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ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRA-ESTRUTURAL DO MESÊNTERO DE Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) FRENTE À TOXINA Cry1Ac
POR
MARIA ESMERALDA CAVALCANTE DE SOUSA
(Sob Orientação da Professora Valéria Wanderley Teixeira)
RESUMO
Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) é a principal praga desfolhadora da
cultura do algodão, provocando perdas entre 21 e 35%. Plantas transgênicas que expressam
proteínas tóxicas de genes da bactéria Bacillus thuringiensis (Berliner) (Bt) foram recentemente
liberadas no Brasil. O algodão Bt AcalaDTL-90B, que expressa a proteína Cry1Ac, é resistente às
principais pragas da Ordem Lepidoptera que afetam a cultura do algodão.. Embora as toxinas de
Bt interajam com pelo menos um receptor final, desencadeando o efeito tóxico, vários fatores
endógenos estão associados à seletividade diferencial das toxinas Bt. Desta forma, estudos da
interação da Cry1Ac com o intestino de insetos pragas do algodoeiro são de fundamental
importância. Assim, esta pesquisa objetivou descrever histoquimicamente, morfologicamente e
ultra-estruturalmente o mesêntero de larvas de A. argillacea alimentadas com a isolinha
(AcalaDTL-90), bem como algodão-Bt (AcalaDTL-90B). As características morfológicas,
histoquímicas e ultra-estruturais do mesêntero de A argillacea, de modo geral, foram semelhantes
às descritas na literatura para a maioria dos insetos da Ordem Lepidoptera. No entanto, o
polimorfismo mitocondrial e microvilosidades bifurcadas sugerem uma modificação ultra-
estrutural e fisiológica, que pode ocasionar uma maior absorção e secreção nas células colunares.
Tal hipótese pode favorecer uma ação mais rápida de toxinas e/ou agentes microbianos,
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sugerindo que esta espécie pode ser altamente suscetível para alguns destes agentes. Larvas de 4º
ínstar após 20 min de alimentação com folhas de algodão Bt (AcalaDTL-90B) mostraram
modificações na parede do mesêntero de A. argillacea. Neste tempo de alimentação, foram
observadas alterações morfológicas e ultra-estruturais nas células colunares e caliciformes, sendo
mais expressivas nessas últimas. Também houve uma redução no número das células
regenerativas, degeneração da camada muscular e destruição da membrana peritrófica em
algumas regiões do mesêntero. Assim, conclui-se que a toxina Cry1Ac age relativamente rápida
no mesêntero da A. argillacea, ocasionando alterações drásticas e irreversíveis.
PALAVRAS-CHAVE: Bollgard I
®
, microscopia, Bacillus thuringiensis curuquerê-do-
algodoeiro, canal alimentar, histoquímica
ii
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MORPHOLOGIC AND ULTRASTRUCTURAL ANALYSIS OF MIDGUT OF Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) FRONT TO THE TOXIN Cry1Ac
by
MARIA ESMERALDA CAVALCANTE DE SOUSA
(Under the direction of Valéria Wanderley Teixeira)
ABSTRACT
The cotton leafworm, Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) is an
important cotton pest in Brazil, occurring almost in the whole growing season and causing
economic losses between 21 and 35%. Bt cotton expressing Cry1Ac protein, a toxin from the
bacterium Bacillus thuringiensis (Berliner) (Bt), has recently been released in Brazil. It is
resistant to the main cotton lepidopteran pests occurring in Brazil. Bt toxins must interact with a
receptor to trigger a toxic effect, although other endogenous factors may account for the
differential Bt toxins selectivity towards insects. Therefore, studies on the Cry1Ac interaction
with the cotton pests midguts are important to understand insect responses when exposed to the
Bt cotton. Then, the aim of this work was to provide an histochemical, morphological, and
ultrastructural description of the midgut of A. argillacea larvae fed with the isoline cotton
(AcalaDTL-90) and the Bt cotton (AcalaDTL-90B). The morphological, histochemical, and
ultrastructural characteristics of the A. argillacea midgut were very similar to those previously
described for most lepidopterans. However, the mitochondrial polymorphism and bifurcate
microvilli suggest an ultrastructural and physiological modification, which may cause a higher
absorption and secretion in the columnar cells. Such hypothesis may account for faster toxin
and/or microbial agent action, suggesting that this species may be highly susceptible to some of
iii
these agents. After 20 min, A. argillacea 4
th
-ínstar larvae feeding on Bt cotton leaves (AcalaDTL-
90B) showed alterations on the midgut walls. During that time, morphological and ultrastructural
alterations in the goblet and columnar cells were observed, although more prominent on the
former. Also, a reduced number of regenerative cells, a deterioration of the muscle layer, and the
peritrophic membrane destruction in some midgut regions were observed. The study overall
conclusion is that the Cry1Ac toxin acts relatively fast in the A. argillacea midgut, causing severe
and irreversible alterations.
KEY WORDS: Bollgard I
®
, microscopy, Bacillus thuringiensis, cotton leafworm, food
channel, histochemical
iv
ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRA-ESTRUTURAL DO MESÊNTERO DE Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) FRENTE À TOXINA Cry1Ac
por
MARIA ESMERALDA CAVALCANTE DE SOUSA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de
Mestre em Entomologia Agrícola.
RECIFE - PE
Fevereiro - 2009
v
ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRA-ESTRUTURAL DO MESÊNTERO DE Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) FRENTE À TOXINA Cry1Ac
por
MARIA ESMERALDA CAVALCANTE DE SOUSA
Comitê de Orientação:
Valéria Wanderley Teixeira – UFRPE
Herbert Álvaro Abreu de Siqueira – UFRPE
Fábio André Brayner dos Santos – CPqAM-FIOCRUZ
RECIFE - PE
Fevereiro - 2009
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ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRA-ESTRUTURAL DO MESÊNTERO DE Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) FRENTE À TOXINA Cry1Ac
por
MARIA ESMERALDA CAVALCANTE DE SOUSA
Orientador:
Valéria Wanderley Teixeira – UFRPE
Examinadores:
Luiz Carlos Alves – CPqAM-FIOCRUZ
Álvaro Aguiar Coelho Teixeira – UFRPE
Herbert Álvaro Abreu de Siqueira – UFRPE
vii
Aos meus pais, Abílio e Josefa
Por quem tenho grande amor, respeito e carinho
Por serem o meu porto seguro
DEDICO
viii
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal Rural de Pernambuco e ao Programa de Pós-Graduação em
Entomologia Agrícola (PPGEA) pela oportunidade de execução deste curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão
da bolsa de estudo.
À Deus, por iluminar meus passos me dando sabedoria, proteção e principalmente muita
força para vencer mais esta etapa da minha vida.
Aos meus pais Abílio Bernardo e Josefa Cavalcante, aos meus irmãos e sobrinhos que
apesar de todas as dificuldades sempre estiveram ao meu lado e se esforçaram para que eu
pudesse continuar minha jornada.
A minha Orientadora Valéria Wanderley Teixeira pelas condições de trabalhos oferecidas,
pela orientação e apoio, pelos ensinamentos constantes e principalmente pela confiança.
Aos meus co-orientadores e amigos Fábio Brayner e Luiz Carlos, pela confiança, pela
orientação, ensinamentos, paciência, companheirismo, pelo estímulo e por todo o aprendizado
durante minha jornada científica.
Ao meu co-orientador Herbert Álvaro A. de Siqueira pela amizade, pelos conhecimentos
passados para execução deste trabalho.
Ao Professor Álvaro Aguiar Coelho Teixeira, pelos ensinamentos, aconselhamentos e
valorosos empréstimos de separatas que foram indispensáveis para elaboração desta dissertação.
Ao Professor Jorge Braz Torres pelo auxílio na quantificação da toxina Cry1Ac e pelas
orientações prestadas.
ix
Aos Professores do PPGEA, Ailton Lôbo, Auristela Albuquerque, Edmilson Marques,
Herbert Siqueira, Manoel Guedes, Reginaldo Barros, Souza-Leão, Valéria Teixeira e José
Vargas.
Ao amigo Alexandre Conte pelo companheirismo, amizade sincera e presença constante em
todos os momentos da minha vida profissional.
Aos amigos da Pós-Graduação Andréa Moreira, Solange, Agna, Vanessa, Tadeu pelos
momentos sérios e de descontração.
Ao Professor Alex Benício da Silveira (UFPE) pela amizade e pela presteza no
fornecimento de protocolos importantes para realização experimental deste trabalho.
Aos meus amigos Yara e Mineo Nacazawa pelos ensinamentos, respeito, apoio que sempre
me deram e principalmente pela amizade durante todos esses anos.
Aos amigos do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal Alicely, Franklin,
Ismaela, Hilda, Andresa, Solange, Mirna e Marcela pelos momentos de descontração, pelas
palavras de incentivo e principalmente pela amizade.
Aos secretários da Coordenação da Área de Fitossanidade do Departamento de Agronomia,
Darci e Romildo pela amizade, presteza e dedicação.
Ao Professor José Luiz de Lima Filho pela infra-estrutura do LIKA que possibilitou a
realização de uma das etapas deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Microscopia Eletrônica Rafael Padilha, Marília, Marcela,
Guilherme, Juliana, Júnior, Kássia, Lídia, Adriana, Rita, Lânia e Diana pela amizade, carinho e
pelos momentos de descontração.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para que pudesse realizar este
sonho.
x
SUMÁRIO
Páginas
AGRADECIMENTOS ..................................................................................................................ix
CAPÍTULOS
1 INTRODUÇÃO ..........................................................................................................01
LITERATURA CITADA ............................... ............................................................05
2 MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DO MESÊNTERO DE Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE).........................................09
RESUMO...............................................................................................................10
ABSTRACT ..........................................................................................................11
INTRODUÇÃO.....................................................................................................12
MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................13
RESULTADOS . ...................................................................................................16
DISCUSSÃO .........................................................................................................17
AGRADECIMENTOS ..........................................................................................21
LITERATURA CITADA ......................................................................................21
3 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E ULTRA-ESTRUTURAIS DO
MESÊNTERO DE Alabama argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA:
NOCTUIDAE) ALIMENTADAS COM ALGODÃO Bt ...........................................30
RESUMO...............................................................................................................31
ABSTRACT ..........................................................................................................32
INTRODUÇÃO.....................................................................................................33
xi
MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................35
RESULTADOS .....................................................................................................38
DISCUSSÃO .........................................................................................................40
AGRADECIMENTOS ..........................................................................................43
LITERATURA CITADA ......................................................................................43
xii
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
O algodão se fez presente como uma cultura de exportação durante toda a história do Brasil,
tendo picos de retomadas de crescimento sempre que havia problemas na produção norte-
americana (Mendonça 1973, Takeya 1985). A produção nacional tornou-se firme e crescente,
somente a partir de 1890, devido ao crescimento e consolidação da indústria têxtil no Brasil, no
qual era produzido de 10 a 20% de excedentes para exportação (Takeya 1985, Beltrão 1996).
Atualmente, o Brasil é considerado um dos principais produtores e exportadores do mundo, sendo
superado apenas pela China, Estados Unidos, Índia e Paquistão (IBGE 2007).
A Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), em seu último levantamento de 2008,
divulgou que a área cultivada com algodão no País totalizou 1,09 milhão de hectares, superior à
safra anterior em 27,2% (232,5 mil hectares). Em relação ao mesmo levantamento a CONAB
relata que as regiões Centro-Oeste e Nordeste participam com 93% da produção do País, com
destaques para os estados de Mato Grosso e Bahia, principais produtores nacionais, onde a área
foi acrescida em 50% e 19% respectivamente. Por outro lado, nos estados de São Paulo e Paraná,
o algodão cedeu área para a cana-de-açúcar (CONAB 2007).
O sucesso da cultura do algodoeiro no cerrado foi impulsionado pelas condições de clima
favorável, terras planas, que permitem a mecanização da lavoura, pela existência de programas de
incentivo à cultura implementada pelos estados da região Centro-Oeste e, sobretudo, pelo uso
intensivo de tecnologias modernas (Ibge 2005). Atualmente os principais estados produtores de
algodão no País são: Mato Grosso, Goiás, Bahia, Mato grosso do Sul, Ceará, São Paulo, Minas
Gerais e Paraná (CONAB 2007). A perda da produtividade agrícola devido ao ataque de insetos
1
pode ser devastadora. Estima-se que, mundialmente, 15% das perdas da produção ocorrem devido
a esses ataques (Braum et al. 1991).
O algodoeiro é atacado por um complexo de insetos incluindo pulgões, percevejos, mosca-
branca e outras espécies de menor projeção. No entanto, o bicudo-do-algodoeiro Anthonomus
grandis (Boheman) (Coleoptera: Curculionidae), é considerado a praga mais severa da
cotonicultura brasileira, pelos danos que ocasiona e pela dificuldade do seu controle, e dentro da
Ordem Lepidoptera a lagarta da maçã Heliothis virescens (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae), a
lagarta rosada Pectinophora gossypiella (Saunders) (Lepidoptera: Gelechiidae), e o curuquerê do
algodoeiro Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), destacam-se como pragas
chave dessa cultura (Miranda & Suassuna 2004, Embrapa Algodão 2008).
O curuquerê-do-algodoeiro, A. argillacea é um inseto que pode ocorrer em toda a fase do
desenvolvimento da cultura, cujas lagartas alimentam-se das folhas e, por esta razão, é
considerada a principal praga desfolhadora, e quando em alta densidade, pode desfolhar
completamente as plantas, reduzindo consideravelmente a produção (Gravena & Cunha 1991,
Jácome et al. 2001, Quirino & Soares 2001). Este inseto pode provocar perdas entre 21 e 35%,
sendo observadas ocorrências freqüentes em qualquer local onde se plante o algodão, bem como
em qualquer estágio fenológico da cultura (Bleicher et al. 1983, Gravena & Cunha 1991).
A importância socioeconômica do algodão está relacionada à questão do controle de insetos-
praga por ser um dos fatores de maior custo na sua produção (Dias et al. 2002). O grande número
de pulverizações requeridas é um dos fatores que oneram a produção, superando os gastos com
aplicação de fertilizantes (Richetti et al. 2004). A necessidade de redução de custos,
principalmente ao aumento da produtividade da cultura, deve ser buscada constantemente para
que deste modo haja diminuição tanto dos valores finais de produção quanto do preço do produto
ao consumidor. A adoção de medidas de controle enquadradas dentro do manejo integrado de
2
pragas (MIP) pode maximizar a produtividade da cultura, por utilizar táticas adequadas que
venham reduzir os custos da produção (Embrapa 2002).
Alternativas de controle de insetos, incluindo a utilização de microrganismos
entomopatogênicos como bactérias, fungos e vírus, plantas transgênicas que expressam genes de
bactérias ou inibidores de proteinases de insetos, e inimigos naturais têm sido amplamente
estudados (Betz et al. 2006). Esses agentes podem ser manipulados para o aumento da
patogenicidade, ampliação do espectro de ação, produção industrial ou a incorporação de genes
inseticidas em espécies vegetais levando à obtenção de plantas transgênicas (Perlak et al. 1990).
Dos vários agentes microbianos que possuem atividade entomopatogênica, destaca-se o Bacillus
thuringiensis (Berliner), pertencente à família Bacillaceae que envolve o gênero de grande
importância, Bacillus (Habib & Andrade 1998). O gênero Bacillus apresenta várias características
que colocam suas espécies entre os agentes altamente promissores no controle de insetos pragas,
como B. thuringiensis (Priest 2000).
A atividade entomopatogênica do B. thuringiensis está relacionada com a produção de
cristais com ação inseticida, que são sintetizados a partir da fase estacionária e acumulados no
compartimento da célula-mãe durante a esporulação, podendo corresponder até 25% do peso seco
das células (Aglaisse & Lereclus 1995). Uma das grandes vantagens de sua utilização é sua
inocuidade ao homem e animais domésticos, além de seu efeito não poluente ao ambiente
(Arango et al. 2002).
Cada cristal pode ser formado por uma ou mais proteínas codificadas pelos genes cry e
conhecidas como δ-endotoxinas ou proteínas cristal. Baseando-se na identificação dos
aminoácidos, 96 seqüências gênicas da δ-endotoxinas foram distribuídas em 17 grupos (Peferoen,
1997). De acordo com Crickmore et al. (1998) as toxinas Cry1Aa1, Cry1Ab1, Cry1Ac1,
Cry1Ad1, Cry1Ba1, Cry1Ca1, Cry1Ea1, Cry1Ia1, Cry2Aa1, Cry2Ac1 e Cry9Aa1 são tóxicas para
3
a Ordem Lepidoptera. Laboratórios em todo o mundo procuram estirpes com novas toxinas e
outras características de patogenicidade, que possibilitem uma maior disponibilidade de princípios
ativos que poderão ser usados para o estabelecimento de estratégias de controle.
O algodão Bollgard
TM
,o milho Maximizer
TM
da Novartis, e a batata Newleaf
TM
da
Monsanto são exemplos de plantas geneticamente modificadas introduzidas no mercado norte-
americano desde 1995, sendo genericamente conhecidas como plantas-Bt (Jouanin et al. 1998). A
introdução de genes de Bt codificadores de proteínas tóxicas (δ -endotoxinas) no genoma dos
vegetais permite a expressão contínua destas proteínas em todos os tecidos da planta, atingindo os
insetos-praga que se alimentam dos seus tecidos (Boborowski et al. 2003). Uma vez presente no
trato digestivo dos insetos suscetíveis, as proteínas tóxicas associam-se a receptores específicos de
ligação nas microvilosidades apicais das células do intestino médio (mesêntero) dos insetos,
causando lise osmótica por meio da formação de poros na membrana, ruptura da integridade
intestinal e conseqüente morte do inseto (Fiuza et al. 1996, Schnepf et al. 1998).
A toxina Cry1Ac liga-se a três receptores de diferentes maneiras para diferentes grupos de
insetos e vários fatores endógenos estão associados à seletividade diferencial de toxinas Bt,
incluindo a Cry1Ac (Hoffmann et al. 1998). Desta forma, estudos da interação desta toxina com o
intestino de insetos pragas e seus inimigos naturais na cultura do algodão são de fundamental
importância para aspectos da sobrevivência de ambos os grupos quando expostos ao algodão-Bt.
Em decorrência dos questionamentos sobre os possíveis efeitos diretos e indiretos causados nos
organismos alvos, por meio da utilização da toxina do algodão-Bt, esta pesquisa teve como objetivo
descrever o mesêntero de larvas de A. argillacea alimentadas com a isolinha (Acala DP 90), e
algodão-Bt (Acala DP 90B), esclarecendo os níveis de alterações morfológicas, ultra-estruturais e
histoquímica.
4
Literatura Citada
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Bleicher, E, A.B.P. Melo, F.M.M. Jesus & C.T. Ferraz. 1983. Distribuição vertical de lagartas
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5
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6
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Schnepf, E., N. Crickmore, J.Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D.R. Zeigler &
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Takeya, D.M. 1985. Um outro nordeste: o algodão na economia do Rio Grande do Norte (1880-
1915). Fortaleza: BNB/ETENE, 138p.
8
CAPÍTULO 2
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DO MESÊNTERO DE Alabama argillacea
(HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
M
ARIA E. C. SOUSA¹, VALÉRIA WANDERLEY-TEIXEIRA², ÁLVARO A.C. TEIXEIRA², HERBERT A.A.
SIQUEIRA
1
, FÁBIO A.B. SANTOS
3
E LUIZ C. ALVES
3
¹ Departamento de Agronomia-Entomologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Av.
Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
² Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
3
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE, Av. Moraes Rego s/n 50670-420,
Recife, PE.
M.E.C. Sousa, V. Wanderley-Teixeira, A.A.C. Teixeira, H.A.A. Siqueira, F.A.B. Santos, L.C.
Alves. Morfologia e ultra-estrutura do mesêntero de Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera:
Noctuidae). Micron.
9
RESUMO – A região do mesêntero tem sido o foco de várias pesquisas, pois alterações nessa
região podem afetar o crescimento e o desenvolvimento dos insetos, bem como todos os eventos
fisiológicos, os quais dependem da alimentação adequada, de sua absorção e transformação.
Assim, a presente pesquisa teve como objetivos descrever a morfologia, histoquímica e ultra-
estrutura do mesêntero de larvas de Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), praga
chave da cultura do algodão no Brasil. Para obter informações, microscopia de luz e eletrônica de
transmissão foi usada para coletar imagens de cortes do mesêntero de larvas do quarto instar de A.
argillacea. As características morfológicas, histoquímicas e ultra-estruturais do mesêntero de A
argillacea, de modo geral, foram semelhantes às descritas na literatura para a maioria dos insetos
da Ordem Lepidoptera. No entanto, a presença de polimorfismo mitocondrial e microvilosidades
bifurcadas sugerem uma modificação ultra-estrutural e fisiológica, podendo ocasionar uma maior
atividade de absorção e secreção nas células colunares nessa espécie. Tal aumento de atividade
pode favorecer uma ação mais rápida de toxinas e/ou agentes microbianos, sugerindo que esta
espécie pode ser altamente suscetível para alguns destes agentes. Contudo, esta hipótese precisa
de investigação adicional.
PALAVRAS-CHAVE: Intestino médio, curuquerê-do-algodoeiro, algodão, histologia,
histoquímica
10
MORPHOLOGY AND ULTRASTRUCTURE OF MIDGUT OF Alabama argillacea
(HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
ABSTRACT - The insect midgut has ultimately been the focus of several researches tempting to
control insect pests because alterations in the gut section may affect, not only insects growth and
development, but also physiological events such as nutrient absorption and transformation. The
objective of the present work was to describe the morphology, histochemical, and ultrastructural
the larvae midgut of Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), a cotton key pest in
Brazil. To gather information, ligth and electronic transmission microscopy were used to obtain
images from midgut sections of late fourth-instar larvae of A. argillacea. The morphology,
histochemistry, and ultrastructure characteristics of A. argillacea midgut were, in general, very
similar to those described in the literature for other lepidopteran species. However, it was
observed a mitochondrial polymorphism and bifurcate microvilli, which suggest a ultrastrucutural
and physiological modification possibly associated with a higher absorption and secretion activity
by the columnar cells of this species. Such higher activity may favor a faster action of microbial
agents and/or toxins, suggesting that this species may be highly susceptible to some kind of these
agents. Nevertheless, this hypothesis needs further investigation.
KEY WORDS: Midgut, cotton leafworm, cotton, histology, histochemical
11
Introdução
O canal alimentar dos insetos está diferenciado em três regiões principais com diferentes
origens embriológicas: intestino anterior ou estomodeu, intestino médio ou mesêntero e intestino
posterior ou proctodeu. Esse canal representa uma área de contato entre os insetos e o meio
ambiente, sendo o foco de grande parte das pesquisas para se controlar o ataque de pragas
(Chapman 1998, Levy et al. 2004), principalmente a região do mesêntero, pois alterações nessa
região podem afetar o crescimento e o desenvolvimento dos insetos, bem como todos os eventos
fisiológicos, os quais dependem da alimentação adequada, de sua absorção e transformação
[Mordue (Luntz) & Blackwell 1993, Mordue (Luntz) & Nisbet 2000].
Em Lepidoptera, o epitélio do mesêntero é composto por quatro tipos de células, as quais
estão envolvidas nos processos de absorção e secreção de enzimas (células colunares),
homeostase iônica (células caliciformes), função endócrina (células endócrinas) e na renovação do
epitélio (células regenerativas) (Terra et al. 2006, Pinheiro et al. 2008). Um mecanismo de defesa
nessa região é a membrana peritrófica que tem um papel fundamental na biologia do intestino
médio, por estar posicionada entre o conteúdo alimentar e o revestimento epitelial,
desempenhando a função de proteger esse epitélio de danos mecânicos, exercendo ainda uma
barreira contra toxinas e substâncias químicas prejudiciais ao inseto (Terra et al. 2001).
Várias pesquisas relacionadas com a descrição morfológica e ultra-estrutural do mesêntero
em insetos da Ordem Lepidoptera tais como: Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lep.: Pyralidae),
Manduca sexta L. (Lep.: Sphingidae), Spodoptera frugiperda (Lep.: Noctuidae) (J. E. Smith) e
Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) sugerem que a distribuição e
morfologia das células epiteliais podem ser variáveis ao longo dessa região (Pinheiro et al. 2003,
Levy et al. 2004, Pinheiro et al. 2006). Essas diferenças morfológicas são principalmente
detectadas em nível ultra-estrutural (Santos et al. 1984, Lehane & Billingsley 1996).
12
No Brasil, a principal praga desfolhadora do algodoeiro Gossypium hirsutum L. raça
latifolium Hutch é o curuquerê, Alabama argillacea (Hübner) (Lep.: Noctuidae). Na América
Tropical, o seu ataque pode ocorrer em qualquer época do ano ou durante todo o ciclo da planta
dependendo das condições climáticas de cada região (Silva et al. 1980). As lagartas alimentam-se
das folhas e quando em altas densidades populacionais, podem desfolhar completamente o
algodoeiro. No Nordeste brasileiro, o seu ataque é mais acentuado na fase inicial de
desenvolvimento da cultura e, na região Centro-Sul, na fase de frutificação, causando prejuízos à
produção (Gravena & Cunha 1991).
Um aspecto particular do curuquerê do algodoeiro é que essa espécie é monófoga. Em
virtude disso, esta praga adquire uma grande importância para a cultura do algodão (Azevedo et
al. 2002). Embora existam estudos sobre a biologia de A. argillacea nenhum enfoque tem sido
dado à descrição morfológica e ultra-estrutural do canal alimentar dessa espécie. Assim, a
presente pesquisa teve como objetivos descrever a morfologia, histoquímica e ultra-estrutura do
mesêntero de lagartas do quarto instar de A. argillacea.
Material e Métodos
A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Toxicologia de Inseticidas do
Departamento de Agronomia, no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e
Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e no Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami da Universidade Federal de Pernambuco (LIKA-UFPE), Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães – CPqAM – FIOCRUZ – Recife, PE.
Obtenção, Manutenção e Criação dos Insetos. As lagartas A. argillacea utilizadas nos
experimentos foram obtidas da criação estoque do Laboratório de Toxicologia de Inseticidas,
oriunda de Paulínia-SP, e foram mantidas em uma câmara climática a 25ºC, 70 ± 10% UR e
13
fotofase de 12h, empregando-se a metodologia de Santos & Boiça Júnior (2001). Os adultos
foram mantidos em gaiolas de PVC de 20cm x 19,5 cm, sendo a extremidade inferior acomodada
em um prato para vasos de jardinagem de 20cm (diâmetro), forrado com papel toalha interfolhado
de 23 x 20,5cm, e na extremidade superior coberta com tecido voil. Internamente as gaiolas foram
revestidas com papel sulfite branco para a obtenção das posturas. Os adultos foram alimentados
com mel e água a 5%, embebida em algodão hidrófilo acondicionado em tampa plástica.
Diariamente, os papéis com posturas eram retirados e transferidos para gaiolas iguais àquelas
utilizadas para os adultos. Próximo à eclosão, foram oferecidas folhas de algodoeiro cultivar
isolinha suscetível Acala 90, retiradas do terço superior das plantas, lavadas em solução de
hipoclorito de sódio a 0,15% e enxaguadas com água. Retirou-se posteriormente o excesso de
umidade das folhas e seus pecíolos foram acondicionados em vidros contendo água, objetivando a
conservação das folhas. Para as lagartas de primeiro e segundo ínstares, as folhas eram trocadas a
cada dois dias, para as lagartas de ínstares mais avançados, devido ao maior consumo de folhas,
estas eram trocadas diariamente. As pupas foram separadas por sexo e mantidas em gaiolas de
PVC de 10cm de altura x 10cm de diâmetro até a emergência dos adultos.
Coleta do Mesêntero para Análise em Microscopia de Luz e Histoquímica. Larvas de quarto
instar foram imobilizadas a baixa temperatura (-4
o
C) por cinco minutos e realizadas as
dissecações das mesmas para retirada do mesêntero, o qual foi imediatamente colocado em
recipientes contendo solução fixadora de Boüin aquoso (75mL de solução saturada de ácido
pícrico, 25mL de formaldeído e 5mL ácido acético) permanecendo neste por um período de vinte
e quatro horas, a 4
o
C. Para a inclusão do mesêntero, este foi submetido ao processo de
desidratação crescente em banhos de álcool etílico 70%, 90% e 100% por 20 minutos cada, álcool
etílico 100% + xilol (1/1) por 20 minutos e a diafanização feita em xilol por 20 minutos.
Decorrida esta etapa, a impregnação foi feita em banhos de parafina diluída em xilol na proporção
14
de 50% e 100% a 58ºC, durante uma hora cada, e incluídos em moldes de 2cm
3
, após o último
banho. Os blocos foram cortados em micrótomo do tipo Minot (LEICA RM 2035) ajustado para
7µm de espessura, os cortes obtidos foram colocados em lâminas previamente untadas com
albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à 37ºC, durante 24h. Posteriormente, estas
lâminas foram submetidas às técnicas de colorações pelo tricrômico de Mallory e Ácido Periódico
de Schiff (P.A.S.), empregando-se a metodologia descrita por Michalany (1990). A análise
histológica foi realizada utilizando-se um microscópio de luz, da marca OLYMPUS BX-49, e
fotografado em fotomicroscópico OLYMPUS BX-51 pertencente ao Laboratório de Histologia.
Coleta do mesêntero para análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Foram
coletados fragmentos do mesêntero de lagartas de quarto ínstar após serem imobilizadas a baixa
temperatura (-4
o
C) por cinco minutos, fixados em seguida na solução de glutaraldeído a 2,5%,
PFA 4% e tampão fosfato 0,1M, pH 7,2. Posteriormente foram lavados três vezes em tampão
fosfato 0,1M, pH 7,2. A pós-fixação em Tetróxido de Ósmio (OsO
4
) a 2% (1:1), por 1h. Em
seguida procedeu-se mais três lavagens em Tampão fosfato 0,1M, pH 7,2 e a desidratação em
séries crescentes de acetona (de 30, 50, 70, 90 e 3x de 100%) por 30 min cada, a temperatura
ambiente. A infiltração foi realizada em resina EMBED812/Araldite (Electron Microscopy
Sciences, Fort Washington, PA) e acetona em temperatura ambiente. O material foi emblocado
em moldes flexíveis e posto para polimerizar a 70ºC por 72h. Os cortes ultrafinos foram obtidos
em ultramicrótomo (Reichert Ultracut), contrastados em acetato de uranila por 1h e em citrato de
chumbo por 10 min e analisado em microscópio Zeiss EM109.
15
Resultados
Cortes semifinos do mesêntero de larvas do quarto ínstar de A. argillacea revelou que este é
formado por um epitélio simples apoiado em duas camadas de músculo, sendo a interna disposta
circularmente e a externa longitudinalmente (Fig. 1A). No epitélio foram identificados apenas três
tipos de células: colunares, caliciformes e regenerativas distribuídas por toda sua extensão (Fig.
1B). No entanto, ultra-estruturalmente foi possível detectar a presença de um quarto tipo celular, a
célula endócrina (Fig. 4B). As células mais freqüentes foram as colunares, células altas com sua
borda em escova característica, núcleo com localização variando de central a apical e bastante
heterocromático. Na região apical várias protuberâncias citoplasmáticas foram evidenciadas, as
quais se destacam em direção ao lúmen (Figs. 1B e 1C). Observações detalhadas da região apical
dessas células revelaram numerosos microvilos longos, alguns bifurcados, e entre eles vesículas
de secreção (Figs. 2A e 2B). Na região subjacente aos microvilos notou-se riqueza de
mitocôndrias de tamanho variado apresentando morfologia esférica, alongada, em forma de capuz
e algumas contendo no seu interior material elétron luscente, caracterizando polimorfismo
mitocondrial (Figs. 2C e 2D). O material elétron luscente apresentou-se constituído por
polissomos e retículo endoplasmático liso (Fig 3A). Entre as mitocôndrias também foi observado
à presença de vacúolo autofágico (Fig. 3B). As células colunares estão intimamente conectadas na
região lateral próximo ao pólo apical por meio de especializações do tipo zônula de oclusão,
sendo ainda bem nítida a presença de espaços entre essas especializações, enquanto que na região
basolateral foram observadas invaginações (Fig. 3C). A região central das células colunares
caracterizou-se por apresentar grande quantidade de retículo endoplasmático rugoso, aparelho de
Golgi e algumas mitocôndrias (Fig.3D). Na região basal evidenciaram-se numerosas invaginações
da membrana plasmática formando um labirinto (Fig. 4A). A célula caliciforme foi bem
caracterizada pela presença de uma cavidade em forma de cálice limitada pelas projeções da
16
membrana plasmática, com núcleo basal bastante heterocromático e nucléolo bem evidente (Figs
1D e 4B). Tanto em observações feitas em microscopia de luz e eletrônica, as células
regenerativas caracterizaram-se por apresentarem morfologia piramidal, dispostas isoladamente
na base do epitélio. Seu citoplasma mostrou-se bastante denso com predominância de polissomos
livres, núcleo central, volumoso e com cromatina dispersa (Figs 1D, 4C e 4D). As células
endócrinas, assim como as células regenerativas não se estendem para o lúmen, portanto são de
localização basal. Essas células apresentaram morfologia alongada, contendo vários grânulos, em
geral concentrados na região basal da célula (Fig. 4B). Histoquimicamente o mesêntero mostrou
secreções de natureza mucosa e glicoprotéica, quando corado pelo tricrômico de Mallory e Ácido
periódico de Schiff, respectivamente (Figs. 5A e 5B).
Discussão
A literatura relata que o epitélio do mesêntero para os insetos da Ordem Lepidoptera pode
apresentar-se simples (Jordão et al. 1999, Cristofoletti et al. 2001, Pinheiro et al. 2003) ou
pseudo-estratificado (Levy et al. 2004), constituído por quatro tipos de células. Histologicamente
o epitélio de A. argillacea apresentou-se do tipo simples, constituído pelas células colunares,
caliciformes, endócrinas e regenerativas, seguindo, portanto, o padrão geral. As células colunares
foram predominantes ao longo do epitélio do mesêntero em A. argillacea e caracterizaram-se
pelos numerosos microvilos longos e alguns bifurcados, além de protuberâncias citoplasmáticas.
A observação de dicotomia nos microvilos dessas células é o primeiro relato e pode levar a
discussão da possível presença de estereocílios, visto que estes são projeções na região apical das
células epiteliais que podem se anastomosar, tendo também o papel de absorção (Junqueira &
Carneiro 2008). Embora, Guo et al. (2000) estudando o arranjo estrutural dos microvilos
sugeriram que modificações nas proteínas do citoesqueleto podem levar a deformação dos
17
mesmos sem alterar sua função. Protuberâncias citoplasmáticas também foram observadas por
Pinheiro et al. (2008) nas células colunares do mesêntero em D. saccharalis Fabricius. Segundo
esses autores essas protuberâncias são resultantes do processo de secreção apócrina de enzimas
digestivas para o lúmen.
Ultraestruturalmente foram observados ainda na região apical das células colunares
polimorfismo mitocondrial e presença de vacúolo autofágico. Segundo Abdalla & Cruz-Landim
(2001, 2004) a variação no tamanho e forma das mitocôndrias é uma ocorrência comum nas
células secretoras dos insetos em geral. Porém, não há relatos na literatura consultada da presença
do polimorfismo mitocondrial nas células colunares do mesêntero em lepidópteros. Abdalla &
Cruz-Landim (2005) estudando esse polimorfismo em células da glândula de Dufour de
Scaptotrigona postica Latreille (Hymenoptera: Apidae) caracterizaram as mitocôndrias de
morfologia esférica como sendo do tipo 1, as alongadas, tipo 2, as em forma de capuz ou as que
contêm polissomos e retículo endoplasmático liso na sua matriz do tipo 3, e as que contêm lipídio
na sua matriz, tipo 4. Porém nas células colunares de A. argillacea não foi observado o último
tipo. De acordo com Caetano et al. (2002) esse polimorfismo resulta de um ciclo de
desenvolvimento com mudanças morfológicas pela quais as mitocôndrias passam, e aos poucos
acumulam secreção lipídica na sua matriz.
No mesêntero a degradação de componentes citoplasmáticas é um processo importante na
fisiologia celular, participando da apoptose ou da renovação das organelas (Weissman 2001).
Durante a degradação as organelas são isoladas do citoplasma em vesículas com dupla membrana
denominadas de vacúolos autofágicos (Klionsky & Emr 2000). Portanto, a presença desses
vacúolos nas células colunares representa uma condição fisiológica normal nas células epiteliais.
Embora a origem das membranas dos vacúolos autofágicos seja um assunto de debate, evidências
indicam que elas são derivadas do retículo endoplasmático rugoso (Dunn 1990).
18
A membrana plasmática das células colunares na região lateral próxima ao pólo apical,
apresentou por toda a sua extensão, especialização do tipo zônula de oclusão intercaladas por
espaços intercelulares. Esses espaços podem sugerir o local de troca de substância entre as células,
pois de acordo com Abdalla (2002) a presença de junções delimitando esses espaços não permite
que substâncias encontradas nessa região cheguem diretamente ao lúmen ou a hemocele. Já no
pólo basolateral observou-se invaginações. Essas invaginações podem variar de tamanho de
acordo com a função desempenhada pela célula e sua localização no intestino médio (Terra et al.
2006). O labirinto observado na região basal é responsável por aumentar a superfície de contato
entre a membrana basolateral da célula e a hemolinfa (Cavalcante & Cruz-Landim 1999, Terra et
al. 2006).
As células caliciformes observadas neste inseto são similares às encontradas em outros
lepidópteros, apresentando a típica cavidade, denominada de câmara globosa. Essas células,
localizadas por todo epitélio do mesêntero, intercaladas por células colunares, têm como função
principal realizar o transporte de potássio da hemolinfa para o lúmen, mantendo a homeostase
iônica e cooperando com as células colunares na absorção de metabólitos (Cavalcante & Cruz-
Landim 1999, Klowden 2002). Através da análise histoquímica foi possível constatar a intensa
atividade secretora de natureza mucosa dessas células pela reação com o tricrômico de Mallory,
pois este corante reage com as mucinas presentes no muco (Behmer et al. 1976, Junqueira &
Junqueira 1983, Michalany 1990). A reação negativa das células caliciformes pelo P.A.S.
confirma os relatos de Pinheiro et al. (2008) de que a secreção glicoprotéica observada é
produzida exclusivamente pelas células colunares.
As células regenerativas são relativamente indiferenciadas e responsáveis pela renovação do
epitélio do intestino médio, substituindo as células principais que se desgastam e se perdem
durante o processo de digestão além de possibilitar o crescimento do canal alimentar a cada
19
ecdise. São encontradas na base do intestino médio, isoladamente ou em grupos formando ninhos
(Chapman 1998, Cavalcante & Cruz Landim 1999, Wanderley-Teixeira et al. 2006, Martins et al.
2006).
A não visualização das células endócrinas no mesêntero de A. argillacea nas preparações
histológicas para análise em microscopia de luz corrobora com os trabalhos de Montuenga et al.
(1989), Jimenez & Gilliam (1990) e Pinheiro et al. (2008) os quais relatam que estas células não
são facilmente identificadas na microscopia de luz pelas técnicas de rotina, sendo necessárias
análises ultraestruturais e imunohistoquímicas. Ultraestruturalmente em A. argillacea essas
células si dispõem na base do epitélio sem, no entanto, atingirem o lúmen. De acordo com
Cavalcante & Cruz-Landim (1999) as células endócrinas que não entram em contato com o lúmen
são classificadas de tipo aberto, já as que estão em contato direto com o lúmen são do tipo
fechado. As características morfológicas, histoquímicas e ultra-estruturais do mesêntero de A
argillacea, de modo geral, foram semelhantes às descritas na literatura para a maioria dos insetos
da Ordem Lepidoptera. No entanto, a presença de polimorfismo mitocondrial e microvilos
bifurcados sugere uma modificação ultra-estrutural e fisiológica, ocasionando uma maior
atividade de absorção e secreção das células colunares nessa espécie. Tal atividade aumentada
pode favorecer uma ação mais rápida de toxinas e/ou agentes microbianos, sugerindo que esta
espécie pode ser altamente suscetível para alguns destes agentes. Contudo, esta hipótese precisa
de investigação adicional.
Agradecimentos
À CAPES pela concessão da bolsa de estudo ao primeiro autor, possibilitando a realização
deste trabalho e a Rafael Padilha (LIKA/UFPE) pela colaboração no preparo e observação do
material em microscopia eletrônica.
20
Literatura Citada
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24
Figura 1. Microscopia de luz: (A) Mesêntero de A. argillacea mostrando epitélio simples apoiado
em duas camadas de músculo. Barra = 100µm. (B) Detalhe das células epiteliais. Barra = 100µm.
(C) Notar várias protuberâncias citoplasmáticas nas células colunares destacando-se para o lúmen.
Barra = 200µm. (D) Observar células: caliciforme e regenerativa. Barra = 25µm. Ep – epitélio
simples, MC – músculo circular, ML – músculo longitudinal, CC – célula colunar, CCa – célula
caliciforme, Seta – célula regenerativa, N – núcleo, PC – protuberância citoplasmática, C –
câmara globosa, BE – borda em escova. Coloração Azul de Toluidina.
Ep
ML
MC
A
CCa
BE
PC
N
N
CC
B
CC
CCa
C
C
D
25
MB
A B
VS
4
3
2
1
D
C
Figura 2. Eletromicrografias de transmissão da região apical da célula colunar: (A)
microvilosidades. Barra = 0,2µm. (B) observar processo de secreção. Barra = 0,2µm. (C) riqueza
de mitocôndrias. Barra = 0,5µm. (D) polimorfismo mitocondrial. Barra = 0,2µm. MB – microvilo
bifurcado, VS – Vesícula de secreção, 1- mitocôndria esférica, 2 – mitocôndria alongada, 3 –
mitocôndria em forma de capuz, 4- mitocôndria armazenando material elétron luscente.
26
•
C
IL
A
Po
REL
RER
N
D
M
VA
M
M
B
Figura 3. Eletromicrografias de transmissão: (A) detalhe da mitocôndria contendo material elétron
luscente. Barra = 0,3µm. (B) vacúolo autofágico Barra = 0,3µm. (C) junção entre as células
colunares Barra = 0,5µm.. (D) região central da célula colunar Barra = 0,5µm.. Po – polissomos,
REL – retículo endoplasmático liso, VA - vacúolo autofágico, M – mitocôndria, Seta longa –
zônula de oclusão, Setas curtas – espaços intercelulares, IL – detalhe da região lateral da célula
colunar mostrando invaginação lateral RER – retículo endoplasmático rugoso, N - núcleo.
27
C
N
CD
ML
MC
D
Po
N
A
LB
CE
CCa
B
Figura 4. Eletromicrografias de transmissão: (A) região basal da célula colunar. Barra = 0,5µm. (B)
células: caliciforme e endócrina. Barra = 0,5µm. (C) e (D) célula regenerativa. Barra = 0,5µm e
0,25µm, respectivamente. LB – labirinto basal, CCa – célula caliciforme, CE – célula endócrina,
Ponta de seta – grânulo, N – núcleo, CD – citoplasma denso, MC – músculo circular, ML – músculo
longitudinal, Po - polissomos.
28
Figura 5. Histoquímica do mesêntero de A. argillacea: (A) Observar a natureza mucosa das
células caliciformes. tricrômico de Mallory. Barra = 25µm. (B) Notar reação positiva pelo P.A.S.
na superfície epitelial e no produto de secreção. Barra = 25µm. Seta - membrana peritrófica, CCa
– célula caliciforme, PS – produto de secreção, MD –material digerido.
A
CCa
MD
B
PS
MD
CCa
29
CAPÍTULO 3
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E ULTRA-ESTRUTURAIS DO MESÊNTERO DE
Alabama argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) ALIMENTADAS COM
ALGODÃO Bt
M
ARIA E. C. SOUSA¹, FÁBIO A.B. SANTOS
3
, VALÉRIA WANDERLEY-TEIXEIRA², ÁLVARO A.C.
TEIXEIRA², HERBERT A.A. SIQUEIRA
1
E LUIZ C. ALVES
3
¹ Departamento de Agronomia-Entomologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Av.
Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
² Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE.
3
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE, Av. Moraes Rego s/n 50670-420,
Recife, PE.
M.E.C. Sousa, F.A.B. Santos, V. Wanderley-Teixeira, A.A.C. Teixeira, H.A.A. Siqueira, L.C.
Alves, J.B. Torres. Alterações morfológicas e ultra-estruturais do mesêntero de Alabama
argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) alimentadas com algodão Bt. Micron.
30
RESUMO – O algodão Bt AcalaDTL-90B, que expressa a proteína Cry1Ac, é resistente às
principais pragas da Ordem Lepidoptera que afetam a cultura do algodão, como o curuquerê-do-
algodão (Alabama argillacea), a lagarta-rosada (Pectinophora gossypiella) e a lagarta-da-maçã
(Heliothis virescens). Estudos histopatológicos e ultra-estruturais têm mostrado a interação entre a
toxina Bt com o mesêntero em larvas de alguns lepidópteros, porém não há relatos dessa interação
em A. argilacea. Assim, esta pesquisa teve como finalidade comprovar os impactos sobre a
morfofisiologia do mesêntero de A. argillacea alimentadas com algodão Bt AcalaDTL-90B,
esclarecendo os níveis de alterações morfológicas e ultra-estruturais. Após 20 minutos de ingestão
de cerca de 0,183 ± 0,077 ng de Cry1Ac, presente nos discos de folhas de algodão Bt AcalaDTL-
90B, as larvas do quarto instar de A. argillacea apresentaram modificações na parede do
mesêntero com alterações morfológicas e ultra-estruturais nas células colunares e caliciformes,
redução no número das células regenerativas, bem como degeneração da camada muscular, além
de provocar destruição da membrana peritrófica em algumas regiões do mesêntero. Assim,
conclui-se que após ingestão em média de 0,183 ± 0,077 ng de Cry1Ac, foram suficientes para
ocasionar alterações a níveis morfológico e ultra-estrutural no mesêntero de larvas do quarto
ínstar de A. argillacea.
PALAVRAS-CHAVE: Bollgard I
®
, lepidoptera, microscopia, Bacillus thuringiensis
31
MORPHOLOGIC AND ULTRASTRUCTURAL ALTERATIONS OF MIDGUT OF Alabama
argillacea (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) FED WITH Bt COTTON
ABSTRACT – The Bt cotton (AcalaDTL-90B line),which express the Cry1Ac protein, is resistant
to the main cotton lepidopteran pests such as the cotton leafworm, Alabama argillacea, the pink
bollworm, Pectinophora gossypiella, and the tobacco budworm, Heliothis virescens.
Histopathological and ultrastructural studies have showed the effects of the Bt toxins interaction
with the larval midgut of many lepidopterans, however no documentation exists regarding these
interactions with A. argillacea. Thus, the aim of this study was to show the Cry1Ac impacts on
the midgut morphophysiology of A. argillacea fed with Bt cotton, particularly the morphological
and ultra-structural alterations. Based on our detection, 20 min after exposure to Cry1Ac, 4
th
-
instar larvae presented modifications on the midgut walls with morphological and ultra-structural
alterations in the columnar and goblet cells, a reduced number of regenerative cells, degeneration
of muscle layer, and destruction of peritrophic membrane in some midgut regions. The overall
conclusion, after ingestion of 0.183 ± 0.077 ng de Cry1Ac for 20 min, is that in average this
amount was enough to cause morphological and ultra-structural alterations in the larval midgut of
the A. argillacea.
KEY-WORDS: Bollgard I
®
, Lepidoptera, Microscopy, Bacillus thuringiensis
32
Introdução
O curuquerê Alabama argillacea (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae), é a principal praga
desfolhadora do algodoeiro Gossypium hirsutum L. raça latifolium Hutch, no Brasil. As lagartas
alimentam-se das folhas e quando em altas densidades populacionais, podem desfolhar
completamente o algodoeiro. No Nordeste brasileiro, o seu ataque é mais acentuado na fase inicial
de desenvolvimento da cultura e, na região Centro-Sul, na fase de frutificação, causando prejuízos
à produção (Leonard et al. 1999, Santos & Boiça Júnior 2002).
A principal forma de controle dos insetos que atacam o algodoeiro tem sido feita pela
utilização de produtos químicos, cuja aplicação exige grande investimento, além de causar danos
ao meio ambiente e gerar riscos de intoxicação ao homem. Uma alternativa foi à introdução de
algodão que expressa uma proteína inseticida do Bacillus thuringiensis Berliner (algodão Bt). B.
thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz, durante sua fase de esporulação, proteínas
cristalinas (delta-endotoxinas), denominadas de Cry toxinas ou proteínas Cry (Estela et al. 2004).
O algodão Bollgard
®
evento 531, também conhecido como Ingard
®
, produzido pela empresa
Monsanto, é resistente às principais pragas da Ordem Lepidoptera que afetam a cultura do
algodão, como o curuquerê-do-algodão (A. argillacea), a lagarta-rosada (Pectinophora
gossypiella) e a lagarta-da-maçã (Heliothis virescens). O algodão Bollgard foi geneticamente
modificado a partir da transformação da variedade comercial Coker 3212, por meio do sistema
mediado por Agrobacterium tumefaciens (Smith & Townsend). A transformação inseriu os genes
nptII, aad, e o gene Cry1Ac que é proveniente de B. thuringiensis, no genoma dessa variedade de
algodão (CTNBio 2007).
Uma vez presente no trato digestivo dos insetos suscetíveis, as proteínas Cry associam-se a
receptores específicos de ligação nas microvilosidades apicais das células do intestino médio
(mesêntero) dos insetos, causando lise osmótica por meio da formação de poros na membrana,
33
ruptura da integridade intestinal e conseqüente morte do inseto (Herrero et al. 2001, Boborowski
et al. 2003, Cavados et al. 2004, Ruiz et al. 2004, Oestergaard et al. 2007).
Embora existam trabalhos na literatura comprovando a suscetibilidade dos insetos da Ordem
Lepidoptera ao B. thuringiensis (Monnerat et al., 2000, Mohan & Gujar 2001, Medeiros et al.,
2006), um problema em potencial associado a esta primeira geração de algodão transgênico
expressando a toxina Cry1Ac, é a possibilidade de que populações de insetos possam desenvolver
resistência a esta toxina (Sayyed et al. 2000, Estela et al. 2004).
Alguns casos de resistência à toxina Cry mostraram ocorrer devido à alteração nos locais de
ligação desta toxina na membrana celular (Lee et al. 1995, Tabashnik et al. 1997, Jurat-Fuentes et
al. 2002). De acordo com Estela et al. (2004), estudos sobre a interação da proteína Cry com o
mesêntero de larvas pode determinar a eficiência de variedades de algodão Bt na expressão da
toxina, pois a demonstração do local de atuação e da forma de ação tem grande importância para a
potencialização de seus efeitos.
Estudos histopatológicos e ultra-estruturais têm mostrado a interação entre a toxina Bt com
o mesêntero em larvas de alguns lepidópteros, como Spodoptera frugiperda J.E. Smith
(Lepidoptera: Noctuidae), H. virescens (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae), Helicoverpa
armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae), Chilo suppressalis (Walker) (Lepidoptera: Pyralidea)
e Manduca sexta L. (Lepidoptera: Sphingidae) (Martin & Wolfersberger 1995, Fiúza et al. 1996,
Jurat-Fuentes et al. 2002, Estela et al. 2004, Ayra-Pardo et al. 2006, Dequech et al. 2007). No
entanto, não há relatos dessa interação em A. argillacea. Em decorrência dos questionamentos
sobre os possíveis efeitos diretos e indiretos causados nos organismos alvos, por meio da
utilização da toxina do algodão Bt, esta pesquisa teve como finalidade comprovar os impactos
sobre a morfofisiologia do mesêntero de A. argillacea alimentadas com algodão-Bt, esclarecendo
os níveis de alterações morfológicas e ultra-estruturais
.
34
Material e Métodos
A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Toxicologia de Inseticidas do Departamento
de Agronomia, no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal
da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e no Laboratório de Imunopatologia
Keizo Asami da Universidade Federal de Pernambuco.
Obtenção, Manutenção e Criação dos Insetos. As lagartas A. argillacea utilizadas nos
experimentos foram obtidas da criação estoque do Laboratório de Toxicologia de Inseticidas,
oriunda de Paulínia-SP, e foram mantidas em uma câmara climatizada a 25ºC, 70 ± 10% UR e
fotofase de 12h, empregando-se a metodologia de Santos & Boiça Júnior (2001). Os adultos
foram mantidos em gaiolas de PVC de 20cm x 19,5cm, sendo a extremidade inferior acomodada
em um prato para vasos de jardinagem de 20cm (diâmetro), forrado com papel toalha interfolhado
de 23cm x 20,5cm, e na extremidade superior coberta com tecido voil. Internamente as gaiolas
foram revestidas com papel sulfite branco para a obtenção das posturas. Os adultos foram
alimentados com solução de mel e água a 5%, embebida em algodão hidrófilo acondicionado em
tampa plástica. Diariamente, os papéis com posturas eram retirados e transferidos para gaiolas
iguais àquelas utilizadas para os adultos. Próximo à eclosão, foram oferecidas folhas de
algodoeiro cultivar isolinha suscetível AcalaDTL-90, retiradas do terço superior das plantas,
lavadas em solução de hipoclorito de sódio a 0,15% e enxaguadas com água. Retirou-se
posteriormente o excesso de umidade das folhas e seus pecíolos foram acondicionados em vidros
contendo água, objetivando a conservação das folhas. Para as larvas de primeiro e segundo
ínstares, as folhas eram trocadas a cada dois dias, para as larvas de ínstares mais avançados,
devido ao maior consumo de folhas, estas eram trocadas diariamente. As pupas foram separadas
por sexo e mantidas em gaiolas de PVC de 10cm de altura x 10cm de diâmetro até a emergência
dos adultos.
35
Instalação do Bioensaio. Larvas de A. argillacea no quarto ínstar (referente ao sétimo dia de
eclosão) foram transferidas e individualizadas por 24 horas em tubos Falcon de 15mL, sem
alimentação e mantidas nas mesmas condições descritas no item anterior. Posteriormente foram
submetidas a dois tratamentos cada um constando de dez repetições: Lagartas alimentadas com
algodão Bt AcalaDTL-90B e não Bt AcalaDTL-90, provenientes da Monsanto Brasil, São Paulo,
SP. Foram utilizados discos de folhas de 9mm de diâmetro, obtidos da parte central de folhas
medianas de algodão Bt e não Bt. Esses discos foram confeccionados em duplicatas, sendo um
oferecido às larvas e o outro congelado para posterior quantificação dos níveis da toxina Cry1Ac.
Antes e após os discos serem oferecidos às lagartas estes foram pesados para posterior cálculo da
quantidade de toxina ingerida e foram dispostos sobre papel de filtro umedecido em água
destilada, no interior da placa plástica, por um período de 20 minutos.
Quantificação da Toxina Cry1Ac. Os níveis da proteína Cry1Ac nas folhas de algodão Bt foram
quantificados, utilizando-se placas PathoScreen
®
já preparadas com anticorpos para Bt-
Cry1Ac/Cry1Ab ELISA e conjugados com a enzima peroxidase (Agdia
®
Inc., Elkhart, IN). Por
ocasião as amostras foram coletadas e acondicionadas em tubos Eppendorfs e congeladas até a
análise de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), para extração e, posterior,
quantificação dos níveis de expressão de Cry1Ac. Foram utilizadas quinze amostras de 0,027g de
folha. A extração da proteína Cry1Ac foi feita pelo maceramento das amostras em solução salina
fosfatada e Tween20 (PBST), nas concentrações de 1:5 (peso/volume).
O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorfs. A quantificação de Cry1Ac foi
feita empregando placa de ELISA, na qual foi adicionado 100µL da enzima peroxidase fornecida
junto ao kit ELISA adquirido da Agdia
®
Inc. (Elkhart, IN), nos 96 poços da placa. A placa foi
diagramada com adicionamento dos controles (branco e amostra não-Bt), com concentrações
36
decrescentes do positivo Cry1Ac de 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125ng/mL para a obtenção de
uma curva padrão objetivando estimar a quantidade de Cry1Ac nas amostras testadas e alíquotas
de 100µL de cada amostra por poço. A placa foi incubada em temperatura ambiente (25
o
C) por 2
horas e, então, realizado seis lavagens com PBST. Após as lavagens foi adicionado 100µL de
TMB (3,3’, 5,5’-Tetrametilbenzidina) e incubado por 15 minutos, quando então a reação foi
paralisada adicionando 50µL de ácido sulfúrico a 3M para possibilitar a leitura a 450nm.
Posteriormente, a placa foi submetida à leitura de absorvância a 450nm empregando leitora de
placa ELISA BioteK EL x 800
TM
(Absorbance Micropole Reader) (Dutton et al. 2002, Torres et
al. 2006).
Coleta do Mesêntero para Análise em Microscopia de Luz e Eletrônica de Transmissão
(MET). Foram coletados fragmentos do mesêntero de larvas de ambos os tratamentos após serem
imobilizadas a baixa temperatura (-4
o
C) por cinco minutos, fixados em seguida na solução de
glutaraldeído a 2,5% (tampão fosfato 0,1M, pH 7,2). Posteriormente foram lavados três vezes em
tampão e pós-fixados em tetróxido de ósmio (OsO
4
) a 2% em tampão fosfato 0,1 M e pH 7,2 por
1h. Em seguida procedeu-se a lavagem e a desidratação em séries crescentes de acetona por 30
min. cada, a temperatura ambiente. A infiltração foi realizada em resina EMBED812/Araldite
(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) e acetona em estufa a 70ºC por 48h para
polimerização. Cortes semifinos foram corados pelo azul de toluidina para análise em
microscopia de luz. Os cortes ultrafinos foram contrastados em acetato de uranila por 1h e em
citrato de chumbo por 10 min e analisado em microscópio Zeiss EM109.
Quantificação das Células Regenerativas do Mesêntero. A quantificação foi realizada
utilizando cinco secções de cortes semifinos, corados pelo azul de toluidina, obtidas da região
mediana do mesêntero de cinco lagartas. Cada lagarta correspondeu a uma repetição, sendo
utilizadas cinco repetições/tratamento. A captura de imagem foi efetuada por meio de câmera de
37
vídeo Sony
®
, acoplada ao microscópio Olympus
®
Bx50. A morfometria foi realizada através do
aplicativo de pontos, associado ao programa ImageLab 2000 para Windows 3x. Em cada
repetição (lâmina com a secção do corte) foram contadas células regenerativas em dez campos
aleatórios. O número médio de células regenerativas obtidas nas amostras (repetições) de lagartas
de A argillacea foi submetido a analise de freqüência de escolha e avaliados pelo teste qui-
quadrado, mediante o programa computacional SAS version 8.02 (SAS Institute 2001).
Resultados
As lagartas as alimentadas com algodão não Bt apresentaram histologicamente a parede do
mesêntero íntegra constituída por um epitélio do tipo simples e revestida externamente por duas
camadas de músculo, sendo a mais interna circular e a mais externa longitudinal (Fig 1A). No
epitélio foram facilmente observadas em cortes semifinos, as seguintes células: colunares com
borda em escova, protuberância citoplasmática e núcleo heterocromático; as caliciformes com a
câmara globosa delimitada pelas projeções da membrana plasmática, núcleo oval e basal; e as
células regenerativas na base do epitélio, com morfologia piramidal, núcleo volumoso e nucléolo
bem evidente (Figs. 1B e 1C). Notou-se ainda a presença da membrana peritrófica envolvendo o
material ingerido (Fig. 1D)
A análise quantitativa dos discos de folhas do algodão Bt oferecidos as larvas do quarto
instar de A. argillacea apresentaram nível médio de toxina Cry1Ac (média ± EP) de 0,023 ± 0,007
µg de Cry1Ac/g de peso fresco de folhas. Verificou-se que em média as larvas ingeriram cerca de
0,183 ± 0,077 ng de Cry1Ac. Histologicamente o mesêntero das larvas alimentadas com esses
discos mostraram alterações bem expressivas, após 20 minutos de ingestão. Em cortes semifinos
foi possível detectar alterações tanto na lâmina epitelial como na musculatura. No epitélio
evidenciaram-se algumas áreas com estratificação e em outras áreas, mesmo o epitélio
38
permanecendo simples, este apresentou projeções para o lúmen dando um aspecto pregueado ao
mesmo (Figs 2A e 2B). Foram observadas expressivas modificações morfológicas nas células
colunares e caliciformes. As células colunares apresentaram-se mais alongadas e delgadas e no
seu citoplasma numeroso vacúolos de tamanho e forma variados (Fig. 2C). Um grande número de
células caliciformes mostrou deformações na sua forma característica (cálice) e adquiriram
aspecto alongado, oval, globoso e fusiforme, além de redução ou ausência das projeções da
membrana plasmática que delimitam a câmara globosa (Figs. 2D e 3A). A camada muscular
apresentou evidências de degeneração (Fig. 3A) e em algumas cortes não foi detectada a presença
da membrana peritrófica.
A análise quantitativa das células regenerativas mostrou que a toxina Cry1Ac ocasionou uma
redução significativa no número dessas células na região mediana do mesêntero nas larvas em
relação à testemunha (GL = 4,43, t = -6,15, P = 0,0025) (Fig. 4). No entanto, as poucas células
observadas apresentaram-se bem preservadas na base do epitélio, com características morfológicas
semelhantes ao grupo controle, porém sem nucléolo evidente (Fig. 3B).
A análise ultra-estrutural revelou que as células colunares nas larvas alimentadas com
algodão não Bt apresentaram microvilos bastante longos e bifurcados, mitocôndrias com tamanho
e forma variada (polimorfismo mitocondrial) na região apical, e na região basal, dobras da
membrana plasmática as quais são conhecidas como labirinto basal (Figs. 3C, 3D e 5A). Nas
larvas alimentadas com algodão Bt observaram-se alterações nos microvilos das células colunares,
os quais apresentaram-se em menor número, mais curtos e alguns em degeneração (Fig. 5B ).
Notou-se ainda que na região apical dessas células houve uma menor variação na morfologia das
mitocôndrias (Fig. 5C) e na região basal, ausência de dobras da membrana plasmática (Fig. 5D).
A célula caliciforme nas larvas alimentadas com algodão não Bt apresentou numerosas
projeções da membrana voltadas para a câmara globosa, com núcleo basal, de morfologia oval,
39
bastante heterocromático e nucléolo bem evidente (Fig. 6A). Já nas larvas alimentadas com
algodão Bt, essas células apresentaram degeneração das projeções da membrana e alteração na
morfologia nuclear (Fig. 6B).
As células regenerativas e endócrinas não apresentaram modificações ultra-estruturais
significativas entre os tratamentos, onde nas regenerativas o citoplasma foi bastante denso com
predominância de polissomos livres, núcleo central, volumoso e com cromatina dispersa (Figs. 6C
e 6D), enquanto as endócrinas células mostram morfologia alongada, contendo vários grânulos,
em geral concentrados na região basal da célula (Fig. 6A).
Discussão
Após 20 minutos de ingestão de cerca de 0,183 ± 0,077 ng de Cry1Ac, presente nos discos
de folhas de algodão Bt AcalaDTL-90B, as larvas do quarto instar de A. argillacea apresentaram
modificações na parede do mesêntero com alterações morfológicas e ultra-estruturais nas células
colunares e caliciformes, redução no número das células regenerativas, bem como degeneração da
camada muscular, além de provocar destruição da membrana peritrófica em algumas regiões do
mesêntero. As modificações morfológicas e ultra-estruturais observadas nas células colunares
foram similares às reportadas por Lane et al. (1989), que alimentando larvas do quarto instar de
M. sexta, com 10µL de δ-endotoxina do B. thuringiensis var. Kurstaki observaram após 1 a 5
minutos de exposição á toxina, modificações na morfologia dos microvilos e presença de vacúolos
no citoplasma associado ao aparelho de Golgi, e que após 15 a 30 minutos de tratamento com a
toxina, as células colunares apresentaram-se mais vacuolizadas e as mitocôndrias começaram a
apresentar morfologia anormal. No entanto, os resultados da presente pesquisa revelaram que 20
minutos de ingestão de folhas de algodão Bt já foram suficientes para ocasionar essas alterações
bem como modificações na morfologia das mitocôndrias e degeneração de alguns microvilos.
40
Copping & Menn (2000) mencionam que quando ocorre à associação das δ-endotoxinas
com receptores específicos na membrana apical das células colunares há formação de poros
aumentando sua permeabilidade, produzindo assim os efeitos observados nestas células. No
entanto, as alterações nas microvilosidades e modificações na morfologia das mitocôndrias
sugerem uma atuação direta ou indireta da toxina Cry1Ac também nas estruturas citoplasmáticas,
pois estudos indicaram que as toxinas Cry podem interagir com proteínas intracelulares do
citoesqueleto, especialmente a actina, durante as fases iniciais do seu modo de ação (Griffitts et al.
2003). Existem também evidências para a hipótese de ativação do mecanismo de apoptose pela
proteína Cry1Ac, após sua ligação com as caderinas, proteínas de cobertura da membrana
plasmática (Zhang et al. 2005). Assim, as modificações nas microvilosidades podem ser
explicadas pela interferência da toxina Cry1Ac com a actina, uma proteína do citoesqueleto
presente nessas especializações, enquanto que as alterações nas mitocôndrias podem estar
relacionadas ao início do processo de apoptose desencadeado pela toxina, já que esta organela
participa diretamente desse processo (Ribeiro et al. 2004, van Ginkel et al. 2007).
As modificações evidenciadas nas células caliciformes, no mesêntero das larvas alimentadas
com algodão Bt indica que as células colunares não são os únicos alvos da toxina Cry1Ac como
parece ser reportada na literatura de um modo geral. Na membrana apical das células caliciformes
a enzima V-ATPase (complexo vacuolar ATPase) representa a principal fonte de energia servindo
como um transportador iônico do H
+
/K
+
por todo o intestino médio do inseto (Klein et al. 1996,
Wieczorek et al. 1999, Gringorten 2001), e foi demonstrado por Krishnamoorthy et al. (2007) em
H. virescens que a subunidade A da V-ATPase funciona também como sítio de ligação para a
toxina Cry1Ac. Essa subunidade é parte periférica catalítica do complexo vacuolar ATPase, sendo
essencial para a função desta enzima (Wieczorek et al. 2000). Assim, os resultados do presente
trabalho reforçam a hipótese de que Cry1Ac ligada a V-ATPase, interfere com o transporte iônico
41
do H
+
/K
+
e, conseqüentemente, desestabiliza tanto o equilíbrio iônico como o pH levando a um
colapso do metabolismo (Knowles 1994).
As células regenerativas e endócrinas não apresentaram modificações morfológicas ou ultra-
estruturais nas larvas alimentadas com algodão Bt. Porém, verificou-se uma redução significativa
do número de células regenerativas, o que pode está relacionada ao processo de diferenciação das
mesmas para reparar os danos provocados nas células colunares e caliciformes, evidenciado pela
estratificação no epitélio. De acordo com Loeb et al. (2001), analisando cultura de células
epiteliais do mesêntero de larvas de H. virescens, tratadas com doses subletais de toxina das
linhagens AA 1-9 (800pg/µL) e HD-73 (600pg/µL) de B. thuringiensis, ao final de dois dias
observaram que a linhagem HD-73 foi mais eficiente por conter a toxina Cry1Ac (Gould &
Anderson 1991), produzindo redução no número de células colunares e caliciformes, além da
diferenciação das células regenerativas para reposição dessas células. Devemos mencionar ainda
que através de técnicas de imunohistoquimica, foi possível determinar que a célula colunar é a
principal fonte de produção do fator de diferenciação das células do mesêntero (MDF), e que seus
níveis aumentaram em culturas de células colunares tratadas com Bt (Loeb et al. 1999, Goto et al.
2000, Loeb et al. 2001). Dessa forma, é possível que as células colunares tenham liberado este
fator promovendo a diferenciação das células regenerativas levando assim a estratificação do
epitélio, e consequentemente reduzindo seu número. Já com relação às células endócrinas, a
ausência de modificações pode esta relacionada ao fato dessas células não possuírem receptores
para a toxina Cry1Ac ou por serem do tipo aberto, não entrando assim em contato com o lúmen
(Cavalcante & Cruz-Landim 1999), e, por conseguinte não interagindo com toxina. Assim,
conclui-se que após ingestão em média de 0,183 ± 0,077 ng de Cry1Ac, por um período de 20
minutos com algodão Bt AcalaDTL-90B, foram suficientes para ocasionar alterações a níveis
morfológico e ultra-estrutural no mesêntero de larvas do quarto instar de A. argillacea, não apenas
42
nas células colunares e camada muscular, mas também nas células caliciformes, bem como
redução significativa das células regenerativas.
Agradecimentos
À CAPES pela concessão da bolsa de estudo ao primeiro autor, possibilitando a realização
deste trabalho, a Álvaro Aguiar Coelho Teixeira (DMFA/UFRPE) pelas valiosas contribuições que
permitiram o aperfeiçoamento deste trabalho e a Jorge Braz Torres (DEPA/UFRPE) pelo auxílio na
quantificação da toxina Cry1Ac.
Literatura Citada
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48
Figura 1. Microscopia de luz do mesêntero de A. argillacea alimentadas com algodão não Bt.
(A) Detalhe da musculatura e epitélio. Barra = 100µm. (B) Células epiteliais. Barra = 100µm.
(C) Detalhe das células: caliciforme e regenerativa. Barra = 25µm. (D) Notar membrana
peritrófica entre o epitélio e o material ingerido. Barra = 200µm. Ep – epitélio simples, MC –
músculo circular, ML – músculo longitudinal, CC – célula colunar, CCa – célula caliciforme,
Setas – célula regenerativa, N – núcleo, PC – protuberância citoplasmática, C – câmara
globosa, BE – borda em escova, Ponta de seta – membrana peritrófica, M – material ingerido.
Coloração Azul de Toluidina.
Ep
M
D
CCa
C
B
CCa
C
N
BE
PC
A
MC
ML
Ep
CC
49
C
CC
V
V
CC
L
Epe
A
L
P
B
CCao
CCa
CCal
CCaf
D
Figura 2. Microscopia de luz do mesêntero de A. argillacea alimentadas com algodão Bt. (A)
Epitélio com estratificação. Barra = 100µm. (B) Epitélio simples com pregas. Barra = 25µm. (C)
Célula colunar com numerosos vacúolos. Barra = 25µm. (D) Células caliciformes com morfologia
variada. Barra = 25µm. Epe – epitélio estratificado, P – pregas do epitélio, CC – célula colunar, V
– vacúolo, CCa – célula caliciforme, CCaf – célula caliciforme fusiforme, CCao – célula
caliciforme oval, CCal – célula caliciforme alongada e ausência de projeções da membrana
plasmática, L - lúmen. Coloração Azul de Toluidina.
50
A
CCag
CCao
M
CCa
B
MVb
C
MV
Mi
Mi
Mi
Mi
D
M
CC
Cr
CCa
CCa
Figura 3. Microscopia de luz do mesêntero de A. argillacea alimentadas com algodão Bt. (A).
Células caliciformes com morfologia alterada e com redução nas projeções da membrana
plasmática. Barra = 25µm. (B) Célula regenerativa. Barra = 25µm. Coloração Azul de Toluidina.
(C e D) Microscopia eletrônica de transmissão da região apical da célula colunar das larvas
alimentadas com algodão não Bt. Barra = 0,5µm e Barra = 1,4µm, respectivamente. CCa – célula
caliciforme, CCao – célula caliciforme oval, CCag – célula caliciforme globosa, Seta – projeções
da membrana plasmática, M – músculo em degeneração, CC – célula colunar, Cr – célula
regenerativa. MV – microvilos, MVb – microvilo bifurcado, Mi – mitocôndrias.
51
Tratamentos
Controle Bt
Nº médio de células regenerativas
0
20
40
60
80
*
NBt
Figura 4. Número médio de células regenerativas do mesêntero de larvas de A. argillacea,
alimentadas com folha de algodoeiro não-Bt (AcalaDTL-90) e Bt (AcalaDTL-90B). Temp: 25ºC,
UR: 70 ± 10% e fotofase de 12h.
*
Médias (± EP) diferem estatisticamente pelo teste de “t” entre
os tratamentos (GL = 4,43, t = -6,15, P = 0,0025).
52
Figura 5. Eletromicrografias de transmissão: (A) Região basal da célula colunar de lagarta
alimentada com algodão não Bt. Barra = 0,5µm. (B e C) Região apical da célula colunar de larva
alimenta com algodão Bt. Barra = 0,5µm e Barra = 0,8µm, respectivamente. (D) Região basal da
célula colunar de larva alimentada com algodão Bt. Barra = 0,5µm. LB - labirinto basal, MVd –
microvilos em degeneração, Mi – mitocôndrias, M – músculo, Seta – ausência de labirinto basal,
V - vacúolos.
B
MVd
C
Mi
Mi
Mi
LB
A
V
V
M
D
53
A
CCa
CE
CCa
CCaa
B
C
N
Po
M
N
D
Figura 6. Eletromicrografias de transmissão: (A) Células: caliciforme e endócrina do
mesêntero de larva alimentada com algodão não Bt. Barra = 0,5µm. (B) Célula caliciforme do
mesêntero de larva alimentada com algodão Bt. Barra = 3,3µm. (C) e (D) célula regenerativa
do mesêntero de larva alimentada com algodão Bt. Barra = 1,2µm e Barra = 0,2µm,
respectivamente. CCa – célula caliciforme, CE – célula endócrina, Ccaa – célula caliciforme
alterada, M – mitocôndria, N – núcleo, Po - polissomos.
54
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