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UNIVERSIDADE FDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO GÊNICA
NAS
CEPAS SELVAGEM W303 E pkc1∆ DE
Saccharomyces
cerevisiae DURANTE O PROCESSO DE
DESREPRESSÃO
METABÓLICA
AUTOR: ANTÔNIO HELVÉCIO TÓTOLA
ORIENTADOR: PROF.DR. ROGELIO LOPES BRANDÃO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do Título de
Doutor em Ciências .
Ouro Preto, Outubro de 2007.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO GÊNICA
NAS
CEPAS SELVAGEM W303 E pkc1∆ DE
Saccharomyces
cerevisiae DURANTE O PROCESSO DE
DESREPRESSÃO
METABÓLICA
AUTOR: ANTÔNIO HELVÉCIO TÓTOLA
ORIENTADOR: PROF.DR. ROGELIO LOPES BRANDÃO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do Título de
Doutor em Ciências .
Ouro Preto, Outubro de 2007.
I
I
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Biologia celular e Molecular do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto (NUPEB), sob
a orientação do professor Dr. Rogelio Lopes Brandão e com o auxílio financeiro da
Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Universidade Federal de
Ouro Preto.
III
“Cantar e cantar e cantar”,
A beleza de ser um eterno aprendiz".
Dedico este trabalho
Ao meu pai, grande pescador! “In memorian”.
A minha mãe, que sempre me incentivou e me serviu de exemplo!
A Cristiane, minha companheira, amiga e mulher que sempre esteve ao meu lado mesmo
quando era difícil. Seu amor e paciência me trouxeram até aqui.Te amo, sempre!
A minha filha Maria Clara, luz da minha vida!
IV
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador professor Dr. Rogelio Lopes Brandão, pela confiança e pelo
exemplo.
Ao meu amigo professor Dr. Ieso de Miranda Castro, pelo apoio e suporte em
todos os momentos.
Ao amigo professor Dr.Luciano Gomes Fietto pela amizade e disponibilidade
para discutir as idéias, os resultados e as divagações.
A amiga professora Dra. Juliana Rangel Fietto, pela ajuda e pela amizade.
A Zezé, grande microbiologista do LBCM, sempre pronta a ajudar e sempre
trazendo alegria ao laboratório.
Ao Eduardo e demais colegas do LIP, pela ajuda e pelo papo sempre alegre
(principalmente quando o Cruzeiro ganhava ou o Galo perdia).
Aos amigos e colegas do LBCM, que sempre se mostraram dispostos a ajudar e
colaborar, mesmos nos momentos mais difíceis.
À Cida, sempre alegre e disposta a ajudar no que for necessário.
Aos professores, funcionários e alunos dos laboratórios do NUPEB, pela
convivência e amizade.
Aos alunos de graduação, pelo aprendizado e convivência.
Ao curso de pós-graduação pela oportunidade.
A minha família pelo apoio e incentivo.
V
RESUMO
A levedura Saccharomyces cerevisiae possue uma via MAP quinase de
transdução de sinais composta por Pkc1p, Bck1p, Mkk1p e Mkk2p, e Mpk1p. Já foi
descrito que esta via está envolvida no controle da integridade da parede celular, na
resposta ao estresse osmótico, no crescimento de pseudo-hifas e no controle do
metabolismo de carbono. Neste trabalho investigamos a participação de Pkc1p no
controle da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono.Para isto, fizemos
uma analise da expressão gênica global através de microarranjos de DNA comparando a
resposta global sob condições de repressão e desrepressão metabólica no mutante a pkc1
∆ e na cepa selvagem correspondente W303. Os resultados obtidos indicaram uma
diferença significativa na expressão global dos genes nas duas cepas analisadas. Vinte e
oito genes envolvidos no metabolismo de carbono foram selecionados para validação por
RT-PCR e os resultados confirmaram que sete genes foram mais expressos na cepa W303
quando comparada com a cepa e quatro genes foram mais expressos na cepa pkc1 ∆
quando comparada com a cepa selvagem.Análises “In silico” apontaram três fatores de
transcrição Sok2p, Crz1p and Gcr1p, que podem estar envolvidos no controle da
expressão gênica por Pkc1p. Experimentos utilizando plasmídeos contendo o gene da β-
galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram
que a expressão destes genes se apresentava diminuída na cepa pkc1 ∆ para o gene
HXT1, aumentada para o gene CYC1 e igual para o gene SUC2 quando comparada com a
cepa selvagem W303. A atividade de Invertase apresenta-se significativamente diminuída
na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem W303. Nossos resultados
VI
confirmam a participação da proteína Pkc1p na regulação da expressão gênica durante o
processo de desrepressão metabólica.
V
I
I
ABSTRACT
The yeast Saccharomyces cerevisiae presents a PKC MAP kinase signal
transduction pathway composed of Pkc1p, Bck1p, Mkk1p and Mkk2p, and Mpk1p. It
was described that this cascade is involved in the control of the cell wall integrity,
osmotic stress response, pseudohyphal growth and control of carbon metabolism. In this
work we investigate the participation of Pkc1p in the control of genes involved in the
carbon metabolism. We have performed a microarray based expression analysis to
compare the global response under repressed and derepressed conditions in a pkc1 ∆
mutant and the correspondent wild-type strain W303. The results indicated a significant
difference in the gene expression between the two strains. Twenty eight genes involved in
carbon metabolism were selected for further validation by RT-PCR and the experiments
confirmed that seven genes were more expressed in the wild type W303 when compared
with the pkc1 ∆ mutant and four genes were more expressed in the pkc1 ∆ mutant when
compared with the wild type W303 cells. “In silico”analyses shows that three
transcription factors, Sok2p, Crz1p and Gcr1p, may be involved with the control of gene
expression by Pkc1p. The β-galactosidase plasmid constructions show that the
transcription of HXT1gene is reduced, CYC1 is higher and SUC2 s is not different on the
pkc1 ∆ mutant when compared with the wild type W303 cells. The Invertase activity is
smaller in the pkc1 ∆ mutant than in the wild type W303 cells. Our results confirm the
participation of the protein Pkc1 p in gene expression regulation during the metabolic
derepression process.
VIII
ÍNDICE
RESUMO.....................................................................................................
ABSTRACT.................................................................................................
LISTA DE ABREVIAÇÕES......................................................................
LISTA DE TABELAS.................................................................................
LISTA DE FIGURAS.................................................................................
V
VI
I
X
XI
V
XV
1.
Introdução....................................................................................................
2
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64
5.
Conclusões....................................................................................................
70
6.
Perspectivas..................................................................................................
73
7.
Referências Bibliográficas………………………………………………..
75
X
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ARG82 – Gene que codifica para uma Inositol polifosfato multiquinase (IPMK), fosforila
Ins (1,4,5)P3 formando Ins(1,3,4,5,6)P5;
BEM2 – Gene que codifica para uma proteína Rho GTPase envolvida no controle da
organização do citoesqueleto e da morfogênese celular
Cdc24 – Gene que codifica para um fator de troca de guanina para Cdc42p
CLN1 – Gene que codifica para uma ciclina envolvida na regulação do ciclo celular; ativa
a quinase Cdc28p e promove a transição da fase G1 para S.
CLN2 - Gene que codifica para uma ciclina envolvida na regulação do ciclo celular; ativa
a quinase Cdc28p e promove a transição da fase G1 para S
COX14 – Gene que codifica para uma proteína da membrana mitocondrial, necessária à
montagem da citocromo oxidase.
Crz1p – Fator de transcrição que ativa genes envolvidos na resposta ao estresse.
CSD2 – Gene que codifica para uma quitina sintase que catalisa a transferência de N-
acetilglicosamina para a quitina.
CYB2 – Gene que codifica para o Citocromo b2; reprimido por glicose e condições
anaeróbicas.
CYC1 - Gene que codifica para o Citocromo c, isoforma 1; transportador de elétrons do
espaço intermembranas da mitocôndria.
DLD1 - Gene que codifica para a D-lactato desidrogenase, oxida D-lactato a piruvato;
reprimida por glicose.
FKS1 – Gene que codifica para uma subunidade catalítica do complexo 1,3-beta-D-
glucano sintase; envolvida na sintese e manutenção da parede celular.
FKS2 - Gene que codifica para uma subunidade catalítica do complexo 1,3-beta-D-
glucano sintase; envolvida na formação da camada interna da parede celular.
FUM1 - Gene que codifica para a Fumarase; converte acido fumárico a acido L-málico
no ciclo dos ácidos tricarboxílicos.
Gcr1p – Fator de transcrição envolvido na regulação da glicólise
GLC3 – Gene que codifica para uma enzima ramificadora do glicogênio
Gpa1p - Proteína G de membrana envolvida na conjugação de leveduras
XI
GPT2 - Gene que codifica para a Glicerol-3-fosfato/dihidroxiacetona fosfato
aciltransferase envolvida na acilação de glicerol-3-fosfato e dihidroxiacetona fosfato
durante a síntese de lipídeos.
GRE1 – Gene que codifica para uma Hidrofilina de função desconhecida, induzida por
estresse; regulada pela via HOG.
GUT1 - Gene que codifica para a Glicerol quinase, converte glicerol a glicerol-3-fosfato
GUT2 - Gene que codifica para am Glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial;
reprimida por glicose e cAMP
Hog1p - Proteína quinase ativada por mitógenos envolvida na síntese de glicerol
Hxk2p - Proteína Hexoquinase P2, que catalisa a fosforilação de glicose no citosol.
ICL2 - Gene que codifica para uma 2-metilisocitrato liase da matriz mitocondrial, catalisa
a conversão de 2-metilisocitrato a succinato e piruvato.
JEN1 – Gene que codifica para um transportador de lactato, necessário à captação de
lactato e piruvato; reprimido por glicose.
MDH2 – Gene que codifica para a Malato desidrogenase citoplasmática; catalisa a
interconversão de malato e oxalacetato; interage com Pck1p e Fbp1p
Mid2p – Proteína da membrana plasmática que atua como sensor da via de integridade
celular; interage com Rom2p e com a proteína Zeo1p
Mig1p - Proteína repressora estimulada por glicose
MNN1 - Gene que codifica para uma Alfa-1,3-manosiltransferase do complexo de Golgi
responsável pela formação de ligações alfa1,3-manose em oligossacarídeos N e O
ligados.
Msb2p –Membro da família das mucinas, participa na via de crescimento filamentoso
dependente de Cdc42p e da via de MAP quinases.
Msn5p - Exportina envolvida na translocação do fator Mig1 p
Pak1p – Serina-Treonina quinase do complexo SNF1;parcialmente redundante a Elm1p
e Tos3p;
PCL1 - Gene que codifica para uma Ciclina envolvida na entrada do ciclo mitótico e na
regulação da morfogênese
PCL2 - Gene que codifica para uma Ciclina envolvida na entrada do ciclo mitótico e na
regulação da morfogênese
X
I
I
PDC1 – Gene que codifica para a Piruvato descarboxilase, enzima envolvida na
fermentação alcoólica; descarboxila piruvato a acetaldeído
PFK2 – Gene que codifica para a Fosfofrutoquinase 2, envolvida na glicólise e
indispensável para o crescimento em anaerobiose; ativada por frutose 2,6-bisfosfato e
AMP.
PLC1 – Gene que codifica para a Fosfolipase C, hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
(PIP2) para gerar inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e 1,2-diailglicerol (DAG)
PYC1 – Gene que codifica para a Piruvato carboxilase, enzima citoplasmática que
converte piruvato a oxalacetato
Ras – CDC42 - Proteína ativadora da enzima adenilato ciclase
Reg1p-Glc7p – Subunidades regulatórias envolvidas na regulação negativa de genes
reprimidos por glicose.
Rga1p – Proteína ativadora de GTPase
RHR2 – Gene que codifica para uma isoforma constitutivamente expressa da DL-
glicerol-3-fosfatase; envolvida na biossíntese do glicerol; induzida em condições
anaeróbicas e por estresse osmótico.
Rlm1p - Regulador gênico envolvido na síntese da parede celular
ROM1 – Gene que codifica para uma proteína que atua como fator de troca GDP/GTP
ROM2 - Gene que codifica para uma proteína que atua como fator de troca GDP/GTP
para Rho1p e Rho2p
RSF2 – Gene que codifica para uma proteína do tipo dedo de zinco, envolvida no
controle transcricional de genes mitocondriais e nucleares necessários ao crescimento em
glicerol.
SAC7 – Gene que codifica para uma proteína ativadora da GTPase para Rho1p, envolvida
com o citoesqueleto de actina.
SDH1 – Gene que codifica para uma Flavoproteína do complexo da succinato
desidrogenase, participa na transferência de elétrons para a ubiquinona
Sho1p – Sensor osmótico transmembrana, participa na ativação de Cdc42p, do
crescimento filamentoso dependente da via de MAP quinases e da via HOG.
Slg1p –Sensor da via de resposta ao estresse ativada por PKC1-MPK1;envolvida na
manutenção da integridade da parede celular e na organização do citoesqueleto.
XIII
SLN1 – Gene que codifica para um sensor osmótico que regula a cascata das MAP
quinases
Slt2p – Serina-treonina Map quinase envolvida na regulação da manutenção da parede
celular e na progressão do ciclo celular. Regulada pela via de PKC1.
Snf1p – Proteína quinase envolvida na via principal de repressão por glicose
Snf4p - Subunidade ativada da proteína Snf1;ativa genes reprimidos por glicose e reprime
genes induzidos por glicose.
Sok2p – Proteina nuclear que desempenha um papel regulatório na via de PKA
dependente de AMP cíclico; regula negativamente o crescimento de pseudo-hifas
Ssk2p - Gene que codifica para uma MAPKKK envolvida na síntese de glicerol; interage
com Ssk1p, induzindo a ativação de Ssk2p.
Ssk22p - Gene que codifica para uma MAPKKK envolvida na síntese de glicerol;
homologo a Ssk2p.
Ssn6p–Tup 1p - Co-repressores transcricionais do complexo que recruta SWI/SNF e
SAGA
Ste12p – Fator de transcrição ativado pela via das MAP quinases, ativa genes envolvidos
na conjugação e no crescimento de pseudohifas.
Ste11p Proteína quinase quinase quinase envolvida na conjugação de leveduras
STE2 - Gene que codifica para o receptor do fator α de acasalamento
Ste20p - Proteína quinase envolvida na conjugação de leveduras
STE3 - Gene que codifica para o receptor do fator a de acasalamento
SUC2 -Gene que codifica para a invertase
Swi4p-Swi6p – Componentes do complexo SBF de ligação ao DNA; ativador
transcricional que regula a transcrição de genes necessários à síntese e reparo do DNA.
TKL2 - Gene que codifica para uma transcetolase, similar a Tkl1p; catalisa a conversão
de xilulose-5-fosfato e ribose-5-fosfato a sedoheptulose-7-fosfato e gliceraldeído-3-
fosfato na via das pentoses fosfato.
TOR2 – Gene que codifica para uma proteína quinase do complexo TORC1, que regula o
crescimento em resposta a nutrientes; envolvida na meiose.
YDR 019c - Gene que codifica para uma subunidade do complexo da glicina
descarboxilase mitocondrial
XIV
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Classificação taxonômica da levedura Saccharomyces cerevisiae
Tabela 02 Marcos histórico da utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae
Tabela 03 Processos e produtos obtidos com o emprego da levedura Saccharomyces
cerevisiae
Tabela 04 Receptores e transportadores funcionais de glicose na levedura
Saccharomyces cerevisiae
Tabela 05 Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas nos experimentos
Tabela 06 Plasmídeos LacZ repórter
Tabela 07 Iniciadores utilizados nos experimentos de RT-PCR para validação dos
experimentos de microarranjos de DNA
Tabela 08 Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Sok2p
Tabela 09 Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Crz1p
Tabela 10 Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Gcr1p
XV
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Principais laboratórios envolvidos no projeto genoma da levedura
Saccharomyces cerevisiae.
Figura 02 Proteínas da membrana plasmática de células eucarióticas envolvidas na
detecção de nutrientes
Figura 03 Vias de MAPK presentes em Saccharomyces cerevisiae
Figura 04 Via de resposta aos hormônios de acasalamento
Figura 05 Mecanismos de adaptação aos choques hipertônico e hipotônico em
Saccharomyces cerevisiae
Figura 06 Via HOG (High Osmolarity Glycerol) in Saccharomyces cerevisiae
Figura 07 Distribuição esquemática dos domínios na proteína Pkc1p
Figura 08 Representação esquemática dos principais componentes da via de Pkc1p
de Saccharomyces cerevisiae
Figura 09 Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os
cDNAs da cepa W303.
Figura 10 Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os
cDNAs da cepa Pkc1∆.
Figura 11 Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após
hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303
Figura 12 Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após
hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa Pkc1∆
Figura 13 Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas
obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303
Figura 14 Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas
obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa Pkc1∆
Figura 15 Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da
cepa selvagem W303
Figura 16 Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da
cepa pkc1 ∆.
XVI
Figura 17 Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono nas cepas
W303 e Pkc1∆.
Figura 18 Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono
selecionados através dos ensaios de microarranjos de DNA para validação
por RT-PCR
Figura 19 Resultado da análise por RT-PCR da expressão de genes envolvidos no
metabolismo de carbono nas cepas W303 e Pkc1∆
Figura 20 Curvas de dissociação das reações de RT-PCR
Figura 21 Atividade de ß-galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das
cepas W303 e pkc1 ∆ transformadas com a construção CYC1–ß-
Galactosidase
Figura 22 Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína)
das cepas W303 e pkc1 ∆ transformadas com a construção HXT1 – ß-
Galactosidase
Figura 23 Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína)
das cepas W303 e pkc1 ∆ transformadas com a construção SUC2 – ß-
Galactosidase
Figura 24 Atividade de invertase (em nmoles de Glicose/min/mg de proteína) das
cepas W303 e pkc1 ∆ transformadas com a construção SUC2 – ß-
Galactosidase
INTRODUÇÃO
2
1 -
Introdução
1.1 - O modelo experimental: a levedura Saccharomyces
cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae é um fungo unicelular, pertencente ao
filo
Ascomycota (Tabela 01) com formato redondo ou oval, medindo aproximadamente de
5
a
10 m de diâmetro, sendo um dos modelos de organismo eucariótico mais
estudados
em biologia celular e
molecular.
Os estudos empregando S. cerevisiae como modelo experimental receberam
um
forte impulso no final da década de 70 com o desenvolvimento da técnica
de
transformação de fungos (Hinnen e cols., 1978). Algumas das propriedades que
tornam
as leveduras tão interessantes como modelo experimental incluem a fácil obtenção,
o
rápido crescimento na forma de células dispersas, um sistema genético bem definido,
a
facilidade de transformação, replicação e isolamento de mutantes, seu
genoma
completamente seqüenciado (Dujon, 1996) (Goffeau e cols., 1996), ser
relativamente
estável tanto no estado haplóide quanto diplóide, além de não ser patogênico,
dentre
outras
.
Tabela 01: Classificação taxonômica da levedura Saccharomyces
cerevisiae
Fonte: Integrated taxonomic information system (http://www.iti S.
usda.gov)
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Ordem Saccharomycetales Kudrjanzev,
1960
Família Saccharomycetaceae G. Winter,
1881
Gênero Saccharomyces
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n,
1883.
Taxonomic Serial Nº
194157
Outro fator que deve ser levado em consideração é o fato de que uma vasta
gama
de processos biológicos e funções celulares são altamente conservados e
compartilhados
entre os fungos e organismos eucarióticos superiores, permitindo a utilização
daqueles
como modelo no estudo comparativo desses processos. A possibilidade
de
3
complementação com genes heterólogos (Atrian e cols., 1990; Smith e cols.,
1990;
Wyckoff & Hsieh, 1988; Hensing e cols., 1995) e a facilidade de manipulação
genética
dos fungos fazem dos mesmos um excelente sistema para o entendimento das
funções
biológicas de produtos gênicos de outros organismos
eucarióticos
.
Além dos fatores descritos acima, deve-se levar em consideração a utilização
de
Saccharomyces cerevisiae em uma vasta gama de processos industriais
e
biotecnológicos (Ro e cols., 2006; Ostergaard e cols., 2000; Weber & Barth,
1988;
Maraz, 2002), além de constituir-se num dos mais antigos organismos
domesticados
pelo ser humano, tendo sido empregada desde os primórdios da civilização (Tabela
02).
Tabela 02: Marcos histórico da utilização da levedura Saccharomyces
cerevisiae
.
Cronologia
Marcos
históricos
6000-2000
AC
Fermentação (Suméria,
Babilônia)
1680
Levedura sob o microscópio (Van
Leeuwenhoek)
1835
Fermentação alcoólica associada com a
levedura
1837
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1877
Introdução do termo Enzima (na levedura) por
Kuhne
1880
Isolamento de cepas puras de levedura
(Hansen)
1883
Produção de álcool e CO
2
em extrato livre de células
(Buchner)
1915
Produção de
Glicerol
1949
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acasalamento.
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1978
Primeira transformação em leveduras (Finck et
al.)
1990-1994
Primeiro produto farmacêutico a partir de levedura (vacina da hepatite
B)
1990
-
1996
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Nos dias atuais, S. cerevisiae é utilizada na indústria alimentícia
(Moreno-
Arribas & Polo, 2005; Chae e cols., 2001; Doores, 1983; Rose, 1981), na obtenção
de
etanol (Bayrock & Michael, 2001; Taylor e cols., 2000; Taylor e cols., 1995),
na
indústria farmacêutica para a produção de uma vasta gama de produtos (Maraz,
2002;
Masimirembwa e cols., 1999; Rombaut & Jore, 1997; Gill & Zaworski, 1991),
em
pesquisas ambientais (Schofield e cols., 2007; Radhika e cols., 2007; Radhika e
cols.,
2005)e no estudo bioquímico e biológico conforme descrito
acima.
4
Na Tabela 03, podemos observar alguns dos processos e produtos obtidos com
a
utilização de S.
cerevisiae.
Tabela 03: Processos e produtos obtidos com o emprego da levedura
Saccharomyces
cerevisiae.
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Genética
Bioquímica
Outros
1.2 - O genoma da levedura Saccharomyces
cerevisiae
A levedura S. cerevisiae contem um conjunto haplóide de 16 cromossomos
com
tamanho variando entre 200 e 2200 Kb. A seqüência completa do DNA
cromossomal,
constituída de 12.052 Kb foi descrita em 1996 (Dujon,1996;Goffeau e
cols.,1996)
.
Contrastando com o genoma de organismos multicelulares, o genoma da levedura
é
altamente compactado, onde os genes representam aproximadamente 72% da
seqüência
total. O tamanho médio dos genes é de 1,45Kb ou 483 códons. Aproximadamente
3,8%
5
das janelas abertas de leitura contêm íntrons. Das 6.183 janelas abertas de
leitura
descritas, compostas por mais que 100 aminoácidos, cerca de 5.800 correspondem
a
possíveis genes que codificam para proteínas. Destas, cerca de 30% já
foram
caracterizadas experimentalmente e 35% correspondem a genes que codificam
para
proteínas que são relacionadas estruturalmente com produtos gênicos já
caracterizados
em outros fungos ou
organismos.
O RNA ribossômico é composto por aproximadamente 120 cópias
arranjados
em seqüência no cromossomo XII e os tRNAs são codificados por 262 genes, dos
quais
80 possuem íntrons. O DNA de S. cerevisiae contém ainda uma série de
elementos
móveis ou retro-transposons, que variam em quantidade e posição de acordo com
as
diferentes cepas de levedura. O DNA mitocondrial tem aproximadamente 85Kb
e
contem os genes que codificam para as subunidades I, II e III da citocromo C
oxidase,
apocitocromo b, subunidades 6, 8 e 9 da ATPase e uma proteína associada
ao
ribossomo. Codifica ainda para as unidades pequena e grande do RNA ribossomal,
24
RNAs transportadores e o RNA 9 S. É caracterizado por um baixo conteúdo de
GC
(17%), possuindo uma grande porção de regiões intergênicas representando 62%
do
mtDNA (Langkjaer e cols.,
2003).
A Figura 01 representa um diagrama esquemático com os
laboratórios
envolvidos no projeto de seqüenciamento do genoma da S. cerevisiae, publicado
em
1996, com os 16 cromossomos em ordem decrescente de tamanho. As
unidades
repetitivas estão representadas por boxes brancos nos cromossomos XII, IV e
VIII
respectivamente.
6
Figura 01: Principais laboratórios envolvidos no projeto genoma da
levedura
Saccharomyces
cerevisiae.
Fonte – Feldmann, H. in: Yeast molecular biology – A short compendium on
basic
features and novel aspects;
2005.
1.3 - O metabolismo de fontes de carbono na levedura Saccharomyces
cerevisiae.
As leveduras são organismos bem adaptados às mais variadas mudanças
nas
condições ambientais, tendo desenvolvido uma série de mecanismos para responder
às
mesmas. Uma vez que a disponibilidade de nutrientes no meio nunca é constante,
as
leveduras devem se adaptar a estas variações e responder a elas modulando
seu
metabolismo e seu crescimento (Holsbeeks e cols., 2004) (Newcomb e cols.,
2003).
Embora seja capaz de utilizar uma grande variedade de fontes de carbono
a
levedura S. cerevisiae utiliza a glicose como sua fonte preferencial de carbono e
energia
7
(Gancedo, 1998; Mashego e cols., 2005)
. O metabolismo de glicose nas leveduras
é
realizado principalmente através da fermentação alcoólica, mesmo sob condições
de
aerobiose (Holm e cols., 2001). Embora a fermentação produza uma menor
quantidade
de ATP por mol de açúcar, ela se processa a uma velocidade bem maior, trazendo
uma
grande vantagem competitiva à levedura, principalmente porque o etanol
produzido
durante a fermentação inibe o crescimento de outros microrganismos capazes
de
competir com a levedura pelas fontes de carbono disponíveis. O etanol produzido
pode
ainda ser utilizado através do metabolismo aeróbico, resultando na utilização
completa
de todo o carbono presente no
meio.
A capacidade que a levedura tem de detectar a flutuação dos níveis de glicose
no
meio externo pode ser explicada pela presença de receptores de glicose na sua
superfície
celular (Tabela
04).
Tabela 04: Receptores e transportadores funcionais de glicose na
levedura
Saccharomyces cerevisiae. Fonte – SGD
(Saccharomyces genome
Database)
http://www.yeastgenome.org
Nome do
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Descrição
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Transportador de hexose de baixa
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HXT5
YHR096C
Proteína da família Hxt com atividade
transportadora
intrínseca
HXT6
YDR343C
Transportador de hexose de alta
afinidade
HXT7
YDR342C
Transportador de hexose de alta
afinidade
HXT14
YNL318C
Proteína da família de transportadores de açúcar
capaz
de suportar o crescimento em
galactose
GPR1
YDL035C
Receptor para glicose e sacarose acoplado à proteína
G
SNF3
YDL194W
Sensor de glicose em baixas concentrações,
semelhante
aos transportadore
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aos transportadore
S.
Além dos diversos transportadores de glicose, as células de S.
cerevisiae
possuem dois tipos de sensores que detectam a presença de glicose, sendo um de
baixa
(Rgt2p) e outro de alta afinidade (Snf3p) (Johnston & Kim, 2005) (Ozcan e cols.,
1998).
Estes sensores são membros da família de transportadores de glicose com
similaridade
parcial com os outros membros, possuindo longas caudas C - terminais
citoplasmáticas
.
8
Rgt2p e Snf3p não são capazes de atuarem diretamente como transportadores
de
glicose; entretanto, agem como sensores extracelulares de glicose envolvidos
no
controle da expressão dos genes dos transportadores, através do fator de
transcrição
Rgt1. Rgt2 é necessário para a máxima indução da expressão do transportador HXT1
em
altas concentrações de glicose, enquanto Snf3p é requerido para a indução da
expressão
dos genes que codificam para Hxt2p, Hxt3p e Hxt4p em baixas concentrações
de
glicose (Kaniak e cols., 2004) (Ozcan & Johnston, 1999). RGT2 é
expresso
constitutivamente, ao passo que SNF3 é reprimido por altas concentrações de
glicose.
As caudas citoplasmáticas de Rgt2p e Snf3p parecem ser responsáveis pela
habilidade
que estas moléculas têm de traduzir a presença de glicose no meio externo para
o
interior a célula. A fusão da cauda de Snf3p com os transportadores Hxt1p e Hxt2p
foi
capaz de converter estes transportadores em sensores funcionais de glicose, capazes
de
gerar o sinal necessário à indução da expressão dos genes dos
transportadores
funcionais de glicose (Ozcan e cols., 1998;Tropia e cols.,
2006)
Nas leveduras, uma das vias metabólicas mais estudadas e
conhecidas,
envolvidas na regulação da utilização de glicose é a via principal de repressão
por
glicose. A presença de glicose no meio desencadeia uma série de processos
regulatórios
direcionados à utilização mais eficiente da mesma. A glicólise é ativada levando
à
conversão da glicose em etanol e CO
2
, enquanto a gluconeogênese é inibida. Ocorre
um
aumento acentuado na taxa de crescimento celular, precedido do aumento
na
concentração de RNA ribossomal e da síntese de proteínas. Os genes envolvidos
no
metabolismo de outras fontes de carbono e na resposta ao estresse são
rapidamente
reprimidos e os carboidratos de reserva são utilizados (Gancedo,
1998).
Os componentes centrais da via principal de repressão por glicose são
o
complexo repressor Mig1p, o complexo da proteína quinase Snf1p e a proteína
fosfatase
I
– Reg1-Glc7 (Gelade e cols., 2003; Schuller, 2003). Mig1p é uma proteína
com
domínios do tipo dedos de zinco Cys2–His2, que na presença de altas concentrações
de
glicose recruta as proteínas co-repressoras Ssn6p e Tup1p, levando à repressão
de
diversas famílias de genes e de seus respectivos indutores transcricionais (Treitel
&
Carlson, 1995). A atividade de Mig1p como repressor é regulada por sua
localização
celular, o que ocorre através da fosforilação ou defosforilação do mesmo. Em
altas
concentrações de glicose, Mig1p é defosforilado pela proteína fosfatase I e
concentra-se
no núcleo da célula, onde se liga aos promotores dos genes reprimidos por
glicose.
Quando a concentração de glicose decresce, Mig1p é fosforilado pela quinase
Snf1p,
9
promovendo a interação de Mig1p com a exportina Msn5p, o que faz com que
seja
transportado rapidamente para o citoplasma, aliviando a repressão gênica(Elbing e
cols.,
2004; Kim e cols.,
2006)
Snf1p é uma proteína serina/treonina quinase que apresenta dois domínios,
um
regulatório na região carboxi-terminal e outro catalítico na região amino-terminal
e
encontra-se associada a uma subunidade ativadora (Snf4p) e a três proteínas
de
estruturação do complexo de alta massa molecular (subunidades Sip1p, Sip2p
e
Gal83p). A subunidade Snf4p é necessária para a atividade de Snf1p, ao passo
que
Sip1p, Sip2p e Gal83p ajudam a manter a associação entre as duas e determinam
a
localização celular do complexo (Papamichos-Chronakis e cols.,
2004).
A ativação de Snf1p parece estar relacionada a uma mudança conformacional
da
mesma. Na presença de glicose, o domínio regulatório carboxi-terminal promove
a
auto-inibição do complexo quinase, associando-se ao domínio catalítico. Na ausência
de
glicose, ocorre a fosforilação de Snf1p, através das quinases Pak1p, Tos3p e
Elm1p
(Nath e cols., 2003), ocasionando uma mudança conformacional que permite a
interação
de Snf4p com o domínio regulatório de Snf1p, dissociando o mesmo do
domínio
catalítico e promovendo a ativação do complexo, que fosforila Mig1p, promovendo
sua
translocação do núcleo para o citoplasma. Quando a glicose é novamente disponível,
o
complexo da proteína fosfatase I Glc7-Reg1p defosforila Snf1p no resíduo treonina
210,
fazendo com que a mesma retorne a sua conformação auto-inibitória. Ao lado disso,
foi
proposta a participação da Hxk2p no processo de repressão por glicose, através
da
interação com Mig1p, formando um complexo repressor localizado no núcleo celular
da
levedura S. cerevisiae. Este complexo se ligaria aos promotores de diversos
genes
reprimidos por glicose, reprimindo a transcrição dos mesmos (Ahuatzi e cols., 2004)
.
Na ausência de glicose, outros carboidratos também podem ser utilizados por
S.
cerevisiae como fonte de carbono e energia. Dentre eles podemos citar a frutose,
a
manose, a galactose, a maltose, a sacarose entre outros. Frutose e manose são
utilizadas
de modo semelhante à glicose, sendo que a galactose não é uma fonte usual de
energia
para S. cerevisiae. Os genes envolvidos no metabolismo de galactose
encontram-se
normalmente reprimidos. Na ausência de glicose e presença de galactose estes
genes
são ativados cerca de 1.000 vezes, sendo um dos poucos genes neste organismo
que
respondem da maneira tudo ou nada. A maltose e a sacarose são convertidas em
seus
respectivos monossacarídeos através da ação da maltase e da invertase. As
leveduras
10
podem ainda utilizar o glicerol após sua captação e conversão em
glicerol-3-fosfato
através da enzima glicerol
quinase.
1.4 - A transdução de sinais na levedura Saccharomyces
cerevisiae.
Na natureza, as leveduras lidam constantemente com flutuações nos níveis
de
nutrientes disponíveis. A capacidade de detectar estas flutuações e de se adaptar a
elas
é um fator preponderante para garantir a sobrevivência destes organismos. Durante
a
evolução, as leveduras desenvolveram vários mecanismos que permitiram
sua
adaptação a estas flutuações. Estes mecanismos envolvem tanto controle positivo
como
negativo na regulação do metabolismo celular. Estes controles podem ser
realizados
tanto a nível transcricional através da repressão ou indução de genes, quanto a nível
pós
-transcricional, controlando a estabilidade e a tradução dos mRNAs, e
pós-tradução,
através do controle da atividade enzimática por ativação ou inibição alostérica ou
da
estabilidade das proteínas. A maioria desses processos é afetada direta ou
indiretamente
pelos mecanismos de detecção e sinalização celular, através de vias de transdução
de
sinais presentes nas
leveduras
.
A membrana plasmática das leveduras não se constitui somente numa
barreira
celular onde moléculas que controlam o metabolismo e a proliferação celular
são
detectadas, mas também numa barreira através da qual os nutrientes que garantem
o
suprimento de energia e o crescimento celular são transportados (Holsbeeks e
cols.,
2004). Nela estão presentes diversos receptores adaptados a responder às
condições
ambientais e a transformar os estímulos externos em respostas celulares
específicas
através da ativação ou repressão transcricional, possibilitando às leveduras adaptar
seu
metabolismo (Figura 02). A presença de um determinado tipo de molécula é
detectada
pelo receptor apropriado, promovendo a ativação do mesmo e desencadeando uma
série
de eventos celulares, geralmente através de uma cascata de reações
enzimáticas
.
Diversas vias de transdução de sinais foram identificadas em leveduras; dentre
elas,
podemos citar aquelas envolvidas com a detecção da presença de hormônios e fatores
de
crescimento; com as oscilações na temperatura e pH; com a presença de nutrientes
e
com a variação da osmolaridade dentre
outras
.
11
Figura 02 – Proteínas da membrana plasmática de células eucarióticas envolvidas
na
detecção de nutrientes. Os receptores apresentam-se divididos em três grandes grupos:
o
grupo de receptores não transportadores, envolvidos na detecção de sinais, mas
não
acoplados ao transporte (Non-transporting transceptor), os receptores
transportadores
não acoplados a proteínas G (transporting transceptors) e os
transportadores
propriamente ditos acoplados a proteínas G (G-protein coupled
receptors).
Fonte: (Holsbeeks e cols.,
2004)
1.4.1 - As vias MAPK (Proteínas quinases ativadas por mitógenos) na
levedura
Saccharomyces
cerevisiae.
As vias de proteínas quinases ativadas por mitógenos são vias de transdução
de
sinais altamente conservadas nos organismos eucarióticos superiores, podendo
ser
ativadas tanto por sinais externos como internos. Estas vias controlam uma série
de
processos em leveduras como o crescimento celular, a morfogênese, a
proliferação
celular, a resposta aos estresses, dentre outras. Geralmente, estas vias apresentam
como
ponto comum, três proteínas quinases: uma MAP quinase (MAPK), uma MAP
quinase
quinase (MAPKK) e uma MAP quinase quinase quinase (MAPKKK), atuando
em
cascata. A ativação dessas vias se dá por sucessivos passos de fosforilação,
culminando
12
com a regulação e modulação de fatores transcricionais. A regulação dessas
vias
também se faz através da ação de diversas proteínas fosfatases que atuam
normalmente
ao nível da MAPKK ou MAPK quinases. A ativação dessas vias normalmente
ocorre
com a participação de uma proteína quinase inicial, associada geralmente a
pequenas
proteínas
G.
Em leveduras, são conhecidas seis vias de MAPK diferentes: a via
de
conjugação em resposta aos ferormônios, a via de desenvolvimento de pseudo-hifas,
a
via HOG (High Osmolarity Glycerol), a via de integridade celular, a via de
montagem
da parede de esporos e a via de crescimento vegetativo. Na Figura 03, temos as
cinco
vias mais conhecidas, mostrando o compartilhamento de algumas proteínas, o
que
contribui para a grande complexidade dos processos envolvendo a ativação das vias
de
MAPK
quinases
.
Figura 03: Vias de MAPK presentes em Saccharomyces
cerevisiae
.
Fonte: Feldmann, H. in: Yeast molecular biology – A short compendium on
basic
features and novel aspects;
2005.
1.4.2 - A transdução de sinais na conjugação em leveduras: resposta
aos
ferormônios
Células de leveduras haplóides com fatores de acasalamento opostos (a ou
α)
podem se cruzar gerando células diplóides. As células MATα produzem o fator α
e
possuem receptores para o fator a, codificado pelo gene STE2. As células
haplóides
13
MATa produzem o fator a e possuem receptores para o fator α, codificado pelo
gene
STE3. Após a ligação do fator de acasalamento ao seu respectivo receptor, ocorre
a
ativação de Gpa1p, uma proteína G heterotrimérica. Em seguida, o sinal é
transmitido
para uma proteína ligante de GTP da família das proteínas relacionadas a Ras
(Cdc42p),
a qual está associada a uma proteína ativadora de GTPase (Rga1p) e ao
fator
estimulador de troca GTP/GDP (Cdc24p). Ocorre então a ativação de Ste20p,
uma
proteína do complexo das MAP quinases, com ativação subseqüente desta via. Os
genes
específicos de acasalamento são por fim ativados pelo fator de transcrição Ste12p, que
é
capaz de se ligar aos elementos de resposta a ferormônios (PRE) (Breitkreutz &
Tyers,
2002)(Figura
04).
Figura 04: Via de resposta aos hormônios de
acasalamento
Fonte: Feldmann, H. in: Yeast molecular biology – A short compendium on
basic
features and novel aspects;
2005
14
1.4.3 - A transdução de sinais envolvidos na resposta ao estresse
osmótico.
A maioria dos organismos unicelulares encontrados na natureza como
as
leveduras, freqüentemente estão expostos a grandes variações nas condições
ambientais
.
A capacidade de responder a estas mudanças eficientemente é de vital importância
para
garantir a sobrevivência dos mesmos. Mudanças no ambiente podem ser de
natureza
física ou química, como temperatura, pressão, radiação, concentração de solutos e
água,
presença de determinados íons, agentes tóxicos, pH e disponibilidade de
nutrientes
.
Freqüentemente, as leveduras lidam com flutuações em mais de um dos fatores
acima
descritos
.
Na natureza, as células de leveduras estão expostas a variações dramáticas
e
muito rápidas na osmolaridade, ou seja, na concentração de água disponível.
Uma
levedura crescendo em um fruto seco pode estar exposta a altas concentrações
de
açúcar, ao passo que imediatamente após uma chuva a mesma pode estar sujeita a
altas
concentrações de água disponível. Durante o metabolismo fermentativo, ocorre
um
aumento acentuado na concentração de álcool produzido como subproduto
do
metabolismo, o que também diminui consideravelmente a água disponível (Tamas
e
cols., 2000). O estresse osmótico é causado pela mudança nas concentrações de
solutos
no meio onde a levedura está presente, alterando a disponibilidade de água.
Em
membranas semipermeáveis, a água sempre flui na direção do compartimento
com
maior concentração osmótica. Uma vez que a maioria das membranas biológicas é
mais
permeável à água do que à maioria dos solutos, as células dos organismos na
maioria
das vezes são afetadas pelas mudanças na osmolaridade. Um aumento da
concentração
osmótica no meio (estresse hiperosmótico) fará com que a água tenha uma tendência
a
fluir do interior da célula para o meio externo, enquanto uma diminuição
da
concentração de solutos no meio (estresse hiposmótico) irá causar um aumento
na
entrada de água para a célula (Figura
05).
15
Adaptação – Saída passiva de água,
diminuição pressão
i
n
t
erna
Choque h
i
per
t
ôn
i
co
Saída de água
Célula murch
a
Aumento da Osmo
l
ar
i
dade
Saída de
g
li
cero
l
Segundos
ou minu
t
os
Horas Acúmulo de g
li
cero
l
Choque h
i
po
t
ôn
i
co
Diminuição da Osmo
l
ar
i
dade
Entrada de água – Aumento da pressão
i
n
t
erna.
Inchamento da cé
l
u
l
a.
Adaptação – Captação passiva de água, capacidade de
proliferação, reassume forma regu
l
ar
Figura 05 – Mecanismos de adaptação aos choques hipertônico e hipotônico
em
Saccharomyces
cerevisiae.
Uma série de vias de sinalização permitem às leveduras detectar as
variações
osmóticas no meio ambiente. As mais conhecidas são a via HOG (High
Osmolarity
Glycerol) em resposta ao estresse hipertônico e a via de integridade celular ou via
das
MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase ou proteínas quinases ativadas
por
mitógenos) em resposta ao estresse
hipotônico.
1.4.4 - A via HOG (High Osmolarity Glycerol) em resposta ao estresse
hipertônico.
O glicerol é um álcool produzido durante o processo fermentativo em
leveduras,
podendo ser utilizado como fonte de carbono e energia, sendo ainda importante
na
biossíntese de fosfolipídios. Além disso, o glicerol é utilizado pela levedura
como
regulador osmótico, através da regulação de sua concentração no interior da célula.
Na
presença de estresse hipertônico, as leveduras acumulam o glicerol, contrabalançando
as
altas concentrações de soluto no meio externo. O acúmulo do glicerol se dá
pelo
aumento de sua captação, pelo aumento na produção do mesmo ou pelo controle
da
abertura e fechamento dos canais de glicerol. A entrada do glicerol nas células
de
leveduras pode acontecer por mecanismos diferentes: difusão passiva, difusão
facilitada
e transporte
ativo.
16
Normalmente, a difusão passiva de glicerol através da membrana celular
de
leveduras é baixa. Em condições de estresse hiperosmótico a difusão passiva
encontra-
se bastante diminuída. Isto parece ser devido ao fato de que as alterações na
membrana
celular durante o estresse dificultam ainda mais a
difusão.
A difusão facilitada de glicerol em leveduras é mediada pelo canal Fps1p.
O
transporte de glicerol pelo mesmo pode se dar tanto num sentido quanto em outro.
O
canal Fps1p desempenha um papel fundamental no controle dos níveis intracelulares
de
glicerol em leveduras. O mecanismo de transporte ativo ainda não está bem
estabelecido
em
leveduras
.
Em S. cerevisiae, foram identificadas três vias de sinalização capazes de ativar
a
via HOG, através da fosforilação e ativação de Hog1p (Figura 06) (Van e cols.,
2000)
(Saito & Tatebayashi, 2004) (Westfall e cols., 2004). Através de Sho1p, uma
proteína
com quatro domínios transmembranares ou através de Msb2p, uma proteína
semelhante
à mucina. Estas duas vias de sinalização estão conectadas à proteína Rho trifosfatase,
a
Cdc42p, à proteína Pak1p, à proteína Ste20p e à proteína MAPKK quinase, Ste11p.
A
outra via de sinalização que ocorre através de SLN1 normalmente é ativada
em
condições de estresse hiperosmótico moderado, levando à ativação de duas
MAPKKKs
redundantes, a Ssk2p e Ssk22p (O'Rourke e cols., 2002; O'Rourke &
Herskowitz,
2004).
As vias de ativação via Sho1p e Msb2p ativam a via HOG através da ação
de
Ste11p e a via de sinalização em resposta ao estresse moderado é ativada a partir
de
Sln1p.
A ativação dessa vias leva a fosforilação de Hog1p, o ponto central da ativação
da
resposta ao estresse hiperosmótico. A fosforilação de Hog1p resulta na sua
translocação
do citoplasma para o núcleo, onde ela interage com uma grande variedade de
proteínas
nucleares, incluindo fatores de transcrição e histona deacetilases, promovendo
a
transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse. Quando a
célula
restabelece o equilíbrio osmótico, Hog1p é defosforilada e exportada para o
citoplasma,
cessando a
resposta.
17
Figura 06 – Via HOG (High Osmolarity Glycerol) in Saccharomyces
cerevisiae
Fonte:
http://stke.sciencemag.org/cgi/cm/stkecm;CMP_14620#authorities
1.4.5 - A via de integridade celular em resposta ao estresse
hipotônico.
A via de integridade celular ou via PKC MAP quinases é uma via de
transdução
de sinais envolvida em uma série de eventos celulares, como resposta a variações
de
temperatura, resposta a ferormônios, ciclo celular e baixa osmolaridade. O
principal
papel desta via parece ser o de manter a integridade celular, através do controle
da
síntese da parede celular durante o crescimento, o desenvolvimento ou após eventos
que
levam a expansão da célula ou perturbações da parede celular (Hohmann,
2002).
Mutantes nesta via de sinalização apresentam defeitos na formação da parede
celular,
18
necessitando a adição de estabilizadores osmóticos (NaCl ou Sorbitol) para
seu
crescimento e
proliferação.
A proteína Pkc1p, codificada pelo gene PKC1 (Levin e cols., 1990) é a
única
proteína quinase C em leveduras homóloga das proteínas quinases C de mamíferos.
Ela
contém uma série de domínios funcionais similares aos encontrados nas
proteínas
homólogas de mamíferos como duas regiões do tipo C1, que são seqüências do
tipo
dedo de zinco com sítios de ligação para diacilglicerol, um domínio tipo C2
envolvido
na ligação de fosfolipídios dependente de cálcio, o domínio quinase, um sítio
para
ligação do pseudosubstrato, a região V5 na porção C-terminal e dois domínios HR1
na
região N-terminal que ligam pequenas proteínas G (Figura 07). Apesar de possuir
os
sítios para ligação de diacilglicerol e o domínio C2 dependente de cálcio,
dados
experimentais obtidos até então demonstram que a Pkc1p de leveduras não é ativada
por
esses sinais (Schmitz & Heinisch,
2003).
Figura 07 - Distribuição esquemática dos domínios na proteína
Pkc1p.
Fonte: Denis,V. (Denis & Cyert,
2005)
Como descrito acima, a via da Pkc1p é ativada por perturbações ao nível
da
parede celular. A capacidade de detectar essas perturbações e ativar essa via
parece
estar associada à presença se sensores na superfície da célula, capazes de detectar
e
transmitir os sinais para o interior da célula. Dois sensores foram identificados
como
sendo possíveis componentes da via da Pkc1p. O primeiro deles é a proteína Slg1p
(ou
Hcs77p ou ainda Wsc1p), que foi descoberta através de estudos que demonstraram
sua
participação na ativação da fosforilação de Slt2p durante o estresse térmico (Gray
e
cols., 1997). O outro é a proteína Mid2p, codificada pelo gene MID2, que participa
no
controle da viabilidade celular durante o acasalamento e na manutenção da
homeostase
do cálcio (Ono e cols., 1994). Sua seqüência de aminoácidos deduzida
apresenta
similaridades com Slg1p. Ambas as proteínas apresentam um domínio rico em serina
e
treonina, indicativo de que sejam proteínas glicosiladas localizadas na
superfície
celular. Não se sabe como ocorre a transmissão do sinal entre esses possíveis sensores
e
a via da
Pkc1p.
19
O ponto central da via de Pkc1p é a cascata de quinases constituída por
uma
MAPquinase quinase quinase (Bck1p), duas MAPquinase quinase redundantes
(Mkk1p
e Mkk2p) e uma MAPquinase (Slt2p) (Figura 08). Esta cascata é ativada através
da
fosforilação de resíduos de serina e treonina presentes em Bck1p pela ação da Pkc1p,
o
que provoca uma seqüência de fosforilações nos componentes seguintes
Mkk1p/Mkk2p
e Slt2p. A ativação de Pkc1p se dá através da ação de Rho1p, uma proteína da
família
das proteínas ligantes de GTP. Rho1p é ativada através da ação do fator de
troca
GDP/GTP (GEF), codificado pelos genes ROM1 e ROM2, sendo que Rom2 p parece
ter
um papel preponderante neste processo. Por outro lado, as proteínas ativadoras
de
GTPase, codificadas pelos genes BEM2 e SAC7, parecem ser as responsáveis
pela
regulação negativa, inibindo a atividade de Rho1p (Schmidt e cols., 2002). O
gene
TOR2 codifica para a proteína Tor2p que é responsável pela ativação de
Rom2p
(Helliwell e cols., 1998b). Essa proteína possui uma grande homologia com
as
fosfatidilinositol quinases de mamíferos, o que pode sugerir uma ligação entre
o
metabolismo de lipídeos, importante na integridade da parede celular, e a via de
Pkc1p.
Rho1p também participa diretamente na ativação do complexo da glucano
sintase
(Mazur & Baginsky,
1996).
Como dissemos anteriormente, a via da Pkc1p está envolvida na manutenção
da
integridade da parede celular e isso se dá através do controle da expressão de
genes
envolvidos na síntese da mesma. Experimentos realizados por Igual(Igual e cols.,
1996)
demonstraram que os genes FKS1 e FKS2, que codificam para as subunidades
do
complexo β-1,3-glucano sintase, o gene MNN1 que codifica para uma
α-1,3-
manosiltransferase e o gene CSD2 que codifica para uma quitina sintase,
são
dependentes da ativação de Slt2p para sua expressão. Um dos fatores
transcricionais
ativados por Slt2p é Rlm1p, um membro da família de proteínas MAD-Box. Estudos
de
duplo híbrido demonstraram a interação de Slt2p com Rlm1p (Watanabe e cols.,
1997)
e que Rlm1p ativa a transcrição de genes somente após a sua fosforilação (Watanabe
e
cols., 1995). Outro alvo da fosforilação por Slt2p é o fator de transcrição SBF,
um
heterodímero composto por Swi4p e Swi6p, envolvido na regulação do ciclo celular
e
do crescimento polarizado em leveduras, principalmente durante a fase de transição
de
G1 para a fase S, ativando a transcrição de genes como CLN1, CLN2, PCL1 e
PCL2
(Madden e cols.,
1997).
20
Figura 08 – Representação esquemática dos principais componentes da via de Pkc1p
de
Saccharomyces
cerevisiae
Fonte: (Heinisch e cols.,
1999).
Estudos realizados por Levin (Levin e cols., 1994) com mutantes na via de
PKC
MAP quinase demonstraram que mutações no gene PKC originaram um fenótipo
mais
severo de osmosensibilidade quando comparados com mutações nos genes de
outros
componentes desta via como BCK1 (MAPquinase quinase quinase),
MKK1/MKK2
(MAPquinase quinase) e SLT2 (MAPquinase), o que sugere que Pkc1p possa
estar
envolvida em outras vias de sinalização nas leveduras, além da via de MAPK
quinases
.
Outras vias envolvidas com Pkc1p já descritas (Heinisch e cols., 1999);
(Gustin
e cols., 1998) incluem a via de calcineurina (Mazur e cols., 1995), a via envolvida
na
detecção de nutrientes, a via HOG, a via de fosfatidil inositol (Yoshida e cols.,
1994;
Schmidt e cols., 1997), a via TOR (Barbet e cols., 1996), a via de controle do
ciclo
celular dependente de Cdc-28 (Marini e cols., 1996), a organização do
citoesqueleto
(Chai e cols., 2002) (Helliwell e cols., 1998a) e a via de conjugação celular (Zarzov
e
cols., 1996). Valentini demonstrou, através da análise de supressores multicópia
do
fator de iniciação eIF5A, a participação de Pkc1p nos mecanismos de controle
da
estabilidade de RNAs mensageiros (Valentini e cols., 2002)
.
21
Estudos realizados em nosso laboratório (Brandão e cols.; 2002)
demonstraram que uma cepa mutante pkc1∆ apresenta uma primeira fase
de
crescimento
mais lenta e um consumo de etanol menor do que as cepas selvagem e
um
mutante bck1∆.
Foi demonstrado ainda que o mutante pkc1∆ apresentava
uma
diminuição na
expressão de transportadores de glicose quando comparada com as
cepas
selvagem e
bck1∆. Os experimentos demonstraram ainda que o mutante pkc1∆
não
crescia na
presença de glicerol como única fonte de carbono e que a desrepressão
do
gene SUC2
que codifica para invertase estava bastante diminuída em comparação com
a
cepa
selvagem. A atividade enzimática de invertase também foi analisada e
os
resultados demonstraram que a cepa pkc1∆ apresentava uma atividade
invertásica
bastante diminuída quando comparada com as cepas selvagem, bck1∆ e
mpk1
∆
.
Posteriormente, Salgado demonstrou que Pkc1p estava envolvida na desrepressão
de
outras enzimas como a álcool desidrogenase e que o mecanismo envolvido
nesse
processo parece ser o controle da localização subcelular do repressor Mig1p pela
Pkc1p
(Salgado e cols., 2002). Por sua vez, Gomes (Gomes e cols., 2005) demonstrou que
a
cepa pkc1∆ não cresce em glicerol por não ser capaz de desreprimir o gene GUT1
que
codifica para a glicerol quinase, a enzima que catalisa o primeiro passo do
metabolismo
do glicerol e que o transporte de glicerol também estava afetado na cepa
pkc1
∆
.
Os dados até então disponíveis, sugerem a participação da proteína Pkc1 p
nos
processos de repressão e desrepressão por glicose; entretanto, como as vias
de
transdução de sinais em leveduras apresentam uma grande complexidade,
com
elementos comuns a várias vias, torna-se difícil avaliar quais são os componentes
que
participam efetivamente nos processos de repressão e desrepressão por glicose que
estão
associados à atividade de
Pkc1p.
Os avanços relacionados à análise da expressão global de genes, através
da
utilização de micro arranjos de DNA, possibilitaram a utilização desta técnica
na
elucidação do padrão de expressão gênica de diversos organismos submetidos
a
condições
pré-determinadas.
Decidimos então empregar a técnica de micro arranjos de DNA, uma vez que
a
mesma nos permite avaliar a expressão global dos genes de Saccharomyces
cerevisiae
em condições de repressão e desrepressão, comparando as células selvagens com
os
mutantes da cepa
pkc1
∆
.
22
OBJETIVOS
23
2 -
Objetivos
2.1 - Objetivo
geral
Tendo em vista os resultados anteriores obtidos em nosso laboratório,
que
apontam para a participação da Pkc1p em processos metabólicos não
relacionados
diretamente à via das Map quinases durante a desrepressão metabólica,
decidimos
analisar comparativamente a expressão global de genes nas cepas selvagem W303
e
mutante pkc1∆ em condição de repressão e desrepressão
metabólica.
2.2 - Objetivos
específicos
2.2.1 - Analisar, através de ensaios de microarranjos de DNA, a expressão de todos
os
genes da levedura Saccharomyces cerevisiae das cepas selvagem e mutante
pkc1
∆
durante o processo de desrepressão metabólica e selecionar os genes que
apresentam
diferenças significativas de expressão entre as duas
cepas.
2.2.2 – Validar os resultados obtidos nos ensaios de microarranjos de DNA para
alguns
dos genes selecionados, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real
(RT-
PCR).
2.2.3 – Analisar a indução da transcrição de alguns genes das cepas selvagem W303
e
pkc1∆ durante o processo de desrepressão metabólica empregando
plasmídeos
contendo os promotores destes genes associados ao gene da
β-galactosidase.
MATERIAIS E
MÉTODOS
25
3 - Materiais e
Métodos
3.1 - Microorganismos utilizados nos
experimentos
3.1.1 - Cepas de Saccharomyces
cerevisiae
As cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho estão descritas na
tabela
abaixo:
Tabela 05: Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas nos
experimentos
Nome
Genótipo
a
W303 Mat a ade2-1 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 can1-100 GAL mal
SUC2
b
YSH850
Mat a
pkc
∆
::
HIS3
(W303-1A)
∗
Letras a-b, procedência das cepas de S. cerevisiae ítem
3.1.2
3.1.2 - Procedência das cepas de Saccharomyces
cerevisiae
:
a- Johan Thevelein, Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie,
Katholieke
Universiteit Leuveun,
Belgium.
b- Stefan Hohmann, CMB/Microbiology, Göteborg Univerty,
Sweden.
3.1.3 - Cepa de
bactéria
A cepa de Escherichia coli utilizada para a amplificação do DNA plasmidial
foi
a TOP10F’: F’, mcr A,
∆
(mrr-hadRMS – mcrBC) Ø
80
∆
lacZ
∆
M15,
∆
lacx74,
deoR,
rec
∆
1,
araD139,
∆
(ara,leu),
7697, galIU, galK, λ-,rs1p,end
∆
1,nupG.
3.2 - Plasmídeos LacZ
repórter
Os plasmídeos contendo os promotores dos genes associados ao gene da
β-
galactosidase estão descritos na tabela
abaixo:
Tabela 06: Plasmídeos LacZ
repórter
N
o
m
e
C
on
s
t
r
u
ç
ã
o
G
e
ne
do
p
r
omotor
a
s
s
o
c
i
a
do
pBM2636
HXT1::lacZ em YEP 357R
(URA3)
YFL011W
p
B
M
1942
p
L
G66
9
-
Z
f
r
om
L.
G
u
a
r
e
nte
(
U
R
A3)
= CYC-LacZ ( with no lexO
sites)
YJR048W
p
B
M
2773
SU
C
2
::
l
ac
Z
e
m
Y
E
P
356
(
U
R
A
3)
Y
I
L
162W
26
Todos os plasmídeos foram fornecidos pelo Dr. Mark Johnston, Washington
University
School of Medicine, St. Louis,
Missouri.
3.3 - Meios de cultura e condições de
crescimento
3.3.1 - Meios de
cultura
3.3.1.1 - Meio LB (Luria –
Bertaine)
O meio LB é composto por triptona 1% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v) e
cloreto
de sódio 0,5% (p/v), pH 7,5 ajustado com NaOH. Ao meio sólido acrescenta-se
ágar
1,5%
(p/v).
3.3.1.2 - Meio
YP
O meio YP é composto por extrato de levedura 1% (pv), bacto-peptona
2%
(p/v). O meio sólido é acrescido de ágar 1,5% (p/v). Em todos os experimentos o
meio
YP foi adicionado de 1M de Sorbitol. As fontes de carbono utilizadas foram as
seguintes:
glicose 2% ou 4% ou rafinose 2%. As fontes de carbono foram
autoclavadas
separadamente e acrescentadas ao meio no fluxo
laminar.
3.3.1.3 - Meio mínimo
SD
O meio SD é composto por 6.7 g/l de base nitrogenada de levedura
sem
aminoácidos, suplementado com os aminoácidos arginina 20 mg/l, ácido glutâmico
100
mg/l, ácido aspártico 100 mg/l, fenilanina 50 mg/l, histidina 100 mg/l, isoleucina 30
mg/l,
lisina 30 mg/l, leucina 250 mg/l, metionina 20 mg/l, serina 375 mg/l, triptofano 100
mg/l,
tirosina 30 mg/l, treonina 200 mg/l, valina 150 mg/l e as bases adenina 50 mg/l e
uracil
50 mg/l. Em todos os experimentos o meio SD foi adicionado de 1M de Sorbitol O
meio
sólido foi acrescido de ágar 1,5% (p/v). O pH do meio SD foi acertado com KOH para
o
valor 6,5. As fontes de carbono usadas foram: glicose 2% (p/v) ou rafinose 2%
(p/v).
27
3.3.2 - Condições de
crescimento
As células de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas a
30
°
C
sob agitação
a
200 rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25) em meio YP
suplementado
com a fonte de carbono adequada. Para as cepas transformadas portadoras
de
plasmídeos, foi utilizado o meio seletivo SD-URA. As células de E. coli
foram
crescidas a
37
°
C
sob agitação de 200 rpm (incubador rotatório New Brunswick
Model
G25) em meio
LB.
3.4 - Transformação de bactérias e
leveduras
3.4.1 - Preparação de células de bactérias
competentes
A bactéria Escherichia coli Top 10 F’, estocada à -
70
°
C
com 25% glicerol,
foi
crescida em meio LB suplementado com 15 g/ml de tetraciclina e 20 g/ml
de
estreptomicina a
37
°
C
durante 16 horas. Uma colônia dessa cultura foi inoculada em
3
ml de meio LB e incubada sob agitação de 200 rpm (Incubador Rotatório
New
Brunswick Model G25) nas mesmas condições descritas acima. Após este
período,
utilizou-se uma alíquota de 1 ml dessa cultura para inocular 100 ml de meio
LB,
mantidos a 37
°
C
sob agitação de 200 rpm (Incubador Rotatório New Brunswick
Model
G25) até atingir a DO
600nm
próxima de 0.8 nm (Du-68
Spectrophtometer-Beckman).
Após o crescimento, as bactérias foram coletadas por centrifugação a 1.000g, por
10
minutos, a
4
°
C.
O sedimento celular foi suspenso em 40 ml de CaCl
2
0.1 M e
mantido
em gelo por 1 hora. Após centrifugação, as células foram suspensas em 1 ml de
CaCl
2
1M. As células competentes foram aliquotadas e usadas imediatamente ou estocadas a
-
70
°
C
em presença de glicerol em uma concentração final de
25%.
3.4.2 - Transformação de
bactérias
Cerca de 10 ng de mistura de ligação ou 2 l de plasmídeo foram adicionados
a
um tubo Eppendorf de 1,8 ml contendo 100 l de bactéria TOP 10F’competentes
(item
3.9). Este material foi mantido em gelo por 30 minutos. Após este período, as
células
foram submetidas a um choque térmico a
42
°
C
por 2 minutos. Em seguida, as
células
28
foram mantidas em 1 ml de meio LB, a
37
°
C,
por 50 minutos. Após centrifugação
a
6.000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofure 13) por 1 minuto, o sobrenadante foi
descartado.
As células foram suspensas em 100 l de LB, plaqueadas com auxílio de pérolas
de
vidro em meio líquido LB-ampicilina (100 g/ml) e crescidas a
37
°
C
sob agitação
200
rpm (incubador rotatório New Brunswick Model G25), por 16
horas
.
3.4.3 - Mini preparação de DNA plasmidial de
bactéria
As colônias obtidas no procedimento anterior foram inoculadas em 5 ml de
meio
LB-ampicilina100 g/ml a
37
°
C por 12 horas. Após o crescimento, a suspensão
de
células foi transferida para tubos de microcentrífuga de 1,8 ml e centrifugadas a
3500
rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e
o
sedimento celular ressuspendido em 100 l da solução I (dextrose 0,5M, EDTA
7,5
mM, Tris-HCl pH 8, 25mM e Ribonuclease A 0,15mg/ml) . Em seguida,
foram
adicionados 200l de solução de lise (SDS 1% e NaOH 0,2 M). As células
foram
homogeneizadas por inversão e incubadas a 4º C por 20 minutos. Após este período,
o
material foi centrifugado a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 20
minutos
.
O sobrenadante foi transferido para outro tubo de microcentrífuga de 1,8 ml,
adicionado
de 300 l de Isopropanol e centrifugado a 13000 rpm por 20 minutos O
sobrenadante
foi descartado e o DNA plasmidial foi lavado com 800 l de etanol 70%. Após
uma
nova centrifugação nas mesmas condições, o sobrenadante foi eliminado e o DNA
seco
a
vácuo (speedvac Savant AS 290). O DNA plamidial foi ressuspendido em 25 l
de
água milli-Q (Sistema Milli-Q
Millipore).
3.4.4 - Preparo de células de levedura
competentes
A cepa de Sacharomyces cerevisiae a ser transformada foi crescida a
30
°
C, 200
rpm (Incubabor Rotatório New Brunswick Model G25), durante 24 horas, em 5 ml
de
YPD com sorbitol 1M. Este pré-inóculo foi utilizado para inocular 100 ml do
mesmo
meio e foi incubado nas mesmas condições de temperatura e agitação descritas
acima,
até que a cultura atingisse um valor de densidade ótica de 0,6. Após o crescimento,
as
células foram coletadas por centrifugação a 1.000g por 4 minutos. O sobrenadante
da
cultura foi descartado e as células foram lavadas com 20 ml de TE (10mM de
Tris-HCl
29
pH 8,0, 1mM EDTA) e suspensas em 5 ml de TE acrescidos de 250 L de uma
solução
de acetato de lítio 2,5 M. A suspensão de células foi incubada a
30
°
C
sob agitação
de
200 rpm durante no mínimo 1 hora. As células de levedura, tornadas competentes
pelo
tratamento descrito acima, foram aliquotadas em frações de 300l e
usadas
imediatamente.
3.4.5 - Transformação de
leveduras
A transformação de leveduras foi realizada de acordo com a técnica descrita
por
Ito e colaboradores (Ito et al., 1983) com pequenas modificações. Em um tubo
de
microcentrífuga contendo 300 l de leveduras competentes, adicionaram-se 5 g
do
DNA plasmidial de interesse e 10 l de DNA de esperma de salmão
(10mg/ml),
previamente desnaturado a
95
°
C
(Thermomixer 5436). Após incubação por 30
minutos
a
30
°
C,
foram adicionados 700L de PEG 4000 (50%), procedeu-se à
homogeneização
do conteúdo delicadamente e incubou-se novamente por 1 hora nas mesmas
condições
anteriores. Em seguida, as células foram submetidas a choque térmico a
42
°
C,
por
10
minutos, e logo após, foram centrifugadas por 10 minutos a 4.000 rpm
(Heraeus
Sepatech, Biofure 13). Após essa nova centrifugação nas mesmas condições
anteriores,
o sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas no sobrenadante
residual
e plaqueadas com pérolas de vidro em meio sólido seletivo (SD-URA). As placas
foram
incubadas a
30
°
C,
por 48 a 72 horas. As colônias crescidas nos meios seletivos
foram
inoculadas em meio líquido YPD com Sorbitol 1M para posterior confirmação
dos
marcadores genéticos com o objetivo de confirmar se a transformação foi
efetiva
Como controle negativo do experimento, utilizamos 300 l de
leveduras
competentes e 10 l de DNA de esperma de salmão (10 mg/ml)
previamente
desnaturado a
95
°
C.
30
3.5 - Determinação da atividade enzimática da Invertase e da β -
Galactosidase
3.5.1 - Inóculo e crescimento das
células
As células de Saccharomyces cerevisiae foram crescidas em 20 ml do meio
SD-
URA acrescido de glicose 4% ou rafinose 2%, durante 24 horas, a
30
°
C,
sob agitação
a
200 rpm em incubador rotatório New Brunswick Model
G25.
3.5.2 - Preparo de extratos celulares para a determinação da atividade
enzimática
da Invertase e β -
Galactosidase.
As células de leveduras foram coletadas em diferentes intervalos de tempo
e
centrifugadas a 1000 g, a
4
°
C,
por 5 minutos. Em seguida as células foram lavadas
uma
vez com tampão de extração (Na
2
PO
4
460mM, NaH
2
PO
4
40mM, KCl 10mM e
MgSO
4
1mM, pH 7,0) e ressuspensas em 500l do mesmo tampão. Após este
procedimento,
adicionou-se, em cada tubo, 0,5 g de pérolas de vidro (0,5 mm de diâmetro) e as
células
foram lisadas por agitação em vortex (três vezes, 60segundos) com repouso em gelo
nos
intervalos de agitação. Em seguida, os extratos foram centrifugados (3000g por 5 min)
e
o sobrenadante foi coletado e congelado a – 70º C para posterior dosagem no
aparelho
bioquímico COBAS-FARA
(Roche).
3.5.3 - Dosagem da
invertase
A dosagem da enzima invertase foi realizada no aparelho de
dosagem
bioquímica COBAS-FARA (Roche), tendo sido utilizado como substrato para a
reação
uma solução de sacarose 0,3 M em acetato de potássio 100 mM pH 5,1. Após 5
minutos
de incubação, a
30
°
C,
a reação foi interrompida pela adição de NaOH 1 M. Em
seguida
um volume igual de HCl 1M foi adicionado para neutralizar o pH da reação. A
glicose
liberada foi determinada pela reação clássica de glicose – oxidase / peroxidase, tendo
a
ortodianisidina como reativo de cor. A leitura da absorbância foi feita a 560 nm.
A
atividade da enzima invertase foi expressa em nmoles de glicose /min /mg
proteína.
31
3.5.4 - Dosagem da
β
-Galactosidase
Os ensaios para determinação da atividade de β-galactosidase foram
realizados
com extratos de células de leveduras pré-incubados por 5 minutos a 30º C. Depois
disso,
0,44 mM de ONPG foi acrescentado e uma outra incubação de 25 minutos foi
realizada.
A reação foi interrompida pela adição de Na
2
CO
3
. Procedeu-se então a leitura
da
absorbância a 420nm e os resultados foram expressos em nmoles ONP min
/mg
proteína. Todas as reações foram realizadas pelo aparelho bioquímico
COBAS-FARA
(Roche).
3.6 - Dosagem de
proteínas
A dosagem de proteínas foi realizada segundo o método de Lowry (Lowry
e
cols.,
1951).
3.7 - Extração do RNA
Total
3.7.1 - Inóculo e crescimento das
células
As leveduras foram inoculadas em 10 ml de meio YPD 4% e incubadas a
30
°
C,
sob agitação a 200 rpm em incubador rotatório (New Brunswick Model G25)
até
atingirem e a densidade ótica entre 0,8 e 1,0 a 600 nm (DU-68
Spectrophotometer-
Beckman). Em seguida, as células foram coletadas por centrifugação (3000 g por
5
min), lavadas em 1M de sorbitol e ressuspensas em meio YPD 4% e em
meio
YPRafinose 2%.As células foram então incubadas sob agitação a 200rpm a
uma
temperatura de 30º C por 2 horas, para que ocorresse a desrepressão das
células
crescidas em
rafinose.
3.7.2 - Extração do
RNA
As células foram coletadas por centrifugação (3000 g por 10 min, 4º
C)
descartando-se o sobrenadante e em seguida foram lavadas com 2 ml de sorbitol
1M,
4ºC. Após nova centrifugação (3000 g por 10 min, 4º C), o sobrenadante foi
descartado
e o conteúdo restante foi ressuspenso em 2 ml de fenol / água 3,75:1 e 2 ml de
TES
(10mM Tris:Cl; 10mM EDTA; 0,5% SDS; pH 7,5) seguido de agitação vigorosa
em
32
Vortex. Os tubos foram incubados em banho Maria a 70º C por 1 hora, sendo
agitados
vigorosamente em Vortex a intervalos de 5 minutos. Os tubos foram
centrifugados
(3000g por 10 min a 4º C) e a fase superior coletada em tubos de
microcentrífuga.
Foram adicionados 800 l de fenol / água 3,75: 1, e após nova agitação os tubos
foram
centrifugados (3000g por 10 min a 4º C). O sobrenadante foi coletado e
foram
adicionados 600 l de clorofórmio. Procedeu-se à nova agitação em vortex e
em
seguida, os tubos foram centrifugados (3000g por 10 min a 4º C). O sobrenadante
foi
coletado e foram adicionados acetato de sódio (50l, 3M pH 5,3) e etanol
gelado
100%(1 ml). Em seguida os tubos foram incubados a –70º C por 10 minutos.
As
amostras foram centrifugadas (15000 rpm por 10 min, 4º C). O sobrenadante
foi
descartado e o sedimento lavado com 500 l de etanol 70%. As amostras
foram
centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. O RNA foi ressuspenso em 50 l
H
2
O
DEPC (200ml H
2
O milli Q estéril, 200l DEPC) e armazenado a -70ºC até a
utilização.
3.7.3 - Eletroforese em gel de
agarose
3.7.3.1 - Preparação das amostras de RNA para corrida no
gel
As amostras foram desnaturadas a 68º C por 5 minutos em aparelho
termoblott.
Uma alíquota de 5l de cada amostra foi misturada com 15l de tampão de amostra
(1x
volume NBC 20x, 3x volume formaldeído 37%, 2x volume corante, 10x
volume
formamida) e 1l de brometo de etídio 10mg/ml. As amostras foram então mantidas
em
gelo por 5 minutos antes da
aplicação.
3.7.3.2 - Montagem do gel para corrida de
RNA
Todo o material utilizado (cuba de eletroforese, pente e suporte para o gel)
foi
previamente tratado com NaOH 0,1M por duas horas e depois enxaguado por
várias
vezes com água milli Q. Para a eletroforese foi preparado um gel de agarose 1%
em
NBC 1x e formaldeído 1%. Antes da aplicação, os géis foram percorridos por
30
minutos a 100V em tampão NBC 1X. Depois disto as amostras foram aplicadas e
a
eletroforese realizada nas mesmas condições. Em seguida os géis foram visualizados
no
transiluminador a 365 nm e fotografados
(Sony-KAISER-RSI).
33
3.8 – Ensaios de microarranjos de
DNA
3.8.1 – Micro arranjos de
DNA
Os avanços obtidos nos últimos anos, relativos ao seqüenciamento do genoma
de
várias espécies, inclusive do genoma humano realizado pelo consórcio
internacional
para seqüenciamento do genoma humano, trouxeram uma vasta gama de informações
a
respeito da constituição do genoma destas espécies, mas independente dos
esforços
realizados, muitas questões permanecem não elucidadas. Com relação ao ser
humano,
não se sabe ainda quantos genes são realmente funcionais, sendo que as
estimativas
realizadas através de análises computacionais variam entre 30.000 e 120.000 (Das
e
cols.,
2001).
Independentemente do número exato de genes funcionais necessários
à
sobrevivência de um dado organismo, o desafio consiste em determinar quais genes
são
necessários em determinada condição fisiológica ou estágio do desenvolvimento,
ou
ainda quais genes são expressos em diferentes tecidos ou em determinadas
situações
patológicas. Estas são questões abordadas por uma nova área do
conhecimento,
denominada genômica funcional (Asnagli & Murphy,
2001).
Um aspecto crucial da genômica funcional é a descrição da expressão global
dos
genes de um determinado organismo, abordando basicamente duas
questões:
a) Quando, no organismo em questão, os genes são expressos ou
reprimidos?
b)Como a expressão desses genes varia em função de mudanças fisiológicas
ou
metabólicas ou ainda
patológicas?
Durante muito tempo, essas questões foram abordadas com o emprego
de
técnicas com baixa capacidade de resolução, como Northern blot, RNAse
protection,
Western blot, permitindo avaliar um pequeno conjunto de genes de cada vez.
A
disponibilidade de dados através dos projetos de análise de genomas e
o
desenvolvimento da técnica de micro arranjos de DNA, possibilitou a análise
da
expressão de centenas ou milhares de genes em um único
ensaio.
A técnica de micro arranjos de DNA consiste na hibridização de
múltiplas
sondas fluorescentes com um DNA alvo de determinada célula ou tecido. As células
de
interesse são submetidas à extração do mRNA. O mRNA é transcrito em cDNA
e
marcado com uma sonda fluorescente. Em seguida, o cDNA marcado é hibridizado
com
34
sondas de DNA conhecidas (representando um genoma ou um conjunto de
genes
específicos) afixadas a uma matriz sólida (um lamina de vidro recoberta com
uma
matriz especifica para adesão das sondas). A hibridização ocorre através do
pareamento
complementar de bases entre as sondas e os cDNAs, proporcionalmente à
concentração
de moléculas de cDNA presentes. Em seguida, as laminas são submetidas à leitura
de
fluorescência em comprimentos de onda específicos para cada corante e os dados
são
coletados na forma de intensidade de fluorescência para cada ponto (cada sonda
alvo),
sendo posteriormente
analisados.
3.8.2 - Marcação do cDNA para Micro
arranjos
Para a realização do experimento de marcação do cDNA obtido a partir
dos
RNAs extraídos foi usado o CyScribe Post-Labelling kit. Os seguintes reagentes
foram
descongelados em gelo: tampão CyScript, DTT, mix de nucleotídeos, AA-dUTP,
H
2
O,
RNA total e iniciadores. Em seguida foi feita a reação de anelamento do RNA
total
com os iniciadores de oligo-dT para a marcação direta. Foi preparado o Mix1 (um
para
controle e o outro para o experimental), sendo utilizada uma quantidade de RNA
total
equivalente a
20µ
g de amostra e como iniciador foi utilizado o
oligo-dT.
Reagentes do
Mix1
Amostra
1
Amostra
2
RNA
total
X
µ
l
(
20µ
g)
X
µ
l
(
20µ
g)
Oligo-dT
ancorado
4
µ
l
4
µ
l
Água (do
kit)
Y
µ
l
Y
µ
l
T
O
T
AL
11
µ
l
11
µ
l
As amostras foram misturadas e incubadas a 70º C por 5 minutos
no
termociclador. Deixou-se esfriar por 10 minutos a temperatura ambiente e preparou-se
o
Mix2.
35
Reagentes do
Mix2
x
1
5x tampão
CyScript
4
µ
l
DTT
0,1M
2
µ
l
M
i
x
de
nu
c
l
e
ot
í
d
e
os
1
µ
l
AA-dUTP
1
µ
l
Tr
a
n
s
c
r
ipt
as
e
r
e
v
e
rs
a
C
y
S
c
r
ipt
1
µ
l
T
O
T
A
L
9
µ
l
Foram transferidos
9µ
l dos tubos de reação do Mix2 para os quatro
tubos
contendo os 11
µ
l do Mix1. Os tubos de reação foram misturados bem com a pipeta
e
quando necessário, submetidos a uma rápida centrifugação para homogeneização
da
mistura. A reação foi incubada 10 minutos a temperatura ambiente e, em seguida a
42ºC
por 1,5 h. Nesta fase, os tubos de reação foram colocados em gelo para
purificação.
3.8.3 - Degradação do mRNA (Hidrólise
alcalina)
Foram adicionados aos tubos de reação
2µ
l de 2,5M NaOH. Misturou-se bem
e
em seguida centrifugou-se durante 30 segundos. Os tubos foram incubados
no
termociclador a 37º C por 15 minutos. Aos tubos foram adicionados
10µ
l de
2M
HEPES “free acid”. Novamente, misturou-se bem e centrifugou-se por 30
segundos
.
Neste momento, pôde-se congelar a -20º C ou prosseguir o experimento fazendo
a
purificação da sonda de
cDNA.
3.8.4 - Purificação da sonda de
cDNA
Foram adicionados
120µ
l de tampão de ligação a cada reação e todo o
volume
foi transferido para um poço da placa de purificação de 96 cavidades
(Millipore
Multiscreen filter plate). Centrifugou-se a 1000xg por 1 minuto a 25ºC e descartou-se
o
filtrado. Cada poço do filtro foi lavado 4x usando
200µ
l de Etanol 80%, sendo que
a
última lavagem foi realizada a 3500rpm por 5 minutos. O filtrado foi descartado e
a
placa de coleta foi trocada por uma nova. As amostras foram eluídas 2x com
45µ
l
de
10mM Tris pH 8,0 e a cada eluição foram centrifugadas a 3000rpm por 5
minutos
.
Juntou-se os
85
µ
l de sonda marcada em um tubo âmbar. As amostras foram secas
no
36
speed-vac por aproximadamente 40 a 60 minutos, até secar (não em excesso).
Neste
ponto pôde-se parar a marcação e as amostras puderam ser congeladas secas por
vários
dias
.
3.8.5 - Reação de marcação com
CyDye
O cDNA amino allyl purificado foi ressuspendido em
15µ
l em
água
DEPC.
Também foi ressuspendida uma alíquota de Cy3 (corante verde) e outra de
Cy5
(corante
vermelho) do kit em
15µ
l de 0,1M Bicarbonato de Sódio pH 9,0.
Adicionou-se
imediatamente uma alíquota de CyDye (corante Cy) a uma alíquota de cDNA. A
reação
foi misturada e incubada a temperatura ambiente, no escuro, por uma
hora.
Foi
adicionado
15µ
l de Hidroxilamina 4M a cada reação. Novamente, a mistura
foi
homogeneizada e incubada à temperatura ambiente, no escuro, por 15 minutos.
Em
seguida, realizou-se a purificação como descrito anteriormente, sem secar e
sem
incidência direta de luz. O volume eluído foi medido e foi dosada a marcação
no
espectrofotômetro. A etapa de marcação dos cDNAs com os corantes fluorescentes foi
realizada
sem a incidência de luz
direta.
3.8.6 - Quantificação da sonda
marcada
Foram utilizadas cubetas de quartzo de
50µ
l reservadas para cada Corante.
As
cubetas foram lavadas cerca de 5 vezes com água milli-Q, tendo sido adicionados
cerca
de
70µ
l de Tris-HCl pH 8,0 para zerar o espectrofotômetro. Apos a retirada da
solução
de Tris da cubeta, colocou-se todo o volume de sonda marcada (não diluída) na
cubeta.
A leitura foi feita nos seguintes comprimentos de onda: 550 nm para Cy3, 650 nm
para
Cy5 e 260 nm para quantificação de cDNA. Foi medido o volume final de cada uma
das
reações. O total de corante incorporado foi determinado de acordo com a
seguinte
fórmula:
(OD x fator de diluição x volume) / (E x 10
-6
) = total pmol de
Cy
Volume = volume de sonda
purificada
OD = densidade ótica, unidade de medida:
nanômetros.
E 550 coeficiente de extinção molar Cy3 =
150000M
E 650 coeficiente de extinção molar Cy5 =
250000M
37
A fórmula também pode ser dada resumidamente
como:
Para Cy3 → (ABS / 0,15) x vol =
pmol
Para Cy5 → (ABS / 0,25) x vol =
pmol
ABS =
absorbância
Esta etapa, tal como a anterior, foi feita sem a incidência de luz
direta.
3.8.7 - Hibridização
manual
As amostras foram secas totalmente no aparelho Speed-vac (Savant), à 30º C
por
aproximadamente 40 a 60 minutos. Cada uma foi ressuspensa com 6,75
µ
l água
DEPC.
As sondas foram misturadas Cy3 e Cy5 (total 13,5
µ
l) e então foram acrescentados
13,5
µ
l de tampão de hibridização e 27
µ
l de formamida. Incubou-se a 92º C por 2 minutos
e
colocou-se no gelo. Os
54µ
l da amostra foram aplicados em uma das extremidades
da
lâmina contendo os microarranjos de DNA (EuroGentec), sem encostar a ponteira
na
lâmina, fazendo um arraste de solução. Com cuidado para não fazer bolhas,
colocou-se
por cima uma lamínula muito limpa com o auxílio de uma pinça. A lamínula
foi
colocada dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml (preso em suporte de ferro) com
um
filme de água, na horizontal. O suporte foi colocado no banho a 42º C por 16
h.
3.8.8 -
Lavagens
As duas primeiras soluções foram aquecidas em banho a 55º C. Foram feitas
5
lavagens, como descrito a seguir, sob leve agitação e protegendo as lâminas da
luz:
1. 1x SSC, 0,2% SDS → 10min 55º
C
2. 0,1x SSC, 0,2% SDS → 10min 55º
C
3. 0,1x SSC, 0,2% SDS → 10min 55º
C
4. 0,1x SSC → 1min- T
emperatura ambiente
5. 4 vezes em água
milli-Q
Após mergulhar em água, as lâminas foram secas imediatamente com nitrogênio
gasoso
e as imagens e fluorescência foram captadas em
seguida.
38
3.8.9 – Leitura das
lâminas.
Ao final da hibridização, a fluorescência nas lâminas foi captada com o auxilio
do
aparelho scanner utilizando os parâmetros de intensidade de fluorescência
relacionados
abaixo. Estes parâmetros são padronizados de acordo com a intensidade
de
fluorescência emitida por cada corante, sendo menores para Cy5 uma vez que a
emissão
de fluorescência deste corante é maior que a emissão de
Cy3.
PMT Cy3 –
900
PMT Cy5 –
650
3.8.10 – Análise
estatística
Os experimentos de hibridização foram realizados no mínimo 3 vezes e
os
resultados foram analisados utilizando-se dos métodos estatísticos descritos por
Yang,
Y.H. e colaboradores. (Yang e cols., 2002). Foram considerados como
genes
diferencialmente expressos apenas aqueles que apresentaram sinal de
fluorescência
igual ou maior que oito vezes o valor do sinal de fundo (background) e
que
apresentaram intensidade de fluorescência maior que 1x log
2
em relação ao
gene
controle. Uma segunda analise foi realizada utilizando o pacote estatístico R, usando
o
critério de Fold Variation de acordo com Gentleman e colaboradores(Gentleman
R
& Ihaka R, 1997). Foram selecionados os genes que apresentaram valores
superiores
a
dois desvios da
média.
39
3.9 – Reação em cadeia da polimerase em tempo
real.
3.9.1 –
Introdução
Os experimentos de microarranjos de DNA são capazes de fornecer um
conjunto
muito grande de dados referentes à expressão gênica global de determinado
organismo.
Estes dados, apesar de fornecerem informações qualitativas muito importantes, não
são
precisos do ponto de vista quantitativo, uma vez que as condições empregadas
nos
experimentos não são as ideais para cada gene analisado. Para validar os dados
obtidos
nos experimentos de microarranjos, devemos empregar um método capaz de
fornecer
dados quantitativos mais precisos. Dentre os vários métodos disponíveis, um dos
mais
empregados é a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), o
qual
permite, através da reação de amplificação dos cDNAs obtidos a partir dos
RNAs
mensageiros, quantificar exatamente o número de cópias de cada RNA
mensageiro
presente nas amostras, através da utilização de corantes ou sondas fluorescentes.
Os
métodos que empregam os corantes fluorescentes se baseiam na propriedade que
estes
corantes apresentam de se ligarem à dupla fita de DNA tão logo ela tenha
sido
sintetizada, permitindo a quantificação dos mesmos. A metodologia que emprega
as
sondas fluorescentes utiliza sondas associadas a um reagente fluorescente e a
uma
substância inibidora de fluorescência. Quando a sonda hibridiza com a seqüência alvo
e
ocorre a amplificação, ocorre a remoção da substância inibidora de fluorescência e
a
emissão de fluorescência proporcional ao número de cópias das seqüências
alvo.
3.9.2 – Obtenção dos
cDNAs
A partir de
5µ
g de RNAs extraídos das cepas selvagem W303 e pkc1∆
extraídos
nas mesmas condições descritas para os experimentos de microarranjos de DNA,
foram
sintetizados os cDNAs através do mesmo protocolo descrito em material e
métodos.
Estes cDNAs foram armazenados a -80º C até a sua
utilização.
3.9.3 – Desenho dos
iniciadores
Os iniciadores para os experimentos de PCR em tempo real foram
desenhados
com o auxílio do programa Primer Express da Applied Biosystems. Foram
escolhidos
os pares de iniciadores com a TM mais próxima e com menor conteúdo de
GC,
40
principalmente nas extremidades. A tabela 07 apresenta a seqüência dos
iniciadores
utilizados.
3.9.4 – Reação da polimerase em
cadeia
Para a reação de polimerase em cadeia em tempo real, foram utilizados
os
regentes e procedimentos abaixo
descritos:
Adicionamos a um tubo de
PCR:
5
µ
l
c
D
NA
5
µ
l iniciadores (direto e reverso) (150
µ
g/ml or 20
µ
M
cada)
4
µ
l
5
mM
4d
N
T
P
10
µ
l 10× tampão de
amplificação
70
.
5
µ
l
H
2
O.
A mistura foi aquecida por 2 min a 94° C e rapidamente
centrifugada.
Foram adicionados 0.5
µ
l (2.5 U) de Taq DNA polimerase, a solução foi
gentilmente
misturada, e rapidamente
centrifugada.
Os tubos de reação foram colocados no aparelho e os ciclos da reação estão
descritos
abaixo:
N
u
me
r
o
d
e
C
i
c
l
o
s
T
e
m
p
o
p
o
r
ci
c
l
o
T
e
m
p
era
t
u
r
a
39
ciclos:
2
min
55
°
C
2
min
72
°
C
1
min
94
°
C
1
ciclo:
2
min
55
°
C
7
min
72
°
C
Para cada conjunto de cDNAs utilizado foi feita uma reação com o gene
normalizador.
Para cada produto de amplificação foi feita uma curva de dissociação para checar
a
especificidade de cada
reação.
3.9.5 – Análise dos
resultados
Para a análise dos resultados, foi utilizado o método de quantificação
relativa,
utilizando o gene da actina como gene normalizador, conforme descrito por Livak
and
Schmittgen ((Livak & Schmittgen, 2001)
.
41
RESULTADOS E DISCUSSÃO
42
4 - Resultados e discussão
4.1. - Análise dos experimentos de microarranjos de cDNA.
Para os experimentos de análise da expressão global de genes na cepa pkc1∆,
foram utilizadas lâminas comerciais fornecidas pela Eurogentec, contendo todas as 5803
ORFs conhecidas de Saccharomyces cerevisiae, cepa 288c em duplicata, perfazendo um
total de 11.606 dados por lâmina. A hibridação e a análise de dados foram realizadas
segundo o protocolo seguido pelo CAGE (Cooperação para a análise dos genes e
genomas do departamento de Bioquímica, Instituto de Química da Universidade de São
Paulo) e o pacote estatístico R. Cada experimento foi realizado no mínimo três vezes e
os resultados foram analisados conforme descrito em material e métodos. Foram
hibridizadas sete lâminas, sendo quatro com cDNAs provenientes de mRNAs da cepa
pkc1∆ e três com cDNAs provenientes de mRNAs da cepa W303, incubadas na
presença de glicose ou rafinose como fonte de carbono.
Os dados obtidos foram filtrados e selecionados e de um total de 81.242 pontos
experimentais iniciais, um primeiro tratamento foi realizado visando eliminar os dados
que não apresentavam confiabilidade, excluindo aqueles cujo valor de intensidade de
fluorescência apresentaram discrepâncias estatísticas entre as duplicatas, pontos com
interferência na fluorescência (sujeira ou falha na impressão) e dados cujos valores de
fluorescência foram iguais ao “background” da lâmina. Utilizando o pacote estatístico
R, foi feita uma análise do background das lâminas e os resultados estão apresentados
nas figuras 9 e 10. Em seguida, foi feita uma normalização das intensidades de
fluorescência para correção dos desvios da média dos valores de fluorescência para cada
um dos corantes. O resultados das normalizações para todas as lâminas são apresentados
nas figuras 11 e 12.
43
Figura 9– Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os
cDNAs da cepa W303. Background verde representa o corante Cy3 e background
vermelho o corante Cy5.
Figura 10 – Análise do background das lâminas obtidas a partir da hibridização com os
cDNAs da cepa pkc1∆. Background verde representa o corante Cy3 e background
vermelho o corante Cy5.
44
Antes da normalização Após a normalização
Figura 11 – Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após
hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303. Estão representadas as três
lâminas hibridizadas com os cDNAs da cepa W303. Em verde está representada a
fluorescência do corante Cy3 e em vermelho a fluorescência do corante Cy5.
Lâmina 01
Lâmina 02
Lâmina 03
45
Antes da normalização Após a normalização
Figura 12 – Normalização da intensidade de fluorescência das lâminas obtidas após
hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa pkc1∆. Estão representadas as
quatro lâminas hibridizadas com os cDNAs da cepa pkc1∆. Em verde está representada
a fluorescência do corante Cy3 e em vermelho a fluorescência do corante Cy5.
Lâmina 03
Lâmina 04
Lâmina 01
Lâmina 02
46
Após a normalização da intensidade de fluorescência, foi realizada a
normalização dos dados globais por “Lowess fitting” para cada uma das lâminas obtidas
com os cDNAs da cepa W303 e da cepa pkc1∆.Estes resultados são apresentados nas
figuras 13 e 14, que apresenta um Box plot antes e após a normalização dos dados.
Antes da normalização Após a normalização
Figura 13 – Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas
obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa W303, onde M = log
2
(Cy5 / Cy3).
Antes da normalização Após a normalização
Figura14 – Box Plot apresentando a normalização por “Lowess fitting” das lâminas
obtidas após hibridização com os cDNAs obtidos a partir da cepa pkc1∆, onde M = log
2
(Cy5 / Cy3).
47
Nas Figuras 15 e 16, podemos observar os resultados normalizados da
hibridização das lâminas com o cDNA produzido a partir dos mRNAs extraídos das
cepas W303 e pkc1∆ crescidas em YPGlicose 4% e YPRafinose 2%.
Figura 15 - Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da
cepa selvagem W303.
WR – Células crescidas em glicose 4% e transferidas para rafinose 2% por 2 horas
WG - Células crescidas em glicose 4% e reincubadas em glicose 4% por 2 horas.
Onde
M = log
2
(Cy5 / Cy3)
S = 1/2*(log
2
(Cy5) + log
2
(Cy3))
B
A
C
48
Figura 16 - Hibridização das lâminas com cDNAs produzidos a partir de mRNAs da
cepa Pkc1∆.
PR – Células crescidas em glicose 4% e transferidas para rafinose 2% por 2 horas
PG - Células crescidas em glicose 4% e reincubadas em glicose 4% por 2 horas
Onde
M = log
2
(Cy5 / Cy3)
S = 1/2*(log
2
(Cy5) + log
2
(Cy3))
As figuras 15 A e 16 A apresentam em um gráfico de M x S, o resultado da
fluorescência emitida a partir da hibridização dos cDNAs obtidos a partir das cepas
incubadas em rafinose sobre a fluorescência emitida a partir da hibridização dos cDNAs
obtidos das cepas incubadas em glicose. O valor de M indica a razão de log
2
de rafinose
sobre glicose, onde cada ponto corresponde a um gene. Os valores de M maiores que
zero indicam os genes que foram mais expressos na presença de rafinose e os genes
abaixo do eixo M (menores que zero) indicam os genes que foram mais expressos em
A
B
C
49
glicose. Os valores de S indicam a intensidade de fluorescência quando comparados
com o background da lâmina. Foram considerados apenas os genes que apresentaram
intensidade de fluorescência (S) maior que oito vezes o valor do background. As figuras
15B e 16B indicam a intensidade de marcação pelos corantes Cy3 versus Cy5. As
figuras 15C e 16C representam os resultados de fluorescência obtidos em A após a
normalização por lowess fitting dos resultados de hibridização das lâminas.
A primeira observação que podemos fazer é que embora tenhamos empregado a
mesma quantidade de mRNA inicial e a mesma quantidade de cDNA marcado nas
hibridizações. houve uma marcação muito mais acentuada na cepa W303 do que na
cepa pkc1∆.
Podemos ainda observar uma marcação muito mais numerosa de genes quando
as cepas W303 e pkc1∆ foram incubadas em rafinose, em comparação com as mesmas
cepas incubadas em glicose. Isto pode ser explicado pela inibição da expressão de um
grande número de genes nas leveduras quando as mesmas estão em presença de glicose,
através da via principal de repressão por glicose, discutida anteriormente.
Utilizando o banco de dados de ontologia gênica do SGD, classificamos os
genes de acordo com a ontologia gênica e separamos os mesmos em grupos diversos.
Selecionamos então os genes envolvidos no metabolismo de carbono para uma análise
mais específica dos dados.
Os resultados obtidos estão apresentados na figura 17, onde estão representados
todos os 178 genes envolvidos com o metabolismo de carbono na levedura S.
cerevisiae, de acordo com a ontologia gênica do SGD. Cada coluna representa as
médias ( Log
2
fold variation)dos experimentos de microarranjos de DNA para as cepas
W303 e pkc1∆ .Cada bloco representa a média dos resultados para um gene isolado,
comparando as condições de desrepressão versus repressão (rafinose/glicose). O grau de
saturação de cor indica a magnitude da expressão (rafinose/glicose) de acordo com a
escala apresentada.
50
Figura 17– Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono nas cepas
W303 e pkc1∆. As colunas representam a expressão dos genes nas cepas W303 e pkc1∆
. Cada bloco representa o Log
2
(Fold variation) para cada gene, comparando a expressão
em condição de desrepressão versus a condição de repressão (rafinose/glicose). A
saturação de cor representa a magnitude da razão da expressão de rafinose sobre glicose
de acordo com a escala indicada na figura.
51
Apesar de alguns genes se apresentarem mais expressos na cepa pkc1∆ , como
por exemplo o gene YDR019c, podemos observar um maior número de genes cuja
expressão é maior na cepa W303 quando comparada com a cepa pkc1∆.
A partir da análise da expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de
carbono, selecionamos um grupo de genes cuja expressão estava aumentada na cepa
W303 em relação à cepa pkc1∆ em condição de desrepressão metabólica. Na figura 18
estão representados os genes selecionados e os resultados da expressão dos mesmos
obtidos a partir dos experimentos de microarranjos de DNA.
52
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
ARG82 COX14 CYB2 DLD1 FUM1 GLC3 GPT2 GRE1 GTT1 GUT1 GUT2 HXT2 HXT3 HXT5 ICL2 JEN1 MDH2 PDC1 PFK2 PLC1 PYC1 RHR2 RSF2 SDH1 SUC2 TKL2
Fold variation
WR/WG
PR/PG
Figura 18 – Expressão dos genes envolvidos com o metabolismo de carbono selecionados através dos ensaios de microarranjos de DNA para
validação por RT-PCR. Os valores estão expressos em Log
2
(Fold variation).
53
Podemos observar nesta figura que o gene SUC2 apresentou uma expressão
maior na cepa pkc1∆ em relação à expressão na cepa selvagem W303. Também não
estão apresentados os valores para os genes HXT1, HXT4 e HXT6 que codificam para
transportadores de glicose. Estes genes não estão representados porque seus dados
foram excluídos durante os procedimentos de análise dos microarranjos de DNA. Para
os genes HXT1 e HXT4 o número de dados não foi suficiente, uma vez que em duas
lâminas da cepa W303 a leitura dos mesmos ficou comprometida. O gene HXT6
apresentou valores muito discrepantes entre as réplicas, não podendo ser analisado.
Apesar disto, estes genes foram incluídos nos experimentos de RT-PCR, uma
vez que dados anteriores obtidos em nosso laboratório indicavam que SUC2, HXT1 e
HXT4 apresentavam uma expressão diminuída na cepa pkc1∆ quando comparada com a
cepa W303. Incluímos o gene HXT6 porque assim teríamos a possibilidade de avaliar o
comportamento de todos os genes para transportadores funcionais de glicose em
Saccharomyces cerevisiae.
4.2. - Reação em cadeia da polimerase em tempo real – (RT-PCR).
Baseados nos resultados obtidos a partir dos experimentos de microarranjos de
DNA, selecionamos 28 genes envolvidos no metabolismo de carbono para validação
através de RT-PCR. Como descrito em material e métodos, utilizamos o gene da actina
como controle interno da análise da expressão dos genes selecionados.
Através do banco de dados disponível no SGD, obtivemos as seqüências das
regiões codificadoras de cada um dos genes e utilizamos estas seqüências para o
desenho dos iniciadores a serem utilizados nos experimentos de RT-PCR. Os
iniciadores foram desenhados com o auxílio do programa Primer Express da Applied
Biosystems. Foram escolhidos os pares de iniciadores com a TM mais próxima e com
menor conteúdo de GC, principalmente nas extremidades. Realizamos então os
experimentos de RT-PCR, a partir dos mRNAs extraídos das cepas W303 e pkc1∆,
comparando a expressão dos mesmos em condição de desrepressão e repressão
metabólica ( rafinose/glicose). Os resultados foram normalizados utilizando o gene da
actina, como descrito em material e métodos. Os resultados estão apresentados na figura
19, e são expressos em quantificação relativa. As figuras estão ordenadas pela
magnitude da expressão, ou seja, primeiro são apresentados os resultados dos genes que
apresentaram uma expressão relativa menor.
54
Gen
e
Iniciador direto Iniciador reverso
Actina
G
CCGAAAGAATGCAAAAGGA
TCTGGAGGAGCAATGATCTTGA
ARG82
CCGGAGCGATGGGAATTACTAA
ACCAGTTGTTTTTTTGTCCTTTGG
COX14
GACGTTGGTTGGTGGTACGTT
TTGTTCGTACTTCTTACCGTTCATG
DLD1
CCCTGAAGAACACGAAACCTGTAG
AAATCGACGGGTGCTTCACCTA
CYB2
GGTGTTCAACGTACCGAAGATG
CCACCATGATTGGATAGAAC
CA
FUM1
TTAGTCACCGCTTTGAACCCTAA
TTCAGGAACAACCCATTCATCA
GLC3
GCTGTGGGATTCCCGTCTTT
AAAATGCCAGGTTTGCTAATAAGAA
GPT2
TCGACCCGGCTTTGGTAAT
CATTCTGGATCGGGACTTTCC
GRE1
TGCTCAAAGTAACCGCTACCAA
CGTTTCCTGACCCAGACAGATC
GUT1
CCACGTTGAAGTTCCCCAAA
TTGGACGACGTTCACCAGTA
AT
GUT2
GCCTCGCTTGTGTACCATGA
ACAGCCGTGATGGCTAAAGTG
HXT1
GCTTCCTGGGTTCCAGTATCC
TGGTTGGTCATCATGCATTAGG
HXT2
GGCCCCAATTGCCTACGT
CAATAGCCATAGCACGATTTTTGA
HXT3
CGAAGCAAGAGCATCTCTTTCC
ACCCCATGATGCTGAACCA
HXT4
TGCTGCTTCCATGACAGCTT
CTTCTTACCATTTGGCCACAATC
HX
T5
CTGGTACCGCCGGTTACAA
GCCTTCATGGGAAATGTAACTTG
HXT6
GCTGCATCCATGACTGCTTGT
TCTTGACCATTTGGCCATAATCT
ICL2
GCCGGATTTTGGCGATT
AATTGCTGCGCCTTGAATATTC
JEN1
CCTTACTGCACATCCACGAGTTT
CCATGTCATTTTGCGCAGTT
MDH2
ACCGGAGCGTTACCCACAT
GGCGGTAACACCGTTGATG
PDC1
CCAACTT
TCGGTGCTAAGGACTAT
CAAGTTTTGTGGAGCATCGAAGA
PFK2
GAAAACTTCAACGCTGATGACAA
CCAGTGAATGACCTTTGGCATT
PLC1
GCAAACTAATGATATTGGACAGCAA
TGGAATCATTTTCGCCTTTGTT
PYC1
TTACTAAATCCAAAGCAGACATGCA
TTTCCATTTTCATGGCGCTTAA
RHR2
TGCCTTTGACCACAAAACCTTT
GAATAACGTGTTCGGCATCGAA
RSF2
CAATAAACGCCAATCCAGCAAT
CATAGCAAACTTCCTCCAAAGCTT
SDH1
TGATGAAGAAACTGGCGAAGAC
CAGAAACACAAGCGGCTTCAC
SUC2
CTATGCCTTGCAAACTTTCTTCAA
TTGAAGCCCAGGCAATACCT
TKL2
ATGGCACAGTTCTCCGACATT
TCCACCTGGTCAACGGAAAG
Tabela 07 – Iniciadores utilizados nos experimentos de RT-PCR para validação dos
experimentos de microarranjos de DNA.
55
A
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
COX14 DLD1 FUM1 HXT1 HXT2 HXT3 HXT4 MDH2 PDC1 PFK2 PLC1 PYC1 RHR2 SDH1
Quantifica ção Relativa
WR/WG
PR/PG
B
0
10
20
30
40
50
ARG82 CYB GLC3 GPT2 RSF2 SUC2
Quantificação Relativa
WR/WG
PR/PG
C
0
20
40
60
80
100
GUT1 GUT2 HXT5 HXT6 ICL2
Quantificação Relativa
WR/WG
PR/PG
D
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
GRE1 JEN1 TKL2
Quantificação Relativa
WR/WG
PR/PG
Figura 19 – Resultado da análise por RT-PCR da expressão de genes envolvidos no
metabolismo de carbono nas cepas W303 e pkc1∆. Os valores estão expressos em
quantificação relativa, usando o gene da actina como gene normalizador e representam a
media de três experimentos.
56
Analisando os resultados da figura 19, podemos observar, para nossa surpresa ,
que alguns genes apresentaram uma expressão maior na cepa pkc1∆ do que na cepa
W303 em condição de desrepressão metabólica. São eles o gene HXT4, que não havia
sido analisado nos experimentos de microarranjos de DNA e os genes MDH2 uma
enzima com atividade málica, RHR2 uma enzima com atividade de glicerol 1 fosfatase e
SDH1 uma enzima com atividade de succinato desidrogenase. Aparentemente estes
resultados contradizem aqueles encontrados nos experimentos de microarranjos.
Entretanto, é conveniente salientar que a validação dos experimentos de microarranjos
de DNA através do RT-PCR visa exatamente eliminar os desvios que podem acontecer
nos experimentos de microarranjos. Devemos lembrar que a hibridização dos cDNAs
nos experimentos de microarranjos não é otimizada para um determinado gene, uma vez
que a temperatura de hibridização não leva em consideração um único gene. Assim,
podemos estar trabalhando numa faixa de temperatura de hibridização que é boa para a
maior parte dos genes mas está longe da ideal para outros em particular. Nos
experimentos de RT-PCR, os iniciadores são desenhados e selecionados para uma faixa
de temperatura ótima para todos os genes, com desvios muito pequenos da temperatura
ideal. Nestas condições, podemos analisar com um grau de certeza maior a expressão
dos genes selecionados.
Voltando à analise dos resultados do RT-PCR, podemos observar que sete genes
apresentam uma expressão maior na cepa W303 quando comparada com a cepa pkc1∆
em condição de desrepressão metabólica. São eles ARG82 que codifica para uma
inositol muliquinase envolvida no metabolismo de inositois polifosfatos, HXT5 que
codifica para um transportador de glicose de afinidade moderada, ICL2 que codifica
para uma proteína envolvida no metabolismo de ácido propiônico, JEN1 que codifica
para um transportador de lactato, PLC1 que codifica para uma fosfolipase que hidroliza
Fosfatidilinositol -4,5-bifosfato gerando inositol 1,4,5 trifosfato e diacilglicerol, RSF2
que codifica para uma proteína do tipo dedo de zinco e está relacionada ao controle de
genes envolvidos no metabolismo respiratório e no crescimento em glicerol e TKL2 que
codifica para uma proteína envolvida no metabolismo de pentoses fosfato. Todos os
demais genes não apresentam uma expressão diferente quando comparadas as duas
cepas analisadas.
Para excluirmos a possibilidade da existência de artefatos nos experimentos de
RT-PCR como a formação de dímeros de iniciadores durante a reação, realizamos as
57
curvas de dissociação para todos os experimentos realizados. Na figura 20,
apresentamos os resultados para os genes da actina e os sete genes que apresentaram
uma expressão maior na cepa W303 quando comparada com a cepa pkc1∆.
Figuras 20 – Curvas de dissociação das reações de RT-PCR. Estão representadas as
curvas de dissociação para as reações realizadas com os cDNAs obtidos das cepas
W303 e pkc1∆. Os genes estão identificados em cada uma das reações.
Os resultados apresentados mostram que não houve a formação de dímeros de
iniciadores ou outros artefatos durante as reações de RT-PCR, demonstrando que os
iniciadores escolhidos satisfizeram os requisitos desejados.
ACTINA
ARG82
H
XT5
ICL2
PLC1
JEN1
RSF2
TKL2
58
4.3. – Análise “in silico” dos genes diferencialmente expressos.
Com base nestes resultados foi realizada uma analise “in silico “ tentando
encontrar algum fator que pudesse conectar os genes que apresentaram uma menor
expressão na cepa pkc1∆. Para isto, foi realizada uma busca por fatores de transcrição
relacionados com o controle da expressão dos genes acima relacionados, através de
pesquisa no site Yeastract (Teixeira e cols., 2006). Quatro dos sete genes (HXT5, ICL2,
JEN1 e RSF2) apresentaram um sitio de ligação para o fator de transcrição Sok2p, um
repressor transcricional dependente de glicose cuja atividade supressora depende da
fosforilação no resíduo T 598 por PKA (Shenhar & Kassir, 2001).Três genes (HXT5,
ICL2 e TKL2) possuem sítios de ligação para o fator de transcrição Crz1p, um ativador
transcricional dependente de calcineurina envolvido na ativação de FKS2, um
componente do complexo glucano sintase regulado por Pkc1p (Lu e cols., 2005a;
Stathopoulos & Cyert, 1997) (Boustany & Cyert, 2002) e no controle da expressao de
diversos genes em S.cerevisiae (Matheos e cols., 1997).
Buscamos então por possíveis sítios de fosforilação em Sok2p e Crz1p por
Pkc1p utilizando as ferramentas disponíveis no site NETPHOSK (Blom e cols., 2004)e
encontramos dezoito sítios de fosforilação por Pkc1p com “score” acima de 0,70 com o
maior “score” (0,91) na posição 132, indicando uma grande possibilidade de que Sok2p
possa ser fosforilado por Pkc1p. O resíduo T598 não aparece como possível sítio de
fosforilação por Pkc1p, indicando que caso Pkc1p atue sobre Sok2p isto aconteça em
outros resíduos. (Tabela 08)
59
Metodo: NetPhosK com filtro ESS – Corte - 0,70
Nome: Sok2p
Pos: AA: Kinase: Score: Positivo: Negativo:
Pos AA Kinase Score Positivo Negativo
14 S PKC 0.79 2 0
132 T PKC 0.906 2 0
133 T PKC 0.905 2 0
186 S PKC 0.818 2 0
220 T PKC 0.738 2 0
291 S PKC 0.772 2 0
377 T PKC 0.728 2 0
384 T PKC 0.834 2 0
385 T PKC 0.718 2 0
395 T PKC 0.724 2 0
515 S PKC 0.796 2 0
532 S PKC 0.705 2 0
533 T PKC 0.809 2 0
647 T PKC 0.726 2 0
695 S PKC 0.711 2 0
731 T PKC 0.7762 2 0
738 T PKC 0.708 2 0
780 T PKC 0.794 2 0
Tabela 08 – Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Sok2p
utilizando as ferramentas disponíveis no site of NetphosK. A predição dos sítios de
fosforilação foi realizada utilizando uma faixa de corte de 0,70 e a ferramenta ESS
(Evolutionary Stable Sites). Somente os sítios de fosforilação por Pkc1p estão
representados.
Estes dados, juntamente com os resultados por nos obtidos, parecem apresentar
uma controvérsia, uma vez que Sok2p funciona como um repressor transcricional
dependente de glicose e que os genes controlados por Sok2p estão menos expressos em
Pkc1p durante o processo de desrepressão metabólica. Uma hipótese para explicar isto,
seria a de que Pkc1p possa regular negativamente a atividade de Sok2p através da
fosforilação em outros resíduos. Na ausência de Pkc1p, Sok2p poderia estar exercendo
seu efeito repressor sobre os demais genes por ele regulados, caracterizando o fenótipo
reprimido da cepa pkc1∆. Para confirmar esta hipótese, teríamos que analisar se Pkc1p
efetivamente fosforila Sok2p.É importante dizer que os níveis de expressão do gene
Sok2p não estão afetados na cepa de pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem
W303, durante o processo de desrepressão metabólica. Outra possibilidade, uma vez
que recentemente nosso laboratório adquiriu a coleção com todos os mutantes contendo
a deleção de todos os genes da cepa Saccharomyces cerevisiae da EuroScarf, seria
analisar se a dupla deleção de PKC1 e SOK2 reverteria o fenótipo de pkc1∆ para os
genes regulados por Sok2p.
60
A busca por sítios de fosforilação em Crz1p resultou em treze possíveis sítios de
fosforilação por Pkc1p com “score” acima de 0,70, com o maior “score” (0,92) na
posição 546, indicando a possibilidade de que Pkc1p fosforile Crz1p (tabela 09).
Metodo: NetPhosK com filtro ESS – Corte - 0,70
Nome: Crz1p
Pos: AA: Kinase: Score: Positivo: Negativo:
Pos AA Kinase Score Positivo Negativo
69 S PKC 0.84 2 0
143 T PKC 0.86 2 0
183 T PKC 0.89 2 0
318 S PKC 0.70 2 0
405 S PKC 0.85 2 0
418 T PKC 0.84 2 0
422 S PKC 0.83 2 0
490 T PKC 0.88 2 0
491 S PKC 0.72 2 0
544 T PKC 0.87 2 0
546 S PKC 0.91 2 0
620 T PKC 0.88 2 0
657 S PKC 0.74 2 0
Tabela 09 – Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Crz1p
utilizando as ferramentas disponíveis no site NetphosK. A predição dos sítios de
fosforilação foi realizada utilizando uma faixa de corte de 0,70 e a ferramenta ESS
(Evolutionary Stable Sites). Somente os sítios de fosforilação por Pkc1p estão
representados.
Crz1p é um fator de transcrição envolvido na ativação da transcrição de FKS2
dependente de calcineurina em resposta ao Cálcio. Zhao e colaboradores (Zhao e cols.,
1998)demonstraram que a via de calcineurina e a via de integridade celular funcionam
em paralelo durante o crescimento em condições de altas temperaturas moderadas e que
a indução de FKS2 durante o crescimento celular em meio pobre em fontes de carbono
era dependente de SNF1 e MIG1. Resultados anteriores em nosso laboratório
demonstraram que PKC1 está envolvido na regulação da localização celular de Mig1p.
Zakrzewska e colaboradores (Zakrzewska e cols., 2005)demonstraram que Crz1p está envolvido
na resposta celular a quitosano, um composto formado por cadeias lineares de resíduos de β-1,4
glicoseaminas que age perturbando a membrana celular, mostrando que células
deletadas do gene CRZ1 são mais sensíveis ao quitosano. Garcia e colaboradores
61
mostraram que o uso de agentes que causam perturbações na parede celular como
vermelho congo e zimolase induziu um aumento da expressão de diversos genes
relacionados à via de integridade da parede celular e que Crz1p estava relacionado à
regulação da expressão de alguns desses genes.(Garcia e cols., 2004). Lagorce e
colaboradores (Lagorce e cols., 2003), usando mutantes da via de síntese da parede
celular, demonstraram que a via de integridade celular e a via de Ca
++
/Calcineurina
atuavam em conjunto regulando a expressão de FKS2 através da ação de Crz1p.
Analisando estes dados em conjunto, podemos estabelecer uma conexão entre
Pkc1p e Crz1p, atuando conjuntamente na manutenção da integridade celular. A
ausência da Pkc1p e conseqüentemente mudanças estruturais ao nível da parede celular,
uma vez que Pkc1p está diretamente envolvida no metabolismo da parede celular
através da ativação da via das MAP quinases e do complexo glucano sintase, pode se
refletir na composição da membrana celular numa tentativa de se manter a integridade
celular. Uma vez que um dos alvos da via de integridade celular é o gene FKS2, que
também é controlado por CRZ1, é possível pensar na hipótese de que outros genes
compartilhem um mecanismo de controle exercido por Pkc1p e Crz1p. Estudos mais
detalhados, com a construção de duplos mutantes pkc1∆:crz1∆ podem permitir uma
visão mais detalhada das possíveis interações de Pkc1p com Crz1p.
Voltando aos genes cuja expressão está diminuída na cepa pkc1∆ , é interessante
notar que dois deles codificam para transportadores presentes na membrana celular (
HXT5 e JEN1). Resultados anteriores obtidos em nosso laboratório mostram que outros
transportadores de glicose também estão menos expressos na cepa pkc1∆ quando
comparada com a cepa selvagem W303. Uma menor expressão destes transportadores
poderia explicar o crescimento mais lento de pkc1∆, uma vez que a captação de
nutrientes, essencial para o crescimento celular, é diretamente dependente da expressão
dos mesmos. Como discutido anteriormente, perturbações ao nível da parede celular
podem implicar em alterações ao nível da membrana celular, o que pode afetar a
organização e a funcionalidade das proteínas associadas à mesma.
Dois outros genes (ARG82 e PLC1) estão envolvidos no metabolismo de
inositois e na sinalização celular dependente de fosfolipídios. Embora em mamíferos
exista uma correlação direta entre PKC e PLC1 através da ação de Diacilglicerol e
Ca++, produtos finais da ação de Plc1p que atuam ativando a Pkc1p (O'Brian & Ward,
1989; Bell e cols., 1986), esta conexão não foi observada em leveduras. A menor
expressão de ARG82 e PLC1 pode estar relacionada com o metabolismo dos lipídeos
62
da membrana celular, uma vez que a cepa pkc1∆ apresenta problemas relacionados à
manutenção da integridade da parede celular. Outro fator a ser levado em conta é o fato
que produtos do metabolismo de fosfolipídeos como IP3, IP4, IP5 e IP6 e outros, estão
relacionados com vias de controle da expressão gênica e nos mecanismos envolvidos no
transporte de mRNAs a partir do núcleo (Odom e cols., 2000; York e cols., 1999; cazar-
Roman e cols., 2006; Resnick e cols., 2005; Auesukaree e cols., 2005; Chi e cols.,
2004). Uma menor expressão de ARG82 e PLC1 poderia afetar o metabolismo destes
fosfolipídeos, afetando a expressão de diversos genes ou mesmo afetando de uma
maneira geral o transporte de mRNAs a partir do núcleo.
O gene RSF2 é um gene cuja expressão é fundamental para o metabolismo
aeróbico e para o metabolismo do glicerol. Lu e colaboradores (Lu e cols.,
2005b)demonstraram que RSF2 controla uma série de genes envolvidos com a
utilização de glicerol como fonte de carbono e genes mitocondriais envolvidos na
respiração celular.Uma expressão diminuída de RSF2 pode explicar a ausência da
segunda fase de crescimento e a incapacidade que a cepa pkc1∆ tem de crescer em
glicerol como única fonte de carbono, conforme descrito anteriormente em nosso
laboratório.
63
Uma busca por fatores de transcrição associados aos genes cuja expressão estava
aumentada em pkc1∆ através do programa Yeastract, nos permitiu identificar o fator de
transcrição Gcr1p, que possue sítios de ligação em três dos quatro genes pesquisados
(HXT4, RHR2 e SDH1).
Gcr1p é um fator transcricional ativador de genes envolvidos na glicólise,
atuando como regulador positivo da enolase e de genes da família das gliceraldeido -3 -
fosfato desidrogenases.
Uma busca por sítios de fosforilação por Pkc1p em Gcr1p resultou em nove
possíveis sítios de fosforilação com score superior a 0,70, indicando a possibilidade de
que Gcr1p seja fosforilado por Pkc1p ( Tabela 10).
Tabela 10 – Predição de sítios de fosforilação quinase específicos na proteína Gcr1p1p
utilizando as ferramentas disponíveis no site NetphosK. A predição dos sítios de
fosforilação foi realizada utilizando uma faixa de corte de 0,70 e a ferramenta ESS
(Evolutionary Stable Sites). Somente os sítios de fosforilação por Pkc1p estão
representados.
Zeng e colaboradores (Zeng e cols., 1997) demonstraram que Gcr1p é altamente
fosforilado em resíduos de serina e que esta fosforilação é dependente do fator Gcr2p.
Entretanto, não foram identificadas qual ou quais seriam as quinases responsáveis pela
fosforilação de Gcr1p e muito menos se a fosforilação do mesmo aumentava ou
diminuía sua atividade como ativador transcricional.
Para analisar se Pkc1p efetivamente fosforila Gcr1p, serão necessários ensaios
de fosforilação “in vitro” e “in vivo” para confirmação. Também seria interessante
analisar o fenótipo do duplo mutante pkc1∆:gcr1∆ e a expressão dos genes regulados
por Gcr1p durante o processo de desrepressão metabólica..
Metodo: NetPhosK com filtro ESS – Corte - 0,70
Nome: Gcr1p
Pos: AA: Kinase: Score: Positivo: Negativo:
20 S PKC 0.85 2 0
48 T PKC 0.8 2 0
132 S PKC 0.81 2 0
225 S PKC 0.78 2 0
479 S PKC 0.81 2 0
605 T PKC 0.77 2 0
607 T PKC 0.77 2 0
612 S PKC 0.8 2 0
687
T
PKC
0.75 2
0
64
4.4. - Análise da atividade de ß-galactosidase das construções CYC1-ß-Gal, HXT1-
ß-Gal e SUC2- ß-Gal.
Resultados obtidos em nosso laboratório por Brandão e cols.. (2002)
demonstraram que uma cepa de S. cerevisiae com deleção do gene PKC1 apresentava
uma série de problemas na desrepressão metabólica. As células de pkc1∆ não eram
capazes de crescer em glicerol como única fonte de carbono, apresentavam uma
atividade invertásica bastante diminuída
mesmo em condições de desrepressão e baixa
expressão do gene SUC2 que codifica para a invertase; além disso, tinham um
crescimento menor na segunda fase de crescimento e apresentava problemas de
expressão dos genes que codificam para os transportadores de glicose Hxt1, Hxt2 e
Hxt4.
Através da transformação das cepas pkc1∆ e W303 com os plasmídeos contendo
o gene da ß-galactosidase sob controle dos promotores dos genes HXT1, SUC2 e CYC1
foram obtidos diversos transformantes selecionados em meio SD-Uracila. Os
transformantes foram transferidos para meio líquido e testados de acordo com a
metodologia descrita.
Na Figura 21, apresentamos os resultados da incubação de células de pkc1∆ e
W303 transformadas com a construção CYC1-ß-galactosidase. O gene CYC1 codifica a
proteína citocromo C, isoforma 1, uma proteína envolvida no transporte de elétrons
durante o processo de respiração celular. Como podemos observar ambas as células
apresentaram atividade de ß-galactosidase quando transferidas para o meio contendo
rafinose como fonte de carbono. A cepa pkc1∆ apresentou uma atividade de ß-
galactosidase superior se comparada à cepa selvagem W303. Os dados representam a
média de três experimentos independentes, realizados com células de leveduras
transformadas isoladas de colônias diferentes.
65
CYC1-LacZ
0
2500
5000
7500
10000
12500
0 10 20 30
Tempo ( horas)
Atividade
β
-Galactosidase nmoles
ONP/min/mg proteina
W303
pkc1
*
*
*
*
Figura 21 – Atividade de ß-galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das
cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção CYC1–ß-Galactosidase.(*)
p<0,05.
Estes resultados indicam que a indução da transcrição do gene da ß-
galactosidase associado ao promotor do gene CYC1 foi superior na cepa pkc1∆ quando
comparamos com a cepa selvagem W303. Isto indica que, apesar de não apresentar uma
segunda fase metabólica respiratória, este problema não se encontra associado à
ativação da transcrição do gene CYC1, devendo haver outros mecanismos envolvidos na
deficiência respiratória da cepa pkc1∆.
Na Figura 22 apresentamos os resultados referentes às células do mutante pkc1∆
e da cepa selvagem correspondente W303 transformadas com a construção HXT1-ß-
galactosidase transferidas de um meio SD-Uracila e rafinose2% para um meio SD-
Uracila e glicose 4% para desrepressão do gene HXT1. O gene HXT1 codifica para um
transportador de glicose de baixa afinidade.Como podemos observar, tanto as células
pkc1∆ quanto as células W303 apresentaram atividade da ß-galactosidase, compatível
com a indução do promotor do gene HXT1. Entretanto, os níveis de indução foram
significativamente menores na cepa pkc1∆ do que na cepa W303, indicando que a cepa
pkc1∆ apresenta problemas de desrepressão do gene HXT1.
66
HXT1
0
3000
6000
9000
12000
15000
0 10 20 30
Tempo ( Horas)
Atividade
-Galactosidase nmoles
ONP/min/mg proteina
W303
pkc1
*
*
*
*
Figura 22 – Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das
cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção HXT1 – ß-Galactosidase. .(*)
p<0,05.
Estes dados corroboram aqueles apresentados por Brandão (2002), que
demonstraram que a cepa pkc1∆ apresentava problemas relacionados à expressão de
alguns transportadores de glicose, inclusive HXT1. O defeito apresentado pela cepa
pkc1∆ na expressão de transportadores de baixa e alta afinidade por glicose, pode ser
um dos fatores cruciais no que diz respeito ao crescimento mais lento que esta cepa
apresenta quando comparada à cepa selvagem, uma vez que a disponibilidade
intracelular de glicose pode estar afetada. Para confirmar esta hipótese, seria necessário
realizar experimentos de captação de glicose, comparando-se as cepas pkc1∆ e W303.
Os dados obtidos para este experimento não podem ser comparados com os
dados obtidos com os experimentos de microarranjos de DNA e RT-PCR, uma vez que
para este ensaio, as células foram crescidas em condição de desrepressão metabólica
(rafinose) e depois foram reincubadas em condições de repressão metabólica (glicose),
uma vez que a transcrição do gene HXT1 é ativada por altas concentrações de glicose. O
fato de não encontrarmos diferença na expressão do gene HXT1 nos experimentos de
microarranjos de DNA e RT-PCR, pode ser explicado pelo fato de termos incubado as
células em glicose e depois termos reincubado as mesmas em rafinose. O tempo em que
as células foram mantidas em condição de desrepressão metabólica (2 horas) pode não
ter sido suficiente para que os níveis de mRNA do gene HXT1 fossem alterados
significativamente nas duas cepas estudadas.
67
Na Figura 23, podemos ver o perfil de indução da transcrição da ß-galactosidase
associada ao promotor do gene SUC2 que codifica para a enzima invertase, após a
transferência das células de meio SD-Ura mais glicose 4% para um meio SD-Ura mais
rafinose 2%. Como podemos observar, ocorre a indução da transcrição do gene da ß-
galactosidase associado ao promotor do gene SUC2 tanto na cepa W303 quanto na cepa
Pkc ∆, não havendo diferença significativa entre as duas cepas.
SUC2-LacZ
0
250
500
750
1000
1250
1500
0 5 10 15 20 25
Tempo ( Horas)
Atividade
-Galactosidase nmoles
ONP/min/mg proteina
W303
pkc1
*
Figura 23 – Atividade de ß -galactosidase (em nmoles de ONP/min/mg de proteína) das
cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção SUC2 – ß-Galactosidase. .(*)
p<0,05.
Dados apresentados por Brandão (2002) indicavam que a atividade de invertase
estava bastante diminuída na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem
W303. Decidimos então analisar a atividade de invertase nas cepas transformadas com a
construção SUC2–ß-galactosidase. Os resultados são apresentados na Figura 24.
68
Invertase - SUC2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25
Tempo (Horas)
nmol Glicose x min
-1
x mg proteina
-1
W303
pkc1
*
*
*
*
Figura 24 – Atividade de invertase (em nmoles de glicose/min/mg de proteína) das
cepas W303 e pkc1∆ transformadas com a construção SUC2 – ß-Galactosidase. .(*)
p<0,05.
Como podemos observar, a atividade de invertase da cepa selvagem W303 é
muito maior que aquela apresentada pela cepa pkc1∆ em todo o intervalo de tempo
analisado. Os tempos correspondem ao tempo de transferência das células de um meio
YPglicose 4% para um meio YPrafinose 2%. Os dados encontrados corroboram aqueles
descritos por Brandão, exceto pelos resultados da atividade de ß-galactosidase das
construções de SUC2 – ß-galactosidase. Estes resultados, associados aos encontrados
nos experimentos de microarranjos de DNA e RT-PCR, indicam que a indução da
transcrição do gene SUC2 não apresenta problemas na cepa pkc1∆ quando comparada
com a cepa selvagem. Estes resultados sugerem que os baixos níveis de atividade
invertásica encontrados na cepa pkc1∆ não são devidos a problemas relacionados com a
transcrição do gene SUC2. Nossos dados apontam que a baixa atividade de invertase na
cepa pkc1∆ parece estar relacionada a problemas pós-transcricionais, podendo estar
relacionada com a estabilidade da proteína invertase por exemplo. Estudos mais
específicos devem ser realizados para avaliar esta hipótese.
69
CONCLUSÕES
70
5 - Conclusões
5.1 - Com base nos resultados das análises do padrão de expressão global dos
genes através de microarranjos de DNA e RT-PCR, podemos confirmar a participação
de Pkc1p nos mecanismos envolvidos na regulação da expressão de diversos genes
durante o processo de desrepressão metabólica.
5.1.1 - A cepa pkc1∆ de S. cerevisiae apresenta níveis diminuídos de expressão
dos genes ARG82, HXT5, ICL2, JEN1, PLC1, RSF2 e TKL2 quando comparada com a
cepa selvagem W303 durante o processo de desrepressão metabólica.
5.1.2 – Os genes HXT4, MDH2, RHR2 e SDH1 apresentam um nível de
expressão aumentado na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem W303
durante o processo de desrepressão metabólica.
5.1.3 – Os genes HXT1 e SUC2 não apresentaram expressão alterada nos
experimentos de RT-PCR realizados quando comparadas as duas cepas analisadas.
5.2 – A análise “in silico” dos sete genes cuja expressão está diminuída na cepa
pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem W303 encontraram dois fatores
transcricionais, Sok2p e Crz1p, possivelmente envolvidos na regulação desses genes.
5.2.1 – O fator Sok2p, um repressor transcricional dependente de glicose, possue
sítios de ligação em quatro genes HXT5, ICL2, JEN1 e RSF2.
5.2.2 – O fator Crz1p, um ativador transcricional dependente de calcineurina,
possue sítios de ligação em três genes HXT5,ICL2 eTKL2
5.2.3 – A análise “in silico” dos quatro genes cuja expressão está aumentada na
cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem W303 encontrou um fator de
transcrição, Gcr1p, envolvido na regulação de três dos quatro genes analisados (HXT4,
RHR2 e SDH1).
.
71
5.2.4 – Os fatores de transcrição Sok2p, Crz1p e Gcr1p possuem prováveis sítios
de fosforilação por Pkc1p com scores superiores a 0,70. Sok2p apresenta dezoito sítios
de fosforilação por Pkc1p, Crz1p apresenta treze sítios de fosforilação e Gcr1p possue
nove sítios de fosforilação por Pkc1p.
5.3 – Os ensaios com as construções com os plasmídeos contendo o gene da ß-
galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram
que:
5.3.1 - a indução da transcrição do gene da ß-galactosidase associado ao
promotor do gene CYC 1 foi superior na cepa pkc1∆ quando comparamos com a cepa
selvagem W303.
5.3.2 - tanto as células pkc1∆ quanto as células W303 apresentaram atividade da
ß-galactosidase, compatível com a indução do promotor do gene HXT1. Entretanto, os
níveis de indução foram significativamente menores na cepa pkc1∆ do que na cepa
W303, indicando que a cepa pkc1∆ apresenta diminuição da resposta de desrepressão
do gene HXT1.
5.3.3 - ocorre a indução da transcrição do gene da ß-galactosidase associado ao
promotor do gene SUC2 tanto na cepa W303 quanto na cepa pkc1∆, não havendo
diferença significativa entre as duas cepas. Entretanto, a atividade de invertase é
significativamente menor na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa selvagem
W303.
72
PERSPECTIVAS
73
6 - Perspectivas
6.1 – Analisar através de ensaios de fosforilação “in vitro” e “in vivo” se Pkc1p
fosforila os fatores de transcrição Sok2p, Crz1p e Gcr1p.
6.2 – Analisar a localização celular dos fatores de transcrição Sok2p, Crz1p e
Gcr1p nas cepas selvagem W303 e pkc1∆ durante o processo de desrepressão
metabólica.
6.3 – Analisar a expressão de outros genes controlados por Sok2p, Crz1p e
Gcr1p durante o processo de desrepressão metabólica nas cepas selvagem W303 e
pkc1∆.
6.4 – Analisar o fenótipo de cepas obtidas através da construção de duplos
mutantes pkc1∆:sok2∆; pkc1∆:crz1∆; pkc1∆:gcr1∆ durante o processo de desrepressão
metabólica e a expressão dos genes analisados nos ensaios de RT-PCR que
apresentaram uma expressão alterada nas cepas selvagem W303 e pkc1∆ relacionados a
estes fatores.
6.5 – Analisar os mecanismos pós-transcricionais envolvidos nos processos de
síntese e estabilidade de proteínas, com o objetivo de explicar porque os níveis de
atividade de invertase estão diminuídos na cepa pkc1∆ quando comparada com a cepa
selvagem W303.
74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
7 - Referências Bibliográficas
AHUATZI D., HERRERO P., DE LA C.T. & MORENO F. (2004) The glucose-
regulated nuclear localization of hexokinase 2 in Saccharomyces cerevisiae is
Mig1-dependent. J.Biol.Chem. 279, 14440-14446.
ASNAGLI H. & MURPHY K.M. (2001) The functional genomics experience (are you
experienced?). Nat.Immunol. 2, 826-828.
ATRIAN S., GONZALEZ-DUARTE R. & FOTHERGILL-GILMORE L.A. (1990)
Synthesis of Drosophila melanogaster alcohol dehydrogenase in yeast. Gene 93,
205-212.
AUESUKAREE C., TOCHIO H., SHIRAKAWA M., KANEKO Y. & HARASHIMA
S. (2005) Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol
pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and
polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 280,
25127-25133.
BARBET N.C., SCHNEIDER U., HELLIWELL S.B., STANSFIELD I., TUITE M.F.
& HALL M.N. (1996) TOR controls translation initiation and early G1
progression in yeast. Mol.Biol.Cell 7, 25-42.
BAYROCK D.P. & MICHAEL I.W. (2001) Application of multistage continuous
fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation
technology. J.Ind.Microbiol.Biotechnol. 27, 87-93.
BELL R.M., HANNUN Y.A. & LOOMIS C.R. (1986) Mechanism of regulation of
protein kinase C by lipid second messengers. Symp.Fundam.Cancer Res. 39,
145-156.
BLOM N., SICHERITZ-PONTEN T., GUPTA R., GAMMELTOFT S. & BRUNAK S.
(2004) Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of
proteins from the amino acid sequence. Proteomics. 4, 1633-1649.
BOUSTANY L.M. & CYERT M.S. (2002) Calcineurin-dependent regulation of Crz1p
nuclear export requires Msn5p and a conserved calcineurin docking site. Genes
Dev. 16, 608-619.
BRANDAO R.L., ETCHEBEHERE L., QUEIROZ C.C., TROPIA M.J., ERNANDES
J.R., GONCALVES T., LOUREIRO-DIAS M.C., WINDERICKX J.,
THEVELEIN J.M., LEIPER F.C., CARLING D. & CASTRO I.M. (2002)
Evidence for involvement of Saccharomyces cerevisiae protein kinase C in
glucose induction of HXT genes and derepression of SUC2. FEMS Yeast Res.
2, 93-102.
BREITKREUTZ A. & TYERS M. (2002) MAPK signaling specificity: it takes two to
tango. Trends Cell Biol. 12, 254-257.
76
CAZAR-ROMAN A.R., TRAN E.J., GUO S. & WENTE S.R. (2006) Inositol
hexakisphosphate and Gle1 activate the DEAD-box protein Dbp5 for nuclear
mRNA export. Nat.Cell Biol. 8, 711-716.
CHAE H.J., JOO H. & IN M.J. (2001) Utilization of brewer's yeast cells for the
production of food-grade yeast extract. Part 1: Effects of different enzymatic
treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics.
Bioresour.Technol. 76, 253-258.
CHAI B., HSU J.M., DU J. & LAURENT B.C. (2002) Yeast RSC function is required
for organization of the cellular cytoskeleton via an alternative PKC1 pathway.
Genetics 161, 575-584.
CHEN R.E. & THORNER J. (2007) Function and regulation in MAPK signaling
pathways: lessons learned from the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Biochim.Biophys.Acta 1773, 1311-1340.
CHI Z.M., LI J.F., WANG X.H. & YAO S.M. (2004) Inositol and phosphatidylinositol
mediated mediated glucose derepression, gene expression and invertase
secretion in yeasts. Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai) 36, 443-449.
DAS M., BURGE C.B., PARK E., COLINAS J. & PELLETIER J. (2001) Assessment
of the total number of human transcription units. Genomics 77, 71-78.
DOORES S. (1983) The microbiology of apples and apple products. Crit Rev.Food
Sci.Nutr. 19, 133-149.
DUJON B. (1996) The yeast genome project: what did we learn? Trends Genet. 12,
263-270.
ELBING K., STAHLBERG A., HOHMANN S. & GUSTAFSSON L. (2004)
Transcriptional responses to glucose at different glycolytic rates in
Saccharomyces cerevisiae. Eur.J.Biochem. 271, 4855-4864.
GANCEDO J.M. (1998b) Yeast carbon catabolite repression. Microbiol.Mol.Biol.Rev.
62, 334-361.
GANCEDO J.M. (1998a) Yeast carbon catabolite repression. Microbiol.Mol.Biol.Rev.
62, 334-361.
GARCIA R., BERMEJO C., GRAU C., PEREZ R., RODRIGUEZ-PENA J.M.,
FRANCOIS J., NOMBELA C. & ARROYO J. (2004) The global transcriptional
response to transient cell wall damage in Saccharomyces cerevisiae and its
regulation by the cell integrity signaling pathway. J.Biol.Chem. 279, 15183-
15195.
GELADE R., VAN d., V, VAN D.P. & THEVELEIN J.M. (2003) Multi-level response
of the yeast genome to glucose. Genome Biol. 4, 233
GENTLEMAN R & IHAKA R (1997) The R language. In Proceedings of the 28th
Symposium on the Interface, L.Billard and N.Fisher Eds.The Interface
Foundation of North America
77
GILL G.S. & ZAWORSKI P.G. (1991) Use of yeasts in production and discovery of
pharmaceuticals. Ann.N.Y.Acad.Sci. 646, 172-180.
GOFFEAU A., BARRELL B.G., BUSSEY H., DAVIS R.W., DUJON B.,
FELDMANN H., GALIBERT F., HOHEISEL J.D., JACQ C., JOHNSTON M.,
LOUIS E.J., MEWES H.W., MURAKAMI Y., PHILIPPSEN P., TETTELIN H.
& OLIVER S.G. (1996) Life with 6000 genes. Science 274, 546, 563-546, 567.
GOMES K.N., FREITAS S.M., PAIS T.M., FIETTO J.L., TOTOLA A.H., ARANTES
R.M., MARTINS A., LUCAS C., SCHULLER D., CASAL M., CASTRO I.M.,
FIETTO L.G. & BRANDAO R.L. (2005) Deficiency of Pkc1 activity affects
glycerol metabolism in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 5, 767-
776.
GRAY J.V., OGAS J.P., KAMADA Y., STONE M., LEVIN D.E. & HERSKOWITZ I.
(1997) A role for the Pkc1 MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae in
bud emergence and identification of a putative upstream regulator. EMBO J. 16,
4924-4937.
GUSTIN M.C., ALBERTYN J., ALEXANDER M. & DAVENPORT K. (1998) MAP
kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Microbiol.Mol.Biol.Rev. 62, 1264-1300.
HEINISCH J.J., LORBERG A., SCHMITZ H.P. & JACOBY J.J. (1999b) The protein
kinase C-mediated MAP kinase pathway involved in the maintenance of cellular
integrity in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Microbiol. 32, 671-680.
HEINISCH J.J., LORBERG A., SCHMITZ H.P. & JACOBY J.J. (1999a) The protein
kinase C-mediated MAP kinase pathway involved in the maintenance of cellular
integrity in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Microbiol. 32, 671-680.
HELLIWELL S.B., HOWALD I., BARBET N. & HALL M.N. (1998a) TOR2 is part of
two related signaling pathways coordinating cell growth in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics 148, 99-112.
HELLIWELL S.B., SCHMIDT A., OHYA Y. & HALL M.N. (1998b) The Rho1
effector Pkc1, but not Bni1, mediates signalling from Tor2 to the actin
cytoskeleton. Curr.Biol. 8, 1211-1214.
HENSING M.C., ROUWENHORST R.J., HEIJNEN J.J., VAN DIJKEN J.P. &
PRONK J.T. (1995) Physiological and technological aspects of large-scale
heterologous-protein production with yeasts. Antonie Van Leeuwenhoek 67,
261-279.
HINNEN A., HICKS J.B. & FINK G.R. (1978) Transformation of yeast.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 75, 1929-1933.
HOHMANN S. (2002) Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts.
Microbiol.Mol.Biol.Rev. 66, 300-372.
HOLM H.E., NISSEN P., SOMMER P., NIELSEN J.C. & ARNEBORG N. (2001) The
effect of oxygen on the survival of non-Saccharomyces yeasts during mixed
78
culture fermentations of grape juice with Saccharomyces cerevisiae.
J.Appl.Microbiol. 91, 541-547.
HOLSBEEKS I., LAGATIE O., VAN N.A., VAN d., V & THEVELEIN J.M. (2004c)
The eukaryotic plasma membrane as a nutrient-sensing device. Trends
Biochem.Sci. 29, 556-564.
HOLSBEEKS I., LAGATIE O., VAN N.A., VAN d., V & THEVELEIN J.M. (2004b)
The eukaryotic plasma membrane as a nutrient-sensing device. Trends
Biochem.Sci. 29, 556-564.
HOLSBEEKS I., LAGATIE O., VAN N.A., VAN d., V & THEVELEIN J.M. (2004a)
The eukaryotic plasma membrane as a nutrient-sensing device. Trends
Biochem.Sci. 29, 556-564.
IGUAL J.C., JOHNSON A.L. & JOHNSTON L.H. (1996) Coordinated regulation of
gene expression by the cell cycle transcription factor Swi4 and the protein
kinase C MAP kinase pathway for yeast cell integrity. EMBO J. 15, 5001-5013.
JOHNSTON M. & KIM J.H. (2005) Glucose as a hormone: receptor-mediated glucose
sensing in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem.Soc.Trans. 33, 247-
252.
KANIAK A., XUE Z., MACOOL D., KIM J.H. & JOHNSTON M. (2004) Regulatory
network connecting two glucose signal transduction pathways in Saccharomyces
cerevisiae. Eukaryot.Cell 3, 221-231.
KIM J.H., BRACHET V., MORIYA H. & JOHNSTON M. (2006) Integration of
transcriptional and posttranslational regulation in a glucose signal transduction
pathway in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot.Cell 5, 167-173.
LAGORCE A., HAUSER N.C., LABOURDETTE D., RODRIGUEZ C., MARTIN-
YKEN H., ARROYO J., HOHEISEL J.D. & FRANCOIS J. (2003) Genome-
wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces
cerevisiae. J.Biol.Chem. 278, 20345-20357.
LANGKJAER R.B., CASAREGOLA S., USSERY D.W., GAILLARDIN C. &
PISKUR J. (2003) Sequence analysis of three mitochondrial DNA molecules
reveals interesting differences among Saccharomyces yeasts. Nucleic Acids Res.
31, 3081-3091.
LEVIN D.E., BOWERS B., CHEN C.Y., KAMADA Y. & WATANABE M. (1994)
Dissecting the protein kinase C/MAP kinase signalling pathway of
Saccharomyces cerevisiae. Cell Mol.Biol.Res. 40, 229-239.
LEVIN D.E., FIELDS F.O., KUNISAWA R., BISHOP J.M. & THORNER J. (1990) A
candidate protein kinase C gene, PKC1, is required for the S. cerevisiae cell
cycle. Cell 62, 213-224.
LIVAK K.J. & SCHMITTGEN T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods
25, 402-408.
79
LOWRY O.H., ROSEBROUGH N.J., FARR A.L. & RANDALL R.J. (1951) Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem. 193, 265-275.
LU L., ROBERTS G.G., OSZUST C. & HUDSON A.P. (2005a) The YJR127C/ZMS1
gene product is involved in glycerol-based respiratory growth of the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 48, 235-246.
LU L., ROBERTS G.G., OSZUST C. & HUDSON A.P. (2005b) The YJR127C/ZMS1
gene product is involved in glycerol-based respiratory growth of the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 48, 235-246.
MADDEN K., SHEU Y.J., BAETZ K., ANDREWS B. & SNYDER M. (1997) SBF
cell cycle regulator as a target of the yeast PKC-MAP kinase pathway. Science
275, 1781-1784.
MARAZ A. (2002) From yeast genetics to biotechnology. Acta
Microbiol.Immunol.Hung. 49, 483-491.
MARINI N.J., MELDRUM E., BUEHRER B., HUBBERSTEY A.V., STONE D.E.,
TRAYNOR-KAPLAN A. & REED S.I. (1996) A pathway in the yeast cell
division cycle linking protein kinase C (Pkc1) to activation of Cdc28 at START.
EMBO J. 15, 3040-3052.
MASHEGO M.R., JANSEN M.L., VINKE J.L., VAN GULIK W.M. & HEIJNEN J.J.
(2005) Changes in the metabolome of Saccharomyces cerevisiae associated with
evolution in aerobic glucose-limited chemostats. FEMS Yeast Res. 5, 419-430.
MASIMIREMBWA C.M., OTTER C., BERG M., JONSSON M., LEIDVIK B.,
JONSSON E., JOHANSSON T., BACKMAN A., EDLUND A. &
ANDERSSON T.B. (1999) Heterologous expression and kinetic characterization
of human cytochromes P-450: validation of a pharmaceutical tool for drug
metabolism research. Drug Metab Dispos. 27, 1117-1122.
MATHEOS D.P., KINGSBURY T.J., AHSAN U.S. & CUNNINGHAM K.W. (1997)
Tcn1p/Crz1p, a calcineurin-dependent transcription factor that differentially
regulates gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 11, 3445-
3458.
MAZUR P. & BAGINSKY W. (1996) In vitro activity of 1,3-beta-D-glucan synthase
requires the GTP-binding protein Rho1. J.Biol.Chem. 271, 14604-14609.
MAZUR P., MORIN N., BAGINSKY W., EL-SHERBEINI M., CLEMAS J.A.,
NIELSEN J.B. & FOOR F. (1995) Differential expression and function of two
homologous subunits of yeast 1,3-beta-D-glucan synthase. Mol.Cell Biol. 15,
5671-5681.
MORENO-ARRIBAS M.V. & POLO M.C. (2005) Winemaking biochemistry and
microbiology: current knowledge and future trends. Crit Rev.Food Sci.Nutr. 45,
265-286.
NATH N., MCCARTNEY R.R. & SCHMIDT M.C. (2003) Yeast Pak1 kinase
associates with and activates Snf1. Mol.Cell Biol. 23, 3909-3917.
80
NEWCOMB L.L., DIDERICH J.A., SLATTERY M.G. & HEIDEMAN W. (2003)
Glucose regulation of Saccharomyces cerevisiae cell cycle genes. Eukaryot.Cell
2, 143-149.
O'BRIAN C.A. & WARD N.E. (1989) Biology of the protein kinase C family. Cancer
Metastasis Rev. 8, 199-214.
O'ROURKE S.M. & HERSKOWITZ I. (2004) Unique and redundant roles for HOG
MAPK pathway components as revealed by whole-genome expression analysis.
Mol.Biol.Cell 15, 532-542.
O'ROURKE S.M., HERSKOWITZ I. & O'SHEA E.K. (2002) Yeast go the whole HOG
for the hyperosmotic response. Trends Genet. 18, 405-412.
ODOM A.R., STAHLBERG A., WENTE S.R. & YORK J.D. (2000) A role for nuclear
inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science 287, 2026-
2029.
ONO T., SUZUKI T., ANRAKU Y. & IIDA H. (1994) The MID2 gene encodes a
putative integral membrane protein with a Ca(2+)-binding domain and shows
mating pheromone-stimulated expression in Saccharomyces cerevisiae. Gene
151, 203-208.
OSTERGAARD S., OLSSON L. & NIELSEN J. (2000) Metabolic engineering of
Saccharomyces cerevisiae. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 64, 34-50.
OZCAN S., DOVER J. & JOHNSTON M. (1998) Glucose sensing and signaling by
two glucose receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 17,
2566-2573.
OZCAN S. & JOHNSTON M. (1999) Function and regulation of yeast hexose
transporters. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 63, 554-569.
PAPAMICHOS-CHRONAKIS M., GLIGORIS T. & TZAMARIAS D. (2004) The
Snf1 kinase controls glucose repression in yeast by modulating interactions
between the Mig1 repressor and the Cyc8-Tup1 co-repressor. EMBO Rep. 5,
368-372.
RADHIKA V., MILKEVITCH M., AUDIGE V., PROIKAS-CEZANNE T. &
DHANASEKARAN N. (2005) Engineered Saccharomyces cerevisiae strain
BioS-1, for the detection of water-borne toxic metal contaminants.
Biotechnol.Bioeng. 90, 29-35.
RADHIKA V., PROIKAS-CEZANNE T., JAYARAMAN M., ONESIME D., HA J.H.
& DHANASEKARAN D.N. (2007) Chemical sensing of DNT by engineered
olfactory yeast strain. Nat.Chem.Biol. 3, 325-330.
RESNICK A.C., SNOWMAN A.M., KANG B.N., HURT K.J., SNYDER S.H. &
SAIARDI A. (2005) Inositol polyphosphate multikinase is a nuclear PI3-kinase
with transcriptional regulatory activity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102, 12783-
12788.
81
RO D.K., PARADISE E.M., OUELLET M., FISHER K.J., NEWMAN K.L.,
NDUNGU J.M., HO K.A., EACHUS R.A., HAM T.S., KIRBY J., CHANG
M.C., WITHERS S.T., SHIBA Y., SARPONG R. & KEASLING J.D. (2006)
Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered
yeast. Nature 440, 940-943.
ROMBAUT B. & JORE J.P. (1997) Immunogenic, non-infectious polio subviral
particles synthesized in Saccharomyces cerevisiae. J.Gen.Virol. 78 ( Pt 8),
1829-1832.
ROSE A.H. (1981) The microbiological production of food and drink. Sci.Am. 245,
126-34, 136, 138.
SAITO H. & TATEBAYASHI K. (2004) Regulation of the osmoregulatory HOG
MAPK cascade in yeast. J.Biochem.(Tokyo) 136, 267-272.
SALGADO A.P., SCHULLER D., CASAL M., LEAO C., LEIPER F.C., CARLING
D., FIETTO L.G., TROPIA M.J., CASTRO I.M. & BRANDAO R.L. (2002)
Relationship between protein kinase C and derepression of different enzymes.
FEBS Lett. 532, 324-332.
SCHMIDT A., BICKLE M., BECK T. & HALL M.N. (1997) The yeast
phosphatidylinositol kinase homolog TOR2 activates RHO1 and RHO2 via the
exchange factor ROM2. Cell 88, 531-542.
SCHMIDT A., SCHMELZLE T. & HALL M.N. (2002) The RHO1-GAPs SAC7,
BEM2 and BAG7 control distinct RHO1 functions in Saccharomyces cerevisiae.
Mol.Microbiol. 45, 1433-1441.
SCHMITZ H.P. & HEINISCH J.J. (2003) Evolution, biochemistry and genetics of
protein kinase C in fungi. Curr.Genet. 43, 245-254.
SCHOFIELD D.A., WESTWATER C., BARTH J.L. & DINOVO A.A. (2007)
Development of a yeast biosensor-biocatalyst for the detection and
biodegradation of the organophosphate paraoxon. Appl.Microbiol.Biotechnol.
SCHULLER H.J. (2003) Transcriptional control of nonfermentative metabolism in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 43, 139-160.
SHENHAR G. & KASSIR Y. (2001) A positive regulator of mitosis, Sok2, functions as
a negative regulator of meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Cell Biol. 21,
1603-1612.
SMITH H.A., GORMAN J.W., KOLTIN Y. & GORMAN J.A. (1990) Functional
expression of the Candida albicans beta-tubulin gene in Saccharomyces
cerevisiae. Gene 90, 115-123.
STATHOPOULOS A.M. & CYERT M.S. (1997) Calcineurin acts through the
CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast.
Genes Dev. 11, 3432-3444.
82
TAMAS M.J., REP M., THEVELEIN J.M. & HOHMANN S. (2000) Stimulation of the
yeast high osmolarity glycerol (HOG) pathway: evidence for a signal generated
by a change in turgor rather than by water stress. FEBS Lett. 472, 159-165.
TAYLOR F., KURANTZ M.J., GOLDBERG N. & CRAIG J.C., Jr. (1995) Continuous
fermentation and stripping of ethanol. Biotechnol.Prog. 11, 693-698.
TAYLOR F., KURANTZ M.J., GOLDBERG N., MCALOON A.J. & CRAIG J.C., Jr.
(2000) Dry-grind process for fuel ethanol by continuous fermentation and
stripping. Biotechnol.Prog. 16, 541-547.
TEIXEIRA M.C., MONTEIRO P., JAIN P., TENREIRO S., FERNANDES A.R.,
MIRA N.P., ALENQUER M., FREITAS A.T., OLIVEIRA A.L. & SA-
CORREIA I. (2006) The YEASTRACT database: a tool for the analysis of
transcription regulatory associations in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic
Acids Res. 34, D446-D451
TREITEL M.A. & CARLSON M. (1995) Repression by SSN6-TUP1 is directed by
MIG1, a repressor/activator protein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92, 3132-3136.
TRÓPIA MJ, CARDOSO AS, TISI R, FIETTO LG, FIETTO JL, MARTEGANI E, CASTRO
IM, BRANDÃO RL. (2006) Calcium signaling and sugar-induced activation of plasma
membrane H(+)-ATPase in Saccharomyces cerevisiae cells. Biochem Biophys Res
Commun. 19;343(4):1234-43.
VALENTINI S.R., CASOLARI J.M., OLIVEIRA C.C., SILVER P.A. & MCBRIDE
A.E. (2002) Genetic interactions of yeast eukaryotic translation initiation factor
5A (eIF5A) reveal connections to poly(A)-binding protein and protein kinase C
signaling. Genetics 160, 393-405.
VAN W.O., REISER V., SIDERIUS M., KELDERS M.C., AMMERER G., RUIS H. &
MAGER W.H. (2000) Response of Saccharomyces cerevisiae to severe osmotic
stress: evidence for a novel activation mechanism of the HOG MAP kinase
pathway. Mol.Microbiol. 37, 382-397.
WATANABE Y., IRIE K. & MATSUMOTO K. (1995) Yeast RLM1 encodes a serum
response factor-like protein that may function downstream of the Mpk1 (Slt2)
mitogen-activated protein kinase pathway. Mol.Cell Biol. 15, 5740-5749.
WATANABE Y., TAKAESU G., HAGIWARA M., IRIE K. & MATSUMOTO K.
(1997) Characterization of a serum response factor-like protein in
Saccharomyces cerevisiae, Rlm1, which has transcriptional activity regulated by
the Mpk1 (Slt2) mitogen-activated protein kinase pathway. Mol.Cell Biol. 17,
2615-2623.
WEBER H. & BARTH G. (1988) Nonconventional yeasts: their genetics and
biotechnological applications. Crit Rev.Biotechnol. 7, 281-337.
WESTFALL P.J., BALLON D.R. & THORNER J. (2004) When the stress of your
environment makes you go HOG wild. Science 306, 1511-1512.
83
WYCKOFF E. & HSIEH T.S. (1988) Functional expression of a Drosophila gene in
yeast: genetic complementation of DNA topoisomerase II.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85, 6272-6276.
YANG Y.H., DUDOIT S., LUU P., LIN D.M., PENG V., NGAI J. & SPEED T.P.
(2002) Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method
addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30,
e15
YORK J.D., ODOM A.R., MURPHY R., IVES E.B. & WENTE S.R. (1999) A
phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for
efficient messenger RNA export. Science 285, 96-100.
YOSHIDA S., OHYA Y., NAKANO A. & ANRAKU Y. (1994) Genetic interactions
among genes involved in the STT4-PKC1 pathway of Saccharomyces
cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 242, 631-640.
ZAKRZEWSKA A., BOORSMA A., BRUL S., HELLINGWERF K.J. & KLIS F.M.
(2005) Transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma
membrane-perturbing compound chitosan. Eukaryot.Cell 4, 703-715.
ZARZOV P., MAZZONI C. & MANN C. (1996) The SLT2(MPK1) MAP kinase is
activated during periods of polarized cell growth in yeast. EMBO J. 15, 83-91.
ZENG X., DEMINOFF S.J. & SANTANGELO G.M. (1997) Specialized Rap1p/Gcr1p
transcriptional activation through Gcr1p DNA contacts requires Gcr2p, as does
hyperphosphorylation of Gcr1p. Genetics 147, 493-505.
ZHAO C., JUNG U.S., GARRETT-ENGELE P., ROE T., CYERT M.S. & LEVIN D.E.
(1998) Temperature-induced expression of yeast FKS2 is under the dual control
of protein kinase C and calcineurin. Mol.Cell Biol. 18, 1013-1022.
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