ads:
TALYTA GALAFASSI ZARPELON
CARACTERIZAÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS E EFICIÊNCIA DO
RIZOLYPTUS
®
NO ENRAIZAMENTO E CRESCIMENTO DE
EUCALIPTO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Fitopatologia, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
TALYTA GALAFASSI ZARPELON
CARACTERIZAÇÃO DE RIZOBACTÉRIAS E EFICIÊNCIA DO
RIZOLYPTUS
®
NO ENRAIZAMENTO E CRESCIMENTO DE
EUCALIPTO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Fitopatologia, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
APROVADA: 21 de março de 2007
_____________________________
Prof. Luiz Antônio Maffia
(Co-Orientador)
_____________________________
Pesq. Poliane Alfenas-Zerbini
(Co-Orientadora)
_____________________________
Prof. Olinto Liparini Pereira
_____________________________
Pesq. Douglas Lau
_____________________________
Prof. Acelino Couto Alfenas
(Orientador)
ads:
ii
“A grandeza não consiste em receber honras, mas em merecê-las”
(Aristóteles)
“Tudo passa”
iii
As minhas avós Eudócia (in memorian) e Sustena (in memorian),
Por acreditarem sempre e representarem a expressão do amor à família.
D
EDICO.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom de vida e por ser presença constante de luz em
minha vida.
À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de realização
dos cursos de graduação em Engenharia Florestal e de pós-graduação em
Fitopatologia.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG), pela concessão da bolsa durante o período de pós-graduação.
À Bio Soja Industria Química e Biológica pelo fornecimento do
inoculante.
À CAF Florestal Santa Bárbara e Veracel pelo apoio logístico e
financiamento de parte deste trabalho.
Ao Prof. Acelino Couto Alfenas pela vibração, orientação e pelo
incentivo nos momentos difíceis.
Ao Dr. Eli pela amizade, pelo acompanhamento e pela colaboração
na elaboração dos trabalhos.
Ao Prof. Maffia pela valiosa cooperação, atenção e pelos
ensinamentos.
À Dr. Poliane pela confiança no trabalho, pelas sugestões e pela
disponibilidade em ensinar.
Ao Prof. Olinto e ao Dr. Douglas pela amizade e sugestões que
enriqueceram o trabalho.
Ao Dr. Lúcio Guimarães pela paciência em ensinar e reensinar com
motivação. Seu estímulo foi decisivo para a conclusão deste trabalho.
À Márcia Maria Brandão pela amizade, paciência e dedicação
constante.
v
Aos amigos Fernanda, Michelle, Marcelo, Léo Batata, Tissiany,
Sílvia e Loly que mesmo distantes estão sempre do meu lado.
À amiga Daniela pelo apoio e pelos momentos de alegria vividos na
graduação e pós-graduação.
Ao Marcelo, pelo amor, pela paciência e ajuda nas montagens e
avaliações dos experimentos.
Aos meus pais José Maria e Claudete, pelo amor e pela dedicação.
Ao meu irmão Tiago, pela coragem e força em alcançar seus
objetivos e que é fonte de inspiração para mim.
Aos funcionários Alex, Cíntia, Euzébio, Ricardo e Rafael e
especialmente ao Renildo pela enorme colaboração e participação durante
todo o período de pesquisa.
A todos que acreditaram neste trabalho e que contribuíram para sua
realização.
vi
BIOGRAFIA
Talyta Galafassi Zarpelon, filha de José Maria Zarpelon e Maria
Claudete Galafassi Zarpelon, nasceu a 18 de maio de 1978, em Cornélio
Procópio, Estado do Paraná.
Ingressou em 1999, no curso de Engenharia Florestal da
Universidade Federal de Viçosa (UFV), no qual foi bolsista de Iniciação
Científica no Departamento de Fitopatologia, sob a orientação do professor
Acelino Couto Alfenas.
Em fevereiro de 2005, iniciou o curso de Mestrado em Fitopatologia
na mesma Instituição, sob a orientação do professor Acelino Couto Alfenas,
defendendo tese em março de 2007.
vii
SUMÁRIO
RESUMO __________________________________________________ ix
ABSTRACT ________________________________________________ xi
INTRODUÇÃO GERAL _______________________________________ 1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _____________________________ 4
A
RTIGO 1 ____________________________________________________ 6
Caracterização de isolados de rizobactérias promotoras de enraizamento de
miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto ____________________ 6
RESUMO ___________________________________________________ 6
ABSTRACT _________________________________________________ 8
1. INTRODUÇÃO ___________________________________________ 10
2. MATERIAL E MÉTODOS __________________________________ 13
2.1. Isolados de rizobactérias _________________________________ 13
2.2. Caracterização morfológica dos isolados de rizobactérias________ 13
2.3. Sensibilidade dos isolados de rizobactérias a antibióticos________ 14
2.4. Caracterização molecular dos isolados de rizobactérias _________ 15
2.4.1. Extração do DNA _______________________________________ 15
2.4.2. Reação de PCR _________________________________________ 16
2.4.3. Análise de restrição dos fragmentos _________________________ 16
3. RESULTADOS____________________________________________ 18
3.1. Caracterização morfológica dos isolados de rizobactérias________ 18
3.2. Sensibilidade dos isolados de rizobactérias a antibióticos________ 24
3.3. Caracterização molecular_________________________________ 26
4. DISCUSSÃO _____________________________________________ 29
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS __________________________ 33
viii
ARTIGO 2 ___________________________________________________ 37
Eficiência de duas formulações de rizobactérias no enraizamento de
miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto ___________________ 37
RESUMO __________________________________________________ 37
ABSTRACT ________________________________________________ 39
1. INTRODUÇÃO ___________________________________________ 41
2. MATERIAL E MÉTODOS __________________________________ 43
2.1. Formulações___________________________________________ 43
2.2. Viabilidade dos isolados de rizobactérias nas formulações líquida e
turfosa ___________________________________________________ 43
2.3. Eficiência do produto Rizolyptus
®
sobre o enraizamento de
miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto _________________ 44
2.4. Delineamento experimental e análises estatísticas______________ 45
3. RESULTADOS____________________________________________ 47
3.1. Viabilidade dos isolados de rizobactérias nas formulações líquida e
turfosa ___________________________________________________ 47
3.2. Eficiência das formulações turfosa e líquida sobre o enraizamento de
miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto _________________ 49
4. DISCUSSÃO _____________________________________________ 61
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS __________________________ 65
CONCLUSÕES GERAIS______________________________________ 69
ix
RESUMO
ZARPELON, Talyta Galafassi, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
março de 2007. Caracterização de rizobactérias e eficiência do
Rizolyptus
®
no enraizamento e crescimento de eucalipto. Orientador:
Acelino Couto Alfenas. Co-Orientadores: Luiz Antônio Maffia e Poliane
Alfenas-Zerbini.
A partir de uma série de experimentos iniciados no final da década
de 90, comprovaram-se os efeitos benéficos de isolados de rizobactérias,
obtidos da rizosfera de mudas de diferentes clones de Eucalyptus grandis,
Eucalyptus urophylla e seus híbridos, quando inoculados na forma de
suspensão salina ao substrato. Para que sua utilização se tornasse
operacionalmente viável, formularam-se os isolados mais promissores em
turfa canadense e em solução estabilizante, e realizou-se sua caracterização
morfológica, molecular e a sensibilidade a antibióticos. Após 24 horas de
incubação, as características de elevação e coloração das colônias
permitiram a diferenciação dos isolados de todas as espécies estudadas.
Ademais os isolados S1, S2 e 3918 de Bacillus subtilis, MF2 e MF4 de
Pseudomonas sp. e Ca de Pseudomonas fulva foram diferenciados por suas
características morfológicas e pela sensibilidade a antibióticos. A análise de
PCR-RFLP permitiu a diferenciação entre os isolados CIIb de
Stenotrophomonas maltophilia, R1 de Frateuria aurantia e FL2 de
Pseudomonas aeruginosa e entre os grupos dos isolados S1, S2 e 3918 de
Bacillus e MF2, MF4 e Ca de Pseudomonas. A eficiência dos inoculantes na
produção de mudas de eucalipto variou de acordo com o clone, tipo de
formulação e isolado testado. Em geral, o clone de E. grandis (11)
respondeu melhor à rizobacterização (Alfenas et al., 2004) que o de E.
x
grandis x E. urophylla (409). A formulação turfosa propiciou maiores
incrementos para as variáveis velocidade de enraizamento, biomassa da
parte aérea e do sistema radicular. Os isolados R1, FL2, S1 e S2
destacaram-se por apresentarem maior incremento de enraizamento e o
isolado S2 para o incremento da biomassa da parte aérea e do sistema
radicular. Tanto a formulação turfosa quanto a líquida mostraram-se
eficientes na indução de enraizamento de miniestacas e no crescimento de
mudas, sendo seu uso uma alternativa prática e viável a ser adotada na
produção de mudas de eucalipto.
xi
ABSTRACT
ZARPELON, Talyta Galafassi, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
March of 2007. Rhizobacteria characterization and Rizolyptus
®
efficiency in eucalyptus rooting and growth. Adviser: Acelino Couto
Alfenas. Co-Advisers: Luiz Antônio Maffia and Poliane Alfenas-
Zerbini.
Since the late 90s, experiments have shown the beneficial effects of
rhizobacteria isolates obtained from the rhizosphere of seedlings of different
clones of Eucalyptus grandis, Eucalyptus urophylla and their hybrids, when
inoculated to the substratum with a saline suspension. To make its use
operationally viable, the most promising isolates were formulated in
canadian turf and in stabilizing solution, as well as morphological and
molecular characterizations and tests of sensibility to antibiotics. After 24-h
incubation, the colonial characteristics elevation and color of allowed the
differentiation of isolates of all studied species. Besides the isolates S1, S2
and 3918 of Bacillus subtilis, MF2 and MF4 of Pseudomonas sp. and Ca of
Pseudomonas fulva were differentiated by their morphological
characteristics and the sensibility to antibiotics. PCR-RFLP analysis allowed
the differentiation among isolates CIIb of Stenotrophomonas maltophilia,
R1 of Frateuria aurantia and FL2 of Pseudomonas aeruginosa and between
the groups of Bacillus isolates S1, S2 and 3918 and Pseudomonas MF2,
MF4 and Ca. The efficiency of inoculants in the production of eucalyptus
seedlings varied with clones, types of tested formulation and isolate. In
general, clones of E. grandis (11) gave better response to rhizobacterization
(Alfenas et al., 2004) than E. grandis x E. urophylla (409). The turf
formulation provided larger increases for the variables rooting speed,
xii
biomass of aerial part and root system. Isolates R1, FL2, S1 and S2 stood
out for showing larger rooting increase and isolated S2 for increasing the
biomass of the aerial part and root system. Both the turf and the liquid
formulations were shown to be efficient in inducing minicutting rooting and
seedling growth, being a practical and viable alternative to be adopted in
eucalyptus seedling production.
1
INTRODUÇÃO GERAL
A clonagem por estaquia, introduzida no Brasil no final da década de
70, representa um dos maiores avanços da eucaliptocultura brasileira. Desde
sua implantação em escala comercial, a propagação clonal de Eucalyptus
vem sofrendo grandes progressos tecnológicos, especialmente quanto aos
métodos de produção e colheita de brotos para estaquia, tipo de substrato,
recipiente e modelos de casa de enraizamento e aclimatação (Alfenas et al.,
2004). Entretanto, a estaquia convencional ou macroestaquia apresenta
inúmeros obstáculos, como o baixo percentual de enraizamento de algumas
espécies de Eucalyptus e seus híbridos e a perda gradual do potencial de
enraizamento com o envelhecimento ontogenético das matrizes (Assis,
1997). Com o advento das técnicas de miniestaquia e microestaquia, na
década de 90, a maioria desses problemas foram amenizados, o que tornou
possível a multiplicação comercial de clones de difícil enraizamento. No
entanto, apesar das inúmeras vantagens da miniestaquia (Alfenas et al.,
2004) alguns clones possuem baixo índice de enraizamento ou sistema
radicular malformado, o que constitui uma limitação para o seu
estabelecimento no campo. Com o objetivo de minimizar estes problemas, o
emprego de rizobactérias promotoras de crescimento de plantas desponta
como uma alternativa viável a ser empregada nos viveiros clonais. A partir
de uma série de experimentos têm sido comprovados os efeitos benéficos
das rizobactérias em promover o enraizamento de estacas, o crescimento de
mudas (Mafia, 2004; Mafia et al., 2005; Teixeira, 2001; Teixeira et al.,
2007) e o controle biológico de doenças que afetam a propagação clonal do
eucalipto (Ladeira, 2004; Teixeira, 2001; Teixeira et al., 2005).
2
Dentre 107 isolados de bactérias, obtidos da rizosfera de mudas de
diferentes clones de Eucalyptus, nove se destacaram quanto ao potencial de
enraizamento de miniestacas de eucalipto e foram identificados sendo três
de Bacillus subtilis Cobn, 1872 (S1, S2 e 3918), um de Pseudomonas fulva
Lizuga & Komagata, 1963 (Ca), um de Pseudomonas aeruginosa
(Schroeter, 1872) Migula, 1900 (FL2), um de Frateuria aurantia Swings et
al., 1980 (R1), um de Stenotrophomonas maltophilia (Hugh, 1872) Palleroni
& Bradbury, 1993 (CIIb) e dois de Pseudomonas sp. Migula, 1894 (MF2 e
MF4) baseando-se nas seqüências parciais da região 16S do DNA
ribossomal (Teixeira et al., 2007).
Posteriormente testou-se a mistura de isolados compatíveis “in
vitro”, em ensaio realizado em casa de vegetação destacando-se as misturas
dos isolados VC2 (não identificado) + Ca (P. fulva) para enraizamento e
VC2 + 3918 (B. subtilis) para biomassa radicular (Mafia, 2004). Nestes
estudos observaram que as respostas obtidas variavam de acordo com o
clone e o isolado empregado. Em um estudo para investigar a especificidade
da interação de isolados de rizobactérias e oito clones de eucalipto, não foi
observado efeito deletério das rizobactérias na rizogênese do eucalipto, mas
os incrementos em enraizamento e biomassa radicular variaram conforme o
isolado e o clone testado, evidenciando a especificidade na interação (Mafia,
2004). A forma de veiculação das rizobactérias também foi testada e os
resultados variaram de acordo com o clone, forma de aplicação e o isolado
empregado. A veiculação direta no substrato é a mais operacional, devido à
facilidade de aplicação. A imersão de miniestacas na suspensão de inóculo,
ou ainda, as duas formas de veiculação concomitantemente torna-se uma
alternativa de inoculação, principalmente quando o objetivo é o biocontrole
de patógenos apodrecedores de miniestacas de eucalipto (Mafia, 2004).
No primeiro estudo de avaliação da eficiência das rizobactérias no
controle de doenças, os isolados FL2 (P. aeruginosa) e MF4 (Pseudomonas
sp.) destacaram-se por reduzir a severidade de ferrugem (Puccinia psidii)
em mudas inoculadas com rizobactérias pré-selecionadas, evidenciando a
indução de resistência sistêmica (Teixeira et al., 2005). A incidência de
patógenos como Cylindrocladium candelabrum Viégas, Rhizoctonia solani
Kühn (Mafia, 2004) e Quambalaria eucalypti (Wingfield, Crous & Swart)
3
Simpson (sin. Sporothrix eucalypti Wingfield, Crous & Swart) (Ladeira,
2004), foi também menor em mudas de eucalipto, multiplicados em
substrato rizobacterizado.
Nesses experimentos de rizobactérias com eucalipto (Ladeira, 2004;
Mafia, 2004; Mafia et al., 2005; Teixeira, 2001; Teixeira et al., 2005;
Teixeira et al., 2007) e outras culturas (Boer et al., 1999; Enebak et al.,
1997; Kloepper et al., 1980; Kokalis-Burelle et al., 2002; Shishido &
Chanway, 2000) utilizaram-se suspensões bacterianas, produzidas em meio
de cultura. Entretanto, este tipo de inóculo é de difícil produção em grande
escala e apresenta dificuldades na manipulação, no transporte,
armazenamento e baixa sobrevivência ao longo do tempo.
Assim, tornou-se necessário o desenvolvimento de uma formulação
para veicular os isolados e facilitar sua aplicação. Através de uma parceria
entre a UFV e a Bio Soja Indústrias Químicas e Biológicas, desenvolveram-
se duas formulações, sólida e líquida, para veicular os isolados de
rizobactérias benéficas na produção de mudas de eucalipto, cujo produto
passou a denominar-se Rizolyptus
®
. A fim de viabilizar o emprego desse
inoculante em ampla escala, no presente trabalho efetuou-se a caracterização
morfológica, molecular e a sensibilidade a antibióticos dos isolados de
rizobactérias (Artigo 1) e avaliaram-se o período de sobrevivência das
bactérias (“shelf life”) nas respectivas formulações, sua capacidade de
estimular a rizogênese de miniestacas e o crescimento de mudas de
eucalipto (Artigo 2).
4
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALFENAS, A.C., ZAUZA, E.A.V., MAFIA, R.G.; ASSIS, T.F.D. Clonagem e
doenças do eucalipto. Viçosa. Imprensa Universitária. 2004.
ASSIS, T.F. Propagação vegetativa de Eucalyptus por microestaquia. Anais, I
Conferência sobre silvicultura e melhoramento de eucaliptos, Salvador BA.
1997. pp. 300-304.
BOER, M., VAN DER SLUIS, I., VAN LOON, L.C.; BAKKER, A.H.M.
Combining fluorescent Pseudomonas spp. strains to enhance suppression of
fusarium wilt of radish. Europan Journal of Plant Pathology 105:201-210.
1999.
ENEBAK, S.A., WEI, G.; KLOEPPER, J.W. Effects of plant growth-promoting
rhizobacteria on loblolly and slash pine seedlings. Forest Science 44:139-144.
1997.
KLOEPPER, J.W., SCHROTH, M.N.; MILLER, T.D. Effets of rhizosphere
colonization by plant growth-promoting rhizobacteria on potato plant
development and yield. Phytopathology 70:1078-1082. 1980.
KOKALIS-BURELLE, N., VAVRINA, C.S., ROSSKOPF, E.N.; SHELBY, R.A.
Field evaluation of plant growth-promoting rhizobacteria amended ransplant
mixes and soil solarization for tomato and pepper production in Florida. Plant
and Soil 238:257-266. 2002.
LADEIRA, M.C.G. Controle biológico de Quambalaria eucalypti mediado por
rizobactérias. Dissertação de mestrado. Viçosa MG. Universidade Federal de
Viçosa. 2004.
5
MAFIA, R.G. Rizobactérias como promotoras do enraizamento, crescimento e
como agentes de biocontrole de doenças na propagação clonal do eucalipto.
Dissertação de Mestrado. Viçosa MG. Universidade Federal de Viçosa. 2004.
MAFIA, R.G., ALFENAS, A.C., FERREIRA, E.M., ZARPELON, T.G.;
SIQUEIRA, L. Crescimento de mudas e produtividade de minijardins clonais
de eucalipto tratados com rizobactérias selecionadas. Revista Árvore 29:843-
851. 2005.
SHISHIDO, M.; CHANWAY, C.P. Colonization and growth promotion of
outplanted spruce seedlings pre-inoculated with plant growth-promoting
rhizobacteria in the greeenhouse. Canadian Journal of Forest Research
30:845-854. 2002.
TEIXEIRA, D.A. Promoção de enraizamento e indução de resistência sistêmica à
ferrugem e à mancha-de-Cylindrocladium, mediadas por rizobactérias em
clones de Eucalyptus spp. Dissertação de Mestrado. Viçosa MG. Universidade
Federal de Viçosa. 2001.
TEIXEIRA, D.A., ALFENAS, A.C., MAFIA, R.G., FERREIRA, E.M.,
SIQUEIRA, L., MAFFIA, L.A.; MOUNTEER, A.H. Rhizobacterial
promotion of eucalypt rooting and growth. Brazilian Journal of
Microbiology 38:1-6. 2007.
TEIXEIRA, D.A., ALFENAS, A.C., MAFIA, R.G., MAFFIA, L.A.; FERREIRA,
E.M. Evidências de indução de resistência sistêmica à ferrugem do eucalipto
mediada por rizobactérias promotoras do crescimento de plantas.
Fitopatologia Brasileira 30:350-356. 2005.
6
ARTIGO 1
Caracterização de isolados de rizobactérias promotoras de
enraizamento de miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto
Talyta G. Zarpelon
1
; Reginaldo G. Mafia
2
; Lúcio Mauro da S. Guimarães
1
;
Poliane Alfenas-Zerbini
1
; Luis A. Maffia
1
; Eli S. Lopes
3
; Acelino C. Alfenas
1
1
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais,
Brasil;
2
Aracruz Celulose;
3
Bio Soja Indústrias Químicas e Biológicas.
RESUMO
Isolados de rizobactérias obtidos da rizosfera de mudas de diferentes
clones de Eucalyptus, que demonstraram capacidade em aumentar a rizogênese de
miniestacas, a biomassa radicular de mudas e promover o controle biológico de
doenças de eucalipto, foram formulados em dois veículos (turfa canadense e
solução líquida) para que sua utilização se tornasse operacionalmente viável. A
fim de garantir um produto livre de contaminantes e a autenticidade dos isolados é
necessária à implementação de um programa de controle de qualidade para os
inoculantes produzidos. Para isso, é indispensável conhecer as características
intrínsecas de cada estirpe a ser propagada. Neste trabalho, efetuou-se a
caracterização morfológica e molecular de nove isolados de rizobactérias
previamente selecionados, sendo três de Bacillus subtilis, dois de Pseudomonas
sp., um de P. fulva, um isolado de Stenotrophomonas maltophilia, um de
Frateuria aurantia e um isolado de Pseudomonas aeruginosa. Para a análise
morfológica, os isolados foram repicados para três diferentes meios de cultura e
avaliados quanto às características de elevação, forma das bordas, estrutura e
7
forma da colônia, crescimento, consistência, superfície, brilho, coloração e
alteração da cor do meio. Avaliou-se também a resistência dos isolados de
rizobactérias a antibióticos. Os isolados de Bacillus subtilis e Pseudomonas sp.
foram facilmente diferenciados por suas características morfológicas e pela
sensibilidade a antibióticos. A análise molecular por PCR-RFLP, do rDNA 16S
permitiu a separação entre os isolados CIIb, R1 e FL2 e os grupos de Bacillus (S1,
S2 e 3918) e de Pseudomonas (MF2, MF4 e Ca). Os perfis de restrição
produzidos por nove enzimas de restrição não diferenciaram os três isolados de B.
subtilis, assim como não distinguiram os isolados de Pseudomonas sp. e P. fulva.
Palavras-chave: Rizobactérias, Eucalyptus, formulação, caracterização.
8
ABSTRACT
ZARPELON, Talyta Galafassi, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, March of
2007. Characterization of eucalyptus minicutting root-inducing and
seedling growth-promoting rhizobacteria isolates. Adviser: Acelino Couto
Alfenas. Co-Adviser: Luiz Antônio Maffia and Poliane Alfenas-Zerbini.
Isolates obtained from the seedling rhizosphere of different clones of
Eucalyptus, which have demonstrated capacity to increase minicutting rooting and
seedling root biomass and to promote biological control of eucalyptus diseases,
were formulated in two vehicles (canadian turf and liquid solution) to make its use
operationally viable. The implementation of a quality control program for
inoculant production is necessary to guarantee a pollutant-free product and isolate
authenticity. Knowledge on the intrinsic characteristics of each strain to be
propagated is therefore fundamental. In this work, morphological and molecular
characterizations of nine previously selected rhizobacteria isolates were carried
out, being three isolates of Bacillus subtilis, two of Pseudomonas sp., one of P.
fulva, one of Stenotrophomonas maltophilia, one of Frateuria aurantia and one of
Pseudomonas aeruginosa. For the morphological analysis, the isolates were
subcultured into three different culture media and evaluated for the characteristics
elevation, margin type, colony structure and shape, growth, consistence, surface,
brightness, color and change in medium color. Isolate resistance to antibiotics was
also evaluated. The isolates of Bacillus subtilis and Pseudomonas sp. were easily
differentiated by their morphological characteristics and sensibility to antibiotics.
PCR-RFLP analysis of rDNA 16S allowed the separation among the isolates CIIb,
R1 and FL2 and between the groups Bacillus (S1, S2 and 3918) and Pseudomonas
(MF2, MF4 and Ca). Restriction profiles produced by nine restriction enzymes
9
did not differentiate the three isolates of B. subtilis nor the isolates of
Pseudomonas sp. and P. fulva.
Key words: Rhizobacteria, Eucalyptus, formulations, characterizations.
10
1. INTRODUÇÃO
A rizosfera é uma estreita zona de solo que circunda a raiz e está sob a
influência do sistema radicular (5) Nesta região, predominam bactérias de vida
livre ou associadas aos tecidos das plantas (2) e que podem exercer um efeito
benéfico, neutro ou deletério sobre elas (5). O grupo de bactérias com
características benéficas foi denominado “Plant Growth-Promoting Rhizobacteria
– PGPR”, ou ainda, rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (3, 14,
15).
Isolados de bactérias, obtidos da rizosfera de mudas de diferentes clones
de eucalipto, foram testados e destacaram-se quanto ao potencial em promover
enraizamento de estacas e miniestacas de clones de Eucalyptus (28). Em diversos
viveiros florestais, localizados em todo o país, os isolados mais promissores foram
testados em escala semi-operacional, inoculados em diferentes composições de
substrato, obtendo incremento em biomassa radicular e da parte aérea, maior
velocidade de enraizamento e controle de doenças como Cylindrocladium
candelabrum Viégas e Rhizoctonia solani Kuhn (17), Quambalaria eucalypti
(Wingfield, Crous & Swart) Simpson (sin. Sporothrix eucalypti Wingfield, Crous
& Swart) (16), e Puccinia psidii Winter via indução de resistência sistêmica (28).
Atualmente, os isolados estão sendo formulados em dois veículos: turfa
canadense e em solução estabilizante, para atender a demanda pelos isolados de
rizobactérias em eucalipto. Na produção de qualquer microrganismo em larga
escala, é fundamental o conhecimento das características intrínsecas de cada
estirpe a ser propagada, de modo a permitir realizar de forma otimizada o controle
de qualidade.
11
A detecção e identificação de bactérias pode ser realizada por métodos
microbiológicos convencionais, como o isolamento, o cultivo de culturas puras
em meio seletivos, testes bioquímicos e observação direta feita através de
microscópio (20). Entretanto, estes métodos são trabalhosos, demandam tempo e,
além disso, a ocorrência de formas intermediárias que dificultam a interpretação
dos resultados, impossibilitam muitas vezes a identificação correta dessas
bactérias. Métodos de detecção molecular incluindo sondas genéticas,
hibridização de DNA, PCR e genes repórteres são utilizados em adição aos
métodos convencionais de identificação de bactérias (7).
Os padrões de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) foram
os primeiros marcadores de DNA usados para se comparar diferentes isolados
(29) e têm sido empregados nos estudos de genética de populações (9, 27). A
análise por RFLP após a amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) das
seqüências parciais da região 16S do DNA ribossomal é uma técnica apropriada e
rápida para diferenciar e caracterizar microrganismos com base nas relações
filogenéticas (1). Os genes ribossomais (rDNA) são encontrados em todos os
microrganismos e são conhecidos por sua baixa taxa de mutação. Os interespaços
entre as regiões altamente conservadas dos genes ribossomais, são regiões que
apresentam seqüências variáveis chamadas de regiões espaçadoras. As mutações
dentro das regiões espaçadoras ocorrem com maior freqüência que com os genes
ribossomais, sendo estas mutações de grande utilidade para a separação entre
gêneros e espécies (6, 12, 27). Em DNA bacteriano, o rDNA inclui os locos 16S,
23S e 5S, os quais são separados pela região denominada ITS, espaço interno
transcrito. Dessa forma, pode-se utilizar o rDNA para estudo de grupos
heterogêneos ou a região espaçadora (ITS) entre genes conservados para o estudo
de grupos muito similiares. Assim, a análise PCR-RFLP da região 16S do DNA
ribossomal é um método utilizado para diferenciação de espécies (24-26) e a
maioria das caracterizações é realizada utilizando um pequeno número de enzimas
e uma interpretação visual do padrão de restrição. Além disso, este método é mais
rápido do que o seqüênciamento da região 16S do rDNA e menos oneroso.
Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivos efetuar a
caracterização morfológica, molecular e a sensibilidade a antibióticos dos isolados
de rizobactérias previamente selecionados, visando à utilização destes métodos na
12
detecção de contaminantes e autenticação dos isolados, auxiliando no controle de
qualidade do produto Rizolyptus
®
a ser comercializado.
13
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Isolados de rizobactérias
Foram utilizados nove isolados de rizobactérias que se destacaram quanto
ao potencial em promover enraizamento de estacas e miniestacas de clones de
Eucalyptus. Os isolados denominados de S1, S2 e 3918 pertencem a espécie
Bacillus subtilis Cobn, 1872, o isolado Ca foi determinado como da espécie
Pseudomonas fulva Lizuga & Komagata, 1963, o isolado FL2 de Pseudomonas
aeruginosa (Schroeter, 1872) Migula, 1900, o isolado CIIb é da espécie
Stenotrophomonas maltophilia (Hugh, 1872) Palleroni & Bradbury, 1993, o
isolado R1 de Frateuria aurantia Swings et al., 1980 e os isolados MF2 e MF4
foram identificados como Pseudomonas sp. Migula, 1894 (28).
2.2. Caracterização morfológica dos isolados de rizobactérias
Os isolados de rizobactérias foram caracterizados morfologicamente em
três diferentes meios de cultura. Para isso, eles foram inicialmente repicados para
o meio 523 e em seguida transferidos para placas de Petri, com 9 cm de diâmetro,
contendo os meios: 523 (13), YMA (yeast extract-manitol-ágar) e Ágar Nutritivo-
Glicose (18), em estado sólido.
Após a repicagem dos isolados, as placas de Petri foram mantidas a 28ºC
por 24 e 48 h, no escuro. As avaliações foram realizadas com o auxílio de biocular
estereoscópica Leica Zoom 2000 e utilizou-se um padrão de classificação (Figura
1) para bactérias segundo os critérios de elevação, estrutura da superfície, forma
da colônia e das bordas. Além destas características, os isolados foram avaliados
14
quanto aos critérios de crescimento (muito rápido: menos de 1 dia, rápido: entre 1
e 2 dias, médio: entre 2 e 3 dias, lento: 3 e 4 dias e muito lento: mais de 4 dias),
consistência (mucosa, fluida e micelial), superfície (lisa e rugosa), brilho
(brilhante, translúcida e opaca), coloração e alteração da cor do meio.
h
i
lp
m
q
j
nr
k
os
a
b
g
c
d
e
f
h
i
lp
m
q
j
nr
k
os
h
i
lp
m
q
j
nr
k
os
h
i
lp
m
q
j
nr
k
os
a
b
g
c
d
e
f
a
b
g
c
d
e
f
a
b
g
c
d
e
f
Figura 1. Padrão utilizado na caracterização morfológica dos isolados pré-
selecionados de rizobactérias. Quanto à elevação das colônias, temos:
a – chata; b – espraiada; c – convexa baixa; d – convexa alta;
e – umbilicada; f – centro-saliente e g – papilífera. Em relação à
forma:
h, k, l, m, n e p – circular; i, j, o, q – irregular e r, s – rizóide.
A estrutura das colônias:
h, l, m, n – amorfa; i, j, k, o – granulosa;
q – cacheada e p, r, s – filamentosa. As bordas das colônias foram
classificadas como: h, n – inteiros; i, o, p, q – ondulados;
j, k – lobados; l, m – denticulados e r, s – franjados.
2.3. Sensibilidade dos isolados de rizobactérias a antibióticos
Para avaliar a resistência dos isolados de rizobactérias a antibióticos
seguiu-se o método padrão do antibiograma (21). Para isso, os isolados de
rizobactérias foram repicados para o meio 523 em estado sólido e incubados a
15
28ºC no escuro. Após 48 h de incubação, obteve-se uma suspensão bacteriana em
solução salina de NaCl a 0,85%. Após esta etapa, foram distribuídos 0,1 mL da
suspensão (O.D.
540
= 0,2) em placas de Petri, onde posteriormente foram
depositados 4 discos de 28 antibióticos posicionados eqüidistantementes entre si
(Tabela 3).
O experimento foi composto por três réplicas e a avaliação realizada 48 h
após a montagem do ensaio, onde foi determinada a presença do halo de inibição.
2.4. Caracterização molecular dos isolados de rizobactérias
2.4.1. Extração do DNA
Para a extração de DNA, os isolados foram repicados para placas de Petri
contendo meio 523 e incubados por 48 h a 27°C no escuro. Após este período,
colônias de cada isolado foram repicadas para tubos de ensaio contendo 5 mL de
meio 523 líquido (13). Os tubos de ensaio foram mantidos por 18 h a 37°C, em
agitação constante de 225 rpm. O DNA genômico foi extraído de acordo com o
protocolo de Graves e Swaminathan (11), com algumas modificações descritas a
seguir. Após o crescimento, as suspensões bacterianas (5 mL) foram centrifugadas
(5000 rpm/5 min) e o precipitado formado ressuspendido em 675 µL de solução
tampão (Tris 0,1 M, NaCl 5 M, pH 8,0). Em seguida, homogeneizou-se em
“vortex” e adicionaram-se 9 µL de lisozima (2 mg/mL). Após incubação por
1 hora a 37°C, foram adicionados 45 µL de SDS (sódio-dodecyl-sulfato) a 20% e
novamente incubadas por 30 min a 37°C. Aos tubos foram adicionados 4,5 µL de
proteinase K (20 µg/µL), 165 µL de NaCl 5M e 132 µL de CTAB/NaCl
(CTAB 10%/NaCl 4,1%) e homogeneizou-se por 10 min. Após incubação por 10
min a 65°C, seguido de 5 min a 37°C, as suspensões foram purificadas, por
extração, com 500 µL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1), através
de centrifugação por 15 min a 7000 rpm. O sobrenadante contendo o DNA de
cada isolado foi transferido para novos tubos e adicionou-se igual volume de
clorofórmio-álcool isoamílico (1:1). As amostras foram novamente
homogeneizadas e centrifugadas por 10 min a 10.000 rpm, a fase aquosa foi
transferida para novos tubos de 1,5 mL. Em seguida, adicionaram-se 500 µL de
16
isopropanol e centrifugou-se a 12000 rpm por 30 min. Descartado o sobrenadante,
o DNA foi lavado duas vezes em etanol 70% e secado por 20 minutos no
dessecador. Posteriormente, o DNA foi ressuspendido em 50 µL de tampão TE
(Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 8,0) e incubados por 1 h a 37°C.
Em seguida, o DNA extraído foi quantificado em um espectrofotômetro a
260 nm e 280 nm. A leitura de absorbância a 260 nm permitiu a quantificação, e a
relação 260
O.D.
/280
O.D.
forneceu a avaliação da pureza da extração.
2.4.2. Reação de PCR
As reações de PCR foram constituídas de 10-20 ng de DNA genômico,
2 mM de MgCl
2
, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 0,1 mM de cada
um dos deoxinucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) (Invitrogen, Rockeville,
MD, USA), 0,1 μM de cada um dos oligonucleotídeos, 1 unidade da enzima Taq
polimerase (Phoneutria) e água estéril (MilliQ) suficiente para atingir o volume
final de 50 μL. Foram utilizados oligonucleotídeos específicos para amplificação
de um fragmento de 1,6 Kb correspondente à região rDNA 16S de bactérias
P1 (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) e P2 (5’-AAG GAG GTG ATC
CAG CCG CA-3’) (30). As reações de PCR foram realizadas em um
termociclador Mastercycler
®
(Eppendorf, Hamburg, Alemanha), com as seguintes
condições: desnaturação inicial a 94ºC por 3 min, seguida de amplificação por
35 ciclos, cada qual constituído por uma etapa de desnaturação do DNA por 1 min
a 94ºC, anelamento dos oligonucleotídeos por 30 seg a 60ºC e extensão por 1 min
e 30 seg a 72°C. Após os 35 ciclos, realizou-se uma extensão final a 72ºC por
7 min. A fim de confirmar a amplificação, 5 μL do produto da PCR foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose (1,2%) de acordo com técnicas
padrão (23).
2.4.3. Análise de restrição dos fragmentos
Após a confirmação da amplificação do DNA, 15 μL da alíquota do
produto da amplificação de cada amostra foram clivados separadamente com nove
enzimas de restrição EcoRI, RsaI, Sau3AI, SphI, MspI, BamHI, DdeI, TaqI e
17
HinfI. Foram adicionados ao produto da amplificação 1 μL da enzima de restrição
e 3 μL do tampão 10X. Em seguida, a reação foi incubada à temperatura,
recomendada pelo fabricante (Promega), específica para cada enzima, por 12 h.
Os fragmentos foram novamente separados por eletroforese como descrito no item
2.4.2.
18
3. RESULTADOS
3.1. Caracterização morfológica dos isolados de rizobactérias
As características morfológicas variaram de acordo com o meio de cultura
(523, YMA e Ágar Nutritivo-Glicose) e isolado de rizobactéria. O meio 523 foi o
que mais diferenciou entre si os três isolados de Bacillus subtilis e os dois de
Pseudomonas sp., principalmente nas características observadas após 24 h de
incubação. Entre as características avaliadas, a coloração e a elevação das colônias
no meio 523 foi a que mais distinguiu os isolados: creme e convexa baixa para o
isolado S1, creme e chata para o R1, creme claro e convexa baixa para S2, branco
gelo e umbilicada para 3918, creme esverdeado e umbilicada para Ca, branca e
convexa baixa para CIIb, verde fluorescente e chata para FL2, amarelo esverdeado
e convexa baixa para MF2 e creme amarelado e umbilicada para o isolado MF4
(Tabela 1).
O isolado R1 diferenciou-se dos demais pela característica de crescimento,
pois foi o único que apresentou crescimento rápido, após 24 h de incubação a
28°C, com tamanho de colônias menores que 1 mm, nos três meios utilizados
(Figuras 2 e 3 e Tabela 1). Já as colônias do isolado CIIb, diferiram das demais
pelo crescimento puntiforme (tamanho <1 mm), inclusive após 48 h de incubação
(Tabela 1 e Tabela 2).
Os isolados S1, S2 e 3918, todos B. subtilis, apresentam características
morfológicas que os diferenciam entre si e principalmente dos outros isolados.
Eles diferem dos demais isolados em duas características: brilho (opaco nos meios
YMA e ágar nutritivo, 24 h de incubação) e superfície (pregueada nos três meios,
48 h de incubação) (Tabela 1 e Tabela 2). As principais características que os
19
separam são: coloração, bordas e superfície. Para o S1, repicado no meio 523,
observou-se coloração creme e superfície rugosa nas primeiras 24 h de cultivo, e
no meio ágar nutritivo coloração creme claro e superfície lisa. Após 24 h de
cultivo, as colônias do isolado S2, repicado para o meio 523, apresentam
consistência fluida e superfície lisa, além de uma forma irregular e bordas
denticuladas nos meios YMA e ágar nutritivo. Outro Bacillus, o isolado 3918,
exibiu quando repicado para meio 523, colônias de coloração branco gelo,
elevação umbilicada e superfície rugosa. Estas características, após 24 h de
incubação diferenciam estes isolados (Figuras 2 e 3 e Tabela 1). Com 48 h de
incubação, a superfície das colônias dos isolados de Bacillus tornam-se
pregueada, entretanto as colônias do isolado S2 apresentam-se brilhantes e de
consistência fluida, quando cultivadas no meio 523, características que também
diferenciam este isolado dos demais Bacillus (Tabela 2).
Para as colônias dos isolados Ca, CIIb, FL2, MF2 e MF4, em todos os
meios de cultura testados e em ambas as avaliações, observou-se consistência
mucosa e superfície lisa. Os isolados Ca e FL2, após a incubação por 48 h,
alteram da cor do meio 523, entretanto as colônias do isolado Ca são brilhantes
enquanto as colônias do FL2, possuem brilho translúcido. As características das
colônias do isolado MF2, após 24 e 48 h de crescimento, não variam entre os três
meios de cultivo testados, exceto a coloração e a elevação das colônias. As
colônias do isolado MF4, em meio 523, apresentam coloração creme amarelado
característica marcante do isolado, além disto após 24 h de incubação, a elevação
das colônias é umbilicada e a estrutura classificada como granulosa (Figura 3 e
Tabela 1).
20
A
B
C
F
E
D
I
H
G
AA
BB
CC
FF
EE
DD
II
HH
GG
Figura 2. Isolados de rizobactérias cultivadas em meio 523, após 24 h de
incubação. (A) isolado S1 - Bacillus subtilis; (B) S2 – B. subtilis;
(C) 3918 – B. subtilis; (D) Ca - Pseudomonas fulva;
(E) CIIb - Stenotrophomonas maltophilia; (F) R1 - Frateuria
aurantia; (G) FL2 – P. aeruginosa; (H) MF2 - Pseudomonas sp. e
(I) MF4 - Pseudomonas sp.
21
B
C
F
E
I
H
A
D
G
B
C
F
E
I
H
A
D
GG
Figura 3. Colônias de rizobactérias cultivadas em meio 523, após 24 h de
incubação. (A) isolado S1 - Bacillus subtilis; (B) S2 – B. subtilis;
(C) 3918 – B. subtilis; (D) Ca - Pseudomonas fulva;
(E) CIIb - Stenotrophomonas maltophilia; (F) R1 - Frateuria
aurantia; (G) FL2 – P. aeruginosa; (H) MF2 - Pseudomonas sp. e
(I) MF4 - Pseudomonas sp.
22
Tabela 1. Caracterização morfológica dos isolados de rizobactérias, determinada após 24 h de incubação, em meio 523, YMA
e ágar nutritivo-glicose, em estado sólido.
Elevação Forma Estrutura Bordas Coloração Brilho Crescimento Tamanho Consistência Superfície
Meio 523 Convexa baixa Circular Amorfa Inteiros Creme Brilhante Muito rápido >3 mm Mucosa Rugosa
YMA Chata Circular Amorfa Lobados Branca Opaco Muito rápido >3 mm Seca Rugosa
Ágar Nutritivo Espraiada Circular Amorfa Inteiros Creme claro Opaco Muito rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Convexa baixa Circular Amorfa Inteiros Creme claro Brilhante Muito rápido >3 mm Fluida Lisa
YMA Chata Irregular Amorfa Denticulados Creme Opaco Muito rápido >3 mm Seca Rugosa
Ágar Nutritivo Espraiada Irregular Amorfa Denticulados Creme Opaco Muito rápido 1-2 mm Mucosa Rugosa
Meio 523 Umbilicada Circular Amorfa Inteiros Branco gelo Brilhante Muito rápido >3 mm Fluida Rugosa
YMA Chata Irregular Amorfa Ondulados Branca Opaco Muito rápido >3 mm Seca Rugosa
Ágar Nutritivo Chata Irregular Amorfa Ondulados Creme claro Opaco Muito rápido 2-3 mm Seca Rugosa
Meio 523 Umbilicada Circular Filamentosa Ondulados Creme esverdeado Brilhante Muito rápido >3 mm Mucosa Lisa
YMA Chata Irregular Filamentosa Inteiros Creme amarelado Brilhante Muito rápido >3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Convexa baixa Irregular Filamentosa Inteiros Creme claro Brilhante Muito rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Convexa media Circular Amorfa Inteiros Branca Brilhante Muito rápido <1 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa alta Circular Granulosa Inteiros Branca Brilhante Muito rápido <1 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Convexa alta Circular Amorfa Inteiros Creme claro Brilhante Muito rápido <1 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Chata Circular Filamentosa Denticulados Creme Brilhante Rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
YMA Chata Circular Filamentosa Inteiros Creme claro Brilhante Rápido >1 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Chata Circular Filamentosa Inteiros Creme claro Brilhante Rápido >1 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Chata Circular Amorfa Inteiros Verde fluorescente Translúcido Muito rápido >3 mm Mucosa Lisa
YMA Chata Circular Granulosa Inteiros Amarelo alaranjado Translúcido Muito rápido 2-3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Chata Circular Granulosa Inteiros Amarelo alaranjado Translúcido Muito rápido >3 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Convexa baixa Circular Granulosa Inteiros Amarelo esverdeado Brilhante Muito rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
YMA Centro saliente Circular Granulosa Inteiros Creme Brilhante Muito rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Umbilicada Circular Granulosa Inteiros Creme escuro Brilhante Muito rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Umbilicada Circular Granulosa Inteiros Creme amarelado Brilhante Muito rápido 2-3 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa média Circular Filamentosa Inteiros Creme amarelado Brilhante Muito rápido 2-3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Centro saliente Circular Amorfa Inteiros Creme amarelado Brilhante Muito rápido 1-2 mm Mucosa Lisa
R1
(Frateuria aurantia )
Fl2
(Pseudomonas
aeruginosa)
MF2
(Pseudomonas sp.)
MF4
(Pseudomonas sp.)
S2
(Bacillus subtilis)
3918
(Bacillus subtilis)
Ca
(Pseudomonas fulva)
CIIb
(Sterotrophomonas
maltophilia)
Isolado Meio de cultivo
Características morfógicas
S1
(Bacillus subtilis )
23
Tabela 2. Caracterização morfológica de isolados de rizobactérias, determinada após 48 h de incubação, em meio 523, YMA
e ágar nutritivo-glicose, em estado sólido.
Elevação Forma Estrutura Bordas Coloração Brilho ACM Tamanho Consistência Superfície
Meio 523 Chata Circular Amorfa Inteiros Creme Opaco Negativo >3 mm Seca Pregueada
YMA Chata Circular Amorfa Denticulados Branca Opaco Negativo >3 mm Seca Pregueada
Ágar Nutritivo Chata Circular Amorfa Denticulados Creme claro Opaco Negativo >3 mm Mucosa Pregueada
Meio 523 Chata Circular Amorfa Inteiros Creme claro Brilhante Negativo >3 mm Fluida Pregueada
YMA Chata Irregular Amorfa Denticulados Creme Opaco Negativo >3 mm Seca Pregueada
Ágar Nutritivo Chata Irregular Amorfa Denticulados Creme Brilhante Negativo >3 mm Mucosa Pregueada
Meio 523 Chata Circular Amorfa Denticulados Branco gelo Opaco Negativo >3 mm Seca Pregueada
YMA Chata Irregular Amorfa Ondulados Branca Opaco Negativo >3 mm Seca Pregueada
Ágar Nutritivo Chata Irregular Amorfa Ondulados Creme claro Opaco Negativo >3 mm Seca Pregueada
Meio 523 Centro saliente Circular Amorfa Inteiros Creme esverdeado Brilhante Amarelo >3 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa baixa Irregular Filamentosa Inteiros Creme amarelado Brilhante Negativo >3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Convexa baixa Circular Amorfa Inteiros Creme claro Brilhante Negativo >3 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Convexa alta Circular Amorfa Inteiros Branca Brilhante Negativo <1 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa média Circular Amorfa Inteiros Branca Brilhante Negativo <1 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Convexa alta Circular Amorfa Inteiros Creme claro Brilhante Negativo <1 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Espraiada Circular Granulosa Denticulados Creme Brilhante Negativo 1-2 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa baixa Circular Filamentosa Inteiros Creme claro Brilhante Negativo 1-2 mm Seca Lisa
Ágar Nutritivo Chata Circular Filamentosa Inteiros Creme claro Brilhante Negativo <1 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Chata Circular Amorfa Inteiros Amarelo fluorescente Translúcido Amarelo >3 mm Mucosa Lisa
YMA Chata Circular Amorfa Inteiros Amarelo alaranjado Translúcido Negativo >3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Chata Circular Amorfa Inteiros Amarelo alaranjado Translúcido Negativo >3 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Centro saliente Circular Amorfa Inteiros Amarelo esverdeado Brilhante Negativo 2-3 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa média Circular Amorfa Inteiros Creme Brilhante Negativo 2-3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Convexa baixa Circular Amorfa Inteiros Creme escuro Brilhante Negativo >3 mm Mucosa Lisa
Meio 523 Convexa baixa Circular Amorfa Inteiros Creme amarelado Brilhante Negativo 2-3 mm Mucosa Lisa
YMA Convexa média Circular Amorfa Inteiros Creme amarelado Brilhante Negativo >3 mm Mucosa Lisa
Ágar Nutritivo Centro saliente Circular Amorfa Inteiros Creme amarelado Brilhante Negativo 2-3 mm Mucosa Lisa
R1
(Frateuria aurantia )
Fl2
(Pseudomonas
aeruginosa)
MF2
(Pseudomonas sp.)
MF4
(Pseudomonas sp.)
S2
(Bacillus subtilis )
3918
(Bacillus subtilis )
Ca
(Pseudomonas fulva)
CIIb
(Sterotrophomonas
maltophilia)
Isolado Meio de cultivo
Características morfógicas
S1
(Bacillus subtilis)
24
3.2. Sensibilidade dos isolados de rizobactérias a antibióticos
O pefloxacin foi o único dos antibióticos testados que inibiu todos os
isolados de rizobactérias. Em contrapartida, os isolados testados foram
insensíveis à penicilina, exceto o R1 que apresentou halo de inibição. Este
isolado foi insensível apenas aos antibióticos oxacilina, aztreonam e
rifampicina.
O isolado FL2 foi o único isolado insensível a amicacina,
amonicilina+ác. clavulanico, cefepime, cefotaxima e norfloxacin e o menos
sensível, sendo que os antibióticos pefloxacin, ácido pipemidico,
estreptomicina, tetraciclina e sulfonamida inibiram o crescimento do
isolado.
Sulfazotrim, clindamicina e vancomicina inibiram os isolados S1,
S2, 3918, R1 e CIIb, sendo os demais isolados insensíveis. O antibiótico
oxacilina inibiu somente o crescimento dos isolados de B. subtilis (S1, S2 e
3918). O isolado S2 demonstrou-se mais sensível aos antibióticos testados,
com exceção dos antibióticos penicilina e cefalexina, que não inibiram o seu
crescimento.
Os antibióticos rifampicina, tobramicina e tetraciclina inibiu somente
o isolado S2, diferenciando-o dos isolados S1 e 3918. Aztreonam, cefalotina
e ceftazidima inibiram o crescimento dos isolados S2 e 3918, em
contrapartida eritromicina, nitrofurantoína, ampicilina, cloranfenicol,
amoxicilina e ácido pipemidico inibiram o crescimento dos isolados S1 e
S2.
Treze antibióticos testados inibiram o crescimento dos isolados MF2
e MF4. Os antibióticos nitrofurantoína, amoxicilina e neomicina inibiram
somente o isolado MF2. Os antibióticos ácido pipemidico, ticarcilina +
ácido clavulanico, tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina inibiram o
crescimento do isolado MF4 sem afetar a multiplicação do isolado MF2.
Para os antibióticos vancomicina, tobramicina, cefalexina,
amoxicilina, neomicina e tetraciclina observou-se a presença de halo duplo
de inibição, o que sugere o crescimento de células com maior tolerância ao
principio ativo destes antibióticos, nos isolados S1, S2, 3918 e MF2
(Tabela 3).
25
Tabela 3. Sensibilidade dos isolados de rizobactérias em relação aos
antibióticos testados.
Nome
comercial
Código Concentração S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
Pefloxacin PEF 5mcg
+++++++++
Penicilina G PEN 10U
-----+---
Amicacina AMI 30μg
++++++-++
Amonicilina +
Ác.Clavulanico
AMC 30mcg
++++++-++
Cefepime COM 30μg
++++++-++
Cefotaxima CTX 30mcg
++++++-++
Norfloxacin NOR 10μg
++++++-++
Sulfazotrim SUT 25μg
+++-++- - -
Clindamicina CLI 2μg
+++-++- - -
Vancomicina VAN 30mcg
+ + +-++---
Oxacilina OXA 1μg
+++------
Rifampicina RIF 5μg
-+--+--++
Tobramicina TOB 10μg
- + -+-+-++
Aztreonam ATM 30μg
-++----++
Cefalotina CFL 30μg
-++--+---
Ceftazidima CAZ 30μg
-+++++-++
Cefalexina CFX 30mcg
+-+ +-+---
Ampicilina AMP 10μg
++-+++- - -
Cloranfenicol CLO 30μg
++-+++- - -
Eritromicina ERI 15μg
++---+---
Nitrofurantoína NIT 300μg
++---+-+-
Amoxicilina AMO 10μg
++-+++-+ -
Ácido
pipemidico
PIP 20mcg
++-++++-+
Estreptomicina EST 10mcg
++++-++-+
Neomicina NEO 30mcg
++++-+-+-
Tetraciclina TET 30μg
- + -++++-+
Ticarcilina +
Ác.Clavulanico
TIC 85mcg
++++++- -+
Sulfonamida SUL 300μg
+++++++-+
Isolado de rizobactériaAntibiótico
Ausência de halo de inibição ( - );
Presença de halo de inibição ( + );
Sinais positivos de cor vermelha indicam a presença de duplo halo de inibição.
26
3.3. Caracterização molecular
A amplificação por PCR da região 16S do rDNA de rizobactérias,
gerou fragmentos de aproximadamente 1,6 kb para todos os isolados (Figura
4). A análise de restrição destes fragmentos, utilizando-se nove enzimas,
diferenciou o grupo dos isolados de Bacillus (3918, S1 e S2) e o grupo das
Pseudomonas (MF2, MF4 e Ca) dos demais isolados de rizobactérias
(Figura 5). Entretanto, a análise não diferenciou entre si os isolados dos
grupos formados. Os demais isolados foram diferenciados entre si por pelo
menos uma enzima.
Entre os isolados testados, CIIb mostrou-se o mais divergente, sendo
que seis das nove enzimas de restrição utilizadas resulta em perfis de
restrição que separa dos demais isolados. O isolado FL2 pôde ser
diferenciado dos demais, pelas enzimas Sau3AI, MspI, BamHI, DdeI e TaqI
(Figuras 5C, E, G e I, respectivamente).
As enzimas Sau3AI e MspI permitiu a separação o maior número de
isolados (Figura 5C, E, respectivamente). Os grupos formados por estas
enzimas foram o dos isolados S1, S2 e 3918 clivado em várias regiões para
ambas as enzimas. Outro grupo diferenciado é composto pelos isolados
MF2, MF4 e Ca com a enzima Sau3AI obteve fragmento de 900 bp e na
clivagem com a enzima MspI apresentou dois fragmentos de
aproximadamente 600 e 500 bp. Os isolados CIIb, R1 e FL2 foram
diferenciado em ambas as enzimas.
A enzima de restrição EcoRI separou os isolados em três grupos.
Os isolados S1, S2, 3918 e R1 com fragmentos de aproximadamente 900 e
700 bp, diferindo do isolado CIIb que obteve fragmentos de 900 e 600 bp e
dos isolados Ca, FL2, MF2 e MF4 na qual a região amplificada não foi
clivada pela enzima (Figura 5A). Os mesmos grupos foram também
separados através da clivagem dos fragmentos com a enzima SphI (Figura
5D). Já os isolados R1 e CIIb foram agrupados pela enzima RsaI, com três
fragmentos próximos de 350 a 550 bp e dois fragmentos com 500 e 850 bp,
respectivamente (Figura 5B).
A clivagem dos fragmentos dos isolados FL2 e R1 com a enzima
TaqI foi diferente dos demais isolados. A TaqI também diferenciou dois
27
grupos, um os isolados S1, S2 e 3918 e o outro grupo formado pelos isolado
Ca, CIIb, MF2 e MF4 (Figura 5I).
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
1.636 pb
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
1.636 pb
1.636 pb
Figura 4. Fragmentos de DNA amplificados por meio de PCR, utilizando
oligonucleotídeos P1 e P2. (M) – 1 Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen); (S1) - Bacillus subtilis; (S2) – B. subtilis; (3918) –
B. subtilis; (Ca) - Pseudomonas fulva; (CIIb) - Stenotrophomonas
maltophilia; (R1) - Frateuria aurantia; (FL2) – P. aeruginosa;
(MF2) - Pseudomonas sp. e (MF4) - Pseudomonas sp.
28
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
A
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
B
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
C
M’ S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
D
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
E
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
F
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
G
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
I
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
H
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
12,216
3,054
2,036
1,636
1,018
506
396
bp
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
A
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
A
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
B
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
B
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
C
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
C
M’ S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
D
M’ S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M’ S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
D
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
E
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
E
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
F
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
F
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
G
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
G
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
I
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
I
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
H
M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4M S1 S2 3918 Ca CIIb R1 FL2 MF2 MF4
H
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
12,216
3,054
2,036
1,636
1,018
506
396
bp
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
12,216
3,054
2,036
1,636
1,018
506
396
12,216
3,054
2,036
1,636
1,018
506
396
12,216
3,054
2,036
1,636
1,018
506
396
bp
Figura 5. Perfil de restrição do fragmento amplificado da região 16S do
rDNA de nove isolados de rizobactérias. (A) - clivagem dos
fragmentos com a enzima de restrição EcoRI; (B) clivagem com
a enzima de restrição RsaI; (C) clivagem com a enzima de
restrição Sau3AI; (D) clivagem com a enzima de restrição SphI;
(E) clivagem com a enzima de restrição MspI; (F) clivagem com
a enzima de restrição BamHI; (G) clivagem com a enzima de
restrição DdeI; (H) clivagem com a enzima de restrição HinfI; (I)
clivagem com a enzima de restrição TaqI; (M) – 1 Kb Plus DNA
Ladder (Invitrogen); (M’) – 1 Kb Ladder (Invitrogen);
29
4. DISCUSSÃO
Nove isolados de rizobactérias promotoras de enraizamento de
miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto, foram avaliados quanto às
características morfológicas, molecular e a sensibilidade a antibióticos
visando à diferenciação entre os isolados e a detecção de contaminantes no
processo de produção do inoculante. A caracterização dos isolados é
fundamental para o processo de produção destes microrganismos em larga
escala, auxiliando no controle de qualidade do produto Rizolyptus
®
,
garantindo o efeito benéfico da rizobacterização na propagação clonal do
eucalipto verificado em experimentos anteriormente realizados.
Todos os isolados foram diferenciados por suas características
morfológicas e pela sensibilidade a diferentes antibióticos. As características
morfológicas dos isolados variam em relação ao meio de cultura utilizado e
ao tempo de incubação, o crescimento dos isolados variam de acordo com o
antibiótico e o isolado de rizobactéria testado e em alguns casos, a presença
do antibiótico resulta em multiplicação de células resistentes, observado
pela formação do halo duplo de inibição.
Os antibióticos são usados para várias finalidades e são amplamente
empregados na cultura de tecidos com objetivo de evitar contaminações
microbianas dos meios de cultura e têm sido recomendados para a
erradicação de fitobactérias de sementes (21). Além disso, antibióticos são
utilizados em meio seletivo e permite a contagem das unidades formadoras
de colônias. A título de exemplo, um mutante P7
rif
, de Pseudomonas
fluorescens, foi selecionado em ágar nutriente acrescido de rifampicina (100
µg/mL) de acordo com características morfológicas da colônia, pigmentação
30
e antagonismo a patógenos similares aos tipos selvagens de rizobactérias.
Após a escolha do mutante, foi monitorada a dinâmica populacional em
plantas de ervilhas no campo e observada a estabilidade ao longo do tempo
da concentração de bactérias e o alto nível populacional, resultante
principalmente da eficiente colonização das raízes (32).
A adição de antibiótico ao meio de cultura utilizado na produção do
inoculante é uma alternativa que reduz os riscos de contaminação ou troca
de isolados, sendo que para o isolado MF2 a utilização do antibiótico
sulfonamida (300μg), inibi o crescimento dos demais isolados. Da mesma
maneira o uso de um dos antibióticos amicacina (30μg), amonicilina+ác.
clavulanico (30mcg), cefepime (30μg), cefotaxima (30mcg) ou norfloxacin
(10μg) não altera o crescimento do isolado FL2. Os antibióticos testados
podem ainda serem utilizados para diferenciar os isolados de Bacillus e de
Pseudomonas, confirmando através das características morfológicas a
identidade de cada isolado.
As características morfológicas dos isolados determinada em três
meios de cultura, além de diferenciarem todos os isolados é uma ferramenta
adicional para a detecção de microrganismos contaminantes. Entretanto, as
características morfológicas e a resistência a antibióticos são técnicas que
mesmo sendo essenciais em um programa de qualidade, por caracterizarem
rapidamente os isolados e possuírem baixo custo, apresentam resultados
subjetivos, como coloração das colônias, forma de bordas e diferentes
respostas a inibição em relação às concentrações dos antibióticos. Desta
forma, as técnicas moleculares que são mais sensíveis e podem detectar
diferenças no genoma devem ser utilizadas como técnica complementar no
controle de qualidade.
Técnicas moleculares têm sido amplamente empregadas nos estudos
de taxonomia e diversidade de bactérias (1, 4, 6, 10, 12, 19, 22, 24-26, 31).
A análise de PCR, que permite a amplificação de seqüências definidas da
molécula do DNA, associada ao método do RFLP, em geral, com
amplificações de regiões de genes cromossômicos conservados, mas com
variabilidade suficiente para detectar diferenças entre gêneros e espécies,
como o 16S rRNA, o 23S rRNA e o espaço intergênico (ITS) entre estas
duas regiões, vem se destacando como um método que permite diferenciar
31
indivíduos, inclusive, de espécies geneticamente relacionadas (8). Para a
caracterização molecular dos isolados de rizobactérias, optou-se pela técnica
denominada PCR-RFLP por ser um método sensível e confiável,
amplamente utilizado, altamente reproduzível e relativamente de fácil
execução.
Os resultados obtidos na análise molecular foram similares aos de
outros autores que diferenciaram microrganismos pela técnica PCR-RFLP
(4, 6, 10, 22, 25). A clivagem das seqüências parciais da região 16S do
DNA ribossomal permitiu diferenciar os grupos de Bacillus (S1, S2 e 3918),
de Pseudomonas (MF2, MF4 e Ca) dos isolados CIIb, R1 e FL2. Nenhum
dos perfis de restrição observado diferenciou entre si os isolados S1, S2 e
3918, todos da espécie B. subtilis, e os isolados MF2, MF4 e Ca do gênero
Pseudomonas, provavelmente devido a região 16S do DNA ribossomal
destas espécies ser altamente conservada, não sendo detectada diferenças
neste fragmento quando digerida pelas nove enzimas de restrição utilizadas.
Tassa e Duarte (26), também não obtiveram sucesso, na separação das
subespécies, Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis,
P. carotovorum subsp. carotovorum e outras pectobactérias disponíveis no
GenBank, devido à baixa especificidade apresentada pelo gene recA
amplificado e digerido por enzimas. No entanto, a clivagem com HhaI e
TasI permitiu a separação de 13 grupos distintos e somente a discriminação
de P. carotovorum subsp. brasiliensis destes grupos.
Para separação entre os isolados de B. subtilis e de Pseudomonas
pode-se utilizar a mesma técnica molecular, entretanto amplificando as
regiões espaçadoras (ITS) entre genes rDNA. Como as mutações dentro das
regiões espaçadoras ocorrem com maior freqüência que com os genes
ribossomais, estas regiões são de grande utilidade para a separação entre
espécies (6, 12, 27). Um exemplo é a diferenciação de Xanthomonas
axonopodis pv. citri Tipo A de X. axonopodis pv. aurantifolii Tipos B e C e
de X. axonopodis pv. citrumela Tipo E, agentes causais de várias doenças
em citrus, por meio da amplificação da região ITS entre 16S e 23S e
posterior clivagem com enzimas de restrição DdeI, AluI e Sau3AI (4).
Os isolados Ca e FL2, apesar de serem do mesmo gênero,
Pseudomonas, possuem características morfológicas distintas,
32
principalmente, em relação a brilho e elevação das colônias e também
podem ser facilmente diferenciadas pela análise molecular que demonstrou
após a clivagem com as enzimas de restrição Sau3AI, MspI, DdeI, BamHI e
TaqI diferentes perfis de restrição para a região amplificada do genoma.
Estas bactérias pertencem a espécies diferentes de Pseudomonas o que
facilita na separação de forma análoga as espécies, Stenotrophomonas
maltophilia e Frateuria aurantia, isolados CIIb e R1, respectivamente.
De maneira geral, as técnicas moleculares são mais sensíveis às
diferenças dos isolados e os resultados são mais confiáveis por expressarem
pequenas diferenças no genoma do indivíduo, e por isso, trazem maior
segurança ao resultado, ao contrário das características morfológicas e da
sensibilidade a antibióticos que podem resultar em respostas subjetivas.
Entretanto, em um processo de produção de microrganismos em larga escala
o conhecimento de várias técnicas que se complementem é importante pré-
requisito para o desenvolvimento de um programa de qualidade, sendo
assim, a utilização dos resultados apresentados neste trabalho, ferramentas
indispensáveis para que se possa garantir a pureza e a autenticação do
isolado no produto comercializado.
33
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Carlotti, A.; Funke, G. (1994). Rapid distinction of Brevibacterium
species by restriction analysis of rDNA generated by polymerase chain
reaction. Systematic and Applied Microbiology, 17, 380-386.
2. Chanway, C.P., Turkington, R.; Holl, F.B. (1991). Ecological
implications of specificity between plants and rhizosphere
microorganisms. Advances in Ecological Research, 21, 121-169.
3. Davison, J. (1988). Plant beneficial bacteria. BioTechniques, 6, 282-
286.
4. Destéfano, S.A.L.; Rodrigues Neto, J. (2002). Rapid differentiation of
Xanthomonas strains causing disease in citrus plants by PCR-RFLP of
the 16S-23S rDNA spacer region. Summa Phytopathologica, 28, 167-
172.
5. Dobbelaere, S., Vanderleyden, J.; Yaacov, O. (2003). Plant growth-
promoting effects of diazotrophs in the rhizosphere. Critical Reviews
in Plant Sciences, 22, 107-149.
6. Edel, V., Steinberg, C., Gautheron, N.; Alabouvette, C. (1996).
Evaluation of restriction analysis of polymerase chain reaction (PCR) -
amplified ribosomal DNA for the identification of Fusarium species.
Mycological Research, 101, 179-187.
7. Errampalli, D., Leung, K., Cassidy, M.B., Kostrzynska, M., Blears,
M., Lee, H.; Trevors, J.T. (1999). Application of the green fluorescent
protein as a molecular marker in environmental microorganisms.
Journal of Microbiological Methods, 35, 187-199.
34
8. Fernandes, M.F., Fernandes, R.P.M.; Hungria, M. (2003).
Caracterização genética de rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros
eficientes em culturas do guandu e caupi. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, 38, 911-920.
9. Geiser, D.M., Arnold, M.L.; Timberlake, W.E. (1994). Sexual origins
of British Aspergillus nidulans isolates. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 91, 2349-2352.
10. Gibotti, A., Tanaka, T.L., Oliveira, V.R., Taddei, C.R.; Martinez, M.B.
(2004). Molecular characterization of enteroinvasive Escherichia coli
ipa genes by PCR-RFLP analysis. Brazilian Journal of Microbiology,
35, 74-80.
11. Graves, L.M.; Swaminathan, M. (1993). IN Diagnostic molecular
microbiology: principles and application (Persing, D. H., Smith, T. F.,
Tenover, F. C.; White, B. E., Eds.), pp. 325-328, American Society for
Microbiology, Washington.
12. Iwen, P.C., Hinrichs, S.H.; Rupp, M.E. (2002). Utilization of the
internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and
identify human fungal pathogens. Med Myc, 40, 87-109.
13. Kado, E.I.; Heskett, M.G. (1970). Selective media for isolation of
Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and
Xanthomonas. Phytopathology, 60, 969-976.
14. Kloepper, J.W., Lifshitz, R.; Zablotowicz, R.M. (1989). Free-living
bacterial inocula for enhancing crop productivity. Trends
Biotechnology, 7, 39-43.
15. Kloepper, J.W.; Schroth, M.N. (1978) IN INTERNATIONAL
CONFERENCE ON PLANT PATHOGENIC BACTERIA (ANGERS,
Ed.), Vol. 4, pp. 879-882, Angers.
16. Ladeira, M.C.G. (2004) Controle biológico de Quambalaria eucalypti
mediado por rizobactérias. Departamento de Fitopatologia, pp. 45,
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.
17. Mafia, R.G. (2004) Rizobactérias como promotoras do enraizamento,
crescimento e como agentes de biocontrole de doenças na propagação
clonal do eucalipto. Departamento de Fitopatologia, pp. 118,
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.
35
18. Mariano, R.L.R. (2000). Manual de Práticas em Fitobacteriologia.
Editora Universitária, UFPE, Recife, PEp.
19. Radu, S., Ling, O.W., Rusul, G., Karim, M.I.A.; Nishibuchi, M.
(2001). Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiplex PCR and
their characterization by plasmid profiling, antimicrobial resistance,
RAPD and PFGE analyses. Journal of Microbiological Methods, 46,
131-139.
20. Reis Junior, F.B., Mendes, I.C., Teixeira, K.R.S.; Reis, V.M. (2002).
Uso de ferramentas moleculares em estudos da diversidade de
microrganismos do solo, Planaltina, DFp.
21. Romeiro, R.S. (2001). Métodos em Bacteriologia de Plantas. Editora
UFV, Viçosa, 279pp.
22. Ruiz, A., Poblet, M., Mas, A.; Guillamón, J.M. (2000). Identification
of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-
23S rDNA intergenic spacer. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 50, 1981-1987.
23. Sambrook, J., Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual., New York.
24. Shah, S.A.; Romick, T.L. (1997). Subspecies differentiation of
Salmonella by PCR-RFLP of the ribosomal operon using universal
primers. Letters in Applied Microbiology, 25, 54-57.
25. Sikora, S.; Redzepovic, S. (2003). Genotypic characterization of
indigenous soybean rhizobia by PCR-RFLP of 16S rDNA, rep-PCR
and RAPD analysis. Food Technology Biotechnology, 41, 61-67.
26. Tassa, S.O.M.; Duarte, V. (2006). Identificação de Pectobacterium
carotovorum subsp. brasiliensis através de PCR-RFLP do Gene recA.
Fitopatologia Brasileira, 31, 23-28.
27. Taylor, J.W., Geiser, D.M., Burt, A.; Koufopanou, V. (1999). The
evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain
typing. Clinical Microbiology Reviews, 12, 126-146.
28. Teixeira, D.A., Alfenas, A.C., Mafia, R.G., Ferreira, E.M., Siqueira,
L., Maffia, L.A.; Mounteer, A.H. (2007). Rhizobacterial promotion of
eucalypt rooting and growth. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 1-
6.
36
29. Vincent, R.D., Geowart, R., Goldman, W.E., Kobayashi, G.S.,
Lambowits, A.M.; Medoff, G. (1986). Classification of Histoplasma
capsulatum isolates by restriction fragments polymorphisms. Journal
Bacteriology, 165, 813-818.
30. Weinsburg, W.G., Barns, S.M.; Pelletier, D.A. (1991). 16S ribossomal
DNA amplification for phylogenetic study. Journal Bacteriology, 173,
697-703.
31. White, T.J., Bruns, T., Lee, S.; Taylor, J. (1990). Amplification and
direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.
New York, 315-322p.
32. Xi, K., Stephens, J.H.G.; Verma, P.R. (1996). Application of
formulated rhizobacteria against root rot of field pea. Plant Pathology,
45, 1150-1158.
37
ARTIGO 2
Eficiência de duas formulações de rizobactérias no
enraizamento de miniestacas e crescimento de mudas de
eucalipto
Talyta G. Zarpelon
1
; Luis A. Maffia
1
; Poliane Alfenas-Zerbini
1
; Eli S.
Lopes
2
; Acelino C. Alfenas
1
1
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas
Gerais, Brasil;
2
Bio Soja Indústrias Químicas e Biológicas
RESUMO
Avaliou-se a viabilidade de rizobactérias, nas formulações líquida e
turfosa, e seus efeitos sobre o enraizamento de miniestacas de eucalipto.
Para a definição do tempo de prateleira dos inoculantes, armazenados à
temperatura ambiente, monitorou-se a sobrevivência do inóculo durante 180
dias. Os isolados apresentaram concentração bacteriana em torno de 1x10
10
u.f.c./mL para a formulação líquida e de 3x10
9
u.f.c./mL para a formulação
turfosa. Comparou-se, em miniestacas de clones de Eucalyptus grandis x E.
urophylla (409) e E. grandis (11), a eficiência dessas formulações com o
tratamento na base das estacas com ácido indolbutírico (AIB) e em relação à
testemunha. A partir do 18° dia após o estaqueamento, avaliou-se o número
de miniestacas contendo raízes por baixo do tubete e aos 60 dias avaliou-se
a biomassa do sistema radicular e da parte aérea. O tratamento com AIB não
foi eficiente em aumentar a velocidade de enraizamento em relação à
testemunha e aos oito isolados testados. Obteve-se maior incremento de
38
enraizamento entre 21 a 27 dias após o estaqueamento para todos os
isolados. O isolado S2, de Bacillus subtilis, destacou-se dos demais
tratamentos para os dois clones nas duas formulações testadas, quando se
avaliou a biomassa da parte aérea e das raízes. A eficiência dos inoculantes
variou de acordo com o clone, tipo de formulação e isolado testado. Em
média, o clone de E. grandis respondeu melhor à rizobacterização que o de
E. grandis x E. urophylla. A formulação turfosa propiciou maiores
incrementos para velocidade de enraizamento, biomassa da parte aérea e do
sistema radicular.
Palavras-chave: Rizobactérias, Eucalyptus, formulação, turfa.
39
ABSTRACT
ZARPELON, Talyta Galafassi, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
March of 2007. Efficiency of two rhizobacteria formulations in
eucalyptus minicutting rooting and seedling growth. Adviser:
Acelino Couto Alfenas. Co-Adviser: Luiz Antônio Maffia and Poliane
Alfenas-Zerbini.
Rhizobacteria survival in liquid and turf formulations and their
effects on eucalyptus minicutting rooting was evaluated. The inoculant
survival was monitored for 180 days in order to define the inoculant shelf
life at room temperature. The isolates had bacterial concentration around
1x10
10
u.f.c./m for the liquid formulation and of 3x10
9
u.f.c. /mL for the turf
formulation, with adequate survival for inoculant use within this storage
period. Formulation efficiency was compared with the treatment of cuttings
with indolbutiric acid (IBA) and with the control (without both rhizobacteria
and IBA). Minicuttings of two clones of Eucalyptus grandis x E. urophylla
(409) and E. grandis (11) were planted after inoculant incorporation into the
rooting substrate. Beginning at the 18
th
day after cutting propagation and
every three days, 8 evaluations for the number of minicuttings with roots
underneath the tubes were carried out, and at the 60
th
day, the biomass of
root system and aerial part was evaluated. The IBA treatment was not
efficient in increasing rooting speed and rooting percentage compared with
the control and the eight isolates of the tested rhizobacteria. The isolates
MF2 of Pseudomonas sp., R1 of Frateuria aurantia, S1 of Bacillus subtilis,
3918 of Bacillus subtilis and FL2 of P. aeruginosa, in both formulations,
stood out for a larger rooting increase between 21 and 27 days after cutting
propagation and, in the following evaluation periods, the increase between
40
evaluations showed no significant differences. The isolate S2 of B. subtilis
stood out from the other treatments, for the two clones with the two tested
formulations, when evaluating the biomass of aerial part and roots. On
average, the turf formulation was more efficient in inducing eucalyptus
minicutting rooting and seedling growth. Inoculant efficiency varied with
clone, type of formulation and tested isolate. On average, clones of E.
grandis (11) gave better response to rhizobacterization than E. grandis x E.
urophylla (409). The turf formulation provided larger increases for the
variables rooting speed, biomass of aerial part and root system. The isolates
R1, FL2, S1 and S2 stood out as the most efficient in inducing minicutting
rooting and the isolate S2 in inducing seedling growth, expressed by the
increase in biomass of aerial part and root system.
Key words: Rhizobacteria, Eucalyptus, formulations, turf
41
1. INTRODUÇÃO
Bactérias que exercem efeito benéfico às plantas são denominadas de
“Plant Growth-Promoting Rhizobacteria – PGPR”, ou seja, rizobactérias
promotoras de crescimento de plantas (8, 13, 14), que inclui diferentes
espécies pertencentes a diversos gêneros, como: Bacillus, Pseudomonas,
Azotobacter, Arthrobacter, Clostridium, Hydroganophaga, Enterobacter,
Serratia e Azospirillum (2).
Além de serem utilizadas para promover o crescimento de plantas (6,
10, 22, 26, 28), alguns outros benefícios incluem o controle biológico de
doenças (1, 3, 19), aumento da produção (11, 17, 21, 22) e indução de
resistência a patógenos foliares (23, 29).
A partir de uma série de estudos iniciados no final da década de 90,
têm sido comprovados os efeitos benéficos das rizobactérias em promover o
enraizamento, o crescimento de mudas (20, 21, 27, 28) e o controle
biológico de doenças que afetam a propagação clonal do eucalipto (18, 27,
29). Dentre 107 isolados de bactérias, obtidos da rizosfera de mudas de
diferentes clones de Eucalyptus, que se destacaram quanto ao potencial de
enraizamento de miniestacas de eucalipto, oito foram identificados como
pertencentes às espécies de Bacillus subtilis (S1, S2 e 3918), Pseudomonas
fulva (Ca), Pseudomonas aeruginosa (FL2), Frateuria aurantia (R1) e
Pseudomonas sp. (MF2 e MF4), baseando-se nas seqüências parciais da
região 16S do DNA ribossomal (28).
Além de estimular o enraizamento (28), a aplicação de rizobactérias
no substrato de enraizamento propiciou uma maior uniformidade na altura
das mudas e uma melhor arquitetura do sistema radicular. Esses isolados
42
também exerceram efeito positivo sobre a produção de biomassa radicular,
produção de brotos para estaquia em minicepas de eucalipto estabelecidas
em leito de areia e produtividade de minijardins clonais (número de
miniestacas x porcentagem de enraizamento) (21).
Os isolados mais promissores foram testados em escala semi-
operacional, em diversos viveiros florestais e inoculados em diferentes
composições de substrato, obtendo incremento em biomassa radicular e da
parte aérea, maior velocidade de enraizamento e controle de doenças.
Nesses experimentos de rizobactérias com eucalipto (18, 20, 21, 27-29) e
com outras culturas (3, 9, 15, 17, 25) utilizaram-se suspensões bacterianas,
produzidas em meio de cultura. Entretanto, este tipo de inóculo é de difícil
produção em grande escala, apresentando dificuldades na manipulação, no
transporte, armazenamento e baixa viabilidade da suspensão bacteriana ao
longo do tempo.
Assim, tornou-se necessário o desenvolvimento de uma formulação
para veicular as rizobactérias e facilitar sua aplicação. Através de uma
parceria, entre a UFV e a Bio Soja Indústrias Químicas e Biológicas,
desenvolveram-se duas formulações, sólida e líquida, para veicular os
isolados de rizobactérias benéficas na produção de mudas clonais de
eucalipto, cujo produto passou a denominar-se Rizolyptus
®
. A fim de
viabilizar o emprego desse inoculante em ampla escala, o presente trabalho
foi realizado objetivando testar a viabilidade do inoculante armazenado
(“shelf life”) e seus efeitos sobre a rizogênese de miniestacas e o
crescimento de mudas de eucalipto.
43
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Formulações
Utilizou-se oito isolados de rizobactérias em duas formulações, líquida
e turfosa, preparadas pela Bio Soja Indústrias Químicas e Biológicas (São
Joaquim da Barra - SP). Os isolados denominados de S1, S2 e 3918
pertencem a espécie Bacillus subtilis Cobn, 1872, o isolado Ca foi
determinado como da espécie Pseudomonas fulva Lizuga & Komagata,
1963, o isolado FL2 de Pseudomonas aeruginosa (Schroeter, 1872) Migula,
1900, o isolado CIIb é da espécie Stenotrophomonas maltophilia (Hugh,
1872) Palleroni & Bradbury, 1993, o isolado R1 de Frateuria aurantia
Swings et al., 1980 e os isolados MF2 e MF4 foram identificados como
Pseudomonas sp. Migula, 1894 (28).
2.2. Viabilidade dos isolados de rizobactérias nas formulações líquida e
turfosa
Avaliou-se pela técnica de micro-gotas (24), a concentração de
células bacterianas dos isolados de rizobactérias formulados pela Bio Soja
Indústrias Químicas e Biológicas e armazenados em embalagem apropriada
à temperatura ambiente a cada 20 dias, durante 180 dias. A partir de 1 g da
formulação turfosa ou 1 mL do formulação líquida, de cada isolado,
adicionados em 9 mL de solução salina (NaCl 0,85%), seguiu-se a diluição
(10
–1
a 10
–8
) da amostra. Alíquotas de 10 μL de cada diluição foram
semeadas em placas de Petri, contendo meio 523 (12) e em seguida, foram
incubadas a 28°C, no escuro, durante 12 a 24 h dependendo do isolado, até o
44
aparecimento das colônias. Para cada diluição foram realizadas cinco
réplicas.
2.3. Eficiência do produto Rizolyptus
®
sobre o enraizamento de
miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto
Os inoculantes, nas formulações turfosa e líquida, foram aplicados
diretamente e aos poucos na mistura do substrato de enraizamento,
previamente homogeneizado, na proporção de 1 g (formulação turfosa) ou
1 mL (formulação líquida) por 50 mL de substrato. Este era composto de
substrato agrícola Mec Plant
®
, vermiculita expandida fina, palha de arroz
carbonizada, na proporção de 2:4:4, enriquecido com 21 g de FTE
(micronutrientes em fritas), 500 g de superfosfato simples, 21 g de sulfato
de amônio e 40 g de cloreto de potássio por m
3
. O substrato sem a adição de
inoculante foi utilizado como testemunha. Miniestacas tratadas na base com
ácido indolbutírico (AIB) a 6000 ppm, veiculado em talco, serviu como
comparador. Os inoculantes foram testados em dois clones de eucalipto: 409
(híbrido de E. grandis x E. urophylla) e 11 (E. grandis) e as repetições em
cada bandeja foram identificadas por clone e tratamento. Após o
estaqueamento, as miniestacas foram mantidas em casa de enraizamento
com cobertura plástica translúcida, nebulização intermitente e temperatura
em torno de 30°C, por 36 dias. Após este período, as mudas foram
transferidas para a aclimatação a sombra, onde receberam duas adubações,
sendo a primeira aos 47 dias com solução nutritiva (5 mL/tubete), composta
por macronutrientes (0,5 kg de MAP (monoamônio fosfato), 0,7 kg de
cloreto de potássio, 1,5 kg de cloreto de cálcio, 1,0 kg de sulfato de
magnésio por litro) e micronutrientes (50 g de ferrilene, 1,5 g de sulfato de
manganês, 3 g de ácido bórico, 0,25 g de sulfato de zinco, 0,20 g de sulfato
de cobre e 0,04 g de molibidato de sódio por litro de solução) e a segunda
realizada aos 53 dias com solução de Ouro Verde
®
à base de
NPK (15:15:20) (5 mL/tubete).
A velocidade de enraizamento (emissão de raízes no fundo do
tubete) foi determinada a cada três dias, do 18º ao 39º dia após o
estaqueamento e o incremento calculado pela diferença entre o número de
45
tubete com raiz exposta de cada avaliações dividida pelo intervalo de tempo
entre elas (3 dias). Aos 60 dias avaliou-se biomassa do sistema radicular e
da parte aérea.
Para atestar a qualidade do inoculante e determinar concentração de
bactérias por mL ou g utilizado no experimento, foi realizado a técnica de
micro-gotas (24), para as duas formulações (item 2.2.) (Tabela 1).
Tabela 1. Número de unidades formadoras de colônias (u.f.c./mL ou g)
dos isolados de rizobactérias veiculados nas formulações
turfosa e líquida do lote de inoculante utilizado no
experimento
Líquida Turfosa
3918
Bacillus subtilis 4,6x10
7
5,0x10
8
S1
Bacillus subtilis 3,2x10
8
3,8x10
8
S2
Bacillus subtilis 3,8x10
9
6,4x10
8
R1
Frateuria aurantia 6,6x10
5
1,1x10
7
Ca
Pseudomonas fulva 7,0x10
9
5,2x10
9
FL2
Pseudomonas aeruginosa 2,8x10
9
1,5x10
10
MF2
Pseudomonas sp. 8,0x10
9
3,4x10
9
MF4
Pseudomonas sp.
7,2x10
9
2,3x10
9
Média
3,2x10
9
3,4x10
9
Espécie
Concentração (u.f.c./mL ou g)
FormulaçãoIsolado
2.4. Delineamento experimental e análises estatísticas
No ensaio de viveiro, para a avaliação da eficiência dos inoculantes,
adotou-se delineamento de blocos ao acaso, no esquema de parcelas
subdivididas. A parcela foi constituída por formulação e a subparcela foi
composta de 10 tratamentos, sendo oito isolados de rizobactérias, um
tratamento com a aplicação do hormônio ácido indolbutírico (AIB) e uma
testemunha sem inoculação. Empregaram-se 8 blocos, sendo o conjunto de
15 plantas considerada uma unidade experimental. Entre cada subparcela foi
deixada uma fileira de orifícios sem tubetes, para minimizar o risco de
contaminações pelas gotas d´água durante a irrigação, ou por escorrimento
46
lateral de água na superfície da bandeja. Os blocos foram dispostos ao longo
da casa de enraizamento e separados por clone e formulação. Utilizaram-se
dois clones (409 e 11) e duas formulações (turfa e solução estabilizante).
Os dados foram analisados com o auxílio do pacote estatístico SAS
V.8 (SAS Institute, Cary, NC, USA).
Efetuou-se análise de regressão linear dos valores de incremento de
velocidade de enraizamento obtidos nas oito avaliações realizadas. Os dados
ajustaram-se ao modelo monomolecular, em vista da independência de
resíduos e pela correlação de Pearson, obtendo os valores de taxa de
enraizamento (r
v
). Para testar a hipótese de semelhança entre as taxas de
enraizamento, determinada pelo incremento a cada três dias, calculou-se o
intervalo de confiança (5) em relação à testemunha e ao hormônio AIB.
Para os valores de biomassa da parte aérea e do sistema radicular,
realizou-se o teste de Shapiro-Wilk, para a verificação da normalidade, e
posteriormente os dados foram submetidos à análise de variância, segundo o
esquema de parcelas subdivididas e empregando-se o teste Tukey a 5% para
comparação dos tratamentos. Os dados de peso seco da raiz (PSR), para os
dois clones e as duas formulações foram transformados para 1/(PSR).
47
3. RESULTADOS
3.1. Viabilidade dos isolados de rizobactérias nas formulações líquida e
turfosa
Na solução estabilizante observou-se maior viabilidade dos isolados,
em média com 1x10
10
u.f.c./mL, comparado aos isolados veiculados em
turfa, com 6,5x10
9
u.f.c./g no período de 180 dias. Os isolados S1, S2 e
MF2 foram mais estáveis ao longo do tempo nas duas formulações.
A viabilidade dos isolados S2, FL2 e Ca, veiculados em turfa
canadense e em solução estabilizante, foi a mesma para ambas as
formulações, durante o período de armazenamento. O FL2 destacou-se para
as duas formulações dos demais isolados com concentração média de
3x10
10
u.f.c./mL. A maior sobrevivência na formulação turfosa foi
observada para o isolado MF2, com concentração bacteriana média de
1x10
10
u.f.c./mL, e na formulação líquida destacaram-se os isolados S1,
3918, FL2 e MF4 contendo em torno de 1,5x10
10
u.f.c./mL ao longo do
tempo.
Os isolados S1, 3918, MF2 e MF4, veiculados na formulação
líquida, possuíram elevada população bacteriana na primeira avaliação e
após 20 dias de armazenamento a concentração foi reduzida.
48
Isolado S2
6
8
10
12
Isolado R1
6
8
10
12
Isolado FL2
6
8
10
12
Isolado MF2
6
8
10
12
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Isolado MF4
6
8
10
12
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Isolado Ca
6
8
10
12
Isolado S1
6
8
10
12
Isolado 3918
6
8
10
12
Concentração (log u.f.c./mL ou g)
Tempo de armazenamento (dias)
Figura 1. Viabilidade dos isolados S1, S2, 3918, R1, Ca, FL2, MF2 e MF4
veiculados nas formulações líquida (*) e turfosa (○),
armazenados em temperatura ambiente por 180 dias.
49
3.2. Eficiência das formulações turfosa e líquida sobre o enraizamento
de miniestacas e crescimento de mudas de eucalipto
A eficiência dos isolados variaram de acordo com o tipo de
formulação, clone utilizado e variável analisada.
Maior emissão de raízes (%) das miniestacas estaqueadas em
substrato rizobacterizado foi observada para os dois clones.
Os isolados na formulação turfosa propiciaram maior emissão de
raízes do clone 409, comparado á formulação líquida em relação a
testemunha. Observou-se que todos os isolados veiculados na formulação
turfosa atingiram 60% de enraizamento entre 27 e 33 dias após o
estaqueamento, enquanto a testemunha somente atingiu esta porcentagem
aos 36 dias, destacando-se o isolado FL2 que aos 36 dias alcançou 81% de
emissão de raízes nos tubete (Figura 2). Na formulação líquida, destacaram-
se os isolados S1, R1 e MF2 com maior porcentagem de emissão das raízes
abaixo do tubete, em relação aos tratamentos testemunha e AIB. Para as
duas formulações testadas, o tratamento com AIB aplicado na base das
miniestacas obteve maior enraizamento até o 24° dia após o estaqueamento,
depois deste período, o incremento de enraizamento tornou-se constante,
enquanto que para os tratamentos com os isolados de rizobactéria observou-
se aumento na emissão de raízes (Figura 3).
Para o clone 11, as formulações turfosa e líquida não diferiram
significativamente entre si (P < 0,05), desta forma optou-se por apresentar
a média das duas formulações por tratamento. Todos os isolados de
rizobactérias testados resultaram em maior porcentagem de emissão de
raízes do que a testemunha e o tratamento com AIB. Os isolados MF2, R1,
S1 e S2 atingiram em média 85% da emissão de raízes, enquanto a
testemunha alcançou 75% aos 39 dias após o estaqueamento (Figura 4).
50
0
20
40
60
80
100
18 21 24 27 30 33 36 39
Tempo (dias)
Emissão de raizes (%)
3918 Ca FL2 MF2 MF4 R1 S1 S2 AIB Test
Figura 2. Desenvolvimento da emissão de raízes (%) do clone de
Eucalyptus grandis x E. urophylla (409), estaqueado em
substrato rizobacterizado com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1,
Ca, FL2, MF2 ou MF4) veiculados na formulação turfosa, em
comparação com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de
ácido indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
51
0
20
40
60
80
100
18 21 24 27 30 33 36 39
Tempo (dias)
Emissão de raizes (%)
3918 Ca FL2 MF2 MF4 R1 S1 S2 AIB Test
Figura 3. Desenvolvimento da emissão de raízes (%) do clone de
Eucalyptus grandis x E. urophylla (409), estaqueado em
substrato rizobacterizado com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1,
Ca, FL2, MF2 ou MF4) veiculados na formulação líquida, em
comparação com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de
ácido indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
52
0
20
40
60
80
100
18 21 24 27 30 33 36 39
Tempo (dias)
Emissão de raizes (%)
3918 Ca FL2 MF2 MF4 R1 S1 S2 AIB Test
Figura 4. Desenvolvimento da emissão de raízes (%) do clone de
Eucalyptus grandis (11), estaqueado em substrato
rizobacterizado com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1, Ca, FL2,
MF2 ou MF4) veiculados na formulação líquida e turfosa, em
comparação com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de
ácido indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
53
Os maiores incrementos foram observados no período entre 18 a 27
dias do estaqueamento, e após este período até a última avaliação, os
incrementos foram menores não diferindo dos resultados apresentados pelos
isolados em relação à testemunha e o tratamento com AIB (Figuras 5, 6 e 7).
Para o incremento de enraizamento entre as avaliações sobre o
intervalo de tempo foi observado efeito significativo (P < 0,05) entre as
formulações turfosa e líquida do clone 409 (Figuras 5 e 6). Para os
tratamentos na formulação turfosa observou-se maiores incrementos no
intervalo entre as avaliações realizadas nos dias 21 a 30 após o
estaqueamento e menores taxas nas últimas avaliações. O incremento obtido
pelo tratamento do isolado FL2 foi o maior observado entre as avaliações
realizadas nos dias 24 a 27 após o estaqueamento (Figura 5). Na formulação
líquida, o incremento de enraizamento do clone 409 foi maior no intervalo
entre as avaliações realizadas no 21º e 24° dias após o estaqueamento para
os isolados S1 e R1, respectivamente (Figura 6).
As formulações turfosa e líquida, para o clone 11, não diferiram
significativamente entre si (P < 0,05) em relação ao incremento calculado
entre as avaliações sobre o tempo de avaliação, por isso optou-se por
apresentar a média das duas formulações por tratamento. Os maiores
incrementos foram observadas nas avaliações correspondentes aos 18° e 27°
dias após o estaqueamento e os menores valores foram observados entre as
três últimas avaliações realizadas. O isolado 3918 destacou-se na primeira
avaliação com maior incremento. Nas avaliações realizadas no intervalo
entre 24 e 27 dias após o estaqueamento o isolado R1 apresentou maior taxa
de incremento de enraizamento (Figura 7).
54
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
18 21 24 27 30 33 36
Tempo (dias após estaqueamento)
Incremento de enraizamento
3918 Ca Fl2 MF2 MF4 R1 S1 S2 Test AIB
Figura 5. Incremento de enraizamento obtidos entre as avaliações sobre o
intervalo de tempo (3 dias), nas oito avaliações realizadas do
clone de Eucalyptus grandis x E. urophylla (409), estaqueado em
substrato rizobacterizado com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1,
Ca, FL2, MF2 ou MF4) veiculados na formulação turfosa, em
comparação com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de
ácido indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
55
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
18 21 24 27 30 33 36
Tempo (dias após estaqueamento)
Incremento de enraizamento
3918 Ca Fl2 MF2 MF4 R1 S1 S2 Test AIB
Figura 6. Incremento de enraizamento obtidos entre as avaliações sobre o
intervalo de tempo (3 dias), nas oito avaliações realizadas do
clone de Eucalyptus grandis x E. urophylla (409), estaqueado em
substrato rizobacterizado com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1,
Ca, FL2, MF2 ou MF4) veiculados na formulação líquida, em
comparação com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de
ácido indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
56
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
18 21 24 27 30 33 36
Tempo (dias após estaqueamento)
Incremento de enraizamento
3918 Ca Fl2 MF2 MF4 R1 S1 S2 Test AIB
Figura 7. Incremento de enraizamento obtidos entre as avaliações sobre o
intervalo de tempo (3 dias), nas oito avaliações realizadas do
clone de Eucalyptus grandis (11), estaqueado em substrato
rizobacterizado com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1, Ca, FL2,
MF2 ou MF4) veiculados nas formulações líquida e turfosa, em
comparação com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de
ácido indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
57
Houve efeito significativo (P < 0,05) entre as formulações turfosa
e líquida para o clone 409 em relação à taxa de enraizamento ao longo do
tempo (r
v
). Os tratamentos que induziram em plantas do clone 409 maior
taxa de enraizamento, em relação à testemunha, foram os isolados 3918,
FL2, MF2, R1, S1, S2 na formulação turfosa e o tratamento com AIB, assim
como, os isolados MF2, R1 e S1 formulados em solução estabilizante. Em
relação ao tratamento com AIB, os isolados 3918, FL2, R1 e S1 na
formulação turfosa e todos os isolados na formulação líquida diferiram
significativamente deste, isto é, o inoculante líquido propiciou maior
velocidade de enraizamento que o AIB aplicado na base das miniestacas
(Tabela 2).
A resposta à rizobacterização, variou de acordo com o clone, tipo de
formulação e isolado testado, sendo o clone 11 o que melhor respondeu a
aplicação dos inoculantes. Como não houve diferença entre as duas
formulações, para o clone 11, empregou-se a média das duas formulações
para comparação dos tratamentos. Todos os tratamentos diferiram da
testemunha e em relação à aplicação com AIB, à exceção do isolado 3918
que foi estatisticamente similar ao tratamento hormonal (Tabela 3).
Tabela 2. Taxa de enraizamento (r
v
) de mudas do clone de Eucalyptus
grandis x E. urophylla (409) tratadas com isolados bacterianos e
o intervalo de confiança da diferença entre as médias dos
isolados e dos tratamentos testemunha (ICTest) e ácido
indolbutírico (ICAIB), nas formulações líquida e turfosa
r
v
ICTest ICAIB
r
v
ICTest ICAIB
3918 0,062 -0,006 ; 0,017 0,013 ; 0,018* 0,066 0,019 ; 0,014* 0,007 ; 0,013*
Ca 0,058 -0,010 ; 0,014 0,008 ; 0,015* 0,041 -0,006 ; 0,016 -0,017 ; 0,015
FL2 0,064 -0,004 ; 0,012 0,014 ; 0,013* 0,080 0,033 ; 0,019* 0,022 ; 0,019*
MF2 0,068 0,001 ; 0,015* 0,019 ; 0,016* 0,048 0,001 ; 0,016* -0,011 ; 0,015
MF4 0,055 -0,013 ; 0,014 0,005 ; 0,015* 0,047 -0,001 ; 0,014 -0,012 ; 0,013
R1 0,078 0,011 ; 0,017* 0,029 ; 0,018* 0,062 0,015 ; 0,015* 0,003 ; 0,015*
S1 0,075 0,008 ; 0,014* 0,026 ; 0,015* 0,063 0,016 ; 0,015* 0,004 ; 0,014*
S2 0,055 -0,013 ; 0,014 0,005 ; 0,0015* 0,057 0,010 ; 0,014* -0,002 ; 0,014
AIB 0,050 - - 0,059 - -
Testemunha 0,068 - - 0,047 - -
Formulação Líquida Formulação Turfosa
Tratamento
* Como o intervalo de confiança não inclui zero, há diferença significativa (P= 0,05) entre o
isolado e o tratamento
58
Tabela 3. Taxa de enraizamento (r
v
) de mudas do clone de
Eucalyptus grandis (11) tratadas com isolados
bacterianos e o intervalo de confiança da diferença
entre as médias dos isolados e dos tratamentos
testemunha (ICTest) e ácido indolbutírico
(ICAIB), nas formulações líquida e turfosa
r
v
ICTest ICAIB
3918 0,062 0,006 ; 0,014* -0,008 ; 0,017
Ca 0,080 0,025 ; 0,013* 0,010 ; 0,017*
FL2 0,075 0,020 ; 0,013* 0,005 ; 0,016*
MF2 0,098 0,042 ; 0,016* 0,028 ; 0,018*
MF4 0,072 0,016 ; 0,014* 0,002 ; 0,018*
R1 0,091 0,036 ; 0,015* 0,021 ; 0,018*
S1 0,078 0,023 ; 0,013* 0,008 ; 0,016*
S2 0,089 0,034 ; 0,013* 0,019 ; 0,016*
AIB 0,070 - -
Testemunha 0,055 - -
Média entre as formulações
Tratamento
* Como o intervalo de confiança não inclui zero, há diferença significativa
(P = 0,05) entre o isolado e o tratamento
Em relação, as variáveis biomassa da parte aérea e radicular do clone
409, foi observado efeito significativo (P < 0,05) entre as formulações
líquida e turfosa. O isolado S2 obteve maiores médias para biomassa da
parte aérea, diferindo estatisticamente do isolado Ca nas duas formulações
testadas. Em relação ao tratamento com AIB, o isolado S2 apresentou
incremento de 17 e 10%, para as formulações líquida e turfosa,
respectivamente (Tabela 4). Para biomassa do sistema radicular não houve
diferença significativa entre os tratamentos. Contudo, pode-se observar que
os isolados S2 e R1, veiculados na formulação turfosa, resultaram em
incrementos de 47 e 23%, respectivamente, apresentando maior resposta que
os mesmos isolados veiculados em formulação líquida que obtiveram 19 e
4% de incremento, respectivamente, comparados à testemunha. Em relação
ao tratamento com o hormônio AIB, os isolados S2 e R1, obtiveram
incrementos de 20 e 6% para formulação líquida e 58 e 32% para a
formulação turfosa (Tabela 4).
Para a biomassa radicular, do clone 11, as formulações turfosa e
líquida diferiram significativamente entre si (P < 0,01), entretanto, não
59
observou-se diferença entre as formulações para a biomassa da parte aérea.
Em relação à biomassa da parte aérea, o isolado S2 diferiu dos isolados Ca,
FL2 e R1, da testemunha e do tratamento comparador AIB com ganho de
18% em relação aos dois últimos tratamentos. Observou-se para a biomassa
radicular, que os isolados veiculados em turfa apresentaram maiores
incrementos do que os veiculados em solução estabilizante. Os isolados S1,
S2 e MF4, veiculados em turfa canadense, resultaram em maior
desenvolvimento do sistema radicular com incrementos de 40, 19 e 19%,
respectivamente, comparados com a testemunha. Para a formulação líquida,
destacaram-se os isolados S2, R1 e 3918 com incrementos de 21, 14 e 11%
quando comparado à testemunha e de 16, 10 e 7% em relação ao tratamento
AIB. (Tabela 5).
Tabela 4. Biomassa da parte aérea e radicular do clone E. grandis
x E. urophylla (409), estaqueado em substrato rizobacterizado
com os inoculantes (S1, S2, 3918, R1, Ca, FL2, MF2 ou MF4)
veiculados nas formulações turfosa e líquida, em comparação
com o substrato não tratado (Test) e a aplicação de ácido
indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
Form. Líquida Form. Turfosa Form. Líquida Form. Turfosa
3918 0,53 ab 0,57 ab 0,162 0,169
Ca 0,49 b 0,50 b 0,148 0,159
FL2 0,53 ab 0,55 ab 0,156 0,168
MF2 0,61 ab 0,54 ab 0,154 0,202
MF4 0,59 ab 0,53 ab 0,152 0,203
R1 0,66 a 0,52 ab 0,166 0,238
S1 0,59 ab 0,54 ab 0,164 0,184
S2 0,68 a 0,64 a 0,189 0,285
AIB 0,58 ab 0,58 ab 0,157 0,180
Test 0,65 a 0,56 ab 0,159 0,194
Tratamentos
Parte Aérea Radicular
Tratamentos seguidos pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste de Tukey
(α=0,05).
60
Tabela 5. Biomassa da parte aérea e radicular do clone E. grandis (11),
estaqueado em substrato rizobacterizado com os inoculantes
(S1, S2, 3918, R1, Ca, FL2, MF2 ou MF4) veiculados nas
formulações turfosa e líquida, em comparação com o
substrato não tratado (Test) e a aplicação de ácido
indolbutírico (AIB) na base das miniestacas
Parte Aérea
Form. Líquida e
Turfosa
Form. Líquida Form. Turfosa
3918 0,68 ab 0,243 0,208
Ca 0,66 b 0,218 0,221
FL2 0,63 b 0,213 0,190
MF2 0,67 ab 0,238 0,227
MF4 0,71 ab 0,240 0,246
R1 0,65 b 0,249 0,189
S1 0,66 ab 0,236 0,289
S2 0,77 a 0,264 0,247
AIB 0,65 b 0,227 0,238
Test 0,65 b 0,219 0,207
Radicular
Tratamentos
Tratamentos seguidos pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste de Tukey
(α=0,01).
61
4. DISCUSSÃO
Oito isolados de rizobactérias, veiculados em turfa canadense e
solução estabilizante, foram avaliados quanto à viabilidade do inoculante
armazenado ao longo tempo e seus efeitos sobre o enraizamento de
miniestacas e o crescimento de mudas de eucalipto.
A veiculação das rizobactérias em um material que conserve as
características dos isolados e mantenha a população bacteriana a níveis
adequados ao longo do tempo é necessário para viabilizar o uso destes
microrganismos comercialmente. A vermiculita, talco, alginato, caulinita,
lignita, farelo de trigo, farelo de aveia, caldo bacteriano e principalmente a
turfa tem sido estudados como veículos para os diferentes gêneros de
rizobactérias. Em geral, as formulações em pó têm se mostrado eficientes no
controle de doenças e na melhora da qualidade das plantas (1, 30),
entretanto a formulação líquida oferece diferentes formas de aplicação,
como por exemplo a aplicação do inoculante juntamente a solução nutritiva
adicionada ao substrato, que pode facilitar a utilização do inoculante na
produção de mudas de eucalipto. Observou-se viabilidade de todos os
isolados de rizobactérias, tanto veiculados em turfa canadense, com
concentração bacteriana média de 6,2x10
9
u.f.c./mL, quanto na formulação
líquida com 9,5x10
9
u.f.c./mL, ao longo de 6 meses, armazenados à
temperatura ambiente. Os isolados de Bacillus subtilis, provavelmente
devido à capacidade de formar endósporos, demonstraram maior
estabilidade da população ao longo do tempo de estocagem do produto.
A resposta a rizobacterização variou de acordo com o clone, isolado,
formulação e variável analisada com o clone, tipo de formulação e isolado
62
testado, mas em geral obteve-se ganho em relação à testemunha (sem
inoculação) e o tratamento comparador com AIB (ácido-indolbutilico). A
variação nos resultados sugere uma aparente especificidade entre isolado de
bactéria e clone de eucalipto e foi anteriormente observada nos ensaios de
seleção seleção (28), na produtividade das minicepas de eucalipto (21), e
nos ensaios utilizando misturas de isolados (20).
Através da determinação da concentração de cada isolado nas duas
formulações utilizadas no experimento, pode-se atestar a pureza e uma
população bacteriana viável que em média atingiu 3x10
9
u.f.c./mL ou g nos
inoculantes turfoso e líquido. Estudos demonstram que a população
bacteriana de isolados de rizobactérias veiculados em turfa com
concentração inicial em torno de 10
8
a 10
9
u.f.c./mL se mantiveram estáveis
após os primeiros dias de armazenamento (4, 7, 10), assim como
demonstraram efeito positivo no controle de patógenos, como Rhizoctonia
solani, Fusarium udum, Pythium aphanidermatum e F. oxysporum (1, 10,
28), e foram eficientes no aumento do enraizamento e na produção de
culturas como ervilha e tomate (9, 29).
A velocidade de enraizamento foi determinada contando-se o
número de miniestacas que emitiam raízes no fundo do tubete, entretanto
este método por não ser destrutivo prejudica a avaliação de forma que as
miniestacas em que as raízes ficam enoveladas ao longo do tubete e não se
exteriorizam não são adicionadas às avaliações. Entretanto através desta
variável pode-se determinar o desenvolvimento da emissão de raízes (%) ao
longo do tempo, o incremento de enraizamento obtido entre as avaliações
sobre o intervalo de tempo (3 dias), a taxa de enraizamento (rv) e o intervalo
de confiança em relação à testemunha e o tratamento comparador AIB. Para
estas variáveis calculadas a partir dos dados de velocidade de enraizamento,
destacou-se o isolado FL2, na formulação turfosa e os isolados MF2, R1 e
S1, na formulação líquida, para o clone 409, o que reflete no observado para
os mesmos isolados e formulações em relação as maiores concentrações
iniciais dos inoculantes utilizados. Para o clone 11 não houve diferença
entre as formulações, observando a média entre os tratamentos os isolados
com melhores resultados foram MF2 e R1.
63
Maior emissão de raízes das miniestacas estaqueadas em substrato
rizobacterizado foi observada para os dois clones, sendo que os isolados na
formulação turfosa propiciaram maior emissão de raízes do clone 409,
comparado á formulação líquida em relação a testemunha. Com base nos
dados analisados as miniestacas em substrato rizobacterizado apresentam
maior capacidade de emissão de raízes e podem ser retiradas mais
precocemente da casa de enraizamento, otimizando a utilização da estrutura
por um período de até 6 dias. Além deste beneficio estrutural, as miniestacas
permanecendo menor tempo na casa de vegetação, também ficarão menos
expostas às condições favoráveis ao ataque de patógenos, podendo assim
reduzir as perdas por doenças bióticas.
O isolado S2, de B. subtilis, destacou-se dos demais tratamentos para
as variáveis biomassa radicular e da parte aérea, nas formulações líquida e
turfosa, destacando-se como uma rizobactéria de interesse comercial para a
produção de mudas de eucalipto. Isolados de Bacillus licheniformis e B.
pumilus, inoculados em plantas de Pinus pinea L., após 90 dias,
aumentaram a biomassa da parte aérea das plantas e aos 150 dias da
inoculação, observou-se aumento significativo na biomassa das plantas em
relação a testemunha, entretanto os tratamentos de bactérias não diferiram
entre si (22).
Para o clone 409 (E. grandis x E. urophylla) a biomassa radicular
não apresentou diferença significativa entre os tratamentos para as duas
formulações utilizadas. Resultados similares foram observados por Mafia et
al. (21) para o mesmo clone, cujo substrato foi tratado com suspensão
bacteriana em solução salina dos mesmos isolados, de forma que se
confirma a especificidade entre os isolados e clone de eucalipto, não
havendo interferência do veículo, turfa ou solução estabilizante, para a
variável analisada.
As rizobactérias do gênero Bacillus e Pseudomonas são atualmente
as mais utilizadas comercialmente e apresentam melhores efeitos de
promoção de crescimento e biocontrole. Substratos à base de turfa tem
demonstrado maior estabilidade ao longo do tempo e praticidade em
veicular rizobactérias comercialmente na produção de mudas com maior
vigor e produtividade (9, 14, 15).
64
A inoculação de rizobactérias ao substrato de enraizamento tem
acarretado melhoria na qualidade das mudas de eucalipto levadas ao campo,
além de promover o controle de patógenos (16, 29). Com a utilização de um
veículo, seja em solução estabilizante ou turfa canadense, o uso do
inoculante tornou-se mais prático e viável e além de conservar a
concentração bacteriana desejável por no mínimo 6 meses, mostrou-se
eficiente no enraizamento de miniestacas e crescimento de mudas de
eucalipto.
65
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Amer, G.A.; Utkhede, R.S. (2000). Development of formulations of
biological agents for management of root rot of lettuce and cucumber.
Canadian Journal of Microbiology, 46, 809-816.
2. Benizri, E., Baudoin, E.; Guckert, A. (2001). Root colonization by
inoculated plant growth-promoting rhizobacteria. Biocontrol Science
and Technology, 11, 557-574.
3. Boer, M., Van Der Sluis, I., Van Loon, L.C.; Bakker, A.H.M. (1999).
Combining fluorescent Pseudomonas spp. strains to enhance
suppression of fusarium wilt of radish. Europan Journal of Plant
Pathology, 105, 201-210.
4. Brown, T.A. (2003). Clonagem genica e análise de DNA: Uma
introdução, Porto Alegre, 376p.
5. Campbell, C.L.; Madden, L.V. (1990). Introduction to plant disease
epidemiology, New York, 532p.
6. Cattelan, A.J., Hartel, P.G.; Fuhrmann, J.J. (1999). Screening for plant
growth-promoting rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil
Science Society of America Journal, 63, 1670-1680.
7. Daigle, D.J., Connick, W.J.; Boyetchko, S.M. (2002). Formulating a
weed-suppressive bacterium in "Pesta". Weed Technology, 16, 407-
413.
8. Davison, J. (1988). Plant beneficial bacteria. BioTechniques, 6, 282-
286.
66
9. Enebak, S.A., Wei, G.; Kloepper, J.W. (1997). Effects of plant growth-
promoting rhizobacteria on loblolly and slash pine seedlings. Forest
Science, 44, 139-144.
10. Freitas, J.R., Banerjee, M.R.; Germida, J.J. (1997). Phosphate-
solubilizing rhizobacteria enhance the growth and yield but not
phosphorus uptake of canola (Brassica napus L.). Biology and Fertility
of Soils, 24, 358-364.
11. Gagné, S., Dehbi, L., Le Quéré, D., Cayer, F., Morin, J., Lemay, R.;
Fournier, N. (1993). Increase of greenhouse tomato fruit yields by
plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) inoculated into the peat-
based growing media. Soil Biology & Biochemistry, 25, 269-272.
12. Kado, E.I.; Heskett, M.G. (1970). Selective media for isolation of
Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and
Xanthomonas. Phytopathology, 60, 969-976.
13. Kloepper, J.W., Lifshitz, R.; Zablotowicz, R.M. (1989). Free-living
bacterial inocula for enhancing crop productivity. Trends in
Biotechnology, 7, 39-43.
14. Kloepper, J.W.; Schroth, M.N. (1978) IN INTERNATIONAL
CONFERENCE ON PLANT PATHOGENIC BACTERIA (ANGERS,
Ed.), Vol. 4, pp. 879-882, Angers.
15. Kloepper, J.W., Schroth, M.N.; Miller, T.D. (1980). Effets of
rhizosphere colonization by plant growth-promoting rhizobacteria on
potato plant development and yield. Phytopathology, 70, 1078-1082.
16. Kokalis-Burelle, N., Kloepper, J.W.; Reddy, M.S. (2006). Plant
growth-promoting rhizobacteria as transplant amendments and their
effects on indigenous rhizosphere microorganisms. Applied Soil
Ecology, 31, 91-100.
17. Kokalis-Burelle, N., Vavrina, C.S., Rosskopf, E.N.; Shelby, R.A.
(2002). Field evaluation of plant growth-promoting rhizobacteria
amended transplant mixes and soil solarization for tomato and pepper
production in Florida. Plant and Soil, 238, 257-266.
18. Ladeira, M.C.G. (2004) Controle biológico de Quambalaria eucalypti
mediado por rizobactérias. Departamento de Fitopatologia, pp. 45,
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.
67
19. Liu, L., Kloepper, J.W.; Tuzun, S. (1995). Induction of systemic
resistence in cucumber by plant growth-promoting rhizobacteris:
Duration of protection and effect of host resistence on protection and
root colonization. Phytopathology, 85, 1064-1068.
20. Mafia, R.G. (2004) Rizobactérias como promotoras do enraizamento,
crescimento e como agentes de biocontrole de doenças na propagação
clonal do eucalipto. Departamento de Fitopatologia, pp. 118,
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.
21. Mafia, R.G., Alfenas, A.C., Ferreira, E.M., Zarpelon, T.G.; Siqueira,
L. (2005). Crescimento de mudas e produtividade de minijardins
clonais de eucalipto tratados com rizobacterias selecionadas. Revista
Árvore, 29, 843-851.
22. Pan, B., Bai, Y.M., Leibovitch, S.; Smith, D.L. (1999). Plant-growth-
promoting rhizobacteria and kinetin as ways to promote corn growth
and yield in a short-growing-season area. European Journal of
Agronomy, 11, 179-186.
23. Press, C.M., Loper, J.E.; Kloepper, J.W. (2001). Role of iron in
rhizobacteria-mediated induced systemic resistance of cucumber.
Biological Control, 91, 593-598.
24. Romeiro, R.S. (2001). Métodos em Bacteriologia de Plantas. Editora
UFV, Viçosa, 279pp.
25. Shishido, M.; Chanway, C.P. (2000). Colonization and growth
promotion of outplanted spruce seedlings pre-inoculated with plant
growth-promoting rhizobacteria in the greeenhouse. Can J For Res,
30, 845-854.
26. Silveira, E.B., Gomes, A.M.A., Mariano, R.L.R.; Silva Neto, E.B.
(2004). Bacterização de sementes e desenvolvimento de mudas de
pepino. Horticultura Brasileira, 22, 217-221.
27. Teixeira, D.A. (2001) Promoção de enraizamento e indução de
resistência sistêmica à ferrugem e à mancha-de-Cylindrocladium,
mediadas por rizobactérias em clones de Eucalyptus spp.
Departamento de Fitopatologia, pp. 80, Universidade Federal de
Viçosa, Viçosa.
68
28. Teixeira, D.A., Alfenas, A.C., Mafia, R.G., Ferreira, E.M., Siqueira,
L., Maffia, L.A.; Mounteer, A.H. (2007). Rhizobacterial promotion of
eucalypt rooting and growth. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 1-
6.
29. Teixeira, D.A., Alfenas, A.C., Mafia, R.G., Maffia, L.A.; Ferreira,
E.M. (2005). Evidências de Indução de Resistência Sistêmica à
Ferrugem do Eucalipto Mediada por Rizobactérias Promotoras do
Crescimento de Plantas. Fitopatologia Brasileira, 30, 350-356.
30. Vidhyasekaran, P., Sethuraman, K., Rajappan, K.; Vasumathi, K.
(1997). Powder formulations of Pseudomonas fluorescens to control
pigeonpea wilt. Biological Control, 8, 166-171.
69
CONCLUSÕES GERAIS
Os resultados deste trabalho permitiram concluir que:
− As características morfológicas de coloração e elevação das
colônias separaram todos isolados de rizobactérias; Os isolados de Bacillus
subtilis, de Pseudomonas sp. e de P. fulva foram diferenciados por suas
características morfológicas e pela sensibilidade a antibióticos;
− No antibiograma os isolados testados foram insensíveis à
penicilina, exceto o isolado R1; Oxacilina inibiu somente o crescimento dos
isolados de B. subtilis; O isolado FL2 foi o único insensível a cefepime e
norfloxacin;
− Para a análise molecular utilizou-se a técnica PCR-RFLP da
região 16S do DNA ribossomal e as enzimas Sau3AI e MspI separaram
através da clivagem o maior número de isolados; Os perfis de restrição
produzidos por nove enzimas de restrição permitiu a separação entre os
isolados CIIb, R1 e FL2 e os grupos de Bacillus (S1, S2 e 3918) e de
Pseudomonas (MF2, MF4 e Ca);
− Todos os isolados avaliados foram viáveis nas formulações
turfosa e líquida armazenados em temperatura ambiente durante 180 dias;
− Os inoculantes em ambas as formulações foram eficientes na
produção de mudas de eucalipto; Os isolados FL2, R1, MF2, S1 e S2
veiculados na formulação turfosa ou líquida destacaram-se por atingirem
mais de 80% da emissão de raízes abaixo do tubete em menos tempo
quando comparado aos tratamentos testemunha e AIB; Para biomassa da
parte aérea e do sistema radicular o isolado S2, de B. subtilis, destacou-se
dos demais tratamentos para os dois clones nas duas formulações testadas;
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
