( PDF ) Estudo da interação ?in vitro? entre Tritrichomonas foetus e espermatozóides bovinos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

ESTUDO DA INTERAÇÃO “IN VITRO” ENTRE Tritrichomonas

foetus E ESPERMATOZOIDES BOVINOS

CLÁUDIA DE MELLO RIBEIRO

Botucatu – SP

Novembro – 2008

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

ESTUDO DA INTERAÇÃO “IN VITRO” ENTRE Tritrichomonas

foetus E ESPERMATOZOIDES BOVINOS

CLÁUDIA DE MELLO RIBEIRO

Tese apresentada junto ao Programa

de Pós-Graduação em Medicina

Veterinária para obtenção do título de

Doutor.

Orientador: Prof. Dr. José Rafael Modolo

Coorientador: Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo

Coorientador: Prof. Dr. Fernando Costa e

Silva Filho

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE

AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE

BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus

Ribeiro, Cláudia de Mello.

Estudo da interação “in vitro” entre Tritrichomonas foetus e

espermatozoides bovinos / M C Ribeiro. – Botucatu [s.n.], 2008.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista,

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2008.

Orientador: José Rafael Modolo

Assunto CAPES: 50502042

1. Bovino - Doenças 2. Doenças transmissíveis em animais

3. Infertili-dade

CDD 636.20896

Palavras-chave: Apoptose; Motilidade espermática;

Tritrichomonas foetus

iii

Nome do Autor: Cláudia de Mello Ribeiro

Título: ESTUDO DA INTERAÇÃO “IN VITRO” ENTRE Tritrichomonas foetus E

ESPERMATOZOIDES BOVINOS

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. José Rafael Modolo

Presidente e Orientador

Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública

FMVZ – UNESP – Botucatu

Profª. Drª Eunice Oba

Membro

Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária

FMVZ – UNESP – Botucatu

Prof. Dr. Alessandro Francisco Talamini do Amarante

Membro

Departamento de Parasitologia

IB – UNESP – Botucatu

Prof

. Dr

. Semíramis Guimarães Ferraz Viana

Membro

Departamento de Parasitologia

IB– UNESP – Botucatu

Prof

. Dr

Fabiana Ferreira de Souza

Membro

Departamento de Cirurgia e Anestesiologia

Universidade de Franca

Data da Defesa:19 de novembro de 2008.

Agradeço

Ao orientador Prof. Dr. José Rafael Modolo – Departamento de Higiene

Veterinária e Saúde Pública – FMVZ - UNESP – Botucatu

Ao co-orientador Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo – Departamento de

Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ - UNESP – Botucatu

Ao co-orientador Prof. Dr. Fernando Costa e Silva Filho – Instituto de

Biofísica Carlos Chagas Filho — Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Ao Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior – Departamento de Microbiologia

e Imunologia – Instituto de Biociências - UNESP – Botucatu.

Aos alunos de pós-graduação Marcell Barbosa Falleiros e Leandro

Rodello – Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária –

FMVZ - UNESP – Botucatu.

Aos alunos do Laboratório de Diagnóstico Molecular – Departamento de

Microbiologia e Imunologia – Instituto de Biociências - UNESP – Botucatu.

À técnica de laboratório Tânia Maria Martins – Departamento de Higiene

Veterinária e Saúde Pública – FMVZ - UNESP – Botucatu

À auxiliar de laboratório Adriana Cristina Pavan Vieira – Departamento

de Higiene Veterinária e Saúde Pública – FMVZ - UNESP – Botucatu

Ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

pelo financiamento deste projeto (Processo 06/60514-5)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Percentagem de espermatozoides móveis, analisada pelo

sistema CASA, durante manutenção no meio SOF (controle)

ou no extrato de incubação de T. foetus nos momentos 0,1,

2 e 3 horas..............................................................................

Tabela 2 -

Percentagem de espermatozoides viáveis (AN-/PI-),

espermatozoides em apoptose (AN+/PI-), espermatozoides

em início de necrose (AN+/PI+) e espermatozoides em

necrose (AN-/PI+), mantidos em SOF (controle) ou em

extrato de incubação de T.foetus nos momentos 0, 1, 2 e 3

horas.......................................................................................

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Análise da expressão gênica de CP8 de T. foetus,

correspondendo a uma banda de 456pb (a) e da

expressão gênica de CP8 durante a interação T.foetus-

espermatozoide (b), nos momentos 0 (h0), 1 (h1), 2 (h2) e

3 (h3) horas..........................................................................

Figura 2 - Histogramas obtidos pela análise da citometria de fluxo

dos espermatozoides mantidos em SOF (controle), nos

momentos 0 (I) e 3 horas (II) ou no extrato de incubação

de T. foetus nos momentos 0 (III) e 3 horas (IV). (a)

Espermatozoides viáveis (AN-/PI-). (b) Espermatozoides

em apoptose (AN+/PI). (c) Espermatozoides em início de

necrose (AN+/PI+). (d) Espermatozoide em necrose (AN-

/PI+). Observe que há uma maior população de

espermatozoides em apoptose após três horas de

manutenção, no extrato de incubação de T. foetus (IV).....

vii

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS

°C - Graus Centígrado

- Dióxido de carbono

DNA - Ácido desoxirribonucleico

cDNA - DNA complementar

g - Gravidade

HeLa - Células do carcinoma cervical humano

kDa - Kilo Dalton

MDCK - Células do rim de cão

mL - Milílitro

µL - Microlitro

pb - Pares de Base

% - Percentual

pmol - Picomolar

RNA - Ácido ribonucleico

RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa

SOF - Meio sintético de fluido de oviduto

SYBR - Corante fluorescente

TYM - Trypticase Yest Medium

UV - Ultravioleta

viii

SUMÁRIO

Página

RESUMO...............................................................................................

ABSTRACT.............................................................................................

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................

2 REVISÃO DA LITERATURA...............................................................

2.1 Tricomoníase bovina....................................................................

2.2 Tritrichomonas foetus...................................................................

2.3 Interação de T. foetus com as células do hospedeiro..................

2.3.1 Fatores de virulência.............................................................

2.3.1.1 Cisteínas peptidases de T. foetus......................................

2.4 Espermatozoides..........................................................................

3 OBJETIVOS.........................................................................................

4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................

4.1 Tritrichomonas foetus...................................................................

4.2 Extrato da incubação de T. foetus................................................

4.3 Espermatozoides..........................................................................

4.4.Desenho experimental.................................................................

4.5 Análise da expressão de CP8 de T. foetus durante a interação

com espermatozoides bovinos.......................................................

4.5.1 Extração do RNA...................................................................

4.5.2. RT-PCR................................................................................

4.6 Avaliação da motilidade espermática ..........................................

4.7 Avaliação da viabilidade espermática pela técnica de citometria

de fluxo.........................................................................................

4.8 Análise estatística........................................................................

5 RESULTADOS...................................................................................

5.1 Espermatozoides bovinos aderem a T. foetus............................

5.2 T. foetus expressa o gene para CP8 durante interação com

espermatozoides..........................................................................

5.3 A motilidade progressiva espermática foi alterada por produtos

extracelulares secretados por T. foetus.....................................

5.4 Viabilidade espermática após manutenção em extrato da

incubação de T. foetus...............................................................

6 DISCUSSÂO........................................................................................

7 CONCLUSÕES....................................................................................

8 BIBLIOGRAFIA....................................................................................

9 TRABALHO CIENTÍFICO....................................................................

RIBEIRO, C.M. Estudo da interação “in vitro” entre Tritrichomonas foetus

e espermatozoides bovinos. Botucatu, 2008. 85p. Tese (Doutorado) –

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,

Universidade Estadual Paulista.

RESUMO

Tritrichomonas foetus é o agente etiológico da tricomoníase bovina,

enfermidade infecto-contagiosa de transmissão venérea que causa

abortamento e infertilidade nestes animais. No touro, a infecção se estabelece

na superfície epitelial do pênis e do prepúcio. Entretanto, são escassas as

informações da susceptibilidade dos espermatozoides bovinos a este parasita.

A proposta deste trabalho foi estudar, in vitro, a interação entre T. foetus e

espermatozoides bovinos, bem como avaliar o efeito dos produtos

extracelulares secretados pelo parasita sobre espermatozoides bovinos. Com

esse objetivo, foi utilizado sêmen comercial criopreservado de cinco touros

férteis (Bos taurus taurus, raça holandesa). Os espermatozoides foram

selecionados pela técnica do gradiente de percoll. Posteriormente, foram

mantidos por três horas com T. foetus ou com o extrato da cultura de T. foetus,

contendo produtos extracelulares secretados pelo parasita. Nos momentos 0,

1, 2 e 3 horas de manutenção, foram analisadas a motilidade espermática

progressiva e a viabilidade espermática. Os resultados foram avaliados pela

técnica da análise de variância não-paramétrica complementada com o teste

de comparações múltiplas de Dunn. Observou-se que T. foetus adere a

espermatozoides bovinos e expressa o seu gene para cisteína peptidase. Os

produtos extracelulares secretados pelo T. foetus foram citotóxicos para os

espermatozoides, causando a diminuição da motilidade espermática

progressiva, embora não tenham ocasionado significante diminuição da

viabilidade espermática.

Palavras-chave: Apoptose; Motilidade espermática; Tritrichomonas foetus.

RIBEIRO, C.M. Study of “in vitro” interaction between Tritrichomonas

foetus and bovine spermatozoa. Botucatu, 2008. 85p. Tese (Doutorado) –

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,

Universidade Estadual Paulista.

ABSTRACTS

Tritrichomonas foetus is the etiologic agent of bovine trichomoniasis, a

contagious infectious disease of venereal transmission, which causes abortion

and infertility in cattle. In bulls, the infection starts in the epithelial surface of the

penis and prepuce. However, there is scarce information on bovine sperm

susceptibility to such parasite. Thus, the aim of this work was to study, in vitro,

the interaction between T. foetus and bovine sperm cells, as well as to evaluate

the effect of extracellular products secreted by the parasite on these cells.

Cryopreserved commercial semen was obtained from five fertile bulls (Bos

taurus taurus, Holstein). Spermatozoa were selected through the Percoll

gradient technique and kept for three hours with T. foetus or T. foetus culture

extract containing extracellular products secreted by the parasite. At 0, 1, 2 and

3 h, the progressive motility and the viability of spermatozoa were assessed.

Results were evaluated through non-parametric analysis of variance

complemented with Dunn’s test for multiple comparison. T. foetus adhered to

the bovine spermatozoa, expressing its gene for cysteine peptidase. The

extracellular products secreted by T. foetus were cytotoxic to the spermatozoa,

decreasing their progressive motility although viability was not significantly

decreased.

Keywords: Apoptosis; Sperm motility; Tritrichomonas foetus.

1 INTRODUÇÃO

Tritrichomonas foetus, protozoário parasita, é encontrado na superfície

da mucosa urogenital dos bovinos, causando a tricomoníase bovina. Esta

enfermidade causa prejuízos econômicos pelos efeitos diretos sobre a

performance reprodutiva e, consequentemente, sobre a produtividade dos

rebanhos infectados (ANDERSON et al., 1996; BONDURANT, 1997). Os

sintomas clínicos da tricomoníase nas fêmeas incluem infertilidade, vaginite,

piometra, morte embrionária, abortamento e infertilidade (PARSONSON et al.,

1976; RHYAN, 1988).

No touro, T foetus aloja-se preferencialmente na mucosa do pênis e do

prepúcio, onde estabelece uma infecção crônica e assintomática

(PARSONSON et al., 1974; RHYAN et al., 1999). A transmissão ocorre

principalmente durante o coito de um touro infectado assintomático com uma

fêmea susceptível (BONDURANT, 1997; MARDONES et al., 2008), porém, a

transmissão mecânica iatrogênica do parasita pode ocorrer mediante

instrumentos ginecológicos (YULE et al., 1989; RAE et al., 2004). Além disso,

tem-se sugerido que T. foetus pode sobreviver em sêmen fresco e

criopreservado e ser transmitido pela inseminação artificial (BARTLETT et al.,

1947). Este evento pode ser considerado uma via em potencial para a

introdução do parasita no processo da fertilização in vitro. Em um estudo

preliminar, relatou-se que T. foetus não impediu o processo de fertilização in

vitro e o desenvolvimento de embriões bovinos (BIELANSKI et al., 2004).

Entretanto, foi exposto que T. foetus pode aderir e provocar danos a

células reprodutivas bovinas in vitro. O parasita foi capaz de aderir aos

espermatozoides bovinos e, após duas horas de interação, foram observadas

diminuição da motilidade e aglutinação espermática (BENCHIMOL et al., 2008).

A exposição de oócitos ao T. foetus causou uma rápida adesão dos parasitas à

zona pelúcida. Após seis horas de interação, os oócitos exibiram

características morfológicas compatíveis com apoptose (BENCHIMOL et al.,

2007). Porém, T. foetus pode também exercer seus efeitos citopáticos por meio

de fatores de virulência secretados no meio de interação. Foi demonstrado que

as cisteínas peptidases (CPs), que são secretadas pelo parasita, têm um efeito

citopático sobre as células do trato reprodutivo bovino. CP8 obtido do

sobrenadante da cultura de T. foetus induz células epiteliais vaginais e uterinas

bovinas à apoptose (SINGH et al., 2004; SINGH et al., 2005).

A infecção pelo T. foetus pode resultar na infertilidade transitória ou

permanente da fêmea bovina. Tem sido sugerido que esta aparente

infertilidade é em razão da morte embrionária, resultante da infecção pelo

parasita (RHYAN et al., 1988). Entretanto, é possível que T. foetus tenha

efeitos citopáticos sobre os espermatozoides, impedindo, desta maneira, o

processo de fertilização. Por isso, são necessários mais estudos do mecanismo

patogênico deste parasita para melhor compreensão da interação parasita-

hospedeiro.

Este estudo foi proposto no sentido de contribuir para a compreensão da

ação de T. foetus na patogenia da tricomoníase, face à escassez de

informações específicas que tratem deste tema.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Tricomoníase bovina

A tricomoníase bovina é uma doença parasitária, infecto-contagiosa, de

transmissão venérea que acomete os bovinos. É causada pelo protozoário

parasita T. foetus que habita a superfície do epitélio do trato urogenital dos

bovinos (HONIGBERG, 1978).

A tricomoníase bovina apresenta ampla distribuição mundial, ocorrendo

de forma endêmica, principalmente em regiões em que o controle sanitário é

deficiente ou o sistema de produção é extensivo, com utilização de monta

natural (BONDURANT, 1997).

No Brasil, a tricomoníase foi diagnosticada pela primeira vez por Roehe

(1948), que identificou o agente no sêmen de touros doadores de sêmen em

central de inseminação artificial, no município de Montenegro, Rio Grande do

Sul. Estudos posteriores registraram a incidência da tricomoníase bovina nos

estados do Ceará, Paraíba, Pernambuco, Bahia (MELLO, 1954), São Paulo

(RABELLO, 1955), Minas Gerais (MEGALE, 1963; PELLEGRIN e LEITE,

2003), Rio Grande do Sul (GOMES et al., 1991) e Rio de Janeiro (JESUS et al.,

2004).

A transmissão de T. foetus acontece principalmente durante a cópula ou

ainda pela inseminação artificial, já que T. foetus pode sobreviver em sêmen

criopreservado (BIELANSKI et al., 2004)..

Nas fêmeas, o aparelho genital é totalmente colonizado, via vaginal, em

duas semanas após a infecção, sendo o útero inicialmente o principal sítio de

infecção (PELLEGRIN e LEITE, 2003). Os sintomas clínicos da tricomoníase

nas fêmeas incluem infertilidade, vaginite, cervicite, endometrite, piometra,

morte embrionária, repetição de cios a intervalos irregulares, abortamento e

maceração fetal (BONDURANT, 1997).

No touro, os locais preferenciais da infecção são o pênis, o prepúcio e o

orifício da uretra. Logo após a infecção, pode desenvolver-se um corrimento

prepucial associado a pequenos nódulos na membrana prepucial. Depois disto,

não existe qualquer sintomatologia clínica e a libido não é afetada. Desta

maneira, o touro torna-se portador assintomático, podendo disseminar a

doença (PARSONSON et al., 1974; BONDURANT, 1997). Touros com idade

superior a cinco anos são duas vezes mais susceptíveis a T. foetus, uma vez

que com a idade aumenta-se a profundidade das criptas prepuciais, local na

mucosa onde o parasita tem o seu nicho ecológico (RAE et al., 2004).

Alguns autores afirmam que certas raças são mais susceptíveis a T.

foetus. Estudos revelaram que touros Bos taurus taurus têm risco

aproximadamente seis vezes maior de infecção pelo parasita do que Bos

taurus indicus. A maior suscetibilidade do grupo genético Bos taurus taurus

está relacionada, possivelmente, à conformação anatômica do prepúcio dos

touros (RAE et al., 2004; JESUS et al., 2004).

Uma vez que os sinais clínicos não são patognomônicos, é importante

realizar o diagnóstico laboratorial. Este pode ser feito pela pesquisa direta em

microscopia óptica de T. foetus em material fetal (fluidos do feto abortado e

suas membranas fetais), em smegma de prepúcio e pênis de touros e em muco

cervico-vaginal das fêmeas. Para a coleta do material pode ser realizado um

lavado prepucial ou vaginal (BONDURANT, 1997; COBO et al., 2007). Outras

técnicas têm sido empregadas no diagnóstico da tricomoníase bovina, tais

como amplificação por reação em cadeia pela polimerase (PCR) e

imunofluorescência indireta (CORBEIL et al., 2008).

Vários métodos podem ser utilizados para o controle da tricomoníase em

rebanhos, como descarte periódico de touros acima de 5-6 anos; pesquisa do

protozoário nos touros duas semanas antes da estação de monta e após o seu

término; repouso sexual das fêmeas por, no mínimo, três ciclos consecutivos;

descarte de todos os touros positivos e das fêmeas que falharem na

concepção, abortarem ou apresentarem piometra, assim como as que forem

comprovadamente positivas; e o não-aproveitamento de touros utilizados em

parcerias (PELLEGRIN e LEITE, 2003).

2. 2 Tritrichomonas foetus

Segundo a classificação feita por Honigberg (1963), T. foetus pertence à

família Trichomonadidae, ordem Trichomonadida, classe Zoomastigophora, filo

Sarcomastigophora e reino Protista. Entretanto, uma classificação filogenética

mais recente dos protozoários baseada na organização microtubular do

citoesqueleto classifica T. foetus como pertencente à classe Parabasalia, filo

Metamonada e reino Protista (DACKS et al., 2008).

T. foetus, Tritrichomonas suis (parasita do tubo digestivo e cavidade

nasal de suínos) e Tritrichomonas mobilensis (parasita do tubo digestivo de

macacos, principalmente ceco e cólon) foram considerados, após análise das

sequências gênicas, como prováveis cepas ou variantes de uma mesma

espécie (TACHEZY et al., 2002; KLEINA et al., 2004).

O hospedeiro da espécie T. foetus é o bovino. O parasita localiza-se na

vagina e no útero da fêmea e na cavidade prepucial do macho. No local da

infecção, os parasitas aderem à superfície apical das células epiteliais do

hospedeiro (PARSONSON et al., 1976).

O organismo é piriforme, com aproximadamente 20 x 10µm, possuindo

um único núcleo e quatro flagelos, cada um deles se originando num corpo

basal localizado na extremidade anterior arredondada. Três dos flagelos são

livres anteriormente, enquanto o quarto estende-se para trás, formando uma

membrana ondulante ao longo do comprimento do organismo, continuando,

posteriormente, como flagelo livre. Um dos principais mecanismos de nutrição

de T. foetus é pela endocitose. A reprodução de T.foetus é assexuada por

divisão binária. Em preparações frescas, o organismo é móvel, avançando por

meio de movimentos espasmódicos giratórios; os flagelos vibráteis e os

movimentos da membrana ondulante são facilmente observados. Às vezes

observam-se formas imóveis, arredondadas, provavelmente degenerativas

(URQUHART et al., 1998).

T. foetus apresenta geralmente forma de trofozoita, embora possa

apresentar também forma de pseudocisto, que não tem motilidade em virtude

da internalização dos flagelos. A transformação do parasita na forma trofozoíta

para pseudocisto pode ocorrer quando o parasita encontra-se em situações de

estresse ou em decorrência da oscilação da temperatura (MARIANTE et al.,

2004).

2. 3 Interação de T. foetus com as células do hospedeiro

Para entender melhor a patogenia da tricomoníase bovina, é importante

conhecer o processo de interação de T. foetus com as células do hospedeiro.

Sabe-se que os tricomonadídeos aderem às superfícies inertes

(CAPPUCCINELLI e VARESIO, 1975), bem como a células mamíferas

(ROCHA-AZEVEDO et al., 2005). A adesão de T. foetus a matriz extracelular e

a células epiteliais é um processo essencial para a manutenção do parasita no

hospedeiro (PETRÓPOLIS et al., 2008). Silva Filho e De Souza (1988)

observaram que T. foetus adere às células do rim de cão (MDCK). Rocha-

Azevedo et al. (2005) observaram que o parasita adere às células do

carcinoma cervical humano (HeLa). Além disso, T. foetus adere fortemente a

eritrócitos (DA SILVA et al., 1996). Estes protozoários interagem com as

células do sistema imunológico como macrófagos e eosinófilos; porém, T.

foetus é fagocitado por estas células (DE AZEVEDO et al., 1991; DE

AZEVEDO e DE SOUZA, 1996).

Receptores para a laminina estão localizados em toda a superfície do

parasita, inclusive em seu flagelo recorrente e têm papel fundamental no

processo de adesão (SILVA FILHO et al., 1988). Petrópolis et al. (2008)

demonstraram que T. foetus adere fortemente às células HeLa, quando o meio

de interação foi suplementado com laminina.

T. foetus exerce seus efeitos citotóxicos pelo contato físico estabelecido

entre as duas superfícies celulares, durante o processo de adesão, pela

liberação de fatores de virulência lançados no meio de interação ou em ambos

os processos (SILVA FILHO e DE SOUZA, 1988; KENNETT e HOOK, 2002).

Segundo Rocha-Azevedo et al. (2005), quanto maior o contato entre o parasita

e a célula do hospedeiro, maior a indução da secreção de fatores de virulência

pelo parasita.

Singh et al. (1999) observaram que, in vitro, T. foetus adere a células

epiteliais vaginais bovinas e causa ruptura severa desta monocamada celular

após 48 horas de interação. Quando retirados os parasitas, a monocamada

celular restabeleceu-se. Este resultado sugere que o efeito citotóxico de T.

foetus é dependente de contato.

O mecanismo pelo qual o protozoário exerce sua citotoxicidade, isto é,

se é dependente ou independente de contato, pode variar entre os subtipos do

parasita. Rocha-Azevedo et al. (2005) analisaram a interação de células HeLa

e parasitas da cepa K, subtipos K1, K2, K3, K4 e K5. Os autores observaram

que diferentes subtipos de T. foetus apresentaram diferentes graus de

citotoxicidade, sendo os subtipos K1 e K5 os mais citotóxicos, pois destruíram

a monocamada celular. Entretanto, o sobrenadante da cultura de T. foetus

subtipo K2 continha uma peptidase, secretada pelo parasita, com alta atividade

proteolítica capaz de destruir a monocamada de células HeLa.

Estudos foram relatados sobre a interação de T. foetus e as células do

hospedeiro bovino, facilitando a compreensão da patogenia da tricomoníase.

Em um deles, Benchimol et al. (2006) isolaram ovidutos de fêmeas bovinas e

inocularam T. foetus na porção do istmo. Após o período de interação, os

ovidutos foram abertos e fixados para análise em microscopia eletrônica. Como

resultado, constatou-se que T. foetus adere a células epiteliais não-ciliadas do

oviduto. Evidências morfológicas de apoptose celular foram observadas nessas

células, como condensação da cromatina e vacuolização do citoplasma.

Em outro relato, oócitos de fêmeas bovinas foram colhidos e, em alguns

deles, as células do complexo cumulus-oócito foram removidas; em outros,

estas células foram mantidas. Os oócitos foram incubados com diferentes

concentrações de T. foetus. Os parasitas aderiram aos oócitos após uma hora

de interação e foram capazes de atravessar a zona pelúcida e deslocá-la,

formando um grande espaço entre as células do cumulus e a zona pelúcida.

Mudanças morfológicas das células do cumulus foram visualizadas pela

microscopia eletrônica de transmissão, como condensação da cromatina e

intensa vacuolização do citoplasma, alterações estas compatíveis com

apoptose (BENCHIMOL et al., 2007).

Exposição de embriões bovinos ao protozoário T. foetus resultou na

aderência de muitos parasitas à zona pelúcida destes embriões. Alguns

parasitas causaram fenestras na zona pelúcida pela ação de seus flagelos;

porém, o parasita não conseguiu interferir no desenvolvimento embrionário. Os

autores concluíram que T. foetus pode não afetar o processo de fertilização e o

desenvolvimento embrionário (BIELANSKI et al., 2004).

2. 3.1 Fatores de virulência

A citotoxicidade de T. foetus está diretamente relacionada aos seus

fatores de virulência. Este protozoário produz uma variedade de fatores de

virulência que incluem proteases intracelulares e extracelulares importantes na

invasão e na degradação dos tecidos do hospedeiro (KENNET e HOOK, 2002).

T. foetus sintetiza adesinas que são fatores de virulência. Alguns autores

sugerem que os lipofosfoglicanos presentes na superfície da membrana de T.

foetus são adesinas de superfície (SHAIA et al., 1998) e permitem ao parasita

aderir às células (DA SILVA et al., 1999). Entretanto, a expressão das adesinas

pode variar entre as diferentes linhagens do protozoário (SHAIA et al., 1998).

Fatores de virulência, como as neuraminidases, estão presentes na

membrana plasmática do protozoário (DIAS FILHO et al., 1999) e podem ser

secretadas no meio de interação, sendo capazes de degradar o ácido siálico da

superfície de eritrócitos (SILVA FILHO et al., 1989).

T. foetus também libera, no meio de interação, hemolisinas capazes de

causar a lise de eritrócitos bovinos (BURGESS et al., 1990) e hemaglutininas

aptas a aglutinar estes eritrócitos (KENNET e HOOK, 2002).

Além destes fatores de virulência, o parasita também secreta cisteínas

peptidases (CPs) que estão associadas à citotoxicidade exercida sobre as

células do hospedeiro (SINGH et al., 2005).

2. 3. 1.1 Cisteínas peptidases de T. foetus

T. foetus possui, pelo menos, 10 cisteínas peptidases com massa

molecular entre 18 e 120 kDa (LOCKWOOD et al., 1987), as quais podem ser

secretadas pelo parasita no meio de interação (THOMFORD et al., 1996;

KENNETT e HOOK, 2002). Elas são semelhantes à catepsina L e à catepsina

B, apresentam, respectivamente, atividade endopeptidase e carboxipeptidase e

são ativas sob o pH ácido dos lisossomos (MALLINSON et al., 1995).

Estas peptidases são codificadas por, no mínimo, sete genes. O gene

correspondente a CP8 é o mais transcrito em T. foetus e codifica uma proteína

de 30 kDa (MALLINSON et al., 1995; Singh et al., 2004). Pela análise da

sequência de aminoácidos, constatou-se que CP8 é um membro da família da

catepsina L (LUCAS et al., 2008).

Várias funções biológicas são propostas para as cisteínas peptidases de

tricomonandídeos, incluindo evasão da resposta imunológica e aquisição de

nutrientes (KUMMER et al., 2008). Além disso, são capazes de degradar

fibronectina, fibrinogênio, lactoferrina, albumina, imunoglobulinas do tipo G

A e

M (TALBOT et al., 1991) e o componente C3 do sistema complemento (KANIA

et al., 2001).

Descrições de citotoxicidade relacionada à atividade de CP8 de T. foetus

foram relatadas. Singh et al. (2004) demonstraram que T. foetus ou CP8,

secretada por esse parasita e presente no sobrenadante da cultura, induz

células epiteliais vaginais bovinas à apoptose. A citotoxicidade dependeu da

concentração de parasitas ou de CP8. Em outro relato, Singh et al. (2005)

observaram que CP8, presente no sobrenadante da cultura de T. foetus, induz

células epiteliais uterinas bovinas à apoptose. A citotoxicidade também

dependeu do tempo de incubação e da concentração de CP8.

2.4 Espermatozoides

Os espermatozoides originam-se nos testículos a partir de células

primordiais da linhagem espermatogênica localizadas nos túbulos seminíferos,

num processo denominado espermatogênese. Do ponto de vista biológico, os

espermatozoides cumprem suas funções por meio da cauda (motilidade),

acrossoma (atividade enzimática preparatória da fecundação) e núcleo

(transmissão do patrimônio genético) (MIES FILHO, 1987). Para serem férteis,

os espermatozoides devem apresentar pelo menos quatro atributos básicos,

tais como: metabolismo para a produção de energia, motilidade progressiva,

enzimas acrossomais intactas e membrana plasmática intacta (AMANN e

PICKET, 1987).

A motilidade espermática representa a percentagem de

espermatozoides com movimentos progressivos. A motilidade é essencial para

o transporte dos espermatozoides pelo trato reprodutivo da fêmea e para a

penetração do espermatozoide no oócito, durante a fertilização, sendo ela uma

das características mais importantes do espermatozoide associada à

habilidade de fertilizar, e uma expressão da viabilidade e da integridade

estrutural do espermatozoide (DONNELLY et al., 1998).

A integridade da membrana plasmática espermática parece exercer

papel crítico na sobrevivência do espermatozoide no trato genital da fêmea e é

pré-requisito importante para o sucesso da fertilização (CROSS e HANKS,

1991). Entretanto, é uma das principais estruturas afetadas pela

criopreservação (ANZAR et al., 2002). No início da fase de distúrbio da

membrana, ocorre inicialmente uma assimetria dos fosfolipídios da membrana,

ou seja, a translocação da fostatidilserina da parte interna para a externa da

membrana, sem que ocorra a ruptura desta, e nesta fase o espermatozoide

sofre a apoptose (VERMES et al., 1995; MARTIN et al., 1995). Em um estágio

posterior, os espermatozóides, já em necrose, perdem a integridade da

membrana plasmática. Espermatozoides em necrose não apresentam

motilidade, já que são células mortas. È importante citar que a percentagem de

espermatozoides vivos e viáveis no sêmen está relacionada à fertilidade

(JANUSKAUSKAS et al., 2003).

Está documentado que microrganismos patogênicos presentes no trato

urogenital de homens e animais machos são uma importante causa de

infertilidade. Muitos desses microrganismos influenciam a motilidade e a

viabilidade espermática. A diminuição da motilidade espermática pode estar

associada a metabólitos citotóxicos e/ou fatores de virulência, liberados pelos

microrganismos presentes no trato urogenital (SYLLA et al., 2005). Em um

estudo, Liu et al. (2002) observaram que Staphylococcus aureus não adere a

espermatozoides de homens, nem induz mudanças morfológicas ou

aglutinação espermática; entretanto, este microrganismo diminui

significantemente a motilidade espermática após quatro horas de incubação

com os espermatozoides. Em bovinos, Mycoplasma mycoides ssp. mycoides

diminuiu a motilidade espermática, porque esse microrganismo desestabiliza a

organização dos microtúbulos do axonema desses espermatozoides (SYLLA et

al., 2005).

Tuttle et al. (1977) incubaram Trichomonas vaginalis, oriundo de

mulheres com tricomoníase, em diferentes concentrações com

espermatozoides de homens não-infectados. A análise dos espermatozoides

foi feita por microscopia óptica, e os autores observaram a diminuição da

motilidade espermática, que foi dependente da concentração de parasitas e do

tempo de incubação. Não houve aglutinação destes espermatozoides após a

interação com o parasita.

Em um único estudo com T. foetus e espermatozoides bovinos

criopreservados, foi observado que os parasitas aderiram aos espermatozoides

e, após duas horas de incubação, houve intensa aglutinação espermática e

morte de espermatozoides (BENCHIMOL et al., 2008).

3 OBJETIVOS

A proposta deste trabalho é estudar os efeitos de interação entre T.

foetus e espermatozoides bovinos sobre a expressão gênica da cisteína

peptidase (CP8) de T. foetus e análise do efeito direto do extrato da incubação

do parasita sobre a motilidade e a viabilidade espermáticas de sêmen bovino

criopresevado.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Tritrichomonas foetus

T. foetus cepa K (SILVA FILHO et al., 1986) foi mantido em meio TYM

Diamond’s (DIAMOND, 1957), suplementado com 10% de soro fetal bovino

(Nutricell – Nutrientes celulares, Campinas, SP - Brasil), a 37°C com 5% CO

, e

cultivado a cada 24 horas no Laboratório de Diagnóstico Molecular,

Departamento de Microbiologia e Imunologia - Instituto de Biociências (UNESP,

Botucatu, Brasil). Para o experimento, T. foetus foi colhido na fase log de

crescimento, centrifugado a 900 X g por 15 minutos em meio TYM Diamond’s

sem soro e depois suspendido em meio sintético de fluido de oviduto (SOF)

(Nutricell – Nutrientes celulares, Campinas, SP - Brasil) (HOLM et al., 1999). O

número de T. foetus foi padronizado a 1x10

parasitas/mL.

4.2 Extrato da incubação de T. foetus

Após a incubação de 1x10

T. foetus/mL em meio SOF por três horas a

37°C, obteve o sobrenadante por centrifugação a 400 X g por 10 minutos, o

qual foi filtrado em membrana com poro de 0,22 µm estéril.

4.3 Espermatozoides

Para o experimento, foram utilizados semens criopreservados de cinco

touros (Bos taurus taurus, raça holandesa) com fertilidade comprovada em

programas comerciais de inseminação artificial. Todas as amostras (20

palhetas de 250 µL) eram da mesma partida comercial. O descongelamento

dos semens foi feito em banho-maria a 40°C por 20 segundos. Em seguida, os

espermatozoides foram selecionados pela técnica de centrifugação em

gradiente de percoll como descrito por Gorus e Pipeleers (1981), a qual

consistiu em adicionar as amostras de sêmen sobre a preparação do gradiente

contendo 1 mL de percoll a 90% (Nutricell – Nutrientes celulares, Campinas,

SP – Brasil) e 1 mL de percoll a 45% (Nutricell – Nutrientes celulares,

Campinas, SP – Brasil). Após a centrifugação a 900 X g por 30 minutos, o

pellet contendo os espermatozoides foi ressuspendido em 3 mL de meio X-

Cell

(IMV Technologies, USA) e centrifugado a 400 X g por cinco minutos. Em

seguida, após a remoção do sobrenadante, aos espermatozoides do pellet

foram adicionados 200 µL de meio SOF. Para a constatação das interações

dos espermatozoides ou do extrato de cultura de protozoário, o número de

espermatozoides foi padronizado a 1x10

espermatozoides/mL. Os

procedimentos experimentais foram realizados separadamente para cada

touro.

4.4 Desenho experimental

Para a análise da interação de T. foetus com os espermatozoides, por

meio da expressão de CP8 de T. foetus, os parasitas a uma concentração de

1x10

/mL foram adicionados em 1 mL de meio SOF, contendo 1x10

espermatozoides/mL, e incubados por até três horas a 37°C com 5% de CO

Para a análise do efeito direto do extrato da cultura do parasita sobre a

motilidade e viabilidade espermática, 1x10

espermatozoides/mL foram

suspendidos em 1 mL do extrato da cultura de T. foetus ou 1 mL do meio SOF

(controle) por até três horas a 37°C.

4.5 Análise da expressão de CP8 de T. foetus durante a interação com

espermatozoides bovinos

A análise da expressão gênica da cisteína peptidase de T. foetus

(número de acesso X87781) foi realizada pela PCR, após transcrição reversa

(RT-PCR) das amostras nos momentos 0, 1, 2 e 3 horas de incubação. Esses

procedimentos foram realizados no Laboratório de Diagnóstico Molecular,

Departamento de Microbiologia e Imunologia - Instituto de Biociências (UNESP,

Botucatu, Brasil).

4.5.1 Extração do RNA

Para a extração do RNA de T. foetus foi utilizado o Total RNA

Purification Kit (Norgen Biotek Corparation, USA) conforme protocolo

recomendado pelo fabricante. Ambas, concentração e pureza do RNA, foram

monitoradas por um espectrofotômetro (Thermo Scientific NanoDrop

1000

Spectrophotometer; NanoDrop, USA). Em seguida, as amostras de RNA foram

tratadas com RQ1 RNase-Free DNase Kit (Promega, USA).

4.5.2 RT-PCR

A síntese do cDNA foi realizada com a enzima ImProm-II™Reverse

Transcriptase (Promega, USA) conforme protocolo recomendado pelo

fabricante. Para a amplificação do cDNA pela PCR foram empregados o

forward primer (5'– TCT CAG CTA TCC AAG CTG CCG AAT) e o reverse

primer (5'– TGG TTG AAC CTT CAG CAC CGA AAC) que amplificam um

produto de 456 pb da região de CP8 de T. foetus. Os primers foram

desenhados pelo programa PrimerQuest (www.idtdna.com.). A reação foi

desenvolvida para um volume final de 25 µL, utilizando o kit Go Taq Green

Master Mix (Promega, USA) com a adição de 4 µL de cDNA por reação e

10pmol de cada primer. A amplificação foi feita pelo termociclador Eppendorf

Mastercycler Gradient (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) e as

condições da reação foram: 94 °C / 5 minutos, 40 ciclos de 94 °C / 1 minuto, 60

°C / 1 minuto e 72 °C /1 minuto seguidos 72 °C / 5 minutos. Após visualização

em gel de agarose corado com SYBR Safe dye (Invitrogen, USA) sob

transiluminador UV, foram consideradas positivas as amostras com banda de

456 pb. Como controle positivo, foi utilizada uma amostra de DNA extraída de

T. foetus e, como controle negativo, foi utilizada água ultrapura estéril.

4.6 Avaliação da motilidade espermática

Para a análise da motilidade progressiva (%) durante a incubação com o

extrato da cultura do parasita ou em meio SOF foi usado Computer-Assisted

Sêmen Analysis – CASA modelo IVOS-12 – Hamilton Thorne Biosciences (IMV

Technologies, USA), adequadamente padronizado com o set-up para sêmen

bovino, no Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária –

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (UNESP, Botucatu, Brasil). As

análises foram realizadas a partir de alíquotas de 5 µL de sêmen incubado nos

diferentes tempos, transferidas a Makler counting Chamber (Sefi-medical

Instruments, Haifa, Israel). Objetos incorretamente identificados como

espermatozoides eram desconsiderados na análise. Nos momentos 0, 1, 2, e 3

horas de incubação dos espermatozoides no sobrenadante ou no meio SOF

(controle) foi avaliada a motilidade espermática progressiva dos

espermatozoides. O resultado foi expresso em percentagem.

4.7 Avaliação da viabilidade espermática pela técnica de citometria de

fluxo

Com 0, 1, 2 e 3 horas de incubação dos espermatozoides no extrato da

cultura do parasita ou em meio SOF (controle), a viabilidade espermática foi

analisada pela técnica da citometria de fluxo com Annexin V-FITC Apoptosis

Detection Kit I (BD Pharmingen, USA) no Laboratório de Citometria de Fluxo,

Hemocentro – Faculdade de Medicina (UNESP, Botucatu, Brasil). Para isso,

espermatozoides (1x10

espermatozoides/mL) foram adicionados em tubos

para citometria de fluxo contendo 200 µL do tampão de ligação fornecido pelo

kit. Em seguida, os espermatozoides foram centrifugados a 900 X g por 15

minutos. Posteriormente, em cada tubo foram adicionados 5 µL de anexina V-

FITC (AN) e 5 µL de iodeto de propídio (IP). Os tubos contendo os

espermatozoides foram agitados e incubados por 15 minutos no escuro. Em

seguida, 400 µL do tampão de ligação foram adicionados em cada tubo e as

amostras analisadas pelo aparelho FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Jose,

CA, USA). A população de espermatozoides foi delimitada mediante

histograma bidimensional dos parâmetros FSC (forward light scatter), o qual

confere informações sobre o tamanho celular, versus SSC (side light scatter)

que emite informações sobre a granulosidade celular interna. Desta maneira,

restringiu-se somente à análise dos espermatozoides. Foi padronizada a

aquisição de dez mil eventos dentro da população de espermatozoides. Para

os espermatozoides selecionados dentro da população de interesse, a

percentagem foi definida nos quadrantes: espermatozoides viáveis (AN-/PI-),

espermatozoides em apoptose (AN+/PI-), espermatozoides em início de

necrose (AN+/PI+), espermatozoides em necrose (AN-/PI+) (ANZAR et al.,

2002).

4.8 Análise estatística

Foi utilizada a técnica da análise de variância não-paramétrica para o

modelo com dois fatores, complementada com o teste de comparações

múltiplas de Dunn (ZAR, 1999). Todas as comparações foram realizadas no

nível de 5% de significância.

5 RESULTADOS

5.1 Espermatozoides bovinos aderem a T. foetus

Aos 30 minutos de manutenção da mistura de 1x10

espermatozoides/mL selecionados por centrifugação em gradiente de percoll

com 1x10

/mL de T. foetus em meio SOF a 37°C com 5% de CO

observou-se

que os espermatozoides bovinos aderiram, pela cabeça e cauda, ao corpo

celular do T. foetus, demonstrando haver uma interação entre ambos.

5.2 T. foetus expressa o gene para CP8 durante interação com

espermatozoides

A expressão do gene para CP8 de T. foetus foi avaliada nos momentos

0, 1, 2, e 3 horas de incubação do parasita em meio SOF (controle) ou em meio

SOF, contendo espermatozoides bovinos. Como resultado, demonstrou-se que

o gene para CP8 é continuamente expresso por T. foetus incubado em meio

SOF, independente da presença dos espermatozoides (Figura 1).

5.3 A motilidade progressiva espermática foi alterada por produtos

extracelulares secretados por T. foetus

O resultado da análise da motilidade espermática progressiva pelo

sistema CASA é visualizado na tabela 1. Observou-se não haver diminuição da

motilidade progressiva dos espermatozoides mantidos no meio SOF (controle)

durante as três horas de experimento. Entretanto, os espermatozoides

mantidos no extrato da incubação de T. foetus apresentaram diminuição da

motilidade progressiva após uma hora. A percentagem de espermatozoides

com motilidade progressiva após três horas foi menor no grupo do extrato da

incubação que a do grupo controle.

h0 h1 h2 h3

456 bp Æ

h0 h1 h2 h3

456 bp Æ

FIGURA 1: Análise da expressão gênica de CP8 de T. foetus, correspondendo

a uma banda de 456pb (a) e da expressão gênica de CP8 durante a interação

T.foetus-espermatozoide (b), nos momentos 0 (h0), 1 (h1), 2 (h2) e 3 (h3)

horas.

TABELA 1: Percentagem de espermatozoides móveis, analisada pelo sistema CASA,

durante manutenção no meio SOF (controle) ou no extrato de incubação de T. foetus

nos momentos 0,1, 2 e 3 horas.

Tempo de manutenção (horas)

Grupo

SOF(controle)

(n=5)

65,0

(50,0-86,0)*

63,0

(58,0-67,0)

60,0

(42,0-64,0)

50,0

(38,0-57,0)

Extrato

(n=5)

67,0

(50,0-80,0)

42,0

(20,0-54,0)

38,0

bAB

(23,0-42,0)

20,0

(17,0-33,0)

Valores com diferentes letras minúsculas na mesma coluna ou com diferentes letras

maiúsculas na mesma linha diferem significativamente (P> 0.05).

SOF: meio sintético de fluido de oviduto

( )* limite (mín–máx)

5.4 Viabilidade espermática após manutenção em extrato da incubação de

T. foetus

Os resultados da análise da viabilidade espermática obtidos em

citometria de fluxo com annexin V-FITC (AN) e iodeto de propídio (PI) durante a

manutenção em extrato da incubação do parasita ou em meio SOF estão

sumarizados na tabela 2. Após três horas de manutenção, a percentagem de

espermatozoides viáveis (AN

/PI

) diminuiu em ambos os grupos avaliados. A

partir das duas horas, a percentagem de espermatozoides viáveis no extrato da

incubação de T. foetus foi maior do que no grupo controle.

Em todos os tempos de manutenção e para ambos os grupos, foi

observada percentagem reduzida de células anexina-V FITC positivas

(AN+/PI

), indicando haver poucos espermatozoides em apoptose. O sêmen de

um touro em particular apresentou um aumento da percentagem de células em

apoptose (10,6%) após três horas de manutenção no extrato da incubação de

T. foetus; entretanto, isso não foi suficiente para causar diferença significativa

entre os grupos estudados que apresentaram diferença apenas no momento

inicial (Figura 2). Os espermatozoides mantidos no extrato da incubação de T.

foetus apresentaram maior percentagem de espermatozoides em apoptose no

final do experimento em relação ao momento inicial.

A maioria das células anexina-V FITC positivas foi também iodeto de

propídio positivas (AN+/PI+). Estas células eram espermatozoides em início de

necrose com membranas plasmáticas comprometidas. A percentagem de

espermatozoides em início de necrose não foi significantemente diferente entre

os grupos, em nenhum dos momentos do experimento, e ambos os grupos

tiveram elevação de espermatozoides desta classe no momento final em

relação ao inicial.

Foi observado um aumento do número de espermatozoides em necrose

(AN

/PI+) durante o período experimental em ambos os grupos, o que

corresponde a um decréscimo na viabilidade espermática ao longo do período

de manutenção.

TABELA 2: Percentagem de espermatozoides viáveis (AN-/PI-), espermatozoides em

apoptose (AN+/PI-), espermatozoides em início de necrose (AN+/PI+) e

espermatozoides em necrose (AN-/PI+), mantidos em SOF (controle) ou em extrato de

incubação de T.foetus nos momentos 0, 1, 2 e 3 horas.

Tempo de manutenção (horas)

Espermatozoides Grupo

0 1 2 3

SOF(controle)

(n=5)

64,8

(47,1-73,5)*

52,6

(41,1-54,8)

38,1

bAB

(34,5-49,5)

28,1

(21,0-34,8)

AN-/PI-

Extrato

(n=5)

69,4

(60,4-74,2)

66,0

(52,6-64,3)

51,4

aAB

(49,7-52,6)

33,2

(32,8-46,9)

SOF(controle)

(n=5)

0,69

(0,47-1,68)

1,01

(0,44-1,08)

0,49

(0,19-0,93)

0,67

(0,60-1,26)

AN+/PI-

Extrato

(n=5)

0,38

(0,15-0,76)

0,57

(0,51-1,43)

0,75

(0,48-1,88)

0,99

(0,53-10,60)

SOF(controle)

(n=5)

28,7

(20,5-44,8)

36,0

(34,7-47,7)

45,1

(38,9-50,5)

55,5

(39,3-62,1)

AN+/PI+

Extrato

(n=5)

24,6

(20,1-33,4)

34,4

(25,9-36,0)

36,2

(32,4-52,6)

45,2

(39,2-51,3)

SOF(controle)

(n=5)

6,1

(5,0-6,5)

10,1

(9,2-12,6)

14,1

(11,4-16,6)

16,2

(15,7-25,0)

AN-/PI+

Extrato

(n=5)

5,6

(4,9-6,1)

9,0

(8,7-12,1)

11,0

(8,6-14,6)

12,7

(6,8-21,1)

Valores com diferentes letras minúsculas na mesma coluna ou com diferentes letras maiúsculas na

mesma linha diferem significativamente (P> 0.05).

SOF: meio sintético de fluido de oviduto

( )* limite (mín–máx)

(I) (II)

d c

b a

Fluorescência PI

Fluorescência anexina-V FITC Fluorescência anexina-V FITC

(III) (IV)

Fluorescência PI

Fluorescência anexina-V FITC Fluorescência anexina-V FITC

FIGURA 2: Histogramas obtidos pela análise da citometria de fluxo dos

espermatozoides mantidos em SOF (controle), nos momentos 0 (I) e 3 horas

(II) ou no extrato de incubação de T. foetus nos momentos 0 (III) e 3 horas

(IV). (a) Espermatozoides viáveis (AN-/PI-). (b) Espermatozoides em apoptose

(AN+/PI). (c) Espermatozoides em início de necrose (AN+/PI+). (d)

Espermatozoide em necrose (AN-/PI+). Observe que há uma maior população

de espermatozoides em apoptose após três horas de manutenção, no extrato

de incubação de T. foetus (IV).

6 DISCUSSÃO

Embora seja bem conhecido e documentado que T. foetus cause

infertilidade em bovinos, são escassos os estudos sobre os mecanismos pelos

quais T. foetus pode provocar infertilidade nesses animais (CLARK et al., 1986;

RHYAN et al., 1988). É provável que a infecção por T. foetus impeça o

processo de fertilização ou interrompa a gestação antes do reconhecimento

materno; porém, muitos destes casos não são notificados.

Os resultados do presente estudo revelados na tabela 1 indicam que,

após duas horas de manutenção dos espermatozoides no extrato da incubação

de T. foetus, os produtos extracelulares secretados por T. foetus causaram

diminuição significativa da motilidade progressiva dos espermatozoides in vitro

em relação ao controle. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por

Benchimol et al. (2007), que observaram uma diminuição da motilidade de

espermatozoides bovinos após duas horas de interação com T. foetus, bem

como com os resultados encontrados por Han et al. (2004), que investigaram in

vitro os efeitos dos metabólitos produzidos pelo T. vaginalis em

espermatozoides humanos, constatando uma diminuição da motilidade

espermática proporcional ao tempo de incubação dos espermatozoides no

sobrenadante da cultura do parasita.

A motilidade é essencial para o transporte dos espermatozoides pelo

trato reprodutivo da fêmea e para a penetração destes no oócito durante a

fertilização (DONNELLY et al., 1998). Kathiravan et al. (2008) encontraram uma

correlação positiva entre a motilidade espermática progressiva e a

percentagem de fertilização. Entretanto, microrganismos patogênicos presentes

no trato urogenital dos bovinos podem causar a diminuição da motilidade

espermática. Sylla et al. (2005) observaram que Mycoplasma mycoides ssp.

mycoides desestabilizou a organização dos microtúbulos do axonema de

espermatozoides bovinos e alterou o mecanismo de transporte destas células,

o que resultou na diminuição da habilidade de fertilização dos espermatozoides

in vitro.

Baseado nos relatos anteriores de que a motilidade espermática é

importante para o processo de fertilização, sugere-se, neste estudo, a hipótese

de que T. foetus possa reduzir a taxa de concepção por interferir na motilidade

espermática. Constatou-se que os produtos extracelulares de T. foetus

causaram diminuição da motilidade espermática e o contato direto dos

espermatozoides com o parasita causou intensa aglutinação, podendo ter

fortes implicações sobre o mecanismo de transporte deste espermático. A

confirmação desta hipótese requer investigações futuras.

Os tricomonandídeos produzem uma variedade de fatores de virulência

que podem ser importantes para a invasão e a destruição do tecido do

hospedeiro, incluindo adesinas (SHAIA et al., 1998), proteases (THOMFORD et

al., 1996), hemaglutininas (NAGAO et al., 2000), hemolisinas (BURGESS et al.,

1990) e cisteína peptidase (MALLINSON et al., 1995). As CPs de T foetus têm

sido observadas na mucosa cervical de novilhas experimentalmente infectadas

com o parasita (BASTIDA-CORCUERA et al., 2000).

Kania et al. (2001) demonstraram que a transcrição do gene para CP8

pode ser detectada por RT-PCR. Os autores observaram que esse gene foi

expresso dentro do útero de fêmeas experimentalmente infectadas por T.

foetus. No presente estudo, após análise da transcrição do gene para CP8 pela

RT-PCR, visualizada na figura 1, sugere-se a hipótese de que os produtos

extracelulares secretados por T. foetus presentes no sobrenadante constituem

fatores de virulência do parasita no meio de interação. Um desses fatores de

virulência pode ser CP8 de T. foetus, já que o parasita expressou

continuamente o gene para essa peptidase, na presença ou na ausência de

espermatozoides bovinos. Entretanto, os efeitos do extrato da incubação de T.

foetus podem não ter sido exclusivamente mediados pelo CP8, podendo estar

presentes diversos outros produtos extracelulares secretados por T. foetus.

Singh et al. (2004) e Singh et al. (2005) demonstraram que CP8 pode

induzir apoptose em culturas de células epiteliais vaginais e uterinas bovinas.

Os autores sugerem que a indução de apoptose, em vez de necrose, pode ser

benéfica para o parasita por limitar a resposta inflamatória, que poderia ser

prejudicial para este

Baseado nestes relatos, este estudo analisou se os produtos

extracelulares secretados pelo T. foetus causariam a perda da viabilidade

espermática e induziriam espermatozóides bovinos a apoptose ou necrose por

meio da técnica da citometria de fluxo com o uso das sondas fluorescentes

anexina-V FITC e iodeto de propídio, que detectam simultaneamente

espermatozoides em apoptose ou necrose.

A anexina-V é uma proteína que tem afinidade para fosfolipídios e,

quando conjugada com o fluorocromo fluorescente isotiocianato (FITC),

apresenta maior afinidade para a fosfatidilserina localizada na parte externa da

membrana do espermatozoide em apoptose, enquanto o iodeto de propídio é

capaz de penetrar no espermatozoide que perdeu a integridade da membrana

(VERMES et al., 1995). A associação destas sondas fluorescentes para a

análise da viabilidade espermática foi descrita por Januskauskas et al. (2003).

Estes autores utilizaram a técnica da citometria de fluxo associada à anexina-V

FITC e ao iodeto de propídio para demonstrarem que sêmen criopreservado de

touros apresenta, após o descongelamento, um aumento do número de

espermatozoides em início de necrose, isto é, células anexina-V FITC e iodeto

de propídio positivas (AN+/IP+).

No presente estudo, considerando-se os resultados da tabela 2, observa-

se que não houve perda significativa da viabilidade espermática após três

horas de manutenção dos espermatozoides com o extrato da incubação de T.

foetus de forma distinta daquela observada no grupo-controle. Esses

resultados diferem dos encontrados por Benchimol et al. (2007), que

demonstraram que, após duas horas de interação de T. foetus com

espermatozoides bovinos, os parasitas causaram perda significativa da

viabilidade dos espermatozoides bovinos (>90%). Entretanto, estes autores

demonstraram os efeitos diretos da interação espermatozoides/parasita, e não

do extrato contendo produtos extracelulares secretados pelo T. foetus como no

presente trabalho.

Essa divergência de resultados pode ser ainda em decorrência dos

diferentes procedimentos utilizados para a preparação dos espermatozoides.

No presente estudo, foi aplicada a técnica do gradiente de percoll para

obtenção de espermatozoides livres do meio diluidor de preservação, para

aqueles com cinética adequada e para aqueles com maior percentual de

membrana plasmática íntegra. Entretanto, Benchimol et al. (2007) estudaram

os efeitos de T. foetus sobre sêmen criopreservado descongelado, sem

utilização de uma técnica de separação espermática e empregaram a técnica

de coloração com eosina/negrosina.

No sêmen criopreservado descongelado, o número de espermatozoides

em apoptose com membrana plasmática íntegra pode aumentar até 30-40%

(ANZAR et al., 2002). Esses espermatozoides podem não ser corados com

eosina; desta maneira, pode-se superestimar a percentagem de

espermatozoides viáveis imediatamente após a descongelação do sêmen.

Os espermatozoides em apoptose representam uma fase transitória

entre os viáveis e os necrosados. Durante a fase inicial de distúrbios da função

da membrana, ocorre uma assimetria dos fosfolipídios, antes da integridade da

membrana a ser perdida (JANUSKAUSKAS et al., 2003). Portanto, os

espermatozoides em apoptose tornam-se necrosados rapidamente após a

incubação a 37°C (ANZAR et al., 2002).

No presente experimento, foi usado o meio SOF para manter os

espermatozoides durante os testes de interação com o extrato da incubação de

T. foetus. No estudo de Benchimol et al. (2007), foi usado o meio de cultura

TCM 199. Martins et al. (2007) observaram que o meio de TCM 199 confere

pouca proteção ao espermatozoide, causando uma alta taxa de danos ao DNA,

com consequente diminuição da viabilidade espermática. Este efeito pode estar

implicado na baixa percentagem de viabilidade espermática após duas horas

de interação com T. foetus, observada por Benchimol et al. (2007).

Pode-se observar, na tabela 2, que não houve diferença significante na

percentagem de espermatozoides em apoptose ou em necrose entre o grupo

de espermatozoides incubados com o extrato da incubação de T. foetus ou em

meio SOF. Entretanto, como visualizado na figura 2, o sêmen de um touro em

particular apresentou um aumento na percentagem de espermatozoides em

apoptose após o período de três horas de incubação com o extrato. É possível

que os espermatozoides deste touro fossem mais susceptíveis aos efeitos dos

produtos extracelulares de T. foetus. Resultados como estes ainda não foram

relatados na literatura consultada e requerem investigações futuras para

elucidar suas implicações.

Neste estudo, constatou-se que T. foetus sobrevive e expressa seu gene

para CP8 na presença ou não de espermatozoides bovinos em meio SOF e,

embora os produtos extracelulares secretados pelo parasita não causem

diminuição da viabilidade espermática, levaram à diminuição da motilidade

espermática progressiva que, aliada à aglutinação espermatozoide/parasita,

pode prejudicar a habilidade de fertilização in vitro dos espermatozoides. Por

hipótese, é possível que este processo ocorra também in vivo, podendo estar

implicado no processo de infertilidade dos bovinos infectados pelo T. foetus.

7 CONCLUSÕES

Nas condições de realização deste estudo, chega-se às seguintes

conclusões:

- T. foetus expressa o gene para cisteína peptidase independentemente

da interação com espermatozoides bovinos.

- Os produtos extracelulares de T. foetus têm efeito citotóxico sobre os

espermatozoides, refletindo em diminuição da motilidade.

- Os produtos extracelulares de T. foetus não têm efeitos citotóxicos

sobre a viabilidade espermática in vitro, após três horas de manutenção.

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should include the hypothesis or objective(s), but should not include a summary

of the findings of the current study.

9) Materials and Methods: must contain enough information to allow a

competent worker to duplicate the study. Materials and equipment should be

named specifically, including the manufacturer/supplier, city, state/province (if

applicable) and country. Descriptions of animals should include species, breed,

sex, and age as well as (if appropriate) husbandry methods, climate,

photoperiod, and geographic location. Experimental methods (including the

experimental design) should be comprehensive and logical. The method of

statistical evaluation must be clearly described (cite the software used). Indicate

treatment and response variables, main effects and interactions, define

experimental units and how they were allocated into groups.

10) Results: should fully describe the outcome, including all information

described as collected in Materials and Methods. The use of tables and figures

is encouraged, especially for data that cannot be easily described in the text.

Emphasize important points in the text, but do not excessively repeat data in

tables and figures. Avoid discussion and interpretation of the data in the Results

section.

11) Discussion: includes principles, relationships, and general truths. First refer

to the outcome of the present study, indicate how it is similar or different to that

previously reported, and discuss your interpretation of the state of knowledge in

the area. Theoretical or practical implications of the work should be discussed,

and suggestions made regarding future studies. Major conclusions and

implications should be stated in a brief, final paragraph.

12) Acknowledgements: cite sources of funds, materials and assistance

13) Figure Legends: should not be excessively long and detailed but should

provide sufficient context that the figure can be interpreted in the absence of the

rest of the paper.

14) All tables should be referred to by consecutive Arabic numerals (e.g., Table

1) in the order in which they are first cited. Avoid excessively large tables and

those without no or few significant differences. Each table should be on a

separate page (at the end of the manuscript). Each table should have a brief,

self-explanatory title. Column headings should be brief, self-explanatory and

have minimal repetition. Standard abbreviations of units of measurement should

be enclosed within parentheses. For column and row headings, capitalize only

the first letter of the first word. Vertical lines should not be used to separate

columns (leave extra space between columns). Information essential to

interpreting the table should appear as a footnote below the table. .

15) All illustrations should be referred to by consecutive Arabic numerals (e.g.,

Fig. 1). Units should be indicated in the figures. Each illustration should be

identified by its number. An indication of the top of the illustrations is required in

all cases where it is not immediately apparent. Illustrations should be consistent

with the layout and size of the journal page (illustrations can be placed in a

single column or across the entire page). Illustrations should be large enough to

allow a reduction of 50%. Ensure that the lettering is big enough to allow a

reduction of 50% without becoming illegible. The lettering should be in English.

Use the same kind of lettering throughout and follow the style of the journal.

Capitalize only the first letter of the first word of all axis labels. Each illustration

should have a caption (typed on a separate sheet). Explanations should be

given in the legend. Text in the illustrations should be kept to a minimum.

16) All references cited in the text should be listed in a References section (after

Acknowledgements). Ensure there is complete agreement between references

cited in the text and those listed in the References section and that all

information in the References section is accurate and complete. References in

the text should be indicated by Arabic numerals in brackets (with multiple

citations separated by a comma and no space between the comma and the

next citation); three or more consecutive citations should be separated by a

hyphen, i.e. [1,2] [1-3] [1-3,5]. In the Reference section, references must be

listed in numerical (NOT alphabetical) order, with reference number enclosed in

brackets. References should use the following style:

a. For periodicals

Connor EE, Ashwell MS, Dahl GE. Characterization and expression of the

bovine growth hormone-releasing hormone (GHRH) receptor. Domest Anim

Endocrinol 2002;22:189-200.

b. For books

Betteridge KJ. Embryo Transfer. In: Reproduction in Domesticated Animals,

King GJ (Ed.), World Animal Science B9, Elsevier B.V., 1993, pp. 413-418.

c. For multi-author books

Van Zutphen LFM, Baumans V, Beynen AC. Principles of Laboratory Animal

Science, Revised Edition. Elsevier B.V., 2001.

Work accepted for publication but not yet published should be referred to as "in

press". References concerning unpublished data and "personal

communications" should not be cited in the reference list but may be mentioned

in the text.

Tritrichomonas foetus extracellular products decrease bull sperm

progressive motility

C.M. Ribeiro

, M.B. Falleiros

, S.D. Bicudo

, J.P. Araujo Júnior

, M.A. Golim

F.C. Silva Filho

, C.R. Padovani

, J.R. Modolo

Corresponding author: José Rafael Modolo

Department of Veterinary Hygiene and Public Health, Faculty of Veterinary

Medicine and Animal Science, São Paulo State University, Botucatu, São

Paulo, Brazil.

Mail box: 524, Botucatu, Zip code: 18.618-000, São Paulo, Brazil

Tel.: +55 14 3811 6270 Fax: +55 14 3811 6075

E-mail address:

[email protected]

Claudia de Mello Ribeiro

Department of Veterinary Hygiene and Public Health, Faculty of Veterinary

Medicine and Animal Science, São Paulo State University, Botucatu, São

Paulo, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

Marcel Barbosa Falleiros

Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, Faculty of

Veterinary Medicine and Animal Science, São Paulo State University, Botucatu,

São Paulo, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

Sony Dimas Bicudo

Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, Faculty of

Veterinary Medicine and Animal Science, São Paulo State University, Botucatu,

São Paulo, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

João Pessoa Araújo Júnior

Department of Microbiology and Immunology, Institute of Biosciences, São

Paulo State University, Botucatu, São Paulo, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

Marjorie Assis Golim

Botucatu Blood Center, School of Medicine, São Paulo State University,

Botucatu, São Paulo, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

Fernando Costa e Silva Filho

Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

Carlos Roberto Padovani

Department of Biostatistics, Bioscience Institute, São Paulo State University,

Botucatu, São Paulo, Brazil.

E-mail address:

[email protected]

Abstract