( PDF ) Genética populacional do peixe-boi da amazônia, Trichechus inunguis natterer, 1883 (Mammalia, sirenia) na amazônia brasileira: implicações para sua conservação

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

TROPICAL E RECURSOS NATURAIS

GENÉTICA POPULACIONAL DO PEIXE-BOI DA AMAZÔNIA, Trichechus

inunguis NATTERER, 1883 (MAMMALIA, SIRENIA) NA AMAZÔNIA

BRASILEIRA: IMPLICAÇÕES PARA SUA CONSERVAÇÃO.

ANDRÉA MARTINS CANTANHEDE

Manaus-Amazonas

Julho, 2008

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ANDRÉA MARTINS CANTANHEDE

GENÉTICA POPULACIONAL DO PEIXE-BOI DA AMAZÔNIA, Trichechus

inunguis NATTERER, 1883 (MAMMALIA, SIRENIA) NA AMAZÔNIA

BRASILEIRA: IMPLICAÇÕES PARA SUA CONSERVAÇÃO.

Orientadora: Dra. Izeni Pires Farias

Co-orientadora: Dra. Vera Maria Ferreira da Silva

Tese apresentada ao PIPG-

BTRN como parte dos

requisitos para obtenção do

título de doutor em Ciências

Biológicas, área de

concentração em Genética,

Conservação e Biologia

Evolutiva.

Manaus, Amazonas

Julho, 2008

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iii

FICHA CATALOGRÁFICA

C357

Cantanhede, Andréa Martins

Genética populacional do peixe-boi da Amazônia, Trichechus

inunguis Natterer, 1883 (Mammalia: Sirenia) na Amazônia

Brasileira: implicações para sua conservação/Andréa Martins

Cantanhede.---Manaus : [s.n.], 2008.

xviii, 116f : il

Tese (doutorado) – INPA/UFAM, Manaus, 2008

Orientador: Izeni Pires Farias

Co-orientador: Vera Maria Ferreira da Silva

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva.

1. Peixe-boi - Amazônia 2. Populações 3. Marcadores

microssatélites. 4. Peixe-boi – Variabilidade genética. I. Título.

CDD 19. ed. 599.550415

Sinopse

Utilizou-se marcadores microssatélites para identificação da

paternidade dos filhotes de peixes-bois da Amazônia nascidos

em cativeiro, análise da diversidade genética populacional, e

investigação sobre eventos de hibridização entre as espécies de

peixes-bois do Brasil, no estuário do Rio Amazonas.

Palavras-chave:

Peixe-boi, paternidade, populações, hibridização, manejo in situ

e ex situ.

Dedico essa tese aos meus pais, Maria

do Rosário e Raimundo Nonato

Cantanhede, meus irmãos André

Rogério e Aurélio Luís, minha sobrinhas

Andressa, Andreyna e Amanda e ao

meu esposo Hádamo Andrade pelo

incentivo para realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

Muitas pessoas me apoiaram ao longo de todo o doutorado, aqui expresso

meus sinceros agradecimentos:

À Deus, a minha fonte de inspiração, por guiar meus caminhos;

Às minhas orientadoras Izeni e Vera, pelo apoio e incentivo absoluto,

pelas lições aprendidas, pela convivência harmoniosa, por contribuição na

minha formação pessoal e profissional, por tudo!!!!É muito bom trabalhar com

vocês;

Ao Tomas, pela grandeza e paciência ao transmitir seus

conhecimentos, pela ajuda nas análises estatísticas, por abraçar nosso

projeto trazendo sempre novas idéias para melhorar nosso trabalho;

Ao Dr. Fernando Rosas, pela amizade e pelas críticas e sugestões ao

trabalho;

À Dra. Maristerra Lemes por impulsionar as primeiras genotipagens, e

por toda contribuição e conselhos durante o desenvolvimento do projeto.

À Dr. Eliana Feldberg pelo incentivo e ajuda nas análises cariotípicas;

Ao Dr. Jorge Porto, sempre disposto a me receber e esclarecer minhas

dúvidas;

O veterinário Anselmo d’Affonseca e sua equipe (Raimundo, Marcelo,

Nazaré, Daniel e Jeová), que contribuíram nas coletas das amostras;

À Stella Maris, Márcia Picanço, e aos seus colaboradores tratadores

pelo apoio ao trabalho e ajuda nas coletas de tecido dos peixes-bois;

Meus companheiros do LMA: Nildon Ataíde, Nataly Castelblanco,

Daniela Fettuccia, Daniela Mello, Giovanna Dantas, Talita, Fermanda

Romagnoli, Paulinha Pink, Fernanda Rodrigues, Jone César, Leandro Ciotti,

Lousinha, Yara Camargo, Gália de Mattos, Márcia Munick, Roberta e aos

estagiários que por aqui estiveram. Vocês fizeram parte da minha “família”

em Manaus;

Aos companheiros do LEGAL, em especial ao Will pelas conversas

filosóficas; Cleiton e Adam sempre de alto astral; Yane e Rafa pelo “ombro

amigo”; Alexandre e Áureo pelas lições de perseverança; Cíntia, Carlota,

Concy e Themis por compartilhar dos momentos de desespero; Marina e

Jack pelas trocas de experiências; Abu, Nat, Daniel, Pedro, ...a turma do

LEGAL é gigante...

Aos colegas do Laboratório de Tecnologia de DNA do centro de apoio

multidisciplinar coordenado pelo Prof. Spartaco, pela colaboração, em

especial ao Jonson e a Dina pela ajuda no Mega Bace;

Aos colegas do LTBM do INPA: Kyara, Jackeline, Gisele, Naiara, que

me ajudaram na injeção das placas de genotipagem;

Ao IBAMA pela licença 003-06/CMA/IBAMA;

A Fábia Luna (IBAMA), Régis Lima (IBAMA), Jairo Moura (Bosque

Rodrigues Alves), Carla Aguilar (CNS), Luiza Lopes (IBAMA), Benoit Thoisy

(NGO KWATA - Guiana Francesa), Fernanda (FMA), Messias (MPEG), Paula

Soares (IBAMA) que me ajudaram na empreitada de conseguir amostras de

peixes-bois;

Ao Hádamo simplesmente por estar do meu lado, e trazer mais brilho a

minha vida!!!

Aos meus irmãos da “casa dos artistas” (Lauren, Guilherme-Massa,

Heitor) foi muito bom morar com vocês;

Aos meus amigos de sempre, Rominho, Day, Clara, Lane, Maisy,

Nívia, Rejane, Camilion, Jaqueline Carneiro;

A todos os professores do curso de Genética, conservação e biologia

evolutiva por terem contribuído na minha formação;

Ao INPA, pela oportunidade de conhecer a Amazônia;

A UFAM, pela disponibilidade na utilização de sua infra-estrutura,

através do Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL);

À CAPES pela bolsa que garantiu minha sobrevivência em Manaus

durante o doutorado;

Aos financiadores do meu projeto e da minha formação durante o

doutorado: CNPQ (PPG7-Genética, conservação e manejo da fauna aquática

da várzea Amazônica), IIEB/Fundação Moore (Programa BECA), FAPEAM

(Programa PAPE), WWF (Programa EFN);

À todos que contribuíram de alguma forma para realização deste

trabalho;

MUITO OBRIGADA!!!!!

Andréa Martins Cantanhede

vii

Sonho que se sonha só, é só um sonho que

se sonha só.

Sonho que se sonha junto é realidade!!!!!!

(Raul Seixas)

viii

RESUMO

O peixe boi da Amazônia, Trichechus inunguis, (o único sirênio

exclusivamente de água doce), possui distribuição restrita a Bacia do

Amazonas, onde é encontrado desde a Ilha de Marajó (Brasil) até as

cabeceiras do Rio Amazonas, na Colômbia, Peru e Equador. A captura

indiscriminada e em grande escala para o uso comercial foi, sem dúvida, a

principal razão da redução populacional dessa espécie na Amazônia, que

associada à baixa taxa reprodutiva, limita a habilidade desta espécie de se

restabelecer rapidamente. No Laboratório de Mamíferos Aquáticos (INPA,

Manaus-AM) e no Centro de Preservação e Pesquisa de Mamíferos

Aquáticos da Eletronorte (Balbina-AM) existem programas de conservação

“ex situ”, com o resgate e a reabilitação dos animais apreendidos devido a

caça ilegal, atividades de pesquisa e educação ambiental, reprodução em

cativeiro, além de projetos de reintrodução de peixes-bois na natureza. A

genética da conservação procura minimizar o risco da extinção por fatores

genéticos. Assim o conhecimento dos níveis e distribuição da variabilidade

genética é fundamental para o planejamento do manejo e conservação do

peixe-boi da Amazônia in situ e ex situ. O presente projeto tem objetivo de

realizar análise de paternidade dos filhotes de nascidos e criados cativeiro do

LMA-INPA e do CPPMA-Balbina; além de verificar o nível e a distribuição da

variabilidade genética das populações de peixe-boi da Amazônia, se existem

eventos de hibridização entre as espécies de peixe-boi que ocorrem no

Brasil, avaliando a contribuição genética de cada uma das espécies,

utilizando marcadores microssatélites. De posse dessas informações,

fornecer subsídios de fundamental importância para o estabelecimento de

eficientes estratégias de conservação e manejo dessa espécie. Para isso,

foram realizadas amplificações cruzadas de 20 loci microssatélites

desenvolvidos para Trichechus manatus em T. inunguis. Todos os loci se

apresentaram em equilíbrio de Hardy-Weinberg e os testes de desequilíbrio

de ligação não foram significativos para os pares de loci em cada população,

após a correção de Bonferroni. Os níveis de diversidade genética encontrada

para a espécie amazônica de peixe-boi foi relativamente maior comparada

com os outros sirênios. Os elevados níveis de polimorfismos dos loci

utilizados neste trabalho permitiram obter sucesso na identificação da

paternidade dos filhotes de peixe-boi da Amazônia nascidos em cativeiro. A

probabilidade de acerto de 99,83% para o filhote erê; 81,38% para o tuã,

90,21% para o filhote natimorto, 90,21% para o filhote kinjá e 97,84% para o

filhote inaê. Para os indivíduos do CPPMA/Balbina, a probabilidade de acerto

foi 94,98% para filha prematura da miri, 98,38% para morena e 97,09% para

uatumã. Nas análises populacionais observou-se a não existência de

estrutura genética nas populações amostradas (F

– 0,00205, p = 1). Os

valores de M variaram de 21,902 a infinito, confirmando o alto nível de fluxo

gênico entre as populações. Além disso, nossos testes indicaram que as

populações não apresentam sinais dos efeitos de um gargalo populacional

recente. Obviamente, existe a possibilidade de que o peixe-boi da Amazônia

tenha sofrido uma redução populacional devido a grande exploração

comercial sofrida pela espécie durante as décadas de 30 a 50, porém por

terem um longo período de vida e tempo de geração, os efeitos dessa

redução não foram detectados no ponto de vista genético. Com os resultados

obtidos no programa STRUCTURE, foi possível observar duas “populações”

bem diferentes geneticamente, que representam as espécies T. inunguis e T.

manatus. Porém, os indivíduos Para_100, Para_b13 e Para_domn rejeitam a

hipótese que eles pertençam de fato a sua espécie correspondente, ou seja,

são indivíduos híbridos. Esses indivíduos são provenientes do estuário

amazônico, região de simpatria entre as duas espécies que ocorrem no

Brasil, onde Domning (1981) já havia sugerido existir uma possível zona de

hibridização entre as espécies. O programa BayesAss+ usa aproximação

bayesiana para calcular taxas recentes de imigração entre populações com

base nos genótipos multilocos individuais. Similar ao programa

STRUCTURE, o programa BayesAss+ indicou que certos indivíduos não

pertencem as suas supostas espécies. Tanto as análises no programa

Isolamento com migração (IMa) como as análises no MIGRATE confirmam a

presença de fluxo gênico entre T. manatus e T. inunguis indicando que este

seria o principal sentido da introgressão. As análises do MIGRATE revelam

que a população do “Pará” de T. inunguis recebe maior número de migrantes

do peixe-boi marinho (Nm=5,0045), enquanto o fluxo gênico de T. manatus e

T. inunguis foi menor (Nm=2,3395). As análises no IMa confirmam a

presença de fluxo gênico significantemente diferente de zero entre T.

inunguis e T. manatus e que existe claramente uma diferença na direção do

fluxo gênico com Nm=7,4779 de T. manatus para T. inunguis, vs Nm=1,7188

de T. inunguis para T. manatus, confirmando os resultados da taxa de

migração obtidos no MIGRATE. Essas análises indicaram claramente o

contínuo, porém desigual fluxo gênico entre T. manatus e T. inunguis

indicando que este seria o principal sentido da introgressão.

ABSTRACT

The Amazonian manatee, Trichechus inunguis, (the only exclusively fresh

water sirenian), possesses restricted distribution in the Amazonian region

where it is found from the Marajó Bay (Brazil) all the way to Colombia, Peru

and Equator. The indiscriminate large scale capture for commercial use was

the main reason of population reduction in the Amazon that associated

together with low reproductive rate limits a potential of a quick recovery of this

species. The Aquatic Mammal Laboratory (LMA-INPA, Manaus-AM) and the

Center of Preservation and Research of Aquatic Mammals of Eletronorte

(CPPMA-Balbina-AM) undertake "ex situ" conservation programs which focus

on the rescue and rehabilitation of animals seized from poachers, research

activities and environmental education, reproduction in captivity, and also

reintroductions of Amazonian manatees into the wild. Conservation genetics

aim to minimize extinction risk caused by genetic factors. Thus the knowledge

of the levels and distribution of the genetic variability is fundamental for the

planning of in situ and ex situ management and conservation strategies for

the Amazonian manatee. Using microssatélites markers, the goal of the

present project is to analyse paternity of animals born and raised in captivity

at LMA-INPA and CPPMA-Balbina, as well as to verify the level and the

distribution of the genetic variability of the Amazonian manatee, to confirm if

hybridization events exists between the two manatees species that occur in

Brazil, evaluating the genetic contribution of each species and to find in which

direction the hybridization events occur; and with this information provide

subsidies of fundamental importance for the establishment of efficient

conservation strategies and management of this species. With this goal in

mind, 20 microssatellite loci originally developed for Trichechus manatus were

utilized in T. inunguis. All of the loci were in Hardy-Weinberg equilibrium and

the tests of linkage disequilibrium were not significant for any pair of loci within

each population. The levels of genetic diversity found for the Amazonian

manatee was relatively large when compared with the other sirenians. The

high level of polymorphism of the loci used in this study allowed for the

successful paternity identification of the Amazonian manatee offsprings born

in captivity. The probability of success were 99,83% for the calf erê; 81,38%

for tuã, 90,21% for a stillborn calf, 90,21% for kinjá and 97,84% for inaê. At

CPPMA/Balbina, the probability of success was 94,98% to a premature calf of

miri, 98,38% for morena and 97,09% for uatumã. In the population analyses it

was observed that no genetic structure exist among the regions sampled (F

- 0,00205, p = 1,0). The values of M (absolute number of migrants) varied

from 21,902 to infinite, confirming the high level of gene flow among the

regions and that these populations do not present signs of the effects of a

recent population bottleneck. It seems obvious that the Amazonian manatee

has suffered a population reduction due to great commercial exploration

during the 1930’s to 1950’s, however most likely since these animals have a

long life span and generation time, the effects of that reduction were not

detected genetically. With the results obtained with the program

STRUCTURE, it was possible to observe two very different "populations",

representing the species T. inunguis and T. manatus. However, the

individuals Para_100, Para_b13 and Para_domn reject the hypothesis of

belonging to their corresponding species, in other words, they are hybrid

individuals. Those individuals are from of the Amazonian estuary, an area of

sympatry of the two species, and where Domning (1980) had already

suggested the existence of a possible hybridization area for the species. The

program BayesAss+ uses a Bayesian population assignment approach to

estimate rates of recent immigration events between populations from

individual multilocus genotypes. Similar to the program STRUCTURE, the

program BayesAss+ indicated that certain individuals do not belong to their

supposed species. Further analyses in the programs IMa and MIGRATE

further confirm the existence of ongoing geneflow between T. manatus and T.

inunguis indicating that this would be the main direction of the introgression.

The MIGRATE analyses confirmed the presence of gene flow between T.

inunguis and T. manatus, with the “Pará” population of T. inunguis receiving

high number of migrants of the marine manatee (Nm=5,0045), while geneflow

in the direction from T. manatus to T. inunguis was lower (Nm=2,3395).

Analyses in the isolation with migration program IMa confirmed the presence

of gene flow significantly different zero between T. inunguis and T. manatus

and existence of clear difference in the direction of gene flow with Nm=7,4779

from T. manatus to T. inunguis vs. Nm=1,7188 from T. inunguis to T.

manatus. These analyses clearly indicated ongoing but unequal geneflow

between T. manatus and T. inunguis indicating the main direction of

introgression.

xii

Lista de Tabelas

Capítulo 1

Tabela 01: Descrição dos vinte primers microssatélites desenvolvidos

por Garcia-Rodriguez et al. (2000) e Pause et al. (2007)*, utilizados na

caracterização genética de Trichechus inunguis.

Tabela 02: Perfil da termociclagem para amplificação via PCR dos

primers marcados com fluorescência.

Tabela 03: Perfil da termociclagem para amplificação via PCR dos

primers com cauda M13 (-21) utilizando o protocolo econômico de

Schuelke (2000).

Tabela 04: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites

desenvolvidos originalmente para T. manatus e utilizados neste

trabalho para 19 indivíduos de peixe-boi da Amazônia, Trichechus

inunguis.

Tabela 05: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites

utilizados neste trabalho para 8 indivíduos de peixe-boi marinho

Trichechus manatus do Brasil.

Capítulo 2

Tabela 01: Animais amostrados para análise de paternidade dos

filhotes nascidos em cativeiro no LMA/INPA.

Tabela 02 - Animais amostrados para análise de paternidade dos

filhotes nascidos em cativeiro no CPPMA.

Tabela 03: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites

utilizados neste trabalho para 12 indivíduos de peixe-boi da Amazônia,

Trichechus inunguis, criados em cativeiro do LMA/INPA, cuja

determinação da paternidade está sendo investigada.

Tabela 04: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites

utilizados neste trabalho para 13 indivíduos de peixe-boi da Amazônia,

Trichechus inunguis, criados em cativeiro do CPPMA/Balbina, cuja

determinação da paternidade está sendo investigada.

Tabela 05 - Análise de exclusão de paternidade de três filhotes de

peixe-boi da Amazônia, T. inunguis, nascidos em cativeiro no

LMA/INPA, com base no cálculo da probabilidade de corretamente

identificar, entre os pais potenciais, o pai verdadeiro. Os valores na

tabela correspondem às probabilidades (p) calculadas segundo o

programa PARENTE (Cercueil et al., 2002).

xiii

Tabela 06 - Análise de exclusão de paternidade de três filhotes de

peixe-boi da Amazônia, T. inunguis, nascidos em cativeiro no

CPPMA/Balbina, com base no cálculo da probabilidade de

corretamente identificar, entre os pais potenciais, o pai verdadeiro. Os

valores na tabela correspondem às probabilidades (p) calculadas

segundo o programa PARENTE (Cercueil et al., 2002).

Capítulo 3

Tabela 01: Diversidade alélica, indicada pelo número de alelos em

peixe-boi da Amazônia (T. inunguis) obtidos no presente trabalho,

comparado com Trichechus manatus latirostris, Trichechus manatus

manatus e Dugong dugon (Garcia-Rodriguez et al., 1998, McDonald,

2005 e Pause et al., 2007). Os valores entre parênteses representam o

número de amostras analisadas.

Tabela 02: Número de alelos (A), Heterozigosidade observada (Ho) e

esperada (He) por loco por população e a probabilidade dos desvios

das proporções de Hardy-Weinberg (Ho e He) para cada população de

T. inunguis analisada.

Tabela 03: Diversidade genética das populações de peixe-boi da

Amazônia representada pela média: do número de alelos (A), da

Heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) e coeficiente de

endogamia (F

Tabela 04: Análise de variância molecular (AMOVA) para as amostras

de peixe-boi da Amazônia (Trichechus inunguis) provenientes das 9

áreas estudadas.

Tabela 05: Matriz de divergência (F

– diagonal abaixo) e fluxo gênico

[M (número absoluto de migrantes por geração), – diagonal acima]

analisado entre os pares de populações de peixe-boi da Amazônia

(Trichechus inunguis).

Tabela 06: Probabilidades para excesso de heterozigotos dos testes de

Wilcoxon calculadas a partir dos modelos IAM, TPM e SMM de

evolução molecular dos marcadores microssatélites para cada

população estudada.

Capítulo 4

Tabela 01: Número de alelos (A), Heterozigosidade observada (Ho) e

esperada (He) e a probabilidade dos desvios das proporções de Hardy-

Weinberg encontrados para os 19 indivíduos analisados Trichechus

manatus.

Tabela 02: Análise de variância molecular (AMOVA) para as amostras

de peixe-boi da Amazônia (Trichechus inunguis) e para o peixe-boi

marinho (Trichechus manatus).

xiv

Tabela 03: Valores de F

– diagonal abaixo e M, número de migrantes

por geração - diagonal acima, entre T. inunguis e T. manatus.

Tabela 04: Caracterização genética dos indivíduos híbridos detectados

pelo programa STRUCTURE. O valor de p refere-se ao teste da

hipótese dos indivíduos serem híbridos.

100

Tabela 05: Valores das probabilidades que indicam quantas gerações

atrás ocorreram os eventos de hibridização obtidos no STRUCTURE.

102

Tabela 06: Probabilidade de indivíduos pertencerem a sua “população”

original estimada pelo programa BayesAss+ para as duas espécies de

peixes-bois, T. inunguis e T. manatus.

102

Tabela 7: Estimativa de fluxo gênico (Nm) unidirecional entre as

populações de peixe-boi da Amazônia amostradas calculadas pelo

programa MIGRATE. Ln(L)= -2911,98

106

Lista de Figuras

______________________________________________________________

Introdução

Figura 01: Resultado de um único dia de caçada de peixe-boi no Lago

Ayapuá, Rio Purus, 1940 (foto: anônima) (Best, 1984b).

Figura 02: Peixe-boi da Amazônia (Trichechus inunguis).

Figura 03: Cladograma mostrando as relações dos sirênios e seus

grupos relacionados. † = taxa extinto (Berta et al., 2006).

Figura 04: Interações entre efeitos demográficos e genéticos da perda

de habitat e isolamento que podem provocar um aumento na

probabilidade de extinção. Modificado de Soulé & Millis (1998).

Capítulo 1

Figura 01: Esquema de amplificação para uma única reação em um

tubo para este método econômico de PCR. (A,B) As caixas com

hachuras indicam os primers de microssatélites específicos, (C) A

caixa cinza ondulada a seqüência do primer universal M13(-21), e a

estrela é a florescência FAM. (D) Nos primeiros ciclos de PCR, o

primer forward contendo a cauda M13(-21) é incorporado nos produtos

de PCR. (E) Estes produtos são marcados com fluorescência FAM do

primer universal M13(-21) que é incorporado durante ciclos

subseqüentes a uma temperatura mais baixa de 53°C. (F) O produto

final marcado pode ser analisado em um sistema de detecção a laser.

Modificado de Schuelke, 2000

Capítulo 2

Figura 01: Distribuição de T. inunguis (Rosas, 1994).

Figura 02: Ilustração do momento da cópula dos peixes-bois

(www.seaworld.org/infobooks/ Manatee/reproman.html).

Figura 03: Parque aquático Robin Best no LMA-INPA (foto: Fernando

Rosas).

Figura 04: Heredrograma mostrando o relacionamento dos animais do

LMA/INPA nascidos no cativeiro.

Figura 05: Heredrograma mostrando o relacionamento dos animais do

CPPMA-Balbina nascidos no cativeiro.

Capítulo 3

Figura 01: Procedência das amostras de Trichechus inunguis

analisadas (modificado de Fantin, 2008). Onde, 1-Amazonas; 2-

Solimões-Amazonas; 3-Solimões; 4-Japurá; 5-Madeira; 6-Negro; 7-

Purus; 8-Tapajós; 9-Estuário amazônico “Pará”.

xvi

Figura 02: Gráfico de barras gerado pelo programa STRUCTURE.

Cada coluna (linha vertical) representa um indivíduo. Cada cor

representa grupos diferentes e a proporção das cores em uma coluna

representa a probabilidade que a amostra pertence a mesma

população.

Capítulo 4

Figura 01: Modelo Isolamento com Migração (IM). Os termos

demográficos são tamanho efetivo populacional (N1, N2 e Na), taxa de

fluxo gênico (m1 e m2), e tempo de divergência populacional (t). Os

parâmetros têm o balanço de uma taxa de mutação neutra (µ)

utilizando um melhor modelo de mutação que se ajusta ao banco de

dados. Os parâmetros de migração são identificados pela fonte de

migrante há um tempo atrás na coalescência, ou seja, a taxa de

migração da população 1 para população 2 (m1) atualmente

corresponde ao movimento de genes da população 2 para 1 com

movimentos um tempo adiante.

Figura 02: Gráfico de barras gerado pelo programa STRUCTURE.

Cada coluna (linha vertical) representa um indivíduo. Cada cor

representa grupos diferentes ou espécies e a proporção das cores em

uma coluna representa a probabilidade que a amostra pertence à

espécie.

Figura 03: Probabilidade para cada parâmetro está descrito em: A)

Tamanho efetivo populacional de T. inunguis; B) Tamanho efetivo

populacional de T. manatus; C) Tamanho efetivo populacional da

população ancestral de T. inunguis e T. manatus.; D) Taxa de

migração de T. inunguis para T. manatus (em número de indivíduos

por geração); E) Taxa de migração de T. manatus para T. inunguis

(em número de indivíduos por geração); F) Tempo de divergência em

anos entre T. manatus e T. inunguis.

107

xvii

SUMÁRIO

Agradecimentos

Resumo

viii

Abstract

Lista de Tabelas

xii

Lista de Figuras

1 INTRODUÇÃO GERAL 19

1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 22

1.2.1. O peixe-boi da Amazônia, Trichechus inunguis

1.2.2. A Ordem Sirenia 24

1.2.3. Estrutura populacional e fluxo gênico 27

1.2.4. Hibridização 29

1.2.5. Genética e conservação 32

1.3 OBJETIVOS

Capítulo 1: Caracterização dos loci microssatélites transferidos

de Trichechus manatus para T. inunguis

2.1 INTRODUÇÃO 36

2.2 MATERIAL E MÉTODOS 38

2.2.1 Coleta das amostras 38

2.2.2 Extração de DNA 38

2.2.3 Digestão 38

2.2.4 Purificação 38

2.2.5 Quantificação do DNA 39

2.2.6 Amplificação in vitro-PCR

2.2.7 Genotipagem 45

2.2.8 Caracterização dos vinte loci microssatélites

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Capítulo 2: Identificação da paternidade dos filhotes de peixe-boi

da Amazônia nascidos em cativeiro

3.1 INTRODUÇÃO 52

3.3 MATERIAL E MÉTODOS 59

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Capítulo 3: Análise da diversidade genética populacional do

peixe-boi da Amazônia

4.1 INTRODUÇÃO 69

4.3 MATERIAL E MÉTODOS 71

4.3.1 Coleta das amostras 71

4.3.2 Análise estatística populacional 72

4.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 75

xviii

4.4.1 Diversidade genética dos 20 loci microssatélites transferidos de

T. manatus para T. inunguis

4.4.2 Diversidade genética entre e dentro das populações de peixe-boi

da Amazônia

4.4.3 Distribuição da variabilidade genética e fluxo gênico entre as

populações de T. inunguis

4.4.4 Identificação de gargalo populacional recente

Capítulo 4: Avaliação de eventos de hibridização entre Trichechus

manatus e T. inunguis no estuário amazônico

5.1 INTRODUÇÃO 89

5.3 MATERIAL E MÉTODOS 91

5.3.1 Coleta das amostras 91

5.3.2 Análises estatísticas inter-específicas 92

5.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 95

5.4.1 Análise inter-específica: T. inunguis X T. manatus

6. CONCLUSÃO

108

7. PERSPECTIVAS

110

8. REFERÊNCIAS BIBIIOGRÁFICAS

111

1 INTRODUÇÃO GERAL

O peixe boi da Amazônia, Trichechus inunguis, mamífero aquático

herbívoro, o único sirênio exclusivamente de água doce, possui distribuição

restrita a bacia amazônica, onde se distribui por todos os principais afluentes,

desde as cabeceiras dos rios da bacia Amazônica no Peru, Colômbia e

Equador, até a sua foz (Best, 1984a). Ocorre nos três tipos de água (Sioli,

1984) existentes na Bacia Amazônica.

Os primeiros registros sobre a exploração dos peixes-bois amazônicos

datam de 1542, sendo antes disso, eram utilizados como alimento pelos índios.

Porém, com o advento da indústria do couro, entre 1935-54 a espécie começou

a ser intensivamente caçada, (Figura 01). Nesse período, cerca de 4000-7000

peixes-bois eram mortos por ano para serem usados na fabricação de correias

de máquinas, polias e mangueiras, e para obtenção de óleo e carne (Domning,

1982a; Best, 1984b).

Embora protegido oficialmente no Brasil como espécie em perigo de

extinção desde 1967 (Lei de proteção da fauna, nº 5.197) ainda sofre com a

caça comercial ilegal e de subsistência que ocorre em toda Amazônia (Colares,

1991; Rosas, 1994; Rosas & Pimentel, 2001; IBAMA, 2003).

Figura 01: Resultado de um único dia de caçada de peixe-boi no Lago

Ayapuá, Rio Purus, 1940 (foto: anônima) (Best, 1984b).

Esta espécie apresenta um comportamento bastante discreto tornando

difícil a sua observação em seu ambiente natural. A turbidez dos rios da região

aumenta essa dificuldade, impedindo a sua observação direta e a contagem

dos indivíduos (Rosas, 1994). Assim, diferentes técnicas e metodologias

devem ser desenvolvidas e aplicadas nos estudos dessa espécie, assim como

o aproveitamento de programas de cativeiro para promover o conhecimento

biológico que auxiliem na conservação do peixe-boi da Amazônia.

As técnicas de genética da conservação podem ser aplicadas com o

intuito de diminuir o risco de extinção de uma espécie por fatores genéticos;

minimizando a endogamia e a baixa diversidade genética; identificando

populações, resolvendo a estrutura populacional, esclarecendo incertezas

taxonômicas, definindo unidades de manejo de espécies; detectando

hibridizações; definindo áreas para reintrodução; selecionando os melhores

indivíduos para reintrodução; na identificação forense usando análise genética

e para entender a biologia da espécie, especialmente o padrão de

acasalamento e sistema reprodutivo (Frankham et al., 2003).

Na foz do rio Amazonas coexistem as duas espécies de peixes-bois do

Brasil: T. inunguis e T. manatus. Domning (1980) levantou a possibilidade da

existência de híbridos nessa região. Garcia-Rodrigues et al. (1998) com base

em estudos moleculares, sugeriram a ocorrência de hibridização entre as

duas espécies de peixes-bois nessa região. Já os resultados de Cantanhede

et al. (2005) indicam que provavelmente as linhagens de DNA mitocondrial

das duas espécies de peixes-bois, ainda não se separaram completamente,

sugerindo a manutenção de um polimorfismo ancestral, apesar de não

descartar a possibilidade de hibridização.

A detecção de hibridização pode ser difícil, embora agora facilitada

com aplicações de técnicas moleculares nas últimas duas décadas (Rhymer

& Simberloff, 1996). Dados moleculares são coletados com relativa facilidade,

interpretar os significados evolutivos da hibridização e determinar o papel das

populações híbridas dentro do desenvolvimento das estratégias de

conservação é mais difícil e muitas vezes incompreendido (Allendorf et al.,

2001).

Determinar qual desses processos pode estar ocorrendo com os

peixes-bois na foz do Rio Amazonas torna-se um fator importante para a

conservação das espécies de peixes-bois do Brasil.

Dentre os marcadores moleculares existentes, os microssatélites têm

sido um dos mais utilizados para medir a diversidade genética, pois se

mostram altamente polimórficos em mamíferos (Litt & Luty, 1989). E por

serem altamente variáveis e multi-alélicos, os marcadores microssatélites são

especialmente úteis para inferir eventos demográficos recentes, inclusive

para verificar impactos humano-induzidos em populações.

Locos com muitos alelos, como os loci microssatélites, têm capacidade

de detectar e descrever diferenças genéticas entre populações (Hedrick,

1999). Dessa forma, é fundamental estudar o quanto essas variações

genéticas são significantes biologicamente e evolutivamente.

Microssatélites são sucessões de simples mono-, di-, tri-

tetranucleotídeos repetidas em “tandem” que são principalmente polimórficos

em comprimento devido a erros gerados durante a replicação do DNA e

ocorrem como elementos extremamente repetitivos dispersados nos

genomas dos eucariotos. A taxa de mutação nestas seqüências repetitivas é,

em geral, 10 a 100 vezes maior do que a de outras regiões do genoma,

fazendo com que sejam consideradas, portanto, seqüências de alta taxa

evolutiva (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Existem basicamente dois modelos que podem explicar as elevadas

taxas de mutação nos microssatélites: crossing-over desigual entre as

moléculas de DNA, resultado da recombinação entre cromossomos

homólogos que não foram alinhados corretamente e o mecanismo do

slippage durante a replicação do DNA (Goldstein & Schlötterer, 1999).

Mutações em loci microssatélites geralmente envolvem mudança no

tamanho de uma repetição, mas algumas vezes as mutações envolvem as

unidades repetitivas. Existem vários métodos teóricos e empíricos

empregados para estudar a dinâmica evolutiva dos microssatélites (Freimer e

Slatkin, 1996 apud Goldstein & Schlötterer, 1999), e o que tem se percebido

é que os processos de mutacionais de microssatélites podem ser muito mais

complexo que se imaginava.

Classicamente, dois modelos mutacionais têm sido considerados: IAM

(infinite allele model ou modelo dos alelos infinitos, Kimura & Crow, 1964)

onde a mutação envolve número de repetição e sempre resulta em alelo não

previamente encontrado na população, ou seja, cria um novo alelo; e o SMM

(stepwise mutation model ou modelo de mutação passo a passo, Kimura &

Ohta, 1978) que descreve as mutações dos alelos de microssatélites por

perda ou ganho de uma única repetição em tandem. Mais recentemente, Di

Rienzo et al. (1994), introduziram o TPM (two phase model ou modelo de

mutação em duas fases), onde as mutações introduzem ganho ou perda de

“x” repetições. Esses modelos teóricos que representam o processo evolutivo

dos microssatélites são utilizados para obter melhores estimativas de

diferenciação populacional e parâmetros demográficos (Goldstein &

Schlötterer, 1999).

A variabilidade alélica em locos de microssatélite é bastante alta

(geralmente 5 a 10 alelos que segregam dentro de uma população de forma

Mendeliana) e pode ser usado como um marcador genético para: solucionar

relação genética entre populações proximamente relacionadas, como

também na paternidade e sucesso reprodutivo, análise de genealogia,

comportamento reprodutivo, níveis de endocruzamento, tamanho efetivo da

população, fluxo gênico local e análise forense (Frankham et al., 2003).

O presente estudo propõe-se a realizar análise de paternidade dos

animais gerados, nascidos e criados em cativeiro do Laboratório de

Mamíferos Aquáticos (LMA-INPA) e do Centro de Preservação e Pesquisa

Mamíferos Aquáticos da Eletronorte (CPPMA-Balbina), além de verificar o

nível e a distribuição da variabilidade genética do peixe-boi da Amazônia, e

confirmar se existem eventos de hibridização entre as espécies de peixe-boi

que ocorrem no Brasil, avaliando a contribuição genética de cada uma das

espécies e conhecer qual a direção dos eventos de hibridização, utilizando

marcadores microssatélites. Os resultados desse estudo fornecerão

subsídios de fundamental importância para o estabelecimento de eficientes

estratégias de conservação e manejo dessa espécie.

1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.2.1. O peixe-boi da Amazônia, Trichechus inunguis

O peixe boi da Amazônia, T. inunguis, (o único sirênio exclusivamente

de água doce), possui distribuição restrita aos rios da região amazônica,

onde é encontrado desde a Ilha de Marajó (Brasil) até as cabeceiras dos rios

da bacia amazônica, na Colômbia, Peru e Equador (Domning, 1981; Best,

1984a; Rosas, 1994). A espécie tem sido encontrada nos principais

tributários do Rio Amazonas como no baixo Tocantins (abaixo das

cachoeiras); rios Tapajós; Nhamundá; Madeira; Negro; Xeruni; Branco e

Purus entre outros. Também tem sido encontrado no rio Tacutu (Roraima) e

nos rios Essequibo e Rupununni, Guiana. Na Colômbia, nos rios Amazonas,

Putumayo, Caquetá (Japurá no Brasil) e baixo Apaporis. No Peru, já foi

observado nos rios Napo, Tigre, Marañon, Pastaza, Samiria, Pacaya, Ucayali

e Huallago. Não se tem registro de peixe-boi amazônico no rio Madre de Dios

na Bolívia (Husar, 1977), embora a presença T. inunguis no rio Orinoco tenha

sido sugerida (Husar, 1977), ainda não existem registros (Best & da Silva,

1983), há apenas registros de T. manatus.

Sua ocorrência está preferencialmente associada a ambientes de

águas calmas e/ou lagos com vegetação aquática (Best, 1984a). Esta

espécie se diferencia dos demais peixes-bois por não apresentar unhas (há

normalmente três ou quatro nas nadadeiras peitorais dos demais peixes-bois)

(Caldwell & Caldwell, 1985); pela diminuição e maior complexidade dos

molares e pelo supraocciptal espesso (Domning & Hayeck, 1986). São

menores tanto no tamanho corporal quanto no peso; o tamanho máximo

alcançado por esta espécie é cerca de 3 m de comprimento, com 300 a 350

kg de peso. Possui coloração mais escura, variando de cinza-escuro a quase

negro, com manchas claras na região ventral (Figura 02) (Ayres & Best,

1979; Best & Silva, 1979 Caldwell & Caldwell, 1985; Rosas, 1991).

(Foto: Doug Perrine)

Figura 02: Peixe-boi da Amazônia (Trichechus inunguis).

Não se tem informação sobre tamanho de grupo e estrutura social do

peixe-boi da Amazônia. São considerados animais relativamente solitários, cuja

estrutura social mais duradoura é entre mãe e filhote, que pode durar mais de

dois anos (Best, 1982; da Silva et al., 2000). Agregações temporárias podem

ocorrer durante o período reprodutivo e durante a estação seca (Best, 1982).

Na seca, os peixes-bois ficam restritos a lagos ou canais mais profundos do rio

(poços) (Best, 1982; Best, 1983; Junk & da Silva, 1997).

De acordo com o ciclo sazonal do sistema de drenagem do Rio

Amazonas, os peixes-bois amazônicos movimentam-se entre lagos e rio.

Durante a cheia dispersam-se na várzea, onde existe maior disponibilidade

de alimento (Best, 1983). A cópula e os nascimentos em sua maioria ocorrem

nesse período, e a gestação dura cerca de 12 meses (Nascimento et al.,

2003). Essa sincronia permite a fêmea recuperar as condições fisiológicas do

final da gestação e início da lactação (Rosas, 1994).

1.2.2. A Ordem Sirenia

Os sirênios representam uma das quatro ordens de mamíferos

agrupadas como “subungulados” (tendo como ancestral comum um ungulado

primitivo). Esta ordem é relacionada filogeneticamente com as ordens

Desmostylia (mamíferos herbívoros extintos), Embrithopoda (ordem de

mamíferos extintos parentes dos proboscídeos), e os demais subungulados,

Tubulidentata (aadwarks), Proboscidea (elefantes) e Hyracoidea (hyrax)

(Domning, 2001).

Os sirênios, proboscídeos, e o taxa extinto desmostilianos são

reconhecidos como um clado denominado de Tethytheria. Dados moleculares

e morfológicos incluem os hiracóides nesse grupo monofilético (Figura 03).

A ancestralidade comum entre proboscídeos, sirênios e hyraxes foi

sugerida pela análise das seqüências de aminoácidos da proteína α A do

cristalino dos olhos destes animais (de Jong & Zweers, 1980), por

características morfológicas (Novarek et al., 1988), pela comparação de

seqüência de aminoácidos (Miyamoto & Goodman, 1986) e por seqüências

nucleotídicas (Springer & Kirsch, 1993; Lavergne et al., 1996; de Jong, 1998;

Shoshani & McKenna, 1998).

Figura 03: Cladograma mostrando as relações dos sirênios e seus grupos

relacionados. † = taxa extinto (Berta et al., 2006).

A evolução da ordem Sirenia não é completamente entendida, mas

sabe-se que esta se originou no Velho Mundo (Eurásia e/ou África) (Reynolds

& Odell, 1991), por volta de 45 a 50 milhões de anos atrás, no médio Eoceno

(Domning, 2001). Mas a grande diversidade do grupo, provavelmente,

ocorreu durante o Mioceno (Domning, 1982c; 2001) e atualmente, existem

apenas 2 gêneros e 4 espécies.

A ordem Sirenia inclui duas famílias com espécies viventes:

Dugongidae, constituída por uma única espécie o Dugong dugon, e

Trichechidae com 3 espécies: Trichechus inunguis, T. manatus e T.

senegalensis.

O dugongo, Dugong dugon, ocorre no litoral tropical e subtropical do

Oceano Índico e oeste do Pacífico. O peixe-boi africano, T. senegalensis,

ocorre em habitats de água doce, estuário e regiões costeiras desde o

Senegal até a Angola, no oeste da África. O peixe-boi marinho, T. manatus,

distribui-se nos rios, estuários e áreas costeiras tropicais e subtropicais do

Oceano Atlântico, assim como em muitos rios da Flórida, nas Antilhas, leste

do México, América Central e nordeste e leste da América do Sul. Todas as

espécies de peixes-bois são consideradas ameaçadas de extinção pela IUCN

devido aos impactos negativos da pressão antrópica, principalmente por

super exploração e perda de habitat (IUCN, 2000).

Domning (1982b) especulou que o gênero Trichechus originou-se de

um outro gênero agora extinto, o Ribodon. Ambos são caracterizados por

molares supranumerários que são substituídos horizontalmente ao longo da

vida, caracterizando uma adaptação à alimentação de vegetação aquática e

sub-aquáticas.

Domning (1982b) sugere que o gênero Trichechus se originou em

lagunas salgadas ou de água doce, e estuários na América do Sul, e

ampliado sua distribuição ao longo da região caribenha seguida por

dispersão para a África Ocidental no final do Plioceno e início do Pleistoceno.

Porém, não existem sinapomorfias morfológicas que apóiam a hipótese da

relação dos taxa irmãos T. manatus e T. senegalenses (Domning, 1982b).

Este mesmo autor também sugere uma invasão da Bacia amazônica

ocidental no Plioceno e a diferenciação morfológica no T. inunguis moderno,

ocasionada pelo isolamento temporário de um ancestral de T. inunguis dentro

da Bacia amazônica ocidental devido a eventos orogênicos andinos. Esta

hipótese é apoiada por fragmentos ósseos fósseis do Pleistoceno de animais

morfologicamente semelhante a T. manatus achados no estado do Acre

(Bacia amazônica ocidental). T. inunguis exibe mais caracteres derivados do

que as outras espécies de peixes-bois (Domning, 1981; 1982b; 2001).

Análises filogenéticas recentes utilizando a região controle do DNA

mitocondrial (Cantanhede et al., 2005; Vianna et al., 2005) sugerem que T.

manatus seria parafilética, e análises utilizando citocromo b (Vianna et al.,

2005) confirmam que T. manatus e T. senegalensis são espécies derivadas

provavelmente de um mesmo ancestral marinho.

Duas subespécies de peixe-boi marinho foram propostas, separadas

por análise morfométrica dos caracteres craniais; o peixe-boi da Flórida

(Trichechus manatus latirostris), restrito a península da Flórida; e o peixe-boi

das Antilhas (Trichechus manatus manatus), distribuído nas Américas Central

e do Sul (Domning & Hayeck, 1986).

Entretanto essa divisão não coincide com as análises filogenéticas

intraespecífica com base em DNA mitocondrial, nas quais três linhagens

distintas foram encontradas correspondendo 1- ao grupo da Flórida e das

Antilhas; 2- Golfo do México e Caribe; 3- Costa Atlântica da América do Sul,

onde haplótipos de peixe-boi da Flórida ocorrem também nas Antilhas, como

por exemplo em peixes-bois marinhos provenientes de Porto Rico e da

Republica Dominicana, sugerindo que a população da Flórida teria se

originado por colonizadores dessa região (Garcia-Rodriguez et al., 1998).

Alguns estudos genéticos com o peixe-boi da Flórida (T. manatus

latirostris) foram realizados, utilizando eletroforese de proteínas

(McClenaghan & O'Shea, 1988) e DNA mitocondrial (Brandley et al., 1993;

Garcia-Rodriguez et al., 1998), e verificaram níveis baixos de diferenciação

genética em torno da península da Flórida, sugerindo um significante fluxo

gênico e homogeneidade nas freqüências dos genes em escala regional,

como resultado de um “estrangulamento” populacional sofrido por essa

espécie ou de uma recente colonização dessa área. Essas informações têm

fornecido base para implementação de programas de manejo e conservação

para a espécie (Garcia-Rodriguez et al., 2000).

1.2.3. Estrutura populacional e fluxo gênico

A estimativa da estrutura de populações e de fluxo gênico é uma das

primeiras aplicações da genética de populações (Fisher, 1930; Wright, 1931).

Isto é particularmente importante na conservação, porque a maioria das

populações de espécies ameaçadas ou são pequenas ou sofreram uma

redução recente, ou fragmentação, ou qualquer outra perturbação.

O problema central para genética da conservação é a identificação de

populações discretas, unidades de manejo e unidades evolutivas

significantes. Este problema pode ser especialmente crítico quando a espécie

possui distribuição mais ou menos contínua (Diniz-Filho & Telles, 2002).

Entender os padrões e a extensão da divergência genética entre as

populações é crucial para proteção das espécies e para desenvolver planos

efetivos de conservação. Por exemplo, translocações de animais e plantas

com objetivo de suplementar uma população deprimida podem ter efeitos

prejudiciais se ocorre a translocação de indivíduos geneticamente diferentes

da população residente (Frankham et al., 2003).

Prioridades para conservação de uma espécie requerem entender a

diferenciação genética adaptativa entre as populações, e mais importante

ainda é, identificar as unidades que devem ser consideradas (Frankham et

al., 2003).

Cetáceos são altamente móveis e normalmente amplamente

distribuíram por um ou mais oceanos. Nestas circunstâncias, existe grande

potencial para fluxo gênico, que pode prevenir diferenciação genética entre

populações que são separadamente milhares de quilômetros (Hoelzel et al.,

2002). Contudo, a diferenciação genética pode ocorrer dentro de uma

determinada região geográfica, mesmo na ausência de barreiras físicas.

Populações subdivididas são importantes para definição de unidades

para conservação das espécies raras ou ameaçadas ou de unidade de

manejo para espécies que são exploradas. Para espécies aquáticas, onde

freqüentemente não existe barreira geográfica óbvia, delimitar unidades

populacionais torna-se um problema especialmente difícil.

Golfinhos de Hector, Cephalorhynchus hectori, são endêmicos das

águas costeiras da Nova Zelândia e são aparentemente filopátricos, estão

mais concentrados ao longo da região central na costa leste e ao oeste das

ilhas do sul. Os golfinhos de Hector da Ilha do norte e da ilha do sul são

considerados subespécies, fisicamente e geneticamente diferentes. Porém,

resultados com DNAmt mostram diferenciação de pelo menos três

populações geneticamente distintas deste golfinho, uma na costa ocidental

da Ilha Norte e em ambas as costas ocidentais e orientais da Ilha Sul (Baker

et al., 2002).

A franciscana, Pontoporia blainvillei, é endêmica na costa Atlântica Sul

da América do Sul. Essa espécie desperta preocupação quanto a sua

conservação porque sofrem elevadas taxas de mortalidade devido a capturas

acidentais em redes de pesca, e talvez seja a maior ameaça aos pequenos

cetáceos nesta região. Estudos morfológicos e genéticos prévios sugerem a

existência de dois estoques distintos um ao norte e outro ao sul da Ilha de

Santa Catarina no Brasil. Foram encontradas diferenças fixadas entre

amostras do Rio de Janeiro e do Rio Grande do Sul, no sul do Brasil. A

diferenciação genética dos 2 estoques é consistente com um modelo de

isolamento por distância, cujos níveis calculados de fluxo gênico são mais

altos entre populações vizinhas, e diminui quando são comparadas com as

localidades mais distantes (Lazaro et al., 2004).

Para a espécie marinha de tartaruga, a verde, Chelonia mydas, tem

sido proposta duas unidades evolutivas significantes (ESU), a do Oceano

Atlântico e a da região Indo-Pacífico (Karl & Bowen, 1999). Dentro de cada

ESU, mais de 10 unidades de manejo foram reconhecidas, porém diferenças

populacionais e demográficas independentes são difíceis de se delinear.

Vários estudos moleculares e demográficos com baleias jubarte, Megaptera

novaeangliae, têm sugerido a presença de uma unidade evolutiva significante

contendo numerosas unidades de manejo, que correspondem aos estoques

identificados nas rotas migratórias (Baker et al., 1998).

1.2.4. Hibridização

A hibridização é parte importante no processo evolutivo e tem sido

reconhecida principalmente na evolução de plantas, estudos recentes a

reconhece como importante evento na evolução em animais (Dowling &

Secor, 1997).

Os dados genéticos devem ser interpretados tanto no nível de

indivíduo quanto de população para entender a história de hibridização dentro

das populações. Indivíduos híbridos podem ser híbridos de primeira-geração

(F1), híbridos de segunda-geração (F2), cruzamentos com um dos taxa

parental, ou geração de híbridos.

A hibridização pode ter vários efeitos sobre a aptidão das espécies. No

caso de heterose ou vigor do híbrido, híbridos têm alcançado performances

ou fitness relativo para cada taxa parental (Dowling & Secor, 1997).

No caso de depressão exogâmica, a progênie híbrida tem menor

performance ou fitness que os parentais. Existem 2 mecanismos primários

que podem reduzir o fitness do híbrido o primeiro mecanismo é a

incompatibilidade genética entre taxa híbrida, isso tem se referido a ambos,

fatores intrínsecos da depressão exogâmica e seleção endógena. E segundo,

a depressão exogâmica pode ser resultado de adaptação reduzida a

condições ambientais de híbridos, isso se refere à depressão exogâmica

extrínseca e seleção exógena (Rhymer & Simberloff, 1996).

Uma vez que o processo de hibridação iniciou, é difícil parar,

especialmente se híbridos são férteis e acasalam entre eles e com ambos os

indivíduos parentais. Depois de algumas gerações, este processo resultará

em uma “população” híbrida na qual essencialmente todos os indivíduos são

de origem híbrida (Allendorf & Luikart, 2007).

Existem vários exemplos bem documentados de hibridização em

mamíferos. O gato doméstico (Felis catus) ameaça a existência do gato

selvagem (F. silvestris) por hibridização (Hubbard et al., 1992). Acredita-se

que a região norte e ocidental da Escócia abrigava os gatos selvagens mais

puros da Europa, várias análises genéticas identificaram que mais de 80%

dos indivíduos estudados tiveram características de gatos domésticos

(Beaumont et al., 2001). Um problema idêntico está acontecendo na África do

Sul com o gato doméstico e o gato selvagem africano F. libyca (Stuart &

Stuart, 1991).

A tentativa de reintroduzir o lobo vermelho (Canis rufus) no leste dos

Estados Unidos foi considerado um insucesso. Análise de mtDNA de

indivíduos de diferentes áreas da sua distribuição atual e histórica indicam

que todos eles têm haplótipos de lobo cinza (C. lupus) e de coiote (C.

latrans), sugerindo que o lobo vermelho pode ser uma espécie de origem

híbrida (Wayne & Jenks, 1991). Lobos vermelhos também intercruzaram com

os coiotes e mais tarde, neste século, aumentaram sua densidade para a

região Leste.

Hibridação entre coiotes e lobos vermelhos ou com lobos cinza

provavelmente afeta os genótipos do coiote do leste (Lariviere & Crete,

1993). Análises utilizando DNA microssatélite (Roy et al., 1994) apóiam a

hipótese da origem híbrida do lobo vermelho. De qualquer modo, os genes de

indivíduos soltos de lobo vermelho muito provavelmente agora vão se

misturar extensivamente com os dos coiotes.

Na Europa, o que vinha sendo considerado populações de lobo puro

(C. lupus) têm se mostrado híbridos entre lobos e cachorro doméstico (Canis

familiaris), levando à criação de uma “Federação de Lobo” para proteger os

lobos da “poluição genética” por cachorro doméstico (Butler, 1994).

Vários híbridos em cetáceos foram reportados, mas a maioria envolve

animais de cativeiro. Há casos conhecidos de hibridização entre o golfinho

nariz de garrafa (Tursiops truncatus) e outras espécies como falsa baleia orca

(Pseudorca crassidens), e o golfinho de dentes rugoso (Steno bredanensis),

golfinho de riso (Grampus griseus) e baleia de piloto de nadadeira curta

(Globicephala macrorhyynchus) (Dohl et al., 1974; Nishiwaki & Tobayama,

1982; Leatherwood & Reeves, 1983; Sylvestre & Tanaka, 1985). Em todos

estes casos os filhotes apresentam características intermediárias entre esses

parentais.

Bérubé & Aguilar, 1998 registraram uma fêmea híbrida entre uma

baleia fin (Balaenoptera physalus) e uma baleia azul (B. musculus) capturada

em 1984 no noroeste da Espanha. Sua coloração e proporções do corpo

eram intermediárias entre uma baleia fin e uma baleia azul, embora essa

fêmea híbrida fosse anomalamente grande (19,4 m) quando comparada com

uma baleia fin de idade similar (4 anos). Esse indivíduo era sexualmente

imaturo, concomitante com sua idade, mas não em seu comprimento se

fosse uma baleia fin. Análises moleculares revelaram que a mãe do híbrido

era uma baleia azul e o pai uma baleia fin. Existem registros para o cinco

híbridos de baleia fin-azul na literatura, mais outros relatos, indicam que a

hibridização entre estas duas espécies acontece em várias regiões

geográficas e parecem relativamente freqüentes, considerando a ausência de

informação de híbridos entre outro misticetos. A capacidade reprodutiva

destes híbridos permanece desconhecida, embora a incidência de prejuízo

reprodutivo pareça ser mais alto em machos híbridos que em fêmeas

híbridas.

Kovacs et al., 1997 utilizando DNAmt e nuclear relata a produção

incomum de híbridos no acasalamento entre Phoca groenlandica e

Cystophora cristata, parentais de gêneros diferentes, morfologicamente

distintos, com tamanhos corporais e comportamento reprodutivo diferentes.

1.2.5. Genética e conservação

Fatores humano-induzidos como a destruição de hábitat, caça e

competição de espécies exóticas introduzidas são as principais causas da

maioria das extinções recentes (Frankham et al., 2003).

Além destes fatores, as espécies são vulneráveis a fatores

estocásticos que também podem causar extinções. Estes fatores podem ser

extrínsecos e podem incluir elementos bióticos como a influência de

predadores, competidores e patógenos (Roelke-Parker et al., 1996), ou

elementos abióticos como inundações, fogo e secas (Raup, 1991).

Outros fatores estocásticos como estocasticidade demográfica e

genética (Frankham et al., 2003) são intrínsecos as espécies. Estocasticidade

demográfica surge de flutuações das taxas de natalidade, mortalidade e

razão sexual (Avise & Nelson, 1989). Estocasticidade genética inclui

depressão endogâmica que é o resultado de acasalamentos entre parentes,

perda de variação genética e o acúmulo de alelos deletérios. Os efeitos da

estocasticidade genética dependem do tamanho efetivo de população. De

qualquer modo, é difícil isolar efeitos genéticos de uma rede de interações

que afetam a viabilidade de populações selvagens (Allendorf & Luikart, 2007)

(Figura 04).

Populações naturais normalmente têm níveis altos de variação

genética. Essa variação é introduzida por mutação ou migração de indivíduos

de outras populações e é perdida por deriva genética, endocruzamento e

seleção natural (Nei, 1987). Como o endocruzamento e a deriva genética são

inversamente proporcionais ao tamanho das populações, espécies que estão

ameaçadas de extinção geralmente possuem níveis muito baixos de

heterozigosidade.

A baixa diversidade genética em pequenas populações reduz a

habilidade das espécies de responder a mudanças no ambiente. Existem

quatro ameaças para a diversidade genética: a extinção de populações ou

espécies; a extinção de alelos; o endocruzamento que reduz a

heterozigosidade; e a seleção, favorecendo um alelo em detrimento de outro

(Frankham et al., 2003).

Uma gama de técnicas e marcadores moleculares tem sido usada

para resolver problemas na área de conservação. Desde que os primeiros

loci microssatélites foram isolados e amplificados em humanos em 1989 (Litt

& Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber & May, 1989), tornaram-se os marcadores

moleculares preferidos para estudos biológicos, inclusive na genética da

conservação. Microssatélites têm sido usados para demonstrar estrutura

populacional (Forbes & Hogg, 1999; Nesje et al., 2000), identificar

paternidades (Houlden et al., 1997; Marshall et al., 1999), avaliar diversidade

genética (Mundy et al., 1997) e identificar espécies e indivíduos a partir de

pequenas quantidades de amostras não invasivas (Ernest et al., 2000;

Sloane et al., 2000).

A diversidade genética pode ser medida usando polimorfismos, pela

proporção de indivíduos heterozigotos dentro da população e também pela

diversidade alélica (Rosel & Reeves, 2000). Indivíduos heterozigotos tendem

a ter maior sobrevivência, resistência a doenças, taxa de crescimento e

sucesso reprodutivo.

Figura 04: Interações entre efeitos demográficos e genéticos da perda de

habitat e isolamento que podem provocar um aumento na probabilidade de

extinção. Modificado de Soulé & Millis (1998).

A tese aqui apresentada está dividida em 4 capítulos, que envolvem a

aplicação dos marcadores microssatélites na genética da conservação do

peixe-boi da Amazônia, correspondem:

Capítulo 1: Caracterização dos loci microssatélites transferidos de

Trichechus manatus para T. inunguis. Neste capítulo a metodologia e

protocolos são detalhados e os níveis de diversidade genética dos loci são

avaliados para suas devidas aplicações.

Capítulo 2: Identificação da paternidade dos filhotes de peixe-boi da

Amazônia nascidos em cativeiro, aqui se investiga o relacionamento entre

indivíduos nascidos em cativeiro no Laboratório de mamíferos

aquáticos/INPA e no Centro de Preservação e Pesquisas com mamíferos

aquáticos, CPPMA-Balbina, buscando reduzir acasalamentos incestuosos,

para minimizar o endocruzamento e a perda de variação genética.

Capítulo 3: Análise da diversidade genética populacional do peixe-boi

da Amazônia, onde são avaliados os níveis e a distribuição da diversidade

genética da espécie e se a espécie sofre algum efeito de um gargalo

populacional recente.

Capítulo 4: Avaliação de eventos de hibridização entre Trichechus

manatus e T. inunguis no estuário amazônico, onde por meio de análises

estatísticas são identificados os indivíduos híbridos, sendo possível avaliar a

contribuição genética de cada uma das espécies e conhecer qual a direção

dos eventos de hibridização.

A genética da conservação procura minimizar o risco da extinção por

fatores genéticos. Assim o conhecimento dos níveis e distribuição da

variabilidade genética é fundamental para o planejamento do manejo e

conservação do peixe-boi da Amazônia in situ e ex situ.

1.3. OBJETIVOS

Geral

O presente projeto propõe-se a realizar análise de paternidade dos

animais de nascidos e criados em cativeiro; além de verificar o nível e a

distribuição da variabilidade genética do peixe-boi da Amazônia, e se existem

eventos de hibridização entre as espécies de peixe-boi que ocorrem no

Brasil, avaliando a contribuição genética de cada uma das espécies nos

híbridos, utilizando marcadores microssatélites; e assim fornecer subsídios

de fundamental importância para o estabelecimento de eficientes estratégias

de conservação e manejo dessa espécie.

Específicos

• Realizar a amplificação cruzada de 20 primers microsatélites

desenvolvidos para T. manatus em indivíduos de T. inunguis;

• Realizar a caracterização genética dos marcadores microssatélites para

Trichechus inunguis;

• Investigar a diversidade genética dos 20 loci testados em T. inunguis

• Realizar a identificação da paternidade dos animais nascidos em cativeiro

no Laboratório de Mamíferos Aquáticos (LMA-INPA) e no Centro de

Preservação e Pesquisa Mamíferos Aquáticos da Eletronorte (CPPMA-

Balbina);

• Caracterizar geneticamente indivíduos de peixe-boi na Amazônia oriundos

de diferentes áreas geográficas;

• Verificar o grau de diferenciação genética intraespecífica e interespecífica;

• Verificar se as populações amostradas apresentam indícios dos efeitos de

uma recente redução no tamanho populacional;

• Confirmar se existe uma zona de hibridização entre T. inunguis e T.

manatus do na foz do Rio Amazonas.

Capítulo 1: Caracterização dos loci microssatélites transferidos de

Trichechus manatus para T. inunguis

2.1 INTRODUÇÃO

Os marcadores microssatélites têm sido usados em genética de

populações para mapear genomas, ecologia molecular e estudos que visam

conservação. São também chamados de VNTRs (número variável de

repetições em tandem) ou SSR (seqüência simples repetitivas) e consistem

de repetições em tandem de pequenas seqüências motifs de 1 a 6

nucleotídeos. Os loci microssatélites são multi-alélicos co-dominantes,

evoluem através de processos mutacionais decorrentes dos “escorregões” da

DNA polimerase (slippage) ou de crossing over desigual (Goldstein &

Schlötterer, 1999).

A principal vantagem desses marcadores é que eles são altamente

polimórficos, até mesmo em populações pequenas e espécies ameaçadas. O

alto polimorfismo é resultado da alta taxa de mutação que ocasiona mudança

no número de repetições. As taxas de mutação variam de 10

-3

a 10

-6

(Weber

& Wong, 1993). Apesar de suas altas taxas evolutivas, os microssatélites são

conservativos em suas regiões flanqueadoras e podem persistir por um longo

período sem modificações (Zardoya et al., 1996). Portanto, pares de primers

desenvolvidos para uma espécie podem ser usados em espécies

proximamente relacionadas porque o lugar onde ele se anela é uma região

altamente conservada.

Marcadores microssatélites são especialmente úteis para inferir eventos

demográficos recentes, inclusive descoberta de impactos humano-induzidos

em populações. Assim, uma variedade de métodos foi especificamente

desenvolvida para dados microssatélite para identificar eventos demográficos

históricos. Isso faz dos marcadores microssatélite uma ferramenta de

pesquisa poderosa, porém o desenvolvimento desses marcadores requer

trabalho intensivo e caro. Conseqüentemente, pesquisadores testaram

marcadores de microssatélite desenvolvido para uma espécie em outra

(Moore et al., 1991, Schlötterer et al., 1991; Katzir et al., 1996; Matsuoka et

al., 2002; Zucoloto et al., 2006; Banhos et al., 2008), uma particularidade

conhecida como transferiabilidade, ou amplificação cross-espécies, ou

amplificação cruzada.

A taxa de sucesso na amplificação cross-espécie de microssatélites tem

mostrado ser diretamente relacionada com divergência evolutiva entre as

espécies para a qual os loci microssatélites foram isolados (Primmer et al.,

2005).

Cantanhede et al. (2005) analisando a região controle do DNA

mitocondrial em peixe-boi da Amazônia, verificaram que a divergência

genética entre indivíduos T. inunguis e T. manatus variou de 6.2 ± 1.3% a 8.3

± 1.5%, e corresponde a divergência de 3.1 ± 0.65–4.0 ± 0.65 milhões de ano

com base na taxa de 2% substituições/sitio/ano. A estimativa de coalescência

de diversificação de Trichechus do Novo Mundo é estimada em a 2.15 ± 0.11

Ma, como uma estimativa mínima muito baixa de tempo de divergência,

corroborando com a hipótese de uma origem de Plio-Pleistoceno e

diversificação de Trichechus (Domning, 1982b). O recente tempo de

divergência entre as duas espécies de peixe-boi do Brasil indica uma boa

possibilidade de sucesso na cross amplificação dos marcadores

microssatélites.

Garcia-Rodriguez et al. (2000) desenvolveram um conjunto de 14

primers microssatélites e Pause et al. (2007) desenvolveram mais 10

marcadores para Trichechus manatus. Nesses trabalhos, os autores

verificaram amplificação positiva para os loci microssatélites em T. inunguis.

Este trabalho visa realizar a amplificação cruzada de 20 primers

desenvolvidos para o peixe-boi marinho, Trichechus manatus, em amostras

de indivíduos de peixe-boi da Amazônia. A utilização desses loci será de

extrema importância para examinar estrutura populacional, análise de

paternidade. Essas informações genéticas são fundamentais para

recomendações de manejo da espécie de peixe-boi da Amazônia, tanto em

cativeiro como em ambiente natural.

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

2.2.1 Coleta das amostras

Indivíduos provenientes de diferentes rios da Bacia Amazônica foram

amostrados, porém para caracterização dos loci microssatélites, foram

analisadas 19 amostras de peixe-boi da Amazônia e 8 de peixe-boi marinho.

Foram coletadas de uma a quatro gramas de tecido da pele de

Trichechus inunguis utilizando o instrumento cirúrgico para biópsia cutânea.

Essas amostras foram estocadas em frascos devidamente etiquetados

contendo solução saturada com sal (NaCl) de dimetil sulfóxido (DMSO) a

20% ou em álcool puro.

2.2.2 Extração de DNA

A digestão do DNA ocorreu em tubos do tipo eppendorf contendo

tampão de lise (SDS e proteinase K) e estocados em estufa a 55ºC. A

extração do DNA total será feita por meio de sucessivas lavagens utilizando

fenol-clorofórmio e precipitação em etanol (Sambrook et al., 1989), conforme

descrito abaixo:

2.2.3 Digestão

Colocou-se em um tubo eppendorf subamostras de aproximadamente

1 grama de pele macerada, adicionados a 500 µl de solução tampão para

extração (1 ml de NaCl 5M; 10 ml SDS 20%; 86 ml ddH

O; 1 ml Tris (1M), pH

8;2ml EDTA 0.5M), 10 µl de proteinase K 10 mg/ml. Esse tubo foi encubado à

55º C por 24 horas (podendo ficar até por 48 horas).

2.2.4 Purificação

Adicionou-se 0.5 ml de fenol ao tubo com tecido digerido, agitou-se por

cinco minutos e centrifugou-se também por 5 minutos a 3000g. Transferiu-se

o sobrenadante para um tubo limpo. Esse processo foi realizado por duas

vezes.

Depois, retirou-se o sobrenadante, adicionou-se 0.5 ml de solução

Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (25:24:1), agitou-se por cinco minutos, e

centrifugou-se por outros cinco minutos à 3000 g. Transferiu-se a camada

sobrenadante para um tubo limpo. Essa operação também foi repetida por

duas vezes.

Novamente, retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 0.5 ml de

solução Clorofórmio/Álcool Isoamílico (24:1) agitou-se por cinco minutos, e

centrifugou-se por cinco minutos a 3000 g. A camada sobrenadante foi

transferida para um tubo limpo, e repetiu-se a operação.

Retirou-se o sobrenadante, e em um novo tubo, adicionou-se 1 ml de

etanol 100%, e depois encubou-se a – 20 ºC por doze horas (ou a – 80ºC por

1 hora). Centrifugou-se o tubo por 30 minutos a 14000g. Lavou-se com

Etanol 70%, e deixou-se secar; ressuspendeu-se com 200 µl de água pura.

2.2.5 Quantificação do DNA

A quantidade e a qualidade do DNA extraído foi avaliada em

comparação a um padrão de peso molecular conhecido em gel agarose 0.8%

corado com EtBr (brometo de etídio). Posteriormente o DNA foi diluído em

uma concentração final que variou entre 10-100ng/µl de DNA.

2.2.6 Amplificação in vitro-PCR

Para realização das genotipagens é necessário que o DNA nuclear de

cada um dos indivíduos seja amplificado por meio de uma reação em cadeia

da polimerase (PCR) utilizando “primer” de oligonucleotídeos. A análise é

feita com base no comprimento dos produtos de PCR utilizando eletroforeses

e um sistema de detecção por laser (em seqüenciador automático), portanto

um desses primers tem que possuir uma marcação fluorescente, podendo ser

6-carboxi-fluorescina (FAM), hexacloro-6-carboxi-fluorescina (HEX), 6-

carboxi-X-rhodamina (ROX), ou tetracloro-6-carboxi-fluorescina (TET).

Os primers utilizados nesse trabalho foram desenvolvidos para

Trichechus manatus, e obtidos em Garcia-Rodriguez et al. (2000) e Pause et

al. (2007) e estão listados na tabela 01. Oito primers foram marcados com

fluorescência, e nos 12 restantes utilizamos o protocolo econômico, utilizando

a cauda M13 (Schuelke, 2000) (Figura 01).

Tabela 01: Descrição dos vinte primers microssatélites desenvolvidos por Garcia-Rodriguez et al., 2000 e Pause et al.,

2007*, utilizados na caracterização genética de Trichechus inunguis.

Locos Tamanho em

T. manatus

Número de repetições Temperatura de

anelamento

Marcação Seqüência do primer (5→3)

TmaA01 107 (TA)

(CA)

CG(CA)

60 M13 FAM F-CAGAAGGGATACATATACA

R-CAGCCCCTGGCTGTCTCTTGTC

TmaA02 247–251 (CACT)

(CA)

59 FAM F-CTCAGTCCAAACAGCTAATG

R-TAGTCATTTGTGCAGAGTGC

TmaA03 163–183 (GACA)

61 FAM F-ACATGTGTTCCCTGCTGTAT

R-GATTTTTGGAGCAGTTGTCA

TmaA04 204 (CT)

(GT)

AT(GT)

60 M13 FAM F-GAACACAAGACCGCAATAAC

R-TGGTGTATCACTCAGGGTTC

TmaA09 150 (GT)

61 TET F-GATGGGATACTGGGTTATGC

R-ATGCAGACACTGGACATAGG

TmaE02 172–174 (GT)

60 M13 FAM F-GTCTCTACGGCCTAGAATTGTG

R-TTTCTCTACCTCTCCTCACACG

TmaE08 149–165 (CA)

TA(CA)

62 TET F-GAATAGAGACTGGGCTAGAATCC

R-GCCTTTTGGAGGGATAGAAGTAG

TmaE11 177–197 (CA)

60 M13 FAM F-ACACACAACATCACTCATCCAC

R-AAGCTGCGTTCTACTTCATATAATC

TmaE26 199–201 (CA)

C(CA)

61 TET F-CATTCCTGATCCACAAAATC

R-CCTGTCTTCTCTCTGTTTCTCC

TmaF14 204–206 (TC)

(TG)

TA(TC)

TG(TC)

62 HEX F-CTAAGACATTGCTCCAAAAGC

R-GGGCAGTGGGATTTGAGATG

TmaF34 271 (TCTCTCTCTTTCTG)

(TC)

60 M13 FAM F-CATGAGAGACTATGCTCCCTTC

TT(TC)

(AC)

AT(AC)

R-CAGGTAGGAAGATGATGAGGAC

TmaH1I 298 (TCTG)

(TCTA)

CCTGTCTATCCA 62 FAM F-AGCAGATAGACACACTGGGAAG

(TCTA)

CCTG(TCTA)

R-GAGTCTGAATGAATGAATTACTGC

TmaM61 176 (TG)

(GT)

60 M13 FAM F-TTGAGGTGTAATCTGTGTG

R-GGTAATCGGAGTTGGTGTA

TmaM79 154–156 (GT)

62 FAM F-CCAATCATGTCCCAAACT

R-CAATAGAAGAAGCAGCAG

TmaJ02* 224–230 (AC)

60 M13 FAM F-CACCATTGCCTCACAATCAG

R-TGGTGGTTAACTTTCTGTGCAA

TmaKb60* 215–219 (TG)

(CG)

(TG)

(CG)

60 M13 FAM F-TAGACACAGGCAAGCAGTGG

R-AAGAGTGAGCGGAGATGTGG

TmaSC5* 124–146 (AC)

G(CA)

60 M13 FAM F-ATTACCCAGCTCAGCATGTAC

R-GCAACCTCTTCTGTTTTCAAA

TmaH13* 237–253 (TCTA)

60 M13 FAM F-GCATCTTGGAAGATTTTTCCTT

R-CACTGACAGATACGTGGTGGA

TmaE14* 238–254 (AT)

(GT)

(TT)

(GT)

60 M13 FAM F-TTTTGGTAGTGGGATGACCA

R-GTGGAGTAGGGTGGACCAGA

TmaH23 (CTAT)

60 M13 FAM F-TGTAAAACGACGGCCAGTCGTAGG

R-ACTGCCAACCTTTCCATTATC

A técnica de PCR envolve 3 etapas: Desnaturação da dupla fita de DNA

pela elevação da temperatura à 94º; Anelamento do par de iniciadores (primers)

à região adjacente da seqüência alvo após redução da temperatura; e Síntese

ou extensão da cadeia complementar do DNA alvo na temperatura ótima de

trabalho da DNA polimerase.

A reação de amplificação foi realizada em um termociclador Eppendorf® e

cada reação utilizando o primer marcado com fluorescência continha: 5,85 µl de

água milli-q; 1 µl de tampão 10x; 0,8 µl de cloreto de magnésio 25M; 0,8 µl de

dNTPs 1 mM; 0,4 µl de primers (10µM) (iniciadores) específicos (0,2µl de cada),

0,15 µl de DNA Taq polimerase à 5 U/µl; 1.0 µl do DNA genômico do espécime

em questão com a concentração entre 10-100 ng/ µl, em uma volume final de

10µ. A temperatura e os ciclos correspondentes estão listados na tabela abaixo:

Tabela 02: Perfil da termociclagem para amplificação via PCR dos primers

marcados com fluorescência.

Temperatura (

C) Tempo Ciclos

Desnaturação inicial 94

5’ 1x

Desnaturação 94

1’

Anelamento dos primers

-61

1’

Extensão 72

1’

30x

Extensão final 72

15’ 1x

Na reação de PCR utilizando o protocolo econômico são utilizados 3

primers: um forward específico da seqüência contendo a cauda M13 na

extremidade 5', um reverse específico da seqüência, e um primer universal M13

(-21) fluorescente. (Figura 01).

Cada reação utilizando o protocolo econômico continha: 2 µl de água milli-

q; 1µl de tampão 10x 1 µl de cloreto de magnésio 25M; 1 µl de dNTPs 1 mM; 0,7

µl de primer forward M13 (2,0pmol/µl), 0,7 de primer universal M13 (2,0pmol/µl)

e 1,4 µl de primer reverse (2,0pmol/µl) 0,2 µl de DNA Taq polimerase à 5 U/µl;

1,0 µl do DNA genômico do espécime em questão com a concentração entre 10-

100 ng/ µl, em uma volume final de 10µl. A temperatura e os ciclos

correspondentes estão listados na tabela 03.

Figura 01: Esquema de amplificação para uma única reação em um tubo para

este método econômico de PCR. (A,B) As caixas com hachuras indicam os

primers de microssatélite específicos (C) A caixa cinza ondulada representa a

seqüência do primer universal M13(-21), e a estrela é a florescência FAM. (D)

Nos primeiros ciclos de PCR, o primer forward contendo a cauda M13(-21) é

incorporado nos produtos de PCR. (E) Estes produtos são marcados com

fluorescência FAM do primer universal M13(-21) que é incorporado durante

ciclos subseqüentes a uma temperatura mais baixa de 53°C. (F) O produto final

marcado pode ser analisado em um sistema de detecção a laser. Modificado de

Schuelke (2000).

Após a reação, a eficiência da amplificação foi verificada em gel de

agarose 1.0 % por comparação a padrão de peso molecular conhecido (DNA

ladder de 100 pares de base) por cerca de 40 minutos com corrente 70 mA. Por

comparação com o marcador, foi verificada a presença ou ausência, e a

concentração do fragmento amplificado.

Tabela 03: Perfil da termociclagem para amplificação via PCR dos primers com

cauda M13 (-21) utilizando o protocolo econômico de Schuelke (2000).

Temperatura (

C) Tempo Ciclos

Desnaturação inicial 94

2’ 1x

Desnaturação 94

50”

Anelamento do primer específico 59

-61

50”

Extensão 72

1’

30x

Desnaturação 92

40”

Anelamento do primer M13 (-21) 53

35”

Extensão 68

40”

20x

Extensão final 72

15’ 1x

2.2.7 Genotipagem

Os produtos de PCR foram colocados em uma placa previamente

identificada e diluídos em água ultra pura de acordo com a sua concentração.

Em seguida, 3 µl foram transferidos para uma nova placa limpa previamente

identificada (placa de genotipagem) contendo em cada poço 7,75 µl de Tween

20 a 0,1% (agente desnaturante que mantém a fita de DNA aberta) e 0,25 µl de

ET-ROX 400 (Padrão de peso molecular usado para alinhar as diferentes

corridas em cada um dos 96 capilares do seqüenciador, GE-Healthcare).

A placa foi tampada com a borracha de silicone centrifugada rapidamente

para retirar as bolhas que por ventura aparecesse e depois levada ao

termociclador a 95

durante 5 minutos, imediatamente após os 5 minutos foi

colocada numa placa de gelo até iniciar a corrida no seqüenciador automático

MegaBACE (GE-Healthcare). Em todas as placas, 3 indivíduos foram utilizados

como controle para averiguar a qualidade das corridas de genotipagens.

2.2.8 Caracterização dos vinte loci microssatélites

Os softwares Genetic Profile e Fragment Profiler do seqüenciador

automático MegaBACE foram utilizados para identificar os alelos dos loci

microssatélites para os indivíduos genotipados.

Degradação ou baixas concentrações de DNA, ou mutações no sítio de

anelamento do primer podem resultar em erros nas genotipagens de

microssatélites. O programa Micro-Checker versão 2.2.3 (Van Oosterhout et al.,

2004) foi utilizado para detectar possíveis erros de genotipagens devido a alelos

nulos (não amplificados), stutters, ou erros tipográficos.

A variabilidade genética foi estimada por meio de estatística descritiva

que determinou o número de loci polimórficos e o número de alelos por loco

(Nei, 1978). O número médio de alelos por loco foi estimado, por meio da

somatória do número de alelos observados em cada um dos loci analisados em

uma dada população e dividindo o valor encontrado pelo número total de loci.

Com o programa Convert (Glaubitz, 2004) foram calculadas as

freqüências alélicas, as quais foram utilizadas como base para calcular as

probabilidades de identidade genética (I), por loco e combinada (Paetkau et al.,

1995). Da mesma forma, foram determinadas as probabilidades de exclusão de

paternidade (Q) dos loci (Weir, 1996).

A heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) (Weir, 1996), assim

como os testes para aderência ao equilíbrio de Hardy – Weinberg (EHW) foram

obtidos utilizando o programa Arlequin 3.1 (Excoffier et al., 2005). A

heterozigosidade observada (Ho) é uma medida da variabilidade genética das

populações e reflete a quantidade de indivíduos heterozigotos para um

determinado loco. A heterozigosidade esperada (He) é a medida que reflete a

quantidade de indivíduos heterozigotos que é esperada de acordo com o

equilíbrio de Hardy-Weinberg. O mesmo programa foi utilizado para estimar o

desequilíbrio de ligação entre os loci estudados.

O termo desequilíbrio de ligação é comumente usado para descrever

associações não randômicas entre alelos de 2 loci (Lewontin & Kojima, 1960). A

hipótese nula para os testes de desequilíbrio de ligação é que a distribuição

genotípica em um loco é independente da distribuição em outro loco. A análise

verifica os desvios do esperado pela regra de multiplicação entre pares de loci

localizados em diferentes cromossomos, levando em consideração que o

conjunto de dados está em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

O F

(Wright, 1922), ou coeficiente de endogamia também foi obtido pelo

programa Arlequin. F

é medido a partir da proporção de Hardy-Weinberg

esperada. A endogamia indica a existência de deficiência de heterozigotos em

uma dada população.

Para aumentar o poder dos testes realizados com comparações múltiplas,

o nível de significância foi ajustado com a correção de Bonferroni descrita por

Rice (1989).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A amplificação cruzada de iniciadores entre espécies tem obtido sucesso

em diversos grupos animais. Por exemplo, 50% dos primers desenhados para

bovinos podem ser utilizados em ovelhas selvagens e cabras (Maudet et al.,

2004), espécies que se divergiram há 20 milhões de anos atrás. Isto é uma

enorme vantagem, economizando o tempo e o custo do desenvolvimento de

primers para as espécies. Transferências similares de marcadores são possíveis

em cães selvagens, felinos, primatas, salmonídeos, aves porque o mapa

genômico foi avaliado com microssatélites (Ostrander et al., 1993; Grisolia et al.,

2007; Banhos et al., 2008).

Todos os vinte primers microssatélites desenvolvidos originalmente para

Trichechus manatus e testados neste trabalho em Trichechus inunguis

amplificaram.

A análise no programa Micro-Check revelou que para 8 loci, onde um alelo

estava presente em mais de 50% dos indivíduos, a possibilidade da presença de

alelos nulos foi observada (TmaH1I, TmaE08, TmaF14, TmaE11, TmaF34,

TmaA01, TmaM61 e TmaJ02). A caracterização genética para os vinte loci

microssatélites está descrita na tabela 04.

Tabela 04: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites desenvolvidos

originalmente para T. manatus e utilizados neste trabalho para 19 indivíduos de

peixe-boi da Amazônia, Trichechus inunguis.

Locos A

Ho He F

I Q

TmaA01 3 0,21053

0,28023

0,25389 0,2473 0,1382

TmaA02 9 0,52632

0,66999

0,21909 0,6256 0,4652

TmaA03 4 0,42105

0,35989

-0,17551 0,3175 0,1871

TmaA04 5 0,50000

0,60313

0,17520 0,5099 0,3407

TmaA09 5 0,84211

0,78947

-0,06865 0,7310 0,5718

TmaE02 4 0,16667

0,16190

-0,03030 0,1534 0,0840

TmaE08 5 0,31579

0,51778

0,18120 0,4777 0,3200

TmaE11 3 0,15789

0,15222

-0,03846 0,1422 0,0763

TmaE26 3 0,42105

0,60313

0,30769 0,4987 0,3253

TmaF14 2 0,05263

0,05263

0,00000 0,0499 0,0253

TmaF34 5 0,38889

0,54603

0,29377 0,4589 0,2956

TmaH1I* 4 0,47368

0,69275

0,32218 0,6233 0,4496

TmaM61* 5 0,22220

0,65397

0,66667 0,6176 0,3181

TmaM79 3 0,36842

0,44808

0,00000 0,3606 0,2236

TmaJ02 6 0,64706

0,78075

0,17564 0,7235 0,5669

TmaKb60 8 0,73684

0,78075

0,05970 0,7275 0,5727

TmaSC5 6 0,66667

0,73651

0,09735 0,6624 0,4900

TmaH13 5 0,68421

0,67994

-0,00645 0,6019 0,4289

TmaE14 7 0,38889

0,47619

0,18771 0,4467 0,2797

TmaH23 3 0,11110

0,10952

-0,01493 0,1038 0,0547

Média 5 0,41510

0,50474

0,18192 2,94 x 10

-09

0,9997

* significativo mesmo após correção de Bonferroni (p=0,0025).

O número médio observado de alelos por loco foi de 5 alelos por loco,

variando de 2 alelos para o loco TmaF14 e 9 alelos para o loco TmaA02 (Tabela

04). O número total de alelos por loco é uma medida complementar de variação

genética porque é mais sensível a perda de variação genética em pequenas

populações que a heterozigosidade, e é uma importante medida de potencial

evolutivo da população a longo prazo (Allendorf & Luikart, 2007).

A medida mais comumente usada para comparar a quantidade de

variação genética entre diferentes populações é a heterozigosidade. Para um

único loco, heterozigosidade é a proporção de indivíduos que são heterozigotos;

a heterozigosidade varia entre 0 e 1.

Em T. inunguis a heterozigosidade média observada foi 0,41510 e a

heterozigosidade média esperada foi de 0,50474 (Tabela 04). Esses valores são

maiores que aqueles encontrados na caracterização de T. manatus para os

mesmos loci (Garcia-Rodriguez et al., 2000; Pause et al., 2007).

Para os indivíduos de T. manatus analisados neste trabalho, o número

médio observado de alelos por loco foi de 4, variando de 1 alelo para os loci

TmaA01, TmaF14, TmaM79 e TmaH23 e 7 alelos para os loco TmaJ02,TmaH13

e TmaE14. A heterozigosidade média observada foi 0,41250 e a

heterozigosidade média esperada foi de 0,49625 (Tabela 05).

A heterozigosidade tem sido amplamente utilizada porque é proporcional

a quantidade de variância genética para um loco. Gorman & Reizi (1979) têm

mostrado que estimativas de He são geralmente insensíveis ao tamanho da

amostra e que poucos indivíduos são suficientes para estimar He se um grande

número de loci é analisado. Portanto, comparações de heterozigosidades em

diferentes espécies ou populações são geralmente mais importantes que

comparações de número de alelos detectados.

Em T. inunguis, as diferenças nos valores de Ho e He não foram

significativas para a maioria dos loci. Observamos desvios do equilíbrio de

Hardy-Weinberg apenas nos loci TmaH1I e TmaM61. Em T. manatus,

apresentam-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg, antes e depois da correção de

Bonferroni. Todos os testes, tanto em T. inunguis com0 em T. manatus, para

análises de desequilíbrio de ligação, não foram significativos, antes e depois da

correção de Bonferroni (p=0,00026).

Tabela 05: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites utilizados neste

trabalho para 8 indivíduos de peixe-boi marinho, Trichechus manatus, do Brasil.

Locos A

Ho He F

I Q

TmaA01 1 - - - - -

TmaA02 2 0,250 0,2333 0,07692 0,1948 0,1034

TmaA03 6 0,875 0,71667

-0,24051 0,6307 0,4655

TmaA04 5 0,625 0,79167

0,22222 0,7009 0,5371

TmaA09 5 0,375 0,73330

0,50588 0,6363 0,4666

TmaE02 2 0,750 0,53333

-0,44828 0,3750 0,2188

TmaE08 5 0,500 0,80000

0,39130 0,7199 0,5512

TmaE11 4 0,375 0,52500

0,30000 0,4582 0,2997

TmaE26 5 0,250 0,60833

0,60563 0,5388 0,3747

TmaF14 1 - - - - -

TmaF34 3 0,125 0,34167

0,65000 0,9803 0,1505

TmaH1I 2 0,125 0,125 0,1103 0,0569

TmaM61 3 1,000 0,64167

-0,62319 0,5163 0,3405

TmaM79 1 - - - - -

TmaJ02 7 0,625 0,85833

0,28571 0,7788 0,6384

TmaKb60 5 0,500 0,75833

0,35632 0,6684 0,5022

TmaSC5 6 0,375 0,81667

0,55789 0,7332 0,5794

TmaH13 7 0,875 0,75000

-0,18072 0,7332 0,5794

TmaE14 7 0,625 0,69167

0,10256 0,6253 0,4694

TmaH23 1 - - - - -

Média 4 0,4125 0,49625

0,1786 IC=3,56 x 10

-05

QC=0,998

Correção de Bonferroni (p=0,0025). (-) Loco monomórfico.

O valor da probabilidade de exclusão é dependente do número de alelos

e da distribuição das freqüências alélicas presentes na população. A

probabilidade de exclusão de paternidade calculada para os vinte loci em

conjunto em T. inunguis foi de 0,9997 e em T. manatus foi 0,9998, indicando

uma probabilidade de cerca de 99% de se excluir corretamente um indivíduo

não-pai escolhido ao acaso na população (Tabela 04 e 05).

A probabilidade combinada de identidade genética foi bastante baixa

tanto em T. inunguis (2,9 x 10

-9

) como em T. manatus (3,56 x 10

) demonstrando

o alto poder de discriminação individual desses loci (Tabela 04 e 05).

O coeficiente de endogamia quando apresenta valor positivo indica excesso

de homozigotos, e o negativo indica déficit de homozigotos. O F

médio para os

loci polimórficos em T. inunguis foi 0,18192 e em T. manatus foi 0,17867 (Tabela

04 e 05).

Interpretar as causas do excesso ou déficit de homozigotos pode ser difícil.

A causa geral de excesso de homozigotos é o acasalamento não randômico ou

subdivisão populacional (Frankham et al., 2003). A endogamia aumenta a

homozigosidade e diminui a heterozigosidade no genoma inteiro. O coeficiente

de endocruzamento de genealogia aumenta a homozigosidade para indivíduos

endocruzantes e também diminui a heterozigosidade no genoma (Allendorf &

Luikart, 2007).

Diferenças na quantidade de variação genética têm importância

significativa entre espécies. Mudanças evolutivas podem não ocorrer, ao menos

que exista variação genética, e isto tem implicações significativas para

conservação (Allendorf & Luikart, 2007).

A partir dos resultados obtidos na caracterização dos loci transferidos de

T. manatus para T. inunguis, foi possível verificar quais deles seriam os

melhores para responder as questões sobre análise de parentesco, genética

populacional e hibridização, sendo, portanto são utilizados bancos de dados

diferentes. Nas análises de parentesco e da diversidade genética populacional

do peixe-boi da Amazônia foram retirados os loci com baixos níveis de

heterozigosidade. Já para avaliar a ocorrência de hibridização entre as duas

espécies de peixe-boi que ocorre no Brasil, os loci pouco polimórficos se tornam

de extrema importância, sendo os mais informativos. Essas análises citadas

estão descritas nos próximos capítulos.

Capítulo 2: Identificação da paternidade dos filhotes de peixe-boi da Amazônia

nascidos em cativeiro

3.1 INTRODUÇÃO

O peixe-boi da Amazônia (Trichechus inunguis) é endêmico da Bacia

Amazônica e o único sirênio que vive exclusivamente em água doce (Best,

1984a; Rosas, 1994), distribui-se desde a Ilha de Marajó (Brasil) até as

cabeceiras do Rio Amazonas, na Colômbia, Peru e Equador. A presença de

cachoeira e áreas de corredeiras (aparentemente) é o fator limitante para a

distribuição dessa espécie na bacia Amazônia (Domning, 1981; Best, 1984a;

Rosas, 1994; Silva et al., in press) (Figura 01).

Figura 01: Distribuição de T. inunguis (Rosas, 1994).

No ambiente natural, o marcante ciclo sazonal no sistema de drenagem

do Rio Amazonas tem um profundo efeito na vida dos organismos aquáticos em

geral, inclusive para o peixe-boi e sua alimentação. As plantas aquáticas não

são recursos constantes ao longo do ano e a distribuição delas, e outras

características podem influenciar nas estratégias reprodutivas (Anderson, 2002).

Na Amazônia, com o aumento do nível da água dos rios (janeiro a julho),

há um aumento na produção de macrófitas aquáticas e semi-aquáticas e os

peixes-bois se dispersam na várzea e no igapó para se alimentar. Durante a

vazante (agosto a outubro), eles iniciam uma migração para os lagos e canais

de rios mais profundos, pois com a redução do nível dos rios, no pico da seca

(novembro e dezembro), as áreas de várzea e igapó desaparecem eliminando a

disponibilidade alimentar desses animais (Best, 1982; 1983; 1984a).

Essa sazonalidade dos rios e da disponibilidade de alimento,

aparentemente, influencia a reprodução dos peixes-bois. A cópula e os

nascimentos ocorrem durante a subida das águas (final de dezembro-junho),

quando, depois de um período de estivação prolongado, os peixes-bois

novamente têm acesso à vegetação das margens e flutuantes. Dessa forma a

fêmea recupera suas condições fisiológicas, a maioria dos nascimentos ocorre

entre fevereiro e maio. Neste período as plantas são abundantes suprimindo a

demanda energética necessária ao final da gravidez e aos primeiros meses de

lactação (Best, 1982).

A gestação desta espécie é estimada como cerca de 12 meses, sugerindo

uma sincronização entre o estro da fêmea e a disponibilidade de alimento (Best,

1982; Junk & da Silva, 1997; Nascimento et al., 2003). A sazonalidade na

ocorrência dos nascimentos de filhotes foi reportada também para o peixe boi

marinho da Florida (T. manatus) e para dugongos (D. dugon) (Reynolds & Odell,

1991; Rathbun et al., 1995)

No INPA, durante um período de 12 meses (entre 1996 e 1997) foi

desenvolvido um estudo para avaliar os níveis de testosterona (hormônio

responsável pela atividade sexual dos machos estimulando a libido e

desencadeando o período reprodutivo) de três machos adultos: tupy, yanomama

e arandu em cativeiro, e se observou que os menores níveis de testosterona

ocorreram entre os meses de agosto e outubro, período que corresponde à fase

seca na várzea amazônica. Comparando com os dois outros machos

analisados, arandu apresentou menores níveis das concentrações de

testosterona durante todo o período de estudo (Pimentel, 1998).

Embora não tenha nenhum estudo específico dedicado ao

comportamento reprodutivo das espécies de peixes-bois, considera-se que o

acasalamento em sirênios é do tipo promíscuo, ainda que estratégias como a

vigia do macho impedindo o acesso de outros machos possa existir (Berta et al.,

2006). O comportamento sexual de dugongos e peixes-bois envolve competição

dos machos pelo acesso a fêmea em estro. Dugongos machos em algumas

áreas da sua distribuição exibem competição violenta entre machos pela fêmea

(Berta et al., 2006).

O único relato sobre o comportamento reprodutivo do peixe-boi da

Amazônia na natureza foi feito por Pereira, 1944, e ele comenta que no

momento da cópula, estes animais formam agregações de 15 a 30 indivíduos,

quando vários machos cortejam uma ou duas fêmeas ao mesmo tempo, com

movimentos violentos e seus corpos chegam a sair fora d’água, e o maior, mais

ágil e agressivo dos machos é o que consegue copular com a fêmea (Pereira,

1944) (Figura 02).

Figura 02: Ilustração do momento da cópula dos peixes-bois

(www.seaworld.org/infobooks/ Manatee/reproman.html).

Observações do comportamento reprodutivo do peixe-boi marinho da

Flórida, Trichechus manatus, revelam que quando uma fêmea entra em estro e é

percebida por um ou mais machos, ela responde com comportamento

“agonístico/invasivo” e por deslocamentos de até 30 Km/dia. Como ela se

movimenta, atrai outros machos que se congregam em grupos de mais de 22

indivíduos e a escoltam (Hartman, 1979; Rathbun et al., 1990; Reid et al., 1995).

Ao longo do período de estro, a fêmea é molestada praticamente continuamente

(Hartman, 1979; Rathbun et al., 1995). Esses grupos de acasalamento ou

reprodutivos persistem por cerca de 30 dias e podem percorrer distâncias acima

de 160 Km (Bengtson, 1981 apud Berta et al., 2006).

Enquanto cavalgam para uma posição mais próxima da fêmea, os

machos se empurram e batem um no outro, tentando se colocar embaixo dela

para conseguir a penetração. Durante a estação reprodutiva machos de peixe-

boi podem ter oportunidade para múltiplas cópulas numa estação reprodutiva,

mas, aparentemente, eles têm pouca garantia de paternidade (Rathbun et al.,

1995).

Em espécies em que ocorrem acasalamentos múltiplos, o sucesso

reprodutivo é o resultado de estratégias pré e pós-copulatórias (Ginsberg &

Huck, 1989). A competição de esperma pode ocorrer quando uma fêmea em

estro acasala com mais de um macho em um único ciclo reprodutivo. (Ginsberg

& Huck, 1989, Møller & Birkhead, 1989; Parker, 1990).

A recente aplicação de marcadores genéticos de alta resolução para

investigar sistemas de acasalamento, sucesso reprodutivo e relacionamentos

entre indivíduos na população, tem promovido uma riqueza de novas

informações sobre a biologia de muitas espécies (Cowlishaw & Dunbar, 1991;

Altmann et al., 1996; Clapham & Palsbøll, 1997; Coltman et al., 1998; Coltman et

al., 1999; Krutzen et al., 2004; Twiss et al., 2006).

O estudo do comportamento versus métodos genéticos para avaliar o

sucesso reprodutivo de machos no acasalamento dependem tanto de estudo

populacional quanto de estrutura social. Nos casos nos quais medidas de

comportamento não refletem exatamente as relações genealógicas, métodos

genéticos fornecem o único meio para determinar ascendência em estudos de

parentesco.

Recentes análises genéticas mostram que paternidade com precisão não

pode ser inferida por hierarquias de machos dominantes ou até mesmo por

observação de acasalamentos. Em alguns casos, a dominância ou a freqüência

de cópulas reflete ascendência correta (Cowlishaw & Dunbar, 1991; Altmann et

al., 1996, Roed et al., 2002), mas, em outros casos, a correlação entre a

dominância ou freqüência das cópulas com a ascendência é inexistente

(Coltman et al., 1999; Soltis et al., 2001).

Em muitos casos, o parentesco não pode ser determinado somente pela

observação direta do comportamento de cópula. Por exemplo, fêmeas de

chimpanzé copulam com vários machos durante seu período fértil (Houlden et

al., 1997). Marcadores genéticos utilizam informações da mãe, da prole e dos

pais potenciais e podem resolver essas incertezas de parentesco. A utilização

de marcadores microssatélites para determinação de paternidade em chipanzés

cativos revelou que um macho dominante na colônia foi responsável pela

maioria da prole (Houlden et al., 1997). Consequentemente em animais cativos

torna-se necessário movimentar os animais entre os zoológicos para minimizar o

endocruzamento e a perda da variabilidade genética (Frankham et al., 2003).

Programas de reprodução em cativeiro têm como objetivo primário

minimizar mudanças causadas por deriva genética e seleção natural.

Dependendo do número de fundadores, populações de cativeiro podem

deteriorar-se geneticamente, portanto elas devem ser manejadas para reter um

alto nível de diversidade genética em longo prazo (Frankham et al., 2003).

Em um estudo clássico de biologia da conservação, Ralls et al. (1979)

demonstraram que o endocruzamento diminui a viabilidade de juvenis em

populações de mamíferos em cativeiro.

Estudos populacionais com veado vermelho (Coulson et al., 1998), foca

do porto (Coltman et al., 1998) e ovelhas (Coltman et al., 1999), utilizaram

marcadores moleculares para estimar similaridade parental e mostrar que o nível

de endocruzamento tem significantes impactos sobre o fitness. Os juvenis que

sobrevivem, em sua maioria, são indivíduos com parentais dissimilares, pois são

menos susceptíveis as doenças.

A análise de parentesco procura determinar a maternidade e a

paternidade de indivíduos sendo essencial para estudar o impacto do

endocruzamento e para análise de pedigree. Esses parâmetros podem ser

usados no manejo genético das espécies ameaçadas, e para determinar o

tamanho efetivo das populações em cativeiro (Allendorf & Luikart, 2007).

A diversidade genética pode ser medida pela proporção de indivíduos

heterozigotos dentro da população, e também pela diversidade alélica. A

quantidade da variabilidade genética mantida dentro de populações isoladas é

determinada por interações da deriva genética, mutação e seleção. Indivíduos

heterozigotos tendem a apresentar maior sobrevida, resistência a doenças, taxa

de crescimento e sucesso reprodutivo (Frankham et al., 2003).

Comparado às espécies terrestres, estudos detalhados de parentesco em

mamíferos aquáticos são escassos. Nielsen et al. (2001) informaram que em

baleias jubarte (Megaptera novaeangliae) machos dominantes têm um sucesso

reprodutivo relativamente mais alto do que os outros machos. Clapham &

Palsbøll (1997) mostraram paternidades múltiplas para prole de diferentes anos

da mesma fêmea dessa espécie. Amos et al. (1991) investigando o

comportamento reprodutivo de baleias piloto, Globicephela melas, mostraram

que 88% de todas as amostras de machos de dentro do grupo podem ser

excluídas como sendo o pai, porém, a prole de diferentes grupos teve

freqüentemente o mesmo pai, criando coortes de meio-irmão paterno.

O programa de conservação ex situ do peixe-boi da Amazônia iniciou em

1974, no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), no então Projeto

Peixe-boi, hoje Laboratório de Mamíferos Aquáticos (LMA). Em 1985, foi criado

o Centro de Preservação e Pesquisas de Mamíferos Aquáticos (CPPMA) da

Eletronorte em Balbina, com o intuito de ajudar na conservação e apoiar as

pesquisas dos mamíferos aquáticos da Amazônia. Atualmente no existem 36

peixes-bois mantidos em cativeiro no INPA (Figura 03) e no CPPMA 40

indivíduos. O plantel dessas instituições de pesquisas é formado por filhotes

órfãos e indivíduos debilitados, apreendidos pelo IBAMA ou doados pela

população e trazidos para o cativeiro onde são reabilitados. Um enorme

problema para animais silvestre é a captura ilegal de indivíduos na natureza,

isso ocasionalmente envolve a caça de um de seus pais.

Figura 03: Parque aquático Robin Best no LMA-INPA (foto: Fernando Rosas).

No INPA, os animais estão distribuídos em piscinas de acordo com as

categorias: filhotes em amamentação, desmamados, jovens e adultos. Para

reprodução, os animais adultos foram manejados de forma que em cada um dos

tanques estivesse um grupo de animais compatíveis. O primeiro registro de

concepção e nascimento dessa espécie em cativeiro ocorreu em 1998 (da Silva

et al., 1998) e até a realização desse trabalho outros cinco filhotes foram

gerados e nascidos nos tanques do LMA/INPA e outros três no CPPMA, Balbina.

O manejo genético por análise de pedigree é extremamente poderoso, já

que promove o máximo de informação genética das populações de cativeiro

sendo também importante no controle do sucesso reprodutivo dos indivíduos

escolhidos para reprodução.

O objetivo deste trabalho é identificar a paternidade é verificar a

paternidade dos oito filhotes de peixes-bois da Amazônia gerados e nascidos em

cativeiro. Para isso, foram utilizados 20 marcadores microssatélites previamente

desenvolvidos para o peixe-boi marinho (Trichechus manatus) (Garcia-

Rodriguez et al., 2000; Pause et al., 2007). Esses marcadores foram escolhidos

por apresentarem alto polimorfismo, co-dominância e, facilidade de detecção por

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), condições ideais para discriminação

genética individual e análise de parentesco.

3.3 MATERIAL E MÉTODOS

O DNA genômico total de seis fêmeas adultas (mães), oito machos

adultos (potenciais pais) e oito filhotes de peixes-bois da Amazônia (Tabela 01 e

02) foram extraídos usando a metodologia desenvolvida por Sambrook et al.

(1989) e descrita no capítulo 1.

Tabela 01: Animais amostrados para análise de paternidade dos filhotes

nascidos em cativeiro no LMA/INPA.

Potenciais pais Mães Filhotes Data de nascimento

dos filhotes

yanomama- pai i3 (349,5 Kg) boo-mãe 02 (204 Kg) erê 08/04/1998

guarany- pai i4 (134 Kg) boo-mãe 02 (204 Kg) natimorto 19/02/2001

arandu- pai i10 (214 Kg) tukano-mãe i1 (272 Kg) tua 21/02/2002

tupy- pai i11 (219 Kg) boo-mãe 02 (204 Kg) kinjá 03/02/2004

camba-mãe i2 inaê 06/04/2005

Tabela 02: Animais amostrados para análise de paternidade dos filhotes

nascidos em cativeiro no CPPMA.

Potenciais pais Mães Filhotes Data de nascimento

dos filhotes

juruti – pai b2 (200 Kg) aira – mãe b11 (291,8 Kg) morena – b32 02/04/2005

marcelo – pai b7 (248 Kg) miri - mãe b12 (244,8 Kg) B18-(prematura) 29/12/2004

carimbó- pai b9 (201 Kg) miri - mãe b12 (244,8 Kg) uatumã – b41 05/07/2006

brooke – pai b10 (219 Kg)

preto – pai b6 (195,6 Kg)

Após a extração do DNA, foi realizada PCR seguindo protocolo descrito

no capítulo 1.

Os produtos da PCR foram genotipados utilizando seqüenciador

MegaBACE (GE-Healthcare) e analisados utilizando-se os programas Genetic e

Fragment Profile.

A análise de paternidade baseou-se na genotipagem multiloco dos

indivíduos de T. inunguis mantidos em cativeiro.

O número de alelos, freqüências alélicas e as estimativas de diversidade

genética heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) por loco, foram

determinados.

O teste para equilíbrio de Hardy-Weinberg foi realizado pelo método de

Markov (permutação de cadeia) e utilizando o programa Arlequin (Excoffier et

al., 2005). O mesmo programa foi utilizado para estimar o desequilíbrio de

ligação entre os loci estudados,

Com base nas frequências alélicas, foram calculadas as probabilidades

de identidade genética (I), por loco e combinada, segundo Paetkau et al., (1995).

Da mesma forma, foram determinadas as probabilidades de exclusão de

paternidade (Q) dos loci (Weir, 1996).

A determinação da paternidade dos filhotes baseou-se na análise simples

de exclusão, com base nos genótipos multilocos gerados, e as análises foram

obtidas pelo programa PARENTE (Cercueil et al., 2002). Os loci que se

apresentaram monomórficos para os indivíduos analisados foram retirados das

análises estatísticas, pois não iriam contribuir para resolver a identificação da

paternidade.

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O entendimento dos processos reprodutivos é a base para o sucesso no

desenvolvimento de programas de reprodução em cativeiro em longo prazo,

contribuindo de forma efetiva para conservação das espécies (Asa, 1996).

As condições nutricionais dos animais são de fundamental importância

para o sucesso na reprodução. Com a melhoria do estado nutricional e da saúde

dos peixes-bois da Amazônia mantidos em cativeiro no LMA-INPA (Chacon,

2001) e no CPPMA-Balbina, obteve-se sucesso nas concepções e nascimentos

desses animais em cativeiro.

A duração da gestação para a espécie foi estimada, tanto pelo intervalo

entre o final do período de lactação e o nascimento do segundo filhote de uma

fêmea do plantel do peixe-boi do INPA (peixe-boi 02 “boo”), quanto pelo perfil

hormonal no sangue de duas fêmeas (peixe-boi 02 “boo” e peixe-boi I1

“tukano”), como sendo de 334 dias. (Nascimento et al., 2003). A lactação do

primeiro filhote (erê) durou cerca de dois anos.

No plantel do LMA/INPA, o tamanho dos grupos de peixes-bois nos

tanques no período das cópulas variou entre 4 e 6 indivíduos. No CPPMA-

Balbina, o tamanho dos grupos de peixes-bois nos tanques no período das

cópulas variou entre 2 e 5 indivíduos.

A manutenção dos níveis altos de diversidade genética e baixos níveis de

endocruzamento é o maior objetivo em programas de conservação. As

Informações dos marcadores genéticos podem ser usadas para resolver

incertezas sobre paternidade. Dos 20 loci utilizados para a identificação da

paternidade dos peixes-bois da Amazônia, somente um primer não amplificou

para a maioria dos indivíduos e foi retirado das análises (TmaM61), 14

mostraram-se polimórficos nos indivíduos utilizados para investigação da

paternidade no cativeiro do INPA e 16 foram polimórficos para os animais de

Balbina (Tabela 03 e 04).

O número médio observado de alelos por loco foi de 3 alelos por loco

para os indivíduos provenientes do plantel do INPA e 4 para Balbina, variando

de 1 a 5 alelos no INPA e de 1 a 8 no CPPMA. Para os animais do INPA, a

heterozigosidade média observada foi 0,4848 e a heterozigosidade média

esperada foi de 0,44102. Já no CPPMA a heterozigosidade média observada foi

0,5079 e a heterozigosidade média esperada foi de 0,46726. Esses valores

revelam que a diversidade genética encontrada para os indivíduos em cativeiro

no CPPMA é ligeiramente maior do que a dos indivíduos do INPA (Tabela 03 e

04).

Tabela 03: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites utilizados neste

trabalho para 12 indivíduos de peixe-boi da Amazônia, Trichechus inunguis,

criados em cativeiro do LMA/INPA da Amazônia, cuja determinação da

paternidade está sendo investigada.

Locos A

Ho He F

I Q

TmaA01 2 0,1818 0,17316

-0,05263

0,1411 0,0734

TmaA02 4 0,7273 0,67100

-0,08844

0,5607 0,3855

TmaA03 3 0,4546 0,38528

-0,19048

0,3924 0,2011

TmaA04 1 0,7273 0,51948

-0,42857

0,3729 0,2172

TmaA09 4 1,0000 0,77489

-0,30952

0,6921 0,5210

TmaE02 1 - - - - -

TmaE08 1 - - - - -

TmaE11 1 - - - - -

TmaE26 3 0,7273 0,65368

-0,11888

0,4447 0,3744

TmaF14 1 - - - - -

TmaF34 4 0,3636 0,33333

-0,09589

0,3012 0,1804

TmaH1I 4 0,6364 0,65801

0,03448 0,5903 0,4186

TmaM61 - - - - - -

TmaM79 4 0,8182 0,69697

0,18421 0,5952 0,4205

TmaJ02 5 0,875 0,81667

-0,07692

0,7266 0,5661

TmaKb60

4 0,6364 0,70996

0,10828 0,6539 0,4806

TmaSC5 3 0,9091 0,69697

-0,3245 0,5912 0,4062

TmaH13 4 0,4546 0,55844

0,19355 0,4817 0,3170

TmaE14 6 0,7000 0,73158

0,04545 0,6653 0,5049

TmaH23 1 - - - - -

Média 3 0,4848 0,44102

-0,12450

IC 3,39 x 10

-5

QC 0,9987

Correção de Bonferroni: Hardy-Weinberg p=0,0025; desequilíbrio de ligação

p=0,00026. (-) Loco monomórfico.

Tabela 04: Caracterização genética dos 20 loci microssatélites utilizados neste

trabalho para 13 indivíduos de peixe-boi da Amazônia, Trichechus inunguis,

criados em cativeiro do CPPMA/Balbina, cuja determinação da paternidade está

sendo investigada.

Lócus A

Ho He F

I Q

TmaA01 4 0,2308 0,22154

-0,04348 0,2061 0,1164

TmaA02 4 0,9231 0,66462

-0,41176 0,5779 0,4014

TmaA03 3 0,6154 0,46462

-0,34266 0,3757 0,2247

TmaA04 2 0,2727 0,50649

0,47368 0,3666 0,2125

TmaA09 5 0,7692 0,75692

-0,01695 0,6786 0,5088

TmaE02 1 - - - - -

TmaE08 2 0,3846 0,32308

-0,20755 0,2624 0,1433

TmaE11 1 - - - - -

TmaE26 3 0,5385 0,67385

0,20755 0,5731 0,3902

TmaF14 2 0,0769 0,07692

0,00000 0,0713 0,0363

TmaF34 2 0,4546 0,45455

0,00000 0,3398 0,1934

TmaH1I 4 0,6923 0,54562

-0,28571 0,4808 0,3167

TmaM61 - - - - - -

TmaM79 3 0,6154 0,58154

-0,06077 0,5258 0,3240

TmaJ02 8 0,6923 0,82462

0,16602 0,7674 0,6264

TmaKb60 7 0,8462 0,72000

-0,18386 0,6613 0,5008

TmaSC5 7 1,0000 0,83077

-0,21401 0,7695 0,6244

TmaH13 4 0,7692 0,57580

-0,35593 0,5000 0,3324

TmaE14 7 0,7692 0,65846

-0,17647 0,6096 0,4492

TmaH23 1 - - - - -

Média 4 0,5079 0,46726

-0,09072 IC 1,22 x 10

-6

QC 0,9992

Correção de Bonferroni: Hardy-Weinberg p=0,0025; desequilíbrio de ligação

p=0,00026. (-) Loco monomórfico.

O valor da probabilidade de exclusão para um indivíduo ser o pai é

dependente do número de alelos e da distribuição das freqüências alélicas

presentes na população, no caso, dos indivíduos de cativeiro. A probabilidade de

exclusão de paternidade calculada para os loci em conjunto na análise de

parentesco foi de 0,9987 nos indivíduos do LMA/INPA e 0,999 no

CPPMA/Balbina, indicando uma probabilidade de cerca de 99% de se excluir

corretamente um indivíduo não-pai escolhido ao acaso na população (Tabela 03

e 04).

A probabilidade combinada de identidade genética foi bastante baixa

tanto para os peixes-bois no INPA (3,39 x 10

-5

) quanto para os de Balbina (1,22

x 10

-6

) demonstrando o alto poder de discriminação individual desses loci

(Tabela 03 e 04).

O coeficiente de endogamia quando apresenta valor positivo indica excesso

de homozigotos, e quando negativo indica déficit de homozigotos. O F

médio

para os loci polimórficos dos animais do INPA foi -0,12450 e de Balbina foi -

0,09072 (Tabela 03 e 04).

Se um alelo derivado paternalmente na prole não está presente nos pais

suspeitos, este macho pode ser excluído como pai potencial. Se muitos loci são

utilizados, paternidades positivas podem ser observadas com alta probabilidade.

Com base na análise SSR (Simple Sequence Repeat) multiloco, foi

possível identificar com precisão, dentro de um universo de nove pais potenciais,

os pais dos cinco filhotes investigados no INPA e dos três filhotes nascido no

cativeiro em Balbina. A probabilidade de acerto de 99,83% para o filhote “erê”;

81,38% para o “tua”, 90,21% para o filhote “natimorto”, 90,21% para o filhote

“kinjá” e 97,84% para o filhote “inaê” (Tabela 05). Nossos resultados revelaram

que 4 dos 5 filhotes nascidos em cativeiro são de 2 pais (“tupy” e “yanomama”).

Esses animais apresentaram os maiores níveis nas concentrações de

testosterona em estudo feito em 1996 e 1997 (Pimentel, 1998).

No CPPMA/ Balbina, a probabilidade de acerto foi 94,98% para a filha

“prematura” da miri, 98,38% para “morena” e 97,09% para “uatumã” (Tabela 06).

No CPPMA/Balbina, nesse plantel, os três filhotes analisados neste trabalho são

filhos do mesmo pai o “carimbó”. Segundo Stella Maris (comunicação pessoal), o

comportamento desse indivíduo destacava-se dos demais por sua grande

interação com os outros indivíduos do recinto e com os tratadores do CPPMA,

por diversas vezes foram observadas tentativas de cópula com diversas fêmeas,

inclusive com machos.

Tabela 05: Análise de exclusão de paternidade de três filhotes de T. inunguis,

nascidos em cativeiro no LMA/INPA, com base no cálculo da probabilidade de

corretamente identificar, entre os pais potenciais, o pai verdadeiro. Os valores na

tabela correspondem às probabilidades (p) calculadas segundo o programa

PARENTE (Cercueil et al., 2002).

Filhotes Mãe yanomama guarany arandu tupy

erê boo 99,83%

natimorto boo 90,21%

Tua tukano 81,38%

kinjá boo 90,21%

inaê cambá 97,84%

Tabela 06: Análise de exclusão de paternidade de três filhotes de T. inunguis,

nascidos em cativeiro no CPPMA/Balbina, com base no cálculo da probabilidade

de corretamente identificar, entre os pais potenciais, o pai verdadeiro. Os valores

na tabela correspondem às probabilidades (p) calculadas segundo o programa

PARENTE (Cercueil et al., 2002).

Filhotes Mãe juruti marcelo

carimbó brooke preto

morena aira 93,38%

prematura miri 94,98%

uatumã miri 97,09%

A sazonalidade reprodutiva do peixe-boi amazônico no ambiente natural

sugerido por Best, 1982 parece persistir mesmo em indivíduos criados e

mantidos em cativeiro, independente da variação anual do nível dos rios e da

disponibilidade de alimento. Exceto um filhote natimorto–b18, com

características de indivíduos pré-matura e abortada em dezembro de 2004,

todos os outros filhotes nascidos em cativeiro nos dois planteis estudados,

nasceram entre fevereiro e julho (Tabela 01 e 02), correspondendo ao período

de enchente-cheia, quando as condições ambientais seriam mais favoráveis.

O ciclo estral das fêmeas em idade reprodutiva e criadas em cativeiro no

INPA varia entre 20 a 27 dias, e aparentemente a atividade folicular coincide

com o período de cheia do ciclo hidrológico dos rios da bacia amazônica,

mesmo após vários anos de cativeiro, indicando uma possível sazonalidade da

atividade reprodutiva nas fêmeas (Nascimento et al., 2003).

As evidências fisiológicas indicam que provavelmente mais importante

que a variação no nível das águas dos rios, uma vez que em cativeiro esse fator

não existe, pluviosidade ou temperatura ambiente podem ser importante na

atividade reprodutiva do peixe-boi da Amazônia.

Não se sabe se fêmeas de sirênios podem armazenar esperma viável ou

que influencie de alguma forma o resultado da competição de espermatozóide.

Em geral, a simples relação entre a massa testicular x corporal durante a

estação reprodutiva poderia ser utilizada para avaliar a relativa importância da

competição de espermatozóide, porém esse dado existe apenas para dugongo

cuja razão é 0,0009, com número amostral igual a 1 (Anderson, 2002), isso

impossibilita fazer qualquer tipo de inferência.

Embora a observação de fêmeas de peixe-boi da Amazônia copulando

com vários machos insinue competição de espermatozóide, se essa baixa razão

entre massa testicular e corporal persistir, é pouco provável que ocorra

competição de espermatozóide nessa espécie. A complementação dos estudos

reprodutivos com peixe-boi da Amazônia poderá elucidar essas questões que

envolvem múltiplos acasalamentos das fêmeas e competição de

espermatozóide.

Em programa de conservação ex situ, o recurso espacial é limitado e

sistemas de acasalamentos não randômicos em cativeiro tem se mostrado

eficiente para aumentar o nível de variabilidade, controlar os níveis de

endocruzamento e aumentar o tamanho efetivo de população de cativeiro.

Informações sobre parentesco são essenciais para verificar impactos do

endocruzamento e para estudos de genealogias usando manejo genético em

espécies ameaçadas (Frankham et al., 2003).

Figura 04: Heredrograma mostrando o relacionamento dos animais do

LMA/INPA nascidos no cativeiro.

Figura 05: Heredrograma mostrando o relacionamento dos animais do CPPMA-

Balbina nascidos no cativeiro.

O conhecimento do relacionamento entre indivíduos é particularmente

importante em programas de procriação em cativeiro que buscam reduzir

acasalamentos incestuosos, para minimizar o endocruzamento e a perda de

variação genética (Frankham et al., 2003; Montgomery et al., 1997).

Assim, decisões sobre quem deve procriar e quanta descendência

deveriam ser produzidas, precisa ter como base informações de genealogias,

em lugar do desempenho reprodutivo individual ou fenótipo.

Espécies ameaçadas, em cativeiro, devem ser manejadas com a

finalidade de reter um alto nível de diversidade genética, minimizando a

endogamia (Frankham et al., 2003). Portanto, assim que os filhotes nascidos em

cativeiro atingirem a maturidade sexual, recomenda-se que o manejo no plantel

seja feito de forma que pais, irmãos e meio-irmãos não tenham oportunidade de

se acasalarem (Figura 04 e 05).

Além disso, ao se perceber que uma fêmea entrou em estro recomenda-

se que diferentes machos tenham a oportunidade de fecundá-la. Ou mesmo

retirar do grupo de acasalamento, machos que já tenham um número alto de

filhotes no plantel, aumentando as chances de outros machos acasalarem,

evitando assim a perda da diversidade genética em cativeiro. O presente

trabalho é o primeiro registro de análise de parentesco em sirênios utilizando

marcadores microssatélites.

Capítulo 3: Análise da diversidade genética populacional do peixe-boi da

Amazônia

4.1 INTRODUÇÃO

O peixe boi da Amazônia, Trichechus inunguis, (o único sirênio

exclusivamente de água doce), possui distribuição restrita a região amazônica,

onde é encontrado desde a Ilha de Marajó (Brasil) até as cabeceiras do Rio

Amazonas, na Colômbia, Peru e Equador (Domning, 1981; Best, 1984a; Rosas,

1994). A espécie tem sido encontrada nos principais tributários do Amazonas.

Na Colômbia, nos rios Amazonas, Putumayo, Caquetá (Japurá no Brasil) e baixo

Apaporis; no Peru, já foi observado nos rios Napo, Tigre, Marañon, Pastaza,

Samiria, Pacaya, Ucayali e Huallago. Não se tem registro de peixe-boi

amazônico no rio Madre de Dios na Bolívia (Husar, 1977), embora a presença

no rio Orinoco tenha sido sugerida (Husar, 1977), ainda não existem registros

(Best & da Silva, 1983).

Historicamente, os peixes-bois vêm sendo explorados tanto para

subsistência como comercialmente (Domning, 1982a). A captura indiscriminada

e em grande escala para o uso comercial foi, sem dúvida, a principal razão da

redução populacional dessa espécie na Amazônia e a baixa taxa reprodutiva

limita a habilidade desta espécie de se restabelecer rapidamente, já que uma

fêmea leva mais de 6 anos para atingir a maturidade sexual e se reproduz

somente a cada três anos (Rosas, 1994).

A espécie está listada no Apêndice I-CITES (Convenção Internacional

para comércio das espécies da Fauna e Flora Silvestres ameaçadas), como

“Vulnerável” na Lista Oficial das Espécies da fauna brasileira ameaçada de

extinção (IBAMA, 2003) e na Lista Vermelha de IUCN (União Internacional para

Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais).

No Laboratório de Mamíferos Aquáticos (INPA, Manaus-AM) e no Centro

de Preservação e Pesquisa de Mamíferos Aquáticos da Eletronorte (Balbina-AM)

existem programas de conservação “ex situ”, com o acompanhamento e a

reabilitação dos animais apreendidos devido a caça ilegal, atividades de

pesquisa e educação ambiental, reprodução em cativeiro, além de projetos de

reintrodução de peixes-bois na natureza.

A genética vem como uma importante ferramenta para analisar a

distribuição da variabilidade genética, para se obter estimativa indireta de

parâmetros populacionais como tamanho de população e taxas de migração

entre as subpopulações.

Cantanhede et al. (2005), analisando a região controle do DNA

mitocondrial de 68 indivíduos verificaram que, apesar da grande pressão de

caça sofrida, T. inunguis apresenta uma alta diversidade genética comparada

com a de T. manatus, elevado fluxo gênico entre as populações de T. inunguis

das seis áreas da Bacia Amazônica amostradas. Diferentemente, as populações

de T. manatus apresentam baixa diversidade genética (Brandley et al., 1993;

Garcia-Rodriguez et al., 1998), e estão estruturadas em três grupos ao longo de

sua distribuição desde a Flórida até o nordeste do Brasil (Garcia-Rodriguez et

al., 1998).

Este trabalho tem o propósito de estudar o nível e a distribuição da

variabilidade genética do peixe-boi da Amazônia no Brasil, utilizando

marcadores microssatélites, além de verificar se a espécie sofre algum efeito de

uma redução populacional recente. Essas informações irão subsidiar o

estabelecimento de eficientes estratégias de manejo e conservação desses

animais em cativeiro e na natureza.

4.3 MATERIAL E MÉTODOS

4.3.1 Coleta das amostras

Indivíduos provenientes de diferentes rios da Bacia Amazônica foram

amostrados. Essas amostras foram coletadas de indivíduos mantidos em

cativeiro no INPA - Manaus, CPPMA - Balbina, Museu Emílio Goeldi e Bosque

Rodrigues Alves - Belém e do Conselho Nacional dos Seringueiros - Santarém e

além carcaças obtidas em excursões realizadas nos rios Madeira, Purus e na foz

do rio Amazonas.

Foram coletadas amostras de tecido de 155 indivíduos de peixe-boi da

Amazônia correspondentes a 9 áreas: Amazonas, Amazonas-Solimões,

Solimões, Japurá, Madeira, Negro, Purus, Tapajós e “Pará” (estuário amazônico)

(Figura 01).

Uma a quatro gramas de tecido da pele cada indivíduo foi coletada

utilizando instrumento cirúrgico para biópsia cutânea. Essas amostras foram

estocadas em frascos devidamente etiquetados contendo solução saturada com

sal (NaCl) de dimetil sulfóxido (DMSO) a 20% ou em álcool puro.

O DNA genômico total de 155 indivíduos foi extraído usando a

metodologia desenvolvida por Sambrook et al., 1989.

Após a extração do DNA foi realizada PCR seguindo protocolo descrito no

capítulo 1. Os produtos das amplificações foram verificadas em eletroforese, e

em seguida as amostras foram genotipadas no seqüenciador automático

MegaBace (GE-Healthcare).

Figura 01: Procedência das amostras de Trichechus inunguis analisadas

(modificado de Fantin, 2008). Onde, 1-Amazonas; 2-Solimões-Amazonas; 3-

Solimões; 4-Japurá; 5-Madeira; 6-Negro; 7-Purus; 8-Tapajós; 9-Estuário

amazônico “Pará”.

4.3.2 Análise estatística populacional

Os softwares Genetic Profile e Fragment Profiler do seqüenciador

automático MegaBACE foram utilizados para identificar os alelos dos loci

microssatélites para os indivíduos genotipados.

Variações no tamanho dos loci de microssatélites foram analisadas por

meio das freqüências alélicas e as estimativas de diversidade genética

(heterozigosidade esperada e observada), por loco e total; divergência na

freqüência alélica e genotípica pelo método de Markov (permutação de cadeia) e

testadas para equilíbrio de Hardy-Weinberg implementadas no programa

Arlequin (Excoffier et al., 2005).

O Arlequin também foi utilizado para estimar o desequilíbrio de ligação

entre os loci estudados, assumindo que o conjunto de dados encontra-se em

equilíbrio de Hardy-Weinberg, e cuja hipótese nula é que a distribuição

genotípica de um loco é independente da distribuição em outro loco.

O número médio de alelos por loco foi estimado, fazendo à somatória do

número de alelos observados em cada um dos loci analisados em uma dada

população e dividindo o valor encontrado pelo número total de loci.

O nível de diferenciação genética intra e interpopulacional foi testado

usando a análise de variância molecular (AMOVA). Estimativas indiretas do fluxo

gênico entre as populações foram calculadas com base no número de migrantes

entre as populações por geração (M) (Excoffier et al., 1992). Essas análises

foram realizadas também no programa Arlequin (Excoffier et al., 2005), assim

como os coeficientes de endogamia (F

) e de diferenciação genética (F

A significância dos métodos foi avaliada por testes de permutação (1000

replicações) e todos os níveis de significância para os testes envolvendo

comparações múltiplas foram ajustados seguindo a correção de Bonferroni

descrita por Rice (1989).

O programa STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) foi utilizado para

identificar a existência de estrutura populacional. Este é um método de

agrupamento Bayesiano com amostragem de genótipos e que usa a suposição

de equilíbrio de Hardy-Weinberg e de ligação dentro das subpopulações para

achar o número de populações, k, que melhor se ajusta aos dados; e os

indivíduos que minimizam o equilíbrio de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de

ligação nessas subpopulações.

Assim, sem informação “a priori” sobre do desenho amostral das

populações, o programa STRUCTURE fornece uma estimativa do número de

subpopulações, cada uma contendo um conjunto de genótipos individuais que

estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Na análise populacional realizada no programa STRUCTURE, nenhuma

população foi assumida “a priori”. Foram testadas 4 hipóteses: 1 2, 3 e 4

populações. Cada hipótese foi testada 10 vezes, e a média das probabilidades

de cada hipótese das 10 corridas foram calculadas. Para cada corrida, foram

feitas de 100.000 e 1.000.000 procuras assumindo que a freqüências dos alelos

por loco não covariam entre os loci.

Para detectar sinais de gargalos populacionais foi utilizado o programa

BOTTLENECK (Piry et al., 1999). Este programa calcula para cada amostra

populacional e para cada loco, a distribuição da heterozigosidade esperada para

o número observado de alelos (k), para determinado tamanho de amostra (n)

assumindo o equilíbrio entre mutação e deriva. Essa distribuição é obtida por

simulação dos processos de coalescência de “n” genes para 3 possíveis

modelos de mutação IAM (modelo de alelos infinito), SMM (modelo mutacional

passo a passo) e TPM (modelo de mutação em duas fases). Neste programa,

para verificar se alguma população exibe um número significante de locos com

excesso de diversidade genética, foi realizado o teste de Wilcoxon, que fornece

alto poder estatístico mesmo quando são usados poucos loci polimórficos e

qualquer número de indivíduos (porém, 15-40 indivíduos e 10-15 loci

polimórficos são recomendados para alcançar alto poder) (Piry et al., 1999).

4.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.4.1 Diversidade genética dos 20 loci microssatélites transferidos de T.

manatus para T. inunguis

A descoberta de que loci de microssatélites são conservados através dos

genomas de mamíferos indicou que iniciadores desenvolvidos para amplificar

repetições em uma espécie podem amplificar locos em outras espécies

(Goldstein & Schlötterer, 1999).

A utilização de iniciadores heterólogos (amplificam dentro de um mesmo

gênero, família ou ordem) pode eliminar tempo e despesas envolvidos no

isolamento de marcadores microssatélites para cada espécie de interesse tais

como, construção de biblioteca genômica de DNA, seqüenciamento do DNA e

determinação dos primers (Goldstein & Schlötterer, 1999).

Neste trabalho, os 20 loci microssatélites, desenvolvidos para Trichechus

manatus e transferidos para Trichechus inunguis, apresentaram 190 alelos e em

média 9,5 alelos por loco, confirmando o alto poder de informação genética

desse marcador genético, mesmo em casos de amplificação cruzada em

espécies relacionadas. O número de alelos variou de 5 a 17 entre os loci. A alta

diversidade alélica encontrada nas amostras de peixe-boi da Amazônia

comparada com os outros sirênios está descrita na tabela 01.

Tabela 01: Diversidade alélica, indicada pelo número de alelos em peixe-boi da

Amazônia (T. inunguis) obtidos no presente trabalho, comparado com

Trichechus manatus latirostris, Trichechus manatus manatus e Dugong dugon

(Garcia-Rodriguez et al., 1998, McDonald, 2005 e Pause et al., 2007). Os

valores entre parênteses representam o número de amostras analisadas.

Lócus

microssatélites

Trichechus

inunguis

Trichechus

manatus

latirostris

Trichechus

manatus

Dugong

dugon

TmaA01 (155) 11 (223)1 (21) 2 (372) 6

TmaA02 (155) 11 (223) 3 (21) 3 (372) 25

TmaA03 (155) 12 (50) 2 (21) 4 (3) 1

TmaA04 (155) 17 (223) 1 (21) 3 (372) 27

TmaA09 (155) 6 (50) 1 (21) 1 (3) 3

TmaE02 (155) 9 (50) 2 (21) 2 (3) 3

TmaE08 (155) 10 (223) 3 (21) 4 (372) 8

TmaE11 (155) 5 (50) 6 (21) 8 (3) 3

TmaE26 (155) 5 (223) 2 (21) 5 (372) 17

TmaF14 (155) 8 (50) 2 (21) 2 (3) 1

TmaF34 (155) 12 (50) 1 (21) 1 (3) -

TmaH1I (155) 9 (50) 1 (21) 1 (3) 1

TmaM61 (19) 5 (50) 1 (21) 2 (3) 1

TmaM79 (155) 8 (223) 3 (21) 3 (372) 18

TmaJ02 (155) 12 (78) 2 (17) 2 (3) 1

TmaKb60 (155) 11 (78) 3 (17) 2 (3) 3

TmaSC5 (155) 8 (78) 7 (17) 3 (3) -

TmaH13 (155) 8 (78) 3 (17) 3 (3) 1

TmaE14 (155) 13 (78) 6 (17) 3 (3) 1

TmaH23 (155) 10 - - -

Total 190 50 54 120

Média 9,5 2,63 2,84 7,05

(-) Dado inexistente

A heterozigosidade é proporcional à quantidade de variância genética

para um loco e tem sido amplamente utilizada para medir diversidade genética

porque essa medida é insensível ao efeito de gargalos populacionais (Allendorf,

1986).

A heterozigosidade esperada (He) pouco influenciada pelo tamanho da

amostra e poucos indivíduos é suficiente para estimar He se diversos loci são

analisados. As estimativas das heterozigosidades observada (Ho) e esperada

(He) na maioria dos loci estudados foram altas, com os valores maiores para o

loco TmaSC5 e menores para os loci TmaA01, TmaE02, TmaE11, TmaF14 e

TmaH23, esses loci foram retirados das análises de diversidade genética inter e

intrapopulacional específica do peixe-boi da Amazônia. O loco TmaM61 não

amplificou para mais da metade das amostras e também não fez parte das

análises (Tabela 01).

Todos os loci em todas as populações se apresentaram em equilíbrio de

Hardy-Weinberg após a correção de Bonferroni. Os testes de desequilíbrio de

ligação não foram significativos para os pares de loci em cada população,

sugerindo que os loci estão em regiões independentes nos cromossomos

(Tabela 02).

O efeito do gargalo populacional sobre o número de alelos atual é mais

complexo que seu efeito sobre a heterozigosidade (Allendorf & Luikart, 2007).

Apesar da intensa exploração comercial sofrida historicamente pelo peixe-boi da

Amazônia, a alta diversidade alélica encontrada sugere que essa espécie não

sofreu um gargalo populacional severo.

Tabela 02: Número de alelos (A), Heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) por loco por população e a

probabilidade dos desvios das proporções de Hardy-Weinberg (Ho e He) para cada população de T. inunguis analisada.

População

TmaA01

TmaA02

TmaA03

TmaA04

TmaA09

TmaE02

TmaE08

TmaE11

TmaE26

TmaF14

Amazonas

A 6 9 5 7 5 4 6 3 3 5

Ho 0,4193 0,6875 0,4848 0,4193 0,6969 0,1333 0,3939 0,0937 0,5454 0,1290

He 0,3675 0,7078 0,3976 0,6499 0,7832 0,1293 0,4391 0,0917 0,6545 0,1258

p 1,00000 0,30425 0,75228 0,00115 0,49839 1,00000 0,03543 1,00000 0,23204 1,00000

AmazSoli A 5 9 6 5 6 2 5 3 3 1

Ho 0,0869 0,7272 0,6087 0,5454 0,8695 0,0434 0,3478 0,1304 0,4782 -

He 0,4077 0,7304 0,5391 0,5750 0,8096 0,0434 0,4415 0,1265 0,6599 -

p 0,00000 0,29370 0,93630 0,08720 0,06560 1,00000 0,10060 1,00000 0,01920 -

Solimões A 4 4 6 5 5 2 4 3 3 2

Ho 0,31250 0,31250 0,31250 0,46660 0,75000 0,05880 0,4666 0,1176 0,4375 0,0588

He 0,33660 0,55440 0,29230 0,56550 0,79230 0,05880 0,4046 0,1158 0,5544 0,0588

p 0,12300 0,02960 1,00000 0,09800 0,00120 1,00000 1,00000 1,00000 0,4748 1,0000

Japurá A 4 5 4 4 5 3 5 3 3 3

Ho 0,1538 0,5384 0,4615 0,5833 0,8461 0,1538 0,3846 0,1538 0,8461 0,1538

He 0,2861 0,6984 0,3969 0,5615 0,7723 0,1507 0,3507 0,1507 0,77231 0,1507

p 0,07260 0,25770 1,00000 0,07220 0,13070 1,00000 1,00000 1,00000 0,01910 1,0000

Purus A 3 7 3 2 5 2 3 2 4 3

Ho 0,3636 0,5454 0,2727 0 1 0,0909 0,5454 0,0909 0,2727 0,0909

He 0,4805 0,7835 0,7229 0,4705 0,7894 0,0909 0,4978 0,0909 0,7229 0,2554

p 0,23060 0,16890 1,00000 0,00480 0,45480 1,00000 1,00000 1,00000 0,00790 0,04970

Negro A 2 6 4 3 5 2 7 2 4 2

Ho 0,1530 0,7142 0,1428 0,5384 0,7692 0,0833 0,3571 0,0769 0,6153 0,0769

He 0,1476 0,6825 0,2672 0,4953 0,7538 0,0833 0,582 0,0769 0,7015 0,0769

p 1,00000 0,09930 0,07970 1,00000 0,08340 1,00000 0,01780 1,00000 0,01210 1,00000

Madeira A 3 6 3 4 5 4 3 1 3 1

Ho 0,2142 0,6428 0,2142 0,3846 0,8571 0,2307 0,3333 - 0,3333 -

He 0,3201 0,7248 0,2037 0,563 0,7777 0,2215 0,4239 - 0,6195 -

p 0,15450 0,03520 1,00000 0,03740 0,12060 1,00000 0,27560 - 0,11700 -

Tapajós A 4 5 5 4 6 3 5 1 4 3

Ho 0,3529 0,625 0,8125 0,4 0,7333 0,125 0,375 - 0,4666 0,125

He 0,4688 0,6693 0,6391 0,5724 0,8069 0,1229 0,4334 - 0,6436 0,1229

p 0,09200 0,21380 0,29310 0,15160 0,92630 1,00000 0,19730 - 0,02180 1,00000

Pará A 3 5 6 5 5 2 7 4 3 2

Ho 0,3846 0,4375 0,6666 0,2727 0,6 0 0,3333 0,2857 0,3846 0,1538

He 0,5138 0,5927 0,5287 0,645 0,7954 0,1375 0,3655 0,2672 0,6 0,1476

p 0,05030 0,25120 0,85460 0,00290 0,34460 0,03840 0,44040 1,00000 0,05680 1,00000

Correção de Bonferroni: Hardy-Weinberg p = 0,0026; desequilíbrio de ligação p= 0,00026. (-) Loco monomórfico

Continuação da tabela 02

População

TmaF34

TmaH1I TmaM79

TmaJ02

TmaKb60

TmaE14

TmaH13

TmaSC5

TmaH23

Amazonas

A 4 7 5 8 8 8 7 8 7

Ho 0,3548 0,7575 0,5312 0,6923 0,6562 0,4 0,6774 0,8387 0,125

He 0,4436 0,6797 0,5788 0,8061 0,8343 0,4791 0,6388 0,7932 0,2351

p 0,39390 0,00100 0,25890 0,47120

0,00010 0,35060 0,16680 0,86430 0,0050

AmazSoli A 4 4 4 8 6 9 5 5 2

Ho 0,2272 0,4347 0,5217 0,5909 0,5652 0,3636 0,7391 0,8095 0,0434

He 0,4365 0,6352 0,5439 0,7484 0,7777 0,5 0,6318 0,7119 0,0434

p 0,00280 0,01050 0,20560 0,22980

0,10220 0,04840 0,51700 0,75730 1,00000

Solimões A 6 5 4 7 6 7 5 6 1

Ho 0,4375 0,6 0,5 0,6428 0,375 0,5333 0,6 0,75 -

He 0,5121 0,7448 0,4213 0,7751 0,6996 0,6206 0,6551 0,7903 -

p 0,17990 0,00280 1,00000 0,03870

0,00620 0,13620 0,31550 0,40510 -

Japurá A 7 4 6 6 5 5 4 6 1

Ho 0,5384 0,4615 0,3846 0,7777 0,6923 0,3333 0,3333 0,8333 -

He 0,5630 0,6769 0,7169 0,8562 0,7323 0,4963 0,6666 0,7536 -

p 0,90690 0,06890 0,00980 0,46970

0,08514 0,13580 0,01630 0,26420 -

Purus A 3 3 6 8 6 7 5 5 1

Ho 0,4444 0,4545 0,5454 0,6363 0,6000 0,8888 0,7272 0,8181 -

He 0,5817 0,5844 0,5887 0,8701 0,8157 0,8235 0,671 0,7878 -

p 0,41900 0,24450 0,31840 0,11080

0,30700 0,33830 0,66070 0,98470 -

Negro A 4 6 4 7 7 6 3 7 2

Ho 0,5000 0,6428 0,5833 0,5384 0,7142 0,5000 0,7142 0,6428 0,0833

He 0,5476 0,7010 0,7644 0,7507 0,7751 0,5740 0,5925 0,6957 0,0833

p 0,86050 0,10510 0,66490 0,09050

0,06730 0,39410 0,45860 0,54660 1,00000

Madeira A 3 5 4 4 7 4 5 6 2

Ho 0,3333 0,4615 0,4166 0,7000 0,5000 0,1818 0,7142 0,6666 0,0769

He 0,5398 0,6338 0,4818 0,7105 0,7898 0,3333 0,6904 0,7753 0,0769

p 0,20140 0,02950 0,14400 0,40780

0,01760 0,09320 0,70980 0,41260 1,00000

Tapajós A 6 6 4 6 10 11 5 5 1

Ho 0,3750 0,5625 0,6428 0,7500 0,7500 0,8125 0,8750 0,8750 -

He 0,4354 0,6774 0,5767 0,7753 0,8407 0,7379 0,6733 0,6733 -

p 0,60030 0,04740 0,68510 0,22000

0,39530 0,56300 0,06700 0,86760 -

Pará A 5 7 5 6 6 5 4 6 2

Ho 0,3333 0,4666 0,4615 0,7500 0,6000 0,3333 0,5000 0,4666 0,1428

He 0,5471 0,7080 0,5138 0,7644 0,7379 0,4384 0,6666 0,6551 0,1375

p 0,07950 0,04820 0,32390 0,29400

0,33070 0,08220 0,04370 0,11840 1,00000

Correção de Bonferroni: Hardy-Weinberg p = 0,0025; desequilíbrio de ligação p= 0,00026. (-) Loco monomórfico

4.4.2 Diversidade genética entre e dentro das populações de peixe-boi da

Amazônia

O número médio de alelos variou de 4,429 (Madeira) a 6,429

(Amazonas). A heterozigosidade média observada variou de 0,4718 para

população do Pará a 0,6875 para população da área do Amazonas. Já a

heterozigosidade média esperada variou de 0,5905 a 0,7078 para a população

do Madeira e Amazonas, respectivamente. A população da área “Amazonas”

apresentou níveis de diversidade genética ligeiramente maior comparada

quando com as outras populações (Tabela 03).

Os níveis de He utilizando marcadores microssatélites observados neste

trabalho para T. inunguis são maiores que os encontrados para o peixe-boi da

Flórida (Garcia-Rodriguez et al., 2000; Pause et al., 2007), porém são similares

aos encontrados a algumas espécies de cetáceos (Valsecchi et al., 1997; Rosel

et al., 1999; Fullard et al., 2000).

Tabela 03: Diversidade genética das populações de peixe-boi da Amazônia

representada pela média: do número de alelos (A), da Heterozigosidade

observada (Ho) e esperada (He) e coeficiente de endogamia (F

População N de indivíduos A Ho He F

Amazonas 33 6,429 0,68750 0,70784 0,03040

AmazSoli 23 5,643 0,55923 0,62367 0,08193

Solimões 16 5,214 0,51318 0,59878 0,16667

Japurá 13 5,000 0,53404 0,63554 0,18110

Purus 11 4,786 0,55368 0,66021 0,12150

Negro 14 5,214 0,56953 0,63457 0,05989

Madeira 14 4,429 0,48142 0,59057 0,10230

Tapajós 16 5,857 0,64681 0,66230 0,01600

Pará 16 5,357 0,47188 0,61136 0,13490

O coeficiente de endogamia, F

, é a probabilidade que dois alelos, de um

loco de um indivíduo, serem idênticos por descendência. Os valores são

medidos a partir da proporção de Hardy-Weinberg esperada e varia de 0 a 1

(Weir & Cockerham, 1984). Valores altos de F

indicam excesso de homozigotos

nas populações. Os valores de F

variaram nos 19 loci, sendo maior na

população do Japurá (0,1811) e menor no Tapajós (0,0160) (Tabela 03).

A principal conseqüência da endogamia em termos genéticos é o aumento

da probabilidade de indivíduos que se cruzam carregarem alelos semelhantes,

em decorrência da descendência de um ancestral comum, ocasionando uma

redução da variabilidade genética (Frankham et al., 2003). A endogamia

aumentará a homozigosidade e diminuirá a heterozigosidade no genoma inteiro.

Os níveis de endogamia e de diversidade genética estão relacionados.

Quando a endogamia é alta, a heterozigosidade será baixa, e vice-versa. Um

dos principais motivos para se evitar a endogamia é o de prevenir um aumento

de indivíduos homozigotos para genes recessivos deletérios ou letais na

população. Esses efeitos poderiam levar a população a sofrer os efeitos de um

fenômeno conhecido como depressão endogâmica (Lande, 1994; Johnston &

Schoen, 1995). Os valores encontrados neste trabalho estão mais próximos de

zero, e não indicam níveis suficientes que possam levar a uma depressão

endogâmica (Spielman et al., 1977; Ralls et al., 1988) (Tabela 03).

A avaliação da estrutura genética populacional inclui medidas de

endogamia, diversidade e diferenciação, fornecendo um perfil genético das

populações.

4.4.3 Distribuição da variabilidade genética e fluxo gênico entre as

populações de T. inunguis

Gaggiotti et al., 1999, mostram que o F

tem uma performance melhor

que outros estimadores de diferenciação genética quando o tamanho amostral é

menor que 50 para cada população e o número de loci utilizado é maior que 10

e menor que 20.

A análise de variância molecular (AMOVA) revelou que a maior parte da

variação genética do peixe-boi da Amazônia ocorre entre os indivíduos dentro

das populações (91,48%) e que não existe nenhuma estrutura genética nas

populações amostradas (F

- 0,00205, p = 1,0) (Tabela 04).

Populações que ocupam lagos isolados ou rios com barreiras são

relativamente fáceis para se definir. Porém, as populações de peixes-bois

ocupam ambientes similares que se mantém interconectados, aumentando a

possibilidade de ocorrência de migrações e fluxo gênico, e que podem então se

homogeneizar fenotípica e geneticamente.

Tabela 04: Análise de variância molecular (AMOVA) para as amostras de peixe-

boi da Amazônia (Trichechus inunguis) provenientes das 9 áreas estudadas.

Quantidade de

variação

Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Componentes

da variância

Porcentagem

da variação

Entre

populações

8 19,604 -0,00492 Va -0,20

Entre indivíduos

dentro das

populações

147 384,877 0,20975 Vb 8,73

Individual 156 343 2,19872 Vc 91,48

Total 311 747,481 2,40354

(Vb): 0,08709 (p = 0,000)

(Va): -0,00205 (p = 1,000)

(Vc): 0,08522 (p = 0,000)

Segundo Hoelzel (1998), apesar da grande mobilidade e da ampla

distribuição de algumas espécies de cetáceos, a diferenciação genética pode

ocorrer até mesmo em populações adjacentes (Hoelzel et al., 1998; Wang et al.,

1999; Parsons et al., 2002; Krützen et al., 2004), como resultado da história de

vida e de aspectos demográficos, e em alguns casos mudanças históricas no

ambiente marinho.

Entender os padrões e a extensão da divergência genética entre as

populações é crucial para proteção das espécies e desenvolver planos efetivos

de conservação. Nas análises realizadas no programa Arlequin, as comparações

entre as populações de peixe-boi da Amazônia mostram valores de F

não

significativos, indicando que não existem diferenças genéticas entre elas. Os

valores de M (número absoluto de migrantes por geração) variaram de 21,902 a

infinito, confirmando o alto nível de fluxo gênico entre as populações (Tabela

05).

Tabela 05: Matriz de divergência (F

– diagonal abaixo) e fluxo gênico [M

(número absoluto de migrantes por geração), – diagonal acima] analisado entre

os pares de populações de peixe-boi da Amazônia (Trichechus inunguis).

A ausência de estruturação genética das populações de Trichechus

inunguis foi confirmada com as análises feitas no programa STRUCTURE

(Pritchard et al., 2000). Esta análise mostra que existem duas populações

diferentes, que correspondem às populações de T. inunguis e T. manatus. Esses

Oito indivíduos de T. inunguis apresentam uma porcentagem do genoma de T.

manatus e 2 de T. manatus tem um percentual de T. inunguis. Esses resultados

também indicam a presença de possíveis híbridos. Alguns indivíduos de T.

inunguis apresentam uma porcentagem do genoma de T. manatus (pequenas

barras vermelhas na porção verde da figura 02) e alguns de T. manatus tem um

percentual de T. inunguis. (pequenas barras verdes na porção vermelha da

/M Amazonas

AmazSoli

Solimões

Japurá Purus Negro Madeira

Tapajós Pará

Amazonas

- Inf 58,318 Inf Inf 73,208 Inf Inf 73,591

AmazSoli -0,0020 - 61,195 Inf Inf 745,881

140,382

Inf Inf

Solimões 0,0085 0,008 - 114,109 144,537

36,570 142,229

245,469 Inf

Japurá -0,0098 -0,002 0,004 - 441,172

149,587

Inf 130,530 69,334

Purus -0,0032 -0,003 0,003 0,001 - Inf Inf Inf Inf

Negro 0,0067 0,006 0,013 0,003 -0,003 - 77,324 85,151 55,843

Madeira -0,0019 0,003 0,003 -0,012 -0,014 0,006 - 72,862 21,902

Tapajós -0,0007 -0,008 0,0200 0,003 -0,008 0,005 0,006 - Inf

Pará 0,0067 -0,004 -0,007 0,007 -0,004 0,008 0,022 -0,020

figura 02). Análises e discussão mais aprofundada sobre hibridização serão

apresentadas no capítulo 4.

Figura 02: Gráfico de barras gerado pelo programa STRUCTURE. Cada coluna

(linha vertical) representa um indivíduo. Cada cor representa grupos diferentes e

a proporção das cores em uma coluna representa a probabilidade que a amostra

pertence a mesma população.

Estes resultados corroboram com estudos recentes utilizando a região

controle do DNA mitocondrial que sugerem a ausência de estruturação genética

nas populações de T. inunguis e um intenso fluxo gênico entre as diferentes

áreas amostradas ao longo da bacia amazônica (Cantanhede et al., 2005).

McDonald, 2005, utilizando 6 loci microssatélites em 7 populações de

dugongos na Austrália também verificou a presença de migração e elevado fluxo

gênico, porém existe certa estruturação genética devido ao isolamento por

distância. Já Garcia-Rodriguez et al. (1998) analisando a região controle do DNA

mitocondrial observaram três linhagens distintas de T. manatus ao longo de sua

distribuição desde a Flórida até o Nordeste do Brasil correspondendo 1- ao

grupo da Flórida e das Antilhas; 2- Golfo do México e Caribe; 3- Costa Atlântica

da América do Sul.

O fluxo gênico é um processo evolutivo homogeneizador que minimiza a

diferenciação genética entre as populações. Em geral, espécies que tem grande

habilidade de se movimentar e realizar trocas entre populações tem menor

divergência genética.

4.4.4 Identificação de gargalo populacional recente

Populações que experimentaram uma recente redução do seu tamanho

efetivo populacional exibem uma redução correlativa do número de alelos (k) e

da diversidade genética (He) nos loci polimórficos. Mas o número de alelos é

reduzido mais rapidamente do que a diversidade genética (Allendorf & Luikart,

2007).

O cálculo da heterozigosidade esperada (He) dependente do modelo

mutacional para os marcadores microssatélites considerados. Com o programa

BOTTLENECK (Piry et al., 1999) é possível testar os excessos de heterozigotos

com base em três modelos mutacionais: IAM, SMM e TPM.

Os resultados obtidos com o BOTTLENECK para as áreas analisadas

nesse estudo sugerem que não houve gargalo de garrafa populacional; as

freqüências dos alelos para todas as populações tiveram uma distribuição

normal, e resultados não significativos nos testes de Wilcoxon (Tabela 06).

Tabela 06: Probabilidades para excesso de heterozigotos dos testes de

Wilcoxon calculadas a partir dos modelos IAM, TPM e SMM de evolução

molecular dos marcadores microssatélites para cada população estudada.

IAM

(Wilcoxon)

TPM

(Wilcoxon)

SMM

(Wilcoxon)

Amazonas

0,2077 0,0215 0,0016

AmazSoli 0,9032 0,1726 0,0418

Solimões 0,3909 0,0905 0,0042

Japurá 0,3909 0,2412 0,0494

Madeira 0,7868 0,1677 0,0214

Negro 0,3591 0,0946 0,0102

Purus 0,9032 0,3258 0,0905

Tapajós 1,0000 0,1909 0,0052

Pará 0,2523 0,0412 0,0026

Obviamente, existe a possibilidade que o peixe-boi da Amazônia tenha

sofrido uma redução populacional devido a grande exploração comercial sofrida

pela espécie durante as décadas de 30 a 50 (Domning, 1982a), porém por terem

um longo período de vida e tempo de geração, os efeitos dessa redução não

foram detectados no ponto de vista genético.

Portanto, as análises de diversidade genética populacional de Trichechus

inunguis neste estudo indicam altos níveis de variabilidade, a existência de

grande fluxo gênico entre as áreas amostradas, confirmando os resultados

obtidos por Cantanhede et al., 2005 utilizando DNA mitocondrial. Pelo fato de

não haver estruturação genética das populações de T. inunguis, medidas de

manejo como, por exemplo, programas de reintrodução de animais de cativeiro,

tornam-se mais simples.

Capítulo 5: Avaliação de eventos de hibridização entre Trichechus manatus e T.

inunguis no estuário amazônico

5.1 INTRODUÇÃO

Na foz do Rio Amazonas, as duas espécies de peixes-bois que ocorrem

no Brasil coexistem, a marinha (Trichechus manatus) e a amazônica (Trichechus

inunguis), (Domning, 1980) (Figura 01), mas os motivos que mantém essa

aparente parapatria não são conhecidos (Domning, 1980; 1981; 1982b).

Valores relativamente altos de divergência genética foram encontrados

entre as duas espécies, porém um resultado interessante obtido por Cantanhede

et al. (2005) nas análises filogenéticas do peixe-boi amazônico foi à relação

filogenética próxima do haplótipo H27 proveniente do Rio Mojú (próximo a

estuário do Rio Amazonas) com haplótipos de T. manatus procedentes do Brasil

e da Guiana (obtido de Garcia-Rodriguez et al., 1998). O inverso, ou seja, um

haplótipo de T. manatus (HP) relacionado com T. inunguis já havia sido

encontrado por Garcia-Rodriguez et al. (1998).

Esses autores sugiram duas hipóteses: a de polimorfismo ancestral desde

a separação T. manatus - T. inunguis, ou a de uma possível zona de

hibridização no estuário do Amazonas.

Vianna et al., 2005, utilizando a região controle do DNA mitocondrial

indicaram a presença de um indivíduo com morfotipo marinho (haplótipo T),

porém relacionado à espécie amazônica. Além disso, a utilização de 2 locos

microssatélites e a análise do cariótipo desse indivíduo revelaram que este seria

um híbrido de 2

geração, ou seja, proveniente do cruzamento de uma fêmea

híbrida com um macho de T. manatus.

Zona híbrida interespecífica é a região onde duas espécies são

simpátricas e hibridizam para formar uma progênie parcialmente fértil. Zona

hibrida usualmente é resultado de um contato secundário de espécies que

divergiram por alopatria (Allendorf & Luikart, 2007). Essas zonas podem agir

como filtro seletivo que permitindo introgressão de somente alelos seletivamente

vantajosos entre espécies. Em muitos casos, híbridos são férteis e podem se

deslocar para um ou ambos os táxons parentais (Allendorf & Luikart, 2007).

A detecção de híbridos por meio de caracteres morfológicos geralmente

assume que indivíduos híbridos serão fenotipicamente intermediários dos

indivíduos parentais (Smith, 1992). Porém, híbridos que contêm a maior parte

dos seus genes de um dos táxons parental são frequentemente indistinguíveis

desse táxon parental (Leary et al., 1996).

Introgressão é o fluxo gênico entre populações cujos indivíduos

hibridizam, cruzando com um ou ambos os parentais. Uma população hibrida, é

uma população de indivíduos na qual ocorreu introgressão em vários níveis por

meio do cruzamento de várias gerações de híbridos com um ou ambos taxa

parental, além de acasalarem entre si (Rhymer & Simberloff, 1996). A

hibridização necessariamente não está acompanhada por introgressão, por

exemplo, a prole de acasalamentos híbridos pode ser estéril. Introgressão pode

ser unidirecional, com acasalamentos dos híbridos com um dos parentais

(Rhymer & Simberloff, 1996).

Eventos de hibridização na natureza são raros e normalmente estão

associados a influências antrópicas (Rhymer & Simberloff, 1996). Por exemplo,

quando ocorre uma redução populacional considerável em uma das espécies, as

chances de formação de pares para reprodução diminuem consideravelmente. A

hibridização pode ser uma ameaça para populações pequenas mesmo que os

pools gênicos não se misturem (Frankham et al., 2003). A mistura de pools

gênico de taxa distintos por introgressão tem sido chamada de “assimilação

genética”, “contaminação”, “infecção”, “deteriorização genética”.

Os efeitos prejudiciais de hibridização, com ou sem introgressão, acarreta

à extinção de muitas populações de animais e plantas e é especialmente

problemática para espécies raras que entram em contato com outras espécies

que são mais abundantes (Allendorf et al., 2001).

Os avanços tecnológicos em biologia molecular têm promovido

oportunidades para investigar interações entre populações. Essas técnicas têm

sido utilizadas também para medir o tamanho efetivo populacional e interpretar

eventos históricos como, por exemplo, gargalos populacionais.

Descobrir o que de fato está acontecendo com as espécies de peixes-

bois no estuário do rio Amazonas é um fator primordial para a conservação

dessas espécies. Os marcadores microssatélites são fundamentais para

responder tais questões porque são bi-parentais, e assim, podem avalizar a

contribuição genética de cada uma das espécies e conhecer qual a direção dos

eventos de hibridização.

Este trabalho tem o objetivo de verificar a ocorrência de eventos de

hibridização entre T. inunguis e T. manatus se eventos de hibridização estão

ocorrendo no estuário amazônico, utilizando marcadores microssatélites,

identificar os indivíduos híbridos, bem como avaliar a contribuição genética de

cada uma das espécies na formação desses híbridos.

5.3 MATERIAL E MÉTODOS

5.3.1 Coleta das amostras

Amostras de peixes-bois de diferentes rios da Bacia Amazônica foram

obtidas. Essas amostras foram coletadas de indivíduos mantidos em cativeiro no

INPA - Manaus, CPPMA - Balbina, Museu Emílio Goeldi e Bosque Rodrigues

Alves - Belém e do Conselho Nacional dos Seringueiros - Santarém e de

carcaças obtidas em excursões realizadas nos rios Madeira, Purus e na foz do

rio Amazonas.

Foram coletadas amostras de tecido de 155 indivíduos correspondentes a

9 áreas descritas no capítulo 3. Amostras de 19 indivíduos T. manatus foram

coletadas no Centro de Mamíferos Aquáticos – Itamaracá para comparação da

variabilidade genética e para verificação de eventos de hibridização.

Uma a quatro gramas de tecido da pele de Trichechus inunguis foi

coletada utilizando o instrumento cirúrgico para biópsia cutânea. Essas amostras

foram estocadas em frascos devidamente etiquetados contendo solução

saturada com sal (NaCl) de dimetil sulfóxido (DMSO) a 20% ou em álcool puro.

O DNA genômico total de 174 indivíduos foram extraídos usando a

metodologia desenvolvida por Sambrook et al., 1989.

Após a extração do DNA foi realizada PCR seguindo protocolo descrito no

capítulo 1.

5.3.2 Análises estatísticas inter-específicas

Os softwares Genetic Profile e Fragment Profiler do seqüenciador

automático MegaBACE (GE-Healthcare) foram utilizados na análise dos

microssatélites para os indivíduos genotipados.

O nível de diferenciação genética intra e inter-específica foi testado

usando a análise de variância molecular (AMOVA). Estimativas indiretas do fluxo

gênico entre as populações foram calculadas com base no número de migrantes

entre as populações por geração (M). Essas análises, assim como os

coeficientes de endogamia (F

) foram realizadas no programa Arlequin

(Excoffier et al., 2005).

A significância dos métodos foi avaliada por testes de permutação (1000

replicações) e todos os níveis de significância para os testes envolvendo

comparações múltiplas foram ajustados seguindo a correção de Bonferroni

descrita por Rice (1989).

O programa STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) foi utilizado para

identificar a existência de estrutura populacional. Este é um método de

agrupamento Bayesiano com amostragem de genótipos e que usa a suposição

de equilíbrio de Hardy-Weinberg e de ligação dentro das subpopulações para

achar o número de populações, k, que melhor se ajusta aos dados; e os

indivíduos que minimizam o equilíbrio de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de

ligação nessas subpopulações.

Para confirmar a presença de híbridos previamente observados no

capítulo 3, uma segunda análise foi realizada no programa STRUCTURE, onde

cada um dos indivíduos que foram encontrados como possíveis híbridos foram

“forçados” a pertencerem a sua espécie correspondente. Para este teste foram

designadas informações populacionais “a priori” utilizando os seguintes

parâmetros de entrada no programa STRUCTURE: USEPOP=fixo,

GENSBACK=4 e MIGPRIOR até 0,01. Esta hipótese foi testada 5 vezes, e a

média das probabilidades de cada hipótese das 5 corridas foram calculadas.

Para cada corrida, foram feitas de 100.000 e 1.000.000 de buscas assumindo

que a freqüências dos alelos por loco não covariam entre eles.

O estimador Bayesiano das taxas de migração implementado no

programa BayesAss+ (Wilson & Rannala, 2003) foi utilizado para estimar

migração entre todas as espécies com base na proporção de indivíduos

amostrados em cada uma delas. Este método calcula as taxas de imigrações

recentes entre populações. É assim, uma análise complementar e pode ser

usada juntamente com um estimador de fluxo gênico em longo prazo.

O programa MIGRATE (Beerli & Felsenstein, 2001) deduz parâmetros

populacionais para dados genéticos. A analise é feita com base no modelo de

coalescência com mutação e migração, e estima medidas de tamanho

populacional, θ, definido como 4Neµ, onde µ é a taxa de mutação, e Nm é o

número de migrantes por geração. O programa utiliza máxima verossimilhança

com métodos de comparações temporais recentes. Uma das vantagens desse

método é que ele estima o número efetivo de indivíduos imigrantes e emigrantes

de cada área amostrada.

A análise foi feita seguindo o modelo Browniano de evolução dos

microssatélites (aproximação mais adequada), com 20 permutações de Markov

(Markov Chain Monte Carlo, MCMC) de cadeia curtas com 20 passos para 500

amostras, totalizando 10000 amostras. E mais 4 permutações de cadeia longas,

com 10000 passos para 5000 amostras, totalizando 100000 amostras.

O teste de máxima verossimilhança implementado no MIGRATE testa

duas hipóteses: 1) θ é similar entre as populações e Nm varia, ou 2) θ varia

entre as populações e Nm é simétrico para cada par de populações (ou seja,

migração da população 1 para população 2 é igual à migração da população 2

para população 1).

Recentes análises utilizando métodos de probabilidade Bayesiana e de

verossimilhança, considerando uma gama de historias genealógicas possíveis e

consistentes com determinados bancos de dados, têm sido utilizada para ajustar

a variância estocástica entre os loci.

Em questões que abrangem divergência entre populações, o foco tem

sido sobre o modelo de divisão populacional que uma população ancestral se

divide em duas populações descendentes, e que posteriormente pode haver

fluxo gênico entre essas populações descendentes, conhecido com Modelo de

Isolamento com Migração (IM model) (Nielsen & Wakeley, 2001; Won & Hey,

2005; Hey & Nielsen, 2007).

Figura 01: Modelo Isolamento com Migração (IM). Os termos demográficos são

tamanho efetivo populacional (N1, N2 e Na), taxa de fluxo gênico (m1 e m2), e

tempo de divergência populacional (t). Os parâmetros têm o balanço de uma

taxa de mutação neutra (µ) utilizando um melhor modelo de mutação que se

ajusta ao banco de dados. Os parâmetros de migração são identificados pela

fonte de migrante há um tempo atrás na coalescência, ou seja, a taxa de

migração da população 1 para população 2 (m1) atualmente corresponde ao

movimento de genes da população 2 para 1 com movimentos um tempo adiante

(Won & Hey, 2005).

Esse modelo tem um grande número de parâmetros que possibilitam

captar a dinâmica que está ocorrendo nas fases de divergência populacional ou

especiação. A figura 01 representa o modelo IM mostrando uma população

ancestral e as descendentes, cada uma com um tamanho constante. A

probabilidade dos parâmetros do Modelo IM é gerada por simulação de cadeia

de Markov, tendo uma distribuição fixa que é proporcional à densidade. No

procedimento de simulação para os cálculos das estimativas do tamanho

populacional, fluxo gênico e tempo de divergência entre as espécies, foram

levados em consideração como modelo de evolução molecular o SMM que

corresponde à taxa de mutação por ano de 0,00056 (e.g. Weber & Wong, 1993;

Weber & Wong, 1993; Brinkmann et al., 1998; Hrbek et al., 2006). O tempo de

geração adotado foi de 5 anos. Para os intervalos de confiança, foram avaliados

para cada parâmetro no nível de 95%.

5.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.4.1 Análise inter-específica: T. inunguis X T. manatus

A análise genética de híbridos e hibridização usam como base em loci

diagnósticos que são fixados ou quase fixados para diferentes freqüências dos

alelos em duas populações ou em espécies que hibridizam (Cornuet et al.,

1999). Portanto, nas análises utilizaram-se principalmente estes loci

considerados diagnósticos, e pouco polimórficos. A caracterização genética de

T. manatus para os loci utilizados para análise de hibridização está apresentada

na tabela 01. A caracterização desses loci para T. inunguis está descrita na

tabela 03 do capítulo 4, sobre genética populacional.

Para os 15 loci analisados em 19 indivíduos de T. manatus, o número

médio observado de alelos por loco foi de 4,533. A heterozigosidade média

observada foi 0,3506 e a heterozigosidade média esperada foi de 0,4384

(Tabela 01). Diferenças significativas nos valores de Ho e He foram encontradas

nos loci TmaA01, TmaA09, TmaE08, TmaE11 e TmaH1I. Os testes de

desequilíbrio de ligação não foram significativos para os pares de loci analisados

Tabela 01: Número de alelos (A), Heterozigosidade observada (Ho) e esperada

(He) e a probabilidade dos desvios das proporções de Hardy-Weinberg

encontrados para os 19 indivíduos Trichechus manatus analisados.

Loci

microssatélites

A Ho He P F

TmaA01* 5 0,2222 0,5317 0,0001 0,5891

TmaA02 3 0,2500 0,2730 0,3632 0,0865

TmaA03 7 0,6315 0,6088 0,0395 -0,0384

TmaA09* 5 0,3500 0,6487 0,0000 0,4669

TmaE02 2 0,5555 0,4888 0,6468 -0,1409

TmaE08* 6 0,5000 0,6871 0,0006 0,2775

TmaE11* 5 0,5500 0,6602 0,0000 0,5891

TmaE26 7 0,3000 0,4705 0,0339 0,3684

TmaF14 2 0,0500 0,0500 1,0000 -0,0000

TmaH1I* 3 0,2500 0,2294 1,0000 -0,0919

TmaM79 1 - - - -

TmaKb60 6 0,5500 0,6641 0,0316 0,1755

TmaSC5 8 0,5500 0,8282 0,0015 0,3417

TmaH13 7 0,5000 0,4359 1,0000 -0,1515

TmaH23 1 - - - -

Média 4,533 0,3506 0,4384 0,2040

*significativo mesmo após a correção de Bonferroni

Correção de Bonferroni: Hardy-Weinberg p = 0,0025; desequilíbrio de ligação p=

0,00026. (-) Loco monomórfico.

Como já se esperava, AMOVA apresentou valores de F

de 0,48317

(p=0,0000), mostrando que existe diferenciação genética entre T. inunguis e T.

manatus. Todas as comparações par a par dos valores de F

das populações

também mostraram valores significativos de diferenciação genética entre as

duas espécies. O coeficiente de endogamia da população de T. manatus foi de

0,2040, (p=0,0000) um valor considerado alto (Spielman et al., 1977), revelando

o nível de endocruzamento da espécie (Tabela 02).

Tabela 02: Análise de variância molecular (AMOVA) para as amostras de peixe-

boi da Amazônia (Trichechus inunguis) e para o peixe-boi marinho (Trichechus

manatus).

Quantidade de

variação

Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Componentes

da variância

Porcentagem

da variação

Entre espécies 1 225,466 3,13282 Va 48,32

Entre indivíduos

dentro das

espécies

172 627,396 0,29653 Vb 4,57

Individual 174 531,500 3,05460 Vc 47,11

Total 347 1384,362 4,06869

=0,08849, p=0,00000

: 0,48317, p=0,00000

=0,52890, p=0,00000

Para dados de microssatélites, quando valores de M que atingem valor de

magnitude de 1 indivíduo migrante por geração, o fluxo gênico é considerado

suficiente para prevenir diferenciação genética (Wright 1931). O número de

migrantes M entre T. inunguis e T. manatus variou de 0,46 a 0,54, portanto a

diferenciação genética entre essas duas espécies fica evidente, o que era

esperado uma vez que são diferentes espécies (Tabela 03).

Tabela 03: Valores de F

– diagonal abaixo e M, número de migrantes por geração - diagonal acima, entre T. inunguis e

T. manatus.

/M Amazonas AmazSoli Solimões Japurá Madeira Negro Purus Tapajós Pará Marinho

Amazonas

- Inf 125,787 Inf Inf 41,273 Inf Inf 37,581 0,54

AmazSoli -0,0023 - 94,288 95,414 292,688 53,030 172,842 Inf 58,427 0,51

Solimões 0,0039 0,0052 - 160,404 Inf 21,190 510,331 24779,2 Inf 0,46

Japurá -0,0046 0,0052 0,00311 - Inf 136,180 133,350 134,661 134,708 0,51

Madeira -0,0053 0,0017 -0,005 -0,0147 - 37,423 Inf 134,708 72,004 0,47

Negro 0,0119 0,0093 0,0231* 0,0036 0,0131 - 32,415 36,040 23,086 0,51

Purus -0,0033 0,0028 0,001 0,0037 -0,0134 0,0151 - Inf Inf 0,54

Tapajós -0,0019 -0,0028 0,00002 0,0037 0,0037 0,0136 -0,0123 - Inf 0,54

Pará 0,0131 0,0084 -0,0037 0,0110 0,0069 0,0212 -0,0062 -0,0065 - 0,54

Marinho 0,4769** 0,4933** 0,5200** 0,4946** 0,5114** 0,4942** 0,4789** 0,4785** 0,4764** -

*não significativo após a correção de Bonferroni

**significativo mesmo após a correção de Bonferroni

Para estimar o valor de máxima verossimilhança de k, ou seja, do número

de populações geneticamente distintas foram feitas várias corridas utilizando o

método Bayesiano de Pritchard et al. (2000). Com os resultados dessas

aplicações obtidos no programa STRUCTURE, foi possível observar duas

“populações” bem diferentes geneticamente, que representam as espécies T.

inunguis e T. manatus e que existe fluxo gênico significantemente diferente de

zero entre as espécies (Figura 02 e Tabela 4).

Os indivíduos Para_100, Para_b13 e Para_domn rejeitam a hipótese de

que eles pertençam de fato a sua espécie correspondente (Tabela 04), ou seja,

são indivíduos híbridos. Esses três indivíduos são provenientes do estuário

amazônico “Pará”, região de simpatria entre as duas espécies de peixes-bois,

onde Domning (1980; 1982b) já tinha sugerido a existência de uma possível zona

de hibridização entre as espécies.

Figura 02: Gráfico de barras gerado pelo programa STRUCTURE. Cada coluna

(linha vertical) representa um indivíduo. Cada cor representa grupos diferentes ou

espécies e a proporção das cores em uma coluna representa a probabilidade que

a amostra pertence à espécie.

100

Tabela 04: Caracterização genética dos indivíduos híbridos detectados pelo

programa STRUCTURE. O valor de p refere-se ao teste da hipótese dos

indivíduos serem híbridos.

Indivíduo População Espécie P

% inunguis % manatus

Para_100 1 (vermelho)

T. inunguis

0,216 90% 10%

Para_b13 1 (vermelho)

T. inunguis

0,446 84% 16%

Para_domn 2 (verde)

T. manatus

0,476 13% 87%

Os indivíduos Para_100 e Para_b13 encontram-se no cativeiro do INPA e

CPPMA, respectivamente e são morfologicamente iguais aos espécimes da

espécie T. inunguis, sem qualquer característica intermediária. O que se pode

destacar é que o tamanho desses animais, quando comparados aos outros

animais da mesma idade presente no cativeiro, é muito menor (Observação

pessoal). O indivíduo Para_domn foi obtido no estuário amazônico em 1974, é

proveniente de caça, e seu coletor comentou que pelas características descritas

pelo caçador não foi possível distinguir a qual espécie o material pertencia (Daryl

Domning, comunicação pessoal).

Análises cariotípicas do peixe-boi da Amazônia (T. inunguis) revelam que o

número de cromossomos da espécie é 2n=56 cromossomos (Assis et al., 1988) e

o do peixe-boi marinho da Flórida (T. manatus) é 2n=48 (White et al., 1976; Gray

et al., 2002). Assis et al., 1988 propõe rearranjos do tipo fissão ou fusão dos

cromossomos acrocêntricos como um possível mecanismo de divergência

cariotípica entre o peixe-boi boi da Amazônia e o peixe-boi da Flórida. Gray et al.

(2002) discordam, e sugerem que a diferença pode ser explicada pela ocorrência

de variação de rearranjos intra e inter-cromossômicos como inversões,

translocações de braços inteiros, fusões em tandem, etc. É necessário averiguar o

cariótipo do peixe-boi marinho do Brasil, pois existe a possibilidade de não ser

igual ao do peixe-boi marinho da Flórida, uma vez que eles pertencem a linhagens

diferentes de DNA mitocondrial.

Investigações citogenéticas de dois indivíduos híbridos encontrados nesse

trabalho não identificaram diferenças cariotípicas com relação ao número de

101

cromossomos da espécie amazônica. A possível ocorrência de hibridização de

indivíduos cromossomicamente distintos é muito mais comum que se imagina

(Lande, 1979). Portanto, decisivamente fazem-se necessários estudos mais

aprofundados sobre a evolução cromossômica das espécies de peixe-boi do Brasil

para elucidar os processos de hibridização que estão ocorrendo na região do

estuário amazônico.

A ocorrência de eventos de hibridização entre mamíferos aquáticos é

comum. Em cetáceos odontocetos têm-se dados de detecção de híbridos entre

Tursiops truncatus e Grampus griseus; T. truncatus e Steno bredanensis, T.

truncatus e Globicehala macrorhynchus, T. truncatus e Pseudorca crassidens, T.

truncatus e Delphinus delphis, Phocoena phocoena e Phocoenoides dalli. Um

híbrido de T. truncatus e Pseudorca crassidens teve dois filhotes com machos de

T. truncatus. Um desses dois híbridos de segunda geração sobreviveu até 8 anos

de idade (Duffield & Amos, 2001). Em misticetos, existem pelo menos cinco

registros de indivíduos intermediários entre baleia azul (Balaenoptera músculus) e

fin (B. physalus) (Bérubé & Aguilar, 1998), espécies simpátricas cujo tempo de

divergência entre elas é estimado entre 3,5-5 milhões de anos (Arnason &

Gullberg, 1993).

Indivíduos morfologicamente intermediários entre T. inunguis e T. manatus

já foram reportados, assim como compartilhamento de informações genéticas

(Garcia-Rodriguez et al., 1998; Sousa-Lima, 1999; Cantanhede et al., 2005;

Vianna et al., 2005). A confirmação e a extensão dos eventos de hibridização são

de extrema importância para ambas as espécies.

Com base nos resultados obtidos no programa STRUCTURE, pode-se

inferir que no caso dos indivíduos Para_100 e Para_b13 o primeiro evento de

hibridização tem maior probabilidade de ter ocorrido há 4 gerações no passado e

no caso do indivíduo Para_domn há 3 gerações (Tabela 05). O modelo básico que

o programa utiliza é que, para cada “t” gerações no passado, houve um evento de

mistura que mesclou as “k” populações.

102

Tabela 05: Valores das probabilidades que indicam quantas gerações atrás

ocorreram os eventos de hibridização obtidos no STRUCTURE.

Indivíduo Geração 1 Geração 2 Geração 3 Geração 4

Para_100 0 0,027 0,300 0,458

Para_b13 0 0,018 0,204 0,332

Para_domn 0 0,078 0,238 0,208

O programa BayesAss+ segue uma aplicação também com uma

abordagem Bayesiana e utiliza a distribuição de genótipos multilocos individuais

para estimar a probabilidade de migrantes serem da população original (Wilson &

Rannala, 2003). Os resultados revelam que a taxa de migração é maior no sentido

T. manatus - T. inunguis indicando que este seria possivelmente a principal

direção da introgressão (Tabela 06)

Tabela 06: Probabilidade de indivíduos pertencerem a sua “população” original

estimada pelo programa BayesAss+ para as duas espécies de peixes-bois, T.

inunguis e T. manatus.

De T. inunguis De T. manatus

Para T. inunguis

0,9904 0,0150

Para T. manatus

0,0095 0,9846

O tamanho efetivo populacional histórico (θ), estimado usando o programa

MIGRATE, foi semelhante entre todas as áreas e o fluxo gênico histórico elevado

e aparentemente assimétrico, e em geral, com a população do “amazonas” e do

contribuindo mais migrantes que recebendo das demais populações (Tabela 07).

Quando existe um elevado fluxo gênico entre as populações que leva a uma

homogeneidade genética entre elas, pode ser explicado por eventos demográficos

que persistem devido a uma dispersão periódica a partir de uma fonte

populacional comum (Gaggiotti, 1996).

As análises no MIGRATE confirmam a presença de fluxo gênico entre T.

inunguis e T. manatus, com a espécie marinha de peixe-boi recebendo um

103

elevado número de migrantes de peixe-boi da Amazônia da população do “Pará”

(Nm=5,0045). Já o fluxo gênico de T. manatus e T. inunguis foi menor

(Nm=2,3395) (Tabela 07).

Comparando as figuras 03 A e 03 B do tamanho efetivo populacional das

espécies de peixe-boi, nota-se que a espécie da Amazônia apresenta maiores

valores. Os resultados mostrados na figura 03 C revela que população ancestral

de T. inunguis e T. manatus é aproximadamente 100 vezes maior que o tamanho

das populações atuais de T. inunguis e T. manatus.

As análises no programa Isolamento com migração (IMa) confirmam a

presença de fluxo gênico significantemente diferente de zero entre T. inunguis e T.

manatus. Esta diferença está clara na figura 03 D e 03 E. A direção do fluxo

gênico com Nm=7,4779 de T. manatus para T. inunguis vs Nm=1,7188 de T.

inunguis para T. manatus, confirmando os resultados da taxa de migração obtidos

no MIGRATE mostrados na tabela 07, na comparação entre a população “Pará” e

“marinho” (Nm=5,0045)

Existem sirênios estritamente marinhos, os dugongos, e exclusivos de água

doce, peixe-boi da Amazônia, e os que habitam e se deslocam tanto à água doce,

quanto a salgada, peixe-boi marinho e o peixe-boi africano. Existem diferenças

notáveis na anatomia renal entre dugongos e o peixe-boi marinho, que sugerem

estar relacionadas à morfologia do rim e as variações do habitat dessas espécies.

Essa habilidade permite o peixe-boi marinho se deslocar entre o ambiente marinho

e de água doce sem efeitos danosos (Ortiz et al., 1998; Ortiz, 2001).

Nenhum estudo de telemetria ou marcação e recaptura foi feito ainda com

os peixes-bois do Brasil na região do estuário amazônico para saber até onde

essas espécies podem se deslocar rio “adentro” ou “afora”. Existem alguns

registros de animais tipicamente marinhos que entraram no Rio Amazonas, como

foi o caso em 2007 de uma baleia minke que chegou até o rio Tapajós,

aproximadamente 800 km da foz do Rio Amazonas, mas foi a óbito. Já Trichechus

inunguis é tipicamente de água doce, não existe registro dessa espécie em águas

marinhas, e é pouco provável que se desloque para o ambiente marinho.

104

Estimativas de tamanho populacionais feitas com base em entrevistas ao

longo do litoral brasileiro revelaram que existiam aproximadamente 500 indivíduos

ao longo da costa nordestina brasileira (Lima, 1997). Assim, é possível que, no

estuário amazônico, a chance dos poucos indivíduos de peixe-boi marinho

encontrar parceiros da mesma espécie é bem menor do que a de encontrar o

peixe-boi da Amazônia.

A degradação das áreas estuarinas ao longo da costa brasileira devido à

instalação criadouros de camarões, áreas de extração de sal, além do aumento de

atividades de pesca e turismo, vêm sendo documentada. Este fator é considerado

como a principal causa dos encalhe dos filhotes de peixes-bois marinhos nas

praias do litoral brasileiro, por reduzirem as áreas disponíveis para o nascimento e

alimentação dessa espécie (Lima et al., 2005). As modificações antrópicas no

habitat aumentam o um risco para redução populacional da espécie e

potencializam as chances dos eventos de hibridização.

Esses eventos de hibridizações podem ter sérias conseqüências na

conservação das espécies de peixe-boi do Brasil, principalmente para T. manatus,

a espécie de mamífero aquático mais ameaçado do Brasil, uma vez que esse

investimento reprodutivo na produção de híbridos representa uma erosão

genética, que a longo prazo, pode levar a sua extinção.

De fato, as duas espécies de peixes-bois do Brasil correspondem a duas

linhagens evolutivamente diferenciadas, com valores altos de divergência, 3,1 a 4

milhões de anos com base em dados de DNA mt (Cantanhede et al., 2005).

Porém, na zona de simpatria ocorre um contato de pool gênico distintos,

envolvendo o intercruzamento e backcrossing (isto é, hibridização) resulta numa

hibridização introgressiva, onde ocorre uma permanente incorporação de genes

fixados de uma “população” diferenciada dentro do material genético de um outro

pool gênico distinto.

A confirmação da existência de uma zona de hibridização no estuário

amazônico tem importantes implicações para o manejo dessas espécies. Todos os

animais de cativeiro provenientes dessa região devem ser avaliados

geneticamente antes de implementação de qualquer medida de manejo desses

105

indivíduos, e principalmente em programas de reintrodução, como uma forma de

proteger as populações puras.

106

Tabela 07: Estimativa de fluxo gênico (Nm) unidirecional entre as populações de peixe-boi da Amazônia amostradas

calculadas pelo programa MIGRATE. Ln(L)= -2911,98

Imigrantes

População

Theta (θ)

[4Neµ]

4Nm [x=população recebendo migrantes]

Emigrantes Amazonas AmazSoli Solim Japurá Madeira Negro Purus Tapajós Pará Marinho

Amazonas 1,0757

------- 7,7130

3,9300

4,3550

4,9625

5,1175

3,7525

5,2935

4,5070

1,5540

AmazSoli 0,9397

7,8920

------- 5,5670

5,8000

5,5145

4,2835

5,2845

6,3610

3,7735

2,8255

Solimões 0,9222

9,9475

7,7950

------- 6,4755

4,9445

5,7785

4,7465

6,2135

6,5370

2,0475

Japurá 0,9702

6,8975

5,1140

5,9640

------- 7,4005

4,5225

4,7320

6,6390

7,1895

2,0800

Madeira 0,9512

6,4990

7,1335

6,3860

5,3350

------- 3,9085

3,2735

2,9960

6,3900

3,1495

Negro 0,9504

7,0005

6,1105

5,9700

5,8860

3,3630

------- 3,3240

5,9620

3,8760

2,9195

Purus 1,1016

5,8235

5,9190

6,0340

5,8775

4,6290

5,3085

------- 4,4775

6,3485

3,3075

Tapajós 1,0371

5,1595

3,6090

5,2710

6,3570

5,5100

4,8590

4,6535

------- 3,3795

2,9960

Pará 1,0319

6,3290

5,8290

6,0135

7,6700

5,4675

4,1545

4,7665

3,7785

------- 5,0045

Marinho 1,0318

2,4520

2,3020

2,9605

2,8900

2,1470

2,1635

2,4510

2,3755

2,3395

-------

107

Figura 03: Probabilidade para cada parâmetro está descrito em: A) Tamanho efetivo populacional de T. inunguis; B)

Tamanho efetivo populacional de T. manatus; C) Tamanho efetivo populacional da população ancestral de T. inunguis e

T. manatus.; D) Taxa de migração de T. inunguis para T. manatus (em número de indivíduos por geração); E) Taxa de

migração de T. manatus para T. inunguis (em número de indivíduos por geração); F) Tempo de divergência em anos

entre T. manatus e T. inunguis.

108

6. CONCLUSÃO

Podemos considerar que obtivemos bastante sucesso com a

amplificação cruzada dos primers microssatélites desenvolvidos para

Trichechus manatus em T. inunguis, obtendo níveis de polimorfismos

suficientes para a realização das análises de diversidade genética, e

responder questões sobre a genética populacional, análise de

relacionamento e as questões envolvendo eventos de hibridização entre as

espécies de peixe-boi do Brasil.

Com base na análise dos microssatélites, foi possível identificar com

precisão, dentro de um universo de nove pais potenciais, os pais dos cinco

filhotes investigados no INPA e dos três filhotes nascido no cativeiro em

Balbina. O conhecimento do parentesco entre indivíduos é particularmente

importante em programas de procriação em cativeiro que buscam reduzir

acasalamentos incestuosos, para minimizar o endocruzamento e a perda de

variação genética. Assim, decisões sobre quem deve procriar e quanta

descendência deveriam ser produzidas, precisa ter como base informações

de genealogias.

Nas análises populacionais realizadas com base nas amostras de 9

áreas constatamos a ausência de estruturação genética nas populações de

T. inunguis e um intenso fluxo gênico entre as diferentes áreas amostradas

ao longo da bacia amazônica, confirmando os estudos prévios utilizando DNA

mitocondrial. A ausência de estruturação genética nas populações de peixe-

boi da Amazônia facilita programas de reintrodução, pois a área de origem

dos animais e a escolha do sítio para reintrodução não seriam fatores

limitantes.

Com os resultados dessas aplicações obtidos no programa

STRUCTURE, foi possível observar duas “populações” bem diferentes

geneticamente, que representam as espécies T. inunguis e T. manatus. Os

resultados nesse programa constataram a presença de três indivíduos

híbridos na amostragem, todos provenientes do estuário amazônico.

109

Verificamos que apesar da elevada divergência genética entre as duas

espécies de peixe-boi do Brasil, T. inunguis e T. manatus, as análises

genética utilizando marcadores microssatélites revelam a existência de

pequenos valores de fluxo gênico entre as espécies, e que a taxa de

migração é maior no sentido T. manatus - T. inunguis.

As análises no MIGRATE confirmam a presença de fluxo gênico entre

T. inunguis e T. manatus, com a espécie marinha de peixe-boi recebendo um

elevado número de migrantes de peixe-boi da Amazônia da população do

“Pará” (Nm=5,0045). As análises no programa Isolamento com migração

(IMa) confirmam a presença de fluxo gênico significantemente diferente de

zero entre T. inunguis e T. manatus, e que existe claramente uma diferença

na direção do fluxo gênico, com Nm=7,4779 de T. manatus para T. inunguis,

vs Nm=1,7188 de T. inunguis para T. manatus, confirmando os resultados da

taxa de migração obtidos no MIGRATE. Essas análises indicaram claramente

o contínuo, porém desigual fluxo gênico entre T. manatus e T. inunguis

indicando que este seria o principal sentido da introgressão.

A confirmação e a extensão dos eventos de hibridização são de

extrema importância para ambas as espécies. Portanto todos os animais

provenientes dessa região têm que ser avaliado geneticamente antes de

implementar qualquer medida de manejo desses indivíduos em cativeiro, e

principalmente em programas de reintrodução, como uma forma de proteger

as populações puras.

110

7. PERSPECTIVAS

O estudo aqui apresentado sugere algumas possibilidades de pesquisas com

T. inunguis:

A continuação das análises de identificação de paternidade dos futuros

filhotes concebidos e nascidos em cativeiro como uma medida para evitar

acasalamentos incestuosos, para minimizar o endocruzamento e a perda de

variação genética em cativeiro.

A complementação de estudos reprodutivos do peixe-boi da Amazônia

que irão nortear o entendimento das questões que envolvem múltiplos

acasalamentos das fêmeas e a existência ou não de competição de

espermatozóide.

Estudos genéticos que envolvam marcadores nucleares de regiões

codificadores, como por exemplo, MHC (complexo principal de

histocompatibilidade), que corresponde a uma grande família de loci com

elevado nível de diversidade genética e que possui um papel importante no

sistema imune dos vertebrados e no combate a doenças.

O aprofundamento nas questões que envolvem a hibridização entre as

espécies de peixe-boi do Brasil, com o aumento da amostragem na região do

estuário amazônico. A utilização de outros marcadores genéticos nucleares e

a aplicação de técnicas citogenéticas, como pintura cromossômica, para

esclarecer o processo da evolução cromossômica das espécies.

111

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