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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ESTUDO DOS EFEITOS DO AVE 0991, ANÁLOGO NÃO
PEPTÍDICO DA ANGIOTENSINA-(1-7), SOBRE
PARÂMETROS CARDIOVASCULARES E
METABÓLICOS EM HAMSTERS SUBMETIDOS À
DIETA HIPERCOLESTEROLÊMICA.
Analina Raquel da Silva
Ouro Preto - MG
2008
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II
Catalogação: [email protected]
S586e Silva, Analina Raquel da.
Estudo dos efeitos do AVE 0991, análogo não peptídico da angiotensina-(1-7),
sobre parâmetros cardiovasculares e metabólicos em hamsters submetidos à dieta
hipercolesterolêmica. [manuscrito] / Analina Raquel da Silva. - 2008.
xii, 71f.: il.; grafs.; tabs.
Orientadora: Profª. Dra. Raquel do Pilar Machado.
Co-orientadora: Profª. Dra. Andréia Carvalho Alzamora.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
1. Angiotensina - Teses. 2. Sistema renina-angiotensina - Teses. 3. Colesterol
- Hamsters - Teses. 4. Aterosclerose - Teses. 5I. Universidade Federal de Ouro
Preto. II. Título.
CDU: 616.13-004.6
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III
IV
ANALINA RAQUEL DA SILVA
ESTUDO DOS EFEITOS DO AVE 0991, ANÁLOGO NÃO PEPTÍDICO DA
ANGIOTENSINA-(1-7), SOBRE PARÂMETROS CARDIOVASCULARES E
METABÓLICOS EM HAMSTERS SUBMETIDOS À DIETA
HIPERCOLESTEROLÊMICA.
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação
do núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração:
Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
V
Dedico este trabalho à minha família,
representação Divina em minha vida.
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida.
À minha família, pelo amor e apoio incondicionais. Vocês são o suporte, exemplo de
vida, alegria e união, que me ensinou que mais importante na vida é amar!
À Prof
a
. Raquel pela orientação. Você me ensinou tudo que uma pessoa precisa para ser
o melhor profissional em qualquer carreira. Nem sempre, para orientar, é necessário
estar ao lado o tempo todo. A melhor orientação é feita por exemplos nos quais
podemos nos espelhar o resto da vida!
À Prof
a
. Andréia pelo apoio e “novamente” pelos nossos Tem Alegria!
Agradeço a Prof
a
. Cláudia e a todos do Laboratório de Patologia pelos ensinamentos e
oportunidade.
Ao Prof. Marcelo e a Prof
a
. Lucinha pelo apoio e colaboração.
Ao Prof. Robson Santos pelo voto de confiança nesse trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Hipertensão pelo grande incentivo, colaborações e
momentos de descontração. Aqui, em especial agradeço aos meus amigos de mestrado
Bi, Luíza e Everton, pela adorável convivência e pelo auxílio sempre que precisei. Ao
Vinícius (in memorian) que me ensinou como se trabalha em equipe.
À minha querida estagiária Janete. Obrigada por tornar nosso trabalho muito mais
alegre e agradável. Hoje não mais uma estagiária e sim uma grande amiga!
Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas pela oportunidade. A todos os
colegas de mestrado e a nossa querida Cida.
VII
Ao Prof. Déo pelos auxílios sem os quais não teria condições de ir a eventos, tão
importantes para um pesquisador.
À minha casinha, Rep. Maxixe e as irmãs maxixeiras, por entenderem o meu “estresse”
e por proporcionarem os melhores momentos durante esses anos maravilhosos de
convivência.
Ao Victor que é um anjo em minha vida.
Aos meus verdadeiros amigos, que transformaram tempos em momentos.
Ao sacrifício dos animais experimentais.
VIII
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos do AVE 0991, análogo não-peptídico da
Angiotensina-(1-7), sobre lesões ateroscleróticas em hamsters tratados com uma dieta
hipercolesterolêmica semi-purificada. Hamsters machos com aproximadamente 1 mês
de idade foram divididos nos seguintes grupos: grupos controles tratados (GCT, n=7) ou
não (GC, n=7), e grupos hipercolesterolêmicos tratados (GHT, n= 9) ou não (GH, n=10)
com AVE 0991. A dieta hipercolesterolêmica foi similar a controle, porém, com
acréscimo de 0,5% de colesterol e substituição de 8% de óleo de soja por 17% de
gordura de coco. O AVE 0991 foi administrado, oralmente, nos últimos 30 dias de 120
dias de dieta. O colesterol total (CT) foi medido mensalmente e o colesterol HDL foi
medido no final do experimento. No final do tratamento os animais foram anestesiados
com uretana (1,2g/Kg i.p.) e a artéria femural foi canulada para medidas da pressão
arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC). O coração e arco aórtico foram
corados com Sudam III para avaliações histológicas. O CT dos grupos hiper tratados ou
não foram significativamente maiores em relação aos grupos controles (tratados ou não)
durante o experimento
(294,8±25,3 mg/dL, GH e 256,8±21,6 mg/dL, GHT, comparado
a 95,67±7,1 mg/dL, GC e 99,01±8,5 mg/dL, GCT, em 120 dias). Não houve efeito nos
níveis de CT pelo tratamento com AVE. O HDL sérico estava elevado tanto no GH
quanto no GHT (160,6 ± 10,9 mg/dL, GH e 132,0 ± 16,8 mg/dL, GHT) em relação ao
GC e GCT (45,5 ± 3,8 mg/dL, GC e 61,2 ± 6,7 mg/dL, GCT). O tratamento com AVE
0991 não influenciou os níveis séricos de HDL. Não houve diferenças significativas tanto
na PAM (87,86±5,3 mmHg, GC; 91,38±2,0 mmHg, GCT; 93,4±1,1 mmHg, GH;
94,8±3,1 mHg, GHT) quanto na FC (469,6±11,0 bpm, GC; 442,1±23,5, GCT;
484,5±6,6 bpm, GH; 471,5±11,2 bpm, GHT). As análises histológicas mostraram lesões
ateroscleróticas no coração, válvula aórtica e arco aórtico em 33% dos animais do
grupo hipercolesterolêmico, enquanto nos grupos tratados com AVE e controle (GC),
nenhuma área corada foi encontrada. Esses dados sugerem que uma dieta
semipurificada contendo 0,5% de colesterol e 17% de gordura de coco foi eficiente em
induzir o aparecimento de lesões ateroscleróticas em hamsters. Além disso, nossos
resultados sugerem que o AVE 0991 produz uma atenuação das lesões vasculares
induzidas pela dieta hipercolesterolêmica, independentemente de alterações na pressão
arterial.
IX
ABSTRACT
The objective of this study was to study the effect of AVE 0991, an non-peptidic
analogue of Angiotensin-(1-7), on atherosclerotic lesions in hamsters treated with a
partially purified hypercholestolemic diet. Male hamsters about one months old were
divided in the following groups: without treatment (CG, n=7), treated control group
(TCG, n=7), and non-treated (HG, n=10) and treated (THG, n=9) hypercholesterolemic
groups. The hypercholesterolemic diet was similar to the control one, but, with addition
of 0.5 % cholesterol and replacement of 8 % soy oil by 17 % coconut oil. The AVE
0991 was administered, orally, in the last 30 days of the 120 days of diet. The total
cholesterol (TC) was measured monthly and HDL cholesterol were measured in the end
of experiment. At the end of the treatments the animals were anesthetized with urethane
(1.2 g/ Kg, i.p.) and the femoral artery was cannulated for mean arterial pressure (MAP)
and heart rate (HR) measurements. The heart and aortic tissues were stained with Sudan
III for histological evaluation. The TC of HG and THG were significantly higher than
the controls (CG+TCG) during the experiment (294.8±25.3 mg/dL, HG and 256.8±21.6
mg/dL, THG, compared to 95.67±7.1 mg/dL, CG and 99.01±8.5 mg/dL, TCG, in 120
days). There was no effect in TC levels with the AVE treatment. The serum HDL was
enhanced in HG and THG (160.6 ± 10.9 mg/dL, HG and 132.0 ± 16.8 mg/dL, THG) in
relation the CG and TCG (45.5 ± 3.8 mg/dL, CG and 61.2 ± 6.7 mg/dL, TCG). The
treatment with AVE 0991 did not influenced the levels of serum HDL. There were no
differences in both MAP (87.86±5.3 mmHg, CG; 91.38±2.0 mmHg, TCG; 93.4±1.1
mmHg, HG; 94.8±3.1 mmHg, THG) and HR (469.6±11.0 bpm, CG; 442.1±23.5, TCG;
484.5±6.6 bpm, HG; 471.5±11.2 bpm, THG). The histological analysis showed
atherosclerotic lesions in the heart, aortic valve and aortic arch in33% of the animals of
the of Hypercholesterolemic group while no stained areas were observed in AVE-
treated and control-diet (CG) hamsters. These data suggest that the semipurified diet
containing 0.5 % cholesterol and 17 % coconut oil was efficient to induce
atherosclerotic vascular lesions. More importantly, our results suggest that AVE 0991
produces blood pressure-independent attenuation of hypercholesterolemic diet- induced
vascular lesions.
X
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................
VIII
ABSTRACT............................................................................................................
IX
LISTA DE TABELAS............................................................................................
XII
LISTA DE FIGURAS............................................................................................
XIII
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................
1
2. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................
5
2.1. Metabolismo das lipoproteínas......................................................... 5
2.2. Aterosclerose.................................................................................... 8
2.2.1. Classificação e histopatologia das lesões ateroscleróticas................
10
2.3. Sistema Renina – Angiotensina........................................................ 12
2.3.1. SRA e aterosclerose........................................................................ 15
2.4. AVE 0991......................................................................................... 17
2.5. O hamster como modelo no estudo de hipercolesterolemia e
aterosclerose...............................................................................................
18
3. OBJETIVOS....................................................................................................
20
3.1. Objetivo geral................................................................................... 20
3.2. Objetivos específicos........................................................................ 20
4. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................
21
4.1. Animais............................................................................................. 21
4.2. Dietas................................................................................................ 21
4.3. Desenho experimental.......................................................................
21
4.4. Tratamento com AVE 0991.............................................................. 23
4.5. Amostras biológicas..........................................................................
24
4.5.1. Peso corporal e peso dos órgãos...................................................... 24
4.5.2. Obtenção do soro............................................................................. 24
4.6. Parâmetros bioquímicos....................................................................
24
XI
4.6.1. Dosagens bioquímicas utilizando kits comerciais........................... 24
4.6.2. Determinação da atividade da enzima paraoxonase........................ 25
4.6.3.
Sulfidrilas totais............................................................................... 25
4.6.4. Determinação da atividade da catalase............................................ 26
4.7. Avaliação dos parâmetros cardiovasculares..................................... 27
4.7.1. Anestesia.......................................................................................... 27
4.7.2. Confecção da cânula implantada na artéria..................................... 27
4.7.3. Canulação da artéria aorta abdominal..............................................
27
4.7.4. Registro da pressão arterial e freqüência cardíaca........................... 28
4.8. Análise histopatológica..................................................................... 28
4.9. Análise estatísitica………………………………………………… 28
5. RESULTADOS................................................................................................
30
5.1. Parâmetros biológicos....................................................................... 30
5.1.1. Ganho de peso corporal e peso dos órgãos...................................... 30
5.1.2. Peso dos órgãos................................................................................
31
5.2. Parâmetros bioquímicos....................................................................
34
5.2.1. Lipídios: níveis séricos de colesterol total, HDL, n-HDL, razão
HDL/n-HDL e triglicérides........................................................................
34
5.2.2. Função hepática: alanina aminotransferase (ALT).......................... 39
5.2.3. Estresse oxidativo: catalase, paraoxonase e sulfidrilas totais.......... 39
5.3. Parâmetros cardiovasculares: pressão arterial média (PAM) e
freqüência cardíaca (FC)............................................................................
42
5.4. Análise histopatológica..................................................................... 43
6. DISCUSSÃO....................................................................................................
49
7. CONCLUSÕES...............................................................................................
56
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................
57
9. ANEXOS..........................................................................................................
74
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
Composição das dietas controle e hipercolesterolêmica em gramas
para cada 1000g de dieta..........................................................................................
23
Tabela 2: Diluições da solução padrão em trietanolamina-HCL
(TEA).......................................................................................................................
26
Tabela 3 Quantidades (
µ
l) dos reagentes utilizados para o preparo da curva
padrão necessária para o cálculo das sulfidrilas totais.............................................
26
Tabela 4: Peso relativo do coração, fígado e baço (mg/g de peso corporal) em
hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou
não com AVE 0991..................................................................................................
32
Tabela 5: Peso relativo dos rins direito e esquerdo e do pulmão (mg/g de peso
corporal) em hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica,
tratados ou não com AVE 0991...............................................................................
34
Tabela 6
: Níveis séricos de colesterol total em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991, antes e após
tratamento.................................................................................................................
36
XIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Cascata simplificada do sistema renina angiotensina................................
13
Figura 2: Organograma dos grupos experimentais de acordo com o tipo de dieta e
tratamento recebidos...................................................................................................
22
Figura
3
:
Ganho de peso em hamsters alimentados com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...............................................
30
Figura 4: Fotos ilustrativas dos fígados de hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica................................................................................
33
Figura 5: Níveis séricos de colesterol total em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica................................................................................
35
Figura
6
:
Níveis séricos da fração HDL em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...........................
36
Figura
7
:
Níveis séricos do colesterol presente nas frações n-HDL em hamsters
alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com
AVE 0991...................................................................................................................
37
Figura
8
:
Razão entre a frações de colesterol n-HDL/HDL em hamsters
alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados por 30 dias ou
não com AVE 0991....................................................................................................
38
Figura
9
:
Os níveis séricos de triglicérides em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...........................
38
Figura 10: Atividade da enzima alanina aminotransferase (ALT) em hamsters
alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com
AVE 0991...................................................................................................................
39
Figura 11: Atividade da enzima catalase em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...........................
40
Figura 12: Atividade da enzima paraoxonase (PON) em hamsters alimentados
com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...........
41
Figura 1
3
:
Níveis de sulfidrilas totais em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...........................
41
Figura 14: Níveis basais de pressão arterial média em hamsters alimentados com
dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE
0991............................................................................................................................
42
XIV
Figura 15: Valores de freqüência cardíaca em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991...........................
43
Figura
16
: Fotomicrografia do fígado de hamsters...................................................
45
Figura 17: Fotomicrografia de válvula aórtica de hamster........................................ 46
Figura 18: Fotomicrografia da artéria aorta (arco aórtico) de hamster......................
47
Figura
19
: Fotomicrografia do coração de hamster...................................................
48
Silva, A.R. INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Durante o último século as doenças cardiovasculares (DCV) se tornaram a
principal causa de morbidade e mortalidade no mundo (Steffens, 2003), representando
metade de todas as mortes no mundo desenvolvido e 25% no mundo em
desenvolvimento (Murray & Lopez, 1996). Estima-se que metade dessas mortes seja
causada pela doença arterial coronariana (DAC) (Beaglehole, 1999). Espera-se que, em
2020, a DAC seja a principal causa de doença no mundo e a maior causa de morte nos
países em desenvolvimento (Okrainec et al., 2004). Estes dados também se aplicam ao
Brasil, onde as DCV representaram 32% de todos os óbitos nas capitais brasileiras em
1990 (Steffens, 2003).
Dentre os fatores de risco das DCV o tabagismo, níveis elevados da lipoproteína
de baixa densidade (LDL), baixos da lipoproteína de alta densidade (HDL), diabete
Mellitus, hipertensão arterial sistêmica, história familiar, obesidade, sedentarismo,
obesidade central, síndrome plurimetabólica e ingesta de álcool estão fortemente
relacionados com aterosclerose e suas manifestações clínicas (Polanczyk, 2005). O
estudo AFIRMAR (Acute Myocardial Infarction Risk Factor Assessment in Brazil),
desenvolvido em 104 hospitais de 51 cidades do Brasil, mostrou que a predisposição
para doença aterosclerótica no Brasil é muito semelhante àquela observada em países da
Europa e América do Norte (Piegas et al., 2003). A aterosclerose é considerada a
patologia básica para as diferentes manifestações da DCV, tais como DAC, doença
vascular periférica e doença cerobrovascular.
O International Clinical Epidemiology Network, INCLEN (1992), pesquisou a
prevalência dos fatores de risco da DAC em 7 países em desenvolvimento, incluindo o
Brasil. Este estudo mostrou que 19% dos participantes do Rio de Janeiro e São Paulo
apresentavam colesterol sérico elevado, sendo este considerado o principal fator de
risco da aterosclerose.
Estudos mostram que nos países em desenvolvimento estão ocorrendo mudanças
sócio-econômicas que contribuem para aumentar os fatores de risco das doenças
cardiovasculares. O aumento na expectativa de vida, transição nutricional e mudanças
Silva, A.R. INTRODUÇÃO
2
no estilo de vida, estão entre os fatores que ajudaram a aumentar o número de
casos de morbimortalidade por doenças cardiovasculares nesses países (Reddy et al.,
1998).
A aterosclerose é um processo inflamatório crônico do sistema cardiovascular que
se inicia com o transporte e retenção de lipoproteínas dentro da parede arterial (Berliner
et al., 1995), devido a uma maior permeabilidade aos constituintes do plasma decorrente
de injúria sustentada à parede arterial (Ross, 1986). As células da parede arterial
secretam produtos oxidativos de múltiplas vias que podem atingir a LDL bloqueada no
espaço subendotelial e iniciar uma oxidação lipídica (Witztum et al., 1991). Esses
produtos oxidativos podem ser metais como o cobre, lipoxigenase celular, tióis, ácido
hipocloroso, aldeídos e espécies reativas de oxigênio (EROs) (Steinbrecher et al., 1990;
Witztum et al., 1991 e Parthasarathy, 1994).
O acúmulo de LDL oxidado (oxLDL) contribui significativamente para o
recrutamento de monócitos circulantes (Quinn et al., 1987 e Berliner et al., 1990) que se
convertem em macrófagos que, por sua vez, contribuem para aumentar a oxidação das
LDLs (Rajavasisth et al., 1990).
A LDL oxidada passa a não ser mais reconhecida por seus receptores de
superfície, ocasionando uma captação celular de LDL por receptores “scavenger” e/ou
receptores de LDL oxidada, que não são regulados pelo conteúdo de colesterol celular,
acarretando um acúmulo de colesterol pelos macrófagos (Brown et al., 1990; Freeman
et al., 1990 e Sparrow et al., 1989). Como as células cheias de colesterol têm um
citoplasma espumoso são chamadas de células espumosas ou “foam cells”. Essas
células são a marca da lesão inicial da aterosclerose, a estria de gordura.
As células espumosas ativadas liberam uma variedade de moléculas quimiotáticas,
citocinas e fatores de crescimento. Mais linfócitos são atraídos para a lesão levando a
um pool de moléculas efetoras que expandem e perpetuam a resposta inflamatória
(Chilton, 2004). Mediadores inflamatórios aumentam a ligação das LDLs às células
endoteliais e a migração de células do músculo liso vascular (CMLV) para a lesão
(Ross, 1993), fazendo com que o processo se torne cíclico.
As CMLV começam a secretar proteínas de matriz extracelular, colágeno e
elastina em excesso formando uma placa fibrosa em torno do núcleo lipídico,
estabilizando a estrutura (Ross, 1993). Essa combinação de acúmulo de lipídeos e
Silva, A.R. INTRODUÇÃO
3
produção de colágeno resulta nas formas avançadas complexas de placas
ateroscleróticas (Kádár et al., 2001). Eventualmente, os macrófagos podem liberar
metaloproteinases que degradam a capa fibrosa tornando a placa vulnerável à ruptura
(Chilton, 2004), que no coração leva ao infarto agudo do miocárdio e morte
coronariana.
Diversos estudos têm mostrado a participação do sistema renina angiotensina
(SRA) na progressão da aterosclerose focalizando principalmente o bloqueio desse
sistema, seja através de inibidores da ECA ou por bloqueadores do receptor AT
1
(Strawn et al., 2000; Miyazaki et al., 1999; Uehara et al., 2002 e Kowala et al., 1998).
A angiotensina II (Ang II), importante peptídeo do SRA, tem um papel crucial na
regulação da resposta inflamatória vascular por ativar o recrutamento de células
inflamatórias (Kim et al., 1996, Strawn et al., 1999 e Ferrario 2006). Além disso, esse
peptídeo modula a contração, regula o crescimento celular, apoptose e diferenciação,
influencia a migração celular e deposição de matriz (Touyz et al., 2002), além de
aumentar o estresse oxidativo (Vaughan, 2000). Este conjunto de atividades faz da Ang
II um peptídeo aterogênico.
Pesquisas indicam que, além da Ang II, outros derivados peptídicos
angiotensinérgicos também são mediadores finais do SRA, sendo a angiotensina-(1-7)
(Ang-(1-7)) um desses peptídeos e alvo de inúmeros estudos, especialmente por
desempenhar ações mais seletivas que a Ang II e por poder ser formada por uma via
independente da ECA (Ferrario et al., 1990). A Ang-(1-7) apresenta-se como o mais
pleiotrópico dos metabólitos derivados da Ang II, por exercer efeitos que podem ser
idênticos, opostos ou distintos da Ang II (Ardaillou, 1997).
A Ang-(1-7), ao contrário da Ang II, age como agente antiproliferativo em células
da musculatura lisa vascular (CMLV), reduz a formação de neoíntima (Strawn et al.,
1999 e Tallant et al., 1999), tem ação antitrombótica, reduz a adesão plaquetária
(Kucharewicz et al., 2000), e bloqueia os efeitos pró-oxidantes da Ang II, reduzindo a
produção do ânion superóxido (Polizio et al., 2007). Considerando essas ações
contraregulatórias da Ang-(1-7) em relação àquelas da Ang II, e sendo este último um
peptídeo aterogênico, pode se especular uma ação antiaterogênica atribuída à Ang-(1-7).
O grande número de evidências associadas às ações cardiovasculares da Ang-(1-7) em
Silva, A.R. INTRODUÇÃO
4
oposição aos efeitos atribuídos à Ang II, faz deste peptídeo um potencial alvo para o
desenvolvimento de fármacos associados às doenças cardiovasculares.
Um importante avanço nos estudos relacionados às ações da Ang-(1-7) e suas
possíveis aplicações farmacológicas foi a descoberta recente do seu análogo AVE 0991
(Wiemer et al., 2002). Este composto é um agonista do receptor Mas da Ang-(1-7) não-
peptídico e ativo oralmente mimetizando os efeitos dessa angiotensina em muitos
tecidos (Santos et al., 2006), tornando-se dessa forma, um candidato promissor nas
terapias de doenças cardiovasculares.
Neste trabalho, utilizamos o AVE 0991 para elucidar as ações da ANG-(1-7) sobre
o perfil de lipídeos, estresse oxidativo, parâmetros cardiovasculares e sobre a formação
de lesões ateroscleróticas em hamsters hipercolesterolêmicos.
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Metabolismo das lipoproteínas
O colesterol é um lipídio que está presente no organismo animal, tanto nos tecidos
como nas lipoproteínas plasmáticas, seja sob a forma livre ou combinada (com ácidos
graxos) como éster de colesterol (Brody, 1993).
Sua importância fisiológica reside no amplo papel que desempenha no organismo
animal, como precursor de sais biliares e de hormônios glicocorticóides e
mineralocorticóides, na síntese de hormônios sexuais e na formação de vitamina D, e
principalmente como elemento estrutural, nas membranas celulares (Brody, 1993). O
colesterol está presente em diversos tipos de alimentos, podendo ser ingerido na dieta,
mas pode também ser sintetizado no fígado a partir de precursores mais simples (Nelson
e Cox, 2006).
A homeostase do colesterol é mantida pelo balanço da absorção do colesterol
intestinal e síntese do colesterol endógeno (Ros, 2000). O controle no metabolismo do
colesterol é de importância chave na manutenção da saúde do sistema cardiovascular.
Portanto, um desequilíbrio nas taxas de colesterol plasmático pode ser prejudicial ao
sistema cardiovascular, uma vez que depósitos anormais de colesterol nos tecidos estão
associados a várias condições, incluindo aterosclerose e diabetes mellitus (Brody,
1993).
O colesterol, os ésteres de colesterol, assim como os triacilgliceróis e
fosfolipídios, são essencialmente insolúveis em água (Nelson e Cox, 2006). Eles são
transportados pelo plasma sangüíneo na forma de lipoproteínas plasmáticas, que são
complexos moleculares de proteínas transportadoras específicas chamadas de
apolipoproteínas (apo) com combinações variadas de fosfolipídios, colesterol, ésteres de
colesterol e triacilgliceróis (Nelson e Cox, 2006). As lipoproteínas são complexos
esféricos com lipídios hidrofóbicos no centro e as cadeias laterais hidrofílicas dos
aminoácidos das proteínas na superfície (Nelson e Cox, 2006). Cada classe de
lipoproteína tem uma função específica, determinada por seu lugar de síntese,
composição lipídica e conteúdo de apolipoproteína (Nelson e Cox, 2006).
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
6
Os lipídios da dieta deixam as células intestinais conjugados em quilomícrons
através de um processo que requer a apo B-48 (Kwiterovich, 2000). Os trigliceróis no
núcleo dos quilomícrons são hidrolisados em ácidos graxos livres e glicerol pela lipase
lipoprotéica com a apo C-II como um cofator, produzindo um quilomícron
remanescente pequeno (Kwiterovich, 2000). Os remanescentes dos quilomícrons,
privados da maior parte de seus triglicerídeos, mas ainda contendo colesterol, apo E e
apo B-48, movem-se da corrente sanguínea para o fígado. No fígado, existem receptores
que reconhecem a apo E e essa ligação promove absorção dos quilomícrons por
endocitose (Nelson e Cox, 2006).
Um atraso na remoção dos quilomícrons remanescentes pode promover a
aterogênese (Kwiterovich, 2000). Estudos mostram que pacientes com doença arterial
coronariana possuem elevação dos níveis de triglicérides pós-prandial e um retardo no
retorno dos triglicérides aos níveis basais, devido a uma lentidão na remoção das
partículas dos quilomícrons remanescentes (Patsch et al., 1992).
Quando a dieta contém mais ácidos graxos que a quantidade necessária como
combustível, estes são convertidos em triacilgliceróis no fígado e unidos a
apolipoproteínas específicas para formar lipoproteínas de muito baixa densidade, as
VLDL (Very-Low-Density Lipoprotein) (Nelson e Cox, 2006). Essas transportam
triacilglicerol do fígado para os tecidos periféricos.
As VLDL são sintetizadas e secretadas do fígado em um processo que requer a
apo B-100 (Kwiterovich, 2000). No plasma, o triacilglicerol na VLDL é clivado em
ácidos graxos livres e glicerol pela lipase lipoprotéica e seu cofator, a apo C-2
(Kwiterovich, 2000). A perda de triacilgliceróis converte algumas VLDL em VLDL
remanescentes, que são também chamadas de lipoproteínas de densidade intermediária
– as IDL (Intermediate Density Lipoprotein) (Nelson e Cox, 2006). Elas são uma classe
heterogênea de partículas que normalmente não se acumulam no plasma (Lichtenstein et
al., 1996).
Algumas das partículas IDL são removidas por interações da apo E com o receptor
de LDL na superfície do fígado, ou os triglicerídeos das IDL podem ser hidrolisados
pela lipase hepática para produzir as lipoproteínas de baixa densidade (LDL, Low-
Density Lipoprotein) (Kwiterovich, 2000). As LDL transportam o colesterol para os
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
7
tecidos periféricos (extra-hepáticos), que possuem receptores de superfície específicos
para ela através da interação com a apo B-100 (Nelson e Cox, 2006).
Se a LDL é oxidada, ela pode ser captada por macrófagos através de receptores
scavenger, CD 36 e SR-A, na superfície do macrófago (Kwiterovich, 2000), levando ao
desenvolvimento das células espumosas que iniciam a formação de lesões
ateroscleróticas. O Framinghan Study (Gordon et al., 1977) reportou o nível sérico de
LDL como melhor preditor da doença arterial coronariana do que o nível de colesterol
total (CT) tanto em homens quanto em mulheres.
Outro excelente indicador é a relação inversa entre a lipoproteína de alta
densidade (HDL, High-Density Lipoprotein) e o risco de doença arterial coronariana.
As HDLs são uma subclasse de lipoproteínas originárias do intestino e fígado
(Lichtenstein et al., 1996). Sua principal proteína é a apo A-I e apo A-II, embora as
HDLs também contenham apo A-IV, apo A-V, apo E, paraoxanase (PON), entre outras
(O’Connell & Genest, 2001).
O HDL recebe o colesterol dos remanescentes de quilomícrons e VLDL e os
transporta para o fígado, onde o colesterol é liberado e parte dele é convertida em sais
biliares (Nelson e Cox, 2006). Esse processo conhecido como transporte reverso do
colesterol (TRC) protege o organismo contra aumentos das LDLs e consequentemente
do seu acúmulo na parede vascular. Em adição ao TRC, a HDL também tem efeito
inibitório contra a oxidação lipídica e diminui a resposta inflamatória (Negre-Salvayre
et al., 2006). Enzimas associadas à HDL estão envolvidas na função antioxidante da
HDL, entre elas a PON (Mackness et al., 1991), lecitina- colesterol aciltransferase
(LCAT), fosfolipase-D, proteases, entre outras (Negre-Salvayre et al., 2006).
Sendo assim, a dislipidemia, condição na qual há concentrações anormais de
lipídios ou lipoproteínas no sangue, é um fator de risco importante para o
desenvolvimento de complicações da aterosclerose. Modelos de hipercolesterolemia,
dessa forma, se tornam importantes ferramentas em estudos sobre os efeitos de
substâncias sintéticas no tratamento das doenças cardiovasculares.
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
8
2.2. Aterosclerose
A aterosclerose é um processo inflamatório crônico que, geralmente, inicia-se na
infância e vai apresentar manifestações clínicas na idade adulta
,
sendo altamente
prevalente em homens e mulheres. As complicações trombo-oclusivas dessa doença,
incluindo acidente vascular cerebral e infarto, são as principais causas de morbidade e
mortalidade em quase todo o mundo (Goldschmidt-Clermont et al., 2005). Essa
complexa patogênese não pode ser atribuída a um simples fator. Ela parece ser
multifatorial com fatores ambientais, alimentares, hemodinâmicos, genéticos dentre
outros, fazendo parte da gênese e desenvolvimento desta patologia (Ross et al., 1993 e
Schmitz et al., 1998).
A aterosclerose é uma doença que afeta primariamente a túnica íntima das artérias
de grande e médio calibres caracterizada pelo depósito e acúmulo de lípides, pela
proliferação de fibras colágenas e pela frequente ocorrência de calcificação nas áreas
afetadas, nas fases mais tardias (Pasqualucci et al., 1999)..
O processo aterosclerótico se desenvolve como resultado de injúria sustentada à
parede arterial,
hipótese proposta por Ross et al. (1986). Diversos fatores podem levar a
injúria vascular incluindo agentes infecciosos, pressão sanguínea elevada, mediadores
inflamatórios e eventos de glicação, todos envolvendo estresse oxidativo (Basta et al.,
2002 e Gattone et al., 2001). Segundo essa hipótese, deve ser salientado que não há
necessidade que ocorra uma lesão de endotélio evidente, como uma desnudação de
células endoteliais. Alterações funcionais do endotélio, tais como aumento de
permeabilidade, liberação de substâncias vasoativas e fatores de crescimento, alteração
nas propriedades antitrombogênicas da superfície endotelial e estímulo das propriedades
pró-coagulantes do endotélio, já seriam capazes de desencadear as lesões
ateroscleróticas (Ross et al., 1986).
A principal causa de agressão vascular é o transporte e retenção de lipoproteínas
de baixa densidade (LDL) para o interior da parede arterial (Berliner et al., 1995),
devido a maior permeabilidade aos constituintes do plasma, como citado anteriormente.
A injúria arterial, em adição à resposta local, aumenta uma profunda resposta sistêmica
que envolve uma cascata de eventos celulares e moleculares que promovem o reparo da
parede do vaso (Goldschmidt-Clermont et al., 2005). Uma falha nesse processo de
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
9
reparo em resposta a sinais inflamatórios promove a aterogênese e ainda cria um
feedback positivo que propaga o dano vascular (Goldschmidt-Clermont et al., 2005).
As alterações mais precoces causadas pela aterosclerose na parede arterial já são,
geralmente, encontradas em crianças e assumem a forma denominada de estria
gordurosa. Essa se inicia com o transporte de lipoproteínas para dentro da parede do
vaso com subseqüente bloqueio dessas em uma malha fibrilar tridimensional do espaço
subentodelial (Nivelstein-Post et al., 1991). As células da parede arterial secretam
produtos oxidativos de múltiplas vias que podem atingir a LDL bloqueada no espaço
subendotelial e iniciar uma oxidação lipídica (Witztum et al., 1991). Esses produtos
oxidativos podem ser metais como o cobre, lipoxigenase celular, tióis, ácido
hipocloroso, aldeídos e espécies reativas de oxigênio (EROs) (Steinbrecher et al., 1990;
Witztum et al., 1991 e Parthasarathy, 1994).
O acúmulo de LDL oxidado (oxLDL) contribui significativamente para o
recrutamento de monócitos circulantes (Quinn et al., 1987 e Berliner et al., 1990). O
tratamento de células endoteliais, in vitro, com LDL minimamente oxidada (MM-LDL)
ativa um fator de trancrição NFκB-like (Parhami et al., 1993), o qual induz uma série de
genes característicos da resposta inflamatória crônica. Dentre os genes induzidos pelo
NFκB que estão aumentados pela oxLDL incluem o da proteína quimiotática de
monócitos 1 (MCP-1) (Cushing et al., 1990), do fator estimulante de colônia de
monócitos (M-CSF) (Rajavasisth et al., 1990) e proteína Gro (Shwartz et al., 1994). Os
monócitos recrutados para a lesão são ativados pelo M-CSF e se convertem em
macrófagos que, por sua vez, contribuem para aumentar a oxidação das LDLs
(Rajavasisth et al., 1990).
Durante o processo oxidativo ocorre uma cadeia de reações que modificam a
estrutura da apoproteína B (apoB), o epitopo de reconhecimento da LDL pelos
receptores de LDL (Witztum et al., 1991). Essas modificações da porção protéica das
LDLs levam a uma diminuição no reconhecimento pelos receptores de LDL. Isso
acarreta em uma captação celular de LDL por receptores “scavenger” e/ou receptores de
LDL oxidada, que não são regulados pelo conteúdo de colesterol celular, levando a um
acúmulo de colesterol pelos macrófagos (Brown et al., 1990; Freeman et al., 1990 e
Sparrow et al., 1989). Como as células cheias de colesterol têm um citoplasma
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
10
espumoso são chamadas de células espumosas ou “foam cells”. Tanto macrófagos como
células musculares lisas na lesão vascular acumulam colesterol para formar células
espumosas (Wolfbauer et al., 1986). Essas células são a marca da lesão inicial da
aterosclerose, a estria de gordura.
As células espumosas ativadas liberam uma variedade de moléculas quimiotáticas,
citocinas e fatores de crescimento (Chilton, 2004). Dessa forma, mais linfócitos são
atraídos para a lesão ativando um conjunto de moléculas efetoras que expandem e
perpetuam a resposta inflamatória (Chilton, 2004). Monócitos /macrófagos são potentes
fontes de fator de crescimento para células do músculo liso vascular (CMLV) e de fator
de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) (Ross, 1993), explicando em parte, a
migração de CMLV que ocorre dentro da lesão. A crescente produção de mediadores
inflamatórios aumentam a ligação das LDLs às células endoteliais e a migração de
CMLV para a lesão, fazendo com que o processo se torne cíclico (Chilton, 2004).
As CMLV começam a secretar proteínas de matriz extracelular, colágeno e
elastina em excesso formando uma placa fibrosa em torno do núcleo lipídico,
estabilizando a estrutura (Ross, 1993). Essa combinação de acúmulo de lipídeos e
produção de colágeno resulta nas formas avançadas complexas de placas
ateroscleróticas (Kádár et al., 2001). Eventualmente, os macrófagos podem liberar
metaloproteinases que degradam a capa fibrosa tornando a placa vulnerável à ruptura
(Chilton, 2004), levando, no coração ao infarto agudo do miocárdio e morte
coronariana.
2.2.1. Classificação e histopatologia das lesões ateroscleróticas
A American Heart Association padronizou e classificou os vários estágios das
lesões ateroscleróticas. As lesões do tipo I ou “lesões iniciais” consistem dos primeiros
depósitos lipídicos detectados química e microscopicamente na íntima e as reações
celulares relacionadas a tais depósitos (Stary et al., 1994). As mudanças histológicas
iniciais na íntima humana são mínimas (Stary et al., 1994). Podem-se observar
pequenos grupos isolados de macrófagos contendo gotas lipídicas (macrófagos-células
espumosas) que se formam (Stary, 1987). Tanto macrófagos como as células
musculares lisas preenchidas de gordura assumem, nas preparações histológicas
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
11
convencionais coradas pela hematoxilina e eosina, o aspecto de células espumosas,
vacuolizadas, uma vez que o conteúdo lipídico dessas células é extraído durante o
processamento histológico (Pasqualucci et al., 1999).
As lesões do tipo II são aquelas referidas geralmente como estrias gordurosas
(Stary et al., 1994). Essas lesões podem ser visíveis a olho nu e consistem
primariamente de células espumosas estratificadas na camada adjacente e não somente
em grupos isolados de poucas células como ocorre nas lesões do tipo I (Stary et al.,
1994). Além de macrófagos, células musculares lisas vasculares também podem conter
gotas lipídicas e ainda gotas de lipídio dispersas podem ser encontradas neste tipo de
lesões (Stary et al., 1994).
Macroscopicamente, a estria gordurosa consiste de uma faixa disposta,
geralmente, ao longo do maior eixo do vaso, amarelada devido a grande quantidade de
lipídio presente no citoplasma das células espumosas (Lupu et al., 1987). Nas células
preenchidas com gotículas de lípides que se apresentam como vacúolos vazios, nas
preparações embebidas em parafina, esses vacúolos são circundados por um fino halo
de citoplasma. A análise pela microscopia eletrônica pode permitir a identificação de
algumas dessas células, entretanto a identificação da origem de um grande número delas
permanece difícil ou mesmo impossível, usando-se as técnicas rotineiras de coloração
tecidual (Pasqualucci et al., 1999). O termo “lesões iniciais” é utilizado somente para as
lesões dos tipos I e II (Stary et al., 1994).
O tipo III, ou preateroma, representa o estágio intermediário entre as lesões do
tipo II e as lesões avançadas ou ateromas (Stary et al., 1994). Essas lesões possuem
maior quantidade de gotas lipídicas extracelulares encontradas logo abaixo da camada
de macrófagos e células espumosas, substituindo proteoglicanos e fibras da matrix
extracelular (Stary et al., 1994).
Na fase IV, a primeira das lesões avançadas, ocorre um acúmulo de lipídio
extracelular, conhecido como núcleo lipídico, ocupando uma região bem definida da
íntima (Stary et al., 1995). Nas lesões do tipo IV um aumento de tecido fibroso não é
característico, e complicações tais como trombose e lesões de superfície estão ausentes
(Stary et al., 1995). O núcleo lipídico causa uma severa desorganização da íntima (Stary
et al., 1995). Essas lesões são encontradas na mesma região onde existe um
espessamento excêntrico da íntima e por isso são consideradas lesões excêntricas. As
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
12
CMLVs e matrix extracelular da íntima são dispersos e substituídos por acumulados de
partículas de lipídio extracelular (Stary et al., 1995). As organelas de algumas CMLVs
podem ser calcificadas, e partículas de cálcio são encontradas dentro de núcleos
lipídicos (Stary et al., 1995). As lesões do tipo IV são também conhecidas como
ateroma (Stary et al., 1995).
Quando esse núcleo lipídico sofre um aumento de um proeminente novo tecido
fibroso (principalmente colágeno), a lesão é então chamada de tipo V (Stary et al.,
1995). Quando o novo tecido é parte de uma lesão do tipo IV, este tipo de lesão pode
ser referido como fibroateroma ou lesão do tipo Va. Algumas lesões do tipo V são
largamente calcificadas (tipo Vb), e algumas consistem principalmente de tecido
conjuntivo fibroso e pouca ou nenhuma acumulação lipídica (tipo Vc) (Stary et al.,
1995).
As placas fibrosas, macroscopicamente, apresentam coloração esbranquiçada e
são, comumente, sobrelevadas. Em muitos casos, elas fazem protrusão para a luz da
artéria e são suficientemente grandes para comprometer o fluxo do sangue e ainda
muitas vezes coalescem, formando lesões maiores (Pasqualucci et al., 1999).
As lesões do tipo VI são conhecidas como lesões complicadas e se formam a partir
de uma característica adicional às lesões do tipo IV ou V (Stary et al., 1995). Tais
características adicionais podem ser uma ruptura ou lesão de superfície, hematoma ou
hemorragia, além de depósitos trombóticos (Stary et al., 1995).
2.3. Sistema Renina – Angiotensina
O sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido o centro de intensas atividades de
pesquisa desde a descoberta da renina pelo fisiologista Finlandês Robert Tigerstedt, há
mais de 100 anos. Embora classicamente o SRA seja considerado como um sistema
endócrino responsável pela correção da hipotensão aguda através de mudanças na
resistência periférica e homeostase de eletrólitos, atualmente, este sistema é reconhecido
como sendo importante no controle a curto, médio e longo prazo da pressão arterial,
progressão da nefropatia diabética e desenvolvimento de cardiomiopatia hipertensiva, e
mais recentemente, tem sido envolvido como um fator modulador no controle do
desenvolvimento (ou pregressão) da aterosclerose (Brasier et al., 2002).
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
13
O processamento das angiotensinas (figura 1) se inicia com a hidrólise do
angiotensinogênio (um α
2
globulina circulante produzido no fígado) pela renina para
formar o decapeptídeo angiotensina-I (Ang I) (Keidar et al., 2007). A Ang I é
convertida pela enzima conversora de angiotensina (ECA) em angiotensina-II (Ang II)
pela remoção de dois aminoácidos C-terminais (Das, 2005). Em coração humano,
entretanto, a maior parte da conversão da Ang I em Ang II é feita em uma via
alternativa, pela enzima quimase (Urata et al., 1990).
Figura 1. Cascata simplificada do sistema renina angiotensina focando a via de formação da Ang-(1-7).
ACE, enzima conversora de angiotensina; AT
1
, receptor de Ang II do tipo 1; AT
2
, receptor de Ang II do
tipo 2; A779, antagonista Mas; D-Pro
7
-Ang-(1-7), antagonista Mas; G, proteína G; Mas, receptor Mas de
Ang-(1-7); NEP, endopeptidase neutra; PCP, prolilcarboxipetidase; PD 123,319, antagonista de AT
2
;
PEP, prolilendopeptidase. Modificado de Santos et al. (2006).
A Ang II, principal peptídeo do SRA, exerce suas diversas atividades biológicas
através da ligação em um dos dois tipos de receptores conhecidos (Keidar et al., 2007).
O receptor do tipo 1 (AT
1
) é altamente expressado em adultos e tem importante papel
nas doenças cardiovasculares (Keidar et al., 2007). O receptor AT
1
medeia a maior parte
dos usualmente associados com a Ang II, tais como vasoconstrição, proliferação,
inflamação, coagulação, deposição de matrix, estimulação da liberação de aldosterona e
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
14
da atividade do sistema nervoso simpático (de Gasparo et al., 2000). Entretanto, a
ligação da Ang II ao receptor do tipo 2 (AT
2
) possui ações contrárias aos efeitos
mediados pelo receptor AT
1
, tanto a curto como a longo prazo (de Gasparo et al., 2000),
provendo um papel protetor.
Além da Ang II, outros Ang-peptídeos, tais como angiotensina IV [Ang IV ou
Ang-(3-8)] e angiotensina 1-7 [Ang-(1-7)], também têm importantes atividades
biológicas (Wessel et al., 2007). A Ang-(1-7), especialmente, tem se tornado uma
angiotensina de interesse por ser considerado o mais pleiotrópico dos metabólitos
derivados da Ang II, por exercer efeitos que podem ser idênticos, opostos ou distintos
ao da Ang II (Ardaillou, 1997).
A Ang-(1-7) pode ser formada diretamente da Ang I ou Ang II e indiretamente da
Ang I tendo como passo intermediário a formação da angiotensina-(1-9) (Ang-(1-9))
(Santos et al., 2000). A remoção da fenilalanina do C-terminal da Ang II resulta na
formação da Ang-(1-7). Essa conversão é eficientemente catalisada pelo homólogo da
ECA recentemente descoberto, a ECA2 (Vickers et al., 2002). Além da ECA2, prolil-
endopetidase e prolil-carboxipeptidase podem gerar Ang-(1-7) diretamente da Ang II
(Santos et al., 2006). Em outra via, a conversão direta da Ang I em Ang-(1-7) pode ser
mediada por diversas enzimas tais como: prolil-endopeptidase e endopeptidase neutra
(neprilisina) através da hidrólise da ponte Pro
7
-Phe
8
(Rice et al., 2004 e Stanziola et al.,
1999). Outra via, embora cineticamente menos eficiente (Rice et al., 2004), envolve
papéis alternativos para a ECA e ECA2. A Ang I é primeiro hidrolizada pela ECA2 para
formar Ang-(1-9) (Donoghue et al., 2000), um peptídeo sem atividade biológica
conhecida, e então convertida pela ECA ou endopeptidase neutra em Ang-(1-7) (Rice et
al., 2004). A geração de Ang-(1-7) através de uma via secundária à formação de Ang II
pode ser benéfica, uma vez que esses dois peptídeos têm ações antagônicas (Keidar et
al., 2007).
O heptapeptídeo Ang-(1-7), como a Ang II, estimula a liberação de vasopressina
no hipotálamo de ratos (Schiavone et al., 1988) e facilita a transmissão noradrenérgica
(Gironacci et al., 1994). Ao contrário da Ang II, a Ang-(1-7) não é vasopressora e não
estimula a dipsinogênese ou liberação de aldosterona (Ferrario et al., 1997). A ligação
da Ang-(1-7) às células endoteliais induz vasodilatação por estimular a produção de
óxido nítrico (NO), prostaglandinas ou fatores de relaxamento derivados do endotélio
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
15
(Ferreira et al., 2005 e Keidar et al., 2007), dependendo da espécie e do leito vascular.
Em adição, ela estimula a vasodilatação induzida por bradicinina (Lima et al., 1997).
Em ratos, a infusão em fmol dessa angiotensina reduz a resistência vascular periférica
(Sampaio et al., 2003). O heptapeptídeo também está relacionado com o controle do
balanço hidroeletrolítico (Santos & Campagnole-Santos, 1994) modulando a excreção
de água e sódio (Dellipizzi et al., 1994).
Rocks et al. (1999) mostraram que a Ang-(1-7) é um antagonista das respostas
vasculares da Ang II também em artérias humanas e um inibidor da ECA em plasma e
tecidos cardíaco e vascular humanos.
Recentemente, Santos e cols. (2003) reportaram que a Ang-(1-7) é um ligante
endógeno do receptor acoplado à proteína G Mas. O receptor Mas, caracterizado como
um receptor oncogene, era conhecido por influenciar a regulação fetal da diferenciação
celular e crescimento (Hanley et al., 1990). Originalmente, o receptor Mas foi
considerado por ser o primeiro receptor de Ang II isolado de tecidos (Jackson et al.,
1988), porém estudos posteriores desproveram esta participação.
Um dos principais avanços no entendimento do papel patofisiológico da Ang-(1-7)
está relatado aos seus efeitos cardíacos. Uma resposta vasodilatadora em artérias
coronárias de cães e porcos, aortas de ratos e arteríolas renais de coelhos foi atribuída à
Ang-(1-7) (Le Tran et al., 1997, Ren et al., 1998 e Sampaio et al., 2003). Porém,
dependendo da dose e do leito vascular, ela pode também, produzir vasoconstrição
(Osei et al., 1993). Em adição, a Ang-(1-7) inibe, em humanos, a ECA plasmática, atrial
e arterial, e antagoniza a contração arterial induzida pela Ang II (Rocks et al., 1999)
O grande número de evidências associadas às ações cardiovasculares da Ang-(1-7)
em oposição aos efeitos atribuídos à Ang II, faz deste peptídeo um potencial alvo para o
desenvolvimento de fármacos associados às doenças cardiovasculares.
2.3.1. SRA e aterosclerose
Estudos em vários modelos animais têm mostrado que o bloqueio das ações da
Ang II usando inibidores da ECA (Miyazaki et al., 1999 e Grothusen et al., 2005) ou
bloqueadores de AT1 (Strawn et al., 2000; Grothusen et al., 2005; Miyazaki et al., 1999
e Ferrario, 2002) podem ser efetivos em evitar a progressão da aterosclerose.
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
16
A aterosclerose é uma reação inflamatória crônica e diversos estudos
demonstraram que o SRA está envolvido em todos os estágios desse processo. A Ang II
tem um papel crucial na regulação da resposta inflamatória vascular por ativar o
recrutamento de células inflamatórias (Kim et al., 1996, Strawn et al., 1999 e Ferrario
2006). Estudos mostram que essa angiotensina aumenta a expressão de VCAM-1,
ICAM-1 e P-selectina dentro da parede vascular e subsequentemente na circulação
(Graninger et al., 2004). Além disso, a Ang II também aumenta a expressão de MCP-1,
que facilita o movimento de monócitos e células T dentro do tecido vascular lesado
(Ferrario, 2006). Infusão de Ang II eleva a síntese e níveis de TNF-α, IL-6, e
cicloxigenase-2, os quais agem aumentando a resposta inflamatória (Ferrario, 2006).
Em adição, células inflamatórias podem produzir Ang II, resultando em uma resposta de
feedback positivo local, dessa forma perpetuando o ciclo inflamatório (Ferrario, 2006).
Diversos estudos mostraram que a Ang II causa um aumento na liberação de
espécies reativas de oxigênio (EROs), incluindo peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) que
participam da inflamação (Das, 2005). A produção de EROs induzida por Ang II,
principalmente pela ativação da NADPH oxidase (Girendling et al., 1994), resulta na
inativação química do óxido nítrico (NO), impedindo sua habilidade vasodilatadora e de
anti-agregação plaquetária (Das, 2005). O estresse oxidativo ativado pela Ang II pode
contribuir para aumentar a peroxidação lipídica das LDLs (Keidar et al., 1997),
contribuindo para o acúmulo de lipídios na placa aterosclerótica. Outro efeito parácrino
de EROs é a regulação da atividade das metaloproteinases pro-MMP-9 e pro-MMP-2
(Rajagopalan et al., 1996), importantes na estabilidade e ruptura da placa (Brasier et al.,
2002).
Nos estágios finais da aterosclerose, a Ang II estimula o acúmulo de matrix
extracelular diretamente e indiretamente por estimular a produção de TGF-β (Omura et
al., 1994). Além disso, ela também promove a produção de inibidor da ativação do
plasminogênio-1, o que leva a uma redução no sistema fibrinolítico e provavelmente
contribui para a deposição de fibrina e fibrinogênio (Vaughan et al., 1995).
A Ang-(1-7), em contraste a Ang II, tem ação antiproliferativa em células da
musculatura lisa vascular (CMLV) e reduz a formação de neoíntima (Strawn et al., 1999
e Tallant et al., 1999). Em infusão contínua, esse peptídeo tem ação antitrombótica
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
17
através da liberação de NO e prostaglandina (PGL2) e, in vitro, reduz a adesão
plaquetária (Kucharewicz et al., 2000). Além disso, a Ang-(1-7) bloqueia os efeitos pró-
oxidantes da Ang II, reduzindo a produção do ânion superóxido (Polizio et al., 2007).
Considerando essas ações vasculares contraregulatórias da Ang-(1-7) em relação
àquelas da Ang II e sendo esta última uma molécula aterogênica, pode se especular uma
ação antiaterogênica atribuída à Ang-(1-7).
Diversos estudos têm mostrado a participação do SRA na progressão da
aterosclerose focalizando principalmente o bloqueio desse sistema, seja através de
inibidores da ECA ou por bloqueadores do receptor AT
1
(Strawn et al., 2000; Miyazaki
et al., 1999; Uehara et al., 2002 e Kowala et al., 1998). Esses trabalhos confirmam a
participação efetiva da Ang II em todas as fases do desenvolvimento da aterosclerose,
mas em sua maioria, não se atentam para o papel dos demais peptídeos
angiotensinérgicos ativos tais como a Ang-(1-7). Como citado anteriormente, a Ang-(1-
7), agindo em seu receptor Mas, possui diversas ações contrarregulatórias às da Ang II.
Dessa forma, é plausível se especular uma ação contrária efetiva da Ang-(1-7) no
desenvolvimento das lesões ateroscleróticas.
2.4. AVE 0991
Um importante avanço nos estudos relacionados às ações da Ang-(1-7) e suas
possíveis aplicações farmacológicas foi a descoberta recente do seu análogo AVE 0991
(Wiemer et al., 2002). Este composto é um agonista do receptor Mas da Ang-(1-7) não-
peptídico e ativo oralmente que mimetiza os efeitos dessa angiotensina em muitos
tecidos (Santos et al., 2006).
Wiemer e cols. (2002) observaram que o AVE 0991 compete pelos sítios de
ligação da Ang-(1-7) e libera óxido nítrico/superóxido com perfil similar ao da Ang-(1-
7). Um efeito antidiurético foi atribuído ao AVE 0991, possivelmente através da ligação
no receptor Mas, em estudos recentes realizados por Pinheiro e cols. (2004). Em anéis
aórticos isolados de murinos esse agonista apresenta um efeito vasodilatador
dependente da concentração (Lemos et al., 2005). Em adição, uma potenciação da
vasodilatação induzida por acetilcolina tem sido atribuída ao AVE 0991 em ratos Wistar
(Faria-Silva et al., 2005). Estudos recentes também mostraram prevenção dos danos em
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
18
órgãos-alvo induzidos por tratamento com L-NAME em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) (Benter et al., 2006). Mais recentemente, Ferreira et al. (2007)
mostraram que o AVE 0991 tem efeito cardioprotetor sobre o remodelamento cardíaco
induzido por isoproterenol.
Compostos não peptídicos são importantes na terapia farmacológica devido à
resistência a enzimas proteolíticas e com isso, possibilidade de administração oral. Com
a descoberta da ECA2 e das ações do eixo ECA2 – Ang-(1-7) – Mas, substâncias que
sejam capazes de interferir nesse eixo podem aparecer como novas classes de drogas
para o tratamento de doenças renais e cardiovasculares (Santos et al., 2006). Dessa
forma, o AVE 0991 se torna um candidato promissor nas terapias de doenças
cardiovasculares.
2.5. O hamster como modelo no estudo de hipercolesterolemia e
aterosclerose
A maioria das informações existentes que basearam nosso entendimento sobre o
processo aterosclerótico tem sido adquirida através de estudos em animais. Neste
contexto, vários modelos animais têm sido usados no estudo da hipercolesterolemia e
aterosclerose. Ratos são resistentes ao desenvolvimento de lesões ateroscleróticas,
mesmo com dietas ricas em colesterol. Esse fato pode ser explicado pela ausência, nesse
modelo, da proteína de transferência do éster de colesterol (CETP), e pela HDL ser a
principal proteína tranportadora de colesterol (Moghadasian et al., 2002). Coelhos têm
sido utilizados como modelo de aterosclerose pelo rápido desenvolvimento de lesões
aórtica (Daley et al., 1994). Porém eles são totalmente vegetarianos e possuem
metabolismo do colesterol diferentes dos humanos (Nistor et al., 1987).
O hamster (Mesocricetus auratus) tem sido amplamente empregado em estudos
sobre aterosclerose devido a inúmeras características que fazem desse animal um
excelente modelo para essa patologia (Pien et al., 2002). Eles são onívoros, têm baixo
custo para aquisição e manutenção, são susceptíveis ao desenvolvimento das lesões
ateroscleróticas (Nistor et al., 1987), além de possuírem composição celular e não-
celular de cada estágio da lesão similares aos humanos (Pien et al., 2002). Hamsters,
como humanos, possuem limitada capacidade de síntese de colesterol pelo fígado
Silva, A.R. REVISÃO DA LITERATURA
19
(Spady & Dietschy 1988 e Spady et al.; 1985), por isso os hepatócitos de ambos não são
prontamente adaptados a alterações no fluxo de colesterol, e dessa forma, uma mudança
na dieta altera a taxa de transporte pela LDL. Além disso, hamsters, particularmente a
raça F
1
B, alimentados com uma dieta rica em colesterol e lipídios apresentam elevação
dos níveis de colesterol primariamente por aumentar as frações LDL e VLDL (Spady et
al., 1985). Hamsters são animais considerados HDL, ou seja, possuem níveis elevados
dessa fração, mas a despeito disso, a maioria dos estudos considera esse animal um
excelente modelo para estudos sobre a aterosclerose (Bravo et al., 1993; Sicart et al.,
1984 e Goulinet & Chapman, 1993).
As lesões ateroscleróticas em hamsters têm sido produzidas com dieta comercial
suplementada com diferentes níveis de colesterol e gorduras (Pien et al.; 2002 e Wilson
et al.; 1999). O aparecimento de células em espuma e estrias de gordura na íntima do
arco aórtico, típicas das lesões ateroscleróticas iniciais, foram encontradas depois de 4
semanas por Nistor (1987) e 8 semanas por Kowala (1998) ambos utilizando dietas
comerciais. Entretanto, em estudos designados para avaliar o efeito de nutrientes
específicos e substâncias sintéticas sobre a progressão e regressão da aterosclerose, é
essencial uma dieta semi-purificada bem definida (Kahlon et al.;1997).
Silva, A.R. OBJETIVOS
20
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
O objetivo geral do presente estudo será avaliar os efeitos do AVE 0991, análogo
não peptídico da Angiotensina (1-7), sobre parâmetros cardiovasculares e metabólicos
em hamsters submetidos à dieta hipercolesterolêmica.
3.2. Objetivos específicos
Padronizar o modelo para estudo da progressão da aterosclerose.
Avaliar os parâmetros bioquímicos do perfil lipídico de hamsters
hipercolesterolêmicos e controles, tratados ou não com AVE 0991.
Avaliar os parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo de hamsters
hipercolesterolêmicos e controles, tratados ou não com AVE 0991.
Avaliar a pressão arterial e frequência cardíaca em hamsters controle e
submetidos aos procedimentos experimentais (tratados com AVE 0991) e dieta
hipercolesterolêmica.
Avaliar, através de análise histológica, o desenvolvimento ou não de lesões
ateroscleróticas em hamsters hipercolesterolêmicos e controles, tratados ou não com
AVE 0991.
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
21
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados hamsters machos albinos, com aproximadamente 1 mês de
idade, pesando em média 50 g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental
do Departamento de Alimentos, Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro
Preto.
4.2. Dietas
A dieta controle foi preparada conforme as recomendações da AOAC, 1980. A
dieta hipercolesterolêmica diferiu da dieta controle na substituição da gordura de coco
por óleo de soja e ausência de colesterol (Tabela 1). Uma maior quantidade de fibra e
menor quantidade de amido de milho foram utilizadas na dieta hipercolesterolêmica
para que essa se tornasse isocalórica em relação à dieta controle. Ambas as dietas foram
preparadas no Laboratório de Nutrição Experimental, Escola de Nutrição, Universidade
Federal de Ouro Preto.
4.3. Desenho experimental
Os animais foram divididos em quatro grupos (figura 2) de acordo com a dieta
recebida e do tratamento ou não com AVE 0991 (0,5mg/Kg):
- Grupo Controle: animais que se alimentavam de dieta controle e não foram
tratados com AVE 0991 (0,5mg/Kg).
- Grupo Controle tratado: animais que se alimentavam de dieta controle e foram
tratados com AVE 0991 (0,5mg/Kg).
- Grupo Hiper não tratado: animais que se alimentavam de dieta
hipercolesterolêmica e não foram tratados com AVE 0991 (0,5mg/Kg).
- Grupo Hiper tratado: animais que se alimentavam de dieta hipercolesterolêmica
e foram tratados com AVE 0991 (0,5mg/Kg).
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
22
Figura 2. Organograma dos grupos experimentais de acordo com o tipo de dieta e tratamento recebidos.
As dietas foram ministradas a todos os grupos experimentais durante 120 dias.
Esse tempo de dieta tem sido caracterizado por apresentar lesões iniciais
ateroscleróticas em hamsters (Pien et al., 2002). O peso dos animais foi acompanhado
semanalmente. O tratamento com AVE 0991 foi realizado conforme descrito no item
4.4 dos materiais e métodos.
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
23
Tabela 1: Composição das dietas controle e hipercolesterolêmica em gramas para cada
1000g de dieta (AOAC Modificada)
Dieta
Nutrientes Controle Hipercolesterolêmica
Caseína 120 120
Mistura de Sais
a
50 50
Mistura de Vitaminas
b
10 10
Óleo*/gordura de coco** 80* 170**
Colesterol - 5
Colina 4 4
Celulose 10 120
Amido de milho 726,00 521,00
Calorias 4118,4 4153,4
a
Mistura de sais (g/kg da mistura): NaCl – 139,3
/ Kl – 0,79 / MgSO
4
7H
2
O – 57,3 /
CaCO
3
–381,4 / MgSO4 H
2
O – 4,01 / FeS O
4
7H
2
O – 27,0 / ZnSO
4
7H
2
O – 0,548 / CuSO
4
5H
2
O – 0,477 / CoCl
2
5H
2
O – 0,023 / KH
2
PO
4
– 389,0.
b
Mistura de vitaminas (g/Kg de
mistura): acetato de retinol – 2.000.000 IU / colecalciferrol – 200.000 IU / ácido p-amino
benzóico – 10,00 / I-inositol – 10,00 / niacina – 4,00 / pantotenato de cálcio – 4,00 /
riboflavina – 0,80 / tiamina HCL – 0,50 / piridoxina HCL - 0,50 / ácido fólico – 0,20 /
biotina – 0,040 / vitamina B
12
– 0,003 / sacarose – q.s.p. 1.000 / α-tocoferol – 10.000 IU.
*Dieta controle: 80ml de óleo/kg; **Dieta hipercolesterolêmica: 170ml de gordura de
coco/Kg.
4.4. Tratamento com AVE 0991
Para o tratamento dos animais com AVE 0991 foi preparada uma solução estoque
(10 mg de AVE 0991 em 1 ml de KOH 10 mM). Dessa solução foram obtidas alíquotas
de 50µL em tubos de polietileno Eppendorf® que permaneceram congeladas até o
momento de uso. A cada alíquota foram acrescentados 2,5 ml de água destilada e
homogeneizado no aparelho Vórtex.
Os animais receberam diariamente, durante o último mês de experimento, 1 ml
dessa solução final de AVE 0991, por gavagem, correspondente a dose de 0,5 mg/kg.
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
24
4.5. Amostras Biológicas
4.5.1. Peso corporal e peso de órgãos
O ganho de peso foi determinado, semanalmente a partir do início do protocolo
experimental. Ao final do protocolo, os animais foram instrumentados (conforme
descrito nos itens 4.8.2; 4.8.3 e 4.8.4 dos materiais e métodos), para avaliações
cardiovasculares de pressão arterial média e freqüência cardíaca. Após a realização
destes experimentos os animais foram sacrificados e o fígado, coração, baço, rins e
pulmões foram extraídos, pesados e acondicionados em recipiente protegido da luz
contendo solução de formol tamponado a 3,7%. As análises dos pesos dos órgãos foram
realizadas pelo peso específico (razão peso do órgão pelo peso corporal).
4.5.2. Obtenção do soro
O soro dos animais foi colhido antes do início do experimento e mensalmente
durante a realização do experimento. As amostras de sangue foram colhidas em tubos
de polietileno. Os animais em jejum de 8 horas foram anestesiados com éter etílico, o
sangue foi obtido através do plexo retroorbital com auxílio de uma pipeta de Pasteur
contendo heparina sódica (25000 UI/5 mg) diluída 1:10 e centrifugado a 15000 rpm por
15 minutos para obtenção do soro. No final do experimento, o sangue foi colhido em
tubos de polietileno via catéter inserido na artéria femural e centrifugado a 15000 rpm
por 15 minutos para a obtenção do soro.
4.6. Parâmetros bioquímicos
4.6.1. Dosagens bioquímicas utilizando kits comerciais
As dosagens das concentrações séricas de colesterol total, HDL-colesterol,
triglicérides e a determinação da atividade da enzima alanina aminotransferase (ALT)
foram realizadas conforme as orientações do fabricante dos kits comerciais (Labtest
Diagnóstica). Todas as amostras foram lidas no Espectrofotômetro FEMTO 600 Plus.
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
25
No Anexo I, encontram-se detalhes da execução e os princípios das técnicas de cada
dosagem mencionada acima.
4.6.2. Determinação da atividade da enzima paraoxonase
A dosagem da atividade arilesterase da enzima paraoxonase (PON) foi realizada
conforme Beltowski et al. (2002), tendo como base a velocidade de hidrólise do
fenilacetato.
Para este procedimento, foi preparada uma solução contendo 1µl de fenilacetato
em 1500µl de Tris HCl 9mM pH 8. Dessa solução foi retirado 1ml e misturados com
4ml de Tris HCl 9mM pH 8. A essa solução final foram acrescentados 10µl de soro e a
absorbância do teste obtida a 270nm em exatamente 3 minutos. A leitura do branco foi
realizada como descrito acima, porém sem a adição da amostra de soro e foi subtraído
das absorbâncias obtidas. A atividade enzimática de PON foi expressa em µmoles de
produto formado (fenol) por minuto pela diluição final em ml. Foi utilizado o
coeficiente de absortividade do fenilacetato 1310 (mol/L
-1
cm
-1
). As leituras foram
realizadas no espectrofotômetro 700S com fonte de luz Ultra Violeta.
4.6.3. Sulfidrilas totais
A determinação dos radicais sulfidrilas foi obtida segundo Sedlak et al., (1968)
utlizando o ácido 5,5’-Ditio-bis (2-nitrobenzoico), DTNB (reagente de Ellman),
conforme padronização do Laboratório de Nutrição Experimental – ENUT/ UFOP.
Os grupos tióis reagem com DTNB formando um composto colorido, que absorve
luz a 412 nm. No ensaio para determinação do SH total foi preparada uma solução
padrão contendo 949µl de Trietanolamina-HCl (TEA) e 49 µl de glutationa estoque (12
mg de cisteína + 5ml de TEA). Esta solução foi utilizada para a construção da primeira
curva conforme tabela abaixo:
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
26
Tabela 2: Diluições da solução padrão em trietanolamina-HCL (TEA).
0 50 100 250 500 1000
Padrão
0 25 50 125 250 500
TEA
500 475 450 375 250 0
Em seguida, foi obtida a segunda curva de acordo com a tabela 3:
Tabela 3: Quantidades (µl) dos reagentes utilizados para o preparo da curva padrão
necessária para o cálculo das sulfidrilas totais.
0 50 100 250 500 1000
Padrão 1ª
Curva
40 40 40 40 40 40
Tris
pH=8,2
150 150 150 150 150 150
DNTB
50 50 50 50 50 50
Metanol
800 800 800 800 800 800
Para cada amostra foi pipetado 40µl de soro, 50µl de DNTB, 150µl de Tris - pH
8,2 e 800µl de metanol, centrifugado a 3000 GS durante 5 minutos a 25ºC. Foram feitas
duas soluções para serem utilizadas como o branco: branco 1 (B1) composto de 50µl de
DNTB, 150µl de Tris - pH 8,2 e 800µl de metanol e branco 2 (B2) de 150µl de Tris -
pH 8,2 e 800µl de metanol. A leitura da 2ª curva, das amostras e do B1 foram realizadas
no espectrofotômetro FEMTO 600 plus. O B2 foi utilizado para zerar o aparelho. As
concentrações são expressas em µmol/L.
4.6.4. Determinação da atividade da catalase
A dosagem da atividade da enzima catalase foi modificada de Beutler (1975),
sendo realizada conforme padronização do Laboratório de Nutrição Experimental –
ENUT/ UFOP.
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
27
A atividade da catalase foi determinada medindo-se a redução do peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) cineticamente, durante 5 minutos, pela leitura espectrofotométrica a
240 nm. Para o ensaio, utilizaram-se 40µl de água destilada, 50µl de tampão fosfato,
10µl de soro e 900µl de solução H
2
O
2
20mM preparada no momento da leitura. Para
cada amostra havia um branco (990µl de tampão fosfato + 10 µl de soro). Os cálculos
consideram o valor de 39,4 M
-1
cm
-1
como coeficiente de absortividade do peróxido de
hidrogênio. A atividade da catalase foi expressa como µmoles de substrato (H
2
O
2)
reduzido por minuto a 37
o
C.
4.7. Avaliação dos parâmetros cardiovasculares
4.7.1. Anestesia
Para a implantação da cânula na artéria femural, os animais foram anestesiados
intraperitonialmente com uretana na dose
1,2 g/ kg
.
4.7.2. Confecção da cânula implantada na artéria
Na confecção da cânula foram utilizados tubos de polietileno PE 10 de 2 cm,
soldado por aquecimento a outro tubo de polietileno PE 50 de 15 cm. Antes de ser
implantada, a cânula foi preenchida com solução fisiológica (NaCl 0,9%) e a
extremidade do PE 50 foi obstruída com um pino de metal.
4.7.3. Canulação da artéria aorta abdominal
Os animais foram colocados em decúbito dorsal em uma prancha cirúrgica
realizando-se uma pequena incisão na pele da pata traseira direita, separando a
musculatura para localização do feixe vásculo-nervoso femural. A cânula foi
introduzida na aorta abdominal, via artéria femural, para registro dos parâmetros
cardiovasculares e amarradas junto ao feixe com fio cirúrgico. Em seguida, foi injetada
na cânula 0,5 ml de salina heparinizada (heparina sódica 25.000 UI / 5 ml) a fim de se
evitar a formação de coágulo durante o registro da PA e posteriormente foi conectada ao
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
28
transdutor. Depois do registro da pressão arterial, o sangue foi colhido via cânula como
descrito anteriormente (intem 4.5.2).
4.7.4. Registro da pressão arterial e frequência cardíaca
A pressão arterial foi monitorada por um transdutor de pressão modelo Gould
conectado a um amplificador (PM-1000, CWE). O sinal de pressão arterial pulsátil é
derivado para um cardiotacômetro (PM-1000,CWE) para se obter a freqüência cardíaca
e para um registrador (Gould). A pressão arterial pulsátil e freqüência cardíaca foram
continuamente amostradas por um sistema de conversão analógico/digital de 12 bits
(Powerlab 4. 0. 4) a uma freqüência de 800 Hz e armazenados em disco rígido (PC).
Posteriormente, o sinal foi processado por um software (Powerlab 4. 0. 4) para se obter
a pressão arterial média (PAM), as características temporais e as alterações máximas
dos parâmetros desejados.
4.8. Análise histopatológica
Para avaliar as alterações histopatológicas no tecido hepático foram coletados
fragmentos do fígado e processados em processador histológico (OMA Metalúrgica)
através de banhos sucessivos com duração de 60 minutos de álcool (70%, 80% e 90%),
álcool absoluto, xilol e parafina, respectivamente. Este material foi fixado em blocos de
parafina. Os blocos contendo os fragmentos de tecidos foram submetidos à microtomia
com 4 µm de espessura. Foi realizada a coloração de rotina Hematoxilina-Eosina (HE)
pra uma observação geral das possíveis alterações histopatológicas. Todo o processo de
coloração e montagem de lâminas era realizado em capela (GP Científica).
Os tecidos cardíaco e aórtico foram retirados do formol, lavados, congelados, e
incluídos em Tissue - Tek® para cortes em criostato à -30
o
C. Foram realizados cortes
semi-seriados com 20 µm de espessura e corados pelo Sudam III para visualização de
possíveis acúmulos de lipídios.
4.9. Análise estatística
Silva, A.R. MATERIAIS E MÉTODOS
29
Todos os resultados foram expressos com médias ± EPM. A comparação entre os
grupos foi feita utilizando-se ANOVA Two-way seguido de post hoc de Bonferroni
quando apropriado. Comparações entre antes e depois do tratamento no mesmo animal
foram feitas pelo teste “t” de Student para observações pareadas. Para observações
entre animais diferentes foi utilizado o teste “t” de Student não pareado. Estas análises
foram realizadas no software Graphpad Prism Project (versão 4.00). Foram
consideradas diferenças significativas para p < 0.05.
Silva, A.R. RESULTADOS
30
5. RESULTADOS
5.1 Parâmetros biológicos
5.1.1. Ganho de peso corporal e peso dos órgãos
A figura 3 apresenta o ganho de peso final após 120 dias do protocolo
experimental em hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica,
tratados ou não com AVE 0991. Verificamos que tanto o tratamento quanto a dieta não
influenciaram significativamente o ganho de peso corporal final entre os grupos
(Controle: 46,73 ± 1,32 g, n=11; Controle AVE: 57,71 ± 4,77 g, n=7; Hiper: 55,7 ±
3,37g, n=10; Hiper AVE: 56,11 ± 4,26 g, n=9). Além disso, não houve interação entre o
tratamento com AVE 0991 e o tipo de dieta (p > 0,05).
0
10
20
30
40
50
60
70
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
Ganho de peso (g)
Figura 3: Ganho de peso (g) em hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica
(Hiper), tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE 0991 (0,5mg/Kg) (Controle,
n=11; Hiper, n=10). Os dados são expressos como média ± erro padrão; diferença significativa, p < 0,05.
NS= Não significativo, p > 0,05
Valor de p
Dieta
Ns
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
31
5.1.2. Peso dos órgãos
Os dados da tabela 4 mostram a relação peso órgão/peso corporal do coração,
fígado e baço, em hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica,
tratados ou não com AVE 0991. A dieta e o tratamento não interferiram
significativamente no peso do coração, assim como também não houve interação entre o
tratamento e a dieta (p > 0,05).
Ao observarmos o peso relativo do fígado, verificamos que os grupos que
receberam dieta hiper apresentaram um aumento significativo no peso do fígado em
relação aos animais do grupo controle (p < 0,05). Através da ilustração da figura 4
pode-se notar os tamanhos acentuadamente diferentes dos fígados entre os grupos
controle (sem tratamento em A e tratados em C) e hiper (sem tratamento em B e
tratados em D). O tratamento com AVE 0991 não influenciou significativamente o peso
do fígado dos animais (p > 0,05) e também não houve interação entre o tratamento e a
dieta (p > 0,05). A figura 4 ilustra também o aspecto macroscópico do fígado dos
animais, sendo possível observar uma coloração esbranquiçada no fígado daqueles que
receberam dieta hiper (B e D), devido ao aumento na concentração lipídica nesse órgão.
O peso relativo do baço não foi influenciado pela dieta (p > 0,05) ou tratamento
com AVE 0991 (p > 0,05). Não houve interação entre o tratamento com AVE 0991 e a
dieta (p > 0,05).
Os dados da tabela 5 mostram a relação peso órgão/peso corporal dos rins direito
e esquerdo e do pulmão, em hamsters alimentados com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991. Verifica-se que o peso relativo
dos rins, tanto direito quanto esquerdo, foi influenciado significativamente pela dieta,
sendo que os animais que recebiam dieta hiper apresentavam valores significativamente
menores em relação aos animais que receberam dieta controle (p < 0,05). O tratamento
com AVE 0991 não influenciou no peso relativo dos rins, assim como também não
houve interação entre o tratamento e a dieta (p > 0,05).
Em relação ao peso relativo do pulmão, verificamos que este não foi influenciado
pela dieta (p > 0,05) ou tratamento com AVE 0991 (p > 0,05). Não houve interação
entre o tratamento com AVE 0991 e a dieta (p > 0,05).
Silva, A.R. RESULTADOS
32
Tabela 4: Peso relativo do coração, fígado e baço (mg/g de peso corporal) em hamsters
alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE
0991.
Grupo
experimental
Relação peso órgão/ peso corporal
Coração Fígado Baço
Controle
5,7 ± 0,13 34,7 ± 0,76 1,1 ± 0,09
Hiper
5,4 ± 0,13 57,7 ± 1,04
*
0,9 ± 0,06
Controle AVE
5,6 ± 0,17 30,8 ± 0,49 1,0 ± 0,05
Hiper AVE
5,5 ± 0,08 58,8 ± 0,55
*
0,9 ± 0,05
Valor de p
Dieta
Ns < 0,05 Ns
Tratamento
Ns Ns Ns
Interação
Ns Ns Ns
Os resultados são expressos como média ± erro padrão; * em relação aos grupos controles, p < 0,05. NS=
Não significativo, p > 0,05. Legenda: Hiper = Dieta Hiper sem Tratamento com AVE, n=10; Controle =
Dieta controle sem Tratamento com AVE, n=8; Hiper AVE = Dieta Hiper com Tratamento de AVE, n=9;
Controle AVE = Dieta Controle com tratamento de AVE, n=7.
Silva, A.R. RESULTADOS
33
Figura 4: Fotos ilustrativas dos fígados de hamsters alimentados com dieta controle (sem
tratamento, painel A; e tratados, painel C) ou hipercolesterolêmica (sem tratamento,
painel B; e tratados, painel D). ABCD (X3,5). Escala: cm.
Silva, A.R. RESULTADOS
34
Tabela 5: Peso relativo dos rins direito e esquerdo e do pulmão (mg/g de peso corporal)
em hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não
com AVE 0991.
Grupo
experimental
Relação peso órgão/ peso corporal
Rim D Rim E Pulmão
Controle
3,4 ± 0,14 3,7 ± 0,18 5,4 ± 0,16
Hiper
3,1 ± 0,07* 3,2 ± 0,07* 5,1 ± 0,14
Controle AVE
3,2 ± 0,12 3,6 ± 0,24 5,1 ± 0,39
Hiper AVE
3,0 ± 0,08* 3,2 ± 0,09* 4,9 ± 0,12
Valor de p
Dieta
< 0,05 < 0,05 Ns
Tratamento
Ns Ns Ns
Interação
Ns Ns Ns
Os resultados são expressos como média ± erro padrão; * em relação aos grupos controles, p < 0,05. NS=
Não significativo, p > 0,05. Legenda: Hiper = Dieta Hiper sem Tratamento com AVE, n=10; Controle =
Dieta controle sem Tratamento com AVE, n=8; Hiper AVE = Dieta Hiper com Tratamento de AVE, n=9;
Controle AVE = Dieta Controle com tratamento de AVE, n=7. Rim D = rim direito; Rim E = rim
esquerdo.
5.2.
Parâmetros bioquímicos
5.2.1. Lipídios: níveis séricos de colesterol total, HDL, n-HDL, razão HDL/n-
LDL e triglicérides.
A figura 5 apresenta os níveis séricos de colesterol total em hamsters alimentados
com dieta controle ou hipercolesterolêmica. Observa-se que não houve diferença
significativa no nível basal, antes de iniciar a administração da dieta, entre os grupos
controle e hipercolesterolêmico (p > 0,05). Após 30 dias do início da administração das
dietas verifica-se uma elevação significativa no nível de colesterol para o grupo hiper
Silva, A.R. RESULTADOS
35
quando comparado ao controle (Controle 30 dias: 73,0 ± 3,8 mg/dL, n=14 e Hiper 30
dias: 284,0 ± 8,0 mg/dL, n= 20). Esse aumento nos níveis de CT se manteve durante
todo o curso do experimento, porém não aumentou proporcionalmente ao tempo de
dieta (Controle 60 dias: 80,8 ± 2,8 mg/dL, n=14 e Hiper 60 dias: 328,2 ± 29,3 mg/dL,
n= 20; Controle 90 dias: 88,6 ± 3,4 mg/dL, n=13 e Hiper 90 dias: 303,5 ± 22,4 mg/dL,
n= 20; Controle 120 dias: 82,0 ± 4,2 mg/dL, n=13 e Hiper 120 dias: 301,1 ± 13,7
mg/dL, n= 20).
0
100
200
300
400
Controle
Hiper
30
60Basal 90 120
Dias
* #
*#
*#
*#
Colesterol total (mg/dL)
Figura 5:
Níveis séricos de colesterol total em hamsters alimentados com dieta controle (n= 13) ou
hipercolesterolêmica (n=20). Valores expressos em média ± erro padrão da média. *p<0,05 em
comparação a dieta controle. #p<0,05 em comparação ao CT no tempo basal (teste “t” de Student
para observações pareadas e não pareadas).
O tratamento com AVE 0991 não influenciou significativamente os níveis de CT
(p > 0,05) em ambos os grupos, como mostra os dados da tabela 6 e não houve interação
entre tratamento e dieta (p > 0,05). Também não houve diferença significativa entre os
níveis de CT antes e após o tratamento com AVE 0991, tanto no grupo controle quanto
no grupo hiper (p > 0,05).
Em relação aos níveis séricos de colesterol presentes na lipoproteína HDL (figura
6) em hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não
com AVE 0991, pode-se observar que a dieta teve efeito significativo, no qual os
animais dos grupos que receberam dieta hiper (Hiper: 140,5 ± 7,3 mg/dL, n= 20 e Hiper
AVE = 124,8 ± 6,9 mg/dL, n=9) apresentaram elevação significativa do colesterol HDL
Silva, A.R. RESULTADOS
36
em relação aos grupos que receberam dieta controle (Controle: 36,5 ± 1,7 mg/dL, n=13
e Controle AVE: 37,8 ± 2,9 mg/dL, n=7). Não houve efeito do tratamento e nem
interação entre a dieta e o tratamento com AVE 0991 sobre os níveis de HDL colesterol
(p > 0,05).
Tabela 6: Níveis séricos de colesterol total em hamsters alimentados com dieta controle
ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991 (0,5mg/Kg), antes e após
tratamento.
Tempo
Grupo experimental
Controle AVE Hiper AVE
Antes
(90 dias -mg/dL)
82,7 ± 13,1 256,3 ± 11,6
Após
(120 dias - mg/dL)
99,0 ± 8,5 256,8 ± 21,6
Valores expressos em média ± erro padrão da média. (teste “t” de Student para observações pareadas).
Legenda: Hiper AVE = Dieta Hiper com Tratamento de AVE, n=9; Controle AVE = Dieta Controle com
tratamento de AVE, n=7.
0
50
100
150
200
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
HDL (mg/dL)
Figura 6: Níveis séricos da fração HDL em hamsters alimentados com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE 0991 (0,5mg/Kg)
(Controle, n=13; Hiper, n=20). Os dados são expressos como média ± erro padrão; p < 0,05. NS= Não
significativo, p > 0,05.
Valor de p
Dieta
<0,05
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
37
A figura 7 mostra os níveis séricos de colesterol presentes nas demais frações
lipoprotéicas, não HDL (n-HDL), em hamsters alimentados com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991. Os animais que receberam dieta
hiper (Hiper: 160,6 ± 10,9 mg/dL, n=20 e Hiper AVE: 132,0 ± 16,8 mg/dL, n=9)
apresentaram valores de colesterol n-HDL superiores em relação aos animais que
receberam dieta controle (Controle = 45,5 ± 3,8 mg/dL, n= 13 e Controle AVE = 61,2 ±
6,7 mg/dL, n=7). Assim como observado para os valores de HDL, não houve efeito do
tratamento (p > 0,05) e interação entre a dieta e o tratamento com AVE 0991 sobre os
níveis do colesterol n-HDL (p > 0,05).
0
50
100
150
200
Sem AVE
Com AVE
Controle Hiper
Dieta
n-HDL (mg/dL)
Figura 7: Níveis séricos do colesterol presente nas frações n-HDL em hamsters alimentados com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE 0991
(Controle, n=13; Hiper, n=20). Os dados são expressos como média ± erro padrão; p < 0,05. NS= Não
significativo, p > 0,05.
Observando-se a relação entre as frações n-HDL/HDL (figura 8), nota-se que a
dieta diminuiu significativamente essa razão (Hiper: 1,20 ± 0,1 1 n=20; Hiper AVE:
1,05 ± 0,11 n=9; Controle: 1,29 ± 0,13 n=13; Controle AVE: 1,64 ± 0,17 n=7). Não
houve efeito significativo do tratamento com AVE 0991 sobre os valores da razão entre
as frações lipoprotéicas n-HDL/HDL (p > 0,05). A interação entre o tratamento e a dieta
não foi significativa (p > 0,05).
A figura 9 apresenta os níveis séricos de triglicérides em hamsters alimentados
com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991. Verifica-
se que a dieta hipercolesterolêmica elevou significativamente os valores séricos de
Valor de p
Dieta
< 0,05
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
38
triglicérides (Hiper: 159,8 ± 15,2 mg/dL, n=16; Hiper AVE: 170,4 ± 5,99 mg/dL, n=9)
quando comparada à dieta controle (Controle: 110,9 ± 14,7 mg/dL, n=11; Controle
AVE: 131,2 ± 7,10 mg/dL, n=7). Não houve efeito do tratamento com AVE 0991 ou
interação entre tratamento com AVE e o uso da dieta (p > 0,05).
0
1
2
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
n-HDL/HDL
Figura 8: Razão entre a frações de colesterol n-HDL/HDL em hamsters alimentados com dieta controle
ou hipercolesterolêmica, tratados por 30 dias (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE
0991(0,5mg/Kg) (Controle, n=13; Hiper, n=20). Os dados são expressos como média ± erro padrão;
diferença significativa, p < 0,05. NS= Não significativo, p > 0,05.
.
0
100
200
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
Triglicérides (mg/dL)
Figura 9: Os níveis séricos de triglicérides em hamsters alimentados por 120 dias com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE 0991(0,5mg/Kg)
(Controle, n=11; Hiper, n=16). Os dados são expressos como média ± erro padrão; diferença
significativa, p < 0,05. NS= Não significativo, p > 0,05.
Valor de p
Dieta
< 0,05
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Valor de p
Dieta
< 0,05
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
39
5.2.2.
Função hepática: alanina aminotransferase (ALT)
A atividade enzimática da ALT (figura 10) foi significativamente maior nos
animais que receberam a dieta hipercolesterolêmcia (Hiper: 117,3 ± 8,87 Um/ml, n=10
e Hiper AVE: 125,1 ± 8,88 Um/ml, n=9) quando comparados aos animais que
receberam dieta controle (Controle: 42,97 ± 11,25 Um/ml, n=6 e Controle AVE: 65,14
± 12,83 Um/ml, n=7). O tratamento com AVE 0991, bem como a interação entre o
tratamento e a dieta não provocaram qualquer efeito sobre a atividade da ALT (p >
0,05).
0
50
100
150
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
ALT (Un/ml)
Figura 10: Atividade da enzima alanina aminotransferase (ALT) em hamsters alimentados por 120 dias
com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com
AVE 0991(0,5mg/Kg) (Controle, n=6; Hiper, n=10). Os dados são expressos como média ± erro padrão;
p < 0,05. NS= Não significativo, p > 0,05.
5.2.3. Estresse oxidativo: catalase, paraoxonase (PON) e sulfidrilas totais
A figura 11 apresenta a atividade da enzima catalase em hamsters alimentados
com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991. A
atividade dessa enzima apresentou-se significativamente elevada nos animais que
receberam a dieta hipercolesterolêmica (Hiper: 0,2249 ± 0,0321 µmoles/min, n=16;
Hiper AVE: 0,1777 ± 0,0259 µmoles/min, n=9) quando comparados aos animais que
receberam a dieta controle (Controle: 0,1142 ± 0,0083 µmoles/min, n=10; Controle
AVE: 0,0761 ± 0,016 µmoles/min, n=6). Verifica-se ainda, que o tratamento com AVE
Valor de P
Dieta
< 0,05
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
40
0991 não influenciou a atividade da catalase (p > 0,05). Não houve interação
significativa entre a dieta e o tratamento com AVE 0991 (p > 0,05).
Controle Hiper
0.0
0.1
0.2
0.3
Sem AVE
Com AVE
Dieta
Catalase (
µ
moles/min)
Figura 11: Atividade da enzima catalase em hamsters alimentados com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=6; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE 0991 (0,5mg/Kg)
(Controle, n=10; Hiper, n=16). Os dados são expressos como média ± erro padrão; p < 0,05. NS= Não
significativo, p > 0,05.
Em relação à atividade arilesterase da paraoxonase (PON) (figura 12) verifica-se
que os animais que foram tratados com AVE 0991 (Hiper AVE: 0,2959 ± 0,0364
µmoles/min, n=7 e Controle AVE: 0,2661 ± 0,0199 µmoles/min, n=7) apresentaram
diminuição significativa em relação aos animais que não receberam tratamento (Hiper:
0,4099 ± 0,0253 µmoles/min, n=19 e Controle: 0,3771 ± 0,0152 µmoles/min, n=12). O
tipo de dieta não alterou a atividade da PON e não houve interação entre o tratamento
com AVE 0991 e a dieta (p > 0,05).
A figura 13 apresenta os valores das sulfidrilas totais em hamsters alimentados
com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com AVE 0991. Verifica-se
que tanto a dieta, o tratamento quanto a interação de ambos influenciaram
significativamente na quantidade de radicais sulfidrilas presentes no soro. Os níveis de
sulfidrilas foram maiores nos animais que receberam dieta controle (Controle: 375,6 ±
26,0 Um/ml, n=13; Controle AVE: 645,1 ± 37,10 Um/ml, n=7) em relação aos que
receberam dieta hiper (Hiper: 305,4 ± 25,5 Um/ml, n=18; Hiper AVE: 287,2 ± 61,0
Um/ml, n=7). O tratamento com AVE 0991 aumentou significativamente os valores de
sulfidrilas séricas nos grupos experimentais e houve interação entre tratamento e dieta.
Valor de P
Dieta
< 0,05
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
41
Controle Hiper
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Sem AVE
Com AVE
Dieta
PON (
µ
moles/min)
Figura 12 Atividade da enzima paraoxonase (PON) em hamsters alimentados por 120 dias com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=7) ou não com AVE 0991
(0,5mg/Kg) (Controle, n=12; Hiper, n=19). Os dados são expressos como média ± erro padrão; p < 0,05.
NS= Não significativo, p > 0,05.
0
200
400
600
800
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
a
b
Dieta
Sulfidrilas (Un/mL)
a
a
Figura 13: Níveis de sulfidrilas totais em hamsters alimentados por 120 dias com dieta controle ou
hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=7) ou não com AVE 0991(0,5mg/Kg)
(Controle, n=13; Hiper, n=18). Os dados são expressos como média ± erro padrão; letras superescritas
diferentes indicam diferença significativa; p < 0,05. NS= Não significativo, p > 0,05.
Valor de P
Dieta
Ns
Tratamento
< 0,05
Interação
Ns
Valor de p
Dieta
< 0,05
Tratamento
< 0,05
Interação
< 0,05
Silva, A.R. RESULTADOS
42
5.3.
Parâmetros cardiovasculares: pressão arterial média (PAM) e
freqüência cardíaca (FC)
As figuras 14 e 15 apresentam os níveis basais de PAM (mmHg) e FC (bpm) em
hamsters alimentados com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados ou não com
AVE (0,5mg/Kg), respectivamente. Os níveis da PAM (Hiper: 93,4 ± 1,1 mmHg, n=10;
Hiper AVE: 94,8 ± 3,1 mmHg, n=9; Controle: 87,9 ± 5,3 mmHg, n=6; Controle AVE:
91,4 ± 2,0 mmHg, n=7) e da FC (Hiper: 484,5 ± 6,6 bpm, n=10; Hiper AVE: 471,5 ±
11,2 bpm, n=9; Controle: 469,6 ± 11,0 bpm, n=6; Controle AVE: 442,1 ± 23,5 bpm,
n=7) não foram alterados significativamente pela dieta, tratamento ou a interação de
ambos (p > 0,05).
0
25
50
75
100
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
PAM (mmHg)
Figura 14: Níveis basais de pressão arterial média (PAM, mmHg) em hamsters alimentados por 120 dias
com dieta controle ou hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com
AVE 0991 (0,5mg/Kg) (Controle, n=7; Hiper, n=10). Os dados são expressos como média ± erro padrão;
diferença significativa, p < 0,05. NS= Não significativo, p > 0,05.
Valor de P
Dieta
Ns
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
43
0
100
200
300
400
500
Sem AVE
Com AVE
Controle
Hiper
Dieta
FC (bpm)
Figura 15: Valores de freqüência cardíaca (FC, bpm) em hamsters alimentados por 120 dias com dieta
controle ou hipercolesterolêmica, tratados (Controle AVE, n=7; Hiper AVE, n=9) ou não com AVE 0991
(0,5mg/Kg) (Controle, n=7; Hiper, n=10). Os dados são expressos como média ± erro padrão; diferença
significativa, p < 0,05. NS= Não significativo, p > 0,05
5.4.
Análise histopatológica
A análise histopatológica das lâminas de fígado coradas pelo método da
Hematoxilina e Eosina (HE) mostrou a presença esteatose microvesicular nos animais
do grupo que recebeu dieta hipercolesterolêmica (figura 16, B). As lâminas pertencentes
aos animais do grupo controle apresentaram-se compatíveis com a normalidade (figura
16, A).
Na análise da região da válvula aórtica foi observado a presença de placa
aterosclerótica em um animal do grupo hipercolesterolêmico (figura 17 B, C e D). Tal
alteração foi observada macroscopicamente e fotografada com o auxílio de uma lupa.
Nota-se um aspecto amarelado compatível com células carregadas de lipídios e com o
auxílio da lupa pôde-se claramente observar a presença de aglomerados lipídicos nessa
lesão (figura 17, D). As válvulas aórticas dos animais controles tratados ou não com
AVE 0991 não apresentaram quaisquer tipo de lesão (figura 17, A).
Nas lâminas de fragmentos do arco aórtico dos animais do grupo
hipercolesterolêmico tratados com AVE 0091 não foram encontradas marcações
positivas pelo Sudam III e nenhum tipo de anormalidade (figura 18, B). Entre as
lâminas do arco aórtico dos animais do grupo hipercolesterolêmico foi encontrado
Valor de P
Dieta
Ns
Tratamento
Ns
Interação
Ns
Silva, A.R. RESULTADOS
44
presença de células sudanofílicas na túnica íntima da parede arterial (figura 18, C e D).
A parede arterial dos animais controles apresentava aspecto compatível com a
normalidade, como ilustrado na figura 18A.
Dentre os animais do grupo hipercolesterolêmico também foi encontrado um caso
de formação de lesão na parede cardíaca (figura 19, B). Essa lesão estendia-se por todo
diâmetro da parede ventricular direita, ocupando também parte do lúmen do ventrículo.
Macroscopicamente esta lesão apresentava coloração amarelada e com aspecto
gelatinoso ao toque com uma pinça. A análise histológica do material mostrou grande
quantidade de marcação positiva pelo Sudam III, principalmente no núcleo da placa,
além da presença de células inflamatórias (figura 19, C e D). As paredes ventriculares
dos animais do grupo controle apresentavam aspecto compatível com a normalidade
(figura 19, A).
Os casos aqui relatados representaram 33,34% dos animais hipercolesterolêmicos
analisados (n=9). Não foi encontrado nenhum tipo de lesão ou marcação sudanofílica
nos animais dos grupos controle tratado (n=7) ou não com AVE 0991 (n=7) e
hipercolesterolêmicos tratados (n=9).
Silva, A.R. RESULTADOS
45
Figura 16: Fotomicrografia do fígado de hamster. (A) Grupo controle.
(B) Grupo hipercolesterolêmico evidenciando esteatose
microvesicular (seta). Hematoxilina Eosina, AB (500X).
Silva, A.R. RESULTADOS
46
Figura 17: Válvula aórtica de hamster. (A) Grupos controle (A). (B) Grupo
hipercolesterolêmico evidenciando placa aterosclerótica presente na parede da válvula
aórtica (setas). (C e D) Detalhe de B. (AB, 25X), C (40X), D(50X).
Silva, A.R. RESULTADOS
47
Figura 18: Fotomicrografia da artéria aorta (arco aórtico) de hamster. (A) Grupo controle. (B)
grupo hipercolesterolêmico tratado com AVE 0991 evidenciando aspecto histológico
compatível com normalidade. (C) Grupo hipercolesterolêmico sem tratamento evidenciando
células Sudam III positivas (seta). (D) Detalhe de C. Sudam III.
Silva, A.R. RESULTADOS
48
Figura 19: Fotomicrografia do coração de hamster. (A) Grupo controle com aspecto
histológico compatível com normalidade. (B) grupo hipercolesterolêmico evidenciando placa
aterosclerótica voltada para a luz do ventrículo direito. (C e D) detalhe de B evidenciando
células com marcação positiva para o Sudam III (seta) e presença de células inflamatórias
(cabeça de seta em D). Sudam III. AB (100X), C (200X), D(500X).
Silva, A.R. DISCUSSÃO
49
6.
DISCUSSÃO
A hipercolesterolemia é um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento
de lesões ateroscleróticas. Nosso trabalho, inicialmente, objetivou desenvolver uma
dieta semipurificada que induzisse um quadro de aterosclerose em hamsters, uma vez
que este modelo é susceptível ao desenvolvimento das lesões ateroscleróticas (Nistor et
al., 1987).
Nossos dados mostraram que os níveis de colesterol de hamsters alimentados com
dieta hipercolesterolêmica com 0,5% de colesterol e 17% de gordura de coco foi
eficiente em aumentar os níveis de colesterol em 3,7 vezes em relação aos níveis basais.
No trabalho de Silva (2005), que diferencia do presente estudo somente em relação à
fonte de gordura utilizada, houve um aumento nos níveis de colesterol de 2,6 vezes,
portanto, menor do que os valores encontrados em nosso estudo. Essa diferença pode se
dever ao conteúdo de ácidos graxos saturados elevados na gordura de coco, enquanto
que o óleo de soja utilizado por Silva (2005) possui a maior parte de seus lipídios
constituída por ácidos graxos insaturados. O aumento nos níveis de colesterol
encontrados por nós se assemelha aos do estudo pioneiro de Nistor et al. (1987). Esse
estudo foi o primeiro a definir o hamster como modelo de aterosclerose e mostrou o
aparecimento de lesões iniciais a partir de 4 semanas de dieta suplementada com 15%
de manteiga e 3% de colesterol. Entretanto, Kahlon et al. (1997) mostraram que tanto
0,5% como 3% de colesterol em dietas com 15% de gordura podem ser igualmente
aterogênicas, porém 3% de colesterol provoca saturação hepática, sugerindo, portanto,
como melhor dieta hipercolesterolêmica para hamsters aquela contendo 0,5% de
colesterol.
O hamster é considerado um animal HDL por possuir níveis elevados dessa
lipoproteína. Nossos resultados mostraram uma elevação significativa dos níveis do
colesterol presente nas HDLs nos animais hipercolesterolêmicos. Apesar disso, os
níveis do colesterol não-HDL se mantiveram elevados em relação a HDL nesses
animais como mostra a correlação sempre maior que 1 na razão entre n-HDL/HDL,
embora essa razão tenha sido menor no grupo hiper. Esses resultados corroboram com
outros autores que, a despeito do aumento na HDL, consideram esse animal um
excelente modelo para estudos sobre a aterosclerose (Bravo et al., 1993; Sicart et al.,
Silva, A.R. DISCUSSÃO
50
1984 e Goulinet & Chapman, 1993). Nesse sentido, é importante ressaltar que a
aterosclerose é uma doença multifatorial e que a sua indução em laboratório pode
necessitar de mais de um fator de risco. Nossos dados, se comprados aos de Silva
(2005), confirmam a necessidade de associar um outro fator além do colesterol exógeno
nos estudos sobre aterosclerose, sendo este fator os níveis de gorduras saturadas
presentes na gordura de coco.
A análise histopatológica do coração, válvula e arco aórticos, mostrou o
aparecimento de lesões vasculares em 33,34% dos animais hipercolesterolêmicos. Essas
lesões variaram em termos de localização e grau de avanço dentre os casos encontrados.
Uma vez que padronizamos a dieta em um modelo susceptível ao
desenvolvimento de lesões ateroscleróticas, nosso trabalho objetivou estudar as ações
do análogo não-peptídico da angiotensina-(1-7), AVE 0991, sobre o perfil de lipídeos,
estresse oxidativo, parâmetros cardiovasculares e sobre a formação de lesões
ateroscleróticas em hamsters. O tratamento com AVE 0991 foi realizado a partir de 90
dias de dieta, consistindo num total de 30 dias de tratamento. Todos os animais
aparentavam estarem saudáveis sendo que não houve diferença significativa em relação
ao ganho de peso nos grupos experimentais.
Nossos resultados mostraram que não houve efeito do AVE 0991 sobre os níveis
do colesterol total, bem como nos valores de colesterol presentes nas lipoproteínas HDL
e nas demais frações. Entretanto, nenhuma lesão ou região sudanofílica foi encontrada
nos animais hipercolesterolêmicos tratados com AVE 0991. Está bem estabelecida na
literatura a associação entre o SRA e a progressão da aterosclerose (Miyazaki et al.,
1999; Strawn et al. 2000 e Ferrario, 2002). Apesar desta estreita correlação, estudos
com inibidores da ECA ou antagonistas do receptor AT
1
não mostram reduções nos
níveis plasmáticos de colesterol, bem como das frações lipoprotéicas (Strawn et al.,
2000; Miyazaki et al., 1999; Uehara et al., 2002 e Kowala et al., 1998), corroborando
com nossos resultados. Dessa forma, as ações anti-ateroscleróticas associadas ao
bloqueio do SRA parecem estar relacionadas não à diminuição dos níveis de colesterol
plasmáticos, mas uma redução do processo inflamatório e estresse oxidativo presentes
na progressão da placa.
Em relação aos níveis séricos dos triglicérides, houve um aumento provocado pela
dieta hipercolesterolêmica, corroborando com Ausman (2005), que observou maiores
Silva, A.R. DISCUSSÃO
51
valores de triglicérides nos hamsters que recebiam gordura de coco na dieta em relação
aos grupos que recebiam óleo de canola ou óleo de farelo refinado. Existe uma estreita
correlação entre a quantidade de colesterol carreado pela VLDL e os níveis de
triglicérides, e esses níveis são associados com as doenças cardiovasculares (Criqui et
al., 1998). Os triglicérides presentes nos quilomícrons vindos do intestino são
hidrolizados em ácidos graxos livres e glicerol, produzindo os quilomícrons
remanescentes. Esses são removidos por um receptor de quilomícron remanescente no
fígado. Um atraso na remoção dos quilomícrons remanescentes podem promover a
aterogênese. Tem sido encontrado altos níveis de triglicérides pós-prandial e um atraso
no retorno aos níveis normais em pacientes com doença arterial coronariana
(Kwiterovich, 2000).
Os resultados de peso relativo do fígado mostraram um aumento significativo dos
animais do grupo hiper de 2 vezes em relação ao grupo controle, sendo estes dados
confirmados por Silva (2005). Está amplamente definido que o fígado é responsável
pela homeostase de lipídios e que nem toda gordura pode ser metabolizada e
armazenada no tecido adiposo causando, dessa forma, acúmulo de gordura no fígado, o
que gera a hipertrofia desse órgão. O tratamento com AVE 0991 não interferiu no
tamanho relativo do fígado dos animais.
Verificamos também a função hepática através da dosagem da alanina
aminotransferase (ALT), enzima presente nos hepatócitos que é liberada em maior
quantidade para a corrente sanguínea sempre que o parênquima hepático estiver afetado
(Henry, 1996). Nossos dados mostraram um aumento significativo da ALT nos animais
que receberam dieta hiper em relação aos que receberam dieta controle, o que sugere
uma alteração na função hepática. Esses resultados estão de acordo com Beynem et al.
(1986), que estudando o efeito do colesterol na dieta, verificaram que os animais que
receberam dieta rica em colesterol tiveram as atividades da ALT e da aspartato
aminotransferase (AST) aumentadas em relação ao grupo controle. O tratamento com
AVE 0991 por 30 dias não interferiu na atividade da enzima ALT, mostrando que esse
composto provavelmente não exibe toxicidade hepática.
Embora o peso do fígado e a atividade da enzima ALT dos grupos hiper estarem
aumentados em relação aos grupos controles, a análise histológica desse órgão mostrou
uma esteatose microvesicular, sugerindo uma alteração hepática discreta. Kahlon et al.
Silva, A.R. DISCUSSÃO
52
(1996) mostrou que existe uma correlação positiva entre a quantidade de infiltração de
gordura no fígado e os níveis de gordura da dieta. Esses autores sugerem que
quantidades de colesterol na dieta acima de 0,5% podem saturar o metabolismo
hepático, sendo este, portanto, o valor limítrofe nos estudos sobre aterosclerose em
hamsters.
O tratamento com AVE 0991 não influenciou significativamente no peso relativo
dos demais órgãos analisados (baço, rins e pulmões). Por outro lado, a dieta
hipercolesterolêmica diminuiu o tamanho relativo dos rins tanto o esquerdo como o
direito. Pode se sugerir que o aumento dos níveis de colesterol sanguíneos tenha
induzido um acúmulo de lipídios nas artérias renais e/ou nos rins, o que prejudicaria a
função renal reduzindo, conseqüentemente, o tamanho deste órgão. Porém, neste
trabalho, não analisamos histologicamente os rins e artérias renais dos animais.
Mazzolai et al. (2005) observaram um massivo acúmulo de lipídios nos glomérulos,
área justaglomerular e túbulos renais de camundongos ApoE-/- alimentados com dieta
hipercolesterolêmica, corroborando com nossa hipótese.
O desenvolvimento da aterosclerose se inicia com uma injúria sustentada à parede
arterial, que pode ser causada por diversos fatores, mas todos envolvendo estresse
oxidativo (Basta et al., 2002 e Gattone et al., 2001). As células dos mamíferos possuem
um sistema de defesas antioxidantes que incluem enzimas como a superóxido
dismutase, a catalase, a glutationa peoxidase, e moléculas como ascorbato, piruvato,
flavonóides, carotenóides e glutationa (Yokoyama, 2004). Neste trabalho foi analisado o
efeito da dieta hipercolesterolêmica e do tratamento com AVE 0991 sobre o estresse
oxidativo através das dosagens das enzimas catalase e paraoxonase e dos níveis dos
radicais sulfidrilas totais.
Em nosso trabalho a atividade da catalase (Cat), uma das principais enzimas
responsáveis pelo metabolismo do H
2
O
2
, foi significativamente aumentada pela dieta
hipercolesterolêmica. Este resultado pode estar refletindo uma adaptação do animal ao
estresse oxidativo, uma vez que, maiores concentrações da catalase melhoram a
sobrevivência sob tais condições. Os estudos envolvendo a atividade da catalase ainda
são controversos. Tem sido reportado que em pacientes com doença coronariana a
atividade da catalase está diminuída (Leopold et al., 2005) e outros também
encontraram diminuição na atividade da catalase de animais experimentais (Mahfouz,
Silva, A.R. DISCUSSÃO
53
2000). Por outro lado, esse mesmo autor, encontrou resultados controversos entre a
atividade da catalase hepática de coelhos e de ratos. Nossa hipótese pode ser suportada
por Meilhac et al. (2000) que encontraram um aumento na atividade da catalase
induzida por dieta hipercolesterolêmica. Além disso, Inal et al. (2001), observaram uma
correlação positiva entre a atividade da catalase e idade. Para confirmar nossas suspeitas
de que a catalase estaria aumentada como um mecanismo de defesa seria importante
verificar as atividades de duas outras importantes enzimas antioxidantes, a superóxido
dismutase (SOD) e a glutationa peroxidase (GPx). A superóxido dismutase tem como
produto o H
2
O
2
e a glutationa peroxidase também catalisa o H
2
O
2
. Se a atividade da
GPx estiver diminuída os níveis de H
2
O
2
poderão se elevar, o que explica, em parte, os
aumentos da atividade da catalase em resposta a um feedback. Mahfouz (2000)
observou uma diminuição da atividade da GPx e um aumento da catalase, corroborando
com essa hipótese. O tratamento com AVE 0991 não interferiu na atividade da catalase.
O principal representante das esterases “A” é a enzima paraoxonase, hidrolase de
ligações triésters de ácido fosfórico com afinidade específica a organofosforados. A
maior parte da sua atividade está presente no soro associada à HDL, podendo também
ser encontrada em eritrócitos e tecido cerebral (Faggioni, 2003). A paraoxonase
pertence a uma família multigênica de enzimas com três genes designados por PON1,
PON2 e PON3. Esta enzima possui atividades antioxidantes, mas suas isoformas
reagem de maneiras diferentes ao estresse oxidativo (Aviram et al., 2005). Estudos
prévios têm demonstrado que a expressão da PON1 é downregulada pelo estresse
oxidativo, enquanto que a PON2 é upregulada e a PON3 permanece inalterada em
resposta a agentes indutores de estresse oxidativo (Carey et al., 2005). Em nosso
trabalho a dieta hipercolesterolêmica não afetou os níveis séricos da paraoxonase. Em
contraste, outros autores têm relacionado diminuição da atividade da PON1 com altos
níveis de colesterol séricos (Mackness et al., 1991). Subsequentemente Navab et al.
(1997) mostraram que pacientes com altos níveis de HDL mas baixa PON1 eram mais
susceptíveis à DAC do que pacientes com baixo HDL mas alta PON. Estudos adicionais
mostraram que ratos alimentados com dietas suplementadas com diferentes fontes de
gordura alteram diferentemente a atividade da PON, sugerindo que o tipo de lipídio na
dieta influencia na atividade da PON (Kudchodkar et al., 2000). Sendo a PON uma
enzima multifuncional e multigênica, mais estudos são necessários para elucidar as
Silva, A.R. DISCUSSÃO
54
questões acerca das funções, regulação e possíveis intervenções no tratamento das
doenças cardiovasculares.
Em nosso estudo o tratamento com AVE 0991 reduziu a atividade da PON. Os
estudos sobre a intervenção com fármacos e agentes antioxidantes sobre a atividade da
PON são ainda conflitantes. Em ratos a fluvastatina (20 mg/kg/dia) reduziu a atividade
plasmática e hepática da PON1, enquanto que uma dose menor (2 mg/kg/dia) foi efetiva
somente na atividade hepática. Deakin et al. (2003) encontraram um aumento na
atividade sérica de PON1 em pacientes tratados com sinvastatina. Uma vez que a ang-
(1-7) bloqueia os efeitos pró-oxidantes da Ang II (Polizio et al., 2007), esperávamos um
efeito antioxidativo também atribuído a seu análogo AVE 0991. Dois recentes estudos
na população finlandesa reportaram que altos consumos de vegetais, ricos em vitaminas
C e E, estavam negativamente correlacionados com a atividade sérica da PON1 (Rantala
et al., 2002 e Kleemola et al., 2002). Estes estudos sugerem que aumentos dos
antioxidantes exógenos diminuem a atividade da PON, provavelmente como uma
resposta adaptativa à diminuição no estresse. Em nosso trabalho, a dosagem da
atividade da PON foi realizada utilizando somente um de seus substratos, o fenilacetato.
Dessa forma, conseguimos avaliar somente a atividade arilesterase da PON. Além disso,
a maioria dos trabalhos verifica somente a atividade da PON1 (Mackness et al., 1991;
Navab et al.,1997; Costa et al., 2005) e nossa metodologia não nos permite distinguir
entre as isoformas. Na PON2 e PON3 falta a atividade paraoxonase ou arilesterase
(Costa et al., 2005), e como dito anteriormente, reagem de maneiras diferentes ao
estresse oxidativo.
Existe uma variação de 40X na atividade sérica da PON1 dentro dos indivíduos; e
provavelmente diversos outros polimorfismos serão ainda caracterizados (Costa et al.,
2005). Futuros estudos são necessários para elucidar os mecanismos moleculares e
bioquímicos que modulam a expressão e atividade da PON, podendo assim, identificar
novas ações e, mais importante, novos fatores protetores.
Além da paraoxonase e da catalase, dosamos também os radicais sulfidrilas
presentes no soro dos hamsters. Esses radicais representam todos os grupos tióis
encontrados na glutationa, em proteínas e em compostos de baixo peso molecular no
plasma (Wisdom et al., 1991). A dosagem de sulfidrilas pode ser mais um indicativo do
nível de estresse oxidativo ao qual o organismo é submetido, uma vez que eles podem
Silva, A.R. DISCUSSÃO
55
ser oxidados quando o estresse oxidativo está elevado, diminuindo o nível de tióis no
plasma. Nossos resultados mostraram que a dieta hipercolesterolêmica reduziu os níveis
de sulfidrilas totais, confirmando o aumento no estresse oxidativo observado pela
dosagem da atividade da catalase. Além disso, nossos dados mostraram que o
tratamento com AVE 0991 aumentou os radicais sulfidrilas no grupo controle tratado,
indicando que esses radicais sofriam menor grau de oxidação nesses animais. Sen e
Packer (2000) ressaltaram que os tióis têm como característica funcional a capacidade
de atuar como agentes redutores, podendo se ligar às espécies reativas de oxigênio
neutralizando o potencial oxidativo dessas moléculas.
Para avaliar se a dieta hipercolesterolêmica e/ou o tratamento com AVE 0991
estavam interferindo em parâmetros cardiovasculares, verificamos também os níveis de
pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) nos animais experimentais. A
dieta hipercolesterolêmica e o tratamento com AVE 0991 não influenciaram tanto na
PAM como na FC aferidas no fim do experimento. Outros autores também não
encontraram alterações nesses parâmetros devido a aumentos dos lipídios na dieta
(Kowala et al., 1998; Uehara et al., 2002 e Mawatari et al., 2004). A hipertensão é uma
doença multifatorial e PAM possui diversos mecanismos de controle, tanto neurais
como humorais. É certo de que um único fator de risco induzido em nosso trabalho não
foi suficiente para provocar um descontrole nos sistemas. Faria-Silva et al. (2005) não
encontraram alterações na PAM ou FC em ratos submetidos a infusões (i.v) de AVE
0991 em diferentes doses, confirmando nossos resultados.
Em síntese, nossos dados sugerem que a dieta hieprcolesterolêmica contendo 0,5%
de colesterol e 17% de gordura de coco administrada por 120 dias foi eficiente em
induzir lesões ateroscleróticas em hamsters. Mais importante, o tratamento desses
animais com AVE 0991 provavelmente atenua essas lesões, independente de alterações
na PAM, FC e nos níveis plasmáticos de lipídios.
Silva, A.R. CONCLUSÕES
56
7.
CONCLUSÕES
Em síntese, os resultados do presente estudo mostram:
•
A dieta AOAC modificada, utilizada neste estudo, foi eficaz em induzir um
perfil dietético hipercolesterolêmico.
•
A dieta semipurificada no presente estudo aumentou o estresse oxidativo dos
animais, observado através do aumento da atividade da catalase e diminuição
dos grupos sulfidrilas no soro, ambos refletindo uma adaptação do animal ao
estresse oxidativo,
•
A análise histopatológica do coração, válvula e arco aórticos, mostrou o
aparecimento de lesões vasculares em 33,34% dos animais
hipercolesterolêmicos, mostrando que a dieta utilizada foi eficiente em induzir o
aparecimento de lesões ateroscleróticas em hamsters.
•
O tratamento com AVE 0991 não alterou os níveis séricos de colesterol total,
bem como de suas frações.
•
O tratamento com AVE 0991 por 30 dias reduziu os níveis da PON,
provavelmente por um mecanismo de resposta a um antioxidante exógeno
(AVE). Além disso, nossos dados mostraram que o tratamento com AVE 0991
aumentou os radicais sulfidrilas no grupo controle tratado, indicando que esses
radicais sofriam menor grau de oxidação nesses animais.
•
Tanto a dieta hipercolesterolêmica como o tratamento com AVE 0991 não
influenciaram na PAM e FC
•
Nos animais tratados com AVE 0991 não foi encontrado nenhum tipo de lesão
ou marcação sudanofílica através da análise histopatológica.
Em síntese, nossos dados sugerem que a dieta hiepercolesterolêmica utilizada
nesse estudo foi eficiente em induzir lesões ateroscleróticas em hamsters. Além disso,
nossos resultados indicam que o tratamento desses animais com AVE 0991
possivelmente atenua essas lesões, sem causar alterações na PAM, FC e nos níveis
plasmáticos de lipídios.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
57
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ardaillou, R. (1997) Active fragments of angiotensin II: enzymatic pathways of
synthesis and biological effects. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 6(1):28-34.
Association of Official Analytical Chemists (AOAC). (1980) Official Methods of
Analysis,
Tenth Edition. Pushied by The Association of Official Agricultural Chemists
Whashington. pp. 437.
Ausman, L.M.; Rong, N.; Nicolosi, R.J. (2005) Hypocholesterolemic effect of
physically refined rice bran oil: studies of cholesterol metabolism and early
atherosclerosis in hypercholesterolemic hamsters. Journal of Nutritional Biochemistry.
16:521-529.
Aviram, M.; Rosenblat, M. (2005) Paraoxonases and cardiovascular diseases:
pharmacological and nutritional influences. Current Opinion in Lipidology. 16:393–399.
Basta, G.; Lazzerini, G.; Massaro, M.; Simoncini, T.; Tanganelli, P.; Fu, C.; Kislinger,
T.; Stern, D.M.; Schmidt, A.M.; De Caterina, R. (2002) Advanced glycation end
products activate endothelium through signal-transduction receptor RAGE: a
mechanism for amplification of inflammatory responses. Circulation. 105:816-822.
Beaglehole, R. (1999) International trends in coronary heart disease mortality and
incidence rates. J Cardiovasc Risk. 6:63-8.
Beltowski, J., Wojicicka, G., Jamroz, A. (2002) Differential effect of 3 - hydroxy - 3 -
methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on plasma paroxanase 1 activity in the
rat. Pol. J. Pharmacol. 54(6): 661-71.
Benter, I.F.; Yousif, M.H.; Anim, J.T.; Cojocel, C.; Diz, D.I. (2006) Angiotensin-(1-7)
prevents development of severe hypertension and end-organ damage in spontaneously
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
58
hypertensive rats treated with L-NAME. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290:H684-
H691.
Berliner, J.A.; Navab, M.; Fogelman, A.M.; Frank, J.S.; Demer, L.L.; Edwards, P.A.;
Watson, A.D.; Lusis, A.J. (1995) Atherosclerosis: Basics mechanisms. Circulation.
91(9):2488-2496.
Berliner, J.A.; Territo, M.C.; Sevanian, A.; Ramin, S.; Kim, J.A.; Bamshad, B.;
Esterson, M.; Fogelman, A.M. (1990) Minimally modiefied LDL stimulates monocyte
endothelial interactions. J Clin Invest. 85:1260-1266.
Beutler, E. (1975) Red Cell Metabolism. 2a edition, Greene & Statton, New York, pp:
160.
Beynem, A.C.; West, C.E.; Zutphen, L.F.M.; Van and Katan, M.B. (1986) Relation
between the responses of serum cholesterol to dietary cholesterol and to the type of
dietary fat in random-bred rabbits. Circ Res. 58:331-340.
Brasier, A.R.; Recimos III, A.; Eledrisi, M.S. (2002) Vascular inflammation and the
renin-angiotensin system. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22:1257-1266.
Bravo, E.; Cantafora, A.; Calcabrini, A.; Ortu, G. (1994) Why prefer the golden Syrian
hamster (Mesocricetus auratus) to the Wistar rat in experimental studies on lipoprotein
metabolism? Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and
Molecular Biology. 107 (2):347-355.
Brody, T. (1993) Nutritional Biochemistry. Academic Press, INC. San Diego,
California. pp 261-276.
Brown, M.S.; Goldstein, J.L. (1990) Scavenging for receptors. Nature. 343:508-509.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
59
Carey, J.Ng.; Shiha, D.M.; Hama, S.Y.; Villa, N.; Navab, M.; Reddy, S.T. (2005) The
paraoxonase gene family and atherosclerosis. Free Radical Biology & Medicine.
38:153– 163.
Chilton, R.J. (2004) Pathophysiology of coronary heart disease: a brief review. JAOA.
supl 7, vol 104(9):S5-S8
Costa, L.G.; Vitalone, A.; Cole, T.B.; Furlong, C.E. (2005) Modulation of paraoxonase
(PON1) activity. Biochemical Pharmacology. 69:541–550.
Criqui, M.H.; Golomb, B.A. (1998) Epidemiologic aspects of lipid abnormalities. The
American Journal of Medicine. 105(1) suppl.1:48S-57S.
Cushing, S.D., Berliner, J.A., Valente, A.J., Territo, M.C., Navab, M., Parhami, F.,
Gerrity, R., Schwartz, C.J., Fogelman, A.M. (1990) Minimally modified low density
lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and
smooth muscle cells. Cell Biology, 87: 5134-5138.
Daley, S.J.; Klemp, K.F.; Guyton, J.H.; Hogers, K.A. (1994) Cholesterol-fed and
casein-fed rabbit models of atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 14:105-114.
Das, U.N. (2005) Is angiotensin-II an endogenous pro-inflamatory molecule? Med Sci
Monit. 11:RA155-162.
de Gasparo, M.; Catt, K.J.; Inagami, T.; Wright, J.W.; Unger, T. (2000) International
union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacol Rev. 52:415-
72.
Deakin, S.; Leviev, I.; Guernier, S.; James, R.W. (2000) Simvastatin modulates
expression of the PON1 gene and increases serum paraoxonase: a role for sterol
regulatory element-binding protein-2. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:2083–9.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
60
DelliPizzi, A.M.; Hilchey, S.D.; Bell-Quilley, C.P. (1994) Natriuretic action of
angiotensin-(1-7). Br J Pharmacol. 111:1-3.
Donoghue, M.; Hsieh, F.; Baronas, E.; Godbout, K.; Gosselin, M.; Stagliano, N.; et al.
(2000) A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase (ACE2)
converts angiotensin I to angiotensin 1–9. Circ Res. 87:E1–9.
Faggioni, T. (2003) O efeito do hábito de fumar sobre a atividade da enzima
paraoxonase em uma população humana. Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de
Saúde Pública. Dissertação de Mestrado.
Faria-Silva, R.; Duarte, F.V.; Santos, R.A.S. (2005) Short-term angiotensin-(1-7)
receptor Mas stimulation improves endothelial function in normotensives rats.
Hypertension. 46[part 2]:948-952.
Ferrario, C.M. (2002) Use of angiotensin II blokers in animal models of atherosclerosis.
American Journal of Hypertension. 15:9S-13S.
Ferrario, C.M. (2006) Role of the rennin-angiotensin-aldosterone system and
proinflammatory mediators in cardiovascular disease. Am J Cardiol. 98:121-128.
Ferrario, C.M.; Barnes, K.L.; Block, C.H.; Brosnihan, B. et al. (1990) Pathways of
angiotensin formation and function in the brain. Hypertension. 15(suppl I):I-13-I-19.
Ferrario, C.M.; Chappel, M.C.; Tallant, E.N.; Brosnihan, K.B.; Diz, D.I. (1997)
Counterregulatory actions of angiotensin-(1-7). Hypertension. 30[part 2]:535-541.
Ferreira, A.J.; Oliveira, T.L.; Castro, M.C.M.; Almeida, A.P.; Castro, C.H.; Caliari,
M.V.; Gava, E.; Kitten, G.T.; Santos, R.A.S. (2007) Isoprotereno-induced impairment
of heart function and remodeling are attenuated by the nonpeptide angiotensin-(1-7)
analogue AVE 0991. Life Sciences. 81:916-923.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
61
Ferreira, A.J.; Santos, R.A.S. (2005) Cardiovascular actions of angiotensin-(1-7). Braz J
Med Biol Res. 38:499-507.
Freeman, M.; Ashkenas, J.; Rees, D.J.; Kingsley, D.M.; Copeland, N.G.; Jenkins, N.A.;
Krieger, M. (1990) An ancient, highly conserved family of cysteine-rich protein
domains revealed by cloning type I and type II murine macrophage scavenger receptors.
Proc Natl Acad Sci USA. 87:8810-8814.
Gattone, M.; Lacoviello, L.; Colombo, M.; Castelnuovo, A.D.; Soffiantino, F.;
Gramoni, A.; Picco, D.; Benedetta, M.; Giannuzzi, P. (2001) Chlamydia pneumoniae
and cytomegalovirus seropositivity, inflammatory markers, and the risk of myocardial
infarction at a young age. Am Heart J. 142:633-640.
Girendling, K.K.; Minien, C.A.; Ollerenshaw, J.D.; Alexander, R.W. (1994)
Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular
smooth muscle cells. Circ Res. 74:1141-48.
Gironacci, M.M.; Adler-Graschinsky, E.; Peña, C.; Enero, M.A. (1994) Effects of
angiotensin II and angiotensin-(1-7) on release of [
3
H]-norepinephrine from rat atria.
Hypertension. 24:457-60.
Goldscmidt-Clermont, P.J.; Creager, M.A.; Losordo, D.W.; Lam, G.K.W.; Wassef, M.;
Dzau, V.J. (2005) Atherosclerosis 2005: recent discoveries and novel hypotheses.
Circulation. 112:3348-3353.
Gordon, T.; Castelli, W.P.; Hjortland, M.C. et al. (1977) High density lipoprotein as a
protective factor against coronary heart disease: the Framingham Study. Am J Med.
62:707-714.
Goulinet, S.; Chapman, M.J. (1993) Plasma lipoproteins in the Golden Syrian hamster
(Mesocricetus auratus): heterogeneity of apoB- and apoA-I-containing particles.
Journal of Lipid Research. 34:943-959.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
62
Graninger, M.; Reiter, R.; Drucker, C.; Minar, E.; Jilma, B. (2004) Angiotensin receptor
blockade decreases markers of vascular inflammation. J Cardiovasc Pharmacol. 44:335-
339.
Grothusen, C.; Bley, S.; Selle, T.; Luchtefeld, M.; Grote, K.; Tietge, U.J.F.; Drexler, H.;
Schieffer, B. (2005) Combined effects of HMG-CoA-reductase inhibition and renin-
angiotensin system blockade on experimental atherosclerosis. Atherosclerosis. 182:57-
69.
Hanley, M.R.; Cheung, W.T.; Hawkins, P.; Poyner, D.; Benton, H.P.; Blair, L.; Jackson,
T.R.; Goedert, M. (1990) The mas oncogene as a neural peptide receptor: expression,
regulation and mechanism of action. Ciba Found Symp. 150:23-38.
Henry, J.B. (1996) Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 19
a
ed.
Saunders Company.
Inal, M.E., Kanbak, G., Sunal, E. (2001) Antioxidant enzyme activities and
malondialdehyde levels related to aging. Clin. Chim. Acta. 305:75–80.
International Clinical Epidemiology Network (INCLEN). (1992) Risk factors for
cardiovascular disease in developing world. A multicentre collaborative study in
International Clinical Epidemiology Network (INCLEN). INCLEN Multicentre
Collaborative Group. J. Clin. Epidemiol. 45(8): 841-7.
Jackson, T.R.; Blair, L.A.; Marshall, J.; Goedert, M.; Hanley, M.R. (1988) The mas
oncogene encodes an angotensin receptor. Nature. 335:437-440.
Kádár, A.; Glasz, T. (2001) Development of atherosclerosis and plaque biology.
Cardiovascular Surgery. 9(2):109-121.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
63
Kahlon, T.S.; Chow, F.I.; Irving, D.W.; Sayre, R.N. (1997) Cholesterol response and
fatty streak formation in hamsters fed two levels of saturated fat and various levels of
cholesterol. Nutrition Research. 17:1693-1707.
Keidar, S.; Kaplan, M.; Gamliel-Lazarovich, A. (2007) ACE2 of the heart: from
angiotensin I to angiotensin (1-7). Cardiovascular Research. 73:463-469.
Keidar, S; Attias, J.; Smith, J.; Breslow, J.L.; Hayek, T. (1997) The angiotensin II
receptor antagonist, losartan, inhibits LDL lipid peroxidation and atherosclerosis in
apolipoprotein E-deficient mice. Biochemical and Biophysical Research
Communications. 236:622-625.
Kim, J.A.; Berliner, J.A.; Nadler, J.L. (1996) Angiotensin II increases monocyte
binding to endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Commnications.
226:862-868.
Kleemola, P.; Freese, R.; Jaulainen, M.; Pahlman, R.; Alfthan, G.; Mutanen, M. (2002)
Dietary determinants of serum paraoxonase activity in healthy humans. Atherosclerosis.
160:425–32.
Kowala, M.C.; Valentine, M.; Recce, R.; Beyer, S.; Goller, N.; Durham, S.; Aberg, G.
(1998) Enhanced reduction of atherosclerosis in hamsters treated with pravastatin and
captopril: ACE in atheromas provides cellular targets for captopril. Journal of
Cardiovascular Pharmacology. 32(1):29-38.
Kucharewicz, I.; Buczko, W. (2000) The antithrombotic action of angiotensin-(1-7) in
experimental venous thrombosis model in renal hypertensive rats. Fibrynolysis and
Proteolysis. 14(suppl 1):56.
Kudchodkar, B.J.; Lacko, A.G.; Dory, L.; Fungwe, T.V. (2000) Dietary fat modulates
serum paraoxonase 1 activity in rats. J Nutr. 130:2427–33.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
64
Kwiterovich, Jr.P.O. (2000) The metabolic pathways of high-density lipoprotein, low-
density lipoprotein, and triglycerides: a current review. Am J Cardiol. 86 (suppl):5L-
10L.
Lemos, V.S.; Silva, D.M.R.; Walther, T.; Alenina, N.; Bader, M.; Santos, R.A.S. (2005)
The endothelium-dependent vasodilator effect of the nonpeptide ang-(1-7) mimic AVE
0991 is abolished in the aorta of Mas-Knouckout mice. J Cardiovasc Pharmacol.
46:274-279.
Le Tran, Y.; Forster, C. (1997) Angiotensin-(1–7) and the rat aorta: modulation by the
endothelium. J Cardiovasc Pharmacol. 30:676–82.
Leopold, J.A.; Loscalzo, J. (2005) Oxidative Enzymopathies and Vascular Disease.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25:1332-1340.
Lichtenstein, A.H. (1996) Atherosclerosis. In: Present Knowled in Nutrition. 7
th
edition.
ILIS Press. Washington DC. 42:430-437.
Lima, C.V.; Paula, R.D.; Resende, F.L.; Khosla, M.C.; Santos, R.A.S. (1997)
Potentiation of the hypontensive effect of bradykinin by short-term infusion of
angiotensin-(1-7) in normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 30:542-548.
Lupu, F.; Danaricu, I.; Simionescu, N. (1987) Development of intracellular lipid
deposits in the lipid-laden cells of atherosclerotic lesions: a cytochemical and
ultrastructural study. Atherosclerosis. 67:127-42.
Mackness, M.I.; Arrol, A.; Durringtorm, P.N. (1991) Paraoxonase prevents
accumulation of lipoperoxides in low-density lipoprotein. Federation of European
Biochemical Societies. 286(1.2):152-144.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
Mackness, M.I.; Harty, D.; Bhatnagar, D.; Winocour, P. H.; Arrol, S.; Ishola, M.;
Durrington, P.N. (1991) Serum paraoxonase activity in familial hypercholesterolaemia
and insulin-dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis. 86:193–199.
Mahfouz, M.M.; Kummerow, F.A. (2000) Cholesterol-rich diets have different effects
on lipid peroxidation, cholesterol oxides, and antioxidant enzymes in rats and rabbits. J.
Nutr. Biochem. 11:293–302.
Mawatari, K.; Kakui, S.; Harada, N.; Ohnishi, T.; Niwa, Y.; et al. (2004) Endothelin-1
(1-31) levels are increased in atherosclerotic lesions of the thoracic aorta of
hypercholesterolemic hamsters. Atherosclerosis. 175:203-212.
Mazzolai, L.; Korber, M.; Bouzourene, K.; Aubert, J-F.; Nussberger, J.; Stamcnkovic,
I.; Iiayoz, D. (2005) Severe hyperlipidemia causes impaired renin-angiotensin system
function in apolipoprotein E deficient mice. Atherosclerosis.
Meilhac O, Zhou M, Santanam N, Parthasarathy S. (2000) Lipid peroxides induce
expression of catalase in cultured vascular cells. J Lipid Res. 41:1205-1213.
Miyazaki, M.; Sakonjo, H.; Takai, S. (1999) Anti-atherosclerotic effects of angiotensin
converting enzyme inhibitor and angiotensin II antagonist in Cynomolgus monkeys fed
a high-cholesterol diet. British Journal of Pharmacology. 128:523-529.
Moghadasian, M.H. (2002) Experimental atherosclerosis. A historical overview. Life
Sciences. 70:855-865.
Murray, C.J.L. & Lopez, A.D. (1996) The global burden of disease. Cambridge, MA.
Havard School of Public Health.
Navab, M.; Hama-Levy, S.; Van Lenten, B. J.; Fonarow, G. C.; Carelinez, C. J.;
Castellani, L. W.; Brennan, M.-L.; La Du, B. N.; Lusis, A. J.; Fogelman, A. M. (1997)
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
66
Mildly oxidised LDL induces an increased apolipoprotein J/paraoxonase ratio. J. Clin.
Invest. 99:2005– 2019.
Negre-Salvayre, A.; Dousset, N.; Ferretti, G.; Bacchetti, T.; Cutarola, G.; Salvayre, R.
(2006) Antioxidant and cytoprotective properties of high-density lipoproteins in
vascular cells. Free Radical Biology & Medicine. 41:1031-1040.
Nelson, D.L.; Cox, M.M. (2006) Lehninger Princípios de Bioquímica. 4ª ed. Sarvier.
São Paulo, SP. pp 807-819.
Nistor, A.; Bulla, A.; Filip, D.A.; Radu, A. (1987) The hyperlipidemic hamster as a
model of experimental atherosclerosis. Atherosclerosis. 68:159-173.
Nivelstein-Post, P.F.E.M.; Fogelman, A.M.; Mottino, G.; Frank, J.S. (1991) Lipid
accumulation in rabbit aortic intima 2 hours after bolus infusion of low density
lipoprotein. A deep-etch and immunolocalization study of rapidly frozen tissue.
Arterioscler Tromb. 11:1795-1805.
O’Connell, B.J.; Genest, J.Jr. (2001) High-density lipoproteins and endothelial function.
Circulation. 104:1978.
Okrainec, K.; Banerjee, D.K.; Eisenberg, M.J. (2004) Coronary artery disease in
developing world. Am Heart J. 148:7-15.
Omura, T.; Kim, S.; Takeuchi, K.; Iwao, H.; Takeda, T. (1994) Transforming growth
factor beta 1 and extracellular matrix gene expression in isoprenaline induced cardiac
hypertrophy: effect of inhibition of rennin-angiotensin system. Cardiovasc Res. 28:835-
1842.
Osei, S.Y.; Ahima, R.S.; Minkes, R.K.; Weaver, J.P.; Khosla, M.C.; Kadowitz, P.J.
(1993) Differential responses to Ang-(1–7) in the feline mesenteric and hindquarter
vascular beds. Eur J Pharmacol. 234:35–42.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
67
Parhami, E.; Fang, Z.T.; Fogelman, A.M.; Andalibi, A.; Territo, M.C.; Berliner, J.A.
(1993) Minimally modified low density lipoprotein-induced inflammatory responses in
endothelial cells are mediated by cyclic adenosine monophosphate. J Clin Invest.
92:471-478.
Parthasarathy, S. (1994) Modified lipoproteins in pathogenesis of atherosclerosis.
Austin: R.G. Landes Co. 91-119.
Pasqualucci, C.A.; Uint, L.; Lage, S.G. (1999) Aterosclerosis Parte I: Fenômenos
celulares na aterosclerose. Revista Brasileira de Cardiologia. A1N1
Patsch, J.R.; Miesenbock, G.; Hopferwieser, T.; Muhlberger, V.; Kuapp, E.; Dunn, J.K.;
Gotto, A.M.Jr. Patsch, W. (1992) Relation of triglyceride metabolism and coronary
artery disease. Arterioscler Thromb. 12:1336-1345.
Piegas, L.S.; Avezum, A.; Pereira, J.C. et al. (2003) AFIRMAR Study Investigators.
Risk factors for myocardial infarction in Brazil. Am Heart J. 146:331-8.
Pien, C.S.; Davis, W.P.; Marone, A.J.; Foxall, T.L. (2002) Characterization of diet
induced aortic atherosclerosis in Syrian F
1
B hamsters. Journal of Experimental Animal
Science. 42:65-83.
Pinheiro, S.V.B.; Simões e Silva, A.C.; Sampaio, W.O.; de Paula, R.D.; Mendes, E.P; et
al. (2004) Nonpeptide AVE 0991 is an angiotensin-(1-7) receptor Mas agonist in the
mouse kidney. Hypertension. 44:490-496.
Polanczyk, C.A. (2005) Fatores de risco cardiovascular no Brasil: os próximos 50 anos.
Arquivos Brasileiros de Cardiologia. 84(3):199-201.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
68
Polizio, A.H.; Gironacci, M.M.; Tomaro, M.L. Peña, C. (2007) Angiotensin-(1-7)
blocks the angiotensin II – stimulated superoxide production. Pharmacological
Research. 56:86-90.
Quinn, M.T.; Parthasarathy, S.; Fong, L.G.; Steinberg, D. (1987) Oxidatively modified
low density lipoproteins: a potential role n recruitment and retention of
monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 84:2995-2998.
Rajagopalan, S.; Meng, X.P.; Ramasamy, S.; Harrison, D.G.; Galis, Z.S. (1996)
Reactive oxygen species produced by macrophage-derived foam cells regulate the
activity of vascular matrix metalloproteinases in vitro: implications of atherosclerotic
plaque stability. J Clin Invest. 98:2572-2579.
Rajavasisth, T.B.; Andalibi, A.; Territo, M.C.; Berliner, J.A.; Navab, M.; Fogelman,
A.M.; Lusis, A.J. (1990) Modified LDL induce endothelial cell expression of
granulocyte and macrophage colony stimulation factors. Nature. 344:254-257.
Rantala, M.; Silaste, M.L.; Tuominen, A.; Kaikkonen, J.; Salonen, J.T.; Alfthan, G.; et
al. (2002) Dietary modifications and gene polymorphisms alter serum paraoxonase
activity in healthy women. J Nutr. 132:3012–7.
Reddy, K. S., Yusuf, S. (1998) Emerging epidemic of cardiovascular disease in
developing countries. Circulation, 97: 596-601.
Ren, Y.; Garvin, J.L.; Carretero, O.A. (1998) Vasodilator action of angiotensin 1–7
(Ang 1–7) in the isolated afferent arteriole of the rabbit kidney. J Am Soc Nephrol.
9:345A.
Rice, G.I.; Thomas, D.A.; Grant, P.J.; Turner, A.J.; Hooper, N.M. (2004) Evaluation of
angiotensin converting enzyme (ACE), its homologue ACE2 and neprilyzin in
angiotensin peptide metabolism. Biochem J. 383:45-51.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
Rocks, A.J.M.; van Geel, P.P.; Pinto, Y.M.; Buikema, H.; Henning, R.H.; Zeeuw, D.;
van Gilst, W.H. (1999) Angiotensin-(1-7) is a modulator of the human rennin-
angiotensin system. Hypertension. 34:296-30.
Ros, E. (2000) Intestinal absorption of triglyceride and cholesterol. Dietary and
pharmacological inhibition to reduce cardiovascular risk. Atherosclerosis. 151:357-379.
Ross R. (1986) The pathogenesis of atherosclerosis - an update. N Engl J Med. 314:400-
500.
Ross, R. (1993) The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s.
Nature. 362:801-809.
Sampaio, W.O.; Nascimento, A.A.; Santos, R.A.S. (2003) Systemic and regional
hemodynamic effects of angiotensin-(1–7) in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
284:H1985–94.
Santos, R.A.S., Campagnole-Santos, M.J. (1994) Central and peripheral actions of
angiotensin-(1-7). Braz J Med Biol Res. 27:1033-47.
Santos, R.A.S.; Campagnole-Santos, M.J.; Andrade, S.P. (2000) Angiotensin-(1-7): un
update. Regul Pept. 91:45-62.
Santos, R.A.S.; Ferreira, A.J. (2006) Pharmacological effects of AVE 0991, a
nonpeptide angiotensin-(1-7) receptor agonist. Cardiovascular Drug Reviews. 24(3-
4):239-246.
Santos, R.A.S.; Simões e Silva, A.C.; Maric, C.; Silva, D.M.; Machado, R.P.; de Buhr,
I; et al. (2003) Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled
receptor Mas. Proc Natl Acad Sci USA. 100:8258-63.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
70
Schiavone, M.T.; Santos, R.A.S.; Brosnihan, K.B.; Khosla, M.C.; Ferrario, C.M. (1988)
Release of vasopressin from the rat hypotalamo-neurohypophysial sytem by
angiotensin-(1-7) heptapetide. Proc Natl Acad Sci USA. 85:4095-8.
Schmitz, G.; Aslanidis, C.; Lackner, K.J. (1998) Recent advances in molecular genetics
of cardiovascular disorders. Implications for atherosclerosis and diseases of cellular
lipid metabolism. Pathology Oncology Research. 4(2):152-160.
Schwartz, D.; Chaverri-Almada, L.; Berliner, J.A.; Kirchgessner, T.; Quirmorio, D.C.;
Fang, Z.T.; Tekamp-Olson, P.; et al. (1994) The role of a grohomologue in monocyte
adhesion to the endothelium. J. Clin. Invest. 94:1068-1973.
Sedlak, J. e Lindsay, R.H. (1968) Estimation of total, protein-bound, and nonprotein
sulphydryl groups in tissue with Elman’s reagent. Analytical Biochemistry. 25:192-205.
Sen, C.K.; Packer, L. (2000) Thiol homeostasis and supplements in physical exercise.
Am. J. Clin. Nutr. 72(suppl):653S–69S.
Sicart, R.; Sable-Amplis, R.; Guiro, A. (1984) Comparative studies of the circulating
lipoproteins in hamster (Mesocricetus auratus) with a normal or spontaneous high level
of cholesterol in the plasma. Comparative Biochemistry and Physiology Part A:
Physiology. 78(3):511-514.
Silva, J.C.A. (2005) Efeito do excesso de ferro e dieta hipercolesterolêmica sobre o
perfil de lipídios séricos e estresse oxidativo em hamsters. Universidade Federal de
Ouro Preto. Dissertação de Mestrado.
Spady, D.K.; Dietschy, J.M. (1988) Interaction of dietary cholesterol and triglycerides
in the regulation of hepatic low-density lipoprotein transport in the hamster. J. Clin.
Invest. 81:300-309.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
71
Spady, D.K.; Turley, S.D.; Dietschy, J.M. (1985) Rates of low-density lipoprotein
uptake and cholesterol synthesis are regulated independently in the liver. J. Lipid Res.
26:465-472.
Sparrow, C.P.; Parthasaraty, S.; Steinberg, D. (1989) A macrophage receptor that
recognizes oxidized low density lipoprotein but not acetylated low density lipoprotein. J
Biol Chem. 264:2599-2604.
Stanziola, L.; Greene, L.J.; Santos, R.A.S. (1999) Effects of chronic angiotensin
converting enzyme inhibition on angiotensin I and bradykinin metabolism in rats. Am J
Hypertension. 12:1021-1029.
Stary, H.C. (1987) Macrophages, macrophage foam cells, and eccentric intimal
thickening in the coronary arteries of young children. Atherosclerosis. 64:91-108.
Stary, H.C.; Chandler, A.B.; Dinsmore, R.E.; Fuster, V.; Glagov, S.; Insull, J.W.;
Rosenfeld, M.E.; Schwartz, C.J.; Wagner, W.; Wissler, R.W. (1995) A definition of
advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of
atherosclerosis: a report from the committee on vascular lesions of the council on
atherosclerosis, American Heart Association. Atherosclerosis, thrombosis, and Vascular
Biology. 15(9):1512-1531.
Stary, H.C.; Chandler, A.B.; Glagov, S.; Guyton, J.R.; Insull, W.Jr.; et al. (1994) A
definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report
from the committee on vascular lesions of the council on atherosclerosis, American
Heart Association. Circulation. 89:2462-2478.
Steffens, A.A. (2003) Epidemiologia das doenças cardiovasculares. Revista da
Sociedade de Cardiologia do Rio Grande do Sul. Ano XII n3:5-15.
Steinbrecher, U.P.; zhang, H.F.; Lougheed, M. (1990) Role of oxidatively modified
LDL in atherosclerosis. Free Radic. Biol. 9:155-168.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
Strawn, W.B.; Chappell, M.C.; Dean, R.H.; Kivlign, S.; Ferrario, C.M. (2000)
Inhibition of early atherogenesis by losartan in monkeys with diet-induced
hypercholesterolemia. Circulation. 101:1586-1593.
Strawn, W.B.; Ferrario, C.M.; Tallant, E.A. (1999) Angiotensin-(1-7) reduces smooth
muscle growth after vascular injury. Hypertension. 33(1S):207-211.
Strawn, W.B.; Gallagher, P.E.; Tallant, E.A.; Ganten, D.; Ferrario, C.M. (1999)
Angiotensin II AT
1
-receptor blockade inhibits monocyte activation and adherence in
transgenic (mRen2)27 rats. J Cardiovasc Pharmacol. 33(3):341-351.
Tallant, E.A.; Debra, I.D.; Ferrario, C.M. (1999) Antiproliferative actions of
angiotensin-(1-7) in vascular smooth muscle. Hypertension. 34[part 2]:950-957.
Touyz, R.M.; Berry, C. (2002) Recent advances in angiotensin II signaling. Braz J Med
Res. 35(9):1001-1015.
Uehara, Y.; Urata, H.; ideishi, M.; Arakawa, K.; Saku, K. (2002) Chymase inhibition
supresses high-cholesterol diet-induced lipid accumulation in the hamster aorta.
Cardiovascular Research. 55:870-876.
Urata, H.; Kinoshita, A.; Misono, K.S.; Bumpus, F.M.; Husain, A. (1990) Identification
of a highly specific chymase as the major angiotensin II-forming enzyme in the human
heart. J Biol Chem. 265:22348–57.
Vaughan, D.E.; Lazos, S.A.; Tong, K. (1995) Agiotensin II regulates the expression of
plasminogen activator inhibitor-1 in cultered endothelial cells: a potential link between
the renin-angiotensin system an thrombosis. J Clin Invest. 95:995-1001.
Silva, A.R. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
73
Vickers, C.; Hales, P.; Kaushik, V.; Dick, L.; Gavin, J.; Tang, J.; et al. (2002)
Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related
carboxypeptidase. J Biol Chem. 277:14838–43.
Wessel, N.; Malberg, H.; Heringer-Walther, S.; Shultheiss, H.-P.; Walther, T. (2007)
The angiotensin-(1-7) receptor agonist AVE 0991 dominates the circadian rhythm and
baroreflex in spontaneously hypertensive rats. J Cardiovasc Pharmacol. 49:67-73.
Wiemer, G.; Dobrucki, L.W.; Louka, F.R.; Malinski, T.; Heitsch, H. (2002) AVE 0991,
a nonpeptide mimic of the effects of angotensin-(1-7) on the endothelium.
Hypertension. 40:847-852.
Wilson, T.A.; Nicolosi, R.J.; Lawton, C.W.; Babiak, J. (1999) Gender differences in
response to a hypercholesterolemic diet in hamsters: effects on plasma lipoprotein
cholesterol concentrations and early aortic atherosclerosis. Atherosclerosis. 146:83-91.
Wisdom, S.J.; Wilson, R.; Mckillop, J.H. & Walker, J.J. (1991) Antioxidant systems in
normal pregnancy and pregnancy-induced hypertension. American Journal of Obstetrics
and Gynecology. 165:170-174.
Witztum, J.L.; Steinberg, D. (1991) Role of oxidized low density lipoprotein in
atherogenesis. J Clin Invest. 88:1785-1792.
Wolfbauer, G.; Glick, J.M.; Minor, L.K.; Rothblat, G.H. (1986) Development of smooth
muscle foam cell: uptake of macrophage lipid inclusions. Proc Natl Acad Sci USA.
83:7760-7764.
Yokoyama, M. (2004) Oxidant stress and atherosclerosis. Current Opinion in
Pharmacology. 4:110–115.
9. ANEXOS
ANEXO I:
Protocolos fornecidos pelo fabricante Labitest Diagnóstica para determinação das
concentrações séricas de colesterol total, HDL-colesterol, triglicérides e para
determinação da atividade da enzima alanina aminotransferase (ALT).
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