. Diagrama demonstrando a forma de estabelecimento dos valores de
LOD e LOQ
3.10.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)
O valor numérico usado para avaliar a precisão em termos de desvio padrão
relativo (RSD), pode ser calculado através da Equação (2) (RIBANI et al., 2004;
GARP, 1999).
100
x
s
RSD
m
×=
onde:
s = estimativa de desvio padrão absoluto = {∑(x
i
– x
m
)
2
/ N- 1}
1/2
x
i
= valores individuais
x
m
= média das medidas em replicatas
N = número de medidas.
A precisão do instrumento foi obtida através das seis injeções de cada
concentração das soluções analíticas no sistema GC×GC-µECD, efetuadas no
estudo da linearidade.
(2)
70
A precisão do método, em termos de repetitividade (RSD
r
), foi efetuada
procedendo-se a extração e análise das amostras fortificadas. Cada nível de
fortificação foi extraído seis vezes e cada extrato injetado uma vez.
Para avaliar a precisão intermediária (RSD
pi
) do método por GC×GC-µECD,
utilizaram-se 2 dias e 2 operadores diferentes na execução da etapa de extração e
análise.
3.10.4 Ensaios de fortificação para avaliação da recuperação (exatidão)
Os ensaios de fortificação e de recuperação têm por objetivo a avaliação da
exatidão e precisão do método como um todo. Neste trabalho, a exatidão foi
calculada pela Equação (3) e é expressa em percentagem (INMETRO, 2003):
100
C
C
(%) R
3
21
×
−
=
C
onde:
C
1
= concentração determinada na amostra fortificada
C
2
= concentração determinada na amostra não fortificada
C
3
= concentração teórica na amostra fortificada
O procedimento de fortificação foi realizado 6 vezes (n = 6) para cada nível de
fortificação (3 níveis). Também realizou-se 6 vezes a análise da amostra “branco”
para verificação da real ausência desses compostos na matriz. Este extrato “branco”
também foi utilizado para o preparo das soluções analíticas, quando em extrato da
matriz.
3.10.5 Avaliação do efeito matriz
Para a avaliação da existência do efeito matriz nos extratos nas análises por
GC×GC, realizou-se a comparação entre as áreas obtidas das soluções analíticas
em solvente (acetato de etila) e daquelas obtidas com soluções analíticas
(3)
71
preparadas no extrato da matriz (tomate). O cálculo foi efetuado através da Equação
(4).
100(%)
2
21
x
X
XX
izEfeitoMatr
−
=
onde:
X
1
= Média das áreas da solução analítica de cada pesticida, preparada em extrato
da matriz (tomate), numa dada concentração;
X
2
= Média das áreas da solução analítica de cada pesticida, preparada em solvente,
numa dada concentração.
(4)
72
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A análise por GC×GC-µECD dos pesticidas piretróides bifentrina, ciflutrina,
esfenvalerato, fenpropatrina, fenvalerato, permetrina cis e permetrina trans em
tomate fortificado, empregando os métodos QuEChERS e mini-Luke modificados,
gerou os resultados descritos a seguir.
4.1 Condições cromatográficas otimizadas para análise dos resíduos de
pesticidas por GC×GC-µECD
4.1.1 Coluna cromatográfica e programação de temperatura
Os resultados a seguir foram obtidos empregando como primeira coluna uma
VF-5 (30 m de comprimento, 0,25 mm de d.i. e 0,25 µm de espessura de filme) e
como segunda coluna uma VB-50 (0,5 m de comprimento, 0,1 mm de d.i. e 0,1 µm
de espessura de filme).
O programa de temperatura do forno da coluna selecionado foi o P3*
(conforme Tabela 6), o qual proporcionou melhores resultados na separação dos
compostos em estudo, totalizando em 25 minutos o tempo da análise
cromatográfica.
4.1.2 Escolha da melhor vazão do gás de arraste
O estudo da melhor vazão do gás de arraste foi realizado utilizando-se a
programação de temperatura P3*, conforme item 3.6.2. A vazão que proporcionou
melhores resultados para os pesticidas avaliados foi a de 1,0 mL min
-1
, que foi
verificado pela melhor resolução dos picos cromatográficos. Esta vazão foi mantida
constante durante toda a corrida. Percebeu-se que, utilizando a vazão de 1,2 mL
min
-1
, a resolução não foi adequada para os picos relacionados a permetrina cis e
trans, sendo este o motivo para que esta vazão não fosse a escolhida. Eficiência
73
semelhante foi verificada utilizando tanto a vazão 0,8 quanto a vazão 1,0 mL min
-1
,
sendo assim optou-se pela vazão 1,0 mL min
-1
por resultar em uma análise mais
rápida.
4.1.3 Condições cromatográficas
Para o injetor, a temperatura utilizada foi de 280 °C, com um volume de injeção
de 1 µL no modo splitless. Para o detector, a temperatura foi 300 °C e a melhor
vazão do gás make-up (nitrogênio) foi de 60 mL min
-1
.
Dessa forma, as condições cromatográficas utilizadas para a separação dos
compostos em estudo foram as seguintes:
• Modo de injeção: splitless;
• Injeção realizada com o auxílio de amostrador automático;
• Temperatura do injetor: 280 °C;
• Volume de injeção: 1 µL;
• Programação de temperatura do forno da coluna: temperatura inicial de 80 °C
com incremento de temperatura de 20 °C min
-1
até 200 °C; posteriormente de
5 ºC min
-1
até 300 ºC;
• Vazão do gás de arraste (hélio) constante em 1,0 mL min
-1
;
• Tempo de modulação: 5 s;
• Tempo total de corrida: 25 min;
• Temperatura do detector µECD: 300 °C;
• Velocidade de aquisição dos dados pelo µECD: 50 Hz;
• Vazão do gás make up (nitrogênio) no detector: 60 mL min
-1
.
Com estas condições, o perfil de um cromatograma de separação dos
pesticidas estudados pode ser observado na Figura 16, obtido com a injeção de
1 µL de uma solução analítica contendo 0,2 mg L
-1
de cada pesticida. É
importante ressaltar que os isômeros fenvalerato e esfenvalerato, assim como,
permetrina cis e trans, foram quantificados juntos, uma vez que os Limites
Máximos de Resíduos também são fornecidos para cada par destes isômeros e
não isoladamente, conforme demonstrado no item 2.3.4.
74
Figura 16 - Cromatograma em 1D da solução analítica 0,2 mg L
-1
contendo uma
mistura dos pesticidas estudados preparada em solvente, obtido por GC×GC-µECD
conforme condições descritas no item 4.1.3
4.2 Determinação de resíduos de pesticidas por GC×GC-µECD utilizando
extração pelos métodos QuEChERS e mini-Luke modificados e utilizando o
modulador com ar comprimido
Neste trabalho, a identificação dos compostos de interesse foi realizada
através da injeção de cada pesticida separadamente e a integração das áreas dos
picos para a quantificação dos pesticidas foi realizada manualmente usando o
software HP Chemstation.
A Figura 17 apresenta os cromatogramas obtidos por GC×GC-µECD de uma
solução analítica 0,5 mg/L
-1
contendo uma mistura dos pesticidas estudados,
preparada no extrato da matriz (tomate) obtida pelo método QuEChERS modificado
com visualização em uma dimensão (1D) no cromatograma A e em duas dimensões
(2D) no cromatograma B. A Figura 18 apresenta a mesma comparação, entretanto,
com o extrato obtido pelo método mini-Luke modificado.
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
75
Figura 17 – Cromatograma da solução analítica 0,5 mg L
-1
, contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, preparada no extrato da matriz obtida pelo
método QuEChERS modificado conforme condições descritas no item 4.1.3 (A)
visualização em 1D (B) visualização em 2D
2
t
R
segunda dimensão
(s)
1
t
R
primeira dimensão (min)
(A)
(B)
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina
cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
76
Figura 18 – Cromatograma da solução analítica 0,5 mg L
-1
,
contendo uma mistura
dos pesticidas estudados, preparada no extrato da matriz e obtida pelo método mini-
Luke modificado conforme condições descritas no item 4.1.3 (A) visualização em 1D
e (B) visualização em 2D
1
t
R
primeira dimensão (min)
2
t
R
segunda dimensão (s)
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
(A)
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina
cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
(B)
77
4.2.1 Análise dos solventes e reagentes pelos métodos de extração QuEChERS e
mini-Luke modificados
Ao realizar-se a análise dos solventes e reagentes, conforme descrito no item
3.9, não se observou nenhuma contaminação dos solventes e reagentes utilizados
para a extração dos pesticidas em tomate, tanto pelo método QuEChERS quanto
pelo método mini-Luke modificados.
4.3 Validação dos métodos de extração para análise de resíduos de pesticidas
em tomate
Todas as soluções analíticas utilizadas foram preparadas no solvente acetato
de etila e no extrato da matriz (tomate), tanto pelo método QuEChERS modificado
quanto pelo método mini-Luke modificado, sendo possível avaliar o efeito da
presença deste extrato. O efeito matriz pode influenciar nos resultados, dependendo,
principalmente, dos compostos em estudo, da técnica cromatográfica empregada e
da matriz utilizada.
4.3.1 Linearidade das curvas analíticas
4.3.1.1 Método QuEChERS modificado
As Tabelas 7 e 8 apresentam as equações das curvas analíticas para os
pesticidas analisados em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz,
respectivamente
,
sendo que o primeiro ponto da curva corresponde ao limite de
quantificação do método para o respectivo pesticida.
78
Tabela 7 - Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas em
acetato de etila utilizando o método QuEChERS modificado
Pesticida
Equação da reta
(y= ax+b)
r
2
Intervalo linear
(mg L
-1
)
Bifentrina y = 40320x + 434,04 0,9991 0,01 - 1,0
Ciflutrina y = 121012x +103,05 0,9992 0,02 - 1,0
Fenpropatrina y = 45418x + 287,86 0,9990 0,01 - 1,0
Fenvalerato e esfenvalerato y = 193713x + 847,69 0,9991 0,01 - 1,0
Permetrina cis e trans y = 31999x + 359,57 0,9986 0,02 - 1,0
Tabela 8 - Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas no
extrato da matriz
utilizando o método QuEChERS modificado
Pesticida
Equação da reta
(y= ax+b)
r
2
Intervalo linear
(mg L
-1
)
Bifentrina y = 33001x + 454,72 0,9995 0,01 - 1,0
Ciflutrina y = 94123x + 210,2 0,9992 0,02 - 1,0
Fenpropatrina y = 36873x + 100,18 0,9995 0,01 - 1,0
Fenvalerato e esfenvalerato y = 155591x + 1150,5 0,9994 0,01 - 1,0
Permetrina cis e trans y = 26129x + 1999,29 0,9999 0,02 - 1,0
Analisando as equações das curvas obtidas pode-se concluir que o modelo
linear é bastante adequado já que os coeficientes de determinação (r
2
) foram iguais
ou maiores que 0,9986 para as curvas analíticas preparadas em solvente (acetato
de etila) e maiores ou iguais que 0,9992 para as curvas preparadas no extrato da
matriz, o que é satisfatório segundo a literatura (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003).
4.3.1.2 Método mini-Luke modificado
As Tabelas 9 e 10 apresentam as equações das curvas analíticas para os
pesticidas analisados em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz,
79
respectivamente
,
neste caso, utilizando o método de extração mini-Luke modificado
.
Novamente, o primeiro ponto da curva corresponde ao limite de quantificação do
método para o respectivo pesticida.
Tabela 9 - Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas em
acetato de etila utilizando o método mini-Luke modificado
Pesticida
Equação da reta
(y= ax+b)
r
2
Intervalo linear
(mg L
-1
)
Bifentrina y = 40149x + 651,07 0,9992 0,02 - 1,0
Ciflutrina y = 97035x +103,05 0,9995 0,05 - 1,0
Fenpropatrina y = 46498x + 274,55 0,9998 0,02 - 1,0
Fenvalerato e esfenvalerato y = 144846x + 814,34 0,9998 0,02 - 1,0
Permetrina cis e trans y = 32772x + 330,61 0,9993 0,05 - 1,0
Tabela 10 - Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas no
extrato da matriz utilizando o método mini-Luke modificado
Pesticida
Equação da reta
(y= ax+b)
r
2
Intervalo linear
(mg L
-1
)
Bifentrina y = 39187x + 576,95 0,9997 0,02 - 1,0
Ciflutrina y = 94714x + 1897,6 0,9955 0,05 - 1,0
Fenpropatrina y = 42395x + 668,8 0,9990 0,02 - 1,0
Fenvalerato e esfenvalerato y = 148983x + 3545,1 0,9965 0,02 - 1,0
Permetrina cis e trans y = 31136x + 1107,9 0,9988 0,05 - 1,0
Da mesma maneira que no método anterior pode-se concluir que o modelo
linear é bastante adequado já que os valores de r
2
foram iguais ou maiores que
0,9992 para as curvas preparadas em solvente (acetato de etila) e iguais ou maiores
que 0,9955 para as curvas preparadas no extrato da matriz.
Estes resultados demonstram que o método QuEChERS modificado forneceu
valores de r
2
mais apropriados que no caso do mini-Luke modificado, uma vez que
80
no método QuEChERS esses valores foram iguais ou maiores que 0,9992 para as
curvas preparadas no extrato da matriz. Outra observação importante é que os
cromatogramas das soluções analíticas preparadas no extrato, quando obtidos pelo
método QuEChERS modificado apresentam ruído da linha base menos intensos,
conforme demonstrado na Figura 19, a qual mostra os cromatogramas obtidos por
GC×GC-µECD do “branco” do extrato obtidos pelos métodos QuEChERS e mini-
Luke modificados.
Observando estes cromatogramas, nota-se que o ruído é maior utilizando o
método mini-Luke (cromatograma B), uma vez que esse método faz uso de um
homogeneizador (Ultraturrax), o qual promove maior trituração da amostra de
tomate, o que fornece ao extrato uma maior quantidade de compostos provenientes
da matriz, gerando um maior ruído no cromatograma. Por outro lado, durante a
extração baseada no método QuEChERS (cromatograma A), a agitação é realizada
manualmente, sem promover grande extração dos componentes da matriz, o que
gerou um menor ruído ao sistema.
81
Figura 19 - Cromatogramas do “branco” do extrato da matriz obtidos por
GC×GC-µECD utilizando: (A) método QuEChERS modificado e (B) método
mini-Luke modificado
(B)
(A)
82
4.3.2 Limite de detecção e quantificação
4.3.2.1 Método QuEChERS modificado
Os valores de LOD e LOQ no solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz
estão apresentados na Tabela 11.
Neste estudo, para quantificação dos pesticidas utilizou-se as curvas
analíticas preparadas no extrato da matriz. Portanto, os valores de LOD e LOQ que
devem ser considerados são também os obtidos no extrato da matriz.
Tabela 11 - Valores de LOD e LOQ do instrumento e do método no solvente e
no extrato da matriz para os pesticidas estudados utilizando o método
QuEChERS modificado
Solvente
Extrato da matriz
Pesticida LOD
i
(mg L
-1
)
LOQ
i
(mg L
-1
)
LOD
i
(mg L
-1
)
LOD
m
(mg kg
-1
)
LOQ
i
(mg L
-1
)
LOQ
m
(mg kg
-1
)
Bifentrina 0,002 0,006
0,003 0,003 0,01 0,01
Ciflutrina 0,003 0,01
0,006 0,006 0,02 0,02
Fenpropatrina 0,002 0,006
0,003 0,003 0,01 0,01
Fenvalerato e esfenvalerato
0,002 0,006
0,003 0,003 0,01 0,01
Permetrina cis e trans 0,003 0,01
0,006 0,006 0,02 0,02
FC= 1 (portanto, LOD
i
= LOD
m
e LOQ
i
= LOQ
m
)
Os limites de detecção e de quantificação no extrato da matriz são
considerados satisfatórios, quando comparados aos Limites Máximos de Resíduos
permitidos pela ANVISA, Codex Alimentarius e União Européia, pois permitem
determinar concentrações abaixo ou pelo menos igual a estes limites.
A Figura 20 compara os cromatogramas de uma solução analítica preparada
no extrato da matriz (A) e preparada no solvente acetato de etila (B).
83
Figura 20 - Cromatogramas de uma solução analítica 0,5 mg L
-1
, contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, conforme condições descritas no item 4.1.3 (A)
preparada no extrato da matriz pelo método QuEChERS modificado e (B)
preparada
em solvente (acetato de etila)
4.3.2.2 Método mini-Luke modificado
Os valores de LOD e LOQ no extrato da matriz obtidos utilizando o método de
extração mini-Luke modificado estão apresentados na Tabela 12. Novamente, para
(A)
(B)
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
84
quantificação utilizaram-se as curvas analíticas preparadas no extrato da matriz,
portanto, os valores de LOD e LOQ que devem ser considerados são também os
obtidos no extrato da matriz.
Tabela 12 - Valores de LOD e LOQ do instrumento e do método no solvente e
no extrato da matriz para os pesticidas estudados utilizando o método mini-
Luke modificado
Solvente
Extrato da matriz
Pesticida LOD
i
(mg L
-1
)
LOQ
i
(mg L
-1
)
LOD
i
(mg L
-1
)
LOD
m
(mg kg
-1
)
LOQ
i
(mg L
-1
)
LOQ
m
(mg kg
-1
)
Bifentrina 0,002 0,006
0,006 0,006 0,02 0,02
Ciflutrina 0,003 0,01
0,015 0,015 0,05 0,05
Fenpropatrina 0,002 0,006
0,006 0,006 0,02 0,02
Fenvalerato e esfenvalerato
0,002 0,006
0,006 0,006 0,02 0,02
Permetrina cis e trans 0,003 0,01
0,015 0,015 0,05 0,05
FC= 1 (portanto, LOD
i
= LOD
m
e LOQ
i
= LOQ
m
)
Os limites de detecção e de quantificação no extrato da matriz são
considerados satisfatórios, quando comparados aos Limites Máximos de Resíduos
permitidos pelo Codex Alimentarius e União Européia, pois permitem determinar
concentrações abaixo ou pelo menos igual aos limites estabelecidos.
Com relação aos limites máximos de resíduos permitidos pela ANVISA,
apenas o valor de LOQ encontrado para ciflutrina não é satisfatório, pois o valor de
LOQ está acima desse limite, demonstrando que a quantificação deste pesticida não
é segura em concentrações abaixo de 0,05 mg kg
-1
. No entanto, o Limite Máximo de
Resíduos para este pesticida em tomate é de 0,02 mg kg
-1
. Para os demais
pesticidas, os limites de quantificação são considerados satisfatórios, pois permitem
determinar concentrações abaixo ou iguais aos limites máximos de resíduos
fornecidos pela ANVISA.
A partir destas conclusões e observando as Tabelas 11 e 12, notam-se
valores de LOD e LOQ mais apropriados utilizando o método QuEChERS modificado
85
para todos os pesticidas estudados. Uma provável explicação para esse fato é o
aumento do ruído utilizando o método mini-Luke, conforme descrito no item 4.3.2.1.
A Figura 21 compara um cromatograma de uma solução analítica preparada
no extrato da matriz pelo método mini-Luke modificado (A) e um cromatograma de
um padrão preparado no solvente (B).
Figura 21 - Cromatogramas de uma solução analítica 0,5 mg L
-1
, contendo uma
mistura dos pesticidas estudados, conforme condições descritas no item 4.1.3 (A)
preparada no extrato da matriz pelo método mini-Luke modificado e (B)
preparada
em solvente (acetato de etila)
(A)
(B)
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
86
4.3.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)
De acordo com a literatura, para validação de métodos cromatográficos, na
faixa de concentração avaliada nesse trabalho, recomenda-se precisão com RSD ≤
20% (GARP, 1999).
A precisão do instrumento (repetitividade e precisão intermediária) foi
determinada injetando-se 6 vezes a solução referente a cada nível da curva analítica
(n= 6) preparado no extrato da matriz.
O teste de precisão intermediária foi realizado empregando analistas e dias
diferentes dos utilizados para os estudos de repetitividade.
4.3.3.1 Método QuEChERS modificado
Para determinação da repetitividade para o instrumento injetou-se 6 vezes
cada nível da curva analítica de acordo com o item 4.3.1.1. Para determinação da
precisão intermediária injetou-se 6 vezes cada nível de uma curva analítica com os
seguintes pontos: 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 e 0,5 mg L
-1
.
A repetitividade (RSD
r
) e a precisão intermediária (RSD
pi
) para o instrumento
nos níveis de concentração utilizados na elaboração da curva analítica, encontram-
se na Tabela 13. Os valores para a repetitividade dos pesticidas ficaram entre 2,7 e
9,3%, com valores médios entre 5,7 e 7,9%, e para a precisão intermediária ficaram
entre 2,1 e 9,5%, com valores médios entre 5,5 e 6,0%.
87
Tabela 13 - Precisão do instrumento utilizando o método QuEChERS
modificado
RSD
r
(%)
RSD
pi
(%)
Pesticida Faixa de
variação
Média
Faixa de
variação
Média
Bifentrina 2,7 – 7,9 5,7
3,7 – 7,3
5,5
Ciflutrina 3,1 – 9,5 6,5
3,9 – 8,6
6,0
Fenpropatrina 4,0 – 8,5 7,0
3,9 – 8,7
5,8
Fenvalerato e esfenvalerato 3,4 – 8,9 7,1
2,1 – 9,4
5,7
Permetrina cis e trans
4,4 – 9,3 7,9
4,0 – 9,5
5,7
n= 6 (6 injeções para cada diferente solução analítica da curva analítica).
Os resultados de precisão para o método estão demonstrados juntamente
com os resultados de recuperação, na Tabela 15, sendo que os valores para a
repetitividade dos pesticidas ficaram entre 3,1 e 8,7% e para a precisão intermediária
ficaram entre 2,1 e 8,3%.
Os resultados obtidos para as concentrações estudadas estão dentro do limite
sugerido pela literatura para validação de métodos cromatográficos, no qual a
precisão deve apresentar RSD ≤ 20% (GARP, 1999).
4.3.3.2 Método mini-Luke modificado
Para determinação da repetitividade para o instrumento injetou-se 6 vezes
cada nível da curva analítica de acordo com o item 4.3.1.1. Para determinação da
precisão intermediária injetou-se 6 vezes cada nível de uma curva analítica com os
seguintes pontos: 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 e 1,0 mg L
-1
.
A Tabela 14 demonstra a repetitividade (RSD
r
) e a precisão intermediária
(RSD
pi
) para o instrumento. Os valores para a repetitividade dos pesticidas ficaram
entre 1,2 e 9,9%, com valores médios entre 3,2 e 6,7, e para a precisão
intermediária ficaram entre 2,5 e 6,4%, com valores médios entre 3,9 e 5,2.
88
Tabela 14 - Precisão do instrumento utilizando o método mini-Luke
modificado
RSD
r
(%)
RSD
pi
(%)
Pesticida Faixa de
variação
Média
Faixa de
variação
Média
Bifentrina 1,2 – 5,4 3,2
3,4 – 4,5 3,9
Ciflutrina 3,8 – 8,5 5,9
2,5 – 5,6 4,7
Fenpropatrina 2,8 – 5,3 4,1
2,8 – 5,2 3,9
Fenvalerato e esfenvalerato
2,6 – 9,7 5,9
4,1 – 5,9 5,2
Permetrina cis e trans
4,2 – 9,9 6,7
3,9 – 6,4 5,0
n= 6 (6 injeções para cada diferente solução analítica da curva analítica).
Observando a Tabela 14, nota-se novamente que os resultados obtidos para
as concentrações estudadas estão dentro do limite sugerido, no qual a precisão
deve apresentar RSD ≤ 20% (GARP, 1999).
Os resultados de precisão para o método estão demonstrados juntamente
com os resultados de recuperação na Tabela 16, sendo que os valores para a
repetitividade dos pesticidas ficaram entre 3,3 e 9,3% e para a precisão intermediária
ficaram entre 1,1 e 10,7%.
Comparando os resultados de precisão para os dois métodos utilizados,
demonstrados nas Tabelas 15 e 16, percebe-se que, em ambos os métodos, os
valores estão abaixo de 20%, o que está de acordo com o sugerido pela literatura
(GARP, 1999). Além disso, nota-se que o método QuEChERS forneceu resultados
com maior precisão em termos de RSD
r
e RSD
pi
, porém, essa diferença não é muito
significativa, chegando no máximo a 8,7% para o método QuEChERS modificado e
10,7% para o método mini-Luke modificado.
4.3.4 Recuperação dos analitos
Neste trabalho, seguiu-se a recomendação de que, para a validação de
métodos cromatográficos, as recuperações devem estar entre 70 e 120%. A
89
recuperação depende de fatores como a amostra utilizada, o procedimento de
extração e a faixa de concentração do analito (GARP, 1999).
4.3.4.1 Método QuEChERS modificado
A Tabela 15 apresenta os valores de recuperação, RSD
r
e RSD
pi
para o
método, obtidos para as fortificações em diferentes níveis de concentração,
utilizando o procedimento descrito no item 3.8.1.
Tabela 15 - Recuperação, RSD
r
e RSD
pi
do método para os pesticidas
utilizando o método QuEChERS modificado
Repetitividade
Precisão intermediária
Pesticida
Nível de
fortificação
(µg kg
-1
)
Recuperação
(%)
RSD
r
(%)
Recuperação
(%)
RSD
pi
(%)
20 102,2 3,1
92,6 8,3
50 104,1 6,8
100,4 8,1
Bifentrina
200 98,8 5,8
101,3 4,0
20 90,9 8,7
102,4 2,9
50 102,9 5,2
101,0 3,4
Ciflutrina
200 96,2 7,2
88,4 5,6
20 92,8 4,2
80,6 6,7
50 105,5 6,5
102,3 2,6
Fenpropatrina
200 98,3 7,0
81,5 1,9
20 90,2 7,3
86,7 4,2
50 99,0 7,1
100,8 2,1
Fenvalerato e
esfenvalerato
200 97,9 8,2
103,5 4,8
20 98,3 8,7
81,0 6,3
50 104,4 6,7
99,0 2,3
Permetrina cis e
trans 200 101,3 5,2
96,5 5,3
n=6 (6 extrações × 1 injeção de cada extrato)
90
No estudo de repetitividade, as recuperações para os pesticidas ficaram entre
90,2 e 105,5%, com RSD ≤ 8,7%. No ensaio de precisão intermediária as
recuperações variaram entre 80,6 e 103,5%, com RSD ≤ 8,3%. Sendo assim, todos
os valores obtidos apresentaram-se dentro do intervalo recomendado pela literatura
(GARP, 1999).
A Figura 22 apresenta os cromatogramas de um extrato da matriz (tomate)
“branco” fortificado com os pesticidas em estudo ao nível de 50 µg kg
-1
e o seu
respectivo cromatograma visualizado em duas dimensões.
91
Figura 22 – Cromatogramas do extrato da matriz “branco” fortificado ao nível
de 50 µg kg
-1
com os pesticidas analisados por GC×GC-µECD utilizando o
método QuEChERS modificado, conforme condições descritas no item 4.1.3
(A) visualização em 1D e (B) visualização em 2D
1
t
R
primeira
dimensão (min)
2
t
R
s
egunda dimensão (s
)
esfenvalerato
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
(A)
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina
cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
(B)
92
4.3.4.2 Método mini-Luke modificado
A Tabela 16 apresenta os valores de recuperação, RSD
r
e RSD
pi
obtidos para
as fortificações, em diferentes níveis de concentração, utilizando o procedimento
descrito no item 3.8.2, baseado no método mini-Luke modificado.
Tabela 16 - Recuperação, RSD
r
e RSD
pi
do método para os pesticidas
utilizando o método mini-Luke modificado
Repetitividade
Precisão intermediária
Pesticida
Nível de
fortificação
(µg kg
-1
)
Recuperação
(%)
RSD
r
(%)
Recuperação
(%)
RSD
pi
(%)
50 110,8 8,4
92,2 1,6
200 94,1 7,6
102,8 1,1
Bifentrina
500 95,2 7,7
103,1 5,6
50 109,3 7,7
104,1 5,8
200 90,7 9,3
108,7 6,9
Ciflutrina
500 95,6 5,6
103,3 5,9
50 101,8 3,3
101,9 5,9
200 87,0 6,5
102,6 7,3
Fenpropatrina
500 87,9 8,8
105,6 5,8
50 100,1 3,9
90,4 5,5
200 94,0 9,3
98,6 10,7
Fenvalerato e
esfenvalerato 500 100,0 6,5
100,2 8,2
50 91,2 8,7
98,2 8,3
200 86,2 9,0
103,9 6,4
Permetrina cis e trans
500 88,9 9,0
103,5 5,3
n=6 (6 extrações × 1 injeção de cada extrato)
No estudo de repetitividade, as recuperações para os pesticidas ficaram entre
86,2 e 110,8%, com RSD ≤ 9,3%. No ensaio de precisão intermediária as
recuperações variaram entre 90,4 e 108,7%, com RSD ≤ 10,7%. Sendo assim, todos
os valores obtidos apresentaram-se dentro do intervalo recomendado pela literatura
(GARP, 1999).
93
Nota-se que ambos os métodos estudados resultaram em recuperações
adequadas, demonstrando que são dois métodos confiáveis. Os resultados de
recuperação ficaram todos dentro do intervalo recomendado pela literatura, ou seja,
entre 70 e 120% (GARP, 1999).
A Figura 23 apresenta os cromatogramas de um extrato de tomate “branco”
fortificado com os pesticidas estudados ao nível de 200 µg kg
-1
e o seu respectivo
cromatograma visualizado em duas dimensões.
Figura 23 – Cromatogramas do extrato da matriz “branco” fortificado ao nível
de 200 µg kg
-1
com os pesticidas analisados por GC×GC-µECD utilizando o
método mini-Luke modificado, conforme condições descritas no item 4.1.3 (A)
visualização em 1D e (B) visualização em 2D.
1
t
R
primeira
dimensão (min)
2
t
R
segunda dimensão (s
)
fenpropatrina
(A)
(B)
Permetrina cis e trans
ciflutrina
bifentrina
fenvalerato
esfenvalerato
bifentrina
fenpropatrina
Permetrina
cis e trans
ciflutrina
fenvalerato
esfenvalerato
94
4.3.5 Efeito matriz
O efeito matriz sempre sofre variações ao longo do tempo e também varia
dependendo das condições do instrumento utilizado, devendo, por isso, ser
constantemente avaliado, tanto na etapa de desenvolvimento do método quanto na
aplicação deste método nas análises de rotina.
No estudo do efeito matriz verificou-se se a matriz exerceu efeito positivo
(aumento de sinal) ou negativo (decréscimo de sinal) sobre o resultado da análise. O
efeito matriz negativo pode ser atribuído à possibilidade de ocorrer a interação de
algum componente da matriz ou reagente adicionado durante extração com os
pesticidas analisados, fazendo assim, com que ocorra uma diminuição do sinal
analítico. O efeito matriz positivo é usualmente causado pelos componentes da
matriz que evitam a capacidade de certos analitos de serem adsorvidos nos sítios
ativos do sistema cromatográfico, resultando numa maior resposta do detector para
os analitos na presença da matriz do que a resposta fornecida para os analitos
provenientes de solução analítica preparada em solvente.
A avaliação do efeito matriz na análise cromatográfica de amostras de tomate
foi realizada conforme descrito no item 3.10.5 e os resultados estão descritos a
seguir.
4.3.5.1 Método QuEChERS modificado
As Figuras de 24 a 28 representam as curvas analíticas para os pesticidas
analisados tanto em solvente quanto no extrato da matriz obtidas utilizando o
método QuEChERS modificado onde se pode verificar a existência ou não de efeito
matriz. Quando uma curva difere da outra, com uma variação maior que 10% entre
os resultados obtidos para o solvente e para o extrato da matriz, considera-se que o
efeito matriz começa a exercer influência nas análises (ZROSTLIKOVA &
HAJSLOVA, 2003).
95
y = 40320x + 434,04
R
2
= 0,9991
y = 33001x + 454,72
R
2
= 0,9995
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 24 - Curva analítica do pesticida bifentrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de extração
QuEChERS modificado
y = 121012x + 103,05
R
2
= 0,9992
y = 94123x + 210,2
R
2
= 0,9992
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 25 - Curva analítica do pesticida ciflutrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de extração
QuEChERS modificado
Área
Concentração (mg L
-
1
)
Concentração (mg L
-
1
)
Área
96
y = 45418x + 287,86
R
2
= 0,999
y = 36873x + 100,18
R
2
= 0,9995
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 26 - Curva analítica do pesticida fenpropatrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de extração
QuEChERS modificado
y = 193713x + 847,69
R
2
= 0,9991
y = 155591x + 1150,5
R
2
= 0,9994
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 27 - Curva analítica dos pesticidas fenvalerato e esfenvalerato
preparados em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo
método de extração QuEChERS modificado
Área
Concentração (mg L
-
1
)
Área
Concentração (mg L
-
1
)
97
y = 31999x + 359,57
R
2
= 0,9986
y = 26129x + 199,29
R
2
= 0,9999
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 28 – Curva analítica dos pesticidas permetrina cis e trans preparados
em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração QuEChERS modificado
Nota-se que todos os pesticidas estudados apresentaram considerável efeito
matriz negativo, quando obtidos pelo método de extração QuEChERS modificado.
A partir destes resultados, pode-se dizer que, para a quantificação dos
resíduos dos pesticidas estudados utilizando o método de extração QuEChERS
modificado e analisados por GCxGC-µECD, as soluções analíticas devem ser
preparadas no extrato da matriz.
4.3.5.2 Método mini-Luke modificado
As Figuras de 29 a 33 representam as curvas analíticas para os pesticidas
analisados tanto em solvente quanto no extrato da matriz, utilizando o método mini-
Luke modificado onde se pode observar os resultados do efeito matriz para este
método.
Área
Concentração (mg L
-
1
)
98
y = 40149x + 651,07
R
2
= 0,9992
y = 39187x + 576,95
R
2
= 0,9997
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 29 - Curva analítica do pesticida bifentrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de extração mini-
Luke modificado
y = 94714x + 1897,6
R
2
= 0,9955
y = 97035x - 701,84
R
2
= 0,9995
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 30 - Curva analítica do pesticida ciflutrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de extração mini-
Luke modificado
Área
Concentração (mg L
-
1
)
Concentração (mg L
-
1
)
Área
99
y = 46498x + 274,55
R
2
= 0,9998
y = 42395x + 668,8
R
2
= 0,999
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 31 - Curva analítica do pesticida fenpropatrina preparado em solvente
(acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de extração mini-
Luke modificado
y = 148983x + 3545,1
R
2
= 0,9965
y = 144846x + 814,34
R
2
= 0,9998
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 32 - Curva analítica dos pesticidas fenvalerato e esfenvalerato
preparados em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo
método de extração mini-Luke modificado
Área
Concentração (mg L
-
1
)
Área
Concentração (µg mL
-
1
)
100
y = 32772x + 330,61
R
2
= 0,9993
y = 31136x + 1107,9
R
2
= 0,9988
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Solvente
Extrato
Figura 33 - Curva analítica dos pesticidas permetrina cis e trans preparados em
solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz obtido pelo método de
extração mini-Luke modificado
Analisando as figuras acima, nota-se um menor efeito matriz utilizando o
método mini-Luke modificado para todos os pesticidas estudados quando
comparado com o método QuEChERS modificado. Percebe-se que, diferentemente
da extração utilizando o método QuEChERS, onde todos os pesticidas estudados
apresentaram considerável efeito matriz negativo, utilizando o método mini-Luke o
efeito matriz teve resultados positivos e negativos, sendo que, muitas vezes, este
efeito não foi significativo, ou seja, foi menor que 10%.
Mesmo alguns pesticidas não apresentando efeito matriz significativo, de
maneira geral, para a quantificação dos pesticidas estudados nos extratos da matriz
e utilizando o método de extração mini-Luke modificado, as soluções analíticas
devem ser preparadas nos extratos da matriz, pelo fato de alguns pesticidas
fornecerem um efeito matriz relativamente significativo.
Área
Concentração (mg L
-
1
)
101
4.4 Comparação entre os resultados obtidos pelo método QuEChERS e mini-
Luke modificados
Além da comparação dos resultados por meio das tabelas anteriores, onde
destacou-se as diferenças entre LOD, LOQ, precisão, exatidão e efeito matriz,
algumas características destes dois métodos também devem ser detalhadas, pois
proporcionam diferenças significativas durante a análise em termos de tempo, custo,
facilidade, geração de resíduos, entre outros.
O método QuEChERS mostrou ser um procedimento mais simples,
principalmente pela diferença no processo de agitação das amostras. Enquanto que
a maioria dos métodos de extração utiliza agitação mecânica, o método QuEChERS
faz uso de agitação manual, o que possui algumas vantagens, como por exemplo, a
possibilidade de ser aplicado em qualquer laboratório ou a campo. Além disso, o fato
da extração ser realizada em frasco fechado, não expondo o analista, e não
havendo a necessidade de lavagem do homogeneizador entre uma amostra e outra,
o que proporciona maior rapidez ao método, constituem algumas vantagens do
método (ANASTASSIADES et al., 2003)
Outra característica interessante que pôde ser observada é que o uso do
homogeneizador Ultraturrax no método mini-Luke gerou um maior ruído da linha
base nos cromatogramas em relação ao uso da agitação manual, a qual é mais
branda, não promovendo a trituração do extrato como ocorreu no método mini-Luke
modificado.
Outro ponto fundamental é em relação à quantidade de solvente utilizado em
cada método. Enquanto que no método QuEChERS fez-se uso de apenas 10 mL de
acetonitrila, no método mini-Luke, o volume total de solvente orgânico utilizado
chega a 90 mL. Além do problema da geração de uma maior quantidade de
resíduos, esta adição de solventes apolares também resulta na diluição do extrato.
Isso pode ser explicado pelo fato de que acetona e acetonitrila são miscíveis
com água e promovem a extração em uma única fase quando em contato com a
matriz. Porém, quando a extração é realizada com acetona (mini-Luke) há
necessidade de adição de solventes apolares miscíveis em acetona para que ocorra
a separação entre as fases (orgânica-água), uma vez que a acetona é muito miscível
com água para ser separada sem utilizar solventes apolares. Este procedimento não
102
é necessário quando se utiliza a acetonitrila, uma vez que, apenas a adição de sais
ao extrato faz com que ocorra tal separação (ANASTASSIADES et al., 2003;
SCHENCK et al., 2002).
A utilização de acetonitrila possibilita a extração de uma menor quantidade de
co-extrativos provenientes da amostra, como ceras, gorduras e pigmentos. Este
solvente também proporciona a extração de uma ampla faixa de pesticidas de
diferentes polaridades e, quando acidificada, permite recuperações satisfatórias de
pesticidas que geralmente apresentam problemas de estabilidade
(ANASTASSIADES et al., 2003). No entanto, uma desvantagem da utilização da
acetonitrila como solvente de extração é que esta apresenta maior custo quando
comparada à acetona.
Outro ponto fundamental, que deve ser considerado, é a etapa de clean-up, a
qual é muito importante para gerar confiabilidade aos resultados. Originalmente, no
método QuEChERS, um clean-up diferente é utilizado. Um pequeno volume de
extrato é colocado em contato com uma mistura de PSA e um agente secante,
possibilitando que a redução de água residual e a etapa de clean-up ocorram
simultaneamente. Esse procedimento de clean-up é chamado de extração em fase
sólida dispersiva, onde o PSA remove eficientemente componentes muito polares da
matriz, como ácidos orgânicos e alguns pigmentos (ANASTASSIADES et al., 2003).
Esta etapa de clean-up não faz parte do método mini-Luke, porém para efeitos de
comparação de resultados, este foi realizado durante este trabalho.
A Tabela 17 resume os principais parâmetros de comparação entre os dois
métodos estudados, incluindo os valores obtidos na validação dos métodos e
parâmetros como solvente de extração utilizado, adição ou não de solvente apolar,
toxicidade e custo do solvente de extração, entre outros.
103
TABELA 17 - Comparação entre os métodos de extração empregados: QuEChERS
e mini-Luke modificados
Parâmetros de comparação QuEChERS Mini-Luke
LOD 0,003 - 0,006 mg kg
-1
0,006 - 0,015 mg kg
-1
LOQ 0,01 - 0,02 mg kg
-1
0,02 - 0,05 mg kg
-1
Linearidade 0,01 - 1,0 mg L
-1
0,02 - 1,0 mg L
-1
Precisão método (RSD
r
)
≤ 8,7% ≤ 9,0%
Exatidão (recuperação) 90,2 - 105,5% 86,2 - 110,8%
Efeito matriz efeito matriz negativo para
todos os analitos
efeito matriz tanto positivo
quanto negativo
Solvente de extração acetonitrila acetona
Adição de solvente apolar não sim
Quantidade final de solvente 10 mL 90 mL
Toxicidade dos solventes
utilizados
menor maior
Preço do solvente de
extração
maior menor
Agitação manual mecânica (Ultraturrax)
Ruído da linha base menor maior
Tempo mais rápido mais demorado
Simplicidade mais simples mais trabalhoso
Geração de resíduos menor quantidade maior quantidade
104
5. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que o desempenho de
uma análise de resíduos de pesticidas está relacionado ao método de extração
utilizado, ou seja, é dependente do solvente de extração escolhido, além de outros
detalhes do procedimento de extração, como por exemplo, o tipo de agitação
realizada, assim como a etapa de clean-up.
Ao empregar-se o método de extração com acetonitrila (método QuEChERS
modificado) para extração dos pesticidas piretróides em estudo, obteve-se
recuperações entre 90,2 e 105,5% com RSD menor que 8,7%, enquanto que
utilizando o método de extração com acetona (método mini-Luke modificado) as
recuperações ficaram entre 86,2 e 110,8% com RSD menor que 9,0%. Dessa
maneira, percebe-se uma pequena variação nos resultados comparando os dois
métodos realizados, sendo que ambos os resultados obtidos apresentaram-se
dentro do intervalo recomendado pela literatura.
Em termos de LOD e LOQ, a diferença entre os resultados encontrados foi
mais perceptível comparando os dois métodos de extração. Utilizando o método
QuEChERS modificado os valores de LOQ ficaram entre 0,01 e 0,02 mg kg
-1
, o que
é considerado satisfatório, quando comparado aos Limites Máximos de Resíduos
permitidos pela ANVISA, Codex Alimentarius e União Européia, pois estes valores
de LOQ permitem determinar concentrações abaixo ou pelo menos igual aos limites
máximos de resíduos dos compostos em estudo. Utilizando o método mini-Luke
modificado, os valores de LOQ ficaram entre 0,02 e 0,05 mg kg
-1
, sendo que, neste
caso, o valor de LOQ encontrado para ciflutrina não foi satisfatório, pois este está
acima do Limite Máximo de Resíduos permitido pela ANVISA. Para os demais
pesticidas, os limites de quantificação são considerados satisfatórios, pois permitem
determinar concentrações abaixo ou pelo menos igual aos limites máximos de
resíduos fornecidos pela ANVISA, Codex Alimentarius e União Européia.
Com relação aos coeficientes de determinação (r
2
) das curvas analíticas,
percebeu-se que, utilizando o método QuEChERS modificado, estes valores foram
maiores ou iguais a 0,9992 para as curvas preparadas no extrato da matriz, o que é
satisfatório segundo a literatura. No caso do método mini-Luke modificado os valores
de r
2
foram maiores ou iguais a 0,9955 para as curvas preparadas no extrato da
105
matriz, demonstrando, portanto, que o método QuEChERS modificado forneceu
valores de r
2
mais apropriados que no caso do mini-Luke modificado.
Outra observação importante é que os cromatogramas das soluções
analíticas no extrato obtido pelo método mini-Luke modificado apresentaram ruído
da linha base mais intensos, uma vez que esse método faz uso de um
homogeneizador (Ultraturrax), o qual promove maior trituração da amostra de
tomate, o que fornece ao extrato uma maior quantidade de compostos provenientes
da matriz, gerando um maior ruído no cromatograma. Por outro lado, durante a
extração baseada no método QuEChERS, a agitação é realizada manualmente, sem
promover grande extração dos componentes da matriz, o que gerou um menor ruído
ao sistema.
Com relação ao efeito matriz, percebeu-se que todos os pesticidas estudados
apresentaram considerável efeito matriz negativo quando obtidos pelo método de
extração QuEChERS modificado, o que pode ser atribuído à possibilidade de ocorrer
a interação de algum componente da matriz ou reagente adicionado durante a
extração com os pesticidas analisados, resultando numa diminuição do sinal
analítico. Por outro lado, percebeu-se um menor efeito matriz utilizando o método
mini-Luke modificado para todos os pesticidas estudados quando comparado com o
método QuEChERS modificado. Diferentemente da extração utilizando o método
QuEChERS, onde todos os pesticidas estudados apresentaram considerável efeito
matriz negativo, utilizando o método mini-Luke o efeito matriz teve tanto resultados
positivos como negativos, sendo que, muitas vezes, este efeito não foi significativo,
ou seja, foi menor que 10%.
Constatou-se que o método QuEChERS é um procedimento mais simples,
principalmente pela diferença no processo de agitação das amostras, o que resulta
na possibilidade de ser aplicado em qualquer laboratório ou a campo. Além disso, a
extração é realizada em frasco fechado, não expondo o analista e não havendo a
necessidade de lavagem do homogeneizador entre uma amostra e outra, o que
proporciona maior rapidez ao método, minimizando o risco de contaminação. Outra
vantagem importante do método QuEChERS é a menor quantidade de solvente
utilizado. No entanto, uma desvantagem da utilização de acetonitrila como solvente
de extração é que esta apresenta maior custo quando comparada à acetona.
Este estudo mostrou também que o sistema GC×GC-µECD com modulador
de duplo jato de ar comprimido possibilita a redução dos custos da análise, com
106
relação ao modulador que utiliza CO
2
líquido, e que esta combinação pode ser
utilizada em análises de pesticidas piretróides em tomate, pois obteve-se baixos
valores de LOD e LOQ, boa precisão e exatidão da resposta analítica e, além disso,
não foram observados problemas de sobreposição de outros compostos presentes
na matriz.
Sendo assim, pode-se afirmar que os objetivos traçados para este trabalho
foram satisfatoriamente alcançados, uma vez que foi possível avaliar e comparar
dois métodos de extração de resíduos de pesticidas bastante utilizados, o método
QuEChERS e o método mini-Luke, utilizando um sistema GC×GC-µECD.
107
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Desenvolvimento e validação de métodos utilizando GC×GC para determinar
diferentes classes de pesticidas, tais como carbamatos, organofosforados,
organoclorados e piretróides na cultura de tomate;
Utilização do sistema GC×GC na resolução de problemas relacionados a
picos sobrepostos, obtidos principalmente quando utiliza-se cromatografia gasosa
convencional, na análise de resíduos de pesticidas em amostras complexas;
Comparação dos resultados obtidos utilizando os métodos de extração
QuEChERS e mini-Luke modificados na análise de resíduos de pesticidas em
diferentes matrizes de frutas e vegetais;
Utilização do sistema GC×GC para identificação e quantificação de diferentes
compostos em amostras complexas, tais como produtos petroquímicos e amostras
ambientais.
108
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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de 11 de julho de 1989, que dispõe sobre a pesquisa, a experimentação, a
produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o armazenamento, controle, a
inspeção e a fiscalização de agrotóxicos, e dá outras providências. Diário Oficial
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