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RONEY ALVES DA ROCHA
COMBINAC¸
˜
AO DAS T
´
ECNICAS DE PRECIPITAC¸
˜
AO
´
ACIDA E COM-
PLEXAC¸
˜
AO PARA OBTENC¸
˜
AO DE FRAC¸
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OES ENRIQUECIDAS DE
α-LACTOALBUMINA E β-LACTOGLOBULINA DO ISOLADO PRO-
T
´
EICO DE SORO DE LEITE
Disserta¸c˜ao apresentada `a Universidade Fe-
deral de Vi¸cosa, como parte das exigˆencias
do Programa de P´os-Gradua¸c˜ao em Ciˆencia
e Tecnologia de Alimentos, para obten¸c˜ao
do t´ıtulo de Magister Scientiae.
VIC¸OSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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RONEY ALVES DA ROCHA
COMBINAC¸
˜
AO DAS T
´
ECNICAS DE PRECIPITAC¸
˜
AO
´
ACIDA E COM-
PLEXAC¸
˜
AO PARA OBTENC¸
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AO DE FRAC¸
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OES ENRIQUECIDAS DE
α-LACTOALBUMINA E β-LACTOGLOBULINA DO ISOLADO PRO-
T
´
EICO DE SORO DE LEITE
Disserta¸c˜ao apresentada `a Universidade Fe-
deral de Vi¸cosa, como parte das exigˆencias
do Programa de P´os-Gradua¸c˜ao em Ciˆencia
e Tecnologia de Alimentos, para obten¸c˜ao
do t´ıtulo de Magister Scientiae.
APROVADA: 30 de julho de 2008.
Prof. Luis Henrique Mendes da Silva Profª. Maria do Carmo Hespanhol da Silva
(Co-Orientador)
Prof. Antˆonio Fernandes de Carvalho Profª. Maria Cristina Baracat Pereira
Prof. Luis Antˆonio Minim
(Orientador)
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`
A Maria da Gl´oria,
minha querida m˜ae, e
`a minha irm˜a, Fl´avia.
Sem o incentivo, a dedica¸c˜ao e o apoio de
vocˆes, o sonho de vir estudar em Vi¸cosa n˜ao
teria se tornado uma realidade ...
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo o que tem feito e ainda far´a em minha vida. Por estar
sempre presente. Por quebrar as correntes que me atavam a supersti¸c˜oes, cren¸cas
e tradi¸c˜oes que ofuscavam o brilho de Sua verdadeira Majestade. Por ter me
permitido a realiza¸c˜ao deste trabalho.
`
A Universidade Federal de Vi¸cosa (UFV) e ao Departamento de Tecnologia
de Alimentos (DTA), que se tornaram minha segunda casa.
`
A Coordena¸c˜ao de Aperfei¸coamento de Pessoal de N´ıvel Superior (CAPES)
pelo apoio financeiro.
Ao professor Luis Antˆonio Minim, agrade¸co pela amizade, paciˆencia, ensi-
namentos, oportunidades, e por ser meu orientador. Obrigado por compartilhar
com n´os, seus orientados, a sua postura profissional e seu amplo conhecimento
cient´ıfico e tecnol´ogico nos dom´ınios da Engenharia.
`
A professora Jane S´elia dos Reis Coimbra, pela amizade, pelos ensinamentos,
pelas dicas, e por gentilmente ter me recebido em seu gabinete todas as vezes
em que tive necessidade de contar com suas opini˜oes e sugest˜oes.
Ao professor Luis Henrique Mendes da Silva e sua esposa, professora Maria
do Carmo, pela amizade, pela cordialidade, inigual´avel aten¸c˜ao, ensinamentos, e
pelo incentivo.
`
A professora Val´eria Paula Rodrigues Minim, pela gentileza, pela simpatia,
pelos ensinamentos e pelas valiosas contribui¸c˜oes em minha forma¸c˜ao pessoal e
profissional.
iii
Ao professor Antˆonio Fernandes de Carvalho e `a professora Maria Cristina Ba-
racat Pereira, que gentilmente aceitaram o convite de participar como membros
da banca que avaliou este trabalho. A vocˆes os meus sinceros agradecimentos
pelas dicas, sugest˜oes, corre¸c˜oes e pela amizade.
Ao amigo e incentivador, Dr. Afonso Celso Lacerda de Souza (Catagua-
ses/MG), que entre um caf´e e outro insistia veementemente para o meu ingresso
em uma carreira universit´aria.
Ao Dr. Aur´elio Augusto de Sousa Filho (IBAMA/JF), pela amizade, incen-
tivo, apoio e ensinamentos.
A minha m˜ae, Maria da Gl´oria, que me amparou de todas as formas poss´ıveis,
e n˜ao mediu sacrif´ıcios ao longo de toda essa caminhada.
A minha irm˜a, Fl´avia, p elas ora¸c˜oes, pela confian¸ca e pelo constante incen-
tivo.
Ao meu sobrinho, Daniel, pelas brincadeiras, pela descontra¸c˜ao, e por me
proporcionar horas de imensa alegria ao seu lado.
Ao Robinson, pelo otimismo, pelo esp´ırito empreendedor, e por estar presente
e sempre disposto a ajudar.
`
A Pricilla, pela dedica¸c˜ao, pelo esfor¸co e pelas contribui¸c˜oes, que tornaram
este trabalho poss´ıvel.
Aos funcion´arios do DTA, do DEQ (Eduardo, do laborat´orio de cromatografia,
e D.Onezina, do almoxarifado de reagentes anal´ıticos) e amigos que trabalham
no LPS (Laborat´orio de Processos de Separa¸c˜ao), e a todos aqueles que, de
alguma forma, contribu´ıram para a realiza¸c˜ao deste trabalho.
iv
BIOGRAFIA
RONEY ALVES DA ROCHA, filho de Geraldo Sebasti˜ao da Rocha e Maria
da Gl´oria Alves Brand˜ao, nasceu em Cataguases, Minas Gerais, no dia 09 do mˆes
de julho de 1975.
Em mar¸co de 2001, iniciou o Curso de Engenharia de Alimentos na Univer-
sidade Federal de Vi¸cosa, colando grau em outubro de 2006. No mesmo mˆes,
ingressou no Curso de P´os-Gradua¸c˜ao em Ciˆencia e Tecnologia de Alimentos, em
n´ıvel de Mestrado, na Universidade Federal de Vi¸cosa.
Em julho de 2008, submeteu-se `a defesa de disserta¸c˜ao.
v
´
INDICE
LISTA DE TABELAS .................. vii
LISTA DE FIGURAS .................. viii
LISTA DE EQUAC¸
˜
OES .................. x
LISTA DE S
´
IMBOLOS E ABREVIATURAS .................. xi
RESUMO .................. xiii
ABSTRACT .................. xv
1.INTRODUC¸
˜
AO .................. 1
2.REVIS
˜
AO DE LITERATURA .................. 4
3.MATERIAIS E M
´
ETODOS .................. 21
4.RESULTADOS E DISCUSS
˜
AO .................. 32
CONCLUS
˜
OES .................. 65
SUGEST
˜
AO PARA TRABALHOS FUTUROS .................. 69
REFER
ˆ
ENCIAS BIBLIOGR
´
AFICAS .................. 70
vi
LISTA DE TABELAS
Tab. 1 - Composi¸c˜ao prot´eica do leite ..... 5
Tab. 2 - Vari´aveis de resposta do experimento ..... 23
Tab. 3 - Fatores e N´ıveis dos Fatores ..... 23
Tab. 4 - Design Experimental ..... 24
Tab. 5 - Gradiente de centrifuga¸c˜ao ..... 26
Tab. 6 - Gradiente da fase m´ovel (HPLC) ..... 29
Tab. 7 - Resultado da an´alise cromatogr´afica do WPI ..... 32
Tab. 8 - Massa de α-La e β-Lg obtidas como precipitado ..... 38
Tab. 9 - Recupera¸c˜ao de α-La e β-Lg no precipitado ..... 40
Tab. 10 - ANOVA: An´alise de α-La no precipitado ..... 41
Tab. 11 - ANOVA: An´alise de β-Lg no precipitado ..... 44
Tab. 12 - Resultado de otimiza¸c˜ao para o precipitado ..... 47
Tab. 13 - Pureza dos precipitados em rela¸c˜ao a α-La ..... 48
Tab. 14 - Massas de α-La e β-Lg presentes no sobrenadante ..... 51
Tab. 15 - Recupera¸c˜ao de α-La e β-Lg no sobrenadante ..... 52
Tab. 16 - ANOVA: An´alise de α-La no sobrenadante ..... 53
Tab. 17 - Resultado de otimiza¸c˜ao para o sobrenadante ..... 59
Tab. 18 - Pureza dos sobrenadantes em rela¸c˜ao a β-Lg ..... 60
Tab. 19 - Previs˜ao de recupera¸c˜ao no ponto de ´otimo global ..... 64
vii
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1 - Estrutura prim´aria da α-La ... 8
Fig. 2 - Estrutura terci´aria da α-La ... 9
Fig. 3 - Estrutura terci´aria da β-Lg ... 12
Fig. 4 - Solubilidade de prote´ına em fun¸c˜ao do pH ... 16
Fig. 5 - Liga¸c˜oes do ´atomo de c´alcio no interior da α-La ... 19
Fig. 6 - Anova da curva de calibra¸c˜ao da α-La ... 33
Fig. 7 - Anova da curva de calibra¸c˜ao da β-Lg ... 34
Fig. 8 - Perfil cromatogr´afico da dispers˜ao do WPI em ´agua ... 36
Fig. 9 - Cromatograma de an´alise do gradiente de centrifuga¸c˜ao ... 37
Fig. 10 - Diagrama Pareto: α-La no precipitado ... 39
Fig. 11 - Fatores Principais: α-La no precipitado ... 42
Fig. 12 - Intera¸c˜ao entre Fatores: α-La no precipitado ... 43
Fig. 13 - Fatores Principais: β-Lg no precipitado ... 45
Fig. 14 - Resultado de otimiza¸c˜ao para o precipitado ... 46
Fig. 15 - Co-precipita¸c˜ao da β-Lg no precipitado ... 49
Fig. 16 - Agrupamento dos tratamentos para o precipitado ... 49
Fig. 17 - Curvas de n´ıvel para a recupera¸c˜ao de α-La no precipitado ... 50
Fig. 18 - Diagrama Pareto: α-La no sobrenadante ... 53
Fig. 19 - Fatores Principais: α-La no sobrenadante ... 54
viii
LISTA DE FIGURAS
Fig. 20 - Teste-t: β-Lg no sobrenadante ...... 55
Fig. 21 - Diagrama Pareto: β-Lg no sobrenadante ...... 55
Fig. 22 - Fatores Principais: β-Lg no sobrenadante ...... 56
Fig. 23 - Resultado de otimiza¸c˜ao para o sobrenadante ...... 58
Fig. 24 - Co-recupera¸c˜ao de α-La no sobrenadante ...... 60
Fig. 25 - Agrupamento dos tratamentos para o sobrenadante ...... 61
Fig. 26 - Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de β-Lg no sobrenadante ...... 62
Fig. 27 - Otimiza¸c˜ao global do experimento ...... 63
ix
LISTA DE EQUAC¸
˜
OES
Eq. 1 - Solubilidade de Prote´ınas ................... 13
Eq. 2 - Hidrofobicidade M´edia de Amino´acidos ................... 14
Eq. 3 - Freq¨uˆencia de Carga ................... 14
Eq. 4 - Equa¸c˜ao de Regress˜ao para α-La ................... 35
Eq. 5 - Equa¸c˜ao de Regress˜ao para β-Lg ................... 35
x
LISTA DE S
´
IMBOLOS E ABREVIATURAS
g Acelera¸c˜ao da gravidade (≈ 9,80665 m s
2
)
ASP Amino´acido (´acido asp´artico)
R
2
Coeficiente de determina¸c˜ao
CV Coeficiente de varia¸c˜ao
CaCl
2
Cloreto de c´alcio
NaCl Cloreto de s´odio
WPC Concentrado prot´eico do soro de leite
HPLC Cromatografia l´ıquida de alta performance
BOD Estufa laboratorial
σ Freq¨uˆencia de carga
PVC Filme polim´erico (Policloreto de vinila)
∆g Hidrofobicidade m´edia dos res´ıduos de amino´acido
∆g
Res´ıduo
Hidrofobicidade da cadeia lateral do amino´acido
Ig Imunoglobulinas
IFIS International Food Information Service
WPI Isolado Prot´eico do Soro de Leite
α-La α-lactoalbumina
β-Lg β-lactoglobulina
n
−
N´umero total de res´ıduos de amino´acido com carga negativa
n
+
N´umero total de res´ıduos de amino´acido com carga positiva
n N´umero total de res´ıduos de amino´acidos na prote´ına
pI Ponto isoel´etrico
xi
pH Potencial hidrogeniˆonico
N Teor de nitrogˆenio na amostra
Trat. Tratamento
mM Unidade de concentra¸c˜ao: mMol litro
−
1
Da Unidade de massa molecular (D´altons)
µm Unidade de medida: 10
−6
metro
xii
RESUMO
ROCHA, Roney Alves da, M.Sc., Universidade Federal de Vi¸cosa, julho de 2008.
Combina¸c˜ao das t´ecnicas de precipita¸c˜ao ´acida e complexa¸c˜ao para
obten¸c˜ao de fra¸c˜oes enriquecidas de α-lactoalbumina e β-lactoglo-
bulina do isolado prot´eico de soro de leite. Orientador: Luis Antˆonio
Minim. Co-Orientadores: Luis Henrique Mendes da Silva e Val´eria Paula
Rodrigues Minim.
Neste trabalho foram estudados os efeitos da combina¸c˜ao de duas t´ecnicas
de recupera¸c˜ao de prote´ınas, com o objetivo de se obter uma fra¸c˜ao enriquecida
em α-lactoalbumina e uma enriquecida em β-lactoglobulina, a partir de isolado
prot´eico de soro de leite comercial (WPI). As t´ecnicas empregadas foram a pre-
cipita¸c˜ao ´acida e a complexa¸c˜ao do ´ıon c´alcio, presente no interior da α-La. A
mat´eria-prima utilizada foi o WPI da marca BiPRO
®
, produzido e comercia-
lizado pela Davisco Food International Inc., USA. No soro reconstitu´ıdo foram
investigados cinco fatores: pH, tempo de agita¸c˜ao, temp eratura de processo,
tipo de complexante, e a concentra¸c˜ao do WPI. Ap´os a adi¸c˜ao do ´acido l´atico
ou c´ıtrico e centrifuga¸c˜ao, foram obtidas duas fra¸c˜oes, uma sobrenadante e uma
precipitado, que foram submetidos, individualmente, e para cada tratamento, a
an´alises cromatogr´aficas (HPLC), para avaliar as quantidades de α-La e β-Lg
presentes em cada uma. Para o precipitado, rico em α-La, verificou-se que as
melhores condi¸c˜oes de recupera¸c˜ao dessa prote´ına, com a restri¸c˜ao imposta de se
minimizar a co-precipita¸c˜ao de β-Lg, foram: tempo de agita¸c˜ao de 30 minutos,
xiii
temperatura de processo de 40 ℃, pH 3,9, 12,0 % (m/m) para a concentra¸c˜ao de
WPI, e a utiliza¸c˜ao de ´acido c´ıtrico como complexante. Para o sobrenadante, rico
em β-Lg, verificou-se que as melhores condi¸c˜oes de recupera¸c˜ao dessa prote´ına,
com a restri¸c˜ao imposta de se minimizar a co-recupera¸c˜ao de α-La, foram: tempo
de agita¸c˜ao de 30 minutos, temperatura de processo de 30 ℃, pH 3,9, 9 % (m/m)
de WPI, e ´acido l´atico como acidificante, podendo, em sua substitui¸c˜ao, ser uti-
lizado um outro acidificante de menor custo. Em adi¸c˜ao `as an´alises realizadas
para o precipitado e para o sobrenadante, estabeleceu-se uma fun¸c˜ao-objetivo
que permitiu estimar, dentro das condi¸c˜oes experimentais realizadas, um ponto
de otimiza¸c˜ao. Este ponto refere-se aos valores dos n´ıveis dos fatores em estudo
cuja recupera¸c˜ao de α-La no precipitado e a recupera¸c˜ao de β-Lg no sobre-
nadante s˜ao simultaneamente maximizadas, enquanto que a co-recupera¸c˜ao de
α-La no sobrenadante e a co-precipita¸c˜ao de β-Lg no precipitado s˜ao minimi-
zadas. Nestas condi¸c˜oes os valores encontrados foram: tempo de agita¸c˜ao 30
minutos, temperatura de processo 40 ℃, pH ajustado para 3,9 com ´acido c´ıtrico,
concentra¸c˜ao de WPI igual a 9 % (m/m), e adi¸c˜ao de citrato de s´odio trib´asico
como agente complexante.
xiv
ABSTRACT
ROCHA, Roney Alves da, M.Sc., Universidade Federal de Vi¸cosa, july of 2008.
Combination of the techniques of acid precipitation and complexing
for obtaining of enriched fractions of α-lactalbumin and β-lactoglo
bulin from whey protein isolate of milk. Adviser: Luis Antˆonio Minim.
Co-Advisers: Luis Henrique Mendes da Silva and Val´eria Paula Rodrigues
Minim.
In this work it was studied the effects of the combination of two techniques
for proteins recovering, in order to obtain an enriched fraction in α-lactalbumin
and an enriched one in β-lactoglobulin, from commercial whey protein isolate
(WPI) of cheese. The employed techniques were the acid precipitation and the
complexation of calcium ion, present inside α-La. The used raw material was
WPI of BiPRO
®
mark, produced and marketed by Davisco Food International
Inc., USA. In the reconstituted whey five factors were investigated: pH, time of
agitation, temperature of process, complexing type, and concentration of WPI.
After addition of acid and centrifugation, were obtained two fractions: one frac-
tion supernatant and a fraction of precipitate, that were submitted, individually,
and for each treatment, to chromatographic analyses (HPLC), to evaluate the
amount of α-La and β-Lg present in each one. For the precipitate, enriched in
α-La, it was detected that the best conditions of protein recovering, with the
imposed restriction of minimizing the co-precipitation of β-Lg, were: time of
agitation of 30 minutes, process temperature of 40 ℃, pH 3.9, 12.0 % (w/w)
xv
for WPI concentration, and the use of citric acid as complexing. For the su-
pernatant, enriched in β-Lg, it was detected that the best conditions of protein
recovery, with the imposed restriction of minimizing co-recovering of α-La, were:
agitation time of 30 minutes, process temperature of 30 ℃, pH 3.9, 9 % (w/w)
of WPI, and the use of lactic acid as acidifier, being able to, in it’s substitution,
another acidifier of smaller cost to be used. In addition to the analyses accom-
plished for the precipitate and for supernatant, was settled down a objective
function that allowed to esteem, over the experimental conditions accomplished,
a point of optimization. This point refers to values of levels of the factors in
study whose recovery of α-La in the precipitate and the recovery of β-Lg in
the supernatant are simultaneously maximized, while the co-recovery of α-La in
the supernatant and the co-precipitation of β-Lg in precipitate are minimized.
In these conditions the found values were: agitation time: 30 minutes, process
temperature: 40 ℃, pH adjusted for 3.9 with citric acid, concentration of WPI
of 9 % (w/w), and addition of tribasic sodium citrate as the complexing agent.
xvi
1. INTRODUC¸
˜
AO
O soro ´e o componente l´ıquido do leite, e industrialmente ´e obtido durante o
processo de fabrica¸c˜ao do queijo, ap´os a forma¸c˜ao do co´agulo, nas etapas de corte
e mexedura da coalhada (HUI, 1993). Nesse processo, a separa¸c˜ao do soro ocorre
principalmente devido `a a¸c˜ao mecˆanica de agita¸c˜ao e, ao seu t´ermino, obt´em-se
uma fra¸c˜ao s´olida, a massa, composta em sua maior parte por gordura, ´agua e
prote´ına, e que dar´a origem ao queijo nas etapas subseq¨uentes do processamento,
e uma fra¸c˜ao l´ıquida, que ´e designado soro de leite (PIETER et al., 2006).
O soro, portanto, ´e uma solu¸c˜ao de nutrientes dilu´ıda, e entre esses est˜ao
prote´ınas, lactose, sais e gordura residual (CHAO, 2001).
Historicamente, o soro era considerado como um res´ıduo industrial e o seu
descarte no ambiente era feito de forma que apresentasse o menor custo poss´ıvel
(CHATTERTON et al., 2006), implicando em impactos ambientais, ou ent˜ao,
destinado ao uso como ingrediente em formula¸c˜oes para alimenta¸c˜ao animal
(MEADE e STRINGHAM, 1949). Este cen´ario ainda ´e o que prevalece em
muitas das regi˜oes do pa´ıs. Por´em, com a crescente demanda por alimentos de
maior ap orte nutricional, economicamente atrativos, e p ela ins´ıgnia exercida pela
legisla¸c˜ao ambiental para que se reduza a elevada carga de efluentes poluidores,
a ind´ustria de processamento de l´acteos, amparada pelo apoio tecnol´ogico de
universidades e institui¸c˜oes de pesquisa, seguida pelas ind´ustrias farmacˆeutica
e qu´ımica, vˆem avan¸cando nas investiga¸c˜oes e nos estudos visando expandir a
utiliza¸c˜ao do soro como ingrediente em uma gama ainda maior de formula¸c˜oes.
Entre essas pode-se citar: sorvetes, alimentos para crian¸cas e atletas, sopas
desidratadas, cosm´eticos, medicamentos e muitos outros (CHAO, 2001).
Algumas empresas do setor aliment´ıcio j´a recuperam, processam e comerci-
1
alizam o soro de leite para essas finalidades, e o disponibilizam sob a forma de
soro em p´o.
O concentrado prot´eico do soro de leite (WPC – Whey Protein Concentrate)
e o isolado prot´eico do soro de leite (WPI – Whey Protein Isolate) s˜ao outros
produtos obtidos a partir do processamento do soro de leite e, de modo seme-
lhante ao soro, tamb´em s˜ao comercializados sob a forma de p´o, sendo que o
conte´udo total de prote´ınas no soro ´e menor do que o conte´udo de prote´ınas no
WPC, e este, por sua vez, possui menor quantidade de prote´ınas do que o WPI
(LUCENA et al., 2007).
Para estudo, as prote´ınas do soro de leite podem ser classificadas em dois
grupos principais: 1) uma fra¸c˜ao de globulinas, contendo principalmente a β-
lactoglobulina (β-Lg) e as imunoglobulinas (Ig); e 2) uma fra¸c˜ao de albumi-
nas, que incluem a α-lactoalbumina (α-La) e as albuminas do soro (DeWIT e
BRONTS, 1995; CHAO, 2001).
A α-La e a β-Lg s˜ao duas pequenas prote´ınas globulares, e s˜ao, em ter-
mos nutricionais e funcionais, as mais importantes prote´ınas do soro de leite, e
encontram-se naturalmente presentes no leite bovino (KUHLMAN et al., 2003).
No leite humano, por´em, apenas a α-La est´a presente e tipicamente encontra-se
em uma quantidade correspondente a 40 %, em peso, do seu total de prote´ınas,
enquanto que no leite bovino, este valor ´e muito menor, variando entre 4 % e 5
%, respectivamente (CHAO, 2001).
Algumas pesquisas tˆem relatado que a β-Lg, presente em alimentos cuja for-
mula¸c˜ao contenha leite ou soro de leite de origem bovina, tem sido a principal
causa de alergia em crian¸cas, sendo, dessa maneira, desej´avel que as formula¸c˜oes
l´acteas infantis tenham baixa concentra¸c˜ao de β-Lg ou contenham uma concen-
tra¸c˜ao relativamente alta de α -La, para torn´a-las mais similar ao leite humano
(CHAO, 2001 e LUCENA et al., 2007).
2
Assim, torna-se de interesse para a ind´ustria de alimentos a obten¸c˜ao des-
sas prote´ınas, principalmente a α-La, em sua forma pura ou quase pura, para
aplica¸c˜ao nas formula¸c˜oes enriquecidas em prote´ınas em que se espera um redu-
zido potencial alergˆenico.
Entre as t´ecnicas apresentadas na literatura para o fracionamento dessas
prote´ınas, a precipita¸c˜ao ´acida e a complexa¸c˜ao de ´ıons met´alicos tˆem se mos-
trado bastante atrativas, principalmente por fazerem uso de reagentes qu´ımicos
que apresentam baixo custo.
Este trabalho teve como objetivo estudar o processo de precipita¸c˜ao ´acida
e a complexa¸c˜ao do c´alcio no sentido de se obter fra¸c˜oes enriquecidas tanto de
α-La quanto de β-Lg. Foram avaliadas as principais vari´aveis do processo em
termos de sua influˆencia no rendimento e na pureza das fra¸c˜oes prot´eicas.
3
2. REVIS
˜
AO DE LITERATURA
2.1. O SORO DE LEITE.
Os queijos est˜ao entre os gˆeneros aliment´ıcios mais antigos que se tˆem co-
nhecimento. A data de sua primeira utiliza¸c˜ao como alimento ainda ´e incerta e,
possivelmente, seu surgimento tenha ocorrido de modo acidental e expontˆaneo,
conseq¨uˆencia da fermenta¸c˜ao natural do leite, realizada por microrganismos pre-
sentes no ambiente (HUI, 1993).
As t´ecnicas e os procedimentos empregados na fabrica¸c˜ao dos queijos variam
geogr´afica e culturalmente. Por´em, nos diferentes modos de processamento do
leite para se produzir quejo, nota-se que o princ´ıpio b´asico da t´ecnica ´e o de
promover a concentra¸c˜ao da case´ına e da gordura, em aproximadamente dez
vezes, formando a massa que dar´a origem ao queijo, ao passo que as prote´ınas do
soro, os sais sol´uveis e a lactose s˜ao, em sua maior parte, removidos juntamente
com o soro, quando este ´e separado da massa (FOX e McSWEENEY, 1998).
O soro ´e, portanto, um co-produto da fabrica¸c˜ao do queijo, e a sua com-
posi¸c˜ao varia em fun¸c˜ao do tipo de queijo produzido, da composi¸c˜ao inicial e do
pr´e-tratamento t´ermico dado ao leite, entre outros. Com rela¸c˜ao `a composi¸c˜ao,
o soro de leite bovino cont´em cerca de 65 g kg
-1
de s´olidos totais, dos quais 50
g kg
-1
s˜ao lactose, 6 g kg
-1
s˜ao prote´ınas, 6 g kg
-1
s˜ao cinzas, contendo 2 g
kg
-1
de nitrogˆenio n˜ao prot´eico, e 0,5 g kg
-1
de gordura (BRITZ e ROBINSON,
2008).
A Tabela 1 apresenta valores m´edios referentes `a composi¸c˜ao prot´eica do
leite (PIETER et al., 2006). Nessa Tabela pode-se observar que o soro de leite
encerra um n´umero significativo de prote´ınas, e que, segundo CHATTERTON et
al. (2006), s˜ao prote´ınas de alto valor biol´ogico e nutricional.
ARVANITOYANNIS (2008), enfatiza a ind´ustria de latic´ınios como sendo
4
Tabela 1: Composi¸c˜ao prot´eica m´edia do leite (Adaptado de PIETER et al.,
2006)
Prote´ına g kg leite
−1
g 100g Prote´ına
−1
Massa Molecular (Da)
Case´ına 26 78,1
α
S1
-Case´ına 10,7 32 ≈ 23.600
α
S2
-Case´ına 2,8 8,4 ≈ 25.200
β-Case´ına 8,6 26 23.983
κ-Case´ına 3,1 9,3 ≈ 19.550
γ-Case´ına 0,8 2,4 ≈ 20.500
Prote´ınas do Soro 6,4 19,5
β-Lactoglobulina 3,2 9,8 18.283
α-Lactoalbumina 1,2 3,7 14.176
Albumina do soro 0,4 1,2 66.267
Proteose-Peptona 0,8 2,4 4.000-40.000
Imunoglobulinas 0,8 2,4 -
Outras Prote´ınas 0,81 2,32 -
Lactoferrina 0,1 0,3 86.000
Transferrina 0,01 0,02 76.000
Prot. de Membrana 0,7 2 -
Enzimas - - -
5
uma das maiores fontes geradoras de efluentes industriais poluidores na Europa,
onde ressalta o papel do soro de leite como causador de grande impacto ambi-
ental e sugere metodologias para o seu tratamento e correta disposi¸c˜ao. A lista
dos maiores consumidores mundiais de queijo, conforme dados de 2004 apresen-
tados por esse mesmo autor, mostra que o Brasil ocupa a nona posi¸c˜ao geral,
correspondendo a um consumo m´edio de 2,6 kg (habitante x ano)
−1
, o que gera
uma quantia de um bilh˜ao e centro e oitenta e quatro milh˜oes de litros de soro
de leite por ano.
Por´em, com a crescente demanda por alimentos cada vez mais nutritivos,
acess´ıveis e com menor custo de produ¸c˜ao (MAROULIS e SARAVACOS, 2008),
o soro de leite, que at´e ent˜ao era considerado apenas como um agente poluidor,
se desp onta como uma importante fonte de nutrientes nobres, pass´ıveis de serem
recuperados e utilizados na elabora¸c˜ao de uma grande quantidade de produtos
aliment´ıcios. Como exemplo, uso em formula¸c˜oes infantis, alimentos para pessoas
doentes, em produtos de panifica¸c˜ao, entre outros (LIU, 2007).
Dentre os nutrientes presentes no soro de leite, duas prote´ınas se desta-
cam pelo seu elevado valor nutricional e funcional, a α-lactoalbumina e a β-
lactoglobulina, consideradas quantitativamente as duas mais importantes prote-
´ınas do soro (CHATTERTON et al., 2006). Atualmente, existem tecnologias e
m´etodos que permitem recuper´a-las, em escala industrial, sem perdas significati-
vas em suas funcionalidades, o que representa uma grande vantagem, pois, nesta
forma, essas prote´ınas apresentam-se sol´uveis em ´agua (LUCENA et al., 2007),
facilitando sua adi¸c˜ao em formula¸c˜oes aliment´ıcias.
2.2. α -LACTOALBUMINA E β-LACTOGLOBULINA.
Segundo DeWIT e BRONTS (1995) e CHAO (2001), as prote´ınas do soro de
leite podem ser classificadas em dois grupos principais:
6
1) uma fra¸c˜ao de globulinas, contendo principalmente β-lactoglobulina (β-Lg) e
imunoglobulinas (Ig); e
2) uma fra¸c˜ao de albuminas, que inclui a α-lactoalbumina (α-La) e as albuminas
do soro.
2.2.1 α-LACTOALBUMINA.
A α-La ´e uma prote´ına cujo percentual corresponde a aproximadamente 20
% (m/m) da quantidade de prote´ınas presentes no soro de leite bovino ( ≈ 3,5
% (m/m) do total de prote´ınas do leite).
´
E a principal prote´ına do leite humano
e desenvolve um importante papel na s´ınstese da lactose.
´
E uma prote´ına pe-
quena, cuja massa molar ´e de 14.176 D´altons. Quanto `a sua composi¸c˜ao, a α -La
´e uma prote´ına relativamente rica em triptofano (quatro res´ıduos por mol´ecula).
Tamb´em ´e rica em enxofre (1,9 %), presente na cistina (quatro liga¸c˜oes in-
tramoleculares dissulfeto por mol), e rica em metionina. A α-La n˜ao cont´em
ciste´ına (grup os sulfidrila livres). O seu ponto isoel´etrico ´e 4,8 e a solubilidade
m´ınima, quando em solu¸c˜ao de NaCl 0,5 M, ocorre tamb´em em pH 4,8 (FOX e
McSWEENEY, 1998).
O leite obtido de gados ocidentais, em geral, apresenta apenas uma variante
gen´etica da α-La (α-La B), mas nos gados oriundos de outras partes do mundo,
como o Zebu, origin´ario da
´
India, o leite pode apresentar duas variantes da
α-La, A e B, respectivamente (FOX e McSWEENEY, 1998). A α-La possui,
em sua estrutura prim´aria, 123 res´ıduos de amino´acidos, conforme representado
pela Figura 1, e tem sido observada uma certa similaridade entre a estrutura
prim´aria da α-La bovina e a estrutura prim´aria da lisozima de diferentes esp´ecies
animais. A lisozima, presente na clara do ovo de galinha, apresenta-se idˆentica
`a α-La bovina nos seus primeiros 54 res´ıduos de amino´acidos, e os pr´oximos 23
7
res´ıduos apresentam similaridades estruturais, como Ser/Thr e Asp/Glu (QASBA
e KUMAR, 1997).
Quanto `a estrutura secund´aria e terci´aria, a α-La ´e uma metaloprote´ına glo-
bular compacta ligada ao ´atomo de c´alcio, e se apresenta em solu¸c˜ao como um
elips´oide alongado na dire¸c˜ao de seu eixo maior, com dimens˜oes de (2,5 x 3,7 x
3,2) nm. Ela consiste em 26 % de α-h´elice, 14 % de estruturas-β, e 60 % de
estrutura n˜ao ordenada (FOX e McSWEENEY, 1998).
Figura 1: Estrutura prim´aria da α-lactoalbumina, mostrando liga¸c˜oes dissulfeto (li-
nhas) e a substitui¸c˜ao de amino´acidos para diferentes variantes gen´eticas (adaptado
de FOX e McSWEENEY, 1998).
A Figura 2 representa um modelo de fitas da α-La bovina, mostrando, no
centro da imagem, o ´atomo de c´alcio. A α -La apresenta forte habilidade de
liga¸c˜ao ao ´ıon c´alcio.
`
A temperatura ambiente e na ausˆencia de c´alcio, a es-
8
trutura terci´aria da α-La est´a parcialmente desdobrada, e grupos hidrof´obicos
do interior da prote´ına se tornam acess´ıveis ao seu meio externo. Na presen¸ca
de c´alcio, o estado nativo da prote´ına ´e recuperado e o interior hidrof´obico se
torna novamente inacess´ıvel (NOPPE et al., 1999). Muitas s˜ao as proprieda-
des funcionais associadas a α -La, e entre elas, CHATTERTON et al. (2006) e
MEZZAROBA et al. (2006) citam as seguintes:
- Propriedades anti-carcinogˆenicas e antimicrobianas,
- Redu¸c˜ao do estado de estresse e efeito hipocolesterolˆemico,
- Efeito contraceptivo (aplica¸c˜ao farmacol´ogica) (SHUR, 1985)
- Importantes fun¸c˜oes metab´olicas e fisiol´ogicas.
Figura 2: Estrutura terci´aria da α-lactoalbumina bovina gerada a partir da an´alise por
dispers˜ao de Raios-X, mostrando, em azul os dom´ınios-α, em verde os dom´ınios-β,
em laranja o ´ıon Ca
++
e, em preto, as liga¸c˜oes dissulfeto. (TROULLIER et al., 2000).
9
2.2.2 β-LACTOGLOBULINA.
A β-Lg ´e a prote´ına presente em maior quantidade no soro de leite, represen-
tando cerca de 50 % (m/m) do total das prote´ınas do soro e at´e 12 % (m/m) das
prote´ınas presentes no leite (FOX e McSWEENEY, 1998). Assim, suas proprie-
dades tendem a dominar as propriedades das formula¸c˜oes aliment´ıcias elaboradas
a partir do soro de leite (PIETER et al., 2006).
A β-Lg ´e uma prote´ına globular t´ıpica. Tem sido estudada extensivamente
e ´e muito bem caracterizada. Sua solubilidade depende fortemente do pH e da
for¸ca iˆonica do meio, e suas estruturas secund´arias e terci´arias (Figura 3) s˜ao
bem conhecidas (PIETER et al., 2006).
A β-Lg ´e a principal prote´ına do soro no leite em bovinos, ovinos, caprinos e
bubalinos, embora apresente pequenas diferen¸cas quando se compara a β-Lg de
diferentes esp´ecies. H´a alguns anos, acreditava-se que a β-Lg estivesse presente
apenas no leite de ruminantes, mas agora j´a se sabe que sua presen¸ca ocorre
tamb´em no leite de su´ınos, ´egua, canguru, golfinho e manati
1
, entre outros. A
β-Lg, contudo, n˜ao ocorre no leite de humanos, ratos, camundongos ou porco
da guin´e. Nestes, a α-La ´e, portanto, a principal prote´ına do soro (PIETER et
al., 2006).
Quatro variantes gen´eticas da β-Lg tˆem sido identificadas no leite bovino.
S˜ao as variantes A, B, C e D, respectivamente. A quinta variante, que cont´em
carboidrato, foi identificada em bovinos oriundos da Austr´alia (PIETER et al.,
2006).
A β-Lg ´e rica em amino´acidos sulfurados, o que a confere um elevado valor
biol´ogico (Valor Biol´ogico de 110). Ela cont´em cistina e ciste´ına, e o seu ponto
1
Animal mam´ıfero (Trichechus mamatus), com cor e aspecto geral do peixe-boi, pre-
sente nas Antilhas, costa da Venezuela e Guianas, at´e o litoral do PA. (Fonte: Dicion´ario
Aur´elio da L´ıngua Portuguesa, 2004 )
10
isoel´etrico ´e 5,2. A ciste´ına ´e importante porque ela reage e forma liga¸c˜oes
dissulfeto com a κ-case´ına, afetando a coagula¸c˜ao do leite na forma¸c˜ao do queijo.
Tamb´em ´e reconhecida por conferir ao leite o aroma caracter´ıstico de ”leite
pasteurizado”, ap´os o seu processo de pasteuriza¸c˜ao (PIETER et al., 2006).
A estrutura prim´aria da β-Lg consiste de 162 res´ıduos de amino´acidos por
monˆomero, e sua estrutura secund´aria, quando estudada na faixa de pH de 2
a 6, apresenta 10–15 % de α-h´elice, 43 % de folha-β e 47 % de estrutura n˜ao
ordenada. A estrutura terci´aria da β-Lg foi estudada por cristalografia (Raios-X),
e se mostra como uma prote´ına globular muito compacta (PIETER et al., 2006).
CHATTERTON et al. (2006), atribuem `a β-Lg algumas propriedades funci-
onais, entre as quais pode-se destacar:
- Excelentes caracter´ısticas de forma¸c˜ao de gel e espuma para aplica¸c˜oes na
ind´ustria aliment´ıcia e farmacˆeutica,
- Atividade antimicrobiana, antiviral e anticarcinogˆenica,
- Inibi¸c˜ao nos processos de ades˜ao microbiana, prevenindo a coloniza¸c˜ao de
pat´ogenos quando nos est´agios iniciais da infec¸c˜ao,
- Efeito hipocolesterolˆemico,
- Atua de modo a promover o transporte de substratos hidrof´obicos, como o
retinol, em n´ıvel intestinal, facilitando o seu metabolismo, entre outras.
A β-Lg, por´em, devido ao fato de n˜ao estar presente no leite humano, ´e
apontada como potencial fonte de alergias em crian¸cas, e isso ocorre quando
se faz o consumo de alimentos elaborados com leite, soro ou algum de seus
derivados contendo essa mol´ecula, (GARC
´
IA et al., 1998 e WOOD, 2007).
11
A Figura 3 ´e uma representa¸c˜ao esquem´atica da estrutura terci´aria da β-Lg.
Figura 3: Representa¸c˜ao esquem´atica da estrutura terci´aria da β-lactoglobulina.
(Fonte: FOX e McSWEENEY, 1998)
2.3. PROPRIEDADES E FRACIONAMENTO DAS PROTE
´
INAS.
Muitas s˜ao as t´ecnicas que podem ser empregadas para recuperar e purificar
as prote´ınas presentes no soro de leite e em outros materiais. Nos ´ultimos anos,
um grande n´umero de m´etodos utilizados para purificar substˆancias de origem
biol´ogica tˆem se tornado dispon´ıvel. Os mais importantes m´etodos e tecnolo-
gias utilizados para grandes mol´eculas, polipept´ıdeos e particularmente prote´ınas,
compreendem (ARMAREGO e CHAI, 2003):
- Centrifuga¸c˜ao,
- Complexa¸c˜ao (DeWIT e BRONTS, 1995),
- Cromatografia de afinidade,
- Cromatografias utilizando matrizes de troca iˆonica e hidroxilapatita,
- Cristaliza¸c˜ao, entre outras. - Di´alise,
- Filtra¸c˜ao em gel de agarose e em gel de poliacrilamida,
12
- Precipita¸c˜ao,
- Ultrafiltra¸c˜ao,
Estes m´etodos e tecnologias podem ser utilizados isoladamente ou em con-
junto, e est˜ao devidamente descritos e exemplificados em literaturas t´ecnicas,
como em DEUTSCHER (1990).
2.3.1. PRECIPITAC¸
˜
AO E SOLUBILIDADE DAS PROTE
´
INAS.
As propriedades funcionais das prote´ınas s˜ao freq¨uentemente influenciadas
pela sua solubilidade, tais como a viscosidade, capacidade de forma¸c˜ao de es-
puma, capacidade de emulsifica¸c˜ao, e forma¸c˜ao de gel, entre outras. Prote´ınas
insol´uveis tˆem aplica¸c˜ao muito limitada para uso no preparo de alimentos.
Segundo FENNEMA (1996), a solubilidade de uma prote´ına ´e a manifesta¸c˜ao
termodinˆamica do equil´ıbrio das intera¸c˜oes entre prote´ına-prote´ına, prote´ına-
solvente e solvente-solvente, conforme representado pela Equa¸c˜ao 1.
Prote´ına-Prote´ına + Solvente-Solvente Prote´ına-Solvente (1)
As principais intera¸c˜oes que influenciam as caracter´ısticas de solubilidade de
prote´ınas s˜ao de natureza hidrof´obica e eletrost´atica. Intera¸c˜oes hidrof´obicas
promovem intera¸c˜oes prote´ına-prote´ına e resultam na redu¸c˜ao da solubilidade,
enquanto que intera¸c˜oes eletrost´aticas promovem intera¸c˜oes entre a prote´ına e
a ´agua, resultando no aumento da solubilidade. A exemplo, res´ıduos iˆonicos
introduzem dois tipos de for¸cas repulsivas entre as mol´eculas da prote´ına em
solu¸c˜ao, favorecendo a solubiliza¸c˜ao das mesmas. A primeira envolve repuls˜ao
eletrost´atica entre as mol´eculas de prote´ına, pela presen¸ca de carga l´ıquida po-
sitiva ou negativa em qualquer pH diferente daquele no ponto isoel´etrico. A
segunda envolve a repuls˜ao entre as camadas de hidrata¸c˜ao ao redor dos grupos
13
iˆonicos.
BIGELOW (1967), citado por FENNEMA (1996), propˆos que a solubilidade
de uma prote´ına est´a fundamentalmente relacionada com a hidrofobicidade m´edia
dos res´ıduos de amino´acidos e a freq¨uˆencia de carga. A hidrofobicidade m´edia
(Equa¸c˜ao 2) ´e definida como:
∆g = Σ
∆g
res´ıduo
n
(2)
onde ∆g
res´ıduo
´e a hidrofobicidade de cada cadeia lateral de res´ıduos de amino´acidos,
e n ´e o n´umero total de res´ıduos na prote´ına. A freq¨uˆencia de carga (Equa¸c˜ao 3)
´e definida como:
σ =
(n
+
+ n
−
)
n
(3)
onde n
+
e n
−
s˜ao o n´umero total de res´ıduos carregados positiva e negativa-
mente, respectivamente, e n ´e o n´umero total de res´ıduos. De acordo com BIGE-
LOW (1967), quanto menor a hidrofobicidade m´edia e quanto maior a freq¨uˆencia
de carga, maior ser´a a solubilidade da prote´ına em solu¸c˜ao.
Embora esta correla¸c˜ao emp´ırica seja verdadeira para muitas das prote´ınas,
ela n˜ao ´e absoluta. A abordagem de BIGELOW (1967) ´e incompleta visto que a
solubilidade de uma prote´ına ´e ditada pelos car´ateres hidrof´ılico e hidrof´obico da
superf´ıcie da prote´ına que est´a em contato com a ´agua presente na vizinhan¸ca,
ao inv´es de ser a hidrofobicidade m´edia e a freq¨uˆencia de carga da mol´ecula,
como um todo.
Segundo FENNEMA (1996), baseado nas caracter´ısticas de solubilidade, as
prote´ınas s˜ao classificadas em quatro categorias:
- Albuminas: prote´ınas que s˜ao sol´uveis em ´agua, em pH 6,6 (ex: albuminas do
soro, ovoalbumina e α-lactoalbumina);
- Globulinas: prote´ınas sol´uveis em solu¸c˜oes dilu´ıdas de sal, no pH 7,0 (ex:
14
glicinina, faseolina e β-lactoglobulina);
- Glutelinas: s˜ao aquelas sol´uveis apenas em solu¸c˜oes ´acidas (pH 2,0) e alcalinas
(pH 12), (ex: glutelinas do trigo);
- Prolaminas: s˜ao aquelas sol ´uveis em etanol 70 % (ex: gliadinas).
Tanto as prolaminas quanto as glutelinas s˜ao prote´ınas altamente hidrof´obicas.
Em adi¸c˜ao a essas propriedades f´ısico-qu´ımicas intr´ınsecas, a solubilidade ´e in-
fluenciada por diversas condi¸c˜oes da solu¸c˜ao, como pH, for¸ca iˆonica, temperatura
e a presen¸ca de solventes orgˆanicos.
2.3.2. pH, TEMPERATURA E SOLUBILIDADE DAS PROTE
´
INAS.
Em valores de pH abaixo e acima do pH isoel´etrico as prote´ınas mantˆem uma
carga l´ıquida positiva ou negativa, respectivamente. A repuls˜ao eletrost´atica
e a hidrata¸c˜ao dos res´ıduos carregados promovem a solubiliza¸c˜ao da prote´ına.
Quando, em um gr´afico, a solubilidade ´e plotada em fun¸c˜ao do pH (Figura 4),
muitas prote´ınas exibem uma curva em forma de ”U”. A solubilidade m´ınima
ocorre em torno do pH isoel´etrico das prote´ınas. A maioria das prote´ınas encon-
tradas em alimentos exibem uma solubilidade m´ınima na faixa de pH que vai de
4 a 5 (pH isoel´etrico), e solubilidade m´axima em pH alcalino (FENNEMA, 1996).
A ocorrˆencia de solubilidade m´ınima no ponto isoel´etrico se deve primaria-
mente `a falta de repuls˜ao eletrost´atica l´ıquida, que promove agrega¸c˜ao e preci-
pita¸c˜ao via intera¸c˜oes hidrof´obicas. Algumas prote´ınas aliment´ıcias, como a β-Lg
(pI 5,2) e BSA (pI 5,3) s˜ao altamente sol´uveis em seu pH isoel´etrico. Isso ocorre
porque essas prote´ınas apresentam uma grande propor¸c˜ao de res´ıduos hidrof´ılicos
em sua superf´ıcie em rela¸c˜ao aos res´ıduos hidrof´obicos ali presentes (FENNEMA,
1996). Deve-se lembrar, por´em, que muito embora uma prote´ına esteja com
carga l´ıquida igual a zero em seu ponto isoel´etrico, ela ainda possui cargas, mas
a quantidade de cargas negativas e positivas em sua superf´ıcie s˜ao, em m´odulo,
15
iguais. Se a hidrofilicidade e as for¸cas de repuls˜ao na camada de hidrata¸c˜ao,
que podem surgir a partir desses res´ıduos carregados, forem maiores do que as
intera¸c˜oes hidrof´obicas prote´ına-prote´ına, ent˜ao a prote´ına permanecer´a sol´uvel
em seu ponto isoel´etrico.
Visto que muitas prote´ınas s˜ao altamente sol´uveis em pH alcalino (pH 8 a 9),
a extra¸c˜ao de prote´ınas de origem vegetal, tais como aquelas presentes no farelo
de soja (ARA
´
UJO, 2004), ´e feita nessa faixa de pH, e a prote´ına ser´a recuperada
promovendo sua precipita¸c˜ao exatamente em seu ponto isoel´etrico.
Figura 4: Solubilidade da prote´ına em fun¸c˜ao do pH (adaptado de ARA
´
UJO, 2004)
16
Em pH e for¸ca iˆonica constantes, a solubilidade da maioria das prote´ınas
geralmente aumenta com a temperatura entre (0 e 40) ℃. Exce¸c˜oes ocorrem
com prote´ınas altamente hidrof´obicas, tais como a β-case´ına e algumas prote´ınas
de cereais, que exibem uma correla¸c˜ao negativa com a temperatura.
2.3.3. COMPLEXAC¸
˜
AO DE
´
IONS COM AGENTES QUELANTES.
Segundo o Dicion´ario de Ciˆencia e Tecnologia de Alimentos, do International
Food Information Service (IFIS, 2005), um agente quelante ´e uma substˆancia
que forma uma uni˜ao est´avel com ´ıons met´alicos livres presentes em um meio, e
que pode ser utilizado em alimentos para ajudar a controlar rea¸c˜oes que ocorrem
entre tra¸cos de metais e outros componentes desse alimento.
Nestes casos, os agentes quelantes seq¨uestram ´ıons met´alicos (e por isso
s˜ao tamb´em denominados ”seq¨uestrantes”) prevenindo, p or exemplo, a oxida¸c˜ao
lip´ıdica catalisada por eles. Atuam reprimindo a cristaliza¸c˜ao indesejada e a perda
de qualidade nutricional, em uma variedade de alimentos.
Entre os agentes qu´ımicos quelantes citados neste dicion´ario para uso em
alimentos est˜ao:
-
´
Acido Tart´arico;
- Citrato de S´odio e
´
Acido C´ıtrico;
- Dextrinas e ciclodextrinas; - EDTA (´acido etilenodiaminotetrac´etico);
- Glucona-δ-lactona;
- Tartarato de s´odio e c´alcio;
O ´acido l´atico, embora seja considerado por alguns autores como comple-
xante (LUCENA et al., 2006 e 2007), n˜ao aparece citado em outras literaturas
consultadas com essa fun¸c˜ao. Algumas das fun¸c˜oes atribu´ıdas ao ´acido l´atico,
citadas por outros autores, est˜ao apresentadas a seguir:
17
- Acidulante e conservante (IFIS, 2005);
- Agente real¸cador de flavour, humectante, agente de controle de pH, acidificante
(Committee on Food Chemicals Codex, 2004);
- Acidulante e agente real¸cador de flavour (SMITH e HONG-SHUM, 2003).
2.4. COMBINAC¸
˜
AO DE T
´
ECNICAS PARA RECUPERAR PROTE
´
INAS.
Estudos tˆem mostrado que a combina¸c˜ao de diferentes metodologias de re-
cupera¸c˜ao de prote´ınas pode ser a chave para se obter bons resultados no fraci-
onamento das prote´ınas do soro (LUCENA et al., 2007).
Neste trabalho procedeu-se `a combina¸c˜ao de duas das t´ecnicas utilizadas na
recupera¸c˜ao de prote´ınas: o abaixamento do pH, para promover o enfraqueci-
mento das liga¸c˜oes entre o c´alcio e a α-La, e a complexa¸c˜ao desse ´ıon com um
complexante.
A α-La ´e uma metaloprote´ına, e ela se liga ao ´atomo de c´alcio (Figura 5) na
propor¸c˜ao de um´ıon Ca
2+
para cada mol´ecula de prote´ına (FOX e McSWEENEY,
1998). O´ıon c´alcio permanece, ent˜ao, no interior de uma estrutura tridimensional
empacotada, ligado a quatro res´ıduos de Aspartato (Asp - amino´acido com grupo
lateral carregado negativamente). Esses res´ıduos s˜ao altamente conservados em
todas as mol´eculas de α-La e lisozima. A α-La, quando associada ao c´alcio, ´e
bastante est´avel termicamente (das prote´ınas do soro, ´e a mais termoest´avel),
por´em, quando o pH ´e reduzido para valores inferiores a cinco (pH < 5), os
res´ıduos de Asp se tornam protonados, e perdem sua capacidade de se ligar ao
Ca
2+
(FOX e McSWEENEY, 1998).
18
Na temperatura ambiente e na ausˆencia de Ca
2+
, a estrutura terci´aria da α-
La se torna parcialmente desdobrada, e grupos hidrof´obicos do interior da prote´ına
tornam-se acess´ıveis ao meio externo, e a α-La torna-se, nestas condi¸c˜oes, in-
sol´uvel (NOPPE et al., 1999). Com a nova adi¸c˜ao de ´ıons Ca
2+
, a estrutura
nativa da prote´ına ´e novamente recuperada e os grupos hidrof´obicos anterior-
mente expostos se realocam novamente para o interior da prote´ına e ela se torna
novamente sol´uvel (ALOMIRAH e ALLI, 2004).
Figura 5: Representa¸c˜ao esquem´atica das liga¸c˜oes do ´atomo de c´alcio no interior da
α-La (adaptado de FOX e McSWEENEY, 1998).
19
Em um trabalho desenvolvido por FOX e McSWEENEY (1998), o precipitado
(fra¸c˜ao rica em α-La) obtido pela complexa¸c˜ao dos ´ıons c´alcio e em condi¸c˜oes de
baixo pH, foi submetido `a centrifuga¸c˜ao, ocorrendo a separa¸c˜ao do sobrenadante,
rico em β-Lg.
A α-La e a β-Lg apresentam, portanto, caracter´ısticas f´ısico-qu´ımicas dife-
rentes, o que permite sua separa¸c˜ao combinando a adi¸c˜ao de ´acido e a remo¸c˜ao
do ´ıon c´alcio, presente na α-La, pela adi¸c˜ao de um agente complexante.
Neste trabalho o objetivo principal foi o de avaliar a combina¸c˜ao dos trata-
mentos que permitisse obter de forma otimizada duas fra¸c˜oes, uma rica em α-La
e uma rica em β-Lg, a partir do WPI, sob a forma de precipitado e sobrenadante,
respectivamente.
20
3. MATERIAIS E M
´
ETODOS
Os experimentos foram realizados no Laborat´orio de Processos de Separa¸c˜ao
(LPS) do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de
Vi¸cosa, MG.
3.1. AVALIAC¸
˜
AO DA CONCENTRAC¸
˜
AO DE PROTE
´
INAS NA MAT
´
ERIA-PRIMA.
Neste trabalho foi utilizado como mat´eria-prima o isolado prot´eico de soro
de leite (WPI), produzido pela Davisco Foods International Inc.(USA), da marca
BiPRO
®
. Este produto foi adquirido em um pacote de 15 kg, sob a forma de p´o.
Da embalagem foi coletada, em um b´equer, uma amostra de aproximadamente
900 g, que permaneceu em estufa a 45 ℃, por cerca de uma semana, at´e peso
constante. Essa quantidade recebeu o nome de estoque de WPI. Do estoque
de WPI, foram coletadas trˆes amostras individuais, sendo que cada amostra foi
retirada de uma zona ou ponto diferente no interior do b´equer.
Cada uma das amostras foi submetida `a an´alise da concentra¸c˜ao de prote´ına
pelo m´etodo de Kjeldahl, conforme descrito pelo Committee on Food Chemicals
Codex, 2004, com N x 6,38.
Em um b´equer de vidro de capacidade de 100 ml, aproximadamente 15 g
de WPI foram pesados acuradamente em uma balan¸ca anal´ıtica (Denver Instru-
ments, USA) e aproximadamente 80 ml de ´agua (Sistema MilliQ
®
, MilliPore)
foi adicionado ao b´equer, e este deixado em repouso para a solubiliza¸c˜ao das
prote´ınas. Decorrido um per´ıodo de 6 horas, o WPI, que se encontrava completa-
mente solubilizado, foi transferido quantitativamente para um bal˜ao volum´etrico
de 250 ml. O volume do bal˜ao foi completado com ´agua MilliQ
®
, em seguida o
bal˜ao foi tampado e agitado suavemente (evitando a forma¸c˜ao de bolhas). Esse
bal˜ao foi identificado como Bal˜ao 1.
21
Do Bal˜ao 1 foi coletada uma al´ıquota de 25 ml, em pipeta volum´etrica, a
qual foi transferida para um outro bal˜ao de 250 ml, identificado como Bal˜ao 2.
Este ´ultimo bal˜ao teve seu volume completado com ´agua MilliQ
®
, foi tampado,
e agitado suavemente. Uma amostra de aproximadamente 1 ml do Bal˜ao 2 foi
filtrada em membrana, de diˆametro de poro de 0,45 µm e submetida a an´alise em
HPLC (Shimadzu, Jap˜ao) para quantifica¸c˜ao das prote´ınas. As an´alises foram
feitas em quatro repeti¸c˜oes e a separa¸c˜ao foi feita por fase reversa.
3.2. DESIGN EXPERIMENTAL.
Antes que o experimento fosse efetivamente inicializado, foram feitas v´arias
simula¸c˜oes e cen´arios computacionais utilizando-se o pacote estat´ıstico SAS
®
.
O m´odulo utilizado para as simula¸c˜oes do experimento foi o SAS/ADX
®
(In-
terface for Design of Experiments), que permitiu propor um design experimental
capaz de testar as intera¸c˜oes principais e analisar graficamente as poss´ıveis in-
tera¸c˜oes secund´arias entre os fatores em estudo.
Uma das vantagens desse m´odulo (ADX) ´e que ele permitiu estabelecer uma
fun¸c˜ao-objetivo que foi utilizada para promover otimiza¸c˜ao nos resultados finais,
apontando a melhor combina¸c˜ao de tratamentos, de modo a maximizar a recu-
pera¸c˜ao da α-La e minimizar a presen¸ca da β-Lg no precipitado, e, de modo
an´alogo, para o sobrenadante, permitiu maximizar a recupera¸c˜ao de β-Lg e mi-
nimizar a recupera¸c˜ao de α-La, tudo isso levando em considera¸c˜ao que o design
deveria apresentar o n´umero m´ınimo (por´em, necess´ario) de experimentos, de
modo a se obter resultados corretos, e reduzir o tempo de an´alise, bem como o
tempo de ocupa¸c˜ao dos equipamentos e, conseq¨uentemente, os custos envolvidos
nas an´alises.
As vari´aveis de resposta deste experimento est˜ao apresentadas na Tabela 2.
Os Fatores e seus N´ıveis, testados neste experimento com o objetivo de obter
22
Tabela 2: Vari´aveis de Resposta do Experimento
Vari´avel de Resposta Descri¸c˜ao
REC ALFA Percentual de Recupera¸c˜ao da α-La
REC BETA Percentual de Recupera¸c˜ao da β-Lg
as condi¸c˜oes que otimizam a recupera¸c˜ao da α-La no precipitado, e a recupera¸c˜ao
de β-Lg no sobrenadante dos tratamentos, est˜ao apresentados na Tabela 3.
Tabela 3: Fatores e N´ıveis avaliados no experimento
Fator Descri¸c˜ao Baixo Central Alto
TEMPO Tempo de Agita¸c˜ao (min) 30 45 60
TEMPER Temperatura (℃). 25 35 45
pH Valor de pH ajustado com ´acido. 3,9 4,2 4,5
CONCWPI Concentra¸c˜ao % (m/m) de WPI. 9 10,5 12
COMPLEX Tip o de Complexante. Citrato* — Lactato**
* Citrato de s´odio trib´asico ** Lactato de s´odio
As vari´aveis de resposta foram avaliadas tanto para o precipitado quanto para
o sobrenadante.
O design experimental gerado pelo SAS
®
, e adotado neste trabalho, ´e um
experimento fatorial 1/4 fracionado, de dois n´ıveis, resolu¸c˜ao igual a trˆes, e est´a
reproduzido na Tabela 4. Essa classe de experimento tem seu uso recomendado
para investiga¸c˜oes explorat´orias, quando se deseja avaliar apenas as intera¸c˜oes
principais entre os fatores em estudo.
´
E apropriado para quando h´a um n´umero
grande de fatores e quando ´e desej´avel que se tenha um n´umero m´ınimo de
experimentos.
23
Tabela 4: Design Experimental - Fatorial Fracionado 1/4
Trat. Rep. TEMPO TEMPER PH CONCWPI* COMPLEX**
1 1 30 25 3,9 12 Lactato
1 2 30 25 3,9 12 Lactato
2 1 60 25 3,9 9 Citrato
2 2 60 25 3,9 9 Citrato
3 1 30 45 3,9 9 Lactato
3 2 30 45 3,9 9 Lactato
4 1 60 45 3,9 12 Citrato
4 2 60 45 3,9 12 Citrato
5 1 30 25 4,5 12 Citrato
5 2 30 25 4,5 12 Citrato
6 1 60 25 4,5 9 Lactato
6 2 60 25 4,5 9 Lactato
7 1 30 45 4,5 9 Citrato
7 2 30 45 4,5 9 Citrato
8 1 60 45 4,5 12 Lactato
8 2 60 45 4,5 12 Lactato
* Em % (m/m) ** Lactato de s´odio e Citrato de s´odio trib´asico
3.3. DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL.
O citrato de s´odio trib´asico e o lactato de s´odio foram utilizados com a finali-
dade de complexar o c´alcio presente no interior da mol´ecula de α-La. A pesagem
do WPI e do complexante, para cada tratamento, foi feita, a partir do estoque
de WPI, em b´equer de vidro com capacidade para 80 ml. Ambos foram pesados
no mesmo b´equer.
A quantidade de complexante a ser pesada foi definida com base na sugest˜ao
24
de ALOMIRAH e ALLI (2004) e foi de 0, 15 moles L
−1
para todos os tratamentos.
Portanto, a massa de complexante foi de (1,9355±0,0005) g para os tratamentos
utilizando o citrato de s´odio trib´asico, e de (1,6809±0,0005) g, para os trata-
mentos utilizando o lactato de s´odio. Ap´os a pesagem, aproximadamente 40ml
de ´agua MilliQ
®
foram adicionados ao b´equer contendo o WPI e o complexante.
O b´equer foi coberto com filme de PVC e deixado em repouso, por cerca de 2 a
4 horas, em temperatura de aproximadamente 5 ℃, para haver a hidrada¸c˜ao das
prote´ınas presentes, solubiliza¸c˜ao parcial do WPI e evitar a forma¸c˜ao de bolhas.
A temperatura de geladeira foi utilizada para retardar a a¸c˜ao deterioradora de
microrganismos.
Ap´os a solubiliza¸c˜ao do WPI, o sistema foi deixado sob agita¸c˜ao suave em
agitador magn´etico. O conte´udo do b´equer foi acidificado com solu¸c˜ao de ´acido
c´ıtrico ou l´atico, na concentra¸c˜ao de 3 moles Litro
−1
(de acordo com o trata-
mento), com o uso de pipeta de Pasteur. O valor do pH foi constantemente
monitorado com o pHmetro (MB-10, Marte Ind. e Com. Ltda), at´e alcan¸car o
valor de pH estabelecido para o tratamento, quando a agita¸c˜ao foi desligada e
o conte´udo do b´equer (≈ 45 ml) foi transferido quantitativa e cuidadosamente
para um bal˜ao volum´etrico de 50 ml, o volume foi completado com solu¸c˜ao ´acida,
feita com o mesmo ´acido utilizado no referido tratamento, e no mesmo valor de
pH do tratamento.
Em seguida foram coletadas duas al´ıquotas de 2 ml cada, utilizando uma
pipeta volum´etrica devidamente calibrada com ´agua MilliQ
®
, e as al´ıquotas foram
transferidas para um microtubo (tubo Eppendorf
®
) com capacidade para 2 ml.
Os dois tubos foram fechados, identificados ( R
1
, Repeti¸c˜ao 1 e R
2
, Repeti¸c˜ao
2), e agitados em um agitador de tubos montado no interior de uma estufa BOD,
na temperatura do tratamento, denominada temperatura de processo. O tempo
de agita¸c˜ao e a temperatura da estufa foram continuamente monitorados.
25
Transcorrido o temp o de agita¸c˜ao, os tubos foram transferidos para uma mi-
crocentr´ıfuga (Force7
®
, LabNet) e submetidos a um gradiente de centrifuga¸c˜ao
crescente (Tabela 5).
Tabela 5: Gradiente de Centrifuga¸c˜ao
Equivalente em g Tempo (min.)
300 2
600 2
1.800 4
7.200 12
Segundo LUCENA et al. (2006), ap´os a acidifica¸c˜ao, parte da β-Lg ´e co-
precipitada com a α-La. Alguns autores, como DeWIT e BRONTS (1995), su-
gerem que, ap´os a adi¸c˜ao do agente seq¨uestrante do ´ıon c´alcio e a acidifica¸c˜ao, o
sistema deve permanecer em repouso, para que a α-La se sedimente lentamente,
deixando a β-Lg em solu¸c˜ao, e, assim, arraste consigo uma quantidade m´ınima
dessa prote´ına, considerada contaminante. Por esse motivo foi proposto e utili-
zado neste exp erimento um gradiente de centrifuga¸c˜ao que teve como objetivo
reduzir, ao m´ınimo, a co-precipita¸c˜ao da β-Lg.
O sobrenadante (supostamente rico em β-Lg) foi transferido para um tubo
graduado de centr´ıfuga com capacidade para 15 ml, e o seu volume completado
at´e a marca de 10 ml com solu¸c˜ao de NaCl 7 %. O tubo de centr´ıfuga foi
fechado, agitado em um agitador el´etrico para tubos, e centrifugado a 4.500 x
g, por 15 minutos, com o objetivo de lavar o sobrenadante com solu¸c˜ao salina,
visto que a β-Lg ´e sol´uvel em solu¸c˜ao de cloreto de s´odio em baixas e moderadas
concentra¸c˜oes, e outras prote´ınas presentes no sobrenadante seriam eliminadas
sob a forma de precipitado.
Ap´os a centrifuga¸c˜ao, transferiu-se o sobrenadante para um bal˜ao volum´etrico
26
de 50 ml cujo menisco foi ajustado com ´agua acidificada, no mesmo pH de
trabalho. Ap´os completar o volume, a solu¸c˜ao foi homogeneizada, uma al´ıquota
de 2 ml retirada, filtrada em membrana MilliPore
®
de 0,45 µm, e a concentra¸c˜ao
das prote´ınas α-La e β-Lg foi analisada por cromatografia de fase reversa, em
coluna C18, em HPLC.
O precipitado (supostamente rico em α-La) foi triturado mecanicamente com
o aux´ılio de uma haste de a¸co, transferido quantitativamente para um tubo gra-
duado de centr´ıfuga, com capacidade para 15 ml, e o seu volume foi completado
at´e a marca de 10 ml com solu¸c˜ao de NaCl 7 %. Ao ser transferido do tubo
Eppendorf
®
para o tubo de centr´ıfuga, o tubo Eppendorf
®
foi exaustivamente
lavado com solu¸c˜ao de NaCl para garantir a total transferˆencia do precipitado, e
as ´aguas da lavagem foram juntadas ao precipitado que j´a havia sido transferido
para o tubo de centr´ıfuga.
O tubo de centr´ıfuga foi fechado, agitado em um agitador el´etrico para tubos,
e submetido `a centrifuga¸c˜ao de 4.500 x g por 15 minutos.
Esse procedimento teve como objetivo promover uma lavagem do precipitado,
removendo prote´ınas sol´uveis em solu¸c˜ao salina. O precipitado era supostamente
constitu´ıdo por α-La, visto que ela n˜ao ´e sol´uvel em NaCl 7 %
Ap´os a centrifuga¸c˜ao, o sobrenadante foi descartado, e o precipitado res-
suspendido em solu¸c˜ao de CaCl
2
na concentra¸c˜ao de 0,1 molar, previamente
preparada, filtrada e mantida sob refrigera¸c˜ao. O processo de ressuspens˜ao do
precipitado foi realizado em um b´equer de vidro, com capacidade para 50 ml, e
feito sob agita¸c˜ao, usando um pequeno agitador magn´etico (≈ 1 cm de com-
primento). Durante a ressuspens˜ao, o pH foi monitorado por um pHmetro de
bancada (MB-10, Marte Ind. Com. Ltda.) e o seu valor final corrigido para 7,5
com NaOH 0,1 moles Litro
−1
. O volume final presente no b´equer, ap´os o ajuste
do pH era de aproximadamente 45 ml.
27
O precipitado, ressuspendido em solu¸c˜ao de CaCl
2
e com o pH corrigido para
7,5, foi transferido para um tubo de centr´ıfuga com capacidade para 50 ml. Em
seguida, esse tubo foi submetido `a centrifuga¸c˜ao de 4.500 x g por 15 minutos.
Decorridos os 15 minutos de centrifuga¸c˜ao, o tubo foi retirado da centr´ıfuga
e o precipitado descartado.
Transferiu-se o sobrenadante para um bal˜ao volum´etrico de 50 ml cujo me-
nisco era ajustado com ´agua MilliQ
®
. O pH final esperado para a solu¸c˜ao contida
no bal˜ao, estava entre 7,0 e 7,5, valor verificado com o pHmetro em cada re-
peti¸c˜ao e em todos os tratamentos.
Ap´os completar o volume, tampou-se o bal˜ao com filme de PVC, homogene-
izou-se o seu conte´udo, e retirou-se uma al´ıquota de 2 ml, a qual era filtrada em
membrana MilliPore
®
de 0,45 µm, e a concentra¸c˜ao de α-La e β-Lg analisada
em um HPLC, por cromatografia l´ıquida de fase reversa em coluna C18.
3.4. AN
´
ALISE CROMATOGR
´
AFICA.
A an´alise das prote´ınas α-La e β-Lg foi realizada por cromatografia l´ıquida
de alto desempenho (HPLC), utilizando-se um cromat´ografo Shimadzu
®
(mo-
delo LC–10VP), composto por duas bombas dosadoras anal´ıticas (modelo LC–
10ADVP), autoinjetor para 150 amostras (modelo SIL–10ADVP), detector de
feixe de diodos UV-Vis´ıvel (modelo SPD–M10AVP), forno com controle de tem-
peratura da coluna (modelo CTO–10AVP), unidade de controle (modelo SCL–
10AV), coluna C18 (Shim-Pack VP-ODS 150Lx4.6, Shimadzu), coluna de guarda
(modelo CLCG-ODS, 10mm x 4mm) e o software Class–VP vers˜ao 5.6.
As condi¸c˜oes anal´ıticas foram (FERREIRA, 2001):
• Fase m´ovel A: Solu¸c˜ao de NaCl 0,15 Molar, em pH 2,5 (acidificado com
HCL, devidamente filtrada e desgaseificada);
28
• Fase m´ovel B: Acetonitrila (100 %), devidamente filtrada e desgaseificada;
• Vaz˜ao da fase m´ovel: 1ml min
−1
;
• Temperatura da coluna: 40 ℃;
• Comprimento de onda para detec¸c˜ao: 205 nm;
• Volume de inje¸c˜ao da amostra: 20 µL;
O gradiente foi programado conforme apresentado na Tabela 6:
Tabela 6: Gradiente descont´ınuo da Fase M´ovel - RP-C18-HPLC
Concentra¸c˜oes Iniciais Concentra¸c˜oes Finais Tempo de Dura¸c˜ao (min.)
100 % de A, 0 % de B 64 % de A, 36 % de B 3
64 % de A, 36 % de B 45 % de A, 55 % de B 18
45 % de A, 55 % de B 45 % de A, 55 % de B 2
45 % de A, 55 % de B 100 % de A, 0 % de B 10
3.5. CURVAS DE CALIBRAC¸
˜
AO.
As curvas de calibra¸c˜ao para a α-La e β-Lg foram constru´ıdas a partir de
solu¸c˜oes feitas com padr˜ao, grau HPLC, dessas prote´ınas, respectivamente, em
concentra¸c˜oes na faixa de (0,33 a 3,51) mg ml
−1
para a α-La, e 0,294 a 3,508
mg ml
−1
para β-Lg.
A rela¸c˜ao entre as ´areas dos picos dos cromatogramas e a concentra¸c˜ao
das prote´ınas foi expressa por uma equa¸c˜ao linear de primeiro grau, ajustada
aos dados experimentais. O ajuste das curvas foi feito utilizando-se o pacote
estat´ıstico SAS
®
, atrav´es do Proc GLM e Proc Reg.
29
O coeficiente de determina¸c˜ao (R
2
) e a dispers˜ao gr´afica dos res´ıduos es-
tudentizados foram crit´erios utilizados para avaliar a qualidade das curvas de
calibra¸c˜ao.
3.6. REAGENTES E EQUIPAMENTOS.
3.6.1 REAGENTES E MEMBRANAS.
- Acetonitrila grau HPLC (99,99 % pureza)
-
´
Acido c´ıtrico P.A. (99,8 % pureza)
-
´
Acido Clor´ıdrico Fumegante P.A. (99,9 % pureza)
-
´
Acido l´atico P.A. (85 % pureza)
-
´
Agua MilliQ
®
- Citrato de S´odio Anidro Trib´asico P.A. (99,5 % pureza)
- Cloreto de C´alcio P.A. (99,9 % pureza)
- Cloreto de S´odio P.A. (99,6 % pureza)
- Isolado Prot´eico de Soro de Leite (WPI) (Davisco Food Ingredients, Inc., marca
BiPRO
®
)
- Lactato de S´odio P.A. (50 % pureza)
- Membrana de acetato de celulose com 0,22 µm de diˆametro de poro
- NaOH 0,1 Normal (0,1 moles Litro
−1
)
- Padr˜oes anal´ıticos, grau HPLC, de α-La e β-Lg, adquiridos da Davisco Food
Ingredients, Inc.
- Solu¸c˜oes-Tamp˜ao para calibra¸c˜ao de pHmetro
Os reagentes anal´ıticos utilizados foram de diferentes marcas, todas de alta
qualidade.
30
3.6.2. EQUIPAMENTOS.
- Agitador de tubos tipo Vortex
- Agitador magn´etico (110 volts)
- Balan¸ca anal´ıtica (Denver Instruments, USA)
- Banho de ultra-som (desgaseificador)
- Centr´ıfuga para tubos de 15 ml e de 50 ml - Cromat´ografo HPLC (Shimadzu
®
)
completo
- Equipamento de purifica¸c˜ao de ´agua MilliQ
®
(MilliPore
®
)
- Estufa BOD. (EletroLab)
- Microcentr´ıfuga (Force7
®
, LabNet)
(Eppendorf
®
)
- pHmetro de bancada
- Pipeta autom´atica 1,0 ml
- Sistema de filtra¸c˜ao a v´acuo + bomba de v´acuo (Supelco
®
)
- Tubos Eppendorf
®
de 2 ml
31
4. RESULTADOS E DISCUSS
˜
AO.
4.1. PRECIPITAC¸
˜
AO
´
ACIDA.
O experimento envolvendo a precipita¸c˜ao ´acida e a complexa¸c˜ao do c´alcio
foi realizado em etapas. Na primeira etapa buscou-se avaliar o teor de prote´ına
e a quantidade de α-La e β-Lg presente na mat´eria-prima, o WPI. Em seguida
foram feitos os tratamentos, seguindo o design experimental, descrito na se¸c˜ao
3.2., em que precipitado e sobrenadante foram analisados separadamente. Os
resultados ser˜ao apresentados a seguir, seguindo esta ordem.
4.1.1. CONCENTRAC¸
˜
OES DE PROTE
´
INA TOTAL, DE α-LA E β-LG NO WPI.
Feito em trˆes repeti¸c˜oes, o teor de prote´ınas totais encontrado no WPI foi de
(86, 15±0, 08) %. A quantifica¸c˜ao de α-La e β-Lg no WPI, foi feita em quatro
repeti¸c˜oes, como descrito na se¸c˜ao 3.1. A massa de WPI e as ´areas dos croma-
togramas, obtidas por integra¸c˜ao dos picos feita pelo software do cromat´ografo,
s˜ao apresentadas na Tabela 7.
Tabela 7: Resultado da an´alise cromatogr´afica do WPI
Repeti¸c˜ao Massa de WPI (g)
´
Area da α-La
´
Area da β-Lg
1 15,0002 21979044 67627720
2 14,9999 18190040 56797821
3 14,9999 22155367 65386592
4 14,9997 23900588 70239572
32
4.1.1.1. CURVAS DE CALIBRAC¸
˜
AO DA α-LA E β-LG.
A ANOVA e os parˆametros intercepto e coeficiente angular da equa¸c˜ao de re-
gress˜ao, bem como os intervalos de confian¸ca desses parˆametros para a α-La,
obtidos como relat´orio de sa´ıda do SAS
®
, est˜ao apresentados a seguir:
--------------------------------------------------------------
Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------
Sum of Mean
Source DF Squares Square F Value Pr > F
Model 1 5.012398E15 5.012398E15 612.23 <.0001
Error 10 8.187179E13 8.187179E12
Corrected Total 11 5.09427E15
--------------------------------------------------------------
Root MSE 2861325 R-Square 0.9839
Dependent Mean 39244463 Adj R-Sq 0.9823
Coeff Var 7.29103
--------------------------------------------------------------
Parameter Estimates
Parameter Standard
Variable DF Estimate Error t Value Pr > |t|
Intercept 1 4634021 1624460 2.85 0.0172
Conc 1 18789599 759385 24.74 <.0001
--------------------------------------------------------------
Parameter Estimates
Variable DF 95% Confidence Limits
Intercept 1 1014499 8253543
Conc 1 17097585 20481614
--------------------------------------------------------------
Figura 6: Anova da curva de calibra¸c˜ao da α-La
33
A ANOVA e os parˆametros intercepto e coeficiente angular da equa¸c˜ao de
regress˜ao, bem como os intervalos de confian¸ca desses parˆametros para a β-Lg,
obtidos como relat´orio de sa´ıda do SAS
®
, est˜ao apresentados a seguir:
--------------------------------------------------------------
Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------
Sum of Mean
Source DF Squares Square F Value Pr > F
Model 1 6.423398E15 6.423398E15 5689.72 <.0001
Error 14 1.580528E13 1.128949E12
Corrected Total 15 6.439203E15
--------------------------------------------------------------
Root MSE 1062520 R-Square 0.9975
Dependent Mean 33429709 Adj R-Sq 0.9974
Coeff Var 3.17837
--------------------------------------------------------------
Parameter Estimates
Parameter Standard
Variable DF Estimate Error t Value Pr > |t|
Intercept 1 678074 509006 1.33 0.2041
Conc 1 17773238 235625 75.43 <.0001
--------------------------------------------------------------
Parameter Estimates
Variable DF 95% Confidence Limits
Intercept 1 -413635 1769783
Conc 1 17267873 18278604
--------------------------------------------------------------
Figura 7: Anova da curva de calibra¸c˜ao da β-Lg
34
A equa¸c˜ao de regress˜ao (Equa¸c˜ao 4) para a α-La, fornecida pelo SAS
®
´e:
A = 4634021 + 18789599 C (4)
onde A ´e a ´area do pico da α-La, obtida a partir da integra¸c˜ao num´erica a
205 nm, e C ´e a respectiva concentra¸c˜ao, em mg ml
−1
Nos c´alculos feitos com os valores de ´area apresentados na Tabela 7, con-
siderou-se o intervalo de confian¸ca dos parˆametros da Equa¸c˜ao 4 (a 95 % de
probabilidade), e o fator de dilui¸c˜ao das amostras (1:2500), verificou-se que o
WPI cont´em (15, 17±3, 55) % de α -La.
A equa¸c˜ao de regress˜ao (Equa¸c˜ao 5) para a β-Lg, fornecida pelo SAS
®
´e:
A = 678074 + 17773238 C (5)
Nesta equa¸c˜ao, A ´e a ´area do pico da β-Lg, obtida a partir da integra¸c˜ao
num´erica a 205 nm, e C ´e a respectiva concentra¸c˜ao, em mg ml
−1
De modo an´alogo ao que foi feito para a α-La, foram considerados os dados
ta Tabela 7, o intervalo de confian¸ca dos parˆametros da equa¸c˜ao (a 95 % de
probabilidade), e o fator de dilui¸c˜ao das amostras (1:2500), onde verificou-se que
o WPI cont´em (60, 42±5, 79) % de β-Lg.
Na Figura 8 pode-se ver o cromatograma da primeira repeti¸c˜ao, obtido ao se
analisar o WPI para determinar o seus teores de α-La e de β-Lg, respectivamente.
O primeiro pico, no centro da imagem e `a esquerda (T
R
= 14, 981 min.),
corresponde ao sinal registrado pelo detector para a α-La, e o segundo pico, a
sua direita, (T
R
= 16, 840 min.) corresponde ao sinal registrado pelo detector
para a β-Lg em fun¸c˜ao do tempo.
35
O pico da β-Lg apresenta um duplo ´apice caracter´ıstico, representando, da
esquerda para a direita, as suas variantes gen´eticas A e B, respectivamente
(FERREIRA, 2001).
Figura 8: Perfil cromatogr´afico de fase reversa em coluna C18-HPLC da dispers˜ao do
WPI em
´
Agua. Dilui¸c˜ao: 1:2500
4.1.2 AVALIAC¸
˜
AO DO GRADIENTE DE CENTRIFUGAC¸
˜
AO UTILIZADO.
Foi utilizado um gradiente de centrifuga¸c˜ao, conforme descrito na se¸c˜ao 3.3.,
com a finalidade de simular uma sedimenta¸c˜ao suave (por repouso) da α-La,
reduzindo, assim, a incidˆencia de co-precipita¸c˜ao de β-Lg no precipitado.
Para avaliar o efeito do gradiente de centrifuga¸c˜ao, foi escolhido, ao acaso,
um dos tratamentos (Trat. 5, Rep. 1), que foi repetido e analisado duas vezes.
Para a primeira an´alise, o tratamento foi realizado utilizando o gradiente de
centrifuga¸c˜ao proposto (Tabela 5) e, para a segunda an´alise, utilizando apenas
36
uma centrifuga¸c˜ao de 7.200 x g, por 15 minutos (Figura 9).
Da an´alise da Figura 9 pode-se ent˜ao inferir que o gradiente de centrifuga¸c˜ao
proposto parece n˜ao exercer nenhum efeito para evitar, ou mesmo reduzir, a co-
precipita¸c˜ao da β-Lg junto ao precipitado. Embora o gradiente de centrifuga¸c˜ao
tenha sido utilizado em todos os tratamentos, a an´alise da Figura 9 permite
sugerir a utiliza¸c˜ao da centrifuga¸c˜ao de 7.200 x g, por 15 minutos, ao inv´es do
gradiente de centrifuga¸c˜ao. Esta ´ultima pode ser realizada em um menor temp o,
implicando em menor custo, desgaste da centr´ıfuga, menor possibilidade de des-
natura¸c˜ao das prote´ınas decorrente de aquecimento e promovendo os mesmos
resultados.
Figura 9: Cromatogramas comparativos de co-precipita¸c˜ao de β-Lg, com a utiliza¸c˜ao
de gradiente de centrifuga¸c˜ao (curva em vermelho), e sem o gradiente de centrifuga¸c˜ao
(curva em azul)
37
4.1.3. AN
´
ALISE DO PRECIPITADO.
A partir das ´areas dos picos apresentadas pelos cromatogramas, foram calcu-
ladas, por meio das curvas de calibra¸c˜ao (Equa¸c˜oes (4) e (5), respectivamente),
as massas de α-La e β-Lg obtidas sob a forma de precipitado, para cada repeti¸c˜ao,
de cada tratamento, como apresentado na Tabela 8.
Tabela 8: Massas de α-La e β-Lg obtidas sob a forma de precipitado, e os
respectivos valores percentuais de recupera¸c˜ao
Massa de Precipitado (g) Recupera¸c˜ao (%)
Trat. Massa de WPI (g) Alfa Beta Alfa Beta
1 6,0006 1,034 ±0,174 0,595 ±0,094 17,240 ±2,894 9,915 ±1,567
2 4,5007 0,758 ±0,081 0,337 ±0,003 16,844 ±1,799 7,486 ±0,066
3 4,5007 0,198 ±0,026 0,330 ±0,233 4,409 ±0,584 7,339 ±5,178
4 5,9997 0,958 ±0,019 0,449 ±0,021 15,962 ±0,319 7,477 ±0,352
5 6,0003 1,012 ±0,044 0,748 ±0,058 16,859 ±0,740 12,458 ±0,960
6 4,5004 0,042 ±0,059 0,249 ±0,119 0,933 ±1,320 5,535 ±2,644
7 4,5006 0,341 ±0,019 0,194 ±0,030 7,584 ±0,415 4,308 ±0,677
8 5,9999 0,203 ±0,031 0,210 ±0,034 3,389 ±0,515 3,493 ±0,558
Em seguida foram calculados os valores de Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia para
a α-La e para a β-Lg, presentes no precipitado. A Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia
foi calculada fazendo-se a raz˜ao entre o percentual m´edio de recupera¸c˜ao de α-La
(ou β-Lg) dos tratamentos (Tabela 8) e o percentual m´edio de α-lactoalbumina
(ou β-Lg) originalmente presentes no WPI: (15, 17±3, 55) % para a α-La e
(60, 42±5, 79) % para a β-Lg, conforme apresentado na p´agina 35. Os resul-
tados foram expressos em termos percentuais e est˜ao apresentados na Tabela 9,
e como pode ser observado, em nenhum dos tratamentos, o precipitado obtido
est´a isento da presen¸ca da β-Lg.
A An´alise de Variˆancia dos dados referentes `a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia
de α-La no precipitado est´a apresentada na Tabela 10.
38
Os valores de probabilidade apresentados na Tabela 10 indicam que todos
os efeitos principais s˜ao significativos ao n´ıvel de 5 % de probabilidade, ou seja,
todos os fatores em estudo interferem, de alguma forma, na recupera¸c˜ao da
α-La.
Para avaliar a ordem de importˆancia dos fatores em estudo, foi feito, com
base nas suas respectivas Somas de Quadrados, apresentadas pela An´alise de
Variˆancia, um diagrama de Pareto (Figura 10).
Figura 10: Diagrama de Pareto para a Soma de Quadrado dos fatores em estudo para
a α-La no precipitado
O diagrama de Pareto mostra que o fator em estudo mais importante na
recupera¸c˜ao da α-La ´e o tipo de complexante utilizado. Esse fator responde por
aproximadamente 36,22 % da Soma de Quadrados do modelo, ou seja, 36,22
% da Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia da α-La ocorrida no precipitado ´e devido ao
efeito do tipo de complexante utilizado, o que pode ser claramente observado ao
avaliar-se visualmente os resultados das Tabelas 8 e 9.
39
Os demais fatores em estudo seguem uma ordem de importˆancia decrescente,
onde o mais importante ´e o tipo de complexante utilizado no estudo (36,22 %
da soma de quadrados total), seguido pelo pH (24,44 %), pela concentra¸c˜ao de
WPI utilizada (20,76 %), pela temperatura do processo (15,61 %), e o fator que
parece exercer o menor efeito, e por isso considerado como o menos importante,
o tempo de agita¸c˜ao, que respondeu por apenas 2,97 % da soma de quadrados
total.
Ainda foi poss´ıvel avaliar o comportamento dos n´ıveis dos fatores em estudo
e o modo como cada um deles parece exercer efeito sobre a vari´avel de resposta,
que neste caso, ´e a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia da α-La no precipitado. Essa
avalia¸c˜ao foi feita tomando como base a Figura 11.
A Figura 11 sugere que o tempo de agita¸c˜ao apresenta uma correla¸c˜ao nega-
tiva com a vari´avel de resposta, ou seja, um tratamento com tempo de agita¸c˜ao
de 30 min. pode implicar em recupera¸c˜ao sensivelmente maior de α-La do que
para um tempo de agita¸c˜ao de 60 min.
Tabela 9: Resultados de Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia (%) de α-La e β-Lg
no precipitado enriquecido por α-La
Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia (%)
Tratamento α-lactoalbumina β-lactoglobulina
1 113,644 16,409
2 111,037 12,390
3 29,067 12,146
4 105,220 12,374
5 111,134 20,620
6 6,153 9,161
7 49,991 7,130
8 22,337 5,780
40
Tabela 10: ANOVA para dados de recupera¸c˜ao absoluta m´edia de α-La no
precipitado (CV=15,70 % e R
2
=96,20 %)
F.V. GL SQ QM F Pr > F
TEMPO 1 976.5625 976.5625 7.52873 0.0207
TEMPER 1 5125.844 5125.844 39.51728 0.0001
pH 1 8025.472 8025.472 61.87173 0.0001
CONCWPI 1 6816.979 6816.979 52.55495 0.0001
COMPLEX 1 11895.17 11895.17 91.70488 0.0001
Modelo 5 32840.03 6568.006 51.63551 0.0001
Erro 10 1297.115 129.7115
(Falta de Ajust.) 2 578.0185 289.0092 3.21525 0.0945
(Erro Puro) 8 719.0961 89.88701
Total Corrigido 15 34137.15
A Figura 11 tamb´em sugere a temperatura e o pH do processo de precipita¸c˜ao
apresentam correla¸c˜oes negativas com a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La
no precipitado.
Essa figura ainda permite verificar que a concentra¸c˜ao do WPI utilizada no
experimento apresenta uma correla¸c˜ao positiva com a vari´avel de resposta.
Assim, dentro da faixa de concentra¸c˜oes analisadas, espera-se que o uso de
maiores percentuais de WPI esteja associado a uma maior recupera¸c˜ao de α-La.
41
Uma outra observa¸c˜ao a ser feita ´e que entre os complexantes utilizados, o
citrato de s´odio ´e o que est´a correlacionado a um maior rendimento em recu-
pera¸c˜ao da α -La, enquanto que para o lactato de s´odio, a recupera¸c˜ao esperada
seria distintamente menor.
Figura 11: Comportamento dos n´ıveis dos fatores principais em rela¸c˜ao `a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia da α-La no precipitado
A disposi¸c˜ao gr´afica do comportamento geral da intera¸c˜ao dois a dois entre
todos os fatores em estudo, para o precipitado, est´a apresentada na Figura 12.
Essa figura disp˜oe tais informa¸c˜oes sob a forma de uma matriz quadrada, de
ordem 5, na qual a diagonal principal representa os fatores principais.
Assim, como exemplo, se tomarmos a c´elula que est´a na quinta linha e pri-
meira coluna, poderemos inferir que para um tempo de agita¸c˜ao fixado em 60
minutos, e todas as demais vari´aveis do modelo mantidas fixas, ent˜ao, para o
42
citrato de s´odio (azul claro) ´e esperado um Rendimento Absoluto M´edio em re-
cupera¸c˜ao de α-La superior ao que ter´ıamos, caso fosse utilizado o lactato de
s´odio (azul escuro).
Foi observado que a β-Lg tamb´em est´a presente no precipitado. Embora,
para alguns tratamentos, em pequena quantidade, sua presen¸ca n˜ao ´e desejada
visto que um dos motivos em se obter uma fra¸c˜ao rica em α-La, neste caso, o
precipitado, ´e, entre outros, o preparo de formula¸c˜oes aliment´ıcias para crian¸cas
e esta deve apresentar reduzido potencial alergˆenico, conforme discutido anteri-
ormente neste trabalho.
Figura 12: Comportamento geral dos fatores em estudo para a Recupera¸c˜ao Absoluta
M´edia da α-La no precipitado
43
A inspe¸c˜ao dos valores de probabilidade na an´alise de variˆancia para recu-
pera¸c˜ao absoluta m´edia da β-Lg no precipitado (Tabela 11), indicam que apenas
a temperatura na qual o tratamento ´e realizado parece estar exercendo influˆencia
na co-precipita¸c˜ao da β-Lg.
Tabela 11: ANOVA para dados de recupera¸c˜ao absoluta m´edia de β-Lg no
precipitado (CV=32,54 % e R
2
=64,81 %)
F.V. GL SQ QM F Pr > F
TEMPO 1 70.18251 70.18251 4.519062 0.0594
TEMPER 1 113.9023 113.9023 7.334183 0.0220
pH 1 28.75641 28.75641 1.851629 0.2035
CONCWPI 1 52.45381 52.45381 3.377508 0.0959
COMPLEX 1 20.77081 20.77081 1.337435 0.2744
Modelo 5 286.0658 57.21316 3.683964 0.0377
Erro 10 155.3033 15.53033
(Falta de Ajust.) 2 49.07151 24.53576 1.847715 0.2189
(Erro Puro) 8 106.2318 13.27897
Total Corrigido 15 441.369
A representa¸c˜ao gr´afica dos efeitos principais, para a Recupera¸c˜ao Absoluta
M´edia da β-Lg no precipitado, Figura 13, sugere que se o tratamento for realizado
a uma temperatura maior, pr´oxima aos 45 ℃, ent˜ao pode-se esperar uma co-
precipita¸c˜ao menor de β-Lg no precipitado.
Para a presente situa¸c˜ao, n˜ao foi necess´ario avaliar os demais fatores visto que
estes n˜ao s˜ao significativos ao n´ıvel de 5 % de probabilidade, conforme mostrado
na an´alise de variˆancia da Tabela 11.
44
Um aumento deliberado na temperatura de processo com o objetivo de se
reduzir a co-precipita¸c˜ao da β-Lg n˜ao ´e recomendado. Quando a α-La est´a sem
a presen¸ca do ´ıon c´alcio em sua estrutura, esta apresenta-se com baixa estabi-
lidade t´ermica e, conforme relatado por CHATTERTON et al. (2006), estudos
de calorimetria diferencial de varredura mostraram que sem o c´alcio sua desna-
tura¸c˜ao pode ocorrer em temperaturas t˜ao baixas quanto 43 ℃, contrastando
com a temperatura de 68 ℃, quando est´a ligada ao c´alcio.
Figura 13: Comportamento dos n´ıveis dos fatores principais em rela¸c˜ao `a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia da β-Lg no precipitado
45
4.1.3.1. OTIMIZAC¸
˜
AO DA RECUPERAC¸
˜
AO DE α-LA NO PRECIPITADO
Foi estabelecida uma fun¸c˜ao-objetivo que permitiu, dentro da faixa das
condi¸c˜oes experimentais estudadas, determinar um ponto de otimiza¸c˜ao, con-
siderando tanto a precipita¸c˜ao da α-La quanto a co-precipita¸c˜ao da β-Lg.
A fun¸c˜ao-objetivo, constru´ıda com o aux´ılio do SAS/ADX
®
, foi estabelecida,
interativamente, em termos de se maximizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia da
α-La e minimizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia da β-Lg, ou seja, minimizar
sua co-precipita¸c˜ao.
O resultado gr´afico obtido a partir dos c´alculos de otimiza¸c˜ao est´a apresen-
tado na Figura 14.
Figura 14: Valores ´otimos dos parˆametros, obtidos pela fun¸c˜ao-objetivo, estabelecida
para maximizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia da α-La e de minimizar a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia da β-Lg (co-precipita¸c˜ao) no precipitado
46
Na Figura 14 os dados est˜ao dispostos sob a forma de uma matriz de trˆes
linhas e seis colunas. Nas duas primeiras linhas dessa matriz est˜ao as vari´aveis de
resposta, Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia da α-La e da β-Lg, e nas colunas, cada
um dos fatores em estudo. O algoritmo de otimiza¸c˜ao executado pelo software
para os dados experimentais ´e o mesmo descrito por DERRINGER e SUICH
(1980). O resultado da otimiza¸c˜ao que maximiza a Recup era¸c˜ao Absoluta M´edia
de α-La e minimiza a co-precipita¸c˜ao da β-Lg, informado pela fun¸c˜ao-objetivo
na Figura 14, ´e apresentado na Tabela 12.
Tabela 12: Resultados de otimiza¸c˜ao, obtidos pela fun¸c˜ao-objetivo, para ma-
ximizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La e minimizar a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia de β-Lg no precipitado
Vari´avel (Fator) Descri¸c˜ao Valores de Otimiza¸c˜ao
TEMPO Tempo de agita¸c˜ao (min.) 30 minutos
TEMPER Temperatura (℃) 40 ℃
pH Valor de pH ajustado com ´acido. 3,90
CONCWPI Concentra¸c˜ao % (m/m) de WPI 12,0 %
COMPLEX Tipo de Complexante. Citrato*
* Citrato de s´odio trib´asico
47
4.1.3.2. ESTUDO COMPARATIVO DA CO-PRECIPITAC¸
˜
AO DE β-LG NO PRECIPITADO.
Embora os tratamentos tivessem sido submetidos a um gradiente de centri-
fuga¸c˜ao, com a inten¸c˜ao de reduzir o efeito de co-precipita¸c˜ao da β-Lg, verificou-
se que este n˜ao apresentou nenhum efeito, conforme apresentado na se¸c˜ao 4.1.2,
e que a presen¸ca de β-Lg foi confirmada no precipitado de todos os tratamen-
tos. A rela¸c˜ao α-La/(α -La+β-Lg), a partir dos dados da Tabela 9 (p´agina 40)
representa, em termos percentuais, o grau de pureza do precipitado em rela¸c˜ao
`a α-La, para cada tratamento, e ´e apresentada na Tabela 13.
Conforme pode ser observado, nenhum dos tratamentos foi capaz de recupe-
rar a α-La com menos de 10 % de contamina¸c˜ao com β-Lg.
A Figura 15 ´e um gr´afico que informa, em termos comparativos, para cada
um dos tratamentos, a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La (em barras na cor
azul escuro) e de β-Lg (barras na cor azul claro), no precipitado.
A Figura 16 ´e um dendrograma que mostra a possibilidade de se acomodar os
tratamentos em dois grupos distintos. Um grupo (na cor azul), s˜ao os tratamen-
tos que apresentam alta Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La e relativamente
baixa co-precipita¸c˜ao de β-Lg. O outro grupo (cor vermelha) acomodaria os
tratamentos com menor capacidade de Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La e
maior percentual relativo de co-precipita¸c˜ao de β-Lg.
Tabela 13: Pureza dos precipitados dos tratamentos em rela¸c˜ao a α-La
Tratamentos
1 2 3 4 5 6 7 8
Pureza em α-La % (m/m) 87,38 89,96 70,53 89,48 84,35 40,18 87,52 79,44
48
A forma¸c˜ao dos grupos permite verificar a influˆencia do fator tipo de comple-
xante: no primeiro grupo predominam os tratamentos nos quais o complexante
foi o citrato de s´odio trib´asico, e no segundo grupo, os tratamentos que tiveram
o lactato de s´odio como complexante.
Figura 15: Comparativo da co-precipita¸c˜ao de β-Lg entre diferentes tratamentos
Figura 16: An´alise de agrupamento dos tratamentos: recupera¸c˜ao de α-La no preci-
pitado
49
Considerando apenas os fatores mais relevantes na recupera¸c˜ao da α-La no
precipitado (tipo de complexante, pH e concentra¸c˜ao de WPI), pode-se tra¸car
as curvas de n´ıvel para a vari´avel de resposta (Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de
α-La no Precipitado), obtendo, assim, um gr´afico como o que est´a representado
pela Figura 17. Nesta figura, as curvas de n´ıvel sugerem que ´e poss´ıvel aumentar
a recupera¸c˜ao de α-La sob a forma de precipitado `a medida em que o pH ´e
ajustado para valores pr´oximos a 3,9 e `a medida em que a concentra¸c˜ao do WPI
utilizada ´e ajustada para valores que se aproximam de 12 %
Figura 17: Curvas de n´ıvel para a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La no precipitado,
considerando os trˆes fatores mais importantes: pH, Concentra¸c˜ao de WPI e Tipo de
Complexante (Citrato)
50
4.1.4. AN
´
ALISE DO SOBRENADANTE.
A β-Lg, embora citada como potencial fonte de alergia em crian¸cas, tem
amplas aplica¸c˜oes industriais. Por isso pode haver interesse em recuper´a-la a
partir do WPI, o que justifica uma an´alise do sobrenadante dos tratamentos.
As descri¸c˜oes dos resultados gr´aficos s˜ao an´alogas `as que foram apresentadas
para a an´alise do precipitado, se¸c˜ao 4.1.3, e por isso n˜ao ser˜ao repetidas aqui,
apenas ser˜ao acrescidos alguns coment´arios que foram julgados necess´arios.
A Tabela 14 apresenta os resultados (m´edia das repeti¸c˜oes) obtidos para o
sobrenadante de cada um dos tratamentos.
Tabela 14: Massas de α-La e β-Lg obtidas no sobrenadante, e os respectivos
valores percentuais de recupera¸c˜ao
Massa de Precipitado (g) Recupera¸c˜ao (%)
Trat. Massa de WPI (g) Alfa Beta Alfa Beta
1 6,0006 0,000 ±0,000 3,778 ±0,027 0,000 ±0,000 62,954 ±0,443
2 4,5007 0,000 ±0,000 3,036 ±0,040 0,000 ±0,000 67,464 ±0,881
3 4,5007 0,000 ±0,000 2,946 ±0,017 0,000 ±0,000 65,465 ±0,372
4 5,9997 0,000 ±0,000 3,519 ±0,058 0,000 ±0,000 58,659 ±0,961
5 6,0003 0,482 ±0,011 3,880 ±0,043 8,035 ±0,176 64,665 ±0,719
6 4,5004 0,703 ±0,018 3,464 ±0,010 15,619 ±0,395 76,977 ±0,211
7 4,5006 0,000 ±0,000 2,642 ±0,009 0,000 ±0,000 58,704 ±0,197
8 5,9999 0,223 ±0,008 3,534 ±0,055 3,720 ±0,141 58,896 ±0,909
A Tabela 15 apresenta os valores de Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La e
β-Lg no sobrenadante dos tratamentos.
51
Tabela 15: Recup era¸c˜ao Absoluta M´edia (%) de α-La e β-Lg no sobrenadante
Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia (%)
Tratamento α-lactoalbumina β-lactoglobulina
1 0,000 104,194
2 0,000 111,659
3 0,000 108,350
4 0,000 97,085
5 52,965 107,026
6 102,962 127,403
7 0,000 97,160
8 24,520 97,478
As Tabelas 14 e 15 mostram que para alguns tratamentos (1,2,3,4 e 7) a α-La
no sobrenadante se encontra ausente ou presente em quantidade n˜ao detect´avel
nas condi¸c˜oes da an´alise, e que a recupera¸c˜ao da β-Lg assume elevados valores
percentuais de Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia (%).
A An´alise de Variˆancia dos dados referentes `a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia
de α-La no sobrenadante est´a apresentada na Tabela 16.
Conforme pode ser observado pelos valores de probabilidade, a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia de α-La no sobrenadante ´e influenciada apenas pela temperatura
do processo e pelo pH. Os demais fatores n˜ao s˜ao significativos ao n´ıvel de 5
% de probabilidade. O diagrama de Pareto apresentado pela Figura 18 mostra
que, para a recupera¸c˜ao de α-La no sobrenadante, mais de 50 % da soma de
quadrados do modelo ´e devido ao fator pH, seguido pelo segundo fator mais
importante, a temperatura de processo, que responde p or quase 30 % da soma
de quadrados total.
52
Nesse diagrama, as barras em cinza escuro correspondem aos fatores signifi-
cativos, e barras cinza claro correspondem aos fatores n˜ao significativos, ao n´ıvel
de 5 % de significˆancia, respectivamente
Tabela 16: ANOVA para dados de recupera¸c˜ao absoluta m´edia de α-La no
sobrenadante (CV=93,92 % e R
2
=77,43 %)
F.V. GL SQ QM F Pr > F
TEMPO 1 1553.72 1553.72 3.093037 0.109133
TEMPER 1 4831.605 4831.605 9.618423 0.011225
pH 1 9110.75 9110.75 18.13705 0.001666
CONCWPI 1 181.6228 181.6228 0.361562 0.561023
COMPLEX 1 1553.72 1553.72 3.093037 0.109133
Modelo 5 17231.42 3446.284 6.860621 0.005031
Erro 10 5023.282 502.3282
(Falta de Ajust.) 2 5013.228 2506.614 1994.525 0.0001
(Erro Puro) 8 10.05398 1.256748
Total Corrigido 15 22254.7
Figura 18: Diagrama de Pareto para a Soma de Quadrados dos fatores em estudo
para a α-La no sobrenadante
53
O gr´afico da Figura 19 sugere que, em menores valores de pH, a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia de α-La ´e menor, o que ´e muito interessante para o caso de se
desejar recuperar a β-Lg, a partir do sobrenadante, com baixa contamina¸c˜ao de
α-La, e o mesmo racioc´ınio vale para o fator temperatura de processo: maior
temperatura pode resultar em menor contamina¸c˜ao pela α-La.
Foi verificado que a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de β-Lg no sobrenadante ´e
influenciada por trˆes fatores (Figura 20, linhas hachuradas em cinza escuro) que
s˜ao a temperatura de processo, a concentra¸c˜ao de WPI, e o tipo de complexante
utilizado. Em escala industrial o controle conjunto desses fatores pode implicar
em maior recupera¸c˜ao de β-Lg a partir do WPI.
Figura 19: Comportamento dos n´ıveis dos fatores principais em rela¸c˜ao a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia de α-La no sobrenadante
54
Figura 20: Valores de probabilidade (P-Value), obtidos pelo uso do teste-t, usados
para avaliar a significˆancia dos fatores na Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de β-Lg no
sobrenadante
Na Figura 21 ´e apresentado um diagrama de Pareto, mostrando que, entre
os fatores significativos, a temperatura de processo ´e o de maior importˆancia.
Este fator responde por mais da metade da soma de quadrados, seguido pela
concentra¸c˜ao utilizada de WPI, que responde por aproximadamente 30 % da
soma de quadrados do modelo. Juntos, esses dois fatores respondem por, apro-
ximadamente, 80 % da soma de quadrados total.
Figura 21: Diagrama de Pareto para a Soma de Quadrados dos fatores em estudo
para β-Lg no sobrenadante
55
O fator significativo de menor relevˆancia para a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia
de β-Lg no sobrenadante ´e o tipo de complexante, e os outros dois fatores ava-
liados n˜ao apresentaram-se como significativos ao n´ıvel de 5 % de probabilidade.
Para complementar os resultados apresentados na Figura 20 a Figura 22 evidencia
que menores temperaturas de processo poder˜ao resultar em maior recupera¸c˜ao de
β-Lg a partir do sobrenadante dos tratamentos. Maiores recupera¸c˜oes de β-Lg
tamb´em ser˜ao esperadas se forem utilizadas menores concentra¸c˜oes de WPI e, de
modo contr´ario, aos resultados obtidos quando o objetivo era o de se recuperar a
α-La por precipita¸c˜ao, a utiliza¸c˜ao do ´acido l´atico, ao inv´es de se utilizar o ´acido
c´ıtrico, poder´a fornecer melhores resultados em termos de recupera¸c˜ao de β-Lg.
Figura 22: Comportamento dos n´ıveis dos fatores principais em rela¸c˜ao `a Recupera¸c˜ao
Absoluta M´edia de β-Lg no sobrenadante
56
Assim, a recupera¸c˜ao da β-Lg a partir do sobrenadante, diferente do que
ocorre com a α-La, se deve a precipita¸c˜ao pelo abaixamento do pH, e n˜ao por
efeito de complexa¸c˜ao, visto que a β-Lg n˜ao ´e uma metaloprote´ına, e outros
acidificantes, de menor custo, como o HCL, poderiam ser utilizados em substi-
tui¸c˜ao ao ´acido l´atico, n˜ao sendo, portanto, necess´aria a adici¸c˜ao de nenhum sal
complexante.
57
4.1.4.1. OTIMIZAC¸
˜
AO DA RECUPERAC¸
˜
AO DE β-LG. NO SOBRENADANTE
De modo an´alogo ao que foi feito na se¸c˜ao 4.1.3.1., estabeleceu-se uma fun¸c˜ao-
objetivo para fazer a otimiza¸c˜ao de recupera¸c˜ao da β-Lg no sobrenadante, dentro
da faixa de valores estudados neste experimento. Na constru¸c˜ao desta fun¸c˜ao-
objetivo foram impostas duas restri¸c˜oes: maximizar a Recupera¸c˜ao Absoluta
M´edia de β-Lg no sobrenadante e minimizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de
α-La, considerada, para este processo, como um contaminante indesej´avel.
Ap´os a execu¸c˜ao do algoritmo de otimiza¸c˜ao, chegou-se ao resultado gr´afico
apresentado pela Figura 23.
Figura 23: Resultado de otimiza¸c˜ao, feito pela fun¸c˜ao-objetivo, estabelecida para
maximizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de β-Lg no sobrenadante, e minimizar a
co-recupera¸c˜ao com α -La
58
´
E importante ressaltar, que para o caso de se recuperar a β-Lg a partir
do sobrenadante dos tratamentos, uma pequena contamina¸c˜ao com α-La n˜ao
acarretaria problemas, do ponto de vista em se causar alergia no consumidor,
visto que a α-La ´e uma prote´ına que se encontra naturalmente presente no leite
humano.
Os resultados ´otimos que maximizam a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de β-Lg
no sobrenadante e minimizam a co-recupera¸c˜ao de α-La, est˜ao apresentados na
Tabela 17, cujas informa¸c˜oes foram obtidas da Figura 23.
Tabela 17: Resultados de otimiza¸c˜ao para maximizar a Recupera¸c˜ao Abso-
luta M´edia de β-Lg e minimizar a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de α-La no
sobrenadante
Vari´avel (Fator) Descri¸c˜ao Valores de Otimiza¸c˜ao
TEMPO Tempo de Agita¸c˜ao (min) 30 minutos
TEMPER. Temperatura (℃) 30 ℃
pH Valor de pH ajustado com ´acido. 3,90
CONCWPI Concentra¸c˜ao % (m/m) de WPI. 9,0 %
COMPLEX Tipo de Complexante. Lactato
A rela¸c˜ao β-Lg/(α-La+β-Lg), a partir dos dados da Tabela 15 (p´agina 52)
representa, em termos percentuais, o grau de pureza do sobrenadante em rela¸c˜ao
β-Lg, para cada tratamento, e ´e apresentada na Tabela 18.
Diferentemente do que foi observado para a recupera¸c˜ao de α-La no preci-
pitado, que apresentou contamina¸c˜ao por co-precipita¸c˜ao de β-Lg em todos os
tratamentos, a Figura 24 mostra que, para o caso da recupera¸c˜ao de β-Lg a par-
tir do sobrenadante, apenas os tratamentos 5, 6 e 8 apresentaram quantidades
detect´aveis de α-La.
59
Tabela 18: Pureza dos sobrenadantes dos tratamentos em rela¸c˜ao a β-Lg
Tratamentos
1 2 3 4 5 6 7 8
Pureza em β-Lg % (m/m) 100,00 100,00 100,00 100,00 66,90 55,30 100,00 79,90
A Figura 25 ´e um dendrograma que mostra uma maior similaridade entre
os tratamentos 1,2,3,4 e 7 (cor azul). Estes tratamentos formam o grupo dos
tratamentos capazes de recuperar a β-Lg, cuja co-recupera¸c˜ao de α-La n˜ao ´e
observada.
Os tratamentos 5,6 e 8 (cor vermelha) s˜ao os que apresentam maior dissi-
milaridade e correspondem aos tratamentos que recuperam a β-Lg, por´em com
significativa co-precipita¸c˜ao de α-La.
Figura 24: Comparativo da co-recupera¸c˜ao de α-La entre diferentes tratamentos
60
A forma¸c˜ao dos grupos permitiu verificar que os tratamentos cuja co-preci
pita¸c˜ao de α-La foi detectada (tratamentos 5, 6 e 8) foram aqueles que tiveram
o valor de pH ajustado para 4,5.
Figura 25: An´alise de agrupamento dos tratamentos: recupera¸c˜ao de β-Lg no sobre-
nadante
Avaliou-se o comportamento da vari´avel de resposta considerando-se o tipo
de complexante como um fator fixo e avaliando-se o efeito dos outros dois fatores
significativos, conforme apresentado no resultado gr´afico da Figura 26.
61
Pode-se observar que valores de temperatura de processo que se aproximam
dos 25 ℃ e valores de concentra¸c˜ao que se aproximam dos 9 % est˜ao associados
a correspondentes aumentos em recupera¸c˜ao de β-Lg a partir do sobrenadante.
Figura 26: Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia de β-Lg no sobrenadante em fun¸c˜ao dos
fatores temperatura e concentra¸c˜ao de WPI (acidificante=´acido l´atico)
62
4.1.5. OTIMIZAC¸
˜
AO GLOBAL PARA O PRECIPITADO E O SOBRENADANTE.
Foi poss´ıvel avaliar uma condi¸c˜ao global de otimiza¸c˜ao para o experimento
de precipita¸c˜ao com o objetivo de recuperar, dentro da faixa de valores ex-
perimentados, a maior quantidade de α-La, sob a forma de precipitado, e a
maior quantidade de β-Lg, sob a forma de sobrenadante, considerando valores
m´ınimos de co-recupera¸c˜ao em ambas as fra¸c˜oes. Assim, foi estabelecida uma
nova fun¸c˜ao-objetivo, associada a quatro restri¸c˜oes simultˆaneas:
- maximizar a recupera¸c˜ao de α-La no precipitado;
- maximizar a recupera¸c˜ao de β-Lg no sobrenadante;
- minimizar a co-precipita¸c˜ao de β-Lg no precipitado, e
- minimizar a co-recupera¸c˜ao de α-La no sobrenadante.
O resultado da otimiza¸c˜ao est´a apresentado graficamente pela Figura 27.
Figura 27: Otimiza¸c˜ao global do experimento para precipitado e sobrenadante
63
Os resultados de otimiza¸c˜ao apresentados pela Figura 27 sugerem que as
condi¸c˜oes: tempo de processo igual a 30 minutos, temperatura de processo igual
a 40 ℃, pH ajustado para 3,9 com ´acido c´ıtrico e uma concentra¸c˜ao de WPI de
9 %, possam ser, dentro da faixa de valores experimentados, as condi¸c˜oes que
otimizam a fun¸c˜ao-objetivo, considerando as quatro restri¸c˜oes apresentadas.
Nestas condi¸c˜oes, os valores preditos pelo modelo estat´ıstico para a recu-
pera¸c˜ao de α-La e de β-Lg, no precipitado e no sobrenadante, s˜ao (Tabela 19):
Tabela 19: Previs˜ao de recupera¸c˜ao de α-La e β-Lg, no precipitado
e no sobrenadante, nas condi¸c˜oes de otimiza¸c˜ao global
Estimativas para a Recupera¸c˜ao Absoluta M´edia (%).
α-lactoalbumina β-lactoglobulina
Precipitado 100,40 ±6,52 10,78 ±1,35
Sobrenadante -8,69 ±9,48 105,90 ±2,32
64
CONCLUS
˜
OES
O experimento envolvendo a precipita¸c˜ao por adi¸c˜ao de ´acido e a complexa¸c˜ao
do´ıon c´alcio presente no interior da α-La foi feito com dois objetivos. O primeiro,
e foco deste trabalho, recuperar uma fra¸c˜ao enriquecida em α-La (um precipi-
tado) a partir do isolado prot´eico de soro de leite comercial, a qual pode ser
utilizada em formula¸c˜oes infantis com reduzido potencial alergˆenico. O segundo
objetivo ´e o de se recuperar uma fra¸c˜ao enriquecida em β-Lg (sobrenadante),
visto que esta prote´ına, embora apontada como causadora de alergia em crian¸cas,
encontra amplas aplica¸c˜oes na ind´ustria de alimentos.
Foram estudados, separadamente, o precipitado e o sobrenadante dos tra-
tamentos, os quais foram analisados por cromatografia l´ıquida RP-C18-HPLC e
os resultados submetidos a an´alises estat´ısticas utilizando-se o pacote estat´ıstico
SAS
®
. Foram estudados simultaneamente cinco fatores: tempo e temperatura
de incuba¸c˜ao, pH, tipo de agente complexante e concentra¸c˜ao de WPI.
Para a recupera¸c˜ao de α-La a partir do precipitado, verificou-se que as me-
lhores condi¸c˜oes experimentais foram:
- pH 3,9;
- tempo de incuba¸c˜ao igual a 30 minutos;
- temperatura de incuba¸c˜ao de 40 ℃;
- concentra¸c˜ao de WPI igual a 12 % e
- a utiliza¸c˜ao do citrato de s´odio anidro trib´asico, como complexante.
65
Nestas condi¸c˜oes foi verificado, atrav´es do estabelecimento de uma fun¸c˜ao-
objetivo, a maximiza¸c˜ao de recupera¸c˜ao de α-La e minimiza¸c˜ao da recupera¸c˜ao
de β-Lg no precipitado, respectivamente.
Verificou-se que, em nenhum dos tratamentos, o precipitado estava isento da
presen¸ca de β-Lg.
A presen¸ca de β-Lg no precipitado corresponde `a sua co-precipita¸c˜ao de β-
Lg, e os tratamentos 1,2,4, e 5, definidos na se¸c˜ao 3.2, Tabela 4, foram os que
apresentaram o menor percentual relativo de co-precipita¸c˜ao e maior rendimento
em recupera¸c˜ao, sendo, portanto, entre os tratamentos avaliados, os melhores
para recuperar a α-La pela combina¸c˜ao das t´ecnicas de precipita¸c˜ao ´acida e
complexa¸c˜ao do c´alcio.
Para o caso de o interesse estar focado em se recuperar a β-Lg a partir do
sobrenadante, foi verificado, pelo estabelecimento de uma fun¸c˜ao-objetivo, que
as condi¸c˜oes que otimizam a recupera¸c˜ao s˜ao:
- pH 3,9;
- tempo de incuba¸c˜ao igual a 30 minutos;
- temperatura de incuba¸c˜ao de 30 ℃;
- concentra¸c˜ao de WPI igual a 9 %, e
- utiliza¸c˜ao ´acido l´atico como acidificante, sendo desnecess´aria a utiliza¸c˜ao do
lactato de s´odio como complexante do c´alcio, visto que a β-Lg n˜ao ´e uma me-
taloprote´ına, e, conforme discutido na se¸c˜ao 4.1.4., um outro acidificante, de
menor custo, podendo ser utilizado em substitui¸c˜ao ao ´acido l´atico.
Foi verificado que, em alguns tratamentos, a β-Lg pode ser obtida do so-
brenadante com quantidades n˜ao detect´aveis de α-La, conforme apresentado na
Tabela 18, para os tratamentos 1,2,3,4 e 7, indicando elevada pureza em β-Lg.
66
Para a recupera¸c˜ao de β-Lg a partir do sobrenadante, ao contr´ario do obser-
vado para a recupera¸c˜ao de α-La a partir do precipitado, nem todos os fatores
estudados foram considerados significativos.
Conforme apresentado na Figura 21, os fatores que mais influenciam na re-
cupera¸c˜ao de β-Lg a partir do sobrenadante s˜ao a temperatura de incuba¸c˜ao e
a concentra¸c˜ao de WPI, que juntos, respondem por aproximadamente 80% da
varia¸c˜ao observada.
Para avaliar as condi¸c˜oes que otimizam, simultaneamente, a recupera¸c˜ao de
α-La a partir do precipitado e a recupera¸c˜ao de β-Lg a partir do sobrenadante,
foi estabelecido uma fun¸c˜ao-objetivo sujeita a quatro restri¸c˜oes, conforme apre-
sentado na se¸c˜ao 4.1.5.
Os resultados apresentados pelo gr´afico da Figura 27 mostram que: tempo de
processo igual a 30 minutos, temperatura de processo igual a 40℃, pH ajustado
para 3,9 com ´acido c´ıtrico e uma concentra¸c˜ao de WPI de 9%, s˜ao as condi¸c˜oes
que, dentro da faixa de valores experimentados, atendem os prop´ositos da fun¸c˜ao-
objetivo e das restri¸c˜oes impostas. As estimativas de recupera¸c˜ao das prote´ınas,
tanto para o precipitado quanto para o sobrenadante, est˜ao apresentadas na
Tabela 19.
Os resultados obtidos permitem concluir que o isolado prot´eico de soro de
leite ´e uma excelente fonte de prote´ınas. Essas prote´ınas s˜ao importantes na ali-
menta¸c˜ao humana e encontram potencial uso em aplica¸c˜oes industriais. Entre as
aplica¸c˜oes poss´ıveis uma ´e a de produzir alimentos l´acteos destinados ao consumo
infantil, caracterizados pela necessidade de reduzido potencial alergˆenico.
Outras fontes de prote´ınas, ainda consideradas como rejeitos pelas ind´ustrias
de latic´ınios, devem ser investigadas com os mesmos objetivos deste trabalho.
Entre elas pode-se citar o soro de leite, obtido durante o processamento do queijo,
e o leitelho, gerado no processo de fabrica¸c˜ao da manteiga.
67
Neste trabalho a combina¸c˜ao de t´ecnicas para recupera¸c˜ao de prote´ınas em-
pregou reagentes de baixo custo e de f´acil aquisi¸c˜ao, e a execu¸c˜ao do experimento
foi realizada de forma bastante simples. Os reagentes utilizados (´acido c´ıtrico,
´acido l´atico, lactato de s´odio e citrato de s´odio trib´asico) tˆem o seu uso permi-
tido e regulamentado pela Agˆencia Nacional de Vigilˆancia Sanit´aria (ANVISA)
e s˜ao amplamente utilizados em muitos processos, em diferentes ind´ustrias ali-
ment´ıcias.
As fra¸c˜oes prot´eicas recuperadas poder˜ao ser submetidas a etapas posteriores
de purifica¸c˜ao (refinamento), empregando tanto t´ecnicas individuais como, por
exemplo, ultrafiltra¸c˜ao ou di´alise, quanto uma combina¸c˜ao criteriosa de t´ecnicas
que, em conjunto, poder˜ao recuperar α-La e β-Lg com elevado grau de pureza,
direcionando sua utiliza¸c˜ao para aplica¸c˜oes farmacol´ogicas e biotecnol´ogicas, en-
tre outras.
68
SUGEST
˜
AO PARA TRABALHOS FUTUROS
Ap´os a conclus˜ao deste trabalho ´e sugerido que sejam feitos novos estudos
envolvendo a recupera¸c˜ao de α-La a partir do soro de leite, ou mesmo a partir
do WPC ou do WPI, utilizando-se, como complexante, o ´acido f´ıtico e ou seu
sal, o fitato.
Esses compostos ocorrem naturalmente em alguns tecidos vegetais, com des-
taque para tecidos presentes nas sementes, e ´e apontado por alguns autores
(REDDY, 2002) como um importante fator antinutricional na alimenta¸c˜ao, tanto
humana quanto animal, devido ao fato de se complexarem fortemente com mi-
nerais (c´alcio, zinco, magn´esio e ferro, principalmente), reduzindo sua biodispo-
nibilidade.
O ´acido f´ıtico, dispon´ıvel no com´ercio especializado de insumos para labo-
rat´orios, pode ser adicionado a um meio contendo a α-La e, uma vez comple-
xado o c´alcio, ´e esperado a forma¸c˜ao de um precipitado insol´uvel e est´avel, que
muito provavelmente possa ser separado da fra¸c˜ao enriquecida em α-La assim
obtida, fazendo-se pequenos ajustes nas condi¸c˜oes do meio, como, por exem-
plo, elevando-se o seu pH para valores acima daqueles observados para o ponto
isoel´etrico da α-La, de modo que esta se mantenha sol´uvel e possa ser separada
do precipitado por centrifuga¸c˜ao.
Para o caso da ocorrˆencia de um complexo fitato-metal-prote´ına, metodo-
logias tradicionais envolvendo a recupera¸c˜ao de prote´ınas tamb´em poder˜ao ser
utilizadas e, na necessidade requerida por algum processo em se desfazer a in-
tera¸c˜ao fitato-metal-prote´ına, pode-se avaliar a possibilidade do uso de fitase,
uma enzima capaz de dissolver esse complexo, liberando o metal do fitato.
As caracter´ısticas do fitato e o seu mecanismo de complexa¸c˜ao com metais
s˜ao bem descritos nas literaturas envolvendo nutri¸c˜ao mineral, humana e animal.
69
REFER
ˆ
ENCIAS BIBLIOGR
´
AFICAS
ADAMSON, A.W. Physical Chemistry os Surfaces, New York: John Wiley
& Sons, 1990, 537p.
ALOMIRAH, H.F.; ALLI, I.; Separation and Characterization of β-Lactoglobulin
and α-Lactalbumin from Whey and Whey Protein Preparations, International
Dairy Journal, 14:411–419, 2004.
ARA
´
UJO, J.M.A. Qu´ımica de Alimentos - Teoria e Pr´atica. Vi¸cosa: UFV,
Imprensa Universit´aria, 2004, 475p.
ARMAREGO, W.L.F.; CHAI, C.L.L.; Purification of Laboratory Chemicals,
Butterworth Heinemann - Elsevier Science, USA, 5th. ed., 2003, 609p.
ARVANITOYANNIS, I.S.; Waste Management For The Food Industries,
New York: Elsevier Academic Press, 2008, 1071p.
BIGELOW, C.C.; On The Average Hydrophobycity of Proteins and The Relation
Between It and Protein Structure, J. Theor. Biol., 16:187-211, 1967.
BRAMAUD, C.; AIMAR, P.; DAUFIN, G.; Optimisation of a Whey Protein
Fractionation Process Based on the Selective Precipitation of α-Lactalbumin.
Lait 77:411–423, 1997.
70
BRITZ, T.J.; ROBINSON, R.K; Advanced Dairy Science and Technology,
US: Blackwell Publishing Ltd., 2008, 300p.
CHAO WU, AMES, IA(US). Whey Treatment Process for Achieving High
Concentration of α-Lactalbumin. US Patent 6,312,755 B1.; 2001.
CHATTERTON, D.E.W; SMITHERS, G.; ROUPAS, P.; BRODKORB,A., Bio-
activity of β-Lactoglobulin and α-Lactalbumin – Technological Implications for
Processing, International Dairy Journal, 16:1229–1240, 2006.
Committee on Food Chemicals Codex; Food Chemicals Codex, Food and
Nutrition Board, Institute of Medicine, Washington, D.C.: The National
Academies Press, 5th. ed., 2004, 998p.
DERRINGER, G.; SUICH, R.; Simultaneous Optimization of Several Response
Variables, Journal of Quality Technology, 12:214–219, 1980.
DEUTSCHER, M.P.; Methods in Enzymology - Volume 182 - Guide to
Protein Purification, Academic Press, Inc., USA, 1990, 894p.
DeWIT, J.N.; BRONTS, H.; Process for the Recovery of α-Lactalbumin
and β-Lactoglobulin from a Whey Protein Product. US Patent 5,420,249;
1995.
FENNEMA, O.R; Food Chemistry, New York: Marcel Dekker Inc., 3rd. Ed.,
1996, 1069p.
FERREIRA, R.C.; Separa¸c˜ao de α-Lactoalbumina e β-Lactoglobulina de
Prote´ınas do Soro de Queijo por Adsor¸c˜ao em Colunas de Leito Fixo,
Vi¸cosa, MG: UFV, 2001. Tese (Mestrado), Departamento de Tecnologia de
Alimentos, Universidade Federal de Vi¸cosa, 2001, 81p.
71
FOX, P.F.; McSWEENEY, P.L.H; Dairy Chemistry and Biochemistry, Ire-
land: Blackie Academic & Professional, 1998, 478p.
GARC
´
IA, M.C.; MARINA, M.L; TORRE, M.; Ultrarapid Detection of Bovine
Whey Proteins in Powdered Soybean Milk by Perfusion Reversed-Phase High-
Performance Liquid Chromatography, Journal of Chromatography, A 822, 225–
232, 1988.
GIRSH, L.S.; Hypoallergenic Milk Products and Process of Making, US
Patent 4,954,361, 1990.
HUI, Y.H. (Editor) Dairy Science and Technology Handbook: Product
Manufacturing, California: John Wiley & Sons – VCH, 1993, vol.2., 440p.
IFIS - International Food Information Service; Dictionary of Food Science
and Technology,Iowa: Blackwell Publishing Ltd., 2005, 413p.
KANEKO, T.; KOJIMA, T.; KUWATA, T.; YAMAMOTO, Y.; Selective Enzi-
matic Degradation of β-Lactoglobulina Contained in Cow’s Milk-Serum
Protein, US Patent 5,135,869, 1992.
KONRAD, G.; KLEINSCHMIDT, T.; A New Method for Isolation of Native
α-Lactalbumin From Sweet Whey, International Dairy Journal, 18:47-54, 2008.
KUHLMAN, C.F.; LIEN, E.L.; WEABER, J.R.; O’CALLAGHAN, D.M.; In-
fant Formula Compositions Comprising Increased Amounts of α-
Lactalbumin. World Intellectual Property Organization, Patent WO 03/055322
A1, 2003.
LIU, S.X.; Food and Agricultural Wasterwater Utilization and Treat-
ment, Iowa: Blackwell Publishing Ltd., 2007, 277p.
72
LUCENA, M.E.; ALVAREZ, S.; MEN
´
ENDEZ, C.; RIEIRA, F. A.; ALVAREZ,
R., Beta-Lactoglobulin Removal from Whey Protein Concentrates - Production
of Milk Derivatives as a Base for Infant Formulas. Journal of Separation and
Purification Technology, 52:310–316, 2006.
LUCENA, M.E.; ALVAREZ, S.; MEN
´
ENDEZ, C.; RIEIRA, F. A.; ALVAREZ,
R., α-Lactalbumin Precipitation From Commercial Whey Protein Concentrates.
Journal of Separation and Purification Technology, 52:446–453, 2007.
MAROULIS, Z.B.; SARAVACOS, G.D; Food Plant Economics, New York:
CRC Press - Taylor & Francis Group, 2008, 352p.
MEADE, R.E.; STRINGHAM, J.M., Process of Making Whey Food Pro-
ducts. US Patent 2,465,905, 1949.
MEZZAROBA, L.F.H; CARVALHO, J.E.; PONEZI, A.N.; ANT
ˆ
ONIO, M.A.;
MONTEIRO, K.M.; POSSENTI, A.; SGARBIERI, V.C.; Antiulcerative Proper-
ties of Bovine α-Lactalbumin, International Dairy Journal, 16:1005-1012, 2006.
MULLER, A.; DAUFIN, G.; CHAUFER, B.; Ultrafiltration Modes of Opera-
tion for the Separation of α-Lactalbumin from Acid Casein Whey, Journal of
Membrane Science, 153:9-21, 1999.
NELSON, D.L.; COX, M.M.; Lehninger Principles of Biochemistry, W.H.
Freeman and Companhy, New York, 4th. ed., 2005, 1120p.
NOPPE, W.; HAEZEBROUCK, P.; HANSSENS, I.; CUYPER, M.D.; A Simpli-
fied Purification Procedure of α-Lactalbumin From Milk Using Ca
2+
-dependent
Adsorption in Hydrofobic Expanded Bed Chromatography, Bioseparation 8:153–
158, 1999.
73
PIETER, W.; WOUTERS, J.T.M.; GEURTS, T.J., Dairy Science and Tech-
nology, New York: Taylor & Francis Group, 2nd ed., 2006, 762p.
QASBA, P.K; KUMAR, S.; Molecular Divergence of Lysozymes and Alpha-
Lactalbumin, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32:255–306, 1997.
REDDY, N.R.; SATHE, S.K.; Food Phytates, New York: CRC Press LLC.,
2002, 251p.
REHM, H.; Protein Biochemistry and Proteomics - The Experimenter
Series, USA: Elsevier - Academic Press, Inc., 2006, 236p.
REITH, A.D.;; Methods in Molecular Biology - Volume 124 - Protein
Kinase Protocols, USA: Humana Press, Inc., 2004, 359p.
SAS Institute Inc. Getting Started with the SAS
9.1 ADX Interface for
Design of Experiments. Cary, NC: SAS Institute Inc., 2004.
SHUR, B.D.; α-Lactalbumin Contraceptive, US Patent 4,511,558, 1985.
SMITH, J.; HONG-SHUM, L.; Food Additives Data Book, Blackwell Science
Ltd., 2003, 1016p.
TROULLIER, A.; REINST
¨
ADLER, D.; DUPONT, Y.; NAUMANN, D.; FORGE,
V.; Transient Non-Native Secondary Structures During The Refolding of α-
Lactalbumin Detected by Infrared Spectroscopy, Nature Structural Biology, 7,
Num. 1, 78–86, jan. 2000.
WOOD, R.A.; Food Allergies for Dummies, Indianapolis: Wiley Publishing,
Inc., 358p., 2007.
74
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