( PDF ) Análise comparativa do genoma de dois isolados de Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) provenientes de diferentes hospedeiros

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DANIELLE RIBEIRO DE BARROS

ANÁLISE COMPARATIVA DO GENOMA DE DOIS ISOLADOS DE Cowpea aphid-

borne mosaic virus (CABMV) PROVENIENTES DE DIFERENTES HOSPEDEIROS

Tese apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Fitopatologia, para obtenção do

título de Doctor Scientiae

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

2007

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DANIELLE RIBEIRO DE BARROS

ANÁLISE COMPARATIVA DO GENOMA DE DOIS ISOLADOS DE Cowpea aphid-

borne mosaic virus (CABMV) PROVENIENTES DE DIFERENTES HOSPEDEIROS

Tese apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Fitopatologia, para obtenção do

título de Doctor Scientiae

APROVADA: 27 de setembro de 2007.

Prof. Murilo Geraldo de Carvalho

(Co-orientador)

Pesq. Poliane Alfenas Zerbini

(Co-orientadora)

Pesq. Eduardo Chumbinho de Andrade

Prof. Olinto Liparini Pereira

Prof. Francisco Murilo Zerbini Júnior

(Orientador)

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AGRADECIMENTOS

À meu pai Nilton de Barros Junior por acreditar em mim em todos os momentos da

minha vida e tornar possível a realização de um sonho;

A Talita Barros amiga de todas as horas e torcedora fiel pelo meu sucesso;

Aos meus irmãos Sergius Vinicius, Giselle Jean Pierre Ana Luisa Pedro Luis e Nilton

César por me apoiarem nesta jornada e demonstrarem todo seu carinho e atenção ao longo

destes anos;

Aos amigos Renata, Ricardo, Verônica, Daniela, Liliane e Pedro que participaram

ativamente da minha vida em Viçosa, fazendo com que eu pudesse crescer tanto pessoal

quanto profissionalmente;

Aos amigos, Giselle, Renatinha, Mara, Kiriaque, Josefina, Cassinha, e Simone pela

amizade e companheirismo;

Ao professor Murilo Zerbini, orientador e amigo de todas as horas, que me deu a

oportunidade de me encontrar e amar a minha profissão;

Aos amigos do Laboratório e da vida, Jose Evando, Eduardo; Poliane, Gloria e Sandra

por me ajudarem com suas experiências a realizar o trabalho da melhor forma possível;

Aos companheiros do Laboratório de Virologia Vegetal Molecular, Alison, Alvaro, Ana

Verônica, Bruno, Carlos, Carol, Fernanda, Fabio, Jorge, Lidiane, Renan, Riani e Sávio por

ajudarem de alguma forma para o bom andamento do trabalho;

Ao professor Murilo Geraldo de Carvalho por toda atenção e ensinamentos passados ao

longo destes anos;

A Universidade Federal de Viçosa por possibilitar a minha formação;

Aos professores do curso de Pós-Graduação em Fitopatologia da UFV por seus

ensinamentos;

iii

Aos funcionários Joaquim, Fizinho e Délio pelo apoio para a realização deste trabalho e

à amizade durante este tempo;

A CAPES pelo suporte financeiro ao projeto;

A todos que dê uma forma direta ou indireta fizeram o trabalho acontecer.

Obrigada a todos.

BIOGRAFIA

DANIELLE RIBEIRO DE BARROS, natural do Rio de Janeiro, RJ, nascida a 16 de

outubro de 1972, filha de Nilton de Barros Junior e Marilena Ribeiro de Barros. Conclui o

primeiro grau no colégio Municipal Albert Einstein em 1987, e o segundo grau na Escola

Técnica Federal de Química do Rio de Janeiro em 1994, ambos em seu Município Natal.

Em 1996 ingressou no curso de Agronomia na Universidade Federal de Viçosa, onde

se graduou como Engenheira Agrônoma em março de 2001. Em abril do mesmo ano

ingressou no curso de mestrado do programa de Pós-Graduação do Departamento de

Fitopatologia da Universidade Federal de Viçosa. Em agosto de 2003, ingressou no curso de

Doutorado do programa de Pós-Graduação do Departamento de Fitopatologia da

Universidade Federal de Viçosa na cidade de Viçosa, Minas Gerais. Em 27 setembro de 2007,

concluiu o doutorado com a defesa da tese.

SUMÁRIO

Resumo..............................................................................................................................vi

Abstract .............................................................................................................................viii

Introdução..........................................................................................................................1

Revisão de Literatura ........................................................................................................5

1. Aspectos gerais do maracujazeiro............................................................................5

2. O endurecimento dos frutos do maracujazeiro.........................................................6

3. A família Potyviridae...............................................................................................9

3.1. Ciclo de infecção de potyvírus..........................................................................13

3.1.1. Tradução do RNA genômico e produção das proteínas virais..................13

3.1.2. Replicação do genoma ..............................................................................16

3.1.3. Movimento do vírus na planta ..................................................................20

4. Taxonomia de potyvírus...........................................................................................24

Material e Métodos............................................................................................................28

1. Manutenção dos isolados virais................................................................................28

2. Clonagem e sequenciamento do genoma dos isolados BR1 e MG-Avr...................28

3. Comparações de sequências e análise filogenética ..................................................32

Resultados e Discussão .....................................................................................................33

Referências Bibliográficas ................................................................................................47

RESUMO

BARROS, Danielle Ribeiro de, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2007.

Análise comparativa do genoma de dois isolados de Cowpea aphid-borne mosaic virus

(CABMV) obtidos de diferentes hospedeiros. Orientador: Francisco Murilo Zerbini

Júnior. Co-orientadores: Elizabeth Pacheco Batista Fontes e Murilo Geraldo de Carvalho.

No Brasil e em outros países onde se cultiva o maracujazeiro à doença viral

denominada “endurecimento dos frutos” é um fator limitante à produção. Durante muitos anos

esta virose esteve associada a uma única espécie de potyvirus, o Passion fruit woodiness virus

(PWV). No entanto, estudos conduzidos ao longo dos últimos 20 anos demonstraram que

duas outras espécies de potyvírus, o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) e o East

Asian Passiflora virus (EAPV), também podem causar a mesma doença. As plantas infectadas

apresentam mosaico e endurecimento do pericarpo dos frutos. No Brasil, foi demonstrado

recentemente, através de caracterização molecular, que isolados de potyvírus causando

endurecimento dos frutos anteriormente classificados como PWV com base em características

biológicas e sorologia são na verdade isolados de CABMV. Os diversos isolados analisados

foram capazes de infectar espécies de leguminosas como o feijoeiro comum (Phaseolus

vulgaris) e o caupi (Vigna unguiculata). Até o momento, somente um isolado de CABMV

(CABMV-Zimbábue, obtido de caupi) teve seu genoma completamente sequenciado. Para

alguns isolados brasileiros, a seqüência correspondente à região codificadora da proteína

capsidial e a região 3’ não traduzida foram determinadas. A análise destas sequências não foi

capaz de fornecer informações capazes de explicar as diferenças biológicas observadas entre

os isolados. O objetivo deste trabalho foi obter a sequência de nucleotídeos completa de dois

isolados de CABMV do Brasil, um deles provenientes de plantas de maracujá-amarelo

apresentando sintomas de endurecimento dos frutos (isolado MG-Avr, que também infecta

vii

feijão e caupi), e outro proveniente de amendoim (isolado BR1, também infecta feijão e caupi

porém não infecta maracujá). Os isolados virais foram mantidos e multiplicados em plantas de

caupi cv. Pitiúba. O RNA viral foi purificado a partir de preparações virais concentradas e

utilizado como molde para a síntese de cDNAs, que por sua vez foram utilizados como molde

para reações de PCR longo utilizando-se uma DNA polimerase com atividade de correção de

erro e diferentes combinações de oligonucleotídeos degenerados e específicos. As sequências

de nucleotídeos dos isolados BR1 e MG-Avr são 95% idênticas e apresentam 87 e 86% de

identidade com o CABMV-Z, respectivamente. Ambos os isolados apresentam todas as

características típicas de potyvírus, incluindo o potencial de codificar uma poliproteína que

sofre autoproteólise gerando de 8 a 10 proteínas virais. Dessas proteínas, P3 e VPg são as

mais conservadas entre os dois isolados, com 99% de identidade para a seqüência de

aminoácidos, e a CP é a menos conservada, com 85% de identidade. A análise filogenética

das seqüências completas de nucleotídeos indicou que os dois isolados brasileiros se

agruparam juntamente com o isolado Z, no grupo de espécies de potyvírus que infectam

leguminosas, no subgrupo do Bean common mosaic virus (BCMV). Estudos de mutagênese e

análise do fenótipo poderão identificar de forma definitiva possíveis regiões ou aminoácidos

que possam estar envolvidos na diferenciação biológica dos dois isolados.

viii

ABSTRACT

BARROS, Danielle Ribeiro de, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, September 2007.

Comparative analysis of the genome of two isolates of Cowpea aphid-borne mosaic

virus (CABMV) obtained from different hosts. Advisor: Francisco Murilo Zerbini

Júnior. Co-Advisers: Elizabeth Pacheco Batista Fontes and Murilo Geraldo de Carvalho.

In Brazil and in other countries where passionfruit is grown, the viral disease known

as passionfruit woodiness is a limiting factor for production. For many years this disease was

associated with a single potyvirus, Passion fruit woodiness virus (PWV). However, studies

conducted over the last 20 years demonstrated that two additional potyviruses, Cowpea aphid-

borne mosaic virus (CABMV) and East Asian Passiflora virus (EAPV) can also cause

passionfruit woodiness. Plants infected by either one of these three viruses display mosaic in

the leaves and woodiness of the pericarp of the fruit. In Brazil, molecular analysis has shown

that several potyvirus isolates previously classified as PWV based on biological and

serological properties are actually CABMV isolates. These isolates are capable of infecting

legume crops such as common bean (Phaseolus vulgaris) and cowpea (Vigna unguiculata).

To this date, only one CABMV isolate (CABMV-Zimbabwe, obtained from cowpea) has

been completely sequenced. For some Brazilian isolates, the capsid protein (CP) coding

region and the 3’-untranslated region have been sequenced. Sequence analysis did not indicate

any features that could be correlated with biological differences among the isolates. The

objective of this work was to determined the complete genomic sequence of two CABMV

isolates from Brazil, one obtained from passionfruit with woodiness symptoms (isolate MG-

Avr, which also infects bean and cowpea), and one obtained from peanut (isolate BR1, which

also infects bean and cowpea, but does not infect passionfruit). Both isolates were maintained

in cowpea plants of the cultivar Pitiúba. Viral RNA was purified from concentrated virions

and used as a template for cDNA synthesis, which was then used as a template for long range

PCR using a high fidelity DNA polymerase and different combinations of degenerate and

specific primers. The nucleotide sequences of isolates BR1 and MG-Avr are 95% identical

and display 87 and 86% identity with CABMV-Z, respectively. Both isolates have the typical

potyvirus genome features, including the potential to encode a polyprotein which can generate

8 to 10 putative viral proteins by autoproteolysis. Among these putative viral proteins, P3 and

VPg are the most conserved between the two isolates, with 99% amino acid sequence identity,

and the CP is the least conserved, with 85% identity. Phylogenetic analysis indicates that the

two Brazilian isolates group with CABMV-Z in the legume-infecting species cluster, and in

the Bean common mosaic virus (BCMV) subgroup. Mutagenesis studies and phenotypic

analysis could identify genomic regions or amino acids involved in the biological differences

between the two isolates.

INTRODUÇÃO

A produção de maracujá possui grande importância econômica no Brasil.

Atualmente, o Brasil aparece nas primeiras posições em termos de produção mundial, e

a cultura está presente em quase todos os estados brasileiros.

A família Passifloraceae está dividida em duas tribos: Paropsieae e

Passiflorieae. A tribo Passiflorieae está representada no continente americano por

quatro gêneros: Ancistrothyrsus Harms, Dilkea Mast., Mitostemma Mast. e Passiflora L.

O gênero Passiflora possui aproximadamente 520 espécies, distribuídas principalmente

em regiões tropicais e subtropicais. Dessas, cerca de 150 são nativas do Brasil. As

espécies mais difundidas e cultivadas comercialmente são Passiflora edulis Sims f.

flavicarpa Deg. (maracujá-amarelo), P. edulis f. edulis Sims (maracujá-roxo), P. alata

Dryand (maracujá-doce), P. ligularis Juss. e P. quadrangularis L. (Bruckner, 1997;

Silva & São José, 1994; Souza & Meletti, 1997).

O endurecimento dos frutos do maracujazeiro é a virose mais importante da

cultura em todo o mundo. Foi descrito pela primeira vez na Austrália em 1901 por

Allen, citado por Cobb (1901) e Noble (1928). Até pouco tempo acreditava-se que era

causado somente pelo Passionfruit woodiness virus (PWV), porém o seqüenciamento

do gene da proteína capsidial demonstrou que a estirpe da África do Sul do PWV

constituía na verdade em uma outra espécie do gênero Potyvirus, originalmente

denominada South African passiflora virus (SAPV) (McKern et al., 1994). Análises

posteriores determinaram que o SAPV consistia na verdade um isolado do Cowpea

aphid-borne mosaic virus (CABMV) (Sithole-Niang et al., 1996). Recentemente, uma

terceira espécie de potyvírus designada East Asian Passiflora virus (EAPV) foi

identificada no Japão causando endurecimento dos frutos do maracujazeiro (Iwai et al.,

2006b). Desta forma, o EAPV, juntamente com o PWV e o CABMV, são as espécies

reconhecidas até o momento como causadoras da doença.

Os sintomas característicos do endurecimento dos frutos causado tanto pelo

PWV quanto pelo CABMV ou EAPV são praticamente idênticos, e incluem mosaico,

deformação foliar e principalmente má-formação dos frutos, que apresentam-se

deformados e com o pericarpo endurecido (Bruckner et al., 2002). No Brasil, até

meados dos anos 90, isolados virais causando endurecimento dos frutos em

maracujazeiro haviam sido identificados exclusivamente com base em características

biológicas e sorológicas, e em todos os casos o PWV havia sido relatado como agente

causal (Chagas et al., 1981; Inoue et al., 1995). Entretanto, a análise molecular da

região codificadora da proteína capsidial de diversos isolados brasileiros, inclusive de

alguns anteriormente identificados como PWV, demonstrou que o CABMV é o

principal, senão o único, agente associado à doença no país (Nascimento et al., 2006;

Nascimento et al., 2004).

As três espécies virais causadoras do endurecimento dos frutos do maracujazeiro

(PWV, CABMV e EAPV) pertencem ao gênero Potyvirus da família Potyviridae,

possuindo partículas alongadas e flexuosas medindo aproximadamente 715×13 nm e

genoma composto por uma única molécula de RNA de fita simples, com

aproximadamente 10.000 nucleotídeos. O RNA genômico possui uma única fase aberta

de leitura (open reading frame, ORF) cuja tradução gera uma proteína que sofre

autoproteólise, gerando de 8 a 10 produtos finais (Berger et al., 2005). A transmissão

natural dos potyvírus se dá por meio de afídeos, com uma relação vírus-vetor do tipo

não-circulativa (Berger et al., 2005; Dipiero et al., 2006; Urcuqui-Inchima et al., 2001),

além de serem transmitidos por extrato vegetal tamponado e por enxertia (Costa et al.,

1995; McKern et al., 1994). Os três vírus infectam naturalmente plantas de diversas

espécies de leguminosas, e artificialmente alguns membros das famílias

Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae e Cucurbitaceae (Taylor & Greber,

1973; Teakle & Widermuth, 1967).

A caracterização biológica, sorológica e molecular de 14 isolados de potyvírus

causadores de endurecimento dos frutos do maracujazeiro, provenientes de sete estados

brasileiros, indicou que todos pertenciam à espécie CABMV (Nascimento et al., 2006;

Nascimento et al., 2004). Todos os isolados foram capazes de infectar duas cultivares de

caupi (Pitiúba e Clay). Entretanto, foram encontradas diferenças nos sintomas induzidos

pelos isolados em plantas de feijoeiro e caupi. Essa variabilidade biológica refletiu-se na

variabilidade molecular entre os isolados: as seqüências de aminoácidos de suas

proteínas capsidiais apresentaram de 6 a 15% de diferenças. A análise filogenética

baseada na proteína capsidial demonstrou que os isolados se agrupam principalmente

com base na origem geográfica, e não com base em suas gamas de hospedeiros. Assim,

o isolado CABMV-BR1, obtido de planta de amendoim coletada no estado da Paraíba e

que não infecta maracujá, agrupou-se juntamente com os isolados brasileiros de

CABMV obtidos de maracujá. Já o isolado CABMV-SAP, obtido de maracujá amarelo

na África do Sul, apresentou um relacionamento mais distante com os isolados

brasileiros (Nascimento et al., 2006).

A região seqüenciada até o presente para os isolados brasileiros (proteína

capsidial e 3`-NTR) corresponde a aproximadamente 10% do genoma viral. A análise

dessas regiões não permitiu a identificação de fatores que possam estar relacionados

com as diferenças biológicas entre os isolados (Nascimento et al., 2006).

Atualmente, dentre todos os isolados de CABMV descritos, somente um isolado

obtido de planta de caupi coletada no Zimbábue (África) encontra-se completamente

seqüenciado (Mlotshwa et al., 2002). Desta forma, o presente trabalho teve como

objetivos sequenciar o genoma completo de dois isolados de CABMV provenientes dos

estados da Paraíba (isolado CABMV-BR1) (Pio-Ribeiro et al., 2000) e Minas Gerais

(isolado MG-Avr) (Costa, 1996; Nascimento et al., 2006), a fim de realizar uma análise

comparativa entre eles e verificar possíveis diferenças que possam identificar regiões

genômicas ou até mesmo aminoácidos diferentes responsáveis pelas diferentes

propriedades biológicas destes isolados.

REVISÃO DE LITERATURA

1. Aspectos gerais do maracujazeiro

Os maracujazeiros (Passiflora spp.) são plantas da família Passifloraceae

originárias da América Tropical. O Brasil é o centro de origem de um grande número de

espécies da família. A família Passifloraceae está dividida em duas tribos: Paropsieae e

Passiflorieae. A tribo Passiflorieae está representada no continente latino-americano

por quatro gêneros: Ancistrothyrsus Harms, Dilkea Mast., Mitostemma Mast. e

Passiflora L. O gênero Passiflora possui aproximadamente 520 espécies (Cervi, 2005).

O maracujá-amarelo, P. edulis f. flavicarpa, é a espécie comercialmente mais

cultivada no Brasil. Acredita-se que tenha sido resultado do cruzamento entre P. edulis

e uma espécie próxima, possivelmente P. ligularis, ou uma mutação em P. edulis, ou

ainda seria uma forma mutante originária da Austrália (Oliveira & Ferreira, 1991).

A partir do final da década de 60 ocorreu grande expansão da cultura do

maracujazeiro no Brasil. Atualmente o plantio de maracujá-amarelo está presente em

quase todos os estados, destacando-se como uma cultura que requer uso intensivo de

mão-de-obra. Em 1975, Bahia e Minas Gerais eram responsáveis por 55% da produção

nacional. Em 1993, os principais estados produtores eram Pará, São Paulo, Minas

Gerais, Bahia, Rio de Janeiro e Sergipe, que representavam 97% de toda a produção

nacional (revisado por Nascimento et al., 2006). Em 2003, os estados da Bahia, Espírito

Santo, São Paulo e Rio de Janeiro eram os principais produtores, representando

aproximadamente 57% da produção nacional. Esses dados demonstram uma dificuldade

no estabelecimento da cultura de forma economicamente viável a longo prazo, o que

ocorre principalmente devido à incidência de doenças de difícil controle.

2. O endurecimento dos frutos do maracujazeiro

No Brasil, as doenças constituem o principal fator que impede uma maior

expansão e produtividade dos cultivos de maracujá-amarelo e de maracujá-doce. Um

dos principais problemas é a doença conhecida como endurecimento dos frutos, que

constitui a virose mais importante da cultura em todo o mundo. Após o primeiro relato

da doença na Austrália (Cobb, 1901), outros relatos ocorreram na África (McKern et al.,

1994) e Américas (Chagas et al., 1981). A caracterização biológica e sorológica dos

isolados virais indicava que todos pertenciam à mesma espécie do gênero Potyvirus,

denominada Passion fruit woodiness virus (PWV). Entretanto, com o advento das

técnicas moleculares, verificou-se que pelo menos duas outras espécies do gênero estão

associadas à doença: Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), presente na África

e no Brasil, e East Asian Passiflora virus (EAPV), presente no Japão (Iwai et al.,

2006b; McKern et al., 1994; Nascimento et al., 2006; Nascimento et al., 2004; Sithole-

Niang et al., 1996). Embora apresentem propriedades biológicas e sorológicas muito

semelhantes, as três espécies possuem seqüências de nucleotídeos bastante distintas. É

interessante notar que, embora a seqüência do genoma completo esteja disponível para

isolados de CABMV (Mlotshwa et al., 2002) e EAPV (Iwai et al., 2006a), até hoje

nenhum isolado de PWV foi completamente seqüenciado.

As espécies virais causadoras do endurecimento dos frutos do maracujazeiro

(PWV, CABMV e EAPV) pertencem ao gênero Potyvirus da família Potyviridae.

Possuem partículas alongadas e flexuosas medindo aproximadamente 715 x 13 nm e

genoma composto por uma única molécula de RNA de fita simples, sentido positivo,

com aproximadamente 10.000 nucleotídeos. Suas gamas de hospedeiros incluem

essencialmente espécies das famílias Passifloraceae e Fabaceae, além de alguns

membros das famílias Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae e Cucurbitaceae

(Iwai et al., 1996; Nascimento et al., 2006; Taylor & Greber, 1973). Os sintomas

foliares incluem mosaico de intensidade variada, bolhosidade e distorção foliar. Os

frutos são freqüentemente deformados, de tamanho reduzido e com o pericarpo

endurecido e espesso em comparação com frutos de plantas sadias (Bruckner et al.,

2002). A diminuição do ciclo produtivo das plantas aliada à deformação dos frutos e à

redução na produção da polpa ocasiona queda drástica da produtividade e produção de

frutos sem valor comercial. Conseqüentemente, a viabilidade econômica do pomar é

reduzida (Bruckner et al., 2002; Gioria et al., 2000; Rezende, 1994). Na maioria dos

estados brasileiros, o maracujá-amarelo é cultivado durante apenas um ano devido à

incidência do endurecimento dos frutos, quando apresenta potencial para exploração

comercial durante 3 a 4 anos.

O endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Brasil apresenta características

semelhantes às da doença descrita originalmente na Austrália. A doença já foi relatada

nos principais estados produtores, e em todos os casos o agente etiológico foi

identificado como PWV, com base em características biológicas e sorológicas (Bezerra

et al., 1995; Chagas et al., 1981; Chagas et al., 1992; Costa, 1996; Inoue et al., 1995;

Trindade et al., 1999). No entanto, análises da sequência de aminoácidos da CP de

diversos isolados previamente identificados como PWV demonstraram que na verdade

esses isolados pertencem à espécie CABMV (Nascimento et al., 2006; Nascimento et

al., 2004). No Brasil, além de diversos relatos em caupi e em outras espécies de

leguminosas (Lima et al., 1979; Sousa et al., 1996), o CABMV já havia sido relatado

em plantas de amendoim coletadas no estado da Paraíba (Pio-Ribeiro et al., 2000). A

comparação da sequência correspondente à CP e à região 3’-não traduzida (3’NTR) do

genoma viral mostrou um alto grau de identidade entre este isolado (denominado BR1)

e outros isolados de CABMV de outros países, incluindo Zimbábue, EUA e África do

Sul.

Em 2006, Nascimento et al. caracterizaram isolados de potyvírus obtidos a partir

de amostras foliares de plantas de maracujá-amarelo com sintomas típicos de

endurecimento dos frutos, coletadas em sete estados brasileiros e no Distrito Federal. A

infecção viral foi comprovada através de sorologia e gama de hospedeiros. Foram

analisados quatorze isolados virais capazes de infectar várias espécies de plantas, porém

apresentando diferenças na intensidade dos sintomas induzidos nessas hospedeiras. O

teste sorológico (ELISA indireto) mostrou que os isolados eram relacionados entre si e

com o potyvírus CABMV. A sequência de aminoácidos da proteína capsidial foi

determinada para todos isolados, e sua comparação com outros potyvírus indicou uma

identidade máxima com isolados de CABMV (86 a 94%), e identidade de apenas 68 a

76% com isolados de PWV. A análise filogenética a partir destas sequências confirmou

que os isolados obtidos são relacionados a isolados de CABMV, e distintos de isolados

de PWV. Esses resultados confirmaram que o endurecimento dos frutos do

maracujazeiro, no Brasil, é causado primariamente pelo CABMV. Dentre os isolados

caracterizados por Nascimento et al. (2006) inclui-se o isolado MG-Avr, obtido a partir

de planta coletada no município de Areia Vermelha, MG. Sua gama de hospedeiros

inclui, além do maracujá-amarelo, as espécies Nicotiana benthamiana, N. clevelandii,

feijão cv. Preto 153 e caupi cvs. Pitiúba e Clay. Já o isolado CABMV-BR1, obtido

originalmente de planta de amendoim, induziu sintomas de mosaico severo nas

cultivares de caupi e feijão cv. Preto 153, porém não infectou maracujá. Esses

resultados indicam a existência de um grau significativo de variabilidade entre isolados

brasileiros de CABMV, e sugerem que a capacidade de um determinado isolado em

infectar maracujá evoluiu de forma independente na África e no Brasil (Nascimento et

al., 2006).

3. A Família Potyviridae

A família Potyviridae é uma das maiores e economicamente mais importante

entre as famílias de vírus que infectam plantas, contendo cerca de 16% das espécies

descritas (Fauquet et al., 2005). Está dividida em seis gêneros (Bymovirus, Ipomovirus,

Macluravirus, Potyvirus, Rymovirus e Tritimovirus), de acordo com o agente vetor e a

organização do genoma (Berger et al., 2005). Os potyviridae são encontrados em todo o

mundo, infectando mais de 2.000 espécies de plantas. Todos os potivirus formam

corpos de inclusões cilíndricas no citoplasma de células infectadas, também

denominadas “cata-ventos”, sendo esta uma característica relevante para a identificação

de espécies pertencentes à família. Membros dessa família são facilmente transmitidos

experimentalmente de plantas infectadas para plantas sadias, pela inoculação via extrato

vegetal infectado ou utilizando preparações virais purificadas ou concentradas (Berger

et al., 2005).

O gênero Potyvirus é o mais numeroso da família Potyviridae, com mais de 100

espécies descritas. Em conjunto, essas espécies infectam uma ampla gama de plantas

monocotiledôneas e dicotiledôneas em diferentes regiões climáticas, causando grandes

danos econômicos em várias culturas. Esses vírus são transmitidos de maneira não-

circulativa por afídeos (Bock & Conti, 1974; Dipiero et al., 2006; Fauquet et al., 2005).

As partículas virais são alongadas, flexuosas, com 680-900 nm de comprimento e 11-13

nm de diâmetro. Seu genoma é constituído de uma única molécula de RNA de fita

simples, sentido positivo, com aproximadamente 10.000 nucleotídeos. O RNA

genômico é envolto por um capsídeo formado por cerca de 2.000 cópias da proteína

capsidial (CP), que possui massa molecular de aproximadamente 34 kDa.

A proteína capsidial dos potyvírus apresenta uma região amino-terminal

altamente variável em tamanho e seqüência, uma região central altamente conservada

contendo de 215 a 227 aminoácidos, e uma região carboxi-terminal com 18-20

aminoácidos. As regiões amino e carboxi-terminal estão voltadas para o exterior da

partícula viral, e são responsáveis pelas propriedades antigênicas da proteína e,

conseqüentemente, da partícula viral (Shukla et al., 1991). O RNA dos potyvírus é

covalentemente ligado a uma proteína de origem viral (genome-linked viral protein,

VPg) em sua extremidade 5’ (Riechmann et al., 1989) e apresenta uma cauda

poliadenilada, de origem viral, em sua extremidade 3’ (Allison et al., 1986). O RNA

genômico apresenta uma única fase aberta de leitura (open reading frame, ORF)

localizada entre duas regiões não codificadoras denominadas 5’NTR e 3’NTR. A

tradução da ORF origina potencialmente uma poliproteína com peso molecular de

aproximadamente 350 kDa (Allison et al., 1986), que é processada por meio da

atividade proteolítica de três proteases (P1, HC-Pro e NIa) contidas na própria

seqüência, dando origem a 8-10 produtos finais (Carrington et al., 1990) (Figura 1). As

proteases P1 e HC-Pro catalisam unicamente suas próprias clivagens em cis. A protease

NIa, além de catalisar sua própria clivagem em cis, catalisa seis clivagens adicionais em

trans (Daros & Carrington, 1997). Uma característica das proteínas sintetizadas pelos

potyvírus é o seu caráter multifuncional. Cada proteína é geralmente responsável por

várias funções durante o ciclo de infecção (revisado por Urcuqui-Inchima et al., 2001).

Um resumo das funções de cada uma destas proteínas encontra-se na Tabela 1.

Figura 1. Representação esquemática da organização e expressão do genoma de um potyvírus.

O RNA viral possui uma proteína viral (VPg) ligada à sua extremidade 5’ e uma cauda poli-A

em sua extremidade 3’. A única fase aberta de leitura dá origem a uma poliproteína que sofre

autoproteólise gerando diferentes intermediários e, finalmente, 8 proteínas virais (P1, HC-Pro,

P3, CI, 6K

, NIa, NIb e CP). A proteína NIa pode sofrer uma clivagem adicional gerando VPg e

Pro, dependendo da espécie viral. Em alguns potyvírus, a proteína P3 sofre clivagem adicional

gerando as proteínas P3 e 6K

. Adaptado de Shukla et al. (1994).

A(n)

CP NIb

NIa

VPg Pro

VPg

HC-Pro

5’

3’

5’NTR

3’NTR

Tradução

Processamento em cis

Processamento em cis e trans

P1(Pro)

HC-Pro

NIa

NIb

Pro

VPg

CI (Hel)

Tabela 1. Funções associadas às regiões não traduzídas e à proteínas dos potyvírus.

Reproduzido de Krause-Sakate (2001).

Proteína ou região Funções Referências

5´NTR Promotor da tradução

Promotor da replicação do RNA viral

Competitividade e adaptação viral

Local de início do encapsidamento

Carrington & Freed, 1990

Simón-Buela et al., 1997b

Wu & Shaw, 1998

P1 Protease

Fator acessório para a replicação do

genoma viral

Verchot et al., 1991

Verchot & Carrington, 1995b

HC-Pro Transmissão por afídeos

Protease

Movimento à longa distância

Fator acessório para a replicação do

genoma viral

Movimento célula-a-célula

Transmissão por semente

Inibição da resposta de defesa da planta

Sinergismo viral

Determinante de sintomatologia

Thornbury et al., 1985

Carrington et al., 1989

Cronin et al., 1995

Kasschau & Carrington, 1998

Cronin et al., 1995; Rojas et al.,

1997; Kasschau et al., 1997

Johansen et al., 1996

Anandalakshmi et al.,

1998);Brigneti et al., 1998;

Kasschau & Carrington, 1998)

Pruss et al., 1997

Sáenz et al., 2001

P3 Fator auxiliar para replicação do genoma

viral

Klein et al., 1994

CI Replicação (Helicase, ATPase)

Movimento célula-a-célula

Laín et al., 1991

Carrington et al., 1998

Manter o complexo de replicação

ancorado à membrana plasmática

Restrepo-Hartwig & Carrington,

1994; Schaad et al., 1997a

NIa (Pro-VPg) Protease (Pro)

Iniciador para a replicação do RNA viral

(Vpg)

Carrington & Dougherty, 1987

Schaad et al., 1996

NIb RNA polymerase dependente de RNA Hong & Hunt, 1996

CP Encapsidação do genoma

Transmissão por afídeos

Movimento célula-a-célula

Movimento a longa distância

Replicação

Determinante de sintomatologia

Allison et al., 1986; Varrelmann &

Maiss, 2000

Atreya et al., 1991

Dolja et al., 1995

Dolja et al., 1995; Dolja et al.,

1994

Mahajan et al., 1996;

Haldeman-Cahill et al., 1998

3´NTR Promotor de replicação do RNA viral

Determinante de sintomatologia

Fator acessório à replicação

Haldeman-Cahill et al., 1998

Mahajan et al., 1996

Rodriguez-Cerezo & Shaw, 1991

Mahajan et al., 1996

3.1. Ciclo de infecção de potyvírus

3.1.1. Tradução do RNA genômico e produção das proteínas virais

O primeiro evento que ocorre após um potyvírus alcançar o interior de uma

célula vegetal é o desencapsidamento do vírion, seguido da tradução da única ORF em

uma poliproteína que será processada produzindo uma quantidade suficiente de

proteínas virais para serem utilizadas nos processos subsequentes de replicação,

montagem e obtenção das partículas virais.

Todos os mRNAs celulares eucarióticos possuem uma estrutura “capeada” em

seu terminal 5’ (um nucleotídeo modificado, quase sempre m

GpppN), essencial para

que ocorra a tradução e para a manutenção da integridade do mRNA (Niepel & Gallie,

1999). O RNA genômico dos potyvírus não possui tal estrutura, e sua tradução é

independente de sua presença (Carrington & Freed, 1990). Dois elementos regulatórios

fundamentais para a tradução independente da capa (cap-independent regulatory

elements, CIREs) foram identificados na região 5’NTR do Tobacco etch virus (TEV), e

a combinação destes dois elementos resulta em um efeito multiplicativo da tradução

(Niepel & Gallie, 1999). No caso do TEV, as regiões 5’ e 3’ do genoma viral (cauda

poli-A) agem de forma sinérgica na regulação da tradução, ou seja, a tradução é

estimulada pela presença da cauda poli-A (Gallie et al., 1995).

Existem controvérsias quanto à maneira pela qual ocorre o processo de tradução

dos potyvírus. Para o Turnip mosaic virus (TuMV) evidências indicam que a tradução

ocorre por meio de iniciação interna (Basso et al., 1994). Posicionando-se uma estrutura

em forma de grampo à frente da 5’NTR do TuMV verificou-se que não foi alterada a

expressão do gene repórter para β-glucuronidase (GUS), situado logo em seguida, o que

seria esperado caso o processo de tradução fosse o leaky-scanning. Entretanto, trabalhos

realizados com o Plum pox virus (PPV) indicaram que para esse vírus a tradução se

inicia pelo mecanismo de leaky scanning e não por iniciação interna, pois o primeiro

ATG localizado na posição 36 (

AUG) não é reconhecido pelo ribossomo, por não

estar em um contexto favorável. O ribossomo irá escanear o RNA viral até atingir o

próximo códon de iniciação (

147

AUG), este em contexto favorável, e então iniciará a

tradução. Quando o primeiro AUG é colocado em um contexto favorável por meio de

mutações sítio-específicas, a tradução passa a ocorrer a partir deste códon. Este modelo

pode ser explicado pela ausência de estruturas secundárias fortes na 5’NTR. É possível

que potyvírus distintos utilizem estratégias diferentes para a tradução do genoma, ou

que ambas estratégias sejam utilizadas em conjunto.

Uma outra função desempenhada pela estrutura capeada do terminal 5’ é o

recrutamento de fatores de tradução antes da chegada dos ribossomos. Nos potyvírus,

portanto, essa função deverá ser desempenhada pela VPg ou pela 5’NTR. A VPg é

capaz de se associar aos fatores de iniciação de tradução eIF4E ou eIF(iso)4E (Nicaise

et al., 2003; Ruffel et al., 2002). Ensaios realizados utilizando o sistema duplo-híbrido

de leveduras demonstraram que a VPg do TuMV interage com o fator eucariótico de

tradução eIF(iso)4E de Arabidopsis thaliana (Wittmann et al., 1997) e de aveia

(Triticum aestivum) (Léonard et al., 2000). A VPg do TEV interage com o fator eIF4E

de tomateiro e tabaco, e esta interação é estirpe-específica (Schaad et al., 2000).

Impedida esta interação por meio de mutação de um único resíduo no domínio de

interação da VPg do TuMV, a produção de partículas virais em Brassica perviridis foi

altamente comprometida. O fato de terem sido encontradas interações VPg/eIF(iso)4E

em diferentes patossistemas envolvendo potyvírus (revisado por Robaglia & Caranta,

2006) reflete a importância desta interação para o ciclo de infecção viral. Curiosamente,

transcritos sintetizados a partir de um clone infeccioso do PPV sem a VPg ligada ao

terminal 5’ foram traduzidos em nível suficiente para iniciar a infecção, indicando que a

VPg não é essencial, pelo menos, para os primeiros eventos de tradução do genoma do

PPV na planta (Riechmann et al., 1990) e nem para a infectividade do RNA viral (Hari,

1981). De fato, a relevância biológica da interação VPg-eIF4E ainda não foi

determinada (Robaglia & Caranta, 2006)

O produto da tradução dos potyvírus é uma poliproteína, processada por meio de

clivagens proteolíticas realizadas pelas três proteases (P1, HC-Pro e NIa), originando as

proteínas virais (Dougherty et al., 1988). A proteína NIa, que consiste de dois

polipeptídeos com funções distintas (a VPg na porção amino e a protease na porção

carboxílica) cataliza as clivagens entre todos os polipeptídeos que compõem a

poliproteína, com exceção de P1/HC-Pro e HC-Pro/P3, que são realizadas pelas

proteases P1 e HC-Pro, respectivamente (Dougherty & Parks, 1991).

A protease NIa, que atua em cis e trans, é do tipo cisteína e todos os cinco sítios

de clivagens apresentam a sequência conservada Glu-X-X-Tyr-X-Gln/Ser,Gly, Ala, Val,

com o local de clivagem localizado após o resíduo de glutamina. As posições X são

ocupadas por aminoácidos neutros ou hidrofóbicos (Carrington & Dougherty, 1988;

Dougherty et al., 1988). Por se tratar de uma sequência degenerada, as clivagens das

diferentes regiões são processadas com eficiências distintas, dependendo do contexto de

aminoácidos da seqüência, e esta regulação é essencial para a replicação viral. O sítio de

clivagem localizado entre as porções VPg e Pro da própria NIa é processado de maneira

imperfeita, pois não possui a seqüência ideal de reconhecimento. A sequência neste sítio

para o TEV é Glu-Asp-Leu-Thr-Phe-Glu/Gly, o que prejudica o reconhecimento da

sequência. É interessante notar, entretanto, que mutações que aceleram a clivagem deste

sítio são prejudiciais à amplificação do genoma viral (Schaad et al., 1996).

A protease P1, responsável pela proteólise da junção P1/HC-Pro, é do tipo serina

e o sítio ativo, Gli-X-Ser-Gli é conservado em todos os potyvírus cuja sequência de P1

já foi determinada (Adams et al., 2005a). A proteína HC-Pro, responsável pela clivagem

entre HC-Pro e P3, é dependente de cisteína e no caso do TEV a clivagem ocorre entre

os dois resíduos de glicina da sequência Tyr-X-Val-Gly-Gly (Carrington et al., 1989).

Uma consequência da estratégia de expressão do genoma dos potyvírus é a

produção em quantidades estequiometricamente idênticas de todas as proteínas virais,

independentemente da necessidade de cada uma delas. Deste modo, diversas proteínas

acumulam-se na célula infectada na forma de inclusões. As proteínas NIa e NIb

acumulam-se no núcleo das células infectadas, devido ao sinal de localização nuclear

presente em suas seqüências (Restrepo et al., 1990). Embora não exista regulação da

quantidade de proteínas produzidas, ocorre regulação temporal com base na eficiência

de clivagem dos sítios de reconhecimento da protease NIa, conforme mencionado

anteriormente.

3.1.2. Replicação do genoma

Uma vez ocorrida a tradução do RNA viral, o vírus dispõe de todas as

proteínas necessárias para a replicação do genoma. A replicação da fita positiva é

catalizada pela RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) viral (a proteína NIb) em

conjunto com proteínas do hospedeiro. A replicação é iniciada pela síntese de uma fita

complementar negativa a partir da fita de RNA viral (positiva). As novas fitas positivas

são em seguida sintetizadas utilizando-se as fitas negativas como molde, sendo a

especificidade do complexo replicativo assegurada pelo reconhecimento de sinais em

cis presentes em ambas as fitas (Simón-Buela et al., 1997a). A VPg atua como

iniciadora da síntese de fitas de RNA negativo, por meio do grupamento hidroxil

presente em um resíduo conservado de tirosina (Murphy et al., 1996).

A sequência da 3’NTR é essencial para a amplificação viral, uma vez que ela

contém o promotor para a síntese da fita negativa. Foi demonstrado que a 3’NTR do

TEV apresenta estruturas secundárias essenciais para a replicação do genoma, que

pareiam com outras sequências dentro da própria 3’NTR e também com sequências

localizadas na região codificadora da proteína capsidial. Mutações afetando a estrutura

secundária destas sequências reduzem o nível de replicação viral, porém se a sequência

é alterada, mas a estrutura secundária mantida, a replicação é restaurada a nível normal

(Haldeman-Cahill et al., 1998). Desta maneira, a região codificadora da proteína

capsidial e a 3’NTR estão implicadas na amplificação do genoma viral por meio da

formação de estruturas secundárias que serão reconhecidas pelo complexo replicativo.

Foi demonstrado que plantas transgênicas expressando a proteína capsidial e a 3’NTR

do LMV sintetizam fitas de RNA negativo para estas sequências quando co-infectadas

com potyvírus distintos como o TEV, Tobacco vein mottling virus (TVMV) ou Pepper

mottle virus (PepMoV) (Teycheney et al., 2000). Isto evidencia a presença de elementos

essenciais na sequência codificadora da proteína capsidial e na 3’ NTR que permitem o

reconhecimento específico do RNA viral pela polimerase de potyvírus distintos.

A maioria das proteínas codificadas pelos potyvírus é necessária, direta ou

indiretamente para a replicação viral. Dentre estas, as proteínas CI, NIa e NIb formam o

núcleo replicativo, catalisando processos enzimáticos essenciais durante a replicação. A

proteína CI possui atividades de helicase, ATPase e ligação a RNA (Laín et al., 1991).

A proteína NIb é a RNA polimerase dependente de RNA e possui a seqüência de

aminoácidos Gln-Asp-Asp característica das RdRp’s virais (Hong & Hunt, 1996). O

processo de replicação ocorre em associação com o retículo endoplasmático das células

infectadas (Schaad et al., 1997a). A proteína 6K

funciona como uma âncora, graças à

presença de um domínio central hidrofóbico de 19 aminoácidos que lhe confere a

propriedade de associação a membranas (Restrepo-Hartwig & Carrington, 1994; Schaad

et al., 1997a). Como o sítio de clivagem entre 6K

e NIa possui baixa afinidade pela

protease, essas proteínas permanecem como um único polipeptídeo por um tempo

relativamente longo, ancoradas ao retículo endoplasmático (Restrepo-Hartwig &

Carrington, 1992). A proteína NIb é recrutada para o retículo endoplasmático por meio

de interações proteína-proteína (NIa/NIb). Estudos in vitro utilizando o sistema duplo-

híbrido de levedura demonstraram que a proteína NIa interage com NIb, possivelmente

estimulando sua atividade de RNA polimerase (Fellers et al., 1998). Observou-se que a

interação NIb/NIa do TVMV diminui quando são feitas mutações no domínio VPg,

concluindo que a porção VPg é responsável pela interação (Fellers et al., 1998).

Entretanto, outros autores concluiram que o domínio protease é o responsável pela

interação NIa/NIb do TEV (Li et al., 1997). A VPg se liga à extremidade 5’ do RNA

viral por meio de um resíduo de tirosina situado na porção amino terminal da proteína,

onde irá exercer sua função de iniciadora da replicação (Murphy et al., 1996). Ao final

da replicação, o complexo é liberado do retículo endoplasmático por meio da

autoproteólise entre as porções VPg e Pro da proteína NIa.

As proteínas P1, P3 e HC-Pro também participam do processo de replicação

como ativadores ou reguladores. A P1 atua como fator de amplificação do genoma

(Verchot & Carrington, 1995b) e pode estar envolvida na infectividade e acúmulo viral

(Rajamaki et al., 2005). Um mutante do TEV no qual foi deletada a sequência

codificadora para a proteína P1 possui a capacidade de se movimentar na planta, porém

o nível de replicação foi muito inferior quando comparado ao vírus selvagem. A

complementação a partir da expressão da P1 em plantas transgênicas demonstra sua

atividade em trans (Verchot & Carrington, 1995a). Mutantes de inserção na proteína P3

são incapazes de se replicar em protoplastos (Klein et al., 1994). Tanto a proteína P1

(Rodriguez-Cerezo et al., 1993) como P3 (Arbatova et al., 1998) foram encontradas

associadas à proteína CI em células infectadas, e a interação entre as proteínas P1/CI e

P3/NIb foi demonstrada utilizando o sistema duplo-híbrido de levedura (Merits et al.,

1999).

O papel da proteína HC-Pro durante a replicação é complexo, envolvendo no

mínimo as regiões central e carboxi-terminal. O processamento da proteína HC-Pro é

essencial para a replicação. Mutantes que suprimem a atividade proteolítica de HC-Pro

não são viáveis e esta atividade não pode ser complementada por HC-Pro selvagem

produzida em plantas transgênicas, indicando a sua atividade exclusivamente em cis

(Kasschau & Carrington, 1995). Mutantes para a região central da proteína apresentam

capacidade proteolítica, porém exibem um fenótipo de supressão da amplificação viral,

demonstrando que não somente a atividade proteolíca é importante para a amplificação

do genoma (Kasschau et al., 1997). Mutantes para a região central da proteína HC-Pro

podem ser complementados em trans. A afinidade da HC-Pro do Potato virus Y (PVY)

e Potato virus A (PVA) ao RNA viral foi demonstrada in vitro (Maia & Bernardi, 1996).

Dois domínios independentes localizados na região central, denominados “domínio A”

(aminoácidos 89-230) e “domínio B” (aminoácidos 234-321) são responsáveis pela

ligação de HC-Pro de maneira não específica a ácidos nucleicos, preferencialmente

RNA, e o domínio B apresenta um motivo ribonucleoprotéico (RNP) que é encontrado

em uma grande família de proteínas envolvidas no processamento e transporte de RNA,

expressão gênica e desenvolvimento celular (Urcuqui-Inchima et al., 2000). A provável

forma ativa da HC-Pro é um homodímero, uma vez que esta é a forma purificada a

partir de plantas infectadas (Thornbury et al., 1985). Utilizando o sistema duplo-híbrido

de levedura, foram obtidas evidências da capacidade das HC-Pro’s do LMV e do PVY

em auto-interagir, verificando-se também a possibilidade de uma interação heteróloga

entre estas HC-Pro’s e demonstrando-se que 72 aminoácidos presentes na região amino-

terminal da proteína são responsáveis pela interação (Urcuqui-Inchima et al., 1999).

A região do RNA viral que codifica a proteína capsidial (CP) também está

envolvida na replicação viral. Mutantes do TEV nos quais ocorre terminação prematura

da tradução apresentam replicação deficiente, enquanto mutantes nos quais a fase de

leitura foi modificada, porém sem terminação prematura, replicaram normalmente.

Estes resultados indicam que a tradução completa da região codificadora da CP, porém

não a proteína propriamente dita, é essencial para a replicação (Mahajan et al., 1996).

3.1.3. Movimento do vírus na planta

O movimento de vírus de plantas no hospedeiro pode ser dividido em duas

etapas: movimento célula-a-célula (curta distância) e movimento sistêmico (longa

distância) (Lucas, 2006). Inicialmente, a partir da célula infectada, o vírus deverá se

movimentar célula-a-célula por meio das conexões citoplasmáticas denominadas

plasmodesmas, que permitem a continuidade do citoplasma e do sistema de

endomembranas entre as células. Como o limite de exclusão passivo dos plasmodesmas

em células do mesófilo é de aproximadamente 1 kDa, os vírus de plantas produzem

proteínas capazes de alterar esse limite de exclusão, ligando-se ao RNA viral e

permitindo a passagem deste pelos plasmodesmas na forma de um complexo RNA

viral-proteína de movimento ou na forma de vírions (Lucas, 2006).

Os potyvírus, ao contrário de todos os outros vírus de plantas já estudados, não

possuem proteína com função exclusiva no movimento célula-a-célula. Diversas

proteínas dos potyvírus já foram implicadas no movimento célula-a-célula, incluindo

CP, HC-Pro, CI e VPg.

Evidências genéticas demonstram que a função da CP do TEV no movimento

célula-a-célula é independente da formação de vírions (Dolja et al., 1994). Mutantes na

região central da CP do TEV não foram capazes de se movimentar célula-a-célula, e

deleções na região amino-terminal da CP também implicaram em uma redução do

movimento, podendo esta região atuar de forma acessória (Dolja et al., 1995; Dolja et

al., 1994).

O envolvimento da proteína HC-Pro no movimento foi demonstrado por meio de

ensaios genéticos e de microinjeção. Mutantes na HC-Pro do TEV apresentam

movimento célula-a-célula reduzido quando comparado ao vírus selvagem (Cronin et

al., 1995; Kasschau et al., 1997), indicando possível envolvimento da proteína como

fator acessório ao movimento. Estudos de microinjeção de proteínas dos potyvírus Bean

common mosaic necrosis virus (BCMNV) e LMV expressas em Escherichia coli

demonstraram a capacidade das proteínas CP e HC-Pro de se movimentarem célula-a-

célula, aumentarem o limite de exclusão dos plasmodesmas e facilitarem o movimento

de RNA viral. Mutações na região central da CP e na região carboxi-terminal de HC-

Pro aboliram o movimento célula-a-célula destas proteínas. Os experimentos indicaram

uma interação entre CP, HC-Pro e os plasmodesmas, sugerindo que os potyvírus

codificam duas proteínas com características de proteínas de movimento (Rojas et al.,

1997). A proteína CI não demonstrou capacidade de aumentar o limite de exclusão dos

plasmodesmas (Rojas et al., 1997). Porém, análises ultraestruturais de folhas de tabaco

recém-infectadas com o TVMV e do ‘front’ de infecção de cotilédones de ervilha

infectados com o Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) revelaram a co-localização das

proteínas CI e CP próximas ou sobre a abertura dos plasmodesmas (Rodríguez-Cerezo

et al., 1997). Estudos genéticos da proteína CI do TEV demonstraram que mutantes na

região amino-terminal desta proteína não são capazes de se movimentar célula-a-célula,

mesmo com nível de replicação equivalente ao do vírus selvagem (Carrington &

Whitham, 1998).

A proteína VPg também parece estar implicada no movimento célula-a-célula.

Por meio da construção de vírus quiméricos, o determinante de virulência do TVMV em

plantas de Nicotiana tabacum cv. TN86 (que contém o gene de resistência va) foi

identificado como sendo a VPg (Nicolas et al., 1997). Verificou-se que a inserção da

VPg do isolado TVMV-WT, incapaz de infectar plantas contendo o gene de resistência,

no genoma do isolado TVMV-S, confinava a infecção às células iniciais, indicando

deficiência no movimento célula-a-célula.

Pelo menos três proteínas virais parecem estar envolvidas no movimento a longa

distância dos potyvírus: CP, HC-Pro e VPg. Para a proteína CP, foi verificado que

mutantes do TEV-GUS apresentando deleções nas porções amino- e carboxi-terminais

da CP apresentavam restrições no movimento a longa distância (Dolja et al., 1995;

Dolja et al., 1994). O movimento a longa distância destes mutantes não pôde ser

restabelecido pela expressão da CP a partir de plantas transgênicas. No caso do PSbMV,

verificou-se por meio da análise genética de quimeras que a substituição de uma serina

na posição 47 da CP era suficiente para permitir o movimento a longa distância em

Chenopodium quinoa de um isolado normalmente restrito às folhas inoculadas

(Andersen & Johansen, 1998). O resíduo de ácido aspártico na sequência Asp-Ala-Gli

da CP do TVMV também confere ao vírus habilidade de se movimentar em plantas de

tabaco (Atreya et al., 1995; Lopez-Moya & Pirone, 1998).

O envolvimento de HC-Pro no movimento a longa distância foi demonstrado por

diversos autores. Mutantes do TEV-GUS na sequência Cys-Cys-Cys-Glu, localizada na

região central da proteína, são deficientes no movimento a longa-distância e este é

restabelecido pela expressão da HC-Pro do TEV em plantas transgênicas (Cronin et al.,

1995). Analisando-se o comportamento deste mutante em diferentes combinações de

enxerto e porta-enxerto, transgênicos ou não, verificou-se que o movimento a longa-

distância só ocorre na presença da combinação enxerto e porta-enxerto transgênicos,

indicando a necessidade da HC-Pro tanto nos tecidos inoculados como não inoculados

(Kasschau et al., 1997). Mutações na porção amino-terminal da HC-Pro do TVMV

resultaram em ausência de movimento sistêmico (a longa distância) do vírus (Klein et

al., 1994).

Estudos envolvendo recombinantes entre duas estirpes do TEV demonstraram o

envolvimento da VPg no movimento a longa distância. Analisando-se as estirpes TEV-

HAT, restrita às células inoculadas na cultivar de tabaco V20, mas capaz de infectar

sistemicamente a cultivar Havana, e TEV-Oxnard, que causa infecção sistêmica em

ambas as cultivares, verificou-se que o híbrido TEV-HAT contendo a VPg do TEV-

Oxnard era capaz de se mover a longa distância na cultivar V20 (Schaad et al., 1997b).

Ecotipos de Arabidopsis thaliana que restringem o movimento à longa distância

do TEV sem envolver a resposta de hipersensibilidade foram selecionados para se

estudar a restrição ao movimento do TEV. Verificou-se que pelo menos dois genes

dominantes, RTM1 e RTM2, presentes nos ecotipos Columbia-0 (Col-0) e

Wassilewskija-2 (Ws-2) são responsáveis pela restrição do movimento a longa

distância, permitindo a replicação e movimento célula-a-célula do vírus (Mahajan et al.,

1998). Ambos foram clonados, verificando-se que RTM1 codifica uma proteína similar

às lecitinas e a uma família de proteínas contendo domínios repetidos do tipo jacalina

(Chisholm et al., 2000). O produto do gene RTM2 é uma proteína apresentando

multidomínios contendo uma região amino-terminal de alta similaridade com small heat

shock proteins (HSPs) (Whitham et al., 2000). Proteínas relacionadas às jacalinas

parecem estar envolvidas na resistência de plantas contra insetos e fungos, enquanto que

lecitinas geralmente conferem resistência contra bactérias, fungos e insetos (Chisholm

et al., 2000). A expressão de HSPs de plantas é geralmente induzida por temperatura,

mas este não é o caso para a proteína codificada pelo gene RTM2, que além disso não

confere termotolerância às plantas (Whitham et al., 2000).

O mecanismo pelo qual os genes RTM1 e RTM2 cooperam no mecanismo de

restrição ao movimento à longa distância do TEV não está estabelecido. A restrição

pode ser um bloqueio físico para entrada ou passagem do vírus pelo floema, ou inibição

de algum fator necessário durante o movimento do vírus nos elementos de tubo

crivados. Em experimentos de co-infecção do TEV-GUS com outros vírus como o

Cucumber mosaic virus (CMV) ou TVMV verificou-se que estes vírus não eram

capazes de auxiliar o movimento à longa distância do TEV no ecotipo Col-0,

descartando uma resposta de defesa generalizada. O CMV e o TEV codificam

respectivamente as proteínas 2b e HC-Pro, envolvidas na supressão do silenciamento

gênico pós-transcricional. Em plantas de Nicotiana spp. o TEV ocasiona um aumento

do acúmulo do CMV, porém este efeito sinergístico não é verificado em plantas Col-0

(RTM1/RTM2), indicando que nessas plantas a HC-Pro do TEV não é eficaz na

supressão do silenciamento (Whitham et al., 2000). É possível, embora ainda não

existam evidências experimentais nesse sentido, que a incapacidade de HC-Pro em

suprimir a resposta de silenciamento seja a responsável pela restrição ao movimento a

longa distância do vírus em plantas contendo os genes RTM1 e RTM2.

4. Taxonomia de potyvírus

Características como gama de hospedeiros, sintomatologia, morfologia de

inclusões citoplasmáticas e sorologia constituíram durante vários anos os principais

critérios para a classificação de espécies e estirpe de potyvírus. Apesar destas

características terem desempenhado papel significativo na determinação do

relacionamento taxonômico entre muitos potyvírus, elas por si só não fornecem uma

solução adequada para a identificação de espécies e estirpes no gênero como um todo,

devido à intensa variação biológica e antigênica observada entre membros do gênero

(Shukla et al., 1994). Atualmente, um dos principais critérios adotados pelo Comitê

Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) para a designação de novas espécies para

o gênero Potyvirus é a comparação da seqüência de aminoácidos da poliproteína e da

proteína capsidial (Berger et al., 2005). A seqüência de nucleotídeos da 3’NTR também

pode ser utilizada na classificação (Adams et al., 2005b). De um modo geral, espécies

distintas apresentam identidade de até 53% para as seqüências de aminoácidos da CP,

enquanto estirpes de um mesmo vírus apresentam de 83 a 99 % de identidade.

Comparações das seqüências do genoma completo de espécies da família Potyviridae

demonstraram que a maioria das espécies em um mesmo gênero possui de 50 a 55% de

identidade entre as seqüências de nucleotídeos da ORF completa (Adams et al., 2005b).

O nível de identidade para demarcação de espécies foi proposto em 76% para

sequências de nucleotídeos, e 82% para sequências de aminoácidos. A análise com base

na sequência de nucleotídeos da região codificadora da proteína capsidial indica um

valor de 76-77% de identidade para demarcação de espécies. A análise comparativa das

seqüências de aminoácidos da CP de diversos potyvírus reflete adequadamente o

relacionamento entre espécies. A aplicação desse modelo levou à determinação do

posicionamento taxonômico do Passionfruit woodiness virus (PWV), Cowpea aphid-

borne mosaic virus (CABMV), South African passiflora virus (SAPV) e Sesame mosaic

virus (SeMV) (Berger et al., 1997; McKern et al., 1994; Pappu et al., 1997; Sithole-

Niang et al., 1996). A porcentagem de identidade entre as seqüências de aminoácidos da

CP de isolados de PWV e de CABMV é inferior a 70%, indicando claramente que esses

vírus constituem espécies distintas. Entretanto, isolados de CABMV, SAPV e SeMV

apresentaram identidade em torno de 85%, indicando tratar-se de estirpes do mesmo

potyvírus. Como o CABMV foi o primeiro desses vírus a ser descrito, foi recomendado

que o SAPV e SeMV passassem a ser considerados estirpes do CABMV (Sithole-Niang

et al., 1996).

Avanços substanciais ocorreram recentemente no conhecimento da biologia

molecular da interação entre potyvírus e seus hospedeiros. Isso se deve em grande parte

à clonagem do genoma completo destes vírus, proporcionando estudos com clones

infecciosos, utilização de técnicas de mutagênese e construção de vírus híbridos

recombinantes (Revers et al., 1999). Em alguns casos, a simples comparação entre as

seqüências de isolados biologicamente distintos pode indicar as diferenças moleculares

correspondentes. O exemplo clássico foi a identificação da seqüência de três

aminoácidos (Asp-Ala-Gli) na região amino-terminal da CP essenciais para a

transmissão de potyvírus por afídeos, feita com base na comparação entre as seqüências

de isolados normais e de mutantes que haviam perdido a capacidade de serem

transmitidos pelo vetor (Atreya et al., 1995). Em outro estudo, Takaki et al. (2006)

clonaram e sequenciaram dois isolados (fraco e forte) do potyvírus Onion yellow dwarf

virus (OYDV) e demonstraram que eles possuiam como característica diferencial na sua

seqüência genômica uma deleção de 92 aminoácidos na região N-terminal da proteína

HC-Pro, que determinava um fenótipo atenuado. Isolados de Potato virus A (PVA) que

infectam plantas de Nicotiana benthamiana sistemicamente causando mosaico severo e

distorção foliar também foram estudados. O isolado PVA-B11 difere de PVA-U por não

ser capaz de infectar plantas de batata. Vírus recombinantes foram obtidos a partir dos

clones infecciosos de ambos os isolados. Curiosamente, um dos recombinantes induziu

um fenótipo atípico de amarelecimento das nervuras sem causar distorção foliar em N.

benthamiana. Apesar da diferença fenotípica, comparações dos genomas dos dois

isolados revelaram identidade elevada, exceto para as regiões codificadoras de 6K

e da

proteína capsidial, com 95,5 e 96,8% de identidade, respectivamente. Aparentemente

um evento de recombinação entre isolados semelhantes deu origem a um novo isolado

capaz de induzir um fenótipo distinto, sugerindo que diferentes partes do genoma agem

coordenadamente favorecendo a adaptabilidade de novos isolados (Paalme et al., 2004).

Entretanto, em outros casos a comparação da seqüência, por si só, não permite a

identificação de regiões do genoma viral associadas a determinadas propriedades

biológicas dos vírus. Por exemplo, a comparação das seqüências de nucleotídeos dos

genomas completos de dois isolados de Lettuce mosaic virus (LMV), um deles (LMV-

E) capaz de infectar plantas com o gene de resistência mo1

, e outro (LMV-0) incapaz

de infectar tais plantas, identificou mais de 200 diferenças ao longo de todo o genoma

(Revers et al., 1999). Nesses casos, a estratégia mais comumente empregada é a

produção de recombinantes contendo porções dos genomas dos dois isolados, seguida

de análise fenotípica (Krause-Sakate et al., 2005; Palanichelvam et al., 1998; Tribodet

et al., 2005).

MATERIAL E MÉTODOS

1. Manutenção dos isolados virais

Os dois isolados de CABMV utilizados no trabalho são provenientes dos estados

de Minas Gerais (isolado MG-Avr, obtido de planta de maracujá) (Costa, 1996) e

Paraíba (isolado BR1, obtido de planta de amendoim) (Pio-Ribeiro et al., 2000). Os

isolados foram mantidos em plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) cv. Preto 153,

caupi (Vigna unguiculata (L.) subsp. unguiculata Walp.) cv. Pitiúba e Nicotiana

benthamiana Domin., por meio de inoculações sucessivas via extrato vegetal

tamponado em fosfato de potássio 0,05 M, pH 7.2, contendo sulfito de sódio a 0,1%

(p/v). Os isolados também foram armazenados in vitro a -20

C na forma de material

foliar dessecado.

2. Clonagem e sequenciamento do genoma dos isolados BR1 e MG-Avr

Folhas de feijoeiro ‘Preto 153’ apresentando infecção sistêmica foram coletadas

e utilizadas para a obtenção de uma preparação viral concentrada (Lane, 1992). O RNA

viral dos isolados BR1 e MG-Avr, foi extraído a partir das preparações concentradas

conforme descrito anteriormente (Krause-Sakate et al., 2001). O RNA viral foi

empregado como molde para a síntese de cDNA via transcrição reversa, utilizando-se

um oligonucleotídeo específico para o CABMV (p2: 5’-AGC GAG TTT TCA TAC

ACA AAT C-3’), cuja sequência foi determinada a partir da seqüência da região

codificadora da proteína capsidial do isolado MG-Avr (disponível no GenBank, número

de acesso DQ397525), e o kit “ThermoScript RT-PCR System” (Invitrogen), de acordo

com instruções do fabricante. Em seguida, o cDNA foi empregado como molde em

reações de PCR, utilizando-se o mesmo oligonucleotídeo 3’ (p2) em conjunto com um

oligonucleotídeo universal para potyvírus HC2+ (5’-GCI GAR YTI CCI MGI ATW

YTR GTK GAY CA3’), cuja sequência foi determinada a partir dos motivos

conservados presente na região C-terminal da região codificadora da proteína HC-Pro

(Mlotshwa et al., 2002). Nesta etapa de amplificação foi utilizada a enzima “Platinum

High Fidelity Taq DNA Polymerase” (Invitrogen), que possui atividade de correção de

erro.

Inicialmente foram amplificados dois fragmentos a partir do isolado MG-Avr,

que foram clonados no plasmídeo vetor pGEM-T-Easy (Promega), de acordo com as

instruções do fabricante, originando os clones M1 e M2 (Figura 2). A partir da

sequência destes clones foram desenhados oligonucleotídeos utilizados para amplificar

o restante do genoma dos dois isolados de CABMV em estudo. Utilizando-se o cDNA

obtido com o oligonucleotídeo p2 foram realizadas amplificações via PCR para os dois

isolados, da mesma forma descrita anteriormente, com os oligonucleotídeos CP (5’-

CTG AGC TGT GTC TTT GAT GC-3’, a partir da sequência do isolado MG-Avr

disponível no GenBank) e NIa-2 (5’-CGT ACC TGC ACC TAA CG-3’, a partir da

sequência do clone M1), e NIa-1 (5’-CTG TGA GGT GTT AAG TCC-3’, a partir da

sequência do clone M1) e P3-2 (5’-GAT TTG TGA GTG CGT GC-3’, a partir da

sequência do clone M2). Os insertos foram clonados em pGEM-T-easy originando,

respectivamente, os clones Ca1-BR/Ca1-MG e Ca2-BR/Ca2-MG (Figura 2). Para a

obtenção dos clones Ca3-BR/Ca3-MG foi realizada uma nova reação de transcrição

reversa utilizando-se o kit “SuperScript II RNase H

Reverse Transcriptase”

(Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante, e o oligonucleotídeo específico

P3-1 (5’-CCC AGT TGT TCA AGG AG-3’, a partir da sequência do clone M2). O

novo cDNA obtido foi empregado como molde em reações de PCR utilizando-se o

mesmo oligonucleotídeo P3-1 em conjunto com o oligonucleotídeo 5’CABMV (5’-

CTA GCT GGA CAC TAG TTG-3’), cuja seqüência foi determinada a partir da

seqüência da região 5’ do isolado CABMV-Z. Todas as amplificações foram realizadas

utilizando-se a enzima “Platinum High Fidelity Taq DNA Polymerase” (Invitrogen).

Figura 2. Estratégia empregada para a clonagem do genoma completo dos isolados

CABMV-BR1 e CABMV-MG-Avr. As posições de alinhamento dos oligonucleotídeos

(com base na sequência do isolado CABMV-Z) estão indicadas por setas pretas. As

setas vermelhas indicam a região do genoma previamente seqüenciada (Seq1, para o

isolado BR1, número de acesso no GenBank AF241233, e Seq1.1, para o isolado MG-

Avr, número de acesso DQ397525). As chaves indicam a região correspondente a cada

clone.

Para a obtenção dos clones Ca4-BR e Ca4-MG, foi realizada uma nova extração

de RNA para os dois isolados a partir de folhas de feijoeiro, utilizando-se o reagente

Brazol (LGC Biotecnologia), de acordo com instruções do fabricante. Estes RNAs

serviram de molde para a síntese de cDNA utilizando-se o kit “SuperScript II RNase H

Reverse Transcriptase” (Invitrogen) e o oligonucleotídeo específicos GSP1(5’) (5’-

TCT TAC CTC CCT CAT GCG GAA G-3’) cuja a sequência foi determinada a partir

P1 HC-Pro P3

6K1

6K2

VPg

Pro

NIb CP

Seq1

Seq1.1

CP NIa-2NIa-1P3-2P3-1

VPg

Ca3-BR ou Ca3-MG

Ca2-BR ou Ca2-MG

Ca1-BR ou Ca1-MG

2911 nt 2469 nt

CABMV(5859)

CABMV

(

6196

)

Ca4-BR ou Ca4-MG

5’

3’

NIa

5’-CABMV

HC2+

da sequência do clone Ca3-BR. Os cDNAs, em conjunto com o oligonucleotídeo GSP1

e o oligonucleotídeo GSP2 (5’- CGC AAG TTG CAC AAC TTG TC-3’), cuja

sequência também foi determinada a partir da sequência do clone Ca3-BR, foram

empregados em reações de amplificação com o kit “5’ RACE System for Rapid

Amplification of cDNA Ends” (Invitrogen), de acordo com instruções do fabricante. Por

fim, a seqüência do isolado BR1 correspondente ao clone M1 foi amplificada

utilizando-se o cDNA sintetizado com o oligonucleotídeo p2 e os oligonucleotídeos

CABMV-5859 (5’-GCA AGA TGA GAT CGG AG-3’) e CABMV-6196 (5’-GTA

CAC CCA TCA GAA GCG-3’), cujas sequências foram determinadas a partir das

seqüências dos clones Ca1-BR e Ca2-BR, obtendo-se o clone B1.

O sequenciamento de todos os clones foi realizado pela Macrogen Inc., na

Coréia do Sul (www.macrogen.com).

3. Comparações de sequências e análise filogenética

As sequências de nucleotídeos e aminoácidos correspondentes aos isolados BR1

e MG-Avr foram comparadas com seqüências de potyvírus relacionados disponíveis no

GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). Alinhamentos múltiplos foram obtidos

utilizando-se o programa Clustal W (Thompson et al., 1994). A partir dos alinhamentos

foram preparadas árvores filogenéticas utilizando-se o programa MEGA, versão 3.1

(Kumar et al., 2004), utilizando-se o método de neighbour-joining com correção

Poisson. Os ramos das árvores foram testados por bootstrap, com 2.000 repetições.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A seqüência obtida para o isolado BR1 inclui desde a região N-terminal da

região codificadora da proteína P1 até a extremidade 3’ do genoma viral, e a seqüência

do isolado MG-Avr inclui desde a região C-terminal da região codificadora da proteína

HC-Pro até a extremidade 3’ do genoma viral. A seqüência do isolado BR1 possui 9141

nucleotídeos, incluindo a região 3’-NTR com 231 nucleotídeos. A sequência do isolado

MG-Avr possui 7332 nucleotídeos, incluindo a região 3’-NTR com 228 nucleotídeos.

As duas seqüências possuem uma única fase aberta de leitura (ORF), com o códon de

iniciação não determinado, pois deve estar localizado na região cuja seqüência ainda

não foi obtida. As seqüências deduzidas de aminoácidos dos dois isolados foram

alinhadas com a seqüência do isolado CABMV-Z. Utilizando a seqüência deste isolado

como referência pode-se inferir que os genomas dos isolados MG-Avr e BR1 codificam

poliproteínas com 3079 e 3078 aminoácidos, respectivamente (Figura 3).

Para o isolado BR1 nove sítios de clivagem da poliproteína foram identificados,

enquanto que para o isolado MG-Avr foram identificados oito sítios de clivagem

(Tabela 2). Destes, sete são totalmente conservados entre os dois isolados, e três (HC-

Pro/P3, 6K

/VPg e NIb/CP) são totalmente conservados entre os dois isolados

brasileiros e o isolado Z. A única diferença observada entre os sítios de clivagem dos

isolados brasileiros é a presença de ácido aspártico, ao invés de glutamina, na posição -5

do sítio de clivagem NIa-VPg/NIa-Pro do isolado MG-Avr. Na comparação entre os três

isolados (BR1, MG-Avr e Z), as diferenças observadas nos sítios 6K

/CI e CI/6K

envolvem aminoácidos que provavelmente não afetam o reconhecimento da seqüência

pela protease NIa-Pro. Entretanto, as seqüências dos sítios P3/6K

e NIa-Pro/NIb

diferem em vários aminoácidos, incluindo o resíduo de valina presente na posição -4,

altamente conservado entre todos os potyvírus. É possível que a seqüência do isolado Z

contenha erros nessas posições. As seqüências dos isolados brasileiros são idênticas

para ambos os sítios (E-H-V-E-T-Q/A para P3/6K1, e D-G-V-A-T-Q/S para NIa-

Pro/NIb), e estão em total conformidade com a seqüência consenso de clivagem pela

protesase NIa-Pro, X-X-V-X-X-Q/E//S/G/A/V (Carrington et al., 1993; Martín et al.,

1990).

Com os sítios de clivagem mapeados pode-se montar o mapa genômico de cada

isolado, identificando-se o início da seqüência de cada região codificadora (Figura 3).

Figura 3. Representação esquemática da organização genômica dos isolados CABMV-

BR1 e CABMV-MG-Avr. *, numeração das posições de nucleotídeos do isolado

CABMV-Z (AF348210). **, numeração das posições de nucleotídeos do início das

regiões codificadoras dos isolados brasileiros, com base na seqüência obtida até o

presente.

Tabela 2. Alinhamento dos oito sítios de clivagem da poliproteína identificados nas seqüências

deduzidas de aminoácidos dos isolados MG-Avr e BR1 com os sítios correspondentes no

isolado CABMV-Z (AF348210). As letras em negrito indicam os aminoácidos diferentes entre

os isolados.

Sítios de

clivagem

HC-Pro/

P3/6K1 6K1/CI CI/6K2

6K2/NIa-

VPg

VPg/NIa-

Pro

NIa/NIb NIb/CP

MG-Avr

KFYKVG/G EHVETQ/A EEVRMQ/S NTVCLQ/S EEVTTQ/G ENVGVE/S DGVATQ/S EDVVLQ/S

BR1

KFYKVG/G EHVETQ/A EEVRMQ/S NTVCLQ/S EEVTTQ/G EDVGVE/S DGVATQ/S EDVVLQ/S

KFYKVG/G RVGRHQ/A EEVRVQ/G NTVCLQ/G EEVTTQ/G EDVGVE/S DRGCTQ/S EDVVLQ/S

MG-Avr

5556

935

2301 3345 3501 5397 6126 6855

8409

9234

P1 HC-Pro P3

6K1

6K2

Pro

NIb CP

NIa

2302 3343 3499 5398

5557

6127 6856 9232

3’NT

9465

5’NT

935

2301 3345 3501 5397

5556

6126 6855

8409

9234

P1 HC-Pro P3

6K1

6K2

Pro

NIb CP

NIa

2303 3344 3500 5402 6131 6860 8411 9236

9465

5561

5’NT

3’NTR

BR1

8407

935

O alinhamento das seqüências deduzidas de aminoácidos dos isolados MG-Avr,

BR1 e Z permite mapear os motivos conservados presentes nas diferentes proteínas

produzidas durante a infecção da planta por potyvírus (Figura 4). Na região codificadora

da proteína CI foram encontrados os motivos conservados G-A-V-G-S-G-K-S-T, V-L-

L-L-E-P-T-R-P-L, K-V-S-A-T, L-V-Y-V, L-E-P-T-R-P-L e V-A-T-N-I-I-E-N-G-V-T-

L, relacionados com as atividades de ATPase, ligação a RNA e RNA helicase (Eagles et

al., 1994; Fernandez et al., 1995; Laín et al., 1991). Na região codificadora da proteína

NIb observou-se a presença dos motivos S-L-K-A-E-L e G-D-D, ambos relacionados

com atividade de RNA polimerase dependente de RNA (Hong & Hunt, 1996). Na

região codificadora da CP, os motivos D-A-G, essencial para a transmissão por afídeos

(Atreya et al., 1991; Atreya et al., 1995), e A-F-D-F, altamente conservado entre

potyvírus, também foram encontrados (Figura 4).