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CLINEU JULIEN SEKI UEHARA
CARACTERIZAÇÃO DOS GENES OR2I1P, OR12D3, OR14J1, OR2B4P,
OR2E1P, OR1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W4P, OR2B6 E
OR2W6P EM LINHAGENS CELULARES HUMANAS
CURITIBA
2008
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CLINEU JULIEN SEKI UEHARA
CARACTERIZAÇÃO DOS GENES OR2I1P, OR12D3, OR14J1, OR2B4P,
OR2E1P, OR1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W4P, OR2B6 E
OR2W6P EM LINHAGENS CELULARES HUMANAS
Dissertação apresentada como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas, na área de
concentração de Genética, do Programa de
Pós-Graduação em Genética, do
Departamento de Genética, Setor de
Ciências Biológicas, Universidade Federal
do Paraná.
Orientadora: Profª. Drª. Maria da Graça
Bicalho.
CURITIBA
2008
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Universidade Federal do Paraná
Sistema de Bibliotecas
Uehara, Clineu Julien Seki
Caracterização dos genes OR2I1P, OR12D3, OR14J1, OR2B4P, OR2E1P,
OR1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W4P, OR2B6 e OR2W6P em
linhagens celulares humanas. / Clineu Julien Seki Uehara. – Curitiba, 2008.
xi, 68f. : il ; 30cm.
Orientadora: Maria da Graça Bicalho
Dissertação ( mestrado) – Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências
Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Genética.
1. Genética 2. Linhagem (Genética). I.Título II. Bicalho, Maria da Graça III.
Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
Graduação em Genética.
CDD(20.ed.) 575.1
AGRADECIMENTOS
Todo trabalho faz parte do empenho de várias pessoas, nunca é o esforço
de um e sim o poder do coletivo. Por isso, o reconhecimento dos colegas dessa
jornada fica aqui registrado! Sem a participação dessas pessoas, esse trabalho não
seria realizado!
À minha orientadora, professora Dr
a
. Maria da Graça Bicalho, por toda a
confiança, por toda a motivação e entusiasmo depositado nesta jornada.
Aos professores do Departamento de Genética da UFPR, por passar um
pouco do seu conhecimento para que esta obra pudesse ser concretizada.
Aos membros da bancada de acompanhamento professora Dr
a
. Valéria
Sperandio Roxo e professor Dr
o
. João Carlos Marques Magalhães, pelas sugestões
e disposição em ajudar. A professora Dr
a
. Adriana Frohlich Mercadante, por sua
participação na banca de avaliação, contribuindo com suas sugestões.
Ao pessoal do Institut für Immungenetik, Charité da Universidade Livre de
Berlim, principalmente ao Pablo Sandro Carvalho Santos e aos pesquisadores
Andreas Ziegler e Barbara Uchanska-Ziegler, pelo suporte científico e por ter
fornecido gentilmente as linhagens celulares utilizadas neste estudo.
Ao pessoal do IBMP, principalmente ao Stênio Perdigão Fragoso, a
Adriana Castilhos Souza Umaki e ao Paulo Rodrigo Claure Arauco, pela ajuda nas
técnicas de clonagens.
Aos meus companheiros no LIGH, Dr
a
. Eni Picchioni Bompeixe, Dr
a
.
Fabiana Poerner, Msc. Fernanda Ribas Zacarias, José Luiz Marques Bilá Jr.,
Cláudia Terezinha Schuertz, Marina Bárbara de Sousa Xavier, Gorete Ynaquiev
Tomaz de Rezende, Téo M. Ruiz, Paulo Rincoski Costantino, Msc. Alessandro
Pirri, Rafael Gustavo Vargas e Isabel Terezinha da Costa Moreira Martinez, por
todo o apoio e compreensão, com todas as suas idéias e sugestões. Gostaria de
agradecer especialmente: a Sibelle Botogosque Mattar, pela contribuição na etapa
ii
do seqüenciamento das amostras; e a Sonia Maria Correia Machado da Costa, por
me ensinar as técnicas dentro laboratório.
Aos meus pais e professores, Clineu Uehara e Mitica Seki Uehara, pelo
suporte e por me ensinar a importância da dedicação e o amor pelo ensino.
À minha família, minha irmã Letícia, tia Odete, tio Luís, tia Lúcia e tia
Celina que sempre me apoiaram e incentivaram.
Aos amigos de infância, Luciano e Francis, e aos amigos da graduação,
Leonardo, Chico e Francini! Obrigado pelas palavras de incentivo e os momentos
de alegria!
Enfim, ao que torna tudo possível: Deus!
iii
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO................................................................................ 01
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................... 03
2.1. CROMOSSOMO 6, MHC CLÁSSICO E O MHC ESTENDIDO
(MHCx)............................................................................................
...
03
2.1.1. MHC Clássico.................................................................................. 03
2.1.1.1. Localização cromossômica e estrutura gênica da região
MHC.................................................................................................
...
05
2.1.1.2. Olfato e MHC................................................................................... 10
2.1.2. MHC Estendido (MHCx)................................................................. 15
2.1.2.1. Genes de receptores olfatórios ligados ao MHC.............................. 19
2.2. RECEPTORES OLFATÓRIOS....................................................... 21
2.2.1. Distribuição Cromossômica dos Genes de Receptores Olfatórios
no Genoma Humano........................................................................
...
23
2.2.2. Produto protéico dos receptores olfatórios....................................... 23
2.2.3. Nomenclatura dos Genes OR em humanos...................................... 26
2.2.4. Transdução de Sinal Mediada pelos Receptores Olfatórios............. 27
2.2.5. Sistemas Quimiossensoriais e Receptores Olfatórios...................... 27
3.
OBJETIVOS GERAIS.................................................................. 33
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................... 33
4.
JUSTIFICATIVA........................................................................... 34
5.
MATERIAL E MÉTODOS........................................................... 35
5.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA.......................................... 35
iv
5.2. CULTIVO CELULAR E EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO.... 37
5.3. QUANTIFICAÇÃO DO DNA OBTIDO NA ETAPA DA
EXTRAÇÃO....................................................................................
...
37
5.4. SEQUENCIAMENTO DOS GENES DOS RECEPTORES
OLFATÓRIOS.................................................................................
...
37
5.4.1. Desenvolvimento dos Oligonucleotídeos Iniciadores para os
Genes OR.........................................................................................
…
39
5.4.2. Reação de Amplificação dos Genes OR (OR2I1P, OR12D3,
OR14J1, OR2B4P, OR2E1P, ORF1F12, OR2B8P, OR2B7P,
OR2W2P, OR2W4P, OR2B6, OR2W6P)……………..…………
…
…
40
5.4.3. Purificação das Amostras de Genes OR Amplificados.................... 41
5.4.4. Seqüenciamento, Precipitação e Denaturação das Amostras de
Genes OR Amplificados...................................................................
...
42
5.5. CARACTERIZAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DOS GENES DE
RECEPTORES OLFATÓRIOS LIGADOS AO MHC...................
...
43
6.
RESULTADOS............................................................................... 44
6.1. RESULTADOS DO PROCESSO DE IMPLANTAÇÃO E
AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DE SEQÜENCIAMENTO DE
GENES OR......................................................................................
....
...
44
6.2. POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP)............. 45
6.3. COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS DO PRESENTE
ESTUDO COM OS DE EHLERS et al. (2000)...............................
...
57
7.
DISCUSSÃO................................................................................... 58
8.
CONCLUSÃO................................................................................ 60
REFERÊNCIAS............................................................................. 61
v
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - VIAS SIMPLIFICADAS DE PROCESSAMENTO DE
ANTÍGENOS PARA APRESENTAÇÃO POR
MOLÉCULAS
HLA.....................................................................................
.....
.....
....
05
FIGURA 2 - ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA E GÊNICA DO
MHC....................................................................................
....
06
FIGURA 3 - REPRESENTAÇÕES DAS MOLÉCULAS HLA DE
CLASSE I E DE CLASSE II...............................................
....
08
FIGURA 4 - POLIALELISMO RELACIONADO AS PROTEÍNAS E
ALELOS HLA DE CLASSE I E II.....................................
.....
.09
FIGURA 5 - MECANISMOS DE COMO O MHC ATUARIA NA
FORMAÇÃO DO “ODORTIPO”.......................................
.....
14
FIGURA 6 - MAPA GÊNICO DO MHC ESTENDIDO......................... 18
FIGURA 7 - OS GENES DE RECEPTORES OLFATÓRIOS
LIGADOS AO MHC...........................................................
....
19
FIGURA 8 - DIAGRAMA REPRESENTATIVO DOS GENES DE
RECEPTORES OLFATÓRIOS LIGADOS AO MHC.......
.....
20
FIGURA 9 - EXEMPLO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA DOS
RECEPTORES OLFATÓRIOS..........................................
....
24
FIGURA 10 - LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DE GENES OR
HUMANOS.........................................................................
....
25
FIGURA 11 - TRANSDUÇÃO DE SINAL MEDIADA PELOS
RECEPTORES OLFATÓRIOS..........................................
....
27
FIGURA 12 - SISTEMAS QUIMIOSSENSORIAIS ASSOCIADOS AO
SENTIDO DO OLFATO....................................................
....
28
FIGURA 13 - EXEMPLO DE COMO SÃO FORMADOS OS
CÓDIGOS PARA ODORANTES ATRAVÉS DA
COMBINAÇÃO DOS RECEPTORES OLFATÓRIOS.....
.....
....
31
vi
GENES OR LIGADOS AO MHC ANALISADOS
NESTE ESTUDO................................................................
FIGURA 14 - ....
38
FIGURA 15 - EXEMPLO DE INTERPRETAÇÃO DOS
ALINHAMENTOS.............................................................
....
46
FIGURA 16 - EXEMPLOS DE SLIPPAGE DA DNA POLIMERASE.... .58
FIGURA 17 - SLIPPAGE DA DNA POLIMERASE OCORRIDO NA
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO DO GENE
OR1F12...............................................................................
.....
....
59
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - CARACTERÍSTICAS DAS LINHAGENS CELULARES
PESQUISADAS..........................................................................
...
36
TABELA 2 - RELAÇÃO DOS INICIADORES DESENVOLVIDOS............ 39
TABELA 3 - REAGENTES UTILIZADOS PARA REAÇÃO DE
AMPLIFICAÇÃO.......................................................................
...
40
TABELA 4 - CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NA PCR.......... 40
TABELA 5 - REAGENTES UTILIZADOS NA ETAPA DE
PURIFICAÇÃO..........................................................................
...
41
TABELA 6 - CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NA ETAPA
DE PURIFICAÇÃO....................................................................
...
41
TABELA 7 - REAGENTES UTILIZADOS NA REAÇÃO DE
SEQÜENCIAMENTO................................................................
...
42
TABELA 8 - REAGENTES UTILIZADOS NA CALIBRAÇÃO
ESPECTRAL..............................................................................
...
42
TABELA 9 - CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NAS
REAÇÕES DE SEQÜENCIAMENTO DOS GENES OR2I1P,
OR12D3, OR14J1, OR2B4P, OR2E1P, OR1F12, OR2B8P,
OR2B7P, OR2W2P, OR2W6.......................................................
....
....
...
42
TABELA 10- CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NAS
REAÇÕES DE SEQÜENCIAMENTO DOS GENES
OR2W4P e OR2B6......................................................................
....
...
43
NÚMERO DE PARES DE BASES DE GENES OR
SEQUENCIADOS......................................................................
...
44
TABELA 11-
NÚMERO DE SNPs NOS GENES OR SEQUENCIADOS...... TABELA 12- 45
viii
LISTA DE SIGLA E ABREVIATURAS
kDa - Quilodalton
Mb - Megabases
μl - Microlitro
µM - Micro molar
BTN - Gene da proteína butirofilina
D.O. - Densidade óptica
dNTPs - Desoxinucleotídeos trifosfatos
EXO I - Enzima exonuclease I
HFE - Gene da hemocromatose
HLA - Antígenos Leucocitários Humanos
do inglês: The Human Olfactory Receptor Data Exploratorium HORDE -
do inglês: The Human Genome Organization HUGO -
do inglês: The international ImMunoGenetics information system IMGT -
LT - Linfotoxina
MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade
MHCx - Complexo Principal de Histocompatibilidade Estendido
MOE - Epitélio Olfatório Principal
OR - Receptor Olfatório
RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa
PCR - Reação em cadeia da polimerase
SAP - Enzima Fosfatase Alcalina de Camarão
SNP - Polimorfismo de nucleotídeo único
T CD4
+
- Linfócito T que expressa à molécula de superfície CD4+
T CD8
+
- Linfócito T que expressa a molécula de superfície CD8+
TAP - Transportador associado ao processamento de antígenos
TCR - Receptor de Linfócitos T
TM - Domínio transmembrana
TNF - Fator de Necrose Tumoral
tRNA - RNA transportador
VNO - Órgão Vomeronasal
ix
RESUMO
A identificação de moléculas presentes no ar proporciona aos seres vivos a
capacidade de perceber o ambiente e desenvolver respostas as quais permitam a
sobrevivência e a reprodução. São várias as hipóteses que associam preferências
olfativas e hábitos comportamentais a moléculas codificadas por genes do MHC.
Na espécie humana, características distintas como, por exemplo, o reconhecimento
da prole e parentesco, escolha preferencial de parceiros, seleção gamética e hábito
tabagista, têm sido freqüentemente associadas a certos haplótipos HLA. O presente
estudo tem como objetivo principal investigar polimorfismos de nucleotídeo único
(SNPs) nos genes OR (OR2I1P, OR12D3, OR14J1, OR2B4P, OR2E1P, OR1F12,
OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W4P, OR2B6 e OR2W6P) de 10 linhagens
celulares humanas (BM28.7, BM19.7, LG2, KR3598, H2LCL, WT51, SA, YAR,
OLGA e AMAI). A investigação desses SNPs foi realizada utilizando-se a técnica
de seqüenciamento, compreendendo toda a região que codifica para os domínios
transmembrana dos receptores olfatórios. O presente estudo somou-se aos que já
foram realizados por EHLERS et al., 2000 (OR2B2, OR2AD1P, OR2W1, OR2P1P,
OR2B3, OR2J1, OR2J3, OR2N1P, OR2J2, OR2J4P, OR2H4P, OR2G1P,
OR2U1P, OR2U2P, OR5V1, OR12D2, OR12D1P, OR11A1, OR10C1, OR2H1,
OR2H5P e OR2H2), cujo objetivo foi fornecer dados complementares sobre a
seqüência de todo o cluster de genes OR ligados ao MHC. No presente estudo
foram identificados nove (9) SNPs ainda não descritos na literatura. Os resultados
obtidos, e por nós referenciados como genótipos OR de referência, são importantes
para entendimento da organização e da estrutura de genes OR no contexto do
MHCx, além de que, fundamentarão os próximos estudos relacionados aos genes
OR desenvolvidos pelo grupo de pesquisa LIGH em parceria com Institut für
Immungenetik, Charité.
x
ABSTRACT
The identification of molecules present in the air allows living organisms
to recognize the environment and develop proper responses to different situations,
a very important aspect for survival and reproduction. There are many hypothesis
that associate olfactory preferences and behavior with molecules that are codified
by MHC genes. In humans, different features, such as, kin and sibling recognition,
preferential partner choice, gametic selection, smoking habit, have been frequently
associated to certain HLA haplotypes. The present report aims to investigate single
nucleotide polymorphisms (SNPs) in OR genes (OR2I1P, OR12D3, OR14J1,
OR2B4P, OR2E1P, OR1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W4P, OR2B6 and
OR2W6P) of 10 human cell lineages (BM28.7, BM19.7, LG2, KR3598, H2LCL,
WT51, SA, YAR, OLGA and AMAI). To investigate these SNPs we used the
sequencing technique of all seven transmembrane region of the olfactory receptor.
This study corroborated a previous investigation of EHLERS et al., 2000 (OR2B2,
OR2AD1P, OR2W1, OR2P1P, OR2B3, OR2J1, OR2J3, OR2N1P, OR2J2,
OR2J4P, OR2H4P, OR2G1P, OR2U1P, OR2U2P, OR5V1, OR12D2, OR12D1P,
OR11A1, OR10C1, OR2H1, OR2H5P and OR2H2), which willed to give
complementary data about all the cluster of OR genes present in the short arm of
chromosome 6. In our study we found nine (9) SNPs not described in the current
literature. The results obtained, considered as reference OR genotype by our
workgroup, are very important to understand the organization and structure of OR
genes in the context of extended MHC. Furthermore, this data will support the next
investigations related to OR genes developed by the LIGH workgroup in
partnership with the Institut für Immungenetik, Charité.
xi
1
1. INTRODUÇÃO
O prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2004 foi entregue à dupla de
cientistas norte americanos Richard Axel e Linda B. Buck pelas pesquisas sobre
receptores olfatórios e a organização do sistema olfatório. Até então, dentre os sentidos
humanos, o olfato era o menos estudado e o mecanismo básico que permitia o
reconhecimento de cerca de 10.000 diferentes odores ainda permanecia por ser
elucidado.
Os estudos conduzidos por BUCK e AXEL (1991) permitiram revelar a
existência de uma grande família gênica, formada por aproximadamente 1.000 genes
diferentes, que codificam para proteínas que atuam como receptores olfatórios. Esses
receptores estão presentes na superfície das células olfativas.
Quando inspiramos, as moléculas dispersas no ar entram em contato com os
receptores olfatório presentes nos neurônios sensitivos. As células sensibilizadas
disparam impulsos nervosos para micro domínios específicos localizados no bulbo
olfatório que vão ser conduzidos para determinadas regiões cerebrais. Posteriormente,
o cérebro analisa o padrão de ativação e reconhece determinado odor (MALNIC et al.,
1999). Essa capacidade de identificar moléculas presentes no ar, através do ato de
“cheirar”, proporciona aos seres vivos a capacidade de perceber o ambiente e
desenvolver respostas propícias que permitam a sobrevivência e a reprodução.
No campo da biologia social, um aspecto importante é a comunicação através
de moléculas voláteis, percebidas pelo sistema olfatório de indivíduos da mesma
espécie, e que atuam de forma a transmitir informações relevantes resultando em
mudanças comportamentais (BROWN e MACDONALD, 1985). Por exemplo,
YAMAZAKI et al. (1990) relataram, em camundongos, uma preferência por parceiros
sexuais dependente de haplótipos MHC que aparentemente seria mediada pelo olfato
(PEN e Potts, 1999).
Um grande número de genes situados na região MHC é relacionado com a
resposta imune. Entretanto, outros locos gênicos sem qualquer relação com a resposta
imunológica foram mapeados nessa região através de estudos de ligação (FAN et al.,
2
1995). Um exemplo foi o estudo de BERGEN et al. (1999) que realizaram uma
varredura no genoma humano em busca de marcadores moleculares para o tabagismo e
mapearam marcadores para esse fenótipo no cromossomo 6, próximos da região do
Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC).
FÜST et al. (2004), baseados no estudo anterior, mapearam marcadores MHC
de Classe III associados ao hábito de fumar. Nesse estudo encontraram uma alta
freqüência do haplótipo MHC, caracterizado pela presença de alelos nulos para o gene
C4A e apenas um gene C4B associado ao alelo TNF2 do promotor do gene TNFA.
Como a região do MHC apresenta como característica, um forte desequilíbrio de
ligação com “agrupamentos” (clusters) de genes de receptores olfatórios (genes OR)
na região do MHC estendido (MHCx) é possível que esses genes influenciem na
predisposição ao hábito tabagista.
O seqüenciamento dos genes de receptores olfatórios de 10 linhagens celulares
humanas, gentilmente cedidas e também analisadas num estudo prévio realizado por
EHLERS et al. (2000) introduz, otimiza e consolida uma linha de investigação no
LIGH relacionada a genes situados no MHCx humano e sua provável influência em
características comportamentais. As informações obtidas poderão contribuir para uma
maior compreensão dos mecanismos que predispõem ao hábito tabagista, bem como a
escolha preferencial de parceiros, características que têm sido associadas com genes da
região MHC.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CROMOSSOMO 6, MHC CLÁSSICO E O MHC ESTENDIDO (MHCx)
O cromossomo 6 humano, é um cromossomo metacêntrico, e constitui
aproximadamente 6% do genoma humano. O seqüenciamento completo desse
cromossomo pelo Projeto Genoma revelou que o mesmo é constituído por
166.880.988 pares de base (MUNGALL et al., 2003).
Em sua composição, o cromossomo 6 apresenta um grande número de genes,
sendo a região do MHC, provavelmente, a mais seqüenciada do genoma humano
(LECHLER e WARRENS, 2000). Os genes da região MHC desempenham papel
fundamental na resposta imunológica.
Além dos genes relacionados a resposta imune, o cromossomo 6 também
apresenta muitos genes que codificam receptores envolvidos na percepção sensorial
e/ou em certas características comportamentais (ZIEGLER, 1997).
2.1.1. MHC Clássico
O MHC humano (do inglês: Major Histocompatibility Complex) é
denominado HLA (Antígenos Leucocitários Humanos) e, foi caracterizado através da
busca por diferenças genéticas determinadas sorologicamente, que pudessem ser
utilizadas para parear indivíduos para fins de transplantes de órgãos e tecidos.
Entretanto, a função primária das proteínas HLA é constituir a base molecular para que
linfócitos T possam discriminar o próprio do não próprio (HORTON et al., 2004).
As moléculas HLA clássicas de classe I são expressas por todos os tipos
celulares nucleados e plaquetas, e sua função é apresentar peptídeos antigênicos
provenientes de patógenos endógenos (como vírus) ou de células tumorais, às células
T CD8
+
. Como observado sucintamente na Figura 1, proteínas presentes no citosol são
degradadas por uma estrutura conhecida como proteassomo. Os peptídeos oriundos do
4
processamento pelo proteassomo são transportados para o interior do retículo
endoplasmático pelas proteínas TAP (Transportador Associado ao Processamento de
antígeno). No retículo endoplasmático, ocorre a formação do complexo peptídeo-
MHC, que posteriormente é expresso na superfície celular (KLEIN e SATO, 2000a).
Os linfócitos T possuem receptores de membrana (TCR) que reconhecem o
complexo peptídeo-MHC. O reconhecimento também envolve outros fatores co-
estimuladores que desencadeiam a produção de citocinas que orquestram a resposta
imunológica. É importante salientar que no caso da resposta celular, os linfócitos T
envolvidos apresentam uma proteína de membrana denominada CD8 que permite a
interação com a molécula HLA de classe I. Caso ocorra ativação desse tipo celular
(TCD8
+
), a célula que apresentou o peptídeo antigênico será destruída e a resposta
imune do tipo celular será ativada (KLEIN e SATO, 2000a).
Contudo, quando existe a presença de patógenos extracelulares, a resposta
imunológica se inicia pela apresentação de peptídeos antigênicos por moléculas HLA
de classe II (também representada na Figura 1). Através da endocitose, proteínas
próprias ou patógenos extracelulares são processadas no interior celular. O
processamento ocorre nos lisossomas que contêm enzimas que degradam seu conteúdo
em peptídeos. Esses peptídeos então são incorporados às moléculas MHC de classe II
e expressos na superfície celular para apresentação aos linfócitos T CD4
+
. A interação
entre a célula que expressa os peptídeos processados e o linfócito T também ocorre
através da interação entre o TCR e a molécula HLA (KLEIN e SATO, 2000b).
No entanto, as moléculas HLA de classe II interagem através de seu domínio
β2 com o antígeno de superfície CD4 encontrado em linfócitos TCD4+. Dessa forma,
a ativação específica dessa classe de linfócito gera uma resposta imunológica de
caráter humoral, ao contrário do processo de reconhecimento via linfócito TCD8
+
. A
expressão de moléculas HLA de classe II apresenta uma distribuição restrita a
linfócitos B, monócitos e macrófagos. Em algumas situações especiais as células
endoteliais de capilares e vênulas também expressam moléculas de classe II (KLEIN e
SATO, 2000b).
5
FIGURA 1 – VIAS SIMPLIFICADAS DE PROCESSAMENTO DE ANTÍGENOS
PARA APRESENTAÇÃO POR MOLÉCULAS HLA
FONTE: HALLING-BROWN, M. D. Computational Techniques for the Prediction of Minor
Histocompatibility and T cell Antigens. Disponível em: <http://igrid-
ext.cryst.bbk.ac.uk/WWW/PhD_thesis.htm>. Acesso em: 03 jun. 2008.
NOTA: A representação demonstra de forma simplificada o processamento e a apresentação de
antígenos aos linfócitos T. O lado esquerdo representa o processamento e a apresentação
mediada por moléculas MHC de classe I. O lado direito da gravura representa o
processamento de polipetídeos orindos do meio extracelular e apresentação por moléculas
HLA de classe II.
2.1.1.1 Localização cromossômica e estrutura gênica da região MHC
O MHC humano está localizado no braço curto do cromossomo 6, na banda
6p21.3, que possui um comprimento de 3,6 milhões de bases (3,6 Mb), e compreende
6
aproximadamente 240 locos (SHIINA, INOKO e KULSKI, 2004), sendo que 40 deles
foram relacionados a alguma função imunológica pela revisão de KLEIN e SATO
(2000a). O complexo MHC possui vários genes HLA e outros genes não pertencentes
ao sistema HLA. A divisão desse complexo em 3 regiões (Figura 2) é baseada na
estrutura e função gênica dos produtos moleculares codificados pelos genes
correspondentes.
FIGURA 2 – ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA E GÊNICA DO MHC
FONTE: NCBI. dbMHC HOME. Disponível em: <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc/main.cgi?
cmd=init&user_id=0&probe_id=0&source_id=0&locus_id=0&locus_group=1&proto_id=0
&kit_id=0&graphview=0> Acesso em: 03 jun. 2008.
• Genes HLA da região MHC de classe I.
A região de classe I é composta por mais de 122 locos: clássicos, não-
clássicos e por pseudogenes. Os locos denominados não clássicos são HLA-E,
HLA-F e HLA-G, sendo pouco polimórficos. Os locos considerados pseudogenes
são HLA-H, HLA-J, HLA-K e HLA-L (CAMPBELL e TROWSDALE, 1993).
7
Os genes clássicos (HLA-A, HLA-B e HLA-C) são os mais conhecidos. Esses
genes HLA são altamente polimórficos e codificam para a cadeia α das moléculas
HLA de classe I cuja estrutura heterodimérica se completa com uma cadeia leve de
β2-microglobulina, codificada por um gene de mesmo nome localizado no
cromossomo 15. Essa estrutura molecular só é funcional com o peptídeo antigênico
alojado na fenda da molécula HLA (Figura 3a).
• Genes HLA da região MHC de classe II.
Os genes que codificam as moléculas de classe II estão mapeados na região
HLA-D, especificamente nas sub-regiões DR, DQ e DP. Os genes situados nessas
sub-regiões codificam respectivamente as moléculas HLA-DR, HLA-DQ e HLA-
DP. As moléculas de classe II são constituídas de duas cadeias polipeptídicas (α e
β) ligadas de forma não covalente (Figura 3b). A cadeia α tem em torno de 32 a
34kDa e a cadeia β tem em torno de 29 a 32kDa e são codificadas por genes MHC
polimórficos.
A molécula HLA-DR estrutura-se a partir do polipeptídeo α codificado
pelo gene DRA e pelo polipeptídeo β codificado pelo gene DRB1. O mesmo é
observado para a molécula HLA-DQ e HLA-DP. Existem ainda, os locos HLA-
DOB, HLA-DMA e HLA-DMB, HLA-DOA, que codificam para cadeias α e β
respectivas. Em alguns haplótipos, além do gene DRB1,estão presentes outros
genes DRB (DRB3 ou DRB4 ou DRB5) o que contribui para o aumento da
diversidade das moléculas HLA-DR expressas por esses indivíduos.
• Genes da região MHC de classe III.
A região de classe III, localizada entre as regiões de classe I e II contém pelo
menos 59 genes, possuindo a maior densidade gênica das três regiões. Há genes
que atuam no processo de ativação do sistema complemento (Bf, C2
, C4A, C4B) e
genes da 21-hidroxilase, da hemocromatose, TNF e LTA (que codificam as
citocinas TNF-α e LT-α, respectivamente), além, de genes de susceptibilidade a
doenças como a Doença de Graves, Doenças de Crohn, entre outros
(MATSUZAKA et al. 2001).
8
FIGURA 3 – REPRESENTAÇÕES DAS MOLÉCULAS HLA DE CLASSE I E DE
CLASSE II
FONTE: ABBAS, A. K.; LICTHMAN, A. H. O Complexo Principal de Histocompatibilidade. In:
Imunologia celular e molecular. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. p.65-81.
NOTA: Fig. 3.a) A representação da esquerda demonstra os domínios que compõem a molécula HLA
de classe I. A representação da direita demontra a interação entre uma molécula HLA de
classe I com o peptídeo a ser apresentado aos linfócitos T CD8
+
. Fig. 3.b) A representação da
esquerda demonstra os domínios que compõem a molécula HLA de classe II. A representação
da direita demontra a interação entre uma molécula HLA de classe II com o peptídeo a ser
apresentado aos linfócitos T CD4
+
.
Outra característica da organização gênica do MHC é a baixa taxa de
recombinação entre os genes aí situados, sendo estimada uma freqüência de 4% entre
os pontos extremos do MHC (GERAGHTY et al., 1992). A combinação de alelos
MHC, presentes em diferentes locos e transmitidos aos descendentes em conjuntos, é
denominada haplótipo. Dessa forma, a transmissão dos alelos HLA é realizada em
bloco, sendo que cada indivíduo possui dois haplótipos, um herdado do pai e outro da
mãe.
O sistema gênico HLA também é reconhecido como o mais polimórfico do
genoma humano (MUNGALL, 2003). Até o mês de junho de 2008 constavam no
banco de dados do projeto IMGT (IMunoGeneTics Project) 649 alelos para o loco
HLA-A e 1029 alelos para o HLA-B.
A B
9
FIGURA 4 –POLIALELISMO RELACIONADO AS PROTEÍNAS E ALELOS HLA
DE CLASSE I E II
FONTE: Adaptado de: ANTHONY NOLAN RESEARCH INSTITUTE. HLA Informatics Group.
Disponível em: <http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html>. Acesso em: 03 jun. 08.
A presença de vários genes duplicados em função (codificar moléculas apresentadoras
de antígenos), o alto polimorfismo e a expressão co-dominante de ambos os alelos no
mesmo loco gênico contribuem para aumentar a diversidade das moléculas HLA
expressas por um indivíduo (JANEWAY, 2002).
Essa diversidade de proteínas HLA maximiza a apresentação de antígenos
para o sistema imune, num ambiente que apresenta uma extrema diversidade de
patógenos a que os indivíduos estão potencialmente expostos. Dessa forma, existem
vários estudos sobre como a seleção natural atuaria para favorecer a grande
diversidade alélica observada nos genes HLA.
Um certo número de pesquisadores investiga a atuação das moléculas MHC na
produção de um “odortipo” e na escolha de “parceiros para a reprodução” baseada no
odor (JACOB et al., 2002; OBER et al., 1997; PEN e POTTS, 1999; SANTOS et al.,
2005; WEDEKIND et al., 1995 YAMAZAKI et al, 1976).
10
2.1.1.2. Olfato e MHC
A capacidade de identificar moléculas presentes no ar, através do ato de
“cheirar”, proporciona aos seres vivos a capacidade de perceber o ambiente e
desenvolver respostas propícias que permitam a sobrevivência e a reprodução. Essa
habilidade torna o olfato primordial no reino animal, sendo utilizado para várias
funções tais como: a identificação de alimentos, a localização de predadores, a
demarcação de território, o acasalamento preferencial, o reconhecimento de prole entre
outras possíveis funções a serem investigadas.
Evidências da influência do olfato sobre características comportamentais
humanas vêm sendo reportadas freqüentemente, como por exemplo, o estudo realizado
por MCCLINTOCK (1971), onde se observou sincronização dos ciclos menstruais de
mulheres que convivem no mesmo ambiente.
Evidências crescentes são sugestivas de que o alto grau de polimorfismo dos
genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) influencia no odor e no
acasalamento preferencial em camundongos domésticos e em humanos (PEN e
POTTS, 1999). Pesquisadores sugerem que o extraordinário polimorfismo observado
nos locos do MHC seja mantido por uma seleção balanceadora que poderia estar
atuando através de mecanismos associados a doenças infecciosas (APANIUS et al.,
1997).
A escolha preferencial de parceiros dependente do MHC atuaria favorecendo
combinações MHC heterozigotas nos descendentes, proporcionando um aumento da
resistência para doenças infecciosas. Existem estudos que associam o aumento do
número de genes MHC em heterozigose com o aumento da resistência ao vírus HIV
(CARRINGTON et al., 1999). A heterozigosidade permitiria expressar uma maior
variedade de moléculas HLA, que dessa forma teriam maior capacidade de
apresentação de peptídeos antigênicos para os linfócitos do sistema imune.
Outra hipótese considerada é de que a seleção sexual dependente do MHC
permitiria ao hospedeiro atuar como um “alvo-móvel” contra as parasitas que evoluem
rapidamente e se adaptam aos genótipos MHC do hospedeiro (PEN e POTTS, 1999).
11
O princípio de “alvo-móvel” se refere à prole do hospedeiro que sempre possuirá
genótipo distinto de seus progenitores. A cada nova geração descendente do progenitor
ou hospedeiro inicial existiriam genótipos MHC distintos , impedindo dessa forma que
os parasitas que se adaptaram ao sistema imune dos progenitores possam se disseminar
por toda a população.
Outra hipótese evolutiva para explicar a existência de uma escolha
preferencial de parceiros baseada no genótipo MHC é conhecida como inbreeding
avoidance hypotesis (PEN e POTTS, 1999). O endocruzamento em camundongos
domésticos tem um efeito extremamente negativo sobre a adaptatividade (MEAGHER
et al., 1999). Assim um sistema que permitisse evitar esse tipo de cruzamento seria
extremamente vantajoso. Existem estudos que evidenciam que certos odores são
utilizados para reconhecimento de parentesco em roedores (PORTER et al., 1981).
Existem várias modelos teóricos que tentam explicar como o MHC
influenciaria na produção do odortipo:
• Hipótese da molécula MHC – Por essa hipótese, as moléculas MHC ou
fragmentos destas moléculas seriam diretamente responsáveis pela formação do
“odortipo” em humanos e ratos (SINGH et al., 1987; ROSER et al., 1991). No
entanto, experimentos posteriores não corroboram essa hipótese. No
experimento realizado por SINGER et al. (1993), foi retirada a parte protéica da
urina de ratos e, mesmo assim, os ratos continuaram a perceber odores MHC
específicos. Outras evidências contra essa hipótese provêm dos estudos de
BROWN et al. (1997) que demonstraram que ratos não identificam o odor de
moléculas MHC de classe I purificadas da urina.
• Hipótese da molécula carreadora – Segundo PEARSE-PRATT et al. (1992),
as regiões apresentadoras de antígenos das moléculas MHC são transformadas
em moléculas carreadoras de substâncias voláteis. As moléculas voláteis,
segundo BROWN (1995), teriam origem em bactérias comensais do intestino e
seriam transportadas para a urina (ex: ratos) ou para o suor (humanos). Essa
hipótese não contradiz aquela proposta por SINGER et al. (1993), uma vez que
as moléculas MHC presentes na urina não formariam os odores corporais, e sim
12
atuariam apenas no transporte de moléculas odoríferas. Essa hipótese, porém,
não explicaria como a região de ligação de peptídeo da molécula MHC, que
apresenta uma conformação hidrofílica e sítio de ligação a peptídeos simples,
adquiriria uma conformação hidrofóbica com sítio de ligação para moléculas
aromáticas mais complexas.
• Hipótese do peptídeo – Muitas evidências são sugestivas de que os feromônios
são transportados por proteínas carreadoras até as glândulas odoríferas
(SPIELMAN et al., 1995). SINGER et al. (1997) sugeriram que as moléculas
MHC poderiam estar atuando no transporte de peptídeos e/ou metabólitos
voláteis para serem processados nas glândulas odoríferas e formar o odor
corporal do indivíduo. O MHC atuaria ligando-se de forma alelo-específico a
determinados peptídeos, que seriam então devidamente processados para
produção de metabólitos voláteis responsáveis pelo odor. Depois de realizado o
transporte, as proteínas MHC presentes nas secreções não fariam parte do
conjunto de moléculas responsáveis pelo odortipo, não contrariando os
resultados observados no experimento realizado por SINGER et al. (1993).
• Hipótese da microflora – Através da sua atuação imunológica, as moléculas
MHC poderiam atuar sobre a microflora, definindo dessa forma uma população
alelo-específico de microorganismos comensais que estariam produzindo
odores (HOWARD, 1977). Nos ratos, os odores da urina são influenciados por
microorganismos presentes na glândula prepucial e próximos à cavidade
genital. Experimentos realizados por NINOMIYA e BROWN (1995)
demonstraram que as fêmeas não eram atraídas pelo macho MHC diferente
quando sua glândula prepucial era removida. Outro estudo favorável a essa
hipótese foi realizado por SCHELLINCK et al. (1995), no qual as fêmeas de
ratos não rejeitavam a urina de outros ratos MHC-similares mantidos em
ambiente estéril.
• Hipótese da microflora e do peptídeo – Essa hipótese seria uma unificação
entre a hipótese da microflora e a hipótese do peptídeo, cujo argumento seria
que moléculas MHC se ligariam de forma alelo-específico a determinados
13
peptídeos que seriam transportados dessa maneira até regiões habitadas por
microorganismos comensais (ex: glândula prepucial, as glândulas sudoríparas,
entre outras localidades). Assim, após o transporte esses peptídeos seriam
transformados em moléculas aromáticas voláteis (PENN e POTTS, 1998). Essa
hipótese é considerada muito importante, pois explicaria porque ratos criados
em ambientes estéreis tem a capacidade olfativa alterada em reconhecer odores
de ratos MHC-similares (YAMAZAKI et al., 1990).
Uma importante característica da região MHC que vem sendo atualmente
referenciada é a presença de clusters de genes de receptores olfatórios (OR) próximos
ao MHC clássico, numa região denominada como Complexo Principal de
Histocompatibilidade estendido ou MHCx. Os estudos focados nessa região
investigam a existência do desequilíbrio de ligação entre genes OR e os genes HLA.
Também existe uma procura por polimorfismos nos genes OR. Tais achados podem
ser sugestivos de um importante papel biológico relacionando haplótipos de genes OR
e genes MHC clássicos com hábitos comportamentais, como por exemplo, na escolha
preferencial de parceiros baseada no genótipo MHC.
Além da escolha preferencial, a região estendida do MHC parece estar
envolvida com outras características comportamentais, como o tabagismo. BERGEN
et al. (1999) realizaram estudos de varredura por marcadores moleculares no genoma
humano para o hábito de fumar e encontraram importantes marcadores no
cromossomo 6, próximos à região do Complexo Principal de Histocompatibilidade
(MHC).
FÜST et. al. (2004), baseado no estudo anterior, pesquisou a incidência de
certos haplótipos HLA e o hábito de fumar, encontrando associações significativas
para freqüência de certos alelos de genes da região do MHC de classe III. No entanto,
provavelmente os receptores olfatórios localizados próximos ao MHC sejam os
verdadeiros fatores envolvidos na dependência ao cigarro (FÜST et. al., 2004).
14
FIGURA 5 – MECANISMOS DE COMO O MHC ATUARIA NA FORMAÇÃO DO
“ODORTIPO”
FONTE: MENGARELLI, R. R. MHC E OLFATO. Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em
Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Paraná. Orientador: Maria da Graça Bicalho,
2005.
15
2.1.2. MHC Estendido (MHCx)
A necessidade e o desejo de melhorar as taxas de sucesso nos transplantes
motivaram um grande número de estudos que permitiram um detalhamento minucioso
da região MHC. Esses esforços para caracterizar essa região em diversas espécies de
vertebrados resultaram, em 1993, no mapa do MHC humano (CAMPBELL e
TROWSDALE, 1993).
Posteriormente, em 1999, o seqüenciamento do cromossomo 6 forneceu o
primeiro mapa baseado nas técnicas de seqüenciamento de DNA (THE MHC
SEQUENCING CONSORTIUM, 1999). No entanto, a região MHC seqüenciada
nesses estudos era derivada de diversos indivíduos de tipos HLA desconhecidos,
gerando dessa forma um mosaico de genótipos possíveis, que seria uma representação
virtual de haplótipos MHC (HORTON et al., 2004).
Outras evidências, tais como a existência de um alto grau de desequilíbrio de
ligação, a sintenia gênica conservada em diversas espécies de mamíferos e a presença
de genes MHC relevantes estendendo-se para fora da região MHC clássica permitiram
concluir que essa região seria bem maior do que aquela definida pelos mapas genéticos
elaboradas até 1999. Em 2003, após o seqüenciamento completo do cromossomo 6, foi
definida uma nova região de 7,6Mb no braço curto desse cromossomo como sendo o
mapa do MHC estendido (HORTON et al., 2004) (Figura 6).
Como característica principal, o MHCx apresenta diversos genes que sofreram
um processo de duplicação gênica. O processo de duplicação originou a formação de
diversos agrupamentos (clusters) gênicos, principalmente de genes relacionados à
reposta imune. Seguindo a definição apresentada no trabalho publicado por HORTON
et al. (2004), o MHCx é constituído por 6 clusters e 6 superclusters:
• Histones superclusters: histonas são proteínas básicas envolvidas na
formação dos nucleossomos. São 66 locos gênicos, 55 expressos e 11
pseudogenes, representando o maior cluster de genes de histonas do
genoma humano e o maior supercluster codificador de proteína dentro do
MHCx.
16
• Solute carrier cluster: carreadores de solutos são genes que fazem parte de
uma família diversa que não são bem compreendidas, mas que
desempenham um papel fisiológico crucial no transporte de solutos e
nutrientes.
• HLA class I supercluster: esse cluster é formado basicamente pelos
mesmos locos gênicos que forma a região de classe I no MHC clássico
mais o gene HFE (Hemocromatose).
• tRNA supercluster: os genes que codificam para os tRNAs são formados
por apenas 75-90 pares de bases e são cruciais na síntese protéica. Esse
supercluster presente no MHCx constitui o maior do genoma humano,
contendo 157 genes tRNA, codificando para todos os principais
aminoácidos, exceto para Asparagina e Cisteína.
• Butyrophilin supercluster: os genes da Butirofilinas (BTN) são membros da
superfamília das imunoglobulinas e apresentam uma notável similaridade
com outros locos do MHCx. O papel biológico dos genes BTN não foi
definido ainda.
• Vomeronasal-receptor cluster: os genes de receptores olfatórios do órgão
vomeronasal são membros da família de receptores de feromônios, que
estão envolvidos na percepção inconsciente de substâncias voláteis como
os feromônios. Esse cluster apresenta exclusivamente pseudogenes,
possivelmente devido a perda gradativa dessa via nos seres humanos.
• Olfactory receptor supercluster: esse cluster contém 34 locos gênicos,
sendo que 14 desses são potencialmente funcionais. Similar aos genes
envolvidos com a reposta imune, esses genes apresentam uma ferramenta
essencial nos processos comportamentais, como na reprodução e caça.
Também em comum com os genes da reposta imune, os genes OR
apresentam um alto grau de polimorfismo.
• Zinc-finger supercluster: as proteínas que compõem esse grupo podem
exercer diversas funções biológicas: enzimas, proteínas de armazenamento,
proteínas da replicação e fatores transcripcionais. As diversas proteínas
17
desse cluster são agrupadas não pela sua similaridade, mas sim devido à
presença de certos domínios estruturais.
• Tumor necrosis factor cluster: esse agrupamento contêm genes de 3
citocinas: TNF (Fator de necrose tumoral), LTA (Linfotoxina α) e LTB
(Linfotoxina β).
• Lymphocyte antigen cluster: apresentam genes de antígenos linfocitários 6
(LY), que codificam as proteínas de superfície celular ancoradas ao
glicosil-fosfatidil-inusitol.
• Heat shock cluster: genes que codificam para as proteínas de choque
térmico são expressos durante estresse celular como, por exemplo, o
choque térmico. Essas proteínas podem desempenhar várias funções. Os
três genes desse cluster participam da resposta imune, mediando a
eliminação de células danificadas, infectadas ou malignizadas.
• HLA class II cluster: esse cluster é formado basicamente pelos mesmos
locos gênicos que forma a região de classe II no MHC clássico.
Outra característica importante do MHCx é que muitos agrupamentos podem
estar sendo mantidos ligados pelo processo evolutivo. No caso dos genes envolvidos
na resposta imune, seria uma forma de organizar a co-expressão de genes que atuem
numa mesma via (HORTON et al., 2004). Outra forma de manutenção da ligação
genética seria entre os genes HLA de classe I e sua proximidade com genes de tRNA.
Como os genes de tRNA são altamente expressos, os genes MHC de classe I,
expressos por todas as células nucleadas, estariam aproveitando da alta taxa de
transcrição dessa região para aumentar a sua própria expressão.
18
FIGURA 6 – MAPA GÊNICO DO MHC ESTENDIDO
FONTE: HORTON, R.; WILMING, L.; RAND, V.; LOVERING, R. C.; BRUFORD, E. A.;
KHODIYAR, V. K.; LUSH, M.J.; POVEY, S.; TALBOT, C.C. JR.; WRIGHT, M.; WAIN,
H. M.; TROWSDALE, J.; ZIEGLER, A.; BECK, S. Gene map of the extended human
MHC. Nature Reviews Genetics, London, v.5, n.12, p.889-899, 2004.
19
2.1.2.1. Genes de receptores olfatórios ligados ao MHC
A descrição de genes de receptores olfatórios ligados ao MHC humano foi
primeiramente realizada por FAN et al. (1995). Os genes OR foram mapeados no
braço curto do cromossomo 6 (Figura 7). Esse cluster de receptores olfatórios é
formado por aproximadamente 4,5Mb de seqüências genômicas contíguas (The MHC
Sequencing Consortium, 1999).
FIGURA 7 – OS GENES DE RECEPTORES OLFATÓRIOS LIGADOS AO MHC
FONTE: Adaptado de: EHLERS, A.; BECK, S.; FORBES, S. A.; TROWSDALE, A. V.; YOUNGER,
R.; ZIEGLER, A. MHC-linked olfactory receptor loci exhibit polymorphism and contribute
to extended HLA/OR-haplotypes. Genome Research, New York, v.10, n.12, p.1968-1978,
2000.
NOTA: A nomenclatura oficial (HUGO) para os genes de receptores olfatórios humanos difere da
figura original. Os nomes em destaque amarelo não foram identificados no GenBank como
os genes citados na coluna a sua esquerda.
Nomenclatura
da Figura
Nomenclatura
Oficial
hs6M1-10 OR2B2
hs6M1-33P OR2W6P
hs6M1-32 OR2B6
hs6M1-34P OR2W4P
hs6M1-30P OR2W2P
hs6M1-31P OR2B7P
hs6M1-29P OR2B8P
hs6M1-35 OR1F12
hs6M1-9P OR2E1P
hs6M1-8P OR2AD1P
hs6M1-15 OR2W1
hs6M1-26P OR2P1P
hs6M1-1 OR2B3
hs6M1-4P OR2J1
hs6M1-3 OR2J3
hs6M1-2P OR2N1P
hs6M1-6 OR2J2
hs6M1-5P OR2J4P
hs6M1-7P OR2H4P
hs6M1-25P OR2G1P
hs6M1-24P OR2U1P
hs6M1-23P OR2U2P
hs6M1-22P OR2B4P
hs6M1-28 OR14J1
hs6M1-21 OR5V1
hs6M1-27 OR12D3
hs6M1-20 OR12D2
hs6M1-19P OR12D1P
hs6M1-18 OR11A1
hs6M1-17 OR10C1
hs6M1-16 OR2H1
hs6M1-14P OR2I1P
hs6M1-13P OR2H5P
hs6M1-12 OR2H2
20
O cluster de receptores olfatórios ligados ao MHC pode ser dividido em duas
sub-regiões segundo YOUNGER et. al.(2001): um agrupamento principal (major) e
outro agrupamento secundário (minor). O agrupamento principal tem
aproximadamente 800kb de extensão e é constituído por 25 locos de genes OR que são
expressos no MOE (Major Olfactory Epitelium), dos quais doze apresentam matrizes
de leitura aberta (open reading frame) e possivelmente são funcionais.
FIGURA 8 – DIAGRAMA REPRESENTATIVO DOS GENES DE RECEPTORES
OLFATÓRIOS LIGADOS AO MHC
Diagrama mostrando os agrupamentos (clusters) principal e secundário dos receptores olfatórios na
região estendida do MHC humano. A orientação utilizada é de telômero para centrômero. A letra “P”
indica pseudogene e os prefixos hs6M1- foram omitidos para melhor visualização (VOLZ et al.,
2003).
É interessante ressaltar que o desequilíbrio de ligação observado entre genes
OR e genes da região MHC na espécie humana também tem sido observado em outras
espécies evolutivamente distintas, como por exemplo, os camundongos. Esse fato
permite inferir uma provável interação entre essas duas classes de genes, e que
mecanismos evolutivos tenham direcionado a ligação dos genes OR com o MHC em
espécies distintas (ZIEGLER, DOHR e UCHANSKA-ZIEGLER, 2002)
21
2.2. RECEPTORES OLFATÓRIOS
Os genes de receptores olfatórios (OR), identificados em 1991 por Buck e
Axel, constituem a maior família gênica dos vertebrados. Tamanha diversidade pode
ser atribuída à necessidade de reconhecimento de milhões de odorantes. Esses genes
são desprovidos de íntrons em sua região codificante (BUCK e AXEL, 1991), porém,
existe um longo sítio de splicing na região 5’ não traduzida (GLUSMAN et al., 1996).
Os receptores olfatórios nos mamíferos são receptores acoplados à proteína G
pertencentes à Classe I ou A, juntamente com os receptores para opsinas e
catecolaminas (BOCKAERT e PIN, 1999). Essa classe de receptores constitui um dos
maiores grupos de receptores de membranas existentes. Esses receptores reconhecem
diversos tipos de ligantes: fótons, odorantes, nucleotídeos, nucleosídeos, peptídeos,
lipídios e proteínas. Os receptores acoplados à proteína G podem ser agrupados em 6
tipos ou famílias e não apresentam similaridade de seqüências entre os grupos. No
entanto, todos os grupos desses receptores apresentam um domínio central constituído
de sete domínios transmembrana (TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 e TM7) unidos
por “alças” (loops): três domínios intracelulares (i1, i2 e i3) e três domínios
extracelulares (e1, e2 e e3) (BALDWIN, 1993).
Existem três famílias principais que podem ser reconhecidas comparando suas
seqüências de aminoácidos: família 1, família 2 e família 3. As outras famílias não
compartilham muitas similaridades entre as suas seqüências, demonstrando um
exemplo de convergência molecular. Dentre as famílias apresentadas, a família 1, a
família 3 e a família 4 constituem os grupos em que estão classificados os receptores
olfatórios encontrados no MOE e no Órgão Vomeronasal (VNO).
Através das análises do seqüenciamento de 93% do genoma humano
(PROJETO GENOMA HUMANO) foram descobertos por MALNIC et al. (2004) 636
genes candidatos a OR. O método utilizado na busca de genes candidatos OR foi a
busca das seqüências do genoma humano depositadas no banco do NCBI (National
Center for Biotechnology Information) utilizando a ferramenta TBLASTN. Essa
ferramenta permite buscar por seqüências traduzidas em proteínas do banco de dados
de seqüências do NCBI, digitando uma seqüência protéica de interesse. Através desse
22
método, os pesquisadores buscaram as seqüências dos motivos conservados nos OR,
como o domínio transmembrana 3 (MAYDRYVAIC) e suas variantes
(MALDRYVAIC e MAFDRYVAIC) e o domínio transmembrana 6 (KAFSTCASH).
Outras sete seqüências de OR de rato distintas também foram usadas na busca
por possíveis seqüências de genes OR no banco de dados de seqüências do genoma
humano. Em seguida, após esgotar a busca por todo o banco de dados, as seqüências
escolhidas foram analisadas utilizando-se o programa ORF Finder
(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Através desse programa, as seqüências
nucleotídicas foram traduzidas para obter a proteína codificada por elas. Para decidir
quais eram seqüências de genes OR foram escolhidas aquelas que apresentavam uma
região codificante de aproximadamente 1kb (quilobase) de comprimento e que
continham ao menos 4 motivos (GN; MAYDRYVAIC, KAFSTCASH e PMLNPFIY)
ou suas variantes em posições apropriadas.
Pela análise da matriz de leitura dos 636 OR, 339 destes foram considerados
codificantes de receptores funcionais. O critério empregado para realizar a
interpretação se uma seqüência codifica ou não um produto funcional foi baseado na
presença de motivos considerados funcionais na seqüência protéica e que são
conservados na maioria dos OR. Fragmentos pequenos de genes OR foram
considerados como pseudogenes e não foram incluídos na análise.
Em ratos, menos de 5% dos genes OR encontrados são classificados como
pseudogenes (ROUQUIER et al., 1998). Estudo com primatas do continente
Americano e do Africano permitiram investigar a proporção de pseudogenes para
receptores olfatórios em seus respectivos genomas. Os pesquisadores compararam essa
percentagem entre os vários primatas analisados. Os primatas que apresentavam os
genes que permitiam a formação da visão tricromática apresentaram número
significativamente alto de pseudogenes OR (GILAD et al., 2004). Ambos os estudos,
com roedores e primatas, permitem especular que durante a evolução pode ter ocorrido
uma perda de importância do sentido olfatório nos humanos.
23
2.2.1. Distribuição Cromossômica dos Genes de Receptores Olfatórios no Genoma
Humano
MALNIC et al. (2004) confirmaram que os genes de receptores olfatórios são
encontrados em agrupamentos (clusters) por todo genoma, o que também havia sido
observado em outros estudos anteriores (ROUQUIER et al., 1998). MALNIC et al.
(2004) localizaram 51 grupamentos diferentes, distribuídos em 21 cromossomos
(Figura 10). Os cromossomos 8, 20 e o Y não apresentam genes OR.
Existe uma grande variação no número de genes nos grupamentos OR,
podendo variar de 1 até 116. Também existe uma grande variação do número de genes
OR encontrados em um determinado cromossomo, variando de 0 até 318 (MALNIC et
al., 2004).
A composição dos tipos de família e subfamília de genes OR dentro de todos
os agrupamentos estudados é única, sendo que 42% dos mesmos codificam para
apenas um tipo de subfamília de genes OR. Essa organização de genes sustenta a idéia
de que certos locos OR, até certo ponto, estão envolvidos na detecção de classes
distintas de odorantes.
MALNIC et al., 1999 bem como KAJIYA et al., 2001, observaram que
proteínas OR que possuem 60% ou mais de homologia entre suas seqüências de
aminoácidos, reconhecem odorantes com estruturas relacionadas.
2.2.2. Produto protéico dos receptores olfatórios
Os receptores olfatórios são proteínas que apresentam sete domínios
transmembrana e fazem parte da família de receptores acoplados à proteína G. Os
domínios transmembranas são separados por 3 alças (loops) extracelulares e 3 alças
intracelulares. A extremidade aminoterminal está localizada no meio extracelular e a
extremidade carboxiterminal se apresenta no meio intracelular (Figura 9).
24
FIGURA 9 – EXEMPLO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA DOS RECEPTORES
OLFATÓRIOS
FONTE: BUCK, L.; AXEL, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular
basis for odor recognition. Cell, Cambridge, v.65, n.1; p.175-187, 1991.
NOTA: Essa figura apresenta uma proteína determinada como receptor olfatório. A proteína atravessa
a membrana plasmática sete vezes, tendo sua ponta aminoterminal localizada no meio
extracelular e sua extremidade carboxiterminal localizada no meio intracelular. Os cilíndros
verticais delimitam os sete motivos estruturais α hélices que atravessam a membrana.
Aminoácidos represenados por círculos pretos demonstram uma maior variabilidade entre as
seqüências de outros OR comparadas.
Análise de múltiplas seqüências de proteínas OR alinhadas permitiu formular
a hipótese de que, possivelmente, as regiões entre o segundo e o sexto domínio
transmembrana formem a região de ligação à molécula odorífera. As seqüências de
genes OR nos mamíferos apresentam grande diversidade nessas regiões de ligação ao
odorante.
Utilizando o critério de GLUSMAN et al. (2000), genes OR que apresentem
40% ou mais de identidade na seqüências de aminoácidos do polipeptídeo
correspondente, são considerados membros da mesma família. Genes OR que
apresentam identidade na seqüência de aminoácidos entre si igual ou superior a 60%
são considerados de mesma sub-família.
FIGURA 10 – LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DE GENES OR HUMANOS
FONTE: MALNIC, B.; GODFREY, P. A.; BUCK, L. B. The human olfactory receptor gene family. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, v.101, n.8, p.2584-2589, 2004.
NOTA: Seiscentos e trinta genes de receptores olfatórios foram localizados em 51 locos cromossômicos diferentes distribuídos por 21 cromossomos
humanos. Locos contendo um ou mais genes OR intactos estão indicados em vermelho; locos contendo apenas pseudogenes são indicados em
verde. A posição citogenética de cada loco é mostrada à esquerda e sua distância em megabases do extremo do braço curto é mostrado à direita
(cromossomo-Mb). O número de genes OR em cada loco é indicado entre parênteses e o número de genes OR em cada cromossomo é indicado
abaixo.
26
2.2.3. Nomenclatura dos Genes OR em humanos
A padronização da nomenclatura dos genes de receptores olfatórios foi
necessária, principalmente para auxiliar na denominação e posterior intercâmbio de
dados das inúmeras seqüências descobertas e analisadas.
Muitas propostas foram sendo apresentadas para nomear as várias seqüências
de genes OR que vem sendo descritas (ex: HGMP07E, R2C4, HPFH1OR, HSOLFMF,
OR17-2, OLFR89, ZF2A, SCor35, gen147, entre outros).
Dentre as nomenclaturas utilizadas, duas são consideradas mais importantes
para entendimento dos trabalhos citados na área de estudo dos receptores ligados ao
MHC. O sistema proposto por EHLERS et al. (2000) utiliza um prefixo “hs” (para
referir-se ao Homo sapiens), seguido pelo número indicando o cromossomo em que
essa seqüência nucleotídica se encontra, pela letra M ou V (M indicando gene
relacionado ao sistema olfatório principal, V indicando gene relacionado ao órgão
vomeronasal), e o algarismo referente ao loco gênico. A letra “P” ao final do nome
representa que essa seqüência nucleotídica trata-se de um pseudogene.
A outra nomenclatura, a qual foi aprovada pelo HUGO (Gene Nomenclature
Committee), é baseada em um sistema utilizando a classificação em famílias e sub-
famílias. A nomenclatura consiste do símbolo OR, seguido por um algarismo
representativo da família, uma letra representando a sub-família e um algarismo
significando o gene individual dentro da sub-família. Por exemplo, “OR3A1” é a
denominação utilizada para o gene de receptor olfatório da família 3, sub-família A,
gene 1 da sub-família A. Outro exemplo que pode ser utilizado é a designação
“OR7E12P” para o pseudogene (representado pela letra “P” ao final da nomenclatura)
do receptor olfatório da família 7, sub-família E, pseudogene 12 da sub-família E.
27
2.2.4. Transdução de Sinal Mediada pelos Receptores Olfatórios
Os receptores olfatórios de mamíferos funcionam como receptores acoplados à
proteína G. A ligação de um determinado odorante a seu receptor específico
desencadeia a interação com uma proteína ligante de GTP (G
s
(olf)). Essa interação
libera a sub-unidade α da proteína G, a qual estimula a adenilato ciclase a produzir
níveis elevados de AMP cíclico. O aumento do AMP cíclico abre canais de cátions
dependentes de nucleotídeos cíclicos. Essa abertura de canais de cátions leva à uma
alteração no potencial de membrana, gerando impulsos elétricos.
FIGURA 11 – TRANSDUÇÃO DE SINAL MEDIADA PELOS RECEPTORES
OLFATÓRIOS
FONTE: BUCK, L.; AXEL, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular
basis for odor recognition. Cell, Cambridge, v.65, n.1; p.175-187, 1991.
2.2.5. Sistemas Quimiossensoriais e ReceptoresOlfatórios
Neurônios especializados, localizados em determinadas regiões anatômicas
(SISTEMAS QUIMIOSSENSORIAIS), identificam partículas odoríferas
(ODORANTE) presentes no ambiente. As interações entre a molécula de odor e seus
respectivos receptores, ativam determinadas vias de transdução de sinal que ocasionam
a despolarização do neurônio, gerando impulsos elétricos que são transmitidos até o
cérebro.
28
São dois os principais sistemas quimiossensoriais envolvidos no sentido do
olfato em mamíferos (figura 12): o epitélio olfatório principal (MOE) e o órgão
vomeronasal (VNO).
FIGURA 12 – SISTEMAS QUIMIOSSENSORIAIS ASSOCIADOS AO SENTIDO
DO OLFATO
FONTE: FRINGS, S. Infoseite Zoophysiologie. Disponível em: <http://www.sinnesphysiologie.de/
olf/olf02al.jpg>. Acesso em: 16/09/06.
NOTA: Ilustração representando o epitélio olfatório (onde está localizado o MOE) e o órgão
vomeronasal.
Os neurônios sensitivos do órgão vomeronasal projetam seus axônios para o
bulbo olfatório acessório e outras regiões do cérebro, incluindo a parte anterior do
hipotálamo. Essa região do cérebro controla o sistema neuro-endócrino responsável
por aspectos do comportamento e da fisiologia reprodutiva (BARTOSHUK e
BEAUCHAMP, 1994; MONTI-BLOCH et al., 1994).
O órgão vomeronasal humano (VNO) consiste de duas pequenas bolsas de
2mm de profundidade, cerca de 1cm a partir das narinas, abrindo-se em pequenas
cavidades ocas com pequenos orifícios em seus centros, de cerca de 0,1 mm de
29
distância. Esse órgão quimiossensorial está associado com a detecção de determinadas
moléculas não voláteis denominadas feromônios.
Os feromônios são compostos simples e de peso molecular relativamente
baixo. Analisando a estrutura dessas moléculas verifica-se a existência de uma
composição muito diversificada, variando a sua natureza com as diferentes espécies.
Os feromônios já foram identificados sob as formas de derivados de ácidos graxos ou
terpenos, álcoois, acetatos, hidrocarbonetos (freqüentemente insaturados, com uma ou
duas ligações duplas), substâncias aromáticas com grupos funcionais diversos, entre
outras.
Os feromônios são moléculas que induzem mudança de comportamento, e
geralmente estão associadas a comportamento sexual e à demarcação de território.
Uma característica importante dessas moléculas é que elas são liberadas externamente
e têm atividade sobre indivíduos da mesma espécie. Alguns pesquisadores, como J. B.
S. Haldane (WILSON, 1985), consideram os feromônios como os precursores dos
hormônios.
O epitélio olfatório principal está situado na parte distal da cavidade nasal,
sendo a região no qual estão localizados neurônios sensitivos do olfato. A detecção de
moléculas voláteis é função dos neurônios localizados nessa região. WANG et al.,
2003, encontraram evidências de que cada neurônio expressa apenas um tipo de
receptor olfatório codificado por um dentre um vasto repertório de genes OR. Esses
neurônios parecem estar distribuídos ao acaso pelo epitélio olfatório principal
(RESSLER, SULLIVAN e BUCK, 1994; VASSAR et. al., 1994; MOMBAERTS et
al., 1996).
Os grupos de axônios dos neurônios sensitivos presentes no MOE se reúnem
no interior do bulbo olfatório, formando estruturas denominadas de glomérulos.
RESSLER, SULLIVAN e BUCK, (1994); VASSAR et al. (1994); MOMBAERTS et
al. (1996), observaram em seus estudos que neurônios expressando o mesmo receptor
olfatório, projetam seus axônios para os mesmos glomérulos no bulbo olfatório. Outro
aspecto importante sobre o bulbo olfatório é que as regiões envolvidas na percepção de
30
certos odores são iguais em vários indivíduos, fundamentando a existência de um
mapa sensorial.
MALNIC et al. (1999) realizaram estudos combinando técnicas de imagem da
concentração de cálcio intracelular e Reverse Transcription-PCR para cada tipo de
neurônio sensitivo a ser estudado. As imagens da concentração de Ca++ intracelular
permitiram analisar a ativação de mecanismos de transdução de sinal pelos receptores
olfatórios expressos por esses neurônios quando expostos a determinadas moléculas.
Enquanto isso, a técnica de RT-PCR permitiu observar qual gene e alelo OR do
genoma estava sendo expresso pelos neurônios estudados. Nesses experimentos foram
testados vários genes OR de camundongos frente às moléculas semelhantes em
estrutura química, porém que proporcionassem “percepção” de odores bem diferentes.
Um exemplo citado no experimento é o caso das moléculas de ácido carboxílico e dos
álcoois alifáticos. Quando testados quanto à percepção olfativa, ambos os grupos
químicos, com o mesmo tamanho da cadeia carbono e variando apenas o grupo
carboxila para o ácido carboxílico, e hidroxila para o álcool alifático, apresentam
cheiros completamente diferentes. Os ácidos carboxílicos despertam sensações
desagradáveis, descritas como cheiros de suor, mofo e azedo. Já, os álcoois são
descritos como odores agradáveis, como essências florais, de ervas ou frutadas.
Os resultados obtidos por MALNIC et al. (1999) permitiram demonstrar que
estruturas químicas semelhantes contendo o mesmo número de carbonos em suas
cadeias, como no caso dos ácidos carboxílicos e os álcoois alifáticos, ativam os
mesmos receptores olfatórios. No entanto, os ácidos carboxílicos ativam também
outros receptores olfatórios não ativados pelas moléculas dos álcoois e vice-versa.
Possivelmente a distinção entre moléculas tão semelhantes ocorre pela criação de
códigos de ativação dos receptores olfatórios expressos pelo indivíduo. Dessa forma,
uma molécula poderia ativar mais de um receptor e um receptor poderia ser ativado
por mais de uma molécula. No entanto, cada molécula ativa apenas certa combinação
de receptores olfatórios. O padrão de estímulos dos neurônios sensitivos gera um
algoritmo complexo que o cérebro é capaz de interpretar e traduzir numa sensação.
31
FIGURA 13 – EXEMPLO DE COMO SÃO FORMADOS OS CÓDIGOS PARA
ODORANTES ATRAVÉS DA COMBINAÇÃO DOS RECEPTORES
OLFATÓRIOS
FONTE: MALNIC, B.; HIRONO, J.; SATO, T.; BUCK, L. B. Combinatorial receptor codes for odors.
Cell, Cambridge, v.96, n.5, p.713-723, 1999.
NOTA: Os receptores coloridos são os que reconhecem o odorante a sua esquerda. A identificação das
diferentes moléculas odoríferas é feita pela interpretação dos distintos códigos de receptores
olfatórios ativados. Diferentes moléculas podem ativar o mesmo neurônio e a mesma molécula
pode ativas mais de um neurônio
.
Nesse mesmo experimento, além da comparação da ativação de neurônios por
parte de moléculas com estruturas químicas altamente relacionadas, foram analisadas e
comparadas as variações na concentração das mesmas moléculas e o padrão de
ativação dos neurônios sensitivos. Os mesmos foram testados para verificar se ocorria
ativação com uma concentração de 100µM da molécula teste. Caso fosse detectada
ativação, o teste era refeito com uma concentração de 10µM até 1µM.
Segundo os resultados, as sensibilidades dos diversos receptores olfatórios
para a mesma molécula variavam com a concentração. Por exemplo, numa
concentração “X” era ativado um número “Y” de neurônios. Quando a concentração
baixava para 1µM da molécula teste, apenas uma pequena parte dos neurônios
anteriores eram ativados. Dessa forma, dependendo da concentração da molécula do
32
odorante, existia uma variação nos tipos de receptores olfatórios ativados, o que
resultava num código distinto para o cérebro interpretar. Um exemplo interessante é o
indol, que em altas concentrações apresenta um odor pútrido, no entanto, quando
diluído, essa mesma molécula apresenta um aroma floral.
33
3. OBJETIVOS GERAIS
Como parte de um trabalho colaborativo e complementar àquele realizado por
EHLERS et al. (2000) do grupo de pesquisa Institut für Immungenetik, Charité,
Universidade Livre de Berlim, o objetivo geral é caracterizar os genes OR2I1P,
OR12D3, OR14J1, OR2B4P, OR2E1P, OR1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P,
OR2W4P, OR2B6 e OR2W6P nas 10 linhagens celulares humanas a seguir
relacionadas: BM28.7, BM19.7, LG2, KR3598, H2LCL, WT51, SA, YAR, OLGA e
AMAI.
Esses resultados juntamente com aqueles obtidos por EHLERS et al. (2000)
possibilitarão uma melhor caracterização da região do MHCx onde situam-se os
clusters de genes OR.
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Implantar e avaliar a eficácia da técnica de seqüenciamento de genes OR em
linhagens celulares para obtenção de genótipos de referência, sem
ambigüidades de tipagem, e que possam fundamentar futuros estudos
relacionados aos genes OR;
• Investigar a existência de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) nos genes
OR através da técnica de seqüenciamento;
• Comparar e comentar nossos resultados com aqueles obtidos por EHLERS et
al. (2000).
34
4. JUSTIFICATIVA
O presente trabalho justifica-se pelo crescente número de artigos relacionando
os receptores olfatórios com a biologia comportamental e evolutiva. São várias as
hipóteses que associam o sentido do olfato e o reconhecimento de indivíduos
aparentados (PORTER et al., 1981), escolha preferencial de parceiros baseados no
genótipo MHC (JACOB et al., 2002; OBER et al., 1997; PEN e POTTS, 1999;
SANTOS et al., 2005; WEDEKIND et al., 1995 YAMAZAKI et al., 1976), seleção
em nível de gametas (Sperm Receptor Selection) (ZIEGLER, DOHR e UCHANSKA-
ZIEGLER, 2002), além de outras influências comportamentais, como uma possível
tendência ao hábito tabagista associada a certos haplótipos HLA (FÜST et al., 2004).
No entanto, faltam algumas informações sobre os genes OR situados no MHCx, tais
como a presença de polimorfismos e outras características gênicas estruturais
relacionadas a seqüências reguladoras, entre outras. Dessa forma, o presente trabalho,
que pretende investigar e caracterizar os genes OR, reveste-se de uma grande
importância pelo potencial de obtenção de dados e informações que se somarão
àquelas já obtidas pelo grupo de pesquisa do Institut für Immungenetik, Charité,
Universidade Livre de Berlim, contribuindo para um melhor entendimento do papel
biológico que os genes OR possam exercer.
35
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Foram utilizadas dez linhagens celulares humanas, de diversos grupos raciais e
étnicos e com diferentes haplótipos HLA (Tabela 1). Essas linhagens foram fornecidas
gentilmente pelo Institut für Immungenetik, Charité, Universidade Livre de Berlim,
tendo sido utilizadas por EHLERS et al. (2000) para investigação de polimorfismo em
genes OR situados no MHCx.
Oito dessas linhagens são homozigotas para os genes HLA clássicos. As
linhagens BM19.7 e BM28.7 são HLA hemizigotas, oriundas de uma única célula
diplóide. As duas linhagens hemizogotas foram produzidas pelo Institut für
Immungenetik, Charité, através de radiação gama, seguido de seleção com anticorpos
monoclonais produzidos contra certas especificidades HLA (SPRING et al., 1985).
A linhagem BM28.7, que possui a tipagem sorológica A1,-B35, Bw6, perdeu
parte do braço pequeno do cromossomo 6, incluindo o loco HLA-A. A linhagem
BM19.7, que possui a tipagem A2, B13, Bw4, perdeu um cromossomo 6 inteiro, sendo
haplóide para o cromossomo 6.
TABELA 1 - CARACTERÍSTICAS DAS LINHAGENS CELULARES PESQUISADAS
LINHAGENS CELULARES
CARACTERÍSTICAS
BM28.7 BM19.7 LG2 KR3598 H2LCL WT51 SA YAR OLGA AMAI
ETNIA NEGRO NEGRO CAUCASIANO CAUCASIANO CAUCASIANO CAUCASIANO JAPONES JUDEU AMERÍNDIO ALGERIANO
HLA
A1,
B35
A2,
B13
A2,
B27
A2,
B44
A3,
B7
A23,
B65
A24,
B7
A26,
B38
A31,
B62
A68,
B53
HAPLÓTIPO OR* 7 8 2 11 E 12 1 9 E 10 5 E 6 1 3 E 4 13
* Os haplótipos de genes OR citados nesta tabela correspondem aos encontrados no trabalho de EHLERS et al. (2000).
37
5.2 CULTIVO CELULAR E EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
Estas etapas foram realizadas pelo Institut für Immungenetik, Charité,
Universidade Livre de Berlim, Alemanha. As linhagens celulares foram replicadas em
meio RPMI 1640 contendo antibióticos e 10% de soro fetal bovino (EHLERS et al.,
2000). A extração de DNA das linhagens celulares foi realizada seguindo o protocolo
do “kit” comercial “Invisorb
®
Spin Blood Maxi Kit” da Invitek GmbH. O protocolo
está disponível no endereço eletrônico da empresa:
<http://shop.invitek.de/pimages/f7f956c9bfb0d4ef439a7285951eade1_Spin%20Blood
%20Maxi%200807.pdf>. (acesso no dia 08 de dezembro de 2007).
5.3. QUANTIFICAÇÃO DO DNA OBTIDO NA ETAPA DA EXTRAÇÃO
Para o uso do DNA extraído nas técnicas de PCR empregadas nos
experimentos, foi necessário o conhecimento da concentração e pureza deste material.
Para quantificar o DNA da amostra foi utilizada a leitura de absorbância (λ) através do
espectrofotômetro “Gene Quantpro RNA/DNA calculator” da Pharmacia Biotech.
5.4. SEQUENCIAMENTO DOS GENES DOS RECEPTORES OLFATÓRIOS
No estudo dos genes dos receptores olfatórios presentes no MHCx foram
analisados 12 (doze) locos gênicos, destacados na Figura 14 em vermelho. Esses locos
foram escolhidos para completar o estudo dos genes (em amarelo) que foram
investigados pelo grupo Institut für Immungenetik, Charité, Universidade Livre de
Berlim e cujos resultados se complementarão para melhor entendimento da
organização dos genes OR.
FIGURA 14 – GENES OR LIGADOS AO MHC ANALISADOS NESTE ESTUDO
NOTA: A figura representa o cromossomo 6 e a Tabela colorida os genes OR ligados ao MHC. Os genes analisados nesse estudo estão pintados de
vermelho e os genes analisados no trabalho de EHLERS et al. (2000) estão pintados de amarelo.
OR2H2
OR2H5P
OR2I1P
OR2H1
OR10C1
OR11A1
OR12D1P
OR12D2
OR12D3
OR5V1
OR14J1
OR2B4P
OR2U2P
OR2U1P
OR2G1P
OR2H4P
OR2J4P
OR2J2
OR2N1P
OR2J3
OR2J1
OR2B3
OR2P1P
OR2W1
OR2AD1P
OR2E1P
OR1F12
OR2B8P
OR2B7P
OR2W2P
OR2W4P
OR2B6
OR2W6P
OR2B2
39
5.4.1. Desenvolvimento dos Oligonucleotídeos Iniciadores (Primers) para os Genes
OR
Para desenvolver os iniciadores utilizados neste estudo, foram obtidas as
seqüências de genes OR presentes no banco de dados para receptores olfatórios
(HORDE) do Weizmann Institute of Science.
Em seguida, as seqüências nucleotídicas dos genes alvo foram utilizadas para
localizar os clones no Genbank do NCBI. As seqüências dos clones foram então
utilizadas para desenvolver os iniciadores com o uso do programa de computador
“Primer Select” v.5.03 da empresa DNASTAR.
A estratégia empregada no desenvolvimento dos iniciadores visou
compreender todas as regiões correspondentes aos domínios transmembranas das
proteínas para investigar a presença de polimorfismos (SNPs) nessas estruturas, uma
vez que estudos indicam sua participação na interação com o odorante (BUCK e
AXEL, 1991).
Os primers desenvolvidos foram verificados quanto à sua especificidade
utilizando a ferramenta BLASTN no site do NCBI. As seqüências nucleotídicas dos
iniciadores foram utilizadas para verificar se essas anelavam-se a outras regiões do
genoma humano. Apenas os iniciadores que não se anelaram a outras regiões foram
selecionados para realizar as reações de seqüenciamento.
TABELA 2 – RELAÇÃO DOS INICIADORES DESENVOLVIDOS
GENE OR
UPPER
PRIMER (5’
→
3’)
LOWER
PRIMER (5’
→
3’
OR1F12 CTGGCAAAAATATTTCATTCTCTGGGT GGAGAAGATTTTTCTTTGGCTTAGGGT
OR2B6 AGAAATACTTTGGTAATTATGAGCATT AAAAATAGGGCAACTTACAGAGAAG
OR2B7P CAACAAGAAAGAGACTGCAAAAACACC CTCAGCAGTCTTCTAGTGCACAAATGT
OR2B8P GGATGACACATGGAGAACGCATA CATGGCCATGTCTTGTACAAATGATA
OR2E1P ATAGAATGCTGTAGCAGATCTCAAAGG CTGTCTTCAGAACTTCTACCAACTCAG
OR2I1P GGTGATCATTCTGCCTACCGAGTGT AATACTTTCTCCCCTCCCCAACTACT
OR2W2P ATTAAGAATATGGTGTGCTCCTATCGC TAAGTATTCCCAAGTTCTGCCTCTGTA
OR2W4P TTGTCCCTACTAGCTATACAGATGATG TTTAAAAATCCAAGAATGTTTGATACA
OR2W6P TCTCTGCTATTCACAGGCATTCATCTT CCCCATCTCATTAAATGCCTCTTCAG
OR14J1 CTTTGGCTTCCTAAACAGAGTCACAC AACAATGCCTTTCATTTGTATGGTTC
OR12D3 GTGTTTCTTGAACCTACTACACTGCCT CTATTCTTCACACTGTTGCTCACCC
OR2B4PU GCTTCCTCCTACTGTTGATGTCTATCC TCAAACACATCTATCCTCGCTTCTTAG
40
5.4.2. Reação de Amplificação dos Genes OR (OR2I1P, OR12D3, OR14J1, OR2B4P,
OR2E1P, ORF1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W4P, OR2B6,
OR2W6P)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando-se os
componentes citados na Tabela 3 em microtubos de 200μl.
TABELA 3 – REAGENTES UTILIZADOS PARA REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO
Reagentes Volume/Quantidade
DNA molde 50ng
Tampão Taq 10X 5,0μl
MgCl
2
(50mM) 1,0μl
dATP (10mM) 0,2μl
dGTP (10mM) 0,2μl
dCTP (10mM) 0,2μl
dTTP (10mM) 0,2μl
Primer OR_U (10μM) 1,0μl
Primer OR_U (10μM) 1,0μl
Enzima Taq polimerase 0,2μl
Água (18,2MΩcm) q.s.p. 50μl
Os microtubos preparados com os reagentes foram submetidos às condições
apresentadas na Tabela 4 (no termociclador TC-512 da Techne).
TABELA 4 – CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NA PCR
N˚ DE CICLOS TEMPERATURA TEMPO
1 ciclo 96˚C 2 minutos
96˚C 30 segundos
61-57˚C* 30 segundos
20 ciclos
72˚C 3 minutos
96˚C 30 segundos
57˚C 30 segundos
20 ciclos
72˚C 3 minutos
1 ciclo 72˚C 10 minutos
1 ciclo 4˚C ∞
41
5.4.3. Purificação das Amostras de Genes OR Amplificados
Antes de prosseguir com a reação de seqüenciamento é necessário purificar os
produtos de PCR, pois a presença de nucleotídeos livres e primers residuais
comprometem a análise do seqüenciamento.
Os produtos de PCR obtidos foram purificados através do método enzimático
utilizando as enzimas Exonuclease I (EXO I) e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) da
USB Corporation
®
. Esse método consiste na atividade nuclease da EXO I em degradar
oligonucleotídeos simples fita (primers) e na atividade da SAP de desfosforilar
nucleotídeos trifosfatos (dNTPs) não incorporados durante a reação de PCR. Essas
enzimas têm atividade ótima na temperatura de 37
o
C e são desnaturadas a temperatura
superior a 65
o
C por um tempo de 15 minutos.
Os reagentes foram utilizados nas concentrações presentes na Tabela 5 e
submetidos às condições de ciclagem presentes na Tabela 6 no termociclador TC-512
da Techne.
TABELA 5 - REAGENTES UTILIZADOS NA ETAPA DE PURIFICAÇÃO
Reagentes Volume/Quantidade
Produto de PCR 10μl
Tampão de Reação SAP 10X 1,0μl
EXO I (10U/μl) 1,0μl
SAP (1U/μl) 2,0μl
TABELA 6 - CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NA ETAPA DE
PURIFICAÇÃO
N˚ DE CICLOS TEMPERATURA TEMPO
1 ciclo 37˚C 1 hora
1 ciclo 80˚C 15 minutos
42
5.4.4. Seqüenciamento, Precipitação e Denaturação das Amostras de Genes OR
Amplificados
Após a purificação dos produtos de PCR, essas foram seqüenciadas com o “kit
BigDye 3.1 Terminator” (Applied Biosystems), conforme o protocolo da Tabela 7.
TABELA 7 - REAGENTES UTILIZADOS NA REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO
Reagentes Volume/Quantidade
Terminator Ready Mix 3μl
Produto de PCR purificado 6μl
Primers específico (U ou L) 3,2pmol
Água (18,2MΩcm) q.s.p. 10μl
Além das amostras, o aparelho deve ser calibrado utilizando-se o controle
fornecido com o kit (Tabela 8).
TABELA 8 - REAGENTES UTILIZADOS NA CALIBRAÇÃO ESPECTRAL
Reagentes Volume/Quantidade
Terminator Ready Mix 4μl
P-Gen (plasmídeo controle) 1μl
Primers específico (kit) 4μl
Água (18,2MΩcm) q.s.p. 10μl
Os microtubos preparados com os reagentes foram submetidos às condições de
ciclagem descritas nas Tabelas 9 e 10 (no termociclador TC-512 da Techne).
TABELA 9 - CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NAS REAÇÕES DE
SEQÜENCIAMENTO DOS GENES OR2I1P, OR12D3, OR14J1,
OR2B4P, OR2E1P, OR1F12, OR2B8P, OR2B7P, OR2W2P, OR2W6P
N˚ DE CICLOS TEMPERATURA TEMPO
1 ciclo 96˚C 1 minuto
96˚C 15 segundos
50˚C 15 segundos
35 ciclos
60˚C 4 minutos
1 ciclo 4˚C ∞
43
TABELA 10 - CONDIÇÕES DE CICLAGEM UTILIZADAS NAS REAÇÕES DE
SEQÜENCIAMENTO DO GENES OR2W4P e OR2B6
N˚ DE CICLOS TEMPERATURA TEMPO
1 ciclo 96˚C 1 minuto
96˚C 15 segundos
55˚C 15 segundos
35 ciclos
60˚C 4 minutos
1 ciclo 4˚C ∞
Posteriormente, as amostras foram precipitadas com acetato de amônia 7,5M e
etanol 96% para obtenção dos diversos fragmentos amplificados e retirada dos
iniciadores, terminadores fluorescentes e outras impurezas. O produto purificado foi
ressuspendido em 15μl de formamida e desnaturado a 96
o
C por 8 minutos no
termociclador TC-512 da Techne, seguido por choque térmico em freezer -80
o
C por 40
segundos. Por fim, os fragmentos foram analisados em seqüenciador automático ABI-
3130 Applied Biosystems, polímero POP7 e capilar de 80cm. Os dados obtidos foram
coletados pelo programa Data Collection v.3.0 (fornecido pela Applied Biosystems)
para análise posterior.
5.5. CARACTERIZAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DOS GENES DE RECEPTORES
OLFATÓRIOS LIGADOS AO MHC
Os dados coletados pelo programa Data Colection v.3.0. oriundos das reações
de seqüenciamento no seqüenciador automático ABI-3130 Applied Biosystems foram
gravados em CD e transferidos para o computador de análise.
Em seguida, os arquivos de extensão “.ab1” foram analisados pelo programa
Sequencing Analysis v.5.2 fornecido junto com o seqüenciador automático ABI-3130
Applied Biosystems. Por fim, utilizou-se o programa SeqScape v.2.5 (Applied
Biosystems) para pareamento das seqüências obtidas com as presentes no GenBank do
NCBI.
44
6. RESULTADOS
6.1. RESULTADOS DO PROCESSO DE IMPLANTAÇÃO E AVALIAÇÃO DA
TÉCNICA DE SEQÜENCIAMENTO DE GENES OR
Para implantação da técnica de seqüenciamento foi necessário a consulta a
protocolos básicos como Sambrook, onde se procurou observar itens técnicos e
reagentes imprescindíveis para a realização da técnica de seqüenciamento. Além disso,
usamos como referência as recomendações dos fabricantes dos reagentes do Kit
BigDye Terminator (Applied Biosystem).
Os protocolos recomendados foram testados e a partir do momento de sua
validação iniciou-se o processo de implantação da técnica de seqüenciamento, cujos
resultados estão na Tabela 11.
TABELA 11 – NÚMERO DE PARES DE BASES DE GENES OR
SEQUENCIADOS
LINHAGENS CELULARES
GENES OR
LG2 YAR BM28.7 BM19.7 KR3598 OLGA _SA WT51 AMAI H2LCL
OR2W6P 938/998 938/998 938/998 938/998 938/998 938/998 938/998 938/998 938/998 938/998
OR2B6 939/939 939/939 939/939 939/939 939/939 939/939 939/939 939/939 939/939 939/939
OR2W4P 897/923 897/923 897/923 897/923 897/923 897/923 897/923 897/923 897/923 897/923
OR2W2P 948/948 948/948 948/948 948/948 948/948 948/948 948/948 948/948 948/948 948/948
OR2B7P 935/935 935/935 0/935 935/935 0/935 0/935 0/935 935/935 935/935 935/935
OR2B8P 950/950 950/950 950/950 950/950 950/950 950/950 950/950 950/950 950/950 950/950
OR1F12 0/921 0/921 0/921 0/921 0/921 0/921 0/921 0/921 0/921 0/921
OR2E1P 474/474 474/474 474/474 474/474 474/474 474/474 474/474 474/474 474/474 474/474
OR2B4P 955/955 955/955 955/955 955/955 955/955 955/955 955/955 955/955 955/955 955/955
OR14J1 963/963 963/963 963/963 963/963 963/963 963/963 963/963 963/963 963/963 963/963
OR12D3 766/948 766/948 766/948 766/948 766/948 766/948 766/948 766/948 766/948 766/948
OR2I1P 945/972 945/972 945/972 945/972 945/972 945/972 945/972 945/972 945/972 945/972
LEGENDA: Foi utilizada a seguinte notação: XXX/YYY, onde XXX corresponde ao número de pares
de bases seqüenciados e YYY o número de pares de bases que possui a seqüência no
banco de dados para receptores olfatórios do Instituto Weizmann (HORDE). Foram
utilizadas as cores: vermelha para as linhagens celulares que não puderam ser analisadas,
azul para as linhagens que foram seqüenciadas parcialmente e verde para as linhagens
que tiveram toda a seqüência analisada.
45
6.2. POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP)
Após análise utilizando o programa SeqScape v.2.5 (Applied Biosystems), as
seqüências obtidas foram alinhadas e analisadas com as contidas no banco de dados
HORDE do Weizmamn Institute of Science. Os SNPs encontrados foram comparados
com os presentes nos bancos de dados do HORDE e do dbSNP(no site do NCBI). As
imagens de alinhamentos foram dispostas de modo a identificar os SNPs presentes nas
seqüências obtidas nesse experimento. Os SNPs novos foram destacados com a caixa
de texto contendo fundo amarelo, na qual consta sua posição e as variantes
encontradas.
TABELA 12 – NÚMERO DE SNPs NOS GENES OR SEQUENCIADOS
LINHAGENS CELULARES
GENES OR
LG2 YAR BM28.7 BM19.7 KR3598 OLGA _SA WT51 AMAI H2LCL
OR2W6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
OR2B6 0 0 0 0 0 2 0 1 0 0
OR2W4P 0 0 0 0 2 1 0 1 1 0
OR2W2P 0 0 0 2 0 2 0 0 0 0
OR2B7P 0 0 - 2 - - - 0 3 0
OR2B8P 0 0 5 5 2 3 4 0 4 0
OR1F12 - - - - - - - - - -
OR2E1P 0 0 1 0 2 1 2 1 0 0
OR2B4P 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0
OR14J1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1
OR12D3 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1
OR2I1P 1 1 0 0 2 2 2 2 6 1
LEGENDA: - Genes OR não seqüenciados. Não há distinção entre homozigotos e heterozigotos. Os
valores de SNPs apresentados foram obtidos utilizando as seqüências de referência
presentes no banco de dados HORDE.
46
SNP descrito. Nomeclatura utilizada pelo dbSNP do NCBI
FIGURA 15 – EXEMPLO DE INTERPRETAÇÃO DOS ALINHAMENTOS
Código do nucleotídeo: Base:
------------------------------------------------
A..............................................Adenina
C..............................................Citosina
G..............................................Guanina
T...............................................Timina
R..............................................A ou G
Y..............................................C ou T
S..............................................G ou C
W.............................................A ou T
K..............................................G ou T
M.............................................A ou C
B..............................................C, G ou T
D..............................................A, G ou T
H..............................................A, C ou T
V..............................................A, C ou G
N..............................................qualquer base
“.” ou “-“..................................."gap"
Nome do gene OR
SNP não descrito na posição 327, substituição de G por A
rs2859370
POSIÇÃO 327 –
G/A
Linhagens celulares
Posição do nucleotídeo. A numeração é iniciada utilizando o primeiro
nucleotídeo da se
q
üência codificante
p
resente no HORDE.
47
• OR2I1P
rs17184255 rs11724
rs16895067
rs389419
48
• OR12D3
rs16895070
rs2294746
rs3749970
49
• OR14J1
POSIÇÃO 486 –
A/C
rs9380122
rs9380122
50
• OR2B4P
• OR2E1P
rs1123283
rs2531811 rs7766749
rs2859370
POSIÇÃO 327 –
G/A
51
• OR2B8P
rs203886 rs203887
rs203888
rs9468270 rs203889
52
• OR2B7P
POSIÇÃO 845 – -/G
As linhagens OLGA, SA e KR3598 são
heterozigotas. As linhagens BM19.7,
BM28.7 E AMAI são homozigotas para a
inserção de “G”.
rs149900
POSIÇÃO 837 –
C/T
53
OR2W2P
rs35572414
POSIÇÃO 326 –
G/A
POSIÇÃO 448 –
G/A
54
• OR2W4P
rs149943
rs12524914
POSIÇÃO 713 –
C/T
55
• OR2B6
rs11752815
POSIÇÃO 916 –
G/A
POSIÇÃO 908 –
G/C
rs7767176
56
rs904142
57
6.3. COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS DO PRESENTE ESTUDO COM OS DE
EHLERS et al. (2000)
Os dados de seqüenciamento obtidos na presente investigação foram
comparados aos dados publicados por EHLERS et al. (2000) para obter a
caracterização de todos os locos gênicos descritos para os receptores olfatórios
presentes no MHC estendido. O número de alelos caracterizados em cada um dos
genes OR foi semelhante àqueles descritos por EHLERS et al. (2000), que observaram
uma variação média entre 2 a 7 alelos ao longo das seqüências dos genes OR, enquanto
no presente estudo observamos uma variação média entre 1 a 6 alelos. Não foram
encontradas características distintas das encontradas por EHLERS et al. (2000).
TABELA 13 – NÚMERO DE ALELOS NOS GENES OR SEQUENCIADOS POR
EHLERS et al. (2000)
GENES OR
HAPLÓTIPOS
LINHAGENS
CELULARES
OR2B2 OR2W1 OR2B3 OR2J1 OR2J3 OR2J2 OR5V1 OR12D2 OR12D1P OR11A1 OR10C1 OR2H1 OR2H2
OR
H2LCL
*01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *03 *02 *01 *02 *01 *03 1
YAR
*01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *03 *02 *01 *02 *01 *03 1
LG2
*01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *03 2
OLGA-1
*01 *01 *01 *01 *01 *01 *01 *05 *01 *01 *03 *01 *01 3
OLGA-2
*01 *01 *01 *02 *02 *02 *03 *07 *01 *01 *03 *01 *04 4
SA-1
*01 *01 *01 *01 *01 *01 *02 *05 *02 *01 *02 *01 *03 5
SA-2
*01 *01 *01 *01 *02 *02 *02 *06 *01 *01 *02 *01 *02 6
BM28.7
*01 *01 *01 *05 *02 *02 *01 *01 *01 *01 *01 *02 *01 7
BM19.7
*01 *01 *02 *05 *02 *02 *01 *03 *02 *01 *05 *03 *02 8
WT51-1
*01 *02 *01 *03 *03 *03 *01 *02 *01 *01 *02 *01 *01 9
WT51-2
*01 *02 *01 *03 *03 *03 *01 *02 *01 *01 *02 *01 *04 10
KR3598-1
*02 *01 *01 *01 *02 *01 *01 *03 *02 *02 *03 *01 *02 11
KR3598-2
*02 *01 *01 *02 *02 *02 *01 *04 *01 *02 *03 *01 *03 12
AMAI
*01 *03 *01 *04 *04 *02 *04 *01 *01 *01 *04 *03 *01 13
NÚMERO
DE ALELOS
2 3 2 5 4 3 4 7 2 2 5 3 4
FONTE: Adaptado de: EHLERS, A.; BECK, S.; FORBES, S. A.; TROWSDALE, A. V.; YOUNGER,
R.; ZIEGLER, A. MHC-linked olfactory receptor loci exhibit polymorphism and contribute
to extended HLA/OR-haplotypes. Genome Research, New York, v.10, n.12, p.1968-1978,
2000.
58
7. DISCUSSÃO
A técnica de seqüenciamento empregada permitiu seqüenciar 11 genes OR dos
12 pretendidos. O gene OR1F12 não foi seqüenciado por apresentar problemas no
delineamento do iniciador OR1F12L. Após ser realizada a reação de seqüenciamento,
o cromatograma apresentou características condizentes com o deslizamento (slippage)
da enzima DNA polimerase (Figuras 16 e 17). Durante a adição de nucleotídeos
complementares numa região que apresenta muitas repetições de um único nucleotídeo
(por exemplo: repetições GGGGGGGGn...) a DNA polimerase perde o foco e
resolução da complementariedade, o que se reflete em picos aleatórios no
cromatograma. A nossa proposta para a resolução dessa dificuldade técnica em estudos
futuros é o desenvolvimento de um novo oligonucleotídeo iniciador cujo seqüência
alvo seja posterior essas regiões de repetições.
FIGURA 16 – EXEMPLOS DE SLIPPAGE DA DNA POLIMERASE
FONTE: NUCLEICS. Mononucleotide or AT Run Slippage. Disponível em: <http://www.nuclei
cs.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-AT-slippage.html> Acesso em: 03 jun.
2008.
NOTA: A parte superior da ilustração representa o problema de slippage da polimerase devido ao
grande número de repetições do nucleotídeo timina. A parte inferior representa o mesmo
problema devido a repetições de citosina. Após o fim das repetições, os eletroferogramas
apresentam vários picos de diferentes nucleotídeos para uma mesma posição, impossibilitando
a análise nesse ponto.
59
FIGURA 17 – SLIPPAGE DA DNA POLIMERASE OCORRIDO NA REAÇÃO DE
SEQUENCIAMENTO DO GENE OR1F12
NOTA: A parte superior da ilustração apresenta o iniciador (OR1F12L) e seu local de anelamento. A
parte inferior, representa o cromatograma obtido utilizando-se o oligonucleotídeo citado.
Como observado na Tabela 11, 4 dos 11 genes OR seqüenciados não
apresentaram resultados completos no que se refere à extensão do segmento gênico
analisado (número de nucleotídeos que compõem as seqüências de referência -
HORDE). Esse fato é explicável pelo protocolo utilizar apenas um par de iniciadores e
não com a técnica de seqüenciamento em si. Para os próximos estudos sugerimos a
utilização de 2 pares de iniciadores quando o gene OR apresentar mais de 950
nucleotídeos em sua seqüência.
A técnica de seqüenciamento vem se afirmando como uma das melhores
técnicas para caracterização de SNPs. No presente estudo nos permitiu caracterizar 9
SNPs novos, ainda não descritos nos banco de dados do NCBI e HORDE.
Primer OR1F12
Re
g
ião contendo re
p
eti
ç
ões de nucleotídeo
60
8. CONCLUSÃO
O presente estudo permitiu chegar às seguintes conclusões:
• Apesar de seu alto custo, a técnica de seqüenciamento mostrou-se adequada e
eficiente para caracterização simultânea de SNPs presentes ao longo de uma
seqüência gênica, diferente de técnicas, como PCR SSP, que focam em SNPs
pontuais. Dessa forma, o seqüenciamento permite um maior detalhamento da
estrutura gênica;
• No presente estudo caracterizamos nove (9) SNPs ainda não descritos na
literatura;
• A confirmação de mutação de base em indivíduos heterozigotos deve ser
analisada por técnicas de clonagem e posterior seqüenciamento;
• Para o seqüenciamento de regiões gênicas que ultrapassem 950pb devem ser
utilizados dois pares de iniciadores ao invés de um (1);
• O número de alelos caracterizados em cada um dos genes OR foram
semelhantes àqueles descritos por EHLERS et al. (2000), que observaram uma
variação média entre 2 a 7 alelos ao longo das seqüências dos genes OR,
enquanto no presente estudo observamos uma variação média entre 1 a 6 alelos;
• Antes de iniciar estudos populacionais relacionados aos genes OR é desejável
que se faça uma caracterização dos genes HLA em alta resolução das 10
linhagens celulares, bem como, a clonagem das linhagens celulares com
evidências de heterozigosidade e com isso poderemos definir alelos, haplótipos
e desequilíbrio de ligação com maior segurança entre HLA e genes OR.
61
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