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MIGUEL ALVES JÚNIOR
ESTUDO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA ADAPTABILIDADE
DIFERENCIAL DE DOIS BEGOMOVÍRUS EM TOMATEIRO E Nicotiana
benthamiana
Tese apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fitopatologia, para obtenção do
título de Doctor Scientiae
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2008
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MIGUEL ALVES JÚNIOR
ESTUDO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA ADAPTABILIDADE
DIFERENCIAL DE DOIS BEGOMOVÍRUS EM TOMATEIRO E Nicotiana
benthamiana
Tese apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fitopatologia, para obtenção do
título de Doctor Scientiae
APROVADA: 29 de fevereiro de 2008.
Prof
a
Márcia Rogéria de Almeida Lamêgo
(Co-orientadora)
Pesq. Poliane Alfenas Zerbini
Pesq. Eduardo Chumbinho de Andrade
Prof. Wagner Campos Otoni
Prof. Francisco Murilo Zerbini Júnior
(Orientador)
ads:
ii
Ao meu pai Miguel Alves Sobrinho (In Memorian)
À minha mãe Tereza Neuma da Silva Alves
Ao meu irmão Magnus Vinícius da Silva Alves
À minha irmã Itatiana Mirelli da Silva Alves
As minhas tias Aidê Gomes de Albuquerque e Alaíde Gomes de Albuquerque
A todos meus familiares e amigos.
Ofereço
À minha querida esposa Aracely Maria da Silva
Valença, pelo carinho, amor, dedicação, incentivo e
apoio para a conclusão deste curso e à minha
pequenina Maria Eduarda, pela alegria e afeto.
Dedico
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter iluminado sempre o meu caminho ao longo destes anos de vitórias, e ser
o motivo de minha existência e fé;
À Universidade Federal de Viçosa (UFV), pela oportunidade de realização deste curso;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudo;
Ao Professor Francisco Murilo Zerbini, pela oportunidade de crescimento profissional,
pela orientação, dedicação e amizade durante a realização deste trabalho;
Aos professores Murilo Geraldo de Carvalho e Márcia Rogéria de Almeida, pela co-
orientação, dedicação, ensinamentos, conselhos, valorosa amizade e respeito;
Aos professores do curso de Pós-Graduação em Fitopatologia, por seus ensinamentos;
Aos professores Wagner Otoni e Marília Ventrella, pelos ensinamentos, paciência e
ajuda nos experimentos;
Aos amigos do Laboratório de Virologia Vegetal Molecular, Alison, Alvaro, Ana
Verônica, Bruno, Carlos, Carol, Dani, Débora, Eduardo Chumbinho, Evando, Flávia,
Fernanda, Fabio, Glória, Jorge, Lidiane, Marília, Poliane, Renan, Riani e Sávio pela amizade
e pelo agradável ambiente de trabalho;
Aos funcionários Joaquim e Fizinho pelo apoio para a realização deste trabalho e à
amizade durante este tempo;
Aos meus amigos do laboratório de Anatomia Vegetal e Cultura de Tecidos, aos quais
agradeço pelo companheirismo e pela experiência compartilhada ao longo deste trabalho;
Aos amigos Walter Evangelista, Diógenes Batista e Ricardo Duarte aos quais agradeço,
em especial, pelos momentos de amizade, companherismo e por todos os momentos vividos
ao longo desta jornada;
iv
Ao meu irmão, por ser presente ao longo de minha vida e pela confiança;
À minha irmã e, especialmente, a minha mãe, por acreditarem em mim e transmitir
amor mesmo distante;
Ao meu padrinho Rabêlo pela confiança e força nas horas difíceis;
Aos meus familiares de Brasília, em especial a minha prima Maria José, por me motivar
sempre;
Aos familiares da minha esposa pela confiança, carinho e compreensão;
À minha esposa Aracely Maria, pelo companherismo, compreensão, dedicação e pela
força e apoio em todos os bons e maus momentos ao longo deste trabalho;
À minha filha Maria Eduarda Valença Alves, maior presente que pude ganhar de Deus
nessa minha estada em Viçosa.
A todos que ajudaram e apoiaram durante esses anos e contribuíram direta ou
indiretamente para a realização deste trabalho.
v
BIOGRAFIA
MIGUEL ALVES JÚNIOR, filho de Miguel Alves Sobrinho e Tereza Neuma da Silva
Alves, nasceu em Afogados da Ingazeira, Pernambuco, no dia 22 de julho de 1975.
Residiu e estudou o primeiro grau na cidade de Iguaracy em Pernambuco e o segundo
grau na cidade de Arcoverde, Pernambuco. Graduou-se nos cursos de Engenharia
Agronômica e Licenciatura no Setor de Técnicas Agropecuárias pela Universidade Federal
Rural de Pernambuco (UFRPE) na cidade de Recife, em agosto de 2001. Em setembro de
2001, foi aprovado em concurso público para o cargo de Professor Substituto na Escola
Agrotécnica Federal da Vitória do Santo Antão, Pernambuco. Em março de 2002 iniciou o
curso de Mestrado em Fitossanidade, com área de concentração em Fitopatologia na UFRPE,
realizando os experimentos da tese no ano de 2003 na Universidade de Brasília (Unb) e
Embrapa Hortaliças, ambos em Brasília, e concluindo o curso de mestrado em fevereiro de
2004. Em fevereiro de 2004, iniciou o curso de pós-graduação em Fitopatologia em nível de
doutorado na Universidade Federal de Viçosa (UFV), na cidade de Viçosa, Minas Gerais. Em
29 de fevereiro de 2008, concluiu o doutorado com a defesa da tese.
vi
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................viii
ABSTRACT.............................................................................................................................x
Introdução Geral.......................................................................................................................1
Revisão de Literatura ...............................................................................................................6
1. A família Geminiviridae..................................................................................................6
2. Replicação viral...............................................................................................................9
3. Movimento do vírus na planta.........................................................................................11
4. Interações geminivírus-hospedeiro..................................................................................13
5. Begomovírus em tomateiro no Brasil..............................................................................18
Literatura citada........................................................................................................................24
Interações positivas e negativas entre dois begomovírus bissegmentados em tomateiro
e Nicotiana benthamiana .........................................................................................................34
Abstract................................................................................................................................36
Introduction .........................................................................................................................37
Material and Methods..........................................................................................................38
Viral isolates and plant material .....................................................................................38
Kinetics of viral infection ...............................................................................................39
Viral DNA accumulation in infected plants ...................................................................39
Viral replication in protoplasts .......................................................................................40
In situ hybridization........................................................................................................41
Results .................................................................................................................................43
vii
Latent period and symptoms of ToYSV and ToRMV in single or mixed
infections in tomato and N. benthamiana.......................................................................43
Kinetics of viral infection in tomato and N. benthamiana..............................................44
Accumulation of ToYSV and ToRMV in single or mixed infections in tomato
and N. benthamiana........................................................................................................46
Replication of ToYSV and ToRMV in N. benthamiana protoplasts..............................47
Tissue tropism of ToYSV and ToRMV in tomato and N. benthamiana........................48
Discussion............................................................................................................................49
Acknowledgments ...............................................................................................................55
References ...........................................................................................................................56
Figure legends .....................................................................................................................62
viii
RESUMO
Alves-Júnior, Miguel, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de 2008. Estudo dos
mecanismos envolvidos na adaptabilidade diferencial de dois begomovírus em
tomateiro e Nicotiana benthamiana. Orientador: Francisco Murilo Zerbini Júnior. Co-
orientadores: Márcia Rogéria de Almeida Lamêgo e Murilo Geraldo de Carvalho.
Os begomovírus pertencem à família Geminiviridae, que inclui vírus com genoma de
DNA circular de fita simples, encapsidado em partículas icosaédricas geminadas. Os
begomovírus são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci, e causam doenças de grande
importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e
subtropicais. No Brasil, um complexo viral composto por pelo menos oito espécies, incluindo
o Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) e o Tomato yellow spot virus (ToYSV), é
responsável por grandes perdas na cultura do tomateiro. Os sintomas induzidos pelo ToYSV
em tomateiro e Nicotiana benthamiana são mais severos e surgem mais cedo em comparação
aos induzidos pelo ToRMV, o que sugere uma adaptação diferencial de cada vírus aos seus
hospedeiros. Neste trabalho, foram conduzidos experimentos com o objetivo de analisar o
papel de diversos fatores nessa adaptação diferencial. A cinética da infecção viral foi
analisada em plantas nas quais a folha inoculada foi removida após diversos períodos de
tempo. O acúmulo de DNA viral foi estimado em plantas infectadas, aos 14 e 28 dias pós-
inoculação (dpi). A replicação viral foi analisada em protoplastos, a 48 e 96 horas pós-
eletroporação (hpe). O tropismo de tecido viral foi analisado por meio de hibridização in situ
aos 14 dpi. Os resultados indicam que o ToYSV é mais eficiente durante os eventos iniciais
(pré-infecção sistêmica) do ciclo de infecção, atingindo uma concentração maior e
estabelecendo a infecção sistêmica mais rapidamente em relação ao ToRMV, tanto em
tomateiro quanto em N. benthamiana. Em infecções mistas, o ToRMV interfere
ix
negativamente com o ToYSV durante os estágios iniciais da infecção, mas essa interferência
cessa após o estabelecimento da infecção sistêmica. Ambos os vírus são restritos ao floema
em tomateiro. Em N. benthamiana, o ToYSV invade o mesofilo, enquanto o ToRMV é
restrito ao floema. Na infecção mista nesse hospedeiro, o ToRMV passa a infectar células do
mesofilo. Em conjunto, esses resultados confirmam a hipótese de que o ToYSV é melhor
adaptado a ambos os hospedeiros em relação ao ToRMV. Em tomateiro, essa melhor
adaptação é expressa na forma de maior eficiência nos processos iniciais de infecção,
permitindo que o ToYSV atinja maior concentração em um período de tempo mais curto, o
que talvez leve a um maior acúmulo de fatores de virulência virais. Em N. benthamiana, a
melhor adaptação é expressa também pela capacidade de invadir os tecidos do mesofilo.
x
ABSTRACT
Alves-Júnior, Miguel, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, February, 2008. Study of the
mechanisms involved in the diferential adaptability of two begomoviruses to tomato
and Nicotiana benthamiana. Adviser: Francisco Murilo Zerbini Júnior. Co-Advisers:
Márcia Rogéria de Almeida Lamêgo and Murilo Geraldo de Carvalho.
Begomoviruses belong to the family Geminiviridae, which includes viruses with a
circular, single-stranded DNA genome encapsidated in twinned icosahedral particles.
Begomoviruses are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci, and cause serious diseases in
several economically important crops, mostly in tropical and subtropical regions. In Brazil, a
viral complex comprising at least eight species, including Tomato rugose mosaic virus
(ToRMV) and Tomato yellow spot virus (ToYSV), is responsible for great losses in tomato
production. ToYSV symptoms in tomato and Nicotiana benthamiana are more severe and
appear earlier compared to ToRMV, suggesting differential adaptation of each virus to their
hosts. We performed a series of experiments in order to analyze the role of a number of
factors in this differential adaptation. The kinetics of viral infection was analyzed in plants
which had the inoculated leaf removed at various periods of time after inoculation. Viral
DNA accumulation was estimated in plants at 14 and 28 days post-inoculation (dpi). Viral
replication was analyzed in protoplasts at 48 and 96 hours post-electroporation (hpe). Viral
tissue tropism was analyzed by in situ hybridization at 14 dpi. Results indicate that ToYSV is
more efficient in carrying out the early (pre-systemic) events of infection, reaching a higher
concentration and establishing a systemic infection sooner and more efficiently than ToRMV
in both tomato and N. benthamiana. In mixed infections, ToRMV negatively interferes on
ToYSV during these initial stages of infection, but once a systemic infection is established
this negative interference ceases. Both viruses are phloem-restricted in tomato. In N.
xi
benthamiana, ToYSV invades the mesophyll, while ToRMV is phloem-restricted. During
mixed infection in this host, ToYSV releases ToRMV from the phloem. We conclude that
ToYSV is better adapted than ToRMV to both hosts. In tomato, this is expressed by its
reaching a higher concentration in a shorter period of time, which may lead to a higher
accumulation of viral virulence factors. In N. benthamiana, it is further expressed by its
ability to invade mesophyll cells.
1
INTRODUÇÃO GERAL
O tomateiro (Solanum lycopersicum L. = Lycopersicon esculentum Mill.) é
cultivado em regiões de clima tropical e subtropical, em todos os continentes durante
praticamente todo o ano. O Brasil é o nono produtor mundial de tomate, com uma
produção de aproximadamente 3,3 milhões de toneladas e um rendimento médio de
57,5 ton/ha em 2006 (Agrianual, 2007). A cultura é altamente rentável e possui
importância social devido ao grande número de empregos gerados. É considerada uma
das hortaliças de maior importância econômica no Brasil, tanto para o consumo in
natura como para o setor agroindustrial. Entretanto, diversos problemas de ordem
fitossanitária podem comprometer sua produtividade.
Nos últimos 30 anos, problemas fitossanitários associados a insetos do gênero
Bemisia (Homoptera:Aleyrodidae), conhecidos vulgarmente por “mosca-branca”, têm
se tornado freqüentes em tomateiros cultivados em todo o mundo (Morales e Anderson,
2001; Naranjo e Ellsworth, 2001). Uma das principais consequências do aumento
populacional desses insetos é o aumento da incidência e severidade de viroses causadas
por vírus pertencentes à família Geminiviridae (Mansoor et al., 2003; Morales e Jones,
2004). Os vírus pertencentes a essa família caracterizam-se pela morfologia de
2
partículas icosaédricas geminadas e genoma composto por uma ou duas moléculas de
DNA fita simples com aproximadamente 2.500 a 3.000 nucleotídeos. A família é
dividida em quatro gêneros, com base no número de componentes do genoma, tipo de
inseto vetor, gama de hospedeiros e relacionamento filogenético: Mastrevirus,
Curtovirus, Topocuvirus e Begomovirus (Rojas et al., 2005; Stanley et al., 2005). No
gênero Begomovirus são classificados os geminivírus transmitidos por diferentes
biótipos de Bemisia tabaci, que infectam dicotiledôneas e que possuem genoma com um
ou dois componentes. Begomovírus que possuem um componente genômico
(monossegmentados) estão presentes no hemisfério oriental, e são frequentemente
associados a um DNA satélite denominado DNA beta. Os begomovírus das Américas
possuem dois componentes genômicos (bissegmentados), denominados DNA-A e -B.
No DNA-A encontram-se os genes que codificam proteínas relacionadas à replicação e
encapsidação do vírus. O DNA-B possui genes que codificam duas proteínas, ambas
relacionadas com o movimento viral.
Espécies de begomovírus infectam diversas culturas de grande importância
econômica em regiões tropicais e subtropicais (Morales e Anderson, 2001; Monci et al.,
2002; Briddon, 2003). Mais de 40 espécies de begomovírus já foram relatadas
infectando o tomateiro (Fauquet et al., 2003). A emergência de novas espécies de
begomovírus infectando o tomateiro nas Américas desde a década de 1980, associada à
disseminação do biótipo B de B. tabaci, vem causando sérias perdas na produtividade
dessa cultura (Polston e Anderson, 1997; Ribeiro et al., 2003; Morales e Jones, 2004).
O primeiro relato de begomovírus associado à cultura do tomateiro no Brasil foi
feito na década de 1970, e a espécie foi denominada Tomato golden mosaic virus
(TGMV) (Matyis et al., 1975). Esse vírus não se estabeleceu nas áreas produtoras de
tomate, muito provavelmente devido ao fato de que o biótipo A de B. tabaci, o único
3
existente naquela época no país, não coloniza eficientemente o tomateiro (Bellows et
al., 1994; Brown et al., 1995). De fato, novos relatos de infecção natural do tomateiro
pelo TGMV só foram feitos duas décadas depois no estado do Rio de Janeiro (Alfenas
et al., 1998).
A partir da década de 1990 houve um aumento considerável de relatos de
begomovírus na cultura do tomateiro nas principais regiões produtoras do Brasil,
provavelmente devido a presença do biótipo B de B. tabaci, relatado pela primeira vez
em 1992 no estado de São Paulo (Melo, 1992) e que apresenta uma gama de
hospedeiros mais ampla quando comparada ao biótipo A (incluindo o tomateiro), além
de maior fecundidade e capacidade de dispersão (Bedford et al., 1994; Santos et al.,
2004). Desde essa época, diversas novas espécies de begomovírus foram relatadas:
Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV), Tomato rugose mosaic virus (ToRMV),
Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV), Tomato severe rugose virus (ToSRV),
Tomato yellow spot virus (ToYSV), Tomato infectious yellows virus (TIYV), Tomato
mottle leaf curl virus (TMoLCV), Tomato crinkle leaf yellows virus (TCrLYV),
Tomato crinkle virus (TCrV), Tomato yellow vein virus (ToYVV) e Tomato chlorotic
vein virus (TClVV) (Faria et al., 1997; Ribeiro et al., 2003; Fernandes et al., 2006;
Inoue-Nagata et al., 2006; Calegario et al., 2007). Algumas destas espécies encontram-
se amplamente distribuídas no país, enquanto outras estão restritas a algumas regiões.
Todas as espécies detectadas até o presente são de ocorrência restrita ao Brasil,
sugerindo a transferência de vírus nativos infectando plantas silvestres ou daninhas para
o tomateiro, via inseto vetor. De fato, a caracterização biológica de algumas espécies
(ToRMV, ToCMoV, ToYSV) confirmou que plantas daninhas como Nicandra
physaloides, Solanum nigrum e Datura stramonium são hospedeiras (Fernandes et al.,
2006; Calegario et al., 2007; Ribeiro et al., 2007).
4
As espécies ToRMV, ToCMoV e ToYSV foram isoladas de tomateiros no
estado de Minas Gerais e caracterizadas biologica e molecularmente (Andrade et al.,
2002; Fernandes et al., 2006; Calegario et al., 2007). Essas espécies, apesar de
apresentarem características moleculares semelhantes, possuem propriedades biológicas
distintas. A principal distinção consiste no grau de severidade dos sintomas induzidos
em tomateiro e N. benthamiana, maior para o ToYSV, intermediário para o ToRMV e
menor para o ToCMoV. Essa diferença no grau de severidade dos sintomas pode estar
relacionada a pequenas diferenças na sequência de nucleotídeos do genoma viral,
conferindo maior grau de adaptação do vírus ao hospedeiro. Uma maior adaptação ao
hospedeiro pode ser consequência de uma interação mais eficiente entre fatores virais e
do hospedeiro, levando a uma maior taxa de replicação na célula, movimento célula-a-
célula e a longa distância mais rápido e eficiente, capacidade de invadir diferentes
tecidos além do floema, no qual o vírus é inicialmente introduzido pelo inseto vetor
(uma propriedade conhecida como tropismo de tecido) (Tyler e Fields, 1996; Petty et
al., 2000), maior eficiência na transmissão pelo vetor, e supressão mais eficiente dos
mecanismos de defesa da planta (Bisaro, 2006). Em termos visuais, essa melhor
adaptação do vírus ao hospedeiro se expressa na forma de uma manifestação de
sintomas severos com um período latente curto, em comparação a um vírus pouco
adaptado ao hospedeiro que induz sintomas atenuados com um período latente mais
longo.
Curiosamente, apesar de ter sido isolado de tomateiro, o ToYSV apresenta
características moleculares e filogenéticas mais próximas às de begomovírus isolados da
planta daninha Sida sp., como o Sida mottle virus (SiMoV), Sida yellow mosaic virus
(SiYMV) e Sida micrantha mosaic virus (SimMV) (Fernandes et al., 1999; Jovel et al.,
2004; Calegario et al., 2007). Essa relação pode ser evidenciada principalmente quando
5
se comparam as sequências de aminoácidos das proteínas MP e NSP do ToYSV e do
isolado B3 do SimMV: o nível de identidade é superior a 90% (Andrade et al., 2006).
De fato, o DNA-A do ToYSV tem uma origem recombinante, com o gene que codifica
a proteína capsidial e suas sequências regulatórias derivadas de vírus que infectam Sida,
e o módulo de replicação, incluindo a origem de replicação, derivado de um vírus não
caracterizado (Andrade, 2006). Em conjunto, esses resultados sugerem que o ToYSV
pode ser o resultado de eventos de recombinação e/ou pseudo-recombinação entre vírus
que infectam Sida, transferido para o tomateiro pelo biótipo B de B. tabaci.
Apesar de induzir sintomas severos no hospedeiro natural (tomateiro) e no
hospedeiro experimental Nicotiana benthamiana, levantamentos de campo realizados
nos últimos anos indicam que as espécies ToRMV, ToCMoV, ToSRV e ToYVSV são
muito mais freqüentes do que o ToYSV, principalmente na região Sudeste do Brasil
(Ambrozevicius et al., 2002; Ribeiro et al., 2003; Inoue-Nagata et al., 2004; Ferreira et
al., 2005; Fernandes et al., 2008). Uma hipótese para a baixa prevalência do ToYSV em
campo poderia ser uma menor eficiência de transmissão pelo inseto vetor.
No contexto atual do patossistema begomovírus-tomateiro, um maior
entendimento da interação vírus-hospedeiro pode levar a novas estratégias de controle
integrado destas viroses, incluindo medidas que promovam menor disseminação do
vírus e do inseto vetor e a resistência do hospedeiro, seja ela natural ou derivada do
patógeno. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel de uma série de componentes da
infecção (cinética do estabelecimento da infecção sistêmica, acúmulo de DNA viral,
replicação viral em protoplastos e tropismo de tecido em plantas infectadas) na
adaptação diferencial do ToYSV e ToRMV ao tomateiro e Nicotiana benthamiana.
6
REVISÃO DE LITERATURA
1. A família Geminiviridae
A família Geminiviridae é caracterizada pela morfologia de partículas
icosaédricas geminadas e genoma composto por DNA de fita simples circular (Rojas et
al., 2005). Os geminivírus compreendem a segunda família mais numerosa entre os
vírus de plantas, superada apenas pela família Potyviridae (Berger et al., 2005). A
família é subdividida em quatro gêneros: Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus e
Begomovirus, que diferem entre si pelo número de componentes do genoma (um ou
dois), tipo de inseto vetor (cigarrinha ou mosca-branca), gama de hospedeiros
(monocotiledôneas ou dicotiledôneas) e relacionamento filogenético (Stanley et al.,
2005). O gênero Mastrevirus engloba os geminivírus que apresentam apenas um
componente genômico e são transmitidos por diversas espécies de cigarrinhas
(Homoptera:Cicadellidae) a monocotiledôneas. A espécie-tipo é o Maize streak virus
(MSV), um vírus economicamente importante na cultura do milho no continente
africano. O gênero Curtovirus inclui geminivírus com um componente genômico
transmitidos por diferentes espécies de cigarrinhas (Homoptera:Cicadellidae) a plantas
dicotiledôneas. O Beet curly top virus (BCTV) é a espécie-tipo e a mais importante
7
economicamente. O gênero Topocuvirus possui apenas uma espécie, denominada
Tomato pseudo-curly top virus (TPCTV), com um componente genômico e transmitida
pela cigarrinha Micrutalis malleifera (Homoptera:Auchenorrhyncha) a espécies
dicotiledôneas. O gênero Begomovirus possui espécies transmitidas pelos diferentes
biótipos de Bemisia tabaci a dicotiledôneas, e que apresentam um ou dois componentes
genômicos (Stanley et al., 2005). Begomovírus do Velho Mundo (Europa, Ásia, África
e Oceania) são na sua maioria monossegmentados e estão, geralmente, associados a um
DNA satélite denominado DNA beta (Briddon, 2003). Já os begomovírus do Novo
Mundo (Américas) apresentam-se, na sua maioria, bissegmentados. O gênero
Begomovirus possui o maior número de espécies da família Geminiviridae. Entre os
begomovírus de maior importância econômica pode-se citar o Bean golden mosaic virus
(BGMV), o African cassava mosaic virus (ACMV) e o Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCV) (Pita et al., 2001; Monci et al., 2002; Potter et al., 2003), que causam
doenças severas nas culturas do feijão, mandioca e tomate, respectivamente (Morales e
Anderson, 2001; Varma e Malathi, 2003). Nas Américas o tomateiro é uma das espécies
de plantas mais afetadas por begomoviroses, com epidemias que podem levar a 100%
de perdas e sérias consequências econômicas e sociais (Faria et al., 2000; Morales e
Anderson, 2001).
Os begomovírus que ocorrem nas Américas possuem genoma dividido em dois
componentes denominados DNA-A e DNA-B, com comprimento semelhante de
aproximadamente 2.600 nucleotídeos. Seu genoma contém capacidade limitada para
codificar proteínas, dependendo de fatores do hospedeiro para replicação do DNA e
movimento (Hanley-Bowdoin et al., 2004). No DNA-A encontram-se os genes
codificadores das proteínas responsáveis pela replicação viral e encapsidação. O DNA-
B possui genes codificadores das proteínas de movimento célula-a-célula e a longa
8
distância do vírus na planta (revisado por Hanley-Bowdoin et al., 1999). Ambos os
componentes são necessários para a infecção sistêmica de plantas. Exceto por uma
região intergênica de aproximadamente 200 nucleotídeos, denominada região comum
(RC), os dois componentes não apresentam identidade em suas seqüências de
nucleotídeos. A RC contém a origem de replicação (ori) dos geminivírus, que inclui
diversos elementos de seqüência altamente conservados entre as diferentes espécies do
gênero que são reconhecidos pela proteína Rep (Argüello-Astorga et al., 1994; Fontes et
al., 1994). A partir da região intergênica divergem os genes virais nos sentidos viral e
complementar (Figura 1). Desta forma, a transcrição é bidirecional em cada
componente.
Figura 1. Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic
virus (BGYMV), espécie-tipo do gênero Begomovirus. Os círculos representam o
genoma viral, com dois componentes (DNA-A e DNA-B) de aproximadamente 2.600
nucleotídeos cada. Uma seqüência de aproximadamente 200 nucleotídeos denominada
região comum (“common region”, CR) contém a origem de replicação viral, com uma
estrutura em forma de grampo característica contendo a seqüência invariável de nove
nucleotídeos (TAATATT↓AC), conservada em todos os membros da família
Geminiviridae. A seta (↓) indica o sítio de início da replicação do DNA viral. As setas
azuis e vermelhas indicam os genes virais e a direção em que ocorre a transcrição (viral
e complementar, respectivamente). Reproduzido de Gutierrez et al. (2004)
9
As espécies do gênero Begomovirus têm o potencial de codificar de quatro a seis
proteínas no DNA-A: uma proteína associada à replicação (Rep, “replication-associated
protein”, anteriormente denominada AC1 ou AL1), iniciadora do mecanismo de
replicação por círculo rolante, com propriedades de ligação a ácidos nucléicos,
endonuclease e ATPase (Fontes et al., 1992; Orozco et al., 1997); uma proteína
transativadora (Trap, “trans-activating protein”, anteriormente AC2 ou AL2), um fator
transcricional dos genes cp e nsp, além de atuar como proteína supressora dos
mecanismos de defesa da planta (Sunter e Bisaro, 1992; Voinnet et al., 1999; Wang et
al., 2005); a proteína Ren (“replication-enhancer protein”, anteriormente AC3 ou AL3),
fator acessório (não essencial) na replicação viral (Sunter et al., 1990; Pedersen e
Hanley-Bowdoin, 1994); e a proteína capsidial (CP, “coat protein”, anteriormente AV1
ou AR1), que além de formar o capsídeo viral é essencial para a transmissão do vírus
pelo inseto vetor (Briddon et al., 1990; Hofer et al., 1997). Alguns begomovírus
apresentam em seu genoma uma ORF denominada AC4, que codifica uma proteína
supressora de silenciamento gênico (Vanitharani et al., 2004). O DNA-B codifica as
proteínas MP (“movement protein”, anteriormente BC1 ou BL1), envolvida no
movimento célula-a-célula do vírus por meio do aumento do limite de exclusão dos
plasmodesmas (Noueiry et al., 1994), e a proteína NSP (“nuclear shuttle protein”,
anteriormente BV1 ou BR1), responsável pelo transporte do DNA através do envelope
nuclear (Noueiry et al., 1994; Sanderfoot et al., 1996).
2. Replicação viral
No processo de infecção e replicação dos geminivírus, incluindo-se os
begomovírus, as partículas virais são inoculadas na planta por meio do inseto vetor, e o
genoma viral (ssDNA) se desassocia de forma espontânea do capsídeo (Lazarowitz,
10
1992; Palmer e Rybicki, 1998). Em seguida o DNA viral é transportado para o núcleo
da célula hospedeira, onde é convertido em um intermediário de fita dupla (dsDNA),
designado forma replicativa, ou RF. A maneira como esta conversão ocorre não é
conhecida, porém evidências indiretas indicam que é realizada por fatores do
hospedeiro. A RF serve como molde para síntese de novos ssDNA e dos mRNAs virais.
O genoma viral é replicado por meio de um mecanismo conhecido por círculo rolante,
semelhante ao utilizado pelos bacteriófagos ϕX174 e M13, utilizando a RF como molde
(Stanley, 1995). Existem evidências que sugerem um mecanismo alternativo de
replicação para os geminivírus denominado replicação dependente de recombinação
(RDR) (Jeske et al., 2001).
A origem de replicação está localizada na região intergênica, comum entre os
dois componentes genômicos. Nesta região está localizada uma seqüência repetida e
invertida composta predominantemente por guanina e citosina, que forma uma estrutura
conservada (“structurally-conserved element”, SCE) em forma de grampo, com uma
alça contendo a seqüência conservada 5’-TAATATTAC-3’, encontrada em todos os
geminivírus (Orozco e Hanley-Bowdoin, 1996). É neste nonanucleotídeo que ocorre a
clivagem pela proteína Rep, que inicia o processo de replicação por círculo rolante. A
proteína Rep atua como uma endonuclease sítio-específica com requerimento de
estrutura e de seqüência (Laufs et al., 1995; Orozco e Hanley-Bowdoin, 1998). Na
região comum encontram-se também seqüências específicas para a ligação da proteína
Rep (Fontes et al., 1992; Fontes et al., 1994) e regiões promotoras da RNA polimerase
tipo II de plantas, responsável pela transcrição dos genes virais.
O sítio de ligação de Rep ao DNA viral está localizado entre a caixa TATA do
gene rep e a SCE (Orozco e Hanley-Bowdoin, 1998), sendo constituído por duas
seqüências em repetição direta (iterons). A ligação de Rep aos iterons é essencial para o
11
início da replicação. Após a ligação de Rep ao DNA viral e estabilização do complexo
formado por Rep, Ren e fatores do hospedeiro, a proteína Rep cliva o nonanucleotídeo
localizado na SCE, dando início à replicação por círculo rolante (Gutierrez, 1999).
3. Movimento do vírus na planta
O estabelecimento de um processo infeccioso na planta depende da capacidade
do vírus de replicar na primeira célula infectada e em seguida mover-se sistemicamente,
alcançando inicialmente as células vizinhas e por fim os tecidos distantes da célula
inicialmente infectada. O movimento no interior do hospedeiro pode ser dividido em
dois processos: movimento célula-a-célula, via plasmodesmas, e movimento a longa
distância, no qual o vírus atinge o sistema vascular e é transportado sistemicamente para
toda a planta hospedeira. Para isto, os begomovírus com dois componentes codificam a
partir do DNA-B duas proteínas relacionadas ao movimento viral. A proteína MP
associa-se à parede celular e altera o limite de exclusão dos plasmodesmas,
possibilitando o transporte do genoma viral (Noueiry et al., 1994). Como os
begomovírus se multiplicam no núcleo da célula infectada, é necessária uma etapa
adicional de transporte do núcleo para o citoplasma (Palmer e Rybicki, 1998), que é
realizada pela proteína NSP. Esta proteína atua cooperativamente com MP para
movimentar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular (Sanderfoot e
Lazarowitz, 1995). As duas proteínas são requeridas para o estabelecimento de uma
infecção sistêmica.
Tanto MP quanto NSP reconhecem o DNA de maneira específica em relação à
forma e comprimento (Rojas et al., 1998), o que a princípio eliminaria a necessidade da
proteína capsidial para o movimento a longa distância. De fato, a proteína capsidial é
dispensável para o estabelecimento de infecção sistêmica para a maioria dos
12
begomovírus já estudados (Rojas et al., 2005). Entretanto, trabalhos realizados por
Galvão et al. (2003) demonstraram que o DNA-A do Tomato chlorotic mottle virus
(ToCMoV), na ausência do DNA-B, não foi capaz de infectar plantas de tomateiro, mas
infectou sistemicamente e induziu sintomas em plantas de N. benthamiana,
apresentando acúmulo de DNA viral nas folhas apicais. O DNA-A de outros
begomovírus bissegmentados, como o Abutilon mosaic virus (AbMV) e o African
cassava mosaic virus (ACMV), também tem a capacidade de infectar sistemicamente N.
benthamiana na ausência do DNA-B (Klinkenberg e Stanley, 1990; Evans e Jeske,
1993). Nesses casos, a proteína CP provavelmente exerce a função de movimento. Em
apoio a essa hipótese, a proteína capsidial é essencial para o processo de infecção
sistêmica do begomovírus monossegmentado Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV).
Para esse vírus, a CP é responsável pelo transporte do DNA viral do núcleo para o
citoplasma, atuando de forma análoga à NSP dos begomovírus bissegmentados (Rojas
et al., 2001), e o movimento célula-a-célula através dos plasmodesmas é mediado pelas
proteínas C4 e/ou V1 (Rojas et al., 2001).
Os geminivírus normalmente se restringem às células associadas ao floema, que
são os sítios de alimentação do inseto vetor. Entretanto, alguns begomovírus são
capazes de infectar, além dos feixes vasculares, os tecidos associados ao mesofilo. O
tropismo de tecido é dependente do hospedeiro e de fatores genéticos virais (Wege e
Pohl, 2007). Trabalhos de complementação e recombinação entre os begomovírus Bean
golden mosaic virus (BGMV), um vírus que infecta feijoeiro mas não infecta tomateiro,
e Tomato golden mosaic virus (TGMV), um vírus que infecta tomateiro e é restrito ao
floema em feijoeiro, identificaram as regiões correspondentes aos genes trap, nsp/mp e
a região reguladora da transcrição do gene nsp, denominada BRi, como determinantes
virais para o tropismo de tecidos em plantas de feijoeiro e N. benthamiana (Morra e
13
Petty, 2000). No hospedeiro comum N. benthamiana, o TGMV induz sintomas severos
e infecta células do floema e do mesofilo. Já o BGMV não induz sintomas e permanece
limitado às células do floema. Fragmentos do genoma viral correspondentes aos genes
supracitados foram permutados formando vírus híbridos entre o TGMV e BGMV.
Regiões do genoma do TGMV inseridas no genoma do BGMV foram responsáveis pela
mudança do tropismo de tecido deste vírus em N. benthamiana, tornado-o capaz de
invadir células do mesofilo. Efeito contrário foi observado quando regiões do genoma
do BGMV foram inseridas no genoma do TGMV: os híbridos correspondentes a estas
mudanças tornaram-se incapazes de invadir o mesofilo (Morra e Petty, 2000).
O tropismo de tecido é dependente também de fatores do hospedeiro, pois
embora o TGMV infecte o mesofilo de N. benthamiana, esse vírus é restrito ao floema
em feijoeiro. Entretanto, os fatores do hospedeiro que determinam essa característica
ainda não foram identificados (Morra e Petty, 2000). Estudos semelhantes realizados
com duas estirpes de TGMV que induzem sintomas distintos identificaram uma região
compreendendo a região 3’ do gene codificador da proteína MP e a região intergênica
do DNA-B (que não inclui a região BRi) como responsável pela diferença nos sintomas
induzidos pelas duas estirpes (Saunders et al., 2001).
4. Interações geminivírus-hospedeiro
Além de apresentarem grande importância econômica como fitopatógenos, os
geminivírus possuem características que os tornam atraentes para o estudo da interação
vírus-hospedeiro: genoma pequeno composto de DNA circular de fita dupla, e
replicação no núcleo da célula hospedeira utilizando diversos componentes da
maquinaria de replicação da planta. Além disso, o genoma de DNA é facilmente
14
manipulado por métodos de clonagem molecular, e existem métodos eficientes de
inoculação independentes do vetor natural (Rojas et al., 2005).
Resultados obtidos por diferentes grupos de pesquisadores demonstram a
multiplicidade de interações entre os geminivírus e seus hospedeiros. Essas interações
incluem modificações na estrutura e função de plasmodesmas (Noueiry et al., 1994;
Gilbertson et al., 2003), respostas a diferentes mecanismos de defesa da planta
(Kjemtrup et al., 1998; Fontes et al., 2004; Vanitharani et al., 2004; Trinks et al., 2005),
interação com proteínas envolvidas na regulação do desenvolvimento celular (Latham et
al., 1997; Xie et al., 1999), e modificações no padrão de expressão gênica do
hospedeiro, principalmente no sentido de ativar genes envolvidos na síntese de DNA e
na divisão celular (Arguello-Astorga et al., 2004; revisado por Hanley-Bowdoin et al.,
2004).
O sucesso da disseminação do vírus pela planta implica na infecção de novas
células hospedeiras e constante replicação viral nessas células. O genoma dos
geminivírus não codifica uma DNA polimerase, e diversos fatores acessórios
codificados pelo hospedeiro são requeridos para replicação e movimento sistêmico do
vírus (Gutierrez, 2000). Como os geminivírus infectam células vegetais diferenciadas,
nas quais não ocorre mais divisão celular, o vírus deve ser capaz de ativar a transcrição
dos genes do hospedeiro envolvidos no processo de síntese de enzimas e outros fatores
necessários para a replicação de DNA. De fato, diversos trabalhos comprovaram que a
proteína Rep dos geminivírus é responsável pela ativação da síntese de DNA em células
totalmente diferenciadas. Essa ativação se dá pela indução do acúmulo de PCNA
(“proliferating cell nuclear antigen”), uma proteína que esta associada à síntese de DNA
em plantas (Nagar et al., 1995; Palmer et al., 1998; Egelkrout et al., 2001; Nagar et al.,
2002). Alguns membros da família Geminiviridae induzem não somente a expressão e
15
acúmulo de PCNA, mas também interferem com a regulação do ciclo celular. A
interação entre Rep e componentes reguladores do ciclo celular de plantas foi revisada
por Gutierrez et al. (2004). A outra proteína viral envolvida na replicação, Ren, interage
com a proteína SINAC1, pertencente à família de fatores de transcrição que possuem
domínio NAC (“no apical meristem, Arabidopsis thaliana factor, cup-shaped
cotyledon”), o que também está correlacionando com aumento no acúmulo de DNA
viral. Ren interage e induz a expressão de SINAC1, um ativador da transcrição de genes
em plantas (Selth et al., 2005).
As plantas possuem diferentes mecanismos de defesa em resposta a infecções
virais. Algumas respostas, como aquelas mediadas por ácido salicílico ou silenciamento
gênico, são objeto de intenso estudo (Baulcombe, 2004; Durrant e Dong, 2004). Em
contrapartida, o papel de defesas mediadas por rotas metabólicas primárias tem recebido
menor atenção. Os geminivírus interferem em diferentes respostas de defesa (Wang et
al., 2003; Fontes et al., 2004; Vanitharani et al., 2004; Trinks et al., 2005),
provavelmente como uma forma de maximizar a replicação viral em termos
quantitativos (permitindo o acúmulo de maiores quantidades de partículas virais na
célula infectada) e temporais (diminuindo o tempo necessário para o estabelecimento da
infecção sistêmica). Algumas dessas interações já foram identificadas, embora os
mecanismos moleculares ainda não tenham sido totalmente elucidados.
Utilizando o sistema duplo-híbrido de levedura foi possível demonstrar que a
proteína Trap inativa uma proteína cinase, designada SNF1 (“sucrose non-
fermenting 1”). Essa inativação leva a um aumento na suscetibilidade da planta, por ser
a cinase SNF1 um regulador chave de respostas a estresses celulares que reduzem a
disponibilidade de ATP (Hao et al., 2003). Trap também interage e inativa outra cinase,
ADK (“adenosine kinase”), responsável pela síntese de 5’-AMP a partir de adenosina e
16
ATP (Wang et al., 2003). As duas interações provavelmente estão interligadas, pois
SNF1 é ativada por 5’-AMP. O fato de Trap interagir com SNF1 e ADK sugere que as
respostas metabólicas mediadas por SNF1 são um componente importante da resposta
de defesa a vírus, e que os geminivírus desenvolveram uma estratégia de contra-ataque
baseada na inativação de dois componentes iniciais dessa via de defesa (SNF1 e ADK).
Esses resultados demonstram ainda que genes responsáveis por processos metabólicos
primários (“housekeeping genes”) também podem participar de respostas de defesa a
estresses bióticos.
O silenciamento de RNA engloba uma série de processos nucleares e
citoplasmáticos envolvidos na regulação da expressão gênica em nível pós-
transcricional, por meio da degradação seqüência-específica de mRNAs alvos
(Baulcombe, 2004; Voinnet, 2005). O silenciamento de RNA constitui também um
mecanismo eficiente de defesa de plantas contra vírus (Vance e Vaucheret, 2001).
Proteínas virais com a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em diferentes
pontos da via metabólica já foram identificadas em um grande número de vírus de
plantas e mesmo em alguns vírus de animais (Roth et al., 2004). No caso dos
geminivírus, as proteínas Trap e AC4 já foram identificadas como supressoras de
silenciamento (Voinnet et al., 1999; Van Wezel et al., 2001; Vanitharani et al., 2004;
Trinks et al., 2005; revisado por Bisaro, 2006). O papel diferenciado de Trap e AC4 na
supressão de silenciamento pode conferir características distintas ao desenvolvimento
da doença causada por diferentes espécies de geminivírus (Vanitharani et al., 2004).
Embora o mecanismo de atuação dessas proteínas ainda não tenha sido elucidado,
resultados recentes demonstram uma relação de causa e efeito entre a inativação da
cinase ADK e a supressão de silenciamento, ambas mediadas por Trap (Wang et al.,
2005). Esses resultados sugerem que a atividade de ADK é necessária para o
17
silenciamento, e que os geminivírus suprimem a resposta de defesa via inibição de
ADK. De fato, a proteína Trap pode interagir com ela mesma, formando dímeros com
localização nuclear, ou interagir com ADK, formando complexos Trap/ADK e
suprimindo o silenciamento gênico local (Yang et al., 2007).
Interações envolvendo as proteínas de movimento MP e NSP também já foram
relatadas. McGarry et al. (2003) identificaram e caracterizaram funcionalmente uma
acetiltransferase de Arabidopsis, denominada AtNSI, que interage diretamente com a
proteína NSP do Cabbage leaf curl virus (CaLCuV). A proteína é altamente conservada
em plantas, possui localização nuclear, pode acetilar as histonas H2A e H3 in vitro, e
também acetila a proteína capsidial viral, mas não a proteína NSP. Além disso, não atua
como um coativador transcricional in vitro. Esta acetiltransferase regula o transporte
núcleo-citoplasma do genoma viral e outros eventos nucleares não-transcricionais.
A interação de proteínas cinase do tipo serina/treonina, denominadas LeNIK
(“Lycopersicon esculentum NSP-interacting kinase”) e GmNIK (“Glycine max “NSP-
interacting kinase”) com a proteína NSP foi demonstrada utilizando-se o sistema duplo-
híbrido de levedura (Mariano et al., 2004). Esta interação foi associada à hipótese do
modelo guarda de resistência em plantas (Van Der Biezen e Jones, 1998), ou seja, NSP
seria um fator de virulência que se liga às NIKs para que não ocorra a indução de uma
resposta de resistência (Mariano et al., 2004). A interação entre as proteínas NIK e NSP
foi alvo de um estudo posterior com o objetivo de elucidar sua função no ciclo de
infecção viral (Fontes et al., 2004). Neste estudo foi feita sua caracterização bioquímica,
demonstrando-se que as cinases que interagem com NSP são proteínas que se localizam
em membranas com propriedades de receptores, e que a interação com NSP inibe essa
atividade. Dessa forma, a interação entre NSP e NIK seria uma outra maneira de
suprimir uma resposta de defesa da planta ao vírus.
18
Florentino et al. (2006) demonstraram que NSP também interage com outra
serina/treonina cinase celular, NsAK (“NSP-associated kinase”). Entretanto, ao
contrário de NIK, NsAK seria uma proteína que contribui com a infecção viral. De fato,
a inibição da atividade de NsAK atenua o desenvolvimento dos sintomas.
5. Begomovírus em tomateiro no Brasil
A cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum L. = Lycopersicon esculentum
Mill.) é uma das mais afetadas pelos geminivírus (Polston e Anderson, 1997; Ribeiro et
al., 1998; Moriones e Navas-Castillo, 2000; Morales e Anderson, 2001). Mais de 40
espécies de geminivírus, a maioria pertencente ao gênero Begomovirus, são capazes de
infectar o tomateiro. Desde a década de 1980, perdas substanciais têm sido relatadas em
diversas regiões das Américas, incluindo-se os EUA, México, Caribe, América Central
e Venezuela, como resultado de infecção por begomovírus (Polston e Anderson, 1997).
Nos Estados Unidos, o Tomato mottle virus (ToMoV) causou perdas na ordem de
milhões de dólares no estado da Flórida durante a década de 1990 (Varma e Malathi,
2003). No México, diversos geminivírus que infectam tomateiros foram descritos nos
últimos vinte anos (Brown e Nelson, 1988; Brown e Poulos, 1990; Torres-Pacheco et
al., 1993; Paplomatas et al., 1994). Na Nicarágua, o Tomato leaf curl Nicaragua virus
(ToLCNV) e outras três espécies de begomovírus causaram epidemias na década de
1980 com perdas próximas a 100% em várias regiões do país (Rojas et al., 2000).
Em 1994, a presença do Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) foi confirmada
na República Dominicana (Nakhla et al., 1994). O TYLCV é um begomovírus
monossegmentado cuja ocorrência estava até então restrita ao Mediterrâneo. A análise
molecular de isolados de TYLCV obtidos na República Dominicana indicou que o vírus
foi provavelmente introduzido via mudas infectadas importadas de Israel (Polston et al.,
19
1994; Salati et al., 2002). A presença do TYLCV na República Dominicana levou à
quase eliminação da tomaticultura no país, com perdas superiores a 90% nos anos de
1995, 1996 e 1997. Uma estratégia agressiva de controle, baseada em um período livre
de tomateiro (e de outros hospedeiros da mosca-branca) permitiu o retorno da atividade
a partir de 1998 (Salati et al., 2002).
O TYLCV já foi disseminado para Porto Rico, Cuba, México e EUA,
provavelmente de forma natural (Ramos et al., 1996; Bird et al., 2001; Ascencio-Ibáñez
et al., 1999; Polston et al., 2001). A presença do vírus nesses países causou uma grande
mudança no quadro epidemiológico das begomoviroses em tomateiro, pois o TYLCV é
um vírus que induz sintomas severos e cuja presença tende a deslocar os vírus nativos
presentes anteriormente. Em 2007 o TYLCV foi relatado na Venezuela (Zambrano et
al., 2007). O vírus ainda não foi relatado no Brasil, e sua introdução seria motivo para
grande preocupação.
O primeiro relato de begomovírus em tomateiro no Brasil foi feito por Costa et
al. (1975). Matyis et al. (1975) identificaram o vírus em questão e o denominaram
Tomato golden mosaic virus (TGMV). Curiosamente, após esse relato inicial, a
incidência do TGMV em tomateiro não acompanhou o aumento populacional de
Bemisia tabaci observado no Brasil ao longo das décadas de 1970 e 1980. De fato, o
TGMV não foi relatado em tomateiros no Brasil durante mais de 20 anos, até ser
encontrado na região de Campos, RJ (Alfenas et al., 1998). Isso provavelmente ocorreu
porque o biótipo A de B. tabaci, o único relatado no Brasil até 1992, coloniza o
tomateiro com baixa eficiência (Bedford et al., 1994).
A partir de 1992, no estado de São Paulo, constatou-se um novo biótipo (biótipo
B) de B. tabaci, provavelmente introduzido pela importação de plantas ornamentais da
Europa ou dos EUA (Melo, 1992). Comparado ao biótipo A, o biótipo B de B. tabaci
20
apresenta maior grau de adaptação, maior fecundidade e dispersão, além da gama de
hospedeiros mais ampla, que inclui solanáceas (como o tomateiro) e diversas espécies
de plantas silvestres e daninhas (Bedford et al., 1994).
A presença do biótipo B no Distrito Federal foi confirmada em 1993, associada
a sintomas de infecção por begomovírus em tomateiros para processamento industrial
(Ribeiro et al., 1994; França et al., 1996). A partir de plantas com sintomas típicos,
fragmentos de DNA correspondentes aos dois componentes genômicos dos
begomovírus foram amplificados via PCR. A sequência de nucleotídeos desses
fragmentos indicou tratar-se de nova espécie de begomovírus, distinta do TGMV e
denominada Tomato chlorotic vein virus (TClVV) (Bezerra et al., 1996; Ribeiro et al.,
2003).
Relatos adicionais de begomovírus em tomateiro foram feitos em São Paulo por
Faria et al. (1997), que descreveram o Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV), no
Rio de Janeiro (Galvão et al., 1997), e na região Nordeste, em amostras de tomateiro
provenientes da Bahia (Ribeiro et al., 1996) e de Pernambuco (Bezerra et al., 1997). Em
1997 a doença foi relatada no submédio São Francisco, na época a principal região
produtora de tomate para processamento industrial no Brasil, acarretando perdas de até
100% em diversas áreas e levando ao abandono da tomaticultura intensiva na região
(Bezerra et al., 1997). O aparecimento do vírus ocorreu, em todos esses casos, logo após
a introdução do biótipo B de B. tabaci.
No Triângulo Mineiro, uma nova espécie de begomovírus foi identificada em
tomateiros em 1996 (Rezende et al., 1996; Fernandes et al., 1996). A comparação da
sequência completa de nucleotídeos do DNA-A e -B com as de outros begomovírus
comprovou tratar-se de uma nova espécie, denominada Tomato rugose mosaic virus
(ToRMV) (Ribeiro et al., 2003; Fernandes et al., 2006). Levantamento de campo
21
realizado em junho de 2000 nos municípios de Araguari, Indianópolis e Uberlândia
indicou a prevalência do ToRMV, detectado em 73% das 148 amostras coletadas e
positivas para begomovírus (Fernandes, 2001). O ToRMV foi caracterizado biologica e
molecularmente (Fernandes et al., 2006).
Na Zona Metalúrgica de Minas Gerais, outro begomovírus foi isolado de
amostras de tomateiro no mesmo ano (Zerbini et al., 1996). A comparação da sequência
completa de nucleotídeos do DNA-A e -B com outros begomovírus (incluindo o
TClVV, ToYVSV e ToRMV) demonstrou tratar-se de nova espécie, designada Tomato
chlorotic mottle virus (ToCMoV) (Andrade et al., 2002; Ribeiro et al., 2003). A
identidade de sequência entre o ToCMoV e o ToRMV é de aproximadamente 85% para
o DNA-A e 80% para o DNA-B, indicando tratar-se de vírus distintos, porém altamente
relacionados. Outros isolados do ToCMoV foram identificados no Rio de Janeiro,
Espírito Santo, Bahia e Pernambuco (Ribeiro et al., 2003). O isolado da Bahia foi
caracterizado biologica e molecularmente (Ribeiro et al., 2007).
Além do ToRMV e ToCMoV, um isolado de begomovírus foi detectado em São
Joaquim de Bicas, Minas Gerais, causando sintomas severos em tomateiro. Esse
isolado, inicialmente denominado “C12” (Ambrozevicius et al., 2002), foi
posteriormente renomeado “MG-Bi2”, a fim de padronizar a nomenclatura de isolados
brasileiros de begomovírus infectando o tomateiro (Ribeiro et al., 2003). O isolado MG-
Bi2 foi caracterizado biologica e molecularmente, demonstrando tratar-se de uma nova
espécie denominada Tomato yellow spot virus (ToYSV) (Calegario et al., 2007). O
ToYSV causa sintomas mais severos em tomateiro do que aqueles ocasionados pelo
ToRMV e ToCMoV (Ambrozevicius et al., 2002). Plantas de tomateiro infectadas pelo
ToYSV apresentam mosaico amarelo intenso e subcrescimento acentuado, com redução
de área foliar e enrolamento foliar. Curiosamente, apesar de ter sido isolado de
22
tomateiro, o ToYSV apresenta relacionamento filogenético mais próximo com
begomovírus isolados de Sida sp., como o Sida mottle virus (SiMoV), Sida yellow
mosaic virus (SiYMV) e Sida micrantha mosaic virus (SimMV) (Andrade et al., 2006).
Estes relatos, considerados em conjunto, indicam claramente que a emergência
de novos begomovírus em tomateiros no Brasil foi favorecida pela rápida disseminação
do biótipo B de B. tabaci (Lourenção e Nagai, 1994; Haji et al., 1999). Agindo como
vetor, o inseto teria permitido que vírus nativos infectando plantas silvestres e daninhas
chegassem ao tomateiro e se adaptassem ao novo hospedeiro em um rápido processo
evolutivo, culminando com o surgimento de novas espécies. Estudos anteriores
realizados no México e nos EUA sugerem que esse processo de evolução e adaptação
pode ocorrer em períodos de tempo da ordem de 5-10 anos (Hou e Gilbertson, 1996;
Torres-Pacheco et al., 1996).
A recombinação e a pseudo-recombinação são os processos mais comumente
associados à geração de diversidade genética e à evolução de begomovírus (Padidam et
al., 1999; Rojas et al., 2005). Evidências de ambos os mecanismos já foram encontradas
em associação ao complexo de begomovírus infectando o tomateiro no Brasil. Galvão et
al. (2003) e Ribeiro et al. (2007) sugeriram que os isolados MG-Bt1 e BA-Se1,
respectivamente, do ToCMoV, possuem origem recombinante. Andrade et al. (2006)
demonstraram a formação de pseudorecombinantes viáveis entre clones infecciosos do
TGMV (DNA-A) e ToYSV (DNA-B), e entre o ToYSV (DNA-A) e o Tomato crinkle
leaf yellows virus (ToCrLYV) (DNA-B). Além disso, Fernandes et al. (2006)
encontraram evidência de pseudo-recombinação entre o ToRMV e um novo vírus, em
condições naturais (planta infectada no campo).
É possível que após a verdadeira explosão na incidência de begomovírus que
ocorreu com a introdução do biótipo B de B. tabaci no Brasil, uma ou poucas espécies
23
que se mostrem mais adaptadas ao novo hospedeiro passem a predominar. De fato,
levantamentos realizados nos últimos cinco anos (Inoue-Nagata et al., 2004; Castillo-
Urquiza et al., 2007; Cotrim et al., 2007; Fernandes et al., 2008) indicam que
determinadas espécies tornaram-se prevalentes em diferentes regiões do país: ToYVSV
em São Paulo, ToRMV e ToCMoV em Minas Gerais, ToSRV e ToYVSV em Goiás.
Entretanto, novas espécies continuam a ser relatadas infectando o tomateiro (Pires et al.,
2004; Castillo-Urquiza et al., 2007), sugerindo que o processo de transferência de vírus
nativos para o tomateiro, com a conseqüente evolução de novas espécies, continua
ocorrendo.
24
LITERATURA CITADA
Agrianual. Anuário da Agricultura Brasileira. São Paulo: FNP Consultoria e
Agroinformativos. 2007. 491 p.
Alfenas, P.C., Galvão, R.M., Andrade, E.C., Mandelli, M.S., Fernandes, A.V., Zerbini,
F.M. e Fontes, E.P.B. Detecção e caracterização molecular de novos geminivírus que
infectam tomateiros. Fitopatologia Brasileira, v.23, p.311. 1998.
Ambrozevicius, L.P., Calegario, R.F., Fontes, E.P.B., Carvalho, M.G. e Zerbini, F.M.
Genetic diversity of begomoviruses infecting tomato and associated weeds in
Southeastern Brazil. Fitopatologia Brasileira, v.27, p.372-377. 2002.
Andrade, E.C. Análise de determinantes virais envolvidos na indução diferencial de
sintomas por begomovírus em tomateiro e Nicotiana benthamiana. (Tese D.S.). Dep.
de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, 2006. 87 p.
Andrade, E.C., Ambrozevicius, L.P., Calegario, R.F., Fontes, E.P.B. e Zerbini, F.M.
Molecular cloning and characterization of Tomato chlorotic mottle virus (TCMV), a
new tomato-infecting begomovirus. Virus Reviews and Research, v.7, p.153. 2002.
Andrade, E.C., Manhani, G.G., Alfenas, P.F., Calegario, R.F., Fontes, E.P.B. e Zerbini,
F.M. Tomato yellow spot virus, a tomato-infecting begomovirus from Brazil with a
closer relationship to viruses from Sida sp., forms pseudorecombinants with
begomoviruses from tomato but not from Sida. Journal of General Virology, v.87,
p.3687-3696. 2006.
Argüello-Astorga, G., Herrera-Estrella, L. e Rivera-Bustamante, R. Experimental and
theoretical definition of geminivirus origin of replication. Plant Molecular Biology,
v.26, p.553-556. 1994.
Arguello-Astorga, G., Lopez-Ochoa, L., Kong, L.J., Orozco, B.M., Settlage, S.B. e
Hanley-Bowdoin, L. A novel motif in geminivirus replication proteins interacts with
the plant retinoblastoma-related protein. Journal of Virology, v.78, p.4817-4826.
2004.
Ascencio-Ibáñez, J.T., Diaz-Plaza, R., Méndez-Lozano, J., Monsalve-Fonnegra, Z.I.,
Argüello-Astorga, G.R. e Rivera-Bustamante, R.F. First report of tomato yellow leaf
curl geminivirus in Yucatán, México. Plant Disease, v.83, p.1178. 1999.
Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature, v.431, p.356-363. 2004.
Bedford, I.D., Briddon, R.W., Brown, J.K., Rosell, R.C. e Markham, P.G. Geminivirus
transmission and biological characterization of Bemisia tabaci (Gennadius) biotypes
from different geographical regions. Annals of Applied Biology, v.125, p.311-325.
1994.
Bellows, T.S., Perring, T.M., Gill, R.J. e Headrick, D.H. Description of a new species of
Bemisia. Annals of the Entomological Society of America, v.87, p.195-206. 1994.
Berger, P.H., Adams, M.J., Barnett, O.W., Brunt, A.A., Hammond, J., Hill, J.H., Jordan,
R.L., Kashiwazaki, S., Rybicki, E.P., Spence, N., Stenger, D.C., Ohki, S.T., Uyeda,
I., Van Zaayen, A., Valkonen, J.P. e Vetten, H.J. Family Potyviridae. In: Fauquet,
C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U. e Ball, L.A. (Ed.). Virus
Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.
San Diego: Elsevier Academic Press, 2005. p.819-841.
25
Bezerra, I.C., Lima, M.F., Ribeiro, S.G., Giordano, L.B., Zerbini, F.M. e Ávila, A.C.
Occurrence of geminivirus in tomato-producing areas in Submédio São Francisco.
Fitopatologia Brasileira, v.22, p.331. 1997.
Bezerra, I.C., Ribeiro, S.G., Ávila, A.C. e Giordano, L.B. Survey of geminivirus
infection in tomato producing areas in Federal District. VIII Encontro Nacional de
Virologia. São Lourenço, MG, 1996. 289 p.
Bird, J., Idris, A.M., Rogan, D. e Brown, J.K. Introduction of the exotic Tomato yellow
leaf curl virus-Israel in tomato to Puerto Rico. Plant Disease, v.85, p.1028. 2001.
Bisaro, D.M. Silencing suppression by geminivirus proteins. Virology, v.344, p.158-
168. 2006.
Briddon, R.W. Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex.
Molecular Plant Pathology, v.4, p.427-434. 2003.
Briddon, R.W., Pinner, M.S., Stanley, J. e Markham, P.G. Geminivirus coat protein
gene replacement alters insect specificity. Virology, v.177, p.85-94. 1990.
Brown, J.K., Coats, S., Frohlich, D.R., Bedford, I.D. e Markham, P.G. Characterization
and distribution of esterase electromorphs in the whitefly, Bemisia tabaci (Genn.)
(Homoptera: Aleyrodidae). Biochemistry and Genetics, v.33, p.205-214. 1995.
Brown, J.K. e Nelson, M.R. Transmission, host range, and virus-vector relationships of
chino del tomate virus, a whitefly-transmitted geminivirus from Sinaloa, Mexico.
Plant Disease, v.72, p.866-869. 1988.
Brown, J.K. e Poulos, B.T. Serrano golden mosaic virus: A newly identified whitefly-
transmitted geminivirus of pepper and tomato in the United States and Mexico. Plant
Disease, v.74, p.720. 1990.
Calegario, R.F., Ferreira, S.S., Andrade, E.C. e Zerbini, F.M. Characterization of
Tomato yellow spot virus, (ToYSV), a novel tomato-infecting begomovirus from
Brazil. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.42, p.1335-1343. 2007.
Castillo-Urquiza, G.P., Beserra Junior, J.E.A., Alfenas-Zerbini, P., Varsani, A., Lima,
A.T.M., Barros, D.R. e Zerbini, F.M. Genetic diversity of begomoviruses infecting
tomato in Paty do Alferes, Rio de Janeiro state, Brazil. Virus Reviews and Research,
v.12, p.233. 2007.
Costa, A.S., Oliveira, A.R. e Silva, D.M. Transmissão mecânica do mosaico dourado do
tomateiro. Fitopatologia Brasileira, v.6, p.147. 1975.
Cotrim, M.A., Krause-Sakate, R., Narita, N., Zerbini, F.M. e Pavan, M.A. Diversidade
genética de begomovírus em cultivos de tomateiro no Centro-Oeste Paulista. Summa
Phytopathologica, v.33, p.300-303. 2007.
Durrant, W.E. e Dong, X. Systemic acquired resistance. Annual Review of
Phytopathology, v.42, p.185-209. 2004.
Egelkrout, E.M., Robertson, D. e Hanley-Bowdoin, L. Proliferating cell nuclear antigen
transcription is repressed through an E2F consensus element and activated by
geminivirus infection in mature leaves. Plant Cell, v.13, p.1437-1452. 2001.
Evans, D. e Jeske, H. Complementation and recombination between mutants of
complementary sense genes of DNA-A of Abutilon mosaic virus. Virology, v.197,
p.492-496. 1993.
26
Faria, J.C., Bezerra, I.C., Zerbini, F.M., Ribeiro, S.G. e Lima, M.F. Situação atual das
geminiviroses no Brasil. Fitopatologia Brasileira, v.25, p.125-137. 2000.
Faria, J.C., Souza-Dias, J.A.C., Slack, S. e Maxwell, D.P. A new geminivirus associated
with tomato in the State of São Paulo, Brazil. Plant Disease, v.81, p.423. 1997.
Fauquet, C.M., Bisaro, D.M., Briddon, R.W., Brown, J.K., Harrison, B.D., Rybicki,
E.P., Stenger, D.C. e Stanley, J. Revision of taxonomic criteria for species
demarcation in the family Geminiviridae, and an updated list of begomovirus
species. Archives of Virology, v.148, p.405-421. 2003.
Fernandes, A.V., Galvão, R.M., Machado, J.J., Zerbini, F.M. e Fontes, E.P.B. Cloning
and molecular characterization of A components of two new Sida rhombifolia-
infecting geminiviruses. Virus Reviews and Research, v.4, p.148. 1999.
Fernandes, F.R., Albuquerque, L.C., Giordano, L.B., Boiteux, L.S., Ávila, A.C. e Inoue-
Nagata, A.K. Diversity and prevalence of Brazilian bipartite begomovirus species
associated to tomatoes. Virus Genes, v.36, p.251-258. 2008.
Fernandes, J.J. Caracterização e diversidade genética de geminivírus associados ao
tomateiro na região do Triângulo Mineiro. (Tese D.S.). Dep. de Fitopatologia,
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, 2001. 192 p.
Fernandes, J.J., Carvalho, M.G., Andrade, E.C., Brommonschenkel, S.H., Fontes,
E.P.B. e Zerbini, F.M. Biological and molecular properties of Tomato rugose mosaic
virus (ToRMV), a new tomato-infecting begomovirus from Brazil. Plant Pathology,
v.55, p.513-522. 2006.
Ferreira, S.S., Alfenas, P.F., Lima, A.T.M., Barros, D.R., Senna, L. e Zerbini, F.M.
Detecção de begomovírus em tomateiro no município de Paty de Alferes, Rio de
Janeiro. Fitopatologia Brasileira, v.30, p.S183. 2005.
Florentino, L.H., Santos, A.A., Fontenelle, M.R., Pinheiro, G.L., Zerbini, F.M., Baracat-
Pereira, M.C. e Fontes, E.P.B. A PERK-like receptor kinase interacts with the
geminivirus nuclear shuttle protein and potentiates viral infection. Journal of
Virology, v.80, p.6648-6656. 2006.
Fontes, E.P.B., Eagle, P.A., Sipe, P.S., Luckow, V.A. e Hanley-Bowdoin, L. Interaction
between a geminivirus replication protein and origin DNA is essential for viral
replication. Journal of Biological Chemistry, v.269, p.8459-8465. 1994.
Fontes, E.P.B., Luckow, V.A. e Hanley-Bowdoin, L. A geminivirus replication protein
is a sequence-specific DNA binding protein. Plant Cell, v.4, p.597-608. 1992.
Fontes, E.P.B., Santos, A.A., Luz, D.F., Waclawovsky, A.J. e Chory, J. The geminivirus
nuclear shuttle protein is a virulence factor that suppresses transmembrane receptor
kinase activity. Genes & Development, v.18, p.2545-2556. 2004.
França, F.H., Villas-Boas, G.L. e Castelo-Branco, M. Ocorrência de Bemisia
argentifolii Bellows & Perring (Homoptera:Aleyrodidae) no Distrito Federal. Anais
da Sociedade Entomológica do Brasil, v.25, p.369-372. 1996.
Galvão, R.M., Almeida, J.A., Camini, N., Zerbini, F.M. e Fontes, E.P.B. Molecular
detection and biobalistic propagation of novel Malvaceae- and tomato-infecting
geminiviruses. Fitopatologia Brasileira, v.22, p.335. 1997.
Galvão, R.M., Mariano, A.C., Luz, D.F., Alfenas, P.F., Andrade, E.C., Zerbini, F.M.,
Almeida, M.R. e Fontes, E.P.B. A naturally occurring recombinant DNA-A of a
27
typical bipartite begomovirus does not require the cognate DNA-B to infect
Nicotiana benthamiana systemically. Journal of General Virology, v.84, p.715-726.
2003.
Gilbertson, R.L., Sudarshana, M., Jiang, H., Rojas, M.R. e Lucas, W.J. Limitations on
geminivirus genome size imposed by plasmodesmata and virus-encoded movement
protein: Insights into DNA trafficking. Plant Cell, v.15, p.2578-2591. 2003.
Gutierrez, C. Geminivirus DNA replication. Cellular and Molecular Life Sciences, v.56,
p.313-329. 1999.
Gutierrez, C. DNA replication and cell cycle in plants: learning from geminiviruses.
EMBO Journal, v.19, p.792-799. 2000.
Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M.M., Sanz-Burgos, A.P., Luque, A. e
Missich, R. Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Veterinary
Microbiology, v.98, p.111-119. 2004.
Haji, F.N.P., Lima, M.F., Mattos, M.A., Nunes, A.M., Alencar, J.A. e Barbosa, F.R.
Levantamento de plantas hospedeiras de mosca-branca (Bemisia spp.) no Submédio
do Vale São Francisco nos anos de 1996 a 1998. VIII Simpósio Latino-Americano e
do Caribe sobre Moscas Brancas e Geminivírus. Recife, Brazil. 17-20 Out. 1999. p.
R21.
Hanley-Bowdoin, L., Settlage, S.B., Orozco, B.M., Nagar, S. e Robertson, D.
Geminiviruses: Models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle
regulation. Critical Reviews in Plant Sciences, v.18, p.71-106. 1999.
Hanley-Bowdoin, L., Settlage, S.B. e Robertson, D. Reprogramming plant gene
expression: a prerequisite to geminivirus DNA replication. Molecular Plant
Pathology, v.5, p.149-156. 2004.
Hao, L., Wang, H., Sunter, G. e Bisaro, D.M. Geminivirus AL2 and L2 proteins interact
with and inactivate SNF1 kinase. Plant Cell, v.15, p.1034-1048. 2003.
Hofer, P., Bedford, I.D., Markham, P.G., Jeske, H. e Frischmuth, T. Coat protein gene
replacement results in whitefly transmission of an insect nontransmissible
geminivirus isolate. Virology, v.236, p.288-295. 1997.
Hou, Y.M. e Gilbertson, R.L. Increased pathogenicity in a pseudorecombinant bipartite
geminivirus correlates with intermolecular recombination. Journal of Virology, v.70,
p.5430-5436. 1996.
Inoue-Nagata, A.K., Giordano, L.B., Fonseca, M.E.N., Ribeiro, S.G., Ávila, A.C.,
Albuquerque, L.C. e Boiteux, L.S. Occurrence of begomovirus in tomato and other
plants in Central Brazil. 4th International Geminivirus Symposium (Programme and
Abstracts). Cape Town, South Africa, 2004. p. W3-3.
Inoue-Nagata, A.K., Martin, D.P., Boiteux, L.S., Giordano, L.D., Bezerra, I.C. e De
Avila, A.C. New species emergence via recombination among isolates of the
Brazilian tomato infecting Begomovirus complex. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
v.41, p.1329-1332. 2006.
Jeske, H., Lutgemeier, M. e Preiss, W. DNA forms indicate rolling circle and
recombination-dependent replication of Abutilon mosaic virus. EMBO Journal, v.20,
p.6158-6167. 2001.
28
Jovel, J., Reski, G., Rothenstein, D., Ringel, M., Frischmuth, T. e Jeske, H. Sida
micrantha mosaic is associated with a complex infection of begomoviruses different
from Abutilon mosaic virus. Archives of Virology, v.149, p.829-841. 2004.
Kjemtrup, S., Sampson, K.S., Peele, C., Nguyen, L., Conkling, M., Thompson, W. e
Roberson, D. Gene silencing from DNA carried by a geminivirus. Plant Journal,
v.14, p.91-100. 1998.
Klinkenberg, F.A. e Stanley, J. Encapsidation and spread of African cassava mosaic
virus DNA-A in the absence of DNA-B when agroinoculated to Nicotiana
benthamiana. Journal of General Virology, v.71, p.1409-1412. 1990.
Latham, J.R., Saunders, K., Pinner, M.S. e Stanley, J. Induction of plant cell division by
beet curly top virus gene C4. Plant Journal, v.11, p.1273-1283. 1997.
Laufs, J., Schumacher, S., Geisler, N., Jupin, I. e Gronenborn, B. Identification of the
nicking tyrosine of geminivirus Rep protein. FEBS Letters, v.377, p.258-262. 1995.
Lazarowitz, S.G. Geminiviruses: Genome structure and gene function. Critical Reviews
in Plant Sciences, v.11, p.327-349. 1992.
Lourenção, A.L. e Nagai, H. Surtos populacionais de Bemisia tabaci no Estado de São
Paulo. Bragantia, v.53, p.53-59. 1994.
Mansoor, S., Briddon, R.W., Zafar, Y. e Stanley, J. Geminivirus disease complexes: An
emerging threat. Trends in Plant Science, v.8, p.128-134. 2003.
Mariano, A.C., Andrade, M.O., Santos, A.A., Carolino, S.M.B., Oliveira, M.L.,
Baracat-Pereira, M.C., Brommonchenkel, S.H. e Fontes, E.P.B. Identification of a
novel receptor-like protein kinase that interacts with a geminivirus nuclear shuttle
protein. Virology, v.318, p.24-31. 2004.
Matyis, J.C., Silva, D.M., Oliveira, A.R. e Costa, A.S. Purificação e morfologia do vírus
do mosaico dourado do tomateiro. Summa Phytopathologica, v.1, p.267-275. 1975.
Mcgarry, R.C., Barron, Y.D., Carvalho, M.F., Hill, J.E., Gold, D., Cheung, E., Kraus,
W.L. e Lazarowitz, S.G. A novel Arabidopsis acetyltransferase interacts with the
geminivirus movement protein NSP. Plant Cell, v.15, p.1605-1618. 2003.
Melo, P.C.T. Mosca branca ameaça produção de hortaliças. Campinas, SP, Brazil:
Asgrow do Brasil Sementes Ltda., Technical Bulletin 1992.
Monci, F., Sanchez-Campos, S., Navas-Castillo, J. e Moriones, E. A natural
recombinant between the geminiviruses Tomato yellow leaf curl Sardinia virus and
Tomato yellow leaf curl virus exhibits a novel pathogenic phenotype and is becoming
prevalent in Spanish populations. Virology, v.303, p.317-326. 2002.
Morales, F.J. e Anderson, P.K. The emergence and dissemination of whitefly-
transmitted geminiviruses in Latin America. Archives of Virology, v.146, p.415-441.
2001.
Morales, F.J. e Jones, P.G. The ecology and epidemiology of whitefly-transmitted
viruses in Latin America. Virus Research, v.100, p.57-65. 2004.
Moriones, E. e Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus
complex causing epidemics worldwide. Virus Research, v.71, p.123-134. 2000.
Morra, M.R. e Petty, I.T.D. Tissue specificity of geminivirus infection is genetically
determined. Plant Cell, v.12, p.2259-2270. 2000.
29
Nagar, S., Hanley-Bowdoin, L. e Robertson, D. Host DNA replication is induced by
geminivirus infection of differentiated plant cells. Plant Cell, v.14, p.2995-3007.
2002.
Nagar, S., Pedersen, T.J., Carrick, K.M., Hanley-Bowdoin, L. e Robertson, D. A
geminivirus induces expression of a host DNA synthesis protein in terminally
differentiated plant cells. Plant Cell, v.7, p.705-719. 1995.
Nakhla, M.K., Maxwell, D.P., Martinez, R.T., Carvalho, M.G. e Gilbertson, R.L.
Widespread occurrence of eastern Mediterranean "strain" of tomato yellow leaf curl
geminivirus in tomatoes in the Dominican Republic. Plant Disease, v.78, p.926.
1994.
Naranjo, S.E. e Ellsworth, P.C. Challenges and opportunities for pest management of
Bemisia tabaci in the new century. Crop Protection, v.20, p.707. 2001.
Noueiry, A.O., Lucas, W.J. e Gilbertson, R.L. Two proteins of a plant DNA virus
coordinate nuclear and plasmodesmal transport. Cell, v.76, p.925-932. 1994.
Orozco, B.M. e Hanley-Bowdoin, L. A DNA structure is required for geminivirus
replication origin function. Journal of Virology, v.70, p.148-158. 1996.
Orozco, B.M. e Hanley-Bowdoin, L. Conserved sequence and structural motifs
contribute to the DNA binding and cleavage activities of a geminivirus replication
protein. Journal of Biological Chemistry, v.273, p.24448-24456. 1998.
Orozco, B.M., Miller, A.B., Settlage, S.B. e Hanley-Bowdoin, L. Functional domains of
a geminivirus replication protein. Journal of Biological Chemistry, v.272, p.9840-
9846. 1997.
Padidam, M., Sawyer, S. e Fauquet, C.M. Possible emergence of new geminiviruses by
frequent recombination. Virology, v.265, p.218-224. 1999.
Palmer, K.E. e Rybicki, E.P. The molecular biology of mastreviruses. Advances in
Virus Research, v.50, p.183-234. 1998.
Palmer, K.E., Schnippenkoetter, W.H. e Rybicki, E.P. Geminivirus isolation and DNA
extraction. Methods in Molecular Biology, v.81, p.41-52. 1998.
Paplomatas, E.J., Patel, V.P., Hou, Y.M., Noueiry, A.O. e Gilbertson, R.L. Molecular
characterization of a new sap-transmissible bipartite genome geminivirus infecting
tomatoes in Mexico. Phytopathology, v.84, p.1215-1224. 1994.
Pedersen, T.J. e Hanley-Bowdoin. Molecular characterization of the AL3 protein
encoded by a bipartite geminivirus. Virology, v.202, p.1070-1075. 1994.
Petty, I.T., Carter, S.C., Morra, M.R., Jeffrey, J.L. e Olivey, H.E. Bipartite geminivirus
host adaptation determined cooperatively by coding and noncoding sequences of the
genome. Virology, v.277, p.429-438. 2000.
Pires, S.R., Andrade, E.C. e Zerbini, F.M. Detection of a possible new begomovirus
species infecting tomato in Minas Gerais state. Virus Reviews and Research, v.9,
p.122. 2004.
Pita, J.S., Fondong, V.N., Sangare, A., Otim-Nape, G.W., Ogwal, S. e Fauquet, C.M.
Recombination, pseudorecombination and synergism of geminiviruses are
determinant keys to the epidemic of severe cassava mosaic disease in Uganda.
Journal of General Virology, v.82, p.655-665. 2001.
30
Polston, J., Mcgovern, R.J. e Brown, L.G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus
in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato.
Plant Disease, v.83, p.984-988. 2001.
Polston, J.E. e Anderson, P.K. The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in
tomato in the western hemisphere. Plant Disease, v.81, p.1358-1369. 1997.
Polston, J.E., Bois, D., Serra, C.A. e Concepcion, S. First report of a tomato yellow leaf
curl-like geminivirus in the Western Hemisphere. Plant Disease, v.78, p.831. 1994.
Potter, J.L., Nakha, M.K., Mejia, L. e Maxwell, D.P. PCR and DNA hybridization
methods for specific detection of bean-infecting begomoviruses in the Americas and
Caribbean. Plant Disease, v.87, p.1205-1212. 2003.
Ramos, P.L., Guerra, O., Dorestes, V. e Ramirez, N. Detection of TYLCV in Cuba.
Plant Disease, v.80, p.1208. 1996.
Rezende, E.A., Filgueira, F.A.R., Zerbini, F.M., Maciel-Zambolim, E., Fernandes, J.J. e
Gilbertson, R.L. Tomato infected with geminivirus in greenhouse conditions at
Uberlândia-MG, Brazil. Fitopatologia Brasileira, v.21, p.424. 1996.
Ribeiro, S.G., Ambrozevicius, L.P., Ávila, A.C., Bezerra, I.C., Calegario, R.F.,
Fernandes, J.J., Lima, M.F., Mello, R.N., Rocha, H. e Zerbini, F.M. Distribution and
genetic diversity of tomato-infecting begomoviruses in Brazil. Archives of Virology,
v.148, p.281-295. 2003.
Ribeiro, S.G., Ávila, A.C., Bezerra, I.C., Fernandes, J.J., Faria, J.C., Lima, M.F.,
Gilbertson, R.L., Zambolim, E.M. e Zerbini, F.M. Widespread occurrence of tomato
geminiviruses in Brazil, associated with the new biotype of the whitefly vector. Plant
Disease, v.82, p.830. 1998.
Ribeiro, S.G., Bezerra, I.C., Lima, M.F., Ávila, A.C. e Giordano, L.B. Occurrence of
geminivirus in tomato plants in Bahia. VIII Encontro Nacional de Virologia
(Resumos). São Lourenco, MG, 1996. p. 290.
Ribeiro, S.G., Martin, D.P., Lacorte, C., Simões, I.C., Orlandini, D.R.S. e Inoue-Nagata,
A.K. Molecular and biological characterization of Tomato chlorotic mottle virus
suggests that recombination underlies the evolution and diversity of Brazilian tomato
begomoviruses. Phytopathology, v.97, p.702-711. 2007.
Ribeiro, S.G., Mello, L.V., Boiteux, L.S., Kitajima, E.W. e Faria, J.C. Tomato infection
by a geminivirus in the Federal District, Brazil. Fitopatologia Brasileira, v.19, p.330.
1994.
Rojas, A., Kvarnheden, A. e Valkonen, J.P.T. Geminiviruses infecting tomato crops in
Nicaragua. Plant Disease, v.84, p.843-846. 2000.
Rojas, M.R., Hagen, C., Lucas, W.J. e Gilbertson, R.L. Exploiting chinks in the plant's
armor: Evolution and emergence of geminiviruses. Annual Review of
Phytopathology, v.43, p.361-394. 2005.
Rojas, M.R., Jiang, H., Salati, R., Xoconostle-Cazares, B., Sudarshana, M.R., Lucas,
W.J. e Gilbertson, R.L. Functional analysis of proteins involved in movement of the
monopartite begomovirus, tomato yellow leaf curl virus. Virology, v.291, p.110-125.
2001.
31
Rojas, M.R., Noueiry, A.O., Lucas, W.J. e Gilbertson, R.L. Bean dwarf mosaic
geminivirus movement proteins recognize DNA in a form- and size-specific manner.
Cell, v.95, p.105-113. 1998.
Roth, B.M., Pruss, G.J. e Vance, V.B. Plant viral suppressors of RNA silencing. Virus
Research, v.102, p.97-108. 2004.
Salati, R., Nahkla, M.K., Rojas, M.R., Guzman, P., Jaquez, J., Maxwell, D.P. e
Gilbertson, R.L. Tomato yellow leaf curl virus in the Dominican Republic:
Characterization of an infectious clone, virus monitoring in whiteflies, and
identification of reservoir hosts. Phytopathology, v.92, p.487-496. 2002.
Sanderfoot, A.A., Ingham, D.J. e Lazarowitz, S.G. A viral movement protein as a
nuclear shuttle. The geminivirus BR1 movement protein contains domains essential
for interaction with BL1 and nuclear localization. Plant Physiology, v.110, p.23-33.
1996.
Sanderfoot, A.A. e Lazarowitz, S.G. Cooperation in viral movement: The geminivirus
BL1 movement protein interacts with BR1 and redirects it from the nucleus to the
cell periphery. Plant Cell, v.7, p.1185-1194. 1995.
Santos, C.D.G., Ávila, A.C., Inoue-Nagata, A.K. e Resende, R.O. Espécies vegetais
hospedeiras de begomovírus isolados de tomateiro em Goiás e no Distrito Federal.
Fitopatologia Brasileira, v.29, p.450-455. 2004.
Saunders, K., Wege, C., Veluthambi, K., Jeske, H. e Stanley, J. The distinct disease
phenotypes of the common and yellow vein strains of Tomato golden mosaic virus
are determined by nucleotide differences in the 3'-terminal region of the gene
encoding the movement protein. Journal of General Virology, v.82, p.45-51. 2001.
Selth, L.A., Dogra, S.C., Rasheed, M.S., Healy, H., Randles, J.W. e Rezaian, M.A. A
NAC domain protein interacts with Tomato leaf curl virus replication accessory
protein and enhances viral replication. Plant Cell, v.17, p.311-325. 2005.
Stanley, J. Analysis of African cassava mosaic virus recombinants suggest strand
nicking occurs within the conserved nonanucleotide motif during the initiation of
rolling circle DNA replication. Virology, v.206, p.707-712. 1995.
Stanley, J., Bisaro, D.M., Briddon, R.W., Brown, J.K., Fauquet, C.M., Harrison, B.D.,
Rybicki, E.P. e Stenger, D.C. Family Geminiviridae. In: Fauquet, C.M., Mayo, M.A.,
Maniloff, J., Desselberger, U. e Ball, L.A. (Ed.). Virus Taxonomy. Eighth Report of
the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Elsevier
Academic Press, 2005. p.301-326.
Sunter, G. e Bisaro, D.M. Transactivation of geminivirus AR1 and BR2 gene expression
by the viral AL2 gene product occurs at the level of transcription. Plant Cell, v.4,
p.1321-1331. 1992.
Sunter, G., Hartitz, M.D., Hormuzdi, S.G., Brough, C.L. e Bisaro, D.M. Genetic
analysis of tomato golden mosaic virus: ORF AL2 is required for coat protein
accumulation while ORF AL3 is necessary for eficient DNA replication. Virology,
v.179, p.69-77. 1990.
Torres-Pacheco, I., Garzón-Tiznado, J.A., Brown, J.K., Becerra-Flora, A. e Rivera-
Bustamante, R. Detection and distribution of geminiviruses in Mexico and the
Southern United States. Phytopathology, v.86, p.1186-1192. 1996.
32
Torres-Pacheco, I., Garzón-Tiznado, J.A., Herrera-Estrela, L. e Rivera-Bustamante, R.F.
Complete nucleotide sequence of pepper huasteco virus: Analysis and comparison
with bipartite geminiviruses. Journal of General Virology, v.74, p.2225-2231. 1993.
Trinks, D., Rajeswaran, R., Shivaprasad, P.V., Akbergenov, R., Oakeley, E.J.,
Veluthambi, K., Hohn, T. e Pooggin, M.A. Suppression of RNA silencing by a
geminivirus nuclear protein, AC2, correlates with transactivation of host genes.
Journal of Virology, v.79, p.2517-2527. 2005.
Tyler, K.L. e Fields, B.N. Pathogenesis of viral infections. In: Fields, B.N., Knipe, D.M.
e Howley, P.M. (Ed.). Fields Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers,
1996. p.173-218.
Van Der Biezen, E.A. e Jones, J.D. Plant disease-resistance proteins and the gene-for-
gene concept. Trends in Biochemical Sciences, v.23, p.454-456. 1998.
Van Wezel, R., Liu, H., Tien, P., Stanley, J. e Hong, Y. Gene C2 of the monopartite
geminivirus Tomato yellow leaf curl virus-China encodes a pathogenicity
determinant that is localized in the nucleus. Molecular Plant-Microbe Interactions,
v.14, p.1125-1128. 2001.
Vance, V. e Vaucheret, H. RNA silencing in plants - Defense and counterdefense.
Science, v.292, p.2277-2280. 2001.
Vanitharani, R., Chellappan, P., Pita, J.S. e Fauquet, C.M. Differential roles of AC2 and
AC4 of cassava geminiviruses in mediating synergism and suppression of
posttranscriptional gene silencing. Journal of Virology, v.78, p.9487-9498. 2004.
Varma, A. e Malathi, V.G. Emerging geminivirus problems: A serious threat to crop
production. Annals of Applied Biology, v.142, p.145-164. 2003.
Voinnet, O. Induction and suppression of RNA silencing: Insights from viral infections.
Nature Reviews Genetics, v.6, p.206-220. 2005.
Voinnet, O., Pinto, Y.M. e Baulcombe, D.C. Suppression of gene silencing: A general
strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proceedings of the
National Academy of Sciences, USA, v.96, p.14147-14152. 1999.
Wang, H., Buckley, K.J., Yang, X., Buchmann, R.C. e Bisaro, D.M. Adenosine kinase
inhibition and suppression of RNA silencing by geminivirus AL2 and L2 proteins.
Journal of Virology, v.79, p.7410-7418. 2005.
Wang, H., Hao, L.H., Shung, C.Y., Sunter, G. e Bisaro, D.M. Adenosine kinase is
inactivated by geminivirus AL2 and L2 proteins. Plant Cell, v.15, p.3020-3032.
2003.
Wege, C. e Pohl, D. Abutilon mosaic virus DNA B component supports mechanical
virus transmission, but does not counteract begomoviral phloem limitation in
transgenic plants. Virology, v.365, p.173-186. 2007.
Xie, Q., Sanz-Burgos, A.P., Guo, H., Garcia, J.A. e Gutierrez, C. GRAB proteins, novel
members of the NAC domain family, isolated by their interaction with a geminivirus
protein. Plant Molecular Biology, v.39, p.647-656. 1999.
Yang, X., Baliji, S., Buchmann, R.C., Wang, H., Lindbo, J.A., Sunter, G. e Bisaro,
D.M. Functional modulation of the geminivirus AL2 transcription factor and
silencing suppressor by self-interaction. Journal of Virology, v.21, p.11972-11981.
2007.
33
Zambrano, K., Carballo, O., Geraud, F., Chirinos, D., Fernández, C. e Marys, E. First
report of Tomato yellow leaf curl virus in Venezuela. Plant Disease, v.91, p.768.
2007.
Zerbini, F.M., Zambolim, E.M., Carrijo, I.V. e Gilbertson, R.L. A new bipartite
geminivirus infecting tomatoes in Minas Gerais, Brazil. Phytopathology, v.86, p.S1.
1996a.
Zerbini, F.M., Zambolim, E.M., Fernandes, J.J., Gilbertson, R.L. e Carrijo, I.V. Um
novo geminivírus isolado de tomateiro (L. esculentum) em Minas Gerais.
Fitopatologia Brasileira, v.21, p.430. 1996b.
34
INTERAÇÕES POSITIVAS E NEGATIVAS ENTRE DOIS BEGOMOVÍRUS
BISSEGMENTADOS EM TOMATEIRO E Nicotiana benthamiana
Alves-Júnior, M.; Andrade, E.C.; Alfenas-Zerbini, P.; Esposito, D.A., Ventrella, M.C.,
Otoni, W.C. & Zerbini, F.M. Positive and negative interactions between two bipartite
begomoviruses in tomato and Nicotiana benthamiana. Virology, submetido.
35
Positive and negative interactions between two bipartite begomoviruses in tomato
and Nicotiana benthamiana
Miguel Alves-Júnior
1
, Eduardo C. Andrade
1
, Poliane Alfenas-Zerbini
1
, Débora A.
Esposito
1
, Marília C. Ventrella
2
, Wagner C. Otoni
2
& F. Murilo Zerbini
1
1
Departamento de Fitopatologia/BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa,
MG, Brasil, 36570-000
2
Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG,
Brasil, 36570-000
Corresponding author: Francisco Murilo Zerbini
Phone: (+55-31) 3899-2935; Fax: (+55-31) 3899-2240; E-mail: [email protected]
Running title: Dual interaction between two geminiviruses
Key words: plant-virus interaction; geminivirus; ToRMV; ToYSV; tomato
36
Abstract
Begomoviruses cause serious diseases in crop plants worldwide. In Brazil, a viral
complex including Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) and Tomato yellow spot virus
(ToYSV) infects tomatoes. ToYSV symptoms in tomato and Nicotiana benthamiana are
more severe and appear earlier compared to ToRMV, suggesting differential adaptation
of each virus to their hosts. We performed a series of experiments to analyze the role of
a number of factors in this differential adaptation. The kinetics of viral infection was
analyzed in plants which had the inoculated leaf removed at various periods of time
after inoculation. Viral DNA accumulation was estimated in plants at 14 and 28 dpi.
Viral replication was analyzed in protoplasts at 48 and 96 hpe, and tissue tropism was
analyzed by in situ hybridization at 28 dpi. Results indicate that ToYSV is more
efficient in carrying out the early (pre-systemic) events of infection, reaching a higher
concentration and establishing a systemic infection sooner than ToRMV in both tomato
and N. benthamiana. ToRMV negatively interferes on ToYSV during these initial
stages of infection, but once a systemic infection is established this negative
interference ceases. In N. benthamiana, ToYSV invades the mesophyll, while ToRMV
is phloem-restricted. During mixed infection in this host, ToYSV releases ToRMV from
the phloem. We conclude that ToYSV is better adapted than ToRMV to both hosts. In
tomato, this is expressed by its reaching a higher concentration in a shorter period of
time, which may lead to a higher concentration of viral virulence factors. In N.
benthamiana, it is further expressed by its ability to invade mesophyll cells.
37
Introduction
The genus Begomovirus includes the most economically important species of the
Geminiviridae (Stanley et al., 2005). Begomoviruses have a small, circular, single-
stranded DNA genome with one or two components, each with approximately 2,600
nucleotides, encapsidated in twinned icosahedral particles (Rojas et al., 2005; Stanley et
al., 2005). They are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera:
Aleyrodidae) and infect dicot species. Begomovirus diseases are a major limiting factor
to crop yields in tropical and subtropical regions (Briddon, 2003; Legg and Thresh,
2000; Monci et al., 2002; Morales and Anderson, 2001; Were et al., 2004).
In Brazil, as in other countries in the Americas, tomatoes are one of the most
affected crops (Morales and Jones, 2004; Polston and Anderson, 1997; Ribeiro et al.,
2003), with a viral complex comprising at least eight begomovirus species (Ribeiro et
al., 2003). Some of these species are becoming prevalent in the major tomato-producing
areas of the country, with mixed infections being common in the field (Castillo-Urquiza
et al., 2007; Fernandes et al., 2008). Two species have been described and characterized
by our group: Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) (Fernandes et al., 2006) and
Tomato yellow spot virus (ToYSV) (Calegario et al., 2007). Although these two species
were originally isolated from tomato, their phylogeny and biological properties are
distinct. Despite a high degree of nucleotide sequence identity, ToYSV is
phylogenetically closer to viruses infecting the common weed Sida, while ToRMV is
closer to other tomato infecting begomoviruses (Andrade et al., 2006). Biologically, the
main distinction is that ToYSV induces more severe symptoms, faster than ToRMV, in
both tomato and the experimental host Nicotiana benthamiana. Also, ToYSV is
efficiently sap-transmissible to several Nicotiana species, while ToRMV is poorly sap-
transmissible to only a few species, including N. benthamiana; none of the two viruses
38
are sap-transmissible in tomato (Calegario et al., 2007; Fernandes et al., 2006).
Variations in the length of the period between virus inoculation and the onset of
symptoms (defined as the latent period) and in symptom severity indicate distinct levels
of virus adaptation to the host, as a consequence of less or more efficient interactions
between viral proteins and host factors (Morra and Petty, 2000; Rothenstein et al.,
2007). A better adapted virus could replicate at a higher rate, and/or move cell-to-cell or
long distance faster and more efficiently, thus reaching additional tissues besides the
phloem, where the virus is initially introduced by the insect vector (Levy and Czosnek,
2003; McGivern et al., 2005; Petty and Qin, 2001; Rojas et al., 2001). Differences in
symptom severity could also be a consequence of variations in the suppression of host
defense responses by the virus (Fontes et al., 2004; Vanitharani et al., 2004).
Here, we report a series of experiments designed to analyze the role of a number
of factors in the differential adaptation of ToYSV and ToRMV to tomato and N.
benthamiana. Patterns of viral DNA accumulation in infected plants, kinetics of the
establishment of systemic infection, replication in protoplasts and tissue tropism
confirm the better adaptation of ToYSV to both hosts. Although we found evidence that
synergism occurs between the two viruses, both positive and negative interactions take
place in mixed infections.
Material and Methods
Viral isolates and plant material
Infectious clones corresponding to viral isolates ToYSV-[Bic2] (Andrade et al.,
2006) and ToRMV-[Ube1] (Fernandes et al., 2006), maintained as glycerol stocks at
-80
o
C, were used in all experiments. Tomato (Solanum lycopersicum cv. ‘Santa Clara’)
and Nicotiana benthamiana plants were biolistically inoculated (Aragão et al., 1996)
39
using 2 μg of each genomic component (DNA-A and DNA-B). Inoculated plants were
kept in a greenhouse with average daily temperatures of 26 ± 2
o
C during the evaluation
period of all experiments.
Kinetics of viral infection
Tomato and N. benthamiana plants were inoculated with ToYSV only, ToRMV
only, and ToYSV plus ToRMV, but with the inoculation targeting a single leaf, which
was detached from the plant at 2, 4 and 6 days post-inoculation (dpi) for N.
benthamiana and 4, 8 and 12 dpi for tomato. Inoculated plants were observed for the
appearance of symptoms until 35 dpi. DNA from all plants was extracted at 28 dpi as
described (Dellaporta et al., 1983) and used as a template for PCR-amplification of viral
genomic fragments using either species-specific primers (ToYSV: 5’GCT GAG GCG
TTA AAT GCT CC3’ and 5’ATG TCA GGA ATG CCT GGT GG3’; ToRMV: 5’GGT
AGG ATC CTG GTA TTT TCC AGC3’ and 5’GGG GGA ATT CAT GAT GCA TTT
GAC GAG G3’) to confirm the presence of each virus in mixed infections, or with the
universal begomovirus primers PAL1v1978 and PAR1c496 (Rojas et al., 1993) for viral
detection in single infections. Three independent experiments were performed.
Viral DNA accumulation in infected plants
Tomato and N. benthamiana plants were inoculated in the apical meristem with
the same combinations of the previous experiment. Approximately 0.3 g of
symptomatic leaves were collected at 14 and 28 dpi, ground in liquid nitrogen,
transferred to a microfuge tube containing 1 ml of extraction buffer (100 mM Tris-HCl
pH 8.0, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% β-mercaptoethanol) and 50 µl of 20% SDS,
and incubated at 65ºC for 10 minutes. After phenol:chloroform extraction, the DNA was
40
precipitated with 0.7 vols of isopropanol, washed with 70% ethanol and ressuspended in
200 µl of TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA).
Two micrograms of DNA were separated by agarose gel electrophoresis,
transferred and covalently linked to nylon membranes (Hybond-N+, GE Healthcare)
according to standard protocols (Sambrook and Russel, 2001), and hybridized to virus-
specific probes. The ToYSV probe corresponded to nucleotides 1423-2148 in the DNA-
A, obtained after Pst I digestion of clone pToYSV-A 1.2 (Andrade et al., 2006). The
ToRMV probe corresponded to nucleotides 1711-2147 in the DNA-A, obtained after
Cla I and EcoR I digestion of clone pUb1-49 (Fernandes et al., 2006). Both probes were
labeled with α-[
32
P]-dCTP using the Prime-it II kit (Stratagene), following
manufacturer’s instructions. The same amount of DNA was labeled for all
hybridizations. Hybridizations and washes were carried out according to standard
protocols (Sambrook and Russel, 2001), at high stringency conditions. The intensity of
the hybridization signal was quantified based on the average pixel intensity, measured
with the program Multi Gauge v. 3.0. Three independent experiments were performed,
and relative intensity was calculated as the average of these three experiments.
Viral replication in protoplasts
A N. benthamiana cell suspension culture was maintained according to Hall
(1991), by incubation at 26ºC and 90 rpm and subculturing weekly with 1:10 dilutions.
Protoplasts were isolated from the cell suspension culture essentially according to Qi
and Ding (2002), with some modifications. Cells were collected by centrifugation at
70 g for 5 minutes, ressuspended in solution I (0.5 M mannitol, 3.6 mM MES, pH 5.5)
containing 1.5% cellulase “Onozuka” R-10 (Yakult Honsha), 0.4% macerozyme R-10
(Yakult Honsha) and 0.2% driselase (Sigma), and incubated in the dark at room
41
temperature for approximately 4 hours at 40 rpm. The suspension was passed through a
64 mesh sieve (Wilson Sieves) and centrifuged at 50 g for 10 minutes. Protoplasts were
washed twice with solution I and ressuspended in 200 μM MOPS pH 7.2, 5 mM KCl,
0,5 M mannitol. The concentration was adjusted to 5 × 10
6
cells/ml. Protoplasts were
electroporated in 0.4 cm cuvettes at 250 V and 500 μF, with 20 μg of each genomic
component and 30 μg of salmon sperm DNA. After electroporation the suspension was
kept on ice for 10 minutes, diluted in 10 ml of MSP1 medium (MS salts supplemented
with 0.5 mg/l of 6-benzylaminopurine, 2 mg/l of α-naphtaleneacetic acid, 3% sucrose
and 0,5 M mannitol pH 5.8) and incubated at 26ºC in the dark. Protoplasts were
collected at 48 and 96 hours post-electroporation (hpe) and total DNA was extracted as
described (Hou et al., 1998). Viral DNA accumulation was analyzed by hybridization,
as described above. Three independent experiments were performed.
In situ hybridization
Leaves in the second internode of tomato and N. benthamiana plants inoculated
with the same combinations of the previous experiments were collected 28 dpi, cut in
1 cm
2
fragments and fixed in 4% paraformaldehyde in PBS (1.8 mM KH
2
PO
4 p
H 7.2, 8
mM Na
2
HPO
4
, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl) for 12 hours. After rinsing in PBS, the
fragments were dehydrated in ethanol (10-100%), infiltrated with xylol:ethanol (1:3,
1:1, 3:1, one hour in each passage), in xylol for one hour and in xylol:paraffin (1:1) at
68°C overnight. This was followed by infiltration with paraffin wax at 68°C for three
days, with daily changes. The last inclusion was made with paraffin containing 8% bee
wax. The tissue was mounted in a block of paraffin and 8% bee wax and solidified on
ice. Sections of 30 μm were prepared in a Spencer 820 microtome (American Optical),
fixed in slides treated with Haupt’s adhesive and dried at room temperature. Paraffin
42
was removed with xylol and the sections were rehydrated with decreasing ethanol
concentrations (100, 95, 70 and 50%), washed in PBS and fixed in 4%
paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. Finally, the sections were treated with
proteinase K (20 μg/ml) in PBS (pH 8.0) for 15 minutes at 37°C, and washed with PBS
(pH 7.2) supplemented with 2 mg/ml of glycine.
The DNA fragments used as probes for the detection of ToYSV and ToRMV
were the same used in the previous experiments. The control probe consisted of the
plasmid vector Bluescript II KS+ (pKS+, Stratagene) linearized with EcoR I. Probes
were labeled using the DIG DNA Labeling and Detection kit (Roche Applied Sciences),
purified with the Perfectprep Cleanup kit (Eppendorf) and ressuspended in 50 μl of
water.
Sections were pre-hybridized for 3 hours in 4× SSC, 50% formamide,
Denhardt’s solution and 500 μg/ml of salmon sperm DNA, in a moist chamber at 37°C.
The solution was changed, and 800 ng/ml of probe and 4% dextran sulfate were added.
Hybridization was carried out at 37°C for 24 hours in a moist chamber. After
hybridization, sections were washed sequentially in 1× SSC at room temperature, 1×
SSC at 55°C for 15 minutes (twice), 0.5× SSC at 55°C for 15 minutes (twice) and 0.5×
SSC for 10 minutes at room temperature, and then transferred to TBS (100 mM Tris-
HCl pH 7.5, 150 mM NaCl). Sections were blocked with TBS with 0.1% Triton X-100
and 1% blocking reagent (Roche Applied Sciences), and then incubated at 4°C for 12
hours in TBS with 0.1% Triton X-100 and 1% blocking reagent containing anti-DIG
antibodies diluted 1:1000. Sections were washed three times in TBS and equilibrated in
detection buffer (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl
2
). Finally,
sections were incubated in detection buffer containing 300 μg/ml NBT and 165 μg/ml
43
BCIP (Promega) for 3-16 hours, and transferred to water. Sections were mounted in
50% glycerol and examined in a light microscope.
Results
Latent period and symptoms of ToYSV and ToRMV in single or mixed infections in
tomato and N. benthamiana
Symptoms of ToYSV infection in tomato appeared at 10 dpi, and include yellow
mosaic, yellow spots and leaf distortion (Table 1; Figure 1A), plus a marked reduction
in plant growth. In contrast, symptoms of infection by ToRMV appeared at 14 dpi, and
include mild mosaic and minimal leaf distortion (Table 1; Figure 1C), with no evident
growth reduction.
The differences between ToYSV and ToRMV in terms of symptom severity and
latent period were even more evident in N. benthamiana. Plants inoculated with ToYSV
started to display symptoms at 5 dpi, with severe mosaic and leaf curl (Table 1; Figure
1D). In contrast, plants infected by ToRMV did not display symptoms until 14 dpi, and
even after that displayed only a very mild mosaic and down-cupping of the leaves
(Table 1; Figure 1F).
The phenomenon known as synergism occurs when a mixed infection by two
viruses causes symptoms which are more severe than the symptoms induced by each
virus separately. Synergism can be due to a higher accumulation of at least one of the
viruses involved. Since mixed infections by ToYSV and ToRMV could occur in the
field, it is important to know whether synergism takes place between them, as reported
for cassava-infecting begomoviruses (Fondong et al., 2000; Vanitharani et al., 2004).
Tomato plants with mixed infection by ToYSV and ToRMV started displaying
symptoms at 10 dpi (Table 1; Figure 1B), like plants with single infection by ToYSV.
44
Symptoms were more severe than those induced by ToYSV alone, and much more
severe than those induced by ToRMV alone. Plants with mixed infection displayed a
unique leaf roll symptom (Figure 1B), which was not observed in any of the plants
inoculated with either virus alone.
N. benthamiana plants with a mixed infection by the two viruses started
displaying symptoms at 5 dpi, and they were as severe as those observed for single
infections by ToYSV (Table 1; Figure 1E). These results were consistently observed in
three independent experiments.
Kinetics of viral infection in tomato and N. benthamiana
The differences observed between ToYSV and ToRMV in terms of latent period
in both hosts suggest that ToYSV reaches the vascular system, and thus initiates a
systemic infection, faster than ToRMV. To investigate this hypothesis, we conducted
experiments where each virus was inoculated in a single leaf, and this leaf was detached
from the plant after different periods of time. Results of these experiments indicate that
ToYSV is more efficient in the establishment of a systemic infection compared to
ToRMV, in both hosts and in all time periods tested (Table 2; Figure 2).
The latent period in tomato was 10 dpi for ToYSV and 14 dpi for ToRMV
(Figure 2A). In N. benthamiana, the latent period was 5 dpi for ToYSV and 14 dpi for
ToRMV (Figure 2C). It is noteworthy that even when the inoculation was directed to a
single leaf, the latent period and the symptoms induced by both viruses were the same
observed in the previous experiment, where the inoculation was directed to the apical
meristem.
Besides having a shorter latent period, ToYSV infected a higher percentage of
plants in comparison to ToRMV in single infections at all time periods. In tomato, 25%
45
of the plants in which the inoculated leaf was detached at 4 dpi were infected by
ToYSV, and only 6.67% were infected by ToRMV (Table 2; Figure 2B). In N.
benthamiana, 61% of the plants in which the inoculated leaf was detached at 2 dpi were
systemically infected by ToYSV, and only 11% by ToRMV (Table 2; Figure 2D).
Equivalent results were observed for the other time periods.
To investigate whether synergism between the two viruses would affect the
establishment of a systemic infection, plants were simultaneously inoculated with both
viruses in a single leaf. The inoculated leaf was detached after different periods of time
and systemic infection by each virus was assayed by PCR with species-specific primers
at 28 dpi. In tomato, mixed infection caused a significant decrease in the efficiency of
systemic infection by ToYSV when the inoculated leaf was detached at 4 dpi (Table 2;
Figure 2B). This negative effect was not observed when the inoculated leaf was
detached at 8 or 12 dpi. Systemic infection by ToRMV took place with the same
efficiency observed in plants with single infection by this virus when the inoculated leaf
was detached at 4 dpi. When the inoculated leaf was detached at 8 or 12 dpi, ToRMV
was capable of establishing a systemic infection as efficiently as ToYSV (Table 2;
Figure 2B). These results suggest that ToRMV has a negative effect on ToYSV during
the initial stages of infection, but ToYSV facilitates systemic infection by ToRMV at
the late stages of infection.
The negative interference of ToRMV on ToYSV during the initial stages of
infection was more evident in N. benthamiana, a host in which both viruses were more
efficient in the establishment of a systemic infection compared to tomato. In plants
where the inoculated leaf was detached at 2 dpi, ToYSV systemically infected 61.5% of
the plants in single infection, and only 17.6% of the plants in mixed infection (Table 2;
Figure 2D). The percentage of plants infected by ToRMV was similar in single and
46
mixed infection (11.1 and 17.6%, respectively, with no statistical difference). However,
when the inoculated leaf was detached at 4 or 6 dpi, not only did the negative effect on
ToYSV disappeared, but the percentage of plants infected by ToRMV increased
drastically compared to plants with a single infection by this virus (Table 2; Figure 2D).
Together, these results indicate that ToYSV is better adapted than ToRMV to
both hosts. ToYSV is capable of establishing a systemic infection faster and more
efficiently than ToRMV in both hosts, although both viruses are more efficient in N.
benthamiana than in tomato. More interestingly, ToRMV has a negative effect over
ToYSV during the initial stages of mixed infection, but ToYSV eventually facilitates
systemic infection by ToRMV at the later stages, in both hosts.
Accumulation of ToYSV and ToRMV in single or mixed infections in tomato and N.
benthamiana
In order to determine whether symptom severity could be correlated with viral
DNA accumulation in infected tissues, systemically infected leaves were collected at 14
and 28 dpi, total DNA was extracted and hybridized with species-specific probes.
In both hosts, results of three independent experiments indicate that, in single
infection, the accumulation of ToYSV is higher than that of ToRMV at both time points
(Figure 3). Furthermore, the concentration of ToYSV remained constant between the
two time points, while that of ToRMV was reduced from 14 to 28 dpi (Figure 3).
In mixed infection of tomato plants, no significant changes in viral DNA
accumulation were observed for ToYSV (Figure 3). Interestingly, although the
accumulation of ToRMV was lower compared to single infection by this virus at 14 dpi,
it increased from 14 to 28 dpi, the opposite of what was observed in single infection
(Figure 3). These results were consistently observed in three independent experiments.
47
As observed in tomato, there were no changes in DNA accumulation for ToYSV
in mixed infection of N. benthamiana (Figure 3). The accumulation of ToRMV was
similar to what was observed in single infection at 14 dpi, but increased significantly
from 14 to 28 dpi (Figure 3). Again, these results were observed consistently in three
independent experiments.
Together, these results indicate that synergism does take place in mixed
infection by ToRMV and ToYSV in both tomato and N. benthamiana, which is
correlated with an increased concentration of ToRMV (at 28 dpi) but not ToYSV.
Furthermore, in single infection, ToYSV accumulates to a higher level than ToRMV in
both hosts, suggesting that ToYSV is better adapted to both hosts and is probably the
virus responsible for the synergistic interaction.
Replication of ToYSV and ToRMV in N. benthamiana protoplasts
To investigate possible differences in the viral replication rate, infectious clones
corresponding to the DNA-A of ToYSV and ToRMV were electroporated separately or
in combination into N. benthamiana protoplasts. Cells were collected at 48 and 96 hpe,
total DNA was extracted and hybridized with virus-specific probes. The results indicate
that the two viruses reach similar concentrations in single infections, reflecting similar
replication rates (Figure 4). However, ToYSV reaches a maximum concentration at 48
hpe, with a significant reduction at 96 hpe. In contrast, ToRMV reaches a maximum
concentration at 96 hpe (Figure 4). Interestingly, no increase in replication was observed
in mixed infection, for either virus (Figure 4). Actually, compared to single infection,
the concentration of ToYSV was reduced at 48 hpe but remained constant until 96 hpe,
and the concentration of ToRMV was decreased at both time points (Figure 4).
48
Together, these results indicate that the replication rate of ToYSV and ToRMV
in N. benthamiana is equivalent in single infections, but higher for ToYSV in mixed
infection. The similar replication rate in single infection indicates that this property is
not responsible for the striking differences in symptom severity by the two viruses in
this host. However, the fact that ToYSV reaches its maximum concentration earlier
than ToRMV (48 hpe, compared to 96 hpe for ToRMV) could explain, at least in
part, the differences observed between the two viruses in the establishment of a
systemic infection, and supports the conclusion that ToYSV is a better adapted
virus.
Tissue tropism of ToYSV and ToRMV in tomato and N. benthamiana
To test the hypothesis that differential tissue tropism is responsible for the
differences in symptom severity between ToYSV and ToRMV and for the higher DNA
accumulation of ToYSV compared to ToRMV, in situ hybridization studies were
carried out in systemically infected leaves of tomato and N. benthamiana plants with
single or mixed infection.
In tomato, both ToYSV and ToRMV were detected only in cells associated with
the vascular tissues (Figure 5A, 5B). In N. benthamiana, ToYSV was detected in a large
number of cells in the mesophyll, besides the vascular tissues (Figure 5C). In contrast,
ToRMV remained phloem-restricted in this host (Figure 5D). However, when semithin
sections from plants infected with both viruses were analyzed using the ToRMV-
specific probe, viral DNA was detected in mesophyll cells (Figure 5E), indicating that
mixed infection with ToYSV allowed mesophyll invasion by ToRMV. The ToRMV-
specific probe did not detect ToYSV in plants with a single infection by this virus, thus
confirming its specificity (Figure 5F).
49
Together, these results indicate that the differences in symptom severity and DNA
accumulation observed between ToYSV and ToRMV in tomato are not due to
differences in tissue tropism, since both viruses are phloem-restricted in this host.
However, tissue tropism could be, at least in part, explain the differences observed in N.
benthamiana, since ToYSV is capable of invading the mesophyll in this host, unlike
ToRMV. Furthermore, in mixed infection, the fact the ToRMV is no longer confined to
the phloem could explain its increased DNA accumulation at the late stages of infection.
Discussion
In Brazil, a begomovirus complex comprised of at least eight species is currently
a major threat to tomato production (Fernandes et al., 2008; Ribeiro et al., 2003). The
introduction of a new biotype (biotype B) of the insect vector Bemisia tabaci, which
unlike the previously existent biotype (biotype A) efficiently colonizes solanaceous
plants such as the tomato, allowed the transfer of indigenous viruses infecting wild
and/or weed hosts to tomato. A few of these species have became prevalent in the field
(Ambrozevicius et al., 2002; Castillo-Urquiza et al., 2007; Fernandes et al., 2008;
Ribeiro et al., 2003), indicating different degrees of adaptation to the new host.
Two of the begomovirus species infecting tomato in the state of Minas Gerais,
ToYSV and ToRMV, exemplify the process described above. Symptoms of ToYSV
infection in tomato appear at 10 dpi and are considerably more severe than those
induced by ToRMV, which appear at 14 dpi. These differences are even more evident in
the experimental host N. benthamiana, and in potential wild hosts such as Nicotiana
glutinosa and Nicotiana tabacum (data not shown). Mixed infection with both viruses
caused symptoms to appear at 10 dpi in tomato and 5 dpi in N. benthamiana. In tomato,
symptoms were more severe than those induced by each virus alone. In N. benthamiana,
symptoms were comparable to those induced by ToYSV alone.
50
The efficiency of a virus in establishing a systemic infection, as expressed by
latent period and the percentage of plants infected following inoculation, may reflect a
better interaction between viral proteins and host factors, leading to improved
replication, cell-to-cell movement and/or suppression of host defense responses.
Likewise, reduced levels of viral DNA accumulation in hosts to which the virus is
poorly adapted probably reflect an inefficient interaction between viral and host factors
(Petty et al., 1995).
ToYSV is more efficient than ToRMV in establishing a systemic infection in
both tomato and N. benthamiana, and both viruses are more efficient in infecting the
experimental host N. benthamiana compared to the natural host (tomato). However, it
must be considered that both hosts belong to the Solanaceae, and that both viruses infect
a number of solanaceous species (Calegario et al., 2007; Fernandes et al., 2006).
Therefore, the perception of tomato as the “natural” host could be merely a consequence
of its economical importance. It is perfectly possible that Nicotiana species are the true
natural host of these viruses (or of the viruses from which they evolved). It is
noteworthy that in a initial experiment in which the inoculated leaf was detached from
tomato plants at the same periods of time used for N. benthamiana (2, 4 and 6 dpi), the
percentage of infected plants was close to zero (data not shown). This further indicates
the lower efficiency of both viruses in infecting tomato compared to N. benthamiana.
Differences in host adaptation of begomoviruses were demonstrated by Hou et
al. (1998), working with Bean dwarf mosaic virus (BDMV) and Tomato mottle virus
(ToMoV). BDMV was more pathogenic than ToMoV in the experimental hosts N.
benthamiana and N. tabacum (which both viruses can infect), and both viruses were less
efficient in infecting their respective “natural” hosts (common bean and tomato).
51
Intriguing results were observed in plants with mixed infection. When the
inoculated leaf was detached at 2 dpi (in N. benthamiana) or 4 dpi (in tomato), a
significant reduction was observed in the percentage of plants infected by ToYSV
compared to the single infection by this virus. This negative interference of ToRMV
over ToYSV was not observed at the other time points (4 and 6 dpi for N. benthamiana,
8 and 12 dpi for tomato). On the contrary, in these treatments the percentage of infected
plants by ToYSV was equivalent to the one observed in single infection, while the
percentage of plants infected by ToRMV increased. These results suggest that the
presence of ToRMV interferes with initial events of the ToYSV infection cycle, which
could be related to replication in the initially infected cell or cell-to-cell movement. It
must be considered that simultaneous inoculation with both viruses does not necessarily
mean that both viruses will be present in the same cells, although it is reasonable to
assume that at least some cells will have both viruses, as reported for mixed infection
with TYLCV and TYLCSV in tomato and N. benthamiana in which 20% of the cells
were infected by both viruses (Morilla et al., 2004).
In a mixed infection, viral proteins which are less efficient in interacting with
host factors could have a negative effect in the interaction of the more efficient proteins,
a phenomenon known as negative dominance (Herskowitz, 1987). An example of
negative dominance is the inhibition of ACMV infection by co-inoculation of a mutant
virus in which the coat protein gene was replaced by a truncated version of the MP gene
of Tomato golden mosaic virus (TGMV) (von Arnim and Stanley, 1992). The use of
negative dominance has been the basis for a number of attempts to generate geminivirus
resistant transgenic plants (Antignus et al., 2004; Duan et al., 1997; Hou et al., 2000;
Noris et al., 1996; Shivaprasad et al., 2006). In any event, whichever is the nature of this
negative interference, once the infection cycle progresses to intermediate and late
52
events, not only does ToYSV infect the plant more efficiently, but it actually assists
ToRMV in the establishment of a systemic infection.
Both positive and negative interactions between geminiviruses and viruses from
different genera and families have been described. Synergism is well documented
among cassava-infecting geminiviruses as a consequence of improved RNA silencing
suppression (Fondong et al., 2000; Pita et al., 2001; Vanitharani et al., 2004). Negative
interference was observed in mixed infections between Abutilon mosaic virus (AbMV),
a begomovirus, and the tobamoviruses Tobacco mosaic virus (TMV) and Tomato
mosaic virus (ToMV), with a reduction in DNA accumulation and infectivity of AbMV
in N. benthamiana (Pohl and Wege, 2007). However, we believe this to be the first time
that both positive and negative interactions are verified for the same interaction at
different stages of infection.
In single infections, the differences observed in the severity of symptoms
correlate with viral DNA accumulation in both hosts: ToYSV accumulates to a higher
level compared to ToRMV at either 14 and 28 dpi. An equivalent result was observed in
cassava and N. benthamiana plants infected with African cassava mosaic virus
(ACMV) e East African cassava mosaic virus (EACMV) from Uganda (Pita et al.,
2001). In our case, the method used to estimate viral DNA accumulation does not allow
us to conclude whether the differences observed are due to higher replication or to a
greater number of infected cells (for example, due to differences in tissue tropism).
In mixed infection, the accumulation of ToYSV did not change compared to
single infection, and the accumulation of ToRMV was higher than in single infection.
These results indicate that synergism does take place between the two viruses in both
hosts. It must be pointed out that, for geminiviruses at least, synergism, as expressed by
increased symptom severity in mixed infection compared to single infections, does not
53
necessarily lead to increased DNA accumulation, as demonstrated in tomato and N.
benthamiana plants infected with TYLCV and TYLCSV (Morilla et al., 2004).
Viral replication assays in N. benthamiana protoplasts indicated that the
replication rate of both viruses is equivalent in this host. However, although the two
viruses reached similar concentrations, the results suggest that the ToYSV replication-
associated proteins interact better with host factors, since ToYSV reached the maximum
level of DNA accumulation earlier than ToRMV (48 hpe compared to 96 hpe). Together
with the results from the infection kinetics experiment, we propose that ToYSV
accumulates DNA (and consequently synthesizes mRNA and protein) faster than
ToRMV, and is therefore capable of establishing a systemic infection more efficiently,
maybe by escaping host defense responses. In mixed infection, although the replication
rate of ToYSV is higher than ToRMV at both time points, ToYSV accumulation is
significantly reduced at 48 hpe, reinforcing the observation that ToRMV negatively
interferes with ToYSV replication.
Infection by a number of geminiviruses is restricted to cells of the vascular
tissues (Hoefert, 1987; Horns and Jeske, 1991; Morilla et al., 2004; Rojas et al., 2001;
Wang et al., 1996). However, many begomoviruses are capable of infecting cells of the
mesophyll (Morra and Petty, 2000; Rushing et al., 1987; Sudarshana et al., 1998; Wang
et al., 1996; Wege et al., 2000). This capacity of invading additional tissues besides the
vasculature indicates a better adaptation of the virus to its host, and is normally
associated with greater severity of symptoms and with sap-transmissibility (Morra and
Petty, 2000; Petty and Qin, 2001; Wege et al., 2000; reviewed by Rojas et al., 2005).
In situ hybridization of foliar sections from tomato plants with single or mixed
infections detected the presence of viral DNA only in cells of the vasculature. A similar
result was observed for tomato infection by TYLCV and TYLCSV, both of which were
54
phloem-restricted either in single or mixed infections (Morilla et al., 2004). Therefore,
tissue tropism does not explain the differences between ToYSV and ToRMV in single
infection or the synergism observed in mixed infection. We did not carry out protoplast
replication assays in tomato, and therefore this remains as a possible explanation for
these differences. Another plausible hypothesis would be that ToYSV encodes a more
efficient silencing suppressor than ToRMV. As mentioned above, synergism between
cassava-infecting geminiviruses was associated with enhanced silencing suppression
(Vanitharani et al., 2004).
In N. benthamiana, in situ hybridization detected ToYSV in both phloem-
associated and mesophyll cells, while ToRMV remained phloem-restricted in single
infection. Therefore, although the two viruses replicate at similar rates, the fact that
ToYSV reaches its peak concentration faster than ToRMV and is capable of invading
the mesophyll could explain its higher DNA accumulation and more severe symptoms.
In situ hybridization from foliar sections of N. benthamiana plants with mixed
infection indicated the presence of ToRMV in mesophyll cells. This demonstrates that
the presence of ToYSV allows ToRMV to invade the mesophyll, and could explain the
higher accumulation of this virus even though its replication rate was reduced compared
to the single infection. Such an effect is not unusual for geminiviruses. Mixed infection
by TGMV, which invades mesophyll cells of N. benthamiana, and Bean golden mosaic
virus (BGMV) or ACMV, both phloem-restricted in this host, resulted in BGMV and
ACMV invading the mesophyll (Morra and Petty, 2000; Wege et al., 2001). Release of
phloem restriction has been observed even between geminiviruses and viruses from
distinct genera, such as TMV (Carr and Kim, 1983) and Cucumber mosaic virus (CMV)
(Wege and Siegmund, 2007), indicating that the viral factors involved in movement are
less specific than those involved in replication.
55
In summary, results from experiments determining kinetics of systemic
infection, viral DNA accumulation, replication in protoplasts and tissue tropism indicate
that ToYSV is more efficient in carrying out the early (pre-systemic) events of the viral
infection cycle, reaching a higher concentration and establishing a systemic infection
sooner than ToRMV in both tomato and N. benthamiana. ToRMV negatively interferes
on ToYSV during these initial stages of infection, but once a systemic infection is
established, this negative interference ceases. In N. benthamiana, ToYSV invades the
mesophyll, while ToRMV is phloem-restricted. During mixed infection in this host,
ToYSV releases ToRMV from the phloem. Based on these results, we conclude that
ToYSV is better adapted than ToRMV in both hosts, although its better adaptation is
more evident in N. benthamiana than in tomato. In tomato, the better adaptation of
ToYSV is expressed by its capacity of reaching a higher concentration in a shorter
period of time, which may lead to a higher concentration of viral virulence factors such
as proteins involved in the suppression of host defense responses. In N. benthamiana,
the better adaptation of ToYSV is further expressed by its ability to invade mesophyll
cells. Our future studies will focus on the identification and functional analysis of the
viral virulence factors responsible for the better adaptation of ToYSV compared to
ToRMV.
Acknowledgments
The authors wish to thank the members of the Plant Molecular Virology Lab. at UFV
for helpful suggestions and discussions, and for critical reading of the
manuscript. This research was funded by grants from CNPq (474140/2004-0) and
Fapemig (CAG 823/03) to FMZ. MAJ was the recipient of a CAPES doctoral
fellowship. PAZ is a CNPq posdoctoral fellow.
56
Literature Cited
Ambrozevicius, L. P., Calegario, R. F., Fontes, E. P. B., Carvalho, M. G., and Zerbini,
F. M. (2002). Genetic diversity of begomoviruses infecting tomato and
associated weeds in Southeastern Brazil. Fitopatol Bras 27, 372-377.
Andrade, E. C., Manhani, G. G., Alfenas, P. F., Calegario, R. F., Fontes, E. P. B., and
Zerbini, F. M. (2006). Tomato yellow spot virus, a tomato-infecting
begomovirus from Brazil with a closer relationship to viruses from Sida sp.,
forms pseudorecombinants with begomoviruses from tomato but not from Sida.
J Gen Virol 87, 3687-3696.
Antignus, Y., Vunsh, R., Lachman, O., Pearlsman, M., Maslenin, L., Hananya, U., and
Rosner, A. (2004). Truncated Rep gene originated from Tomato yellow leaf curl
virus-Israel [Mild] confers strain-specific resistance in transgenic tomato. Ann
Appl Biol 144, 39-44.
Aragão, F. J. L., Barros, L. M. G., Brasileiro, A. C. M., Ribeiro, S. G., Smith, F. D.,
Sanford, J. C., Faria, J. C., and Rech, E. L. (1996). Inheritance of foreign genes
in transgenic bean (Phaseolus vulgaris L.) co-transformed via particle
bombardment. Theoret Appl Gen 93, 142-150.
Briddon, R. W. (2003). Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus
complex. Mol Plant Pathol 4, 427-434.
Calegario, R. F., Ferreira, S. S., Andrade, E. C., and Zerbini, F. M. (2007).
Characterization of Tomato yellow spot virus, (ToYSV), a novel tomato-
infecting begomovirus from Brazil. Br J Agric Res 42, 1335-1343.
Carr, R. J., and Kim, K. S. (1983). Evidence that bean golden mosaic virus invades non-
phloem tissue in double infections with tobacco mosaic virus. J Gen Virol 64,
2489-2492.
Castillo-Urquiza, G. P., Beserra Junior, J. E. A., Alfenas-Zerbini, P., Varsani, A., Lima,
A. T. M., Barros, D. R., and Zerbini, F. M. (2007). Genetic diversity of
begomoviruses infecting tomato in Paty do Alferes, Rio de Janeiro state, Brazil.
Virus Rev Res 12, 233. (Abstract)
Dellaporta, S. L., Wood, J., and Hicks, J. B. (1983). A plant DNA minipreparation:
Version II. Plant Mol Biol Rept 1, 19-21.
Duan, Y.-P., Powell, C. E., Purcifull, D. E., and Hiebert, E. (1997). Geminivirus
resistance in transgenic tobacco expressing mutated BC1 protein. Mol Plant
Microbe Interact 10, 617-623.
Fernandes, F. R., Albuquerque, L. C., Giordano, L. B., Boiteux, L. S., Ávila, A. C., and
Inoue-Nagata, A. K. (2008). Diversity and prevalence of Brazilian bipartite
begomovirus species associated to tomatoes. Virus Genes 36, 251-258.
Fernandes, J. J., Carvalho, M. G., Andrade, E. C., Brommonschenkel, S. H., Fontes, E.
P. B., and Zerbini, F. M. (2006). Biological and molecular properties of Tomato
rugose mosaic virus (ToRMV), a new tomato-infecting begomovirus from
Brazil. Plant Path 55, 513-522.
Fondong, V. N., Pita, J. S., Rey, M. E. C., Kochko, A., Beachy, R. N., and Fauquet, C.
M. (2000). Evidence of synergism between African cassava mosaic virus and a
new double-recombinant geminivirus infecting cassava in Cameroon. J Gen
Virol 81, 287-297.
Fontes, E. P. B., Santos, A. A., Luz, D. F., Waclawovsky, A. J., and Chory, J. (2004).
The geminivirus nuclear shuttle protein is a virulence factor that suppresses
transmembrane receptor kinase activity. Genes Dev 18, 2545-2556.
57
Hall, R. D. (1991). Initiation and maintenance of callus cultures of carrot and tobaco. In
Plant Tissue Culture Manual A2.
Herskowitz, I. (1987). Functional inactivation of genes by dominant negative mutations.
Nature 329, 219-222.
Hoefert, L. (1987). Association of squash leaf curl virus with nuclei of squash vascular
cells. Phytopathol 77, 1596-1600.
Horns, T., and Jeske, H. (1991). Localization of abutilon mosaic virus (AbMV) DNA
within leaf tissue by in situ hybridization. Virology 181, 580-588.
Hou, Y. M., Paplomatas, E. J., and Gilbertson, R. L. (1998). Host adaptation and
replication properties of two bipartite geminiviruses and their
pseudorecombinants. Mol Plant Microbe Interact 11, 208-217.
Hou, Y. M., Sanders, R., Ursin, V. M., and Gilbertson, R. L. (2000). Transgenic plants
expressing geminivirus movement proteins: Abnormal phenotypes and delayed
infection by Tomato mottle virus in transgenic tomatoes expressing the Bean
dwarf mosaic virus BV1 or BC1 proteins. Mol Plant Microbe Interact 13, 297-
308.
Legg, J. P., and Thresh, J. M. (2000). Cassava mosaic virus disease in East Africa: A
dynamic disease in a changing environment. Virus Res 71, 135-149.
Levy, A., and Czosnek, H. (2003). The DNA-B of the non-phloem-limited bean dwarf
mosaic virus (BDMV) is able to move the phloem-limited Abutilon mosaic virus
(AbMV) out of the phloem, but DNA-B of AbMV is unable to confine BDMV
to the phloem. Plant Mol Biol 53, 789-803.
McGivern, D. R., Findlay, K. C., Montague, N. P., and Boulton, M. I. (2005). An intact
RBR-binding motif is not required for infectivity of Maize streak virus in
cereals, but is required for invasion of mesophyll cells. J Gen Virol 86, 797-801.
Monci, F., Sanchez-Campos, S., Navas-Castillo, J., and Moriones, E. (2002). A natural
recombinant between the geminiviruses Tomato yellow leaf curl Sardinia virus
and Tomato yellow leaf curl virus exhibits a novel pathogenic phenotype and is
becoming prevalent in Spanish populations. Virology 303, 317-326.
Morales, F. J., and Anderson, P. K. (2001). The emergence and dissemination of
whitefly-transmitted geminiviruses in Latin America. Arch Virol 146, 415-441.
Morales, F. J., and Jones, P. G. (2004). The ecology and epidemiology of whitefly-
transmitted viruses in Latin America. Virus Res 100, 57-65.
Morilla, G., Krenz, B., Jeske, H., Bejarano, E. R., and Wege, C. (2004). Tête à tête of
tomato yellow leaf curl virus and tomato yellow leaf curl sardinia virus in single
nuclei. J Virol 78, 10715-10723.
Morra, M. R., and Petty, I. T. D. (2000). Tissue specificity of geminivirus infection is
genetically determined. Plant Cell 12, 2259-2270.
Noris, E., Accotto, G. P., Tavazza, R., Brunetti, A., Crespi, S., and Tavazza, M. (1996).
Resistance to tomato yellow leaf curl geminivirus in Nicotiana benthamiana
plants transformed with a truncated viral C1 gene. Virology 224, 130-138.
Petty, I. T. D., Miller, C. G., Meade-Hash, T. J., and Schaffer, R. L. (1995).
Complementable and noncomplementable host adaptation defects in bipartite
geminiviruses. Virology 212, 263-267.
Petty, I. T. D., and Qin, Y. (2001). Genetic analysis of bipartite geminivirus tissue
tropism. Virology 291, 311-323.
Pita, J. S., Fondong, V. N., Sangare, A., Otim-Nape, G. W., Ogwal, S., and Fauquet, C.
M. (2001). Recombination, pseudorecombination and synergism of
geminiviruses are determinant keys to the epidemic of severe cassava mosaic
disease in Uganda. J Gen Virol 82, 655-665.
58
Pohl, D., and Wege, C. (2007). Synergistic pathogenicity of a phloem-limited
begomovirus and tobamoviruses, despite negative interference. J Gen Virol 88,
1034-1040.
Polston, J. E., and Anderson, P. K. (1997). The emergence of whitefly-transmitted
geminiviruses in tomato in the western hemisphere. Plant Dis 81, 1358-1369.
Qi, Y., and Ding, B. (2002). Replication of Potato tuber viroid in cultured cells of
tobacco and Nicotiana benthamiana: The role of specific nucleotides in
determining replication levels for host adaptation. Virology 302, 445-456.
Ribeiro, S. G., Ambrozevicius, L. P., Ávila, A. C., Bezerra, I. C., Calegario, R. F.,
Fernandes, J. J., Lima, M. F., Mello, R. N., Rocha, H., and Zerbini, F. M.
(2003). Distribution and genetic diversity of tomato-infecting begomoviruses in
Brazil. Arch Virol 148, 281-295.
Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Russell, D. R., and Maxwell, D. P. (1993). Use of
degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly-
transmitted geminiviruses. Plant Dis 77, 340-347.
Rojas, M. R., Hagen, C., Lucas, W. J., and Gilbertson, R. L. (2005). Exploiting chinks
in the plant's armor: Evolution and emergence of geminiviruses. Annu Rev
Phytopathol 43, 361-394.
Rojas, M. R., Jiang, H., Salati, R., Xoconostle-Cazares, B., Sudarshana, M. R., Lucas,
W. J., and Gilbertson, R. L. (2001). Functional analysis of proteins involved in
movement of the monopartite begomovirus, tomato yellow leaf curl virus.
Virology 291, 110-125.
Rothenstein, D., Krenz, B., Selchow, O., and Jeske, H. (2007). Tissue and cell tropism
of Indian cassava mosaic virus (ICMV) and its AV2 (precoat) gene product.
Virology 359, 137-145.
Rushing, A. E., Sunter, G., Gardiner, W. E., Dute, R. R., and Bisaro, D. M. (1987).
Ultrastructural aspects of tomato golden mosaic virus infection in tobacco.
Phytopathol 77, 1231-1236.
Sambrook, J., and Russel, D. (2001). "Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3
a
ed.)." Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Shivaprasad, P. V., Thillaichidambaram, P., Balaji, V., and Veluthambi, K. (2006).
Expression of full-length and truncated Rep genes from Mungbean yellow
mosaic virus-Vigna inhibits viral replication in transgenic tobacco. Virus Genes
33, 365-374.
Stanley, J., Bisaro, D. M., Briddon, R. W., Brown, J. K., Fauquet, C. M., Harrison, B.
D., Rybicki, E. P., and Stenger, D. C. (2005). Family Geminiviridae. In "Virus
Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of
Viruses" (C. M. Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, and L. A.
Ball, Eds.), pp. 301-326. Elsevier Academic Press, San Diego.
Sudarshana, M. R., Wang, H. L., Lucas, W. J., and Gilbertson, R. L. (1998). Dynamics
of bean dwarf mosaic geminivirus cell-to-cell and long-distance movement in
Phaseolus vulgaris revealed, using the green fluorescent protein. Mol Plant
Microbe Interact 11, 277-291.
Vanitharani, R., Chellappan, P., Pita, J. S., and Fauquet, C. M. (2004). Differential roles
of AC2 and AC4 of cassava geminiviruses in mediating synergism and
suppression of posttranscriptional gene silencing. J Virol 78, 9487-9498.
von Arnim, A., and Stanley, J. (1992). Inhibition of African cassava mosaic virus
systemic infection by a movement protein from the related geminivirus Tomato
golden mosaic virus. Virology 187, 555-564.
59
Wang, H. L., Gilbertson, R. L., and Lucas, W. J. (1996). Spatial and temporal
distribution of bean dwarf mosaic geminivirus in Phaseolus vulgaris and
Nicotiana benthamiana. Phytopathol 86, 1204-1214.
Wege, C., Gotthardt, R. D., Frischmuth, T., and Jeske, H. (2000). Fulfilling Koch's
postulates for Abutilon mosaic virus. Arch Virol 145, 2217-2225.
Wege, C., Saunders, K., Stanley, J., and Jeske, H. (2001). Comparative analysis of
tissue tropism of bipartite geminivirus. J. Phytopathol. 149, 359-368.
Wege, C., and Siegmund, D. (2007). Synergism of a DNA and an RNA virus: Enhanced
tissue infiltration of the begomovirus Abutilon mosaic virus (AbMV) mediated
by Cucumber mosaic virus (CMV). Virology 357, 10-28.
Were, H. K., Winter, S., and Maiss, E. (2004). Viruses infecting cassava in Kenya. Plant
Dis 88, 17-22.
60
Table 1. Infectivity and latent period in tomato and N. benthamiana plants inoculated
with ToYSV and ToRMV separately or in combination.
Tomato N. benthamiana
Infectivity
a
(% infected plants)
Latent period
(dpi)
b
Infectivity
(% infected plants)
Latent period
(dpi)
no DNA
ToYSV
ToRMV
ToYSV+ToRMV
0/4 (0)
37/46 (80.4)
36/49 (73.5)
42/49 (85.7)
-
10
14
10
0/4 (0)
27/27 (100)
27/28 (96.4)
26/26 (100)
-
5
14
5
a
Number of infected plants/Number of inoculated plants, verified by visual observation of symptoms
and confirmed by PCR amplification of viral genomic fragments at 28 dpi, using either species-specific
primers. Results correspond to the sum of three independent experiments.
b
Period of time, in days, between inoculation and the onset of systemic symptoms (in non-inoculated
leaves).
61
Table 2. Infectivity in tomato and N. benthamiana plants inoculated in a single leaf
with ToYSV and ToRMV, separately or in combination.
Tomato N. benthamiana
Treatments
Infectivity
a
(% infected plants)
Treatments Infectivity
(% infected plants)
Apex control
b
4/5 (80) Apex control 5/5 (100)
no DNA 0/10 (0) no DNA 0/9 (0)
ToRMV 4dpi
c
1/15 (6.67) ToRMV 2dpi
d
2/18 (11.11)
ToRMV 8dpi 0/16 (0) ToRMV 4dpi 1/18 (5.55)
ToRMV 12dpi 1/16 (6.25) ToRMV 6dpi 3/16 (18.75)
ToYSV 4dpi 4/16 (25) ToYSV 2dpi 16/26 (61.54)
ToYSV 8dpi 1/14 (7.14) ToYSV 4dpi 12/22 (54.55)
ToYSV 12dpi 3/15 (20) ToYSV 6dpi 18/23 (78.26)
ToY + ToR 4 dpi
e
1/15 (6.67) ToY + ToR 2 dpi 3/17 (17.65)
ToY + ToR 8dpi 1/16 (6.25) ToY + ToR 4dpi 9/16 (56.25)
ToY + ToR 12 dpi 2/16 (12.5) ToY + ToR 6 dpi 11/16 (68.75)
ToR (ToY+ToR) 4dpi
f
0/15 (0) ToR (ToY+ToR) 2 dpi 0/17 (0)
ToR (ToY+ToR) 8dpi 0/16 (0) ToR (ToY+ToR) 4 dpi 1/16 (6.25)
ToR (ToY+ToR) 12dpi 0/16 (0) ToR (ToY+ToR) 6 dpi 0/16 (0)
ToY (ToY+ToR) 4dpi
g
1/15 (6.67) ToY (ToY+ToR) 2 dpi 0/17 (0)
ToY (ToY+ToR) 8dpi 0/16 (0) ToY (ToY+ToR) 4 dpi 4/16 (25)
ToY (ToY+ToR) 12dpi 1/16 (6.25) ToY (ToY+ToR) 6 dpi 2/16 (12.5)
a
Number of infected plants/Number of inoculated plants, verified by visual observation of symptoms
and confirmed by PCR amplification of viral genomic fragments at 28 dpi, using either species-specific
primers. Results correspond to the sum of three independent experiments.
b
Inoculation with ToYSV, targeted to the apical meristem.
c
Tomato plants had the inoculated leaf detached at 4, 8 or 12 dpi.
d
N. benthamiana plants had the inoculated leaf detached at 2, 4 or 6 dpi.
e
Plants inoculated with both viruses, in which both viruses were present at 28 dpi.
f
Plants inoculated with both viruses, in which only ToRMV was present at 28 dpi.
g
Plants inoculated with both viruses, in which only ToYSV was present at 28 dpi.
62
Figure legends
Figure 1. Symptoms induced by ToYSV and ToRMV in tomato and Nicotiana
benthamiana plants at 14 days post-inoculation. Tomato plants infected with ToYSV
(A) display yellow mosaic and leaf distortion, in contrast to plants infected with
ToRMV (C), which display a milder mosaic with minimal leaf distortion. Plants with
mixed infection (B) display more severe symptoms than those induced by each virus
alone. The arrow indicates the leaf roll symptom observed only in plants with mixed
infection. N. benthamiana plants infected with ToYSV (D) display mosaic and severe
leaf curl, while those infected with ToRMV (F) display only a mild mosaic and down-
cupping of the leaves. Plants with mixed infection (E) display symptoms which are
similar to those induced by ToYSV alone.
Figure 2. Kinetics of the establishment of systemic infection in tomato and N.
benthamiana plants infected with ToYSV and ToRMV, alone or in combination, when
the inoculated leaf was detached from the plant at 4, 8 and 12 days post inoculation
(dpi) (tomato) or 2, 4 and 6 dpi (N. benthamiana). (A) and (C), Percentage of tomato
and N. benthamiana plants, respectively, displaying systemic symptoms at different
time points following inoculation, for each treatment. (B) e (D), Percentage of tomato
and N. benthamiana plants, respectively, in which viral infection was confirmed by
PCR at 28 dpi using species-specific primers, for each treatment. Treatments as in Table
2.
Figure 3. Viral DNA accumulation in tomato and Nicotiana benthamiana plants
inoculated with ToYSV and ToRMV separately or in combination. Total DNA was
extracted from systemically infected leaves at 14 and 28 days post-inoculation (dpi),
and 2 µg of DNA were separated by electrophoresis. DNA accumulation was analyzed
by hybridization with virus-specific probes (indicated at the left). The relative positions
63
of open circular (oc), covalently closed (cc) and single stranded (ss) DNA forms are
indicated at the right. The numbers below each lane indicate the relative intensity of the
signal (average of three independent experiments), based on the average pixel intensity
measured with the program Multi Gauge v. 3.0. For each blot, average values followed
by the same letter do not differ statistically according to Tukey’s test at 5% probability.
Figure 4. Replication of ToYSV and ToRMV in Nicotiana benthamiana protoplasts.
Protoplasts were electroporated with infectious clones corresponding to the DNA-A of
ToYSV and ToRMV, separately or in combination. Cells were collected at 48 and 96
hours post-electroporation (hpe), total DNA was extracted, and 2 µg of DNA were
separated by electrophoresis. DNA accumulation was analyzed by hybridization with
virus-specific probes (indicated at the left). The relative positions of open circular (oc),
covalently closed (cc) and single stranded (ss) DNA forms are indicated at the right.
The numbers below each lane indicate the relative intensity of the signal (average of
three independent experiments), based on the average pixel intensity measured with the
program Multi Gauged v. 3.0. For each blot, average values followed by the same letter
do not differ statistically according to Tukey’s test at 5% probability.
Figure 5. Localization of ToYSV and ToRMV in tomato and N. benthamiana by in situ
hybridization at 28 days post-inoculation. Semi thin sections prepared from infected
plants were hybridized with virus-specific probes and examined in a light microscope.
In tomato plants infected by ToRMV (A) or ToYSV (B), viral DNA was detected only
in cells of the vascular tissues (indicated by arrowheads). In N. benthamiana plants
ToRMV was detected only in the vasculature, while ToYSV was detected in mesophyll
cells (C), (D). In mixed infection, ToRMV was detected in mesophyll cells (E). The
ToRMV-specific probe did not detect ToYSV in plants with single infection by this
virus (F).
64
Figure 1
65
Figure 2
66
Figure 3
67
Figure 4
68
Figure 5
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