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A UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA
Adesão de células mesenquimais da medula óssea de
camundongos e do ligamento periodontal de ratos a
diferentes superfícies de titânio:
Estudo comparativo in vitro
Luciana Bastos Alves
Natal/ RN
2008
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Luciana Bastos Alves
Adesão de células mesenquimais da medula óssea de
camundongos e do ligamento periodontal de ratos a
diferentes superfícies de titânio:
Estudo comparativo in vitro
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Odontologia, com
área de concentração em Periodontia e
Prótese Dentária, da Faculdade de
Odontologia da UFRN, como requisito
parcial para obtenção do grau de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Natal – 2008
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Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Alves, Luciana Bastos.
Adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do
ligamento periodontal de ratos a diferentes superfícies de titânio: estudo
comparativo in vitro / Luciana Bastos Alves. – Natal, RN, 2008.
70 p. : il.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.
Dissertação (Mestrado) – Departamento de Odontologia, Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Ligamento periodontal - Dissertação. 2. Medula óssea – Dissertação.
3. Titânio – Dissertação. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título.
RN/UF/BSO
Black D64
Dedico este trabalho
A
Deus
, pelo seu amor e sua
presença em minha vida que me faz mais
forte e segura.
Aos meus pais
Edmar
e
Lúcia
, que
sempre me apoiaram, incentivaram e se
esforçaram para a concretização de mais
uma etapa da minha vida. Sem vocês eu
nada seria. Muito obrigada!
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, pela confiança
depositada em meu trabalho, pela sua disponibilidade irrestrita, pelos ensinamentos
compartilhados, pelo incentivo e estímulo na área de cultivo celular que me abriram as portas
para a próxima etapa, pelo apoio nos momentos difíceis e pelo carinho e amizade.
À aluna de iniciação científica do curso de Biomedicina da UFRN, Fernanda Ginani,
pelos primeiros passos na área de cultivo de células, pela sua disponibilidade e amizade que
construímos e “cultivamos” junto com este trabalho.
Ao colega e Prof. José Sandro Pereira da Silva, pelas amostras de titânio e completa
contribuição na caracterização de superfícies, pelas orientações nesta área, pelo apoio, atenção
e disponibilidade na elaboração deste trabalho.
Ao LabPlasma (Departamento de Física da UFRN), na pessoa do Prof. Dr. Clodomiro
Alves Júnior, pelo espaço e estrutura cedidos para o tratamento das amostras.
Ao laboratório de cultura de células do Departamento de Bioquímica do Centro de
Biociências da UFRN, na pessoa do Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pelo
espaço e estrutura cedidos para o cultivo celular.
Ao Departamento de Energia Nuclear da UFPE, na pessoa da Prof. Dra. Helen Jamil
Khoury, pela irradiação das amostras.
Ao Laboratório de Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, pela
concessão dos animais utilizados neste trabalho.
A Faculdade de Odontologia da UFRN, na pessoa do chefe do departamento Prof. Dr.
Antônio Ricardo Calazans Duarte,
Aos Professores Dra. Ruthnéia Diógenes Alves Uchoa e Dr. Adriano Rocha
Germano, pela participação na banca da qualificação, o que contribuiu para qualidade desta
dissertação.
Aos Professores Dra. Adriana da Fonte Porto Carreiro, Dr. Antônio Ricardo
Calazans Duarte, Dr. Gustavo Augusto Seabra Barbosa, pelos ensinamentos em Prótese
Dentária, e em especial ao Prof. Dr. Eduardo Gomes Seabra pelos ensinamentos em
Periodontia.
Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFRN, Dra.
Maria Ângela Ferreira, Dr. Kênio Costa Lima, Dr. Ângelo Giuseppe Roncalli, Dra.
Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, Dra. Maria do Socorro Costa Feitosa Alves, Dra.
Íris do Céu Clara costa, e Dra. Maria Celeste Nunes de Melo, pelas orientações e
ensinamentos partilhados.
A todos os funcionários da Faculdade que contribuíram de alguma forma para a
concretização deste trabalho, em especial a Sandra, Ocian e Cecília.
Aos meus colegas de turma, Luana, Eudivar Alessandra, Lidiane, Miguel, Pedro
Henrique, Ana Rafaela e Arcelino, pela convivência amiga e alegre durante todo o curso.
Ao aluno de iniciação científica do curso de Odontologia da UFRN, Marcel Cortês
Bonifácio Varela Cavalcanti, pelo seu apoio no cultivo de células.
Ao aluno do curso de Odontologia da Universidade Potiguar, Almir Nery, pela
contribuição no tratamento de superfícies das amostras.
Ao meu irmão Rafael Bastos Alves, que mesmo distante se fez presente através do
amor, amizade e cumplicidade, o que me deu forças para realização desta etapa.
As minhas amigas Alinne Alice e Renata Filgueira, pelo carinho, apoio e amizade
durante os momentos de convivência alegre fora da faculdade.
A Tony, pelo incentivo, compreensão, carinho e boas energias transmitidas durante a
realização deste trabalho.
As minhas primas de sangue, irmãs de coração e colegas de profissão Nathália Bastos
e Ludmila Alves, pelo carinho e apoio nos momentos difíceis.
A minha “grande família”: tios, primos, sobrinhos e especial aos meus amados avós
Geraldo e Lysia, que estiveram sempre na torcida por mim.
A todos que de acreditaram em mim e de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
Se as coisas são inatingíveis... ora!
Não é motivo para não querê-las...
Que tristes os caminhos, se não fora
a mágica presença das estrelas!
(DAS UTOPIAS – Mário Quintana)
RESUMO
O presente trabalho utilizou a cultura celular para analisar a capacidade de adesão de células
mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos a
diferentes superfícies de titânio. Para tanto, foram utilizados discos de titânio grau II ASTM
F86 nas dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, os quais receberam
diferentes tratamentos de superfície em 2 grupos distintos (polido e nitretação a plasma por
gaiola catódica).
As células foram isoladas da medula óssea de camundongos e do ligamento
periodontal de ratos e cultivadas em meio de cultura meio básico α-MEM contendo
antibióticos e suplementado com 10% de FBS, por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de
CO
2
a 37ºC. No subcultivo as células foram cultivadas em 1 placa de 24 poços, na densidade
de 1 x 10
4
células por poço, onde os discos de titânio foram distribuídos de acordo com os
grupos, incluindo-se controles positivos sem os discos de titânio. Após 24 horas de cultivo, as
células foram submetidas a contagem em câmara de Neubauer. Os resultados analisados
mostraram que tanto as células mesenquimais da medula óssea de camundongos como as
células do ligamento periodontal de ratos tiveram melhor adesão à superfície controle. O
número de células da medula óssea aderidas a superfície de Ti polido não foi estatisticamente
significante quando comparado ao mesmo tipo celular aderido à superfície de Ti tratada por
plasma na configuração de gaiola catódica, entretanto diferença significante foi encontrada
entre o grupo controle e o grupo Ti polido. Com relação à adesão das células do ligamento
periodontal, diferença significativa foi encontrada apenas entre as superfícies controle e as
superfícies de Ti tratadas por plasma. No que diz respeito às comparações entre superfícies
iguais com células diferentes, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente
significante. Portanto, conclui-se que o titânio é um bom biomaterial para a adesão de células
mesenquimais e que as diferentes formas de tratamento de superfície dada ao material podem
influenciar neste processo.
Palavras-chave: Células mesenquimais; medula óssea; ligamento periodontal; titânio.
ABSTRACT
The present experiment used cell culture to analyze the adhesion capacity of mouse
mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament to different titanium surfaces.
Grade II ASTM F86 titanium discs 15mm in diameter and 1.5mm thick were used and
received 2 distinct surface treatments (polished and cathodic cage plasma nitriding).
The cells
were isolated from the mouse bone marrow and rat periodontal ligament and cultured in α-
MEM basic culture medium containing antibiotics and supplemented with 10% FBS and 5%
CO
2
, for 72 hours at 37ºC in a humidified atmosphere. Subculture cells were cultured in a 24-
well plate with a density of 1 x 10
4
cells per well. The titanium discs were distributed in
accordance with the groups, including positive controls without titanium discs. After a 24-
hour culture, the cells were counted in a Neubauer chamber. The results show that both the
mouse mesenchymal bone marrow cells and rat periodontal ligament cells had better adhesion
to the control surface. The number of bone marrow cells adhered to the polished Ti surface
was not statistically significant when compared to the same type of cell adhered to the Ti
surface treated by cathodic cage plasma nitriding. However a significant difference was found
between the control and polished Ti groups. In relation to periodontal ligament cell adhesion,
a significant difference was only found between the control and plasma-treated Ti surfaces.
When comparing equal surfaces with different cells, no statistically significant difference was
observed. We can therefore conclude that titanium is a good material for mesenchymal cell
adhesion and that different material surface treatments can influence this process.
Key words: Mesenchymal cells; bone marrow; periodontal ligament; titanium.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995).
Figura 2. Equipamento para nitretação iônica.
Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação iônica em gaiola catódica (SOUSA, et
al.2008).
Figura 4. Corte das epífises ósseas.
Figura 5. Extração da medula óssea.
Figura 6. Rato Wistar.
Figura 7. Incisivos no meio básico alfa-MEM.
Figura 8. Remoção do ligamento periodontal.
Figura 9. Fragmentos de ligamento periodontal cultivados em tripsina.
Figura 10. Suspensão centrifugada.
Figura 11. Placa de cultura contendo meiobásico alfa-MEM supletmentado com 10% de
SFB.
Figura 12. Suspensão centrifugada.
Figura 13. Placa de cultura com discos e células.
Figura 14. Esquema dos discos de titânio na placa de cultura de 24 poços.
Figura 15. Adesão de células às diferentes superfícies de titânio.
Figura 16. Adesão de células da medula óssea às diferentes superfícies de titânio.
Figura 17. Adesão de células do ligamento periodontal às diferentes superfícies de titânio.
Figura 18. Adesão de células às superfícies controle.
Figura 19. Adesão de células à superfície Ti Polido.
Figura 20. Adesão de células à superfície Ti Gaiola.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.
Tabela 2. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes
superfícies.
Tabela 3. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies
Controle e Ti Polido.
Tabela 4. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies
Controle e Ti Gaiola.
Tabela 5. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Ti
Polido e Ti Gaiola.
Tabela 6. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes
superfícies.
Tabela 7. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies
Controle e Ti Polido.
Tabela 8. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies
Controle e Ti Gaiola.
Tabela 9. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Ti
Polido e Ti Gaiola.
Tabela 10. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle.
Tabela 11. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle Ti Polido.
Tabela 12. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície Ti Gaiola.
Tabela 13. Valores de rugosidade média (Ra) obtidas por profilômetro.
Tabela 14. Valores da média e desvio padrão de molhabilidade.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABCG-2 - Marcador de células-tronco mesenquimais
ALP- Fosfatase alcalina
AOs - Osteoblastos alveolares
α -MEM – Meio essencial mínimo tipo alfa
α-SMA – Actina de músculo liso tipo alfa
ASTM – Sociedade Americana de Análise e Padronização de Materiais
β-FGF- Fator de crescimento fibroblástico beta
BSP- Sialoproteína óssea
β-TCP - Fosfato tricálcio beta
ºC - Grau Celsus
Cbfa-1 - Subunidade alfa 1 do fator de ligação ao core
CD - Marcador de superfície celular
CFU-F – Unidades formadoras de colônias de fibroblastos
c-KIT - Marcador de células-tronco mesenquimais.
cm
2
- Centímetro quadrado
CO
2
- Gás carbônico
Col I - Colágeno tipo I
Col XII - Colágeno tipo XII
CTM - Célula-tronco mesenquimal
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGF- Fator de crescimento epidérmico
FBS - Soro fetal bovino
g - Grama
GFAP – Proteína glial ácida fibrilar
GFs - Fibroblastos gengivais
H - Hidrogênio
hESCs - Células-tronco embrionárias humanas
HNK1 - Marcador para células de cristas neurais indiferenciadas
H
2
O
2
- Peróxido de hidrogênio
hPDLF - Fibroblastos do ligamento periodontal humano
I-11 - Interleucina-11
kGy - KiloGray
L1 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície controle
L2 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio polido
L3 - Grupo de células do ligamento periodontal sobre superfície de titânio tratado
M1 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície controle
M2 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio polido
M3 - Grupo de células da medula óssea sobre superfície de titânio nitretado
mA - Miliampére
Mbar - Milésimo de bar (pressão)
MC3T3-E1 – Linhagem de células osteoblásticas da calvária de embrião de camundongos
MEV - Microscopia eletrônica de varredura
MG-63 – Linhagem de células osteoblásticas
mg/L - Miligramas por litro
mL- Mililitro
mm - Milímetro
mM - Milimolar
mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro
MUC18 - Marcador de células-tronco mesenquimais
µl - Microlitro
N - Nitrogênio
NFM - Neurofilamento M
Oct-4 - Fator crítico transcripicional para manutenção da pluripotencialidade
OCNE - Marcador de células-tronco mesenquimais
OCN - Osteocalcina
OP-CHEM - Tipo de pano de polimento
OPG - osteoprotegerina
OPN - Osteopontina
OSC – Osteocalcina
Osteo-1- Linhagem celular
p75 – Proteína associada a células das cristas neurais indiferenciadas
PBS - Tampão fosfato-salino
PCNA – Antígeno nuclear de proliferação celular
PDL - Ligamento periodontal
PDLFs - Fibroblastos do ligamento peridontal
pH - Potencial hidrogeniônico
Ra – Parâmetro de rugosidade média
RANKL – Ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa
rpm – Rotação por minuto
RTG - Regeneração tecidual uuiada
RUNX-2 – Fator de transcrição associado ao Runt
sccm - Centímetro cúbico padrão por minuto (medida de fluxo de gás)
SiC- Carbeto de silício
Slug - Fator de transcrição associado à crista neural
STRO-1 - Marcador de superfície de células-tronco mesenquimais
Sox2 - Fator de transcrição
Sox9 - Fator de transcrição
Ti - Titânio
Ti6A14V - Liga de Titânio
Twist - Fator de transcrição
U-2 OS – Linhagem de células osteoblásticas de ostessarcoma
V -Voltz
Vol. - Volume
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................17
2 REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................20
2.1 Células mesenquimais da medula óssea.........................................................................20
2.2 Regeneração periodontal.................................................................................................21
2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal..........................................................22
2.4 Osseointegração................................................................................................................31
2.4.1 Titânio (Ti).....................................................................................................................31
2.4.2 Características superficiais e respostas celulares.......................................................32
2.4.3 Tratamento de superfície..............................................................................................35
2.4.3.1 Nitretação iônica.........................................................................................................35
3 OBJETIVOS........................................................................................................................38
3.1 Objetivo geral....................................................................................................................38
3.2 Objetivos específicos.........................................................................................................38
4 METODOLOGIA................................................................................................................39
4.1 Preparo das amostras.......................................................................................................39
4.1.1 Protocolo de nitretação..................................................................................................39
4.2 Caracterização das amostras...........................................................................................41
4.2.1 Composição da camada.................................................................................................41
4.2.2 Textura superficial.........................................................................................................41
4.2.3 Rugosidade.....................................................................................................................41
4.2.4 Molhabilidade................................................................................................................41
4.3 Esterelização das amostras..............................................................................................42
4.4 Cultura de células.............................................................................................................42
4.4.1 Obtenção das células da medula óssea de camundongos...........................................42
4.4.2 Cultivo das células da medula óssea............................................................................43
4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos..........................................43
4.4.4 Cultivo das células do ligamento periodontal.............................................................43
4.4.5 Cultivo nos discos de Titânio........................................................................................45
4.5 Viabilidade e adesão celular............................................................................................46
4.6 Análise estatística..............................................................................................................46
5 RESULTADOS....................................................................................................................47
5.1 Resultados da análise de superfície.................................................................................47
5.2 Resultados de adesão celular...........................................................................................47
5.2.1 Adesão das células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies.....47
5.2.2 Adesão das células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies.....49
5.2.3 Adesão de células da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de
ratos à mesma superfície........................................................................................................50
6 DISCUSSÃO........................................................................................................................52
7 CONCLUSÕES...................................................................................................................58
REFERÊNCIAS.....................................................................................................................59
APÊNDICE.............................................................................................................................67
ANEXOS ................................................................................................................................69
1 INTRODUÇÃO
As células mesenquimais indiferenciadas, ou células-tronco como são conhecidas, são
células com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular
altamente especializado. Existem duas categorias de células-tronco: as células-tronco
embriononárias pluripotentes que são procedentes do embrioblasto durante a fase de blástula
do embrião e que são capazes de dar origem a todas as linhagens celulares do corpo; e a
categoria de células unipotentes ou multipotentes, denominadas células-tronco adultas, que
têm capacidade de dar origem a tipos celulares específicos (SOUZA et al., 2003).
A maior vantagem do uso de células-tronco embrionárias é a sua capacidade de
proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Contudo, existem desvantagens,
como a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros
imunocomprometidos e o risco de formação de teratocarcinomas, além da questão ética. Já as
células-tronco adultas apresentam a vantagem de serem autogênicas, não incorrendo em
limitações morais, e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro. No
entanto, também apresentam desvantagens, como o fato de não serem pluripotentes, a
dificuldade de obtêlas, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença em menor
quantidade nos tecidos (SONG et al., 2004; SOARES, 2007).
A principal fonte de células-tronco adultas é a medula óssea. Constituem uma pequena
população celular, contudo, podem ser expandidas com alta eficiência e induzidas a se
diferenciarem em múltiplas linhagens em condições de cultura definidas. Estas células têm a
capacidade de se diferenciarem em células dos tecidos ósseo, adiposo, cartilaginoso e
muscular, o que demonstra sua alta plasticidade. O interesse neste tipo celular cresceu
vertiginosamente nos últimos anos devido ao seu grande potencial de uso na regeneração de
tecidos e órgãos lesados (PITTENGER et al., 1999; ROSADA et al., 2003;, SHORT et al.,
2003; BARRY, MURPHY, 2004).
Inúmeros estudos também têm isolado células mesenquimais indiferenciadas derivadas
dos tecidos orais, tais como polpa dentária (GRONTHOS, MANKANI, BRAHIM, 2000;
GRONTHOS et al, 2002; MIURA et al., 2003; SHI, ROBEY, GRONTHOS, 2001; SHI,
GRONTHOS, 2003; SLOAN, SMITH, 2007) e ligamento periodontal (SEO et al, 2004;
CHEN et al., 2006; AKIZUKI et al. 2005; NAGATOMO et al., 2006; GRONTHOS et al,
2006). A identificação desta população celular nos tecidos dentais tem estimulado o interesse
no potencial regenerativo destas células e na sua aplicabilidade na engenharia tecidual, ou
bioengenharia.
A bioengenharia é usada para construção ou para regeneração dos tecidos injuriados
ou perdidos, decorrentes de doenças degenerativas, trauma, câncer ou doença periodontal, tais
como o tecido ósseo. Baseia-se na terapia celular envolvendo células mesenquimais
associadas ou não aos biomateriais (SILVÉRIO et al., 2008).
Dentre os biomateriais, diversos estudos têm mostrado que o titânio atualmente é
considerado o biomaterial de escolha para a confecção de implantes osseointegrados em
implantodontia e ortopedia, devido à característica osteocondutora e às propriedades
mecânicas, estabilidade química e biocompatibilidade, que varia de acordo com o tratamento
dado a esse metal. (AMARANTE, LIMA, 2001). Portanto, a natureza da superfície determina
a resposta biológica ao redor do biomaterial e, como conseqüência, o sucesso da interação
célula-superfície.
A interação das células ao biomaterial pode ser dividida em três fases. Na primeira
fase as células em contato com a superfície primeiramente se ligam, aderem e se espalham.
Esta fase é a mais importante, pois a qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na
capacidade para proliferação e diferenciação das células. Durante a segunda fase, as células se
proliferam e se diferenciam. Finalmente, durante a terceira fase, ocorre a deposição da matriz
extracelular mineralizada. (KASEMO, 2002; ANSELME, 2000).
Na busca por superfícies que melhoram a essa interação e supram à necessidade de
obter uma boa adesão, e conseqüentemente uma maior proliferação e formação óssea,
contribuindo para a osseointegração, vários métodos de tratamento de superfície têm sido
utilizados, tais como: a aspersão com plasma de titânio, jateamento com óxido de titânio,
deposição a laser de carbeto de titânio, condicionamento ácido, e outros (XUANYONG,
2004).
Dentre os diferentes métodos, pode-se citar a nitretação iônica ou nitretação a plasma,
um processo de introdução do elemento nitrogênio na superfície dos metais com o objetivo de
alterar as propriedades superficiais desse material (COOPER, MASUDA,WHITSON, 1999;
BRAMA, 2007).
Devido ao importante papel das células mesenquimais nos processos de regeneração
óssea e fixação dos implantes, o presente estudo busca avaliar a capacidade de adesão das
células mesenquimais da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de ratos
às superfícies de titânio lisas e nitretadas por plasma na configuração de gaiola catódica.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Células mesenquimais da medula óssea
A medula óssea não é apenas o local onde ocorre a hematopoese na vida pós-natal,
mas também é um reservatório de células-tronco adultas (CANCEDDA, BIANCHI,
DERUBEIS, 2003) Um tipo específico de célula-tronco adulta é a célula-tronco mesenquimal
(CTM) (PITTENGER et al., 1999; HU et al., 2002) também denominada de célula-tronco
estromal da medula (BIANCO et al., 2001) ou apenas célula estromal da medula (PROCKOP,
1997).
As células-tronco mesenquimais (CTM) foram isoladas pela primeira vez por
Friedenstein e colaboradores no início da década 70, a partir de uma suspensão celular da
medula óssea, e caracterizadas como células aderentes, fibroblastóide e clonogênica, sendo
inicialmente denominadas de células formadoras de colônia fibroblastóides (CFU-F = colony
forming units – fibroblastic) (FRIEDENSTEIN et al., 1966) ou células mesenquimais
estromais multipotentes, de acordo com a nova nomeclatura proposta pela Sociedade
Internacional para Terapia Celular, em 2005 (HOROWITZ et al., 2005). Essas células
mostraram ser multipotenciais e não apenas participam como estroma de mielosuporte, como
também se diferenciam em linhagens mesodérmicas quando implantadas in vivo (OWEN,
1988).
Atualmente, muitos estudos têm isolado as CTM e têm controlado, in vitro, a sua
diferenciação em tecido cartilaginoso e ósseo, utilizando fatores de crescimento específico,
com o objetivo de usar esta nova tecnologia no reparo de tecidos lesados de origem
mesenquimal (PITTENGER et al., 1999; MARTIN et al., 2002; MEIRELES, NARDI, 2003).
Além disso, células estromais da medula óssea também têm sido bastante utilizadas no reparo
de grandes defeitos ósseos, através da associação com biomateriais e injeção sistêmica de
células osteogênicas para o tratamento de doenças ósseas genéticas, como a osteogênese
imperfeita (CANCEDDA, BIANCHI, DERUBEIS, 2003; SHANTI et al., 2007).
As células-tronco mesenquimais podem se diferenciar em osteoblastos e promover
mineralização quando cultivadas na presença de ácido ascórbico, betaglicerol fosfato e
dexametasona (MAEDA et al. 2007). As células adquirem morfologia de osteoblastos, após
14 a 21 dias (KIM et al., 2004) com aumento da atividade da fosfatase alcalina, deposição de
uma matriz extracelular rica em cálcio (BARRY, MURPHY, 2004) e formação de cristais de
hidroxiapatita (BARRY, 2003).
Pesquisas recentes sinalizam para a possibilidade de implantação de tecido ósseo
desenvolvido a partir de cultura de células-tronco do próprio paciente, diferenciadas em
osteoblasto. A regeneração óssea guiada utiliza a implantação de células-tronco no local
afetado, sem a necessidade de enxertos ósseos, usando um biomaterial como veiculo
(BORDJI, 1996). A associação dos implantes de titânio com o tecido ósseo em cultura poderá
contribuir para a engenharia tecidual e o sucesso na regeneração periodontal e
osseointegração (FRAZOLIN et al. 2008).
2.2 Regeneração periodontal
O reparo do aparato de inserção e sustentação do periodonto, destruído como resultado
da progressão da doença periodontal, tem sido a meta principal da terapia periodontal. A
regeneração periodontal busca a formação de novo cemento e novo osso alveolar além da
nova inserção e reinserção das fibras do ligamento periodontal ao novo cemento e superfície
radicular (BARTOLD et al., 2000).
Desde a década de 70, inúmeras técnicas têm sido utilizadas a fim de interromper a
progressão da doença e obter a reconstituição da arquitetura e função das estruturas de suporte
perdidas. A terapia periodontal inclui raspagem e alisamento radicular, cirurgias para
descontaminação e biomodificação da superfície radicular, enxertos, substitutos ósseos,
biomateriais, fatores de crescimento e regeneração tecidual guiada (RTG) (POLIMENI,
XIROPAIDIS, WIKESJO, 2006).
Melcher, em 1976, sugeriu que o tipo de células que repovoam a superfície radicular
após o tratamento cirúrgico periodontal determina a natureza da inserção que formará. A
superfície radicular tratada pode ser repovoada por células epiteliais, células do tecido
conjuntivo, células ósseas e células do ligamento periodontal. Foi sugerido também que a
regeneração do periodonto envolve células progenitoras presentes no ligamento periodontal,
capazes de se diferenciarem em fibroblastos, cementoblastos e osteoblastos.
Baseada nestas hipóteses, a técnica de RTG tem como princípio biológico a exclusão
celular seletiva através da utilização de uma barreira física interposta entre o retalho
periodontal e a superfície radicular tratada. Seu objetivo é excluir o tecido conjuntivo, além
de desviar a proliferação epitelial da superfície radicular, criando um espaço protegido que
poderá ser repovoado por células derivadas do ligamento periodontal, conduzindo assim a
regeneração do periodonto (GOTTLOW, 1984; CAFESSE et al., 1988).
Entretanto estas terapias são limitadas pela severidade da doença periodontal, tipo de
defeito e por fatores locais e sistêmicos, dentre outros. Desta forma, busca-se uma nova
terapia de reconstrução do periodonto destruído pela doença periodontal. Recentes técnicas de
engenharia tecidual baseadas na biologia de células-tronco têm sido propostas para
desenvolver tal terapia (NEEDLEMAN et al., 2006; HASEGAWA et al., 2005; GRONTHOS
et al, 2006; FUJII et al., 2008).
Desta maneira, o ligamento periodontal tem sido de fundamental importância no
processo de reparo e regeneração do periodonto, uma vez que apresentam células como
cementoblastos, osteoblastos, mifibroblastos, células endoteliais, células epiteliais e células
nervosas, além de “células progenitoras” ou células mesenquimais indiferenciadas (células-
tronco) que têm sido identificadas através de vários estudos (IVANOVSKI et al., 2006).
2.3 Células mesenquimais do ligamento periodontal
O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo frouxo interposto entre as superfícies
radiculares dos dentes e a parede interna do osso alveolar. Suas fibras formam uma malha que
se estende entre o cemento e osso e está firmemente ancorada pelas fibras de Sharpey. O
ligamento periodontal une o dente ao osso alveolar propriamente dito, promovendo suporte,
proteção, sensitividade, nutrição, homeostase e reparo (BEERTSENC, MCCULLOC,
SODEK, 1997).
O conceito de que células mesenquimais indiferenciadas podem estar presentes no
ligamento periodontal foi inicialmente proposto por Melcher em 1976, o qual observou que
estas células presentes no ligamento periodontal eram capazes de formarem fibroblastos,
cementoblastos e osteoblastos A partir de então, a capacidade regeneradora das células do
ligamento periodontal tem sido pesquisada através de vários estudos (BARTOLD, SHI,
GRONTHOS, 2006).
Seo et al. (2004) levantaram a hipótese de que o ligamento periodontal pode conter
células indiferenciadas multipotentes que podem ser usadas para regenerar cemento e
ligamento periodontal in vivo. Os autores isolaram células do ligamento periodontal de
terceiros molares extraídos de humanos, e analisaram através da imunohistoquímica para
identificar marcadores de células-tronco. Quando transplantadas em ratos
imunocomprometidos, as mesmas mostraram a capacidade de formar estruturas como
cemento e ligamento e contribuir para o reparo tecidual periodontal. Os resultados da pesquisa
mostraram que células do ligamento periodontal expressaram os marcadores de células-tronco
mesenquimais: STRO-1 e CD146/MUC18. Em condições de cultura, células do ligamento
periodontal diferenciaram-se em cementoblastos, adipócitos e fibroblastos.
Vários antígenos de superfície celular têm sido usados como marcadores para células-
tronco e são importantes para isolar essas células de outros tecidos. Chen et al. (2006)
realizaram um estudo com o objetivo de identificar e localizar células indiferenciadas no
ligamento periodontal humano sadio e doente usando marcadores de superfície celular para
células mesenquimais (STRO-1, CD146 e CD44). Dentes afetados pela doença periodontal e
sadios foram coletados, fixados em formal a 10%, descalcificados e embebidos em parafina
para análise imunohistoquímica. Anticorpos contra STRO-1, CD146 e CD44 foram usados
para identificar células-tronco no ligamento periodontal. Os resultados mostraram que células
mesenquimais indiferenciadas foram identificadas tanto no ligamento de periodonto sadio
quanto em doente.
Akizuki et al. (2005) em um estudo piloto isolaram e cultivaram células do ligamento
periodontal de pré-molares extraídos de cães e aplicaram essas células juntamente com
condutor de ácido hialurônico em cinco defeitos ósseos criados cirurgicamente nas superfícies
mesiais das raízes dos primeiros molares mandibulares de uma hemi-arcada de cada cão. A
outra hemi-arcada foi usada como grupo controle, onde foram criados os mesmos defeitos e
neles aplicados apenas condutor de ácido hialurônico. Após oito semanas, os animais foram
sacrificados e os espécimes preparados a fim de avaliar histologicamente e histometricamente
a cicatrização dos defeitos periodontais. Os resultados mostraram ausência de inflamação
clínica ou recessão gengival em ambos os lados. No grupo experimental foi observada a
cicatrização periodontal com formação de osso, ligamento periodontal e cemento em três dos
cinco defeitos, e no grupo controle não foi constatada a formação de tecido periodontal,
exceto em um defeito. A análise histométrica revelou que a formação de novo cemento no
grupo experimental foi altamente significante quando comparada ao grupo controle. Deste
modo, os autores concluíram que as células do ligamento periodontal têm o potencial de
promover regeneração tecidual, sendo de grande importância para a terapia regenerativa.
Nagatomo et al. (2006) isolaram células do ligamento periodontal de pré-molares e
terceiros molares extraídos de humanos a fim de verificar as propriedades de renovação,
multiplicação e expressão de marcadores dessas células. Análise de fluorescência ativada
revelou que essas células expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166, e
STRO-1. Esses resultados sugerem que as células do ligamento periodontal incluem células-
tronco mesenquimais juntamente com outras células progenitoras.
Gronthos, Mankani e Brahim (2000) demonstraram que as células mesenquimais da
polpa dentária expressavam a molécula de adesão celular CD106 (VCAM-1). Em 2003,
Gronthos, Zannettino e Hay observaram que esta mesma molécula CD106 (VCAM-1) era
expressa nas células-tronco da medula óssea. Em 2006, usaram uma estratégia de
imunoseleção para purificar as células mesenquimais clonogênicas do ligamento periodontal
de ovinos baseada na reatividade ao anticorpo que identifica o CD106. A positividade para
este antígeno CD106 das células do ligamento periodontal de ovinos demonstrou a capacidade
de formarem um agregado de células semelhantes a fibroblastos quando manipuladas em
baixa densidade in vitro. A expanção ex-vivo dessas células exibiu alto grau de proliferação in
vitro e expressaram um fenótipo (CD44+, CD166+, CBFA-1+, colágeno-I+, sialoproteína
óssea+) consistente com células mesenquimais do ligamento periodontal de humanos, além da
capacidade de regenerarem, tanto tecido mineralizado semelhante ao cemento, quanto
ligamento periodontal, quando transplantadas em ratos imunocomprometidos.
Kawanabe, Murakami e Yamamoto (2006) observaram que as células mesenquimais
do ligamento periodontal exibiam um perfil funcional de células-tronco e expressavam
ABCG-2 (um marcador usual de células-tronco) e Oct-4 (um fator crítico transcripicional para
manutenção da pluripotencialidade), entretanto somente 3,9% das células do ligamento
periodontal cultivadas exibiam tais características.
Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo onde células do ligamento
periodontal de humanos foram isoladas, marcadas para STRO-1 e separadas em meio de
cultura com o objetivo de analisar sua capacidade de diferenciação em osso, cartilagem e
tecido adiposo. Células da medula óssea foram usadas como controle nas mesmas condições
de cultivo e indução. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal contêm
células mesenquimais que têm o potencial de se diferenciarem em osteoblastos, condrócitos e
adipócitos, semelhantes às células-tronco da medula óssea.
Fujii et al. (2008) isolaram e cultivaram três linhagens celulares (linhas 1-4, 1-11 e 1-
24) que expressam os marcadores celulares RUNX-2, Col I, ALP, OPN, OCN, RANKL,
OPG, escreráxe , periostina, Col XII, e α-SMA mRNA. A análise histoquímica demonstrou
que o marcador celular CD146 foi expresso nas células das linhagens 1-4 e 1-11 e o STRO-1
foi expresso nas linhagens 1-11 e 1-24. As células das linhagens 1-4 e 1-11 se diferenciaram
em células osteoblásticas e adipócitos quando cultivadas em meio de diferenciação de
linhagem específica. Quatro semanas depois das células da linhagem 1-11 serem
transplantadas em ratos imunodeficientes com fosfato β-tricálcio (β-TCP), o transplante
produziu tecidos semelhantes a cemento e osso ao redor do β-TCP. Oito semanas depois, as
células 1-11 transplantadas formaram estruturas semelhantes ao ligamento periodontal na
superfície do β-TCP. Estes resultados sugerem que as células da linhagem 1-11 eram
derivadas das células progenitoras/ células mesenquimais do ligamento periodontal e pode ser
bastante útil para estudar a biologia e regeneração do periodonto humano.
Coura (2008) buscando verificar a possibilidade de o ligamento periodontal conter
células mesenquimais cresto neurais, isolou e cultivou células do ligamento em dois grupos
distintos (um com células do ligamento de 10 dentes de 7 indivíduos diferentes e outro grupo
com células do ligamento de 4 dentes de um mesmo indivíduo). Após serem cultivadas em
um meio indutivo específico e as analisadas através de imunohistoquímica, observou-se a
presença de um marcador de células-tronco neurais e também marcadores para células cresto
neurais indiferenciadas (HNK1, p75). Os resultados foram similares nos dois grupos,
sugerindo evidências de que o ligamento periodontal humano em adição a derivados
mesodermas, produzem células semelhantes às células cresto neurais.
Lin et al. (2008) realizaram um estudo a fim de identificar e localizar células
mesenquimais indiferenciadas em biópsias em bloco e em cultura de expansão celular
dos
tecidos periodontais humanos regenerados. Para tal, foi utilizada a técnica de regeneração
tecidual guiada com membranas em defeitos de furca e superfície dentária dos terceiros
molares de humanos voluntários. Após o período de cicatrização de 6 semanas, os dentes e os
tecidos ao seu redor (tecidos regenerados e osso alveolar) foram removidos cirurgicamente
para o preparo das amostras em bloco as quais foram processadas para análise
imunohistoquímica, e para obtenção de células para cultura. Os marcadores de células-tronco
mesenquimais STRO-1, CD146 e CD44 foram utilizados para identificar as células. Culturas
celulares obtidas dos tecidos regenerados foram analisadas pela citometria fluida, e os
resultados revelaram positividade para tais marcadores. Mineralização, concentração de cálcio
e potencial adipogênico das células dos tecidos regenerados foram acessados e comparados
com as células mesenquimais do ligamento periodontal, células-tronco da medula óssea e
fibroblastos gengivais. Os resultados mostraram a capacidade desses tecidos formarem
depósitos minerais e adipócitos. Entretanto, o nível de mineralização das células do tecido
regenerado foi mais baixo que o de células mesenquimais do ligamento periodontal e de
células-tronco da medula óssea.
Considerando que as células do ligamento periodontal são muito importantes para o
processo de regeneração dos tecidos periodontais devido a sua localização e suas propriedades
de células indiferenciadas, e que a interleucina-11 (I-11) é uma citocina multifuncional que
participa ativamente do metabolismo ósseo, Leon et al. (2006) realizaram um estudo para
examinar o efeito da I-11 na diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal
de humanos. As células do ligamento periodontal cultivadas foram estimuladas com I-11 e/ou
ácido ascórbico, com ou sem inibidores para o colágeno tipo 1. A diferenciação osteoblástica
foi analisada pela atividade de fosfatase alcalina e expressão gênica do marcador RUNX2,
ostocalcina e sialoproteína óssea utilizando a cadeia de reação da polimerase transcripção
reversa. O colágeno tipo 1 e o tecido inibidor da produção da metaloproteinase-1 foram
medidos usando imunoensaios ligados à enzimas. Os resultados mostraram que a I-11
aumentou a atividade da fosfatase alcanina e do marcador RUNX2, e que na presença de
ácido ascórbico, aumentaram a osteocalcina e expressão gênica da sialoproteína óssea. A I-11
induziu a produção de células do ligamento periodontal pelo colágeno tipo 1 e o tecido
inbidor da metaloproteinase-1. Os autores concluíram que a interleucina-11 e/ou o ácido
ascórbico induzem a diferenciação osteoblástica das células do ligamento periodontal através
da produção de colágeno tipo 1. Os resultados também sugerem que a I-11 pode funcionar
como uma citocina osteopromotora, estimulando a diferenciação osteoblástica das células do
ligamento periodontal principalmente através da síntese de colágeno tipo 1 e possivelmente
pela indução do tecido inibidor da metaloproteinase-1.
Isaka et al. (2001) realizaram um estudo a fim de determinar se as células do
ligamento periodontal tinham um papel importante no reparo ósseo durante o processo de
regeneração periodontal. Para tal, foi investigada, in vitro, a expressão de fenótipo
osteoblástico, tal como atividade da fosfatase alcalina, paratireóide hormônio-dependente 3`e
acúmulo de adenosina monofosfato cíclica 5´ utilizando células isoladas do ligamento
periodontal e células isoladas da mandíbula de cães. As raízes de pré-molares extraídos de
cães foram divididas em grupos: grupo PDL(+), no qual o ligamento periodontal foi
preservado e grupo PDL(-), no qual o ligamento periodontal foi removido. Essas raízes foram
respectivamente transplantadas em defeitos ósseos criados cirurgicamente e cobertas com
uma membrana biológica. Seis semanas após o transplante, os resultados mostraram o
fenótipo osteoblático em ambas as culturas de células ósseas e do ligamento. Um nova
inserção de tecido conjuntivo foi observada somente no grupo PDL(+), entretanto o osso
alveolar foi quase completamente regenerado em ambos os grupos PDL(+) e PDL(-) e a
quantidade de novo osso formado não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Os
autores concluíram que as células do ligamento periodontal de cães demonstravam a
capacidade de se diferenciarem em linhagem de células osteobláticas e contribuírem para a
regeneração periodontal.
Inanç, Elçin e Elçin (2007) investigaram o potencial de diferenciação de células-tronco
embrionárias (hESCs) quando co-cultivadas com fibroblastos do ligamento periodontal
(hPDLF). Após serem expandidas e caracterizadas morfologicamente e
imunohistoquimicamente, hESC foram co-cultivadas com hPDLF por 28 dias. Dois grupos
foram determinados: (i) grupo de indução osteogênica com ácido ascórbico, β-glicerofosfato e
dexametazona contendo as hESC num meio de diferenciação; e (ii) grupo de diferenciação
espontânea com as hESC também num meio de diferenciação. Mudanças morfológicas nas
células foram analisadas em um microscópio invertido, e a himunohistoquímica foi realizada
em espécimes fixados nos dias 1 e 28 usando anticorpos para fosfatase alcalina, osteonectina,
osteopontina, sialoproteína óssea (BSP), e osteocalcina (OSC). A reação em cadeia da
polimerase transcriptase reversa foi utilizada para a detecção da ligação octamérica da
proteína 4, BSP, e o nível de expressão da OSC no mRNA. A mineralização foi observada
usando Alizarin Red, e as mudanças na superfície nas colônias foram demonstradas com
microscopia eletrônica de varredura. Os resultados indicaram a viabilidade da diferenciação
osteogênica das hESCs em co-cultura com hPDLF, e sugeriram o papel dos fibroblastos do
ligamento periodontal no modelo de diferenciação. Os autores concluíram que avanços neste
campo podem permitir a aplicação das hESCs na da engenharia tecidual periodontal,
envolvendo regeneração óssea em áreas de destruição decorrente da doença periodontal.
Ohta et al. (2008) criaram cavidades dentinárias nas raízes mesiais dos primeiros
molares de ratos, os quais formam sacrificados 1, 3, 5, 7 e 14 dias após a cirurgia. Em cada
um destes tempos de sacrifício, as secções foram marcadas histoquimicamente para CD44s,
CD34, c-KIT, OCNE, cbfa-1 e 5-bromo-deoxiuridina usando anticorpos primários. Para
análise morfométrica, os níveis de Cbfa-1 e PCNA células positivas foram calculados de um
número total de células positivas/ 10
4
µ
2
nas cavidades. Os resultados obtidos mostraram que
células positivas para 5-bromo-2-deoxiuridina foram observadas no ligamento periodontal e
tinham migrado para áreas de cicatrização. Um pequeno número de células positivas para
CD44s-, CD34- e c-KIT- foram observadas na medula óssea, mas nada foi observado no
ligamento periodontal. Células positivas para CD44s- foram observadas somente em cavidade
do osso alveolar no 5 dia após a cirurgia. Células positivas para CD23- e c-KIT- foram
observadas somente na cavidade dentinária no 7 dia após a cirurgia. Os valores de Cbfa-1 e
PCNA tenderam a mostrar um aumento no 7 dia após a cirurgia. Os autores puderam concluir
que células-tronco mesenquimais e células-tronco hematopoiéticas na medula óssea não estão
envolvidas na regeneração do periodonto. Células que migraram do ligamento periodontal
residual regeneraram novo osso alveolar num estágio mais cedo, e a regeneração ao redor da
dentina nas cavidades foi mais tardia que nas outras partes.
Seo et al. (2005) utilizaram o ligamento periodontal de humanos para testar a hipótese
que o ligamento periodontal criopreservado conteria células-tronco pós-natais recuperáveis.
Estas células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal preservadas pelo frio
mantiveram as características normais das células mesenquimais do ligamento periodontal,
incluindo a expressão do marcador de superfície celular STRO-1, a formação de colônias
celulares, o potencial de diferenciação, a formação de cemento e tecido de regeneração
semelhante ao ligamento periodontal, além de um cariótipo diplóide normal. Este estudo
demonstrou que as células-tronco pós-natal podem ser recuperadas a partir de células do
ligamento periodontal criopreservadas. Promovendo, desta forma, uma acessível prática
clínica para a utilização de tecidos congelados para isolamento de células-tronco e
regeneração tecidual.
Silvério et al.(2008) realizaram um estudo de revisão da literatura focando na
caracterização in vitro e in vivo das células mesenquimais derivadas de tecidos dentais, e seu
potencial para promover regeneração dos tecidos periodontais. Os primeiros resultados
enfatizaram a necessidade de investigações adicionais para determinar a eficácia da expansão
ex-vivo de células mesenquimais no reparo das estruturas dentais e tecidos periodontais.
Mesmo com as limitações de cada estudo, as células mesenquimais indiferenciadas do
ligamento periodontal mostraram uma habilidade de formarem estruturas semelhantes ao
cemento radicular e ligamento periodontal. Contudo, como estas células são heterogêneas
devido a sua capacidade de se proliferarem e se diferenciarem em células formadoras do
tecido periodontal, mais estudos são necessários para investigar a função destas células no
processo de regeneração. Além disto, células percursoras do folículo dental humano de
terceiros molares podem ser no futuro, geneticamente modificada in vitro então elas estarão
hábeis para se diferenciarem em células do tecido periodontal antes de serem transplantadas in
vivo. Apesar de novos estudos serem necessários para colocar em prática estas terapias
alternativas, neste momento o melhor entendimento das células-tronco e seus possíveis papéis
na regeneração tecidual podem ajudar a desenvolver novas abordagens para um tratamento
mais previsível dos defeitos periodontais.
Trubiani et al. (2008) utilizaram células mesenquimais indiferenciadas do ligamento
periodontal de humanos que foram induzidas a osteogênese, semeadas em arcabouços tri-
dimensionais biocompatíveis (esponja de fibrina, substitutos de derivados ósseos) e
examinadas usando microscopia de luz e eletrônica de varredura e transmissão. Observações
morfológicas mostraram crescimento extensivo da biomassa celular cobrindo parcialmente os
arcabouços após 4 semanas de incubação no meio de mineralização. Estes resultados
indicaram que o ligamento periodontal pode ser facilmente e eficientemente uma fonte
autológa de células mesenquimais indiferenciadas com uma grande capacidade de expansão e
habilidade de se diferenciarem em células osteogênicas que podem colonizar e crescerem
conectadas ao arcabouço biocompatível.
Células-tronco adultas multipotentes têm sido isoladas de vários tecidos não neurais.
Techawattanawisal et al. (2007) relataram pela primeira vez o isolamento de células
mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal com características de
células-tronco neurais primitivas. Células mesenquimais multipotentes do ligamento
periodontal de ratos foram cultivadas utilizando sistema de cultura formadora de neurosferas.
As células foram dissociadas enzimaticamente e cultivadas em meio básico livre de soro
contendo EGFe β-FGF. Esferas livres expressando, GFAP e vimentina foram formadas em 7
dias de cultura. Em adição, as esferas expressaram RNAm de fatores de transcripção
associados à crista neural: Twist, Slug, Sox2 e Sox9. As esferas derivadas do ligamento
periodontal diferenciaram-se em miotubos multinucledos, células semelhantes a neurônios
NFM-positivas, células semelhantes a astrócitos e a oligodentrócito Análise da formação de
colônias de metilcelulose revelou que uma simples célula do ligamento periodontal poderia
formar uma esfera numa freqüência e aproximadamente 0,01 % do total de células. Estes
dados indicam que as esferas derivadas do ligamento periodontal contêm células-tronco
adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em ambas as linhagens neural e
mesodermal, o que sugere que o ligamento periodontal pode ser uma nova fonte de células-
tronco adultas multipotentes, e estas células possam ser usadas no tratamento de várias
doenças tais como doenças neuronais degenerativas e distrofia muscular.
Zhou et al. (2008) investigaram a diferença dos marcadores de superfície celular em
diferentes células periodontais, tais como osteoblastos alveolares (AOs), fibroblastos do
ligamento peridontal (PDLFs) e fibroblastos gengivais (GFs), e seus potencias de
diferenciação em fenótipos osteogênicos e adipogênicos. Estas células periodontais foram
isoladas e a expressão padrão do antígeno de superfície foi analisada pela citometria fluida e
as caracterizações moleculares e hitológicas das induções osteogênicas e adipogênicas foram
monitoradas pela reação de cadeia da transcriptase reversa, Western blot e
imunocitohistologia. Os resultados mostraram que os fenótipos celulares dos AOs foram
verificados pela alta expressão de CD29 e CD49a, enquanto PDLFs mostraram
distintivamente baixos níveis de CD63 e CD73. Em indução adipogênica, limitados AOs
formaram células semelhantes a adipócitos de formato cúbico, enquanto PDLFs formaram
células semelhantes a adipócitos fusiformes. Todos os três tipos celulares expressaram genes
osteorelacionados a linha de base. Os AOs demonstraram maior habilidade osteogênica,
seguidos dos PDLFs e GFs. Através deste estudo, pôde-se concluir que células no osso
alveolar e ligamento periodontal possuem progenitoras osteogênicas e adipogênicas,
indicando a possibilidade de sua aplicação para regeneração dos tecidos periodontais.
Choi (2000), em um estudo piloto, cultivaram células do ligamento periodontal de cães
e investigaram se essas células eram capazes de formar uma nova inserção do ligamento
periodontal quando utilizadas sobre a superfície de implantes de titânio. Os implantes com as
células cultivadas do ligamento periodontal foram colocados nas mandíbulas dos cães. Após 3
meses de cicatrização, o exame histológico revelou que em algumas superfícies do implante,
uma camada com tecido semelhante ao cemento com inserção de fibras colágenas tinha sido
alcançada.Estes resultados demonstraram que células cultivadas do ligamento periodontal
podem formar tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio,
o qual têm sido o biomaterial mais utilizado atualmente em implantodontia através do
processo de osseointegração.
2.4 Osseointegração
O advento da osseointegração, fenômeno descrito por Brånemark no final dos anos 60,
refletiu em avanços notáveis na reabilitação de pacientes com perdas dentárias. Ao descrever
a possibilidade de integração entre um material metálico e o tecido ósseo, o pesquisador sueco
lançou as bases de uma das áreas mais estudadas pela comunidade odontológica. (NETO,
2005).
A reposição de elementos dentários por meio de uma raiz artificial que pode sustentar
uma prótese gerou uma expectativa positiva de impacto funcional e psicossocial aos
pacientes, uma vez que a reabilitação com implantes osseointegrados é capaz de melhorar a
capacidade mastigatória e a satisfação estética dos pacientes (ADELL et al, 1981; LOCKER,
1998).
Além das funções reabilitadoras, os implantes osseointegrados possuem a propriedade
de manter a função, forma e volume ósseo nas regiões onde estiverem instalados, pois
desempenham a função de estimular a produção de matriz óssea calcificada podendo muitas
vezes aumentar a densidade óssea na região onde foi inserido o implante. Os implantes atuam
na biologia óssea local como se fossem uma raiz dental, estimulando a remodelação óssea de
forma equilibrada (DAVIES, 2003)
Com a evolução da implantodontia, vários materiais têm sido testados com o objetivo
de aprimorar os resultados, sejam eles no que tangem a aceleração do processo de
osseointegração, estabilidade óssea, gengival e estética. Durante as últimas décadas, implantes
metálicos têm sido os mais freqüentemente utilizados, sendo que o titânio, em sua forma
comercial pura, se tornou o material de escolha para a fabricação de implantes em cirurgia
oral e craniofacial (HURÉ et al., 1996).
2.4.1 Titânio (Ti)
Dentre muitos materiais possíveis, o titânio (Ti) é atualmente considerado o material
de escolha para a confecção dos implantes intraósseos, pois esse metal possui características
físicas e químicas excepcionais que permitem a sua instalação nos tecidos vivos sem que haja
incompatibilidade entre eles. Propriedades físicas como seu coeficiente elástico, de
deformação e sua resistência à tração são diferentes do tecido ósseo, porém não influenciam
no sucesso deste tipo de tratamento. Sua grande resistência à fratura possibilita resistir aos
esforços necessários para uma boa função mastigatória. Quimicamente o titânio é um metal
muito estável, embora haja uma pequena formação de óxidos em sua superfície,
que facilita a
deposição e adesão da matriz extracelular na interface osso-implante. Estes óxidos se formam
durante o processo de corte, limpeza e esterilização do implante e ficam aderidos à superfície
não sendo liberados para o meio
.
As propriedades supracitadas permitem a cicatrização e a
manutenção da adesão das estruturas teciduais à superfície do titânio (HANSSON et al, 1983).
O comportamento osseointegrador do titânio pode também ser otimizado através da
compreensão das características da superfície sobre as respostas biológicas iniciais (adesão
celular, proliferação, diferenciação, produção de matriz extracelular, maturação e calcificação
óssea) (KASEMO, 2002). Diferentes superfícies têm diferentes propriedades de adsorção, e
estas diferenças estão intimamente relacionadas com aspectos de biocompatibilidade e
osseointegração (MEACHIM, WILLIAMS, 1993).
Vários trabalhos têm sido realizados com as mais diferentes abordagens a fim de
investigar detalhadamente todos os possíveis efeitos da superfície do titânio sobre o
comportamento das células.
Maeda et al. (2007) mostraram que a adesão e proliferação celular e a diferenciação
osteogênica de células-tronco mesenquimais de camundongos em disco de titânio foram
significativamente similares a aqueles na superfície plástica de cultura, elegendo o titânio
como um excelente material para o uso no reparo de tecido duro no campo da engenharia de
tecido ósseo.
2.4.2 Características superficiais e respostas celulares
Dentre as etapas pré-clinicas do desenvolvimento de uma nova superfície, os ensaios
com cultura de células proporcionam um ambiente semelhante ao fisiológico com as
vantagens de poder controlar fatores bioquímicos, determinar a citotoxicidade do material e a
expressão fenotípica do tipo celular investigado (DELIGIANNI et al., 2001).
A interação das células e um biomaterial, ou biocompatibilidade, depende das
propriedades de superfície do material, tais como a energia superficial (hidrofilicidade),
textura, rugosidade e composição química. Estas propriedades determinam como as moléculas
biológicas vão aderir à superfície e, mais particularmente, determinam a orientação das
moléculas aderidas. Elas também determinam o comportamento celular no contato. A
comparação do comportamento de diferentes tipos de células mostra que elas reagem
diferentemente de acordo com a energia superficial (hidrofilicidade ou molhabilidade),
rugosidade e composição química das superfícies (KASEMO, 2002; STIEHLER et al., 2007;
BOYAN et al. 2002).
O termo “adesão” no biomaterial engloba diferentes fenômenos: a fase de adsorção, a
qual ocorre rapidamente e envolve pequenas ligações físico-químicas entre as células e o
material, tais como ligações iônicas, força de Van der Walls, etc., e a fase de adesão, que
ocorre lentamente envolvendo moléculas biológicas, tais como proteínas da matriz celular,
proteínas de membrana celular e proteínas do citoesqueleto, as quais interagem juntas para
induzir sinal de transdução, promovendo a ação dos fatores de transcripção e
consequentemente regulando a expressão gênica. Esta fase é a mais importante, pois a
qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na capacidade para proliferação e
diferenciação das células (ANSLME, 2000).
Características hidrofóbicas e hidrofílicas de um material são de grande importância
para a adesão celular. A adesão celular é geralmente melhor em superfícies hidrofílicas.
Quando inserido no meio biológico, o material é condicionado pelos componentes do fluido
biológico. O pH, composição iônica, energia de ligação, temperatura, grupo funcional de
proteínas são fatores determinantes para adsorção protéica. A energia da superfície pode
influenciar a adsorção protéica e o arranjo estrutural das proteínas no material. O papel
principal das proteínas ósseas é atrair as células ósseas. Quando ocorrem mudanças
conformacionais destas devido a superfícies hidrofóbicas e/ou baixa energia superficial, sua
afinidade com o receptor da superfície celular das células ósseas é diminuída, atraindo
fibroblastos e formando tecido fibroso em torno do material (ANSELME, 2000).
A molhabilidade, avaliada pela medição do ângulo de contato de um líquido com a
superfície do material, sofre influência da rugosidade superficial do titânio, o que interfere na
resposta inicial do hospedeiro principalmente no que diz respeito à adsorção de proteínas
plasmáticas, as quais desempenham um processo importante na sinalização para a migração
de células indiferenciadas para a superfície do material (RUPP et al. 2004).
Atribui-se à rugosidade de superfície um papel importante no desempenho clínico do
biomaterial na osseointegração tornando, portanto, a caracterização de superfície do
biomaterial um aspecto necessário para a interpretação adequada do efeito da rugosidade para
a aposição óssea. A rugosidade da superfície do implante foi descrita como um dos fatores
que favorecem a interação do material com os componentes plasmáticos e celulares
responsáveis pela sinalização e iniciação da deposição de matriz extracelular por células
ósseas e influenciam diretamente a cicatrização no sítio de colocação e posteriormente a
osseointegração (ALBREKTSON et al. 1981), propiciando a aplicação precoce de carga
mecânica sobre esses implantes, além de assegurar estabilidade a longo prazo, que é o
objetivo primordial de qualquer material para uso protético.
Alguns estudos encontrados na literatura têm comparado o efeito de várias superfícies
em estudos in vitro. Embora não se saiba qual a rugosidade ideal para um material para
implantação no tecido ósseo, há larga concordância de que a topografia é um poderoso
modulador do comportamento celular e, portanto, um fator de influência direta na
performance clínica do material.
Buser et al. (1991) e Frazolin et al. (2008), em estudos experimentais comparando
diferentes tipos de superfície, concluíram que os melhores resultados foram os das superfícies
texturizadas. Deligiannni et al. (2001), Anselme et al.(2002) e Keller (1998) observaram que
células da medula óssea e osteoblastos cultivados em diferentes superfícies de titânio, se
aderem e respondem melhor em superfícies com maior rugosidade. Os estudos de Perizzolo,
Lacifield e Brunette (2001), Sul et al. (2002) e Sena et al. (2003) também indicaram que a
proliferação de células osteobálsticas pode ser melhor em superfícies rugosas.
Entretanto, Lange et al. (2002), em seus experimentos com células osteoblásticas MG-
63, Huang et al. (2004) , com as U-2 OS, e Cochran et al. (1994) e Gay et al. (2007) com
células do ligamento periodontal, mostraram que a adesão e proliferação celular foi melhor
em superfícies de titânio lisas quando comparadas com as rugosas.
Anselme (2000), Faghihi et al. (2006), Guehennec et al. (2007) analisaram a adesão,
proliferação e diferenciação de células osteoblásticas da calvária de ratos (MC3T3-E1) e
células osteoblásticas humanas em superfícies de titânio Ti6A14V com variadas rugosidades,
e observaram que textura superficial do biomaterial influenciava na resposta celular e que a
rugosidade influencia na adesão e proliferação das células à superfície do titânio.
As alterações superficiais resultam em variações não apenas nos aspectos físicos do
material, mas também em sua composição química. Superfícies obtidas por diferentes tipos de
tratamento podem apresentar características topográficas semelhantes embora com
desempenho biológico distintos, sugerindo que há grande probabilidade de não apenas a
alteração topográfica como também a modificação na estrutura química da superfície, possam
ter efeito na resposta celular.
Santiago et al. (2005) em seu experimento com células osteoblásticas de camundongo,
analisaram amostras de titânio comercialmente puro (Ti) com diferentes propriedades de
superfície por meio de ataques químico e físicos, e os resultados sugeriram que os tratamentos
utilizados foram favoráveis às respostas biológicas.
Wang et al (2008) mostraram que os métodos de tratamentos químicos de superfície
do titânio utilizados em seu estudo influenciavam positivamente na adesão, proliferação e
diferenciação das células-tronco mesenquimais da medula de coelhos.
A diferenciação dos efeitos químicos e topográficos da superfície não está clara.
Entretanto é unânime entre os pesquisadores que as propriedades físico-químicas das
superfícies dos implantes exercem um papel fundamental no sucesso do fenômeno biológico
da osseointegração. As interações moleculares e celulares que norteiam o destino biológico
dos implantes ocorrem nos estágios iniciais da cicatrização (AMARANTE, 2001).
Na busca por superfícies que melhorem as respostas biológicas e supram à necessidade
de obter uma rápida osseointegração, várias pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando
estas superfícies pelos processos mais variados (SILVA, 2005) que envolvem métodos
mecânicos, químicos, e físicos de tratamento de superfície, tais como: a aspersão com plasma
de titânio, jateamento com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto de titânio,
condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, PAUL, CHUANXIAN, 2004).
2.4.3 Tratamento de superfície
Dentre os métodos de tratamento da superfície pode-se citar a nitretação iônica ou
nitretação a plasma, que apresenta excelentes propriedades mecânicas, estabilidade química e
biocompatibilidade quando aplicada ao titânio (PARK et al., 2003).
2.4.3.1 Nitretação iônica
A nitretação iônica (ion-nitriding) é um processo de tratamento termoquímico, usado
para endurecimento superficial de metais ferrosos e um crescente número de materiais não
ferrosos como ligas de titânio e alumínio (MICHEL et al.,1995), pela obtenção de uma
camada de nitretos, que eleva a resistência ao desgaste das superfícies tratadas (NICOLETO,
TUCCI, ESPOSITO, 1996).
Além dos fatores ambientais, várias são as vantagens desta técnica sobre as
convencionais. As mais importantes são: baixa temperatura de tratamento, melhor controle da
espessura da camada, tempo de tratamento inferior, uniformidade na espessura da camada,
nitretação de partes da peça, mais economia (ALVES Jr, 1995).
Este processo, também conhecido como nitretação por plasma, consiste em ionizar um
gás ou mistura gasosa, contendo nitrogênio, através de uma descarga luminescente, gerada por
uma diferença de potencial entre a amostra (catodo) e o anodo, em uma atmosfera a baixa
pressão. Os íons produzidos no plasma são acelerados em direção a amostra (catodo),
chocando-se com ela e fornecendo energia suficiente para aquecê-la até a temperatura de
nitretação (O’BRIEN J.M.; GOODMAN D, 1991).
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995).
O conceito básico no uso da nitretação iônica para melhorar as propriedades
superficiais de uma liga de titânio é fundamentado na possibilidade de formar nitretos ou
carbetos abaixo da superfície da liga. Os nitretos e carbetos de titânio são materiais duros que
melhoram as propriedades tribológicas da superfície, ou seja: aumentam a resistência ao
desgaste e a dureza superficial (YILBAS, 1996).
Pereira (2008) com o objetivo de melhorar as propriedades tribológicas da superfície
do titânio usado em implantes dentais, particularmente sua resistência ao desgaste,
investigaram o efeito da nitretaçäo em plasma sobre as referidas propriedades de amostras de
titânio. A análise dos dados obtidos indicou que a nitretaçäo em plasma aumenta a resistência
superficial do titânio.
Com modelo de linhagem celular (L929 fibroblastos de ratos), Abidzina et al. (2007)
observaram que a adesão celular à superfície do titânio é favorecida pelo tratamento de
superfície com irradiação iônica de baixa energia (plasma).
Neto (2005) utilizou amostras de titânio nitretadas a plasma a fim de analisar suas
propriedades de superfícies e puderam concluir que as superfícies nitretadas apresentaram
melhores resultados no que se refere a molhabilidade e rugosidade que as amostras sem
tratamento, e que tanto a adesão como a proliferação de células (linhagem Osteo-1) nas placas
nitretadas foram superiores às placas sem tratamento.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
• O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de experimentos in vitro
utilizando cultura celular, a capacidade de adesão das células mesenquimais
provenientes da medula óssea de camundongos e do ligamento periodontal de
ratos quando postas em contato com diferentes superfícies de Titânio (polida e
tratada por plasma).
3.2 Objetivos específicos:
• Analisar a capacidade de adesão das células mesenquimais da medula óssea de
camundongos sobre as superfícies de titânio polidas e tratadas por nitretação
iônica (plasma).
• Analisar a capacidade de adesão das células mesenquimais do ligamento
periodontal de ratos sobre as superfícies de titânio polidas e tratadas por
nitretação iônica (plasma).
4 METODOLOGIA
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte - UFRN (pareceres nº 022/07 e 102/08) e foi dividido em
duas etapas. Na primeira foi realizado o preparo das amostras através do tratamento de
superfície das placas de titânio no Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Na
segunda foi realizado um ensaio in vitro com células isoladas da medula óssea de
camundongos e do ligamento periodontal de ratos e cultivadas sobre as placas de titânio
tratadas e a superfície controle (plástico). Esta etapa foi realizada no laboratório de cultura de
células do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN.
4.1 Preparo das amostras
De acordo com a literatura, o número de amostras utilizadas não têm sido elucidado
em nenhum dos estudos analisados, presumindo-se que o número das amostras de titânio não
influencia nos resultados de adesão celular. Assim sendo, o número de amostras deste
experimento foi determinado aleatoriamente.
As amostras de titânio foram preparadas segundo o protocolo estabelecido no
Labplasma (Departamento de Física da UFRN). Doze discos de titânio grau II ASTM F86 nas
dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, foram embutidas em resina
poliéster e lixados gradualmente com lixas de SiC, de abrasividade 220, 360, 400, 600, 1200 e
2000 água corrente e depois polidas (politriz AROTEC, modelo APL-2 e série 212560,
BRASIL) com pano de polimento OP-CHEM, sílica coloidal e água oxigenada (H
2
O
2
)
20Vol.
até um acabamento final de 0,04µm.
Em seguida, as amostras foram desembutidas e limpas em banho de ultrasom com
acetona por 10 minutos com objetivo de remover contaminantes que pudessem interferir no
processo de nitretação iônica. As amostras foram secadas em temperatura ambiente e
colocadas no sistema de nitretação a plasma.
4.1.1 Protocolo de Nitretação
Após o polimento e limpeza, seis amostras foram colocadas em uma câmara de aço
inoxidável (reator), com 400 mm de diâmetro e 400 mm de comprimento, hermeticamente
fechada para receber o tratamento de superfície. Foi utilizada a configuração no reator de
plasma para nitretação em gaiola catódica.
Internamente, a câmara possuia um eletrodo em forma de disco, sobre o qual foi
colocada a amostra. Inicialmente foi feito um vácuo no reator até uma pressão de 10
-1
mbar e
então foi introduzido hidrogênio com um fluxo de 12sccm, como gás de arraste de impurezas,
até uma pressão de 1,6 mbar por 20 minutos. Após esta etapa, o N
2
a 3sccm foi introduzido
até conseguir uma atmosfera de trabalho estável em torno de 680V, 0,5 miliampére (mA),
temperatura de 450ºC e pressão de nitretação de 2,5mbar. Nestas condições as amostras foram
nitretadas por 60minutos.
As atmosferas do plasma foram configuradas obedecendo um fluxo de gases de
15sccm (tabela 1).
Tabela 1. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.
Grupo
experimental
Atmosfera do
plasma
Tempo de
tratamento
Pressão do
plasma
Temperatura do
plasma
Fluxo do gás
total
Polidas - - - - -
Gaiola catódica N
20%
H
80%
1h 2,5mbar 450°C/17.5mA 15sccm
Figura 2. Equipamento para nitretação iônica Figura 3. Esquema do equipamento para nitretação
iônica em gaiola catódica (SOUSA, et al.2008).
4.2 Caracterização das amostras
Depois de terminado o tratamento de superfície, as amostras foram seqüencialmente
submetidas a ensaio de caracterização superficial como segue:
4.2.1Composição de camada
A composição da camada superficial foi avaliada pela difração de raios-X.
4.2.2 Textura superficial
Uma amostra de cada grupo foi submetida à microscopia eletrônica de varredura
(MEV) para análise das características de textura superficial em ampliações de 25, 100 e 200
vezes.
4.2.3 Rugosidade
Para análise da rugosidade foi mensurado o parâmetro Ra, utilizando um rugosímetro
modelo SURTRONIC 3, (Taylor-Hobson Inc, USA) com cut-off igual a 0.25. As medidas
foram tomadas em três direções diferentes, em ângulos de aproximadamente 120
0
com
dispersão nestas três direções inferior a 10%.
4.2.4 Molhabilidade
Após o tratamento a plasma, cinco amostras de cada grupo experimental foram
submetidas ao ensaio de molhabilidade. A técnica utilizada foi a determinação do ângulo de
contato estático ou técnica da gota séssil para cada uma das amostras e mensurada por dois
observadores. As amostras foram colocadas em uma superfície plana e utilizando uma
micropipeta digital de volume ajustável funcionando com uma solução fisiológica,
posicionada de forma perpendicular e muito próxima à superfície depositando 0,25mL da
solução sobre a superfície da amostra.
De forma a padronizar o teste e por serem gotas muito pequenas, foram feitos
acompanhamento da mudança do ângulo por 01 seg., 30 seg. e 60 seg.
4.3 Esterelização das amostras
Em seguida, todas as amostras (nitretadas em gaiola catódica e polidas) foram
acondicionadas em placas de cultura de 24 poços de 2cm
2
de área e esterilizadas por radiação
gama no DEN (Departamento de Energia Nuclear da UFPE – Universidade Federal de
Pernambuco). A dose total de radiação por amostra foi de 25 kGy, liberada a uma dose
média de 8,993 kGy/h (2h 46minutos a uma distância de 50mm), em irradiador
GAMMACELL 220 Excel (MDS Nordion, Ca).
4.4 Cultura de células
4.4.1 Obtenção das células da medula óssea de camundongos
Foi realizada a extração da medula óssea de dois camundongos albinos machos Swiss,
com 2 meses de idade, com peso em média de 28,5 g, procedentes do Laboratório de
Cronobiologia do Departamento de Morfologia da UFRN, seguindo-se o protocolo de
Maniatopoulos, Sodek e Melcher (1988). Os animais, depois de anestesiados, foram
dissecados sob condições assépticas para remoção dos fêmures e tíbias.
Os ossos recém-dissecados foram mantidos em um tubo cônico contendo PBS (pH
7.4), até que foi feita a remoção de toda porção de tecido muscular aderido aos ossos. Com
auxílio de uma tesoura de ponta reta foram feitos cortes nas epífises dos ossos (figura 4) e,
utilizando uma seringa de 1mL, a medula foi extraída através da inserção da agulha no canal
medular e posterior lavagem do canal utilizando meio de cultura básico α-MEM enriquecido
com 50 mg/L de Sulfato de Gentamicina e 2 mg/L de Anfotericina B (Cultilab, Brasil) e
suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) (figura5).
Figura 4. Corte das epífises ósseas. Figura 5. Extração da medula.
4.4.2 Cultivo das células da medula óssea
A medula extraída foi cultivada em meio básico (α-MEM contendo antibióticos e
suplementado com 10% de FBS), por 72 horas, em atmosfera úmida com 5% de CO
2
a 37ºC.
Após esta etapa, o meio foi trocado - o que possibilitou a remoção das células não-aderidas da
cultura - e incubado novamente por três dias em meio básico. Depois dessas etapas as células
foram tripsinizadas em 0,25% de Tripsina contendo 1mM de EDTA (Gibco) e uma alíquota
de 0,1 mL foi retirada para se fazer a contagem das células na Câmara de Neubauer,
utilizando o método da exclusão de células coradas pelo Azul de Trypan.
4.4.3 Obtenção das células do ligamento periodontal de ratos
Para obtenção do ligamento periodontal dois ratos albinos, machos, saudáveis, da
linhagem Wistar com quatro meses de idade, pesando em média 250 gramas (figura 6),
obtidos do biotério do Departamento de Farmacologia do Centro de Biociências da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foram sacrificados com dose letal do
anestésico (Ketamina) administrado por via intramuscular.
Seguindo-se o protocolo de Akizuki et al.(2005), em uma câmara de fluxo laminar e
sob condições assépticas os animais foram dissecados para remoção dos elementos dentários
(incisivos), os quais foram imediatamente mantidos em um meio básico α-MEM contendo 50
mg/L de Sulfato de Gentamicina e 2 mg/L de Anfotericina B (Cultilab, Brasil) (figura 7).
Figura 6. Rato Wistar. Figura 7. Incisivos no meio básico
α
-MEM.
O ligamento periodontal foi removido através da raspagem delicada da superfície
radicular com o uso de uma lâmina de bisturi (figuras 8 e 9) e encubado em uma solução de
tripsina/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 mM de EDTA – Cultilab/Brasil) por 10
minutos. Em seguida, foi adicionado o meio
α-MEM suplementado com 10% de soro fetal
bovino – FBS (Cultilab, Brasil) com o objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi
centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos (figura 10) e sobrenadante retirado, as células
ressuspensas e cultivadas.
Figura 8. Remoção do PDL Figura 9. Fragmentos de PDL
cultivados em tripsina
Figura 10. Suspensão centrifugada
4.4.4 Cultivo das células do ligamento periodontal
As células foram cultivadas em poços de placas de cultura contendo o meio básico α-
MEM suplementado com 10% de FBS (figura 11). As culturas foram mantidas a 37ºC em 5%
de CO2 até atingirem 70 – 90% de confluência, com troca de meio a cada 3 dias.
Figura 11. Placa de cultura contendo meiobásico
α
-MEM supletmentado com 10% de SFB.
No subcultivo o meio básico foi removido e então adicionado aos poços 2 mL de
tripsina/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 mM de EDTA – Cultilab/Brasil). A suspensão
celular foi então colocada em um tubo cônico com o mesmo volume de meio α-MEM
suplementado com 10% de FBS com o objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi
centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos (figura 12), sobrenadante retirado, as células
ressuspensas em 1 mL de meio α-MEM, e então uma alíquota dessa suspensão foi separada
para a contagem na Câmara de Neubauer, utilizando o método da exclusão de células coradas
pelo Azul de Trypan.
Figura 12. Suspensão centrifugada
4.4.5 Cultivo nos discos de Titânio
As células da medula óssea e do ligamento periodontal foram cultivadas em 2 placas
de 24 poços (TTP®), na densidade de 1 x 10
4
células por poço (figura 13). Foram utilizados
12 discos de titânio, 6 de cada grupo (polido e gaiola catódica). A mesma densidade celular
foi cultivada em seis poços sem disco, como controle positivo.
Figura 13. Placa de cultura com discos e células. Figura 14. Esquema dos discos de titânio na placa de
cultura de 24 poços.
Plástico
Titânio Polido
Titânio Gaiola
ADESÃO
Medula óssea Ligamento Periodontal
M1 M2 M3 L1 L2 L3
4.5 Viabilidade e Adesão celular
O meio básico foi removido, realizada a lavagem com PBS. Em seguida foram
adicionados às placas 300µl de tripsina – (Cultilab/Brasil) por 10 min. A suspensão celular foi
então colocada em um microtubo cônico com o mesmo volume de meio α-MEM com o
objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos,
sobrenadante retirado, as células ressuspensas em 300µl de meio α-MEM, e então uma
alíquota dessa suspensão separada para a contagem celular foi somada ao mesmo volume de
Azul de Trypan e então realizada a contagem de células viáveis e não viáveis na câmara de
Neubauer. As células viáveis expulsam o corante do seu citoplasma e não são coradas, ao
contrário das células mortas na qual o corante permanece no interior da célula, sendo então
coradas de azul.
Para análise da adesão celular foram utilizados os dados obtidos das contagens de
células aderidas às superfícies de titânio (grupo polido e grupo gaiola catódica) e à superfície
de plástico (grupo controle), no período de 24 horas após o plaqueamento. O número de
células colhidas de cada poço foi obtido pela contagem de células viáveis através do uso de
hemocitômetro e o método da exclusão de células coradas pelo Azul de Trypan, obedecendo-
se a seguinte equação matemática: Número total de células contadas x diluição x 10
4
/ Número
de quadrados do hemocitômetro usados para contagem.
4.6 Análise Estatística
Os dados foram submetidos a análise não paramétrica. Cada dado das contagens
corresponde à média ± dp (desvio padrão da média) de 6 amostras por grupo. As diferenças
entre os grupos foram comparadas pelos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Mann Whitney U.
A diferença estatística foi considerada quando p<0.05.
5 RESULTADOS
5.1 Resultados da análise de superfície
Os resultados da análise de superfície (Apêndice) foram obtidos através de um
experimento em andamento no LabPlasma (Departamento de Física da UFRN), no qual foram
utilizadas amostras e metodologias de tratamento idênticas às utilizadas no presente estudo.
5.2 Resultados da adesão celular
As médias de adesão foram maiores às superfícies controles, tanto para as células da
medula óssea de camundongos, como também para as células do ligamento periodontal de
ratos (figura 15). Entretanto, diferenças estatísticas só foram observadas quando cada grupo
celular foi analisado separadamente.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
M1 M2 M3 L1 L2 L3
Número de células (x10^4)
Figura 15. Médias e desvios padrões da adesão de células às diferentes superfícies.
5.2.1 Adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes
superfícies
A média de adesão entre as células da medula óssea de camundongos foi maior no
grupo controle (figura 16), mas a análise estatística da adesão deste tipo celular às três
superfícies não mostrou nenhuma diferença significativa (tabela 2). Contudo, quando os
grupos foram pareados entre si (tabelas 3, 4 e 5), pode-se observar diferença estatisticamente
significante apenas entre o grupo controle (M1) e o titânio polido (M2), conforme mostra a
tabela 3. Podendo-se afirmar que a superfície de titânio tratado por plasma na configuração de
gaiola catódica (M3) apresentou bons resultados de adesão para este tipo celular, uma vez que
se mostrou similar ao grupo controle.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
M1 M2 M3
Número de células da medula (x10^4)
Figura 16. Médias e desvios padrões da adesão de células da medula óssea às diferentes superfícies.
Tabela 2. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às diferentes superfícies.
p* Kruskal-Wallis
Tabela 3. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Controle e Ti Polido.
p* Mann Whitney
Tabela 4. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Controle e Ti Gaiola.
Superfície controle (M1) Ti Gaiola (M3)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Células da
Medula óssea
0.77 ± 0.25 0.61 ± 0.27 0.37
p* Mann Whitney
Controle (M1) Ti Polido (M2) Ti Gaiola (M3)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p
Células da
Medula
óssea
0.77 ± 0.25 0.34 ± 0.87 0.61 ± 0.27 0.16
Superfície controle (M1) Ti Polido (M2)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Células da
Medula
óssea
0.77 ± 0.25 0.34 ± 0.87 0.04*
Tabela 5. Análise da adesão de células da medula óssea de camundongos às superfícies Ti Polido e Ti Gaiola.
p* Mann Whitney
5.2.2 Adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes
superfícies
A comparação da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às três
superfícies distintas mostrou que também a média de adesão foi maior na superfície controle
(figura 17), mas não houve diferença estatística entre os três grupos (tabela 6). Entretanto,
quando as superfícies foram analisadas por pareamento (tabelas 7, 8 e 9), apenas pode-se
observar diferença estatisticamente significante entre os grupos L1 e L3 (tabela 8), o que leva
a inferir que a superfície polida mostrou-se semelhante à superfície controle, com bons
resultados de adesão para este tipo celular.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
L1 L2 L3
Número de células do
ligamento periodontal (x10^4)
Figura 17. Médias e desvios padrões da adesão de células do ligamento periodontal às diferentes superfícies.
Tabela 6. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às diferentes superfícies.
Ti Controle (L1) Ti Polido (L2) Ti Gaiola (L3)
Média ± Desvio padrão Média± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p
Células do
Ligamento
0.62 ± 0.22 0.46± 0.14 0.33 ± 0.10 0.12
p* Kruskal-Wallis.
Ti Polido (M2) Ti Gaiola (M3)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Células da
Medula óssea
0.34 ± 0.08 0.61 ± 0.27 0.12
Tabela 7. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Controle e Ti Polido.
p* Mann Whitney
Tabela 8. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Controle e Ti Gaiola.
Controle (L1) Ti Gaiola (L3)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Células do ligamento
periodontal
0.62 ± 0.22 0.33 ± 0.10 0.04*
p* Mann Whitney
Tabela 9. Análise da adesão de células do ligamento periodontal de ratos às superfícies Ti Polido e Ti Gaiola.
Ti Polido (L2) Ti Gaiola (L3)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Células do ligamento
periodontal
0.46 ± 0.14 0.33 ± 0.13 0.21
p* Mann Whitney
5.2.3 Adesão de células da medula de camundongos e do ligamento
periodontal de ratos à mesma superfície
Os gráficos (figuras 18, 19 e 20) ilustram a análise da adesão dos diferentes tipos
celulares sobre a mesma superfície. Entretanto não foram observadas diferenças estatísticas
significativas em nenhum dos grupos (tabelas 10, 11 e 12).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
M1 L1
Número de células aderidas (x 10^4)
Figura 18. Média e desvios padrões da adesão de células às superfícies controle.
Controle (L1) Ti Polido (L2)
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Células do ligamento
periodontal
0.62 ± 0.22 0.46 ± 0.14 0.12
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
M2 L2
Número de células aderidas
(x10^4)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
M3 L3
Número de células aderidas
(x10^4)
Figura 19. Média e desvios padrões Figura 20. Média e desvios padrões
da adesão de células à superfície Ti Polido da adesão de células à superfície Ti Gaiola.
Tabela 10. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle.
Medula óssea
Ligamento Periodontal
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Controle
0.77 ± 0.25 0.62 ± 0.22 0.21
p* Mann Whitney
Tabela 11. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície controle Ti Polido.
Medula óssea
Ligamento Periodontal
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Ti Polido
0.34 ± 0.87 0.46 ± 0.14 0.12
p* Mann Whitney
Tabela 12. Análise da adesão dos dois tipos celulares sobre a superfície Ti Gaiola.
Medula óssea
Ligamento Periodontal
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão Valor de p*
Ti Gaiola
0.61 ± 0.27 0.33 ± 0.10 0.12
p* Mann Whitney
6 DISCUSSÃO
Além do embrião, as células-tronco também são encontradas em vários órgãos e
tecidos do indivíduo adulto, onde participam da homeostase tecidual, gerando novas células
devido à renovação fisiológica e abrindo novas perspectivas para a regeneração e recuperação
de tecidos e órgãos, pois são entidades capazes de se auto-renovarem e se diferenciarem em
células de diversos tecidos. Tais populações celulares, ou células-tronco adultas, têm sido
facilmente identificadas pela sua morfologia e localização em alguns tecidos que são fontes
principais das células mesenquimais indiferenciadas, tais como a medula óssea. Já em outros
tecidos, como no ligamento periodontal, a presença destas células mesenquimais ainda vem
sendo recentemente identificada através de marcadores celulares (GRONTHOS, MANKANI,
BRAHIM, 2003; SEO et al., 2004; SEO et al 2005; CHEN et al., 2006; NAGATOMO et al.,
2006; GRONTHOS et al., 2006; KAWANABE, MURAKAMI, YAMAMOTO, 2006; LEON
et al., 2006; GAY, CHEN, MACDOUGALL, 2007; FUJII et al., 2008; COURA, 2008; LIN et
al., 2008; OHTA et al., 2008; ZHOU et al., 2008).
Na medula óssea as células-tronco mesenquimais constituem uma pequena população
celular, contudo, podem ser expandidas com alta eficiência e induzidas a se diferenciarem em
múltiplas linhagens em condições de cultura definidas (PITTENGER et al. 1999; ROSADA et
al., 2003; SHORT et al., 2003). São capazes de se aderirem e formarem colônias celulares
clonogênicas com aspecto fibroblastóide (CFU-F) in vitro. Cada colônia representa uma
linhagem de células derivadas da proliferação de uma única célula precursora. À microscopia
de luz ou em contraste de fase, apresentam-se como células fibroblastóides alongadas,
fusiformes e pontiagudas, com núcleo eucromático, oval, grande e central e citoplasma
abundante (GRONTHOS et al, 2006).
A identificação de marcadores de superfície celular que são específicos para células-
tronco mesenquimais é muito importante no processo de identificação das mesmas. O STRO-
1 é um anticorpo que tem sido utilizado para identificar o antígeno de superfície expressado
pelo estroma de células precursoras da medula óssea e apresenta positividade na detecção das
unidades formadores de colônia clonogênica, as quais morfologicamente se assemelham a
fibroblastos. Outros marcadores de superfícies, tais como CD146/MUC-18 e CD44, também
vêm sendo utilizados em combinação para a identificação das células com propriedades
clonogênicas e potencial de se transformarem em múltiplas linhagens (IVANOVSKI et al.,
2006).
Através da utilização destes marcadores de superfície, células mesenquimais também
vêm sendo identificadas em tecidos orais, tais como polpa e ligamento periodontal
(GRONTHOS et al., 2000; GRONTHOS et al., 2002; SEO et al., 2004). Desta maneira, a
regeneração periodontal que busca reconstituir os tecidos destruídos ou lesados pelo avanço
da doença tem ganhado novas perspectivas através da identificação destas células sua
aplicabilidade na bioengenharia ou engenharia tecidual.
As células-tronco mesenquimais apresentam uma série de características que as
tornam a fonte celular ideal para o uso na engenharia de tecidos: 1) o uso das CTM não
oferece complicações éticas e legais; 2) elas são facilmente acessíveis; 3) possuem extensiva
capacidade de expansão, auto-renovação e diferenciação em tecidos mesenquimais; e 5) as
CTM são pouco imunogênicas ou tumorogênicas (SONG et al., 2004).
O conceito básico de biengenharia baseada em células-tronco consiste no isolamento e
expansão celular, seguido pelo procedimento de reimplantação combinado com um arcabouço
material. As células mesenquimais têm sido utilizadas através de experimentos in vitro nos
estudos de bioengenharia como meta de entender os eventos biológicos que ocorrem na
interação entre as células e as superfícies dos biomateriais empregados em cirurgias
maxilofaciais, implantodontia e regeneração óssea (SHANTI et al., 2007).
Uma grande variedade de biomateriais tem sido testada, visando um melhor
aproveitamento do potencial osteogênico das CTM para a engenharia de tecido ósseo, dentre
os quais, o titânio (Ti) é o mais utilizado, devido às suas propriedades mecânicas, estabilidade
química e biocompatibilidade (AMARANTE, LIMA, 2001).
A biocompatibilidade de um material está relacionada não só à sua composição
química, mas também ao tipo de superfície utilizada, o e que reflete no comportamento das
células quando em contato com a superfície. A adesão celular é provavelmente o aspecto mais
importante desta interação célula/superfície, pois é pré-requisito para as outras etapas, tais
como proliferação e diferenciação (ANSELME, 2000).
A partir da extração e cultivo da medula óssea de camundongos é possível obter uma
população de células aderidas, com aspecto fibroblastóide, denominadas de células
mesenquimais estromais multipotentes (HOROWITZ et al., 2005). Estas células também
podem ser obtidas a partir de outros tecidos. Alguns estudos foram publicados com células-
tronco oriundas de ligamento periodontal humano (SEO et al., 2005; CHEN et al., 2006;
NAGATOMO et al, 2006; LEON et al., 2006; KAWANABE, MURAKAMI, YAMAMOTO,
2006; GAY, CHEN, MACDOUGALL, 2007; INANÇ, ELÇIN, ELÇIN, 2007; COURA,
2008; LIN et al., 2008; TRUBIANI et al., 2008; ZHOU et al., 2008) e implantados em
animais submetidos à imunossupressão para avaliar a capacidade de diferenciação destas
células (SEO et al., 2004; FUJII et al., 2008). Outros estudos em modelos experimentais com
animais, principalmente ratos (TECHAWATTANAWISAL et al., 2007; OHTA, 2008),
também foram utilizados para o isolamento de células do ligamento periodontal.
No presente experimento foi analisada, sob condições de cultivo celular, a capacidade
de adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos e células mesenquimais
do ligamento periodontal de ratos à diferentes superfícies de titânio (Ti). A superfície plástica
ou placa de cultura celular de polistireno foi usada como controle positivo, pois é superfície
padrão no cultivo de células por apresentar excelentes características hidrofílicas (MAEDA et
al., 2007).
As características de superfície do material apresentam um papel importante na adesão
celular, pois estas dão condições de adesão das proteínas adsorverem e ajudarem no processo
de adesão celular. Dentre quais, as mais importantes são a composição química da superfície,
rugosidade e molhabilidade (ANSELME, 2000). Contudo, atualmente existem várias técnicas
de tratamento de superfície dos metais que buscam otimizar estas características, tais como a
aspersão com plasma de titânio, jateamento com óxido de titânio, deposição a laser de carbeto
de titânio, condicionamento ácido, e outros (XUANYONG, 2004).
Neste estudo, foi utilizada a técnica de nitretação iônica ou nitretação a plasma, pois a
camada de nitreto formada sobre a superfície do titânio contribui positivamente para as
propriedades tribológicas da superfície, ou seja: aumentam a rugosidade, a molhabilidade, a
resistência ao desgaste e a dureza superficial (YILBAS, 1996; NICOLETO, TUCCI,
ESPOSITO, 1996). Os resultados da caracterização superficial das amostras utilizadas
mostraram que as superfícies nitretadas a plasma apresentaram maiores médias de rugosidade
e melhor molhabilidade que as superfícies polidas (Anexo I), assim como mostrado na
literatura (YILBAS, 1996; PEREIRA, 2008).
A observação do comportamento celular é muito importante para esclarecer a
interação célula/ material. O comportamento celular, incluindo a adesão é geralmente
observado pelo microscópio óptico. Entretanto, observar as culturas celulares sobre o titânio é
difícil pelo microscópio óptico uma vez que o titânio é opaco. Portanto, o método utilizado
neste estudo para análise da adesão celular foi o uso de hemocitômetro para contagem de
células viáveis. Para tal, as células foram submetidas à tripsinização a fim de romper as
ligações e então as células soltas fossem obtidas através de uma alíquota da suspensão
separada para contagem celular.
Os melhores resultados de adesão celular foram à superfície controle (plástica) tanto
para as células da medula óssea de camundongos (M1) com para as células do ligamento
periodontal de ratos (L1), mas nenhuma diferença estatística significante foi obtida quando
comparadas aos grupos experimentais (M2, M3, L2 e L3). Apesar de mais experimentos
serem necessários para esclarecer o mecanismo de adesão celular sobe o titânio, os resultados
sugerem que as características de superfície do titânio são similares às da superfície plástica, o
que resulta na boa capacidade de adesão celular, como visto no estudo de Maeda et al.(2007).
No que diz respeito à influência destas características superficiais do titânio sobre à
adesão celular, pode-se observar que a superfície polida (M2) obteve diferença
estatisticamente significante (p=0,04) na adesão de células da medula óssea de camundongos
quando comparada com o grupo controle (M1). Este resultado reforça o argumento de que o
tratamento de nitretação iônica dado à superfície (M3) contribui para melhor adesão deste tipo
celular, corroborando com alguns trabalhos na literatura no que se refere à rugosidade e à
molhabilidade, tais como Frazolin et al. (2008), cultivando células-tronco hematopoiética
humana periférica sobre implantes de titânio (Ti); Anselme et al. (2002) utilizando células de
linhagem osteoblástica da calvária de ratos (MC3T3-E1); Deligiannni et al. (2001) com
células da medula óssea humana; Sena et al. (2003) e Sul et al. (2002) através da cultura de
células osteoblásticas. Todos estes experimentos demostraram que as superfícies de titânio
rugosas apresentavam maior adesão e proliferação celular. Adicionalmente outros estudos
como o de Perizzolo, Lacifield e Brunette (2001) também mostraram que a topografia da
superfície influenciou no comportamento de células osteoblásticas de ratos.
No presente trabalho, entretanto, quando a superfície tratada (M3) foi comparada à
superfície controle (M1) não houve diferença estatística entre os grupos (p=0.37), o que
permite afirmar que a superfície tratada (M3) apresenta boas características para adesão deste
tipo celular, mas que o tratamento de superfície não influenciou na adesão, diferente dos
estudos de Abidzina et al. (2007) com células do tecido conjuntivo de ratos semelhantes à
fibroblastos (L929) e Neto (2005) com linhagem celular Osteo-1, os quais observaram uma
melhor adesão e proliferação sobre as superfícies de titânio tratadas a plasma.
Quando comparou-se a superfície tratada a plasma (M3) com a superfície polida (M2),
também nenhuma diferença estatística significante foi observada (p=<0.12). Os dados
sugerem que o método de nitretação a plasma não têm efeito no comportamento celular, no
que se refere à capacidade de adesão in vitro de células da medula óssea de camundongos à
superfície de titânio polido.
As células mesenquimais do ligamento periodontal de ratos exibiram respostas
diferentes daquelas observadas nas células da medula óssea de camundongos. Apesar da
adesão celular também ter sido melhor à superfície controle quando analisadas as três
superfícies, os resultados mostraram que diferença estatística só foi encontrada entre as
superfícies controle (L1) e tratada por plasma (L3) (p=0.04), o que poderia sugerir que a
superfície polida (L2) teve melhores resultados de adesão das células do ligamento
periodontal, como visto na literatura nos estudos de Lange et al. (2002) com células
osteobláticas MG-63, Huang et al. (2004) com células osteoblásticas U2-OS e Cochran et al.
(1994) e Gay et al. (2007) com células do ligamento periodontal, os quais observaram que o
comportamento celular teve melhores respostas sobre as superfícies polidas.
Quando a superfície polida (L2) foi comparada à superfície nitretada (L3), nenhuma
diferença estatística foi observada (p=0.021), podendo-se afirmar que o tratamento de
superfície do titânio utilizado neste estudo não teve influência sobre a adesão de células do
ligamento periodontal de ratos in vitro.
Ao comparar a adesão dos dois tipos celulares (medula óssea de camundongos e
ligamento periodontal de ratos) sobre as mesmas superfícies (plástico, titânio polido e titânio
tratado), nenhuma diferença estatística foi encontrada, o que mostra a semelhança no
comportamento entre os tipos de células analisados in vitro.
De uma forma geral, as CTM podem ser expandidas in vitro, seja numa placa de
cultura ou em algum arcabouço, ou podem ser injetadas diretamente no local da lesão. O
crescente número de trabalhos na área da engenharia de tecidos mostra que a associação de
CTM com biomateriais osteoindutores parece ser uma técnica promissora no reparo do tecido
ósseo, porém ainda é muito cedo para se eleger o biomaterial mais indicado para esse tipo de
aplicação e a forma de tratamento dada a esse material (CANCEDDA, BIANCHI,
DERUBEIS, 2003).
De acordo com a literatura, o ligamento periodontal pode ser uma fonte autógena fácil
e eficiente de células mesenquimais indiferenciadas, com capacidade de expansão e
habilidade de se diferenciarem em células fibroblásticas, cementoblásticas e osteoblásticas. A
plausividade da engenharia tecidual baseada na utilização de células-tronco na regeneração
periodontal é suportada por estudos em animais mostrando que as células do ligamento
periodontal cultivadas in vitro podem ser reimplantadas com sucesso em defeitos periodontais
promovendo a regeneração periodontal (ISAKA et al., 2001; HASEGAWA et al., 2005,
IVANOVSKI et al., 2006; AKIZUKI et al., 2006).
Contudo, poucos estudos, dentre os quais Cochran et al. (1994) e Gay et al. (2007),
têm avaliado a capacidade de adesão de células do ligamento periodontal sobre as superfícies
de biomateriais, tais como o titânio, bastante usado em implantodontia. Este contexto reflete a
importância do presente trabalho, onde através do qual foi observado que estas células do
ligamento periodontal também são capazes de se aderirem ao biomaterial, o que traz novas
perspectivas na terapia de regeneração periodontal e na bioengenharia em periodontia e
implantodontia.
Novas pesquisas são necessárias, pois apesar de bastante evidente o papel crucial que
as células do ligamento desempenham na formação e no reparo do periodonto in vivo, o exato
mecanismo pelo o qual as células-tronco mesenquimais agem ainda permaneça obscuro.
Estudos posteriores avaliando a capacidade de proliferação e diferenciação destes tipos
celulares em contato com o biomaterial poderão contribuir para a compreensão do processo de
osseointegração, ou mesmo estudos moleculares para avaliar os tipos de ligações envolvidos
na adesão, poderão ser importantes para esclarecer o mecanismo pelo qual cada tipo celular se
adere à diferentes superfícies.
7 CONCLUSÕES
• Os resultados mostraram que a adesão de células mesenquimais de camundongos e do
ligamento periodontal de ratos em discos de titânio foram similares àqueles na
superfície plástica de cultura, podendo-se concluir que o titânio apresenta-se como um
bom material para o uso no reparo e regeneração na engenharia de tecidual.
• O tratamento com nitretação iônica por configuração de gaiola catódica foi efetivo
para a adesão de células mesenquimais da medula óssea de camundongos. Contudo,
esta forma de tratamento de superfície não apresentou benefício à adesão das células
do ligamento periodontal de ratos ao titânio.
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APÊNDICE
Resultados da análise de superfície
Composição de camada
A composição da camada superficial avaliada pela difração de raios-x revelou a incorporação
de nitreto de titânio no grupo gaiola e a fase formada foi preferencialmente de TiN.
Textura superficial
Uma amostra de cada grupo foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
com a finalidade de observar a textura da superfície após o tratamento. Os dois grupos
apresentaram texturas de superfície distintas, embora o tratamento por gaiola catódica tenha
criado micro-granulações uniformemente distribuídas pelo disco.
Rugosidade
As medidas de rugosidade foram obtidas por profilômetro de contato. Os valores estão
demonstrados na tabela (x). As medidas de rugosidade foram feitas considerando-se quatro
direções diferentes da amostra variando-se os ângulos de medida em 45º em uma mesma
imagem. Os valores de rugosidade representam a média das quatro medidas.
Tabela 13 -Valores de rugosidade média (Ra) obtidas por profilômetro
Tratamento
amostra Ra
polido
1 0.04
polido
1 0.04
polido
1 0.04
polido
1 0.04
polido
1 0.04
polido
1 0.04
gaiola
3 0.04
gaiola
3 0.11
gaiola
3 0.09
gaiola
3 0.07
gaiola
3 0.13
gaiola
3 0.08
Molhabilidade
Tabela 14 – Valores da média e desvio padrão de molhabilidade
1 Hora 1 Dia
Liso
13.93
0.594
53.045
1.8
Gaiola
9.85
0.335
28.058
1.549
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