( PDF ) Avaliação da técnica de biopsia pulmonar transtorácica em ovinos clinicamente sadios e os efeitos do procedimento sobre o metabolismo oxidativo

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DE BIOPSIA PULMONAR

TRANSTORÁCICA EM OVINOS CLINICAMENTE SADIOS E OS

EFEITOS DO PROCEDIMENTO SOBRE O

METABOLISMO

OXIDATIVO

ANDREZA AMARAL DA SILVA

Botucatu

–

Fevereiro de

2009

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

VALIAÇÃO DA TÉCNICA DE BIOPSIA PULMONAR TRANSTORÁCICA EM

OVINOS CLINICAMENTE SADIOS E OS EFEITOS DO PROCEDIMENTO

SOBRE O

METABOLISMO

OXID

ATIVO

ANDREZA AMARAL DA SILVA

Dissertação apresentada junto ao Programa de

Pós

-Graduação em Medicina Veterinária para

obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr.

Roberto Calderon Gonçalves

-Orientador: Profª. Dr

ª.

Débora Cristina

Damascen

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO

CAMPUS DE BOTUCATU

UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus

Silva, Andreza Amaral

da.

Avaliação da técnica de biopsia pulmonar transtorácica em ovinos clinicamente sadios e os

efeitos do procedimento sobre o metabolismo oxidativo / Andreza Amaral da Silva. – Botucatu

: [s.n.], 2009

Dissertação (mestrado)

–

Universidade Estad

ual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária

e Zootecnia, Botucatu, 2009.

Orientador: Roberto Calderon Gonçalves

orientador: Débora Cristina Damasceno

Assunto CAPES: 50501062

1. Pulmões

Biopsia

Ovino 2. Metabolismo oxidativo

CDD 636.30896

Palavras

chave: Biopsia pulmonar; Metabolismo oxidativo; Ovinos

Nome do Autor:

Andreza Amaral da Silva

Título:

AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DE BIOPSIA PULMONAR

TRANST

ORÁCICA EM OVINOS CLINICAMENTE SADIOS E OS EFEITOS DO

PROCEDIMENTO SOBRE O

METABOLISMO

OXIDATIVO

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof

Roberto Calderon Gonçalves

Presidente e Orientador

Departamento de

Clinica Veterinária

FMVZ

–

UNESP

Botucat

Prof.Dr. Simone Biagio Chiacchio

Membro

Departamento de Clínica Veterinária

FMVZ

–

UNESP

Botucatu

Prof.Dr.

Fernando José Benesi

Membro

Departamento de

Clínica Médica

FMVZ

–

USP

–

São Paulo

Data da Defesa

Fevereiro

de 200

iii

Dedicatória

Aos meus pais,

Carlos

Clarice

pela

maior prova

de amor que poderia ser dada, à

renúncia dos próprios sonhos pelos filhos

"O amor faz com que tu

do, de repente, pareça possível

H. Jackson Brown

Ao meu orientador

Roberto Calderon Gonçalves

, pela

disponibil

idade que sempre manifestou e a

empatia com que

recebeu as minhas idéias, estímulo que me permitiu

vencer as inseguranças deste processo.

“

Nosso maior desejo na vida é encontrar alguém que nos faça fazer o melhor

que pudermos

”

Ralph Waldo Emerson

“

Só os sonhadores podem nos ensinar a voar

Anne Marie Pierce

Agradecimentos

A Deus, por sua proteção e presença constante. Serei eternamente grata pelas oportunidades, por me

permitir chegar até aqui e pelas pess

oas que cruzaram meu caminho

Aos animais, por tudo aquilo que serve de cenário para o meu dia-a-dia; pelas noites mal dormidas

dedicadas a vocês, por aumentarem, à sua maneira, meus conhecimentos e por nunca me deixarem

esquecer de que enquanto há vida

há esperança

Aos meus Pais, Carlos e Clarice, exemplo de amor e dedicação, que sempre estiveram ao meu lado nas

adversidades, me ensinado a transpor barreiras e permitindo a realização de meus sonhos

Ao meu orientador, Prof. Roberto Calderon Gonçalves, pelos

ensinamentos

transmitidos, pela

paciência, credibilidade e confiança depositados em mim. Gostaria que soubesse que o admiro e o

considero um exemplo de pessoa e de profissional, que sempre estimulou e contribuiu para o meu

aprimoramento e desenvolvimento na área acadêmica. Por sua capacidade e sensibilidade

, a cada

conversa, extrair de mim elementos e sentimentos que me tornam uma pessoa melhor, minha eterna

gratidão

A minha co-orientadora, Débora Cristina Damasceno, por me receber em seu labora

tório

de braços

abertos

, disponibilizar seus equipamentos e pela orientação na padronização das técnicas

laboratoriais

e na elaboração deste trabalho. Agradeço profundamente a gentileza,

generosidade, a

confiança em mim depositada e o acolhimento.

Ao meu namorado e amigo, João Paulo Tranin Galocha, ouvinte atento de minhas dúvidas, aflições,

desânimos e sucessos.

Obrigada

pelo apoio, pela confiança e valorização do meu trabalho, ainda que

por muitas vezes, sem entender o que tudo aquilo significava. Foi o seu companheirismo que me deu

coragem para transpor meus medos e a culpa pelo tempo que a cada dia te

subtraia.

Amo você!!

As minhas irmãs, Amanda e Amália, que souberam dar sua parcela de contribuição nessa jornada e

procuraram, na amizade, com paciência, atenção e carinho, tornar possíveis meus objetivos

Meu

sincero obrigado

Aos meus familiares que, apesar da distância, sempre me incentivaram, e me deram forças nos

momentos de desânimo e solidão. Um agradecimento especial ao meu primo

Bruno

da Silva Mendes,

pelas constantes palavras de incentivo em nossas infindáveis conversas virtuais.

Ao meu amigo Ulisses Stelmann. Dizer que o admiro e sou eternamente grata a você é muito pouco,

nossa amizade merece mais!!! Obrigado por dizer, algumas vezes, o

que eu realmente precisava ouvir e

por ter me mostrado outro lado a considerar. Obrigada por me ensinar a valorizar mais o meu tempo e

por saber que posso contar contigo e ter sua ajuda sempre que preciso. Obrigado por ser um amigo e

tanto pra mim, de tan

tas diferentes e significativas formas. Que venham mais dez anos de amizade!

Ao meu amigo Luciano José Eloy. Agradeço a sua confiança em mim depositada quando todos me

deram

as costas. Por ter sempre algo para dizer e me fazer pensar, por me arrancar sorrisos nos maus

momentos e me amparar nas vezes em que fraquejei. Os momentos mais difíceis que a vida trouxe

junto com meu mestrado foram, sem dúvida, suavizados pela sua amizade, carinho e apoio. Meu

sincero obr

igada

Ao Dr. Kleber Eduardo de Campos

a Ana Paula Spada, pós-

graduand

a da Faculdade de Medicina

de Botucatu, pela colaboração e presteza na realização das análises bioquímicas, assim como pela

inestimável ajuda no esclarecimento de todas as minhas dúvidas.

Ao pós-

graduando

Danilo Otávio Laurenti Ferreira e a graduanda Bianca Paola Santarosa

pela

ajuda nas colheitas de amostras, mesmo nos horários mais impróprios. Em especial ao Danilo por

disponibilizar os seus animais para o meu experimento.

Ao Prof. Júlio Lopes Sequeira e a doutoranda Camila

Dias Porto pelas

análises histológicas

Ao Prof. Adriano Dias

pela inestimável contribuição na realização dos cálculos estatísticos.

Aos professores do Departamento de Clínica Veterinária desta faculdade Alexandre Secorum Borges,

Rogério Martins Amorim, Roberto Calderon Gonçalves e Simone

Biagio

Chiacchio

. Obrigado pelo

conhecimento compartilhado, pela acolhida, apoio e momentos de descontração durante o mestrado.

Um agradecimento especial ao Prof. Alexandre Secorun Borges que gentilmente cedeu espaço fís

ico

em seu laboratório para que eu colocasse os equipamentos utilizados em meu experimento

Às secretárias do Departamento de Clínica Veterinária, Marlene Dias Camargo e Izabel Cristina

Castro

pela amizade, simpatia e

serviços prontamente prestados sempre

que solicitado.

Aos meus colegas de pós-

graduaç

ão, Janaína Biava, Adriana Rino e Ulisses Stelmann, pelos

momentos agradá

veis

, de descontração e de muito estudo que passamos juntos na nossa “pequena” e

aconchegante sala.

Marco Antônio Simão da Silva e Marcos

Donizeti Gouveia

funcionários do

erviço de

Clínica de

Grandes Animais desta Faculdade, pelo imprescindível auxílio sempre que solicitado.

Aos residentes do Serviço de Clínica de Grandes Animais desta Faculdade pela ajuda prestada em

diversos mom

entos.

Ao Departamento de Clínica Veterinária e a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

UNESP de Botucatu, que me receberam de forma acolhedora tornando

se a extensão de minha casa.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPE

SP)

pelo Auxílio Financeiro

Pesquisa e pela

Bolsa de Estudos concedida, permitindo minha total dedicação ao mestrado.

A todos que, direta ou indiretamente, fizeram parte desta história, mas que minha memória pouco

privilegiada me impediu de lembrar.

"Uma longa viagem começa com um único passo"

Lao

Tsé

vii

LIS

TA DE TABELAS

Tabela

1 Representação dos resultados estatísticos descritivos das

variáveis Superóxido Dismutase (SOD), Glutationa Total (GSH-

t),

Glutationa Peroxidase (GSH-Px) e Substâncias Reativas ao Ácido

Tiobarbitúrico (TBARS) em hemácias de ovinos antes da biopsia

pulmonar

e 30 minutos após o procedimento. Teste de Wilcoxon,

considerando p < 0,05..................................

...............

.................33

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fotomicrografia de cortes histológicos de pulmão de ovino. A.

visão panorâmica de um fragmento pulmonar mostrando a

organização tecidual (H & E, 40x); B e C. organização tecidual

pulmonar: bronquíolos primários e terminais, ductos e sacos

alveolares e alvéolos isolados (H & E, 40x e 100x,

respectivamente);

pneumonia intersticial crônica:

aumento

celularidade, edema, infiltrado inflamatório misto mod

erado,

composto por mononucleares e eosinófilos, além de focos

hemorrágicos

(H & E, 400x)........................................................

Figura 2

Medi

ana e valores Máximo e Mínimo da var

iável

Superóxido

Dismutase (SOD) em h

emácias

de ovinos antes da biopsia

pulmonar e 30 minutos após o procedimento

..............

............

Figura 3 Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Glutationa

Peroxidase

(

GSH

) em hemácias de ovinos antes da biopsia e

30 minutos após o procedimento

.........

........................

...............

Figura 4 Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Glutationa Total

(

GSH

-t)

hemácias de

inos

antes da biopsia e 30 minutos

após o procedimento.................................

............................

......

Figura 5 Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Substâncias

Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (

TBARS

) em hemácias d

ovinos antes da biopsia e 30 minutos após o

procedimento...

..............................................

.................

.............

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

CAT

Catalase

DTNB

cido 5,5

ditiobis

-2-

ácido nitrobenzóico

EDTA

Ácido Etilenodiamida Tetracético

EROs

Espécies Reativas do Oxigênio

GSH

Glutationa Reduzida

GSH

Glutationa Pe

roxidase

GSH

Glutationa Redutase

GSH

-t

Glutationa Total

GSSG

Glutationa Oxidada

Peróxido de Hidrogênio

MDA

alonaldeído

MED

Média

NADPH

Nicotinamida Adenina D

inucleotídeo

-P

Oxigênio

Radical Superóxido

Radical Hidroxila

PBS

Solução Salina Tamponada com Fosfato

SOD

Súperóxido Dismutase

TBA

Ácido Tiobarbitúrico

TBARS

Espécies Reativas ao ácido Tiobarbitúrico

SUMÁRIO

Páginas

Resumo

Abstract

1. Introdução

2. Revisão de Literatura

2.1. Biopsia Pulmonar

2.2. Espécies Reativas do Oxigênio e Estresse Oxidativo

3. Objetivos

4. Material e Métodos

4.1. Animais

4.2. Exame Clínico

4.3. Co

lheita do Material

4.3.1. Contenção

4.3.2. Colheita das Amostras

4.3.2.1 Amostra de Sangue

4.3.2.2. Biopsia Pulmonar

4.4. Processamento e Análise do Material

4.4.1. Exame da Carcaça

4.4.2.

Exame do Fragmento

4.4.2.1. Histopatologia

4.4.3. Amostras de Sangue

4.4.3.1. Determinação da Hemoglo

bina

4.4.3.2. Determinação da Peroxidação Lipídica

4.4.3.3. Determinação da Atividade de Superóxido

Dismutase (SOD

)

4.4.3.4. Determinação da Concentração de Glutationa Total

(GSH

4.4.3.5. Determinação da Atividade Enzimática de

Glut

ationa

Peroxidase (GSH

Px)

4.5. Análise Estatística

5. Resultados

6. Discussão

. Conclusão

8. Referências B

liográficas

9. Anexo

Artigo Científico

SILVA, A.A. Avaliação da técnica de biopsia pulmonar transtorácica em

ovinos clinicamente sadios e os efeitos do procedimento sobre o

metabo

lismo

oxidativo

. Botucatu, 2009

p. Dissertação (Mestrado) –

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,

Universidade Estadual Paulista

Júlio de Mesquita Filho

RESUMO

Avaliou

-se a segurança e a eficácia da técnica de biopsia pul

monar

transtorácica percutânea e seus efeitos sobre o metabolismo oxidativo na

espécie ovina. Foram utilizados 20 ovinos clinicamente sadios e destinados ao

abate. Inicialmente, foram coletadas amostras de sangue da veia jugular em

tubos de ensaio contendo heparina. Após a colheita, foi realizado o exame

clínico seguido da biopsia pulmonar com agulha

semi

automática

no 7º espaço

intercostal direito cerca de 5 cm acima do olécrano. A

vali

o número de

tentativas para a realização do procedimento e o tamanho dos fragmentos. As

amostras obtidas foram a

nalisa

das histologicamente. Uma nova colheita de

sangue foi realizada 30 minutos após a biopsia, e as amostras levadas ao

laboratório para a detecção indireta dos radicais livres [superóxido dismutase

(SOD), glutationa total (GSH-t) e peroxidase (GSH-Px) e substâncias reativas

ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)].

Após

o abate foi realizado o exame

pos

mortem

para avaliação de complicações da técnica e das eventuais lesões

provocadas. Entre todos os animais submetidos à biopsia apenas dois

demonstraram resistência à

técnica, sendo obtidos fragmentos pulmonares

que

mediram

entre 4 mm a 7 mm de comprimento, com média de 1,8

1 tentativas

por fragmento. As principais alterações relacionadas à técnica foram: tosse,

disp

néia inspiratória, elevação das freqüências cardíaca e respiratória e

aumento do ruído broncobronquiol

. Ao exame pos mortem observou-

hemorragia dos músculos intercostais e pleura visceral de tamanho variado

todos os cordeiros

, além de feridas linea

res de até 14 mm

nos

dois animais

que

não reagiram bem ao procedimento. Das 20 tentativas de execução da técnica,

18 obtiveram sucesso, enquanto que

duas o fígado foi equivocadamente

puncionado. As amostras de tecido pulmonar foram consideradas

represen

tativas, pois foi possível a visualização de estruturas íntegras,

incluindo bronquíolos e alvéolos. Trinta minutos após a biopsia houve redução

nas atividades de SOD e de GSH-Px, não sendo verificada alteração

significativa nas concentrações de GSH-t e de TBARS após o procedimento. A

biopsia pulmonar mostrou-se segura e eficaz para obtenção amostras

pulmonares com fins de diagnóstico histológico, sem causar alterações

significativas no metabolismo oxidativo e danos teciduais expressivos.

Palavras

chave:

inos; biopsia pulmonar;

metabolismo

oxidativo.

SILVA, A.A. Evaluation of the transthoracic lung biopsy technique in

clinically healthy sheep and the effects of the procedure on the oxidative

metabolism

Botucatu, 2009. 86

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de

Medicina

Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual

Paulista

Júlio de Mesquita Filho

ABSTRACT

It was evaluated the safety and effectiveness of the percutaneous transthoracic

lung biopsy technique

and

its

effects of the procedure on oxidative metabolism

in sheep. It was used 20 clinically healthy sheep. Initially, blood samples were

collected from the jugular vein in test tubes containing heparin. After collecting

the blood, the clinical examination was carried out followed by lung biopsy with

semi

-automatic needle biopsy. The number of attempts and size of the

fragments were measured and the samples were analyzed histologically. New

blood samples were collected 30 minutes after the biopsy. All blood samples

were taken to the laboratory for the indirect detection of free radicals

[superoxide dismutase (SOD), total glutathione (GSH-t), glutathione peroxidase

(GSH

-Px) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)]. After the

slaughter,

a post mo

rtem examination assessed

the technical complications and

possible injuries. Among all animals underwent biopsy only two did not tolerate

the technique. It were obtained Lung fragments from 4 mm to 7 mm and

were

required on average 1,8 attempts. The main changes related to the procedure

were: cough, labored breathing, increased heart and breathing rate and

increased broncobronquiolar noise. The post-mortem examination revealed

bleeding of the intercostal muscles and visceral pleura of various sizes in al

lambs,

and a wound up to 14 mm in the lung of two animals that did not

tolerate the procedure.

From

20 attempts to implement the technique, 18 were

successful, while in two of them the liver was mistakenly punctured. Samples of

lung tissue were represent

ative.

It was possible to visualize intact structures,

including bronchioles and alveoli. The activity of SOD and GSH-Px decreased

thirty minutes after the biopsy. There were no changes in GSH-t and TBARS

concentrations after the procedure. The percutaneous transthoracic lung biopsy

technique showed to be safe and effective for obtaining lung samples for

histological diagnosis without causing significant changes in oxidative

metabolism and expressive tissue damage.

Key words:

Ovine,

lung biopsy, oxidative

stress

1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos a ovinocultura reapareceu principalmente na região

Sudeste do Brasil, como solução econômica para os pecuaristas de pequeno e

médio porte. Na

ltima década tem se verificado não só

aumento no efetivo dos

rebanhos, mas também no número de propriedades envolvidas nesta atividade.

A principal causa disso é o aumento no consumo de carne ovina, mais

especificamente da carne de cordeiro, viabilizando sistemas de produção

animal em pequenas propriedades e tornando-se mais uma alternativa de

investimento no meio agropecuário.

Atualmente, as doenças respiratórias são consideradas um sério

problema de sanidade na ovinocultura, apresentando altos índices de

morbidade e mortalidade (MARTIN, 1996; CUTLIP et al., 1998), sendo

responsáveis por 10 a 40% das mortes em animais adultos (VIEIRA et al.,

1993) e por 17% das mortes durante o período perinatal (ROOK et al., 1990).

No processo diagnóstico de diversas

enfermidades

do sistema

respiratório é imprescindível a realização de anamnese criteriosa e exame

físico minucioso do aparelho respiratório (GONÇALVES, 2004). Quando estes

recursos semiológicos não são suficientes para uma conduta diagnóstica

adequada, é preciso lançar mão de procedimentos que ajudem o clínico na

busca pelo diagnóstico. Para tanto, os exames complementares auxiliam não

só no diagnóstico, mas também no prognóstico, plano terapêutico e

preservação do paciente.

A biopsia pulmonar pode ser empregada como auxílio diagnóstico, com

a efetividade confirmada do procedimento na obtenção de fragmentos

adequados para o exame histopatológico e microbiológico (PORTO, 1991).

Todavia, a biopsia pulmonar é um procedimento pouco efetuado na medicina

veterinária, talvez pela insegurança dos veterinários em realizar a técnica

correta. Apesar disso, já foi comprovado que a biopsia pulmonar auxilia na

diferenciação de alterações inflamatórias, alérgicas, enfisematosas,

edematosas e neoplásicas em várias espécies animais (BRAUN et al., 1999;

PUGH, 2005), i

nclusive na espécie ovina (BRAUN et al., 2000).

Na ultima década foram realizadas inúmeras pesquisas para esclarecer

papel das Espécies Reativas do Oxigênio (EROs) em processos patológicos

que envolvem o trato respiratório de animais, sobretudo na espécie eqüina

(ART et a., 1999; KIRSCHIVINK et al., 2002; DEATON et al., 2004). Amostras

de tecido pulmonar, obtidas a partir de biopsia, têm sido utilizadas com sucesso

para determinar os danos provocados pelas EROs no parênquima pulmonar de

humanos (SLADE et al., 1985; COMHAIR et al., 2005), ratos (FORMAN &

FISHER, 1981; SLADE et al., 1985) e ovinos (IKEDA et al., 1998; MALHOTRA

et al., 2002). Em contrapartida, não existem relatos que avaliem o papel da

técnica de biopsia pulmonar no desequilíbrio do estado oxidativo, permitindo

assim a formação de grandes quantidades de

EROs

, o que poderia agravar o

quadro clínico do paciente devido ao seu já comprovado envolvimento na

patogenia e progressão de algumas dessas doenças.

Levando em conta o crescente desenvolvimento da ovinocultura no

Brasil, a alta ocorrência de doenças respiratórias nesses animais, e as

evidências de que os radicais livres representem um grande papel no

desenvolvimento de algumas afecções respiratórias, é de suma importância o

estudo de métodos que complementem o diagnóstico clínico e auxiliem a

realização de um diagnóstico precoce, bem como seus possíveis efeitos sobre

o estado oxidativo desses animais.

REVISÃO DE LITERATURA

1. B

iopsia Pulmonar

A biopsia pulmonar é um procedimento invasivo de elucidação

diagnóstica que consiste na remoção de tecido pulmonar vivo para exame

macro e microscópico, envolvendo o processamento laboratorial do material, a

confecção de lâminas seguida de análise e descrição microscópica

(PORTO

1991

). Quando há suspeita de enfermidades de etiologia infecciosa, a amostra

de tecido recolhida pode ainda ser submetida à cultura de fungos e de

bactérias, bem como a testes de sensibilidade a antibióticos. (SAVAGE et al.,

1998; BRAUN et al., 2000). As informações obtidas através da biopsia são

úteis ao clínico na definição de um diagnóstico, permitindo a tomada de

decisões sobre o tratamento e o prognóstico do paciente (STONE 1995).

A história da biopsia pulmonar data de 1883, quando

Leyden

, para a

identificação de microorganismos em três casos de pneumonia, realizou a

primeira biopsia pulmonar aspirativa por acesso transtorácico. Três anos

depois,

Menetrier

(1886) foi o primeiro a diagnosticar carcinoma de pulmão

utilizando esta mesma técnica (PORTO, 1991; UNVER et al., 2006). Depois

disso, devido à alta freqüência de complicações observadas, conseqüentes ao

grosso calibre das agulhas utilizadas, e pela falta de orientação visual do ponto

e do trajeto da punção, o método não teve aceitação generalizada e acabou

caindo em desuso. Apesar do insucesso inicial, em 1963 Dahlgren e

Nordenstrom

reafirmaram a serventia do procedimento, com sua utilização

associada a técnicas de imagem em tempo real, e passa então a ser

amplamente empregada tornando-se uma prática rápida e efetiva para o

diagnóstico de afecções pulmonares (PORTO, 1991; MOORE, 2005; UNVER

et al., 2006). Os dispositivos automáticos para a execução de biopsias foram

introduzidos em 1982 por

Lindgren

, com sua efetividade comprovada na

obtenção de fragmentos de alta qualidade para o exame histopatológico em

diversos órgãos (WAGNER et al., 1995).

Hopper

et al. (1990) demonstraram a

superioridade diagnóstica desses aparelhos diante das agulhas convencionais

na execução de punção abdominal em humanos.

Com relação às vias de acesso, as biopsias pulmonares podem ser

transbronquial, conduzidas com auxílio de um endoscópio, transtorácica e

aberta, onde o pulmão é exposto mediante toracotomia (NEFF, 1980). A

biopsia pulmonar transtorácica, especificamente, pode ser aspirativa ou

lancetante. No primeiro caso usa

se uma agulha simples e se retira um suco de

tecidos para estudos citopatológicos e microbiológicos. Na punção lancetante

consegue

-se um cilindro maciço de tecido também para exames

histopatológicos e microbiológicos (PORT

O, 1991).

A biopsia pulmonar tem valor diagnóstico, sendo demonstrada boa

correlação entre os achados histopatológicos e microbiológicos com o quadro

clínico,

em eqüinos (RAPHEL & GUDSON, 1981; NAYLOR et al., 1992

;

DOUCET & VIEL, 2002

;

VENNER et al., 2006) bovinos (SILVA, 2005;

PRINGLE, 1992), ovinos (BRAUN et al., 2000), cães (ROUDEBUSH et al.,

1981; TESKE et al., 1991; WOOD et al., 1998

;

DeBERRY et al., 2002

)

e gatos

CMILLAN et al., 1988

; WOOD et al., 1998

A indicação da biopsia pulmonar se reserva àqueles pacientes que

necessitam de um diagnóstico histológico e/ou microbiológico para um

direcionamento do manejo e de suas terapias e animais com enfermidades

respiratórias difusas e de causa indeterminada, sobretudo quando a

progressão da doença é um fator decisivo. Entretanto, por ser um método

diagnóstico invasivo, o clínico só deve lançar mão deste recurso quando outros

procedimentos menos invasivos falharam em fornecer um diagnóstico preciso.

(RAPHEL e GUNSON, 1981; CANZIAN et al., 2006). Por outro lado, a biopsia

pulmonar não é um procedimento recomendado para pacientes com

intensa

taquipnéia, acessos de tosse freqüentes, função pulmonar diminuída, distúrbios

de coagulação e animais incapazes cooperar com o procedimento (NEFF,

1980; GRODE et al., 199

3; ROY e LAVOIE, 2003).

Apesar

de a biopsia pulmonar ser um procedimento simples e de ampla

aplicabilidade, alguns profissionais ainda sentem-se inseguros quanto a sua

realização, principalmente por causa das possíveis complicações decorrentes

do procedimento, embora complicações graves sejam incomuns (ZAVALA &

BEDELL, 1972; GERAGHTY et al., 2003). Complicações freqüentemente

associadas à execução da técnica incluem epistaxe e hemoptise transitórias e

pneumotórax, não tendo sido relatadas complicações em longo prazo

(

WARNER, 1990; NAYLOR et al., 1992).

Espécies R

eativas

do Oxigênio (EROs) e Estresse O

xidativo

O oxigênio é essencial para a oxidação de compostos orgânicos e

produção de energia para o metabolismo celular (COMHAIR e ERZURUM,

2002). Entretanto, uma pequena quantidade de oxigênio consumida (2 a 5%) é

reduzida por vias metabólicas normais, produzido uma variedade de

substâ

ncias químicas altamente reativas, denominadas espécies reativas do

oxigênio (EROs) (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; DAMASCENO et al.,

2002). Entre os principais metabólitos reativos do oxigênio produzidos durante

este processo podemos destacar o radical superóxido (O

), o peróxido de

hidrogênio (H

)

e o radical hidroxila (OH ), sendo que a principal fonte

produtora destas EROs é a cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria.

(

SCHNEIDER e OLIVEIRA, 2004

;

MOLINA, 2003).

Sob condições normais, o balanço entre os antioxidantes e as EROs é

suficiente para garantir o bom funcionamento do organismo. Entretanto, um

acréscimo na concentração de EROs ou um decréscimo no sistema

antioxidante pode destruir este equilíbrio. Este estado de desequilíbrio é

conhecido como estresse oxidativo (WRIGHT et al., 1994; KIRSCHIVINK e

LEUKEUX, 2005; VALKO et al., 2007), condição em que as EROs podem

provocar lesões teciduais (KINULLA et al., 1995), danificando organelas

celulares, ácidos nucléicos, lipídeos e proteínas (VALKO et al., 200

7).

De todas as ações deletérias associadas ao estresse oxidativo, a

oxidação das membranas celulares, processo conhecido como peroxidação

lipídica, talvez seja a que tenha maior impacto. A lipoperoxidação envolve o

ataque das EROs aos ácidos graxos insaturados das membranas, levando à

perda da fluidez e aumento da permeabilidade das membranas, com liberação

de nutrientes e substâncias tóxicas

célula no espaço extracelular, lesionando

os tecidos (SJÖDIN et al., 1990; FERREIRA e MATSUBARA, 1997;

DAMASCENO et al., 2002).

Contudo, o organismo não é uma vítima passiva do ataque das EROs.

Pelo contrário, ele conta com um complexo mecanismo de defesa antioxidante

responsável pela manutenção da homeostase entre a produção e a eliminação

de EROs (WRIGHT et al., 19

94).

De modo geral, os agentes antioxidantes

podem ser enzimáticos e não-

enzimát

icos. Os antioxidantes enzimáticos

constituem a primeira defesa e

ndógena de neutralização das ERO

s e incluem a

superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GSH-

) e a glutationa redutase (G

-Rd) e entre os não-enzimáticos podemos

destacar as vitaminas E e C, glutationa reduzida (GSH), carotenos, ácido úrico

e proteínas quelantes de metais de transição. (DAMASCENO et al., 2002).

Apesar da defesa antioxidante básica oferecida pelas enzimas antioxidantes, a

variação individual nos níveis de cada uma dessas enzimas mostra-

importante no agravamento das doenças relacionadas aos agentes oxidantes

(KINNULA & CRAPO, 2003).

Inflamação é uma resposta de defesa do organismo que ocorre após o

dano celular, entretanto, uma resposta inflamatória extensa, prolongada ou não

regulada é altamente prejudicial ao organismo. O processo inflamatório inclui a

participação de diferentes tipos celulares, principalmente células com função

fagocitária. Durante o processo de fagocitose há liberação de grande

quantidade de EROs pelas células fagocíticas, evento conhecido como

explosão respiratória. As EROs liberadas durante a explosão respiratória são,

provavelmente, as principais responsáveis pelos danos teciduais decorrentes

do processo inflamatório. Além de provocar injúria tecidual, as EROs atuam

também como mediadores inflamatórios, potencializando a res

posta

inflamatória. Quando o pulmão e o sangue estão sob estresse oxidativo há

ativação de vias metabólicas que culminarão com a cascata da inflamação.

Células inflamatórias são então recrutadas para a microcirculação pulmonar e

direcionadas às vias aéreas

posteriores

tornan

-se ativas e passando a

produzir ERO

em resposta

aos estímulos inflamatórios

(RAHMAN e

MACNEE,

2000), amplificando seus efeitos nesses tecidos.

Diante do que foi exposto é possível acreditar que técnicas invasivas

como a biopsia pulmonar possam resultar em resposta inflamatória aguda

acarretando aumento na produção de EROs nos pulmões e no sangue,

provocando danos teciduais graves.

3. OBJETIVOS

São objetivos deste estudo:

1. Avaliar a segurança da técnica de biopsia pulmonar percutânea transtorácica

e sua eficácia na obtenção de amostras adequadas que permita a análise

histopatológica do fragmento;

2. Comparar a ocorrência de complicações decorrentes da técnica de biopsia

pulmonar en

tre ovinos clinicamente sadios;

3. Determinar a metodologia para análise de antioxidantes e da

lipoperoxidação

em hemá

cias

de ovinos clinicamente sadios;

4. Estabelecer os principais marcadores do estresse oxidativo em hemácias de

ovinos clinicamente sadios;

5. Avaliar o efeito da biopsia pulmonar percutânea transtorácica sobre

antioxidantes e sobre a peroxidação lipí

dica

em hemácias de ovinos

clinicamente sadios;

4. MATERIAL E MÉTODO

4.1. Animais

Foram

utilizados 20 ovinos clinicamente sadios, independentemente de

sexo, raça e idade, procedentes da região de Botucatu-SP, e destinados ao

abate.

4.2. Exame Clínico

Todos os animais foram submetidos ao exame clínico imediatamente

antes e após a biopsia pulmonar, utilizando-se protocolo adotado por Viana

(2003), conforme apresentado no Anexo 1 e critério clínico de Gonça

lves

(2004). Os resultados foram

anotados em fi

chas individuais.

4.3. Colheita do Material

4.3.1. Contenção

Os animais foram contidos por cabresto e manualmente, com auxílio de

ajudante, mantidos

em pé, durante todo o período d

a colheita de materiais.

4.3.2. Colheita das Amostras

4.3.2.1. Am

ostra de Sangue

Foram

colhidos da veia jugular, 5mL de sangue, em tubos de ensaio

heparinizados, imediatamente após a contenção, antes da realização do exame

físico, visando minimizar os efeitos do estresse desse procedimento sobre os

animais. Novas amostras de sangue foram colhidas da mesma forma, 30

minutos após a biopsia, com a finalidade de verificar os efeitos da biopsia

pulmonar e as suas conseqüências sobre a produção de EROs. Em seguida,

as amostras de sangue foram armazenadas a 10º C em recipiente apropriado

com gelo e encaminhadas ao laboratório de pesquisa experimental de

Ginecologia e Obstetrícia da FMB-UNESP, para a detecção de bioma

rcadores

do estresse oxidativo [SOD, glutationa total (GSH-t), GSH-Px e substâncias

reativas

ao ácido tiobarbitúr

ico (TBARS)]

4.3.2.2. Biopsia Pulmonar

O ponto de punção para a biopsia pulmonar foi demarcado no sétimo

espaço intercostal do antímero lateral direito,

aproximadamente

5 cm acima do

olécrano

. A seguir

foi

feita tricotomia e antissepsia da pele com solu

ção de iodo

povidine a 1%, seguido de anestesia local da pele do espaço intercostal, tecido

subcutâneo, músculos intercostais e pleura parietal, utilizando-se 5 mL de

solução de lidocaína a 2%. Alguns minutos depois

realizou

, com bisturi,

incisão na pel

e e tecido subcutâneo, entre os espaços intercostais. Uma ag

ulha

de biopsia do tipo

semi

automática

foi

inserida, imediatamente cranial à

costela, em ângulo vertical à superfície corporal, evitando-se os vasos e nervos

intercostais.

Amostras do tecido pulmonar

foram

colhidas de ac

ordo com Finn

-Bodner

e Hathcock (1993) e Braun et al. (1999), como em bovinos. Quando não s

obteve

nenhum fragmento do parênquima após a punção,

repetiu

procedimento até que se

conseg

uisse

amostra satisfatória do tecido pul

monar.

BD 16 G X 15 cm; Euromed Cateteres

nalis

o número de tentativas para a execução do procedimento.

Imediatamente após a punção, o fragmento adquirido

foi

conservado em

recipiente contendo formalina a 10% até que

fosse

submetido à análise

histopatológica.

Nenhuma medicação

foi

administrada aos animais e nenhuma atenção

especial

foi

dada ao sítio da biopsia, uma vez que todos os animais

foram

abat

idos

logo após o procedimento.

4.4. Processamento e Análise do Material

4.4.1. Exame da Carcaça

Após

o abate, os animais

foram

analisados por inspeção no exame

pos

mortem

do matadouro para avaliação de complicações decorrentes da técnica.

Considerando

-se o escore de gravidade da lesão descrito por Silva (2005),

adaptado de Braun et al. (1999), as hemorragias encontradas na pleura

visceral

, atribuídas à biopsia foram

consideradas da seguinte forma:

Escore 1: lesão pleural com área até 4mm

Escore 2: lesão pleural com área entre 4,1 e 25mm

Escore 3: Lesão pleural com área superior a 25,1mm

A área total das lesões provocadas por

hemorragia

sub

-pleural também

foi

avaliada.

4.4.2. Exame do Fragmento

As amostras obtidas

foram

submetidas ao exame macroscópico,

avaliando

se o comprimento de cada fragmento tecidual.

4.4.2.1. Histopatologia

Para o exame histopatológico as amostras foram encaminhadas ao

Laboratório de Histopatologia do Serviço de Patologia Veterinária do

Departamento de Clínica Veterinária da FMVZ – UNESP Botucatu fixadas em

formalina tamponada a 10% e, posteriormente, desidratadas em álcool,

embebidas em parafina, seccionadas, coradas com hematoxilina-

eosina

analisadas em microscópio óptico. A qualidade dos cortes histológicos obtidos

a partir dos fragmentos de biopsia

foi

avaliada segundo escore adaptado de

Hopper et al. (1993):

Adequação tecidual para o diagnóstico histopato

lógico (0

Escore 0: tecido insuficiente para análise histopatológica

o Escore 1: tecido insuficiente para uma avaliação histopatológica

adequada, mas é

possível realizar um diagnóstico de suspeita

Escore 2: tecido suficiente para a avaliação histopatológ

ica

Preservação tecidual (0

Escore 0: Pobre

Escore 1: Intermediária

Escore 2: Boa

Presença de artefatos (0

Escore 0: Intensa

Escore 1: Inte

mediária

Escore 2: Sem presença de artefatos

Os achados histopatológicos referentes às biopsias foram registr

ados

por fotomicrog

4.4.3

. Amostras de Sangue

As amostras de sangue foram centrifugadas

a 185 x g por 10 minutos à

temperatura ambiente. Para obtenção das hemácias, o sangue foi lavado com

tampão

salina

-fosfato (PBS), a 4ºC e centrifugado a 1575 x g durante 15

minutos por três vezes. A cada repetição do procedimento retirou-se o plasma,

glóbulos brancos e

plaquetas

, por aspiração com micropipeta. Às hemácias

lavadas (50

foram

adicionados 950 L de água deionizada e agitados, por

inversão, para obtenção do hemolisado. O hemolisado foi utilizado para

determinaç

ão

dos biomarcadores do estresse oxidativo: atividade enzi

mática

SOD

e concentrações de

GSH

-t e de TBARS. Para a determinação da

atividade enzimática da

GSH

, a água deionizada foi substituída por solução

JENAMED 2

–

CARL ZEISS JENA

ENTRÍFUGA EPPENDORF 5804E

estabilizadora (2,7 mM EDTA e 0,7 mM 2-mercaptoetanol) (FERREIRA et al.,

1999).

4.4.3

.1. Determinação da Hemoglobina

Para a determinação da hemoglobina, 20 L do hemolisado

foram

diluídos

e agitados em 2 mL de solução de Drabkin. Após 10 minutos de

repous

o, a leitura da absorbância foi

realizada em espectrofotômetro

a 546 nm

e expressa em g/dL (FERREIRA et al., 1999).

4.4.3

.2. Determinação da Peroxidação Lipídica

Foi

adicionado 1 mL de ácido sulfossalicílico (3,0%) a 1 mL de

hemolisado, agitado por 10 segundos, centrifugado a

15.500

x g por 3 minutos

e deixado em repouso durante 15 minutos. Em seguida foram adicionados 500

L de ácido tiobarbitúrico (TBA a 0,67%) a 500 L de hemolisado. A mistura foi

aquecida a 80ºC por 30 minutos e a absorbâ

ncia

determinada em

espectrofotômetro com comprimento de onda de 535 nm. Os resultados foram

expressos em nM de malonaldeído (MDA) por grama de hemoglobina

(nM/gHb)

(FERREIRA et al., 1999).

4.4.3

.3.

Determinação da Atividade de Superóxido D

ismutase (SOD)

A atividade total da SOD foi determinada pela sua capacidade de inibir a

auto

-oxidação do pirogalol

pelo ânion superóxido. A mistura consistiu na

adição de 100 L de tampão Tris/HCl (EDTA 1M; pH 8,0; 5mM), 20 L de

pirogalol

10mM e 860 L de água deionizada a 20 L de hemolisado. A

absorbância foi determinada em espectrofotômetro com comprimento de onda

de 420 nm (25ºC) por 5 minutos. A quantidade de SOD capaz de produzir 50%

de inibição da oxidação do pirogalol

, por miligrama de hemoglo

bina, é definida

como uma unidade de atividade enzimática expressa em UI/mgHb (FERREIRA

et al., 1999).

BIOESPECTRO –

220

4.4.3

.4. Determinação da Concentração de Glutationa Total (GSH

O conteúdo de GSH-t foi determinado pela adição da forma reduzida da

nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH), que iniciou a reação

enzimática da glutationa com o ácido 5,5

ditiobis

-2-

ácido nitrobenzóico (DTNB)

formando o ácido 2-nitro-5-tiobenzóico. A mistura consiste na adição de

1.290

L de água destilada, 200 L de tampão Tris/HCl (EDTA 1M; pH 8,0;

5mM), 200 L de 10 UI/mL de GSH-

, 200 L de NADPH (2mM) e 100 L de

DTNB (12 mM) a 10 L de hemolisado. Para obtenção da curva padrão da

glutationa, foi realizado o mesmo ensaio, substituindo-se a amostra de

hemolisado por 10 L de solução padrão

1:1000

glutationa oxidada

(GSSG) a 33 M. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro com

comprimento de onda de 412 nm. A concentração da GSH-t foi expressa em

micromolar do substrato reduzido por grama de hemoglobina (

M/g

)

(FERREIRA et al., 1999).

4.4.3

.5. Determinação da Atividade Enzimática de Glutationa-

Peroxidase

(GSH

Px)

A determinação da atividade da GSH-Px foi realizada pelo

monitoramento da oxidação do NADPH. A

mistura consistiu na adição de 1.300

L de água destilada, 200 L de tampão Tris/HCl (EDTA 1M; pH 8,0; 5mM),

200

L de 10 UI/mL de

GSH

Rd, 200

L de NADPH (2mM), 40

L de GSH (0,1

M) a 40 L de hemolisado. A mistura foi agitada em vórtex durante 10

segundos. Em seguida foi adicionado 20 L de T-Butil hidroperóxido (7mM) e

mantida a 37ºC durante 10 minutos. A absorbância foi determinada em

espectrofotômetro com comprimento de onda de 340 nm. A atividade da GSH-

foi

expressa em unidades de atividade enzimática por grama de

hemoglobina

(UI/gHb

) (FERREIRA e

t al., 1999).

4.5. Análise Estatística

Os dados obtidos neste estudo referentes à utilização da técnica de

biopsia pulmonar transtorácica percutânea em ovinos clinicamente sadios

foram expostos por meio de estatística descritiva, através de média, des

vio

padrão e percentual.

Para a análise estatística dos resultados da avaliação das atividades

enzimáticas da SOD e de GHS-

e das concentrações de GSH-t e TBARS

nas hemácias de ovinos submetidos à biopsia pulmonar antes e 30 minutos

após o procedimento, utilizou-se o teste não-paramétrico de Wilcoxon,

adotando o nível de significância de 5%, para

menor ou igual a 0,05.

5. RESULTADOS

Pela técnica anteriormente descrita, fragmentos teciduais foram obtidos

todos os animais submetidos ao procedimento (

/20

0%), sendo

necessária, em média 1,8 ± 1

ten

tativas

. Das 20 biopsias realizadas, amostras

de tecido foram obtidas após apenas uma tentativa em nove (9/20 - 45%)

ocasiões, após duas tentativas em

sete

(7/20 - 35%), após três tentativas em

dois

/20

10%) e

após 4 tentat

ivas também em dois (2/20

10%) momentos.

A agulha escolhida foi de fácil manipulação e a técnica foi executada sem

grandes dificuldades.

Treze animais (13/20 - 65%) toleraram bem a técnica de biopsia

pulmonar transtorácica percutânea, entretanto, alguns animais demonstraram

certa resistência durante o procedimento, vindo até a dificultar a coleta. Cinco

(5/20

– 25%) animais demonstraram suave esforço (berros, feições de medo e

elevação das patas), enquanto que dois (2/20 – 10%) animais apresentaram

forte resistência (saltos e tentativas de coices) à realização da técnica.

Ao exame clínico, atitude geral e postura permaneceram inalteradas e a

temperatura retal não se elevou, permanecendo dentro dos valores de

referência para a espécie. Entretanto, as freqüências cardíaca e respiratória

aumentaram em 14 (70%; Média (MED) = 122bpm) e 12 (60%; MED = 52mrp)

animais, respectivamente. Apesar disso, os parâmetros observados voltaram à

normalidade

em aproximadamente

minutos após a bio

psia

Com relação a alterações no aparelho respiratório, foi observada

tosse

espontânea em

seis

(6/20 - 30%) animais. Anormalidades no pa

drão

respiratório ocorreram em 3 (3

/20

%) ovinos, sendo que

dois

deles

apresentaram dispnéia inspiratória e um animal apresentou expiração em dois

tempos, o que geralmente é característico de dor. À auscultação pulmonar, f

observado aumento do ruído broncobronquiolar no sítio da biopsia, em

três

(3/20

- 15%) animais. Os dois ovinos que demonstraram forte resistência à

execução do procedimento apresentaram, à ausculta

ção

pulmonar no local da

biopsia, um som característico de vazamento de ar, exatamente sobre o local

da punção, embora sem haver saída de ar para o exterior

Um animal entrou em colapso imediatamente após a realização da

biopsia, vindo a decúbito. Este animal apresentou tosse, taquicardia,

taquipnéia, intensa dispnéia inspiratória e posicionou-se em posição

ortopneica, demonstrando grande dificuldade respiratória. A ausculta

ção

pulmonar deste animal

reve

lou aumento do ruído

broncobronquiolar

por toda

área dos pulmões. Apesar disso, o animal levantou em alguns minutos e não

apresentou

mais nenhuma anormalidade

Nenhum dos animais apresentou

hemoptise, epistaxe ou mesmo sinais clínicos compatíveis com h

emotór

ax ou

pneumotórax

, complicaç

ões comumente associadas à biopsia pulmonar.

Os animais foram abatidos, em média, três horas após a realização da

biopsia pulmonar. No exame pos mortem observou-se que todas as punções

estavam localizadas no lobo diafragmático. Das 20 biopsias realizadas, as

alterações encontradas na pleura parietal e músculos intercostais eram

evidenciados como um ponto em 12 carcaças (12

/20

- 60%); em outras quatro

(4/20

- 20%) as lesões tinham até 4 mm de comprimento; foram evidenciadas

como grandes hematomas de até 8mm X 10mm em

quatro

carcaças (4/20 -

20%). Todos os animais apresentaram hemorragia de pleura, cuja área variou

de 4 mm

a 40 mm

. Dos 20 animais biopsiados, avaliados quanto ao escore

de severidade da hemorragia pleural proposto por Silva (2005),

aptado de

Braun et al. (1999), oito ovinos (8/20 - 40%) apresentaram escore 1,

seis

(6/20

30%)

apresentaram escore 2 e outros seis

animais (6/20

30%) apresentaram

escore 3. Ao exame macroscópico dos pulmões foram observados petéquias e

enfisema ao redor da ferida da biopsia, presentes em quatro (4/20 - 20%) e

cinco

(5/2

- 25%) ovinos, respectivamente. Dois animais, mais precisamente

os que demonstraram forte resistência durante a execução da biopsia,

apresentaram uma ferida linear de aproximadamente 12 mm e 14 mm

respectivamente,

na face costal do pulmão direito na região basal do lobo

diafragmático. No pulmão de dois ovinos foi observado sinais de que a agulha

de biopsia havia transpassado o lobo diafragmático.

Os fragmentos teciduais obtidos através da biopsia v

ariaram

4 a 17 mm de comprimento (MED = 10 mm). Das 20 amostras obtidas 18

(18/20

– 90%) eram de tecido pulmonar e duas (2/20 – 10%) eram de tecido

hepático. Todas as amostras de pulmão (18/18 – 100%) estavam adeq

uadas

para análise histopatológica por apresentarem arquitetura pulmonar

preservada.

Quatorze amostras (14/18 – 78%) foram consideradas ideais para

avaliação histológica, pois foi possível observar bronquíolos primá

rios,

terminais e respiratórios, ductos e sacos alveolares bem como alvéolos

isolados.

Em 4 amostras (4/18 – 22%) não foi possível encontrar bronquíolos,

estando ausentes inclusive os bronquíolos terminais. Nestas lâminas estavam

presentes apenas d

tos e sacos alveolares e alvéolos isolados e por isso

foram classificadas apenas como boas para uma avaliação histológica. Duas

amostras (2/18 – 11%) apresentaram infiltrado inflamatório misto discreto,

composto

por mononucleares e neutrófilos. Dois fragmentos (2/18 – 11%)

teciduais apresentaram focos

hemorrágicos isolados

(Figura 1)

Um dos fragmentos pulmonares (1/18 – 5%) apresentou aumento da

celularidade do interstício e conseqüente espessamento, com infiltrado

inflamatório misto moderado, composto por mononucleares e eosinófilos, além

de focos hemorrágicos. A luz bronquiolar mostrou-se diminuída, com presença

de debris celulares. A pleura, observada em uma das extremidades da biópsia,

exibiu espessamento. Esses achados são compatíveis com o diagnóstico de

pneumonia intersticial crônica

(Fig

ura 1

Todas as amostras de pulmão obtidas (18/18 – 100%) mostraram áreas

atelectásicas nas extremidades e duas amostras (2/18 – 11%) apresentaram

também esmagamento tecidual com comprometimento de parte da área

amostrada, todavia nenhuma dessas alterações comprometeu a avaliação

morfológica. Em cinco casos (5/18 – 28%), além de pulmão, também foram

observados fragmentos de pele, músculo esquelético, fígado ou tecido

conjuntivo de origem indeterminada.

A qualidade dos cortes histológicos pulmonares obtidos foram

avaliados

segundo o escore adaptado de Hopper et al. (1993), que considera os graus

zero, um e dois qualitativamente

Levando em conta a adequação tecidual,

todas as amostras

(18/18

100%)

apresentaram escore 2; com relação a

preservação tecidual, duas amo

stras (2/18

–

11%) apresentaram escore 1 e

amostras (16/8

–

89%) obtiveram escore 2; analisando a presença de artefatos,

todas as lâminas

confeccionadas (

/18

–

100%) verificou

se escore 1.

Os resultados para as variáveis SOD, GSH-t, GSH-Px e TBARS obtidos

a partir do hemolisado de hemácias de ovinos submetidos à biopsia pulmonar

antes e trinta minutos após o procedimento encontram-se resumidos na

Tabela

Figuras

(vide também

nexos 2

e 3

Trinta minutos após a biopsia pulmonar, houve redução estatisticamente

significativa nas atividades de SOD e de GSH-Px em hemácias (p<0,05). Não

foi verificada alteração significativa nas concentrações de GSH-t e de TBARS

em hemácias após o procedimento

FIGURA 1:

Fotomicrog

rafia de cortes histológicos em pulmão de ovino. A.

isão panorâmica de um fragmento pulmonar

mostrando a organização tecidual

& E, 40x); B e C. organização tecidual pulmonar: bronquíolos primários e

terminais, ductos e sacos alveolares e alvéolos isolados (H & E, 40x e 100x,

respectivamente

);

pneumonia intersticial crônica:

aumento

da celularidade,

edema,

infiltrado inflamatório misto moderado, composto por mononucleares e

eosinófilos, além de focos hemorrágicos

(H & E, 400x);

TABELA

Represen

tação dos resultados estatísticos descritivos das

variáveis Superóxido Dismutase (SOD), Glutationa Total (GSH-t), Glutationa

Peroxidase (GSH-Px) e Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)

em hemácias

de ovinos antes

e 30

minutos após a biopsia

pulmonar.

VARIÁVEIS

MÉDIA

MEDIANA

MÁXIMO

MÍNIMO

DESVIO

PADRÃO

SOD

1841,778

1682,294

3202,557

373,729

623,621

GSH

-t

33,895

29,108

75,158

19,041

15,325

GSH

0,819

0,745

1,829

0,392

0,397

Antes da

Biopsia

TBARS

262,167

252,925

482,858

107,501

110,510

SOD

1195,937

1072,720

4325,789

537,458

750,333

GSH

-t

33,124

28,443

70,566

21,278

13,703

GSH

0,510

0,376

2,454

0,269

0,491

Minutos

Após a

Biopsia

TBARS

221,978

213,024

423,284

80,626

77,370

* Significativos ao

Teste

Não

paramétrico

e Wilcoxon, considerando p < 0,05

Análise estatística:

VARIÁVEIS

ESTATÍSTICA

COMENTÁRIO

SOD

P = 0,006

GSH

P = 0,001

AB >

GSH

-t

P = 0,940

AB =

TBARS

P = 0,135

AB = DB

AB: antes da biopsia

DB: 30 minutos após a biopsia

GRÁFICO 1:

Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Superóxido Dismutase

(SOD) em hemácias de ovinos antes da biopsia pulmonar e 30 minutos após o

procedimento.

MÍN; 373,729

MÍN; 537,458

MÁX; 3202,557

MÁX; 4325,789

Mediana; 1682,294

Mediana; 1072,720

0,000

500,000

1000,000

1500,000

2000,000

2500,000

3000,000

3500,000

4000,000

4500,000

5000,000

Antes da Biopsia

30 Minutos Após a Biopsia

Concentração de SOD (UI / mgHb) no hemolisado

GRÁFICO 2:

Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Glutationa Peroxidase

(GSH-Px) em hemácias de ovinos antes da biopsia e 30 minutos após o procedimento.

MÍN; 0,392

MÍN; 0,269

MÁX; 1,829

MÁX; 2,454

Mediana; 0,745

Mediana; 0,376

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Antes da Biopsia

30 Minutos Após a Biopsia

Concentração de GSH-Px (UI / gHb) no hemolisado

GRÁFICO 3:

Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Glutationa Total (GSH-t)

em hemácias de ovinos antes da biopsia e 30 minutos após o procedimento.

MÍN; 19,041

MÍN; 21,278

MÁX; 75,158

MÁX; 70,566

Mediana; 29,108

Mediana; 28,443

0,000

10,000

20,000

30,000

40,000

50,000

60,000

70,000

80,000

Antes da Biopsia

30 Minutos Após a Biopsia

Concentração de GSH-t (µM / gHb) no hemolisado

GRÁFICO 4:

Mediana e valores Máximo e Mínimo da variável Substâncias Reativas ao

Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em hemácias de ovinos antes da biopsia e 30 minutos

após o procedimento.

MÍN; 107,501

MÍN; 80,626

MÁX; 482,858

MÁX; 423,284

Mediana; 253

Mediana; 213,024

100

200

300

400

500

600

Antes da Biopsia

30 Minutos Após a Biopsia

Concentração de GSH-t (µM / gHb) no hemolisado

6. DISCUSSÃO

A biopsia pulmonar percutânea realizada com agulhas lancetantes

demorou para ganhar aceitação, mas o avanço nas técnicas de biopsia,

melhorias nas agulhas e a possibilidade de lidar melhor com as complicações

decorrentes da técnica contribuíram para o aumento da popularidade desta útil

ferramenta de auxílio diagnóstico. Neste estudo, as biopsias pulmonares foram

conduzidas às cegas de forma que houvesse máxima probabilidade de se

conseguir amostras de tecido viáveis para um diagnóstico histológico quando

fosse aplicada em ovinos com doença pulmonar difusa. Se o objetivo do

procedimento for obter fragmentos teciduais de lesões localizadas, a biopsia

pulmonar

deve ser preferencialmente, guiada por ultra-som ou radiografias,

como já

relatado por outros autores

(WOOD et al., 1998; BRAUN et al., 2000).

Foram necessárias em média 1,8 tentativas até a obtenção de um

fragmento de tecido viável para análise histológica. Outros autores relatam

resultados semelhantes, com média de 1,2 para Braun et al. (2000) que

também utilizaram uma agulha semi-automática em ovinos, e de 1,3 para

Hamarati (1995) que utilizou um dispositivo automático em humanos. Porém,

nestes dois casos as biopsias não foram realizadas às cegas. A execução da

biopsia pulmonar às cegas aumenta o risco de complicações como punção

equivocada de outros órgãos, lesões de grandes vasos e morte em

conseqüência de hemorragias. No presente estudo foram necessárias poucas

perfurações para a obtenção de amostras de tecido viáveis para um exame

histológico e não foram observadas complicações graves em decorrência da

técnica, indicando que, nestas condições, o 7º espaço intercostal é um bom

acesso para a cavidade torácica em ovinos

, especialmente quando se pretende

obter amostras do lob

o diafragmático

Segundo Moore (2005) e Braun et al.(1999) as reações de desconforto e

dor ocorrem durante a perfuração da pleura parietal e não durante a coleta do

tecido pulmonar. Por isso, a perfuração da pleura deve ser bem rápida para

eliminar a possibilidade de que qualquer movimento repentino desvie a

trajetória da agulha ou então que sua ponta cortante

lese

a pleura antes da

colheita de tecido pulmonar. Dois animais deste estudo demonstraram forte

resistência à técnica, com reações semelhantes às relatadas em bovinos por

Braun et al. (1999), principalmente no momento da perfuração da pleura. Ao

exame

pos mortem pôde-se observar perfurações lineares de até 14 mm nos

pulmões desses ovinos. Embora estivessem anestesiados, é possível que o

volume da droga injetado tenha sido insuficiente para uma adequada anestesia

da pleura parietal, e que o aumento na quantidade de anestésico administrado

possa reduzir a dor desta perfuração, como já foi relatado para

eqüinos

(RAPHAEL e GUNSON, 1981) e bovinos (BRAUN et al., 1999). Outra opção

para evitar reações bruscas dos animais que possam atrapalhar o bom

andamento da técnica seria o uso de sedativos. Contudo, antes da indicação

deste tipo de fármaco é necessária uma avaliação minuciosa da função

pulmonar dos animais, geralmente comprometida em casos de doença

respiratória grave.

As alterações observadas ao exame clínico conduzido após a biopsia

pulmonar estão de acordo com as descrições prévias da literatura (RAPHEL e

GUNSON 1981; SAVAGE et al., 1998; BRAUN et al., 1999; BRAUN et al.,

2000; SILVA, 2005). O aumento das freqüências cardíaca e respiratória,

observadas em alguns animais

deve ter ocorrido em conseqüência ao estresse

da contenção e da realização do procedimento, visto que esses parâmetros

voltaram à normalidade dentro de poucos minutos após a realização da

biopsia.

Com relação ao exame do aparelho respiratório, a elevação do ruído

broncobronquiolar

provavelmente ocorreu em decorrência do esforço físico de

alguns animais ao resistirem à execução da bio

psia

A dispnéia inspiratória,

observada em dois animais,

poderia

ser

resultado da agressão da agulha a

tecido pulmonar, o que pode determinar um sangramento no parênquima

pulmonar

(

RADOSTITS

et al., 2002

Entretanto, nenhum dos animais que

apresentaram

dispnéia inspiratória após o procedimento apresentou focos

hemorrágicos na avaliação histológica da amostra obtida. Por outro lado,

uma

hemorragia focal, como foi observado, não seria suficiente para causar

alteração no padrão respiratório. Pode-se deduzir que a biopsia não determina

grande modificação na estrutura pulmonar, mas

que

o ato de contenção

associado com a dor

conseqüente

à perfuração pleural poderia levar à dispnéia

inspiratória observada nesses dois animais. Se esses

dois

ovinos

apresentassem problema decorrente da lesão provocada pela biopsia

provavelmente haveria manutenção da dificuldade respiratória, o que não foi

observado já que todos os animais voltaram ao seu padrão respiratório normal

em aproximadamente quinze minutos após o procediment

indicando a

segurança da técnica

A ausculta

ção

pulmonar do sítio da biopsia revelou

em dois animais,

ruído semelhante a vazamento de ar (sopro)

Este tipo de ruído provavelmente

ocorreu pela perfuração da pleura visceral e do tecido pulmonar subj

acente

com saída de ar para a cavidade pleural, já que esses animais foram os que

apresentaram maior resistência ao procedimento. A entrada de ar na cavidade

pleural

pode levar a um pneumotórax, se a capacidade de absorção pleural for

ultrapassad

a (

PORTO,

1991

). Como não foi feito diagnóstico por

acompanhamento radiográfico

RAUN et al. 1999; V

ENNER

et al., 2006)

por

uma auscultação seriada algumas horas após a biopsia, já que os animais

precisavam ser abatidos, o pneumotórax não pode ser constatado

motivo para o colapso momentâneo ocorrido logo após a biopsia

pulmonar em um dos animais não foi determinado, embora reações como essa

já tenha sido relatada por outros autores em bovinos, também sem causa

aparente (BRAUN et al., 1999). Contrariando observações de outros autores

que apontam a hemoptise e a epistaxe como complicações normalmente

associadas à biopsia pulmonar (RAPHEL e GUNSON, 1981; SAVAGE et al.,

1998

; DeBERRY et al., 2002; SILVA, 2005; VENNER et al., 2006), não foram

observados nesta pesquisa sinais de sangramento em nenhum dos animais

após

o procedimento. Entretanto, Venner et al. (2006) relatam que indícios de

hemorragia são geralmente evidenciados após endoscopia, mesmo em animais

que não apresentaram sinais aparentes de sangramento. Neste estudo, o

exame

pos mortem não revelou estrias de sangue ou coágulos no trato

respiratório de nenhum dos animais, o que elimina as chances de que

hemorragias de grande porte tenham realmente ocorrido. Contudo, foram

observadas petéquias próximas ao local da punção nos pulmões de dois

ovinos, indicando que pequenas hemorragias no parênquima pulmonar sem

importância clínica ocorreram em conseqüência da biopsia, como já observado

por outros autores (

ROY e LAVOIE,

2003).

As hemorragias de pleura visceral ocorreram em todos os ovinos, sendo

semelhantes às previamente relatadas em outros estudos (BRAUN et al., 1999;

BRAU

N et al., 2000; SILVA, 2005; VENNER et al., 2006). Essas hemorragias

foram agrupadas de acordo com o escore atribuído a área total das lesões. O

escore de lesão adotado para a biopsia neste estudo foi inferior aos resultados

descritos por Silva (2005) e superiores aos de Braun et al. (1999). Silva (2005)

trabalhou com uma agulha de biopsia de grosso calibre, o que provavelmente

ocasionou maior dano tecidual que a agulha de médio calibre utilizada no

presente trabalho. Braun et al. (1999), por sua vez, determinou o escore da

lesão 10 dias após a realização da biopsia, havendo, dessa forma, tempo hábil

para reparação tecidual. As feridas lineares de até 14 mm observadas no

parênquima pulmonar de dois ovinos ocorreram provavelmente em

conseqüência da agitação demonstrada por esses animais no momento da

biopsia.

Os tamanhos dos fragmentos teciduais obtidos neste estudo estão de

acordo com as descrições prévias da literatura (BRAUN et al., 1999; BRAUN et

al., 2000; SILVA, 2005). A técnica empregada permitiu a avaliação da

arquitetura tecidual pulmonar. Uma biopsia é considerada representativa

quando são visualizadas unidades funcionais do tecido amostrado (NAYLOR et

al., 1992). Neste estudo foi possível observar em aproximadamente 80% das

amostras obtidas, bronquíolos primários, terminais e respiratórios, ductos e

sacos alveolares, bem como alvéolos isolados. Resultados semelhantes

também foram observados em eqüinos (RAPHEL e GUNSON, 1981; VENNER,

2006), bovinos

(DUNGWORTH

e HOARE, 1970; BRAUN et al., 1999) e ovinos

(BRAUN et al., 2000). Não foi possível verificar a presença de brônquios nas

amostras obtidas devido a provável ausência dessas estruturas no local onde

realizada grande parte das punções, a porção basal do lobo diafragmático.

Duas amostras apresentaram perfil histológico compatível com processo

inflamatório muito

discreto, composto por mononucleares e neutrófilos. Uma

possível explicação para esse achado é que, se estes animais realmente

apresentavam doença respiratória, o processo ainda estava muito incipiente

para ser detectado ao exame clínico. Como os animais desta espécie, devido

as condições de manejo a que são submetidos, vivem constan

temente

expostos a fatores de risco, é aceitável que achados como este ocorram

quando se realiza biopsia pulmonar. Os focos hemorrágicos encontrados em

duas lâminas foram conseqüentes ao trauma tecidual provocado pela agulha

de biopsia

(RAPHEL e GUNSON, 19

81)

Um dos animais apresentou perfil histológico de pneumonia intersticial

crônica, entretanto, ao exame clínico não foram observadas alterações

compatíveis com o quadro apresentado. Isto provavelmente ocorreu por que as

partes não afetadas do pulmão compensaram a insuficiência funcional das

áreas lesionadas, fazendo com que o animal se mantivesse clinicamente

estável.

Artefatos iatrogênicos estavam presentes em todas as biopsias. O mais

comum foram as áreas de atelectasia presentes nas bordas teciduais. Este tipo

de artefato dificulta a avaliação histológica e geralmente ocorre em função do

trauma tecidual ocorrido (RAPHEL e GUNSON, 1981). A presença de outros

tecidos compactos junto às amostras de tecido pulmonar, observadas neste

estudo

/18)

, também foi descrita por outros autores (RAPHEL e GUNSON,

1981; BRAUN et al., 2000). A desvantagem de se encontrar tecidos maciços

junto ao pulmão é que o parênquima pulmonar, por ser menos compacto, tende

a colapsar e ficar

com

primido entre esses tecidos mais dens

(RAPHEL e

GUNSON, 1981).

A biopsia acidental do fígado ocorreu duas vezes neste estudo. Outros

autores já relataram punção de músculos intercostais (VENNER et al., 2006),

intestino (SAVAGE et al., 1998) e fígado (FOROUDI et al., 1995; VENNER et

al., 2

006). Segundo

mith

(

1994

), a agulha de biopsia deve avançar cerca de 2

cm no interior do parênquima pulmonar para que seja obtida uma amostra

satisfatória de tecido pulmonar. Harrison et al. (1984) defendem que a

penetração máxima da agulha no interior dos pulmões deve ser de 3 cm ou 4

. Neste estudo a biopsia foi realizada segundo a técnica de Finn-Bodner &

Hathcock (1993) e Braun et al. (1999) para bovinos adultos. A indicação desses

autores é de que a agulha penetre no máximo 8 cm no interior da cavid

ade

torácic

a a partir de incisão na pele do animal. Silva (2005) executou a mesma

técnica em bezerros, obtendo sucesso. Durante as coletas não foram feitas

mensurações para saber com exatidão quantos centímetros a agulha de

biopsia penetrou a cavidade torácica, apenas foi feita uma marcação na agulha

para assegurar que esta não penetrasse mais que 8 cm. Apesar da técnica ter

sido conduzida com sucesso em 18 das 20 tentativas realizadas neste estudo,

ficou evidente a necessidade de padronização da profundidade de penetração

da agulha na cavidade torácica na espécie ovina, evitando assim a punção

equivocada de outros órgãos.

Além da segurança da biopsia pulmonar, o presente estudo investigou o

efeito do procedimento sobre o metabolismo oxidativo, utilizando ma

rcadores

bioquímicos, dos eritrócitos de ovinos clinicamente sadios antes e 30 minutos

após a biopsia pulmonar.

Como mencionado anteriormente, o estresse oxidativo ocorre quando há

desequilíbrio entre a produção de EROs e a presença dos agentes

antioxidant

es (KIRSCHIVINK e LEUKEUX, 2005; VALKO et al., 2007). Na

tentativa de conter e minimizar os efeitos do estresse oxidativo, inicialmente, a

SOD catalisa a reação de dismutação do O

em H

e oxigênio (O

). A

produção do H

por sua vez é neutralizada pela ação da CAT e/ou por uma

sucessão de reações mediadas pelas glutationas, denominado ciclo redutor

das glutationas. Neste ciclo o H

é reduzido por ação da GSH-

, que utiliza

a GSH como substrato doador de elétron, transfo

rmando

-a em GSSG. Uma

vez oxidada, a GSSG é convertida novamente em GSH pela ação da GSH-

Rd.

ciclo redutor das glutationas é também o principal mecanismo de remoção

dos lipoperóxidos oriundos das reações de lipoperoxidação (KINNULA e

CAPRO, 2003;

ANDR

ADE JUNIOR et al., 2005;

KINULLA

, 2005

liberado

em conseqüência da biopsia pulmonar acarretou uma

redução nos valores da SOD 30 minutos após o procedimento. Como esta

enzima representa a primeira linha de defesa contra o estresse oxidativo, a sua

atividade enzimática alterou-

na tentativa de neutralizar os efeitos deletérios

deste radical.

Em função da variação na concentração de H

provocada pela ação

da SOD, a atividade enzimática da GSH-Px também se

alterou,

indicando

que

houve ativação do ciclo redutor da glutationa.

Con

tudo

, apesar da diminuição

na atividade enzimática da GSH-Px, a GSH-t permaneceu inalterada mesmo

após o procedimento, demonstrando que o estresse oxidativo induzido pela

biopsia

pulmonar foi contido por ação das glutationas. Cabe ressaltar também

que a ma

nute

nção dos níveis de GSH-

se deve ao fato de que a glutationa em

maior concentração na maioria das células, inclusive nos eritrócitos de

mamíferos, está sob a forma reduzida (GSH)

A depleção dos níveis de GSH

pode ocorrer diretamente, por conjugação com radicais livres e, indiretamente

por inibidores da sua síntese e regeneração (HALLIWELL e GUTTERIDGE,

1999

Como o consumo de GSH provavelmente ocorreu apenas por sua

propriedade antioxidante, a permanência de altas concentrações de GSH nos

eritrócitos

contribuiu para a manutenção dos níveis de GSH-t mesmo após a

biopsia pulmonar. Aliado a isso, a manutenção dos valores de GSH-t pode ter

ocorrido também em função do aumento compensatório na produção de GSH

por outros órgãos, como o fígado, na tentativa de ajudar o organismo a

combater o aumento na produção das EROs (MACHEFER et al., 2004).

O MDA é um dos principais marcadores da peroxidação lipídica e

através dele são mensuradas as TBARS. O acréscimo na concentração

sanguínea dessas espécies está relacionado ao aumento da peroxidação

lipídica e dano oxidativo (DRAPER e HADLEY, 1990). Neste contexto, os

dados deste experimento revelam que a biopsia pulmonar transtorácica

percutânea não induziu a peroxidação lipídica, confirmado pela não a

lteração

dos valores de TBARS nas hemácias dos animais 30 minutos após o

procedimento.

As reações inflamatórias locais são caracterizadas por aumento do fluxo

sangüíneo e da permeabilidade vascular, dilatação dos vasos e acúmulo de

células do processo inflamatório. As principais células envolvidas na fase

aguda da inflamação são os neutrófilos, enquanto que, na fase tardia,

monócitos/macrófagos e algumas linhagens de linfócitos migram para o sítio

inflamatório

. Essas células produzem EROs durante a explosão respiratória

com

o reação aos estímulos fagocíticos. Além disso, vários aspectos do

processo inflamatório são regulados por mediadores produzidos por células do

sistema imune e células endoteliais, como citocinas, histamina, leucotrienos,

prostaglandinas e

, também,

EROs (

UERRE e GOUNON, 1996

A atividade das enzimas SOD, GSH-Px e C

é comumente utilizada

para avaliar a capacidade de defesa do organismo contra a ação das EROs.

Alguns autores sugerem que o aumento da produção de citocinas durante a

fase inicial do processo inflamatório está associado com a atividade

prejudicada das enzimas SOD, GSH-Px e CAT, o que resulta em aumento do

estresse oxidativo e dano celular local, verificado pelo incremento da apoptose

celular

(

LINKE

et al. 2005

A agressão física tecidual ocorrida durante a

introdução da agulha de biopsia deflagrou a resposta inflamatória e a liberação

de mediadores químicos, exacerbando a mesma nos momentos que se

seguiram. Essa seqüência de eventos culminou em dano oxidativo refletido na

diminuição nos níveis de SOD e GSH-Px no sangue dos animais, evidenciada

30 minutos após o procedimento.

Segundo MCINTYRE et al. (1997), a extensão dos eventos inflamatórios

e das injúrias eventualmente provocadas por eles está diretamente relacionada

à intensidade do estímulo inicial e aos mecanismos imunológicos que são

ativados

durante o processo. Como o estresse oxidativo induzido pela biopsia

pulmonar foi aparentemente contido pelo ciclo redutor das glutationas e não

houve sinais de peroxidação lipídica até 30 minutos após a execução do

procedimento, dentro deste contexto, os resultados deste estudo nos levam a

crer que a biopsia pulmonar transtorácica percutânea é um exame seguro,

podendo ser amplamente utilizada na rotina veterinária.

Alguns autores defendem que, para uma melhor interpretação dos

resultados de estudos que envolvem estresse oxidativo, outros fatores tais

como o tipo de marcador utilizado, a metodologia empregada, o tecido

estudado e, principalmente, o momento no qual o marcador foi investigado,

sejam crit

eriosamente considerados (WITT et al., 1992; VOLLARD et al., 2005).

Panza (2007) trabalhou com humanos submetidos a exercício intenso e não

observou alterações nos níveis de TBARS no sangue de humanos até 15

minutos após esforço

Goldfarb et al. (2005), ao submeter humanos ao

exercício físico intenso, só verificaram aumento na concentração plasmática de

MDA

48h após a realização de um protocolo de exercício intenso. Portanto, o

fato de que sinais de peroxidação lipídica não tenham sido observados, com

base

no m

arcador utilizado,

até 30 minutos após a biopsia pulmonar, não exclui

a possibilidade de que a peroxidação lipídica tenha ocorrido em outro momento

durante a recuperação dos animais.

O mesmo pode ser considerado para o

agentes

antioxidantes. Existe a

possibilidade de mudanças transitórias e bifásicas na atividade enzimática

(DNEKE e FANBURG, 1989; MILLS e HIGGNS, 1997; DAMASCENO et al.,

2002),

evidenciada por um decréscimo inicial por consumo das enzimas

antioxidantes viáveis, seguido por elevação devido à mobilização dos estoques

em outros órgãos, como mecanismo compensatório à constante exposição ao

estresse oxidativo aumentado

Com base nessa conjectura, talvez uma avaliação seriada e mais

duradoura das atividades enzimáticas de SOD e de GSH-

e d

concentrações de GSH-t e de TBARS revelasse alterações compatíveis com

estresse oxidativo mais intenso e peroxidação lipídica ainda ocultos 30 minutos

após o procedimento.

7. CONCLUSÃO

Conforme os resultados demonstrados neste trabalho e com a metodol

ogia

utilizada

podemos con

luir:

A biopsia pulmonar transtorácica percutânea mostrou-se um método de

diagnóstico complementar seguro para obtenção de amostra de tecido

pulmonar

A biopsia pulmonar transtorácica percutânea permite a obtenção de

fragmento

s pulmonares adequados para o exame histopatológico, com

visualização de estruturas pulmonares í

ntegras.

O acesso ao pulmão através do sétimo espaço intercostal direito, 5 cm

acima do olecrano, mostrou-se adequado para a obtenção de amostras

pul

monares e

m cordeiros sadios

A biopsia pulmonar transtorácica percutânea não causou alteraç

ões

significat

ivas no metabolismo oxidativo, medido por determinação de

SOD, GSH-Px, GSH-t e TBARS, podendo ser amplamente utilizada em

ovinos sem que ocorram danos teciduais expressivos até 30 minutos

após o procedimento

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9. ANEXOS

Anexo

Plano de exame clínico dos ovinos

Identificação:

Raça:

Sexo:

Idade

Escore corporal:

Proprietário:

Endereço:

Telefone:

Anamnese:

Alimentação e Mineralização:

Parâmetros vitais:

FC: bpm

FR:

mpm

Temp: ºC

Atitude:

Mucosas:

Linfonodos:

Estado Nutricional:

Sistema Respiratório:

Inspeção:

Muflo:

• normal

• ressecado

Narinas:

• NDN

hiperêmicas

Secreção

• ausente

cor

• presente

specto

unilateral

odor

lateral

Ar expirado

• unilateral

• bilateral

• normal

• diminuído

Laringe:

• NDN

• hiperêmica

• paralisia

Traquéia:

• NDN

• crepitação

Reflexo da Tosse:

• negativo

• positivo

• tosse seca

• tosse produtiva

Pulmão:

Tipo respiratório:

•

eupnéia

• dispnéia

• inspiratória

• expiratória

• mista

Postura:

• normal

• ortopneica

Auscultação:

Crepitação fina

• ausente

• presente

• lado direito • lado esquerdo

Crepitação grossa

• ausente

• presente

• lado direito •

lado esquerdo

Ronco

• ausente

• presente

Sibilo

• ausente

• presente

• lado direito • lado esquerdo

Som traqueo

brônquico

• NDN

• aumentado

• lado direito • lado esquerdo

Som bronquio

bronquiolar

• NDN

• aumentado

• lado direito • lado esquerdo

Propagação cardíaca

• NDN

• aumentado

• lado direito • lado esquerdo

Área de silêncio:

presente

ausente

lado direito

lado esquerdo

Roce Pleural

presente

ausente

lado direito

lado esquerdo

Percussão

• claro

timpânico

• sub

maciço

metálico

lado direito

lado esquerdo

Observações

Anexo 2:

Tabela 2

TABELA 2: Representação das atividades de SOD (UI/mgHb) e GSH-

(UI/gHb) e das concentrações de GSH-t (µM/gHb) e de TBARS (nM/gHb) em

hemácias de ovinos antes e 30 minutos após a biopsia pulmonar.

VARIÁVEIS

ANTES DA BIOPSIA

30 MINUTOS APÓS A BIOPSIA

ANIMAL

SOD

GSH

-t

GSH

TBARS

SOD

GSH

-t

GSH

TBARS

3202

,557

75,158

1,754

107,501

1123,760

70,566

1,092

80,626

2479,953

50,661

1,192

363,711

1137,343

25,887

0,443

302,236

1506,883

19,041

0,392

138,392

1154,889

27,829

0,383

211,973

1638,735

34,582

0,829

255,016

537,458

24,018

0,278

161,251

2591,648

0,608

0,481

390,292

1005,202

22,166

0,269

151,366

3049,772

27,551

0,500

429,060

1016,093

21,879

0,295

146,830

1897,953

33,482

0,791

277,914

1060,429

21,278

0,312

192,950

1712,743

24,513

0,611

203,298

1035,405

24,407

0,284

232,683

373,729

28,311

0,499

117,930

1116,668

37,280

0,464

351,406

2218,330

69,841

1,829

445,563

4325,789

66,833

2,454

423,284

1651,845

44,075

1,219

482,858

1031,464

47,015

0,521

241,188

1641,119

35,925

0,581

205,229

1042,954

29,057

0,333

143,861

1510,914

24,698

0,548

164,611

971,599

34,664

0,464

254,136

1467,370

22,130

0,571

174,689

1109,268

25,558

0,358

241,877

1640,225

31,919

0,746

277,914

1101,377

25,038

0,282

208,193

1727,925

25,511

0,744

203,547

1085,010

32,976

0,427

214,075

1771,200

32,437

0,867

293,948

983,290

30,873

0,311

202,824

1637,785

24,672

0,606

185,400

1185,720

32,227

0,378

171,909

1398,387

22,889

0,776

250,835

1088,335

35,945

0,472

282,190

1716,480

29,904

0,836

275,627

806,685

26,981

0,374

224,707

Superóxido Dismuta

se;

Glutationa Total;

Glutationa Peroxidase;

Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico.

0,000

500,000

1000,000

1500,000

2000,000

2500,000

3000,000

3500,000

4000,000

4500,000

Concentração de SOD (UI / mgHb) no hemolisado

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

12 13 14 15 16

17 18 19

Animais

FIGURA 6:

Concentrações de SOD em hemácias de ovinos antes da biopsia e 30

minutos após o procedimento

Antes da Biopsia 30 Minutos Após a Biopsia

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

Concentração de GSH-Px (UI / gHb) no hemolisado

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

12 13

14 15 16 17 18 19

Animais

FIGURA 7:

Concentrações de GSH-Px em hemácias de ovinos antes da biopsia

pulmonar e 30 minutos após o procedimento.

Antes da Biopsia 30 Minutos Após a Biopsia

Anexo 3:

Figuras 6

0,000

10,000

20,000

30,000

40,000

50,000

60,000

70,000

80,000

Concentração de GSH-t (µM / gHb) no hemolisado

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Animais

FIGURA 8:

Concentrações de GSH-t em hemácias de ovinos antes da biopsia

pulmonar e 30 minutos após o procedimento.

Antes da Biopsia

30 Minutos Após a Biopsia

0,000

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

300,000

350,000

400,000

450,000

500,000

Concentração de TBARS (nM / gHb) no hemolisado

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12

14 15 16 17

19 20

Animais

FIGURA 9:

Concentrações de TBARS em hemácias de ovinos antes da biopsia

pulmonar e 30 minutos após o procedimento.

Antes da Biopsia 30 Minutos Após a Biopsia

Artigo:

val

iação da segurança e eficácia da técnica de biópsia pulmonar

transtorácica percutânea para avaliação histopatológica do parênquima

pulmonar de ovinos clinicamente sadios

A ser encaminhado para o periódico Pesquisa Veterinária Brasileira

ISSN: 0100

736X

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editor

da revista

Pesquisa Veterinária Brasileira, no endereço abaixo. Devem constituir-se de

resultados ainda não publicados e não considerados para publicação em outra

revista.

Embora sejam de responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos

trabalhos, os

editores

, com a assistência da Assessoria Científica, reserva-se o

direito de sugerir ou solicitar modificações aconselháveis ou necessárias.

1. Os trabalhos devem ser oganizados, sempre que possível, em

Título

Abstract

Resumo

Introdução

Material e Métodos

Resultados

Discussão

Conclusões

(ou combinações destes três últimos),

Agradecimentos

Referências

a) o

Título

do artigo deve ser c

onciso e indicar o conteúdo do trabalho;

b) um

Abstract

, um resumo em inglês, deverá ser apresentado com os elementos

constituintes observados nos artigos em português, publicados no último número da

revista, ficando em branco apenas a paginação, e, no final, terá indicação dos

index

terms

;

c) o

Resumo

deve apresentar, de forma direta e no passado, o que foi feito e

estudado, dando os mais importantes resultados e conclusões; será seguida da

indicação dos termos de indexação; nos trabalhos em inglês, Resumo e

Abstract

trocam de posição e de constituição (veja-se como exemplo sempre o último

fascículo da revista);

d) a

Introdução

deve ser breve, com citação bibliográfica específica sem que a

mesma assuma importância principal, e finalizar com a indicação do objetivo do

trabalho;

e) em Material e Métodos devem ser reunidos os dados que permitam a repetição

do trabalho por outros pesquisadores;

f) em

Resultados

deve ser feita a apresentação concisa dos dados obtidos; quadros

devem ser preparados sem dados supérfluos, apresentando, sempre que indicado,

médias de várias repetições; é conveniente, às vezes, expressar dados complexos

por gráficos, ao invés de apresentá

los em quadros extensos;

g) na

Discussão

os resultados devem ser discutidos diante da literatura; n

ão

convém mencionar trabalhos em desenvolvimento ou planos futuros, de modo a

evitar uma obrigação do autor e da revista de publicá

los;

h) as

Conclusões

devem basear-se somente nos resultados apresentados no

trabalho;

i) os

Agradecimentos

devem ser sucintos e não devem aparecer no texto ou em

notas de rodapé;

j) a lista de

Referências

, que só incluirá a bibliografia citada no trabalho e a que

tenha servido como fonte para consulta indireta, deverá ser ordenada

alfabeticamente pelo sobrenome do primeiro autor, registrando os nomes de todos

os autores, o título de cada publicação e, por extenso ou abreviado, o nome da

revista ou obra, usando as normas da Associação Brasileira de Normas Técnicas -

ABNT,

Style Manual for Biological Journals (American Institute for Biological

Sciences) e/ou Bibliographic Guide for Editors and Authors (American Chemical

Society, Washington, D.C.).

2. Na elaboração do texto deverão ser atendidas as normas abaixo:

a) os trabalhos devem ser apresentados em uma só face do papel, em es

paço duplo

e com margens de, no mínimo, 2,5 cm; o texto será escrito corridamente; quadros

serão feitos em folhas separadas, usando-se papel duplo ofício, se necessário, e

anexados ao final do trabalho; as folhas, ordenadas em texto, legendas, quadros e

guras, serão numeradas seguidamente;

b) a redação dos trabalhos deve ser a mais concisa possível, com a linguagem,

tanto quanto possível, no passado e impessoal; no texto, os sinais de chamada para

notas de rodapé serão números arábicos colocados um pouco acima da linha de

escrita, após a palavra ou frase que motivou a nota; essa numeração será contínua;

as notas serão lançadas ao pé da página em que estiver o respectivo sinal de

chamada; todos os quadros e todas as figuras serão mencionados no texto; estas

remissões serão feitas pelos respectivos números e, sempre que possível, na ordem

crescente destes; Resumo e

Abstract

serão escritos corridamente em um só

parágrafo e não deverão conter citações bibliográficas;

c) no rodapé da primeira página deverá constar endereço profissional do(s)

autor(es);

d) siglas e abreviações dos nomes de instituições, ao aparecerem pela primeira vez

no trabalho, serão colocadas entre parênteses e precedidas do nome por extenso;

e) citações bibliográficas serão feitas pelo sistema "autor e ano"; trabalhos de dois

autores serão citados pelos nomes de ambos, e de três ou mais, pelo nome do

primeiro, seguido de "et al.", mais o ano; se dois trabalhos não se distinguirem por

esses elementos, a diferenciação será feita pelo acréscimo de letras minúsculas ao

ano, em ambos; todos os trabalhos citados terão suas referências completas

incluídas na lista própria (Referências), inclusive os que tenham sido consultados

indiretamente; no texto não se fará menção do trabalho que tenha servido so

mente

como fonte; este esclarecimento será acrescentado apenas ao final das respectivas

referências, na forma: "(Citado por Fulano 19...)"; a referência do trabalho que tenha

servido de fonte será incluída na lista uma só vez; a menção de comunicação

pesso

al e de dados não publicados é feita, de preferência, no próprio texto, colocada

em parênteses, com citação de nome(s) ou autor(es); nas citações de trabalhos

colocados entre parênteses, não se usará vírgula entre o nome do autor e o ano,

nem ponto-e-

vírgu

la após cada ano; a separação entre trabalhos, nesse caso, se

fará apenas por vírgulas, exemplo: (Flores & Houssay 1917, Roberts 1963a,b,

Perreau et al. 1968, Hanson 1971);

f) a lista das referências deverá ser apresentada com o mínimo de pontuação e

isent

a do uso de caixa alta, sublinhando-se apenas os nomes científicos, e sempre

em conformidade com o padrão adotado no último fascículo da revista, inclusive

quanto à ordenação de seus vários elementos.

3. As

figuras

(gráficos, desenhos, mapas ou fotografias) deverão ser apresentadas

em tamanho maior (cerca de 150%) do que aquele em que devam ser impressas,

com todas as letras ou sinais bem proporcionados para assegurar a nitidez após a

redução para o tamanho desejado; parte alguma da figura será datilografada; a

chave das convenções adotadas será incluída preferentemente, na área da figura;

evitar

-á o uso de título ao alto da figura; desenhos deverão ser feitos com tinta

preta em papel branco liso ou papel vegetal, vedado o uso de papel milimetrado;

cada figura será identificada na margem ou no verso, a traço leve de lápis, pelo

respectivo número e o nome do autor; havendo possibilidade de dúvida, deve ser

indicada a parte superior da figura; fotografias deverão ser apresentadas em branco

e preto, em papel brilhante, e sem montagem, ou em diapositivos (

slides

) coloridos;

somente quando a cor for elemento primordial a impressão das figuras será em

cores; para evitar danos por grampos, desenhos e fotografias deverão ser colocados

em envelope.

4. As legendas explicativas das figuras conterão informações suficientes para que

estas sejam compreensíveis e serão apresentadas em folha separada que se

iniciará com o título do trabalho.

5. Os

quadros

deverão ser explicativos por si mesmos; cada um terá seu título

compl

eto e será caracterizado por dois traços longos, um acima e outro abaixo do

cabeçalho das colunas; entre esses dois traços poderá haver outros mais curtos,

para grupamento de colunas; não há traços verticais; os sinais de chamada serão

alfabéticos, recomeçando de a em cada quadro, e as notas serão lançadas logo

abaixo do quadro respectivo, do qual serão separadas por um traço curto, à

esquerda.

AVAL

IAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DA TÉCNICA DE BIÓPSIA

PULMONAR

TRANSTORÁCICA PERCUTÂNEA PA

RA AVALIAÇÃO

HISTOPATOLÓGICA DO PARÊNQUIMA PULMONAR DE OVINOS

CLINICAMENTE SADIOS

Andreza Amaral da Silva

*, Danilo Otávio Laurenti Ferreira

, Camila Dias Porto

Júlio Lo

pes Sequeira

, Roberto Calderon Gonçalves

ABSTRACT.

- Silva A.A., Ferreira D.O.L., Porto C.D., Sequeira J.L., Gonçalves R.C.

2009.

[Evaluation of safety and effectiveness of the transthoracic percutaneous

lung biopsy technique for histopathological evaluation of the lung parenchyma

in healthy sheep.

]

Avaliação da segurança e eficácia da técnica de biópsia

transtorácica percutânea para avaliação histopatológica do parênquima pulmonar de

ovinos clinicamente sadios.

Pesquisa Veterinária Brasileira

Departamento de Clínica

Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botuca

Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho, Distrito de Rubião Júnior, S/N - CEP:

18.618

000

Botucatu/SP

–

Brasil.

E-

mail:

[email protected]

Dissertação de Mestrado do primeiro autor; auxílio financeiro (processo 07/55341-6) e bolsa de

mestrado (processo 07/51713-

da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo –

FAPESP.

Mestrando (a) do programa de Pós-

aduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP),

mpus Botucatu, São Paulo.

Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu

Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho, Distrito de Rubião Júnior, S/N - CEP: 18.618-

000

Botucatu/SP

–

Brasil.

Autor para co

rrespondência: [email protected]

Doutoranda do programa de Pós-

aduação em Medicina Veterinária da F

MVZ,

UNESP, Campus

Botucatu, São Paulo.

Prof. Ass

do Depa

rtamento de Clínica Veterinária da

FMVZ

UNESP,

Campus

Botucatu, São

Paulo.

It was analyzed the results and complications arising from the use of the

percutaneous transthoracic lung biopsy technique in 20 clinically healthy sheep. The

animals were subjected to clinical examination followed by lung biopsy with a semi-

automatic needle in the 7th intercostal space right, 5 cm above the elbow. It was

evaluated the number of attempts to implement the procedure and size of the

fragments. The samples were evaluated histologically. After the

slaughter

, a post

mortem examination assessed the technical complications and possible injurie

Among all animals underwent biopsy only two did not tolerate the technique. Were

obtained Lung fragments from 4 mm to 7 mm and

were required on average 1,8

attempts

. The main changes related to the procedure were: cough, labored

breathing, increased heart and breathing rate and increased

broncobronquiolar

noise

. The post-mortem examination revealed bleeding of the intercostal muscles

and visceral pleura of various sizes in all lambs, and a wound up to 14 mm in the

lung of two animals that did not tolerate the procedure.

From

20 attempts to

implement the technique, 18 were successful, while in two of them the liver was

mistakenly punctured. Samples of lung tissue were representative. It was possible to

visualize intact structures, including bronchioles and alveoli.

conclu

sion

the lung

biopsy is safe and effective for obtaining lung samples for the purpose of histological

diagnosis

INDEX TERMS:

Sheep, lung biopsy,

auxiliary tests

lung.

RESUMO.

- Foram analisados os resultados e complicações de

cor

rentes do

emprego da técnica de biopsia pulmonar transtorácica percutânea em 20 ovinos

clinicamente sadios

Os animais foram submetidos ao exame clínico seguido da

biopsia

com agulha

semi

-automática no 7º espaço intercostal direito, 5 cm acima do

olécrano

. Foram

analisados

o número de tentativas para a execução do

procedimento e o tamanho dos fragmentos. As amostras obtidas foram avaliadas

histologicamente.

Posteriormente ao abate, foi realizado o exame pos mortem

para

avaliação de complicações da técnica e das eventuais lesões provocadas. Entre

todos os animais submetidos à biopsia apenas dois demonstraram resistência

técnica, sendo obtidos fragmentos pulmonares entre 4mm a 7 mm, com média de

1,8

1 tentativas por fragmento. As principais alterações relacionadas à técnica

foram tosse, dispnéia inspiratória, elevação das freqüências cardíaca e respiratória e

aumento do ruído broncobronquiolar. Ao exame pos mortem observou-

hemorragia dos músculos intercostais e pleura visceral em todos os animais. Das 20

tentativas de execução da técnica, 18 obtiveram sucesso, enquanto que em duas o

fígado foi equivocadamente puncionado. As amostras de tecido pulmonar foram

consideradas representativas, pois foi possível a visualização de estruturas íntegras,

incluindo bronquíolos e alvéolos. Podemos concluir que a

biopsia pulmonar

é segura

e eficaz para obtenção amostras pulmonares com fins de diagnóstico histológico.

TERMOS DE INDEXAÇÃO: Ovinos, biopsia pulmonar, exame complementar

pulmão

INTRODUÇÃO

As doenças que afetam o trato respiratório inferior são consideradas a

principal causa de perda na ovinocultura moderna (D

ohoo

et al., 1985; M

artin

, 1996;

utlip

et al., 1998), sendo responsáveis por 10 a 40% das mortes em animais

adultos (V

ieira

et al., 1993) e por 17% das mortes durante o período perinatal (R

ook

et al., 1990).

Apesar de ocorrerem com freqüência

rebanhos ovinos, muitas vezes as

causas dessas enfermidades pulmonares não podem ser determinadas apenas com

a realização de um exame clínico mais ac

urado,

sendo necessários outros recursos

diagnósticos para definir sua etiologia. Além disso, a necessidade de diagnóstico

específico das doenças pulmonares é uma imposição dos recursos terapêuticos

atuais.

A biópsia pulmonar é um procedimento diagnóstico invasivo, geralmente

utilizado quando outros procedimentos menos invasivos como radiografia, lavado

tra

queobrônquico e

/ou

broncoalveolar, endoscopia e ultrassonografia já foram

realizados sem uma definição diagnóstica, ou quando há necessidade de um

diagnóstico

rápido e preciso (Porto, 1991)

A avaliação histológica de fragmentos

pulmonares obtidos através da biopsia é útil para caracterização de danos

superficiais e subpleurais e para diferenciar lesões inflamatórias, alérgicas,

enfisematosas, edematosas e neop

lá

sicas (B

raun

et al., 1999). Além disso, as

amostras de pulmão podem ser submetidas à cultura de fungos e bactérias, bem

como testes de sensibilidade a antibióticos, dependendo da suspeita diagnóstica

avage

et al., 1998). Entretanto, poucos estudos relatando a segurança e eficácia

da biopsia pulmonar em ovinos já foram publicados.

O primeiro relato científico de biopsia pulmonar em ovinos foi de Pusterla e

colaboradores, em 1995, descrevendo a utilização da técnica para a obtenção de

fragmentos pulmonares de animais com adenomatose pulmonar. Em seguida houve

dois relatos de biopsia pulmonar aspirativa guiada por ultra-som (B

raun

et al., 1995;

Scott & G

essert

, 1998) e outro de biopsia pulmonar lancetante guiada por ultra-

som

(Braun e

t al., 2000).

O objetivo deste estudo é avaliar a segurança da técnica de biopsia pulmonar

percutânea transtorácica às cegas e sua eficácia na obtenção de amostras

adequadas que permita a análise histopatológica do fragmento pulmonar.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 20 ovinos clinicamente sadios (13 da raça Santa Inês e 7

mestiços Santa Inês), 9 machos e 11 fêmeas, com idade entre

150

e 190 dias

(média de 175 dias), pesando entre

e 44 Kg (média

Kg) e destinados ao

abate.

Todos os animais foram submetidos ao exame clínico imediatamente antes e

após a biopsia pulmonar, utilizando-se protocolo adotado por Viana (2003), e critério

clínico de Gonçalves (2004). Os resultados foram anotados em fichas individuais.

O procedimento foi realizado com os animais em estação e con

tidos

manualmente com a ajuda de um assistente. O ponto de punção para a biopsia

pulmonar foi demarcado no sétimo espaço intercostal do antímero lateral direito,

acima do

olécrano

. Esse ponto corresponde à posição topográfica do lobo

diafragmático do pulmão direito. A seguir foi feita tricotomia e antissepsia da pele

com solução de iodo povidine a 1%, seguido de anestesia local da pele do espaço

intercostal, tecido subcutâneo, músculos intercostais e pleura parietal, utilizando-

5 ml de solução de lidocaína a 2%. Alguns minutos depois foi feita, com bisturi,

incisão de aproximadamente 1 cm na pele e tecido subcutâneo, entre os espaços

intercostais. Uma agulha de biopsia do tipo semi-

automática

(BD 16 G X 15 cm;

Euromed Cateteres ) foi inserida, imediatamente cranial à costela, em ângulo

vertical à superfície corporal, evitando-

se os vasos e nervos intercostais.

Amostras do tecido pulmonar foram colhidas de acordo com Finn-Bodner &

Hathcock (1993) e Braun et al. (1999). Se nenhum fragmento do parênquima fosse

obtido após a punção, o procedimento seria repetido até que se conseguisse uma

amostra satisfatória do tecido pulmonar. Foi analisado o número de tentativas para a

execução do procedimento. Imediatamente após a punção, os fragmentos

pulmonares obtidos foram acondicionados em recipientes contendo formalina a 10%

e, posteriormente, desidratados em álcool, embebidos em parafina, seccionados e

corados com hematoxilina

eosina.

Nenhuma medicação foi administrada aos animais e nenhuma atenção

especial foi dada ao sítio da biopsia, uma vez que todos os animais foram

submetidos ao abate logo após o procedimento.

Após serem abatidos, os animais foram analisados por inspeção no exame

pos

mortem

para avaliação de complicações decorrentes da técnica. Hemorragias

na pleura visceral atribuídas à biopsia foram avaliadas segundo o escore de

gravidade da lesão descrito por Silva (2005), adaptado de Braun et al. (1999)

(escore 1 = lesão pleural com área até 4 mm

; escore 2 = lesão pleural com área

entre 4,1 e 25 mm

; escore 3 = lesão pleural com área superior a 25,1 mm

). As

amostras de tecido pulmonar obtidas também foram submetidas ao exame

macroscópico, avaliando

-se o comprimento de cada fragmento tecidual.

A avaliação histológica dos fragmentos de biopsia foi realizada utilizando-

microscópio binocular convencional. A qualidade dos cortes histológicos obtidos foi

avaliada segundo escore adaptado de Hopper et al. (1990) para: 1) adequação

tecidual para o diagnóstico histopatológico (escore 0 = tecido insuficiente pa

análise histopatológica; escore 1 = tecido insuficiente para uma avaliação

histopatológica adequada, mas é possível um diagnóstico altamente suspeito;

escore 2 = tecido suficiente para a avaliação histopatológica); 2) Preservação

Tecidual (escore 0 = pobre; escore 1 = intermediária; escore 2 = boa); 3) Presença

de Artefatos (escore 0 = intensa; escore 1 = intermediária; escore 2 = sem presença

de artefatos). Os achados histopatológicos referentes às biopsias foram registrados

por

fotomicrog

Os dados coletados foram expostos por meio de estatística descritiva, através

de média, desvio padrão e percentual.

RESULTADOS

Pela técnica anteriormente descrita, fragmentos teciduais foram obtidos em

todos os animais submetidos ao procedimento (20/20 - 100%), sendo necessária,

em média 1,8 ± 1 tentativas. Das 20 biopsias realizadas, amostras de tecido foram

obtidas após apenas uma tentativa em nove (9/20 - 45%) ocasiões, após duas

tentativas em sete (7/20 - 35%), após três tentativas em dois (2/20 - 10%) e, após 4

tentativas também em dois (2/20 - 10%) momentos. A agulha escolhida foi de fácil

manipulação e a técnica foi executada sem grandes dificuldades.

Treze animais (13/20 - 65%) toleraram bem a técnica de biopsia pulmonar

transtorácica percutânea, entretanto, alguns animais demonstraram certa resistência

durante o procedimento, vindo até a dificultar a coleta. Cinco (5/20 – 25%) animais

demonstraram suave esforço (berros, feições de medo e elevação das patas),

enquanto que dois (2/20 – 10%) animais apresentaram forte resistência (saltos e

tentativas de coices) à realização da técnica.

Ao exame clínico, atitude geral e postura permaneceram inalteradas e a

temperatura retal não se elevou, permanecendo dentro dos valores de referência

para a espécie. Entretanto, as freqüências cardíaca e respiratória aumentaram em

14 (70%; Média (MED) = 122bpm) e 12 (60%; MED = 52mrp) animais,

respectivamente. Apesar disso, os parâmetros observados voltaram à normalidade

em aproximadamente

minutos após a biopsia

Com relação a alterações no aparelho respiratório, foi observada tosse

espontânea em seis (6/20 - 30%) animais. Anormalidades no padrão respiratório

ocorreram em 3 (3/20 - 15%) ovinos, sendo que dois deles apresentaram dispnéia

inspiratória e um animal apresentou expiração em dois tempos, o que geralmente é

característico de dor. À auscultação pulmonar, foi observado aumento do ruído

broncobronquiolar no sítio da biopsia, em três (3/20 - 15%) animais. Os dois ovinos

que demonstraram forte resistência à execução do procedimento apresentaram, à

auscultação pulmonar no local da biopsia, um som característico de vazamento de

ar, exatamente sobre o local da punção, embora sem haver saída de ar para o

exterior.

Um animal entrou em colapso imediatamente após a realização da biopsia,

vindo a decúbito. Este animal apresentou tosse, taquicardia, taquipnéia, intensa

dispnéia inspiratória e posicionou-se em posição ortopneica, demonstrando grande

dificuldade respiratória. A auscultação pulmonar deste animal revelou aumento do

ruído broncobronquiolar por toda área dos pulmões. Apesar disso, o animal levantou

alguns minutos e não apresentou mais nenhuma anormalidade. Nenhum dos

animais apresentou hemoptise, epistaxe ou mesmo sinais clínicos compatíveis com

hemotór

ax ou p

neumotórax

, complicações comumente associadas à biopsia

pulmonar.

Os animais foram abatidos, em média, três horas após a realização da biopsia

pulmonar.

No exame pos mortem observou-se que todas as punções estavam

localizadas no lobo diafragmático. Das 20 biopsias realizadas, as alterações

encontradas na pleura parietal e músculos intercostais eram evidenciados como um

ponto em 12 carcaças (12/20 - 60%); em outras quatro (4/20 - 20%) as lesões

tinham até 4 mm

de comprimento;

foram evidenciadas como grandes

hematomas de

até 8

mm X 10mm

quatro

carcaças (4/20 - 20%). Todos os animais apresentaram

hemorragia de pleura, cuja área variou de 4 mm

a 40 mm

. Dos 20 animais

biopsiados, avaliados quanto ao escore de severidade da hemorragia pleural

proposto por Silva (2005), adaptado de Braun et al. (1999), oito ovinos (8/20 - 40%)

apresentaram escore 1, seis (6/20 - 30%) apresentaram escore 2 e outros seis

animais (6/20 - 30%) apresentaram escore 3. Ao exame macroscópico dos pulmões

foram observados petéquias e enfisema ao redor da ferida da biopsia, presentes em

quatro (4/20 - 20%) e cinco (5/20 - 25%) ovinos, respectivamente. Dois animais,

mais precisamente os que demonstraram forte resistência durante a execução da

biopsia, apresentaram uma ferida linear de aproximadamente 12 mm e 14 mm,

respectivamente, na face costal do pulmão direito na região basal do lobo

diafragmático. No pulmão de dois ovinos foi observado sinais de que a agulha de

biopsia havia transpassado o lobo diafragmático.

Os fragmentos teciduais obtidos através da biopsia v

ariaram

4 a 17 mm de comprimento (MED = 10 mm). Das 20 amostras obtidas 18 (18/20 –

90%) eram de tecido pulmonar e duas (2/20 – 10%) eram de tecido hepático. Todas

as amostras de pulmão (18/18 – 100%) estavam adequadas para an

álise

histopatológica por apresentarem arquitetura pulmonar preservada. Quatorze

amostras (14/18 – 78%) foram consideradas ideais para avaliação histológica, pois

foi possível observar bronquíolos primários, terminais e respiratórios, ductos e sacos

alveol

ares bem como alvéolos isolados. Em 4 amostras (4/18 – 22%) não foi

possível encontrar bronquíolos, estando ausentes inclusive os bronquíolos terminais.

Nestas lâminas estavam presentes apenas ductos e sacos alveolares e alvéolos

isolados e por isso foram classificadas apenas como boas para uma avaliação

histológica. Duas amostras (2/18 – 11%) apresentaram infiltrado inflamatório misto

discreto, composto por mononucleares e neutrófilos. Dois fragmentos (2/18 – 11%)

teciduais apresentaram focos hemorrágicos

isolados

(Figura 1).

Um dos fragmentos pulmonares (1/18 – 5%) apresentou aumento da

celularidade do interstício e conseqüente espessamento, com infiltrado inflamatório

misto moderado, composto por mononucleares e eosinófilos, além de focos

hemorrágicos. A luz bronquiolar mostrou-se diminuída, com presença de debris

celulares. A pleura, observada em uma das extremidades da biópsia, exibiu

espessamento.

Esses achados são compatíveis com o diagnóstico de pneumonia

intersticial crônica (Figura 1).

Todas as amostras de pulmão obtidas (18/18 – 100%) mostraram áreas

atelectásicas nas extremidades e duas amostras (2/18 – 11%) apresentaram

também esmagamento tecidual com comprometimento de parte da área amostrada,

todavia nenhuma dessas alterações comprometeu a avaliação morfológica. Em

cinco casos (5/18 – 28%), além de pulmão, também foram observados fragmentos

de pele, músculo esquelético, fígado ou tecido conjuntivo de origem indeterminada.

A qualidade dos cortes histológicos pulmonares obtidos foram avaliados

seg

undo o escore adaptado de Hopper et al. (1993), que considera os graus zero,

um e dois qualitativamente. Levando em conta a adequação tecidual, todas as

amostras (18/18 -100%) apresentaram escore 2; com relação a preservação

tecidual, duas amostras (2/18 – 11%) apresentaram escore 1 e, 16 amostras (16/8 –

89%) obtiveram escore 2; analisando a presença de artefatos, em todas as lâminas

confeccionadas (

/18

–

100%) verificou

se escore 1.

ISCUSSÃO

A biopsia pulmonar percutânea realizada com agulhas lancetantes demorou

para ganhar aceitação, mas o avanço nas técnicas de biopsia, melhorias nas

agulhas e a possibilidade de lidar melhor com as complicações decorrentes da

técnica contribuíram para o aumento da popularidade desta útil ferramenta de auxílio

diagnó

stico. Neste estudo, as biopsias pulmonares foram conduzidas às cegas de

forma que houvesse máxima probabilidade de se conseguir amostras de tecido

viáveis para um diagnóstico histológico quando fosse aplicada em ovinos com

doença pulmonar difusa. Se o objetivo do procedimento for obter fragmentos

teciduais de lesões localizadas, a biopsia pulmonar deve ser preferencialmente,

guiada por ultra-som ou radiografias, como já relatado por outros autores

ood

al., 1998; B

raun

et al., 2000).

Foram necessárias em média 1,8 tentativas até a obtenção de um fragmento

de tecido viável para análise histológica. Outros autores relatam resultados

semelhantes, com média de 1,2 para Braun et al. (2000) que também utilizaram uma

agulha semi-automática em ovinos, e de 1,3 para Hamarati (1995) que utilizou um

dispositivo automático em humanos. Porém, nestes dois casos as biopsias não

foram realizadas às cegas. A execução da biopsia pulmonar às cegas aumenta o

risco de complicações como punção equivocada de outros órgãos, lesões de

grandes vasos e morte em conseqüência de hemorragias. No presente estudo foram

necessárias poucas perfurações para a obtenção de amostras de tecido viáveis para

um exame histológico e não foram observadas complicações graves em decorrência

da técnica, indicando que, nestas condições, o 7º espaço intercostal é um bom

acesso para a cavidade torácica em ovinos, especialmente quando se pretende

obter amostras do lobo diafragmático.

Segundo Moore (2005) e Braun et al.(1999) as reações de desconforto e dor

ocorrem durante a perfuração da pleura parietal e não durante a coleta do tecido

pulmonar. Por isso, a perfuração da pleura deve ser bem rápida para eliminar a

possibilidade de que qualquer movimento repentino desvie a trajetória da agulha ou

então que sua ponta cortante lese a pleura antes da colheita de tecido pulmonar.

Dois animais deste estudo demonstraram forte resistência à técnica, com reações

semelhantes às relatadas em bovinos por Braun et al. (1999), principalmente no

momento da perfuração da pleura. Ao exame pos mortem pôde-se observar

perfurações lineares de até 14 mm nos pulmões desses ovinos. Embora estivessem

anestesiados, é possível que o volume da droga injetado tenha sido insuficiente para

uma adequada anestesia da pleura parietal, e que o aumento na quantidade de

anestésico administrado possa reduzir a dor desta perfuração, como já foi relatado

para eqüinos (Raphel & G

unson

, 1981) e bovinos (B

raun

et al., 1999). Outra opção

para evitar reações bruscas dos animais que possam atrapalhar o bom andamento

da técnica seria o uso de sedativos. Contudo, antes da indicação deste tipo de

fármaco é necessária uma avaliação minuciosa da função pulmonar dos animais,

geralmente comprometida em casos de doença respiratória grave.

As alterações observadas ao exame clínico conduzido após a biopsia

pulmonar estão de acordo com as des

crições prévias da literatura (Raphel

unson

1981; S

avage

et al., 1998; B

raun

et al., 1999; B

raun

et al., 2000; S

ilva

, 2005). O

aumento das freqüências cardíaca e respiratória, observadas em alguns animais,

deve ter ocorrido em conseqüência ao estresse da contenção e da realização do

procedimento, visto que esses parâmetros voltaram à normalidade dentro de poucos

minutos após a realização da biopsia.

Com relação ao exame do aparelho respiratório, a elevação do ruído

broncobronquiolar provavelmente ocorreu em decorrência do esforço físico de

alguns animais ao resistirem à execução da biopsia. A dispnéia inspiratória,

observada em dois animais, poderia ser resultado da agressão da agulha ao tecido

pulmonar, o que pode determinar um sangramento no parênquima pulmonar

adostits

et al., 2002

Entretanto, nenhum dos animais que apresentaram dispnéia

inspiratória após o procedimento apresentou focos hemorrágicos na avaliação

hist

ológica da amostra obtida. Por outro lado, uma hemorragia focal, como foi

observado, não seria suficiente para causar alteração no padrão respiratório. Pode-

se deduzir que a biopsia não determina grande modificação na estrutura pulmonar,

mas que o ato de contenção associado com a dor conseqüente à perfuração pleural

poderia levar à dispnéia inspiratória observada nesses dois animais. Se esses dois

ovinos apresentassem problema decorrente da lesão provocada pela biopsia

provavelmente haveria manutenção da dificuldade respiratória, o que não foi

observado já que todos os animais voltaram ao seu padrão respiratório normal em

aproximadamente quinze minutos após o procedimento, indicando a segurança da

técnica.

A auscultação pulmonar do sítio da biopsia revelou, em dois animais, um

ruído semelhante a vazamento de ar (sopro). Este tipo de ruído provavelmente

ocorreu pela perfuração da pleura visceral e do tecido pulmonar subjacente com

saída de ar para a cavidade pleural, já que esses animais foram os que

apresen

taram maior resistência ao procedimento. A entrada de ar na cavidade

pleural pode levar a um pneumotórax, se a capacidade de absorção pleural for

ultrapassad

a (P

orto

, 1991). Como não foi feito diagnóstico por acompanhamento

radiográfico (B

raun

et al. 1999; V

enner

et al., 2006) ou por uma auscultação seriada

algumas horas após a biopsia, já que os animais precisavam ser abatidos, o

pneumotórax não pode ser constatado.

O motivo para o colapso momentâneo ocorrido logo após a biopsia pulmonar

em um dos animais não foi determinado, embora reações como essa já tenha sido

relatada por outros autores em bovinos, também sem causa aparente (B

raun

et al.,

1999). Contrariando observações de outros autores que apontam a hemoptise e a

epistaxe como complicações normalmente associadas à biopsia pulmonar (Raphel &

unson

, 1981; S

avage

et al., 1998; DeB

erry

et al., 2002; S

ilva

, 2005; V

enner

et al.,

2006), não foram observados nesta pesquisa sinais de sangramento em nenhum

dos animais após o procedimento. Entretanto, Venner et al. (2006) relatam que

indícios de hemorragia são geralmente evidenciados após endoscopia, mesmo em

animais que não apresentaram sinais aparentes de sangramento. Neste estudo, o

exame pos mortem não revelou estrias de sangue ou coágulos no trato respirató

rio

de nenhum dos animais, o que elimina as chances de que hemorragias de grande

porte tenham realmente ocorrido. Contudo, foram observadas petéquias próximas ao

local da punção nos pulmões de dois ovinos, indicando que pequenas hemorragias

no parênquima pulmonar sem importância clínica ocorreram em conseqüência da

biopsia, como já observado por outros autores (R

oy &

avoie

2003).

As hemorragias de pleura visceral ocorreram em todos os ovinos, sendo

semelhantes às previamente relatadas em outros estudos (B

raun

et al., 1999; B

raun

et al., 2000; S

ilva

, 2005; V

enner

et al., 2006). Essas hemorragias foram agrupadas

de acordo com o escore atribuído a área total das lesões. O escore de lesão

adotado para a biopsia neste estudo foi inferior aos resultados descritos por Silva

(2005) e superiores aos de Braun et al. (1999). Silva (2005) trabalhou com uma

agulha de biopsia de grosso calibre, o que provavelmente ocasionou maior dano

tecidual

que a agulha de médio calibre utilizada no presente trabalho. Braun et al.

(19

99), por sua vez, determinou o escore da lesão 10 dias após a realização da

biopsia, havendo, dessa forma, tempo hábil para reparação tecidual. As feridas

lineares de até 14 mm observadas no parênquima pulmonar de dois ovinos

ocorreram provavelmente em conseqüência da agitação demonstrada por esses

animais no momento da biopsia.

Os tamanhos dos fragmentos teciduais obtidos neste estudo estão de acordo

com as descrições prévias da literatura (B

raun

et al., 1999; Braun et al., 2000; Silva

2005). A técnica empregada permitiu a avaliação da arquitetura tecidual pulmonar.

Uma biopsia é considerada representativa quando são visualizadas unidades

funcionais do tecido amostrado (N

aylor

et al., 1992). Neste estudo foi possível

observar em aproximadamente 80% das amostras obtidas, bronquíolos primários,

terminais e respiratórios, ductos e sacos alveolares, bem como alvéolos isolados.

Resultados semelhantes também foram observados em eqüinos (R

aphel

& G

unson

1981; V

enner

, 2006), bovinos

ungworth & H

oare

, 1970; B

raun

et al., 1999) e

ovinos (Braun et al., 2000). Não foi possível verificar a presença de brônquios nas

amostras obtidas devido a provável ausência dessas estruturas no local onde foi

realizada grande parte das punções, a porção basal do lobo diafragmático.

Duas amostras apresentaram perfil histológico compatível com processo

inflamatório muito discreto, composto por mononucleares e neutrófilos. Uma possível

explicação para esse achado é que, se estes animais realmente apresentavam

doença respiratória, o processo ainda estava muito incipiente para ser detectado ao

exame clínico. Como os animais desta espécie, devido as condições de manejo a

que são submetidos, vivem constantemente expostos a fatores de risco, é aceitável

que achados como este ocorram quando se realiza biopsia pulmonar. Os focos

hemorrágicos encontrados em duas lâminas foram conseqüentes ao trauma tecidual

provocado pela agulha

de biopsia

aphel &Gunson,

1981).

Um dos animais apresentou perfil histológico de pneumonia intersticial

crônica, entretanto, ao exame clínico não foram observadas alterações compatíveis

com o quadro apresentado. Isto provavelmente ocorreu por que as partes não

afetadas do pulmão compensaram a insuficiência funcional das áreas lesionadas,

fazendo com que o animal se mantiv

esse clinicamente estável.

Artefatos iatrogênicos estavam presentes em todas as biopsias. O mais

comum foram as áreas de atelectasia presentes nas bordas teciduais. Este tipo de

artefato dificulta a avaliação histológica e geralmente ocorre em função do t

rauma

tecidual ocorrido (R

aphel &

unson

, 1981). A presença de outros tecidos compactos

junto às amostras de tecido pulmonar, observadas neste estudo (5/18), também foi

descrita por outros autores (Raphel & G

unson

, 1981; B

raun

et al., 2000). A

desvantagem

de se encontrar tecidos maciços junto ao pulmão é que o parênquima

pulmonar, por ser menos compacto, tende a colapsar e ficar comprimido entre esses

tecidos mais densos (R

aphel

unson

, 1981).

A biopsia acidental do fígado ocorreu duas vezes neste estudo. Outros

autores já relataram punção de músculos intercostais (V

enner

et al., 2006), intestino

avage

et al., 1998) e fígado (F

oroudi

et al., 1995; V

enner

et al., 2006). Segundo

Smith (1994), a agulha de biopsia deve avançar cerca de 2 cm no interior do

parênquima pulmonar para que seja obtida uma amostra satisfatória de tecido

pulmonar. Harrison et al. (1984) defendem que a penetração máxima da agulha no

interior dos pulmões deve ser de 3 cm ou 4 cm. Neste estudo a biopsia foi realizada

segundo a técnica de Finn-Bodner & Hathcock (1993) e Braun et al. (1999) para

bovinos adultos. A indicação desses autores é de que a agulha penetre no máximo 8

cm no interior da cavidade torácica a partir de incisão na pele do animal. Silva (2005)

executou a mesma técnica em bezerros, obtendo sucesso. Durante as coletas não

foram feitas mensurações para saber com exatidão quantos centímetros a agulha de

biopsia penetrou a cavidade torácica, apenas foi feita uma marcação na agulha para

assegurar que esta não penetrasse mais que 8 cm. Apesar da técnica ter sido

conduzida com sucesso em 18 das 20 tentativas realizadas neste estudo, ficou

evidente a necessidade de padronização da profundidade de penetração da agulha

na cavidade torácica na espécie ovina, evitando assim a punção equivocada de

outros órgãos.

Em conclusão, a biopsia pulmonar transtorácica percutânea é um exame

complementar de fácil execução, rápido, seguro e eficiente na obtenção de material

pulmonar adequado e suficiente para uma avaliação histopatológica. O acesso ao

pulmão através do sétimo espaço intercostal direito, 5 cm acima do olécrano,

mostrou

-se adequado para a obtenção de amostras pulmonares para fins

diagnósticos, uma vez que nenhuma complicação grave decorrente da técnica foi

observada, podendo, inclusive, ser utilizado em procedimentos realizados às cegas

em casos de doença pulmonar difusa. A biopsia pulmonar deve ter seu uso

encorajado na rotina veterinária. Todavia, para que isto se concretize, o profissional

de veterinária precisa ter conhecimento de suas indicações e limitações, além da

técnica para a realização de forma eficiente da mesma.

gradecimentos.

- Os autores agradecem ao auxílio financeiro e a bolsa de

estudos de mestrado concedida pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

São Paulo

–

FAPESP (Processos 07/55341

6 e 07/55341

-6

, respectivamente

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