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Universidade Federal de São Carlos
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução
“Biologia de Nidificação e Estrutura Sociogenética
Intranidal em Espécies de Trypoxylon (Hymenoptera:
Crabronidae)”
Mariana Marchi Santoni
SÃO CARLOS, SP
2008
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Universidade Federal de São Carlos
Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução
“Biologia de Nidificação e Estrutura Sociogenética
Intranidal em Espécies de Trypoxylon (Hymenoptera:
Crabronidae)”
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Genética e Evolução do Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Federal de São Carlos,
como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Genética e Evolução, área de
concentração: Genética e Evolução.
Orientador: Marco Antonio Del Lama
SÃO CARLOS, SP
Março – 2008
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
S237bn
Santoni, Mariana Marchi.
Biologia de nidificação e estrutura sociogenética intranidal
em espécies de Trypoxylon (Hymenoptera:Crabronidae) /
Mariana Marchi Santoni. -- São Carlos : UFSCar, 2008.
152 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2008.
1. Crabronidae. 2. Sazonalidade. 3 Habitat (Ecologia).
4. Alocação sexual. 5. Parentesco. 6. Alozimas. I. Título.
CDD: 595.798 (20
a
)
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1
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I
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
BIOLOGIA DE NIDIFICAÇÃO E ESTRUTURA SOCIOGENÉTICA
INTRANIDAL EM ESPÉCIES DE Trypoxy/on (HYMENOPTERA:
CRABONIDAE)
Dissertação de Mestrado de Mariana Marchi Santoni
Banca Examinadora
Prat. Or. MarcoAntonio Dei Lama
+C0l!J...k.~!k:-. ~
~.C}ti.4..&.~
J.JfJil.t~~.1:((.~............
Prata. Ora.Maria José de Oliveira Campos
Prata. Ora.Maria Luisa Tunes Buschini
“Onde estiver o teu tesouro, ali estará também o teu coração”
(Lucas 12, 34)
"O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na
intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos
inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis."
(Fernando Pessoa)
Dedico este trabalho aos meus pais, familiares e amigos.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo que me tem oferecido.
A todas as pessoas que, de alguma forma, participaram fundamentalmente para
a realização deste trabalho. Pessoas que tornaram estes anos convívio, momentos
inesquecíveis.
Aos meus pais, Edson e Maria do Carmo, as pessoas mais importantes na
minha vida, agradeço por todo o amor e dedicação. Por todo o trabalho e preocupação que me
oferecem sem medidas. Obrigada por terem me ajudado a ser quem eu sou e a me ensinado a
crescer em meus sonhos. Agradeço também a todos os meus familiares, avós e primos, que
sempre me apoiaram e ensinaram muito.
A José Eduardo, pelo seu amor, carinho, amizade e compreensão, que me
oferece sempre de braços abertos, de uma forma muito generosa. Agradeço a você por fazer
parte de minha vida e por compartilhar sua vida comigo. Obrigada por oferecer sua “veia
artística”, me presenteando com a maravilhosa arte gráfica em meus pôsteres e capas de
trabalho!
Ao professor Marco, pela oportunidade de convívio durante estes anos, por me
receber de portas abertas em seu laboratório, confiando-me a realização deste trabalho. Foi
uma honra ter sido sua aluna. Agradeço pela ajuda, incentivo, paciência, orientação e
amizade. Obrigada por me ensinar a “voar”.
Às amigas da graduação, Inessa, Nathalia e Lívia, pela grande amizade,
carinho e compreensão. Mesmo distantes, a certeza de uma amizade sincera é percebida
diariamente.
Agradeço a Thaís, Rogério, Otávio, Natália, Regina e Juliano por fazerem parte
de minha vida e me ajudarem a crescer como pessoa e como profissional, sendo exemplos,
conselheiros e ouvintes. Muito obrigada pela amizade e pelos almoços sempre tão divertidos!
À Isabel, por sua amizade, carinho, paciência e dedicação. Obrigada pelo
convívio e pela ajuda, amiga e profissional, nas análises alozímicas.
Aos (muitos) coletas de laboratório, Amanda, Bruno, Camilla, Cíntia, Kátia,
Keize, Luci, Margarita e Vanessa, pessoas que se revelaram muito amigas e prestativas,
fazendo com que o ambiente de trabalho fosse harmonioso e agradável. Agradeço pela ajuda e
convívio. Agradeço também aos colegas de departamento, em especial Samantha, Vanessa e
Patrícia. Pessoas que tornam o ambiente de trabalho mais amigável.
À professora Silvia, por alguns anos de convivência e pela calma, paciência e
perseverança que transmite. Aos alunos do Laboratório de Genética de Aves, Juliana, Luiza,
Iara, Carolina, Thaís, Mateus e Rafael. Por compartilharem suas experiências.
À professora Maria Cristina Arias, por me receber em seu laboratório no
Instituto de Biociências da USP-SP e por toda ajuda durante minha estada. Agradeço também
a todo o pessoal de seu laboratório, Suzy, Alayne, Alyson, Paulo Henrique e Elaine, que
muito me ensinaram de técnicas laboratoriais, além de me receberem de uma forma muito
amigável.
Agradeço às pessoas que convivi por algum tempo em São Paulo, e em
especial, àquelas que muito me ensinaram, como a Nice e o Renato.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-graduação de Genética e
Evolução da UFSCar, pelo profissionalismo, dedicação e ajuda na carreira profissional dos
alunos que ingressam neste programa.
Ao Dr. Sérvio Túlio Pires Amarante (Museu de Zoologia da Universidade de
São Paulo) e ao Técnico José Carlos Serrano (Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, USP)
pela identificação das vespas. Ao Dr. Antonio Brescovit, do Instituto
Butantã, pela identificação das aranhas.
A Dr. Adhemar Rodrigues Alves, dono da Fazenda Rio Branco (Rifaina – SP).
À Dra. Maria José de Oliveira Campos pela leitura de manuscrito e sugestões.
À Fapesp, pela bolsa de estudos a mim conferida para a realização deste
trabalho.
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS..............................................................................................................i
LISTA DE FIGURAS..............................................................................................................v
RESUMO.................................................................................................................................ix
ABSTRACT .............................................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................1
1.1. Aspectos da ordem Hymenoptera.......................................................................................1
1.2. Vespas Esfecídeas .............................................................................................................3
1.3. Aspectos do gênero Trypoxylon ........................................................................................4
1.5. Justificativa ........................................................................................................................6
2. OBJETIVOS .......................................................................................................................6
3. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................8
3.1. Espécies estudadas ............................................................................................................ 8
3.2. Local de estudo ................................................................................................................12
3.3. Método de amostragem ...................................................................................................14
3.4. Dados analisados ..............................................................................................................16
4. RESULTADOS..................................................................................................................19
4.1. Ocupação Diferencial do Habitat por vespas do gênero Trypoxylon (Trypargilum)
(Hymenoptera: Crabronidae)...............................................................................................19
4.1.1 Introdução ................................................................................................................22
4.1.2 Material e Métodos ..................................................................................................23
4.1.3 Resultados ................................................................................................................26
4.1.4 Discussão .................................................................................................................27
4.2. Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon (Trypargilum)
aurifrons Shuckard (Hymenoptera: Crabronidae) ............................................................38
4.2.1 Introduction .............................................................................................................41
4.2.2 Material and Methods ..............................................................................................42
4.2.3 Results .....................................................................................................................44
4.2.4 Discussion ................................................................................................................47
4.3. Estrutura do pupário de duas espécies de Trypoxylon (Trypargilum) (Hymenoptera:
Crabronidae)..........................................................................................................................57
4.3.1 Introdução ................................................................................................................57
4.3.2 Material e Métodos ..................................................................................................58
4.3.3 Resultados ................................................................................................................59
4.3.4 Discussão .................................................................................................................62
4.4. Alocação sexual sazonal em espécies de Trypoxylon Latreille (Hymenoptera:
Crabronidae)..........................................................................................................................67
4.4.1 Introdução ................................................................................................................67
4.4.2 Material e Métodos ..................................................................................................68
4.4.3 Resultados ................................................................................................................71
4.4.4 Discussão .................................................................................................................73
4.5. Caracterização Alozímica, Estrutura Genética Populacional e Intranidal de Vespas
do Gênero Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae)........................................................95
4.5.1 Introdução ................................................................................................................95
4.5.2 Material e Métodos ..................................................................................................96
4.5.3 Resultados ................................................................................................................99
4.5.4 Discussão ...............................................................................................................102
4.6. Caracterização do DNA mitocontrial de Trypoxylon (Trypargilum) nitidum
(Hymenoptera: Crabronidae).............................................................................................126
4.5.1 Introdução ..............................................................................................................126
4.5.2 Material e Métodos ................................................................................................127
4.5.3 Resultados ..............................................................................................................130
4.5.4 Discussão ...............................................................................................................135
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ......................................................136
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................139
i
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Locais de disposição de ninhos-armadilha em Araras, SP......................................................12
Tabela II. Locais de disposição de ninhos-armadilha em São Carlos, SP... ..........................................13
Tabela III. Locais de disposição de ninhos-armadilha na Fazenda Rio Branco, Rifaina, SP................14
Ocupação Diferencial do Habitat por vespas do gênero Trypoxylon (Trypargilum)
(Hymenoptera: Crabronidae)
Tabela I. Número de ninhos de espécies de Trypoxylon coletados em três localidades do estado de São
Paulo. ......................................................................................................................................32
Tabela II. Correlação (r) entre o número de ninhos das espécies de Trypoxylon e a temperatura média
diária ou a precipitação total referentes às coletas realizadas em Araras – SP.......................32
Tabela III. Comprimento (cm) e diâmetro (mm) dos ninhos-armadilha utilizados pelas espécies de
Trypoxylon. Teste de Mann-Whitney (U); * P>0.05. Letras iguais indicam médias
semelhantes.............................................................................................................................32
Tabela IV. Arquitetura dos ninhos fundados por espécies de Trypoxylon em ninhos-armadilha em três
localidades do estado de São Paulo (A = amplitude de variação; N = número de
observações)............................................................................................................................33
Tabela V. Número de aranhas amostradas em ninhos fundados por espécies de Trypoxylon em três
localidades do interior de São Paulo: a = Araras, r = Rifaina e s = São Carlos......................34
Tabela IV. Número de células, taxas de emergência e mortalidade em espécies de Trypoxylon de três
localidades do Estado de São Paulo. o = ovo, l = larva, p = pupa. .........................................35
Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon (Trypargilum) aurifrons
Shuckard (Hymenoptera: Crabronidae)
Table I. Architecture of Trypoxylon aurifrons nests in trap-nests sampled in three localities of the state
of São Paulo (N = number of observations)............................................................................53
Table II. Dimensions of male and female cocoons (mm), weight-at-emergence (WE) (mg) and
forewing length (FWL) (mm) in Trypoxylon aurifrons (N = number of observations)..........53
Table III. Normality test (F) for male and female weight values and ANOVA test for weight variance
between nestmates and between individuals from different nests in Araras and Rifaina - SP54
Table IV. Percentage of emerged Trypoxylon aurifrons males in each cell* according to their position
in the nests (- no emergences).................................................................................................54
Table V.
Number of cells, emerged and dead Trypoxylon aurifrons individuals collected in
three areas of the state of São Paulo
..................................................................................54
ii
Estrutura do pupário de duas espécies de Trypoxylon (Trypargilum) (Hymenoptera:
Crabronidae)
Tabela I. Proporção de pupários “ND” (não dilatado) e “D” (dilatado) e razão sexual em amostras de
Trypoxylon rogenhoferi e Trypoxylon lactitarse em três regiões do estado de São Paulo. ....61
Tabela II. Número de ninhos apresentando o tipo de pupário de cada progênie: pupário não dilatado
(ND); pupário dilatado (D) .....................................................................................................62
Tabela III. Tipo de pupário de cada progênie e provável genótipo parental para a característica de
pupários: “ND”: pupário não dilatado o; “D”: pupário dilatado.............................................65
Alocação sexual sazonal em espécies de Trypoxylon Latreille (Hymenoptera:
Crabronidae)
Tabela I. Abundância sazonal e arquitetura de ninhos de espécies de Trypoxylon coletadas por ninhos-
armadilha em duas áreas do estado de São Paulo. Os valores de correlação (r) entre o
número de células por ninho e o comprimento são apresentados. A: amplitude de variação;
QU: estação quente-úmida; FS: fria-seca................................................................................81
Tabela II. Média ± erro padrão e dimorfismo sexual (DS)
(dimorfismo sexual para tamanho de
corpo foi expresso pela razão do valor médio de cada característica nas fêmeas sobre
o valor médio do traço nos machos)
de cinco caracteres morfológicos de machos e
fêmeas de Trypoxylon. CAA – comprimento da asa anterior, LAA – largura da asa anterior,
CAP – comprimento da asa posterior e LAP – largura da asa posterior. Valores de teste t
comparando as características de machos e fêmeas são apresentados....................................82
Tabela III. Coeficiente de variação de cinco caracteres medidos em machos e fêmeas de espécies de
Trypoyxlon: peso, comprimento da asa anterior (CAA), largura da asa anterior (LAA),
comprimento da asa posterior (CAP) e largura da asa posterior (LAP). ................................83
Tabela IV. Correlação de Pearson entre os cinco caracteres analisados: Peso (mg), CAA (mm) –
comprimento da asa anterior, LAA (mm) – largura da asa anterior, CAP (mm) –
comprimento da asa posterior e LAP (mm) – largura da asa posterior em quatro espécies de
Trypoxylon ..............................................................................................................................83
Tabela V. Razão sexual (fêmeas : machos) em espécies de Trypoxylon coletadas em duas áreas do
estado de São Paulo em diferentes épocas de coleta. Os valores de χ
2
1
comparando a razão
sexual observada (obs.) com a esperada de 1:1 são apresentados. QU: quente-úmida; FS:
fria-seca...................................................................................................................................84
Tabela VI. Média ± erro padrão da fecundidade das fêmeas fundadoras
(número de células por
ninho)
e pesos de machos e fêmeas de quatro espécies de Trypoxylon emergidos em
laboratório. As espécies foram coletadas em duas áreas do estado de São Paulo em duas
iii
estações: (QU: quente-úmida; FS: fria-seca). Teste t comparando as características de
indivíduos produzidos nas estações. .......................................................................................85
Tabela VII. Número de machos e fêmeas emergidos de cada célula de ninhos-armadilha de quatro
espécies de Trypoxylon. As células são numeradas a partir da extremidade oposta à entrada
do ninho. .................................................................................................................................86
Tabela VIII. Herdabilidade ± erro padrão para peso de machos e fêmeas de espécies de Trypoxylon.86
Tabela IX. Média ± erro padrão de pesos de machos e fêmeas de espécies de Trypoxylon emergidos
em ninhos com diferentes números de células. Os valores de F (ANOVA) são apresentados.87
Caracterização Alozímica, Estrutura Genética Populacional e Intranidal de Vespas do
Gênero Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae)
Tabela I. Número de amostras e de ninhos utilizados em análises eletroforéticas de quatro espécies de
Trypoxylon. ...........................................................................................................................109
Tabela II. Soluções-tampão e condições eletroforéticas usadas para as análises alozímicas em espécies
de Trypoxylon .......................................................................................................................109
Tabela III. Sistemas enzimáticos, classificação e abreviação de acordo com “Enzyme Commission”
(EC) e as respectivas soluções-tampão utilizadas em cada sistema (Tabela II)....................110
Tabela IV. Número de locos enzimáticos analisados, grau de polimorfismo, número efetivo de alelos
e heterozigosidade média para cada espécie de Trypoxylon coletada em três localidades do
estado de São Paulo ..............................................................................................................110
Tabela V. Freqüências alélicas observadas e testes de χ
2
para verificação da hipótese nula de aderência
ao Equilíbrio de HW (EHW) em espécies de Trypoxylon coletadas em três cidades do estado
de São Paulo..........................................................................................................................111
Tabela VI. Freqüências alélicas em locos enzimáticos de populações de Trypoxylon subdivididas por
época de coleta, provenientes de três cidades do estado de São Paulo.................................112
Tabela VII. Heterozigosidade intra-loco observada e esperada e heterozigosidade média (± Erro
padrão) em espécies de Trypoxylon coletadas em três cidades do estado de São Paulo
durante três anos. *Valores significativos de χ
2
....................................................................113
Tabela VIII. Valores de F
st
par-a-par para as subpopulações de Trypoxylon aurifrons e Trypoxylon
nitidum analisadas para alozimas, provenientes de duas cidades do estado de São Paulo. As
letras sobrescritas indicam a significância dos valores de χ
2
................................................115
Tabela IX. Parentesco médio entre as fêmeas de Trypoxylon que emergiram de mesmo ninho,
coletadas em duas cidades do estado de São Paulo. N = número de fêmeas analisadas por
ninho; R (±EP) = grau de parentesco médio e erro-padrão (Jackknife sobre ninhos); IC 95%
= intervalo de confiança........................................................................................................115
iv
Tabela X. Ninhos cujos fenótipos aloenzimáticos indicam acasalamentos extra-par de fêmeas das
espécies de Trypoxylon amostradas em duas regiões do estado de São Paulo. Os possíveis
fenótipos parentais estão também apresentados....................................................................117
Tabela XI. Ninhos em que os fenótipos aloenzimáticos observados indicam
associação de fêmeas
e/ou usurpação
de ninhos das espécies de Trypoxylon amostradas em Araras – SP. .........122
Caracterização do DNA mitocontrial de Trypoxylon (Trypargilum) nitidum
(Hymenoptera: Crabronidae)
Tabela I. Pares de primers testados para a amplificação do genoma mitocondrial via PCR de
Trypoxylon nitidum, suas localizações (genes onde se ancoram), seqüências e
referências bibliográficas
. .................................................................................................128
Tabela II.
Tamanho dos fragmentos esperado para Apis meliffera e observado em Trypoxylon
nitidum obtidos pela utilização dos pares de primers. O código segue na Tabela I
..................131
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Filogenia consenso das famílias de Aculeata (Brothers 1999), obtida a partir da análise de
caracteres morfológicos.. ..........................................................................................................3
Figura 2. Nidificação de Trypoxylon rogenhoferi em ninhos-armadilha. a) fêmea chegando ao ninho;
b) macho-guarda. Fotos obtidas em 10/10/04, em Araras.. ......................................................5
Figura 3. a) Fêmea de Trypoxylon rogenhoferi com uma porção de barro para nidificação em ninho-
armadilha (foto obtida em 20/05/06, em Araras); b) fêmea de Trypoxylon nitidum
construindo parede de fechamento com barro (foto obtida em 19/01/07, em São Carlos).......8
Figura 4. Trpoxylon rogenhoferi: a) fêmea; b) clípeo de macho, com destaque para a estrutura de
identificação; c) clípeo de fêmea, com destaque para a estrutura de identificação. Fotos
obtidas em lupa LEICA IM 50 em 25/06/07.............................................................................9
Figura 5. Trypoxylon lactitarse: a) fêmea; b) clípeo de macho, com destaque na estrutura de
identificação; c) clípeo de fêmea, com destaque na estrutura de identificação. Fotos obtidas
em lupa LEICA IM 50 em 25/06/07.. .....................................................................................10
Figura 6. Trypoxylon aurifrons: a) fêmea; b) fronte de fêmea, com destaque para a estrutura de
identificação – ocelos e fronte. Fotos obtidas em lupa LEICA IM 50 em 25/06/07...............11
Figura 7. Trypoxylon nitidum: a) fêmea; b) fronte de fêmea, com destaque para a estrutura de
identificação – ocelos e fronte. Fotos obtidas em lupa LEICA IM 50em 25/06/07................11
Figura 8. Locais de disposição de ninhos-armadilha no campus da Universidade Federal de São
Carlos em Araras - SP.............................................................................................................12
Figura 9. Locais de disposição de ninhos-armadilha no campus da Universidade Federal de São
Carlos, em São Carlos - SP.....................................................................................................13
Figura 10. Locais de disposição de ninhos-armadilha na Fazenda Rio Branco, em Rifaina – SP .........14
Figura 11. Ninho-armadilha construído a partir de bambu seco............................................................15
Figura 12. Abundância de himenópteros que nidificaram em ninhos-armadilha em três localidades do
interior de São Paulo. Spp “menores” e spp “maiores” indicam espécies de Trypoxylon
pertencentes ao grupo nitidum e punctulatum, respectivamente, mas que não apresentaram
emergência para permitir a identificação da espécie...............................................................16
vi
Ocupação Diferencial do Habitat por vespas do gênero Trypoxylon (Trypargilum)
(Hymenoptera: Crabronidae)
Figura 1. Número de ninhos fundados por espécies de Trypoxylum em cada amostragem em três
localidades do estado de São Paulo.........................................................................................36
Figura 2. Ninhos fundados por espécies de Trypoxylon (em porcentagem) coletados em cada sítio
(número nas barras) das três localidades do estado de São Paulo...........................................37
Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon (Trypargilum) aurifrons
Shuckard (Hymenoptera: Crabronidae)
Figure 1. Climate conditions and number of Trypoxylon aurifrons nests and brood cells obtained
monthly during three years of sampling in Araras (SP)..........................................................55
Figure 2. Lengths (a) and diameters (b) of the trap-nests used by Trypoxylon aurifrons.. ...................56
Figure 3. Proportion of males and females according to the inner diameter of the trap-nest................56
Estrutura do pupário de duas espécies de Trypoxylon (Trypargilum) (Hymenoptera:
Crabronidae)
Figura 1. Ninho de Trypoxylon rogenhoferi, apresentando os tipos de pupários: a) “ND”; b) “D”. ....60
Figura 2. Pupários de Trypoxylon rogenhoferi. a) pupário do tipo dilatado – as diferentes dimensões
de diâmetro acompanham os diferentes diâmetros dos ninhos-armadilha utilizados; b)
pupário do tipo não dilatado. ..................................................................................................60
Figura 3. Proporção de pupários tipo não dilatado (“ND”) e dilatado (“D”) em ninhos de a)
Trypoxylon rogenhoferi e b) Trypoxylon lactitarse amostrados por meio de ninhos-
armadilha de diversos diâmetros (mm) em três localidades do estado de São Paulo. As
indicações nas barras indicam o número de observações. ......................................................60
Figura 4. Regressão linear mostrando a influência do diâmetro dos ninhos-armadilha, utilizados em
três localidades do interior de São Paulo, sobre o arcosseno da razão de pupários não
dilatado sobre o total de células de ninhos de a) Trypoxylon rogenhoferi (y = 0.12x - 0.70; F
= 174,06; gl = 406; P = 0,00) e b) Trypoxylon lactitarse (y = 0.13x - 0.53; F = 38,11; gl =
70; P = 0,00)............................................................................................................................61
vii
Alocação sexual sazonal em espécies de Trypoxylon Latreille (Hymenoptera:
Crabronidae)
Figura 1. Asas direitas anterior (a) e posterior (b) de Trypoxylon aurifrons destacando os caracteres
estudados. CAA: comprimento da asa anterior, LAA: largura da asa anterior, CAP:
comprimento da asa posterior e LAP: largura da asa posterior. .............................................88
Figura 2. Proporção de machos e fêmeas de a) Trypoxylon rogenhoferi; b) Trypoxylon lactitarse; c)
Trypoxylon aurifrons; d) Trypoxylon nitidum em cada classe de diâmetro do ninho (mm).. .88
Figura 3. Regressão linear do diâmetro e do número de células dos ninhos-armadilha sobre o
arcosseno da porcentagem de machos de a) e b) Trypoxylon rogenhoferi (F = 1,87; gl = 105;
P = 0,17; F = 15,09; GL = 105; P = 0,00, respectivamente) e c) e d) Trypoxylon aurifrons (F
= 0,93; gl = 39; P = 0,66; F = 15,38; GL = 22; P = 0,00, respectivamente).. .........................89
Figura 4. Variação sazonal do peso (mg) de adultos de espécies de Trypoxylon coletados em Araras (a
– d) e Rifaina (e – f). Os valores apresentados no gráfico correspondem às médias e o desvio
padrão está representado pelas barras verticais de cada ponto. Os valores nas caixas
representam o teste t comparando as massas de machos e fêmeas para cada estação. * P <
0,05.. .......................................................................................................................................92
Figura 5. Número de ninhos de: a) Trypoxylon rogenhoferi; b) Trypoxylon lactitarse; c) Trypoxylon
aurifrons e d) Trypoxylon nitidum em cada classe de intervalo de tempo de acordo com a
emergência do primeiro macho com a primeira fêmea de cada ninho....................................93
Figura 6. Correlação entre os pesos médios de machos e fêmeas do mesmo ninho de a) Trypoxylon
rogenhoferi (n = 156 ninhos; P = 0,00); b) Trypoxylon lactitarse (n = 20 ninhos; P = 0,00);
c) Trypoxylon aurifrons (n = 38 ninhos; P = 0,00) e d) Trypoxylon nitidum (n = 38 ninhos; P
= 0,01).....................................................................................................................................94
Caracterização Alozímica, Estrutura Genética Populacional e Intranidal de Vespas do
Gênero Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae)
Figura 1. Padrão eletroforético de a) esterase, b) fosfoglicomutase, e c) isocitrato desidrogenase em
extratos de Trypoxylon aurifrons obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 7,5... 123
Figura 2. Padrão eletroforético de a) esterase, b) fosfoglicomutase e c) isocitrato desidrogenase em
extratos de Trypoxylon nitidum obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 7,5......123
Figura 3. Padrão eletroforético de a) esterase, b) fosfoglicomutase e c) malato desidrogenase em
extratos de Trypoxylon lactitarse obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 8,0.. .124
Figura 4. Padrão eletroforético de a) esterase, b) isocitrato desidrogenase, c) malato desidrogenase, d)
fosfoglicomutase-2, e) fosfoglicomutase-1 e f) β-hidroxibutirato desidrogenase em extratos
de Trypoxylon rogenhoferi obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 7,5.............125
viii
Caracterização do DNA mitocontrial de Trypoxylon (Trypargilum) nitidum
(Hymenoptera: Crabronidae)
Figura 1. Representação do DNA mitocondrial de Apis mellifera. Fonte: http://inapicoltura.org.......126
Figura 2. Padrão de amplificação dos locos flanqueados pelos primers: a) Seq18 + 8467 F e mtD 26 +
ntD 30; b) 16S R + mtD 36 e mtD 8 + mtD 12; A = água (controle negativo da PCR); M =
marcadores (φX e λ-Hind) ....................................................................................................131
Figura 3. Mapa do mtDNA de Apis mellifera e localização dos primers utilizados para amplificação
dos fragmentos de interesse em Trypoxylon nitidum que apresentaram sucesso (entre
parênteses está o tamanho de cada fragmento amplificado).................................................132
Figura 4. Análise da região 16S+12S seqüenciada de Trypoxylon nitidum: alinhamento das seqüências
de nucleotídeos das espécies Ap (Apis mellifera) e Tn (Trypoxylon nitidum)......................133
Figura 5. Análise da região Cyt B+ND1 seqüenciada de Trypoxylon nitidum: alinhamento das
seqüências de nucleotídeos das espécies Ap (Apis mellifera) e Tn (Trypoxylon nitidum)....134
ix
RESUMO
Fêmeas de vespas do gênero Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae) aprovisionam seus
ninhos de forma massal com aranhas paralizadas. Algumas espécies constróem ninhos de
barro, enquanto outras utilizam-se de cavidades pré-existentes, nas quais formam células
separadas por paredes de barro. Os machos de algumas espécies do subgênero Trypargilum
desempenham o papel de guarda do ninho, ajudando ainda na sua construção e forrageamento.
Neste estudo, dados sobre a biologia da nidificação e estrutura genética intranidal foram
obtidos e analisados comparativamente para quatro espécies de Trypoxylon (Trypargilum) –
T. rogenhoferi, T. lactitarse, T. aurifrons e T. nitidum –. As espécies foram amostradas por
meio de ninhos-armadilha, confeccionados com bambu, durante três anos em Araras e dois
anos em Rifaina e São Carlos (SP). As localidades de estudo foram subdivididas em sítios de
amostragem. Os ninhos coletados foram levados ao laboratório e seus pupários foram
individualmente armazenados em frascos de vidro. Os adultos emergidos foram identificados
e a data de emergência, peso e sexo anotados. Posteriormente, foram armazenados à -20ºC.
Para as análises genéticas do estudo de parentesco intranidal, utilizou-se marcadores
alozímicos revelados por eletroforese horizontal em gel de amido. Alguns adultos foram
também submetidos a análises morfométricas de asa (comprimento e largura das asas anterior
e posterior) e análises do DNA mitocondrial. Ao todo, foram obtidos 2.908 ninhos de
himenópteros solitários, dos quais 2.478 fundados por espécies de Trypoxylon. Intensa
atividade de nidificação e produção de células das quatro espécies foi observada
principalmente na estação quente-chuvosa (outubro-março). Os tubos utilizados para
nidificação pelas espécies apresentaram dimensões significativamente diferentes. A família de
aranhas mais utilizada para aprovisionamento foi Araneidae, mas as espécies de vespas
diferiram quanto às espécies forrageadas. O principal parasitóide das quatro espécies foi
Melittobia. Observou-se que as espécies de Trypoxylon coexistem temporalmente e que nas
três localidades cada espécie nidificou com maior freqüência em um sítio particular,
sugerindo ocupação diferencial do habitat em razão de “competição aparente”. A arquitetura
intranidal das espécies estudadas não diferiu da relatada para outras espécies do subgênero
Trypargilum: as fêmeas dividem o ninho-armadilha em seqüências de estoques de presas e
terminam o ninho com a construção de uma parede de fechamento. Dois tipos de pupários
foram observados em T. rogenhoferi e T. lactitarse, como já descrito para outras espécies do
grupo punctulatum. Esta característica mostrou-se associada ao sexo e ao diâmetro do ninho-
armadilha e sua possível base genética é discutida. A razão sexual populacional 1:1 das quatro
espécies foi constante durante todo o período de amostragem em Araras e Rifaina e a
distribuição do sexo dentro do ninho não foi aleatória, sendo os machos freqüentemente
encontrados nas primeiras células de cria. As fêmeas foram significativamente maiores que os
machos para os cinco caracteres de tamanho de corpo, sendo, portanto, observado um maior
investimento parental para este sexo. Em média, o período de desenvolvimento destas
espécies foi de 30 dias, sendo observada diapausa em T. rogenhoferi e T. lactitarse na estação
fria-seca. As análises alozímicas indicaram que, para a maioria dos ninhos estudados, os
fenótipos sustentam a hipótese de monoginia/monandria, apoiando a idéia de que o
comportamento do macho-guarda confere-lhe a paternidade da prole feminina. No entanto,
acasalamentos extra-par e utilização de uma mesma cavidade por mais de uma fêmea foram
verificados.
x
ABSTRACT
Female wasps of the genus Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae) mass-provision their
nests with paralyzed spiders. Some species build mud nests; others use preexisting tubular
cavities that are divided into a linear series of cells separated by mud partitions. Males of the
Trypargilum subgenus mate with the females at the time a nest is initiated and guard the nest
until it is completed, helping the female in the building and provisioning activities. In this
study, the biology of the nest building and nest genetic structure of four species of Trypoxylon
(Trypargilum) – T. rogenhoferi, T. lactitarse, T. aurifrons and T. nitidum – are shown. The
species were sampled using trap-nests (made of dry bamboo stems) in three localities of the
state of São Paulo: Araras (three years), São Carlos and Rifaina (two years). These areas were
divided in sampling sites. The trap-nests used by the wasps were replaced with new ones and
transported to the laboratory and they had the cocoons individually placed in vials. The
emerged adults were identified and their emergency, weight and sex were registered. Later,
they were stored at -20ºC. Alloyme phenotypes determined through horizontal starch gel
electrophoresis were used to the determination of the intranidal relatedness. Some adults were
submitted to morphometric analysis of wing traits (length and width of the forewing and
hindwing) and mitocondrial DNA analysis. It was collected 2,908 nests of solitary
hymenopterans, and 2,478 were founded by Trypoxylon females. Nesting activity was higher
in the warm-rainy season (October-March) in these species. The trap-nests used by the
different species showed significantly different dimensions. Araneidae was the spider family
mainly used for provision, but a species-specific provisioning was observed. The most
important parasitoid of the four species was Melittobia. In the three areas, the different
species of Trypoxylon coexist temporally but each of them built their nests frequently in a
specific site. This result may suggest differential occupation of the habitat. The intranidal
architecture of the studied species does not differ from other species of the Trypargilum
subgenus: the females divide the nest-trap in sequences of provisioned cells and finish it with
the construction of a closure plug. Two types of T. rogenhoferi and T. lactitarse cocoons were
found, as observed for other species of the group punctulatum. It was verified that the
frequencies of the two types are associated with sex and nest-trap diameter. A possible genetic
determination of this character is discussed. A 1 :1 populational sex ratio for the four species
was found during all the periods for Araras and Rifaina and the distribution of the sexes inside
the nest was not random, where males were frequently found in the first brood cells. Females
were significantly bigger than males for the five traits, showing a higher parental investment
in females. The developmental cycle in these species last 30 days and a short diapause was
observed in T. rogenhoferi and T. lactitarse in the cold-dry season. The allozyme analyses
indicated that most of the nests show phenotypes according to a monoginy/monandry
hypothesis. Although this result clearly suggest that the male-guard behavior confers him the
paternity of the female offspring, some extra-pair matings were also observed.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos da Ordem Hymenoptera
A Ordem Hymenoptera é considerada uma das mais importantes para o
homem. Além dos benefícios da polinização, do controle biológico e dos muitos produtos que
estes insetos fornecem, muitas de suas espécies constituem relevantes organismos-modelo
para diferentes áreas da pesquisa biológica. Ordem extremamente heterogênea, abrange mais
de 120 mil espécies descritas e várias a serem descobertas (Gauld e Bolton 1996; Goulet e
Huber 1993).
A grande adaptabilidade e diversidade desse grupo podem ser conferidas a
quatro características biológicas primitivas (Gauld e Bolton 1996):
i) mecanismo de oviposição: os himenópteros são insetos holometábolos e a
fêmea apresenta, associado ao seu sistema reprodutivo, um ovipositor que, primitivamente,
era usado para a postura dos ovos no local escolhido e que, no decurso do processo evolutivo,
passou a ter função de aparato de veneno. Este apresenta funcionalidade diversa entre os
grupos: em alguns, imobiliza presas para o estágio larval da cria; para outros, serve como um
mecanismo de defesa contra grandes organismos e, para os endoparasitóides, funciona como
regulador da fisiologia dos hospedeiros.
ii) provisão parental para a larva: certamente, a larva do himenóptero
ancestral era fitófaga. A fêmea adulta fazia a postura dos ovos próximo a tecidos vegetais e a
larva, eruciforme, ia à busca de seu alimento. Porém, os grupos evoluíram de forma a fornecer
alimento diretamente às larvas, tanto de forma massal, quanto de forma progressiva. Dessa
maneira, o estágio larval, agora vermiforme, fica menos suscetível à predação e o mais alto
grau dessa especialização encontra-se nos himenópteros parasitóides.
iii) dieta larval: a especialização na dieta larval consiste em armazenar a
porção do alimento que não é digerida na porção final do intestino. Dessa forma, a larva dos
grupos mais complexos pode sobreviver em locais confinados, como uma célula de
aprovisionamento, já que a defecação só ocorre antes da empupação.
iv) determinação do sexo: o mecanismo haplodiplóide de determinação do sexo
consiste em gerar machos haplóides, a partir de ovos não fecundados e fêmeas diplóides, a
partir de ovos fecundados (arrenotoquia). Esta adaptação tem duas conseqüências importantes
na história evolutiva dessa ordem. A primeira é que permite à fêmea escolher o sexo da
2
progênie em diferentes condições ecológicas (Flanders 1956). Em segundo lugar, a
arrenotoquia é um mecanismo capaz de eliminar rapidamente da população genes recessivos
deletérios via seleção natural operando no macho hemizigoto (Havron et al. 1987).
Uma outra característica desta ordem é a ocorrência de diferentes estágios de
socialidade, apresentando desde espécies com comportamento solitário, caracterizado pela
independência das fêmeas na construção e aprovisionamento de seus ninhos (Michener 1974),
até espécies que apresentam comportamento eusocial, definido como a presença permanente
de castas e cuidado aloparental (Crespi e Yanega 1995).
A Ordem Hymenoptera encontra-se dividida em duas subordens, Symphyta e
Apocrita, sendo as espécies da segunda dispostas em dois grupos: Parasitica (Terebrantia) e
Aculeata. O Grupo Parasitica é formado por espécies parasitóides de outros insetos enquanto
Aculeata agrupa todas as espécies capazes de ferroar (Gauld e Bolton 1996). A hipótese mais
aceita atualmente sobre a filogenia de Aculeata foi proposta por Brothers (1999) a partir de
caracteres morfológicos (Figura 1). Neste grupo, formado pelas superfamílias Chrysidoidea,
Vespoidea e Apoidea, são reconhecidos dois clados monofiléticos: Chrysidoidea + Aculeata
sensu stricto (Figura 1) (Ronquist et al. 1999).
A superfamília Apoidea é caracterizada por espécies que apresentam uma
constrição abdominal (cintura) e ausência de pernas na fase larval. Esta superfamília é um
grupo monofilético formado pelos Apiformes e Esfeciformes (Melo 2000). O clado dos
Apiformes corresponde ao grupo monofilético das abelhas, uma grande família que possui
cerca de 30.000 representantes que fornecem pólen e néctar à progênie (Gauld e Bolton 1996)
(Figura 1). O grupo dos Esfeciformes é parafilético e contém as famílias Heterogynaidae,
Ampulicidae, Crabronidae e Sphecidae sensu stricto (Melo 2000) (Figura 1).
3
Figura 1. Filogenia consenso das famílias de Aculeata (Brothers 1999), obtida a partir da análise de
caracteres morfológicos.
1.2 Vespas Esfecídeas
Grande parte das espécies de vespas esfecídeas é solitária, porém nidificações
em densas colônias também ocorrem. Este grupo abrange cerca de 8.000 espécies de vespas,
exibindo uma grande variação de formas e hábitos. São cosmopolitas, mas, em alguns
continentes como África, Austrália e América do Sul apresentam gêneros endêmicos (Bohart
e Menke 1976).
Os adultos apresentam hábitos alimentares variados, incluindo desde néctar a
fluidos corpóreos de suas presas, sendo que a maioria das espécies deste grupo é predadora,
aprovisionando seus ninhos com espécies diferentes de insetos e aranhas (Bohart e Menke
4
1976), ou cleptoparasita, depositando seus ovos dentro ou sobre o hospedeiro (Gauld e
Boulton 1996).
A maioria das vespas esfecídeas exibe cuidado maternal na forma de
construção e aprovisionamento de um ninho onde os imaturos se desenvolvem até o estágio
adulto. Grande parte do tempo e energia das fêmeas é investida nestas atividades e
conseqüentemente, a vida reprodutiva de uma fêmea gira em torno de seus ninhos. Em
síntese, após emergência e acasalamento, as fêmeas procuram um local para construção do
ninho, muitas vezes retornando ao local de onde emergiram e construindo seus ninhos nas
proximidades ou reutilizando o ninho natal (comportamento filopátrico). Em seguida, presas
são capturadas e trazidas para o ninho; as células de cria são aprovisionadas com um número
variável de presas, em geral mais de uma. Finalmente, a fêmea põe um ovo em uma das
presas e fecha a célula (Melo 2000).
Dentre os Esfeciformes, encontra-se a família Crabronidae Latreille 1802. Os
adultos deste grupo apresentam hábitos alimentares variados, incluindo desde néctar a fluidos
corpóreos de suas presas. A maioria das espécies é predadora, aprovisionando seus ninhos
com uma grande variedade de insetos e aranhas (Bohart e Menke 1976).
Em Crabronidae, a Tribo Trypoxylini agrupa um dos maiores gêneros da
família: Trypoxylon Latreille 1796, possuindo 660 espécies descritas (Hanson e Menke 1995).
Só na região neotropical, são encontradas 167 espécies e subespécies desse gênero (Amarante
2002). Devido a características particulares, como o comportamento de guarda exibido pelo
macho, esse gênero pode fornecer indicativos acerca dos mecanismos envolvidos no
surgimento e manutenção da eusocialidade, apresentando espécies que exibem
comportamento variando do solitário ao quase-social.
1.3 Aspectos do gênero Trypoxylon
Richards (1934) dividiu o gênero Trypoxylon em dois subgêneros: Trypoxylon
e Trypargilum. Em Trypargilum são encontradas cerca de 100 espécies, sendo 89 exclusivas
da região neotropical e 64 restritas à América do Sul (Amarante 2002).
São vespas solitárias e a fêmea exibe cuidado maternal na forma de construção
e aprovisionamento dos ninhos, onde os imaturos se desenvolvem até o estágio adulto. Os
membros do subgênero Trypargilum freqüentemente utilizam cavidades preexistentes para
5
nidificarem, dividindo-as em séries lineares de células separadas por paredes de barro (Coville
1982).
Uma outra característica que faz do subgênero um bom material de
investigação é sua facilidade de amostragem o que, conseqüentemente, facilita estudos de
biologia da nidificação. Fêmeas deste subgênero nidificam com enorme sucesso em ninhos-
armadilha (Figura 2), o que aumenta consideravelmente a amostragem de ninhos (Camillo e
Brescovit 1999).
Figura 2. Nidificação de Trypoxylon rogenhoferi em ninhos-armadilha. a) fêmea chegando ao ninho; b) macho-
guarda. Fotos obtidas em 10/10/04, em Araras.
Em Trypargilum, o macho mantém a guarda do ninho (Figura 2b) enquanto a
fêmea está forrageando e, com a sua volta (Figura 2a), ocorrem cópulas no interior do ninho
(Garcia e Adis 1995). Machos de vespas normalmente não estão envolvidos no
comportamento de nidificação, tampouco com o cuidado da prole (Brockmann 1992). No
entanto, o comportamento de guarda exibido pelos machos de Trypoxylon (Trypargilum) pode
resultar em maior garantia de que seus genes sejam passados à próxima geração, além de ser
uma forma eficiente de reduzir a taxa de mortalidade causada por predadores, parasitóides e
outros inimigos (Coville e Coville 1980).
1.4 Justificativa
Considerando que o número de espécies de insetos é da ordem de milhões
(Erwin 1986), não é de se surpreender que muitos grupos apresentem características
10 cm
1cm
b) a)
6
particulares e pouco usuais, as quais fazem com que seus representantes constituam modelos
para se testar hipóteses de Ecologia e Evolução (Roderick 1996).
Em decorrência de sua diversidade biológica e ao surgimento e manutenção de
sistemas sociais em alguns de seus grupos, os himenópteros têm sido objeto de crescente
interesse. Estudos sobre biologia, ecologia, genética e etologia conduzidos nesta ordem
incluem questões a respeito da biologia da nidificação, produtividade sazonal,
aprovisionamento, razão sexual, alocação sexual, níveis de socialidade, sistemas de
acasalamento e parentesco intranidal, níveis de endogamia, dispersão e filopatria, e estrutura
populacional.
A ocorrência de espécies multivoltinas, solitárias e com algum grau de cuidado
parental em espécies de Trypoxylon permite testar algumas questões sobre a biologia destes
insetos, entre elas: i) como se dá a biologia de nidificação destas espécies e quais os fatores
ambientais que a influenciam? ii) como se estruturam temporal e espacialmente as populações
das diferentes espécies de Trypoxylon? iii) se há diferenças no investimento sexual, quais as
causas e as conseqüências desses desvios? iv) em que espécies de Trypoxylon (Trypargilum) o
macho exibe comportamento de guarda? v) nas espécies em que tal comportamento é
verificado, a permanência do macho no ninho durante sua construção lhe proporciona alguma
vantagem reprodutiva?
O subgênero Trypargilum é pouco estudado na região Neotropical (América do
Sul e Central), onde apresenta a maior diversidade de espécies (Coville 1982). Informações
sobre a biologia de nidificação de espécies de Trypoxylon (Trypargilum), aspectos de seu
comportamento e, em particular, sobre a genética de suas populações e ninhos são esparsos na
literatura. Além disso, raros são os trabalhos neste grupo em que se buscou relacionar
aspectos biológicos à genética de populações na tentativa de explicar o sistema de
acasalamento nestas espécies.
2 OBJETIVOS
Em continuidade aos estudos que vêm sendo desenvolvidos no Laboratório de
Genética Evolutiva de Himenópteros (Universidade Federal de São Carlos – SP), iniciados em
2000 (Peruquetti 2003; Peruquetti e Del Lama 2003a, 2003b; Boraschi et al. 2005; Santoni
2005 e Santoni e Del Lama 2005), os quais visam conhecer a biologia de nidificação e
7
determinar a estrutura sociogenética nidal e a estrutura populacional de espécies de vespas e
abelhas solitárias, este trabalho tem por objetivos:
i) comparar aspectos biológicos como ocorrência, sazonalidade, arquitetura do
ninho, razão sexual, forrageamento (aranhas utilizadas), características do pupário,
mortalidade e parasitismo de espécies de Trypoxylon que nidificam em ninhos-armadilha
amostradas em três localidades do Estado de São Paulo (São Carlos, Araras e Rifaina);
ii) relacionar produtividade (quantidade e qualidade da prole), razão sexual e
tempo de desenvolvimento a variações ambientais e às características dos sítios de
nidificação;
iii) investigar a estrutura genética intranidal e estimar o parentesco intranidal,
verificando a utilização do mesmo ninho por mais de uma fêmea e determinando a estrutura
sociogenética intranidal, na tentativa de estabelecer o significado do comportamento de
macho-guarda.
O cumprimento dos objetivos propostos resultou em um conjunto de dados
que, após devidamente analisados e organizados, estão sendo apresentados nesta dissertação
na forma de capítulos. Os três primeiros estão relacionados ao primeiro objetivo; o quarto,
desenvolve o proposto no segundo objetivo e os dois últimos capítulos apresentam os
resultados referentes ao terceiro objetivo. Os capítulos que se seguem têm por título:
Capítulo 1: Ocupação diferencial do habitat por vespas do gênero Trypoxylon
(Trypargilum) Latreille 1796 (Hymenoptera: Crabronidae) – manuscrito submetido à
publicação em janeiro/2008 na Revista Brasileira de Entomologia;
Capítulo 2: Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon
(Trypargilum) aurifrons Shuckard (Hymenoptera: Crabronidae) – Santoni, M. M. e M. A. Del
Lama. 2007. Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon (Trypargilum)
aurifrons Shuckard (Hymenoptera: Crabronidae). Revista Brasileira de Entomologia 51(3):
369-376.
Capítulo 3: Estrutura do pupário de duas espécies de Trypoxylon
(Trypargilum) (Hymenoptera: Crabronidae);
Capítulo 4: Razão sexual e seleção para tamanho de corpo em espécies de
Trypoxylon Latreille (Hymenoptera, Crabronidae);
Capítulo 5: Caracterização Alozímica e Estutura Genética Populacional e
Intranidal de Vespas do Gênero Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae);
8
Capítulo 6: Caracterização do DNA mitocondrial de Trypoxylon nitidum
(Hymenoptera: Crabronidae).
3 MATERIAL E MÉTODOS
Pelo fato desta dissertação estar subdividida na forma de capítulos que
resultaram ou resultarão em manuscritos distintos, o cuidado com a redundância das
informações deve ser redobrado. Neste sentido, a seguir será descrito em detalhes o material
analisado e a maneira como este foi coletado nas diferentes áreas. Seguir-se-á uma descrição
geral da metodologia utilizada, enquanto que detalhes específicos da metodologia ou da
análise dos dados serão apresentados nos devidos capítulos.
3.1 Espécies estudadas
As espécies estudadas pertencem ao grupo nitidum do subgênero Trypargilum,
de acordo com a classificação de Coville (1982). As fêmeas das espécies desse grupo coletam
barro em solo úmido próximo à linha da água nas margens de rios e lagos para construir
paredes que dividem o ninho em uma seqüência linear de células de estoques de aranhas
(Figura 3). Elas constróem seus ninhos sozinhas, preferencialmente em cavidades
preexistentes, como ninhos abandonados de outros himenópteros (Richards 1934). Assim
como os representantes do subgênero Trypargilum, os machos das espécies estudadas
assumem o comportamento de guarda do ninho.
Figura 3. a) Fêmea de Trypoxylon rogenhoferi com uma porção de barro para nidificação em ninho-armadilha
(foto obtida em 20/05/06, em Araras); b) fêmea de Trypoxylon nitidum construindo parede de fechamento com
barro (foto obtida em 19/01/07, em São Carlos).
b
)
1
cm
1
cm
b
)
Foto: Luci Shibata Foto: Juliano C. Almeida
a
)
9
Trypoxylon rogenhoferi Kohl 1884 (Figura 4) é uma espécie que ocorre desde
o sul da Argentina até o norte do Brasil e está agrupada no complexo punctulatum (Coville
1982). Camillo et al. (1994) e Camillo e Brescovit (1999), utilizando ninhos-armadilha,
caracterizaram a arquitetura do ninho, sazonalidade, aprovisionamento e parasitas desta
espécie. Garcia e Adis (1995) elucidaram aspectos sobre o comportamento de nidificação e
Peruquetti (2003) estudou aspectos do parentesco intranidal e estrutura genética populacional
de T. rogenhoferi por meio de marcadores alozímicos. A identificação desta espécie se faz
principalmente pelo formato do clípeo de machos (Figura 4b) e fêmeas (Figura 4c).
Figura 4. Trpoxylon rogenhoferi: a) fêmea; b) clípeo de macho, com destaque para a estrutura de identificação;
c) clípeo de fêmea, com destaque para a estrutura de identificação. Fotos obtidas em lupa LEICA IM 50 em
25/06/07.
Trypoxylon lactitarse Saussure 1867 (Figura 5) é uma espécie que ocorre desde
o sul da Argentina até o sul do Canadá (Coville 1982). Semelhantemente a T. rogenhoferi,
está agrupada no complexo punctulatum e alguns aspectos sobre sua biologia já foram
estudados por Buschini (2007), Buschini et al. (2006), Camillo e Brescovit (1999) e Camillo
et al. (1993).
a)
b)
c)
1m
m
1m
m
10
Figura 5. Trypoxylon lactitarse: a) fêmea; b) clípeo de macho, com destaque na estrutura de identificação; c)
clípeo de fêmea, com destaque na estrutura de identificação. Fotos obtidas em lupa LEICA IM 50 em 25/06/07.
Trypoxylon aurifrons Shuckard 1837 (Figura 6) é uma espécie neotropical,
encontrada em alguns países da América do Sul como Venezuela, Colômbia, Guianas,
Paraguai e Brasil (Amarante 2002). Pela classificação de Coville (1982), está agrupada no
complexo nitidum, divisão de Trypargilum que reúne a maioria dos representantes do
subgênero e que apresenta características particulares da biologia de nidificação. Dados sobre
a biologia de nidificação foram elucidados por Santoni e Del Lama (2007) (Capítulo 2).
a)
b) c)
1mm
1mm
11
Figura 6. Trypoxylon aurifrons: a) fêmea; b) fronte de fêmea, com destaque para a estrutura de identificação –
ocelos e fronte. Fotos obtidas em lupa LEICA IM 50 em 25/06/07.
Trypoxylon nitidum Smith 1856 (Figura 7) é uma espécie cosmopolita, mas
encontrada principalmente na região neotropical, com distribuição do Uruguai ao Texas
(Amarante 2002). Está agrupada no complexo nitidum e raras são as informações sobre esta
espécie (Coville 1982).
Figura 7. Trypoxylon nitidum: a) fêmea; b) fronte de fêmea, com destaque para a estrutura de identificação –
ocelos e fronte. Fotos obtidas em lupa LEICA IM 50em 25/06/07.
3.2 Local de estudo
Foram amostradas três comunidades de Trypoxylon de diferentes localidades
do Estado de São Paulo: Araras, São Carlos e Rifaina. Estas localidades apresentam condições
a)
b)
1m
m
1mm
a)
b)
12
adequadas para ocorrência de nidificação desse gênero, como áreas com vegetação típica de
cerrado, Floresta semidecídua, corpos d´água e áreas com pastagem.
O campus da Universidade Federal de São Carlos em Araras (=ARR) (22º18’S,
47°22’W) exibe uma área de 645 hectares. Dentre as construções existentes na área, apresenta
prédios antigos circundados por vegetação nativa. Os ninhos-armadilha foram dispostos neste
de dezembro de 2003 a outubro de 2007 em 11 sítios diferentes (Tabela I e Figura 8).
Tabela I. Sítios de disposição de ninhos-armadilha em Araras, SP.
Sítio Latitude Longitude Altitude Caracterização
CPM1 22
o
18’51,6” 47
o
22’59,0” 700m
CPM2 22
o
18’20,8” 47
o
22’50,0” 637m
RFT 22
o
18’51,6” 47
o
22’59,0” 700m
Construção próxima ao lago, com
entorno de vegetação secundária.
GAL 22
o
18’20,3” 47
o
22’49,9” 650m
GBX 22
o
18’28,6” 47
o
22’43,5” 650m
TRT 22
o
18’28,1” 47
o
22’54,1” 673m
Construção (garagem do campus)
próxima a prédios e monocultura.
MDT 22
o
18’30,6” 47
o
22’54,6” 662m Construção próxima a pastagem.
LMC 22
o
18’24,9” 47
o
22’56,8” 667m
LMD 22
o
18’24,9” 47
o
22’56,8” 660m
Construção próxima a córrego e
vegetação nativa (cerrado).
GETAP1 22
o
18’32,0” 47
o
22’50,2” 660m
GETAP2 22
o
18’32,0” 47
o
22’50,2” 660m
Construção próxima a córrego e
monocultura.
Figura 8. Sítos de disposição de ninhos-armadilha no campus da Universidade Federal de São Carlos em Araras
- SP.
Googleearth.com
10 m
13
O Campus da UFSCar em São Carlos (=SC) (22°01’S, 47º53’W) apresenta 230
hectares de extensão e 145.890 m
2
de área construída. Como as nidificações das vespas
ocorrem em vários prédios da UFSCar, a área escolhida para amostragem foi a Garagem da
Prefeitura Universitária e o Almoxarifado Central, por constituírem áreas de pouco acesso. As
coletas neste local foram iniciadas em novembro de 2004 e finalizadas em novembro de 2006
e os ninhos-armadilha foram instalados em 3 sítios diferentes (Tabela II e Figura 9).
Tabela II. Sítios de disposição de ninhos-armadilha em São Carlos, SP.
Sítio Latitude Longitude Altitude Caracterização
AMX 21°58’58,2’’ 47º52’39,8’’ 864
MEC 21°58’47,2’’ 47º53’05,3’’ 848
URB 21°58’43,8’’ 47º53’55,1’’ 854
Construção próxima a monocultura
e vegetação nativa (cerrado).
Figura 9. Locais de disposição de ninhos-armadilha no campus da Universidade Federal de São Carlos, em São
Carlos - SP.
A Fazenda Rio Branco está localizada em Rifaina (=RF) (20°00’S, 47°27’). A
comunidade de Trypoxylon dessa localidade é bem antiga e amostras desta foram coletadas no
período de 2000 a 2003 (Del Lama, com. pessoal). Neste trabalho, a disposição de ninhos foi
Googleearth.com
10 m
14
iniciada em novembro de 2004 e concluída em março de 2007, em sete diferentes sítios
(Tabela III e Figura 10).
Tabela III. Sítios de disposição de ninhos-armadilha na Fazenda Rio Branco, Rifaina, SP.
Sítio Latitude Longitude Altitude Caracterização
COL 20
o
00’26,3” 47
o
27’13,9” 578m
SER 20
o
00’28,6” 47
o
27’08,8” 577m
EST1 20
o
00’26,7” 47
o
27’05,1” 579m
EST2 20
o
00’26,1” 47
o
27’05,5” 566m
EST3 20
o
00’26,3” 47
o
27’07,1” 572m
CLS 22
o
00’27,5” 47
o
27’11,9” 581m
TTR 22
o
00’25,4” 47
o
27’11,1” 570m
Construções
antigas,
próximas a
monocultura e
vegetação nativa.
Figura 10. Sítios de disposição de ninhos-armadilha na Fazenda Rio Branco, em Rifaina - SP.
3.3 Método de amostragem
Como método de amostragem foram utilizados ninhos-armadilha, construídos a
partir de gomos de bambu secos, de comprimentos e diâmetros internos variados. Estes ninhos
são fechados em uma das extremidades pelo próprio nó do bambu, abertos longitudinalmente
e unidos com fita adesiva (Figura 11).
10 m
Googleearth.com
15
Figura 11. Ninho-armadilha construído a partir de bambu seco.
Ninhos-armadilha de comprimento similar foram agrupados em blocos
contendo 8-12 tubos e distribuídos nos diferentes sítios de cada localidade, tomando-se o
cuidado de oferecer quantidades semelhantes de ninhos-armadilha de variadas dimensões.
Foram instalados, aproximadamente, 1.000 tubos de bambu em Araras, 600 em Rifaina e 200
em São Carlos, em cada período de coleta.
Durante o período de estudo, foram realizadas 32 coletas em Araras, 19 em
Rifaina e 15 em São Carlos. A periodicidade das coletas foi, em média, 40 dias. Durante as
visitas, a inspeção dos ninhos foi realizada com o auxílio de lanterna. Os ninhos completos
foram retirados, etiquetados e transportados para o laboratório e, em seu lugar, um novo
ninho-armadilha era colocado.
No laboratório, os ninhos foram abertos, tiveram seus dados anotados e os
pupários foram individualmente armazenados em frascos de vidro, tendo o cuidado de
identificá-los com o número do tubo e a posição por eles ocupada no ninho, determinada a
partir do interior deste. Os pupários foram mantidos em local reservado até a emergência dos
adultos.
A utilização de bambus de comprimentos e diâmetros internos variados
possibilitou a nidificação de quatro espécies, T. rogenhoferi, T. lactitarse, T. aurifrons e T.
nitidum, como também de uma quinta espécie não identificada de Trypoxylon (T. sp), Podium
denticulatum Smith 1856, algumas espécies de abelhas e outros himenópteros não
identificados (Figura 12). Ninhos de Trypoxylon em que não ocorreram emergências e,
conseqüentemente, não foi possível a identificação da espécie, foram classificados como “spp
menores”, para as espécies do grupo nitidum e “spp maiores”, para as espécies do grupo
punctulatum.
2c
m
16
119
140
12
209
127
194
78
413
184
49
34
13
29
35
19
12
78
21
125
298
23
15
495
165
21
Figura 12. Abundância de himenópteros que nidificaram em ninhos-armadilha em três localidades do interior de
São Paulo. Spp “menores” e spp “maiores” indicam espécies de Trypoxylon pertencentes ao grupo nitidum e
punctulatum, respectivamente, mas que não apresentaram emergência para permitir a identificação da espécie.
3.4 Dados analisados
Todos os bambus nidificados pelas espécies de Trypoxylon tiveram
comprimento e diâmetro aferidos e número de células contado. Características da arquitetura e
biologia intranidal foram observadas, tais como presença de paredes de fechamento e de
fundo, células vestibular e intercalar, comprimento das células, comprimento dos pupários,
sinais de aprovisionamento, nidificação conjunta com outras espécies, presença de
parasitóides, precedência de cada indivíduo da célula de cria correspondente (a ordenação dos
indivíduos no ninho se deu do fundo do ninho em direção à abertura do bambu) e viabilidade
dos imaturos.
Alguns ninhos que, ao serem abertos, apresentaram os indivíduos em estágio
larval, tiveram as aranhas aprovisionadas armazenadas em álcool 70%. Estas amostras foram
Araras
São Carlos
Rifaina
Formatado: Fonte: Negrito
Formatado: Fonte: Negrito
Formatado: Fonte: Negrito
17
identificadas pelo especialista Dr. Antônio Domingos Brescovit (Instituto Butantan – São
Paulo).
Cada ninho foi tratado como dado independente, pois a construção dos ninhos
não foi monitorada. Para as estimativas de número de células, razão sexual intranidal e razão
entre os diferentes tipos de pupários dentro de um ninho foram considerados apenas os ninhos
completamente fechados, os quais apresentavam parede de fechamento na extremidade do
tubo.
Os adultos emergidos em laboratório tiveram a data de emergência, sexo e
massa (peso úmido) anotados e, posteriormente, foram estocados a -20ºC. Alguns indivíduos
foram montados em alfinetes entomológicos, etiquetados, enviados ao Dr. Sérvio Túlio Pires
Amarante (Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo) e ao Técnico José Carlos
Serrano (Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP) para a
identificação da espécie e, posteriormente, utilizados na determinação da espécie de novos
indivíduos amostrados.
Os dados meteorológicos correspondentes ao período dessa pesquisa foram
obtidos na UFSCar campus Araras (www.ufscar.br
), na Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária – Centro de Pesquisa Pecuária do Sudeste (www.cppse.embrapa.br
) e no Centro
de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura da UNICAMP
(www.unicamp.br
).
O período total de desenvolvimento entre a oviposição e a emergência do
adulto não foi estudado. No entanto, este período foi estimado com base nos intervalos
mínimo e máximo e a média de dias entre a data de coleta dos ninhos e a data de emergência
dos adultos. O tempo de emergência intranidal foi estimado a partir do intervalo de tempo
entre o primeiro macho e a primeira fêmea emergidos em cada ninho.
Medidas morfométricas foram tomadas em asas de adultos emergidos em
laboratório que, posteriormente, foram submetidos a análises genéticas. Os dois pares de asas
dos indivíduos foram montados em lâmina, mas apenas as asas direitas foram mensuradas.
As análises alozímicas foram realizadas utilizando a técnica de eletroforese
horizontal em gel de amido (Smithies 1955). Os extratos protéicos foram obtidos a partir da
cabeça e mesossoma de adultos ou pupas de Trypoxylon emergidos em laboratório e estocados
a -20°C até o momento das análises. Para a detecção de atividade enzimática sobre os géis
foram utilizadas misturas de reação específicas para cada enzima estudada, de acordo com
protocolos descritos em Harris e Hopkinson (1976).
18
Foi extraído o DNA total de mesossoma de indivíduos de T. nitidum (n = 18)
mantidos a -20ºC, de acordo com o método fenol-clorofórmio + proteinase K, descrito por
Sheppard e McPheron (1991), com pequenas modificações. Para a amplificação do genoma
mitocondrial foram utilizados primers universais derivados de insetos (“UBC Insect
Mitochondrial DNA Primers Kit”) (Simon et al., 1994) e outros desenhados no laboratório de
Genética e Evolução de Abelhas – Instituto de Biociências (USP – São Paulo). Os produtos
amplificados foram analisados eletroforeticamente em gel de agarose 0,8%, posteriormente
corado com brometo de etídeo.
19
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Ocupação Diferencial do Habitat por vespas do gênero Trypoxylon (Trypargilum)
(Hymenoptera: Crabronidae)
Mariana Marchi Santoni
1,3
, Antonio Domingos Brescovit
2,4
e Marco Antonio Del Lama
1,5
1
Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros, Departamento de Genética e Evolução,
Universidade Federal de São Carlos. Rodovia Washington Luis (SP – 310), Km 235,
13565.905, São Carlos, São Paulo, Brasil.
2
Laboratório de Artrópodes, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil, 1500, Butantã, 05503-900,
São Paulo, SP, Brazil.
3
4
5
20
ABSTRACT. Differential occupation of the habitat by Trypoxylon (Trypargilum) wasps
(Hymenoptera: Crabronidae). Wasps of the genus Trypoxylon are solitary and females mass-
provision their nests with paralyzed spiders. Some species use successfully trap-nests for
nesting foundation, making easier their sampling and study. This paper reports data about
nesting biology of four species of Trypoxylon (Trypargilum) - T. rogenhoferi, T. lactitarse, T.
aurifrons and T. nitidum. These species were sampled by trap-nests during three years in
Araras and two years in São Carlos and Rifaina (São Paulo). The study areas were subdivided
into sampling sites. A total of 2,698 nests of solitary hymenopterans were collected and most
of them (2,268) were founded by Trypoxylon species. Nesting activity was higher in the
warm, rainy season (October-March) in these species. The trap-nests used by the different
species showed significantly different dimensions. Araneidae was the spider family mainly
used for provision, but a species-specific provisioning was observed. The most important
parasitoid of the four species was Melittobia, but adult chrysidids, ichneumonids, chalcidids
and sarcophagids also attacked their nests. In the three areas, the different species of
Trypoxylon coexist temporally but each of them builded their nests frequently in a specific
site. This result may suggest differential occupation of the habitat. Here is discussed if this
habitat partition of an apparently homogeneous area may be a result of an “apparent
competition” shaped by shared natural enemies.
KEYWORDS: Apparent competition; Araneidae; habitat partition; parasitoid; trap-nest.
21
RESUMO. Ocupação diferencial do habitat por vespas do gênero Trypoxylon (Trypargilum)
(Hymenoptera: Crabronidae). Vespas do gênero Trypoxylon apresentam comportamento
solitário e aprovisionam seus ninhos de forma massal com aranhas paralisadas. Algumas
espécies utilizam cavidades preexistentes para nidificação, o que facilita sua amostragem e
estudo. Neste trabalho, dados sobre a biologia de nidificação de quatro espécies de
Trypoxylon (Trypargilum) - T. rogenhoferi, T. lactitarse, T. aurifrons e T. nitidum - são
apresentados. As espécies foram amostradas por meio de ninhos-armadilha durante três anos
em Araras e dois anos em Rifaina e São Carlos (São Paulo). As localidades de estudo foram
subdivididas em sítios de amostragem. Foram obtidos 2.698 ninhos de himenópteros
solitários, dos quais 2.268 fundados por espécies de Trypoxylon. Intensa atividade de
nidificação foi observada principalmente na estação quente e chuvosa (outubro-março). Os
tubos utilizados para nidificação pelas diferentes espécies apresentaram dimensões
significativamente diferentes. A família de aranhas mais utilizada para aprovisionamento foi
Araneidae, mas as espécies de vespas diferiram quanto às espécies forrageadas. O principal
parasitóide das quatro espécies foi Melittobia, mas indivíduos das famílias Chrysididae,
Ichneumonidae, Chalcididae e Sarcophagidae também foram verificados. Observou-se que as
espécies de Trypoxylon coexistem temporalmente e que nas três localidades cada espécie
nidificou com maior freqüência em um sítio particular, sugerindo ocupação diferencial do
habitat. É discutido se a partição do habitat aparentemente homogêneo possa ser resultado de
“competição aparente” mediada por inimigos naturais comuns.
PALAVRAS-CHAVE: Araneidae; competição aparente; ninho-armadilha; parasitóide;
partição de habitat.
22
4.1.1 Introdução
A ordem Hymenoptera é um grupo diverso e abundante, representando cerca
de 13% dos Hexápodas conhecidos (Grimaldi e Engel 2005). Apresenta mais de 120 mil
espécies conhecidas e um grande número para serem descritas (Gauld e Bolton 1996; Goulet e
Huber 1993). Apesar disto, estes números parecem conservativos, uma vez que estimativas
sugerem que pode existir entre 600.000 a 1.200.000 espécies no planeta (Gaston 1991; Grissel
1999) Estes insetos são considerados componentes essenciais e bioindicadores de
ecossistemas por agirem como polinizadores, predadores, reguladores de populações de
insetos herbívoros e elementos da ciclagem de nutrientes (LaSalle e Gauld 1993; Tscharntke
et al. 1998).
Dentre outros insetos, esta ordem agrupa espécies de abelhas, vespas e
formigas que apresentam diferentes níveis de organização social. Cerca de 90% das espécies
de vespas apresenta comportamento solitário, caracterizado pela independência das fêmeas na
construção e aprovisionamento das células de cria (O´Neill 2001). Algumas espécies
constróem seus ninhos em cavidades preexistentes, como os representantes das famílias
Eumenidae, Pompilidae, Sphecidae e Crabronidae (Gauld e Bolton 1996).
Trypoxylon Latreille 1796 é o gênero mais diverso dentro da família
Crabronidae. Apresenta ampla distribuição geográfica, mas sua maior diversidade está na
região Neotropical. O subgênero Trypargilum Richards 1934, restrito ao Novo Mundo
(Hanson e Menke 1995), é constituído de vespas solitárias cujas fêmeas aprovisionam seus
ninhos com aranhas paralisadas.
Vespas do gênero Trypoxylon (Trypargilum) usualmente nidificam com
sucesso em cavidades artificiais (Coville 1982). A utilização de ninhos-armadilha para
amostragem destas vespas solitárias tem produzido dados sobre abundância, riqueza e
sazonalidade (Camillo et al. 1995; Loyola e Martins 2006; Morato e Martins 2006),
arquitetura intranidal, utilização de presas e inimigos naturais (Buschini et al. 2006; Buschini
e Wolff 2006; Camillo 1999; Camillo et al. 1993, 1994, Camillo e Brescovit 1999, 2000;
Camillo e Brescovit 2000; Coville e Coville 1980; Garcia e Adis 1995; Santoni e Del Lama
2007), comportamento do macho-guarda (Coville e Coville 1980; Brockmann e Grafen 1992)
e investimento parental (Peruquetti e Del Lama 2003a).
Este trabalho descreve dados relativos à biologia de nidificação de vespas do
subgênero Trypargilum em ninhos-armadilha dispostos em três localidades do Estado de São
23
Paulo. Aspectos como diversidade, abundância sazonal, estrutura de ninhos, presas utilizadas
para forrageamento, mortalidade e parasitismo são relatados. Uma possível razão para a
utilização diferencial dos sítios de nidificação pelas espécies é discutida.
4.1.2 Material e Métodos
Áreas de Estudo. Este estudo foi conduzido em três áreas localizadas no
estado de São Paulo: o campus de Araras da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar)
(22º18’S, 47°22’W, 629 m), o campus da UFSCar em São Carlos (22°01’S, 47º53’W, 850 m)
e a Fazenda Rio Branco, localizada no município de Rifaina (20º04’S, 47°25’W, 575 m).
Estas áreas apresentam clima Cwa (sistema de Koppen), caracterizado por duas estações bem
definidas: uma quente e chuvosa (outubro-março), com pluviosidade elevada e temperaturas
acima de 22ºC e outra fria e seca (abril-setembro), com baixa precipitação e temperatura
abaixo de 18ºC.
As coletas em Araras ocorreram entre dezembro de 2003 a março de 2007 em
sete sítios; em São Carlos, entre novembro de 2004 a novembro de 2006 em três sítios e, em
Rifaina, de julho de 2004 a março de 2007 em seis sítios. Em Araras, todos os sítios estavam
localizados no interior de construções antigas, próximos a corpos d’água, com vegetação de
entorno muito modificada (monocultura de cana-de-açúcar e/ou pastagem com alguns traços
de vegetação natural - cerrado). Em São Carlos, os sítios de nidificação localizavam-se no
interior de construções do campus situadas em área de vegetação introduzida (monocultura) e
típica (cerrado). Em Rifaina, os sítios estavam localizados em construções antigas próximas a
uma vegetação natural que está sendo crescentemente alterada pela introdução de
monocultura de cana-de-açúcar. No entanto, dentro de cada área de nidificação (Araras, São
Carlos e Rifaina), os sítios escolhidos apresentavam aparente homogeneidade em condições
ambientais como temperatura, umidade e luminosidade. Estes sítios estavam distantes entre si
de 70 a 380 metros em Araras, de 30 a 101 m em São Carlos e de 42 a 244 m em Rifaina. Ao
todo, foram realizadas 32 coletas em Araras, 14 em São Carlos e 19 em Rifaina .
Os dados meteorológicos do período foram obtidos nos sites da UFSCar
campus Araras (www.ufscar.br
), do Centro de Pesquisa de Pecuária do Sudeste da
EMBRAPA (www.cppse.embrapa.br
) e do Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas
Aplicadas à Agricultura da UNICAMP (orion.cpa.unicamp.br
).
24
Amostragem. As espécies foram amostradas utilizando ninhos-armadilha
construídos de bambus secos seccionados a cada nó. Estes bambus apresentavam
comprimento (100 a 652 mm) e diâmetro interno (4 a 18 mm) variados, eram agrupados em
pacotes de 8 a 12 tubos de dimensões similares e horizontalmente dispostos nos sítios das
áreas de estudo. Tomou-se o cuidado de dispor quantidades semelhantes de ninhos-armadilha
de variadas dimensões em cada sítio. A cada coleta, cerca de 1.000 ninhos-armadilha em
Araras, 300 em São Carlos e 500 em Rifaina foram oferecidos e inspecionados a cada 35 40
dias, aproximadamente.
Todos os tubos utilizados pelas vespas foram substituídos por novos e
transferidos para o Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros (LGEH), onde foram
abertos. A maioria dos ninhos que se encontravam em fase de ovo e/ou larva era novamente
fechado até que o estágio de pupa fosse atingido. As pupas foram individualmente dispostas
em frascos de vidro, identificados com número e posição no ninho e mantidos em local
isolado, à temperatura ambiente, até a emergência dos adultos, momento em que a espécie era
identificada.
Dados coletados. Todos os ninhos-armadilha utilizados pelas espécies de
Trypoxylon tiveram comprimento e diâmetro aferidos. Cada ninho foi tratado como dado
independente, já que a construção dos ninhos não foi monitorada. Características da
arquitetura intranidal, tais como paredes de fechamento e de fundo, e presença de parasitóides
foram anotadas. Estes parasitóides foram identificados após emergência. Aranhas utilizadas
para aprovisionamento foram retiradas de ninhos com células de cria em estágio de ovo e
armazenadas em álcool 70% para posterior identificação por especialista. Todas as aranhas
coletadas foram depositadas na coleção do Instituto Butantan (Curador: A. D. Brescovit).
Análises estatísticas. As análises estatísticas foram realizadas de acordo com
Zar (1999), considerando nível de significância de 5% , utilizando o programa BioEstat 4.0
(Ayres et al. 2005). Média (
X
) e Desvio Padrão (
±
) são apresentados sempre que
necessário. Os valores de comprimento e diâmetro dos ninhos-armadilha utilizados pelas
fêmeas das espécies de
Trypoxylon das três localidades foram agrupados. O número de células
foi estimado considerando somente os ninhos completamente fechados (parede de
fechamento).
A correlação de Pearson foi utilizada para verificar associação entre número de
ninhos e número total de células em relação às condições sazonais (média da temperatura
diária e pluviosidade total referentes a cada período). Análises de Variância (ANOVA) e teste
25
de Mann-Whitney foram utilizados para comparar os comprimentos e diâmetros dos ninhos-
armadilha utilizados por cada espécie.
4.1.3 Resultados
Riqueza e Abundância. Foram fundados 2.698 ninhos por himenópteros
solitários nas três áreas, sendo 96% por espécies de vespas das famílias Crabronidae,
Sphecidae e Eumenidae e 4% por espécies de abelhas das famílias Megachilidae e Apidae.
Foram coletados 1.403 ninhos em Araras, 241 em São Carlos e 1.054 ninhos em Rifaina. As
taxas de ocupação dos tubos (ninhos fundados em relação aos ninhos oferecidos) nas três
áreas foram 5%, 6% e 12%, respectivamente.
Espécies de
Trypoxylon (Trypargilum) nidificaram 2.268 ninhos, cerca
deresultado em 84% dos ninhos amostrados. Foi verificada emergência de adultos em 1.322
ninhos (58%), produzidos por cinco espécies de
Trypargilum do grupo nitidum (Coville
1982):
Trypoxylon rogenhoferi Kohl 1884, T. lactitarse Saussure 1867, T. aurifrons Shuckard
1837,
T. nitidum Smith 1856 e uma espécie não identificada, Trypoxylon sp. Os outros ninhos
ou não apresentaram emergência (31%) ou os adultos já haviam emergido no momento da
coleta no campo (11%).
Ninhos de Trypoxylon rogenhoferi e T. aurifrons foram coletados nas três
áreas, T. nitidum em Araras e São Carlos, e ninhos de T. lactitarse e Trypoxylon sp foram
encontrados apenas em Araras. Esta localidade apresentou o maior número de espécies de
Trypoxylon e Rifaina, maior abundância (Tabela I). Dado o baixo número de ninhos fundados
por T. sp, não foi possível obter dados consistentes sobre a biologia da nidificação nesta
espécie.
Distribuição sazonal e espacial. As espécies de
Trypoxylon nidificaram
durante todo o período de amostragem, mas com maior freqüência na estação quente e
chuvosa nas três localidades (Fig. 1). O número de ninhos de
T. rogenhoferi, T. lactitarse, T.
aurifrons
e T. nitidum apresentou correlação significativa com a temperatura média diária
(Tabela II).
Em Araras, ao longo de três anos, foi possível observar uma diminuição do
número de ninhos fundados por cada uma das espécies estudadas (Fig. 1a). Quarenta e cinco
por cento dos ninhos foram coletados entre dezembro/2003 a novembro/2004, 36% entre
dezembro/2004 a novembro/2005 e 19% entre dezembro/2005 a março/2007. Foi observada
26
ocupação preferencial dos sítios, em que cada espécie nidificou com maior freqüência em um
sítio particular. Este comportamento foi observado nas três localidades (Fig. 2).
Nas três localidades, a predominância de uma espécie em cada sítio foi
observada desde as primeiras coletas. Em Araras, os sítios 1 e 4 foram ocupados quase
exclusivamente por
T. lactitarse e T. rogenhoferi, respectivamente, enquanto que os sítios 2 e
3 foram ocupados, respectivamente, por
T. nitidum e T. aurifrons (Fig. 2). Para estes últimos
sítios, a ocupação predominante de uma espécie foi observada considerando todas as coletas,
embora variação nas proporções de espécies durante os meses de amostragem tenha sido
verificada.
Arquitetura dos Ninhos. As espécies de
Trypoxylon utilizaram ninhos-
armadilha de diferentes comprimentos (F = 33,34; P = 0,00) e diâmetros (F = 143,80; P =
0,00), mas foi observada sobreposição dos valores (Tabela III). Teste de Mann-Whitney
revelou que valores médios de comprimento e diâmetro do tubo são significativamente
diferentes para algumas comparações (Tabela III). Apenas para
T. rogenhoferi os valores de
diâmetro dos tubos utilizados nas três localidades foram significativamente diferentes (F =
7,45; P = 0,04).
Desconsiderando Trypoxylon sp. (devido ao baixo número de ninhos obtidos),
a arquitetura intranidal foi semelhante para as espécies estudadas: os ninhos apresentaram
parede de fundo (deposição de barro no fundo do tubo) e parede de fechamento (parede de
barro construída na extremidade do tubo). As células foram construídas em séries lineares,
divididas por paredes de barro (paredes de partição). Células de fundo (célula vazia no fundo
do tubo) e células vestibulares (célula vazia entre a parede de fechamento e a última célula
aprovisionada) foram observadas (Tabela IV).
Presas coletadas. Foram amostradas 1.809 aranhas, pertencentes a 11 famílias
- Araneidae (93,6%), Tetragnathidae (4,5%), Salticidae (0,8%) e Anyphaenidae (0,5%). As
famílias Lycosidae, Mimetidae, Nephilidae, Oxyopidae, Philodromidae, Scytodidae e
Uloboridae representaram juntas 0,6% das presas.
Mil e trinta aranhas foram provenientes de 38 ninhos de
T. rogenhoferi, 12
ninhos de
T. lactitarse, 15 de T. aurifrons e 15 de T. nitidum. A alta porcentagem de imaturos
amostrados (779 aranhas) dificultou a identificação das espécies, pois os indivíduos nesta fase
não apresentam as estruturas da genitália formadas. As aranhas das famílias Mimetidae,
27
Nephilidae, Scytodidae e Uloboridae foram coletadas em ninhos de Trypoxylon que não
apresentaram emergência de adultos e, como conseqüência, a espécie não foi identificada.
As espécies analisadas de
Trypoxylon utilizaram aranhas de diferentes gêneros
e/ou espécies (Tabela V). Nas três localidades,
T. rogenhoferi apresentou preferência por
aranhas do gênero
Alpaida. T. lactitarse, uma espécie mais generalista, forrageou
principalmente
Eustala spp. T. aurifrons e T. nitidum forragearam preferencialmente Eustala
gr.
fuscovittata e Eustala spp., respectivamente.
Mortalidade e inimigos naturais. Foram amostradas 4.431 células de
T.
rogenhoferi
, 826 de T. lactitarse, 1.252 de T. aurifrons e 887 de T. nitidum. A maior taxa de
mortalidade ocorreu no estágio de pupa para as quatro espécies (Tabela VI) e foi devida,
principalmente, a causas não determinadas.
Melittobia (Hymenoptera: Eulophidae) foi o
principal parasitóide das espécies de
Trypoxylon. Além deste, vespas das famílias
Ichneumonidae, Chalcididae e Chrysididae e moscas da família Sarcophagidae também foram
observadas (Tabela VI).
Como esperado, as taxas de emergência e parasitismo em relação ao número de
células produzidas pelas espécies estudadas mantiveram-se constantes ao longo das coletas
em Araras e Rifaina.
4.1.4 Discussão
A oferta de grande quantidade de ninhos-armadilha de comprimentos e
diâmetros variados possibilitou a nidificação de várias espécies de himenópteros solitários,
principalmente Trypoxylon (Trypargilum). A maior diversidade dos ninhos-armadilha
oferecida justifica a maior taxa de ocupação verificada neste trabalho quando comparada à de
outros estudos (Loyola e Martins 2006; Aguiar e Garófalo 2004).
Muitos fatores podem afetar as taxas de nidificação por espécies de
himenópteros solitários que utilizam cavidades preexistentes, como a oferta de cavidades,
matéria-prima para construção e disponibilidade de recursos para aprovisionamento (Roubik
1989). Cada uma das áreas está particularmente estruturada de acordo com a disponibilidade
destes fatores e estas diferenças contribuem para justificar a maior riqueza de espécies em
Araras e a maior abundância em Rifaina. Enquanto o primeiro resultado pode ser explicado
pela maior disponibilidade de cavidades durante um período maior de amostragem (maior
28
esforço amostral), a maior abundância verificada em Rifaina pode ser reflexo de uma
comunidade estruturada há mais tempo.
Nossos achados confirmam a influência da sazonalidade, possivelmente
associada à temperatura média diária, sobre a biologia de nidificação das espécies
neotropicais e demonstram a ocorrência temporalmente sincrônica destas espécies,
principalmente na estação quente e úmida. Maior taxa de nidificação nesta estação foi
também observada nos estudos realizados por Camillo et al. (1995), Assis e Camillo (1997) e
Loyola e Martins (2006) em T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994) e T. lactitarse (Camillo et al.
1993; Buschini et al. 2006) e T. opacum (Buschini e Wolff 2006).
As espécies de Trypoxylon estudadas demonstraram preferência pelo diâmetro
da cavidade de nidificação, confirmando dados de outros autores (Assis e Camillo 1997;
Budrine et al. 2004; Buschini et al. 2006, Buschini e Wolff 2006; Coville 1982, Coville e
Coville 1980; Garcia e Adis 1995). Estes estudos demonstraram que o diâmetro escolhido
oscila entre um limite inferior, determinado pelo tamanho do corpo da vespa e da presa
utilizada (Garcia e Adis 1995) e um limite superior, definido pela espessura das paredes de
barro, uma vez que paredes muito finas não conferem proteção contra parasitóides (Coville e
Coville 1980).
As espécies estudadas aprovisionaram seus ninhos principalmente com aranhas
da família Araneidae; no entanto, elas diferiram quanto às espécies utilizadas (Coville 1982).
Trabalhos prévios de T. rogenhoferi e T. lactitarse confirmam a preferência pelos mesmos
gêneros e espécies de aranhas verificados neste trabalho (Buschini et al. 2006; Camillo e
Brescovit 1999, 2000; Camillo et al. 1994; Garcia e Adis 1995). Forrageamento espécie-
específico também foi observado em T. tenoctitlan (Coville e Coville 1980) e T. antropovi
(Camillo 1999).
Embora tenha sido descrito que as espécies de aranhas capturadas por uma
determinada espécie possam variar entre as áreas estudadas e as épocas de nidificação
(Camillo e Brescovit 1999), estudos conduzidos em diferentes áreas e épocas relatam que
estas vespas apresentam preferência relativamente constante pelas espécies de presas
forrageadas (Buschini e Wolff 2006; Buschini et al. 2006; Camillo 1999, Camillo et al. 1994;
Garcia e Adis 1995).
O parasitismo nas espécies de Trypoxylon causou cerca de 23% das mortes,
porém não foi a principal causa de mortalidade, como observado em outras espécies de
Trypoxylon (Camillo et al. 1993; Camillo et al. 1994; Camillo e Brescovit 1999; Garcia e
29
Adis 1995). Melittobia, o principal inimigo natural das espécies aqui estudadas, também foi
verificado em outros estudos com T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994; Loyola e Martins
2006), T. lactitarse (Camillo et al. 1993; Loyola e Martins 2006), T. politum (Molumby 1995)
e T. antropovi (Camillo 1999).
Adultos de Ichneumonidae foram encontrados nos ninhos amostrados, bem
como em ninhos de T. lactitarse (Assis e Camillo 1997; Buschini et al. 2006), T. rogenhoferi
(Assis e Camillo 1997; Camillo et al. 1994), T. tenoctitlan (Coville e Coville 1980) e T.
opacum (Buschini e Wolff 2006). Adultos da família Chrysididae também parasitavam ninhos
de T. tenoctitlan (Coville e Coville 1980), T. lactitarse (Assis e Camillo 1997; Buschini et al.
2006; Camillo et al. 1993), T. rogenhoferi (Assis e Camillo 1997; Camillo et al. 1994; Garcia
e Adis 1995), T. opacum (Buschini e Wolff 2006) e T. aestivale (Camillo 1999). Buschini et
al. (2006) e Buschini e Wolff (2006) verificaram moscas da família Sarcophagidae em ninhos
de T. lactitarse e T. opacum, respectivamente. Os nossos dados e os da literatura indicam,
portanto, que as espécies de Trypoxylon analisadas neste trabalho têm inimigos naturais
comuns.
Ocupação diferencial do habitat. A nidificação pelas espécies de Trypoxylon
apresentou um padrão de distribuição sítio-preferencial, caracterizado pela presença
predominante de uma espécie em um sítio específico. Para as quatro espécies, esta
predominância foi usualmente observada nas diferentes coletas e a variação na preferência de
sítios detectada em Araras em T. aurifrons e T. nitidum pode ser devida à grande proximidade
destes sítios (50m).
A preferência por sítios de nidificação ganha relevância ao se considerar que,
nas três áreas de estudo, os sítios escolhidos são muito próximos entre si e, aparentemente,
apresentam níveis de temperatura, luminosidade e umidade relativa semelhantes. Em dois dos
sítios de nidificação em Araras, foi observada uma baixa taxa de nidificação pelas espécies de
Trypoxylon. Um destes sítios diferenciava-se dos demais por estar em edificação baixa, mais à
sombra e nas proximidades de um curso de água. Nos três anos de coleta realizados em
Araras, este sítio foi ocupado quase exclusivamente por Podium denticulatum F. Smith, 1856
(Sphecidae) (dados não publicados). O segundo sítio referido se caracterizava por ser uma
construção aberta, onde foram capturadas espécies de eumenídeos. Estas espécies apresentam
inimigos comuns com as espécies de Trypoxylon analisadas (Assis e Camillo 1997).
O padrão de distribuição dos animais tem sido interpretado principalmente
como (1) o sub-produto de diferenças fisiológicas, morfológicas e bionômicas, (2) o resultado
30
de diferentes histórias evolutivas ou (3) o resultado de competição interespecífica, seguida de
subseqüente especialização para um habitat ótimo (Storch e Frynta 2000).
Por se tratar de espécies-irmãs, as alternativas (1) e (2) parecem não ser
relevantes para explicar a ocupação diferencial do habitat pelas espécies de Trypoxylon.
Alternativamente, a competição interespecífica poderia ser uma explicação para a segregação
espacial verificada.
A teoria da competição prediz que a sobreposição de exigências entre espécies
em um habitat deve ser minimizada pela segregação temporal ou espacial das mesmas. Dessa
forma, preferências por diferentes habitats são comumente explicadas como resultado da
especialização ao habitat em que o fitness de uma espécie não é reduzido pela competição
com outras espécies (Begon et al. 2006). A coexistência temporal destas espécies de
Trypoxylon que parecem apresentar demandas similares sugere que a partição do habitat
poderia ser interpretada como resultado de competição interespecífica, seguida de posterior
especialização para habitats ótimos (Rosenzweig 1981), como demonstrado em comunidades
de himenópteros por Dietrich e Wehner (2003).
No entanto, as espécies estudadas aparentemente não apresentam sobreposição
de recursos para nidificação e forrageamento, uma vez que utilizam ninhos-armadilha de
diferentes dimensões e aprovisionam seus ninhos com diferentes espécies de aranhas. Esta
suposição é corroborada por Camillo e Brescovit (2000), que reportaram baixa sobreposição
de nichos entre T. rogenhoferi e T. lactitarse em razão destas espécies não competirem em
termos de aprovisionamento.
A ocorrência de ‘competição aparente’ pode ser uma explicação alternativa
para esta ocupação diferencial do habitat. Holt (1977) propôs este termo para indicar a
redução da densidade populacional de uma espécie quando a densidade de uma segunda
espécie aumenta, sendo esta interação mediada pelo aumento numérico de uma terceira
espécie de um nível trófico superior. De acordo com este autor, o compartilhamento de
inimigos naturais, como observado nas espécies de Trypoxylon, pode estruturar uma
comunidade da mesma forma que a competição por recursos o faz. Como resultado, espécies
que compartilham inimigos naturais devem evoluir para ocupar em simpatria diferentes áreas
livres destes inimigos (Jeffries e Lawton 1984).
Padrões de distribuição em mosaico têm sido largamente documentados em
comunidades de insetos herbívoros (Rott e Godfray 2000). Morris et al. (2001, 2004) e van
Veen et al. (2005) postulam que, assim como neste grupo, a partição do habitat observada em
31
outras comunidades de insetos pode ser explicada por competição aparente devido a
compartilhamento de parasitóides.
Se a competição aparente é uma alternativa aceitável para a nidificação em
mosaico das espécies de
Trypoxylon, o reconhecimento dos sítios mais vantajosos e a partição
do habitat por estas espécies pode ser resultado de aquisições de dicas cognitivas do habitat
(Storch e Frynta 2000), dentre as quais: (i) a presença dos primeiros colonizadores de cada
espécie, demonstrando a qualidade do sítio, como observado por Mönkkönen
et al (1997); (ii)
a presença de parasitóides nos sítios já colonizados por uma espécie como dica para que outra
espécie evite a divisão dos custos do parasitismo.
Neste trabalho, dados sobre a biologia de nidificação de quatro espécies de
Trypoxylon em três localidades do estado de São Paulo foram relatados. Embora apresentem
muitos aspectos semelhantes da biologia de nidificação, as espécies parecem não competir por
importantes recursos (substrato para nidificação e presas). Alternativamente, a ocupação
diferencial do habitat aparentemente homogêneo pelas espécies de Trypoxylon foi justificada
por competição aparente mediada pelos inimigos naturais comuns.
A demonstração de que a competição aparente produz padrões de dominância
de diferentes espécies em diferentes sítios de nidificação, como sugerida pelos nossos dados, é
relevante do ponto de vista teórico e prático. As propostas de manejo de espécies usualmente
sugerem o enriquecimento de habitats com elementos que possam ser objeto de competição
ou que, de alguma forma, limitem o crescimento das populações-alvo. Se este enriquecimento
potencializar o estabelecimento de competição aparente e segregar as espécies em sítios
específicos do habitat, o risco de extinções locais pode aumentar, tendo em vista a
fragmentação crescente do habitat. Dadas a abundância e a capacidade de nidificação das
espécies neotropicais de Trypoxylon em ninhos-armadilha, este grupo de vespas permite testar
se competição aparente gera partição do habitat e verificar os efeitos desta partição nas taxas
de extinção local, contribuindo para o conhecimento dos fatores que devem ser considerados
ao se delinear estratégias conservacionistas.
Agradecimentos. Ao Dr. Adhemar Rodrigues Alves, dono da Fazenda Rio Branco (Rifaina –
SP), ao Dr. Sérvio Túlio Pires Amarante e José Carlos Serrano pela identificação das espécies
de Trypoxylon, a Rogério Oliveira Souza pela ajuda nas coletas e à Dra. Maria José de
Oliveira Campos pela leitura do manuscrito e sugestões. Às agências financiadoras CNPQ
(ADB) e FAPESP.
32
Tabela I. Número de ninhos de espécies de Trypoxylon coletados em três localidades do estado de São Paulo.
Localidades
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum T. sp
Total
Araras 212 120 118 141 12 603
Rifaina 478 151 629
São Carlos 35 34 21 90
Total 725 120 303 162 12 1322
Tabela II. Correlação (r) entre o número de ninhos das espécies de Trypoxylon e a temperatura média diária ou a
precipitação total referentes às coletas realizadas em Araras – SP.
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Temperatura 0,42* 0,48* 0,43* 0,49*
Precipitação 0,10 0,06 0,11 0,21
* P<0,05
Tabela III. Comprimento (cm) e diâmetro (mm) dos ninhos-armadilha utilizados pelas espécies de Trypoxylon.
Teste de Mann-Whitney (U); * P>0.05. Letras iguais indicam médias semelhantes.
Comprimento Diâmetro
Min Max
SDX ±
Min Max
SDX ±
T. rogenhoferi
10,5 61,5
5,88,27
±
a
5,1 19,2
0,20,9
±
d
T. lactitarse
8,6 44,0
8,58,21
±
b
4,5 17,5
3,22,9
±
d
T. aurifrons
11,7 46,7
6,60,24
±
c
3,1 16,6
7,17,6
±
e
T. nitidum
14,4 46,7
4,53,24
±
c
3,5 11,4
6,15,6
±
e
33
Tabela IV. Arquitetura dos ninhos fundados por espécies de Trypoxylon em ninhos-armadilha em três localidades
do estado de São Paulo (A = amplitude de variação; N = número de observações).
Estrutura do ninho
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Ninhos com mais de
uma parede de fundo
3 - 2 -
Ninhos com mais de
uma parede de
fechamento
55 2 7 10
Número de células
por ninho (ninhos
completos)
A = 1-17
37 ±
N = 471
A = 4-15
28
±
N = 79
A = 1-12
25
±
N = 215
A = 2-13
26
±
N = 87
Comprimento do
ninho (cm)
A = 7-36
86,18 ±
N = 37
A = 7-14,2
31,10
±
N = 4
A = 5-21,2
44,12
±
N = 28
A = 1-24,9
73,6
±
N = 25
Comprimento da
célula de fundo (cm)
A = 0,5-4,0
19,1 ±
N = 82
-
A = 0,6-4,0
12,1
±
N = 2
-
Comprimento da
célula vestibular
(cm)
A = 0,7-5,0
15,1 ±
N = 287
A = 1,0-2,8
17,1
±
N = 268
A = 1,0-6,5
12,2
±
N = 35
A = 0,8-3,3
16,1
±
N = 12
Comprimento da
célula de macho (cm)
A = 1,2-2,6
4.07,1 ±
N = 56
A = 1,4-2,5
3.08,1
±
N = 19
A = 0,7-3,3
5.06,1
±
N = 92
A = 0,9-2,5
5.06,1
±
N = 34
Comprimento da
célula de fêmea (cm)
A = 1,2-2,5
3.07,1 ±
N = 67
A = 1,4-2,5
3.05,1
±
N = 7
A = 1,0-4,8
7.09,1
±
N = 86
A = 0,8-3,2
5.04,1
±
N = 46
34
Tabela V. Número de aranhas amostradas em ninhos fundados por espécies de Trypoxylon em três localidades
do interior de São Paulo: a = Araras, r = Rifaina e s = São Carlos.
Classificação
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Araneidae 182
a
, 373
r
, 44
s
99 85
a
, 35
r
, 30
s
112
a
, 49
s
Acacesia sp 1
a
1
r
Alpaida sp1 1
r
4
a
Alpaida sp2 1
r
Alpaida spp 76
a
, 79
r
, 43
s
Alpaida veniliae
1
42
a
, 20
r
7
Araneus spp 1 1
a
, 3
r
Argiope argentata
2
3
r
,1
s
Eustala spp 3
a
12 3
a
11
a
, 3
s
Eustala sp1 1
a
Eustala sp2 1
a
Eustala fuscovittata
3
1
r
Eustala gr. fuscovittata 1
a
19
a
Larinia sp 9
s
Mecynogea sp 1
r
Metazygia sp 2
a
4
a
2
a
Ocrepeira sp 5
a
, 10
r
, 1
s
Wagneriana sp 1
a
Anyphaenidae 1 2
s
Anyphaenoides clavipes
4
1
Osoriella tahela
5
1
s
Umuara sp 1
s
Lycosidae 1
Oxyopidae
1
s
Philodromidae
2
s
Paracleocnemis sp
1
s
Salticidae 1
a
, 4
s
Lyssomanes sp 2
s
Tetragnathidae 1
a
7 1
s
Leucauge sp 1
s
Tetragnatha 1
a
35
Tabela VI. Número de células, taxas de emergência e mortalidade em espécies de Trypoxylon de três localidades
do Estado de São Paulo. o = ovo, l = larva, p = pupa.
Localidade
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Araras
Células 1481 848 602 803
Emergência 831 (56%) 475 (56%) 264 (44%) 505(63%)
Mortalidade 114
o
, 21
l
, 515
p
106
o
, 6
l
, 261
p
36
o
, 10
l
, 292
p
51
o
, 24
l
, 223
p
Parasitóide 207 (14%) 143 (17%) 128 (21%) 129 (16%)
Melittobia 192 100 125 113
Ichneumonidae 9 40 1 9
Chrysididae 1 3 2 7
Sarcophagidae 5 0 0 0
Causas desconhecidas 443 (30%) 230 (27%) 210 (35%) 169 (21%)
Rifaina
Células 3007 583
Emergência 1975 (66%)
351 (60%)
Mortalidade 260
o
, 80
l
, 692
p
34
o
, 8
l
, 190
p
Parasitóide 255 (8%)
80 (14%)
Melittobia 218 61
Ichneumonidae 10 1
Sarcophagidae 25 6
Chrysididae 0 12
Chalcididae 1 0
Formicidae 2 0
Causas desconhecidas 777 (26%)
152 (26%)
São Carlos
Células 185 142 84
Emergência 100 (54%) 81 (57%) 37(44%)
Mortalidade 24
o
, 2
l
, 59
p
17
o
, 1
l
, 43
p
11
o
, 36
p
Parasitóide 28 (15%) 17 (12%) 12 (14%)
Melittobia 26 15 11
Ichneumonidae 2
Chrysididae 2 1
Causas desconhecidas 57 (31%) 44 (31%) 35 (42%)
36
a) Araras
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Dez/03
Jan/04
Fev/04
Mar/04
Abr/04
Mai/04
Jun/04
Ago/04
Sep/04
Out/04
Nov/04
Dez/04
Jan/05
Fev/05
Mar/05
Abr/05
Jun/05
Jul/05
Ago/05
Set/05
Nov/05
Dez/05
Jan/06
Fev/06
Mar/06
Abr/06
Jun/06
Jul/06
Out/06
Dez/06
fev/07
Mar/07
Meses
Número de ninhos .
b) São Carlos c) Rifaina
0
5
10
15
20
Nov/04
Dez/04
Jan/05
Fev/05
Mar/05
Mai/05
Jun/05
Set/05
Dez/05
Jan/06
Fev/06
Abr/06
Jul/06
Nov/06
Meses
Número de ninhos .
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Set/04
Nov/04
Jan/05
Fev/05
Mar/05
Abr/05
Mai/05
Jul/05
Ago/05
Out/05
Nov/05
Abr/06
Jul/06
Set/06
Out/06
Nov/06
Dez/06
fev/07
Mar/07
Meses
Número de ninhos .
70
80
90
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Figura 1. Número de ninhos fundados por espécies de Trypoxylum em cada amostragem em três localidades do
estado de São Paulo.
37
a) Araras
4
6
2
3
4
1
7
2
5
3
2
4
5
5
2
6
5
74
6
3
3
7
1
1
1
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
T. rogenhoferi
T. lactitarse
T. aurifrons
T. nitidum
b) São Carlos
2
2
1
3
1
2
3
3
1
0% 20% 40% 60% 80% 100%
T. rogenhoferi
T. aurifrons
T. nitidum
c) Rifaina
3
13
45
42
2
5
6
6
17
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
T. rogenhoferi
T. aurifrons
Figura 2. Ninhos fundados por espécies de Trypoxylon (em porcentagem) coletados em cada sítio (número nas
barras) das três localidades do estado de São Paulo.
38
4.2 Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon (Trypargilum)
aurifrons Shuckard (Hymenoptera: Crabronidae)
Mariana Marchi Santoni
1,2
e Marco Antonio Del Lama
1,3
1
Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros - Departamento de Genética e Evolução
- Universidade Federal de São Carlos - Rodovia Washington Luis Km 235 - 13565.905 -
São Carlos - São Paulo - Brasil.
2
3
Revista Brasileira de Entomologia 51(3): 369-376, setembro 2007
Received 21/09/2006; accepted 12/06/2007
39
ABSTRACT. Nesting biology of the trap-nesting Neotropical wasp Trypoxylon (Trypargilum)
aurifrons
Shuckard 1837 (Hymenoptera: Crabronidae). The present study was carried out in
three localities of the state of São Paulo, Brazil: Araras (Dec/03-Dec/06), São Carlos (Nov/04-
Nov/06) and Rifaina (Jul/04-Dec/06). Trap-nests were distributed among sites in the sampling
areas and were collected every 35 days. Data from 295 nests indicate that
T. aurifrons is a
multivoltine species, with higher rates of nest building and cell production in the warm, rainy
season. The trap-nests used by the females ranged from 117 to 467 mm in length and 3.1 to
16.6 mm in diameter. All nests showed deep plugs and a vestibular cell was found in 37% of
the complete nests. The number of cells per nest ranged from one to 12. Females were bigger
than males, emerged from longer cells and their cocoons were significantly larger. A
secondary 1:1 sex ratio was found in Araras and Rifaina. No correlation was observed
between the diameter of the trap-nest and sex ratio. Males were usually oviposited in the first
brood cells. Male and female developmental time from egg to adult was longer in the cold,
dry season.
Trypoxylon aurifrons provisioned their nests mainly with orb-spiders from the
family Araneidae. The most important mortality factor was the death of immature forms,
probably due to development failure. The most important parasitoid was
Melittobia sp..
KEYWORDS: nest architecture, parasitoid, prey, sex ratio, seasonality
40
RESUMO. Biologia da nidificação de Trypoxylon (Trypargilum) aurifrons Shuckard
(Hymenoptera: Crabronidae) em ninhos-armadilha. Este estudo foi realizado em três
localidades do estado de São Paulo: Araras (dez/03-dez/06), São Carlos (nov/04-nov/06) e
Rifaina (jul/04-dez/06). Ninhos-armadilha foram distribuídos em diferentes sítios das áreas
amostradas e coletados a cada 35 dias. Dados de 295 ninhos mostraram que
T. aurifrons é
uma espécie multivoltina, com maiores taxas de nidificação e produção de células na estação
quente e chuvosa. Os ninhos-armadilha utilizados pelas fêmeas
variaram de 117 a 467 mm de
comprimento e de 3,1 a 16,6 mm de diâmetro. Todos os ninhos apresentaram parede de fundo
e célula vestibular foi constatada em 37% dos ninhos completos. O número de células por
ninho variou de um a 12. Fêmeas emergiram de células e pupários maiores, sendo
significantemente maiores que os machos. Razão sexual secundária igual a 1:1 foi observada
em Araras e Rifaina. Não foi encontrada correlação significativa entre a razão sexual e o
diâmetro do tubo. Machos foram encontrados principalmente nas primeiras células de cria. O
tempo de desenvolvimento ovo-adulto foi mais longo na estação fria e seca.
Trypoxylon
aurifrons
aprovisionou seus ninhos principalmente com aranhas da família Araneidae. O
principal fator de mortalidade foi a interrupção do desenvolvimento das formas imaturas e
o
parasitóide mais freqüentemente encontrado
foi Melittobia sp..
PALAVRAS-CHAVE: arquitetura intranidal, parasitóide, presas, razão sexual, sazonalidade.
41
4.2.1 Introduction
Among the Crabronidae, the genus
Trypoxylon Latreille 1976 encompasses
nearly 660 species of cosmopolitan solitary wasps (Hanson e Menke 1995). These insects are
considered excellent model-organisms to test theories on parental care (Brockmann 1992;
Brockmann e Grafen 1989; Coville e Coville 1980), parental investment (Molumby 1997),
sex allocation (Oku e Nishida 1999) and sex ratio (Brockmann e Grafen 1992).
Based on differences in behavior and morphology, Richards (1934) divided
this group into two subgenera:
Trypoxylon and Trypargilum. The latter is restricted to the
New World (Bohart e Menke 1976) and includes about 100 species, 64 of which are restricted
to South America (Amarante 2002).
Trypargilum comprises a group of solitary wasps. Each female constructs her
nest and provisions it with spiders. Some species nest in preexisting tubular cavities and
divide them into a linear series of cells with mud partitions. Unlike most solitary wasps,
Trypargilum males mate with females when the nest is founded and remain inside until its
completion (Coville 1982).
Aspects of the natural history of
Trypargilum species, such as nest
architecture, nest-building time, sex ratio, parental investment, parasites and parasitoids have
been described for
Trypoxylon lactitarse Saussure 1867 (Camillo et al. 1993; Camillo e
Brescovit 1999; Buschini
et al. 2006), T. rogenhoferi Kohl 1884 (Camillo et al. 1994; Garcia
e Adis 1995; Peruquetti e Del Lama 2003a),
T. monteverdeae Coville 1982 (Brockmann
1992),
T. aestivale Richards 1934 (Camillo 1999), T. antropovi Coville 1985 (Camillo 1999)
and
T. opacum (Buschini e Wolff 2006). However, data on the biology of tropical species is
scarce in comparison to temperate species.
Trypoxylon (Trypargilum) aurifrons Shuckard is a Neotropical species
restricted to Venezuela, Colombia, the Guyanas, Paraguay and Brazil (Amarante 2002).
According to Coville’s (1982) classification, this species is included in the
nitidum group,
which clusters most of the species from the subgenus. Information on the morphology and
taxonomy of
T. aurifrons can be found in Richards (1934) and Bohart e Menke (1976).
However, there is no data on the nesting biology of this species in the literature.
This paper reports aspects of the nesting biology of
Trypoxylon aurifrons in
trap-nests. Our results will allow comparative studies with other Neotropical species from the
42
subgenus and will also be useful for future studies on population genetics and the intranidal
sociogenetic structure of
T. aurifrons.
4.2.2 Material and Methods
Study locality.
Trypoxylon aurifrons nests were sampled in three localities of
the state of São Paulo: the Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) campus at Araras
(22º18'S, 47°22'W, 629 m), the UFSCar
campus at São Carlos (22°01'S, 47º53'W, 850 m) and
Fazenda Rio Branco at Rifaina (20º04'S, 47°25'W, 575 m). These localities are classified as
having a Cwa climate (Koeppen system) characterized by two well-defined seasons: one
warm and rainy (October-March), with high rainfall and temperatures above 22ºC; and the
other cold and dry (April-September), with low precipitation and temperatures below 18ºC.
Sampling in Araras was from December 2003 to December 2006 at eight sites;
sampling in São Carlos was from November 2004 to November 2006 at two sites, and
sampling in Rifaina was from July 2004 to December 2006 at six sites. All sites were located
in old buildings near a water source.
Thirty collections were made in Araras, 14 in São Carlos and 17 in Rifaina.
The meteorological data from the period can be found on the UFSCar
campus website
(www.ufscar.br).
Sampling program. The trap-nests were made of dry bamboo stems sectioned
below each node. Bamboo stems of various lengths (100 to 652 mm) and inner diameters (3.0
and 20.0 mm) were used. Bundles of 8–12 units with similar dimensions were placed
horizontally in covered areas at different sites in the study areas. Care was taken to offer a
similar number of trap-nests with various dimensions at each site. Approximately 1,000 trap-
nests were monthly offered in Araras, 500 in Rifaina and 300 in São Carlos. The trap-nests
were checked approximately every 35 days.
The trap-nests used by the wasps were replaced with new ones and transported
to the Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros (LGEH), where they were opened.
If eggs and/or larvae were present, the nest was closed again until the cocoon stage was
reached. Cocoons were individually placed in vials labeled with the numbers of the trap-nest
and cell and kept at room temperature until the emergence of the adults, at which time the
species were identified.
43
Data Collected. The length and diameter of all trap-nests used by T. aurifrons
were measured and the number of cells was counted. Since nest construction was not
monitored, each progeny was treated as independent data. Aspects of the intranidal
architecture, such as closure and deep plugs, and the presence of parasitoids were registered.
The emergence, sex and weight (precision to ±1 mg) of the adults were recorded. To estimate
body size, the forewing length (FWL) of some adults was measured along the edge of the
wing from the tegula to the distal end. Direct observations were carried out in São Carlos
from December 2005 to March 2006 to estimate the developmental time. This was also
indirectly estimated by the average number of days between the collection date and the
emergence of adults. Emergence time was estimated from the time interval between the first
and last adult emerged from a given nest. Spider provisions were removed from larval brood
cells and stored in alcohol 70% for later identification by a specialist.
Some
T. aurifrons individuals were mounted on entomological pins and sent
for identification in order to be used for the identification of new individuals. Specimens were
deposited at the Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo and at the LGEH.
Data analysis. Statistical analyses were carried out following procedures
described by Zar (1999), using BioEstat 4.0 (Ayres
et al. 2005) and considering a 5%
significance level. Mean (
X
) and Standard Deviation (
±
) were given whenever appropriate.
Length and diameter values of the trap-nests used by
T. aurifrons females at
the three areas were pooled. The number of cells per nest was estimated from nests with a
closure plug (complete nests).
Pearson’s correlation test was used (i) to determine association between the
number of nests and total number of cells in relation to seasonal conditions (average daily
temperature and total rainfall of the period) in Araras; (ii) to verify association between the
number of cells and the number of nests produced in each period and the number of cells per
nest with length of the trap-nest; and (iii) to determine association between male and female
weight and FWL.
The Kruskal-Wallis non-parametric test was used to verify differences between
the number of cells per nest in each sampling areas. The Mann-Whitney test was used to
compare cell and cocoon dimensions of both sexes.
The average values of male and female weight and FWL were compared by the
t test. Analysis of Variance (ANOVA) with an a posteriori Tukey test was used to compare
44
differences in adult body mass produced at each area over the two seasons. Male and female
weight variation were tested for normality by the D´Agostino test. ANOVA was used to
compare weight variance between nestmates from nests with at least two males or females to
weight variance between individuals from different nests in these two sampling areas.
A χ
2
test was used to determine whether the secondary sex ratio (based on
emerged individuals) deviated from a 1:1 proportion. Parental investment was estimated from
the number of males and females produced and the amount of resources spent on each sex
(measured by weight). An χ
2
test was used to compare mortality and parasitism rates as well
as the protective role of the vestibular cell. The percentage of males from complete nests
where all individuals had emerged was arc-sin transformed and correlated to trap-nest
diameter through linear regression to determine whether tube diameter affects the intranidal
sex ratio.
4.2.3 Results
Nesting activity at different sites. A total of 2,431 nests of solitary bees and
wasps were sampled in the three areas, 87% of which were founded by
Trypoxylon
(Trypargylum)
wasps. A total of 295 nests of T. aurifrons were collected: 113 in Araras, 34 in
São Carlos and 148 in Rifaina. In these areas, most of the nests were found at a single site
(51% in Araras, 85% in São Carlos and 43% in Rifaina).
Seasonal abundance. Although
Trypoxylon aurifrons females constructed
their nests throughout the year, most of the nests in Araras (88%), São Carlos (71%) and
Rifaina (63%) were collected in the warm, rainy season
. As a more regular sampling effort
was made in Araras, data from there were used to determine the association between number
of nests and climate conditions (Fig. 1). The number of nests had a significant association to
the average daily temperature of the period (r = 0.47, P = 0.01, DF = 28), but not to rainfall (r
= 0.21, P = 0.26, DF = 28).
A total of 1,252 brood cells from
T. aurifrons nests were sampled in Araras (n
= 584), São Carlos (n = 142) and Rifaina (n = 526). Most (75%) were produced in the warm,
rainy season (Fig. 1). As expected, the number of cells had a strong association to the number
of nests produced in the period (r = 0.87, P = 0.00, DF = 59). The number of cells in the nests
from Araras was significantly correlated to the average daily temperature of the period (r =
0.51, P = 0.00, DF = 28), but not to rainfall (r = 0.16, P = 0.40, DF = 28).
45
Nest architecture. Trap-nests used by T. aurifrons had lengths ranging from
117 to 467 mm (
,6.63.241 ±=X
n = 295) as well as inner diameters between 3.1 and 16.6
mm (
,7.17.6 ±=X
n = 295). Most nests (88%) were built in trap-nests with 150 to 349 mm
in length (Fig. 2a) and 5.0 to 9.9 mm in diameter (Fig. 2b).
Complete nests had one to 12 brood cells. On average, five cells were found in
each nest. The number of brood cells per nest was significantly lower in São Carlos than in
Araras, but no difference was found in the number of cells per nest between Araras and
Rifaina or between Rifaina and São Carlos (Kruskal-Wallis: H
Araras x São Carlos
= 11.82, P <
0.05; H
Araras x Rifaina
= 1.72, P = 0.19; H
Rifaina x São Carlos
= 2.37, P = 0,07) (Table 1). No
significant correlation was found between the number of cells per nest and the length of the
trap-nest (r = 0.10, P = 0.16, DF = 207).
All
T. aurifrons nests had similar architecture. The partition walls were rough
and convex on the inner side, while smooth and concave on the outer side (Table I). A layer
of mud before the first brood cell (deep plug) was found in all nests and a double deep plug
was found in two nests (0.8%). There was a deep cell (empty cell between the deep plug and
first brood cell) in 28 nests (10%). A total of 209 nests had a closure plug at the end of the
tube (complete nests) and 26 nests had two closure plugs. In complete nests, 37% had a
vestibular cell (an empty space between the closure plug and the last provisioned cell). Brood
cells had variable lengths (Table I). Male cells were significantly smaller than female cells in
length (Mann-Whitney = 2.85, P = 0.00).
Cocoon.
T. aurifrons cocoons were cylindrical, dark brown, somewhat shiny
and smooth, with a round posterior end. Cocoons ranged from 7 to 14 mm, with an average
length of 11.2 mm (± 7 mm; n = 209). The male cocoon was significantly shorter than female
cocoon (Mann-Whitney = 1.21, P = 0.00) (Table II).
Adults.
T. aurifrons females were significantly heavier than males (t = 12.31,
P = 0.00) (Table II). A one-way ANOVA with an
a posteriori Tukey test confirmed the
difference between male and female weights, while also revealing weight differences between
individuals of the same sex collected in Araras and Rifaina (F
male
= 4.95, P <0.01; F
female
=
4.81, P <0.01, respectively). Individuals produced in the warm season were significantly
heavier from those produced in the cold season, regardless of sex or origin (F = 38.08, P =
0.00) (Table II). Weight was normally distributed among
T. aurifrons males and females from
Araras and Rifaina (Table III). ANOVA showed lower weight variance between nestmates
than between individuals from different nests (Table III).
46
Wings from 108 T. aurifrons females and 82 males were analyzed (Table II).
The weight-at-emergence of
T. aurifrons adults had a positive and highly significant
correlation with FWL for both sexes (r
males
= 0.72, P = 0.00, DF = 80; r
females
= 0.68, P = 0.00;
DF = 106). FWL differences between sexes were also significant (t = 7.74, P = 0.00).
Developmental time. A developmental time from 26 to 31 days (
,5.128 ±=X
n = 7) was estimated directly. An indirect estimate through the nests from Araras (where a
more regular sampling effort was made) gave an average of
2.78.22
±
(n = 97 males) and
3.73.22
±
days (n = 125 females) in the warm season and
5.51.32
±
(n = 17 males) and
4.96.32 ± days (n = 20 females) in the cold season.
From 155 nests (52%), all individuals emerged at the same day. In 209 nests
(71%), the interval between the first and last emergence was five days. This interval reached
21 days in the cold season.
Sex ratio and distribution
. An overall 1:1 sex ratio was observed in Araras
(114 males:145 females;
χ
2
= 3.59, P = 0.0623, DF = 1) and Rifaina (169 males:153 females;
χ
2
= 0.795, P = 0.4032, DF = 1), but not in São Carlos (31 males:50 females; χ
2
= 4,457, P =
0.0455, DF = 1). Females were 30% bigger than males. The parental investment was female-
biased in all three areas: 62% in Araras, 60% in São Carlos and 57% in Rifaina.
The sex ratio was not associated to diameter of the tube in nests where all
brood emerged (y = -0.008x + 0.6153; R
2
= 0.0035; P = 0.72; DF = 37). However, a higher
male production was found in trap-nests with diameters between 4 and 5 mm (Fig. 3). A
nonrandom distribution of the sexes inside the nest was observed. Males were usually found
in the first provisioned cells (Table IV). In complete nests where all adults emerged, a male (n
= 12) and female (n = 3) single-sex progeny was found.
Prey. Spiders from 14 provisioned cells were collected from T. aurifrons nests
in the rainy (n = 143 spiders) and dry seasons (n = 8 spiders). Of the 151 identified spider
prey, 150 (99%) belonged to the family Araneidae. Eight spiders were female, seven were
male and 136 were immature (unidentified sex). The most common prey was
Eustala (n =
23), mainly represented by
Eustala gr. fuscovittata (n = 19). T. aurifrons also used Metazygia
sp
1
(n = 4), Argiope argentata (n = 4), Araneus spp (n = 4), Acacesia sp
1
(n = 1) and
Mecynogea sp
1
(n = 1). Only one immature specimen from the genus Leucage (Tetragnatidae)
was sampled, which occurred in São Carlos on February 25, 2005.
47
In Araras (n = 6 cells), 81% of the spiders were from the genus Eustala and
19% were from the genus
Araneus and Metazygia. In São Carlos (n = 3 cells), the most
common genera were
Argiope (100%). In Rifaina (n = 5 cells), the genera Argiope and
Araneus each represented 38% of the captured spiders, while the genera Acacesia and
Mecynogea each constituted 12% of the prey.
Mortality and natural enemies. A total of 1,252 brood cells were sampled.
Development to adulthood occurred in 53% of cells (Table V). Death of immature forms was
observed in 590 cells in the egg (12%), larval (2%) and pupal (86%) stages. Mortality and
parasitism rates were significantly different in the three areas (
χ
2
= 10.52, P = 0.00, DF = 2;
χ
2
= 15.28, P = 0.00, DF = 2, respectively), with the highest rates in Araras (Table V).
Parasitoids caused the death of 209 brood cells (17%).
Melittobia sp.
(Hymenoptera: Eulophidae) was the most common parasitoid of the
T. aurifrons nests and
was found in 324 cells (26%). During the three years of sampling in Araras, the higher
presence of the parasitoid was positively associated to the number of hosts.
Adults from the families Chrysididae, Ichneumonidae and Chalcididae were
found in six, two and one nests, respectively. These parasitoids were observed mainly in the
last brood cell (6 of the 9 nests) and were found in nests with (3 in 77 nests) or without (6 in
132 nests) a vestibular cell (
χ
2
ind
= 0.05, P = 0.89, DF = 1).
4.2.4 Discussion
Conditions and resources for nest building.
A number of factors affect nest-
building rates among Hymenoptera, such as temperature, wind and rainfall, as well as the
availability and features of natural cavities (Morato e Martins 2006). Our results indicate that
temperature is the main seasonal condition affecting
T. aurifrons nesting behavior. Similar to
other Neotropical wasp species, such as
T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994; Camillo e
Brescovit 1999),
T. lactitarse (Camillo e Brescovit 1999; Camillo et al. 1993; Buschini et al.
2006) and
T. opacum (Buschini e Wolff 2006), T. aurifrons nesting activity was greater
during the warm season.
The size and quality of the brood were also affected by the season. Most cells
were produced in the warm season. Larger individuals were found in this season as well,
regardless of sex. Brockmann e Grafen (1992) observed a seasonal pattern
of sex allocation in
T. politum due to temperature differences. Temperature also affects development time, which
48
was shorter in the warm season. The development time seen in the three areas suggests that T.
aurifrons
has a development cycle with no diapause. Our results demonstrate that T. aurifrons
is a multivoltine species, like
T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994; Camillo e Brescovit 1999),
strengthening Coville´s (1982) suggestion that
Trypoxylon species are bivoltine or
multivoltine in tropical and subtropical regions.
Coville (1982) reports that the number of trap-nests available may affect the
nest choice of
Trypoxylon females. Moreover, Trypoxylon species require a minimum cavity
diameter, which is determined by the body size of the founding female and prey size (Garcia e
Adis 1995). The maximum diameter is determined by preventive action against attacks from
parasitoids and predators, as greater diameters result in thinner plugs (Coville e Coville 1980).
Trypargilum species differ in the number of families of spider preyed and in
the percentage of each spider family among the prey (Coville 1982).
T. rogenhoferi prefers
Alpaida spiders (Camillo et al. 1994; Camillo e Brescovit 1999, 2000; Garcia e Adis 1995); T.
lactitarse
mainly collects Alpaida and Eustala (Camillo et al. 1993; Camillo e Brescovit
1999; Buschini
et al. 2006); T. antropovi uses spiders from the genus Eriophora (Camillo
1999);
T. tenoctitlan collects Metazygia (Coville e Coville 1980); and T. opacum collects
Bertrana and Eustala (Buschini e Wolff 2006).
Although the handling of the cocoons may have produced a biased estimate of
the mortality rate,
the main mortality factor in T. aurifrons was the death of the immature
forms, which is a result similar to that found for other species of
Trypoxylon that use trap-
nests (Camillo
et al. 1993; Camillo et al. 1994; Camillo e Brescovit 1999; Garcia e Adis
1995). Parasitoidism
of T. aurifrons nests resulted in 16% of the deaths. The parasitized cells
were generally found in the last cells, as observed by Coville (1982) and Jayasingh e Taffe
(1982) in species from this genus.
Melittobia sp., which is the main parasitoid of T. aurifrons, was found in 324
cells (25.9%), but only caused the death of 205 individuals (16.4%), usually in the egg stage.
This parasitoid was also found in
T. antropovi (Camillo 1999), T. rogenhoferi (Camillo et al.
1994),
T. politum (Molumby 1995), T. lactitarse (Camillo et al. 1993) and T. antropovi
(Camillo 1999) nests. Adult Ichneumonidae, Chalcididae and Chrysididae were found in
T.
aurifrons
, T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994), T. lactitarse (Camillo et al. 1993), T.
tenoctitlan
(Coville e Coville 1980) and T. antropovi (Camillo 1999) nests.
49
Site distribution of the nests. Trypoxylon aurifrons nesting behavior seems to
be site preferential in the three sampling areas.
T. rogenhoferi, T. lactitarse and T. nitidum
exhibit similar behavior in the three sampling areas (Santoni e Del Lama, in preparation). Is it
possible that resources have affected this “habitat partition”
exhibited by T. aurifrons?
We disposed a large number of trap-nests with different inner diameter sizes at
each nesting site. Thus, there was no lack of substrate or nest construction material that would
explain why
T. aurifrons preferentially nests at one site, while other Trypoxylon species
preferentially nest at other sites.
Our study confirms previous data on the foraging preference of
Trypoxylon
(Trypargilum)
for the Araneidae family and also suggests an absence of interspecific
competition for prey among
Trypargilum species. This species-specific prey preference may
be an adaptive response to prevent overlapping in the prey collected (Camillo e Brescovit
1999). If the habitat partition exhibited by
Trypoxylon species could not be easily explained
by interspecific competition, an independent evolution of cognitive abilities to recognize
important habitat features (‘clues’, as proposed by Storch e Frynta, 2000) may be an
alternative explanation. As the parasitoids found in
T. aurifrons nests are similar to those of
other
Trypargilum nests, we suggest that the presence of shared natural enemies may be a clue
to why one species avoids a site used by another species.
This habitat partition would be reinforced by the presence of the first females
as a sign of a safe place for nesting. Phylopatry is an important factor in nest-building site
selection in changing habitats (Potts e Willmer 1997) and may be another factor in this
behavior. Moreover, the reuse of the parental nest is relatively common among solitary
hymenopterans that form aggregations (Roubik 1989). There are no studies on phylopatric
behavior in
Trypoxylon species. Mark-and-recapture studies or molecular genetic analyses are
required to confirm such behavior.
Intranidal structure. Trypoxylon aurifrons nests exhibited features similar to
those described for species of the subgenus
Trypargilum that nest in preexisting cavities
(Coville 1982; Coville e Coville 1980; Garcia e Adis 1995; Camillo
et al. 1993; Camillo et al.
1994; Genaro 1996a, 1996b). The presence of a deep plug has been described for other
Trypoxylon species (Coville e Coville 1980; Garcia e Adis 1995; Camillo et al. 1994; Camillo
et al. 1993; Genaro 1996a, 1996b). Based on the nesting biology of T. rogenhoferi, Garcia e
Adis (1995) suggest that this behavior is restricted to species whose larvae use mud to make
50
cocoons, as occurs with T. aurifrons, since this plug is destined to the first cell built.
Vestibular cells were also found in nests of other
Trypargilum species that nest in preexisting
cavities. However, as proposed by Coville (1982), this structure did not represent a barrier for
the parasitoids in
Trypoxylon aurifrons (present data) and T. rogenhoferi nests (Garcia e Adis
1995).
T. aurifrons cocoons had the features described by Coville (1982) for the
nitidum complex cocoon, where the anterior end is truncate, with a prominent nipple.
According to Coville (1979), cocoon features are an adequate tool for grouping species:
species from the subgenus
Trypoxylon present fragile cocoons, whereas species from the
subgenus
Trypargilum have hard cocoons, as they incorporate mud in this structure (Garcia e
Adis 1995; Krombein 1967). In the present study, the sexes had different cocoon lengths, as
in
T. lactitarse (Camilo et al.1993; Buschini et al. 2006), where female cocoons are
significantly larger than male cocoons. Similar male and female cocoon lengths were found in
T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994), T. opacum (Buschini e Wolff 2006) and T. tenoctitlan
(Coville e Coville 1980) as well.
Adults. As weight-at-emergence was significantly correlated to FWL, it may
be a good estimator for body size in
T. aurifrons. FWL adequately estimates Trypoxylon body
size as a consequence of the amount of food the brood receives (Coville e Griswold 1983).
Trypoxylon aurifrons females emerged from longer cells than males, which is similar to T.
lactitarse
(Buschini et al. 2006; Camillo et al .1993) and T. tenoctitlan (Coville e Coville
1980), but different from
T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994, Garcia e Adis 1995). ANOVA
analysis demonstrated that nestmates have more similar weight-at-emergence than individuals
from different nests, suggesting that a genetic factor affects this trait.
Trypoxylon aurifrons allocates more resources to produce larger females, as
measured by FWL and weight-at-emergence. Dimorphism for body size is common among
solitary hymenopterans. It is a well-registered fact that females are significantly larger than
males in
Trypoxylon species, including T. lactitarse (Camillo e Brescovit 1999; Camillo et al.
1993; Buschini
et al. 2006), T. rogenhoferi (Camillo e Brescovit 1999), T. antropovi, T.
aestivale
(Camillo 1999) and T. politum (Brockmann e Grafen 1992; Molumby 1997).
The reproductive success of bees and wasps that supply trophic resources to
their brood depends on the maternal phenotype and the choices made by the mother upon
laying its eggs (Peruquetti e Del Lama 2003a). Females provision their brood, affecting its
size and resulting in the differences observed in some species of Crabronidae (Brockmann e
51
Grafen 1992; Molumby 1997; Peruquetti e Del Lama 2003a). Thus, the higher allocation of
resources to one sex may be a way to maximize fitness.
A number of factors influence the intranidal sex ratio in Hymenoptera, as seen
in
Trypoxylon malaisei Gussakovskij 1933 by (Oku e Nishida 1999). Peruquetti e Del Lama
(2003a) demonstrated that male-biased offspring can arise when trap-nests with smaller
diameters are used for nest building. However, this was not observed in
T. aurifrons and
Trypoxylon malaisei (Oku e Nishida 1999).
Although the sex ratio was not different from 1:1 in Araras and Rifaina, the
investment sex ratio was significantly female-biased in the three areas. According to
Rosenheim
et al. (1996), if availability of provisioning resources increases and females
become more egg-limited, they may choose one of two strategies: (i) they could increase
provision masses per offspring and produce a less male-biased brood; or (ii) they could
maintain an equal numerical sex ratio and a more female-biased investment sex ratio. In
Trypoxylon, sex distribution within the trap-nests is usually nonrandom. In some species,
males are found in the first cells and females in the last cells, whereas an inverse arrangement
of males and females is found among other species. Studies with
Trypargilum species
(Coville e Coville 1980; Camillo
et al. 1993; Camillo et al. 1994) have demonstrated that
males are found in the first cells, as verified herein for
T. aurifrons.
As 1:1 secondary sex ratio was found, a similar number of nests would be
expected with a male or female single-sex progeny. The higher number of male single-sex
progeny (13 to 2) suggests nest building by constrained (sperm-depleted or unmated) females.
However, males and females from this subgenus mate immediately before or soon after the
initial activities of nest construction (Coville 1982). Moreover, we observed the presence of
male guards inside all nests built. This finding may alternatively be interpreted as a strategy
for optimal sex allocation.
Our findings demonstrate that temperature was the environmental factor that
most strongly affected
T. aurifrons nesting biology and population dynamics. Many intranidal
architecture features appeared to be similar to those described for other Neotropical species
from this subgenus. These data will support analyses on the intranidal sociogenetic structure
of
Trypoxylon aurifrons and tests on the evolutionary role of the male guarding behavior
found only in
Trypargilum species. The phylopatric behavior and the occurrence of nest
building by unfertilized females require further confirmation through molecular genetic
analysis.
52
Acknowledgements. We are grateful to Dr. Adhemar Rodrigues Alves, owner of the Fazenda
Rio Branco (Rifaina, SP). We thank Servio Tulio Pires Amarante for wasp species
identification and Antonio Carlos Brescovit for spider species identification. We are also
grateful to Rogério Oliveira Souza for helping in the nest sampling and FAPESP for financial
support.
53
Table I. Architecture of Trypoxylon aurifrons nests in trap-nests sampled in three localities of the state of São
Paulo (N = number of observations).
Nest structure
Amplitude of
variation
X
N
Number of cells per nest (from Araras) 1 – 12
26
±
94
Number of cells per nest (from São Carlos) 1 – 11
25
±
25
Number of cells per nest (from Rifaina) 1 – 12
24
±
90
Thickness of cell partition (mm)
1.3 – 2.7
5.02.2
±
25
Thickness of closure plug (mm)
1.9 – 3.3
5.15.2
±
9
Length of nest (cm)
4.9 – 21.2
9.34.12
±
28
Length of the deep cell (cm)
0,6 – 4.0
9.02.1
±
28
Length of the vestibular cell (cm)
1.0 – 6.5 4.12.2
±
35
Length of the brood cell (cm)
0.6 – 5.0 7.08.1
±
319
Length of male brood cell (cm)
0.7 – 3.3
5.06.1
±
92
Length of female brood cell (cm)
1.0 – 4.8
7.09.1
±
86
Table II. Dimensions of male and female cocoons (mm), weight-at-emergence (WE) (mg) and forewing length
(FWL) (mm) in Trypoxylon aurifrons (N = number of observations).
Amplitude
of variation
X
N
Male cocoon length
8 – 14
3.15.11
±
73
Female cocoon length
8 – 14 2.16.10
±
54
Male WE
14 – 42
0.63.25
±
255
Female WE
11 – 60
8.79.32
±
285
Male WE - hot season
14 – 42
8.56.25
±
211
Female WE - hot season
11 – 50 3.79.33
±
232
Male WE - cold season
14 – 28
1.58.19
±
44
Female WE – cold season
12 – 43 8.74.27
±
53
Male FWL 5.99 – 8.12 50.024.7
±
82
Female FWL 6.38 – 8.70 44.074.7
±
108
Table III. Normality test (F) for male and female weight values and ANOVA test for weight variance between
nestmates and between individuals from different nests in Araras and Rifaina - SP.
Test D’Agostino ANOVA
Araras D P
F
DF P
Male 0.2824 >0.05 3.09 32 0.001
Female 0.2800 >0.05 3.26 46 0.000
Rifaina
Male 0.2827 >0.05 1.84 31 0.045
Female 0.2803 >0.05 4.28 28 0.000
54
Table IV. Percentage of emerged Trypoxylon aurifrons males in each cell* according to their position in the
nests (- no emergences).
Nº cells
per nest
Nº of
nests
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 17 75
2 16 78 55
3 32 50 50 56
4 38 56 71 21 35
5 35 82 59 50 43 53
6 32 62 50 48 45 50 33
7 23 60 50 60 50 10 45 45
8 19 75 75 43 0 14 43 80 100
9 9 100 50 50 67 50 100 25 67 75
10 7 3 - 0 0 0 0 50 0 0 50
11 3 3 - 100 100 100 100 0 50 0 0 -
12 2 1 - - - - - 0 100 0 - 0 0
Total 233 66 54 45 43 37 45 55 73 55 50 0 0
* Cells are numbered from inner end of nest toward the entrance.
Table V. Number of cells, emerged and dead Trypoxylon aurifrons individuals collected in three areas of the
state of São Paulo.
Araras São Carlos Rifaina
Cells 584 142 526
Emerged 259 (44%) 81 (57%) 322 (61%)
Deaths by parasitoids 128(22%) 17 (12%) 64 (12%)
Melittobia sp. 125 15 56
Ichneumonidae 1 1
Chrysididae 2 2 6
Chalcididae
1
By unknown causes 197 (34%) 44 (31%) 140 (27%)
55
0
100
200
300
400
500
600
Dec/04
Jan/04
Feb/04
Mar/04
Apr/04
May/04
Jun/04
Ago/04
Sep/04
Oct/04
Nov/04
Dec/04
Jan/05
Fev/05
Mar/05
Apr/05
Jun/05
Jul/05
Ago/05
Sep/05
Nov/05
Dec/05
Jan/06
Fev/06
Mar/06
Apr/06
Jun/06
Jul/06
Oct/06
Dec/06
Total rainfall (mm)
0
5
10
15
20
25
30
Temperature (°C
)
Rainfall (mm) Temperature (ºC)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Dec/04
Jan/04
Feb/04
Mar/04
Apr/04
May/04
Jun/04
Ago/04
Sep/04
Oct/04
Nov/04
Dec/04
Jan/05
Fev/05
Mar/05
Apr/05
Jun/05
Jul/05
Ago/05
Sep/05
Nov/05
Dec/05
Jan/06
Fev/06
Mar/06
Apr/06
Jun/06
Jul/06
Oct/06
Dec/06
Months
Number of nests and cells .
Seqüência1
Seqüência3
N
umber of nests
N
umber of cells
Figure 1. Climate conditions and number of Trypoxylon aurifrons nests and brood cells obtained monthly during
three years of sampling in Araras (SP).
56
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
[100]-150
[150]-200
[200]-250
[250]-300
[300]-350
[350]-400
[400]-450
[450]-[500]
a) Lenght (mm)
Number of nests .
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
[3]-4
[4]-5
[5]-6
[6]-7
[7]-8
[8]-9
[9]-10
[10]-11
[11]-12
[12]-13
[13]-14
[14]-15
[15]-16
[16]-[17]
b) Diameter (mm)
Number of nests .
Figure 2. Lengths (a) and diameters (b) of the trap-nests used by Trypoxylon aurifrons.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
[3]-4
[4]-5
[5]-6
[6]-7
[7]-8
[8]-9
[9]-10
[10]-11
[11]-12
[12]-13
[14]-15
[16]-[17]
Diameter (mm)
Proportion of males and females .
Male Female
Figure 3. Proportion of males and females according to the inner diameter of the trap-nest.
57
4.3 Estrutura do pupário de duas espécies de Trypoxylon (Trypargilum) rogenhoferi e
Trypoxylon (Trypargilum) lactitarse (Hymenoptera: Crabronidae)
4.3.1 Introdução
Utilizando caracteres morfológicos e comportamentais, Richards (1934)
dividiu o gênero
Trypoxylon em dois subgêneros: Trypoxylon e Trypargilum. As fêmeas do
subgênero
Trypoxylon nidificam em cavidades artificiais como troncos de árvore ou
constróem ninhos com barro, como as espécies
T. fabricator e T. asuncicola. A maioria das
espécies apresenta comportamento solitário, mas há relatos de que algumas nidificam em
agregados. Neste subgênero, o macho não mantém guarda do ninho, encontrando com a
fêmea apenas no momento da cópula (Richards 1934).
No subgênero
Trypargilum, a maioria das fêmeas utiliza cavidades
preexistentes para nidificarem, como ninhos vazios de outras espécies, dividindo-as em séries
lineares de células separadas por paredes de barro. Nesse subgênero, o macho mantém a
guarda no ninho enquanto a fêmea está forrageando e, com a sua volta, ocorrem cópulas no
interior do ninho (Coville 1982; Richards 1934).
As características dos pupários também constituem uma boa ferramenta para
relacionar as espécies de cada grupo. Espécies do subgênero
Trypoxylon apresentam pupários
frágeis, pois não incorporam barro na sua construção, sendo de uma coloração esbranquiçada
ou bege (Richards 1934). Em
Trypargilum, os pupários são resistentes devido à incorporação
de barro em sua constituição. São de coloração marrom-escuro brilhante, envolvidos por
tramas de seda, que os prendem às paredes das células de cria.
Krombein (1967) encontrou diferenças diagnósticas na forma dos pupários de
várias espécies de
Trypargilum. Matthews e Matthews (1968) elaboraram inferências
filogenéticas baseadas nas propriedades dos pupários e estabeleceram as seguintes
conclusões:
i) Pupários do complexo spinosum são os únicos que apresentam um colar que
envolve a porção anterior. A área central da porção anterior é truncada e apresenta uma
proeminência;
ii) Pupários do complexo nitidum apresentam a porção anterior truncada com
proeminência;
58
iii) Pupários do complexo punctulatum apresentam a porção anterior dilatada
ou arredondada, quando se encontram em tubos de diâmetro grande.
iv) Pupários de
Trypoxylon tridentatum Packard 1867, uma espécie distinta do
grupo Nitidum, apresentam a porção anterior arredondada, com uma coroa levemente
granulada e bronzeada (Krombein 1967; Coville 1982);
v) Pupários do grupo Albitarse são levemente afunilados na porção anterior,
arredondados e apresentam uma coroa áspera e opaca;
vi) Pupário de
Trypoxylon tenoctitlan Richards 1934 (complexo fugax, grupo
Nitidum) é similar ao do complexo punctulatum (Coville e Coville 1980).
Trypoxylon (Trypargilum) rogenhoferi Kohl 1884 e Trypoxylon (Trypargilum)
lactitarse Saussure 1867 são espécies que ocorrem na região neotropical e, de acordo com
Coville (1982), estão agrupadas no complexo punctulatum. Trabalhos sobre a biologia de
nidificação destas espécies confirmam as características de pupário descritas por Matthews e
Matthews (1968) para este grupo, sendo observados pupários de vários tipos em relação à
porção anterior (
T. rogenhoferi: Camillo et al. 1994; Garcia e Adis 1995; T. lactitarse:
Krombein 1967; Coville 1981; Camillo
et al. 1993; Buschini et al. 2006).
O objetivo deste trabalho foi caracterizar os pupários de
T. rogenhoferi e T.
lactitarse
, obtidos a partir de ninhos coletados em três regiões do estado de São Paulo, e
verificar o efeito de fatores como sexo e diâmetro do ninho-armadilha na freqüência do tipo
de pupário; por fim, discutir uma possível determinação genética deste caráter.
4.3.2 Material e Métodos
Área de estudo.
Ninhos das espécies de Trypoxylon foram coletados em três
áreas localizadas no estado de São Paulo: o
campus de Araras (22º18'S, 47°22'O, 629 m) da
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), durante Dezembro de 2003 a Março 2007; o
campus da UFSCar em São Carlos (22°01’S, 47º53’W, 850 m), entre Novembro de 2004 a
Novembro de 2006; e a Fazenda Rio Branco em Rifaina (20º04'S, 47°25'O, 575 m), durante
Novembro de 2004 a Março de 2007.
Amostragem. As espécies foram amostradas por meio de ninhos-armadilha
feitos de bambus secos seccionados entre cada nó. Os bambus, de vários comprimentos (100 a
652 mm) e diâmetros internos (4,0 a 18,0 mm), foram agrupados e distribuídos nas áreas de
estudo.
59
Todos os ninhos-armadilha usados pelas vespas foram substituídos por novos e
transportados para o Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros (LGEH), onde
foram abertos. Os pupários foram colocados individualmente em frascos de vidro e mantidos
em temperatura ambiente até a emergência do adulto, momento que eram identificadas as
espécies. Os comprimentos e diâmetros dos ninhos-armadilha utilizados pelas espécies de
Trypoxylon foram tomados.
Análises estatísticas. As análises estatísticas foram conduzidas de acordo com
os procedimentos descritos por Zar (1999), usando o software Statistica para Windows
(Release 7.0; Statsoft Inc., Tulsa, Oklahoma) e com nível de significância igual a 5%. Média
(
X
) e Desvio Padrão (
±
) são apresentados quando apropriado.
Para as análises referentes à proporção de pupários dentro de um ninho, foram
considerados os ninhos fechados (que apresentavam parede de fechamento de barro na
extremidade do tubo). Para verificar possível efeito do diâmetro do tubo sobre a proporção
dos tipos de pupário, a porcentagem de pupários de um tipo foi transformada para arcoseno e
relacionada ao diâmetro do tubo por regressão linear. Teste de
χ
2
de independência foi
utilizado para verificar se havia relação entre o tipo de pupário e o sexo do indivíduo.
4.3.3 Resultados
Foram coletados 209 ninhos de
T. rogenhoferi em Araras, 495 em Rifaina e 35
em São Carlos.
T. lactitarse foi amostrada somente em Araras, sendo coletados 127 ninhos. T.
rogenhoferi
nidificou em tubos de 10,5 a 61,5 cm de comprimento (27,8
±
8,5 cm) e 5,1 a
17,2 (mm) de diâmetro (9,0 ± 2,0 mm).
T. lactitarse utilizou cavidades de 8,6 a 44,0 cm de
comprimento (21,8 ± 5,8 cm) e 4,5 a 17,5 mm de diâmetro (9,2
±
2,3 cm) (ver Capítulo 1).
Os pupários de
T. rogenhoferi (n = 4.170) e de T. lactitarse (n = 794)
apresentaram coloração marrom-escuro brilhante e de estrutura resistente. Estes pupários
foram classificados em dois tipos em relação à sua porção anterior: os pupários denominados
“D” (dilatado) apresentaram a porção anterior expandida (Figura 1a) e os pupários nominados
“ND” (não dilatado), extremidade anterior arredondada (Figura 1b).
60
Figura 1. Ninho de Trypoxylon rogenhoferi, apresentando os tipos de pupários: a) não dilatado; b) dilatado.
Os pupários do tipo “D” apresentaram variações no diâmetro da extremidade
expandida de acordo com o diâmetro do ninho-armadilha (Figura 2a): esta região apresentou
valor semelhante ao do diâmetro do tubo. Os pupários do tipo “ND” apresentaram a porção
anterior com o mesmo diâmetro do restante do pupário, independentemente do diâmetro da
cavidade (Figura 2b).
Figura 2. Pupários de Trypoxylon rogenhoferi. a) pupário do tipo dilatado – as diferentes dimensões de diâmetro
acompanham os diferentes diâmetros dos ninhos-armadilha utilizados; b) pupário do tipo não dilatado.
Nas duas espécies, os pupários “D” foram mais freqüentes em ninhos-
armadilha de menor diâmetro (4,0 a 10,0 mm em
T. rogenhoferi e 4,0 a 8,0 em T. lactitarse)
(Figura 3).
a)
6
145
628
515
185
74
5
89
1031
1124
311
43
5
9
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
[4] a 6
[6] a 8
[8] a 10
[10] a 12
[12] a 14
[14] a 16
[16] a 18
Diâmetro (mm)
Proporção de pupários (ND e D)
b)
2
80
156
143
66
30 9
9
165
94
36
4
0%
20%
40%
60%
80%
100%
[4] a 6
[6] a 8
[8] a 10
[10] a 12
[12] a 14
[14] a 16
[16] a 18
Diâmetro (mm)
Proporção de pupários (NDe D)
Figura 3. Proporção de pupários tipo não dilatado (“ND”) e dilatado (“D”) em ninhos de a) Trypoxylon
rogenhoferi e b) Trypoxylon lactitarse amostrados por meio de ninhos-armadilha de diversos diâmetros (mm) em
três localidades do estado de São Paulo. As indicações nas barras indicam o número de observações.
a
b
a
b
61
Considerando ninhos fechados, foi encontrada prole que apresentava
exclusivamente o pupário do tipo “ND” (31 e 12 ninhos para
T. rogenhoferi e T. lactitarse,
respectivamente) ou o pupário do tipo “D” (135 e 9 ninhos para
T. rogenhoferi e T. lactitarse,
respectivamente). Ninhos com prole com os dois tipos de pupários foram os mais comuns
para as duas espécies (573 e 106 ninhos para
T. rogenhoferi e T. lactitarse, respectivamente).
Nestes ninhos, a proporção de pupários “ND” em relação aos pupários “D” variou de acordo
com o diâmetro do ninho e, desta forma, verificou-se uma influência do diâmetro da cavidade
sobre a razão de pupários “ND”, evidenciada por regressão linear (Figura 4). Para esta análise,
foram utilizados ninhos fechados e número total de pupários maior que 70% do número de
células do ninho (
T. rogenhoferi: n = 407; T. lactitarse: n = 71).
a)
R
2
= 0.3006
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
5 6 7 8 9 101112131415161718
Diâmetro (mm)
Arcosseno %ND/Total célul
a
b)
R
2
= 0.3558
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
45678910111213141516
Diâmetro (mm)
Arcosseno %ND/Total céll
a
Figura 4. Regressão linear mostrando a influência do diâmetro dos ninhos-armadilha, utilizados em três
localidades do interior de São Paulo, sobre o arcosseno da razão de pupários não dilatado sobre o total de células
de ninhos de a) Trypoxylon rogenhoferi (y = 0.12x - 0.70; F = 174,06; gl = 406; P = 0,00) e b) Trypoxylon
lactitarse (y = 0.13x - 0.53; F = 38,11; gl = 70; P = 0,00).
Quanto à distribuição do tipo de pupário em relação ao sexo, foi verificado que
os pupários do tipo “ND” são mais comuns em machos e os pupários “D”, em fêmeas de
T.
rogenhoferi
. Para T. lactitarse, os machos são freqüentemente de pupário “ND” e as fêmeas
apresentam semelhante proporção dos dois tipos (Tabela I).
Tabela I. Proporção de pupários “ND” (não dilatado) e “D” (dilatado) e razão sexual em amostras de
Trypoxylon rogenhoferi e Trypoxylon lactitarse em três regiões do estado de São Paulo.
Trypoxylon rogenhoferi Trypoxylon lactitarse
Proporção Araras Rifaina São Carlos Araras
Pupários “ND” –
machos:fêmeas
229:190 501:592 25:15 183:130
Pupários “D” –
machos:fêmeas
110:323 181:696 29:35 73:126
62
A análise do χ
2
ind
(GL = 1)
entre sexo e tipo de pupário apresentou-se
significativa para
T. rogenhoferi (Araras: χ
2
ind
= 76,04; Rifaina: χ
2
ind
= 136,47; São Carlos:
χ
2
ind
= 54,56) e T. lactitarse (Araras: χ
2
ind
= 23,09).
Ao analisar a progênie de um mesmo ninho, foi verificado que, quando um
macho apresentou pupário “ND”, os pupários de fêmeas foram dos dois tipos, enquanto que
quando o pupário de macho era “D”, as fêmeas apresentaram somente pupários “D”. Por fim,
em ninhos com machos nascidos de pupários de ambos os tipos, observou-se semelhante
produção em fêmeas (Tabela II).
Tabela II. Número de ninhos apresentando o tipo de pupário de cada progênie: pupário não dilatado (ND);
pupário dilatado (D).
Sexo e tipo de pupário Número de ninhos
Machos Fêmeas
ND D ND D
T. rogenhoferi
(Araras)
T. rogenhoferi
(Rifaina)
T. lactitarse
(Araras)
x 22 53 21
x x 8 12 5
x x 22 31 22
x x 19 56 12
x x x 4 1 1
x x x 18 30 9
x x x x 2 5 4
x 17 79 10
x x 0 0 0
x x 31 104 5
x x x 1 2 0
x 9 9 10
x x 4 8 3
x 13 41 10
Total 170 431 112
4.3.4 Discussão
Neste trabalho foi verificado que os pupários de
T. rogenhoferi e T. lactitarse
apresentaram as características descritas por Richards (1934) e por Coville (1982) para o
complexo punctulatum: estruturas cilíndricas, resistentes, que contêm barro em sua
composição e apresentam variação do diâmetro na parte posterior. Estas características
também foram evidenciadas em
T. rogenhoferi por Camillo et al. (1994) e Garcia e Adis
(1995) e em
T. lactitarse por Krombein (1967), Coville (1981), Camillo et al. (1993) e
Buschini
et al. (2006).
63
Até o presente, a observação de pupários com dilatação na parte anterior foi
relatada em apenas quatro espécies de
Trypargilum, pertencentes a dois complexos do grupo
nitidum:
T. rogenhoferi, T. lactitarse e Trypoxylon evansi Coville 1882 (Coville 1982),
pertencentes ao complexo punctulatum – e
T. tenoctitlan (Coville e Coville 1980) –
pertencente ao complexo fugax.
Nestes trabalhos, os autores relatam pupários com a porção anterior “dilatada”
ou “não dilatada”; no entanto, há variação em relação ao número de tipos de pupário para
cada espécie. Em
T. rogenhoferi, Camillo et al. (1994) observaram a presença de três tipos de
pupários, denominando-os arredondado, expandido e extremamente expandido, ao passo que
Garcia e Adis (1995) descreveram dois tipos, denominando-os normal e sino. Em
T. lactitarse
foram detectados dois tipos, definidos como arredondado e expandido por Buschini
et al.
(2006); e três tipos, definidos por Camillo
et al. (1993) como arredondado, expandido e
extremamente expandido. Em
T. tenoctitlan foram observados quatro tipos de pupários
(arredondado, 9,5, 6,4 e 4,8 mm) (Coville e Coville 1980).
Esta variação no número de tipos de pupário pode ser explicada pelos ninhos-
armadilha utilizados em cada estudo. Na maioria dos trabalhos em
Trypoxylon são utilizadas
armadilhas de diâmetros definidos (de duas a quatro medidas de abertura); como
conseqüência, aqueles autores observaram tipos exclusivos de pupário para cada diâmetro,
sugerindo a presença de vários tipos (um arredondado e vários dilatados).
No presente estudo, a utilização de ninhos-armadilha de vários diâmetros
internos permitiu verificar que a porção dilatada do pupário apresenta diâmetro similar ao do
ninho-armadilha, assim como proposto por Coville (1982). Desta forma, foi determinada a
ocorrência de apenas dois tipos de pupários: os que apresentavam a extremidade dilatada e os
que apresentavam a extremidade arredondada.
Este tipo de metodologia também possibilitou verificar que o diâmetro do
ninho exerce influência sobre a determinação do tipo de pupário: maior produção de pupário
“D” foi verificada nos tubos de menor diâmetro, enquanto que os “ND” foram amostrados em
ninhos maiores. Este resultado também foi relatado por Buschini
et al. (2006), Camillo et al.
(1993, 1994), Coville e Coville (1980) e Garcia e Adis (1995).
Maior freqüência de emergências de machos em pupário do tipo “ND” também
foi observada em
T. rogenhoferi por Garcia e Adis (1995); porém, diferentemente do presente
trabalho, os autores observaram maior produção de fêmeas em pupários “ND” (machos – não
dilatado:dilatado = 117:10; fêmeas – não dilatado:dilatado = 112:54). Estes dados apresentam
64
diferença significativa para o teste de independência entre sexo e tipo de pupário (χ
2
ind
=
947,36).
Em
T. lactitarse, Buschini et al. (2006) também verificaram maior produção de
machos com pupários “ND” mas, diferente do resultado do presente estudo, os autores
verificaram que as fêmeas produziram mais o pupário “ND” (machos – não dilatado:dilatado
= 82:56; fêmeas – não dilatado:dilatado = 114:49). Não foi observada diferença significativa
para o teste de independência entre sexo e tipo de pupário para os dados de Buschini
et al.
(2006) (χ
2
ind
= 3,64).
Com relação à distribuição do traço dentro de cada ninho, foram verificados
ninhos que apresentavam os dois tipos de pupário; no entanto, a razão de pupários do tipo
“ND” em uma progênie mostrou-se dependente do diâmetro do ninho-armadilha (efeito
confirmado por regressão linear da razão de pupários “ND” sobre o diâmetro do tubo). Além
disso, observou-se um padrão intranidal que relaciona tipo de pupário e sexo do indivíduo.
Estudos envolvendo ninhos-armadilha em
Trypoxylon têm mostrado que
muitos fatores podem influenciar aspectos da biologia de nidificação destas espécies, como a
sazonalidade, a abundância de presas e o diâmetro da cavidade de nidificação. Em
Trypoxylon, havendo predomínio ou exclusividade de diâmetros reduzidos para nidificação
são produzidos mais machos (Krombein 1967; Coville e Coville 1980). Molumby (1997) e
Peruquetti e Del Lama (2003a) verificaram que o diâmetro do ninho-armadilha influenciou na
razão sexual intranidal em espécies de
Trypoxylon, observando um padrão em que fêmeas são
produzidas preferencialmente em ninhos de maior diâmetro. Este resultado também foi
encontrado para
T. rogenhoferi e T. lactitarse do presente estudo (dados apresentados no
capítulo 4 desta dissertação).
Se esta informação for aqui considerada, a relação existente entre tipo de
pupário, sexo e diâmetro do tubo torna-se uma questão redundante: i) o χ
2
ind
entre sexo e tipo
de pupário é significativo pois pupários de tipo “ND” e machos são mais freqüentes em
cavidades de menor diâmetro? ou ii) pelo fato de sexo e tipo de pupário serem relacionados
entre si, os pupários do tipo “ND” são mais freqüentemente encontrados em tubos de menor
diâmetro, onde há predominância de machos?
Além disso, a construção dos dois tipos de pupário leva também à pergunta:
este comportamento tem alguma base genética? Duas observações sustentam esta hipótese: i)
o agrupamento filogenético proposto por Matthews e Matthews (1968), o qual demonstra que
o caráter parece ser monofilético, apresentando-se apenas no grupo nitidum e tendo uma
65
provável origem no ancestral comum de punctulatum e fugax. O caráter “tipo de pupário” em
Trypoxylon seria uma homologia, portanto; ii) a segregação intranidal da característica nas
progênies. Ao analisar cada progênie (Tabela II), pode-se considerar que a característica “tipo
de pupário” seja determinada geneticamente de acordo com uma hipótese de herança
autossômica monogênica dominante, utilizando os genótipos:
I
A
I
A
– fêmeas homozigotas, com
fenótipo de pupário não dilatado;
I
A
I
B
– fêmeas heterozigotas, com fenótipo de pupário
dilatado;
I
B
I
B
– fêmeas homozigotas, com fenótipo de pupário dilatado; I
A
– macho
hemizigoto, com fenótipo de pupário não dilatado;
I
B
– macho hemizigoto, com fenótipo de
pupário dilatado.
Esta hipótese genética pode ser inferida pelo fato de que as fêmeas são
solitárias e os machos guardam os ninhos. Portanto, é esperado que haja apenas um macho e
uma fêmea fundando cada ninho (Coville 1982). Este comportamento de
monandria/monoginia foi confirmado por Peruquetti (2003) e pelos nossos dados (Capítulo 5)
para a maioria dos ninhos destas espécies. Considerando esta herança, foram determinados os
fenótipos dos parentais (Tabela III) a partir da prole. De acordo com o proposto, não são
esperadas famílias com machos exclusivamente “D” e fêmeas exclusivamente “ND”, o que
está de acordo com o observado (Tabela II).
Tabela III. Tipo de pupário de cada progênie e provável genótipo parental para a característica de pupários:
“ND”: pupário não dilatado o; “D”: pupário dilatado.
Sexo e tipo de pupário Genótipo parental
Machos Fêmeas
“ND” “D” “ND” “D”
Macho Fêmea
x I
A
I
A
x x I
A
I
B
x x I
A
I
A
I
A
x x I
B
I
A
I
A
x x x I
A
I
A
I
B
x x x I
A
I
A
I
B
x x x x I
A
I
A
I
B
x I
B
I
B
x x - -
x x I
A
/I
B
I
B
I
B
x x x I
A
I
A
I
B
x I
A
I
A
I
A
x x I
A
I
A
I
B
x I
A
/I
B
I
B
I
B
66
No presente trabalho, a técnica de utilização de ninhos-armadilha de diversos
diâmetros permitiu verificar que a expansão na porção anterior do pupário dilatado tem
diâmetro similar ao do tubo. A relação existente entre diâmetro do tubo e tipo de pupário e
razão sexual é uma característica interessante a ser explorada em novos estudos. No entanto,
uma possível hipótese de herança genética do tipo de pupário deve ser interpretada com
cautela, já que o diâmetro do tubo exerce influência na determinação da característica. Novos
estudos seriam necessários para verificar esta hipótese de herança monogênica dialélica com
penetrância incompleta, dependente do diâmetro do ninho.
67
4.4 Alocação sexual sazonal em espécies de Trypoxylon Latreille (Hymenoptera:
Crabronidae)
4.4.1 Introdução
As teorias de alocação ótima de recursos prevêem que os parentais devem
maximizar seu sucesso reprodutivo de acordo com o investimento dado à progênie. Uma vez
que o investimento parental é limitado, há uma relação entre a quantidade de recursos
fornecidos a cada prole e o número de indivíduos produzidos (Strohm e Lechner 2000).
Ainda, a teoria de Fisher sobre alocação sexual assume que, em populações panmíticas, o
investimento parental será igualmente distribuído entre a progênie feminina e masculina
(Fisher 1958).
Variações sazonais de alocação de recursos também surgem como estratégias
adaptativas de investimento para otimizar o sucesso reprodutivo em alguns animais (Vila e
Cassini 1994; Braby e Jones 1995; Mauck e Grubb 1995). Estas estratégias podem envolver
mudanças na razão sexual ou na determinação do número e do tamanho de corpo da prole
(Kim e Thorp 2001). Estes desvios são freqüentemente encontrados em himenópteros
solitários e atribuídos a fatores ecológicos que variam sazonalmente, como a disponibilidade
de recursos (Frohlich e Tepedino 1986; Tepedino e Torchio 1982; Torchio e Tepedino 1980;
Kim e Thorp 2001).
As fêmeas dos himenópteros podem determinar o sexo da prole a partir da
fertilização ou não de seus ovos, produzindo fêmeas e machos, respectivamente (Flanders
1965). Este sistema haplodiplóide de determinação do sexo permite que a fêmea ajuste o sexo
de sua progênie de acordo com o seu sucesso de aprovisionamento e, desta forma, possibilita
um aumento de seu próprio sucesso reprodutivo (Molumby 1997). A oviposição de ovos
fertilizados ou não, em resposta a condições ambientais, pode ser entendida como uma
estratégia condicional que afeta o sucesso reprodutivo da fêmea fundadora, e de sua progênie
(Charnov 1979; 1982; Trivers e Hare 1976).
Abelhas e vespas solitárias que aprovisionam suas células de cria de forma
massal disponibilizam de uma única vez todo o alimento necessário para o desenvolvimento
da larva. As fêmeas do gênero
Trypoxylon Latreille 1796 (Hymenoptera: Crabronidae)
aprovisionam seus ninhos com aranhas paralisadas da família Araneidae, principalmente. O
número e o peso da provisão em cada célula de aprovisionamento são considerados medidas
68
do investimento parental (Brockmann e Grafen 1992; Molumby 1997). Em algumas espécies,
foi observada correlação destas medidas com o tamanho de corpo do adulto, o qual está
relacionado ao sucesso reprodutivo do adulto (Molumby 1997; Peruquetti e Del Lama 2003a).
Desta forma, estes organismos são particularmente interessantes em estudos sobre alocação
sexual.
O objetivo deste trabalho foi investigar a alocação sexual de recursos,
verificando a influência sazonal no investimento sexual em quatro espécies de
Trypoxylon
coletadas durante três anos em Araras e dois anos em Rifaina (SP).
4.4.2 Material e Métodos
Espécies estudadas.
Trypoxylon (Trypargilum) rogenhoferi Kohl 1884,
Trypoxylon (Trypargilum) lactitarse Saussure 1867, Trypoxylon (Trypargilum) aurifrons
Shuckard 1837 e
Trypoxylon (Trypargilum) nitidum Smith 1856 são espécies de vespas
solitárias encontradas principalmente na América do Sul (Amarante 2002) que nidificam
durante todo o ano, principalmente entre novembro e março (Capítulo 1). As fêmeas destas
espécies apresentam cuidado maternal na forma de construção e aprovisionamento dos
ninhos, onde os imaturos se desenvolvem até o estágio adulto. Os membros do subgênero
Trypargilum freqüentemente utilizam cavidades preexistentes para nidificarem, dividindo-as
em séries lineares de células separadas por paredes de barro (Coville 1982). Os machos deste
subgênero apresentam comportamento de guarda, o que pode ser interpretado como uma
forma de cuidado parental, um traço raro entre os machos de Hymenoptera.
Área de estudo. Este estudo foi conduzido em duas áreas localizadas no estado
de São Paulo: o
campus da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) situado em Araras
(22º18'S, 47°22'O, 629 m) e a Fazenda Rio Branco, localizada em Rifaina (20º04'S, 47°25'O,
575 m). Estas áreas apresentam clima do tipo Cwa (classificação de Koeppen), caracterizado
por duas estações bem definidas: uma quente e chuvosa (Novembro - Março), com
precipitação elevada e temperatura média acima de 22ºC, e outra fria e seca (Abril-Outubro),
com baixa precipitação e temperatura média abaixo de 18ºC. Coletas mensais foram
realizadas em Araras entre Dezembro de 2003 e Março 2007, resultando em 30 coletas (17 na
estação quente-úmida e 13 na fria-seca). Em Rifaina, a periodicidade de amostragem alternou
entre mensal ou bimestral, sendo realizada durante Novembro de 2004 a Março de 2007,
totalizando 21 coletas (10 na estação quente-úmida e 11 na fria-seca).
69
Amostragem. As espécies foram amostradas por meio de ninhos-armadilha
feitos com bambus secos seccionados entre cada nó. Os bambus apresentavam vários
comprimentos (100 a 652 mm) e diâmetros internos (4,0 a 18,0 mm) e foram agrupados em 8
a 12 unidades de dimensões similares e distribuídos nas áreas de estudo.
Todos os ninhos-armadilha usados pelas vespas foram substituídos por novos e
transportados para o Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros (LGEH), onde
foram abertos. Quando os ninhos apresentavam indivíduos em fase de ovo ou larva, eram
fechados novamente até que estes atingissem o estágio de pupa. Os pupários foram colocados
individualmente em frascos de vidro, identificados com o número do ninho e com a posição
em que se encontravam no ninho e mantidos à temperatura ambiente até a emergência do
adulto, momento em que as espécies eram identificadas.
Dados coletados. Os comprimentos e diâmetros dos ninhos-armadilha
utilizados pelas espécies de
Trypoxylon foram tomados. Como a construção dos ninhos não
foi monitorada, cada progênie foi tratada como um dado independente. A fecundidade de cada
fêmea fundadora foi considerada como o número total de células produzidas em um ninho que
apresentasse parede de fechamento. A data de emergência, o sexo e o peso (precisão de ±1
mg) dos adultos foram anotados. Como estimativa do tamanho de corpo, além do peso, alguns
indivíduos tiveram quatro características da asa direita mensuradas (mm): comprimento da asa
anterior (CAA), largura da asa anterior (LAA), comprimento da asa posterior (CAP) e largura
da asa posterior (LAP) (Figura 1). As medidas dos caracteres foram tomadas sob lupa,
utilizando-se o sistema de captura de imagem Win TV 2000 e o programa computacional
LEICA IM 50. Cada medida foi realizada cinco vezes, sendo utilizada a média destas para
análises.
Análises estatísticas. As análises estatísticas foram conduzidas de acordo com
os procedimentos descritos por Zar (1999), usando o programa Statistica para Windows
(Release 7.0; Statsoft Inc., Tulsa, Oklahoma) e com nível de significância igual a 5%. Média
(
X
) Desvio/Erro Padrão (
±
) foram apresentados quando apropriado. Os dados foram
testados para normalidade usando teste Shapiro-Wilcoxon (teste
W) ou D´Agostino (d), para
amostras maiores que 50.
O dimorfismo sexual para tamanho de corpo foi expresso pela razão do valor
médio de cada característica nas fêmeas sobre o valor médio do traço nos machos. O
coeficiente de variação foi estimado para cada caráter estudado.
70
Análise de variância (ANOVA) foi utilizada para comparar: i) os valores de
diâmetro e comprimento dos ninhos das espécies de
Trypoxylon coletadas em diferentes
regiões e ii) comparar dados obtidos nas estações de coleta de diferentes anos. Cada ano de
coleta foi divido em duas estações (quente-úmida; fria-seca).
Correlação de Pearson (r) foi utilizada para verificar associação entre i) o
número de células e o comprimento do ninho e ii) as características de tamanho de corpo.
Correlação entre os valores médios de peso de cada sexo entre os indivíduos do mesmo ninho
foi estimada.
Teste
t foi utilizado para: i) comparar a fertilidade média das fêmeas nas duas
estações e ii) comparar os valores médios das características de tamanho de corpo entre
machos e fêmeas das espécies de
Trypoxylon e entre indivíduos produzidos nas duas estações
(quente-úmida e fria-seca) do ano.
A razão sexual foi determinada com base nos indivíduos que emergiram em
laboratório (razão sexual secundária) em cada uma das populações amostradas nas duas
estações de coleta de cada ano. Teste de
χ
2
foi utilizado para determinar a razão sexual
secundária esperada de 1:1. Ninhos com parede de fechamento e nos quais todos os
indivíduos emergiram foram utilizados para verificar, por regressão linear, o efeito do
diâmetro do tubo e do número de células por ninho sobre a razão sexual (em porcentagem de
machos arcoseno transformada).
O intervalo (em dias) de emergência entre machos e fêmeas de um mesmo
ninho foi estimado a partir da diferença entre a data de emergência do primeiro macho com a
da primeira fêmea. Desta forma, valores nulos representam emergência simultânea, valores
negativos, emergência anterior do macho e valores positivos, emergência anterior da fêmea.
A herdabilidade para peso foi estimada separadamente para machos e fêmeas
de cada espécie, provenientes de Araras e Rifaina, utilizando os coeficientes de correlação
intra-classe entre os indivíduos do mesmo ninho (Falconer 1989). Neste método, a
herdabilidade no sentido estrito,
h
2
, é estimada como t/r, onde t é a correlação intraclasse e r é
a média do parentesco entre os indivíduos. A correlação intraclasse foi calculada a partir da
ANOVA em ninhos (no mínimo, dois indivíduos do mesmo sexo por ninho) e o erro padrão
da herdabilidade foi calculado usando a fórmula de Oldroyd e Moran (1983).
71
4.4.3 Resultados
Abundância sazonal e Arquitetura Intranidal.
Foram amostrados 1.214
ninhos das quatro espécies de
Trypargilum (Tabela I). Estes ninhos foram coletados ao longo
de todo o ano, mas principalmente na estação quente-úmida, período em que também ocorreu
maior produção de células para a maioria das espécies (Tabela I).
As espécies de Trypoxylon utilizaram ninhos-armadilha de variadas dimensões
para nidificar (Tabela I). Não houve diferença significativa entre o comprimento e o diâmetro
dos tubos utilizados por
T. rogenhoferi coletados nas duas áreas (F
1
= 0,30 e F
1
= 1,69,
respectivamente, NS) nem para
T. aurifrons (F
1
= 0,61 e F
1
= 0,08, respectivamente, NS),
razão pela qual os dados foram agrupados. O número de células por ninho apresentou
distribuição normal nas quatro espécies. Considerando ninhos completos (presença de parede
de fechamento), foi verificada correlação entre o número de células e o comprimento do
ninho-armadilha em
T. rogenhoferi e T. lactitarse (Tabela I).
Dimorfismo sexual. Os caracteres de tamanho de corpo apresentaram
distribuição normal em machos e fêmeas das quatro espécies. Nessas espécies de
Trypoxylon,
dimorfismo sexual para tamanho de corpo foi evidenciado nas cinco características estudadas,
sendo o peso dos adultos ao emergir o traço em que as maiores diferenças foram observadas
(Tabela II). Para todas as características, as fêmeas foram significativamente maiores que os
machos (Tabela II), e apresentaram menor variação para estas características (Tabela III).
Nas quatro espécies, correlação significativa foi verificada entre os cinco
caracteres, sendo altos valores encontrados entre todas as medidas de asas de ambos os sexos
(Tabela IV). Apenas em machos de
T. lactitarse não foi verificada significância na correlação
entre LAP e peso.
Razão e Investimento Sexual. A razão sexual secundária total em Araras
diferiu significativamente da proporção 1:1 apenas em
T. nitidum, sendo 1,31 fêmea para 1
macho. Em Rifaina, em
T. rogenhoferi a proporção foi de 1 fêmea para 1,36 machos e em T.
aurifrons
, 1 fêmea para 1,38 machos, valores estatisticamente diferentes de 1:1 (Tabela V).
Considerando o peso ao emergir, o investimento relativo em fêmeas e machos
de
T. rogenhoferi, T. lactitarse, T. aurifrons e T. nitidum provenientes de Araras foi de 1,27:1;
1,29:1; 1,68:1 e 1,76:1, respectivamente, o que difere de 1:1. Em Rifaina, o investimento em
machos de
T. rogenhoferi foi de 51% e 42% em T. aurifrons (ou 1:1,04 e 1,39:1,
respectivamente, o que difere de 1:1) (Tabela VI).
72
Para as quatro espécies verificou-se uma tendência de que em ninhos-
armadilha de menor diâmetro foi produzido maior número de machos (Figura 2). Entretanto, o
efeito do diâmetro da cavidade sobre a razão sexual não foi confirmado por regressão linear
nos ninhos de
T. rogenhoferi e T. aurifrons em que todos os indivíduos emergiram (Figuras
3a e 3c).
Considerando ninhos completos, progênie composta exclusivamente de macho
foi encontrada em nove ninhos de
T. rogenhoferi, cinco de T. aurifrons e dois ninhos de T.
nitidum
. Observou-se ainda que a razão sexual está relacionada significativamente com o
número de células do ninho (Figuras 3b e 3d).
Fecundidade e alocação sazonal de recursos. Em Araras, a fecundidade
média das fêmeas de cada espécie de
Trypoxylon provenientes das duas estações não foi
significativamente diferente nos diferentes anos (ANOVA; P > 0,05). Para as espécies
provenientes de Rifaina, os dados indicam que as fêmeas da estação fria-seca foram mais
produtivas que as da estação quente-úmida (Tabela VI).
Considerando a razão sexual secundária de cada espécie e as diferentes épocas
de coleta em cada localidade, em poucas situações foi verificado desvio significativo da
proporção 1:1 (Tabela V). Em Araras, estes desvios foram principalmente encontrados em
T.
lactitarse
, com um viés para a produção de fêmea, enquanto que em Rifaina, maior produção
de machos de
T. rogenhoferi foi registrada em apenas duas estações (Tabela V).
Durante todo o período de amostragem, as fêmeas das espécies de
Trypoxylon
foram significativamente maiores que os machos e o peso de machos e fêmeas ao longo das
estações apresentou um padrão similar de variação (Figura 4). De maneira geral, os indivíduos
produzidos na estação quente-úmida foram significativamente maiores que os produzidos na
estação fria-seca (Tabela V). Entretanto, os adultos de
T. rogenhoferi coletados na estação
fria-seca de Rifaina foram significativamente maiores que os produzidos na estação quente-
úmida (Tabela V).
Seqüência de oviposição e Intervalo de emergência. Considerando todos os
indivíduos das quatro espécies de
Trypoxylon emergidos nas duas localidades, foi verificado
que há uma tendência em se produzir machos nas primeiras células de cria (a partir de ninhos
em que era conhecida a ordem de construção) (Tabela VIII).
Nas quatro espécies de
Trypoxylon foi verificado que na maioria dos ninhos, o
primeiro macho e a primeira fêmea emergiram no mesmo dia (Figura 5). Desvios de um a três
dias foram observados, tanto para a emergência posterior de machos, quanto de fêmeas. Os
73
maiores valores foram encontrados em poucos ninhos da estação fria-seca, sendo de -27 a 114
dias em
T. rogenhoferi, de -94 a 158 em T. lactitarse, de -18 a 21 dias em T. aurifrons e de -
18 a 18 dias em
T. nitidum.
Estes resultados indicam que ocorre uma diminuição do ritmo de
desenvolvimento em poucos indivíduos de
T. rogenhoferi e em T. lactitarse, dado o intervalo
entre a emergência de indivíduos do mesmo ninho (maior que 30 dias), enquanto que em
T.
aurifrons
e T. nitidum, o período inferior a 30 dias pode ser justificado pelo tempo gasto na
construção do ninho.
Herdabilidade e Seleção para tamanho de corpo. Correlações significativas
entre o peso médio de machos e fêmeas do mesmo ninho foram encontradas para todas as
espécies (Figura 6). Os valores de herdabilidade estimados para as fêmeas das espécies de
Trypoxylon foram menores que os estimados para machos, exceto para T. aurifrons
proveniente de Rifaina (Tabela VIII).
A partir de ninhos completos, provenientes das duas localidades e das
diferentes épocas de coleta, foi verificado que indivíduos que emergiram em ninhos com
maior número de células apresentaram maior peso médio, independente de sexo (Tabela IX).
Esta diferença foi significativa em machos e fêmeas de
T. rogenhoferi e fêmeas de T.
aurifrons
e T. nitidum (Tabela IX).
4.4.4 Discussão
Estimativas de tamanho de corpo e Dimorfismo sexual.
No presente estudo,
cinco caracteres foram utilizados para estimar o tamanho de corpo, dentre eles, peso e
caracteres lineares (medidas de asa). De acordo com Coville e Griswold (1983), o
comprimento da asa anterior é um bom indicador da quantidade de alimento recebida pelo
imaturo. Como esta medida demonstrou estar significativamente correlacionada com o peso
do adulto das quatro espécies estudadas, foi utilizada como único parâmetro nas análises de
investimento parental.
Muitas espécies de aculeados constróem ninhos e as fêmeas aprovisionam o
alimento para a progênie de forma massal. Em razão de que o tamanho do corpo do adulto é
dependente da quantidade de recursos alocada para a cria (Klostermeyer
et al. 1973; Freeman
1981; Johnson 1988; Bosch e Vicens 2005; Peruquetti e Del Lama 2003a) e que há baixa
herdabilidade para características de tamanho de corpo (Tepedino
et al. 1984), o peso do
74
adulto (total ou seco) e caracteres lineares de tamanho de corpo (comprimento e largura de
asa, tórax e tíbia) são amplamente utilizados em estudos de investimento parental como
preditores dos custos envolvidos na produção da progênie (Bosch e Vicens 2005; Danforth
1990).
No entanto, o uso dos valores de peso é questionável, uma vez que machos e
fêmeas de himenópteros apresentam taxas de conversão metabólica diferentes (Boosma e
Isaaks 1985; Trivers e Hare 1976). Danforth (1990) sugere que outras medidas, como o tempo
de forrageamento, sejam também utilizadas; caso contrário, o investimento sexual em fêmeas
pode ser superestimado (Danforth 1990; Bosh e Vicens 2005; Brockmann e Grafen 1992;
Strohm e Linsenmair 2000). Brockmann e Grafen (1992) verificaram que em
Trypoxylon
politum
o melhor estimador de alocação parental foi o peso total de provisão. Porém, a
dificuldade de se obter estas informações em
Trypoxylon faz com que a maioria dos estudos
utilize principalmente o peso como medida de tamanho de corpo (Buschini 2007; Buschini
et
al.
2006; Buschini e Wolff 2006; Peruquetti e Del Lama 2003a), ou outros caracteres
acessíveis. Em
T. rogenhoferi, por exemplo, o caráter utilizado foi o comprimento de asa
anterior por Peruquetti e Del Lama (2003a).
Ao estimar o custo da produção de cada sexo pelas espécies de
Trypoxylon
aqui estudadas, machos foram significativamente menores que fêmeas. Este dimorfismo foi
verificado para as cinco características e apresentou valores significativos para todas as
espécies. Dimorfismo sexual é comum entre os himenópteros solitários, sendo que, na maioria
dos casos, a fêmea é o sexo de maior tamanho (Stubblefield e Seger 1994). Como já
observado entre as espécies de
Trypoxylon, mais recursos são dirigidos para a produção das
fêmeas (Brockmann 1992; Garcia e Adis 1995; Molumby 1997; Camillo e Brescovit 1999;
Peruquetti e Del Lama 2003a; Buschini e Wolff 2006). Este resultado pode significar um
investimento adaptativo por parte da fêmea fundadora (Molumby 1997).
Investimento sexual em Trypoxylon. Em populações panmíticas, a seleção
natural faz com que os parentais invistam igualmente em ambos os sexos, conduzindo a uma
razão sexual uniforme (Trivers e Willard 1973). Uma situação que favorece desvios nesta
razão é a presença de dimorfismo sexual para tamanho de corpo. Neste caso, a teoria de
Fisher (1958) sobre alocação sexual prediz que o investimento parental estará distribuído
igualmente entre a progênie masculina e feminina. Mais recursos serão investidos no sexo de
maior tamanho, mas haverá maior produção do sexo menos custoso. Assim, embora a razão
75
sexual numérica seja enviesada, a razão sexual de investimento (Visscher e Danforth 1993)
será a mesma.
A razão sexual em espécies de
Trypoxylon é variável espacial e temporalmente
(Buschini 2007; Coville e colville 1980; Camillo
et al 1993,1994; Garcia e Adis 1995;
Peruquetti e Del Lama 2003a), resultado também observado neste estudo. Variações sazonais
de oferta de recursos para forrageamento podem causar desvios na razão sexual de muitos
himenópteros, sendo que os machos (sexo menos custoso) são produzidos preferencialmente
quando o sucesso de forrageamento é baixo (Brockmann e Grafen 1992; Charnov 1982;
Strohm e Linsenmair 1997; West e Sheldon 2002). Além das flutuações sazonais, outros
fatores podem contribuir para os desvios da razão sexual 1:1 nos himenópteros. Em espécies
de
Trypoxylon, alguns autores sustentam que características dos ninhos-armadilha apresentam
grande influência sobre a razão sexual. Krombein (1967), Coville e Coville (1980), Oku e
Nishida (1999), Peruquetti e Del Lama (2003a) e Buschini (2007) observaram maior produção
de machos em cavidades de diâmetro reduzido. Neste estudo, maior número de machos foi
observado em tubos de menor diâmetro, mas este efeito do diâmetro da cavidade sobre a
razão sexual secundária não foi confirmada por regressão linear.
Características da história-de-vida também podem influenciar a razão sexual,
como a taxa diferencial de mortalidade entre os sexos. Além disso, o fato da distribuição dos
sexos não ser randômica para a maioria das espécies de
Trypoxylon (Coville e Coville 1980;
Camillo
et al. 1993; Camillo et al. 1994), sendo as fêmeas produzidas nas últimas células,
pode causar desvios na razão sexual, uma vez que o parasitismo por Chrysididae,
Ichneumonidae e Sarcophagidae é principalmente encontrado nestas células (Camillo
et al.
1993). A pressão de parasitas também pode afetar a qualidade da prole: baixa pressão permite
que as células de cria permaneçam mais tempo abertas e possam ser melhor aprovisionadas
pelas fêmeas (Brockmann 1992). Neste trabalho foi considerada a razão sexual secundária, ou
seja, a partir de indivíduos emergidos e diferenças poderiam surgir se considerada a razão
sexual primária. Entretanto, o principal parasitóide destas espécies de
Trypoxylon foi
Melittobia e, na sua presença, a maior parte das células de um ninho era comprometida
(Capítulo 1). Parasitismo por vespas e moscas parasitóides, que podem gerar algum desvio da
razão sexual, foi baixo (Capítulo 1), indicando que a razão sexual pode não ter sido
influenciada por este fator.
Em Araras, o investimento em fêmeas (considerando peso ao emergir) das
quatro espécies de
Trypoxylon foi maior que nos machos e não foi observado viés da razão
76
sexual para o sexo menos custoso. Desta forma, a razão sexual de investimento não foi
igualitária. Desvios deste tipo podem ser atribuídos a: i) competição local por acasalamento
(Hamilton 1967; Cowan 1991), ii) endogamia (Herre 1987), iii) sobreposição de geração
(Werren e Charnov 1978; Seger 1983; Brockmann e Grafen 1992) e, iv) aumento local de
recurso (Schwarz 1988; Martins
et al. 1999).
Em
Trypoxylon malaisei, o maior investimento na produção de fêmeas foi
explicado pela primeira hipótese alternativa: competição local por acasalamento (Oku e
Nishida 1999). Os autores observaram que tanto a razão sexual primária quanto a secundária
foi enviesada para fêmeas. Pelo fato de que na maioria dos ninhos os machos são produzidos
nas últimas células e emergem mais cedo que as fêmeas, acasalamento entre irmãos é
facilitado: machos já estarão presentes na população quando as fêmeas emergirem,
possibilitando a elas acasalarem-se com seus próprios irmãos, principalmente se estes
estiverem próximos ao ninho natal. Nesta situação, a fêmea fundadora diminui a competição
entre seus filhos, aumentando o número de filhas (Taylor 1981). No entanto, esta alternativa
não se aplica aos resultados encontrados neste estudo, uma vez que não há indícios de
endogamia acentuada.
Em
T. politum e outras espécies de vespas, a razão sexual enviesada para
fêmeas foi explicada pelo modelo de sobreposição de gerações (Werren e Charnov 1978;
Seger 1983; Brockmann e Grafen 1992). Neste modelo, espécies parcialmente bivoltinas
apresentam machos que sobrevivem a uma geração e copulam com as fêmeas da próxima
geração. Dessa maneira, a primeira geração deve ser enviesada para machos e a segunda, deve
ser 1:1 ou enviesada para fêmeas. Esta teoria é aplicada para espécies bivoltinas e não tem
sido postulada para espécies tropicais e multivoltinas (Buschini 2007). Este modelo, portanto,
não pode ser aplicado aos dados do presente estudo. Neste trabalho, foi verificada em
T.
rogenhoferi
e em T. lactitarse provável diapausa na estação fria-seca e, portanto, os
indivíduos produzidos em uma geração sobreviveram até a próxima. No entanto, esta pausa
no desenvolvimento foi observada para uma pequena fração da população de ambos os sexos,
não tendo influência na razão sexual temporal.
Peruquetti (2003) sugeriu que em
T. rogenhoferi a hipótese sobre o aumento
local de recursos pode ser uma explicação possível para o viés observado na produção de
fêmeas. O fato de oferecer ninhos de diâmetros variados possibilitou que a fêmea fundadora
escolhesse o diâmetro adequado de acordo com a oferta: em situações de farta disponibilidade
de aranhas, uma maior produção de fêmeas seria encontrada. O aumento local de recurso tem
77
sido uma importante alternativa para explicar a alocação sexual enviesada para fêmeas em
algumas espécies de abelhas (Martins
et al. 1999; Schwarz 1988; Stark 1992). Desta forma,
esta hipótese também poderia ser uma explicação alternativa para os desvios de investimento
sexual nas espécies de
Trypoxylon provenientes de Araras.
Diferentemente, em Rifaina a razão sexual foi desviada para a produção de
machos. Em
T. aurifrons este desvio “compensou” o investimento maior em fêmeas, sendo
que para esta espécie a razão sexual de investimento está de acordo com o esperado por Fisher
(1958). Entretanto, a razão de investimento em
T. rogenhoferi foi maior em machos. Este
resultado pode ser explicado por i) fêmeas não acasaladas e ii) competição local por recurso
(Clark 1978; Visscher e Danforth 1993). Aparentemente, i) não se aplica a esta população, já
que o número de ninhos com prole exclusiva de machos foi baixo. Desta forma, a hipótese de
competição local por recursos (Clark 1978; Visscher e Danforth 1993) pode ser uma
explicação plausível. Este modelo prediz que machos, sendo o sexo menos custoso, são
produzidos preferencialmente quando o sucesso de forrageamento é baixo (Brockmann e
Grafen 1992; Charnov 1982).
Fecundidade e Alocação sazonal. Em himenópteros solitários, a fêmea
investe grande parte de sua energia na reprodução em atividades como a obtenção de
alimento, construção de ninho e síntese das reservas nutritivas do ovo, a fim de aumentar o
valor reprodutivo da progênie. Custos para adquirir estes recursos podem variar sazonalmente
com a mudança de ambiente e, assim, afetar a taxa de aprovisionamento destes insetos (Parker
e Frohlich 1985). Como conseqüência, o tamanho de corpo da prole pode variar em resposta a
variações sazonais de fatores ecológicos.
Maior produção de ninhos e células na estação quente-úmida foi relatada em
espécies de
Trypoxylon neotropicais, como Trypoxylon lactitarse (Camillo et al. 1993;
Camillo e Brescovit 1999; Buschini
et al. 2006), T. rogenhoferi (Camillo et al. 1994; Garcia e
Adis 1995),
Trypoxylon aestivale (Camillo 1999), Trypoxylon antropovi (Camillo 1999),
Trypoxylon opacum (Buschini e Wolff 2006) e T. aurifrons (Santoni e Del Lama 2007). O
presente estudo verificou igualmente que as espécies de
Trypoxylon estão presentes durante
todo o ano; no entanto, apresentam maior atividade entre novembro e março.
Para as espécies coletadas em Araras, houve uma maior atividade de
nidificação na estação quente-úmida. As fêmeas fundadoras apresentaram fecundidades
semelhantes nas duas estações e mantiveram a mesma razão sexual ao longo do período. A
estratégia de produção sazonal adotada por estas fêmeas foi produzir progênie de menor
78
tamanho na estação fria-seca, quando os recursos de aprovisionamento são escassos e,
indivíduos maiores na estação quente-úmida, na qual os recursos são abundantes. Além disso,
em todas as estações, fêmeas foram significativamente maiores que os machos.
Em Rifaina, as duas espécies coletadas apresentaram maior fecundidade na
estação fria-seca. Em
T. aurifrons, progênie feminina maior foi encontrada na estação quente-
úmida, mas em
T. rogenhoferi resultado oposto foi registrado. Para T. rogenhoferi, o padrão
sazonal de investimento pode ser interpretado como uma correlação positiva entre o tamanho
da fêmea e a taxa de aprovisionamento na estação fria-seca: fêmeas maiores estariam
produzindo progênie de maior número e de maior tamanho. No entanto, vale ressaltar que
Rifaina teve uma amostragem maior na estação fria-seca e esta diferença pode causar algum
desvio nos resultados, gerando interpretações equivocadas.
Alguns modelos explicam a variação no padrão de investimento sazonal em
que não são esperados desvios na razão sexual, mas a produção de um menor número de
indivíduos de menor tamanho é requerida. Rosenheim
et al. (1996) apontam que na estação
menos favorável, quando o recurso é escasso, as fêmeas investem em uma progênie de menor
tamanho. No entanto, é o custo relativo dos sexos que determina o investimento ótimo e não o
custo absoluto, ou seja, se fêmeas são duas vezes maiores que machos, e então necessitam do
dobro da quantidade de aprovisionamento, os custos relativos de ambos os sexos não irão
mudar devido à diminuição de recursos. Neste modelo, não importa a disponibilidade de
provisão; se o sucesso reprodutivo é maior quando há produção de filhas, mesmo que elas
necessitem duas vezes mais investimento, a fêmea fundadora alocará mais recursos neste sexo
para garantir sua vantagem adaptativa. Esta hipótese foi aplicada para explicar os resultados
obtidos em abelhas escavadoras do gênero
Amegilla (Alcock 1996; Alcock et al. 2005) e pode
ser aplicada aos resultados deste estudo para as espécies de
Trypoxylon.
Seleção para tamanho de corpo. Em trabalhos com espécies de Trypoxylon é
verificado que fêmeas são maiores que os machos (Brockmann 1992; Buschini 2007;
Buschini
et al. 2006; Garcia e Adis 1995; Molumby 1997; Camillo 1999; Camillo e Brescovit
1999; Peruquetti e Del Lama 2003a). Molumby (1997) sugere que este dimorfismo é um traço
adaptativo: fêmeas maiores têm maior vantagem adaptativa, pois coletam maior massa de
aranhas por dia, caçam aranhas maiores e aprovisionam seus ninhos mais rapidamente. Do
ponto de vista da seleção para tamanho de corpo, fêmeas que recebem maior provisão
enquanto larvas seriam selecionadas favoravelmente em relação às que receberam menos
provisão (Peruquetti e Del Lama 2003a).
79
No presente estudo, seleção para tamanho de corpo em fêmeas das espécies de
Trypoxylon foi evidenciada pelos menores valores dos coeficientes de variação das
características métricas consideradas. Além disso, foi verificado que fêmeas maiores
produzem uma progênie mais numerosa e de maior tamanho de corpo, confirmando a hipótese
proposta por Molumby (1997).
A associação entre valor adaptativo e tamanho de corpo foi detectada em
espécies de vespas e abelhas com aprovisionamento massal (Alcock 1979; Cowan 1991;
Strohm e Lisenmair 1997, 2000; Peruquetti e Del Lama 2003a). Nestes trabalhos, os autores
verificaram taxas diferenciadas de forrageamento, caça, aprovisionamento e construção de
células de cria. Ainda, Molumby (1997) sugere que características de tamanho do corpo
sejam, mesmo que parcialmente, maternalmente herdadas.
Em himenópteros, a base genética de características quantitativas já foi
extensivamente estudada em
Apis mellifera; no entanto, poucos são os trabalhos que tratam de
traços genéticos em outras espécies. Tepedino
et al. (1984) encontraram baixa herdabilidade
para tamanho de corpo (medido por peso) em
Osmia lignaria propinqua, estimada por
correlação intra-classe. Owen e McCorquodale (1994) verificaram valores de herdabilidade
em
Megachile rotundata estimada por correlação intra-classe menores que as estimadas por
regressão linear.
Apesar dos valores de herdabilidade obtidos por correlação intra-classe
superestimarem o efeito materno comum, foi verificado neste trabalho que os indivíduos de
um ninho são mais similares entre si do que com indivíduos de ninhos diferentes. Estes
resultados, associados à alta correlação entre machos e fêmeas de um mesmo ninho indicam
que características de tamanho de corpo apresentam componentes genéticos em sua
determinação. Em fêmeas, foram encontrados valores de herdabilidade menores que em
machos, sugerindo maior pressão de seleção neste sexo (Falconer 1989). No entanto, os altos
valores de herdabilidade em machos sugerem igualmente que estes também se beneficiam do
maior tamanho de corpo.
Em machos, não foi detectada evidência de seleção para tamanho de corpo nos
estudos já realizados (Molumby 1997; Peruquetti e Del Lama 2003a). Estes autores sugerem
que estes resultados podem não ser consistentes, já que em outras espécies de himenópteros,
machos maiores apresentaram maiores valores adaptativos (Alcock 1991; Strohm e Lechner
2000). Molumby (1997) sugere que o maior tamanho de corpo dos machos de
Trypargilum
poderia facilitar a guarda do ninho: o macho “ajudaria” a sua parceira a aprovisionar melhor
80
as células de cria, espantaria melhor seus opositores e inimigos naturais. Dessa forma,
garantiria que prole feminina fosse produzida, beneficiando-se, portanto.
Neste estudo, foi confirmado que fêmeas das espécies de
Trypoxylon são
significativamente maiores que machos, sendo que um maior investimento de recursos é
destinado a este sexo. Como proposto por Molumby (1997), significa um investimento
adaptativo por parte da fêmea fundadora e este resultado foi evidenciado pela observação de
que qualidade e quantidade da prole mostraram-se associadas. A alocação sazonal de
investimento nestas espécies parece estar relacionada com um aumento local de recursos, de
acordo com a teoria de Schwarz (1988). Novos estudos são necessários para confirmar os
padrões de alocação sexual e o significado do dimorfismo sexual nestas e em outras espécies
relacionadas.
81
Tabela I. Abundância sazonal e arquitetura de ninhos de espécies de Trypoxylon coletadas por ninhos-armadilha
em duas áreas do estado de São Paulo. Os valores de correlação (r) entre o número de células por ninho e o
comprimento são apresentados. A: amplitude de variação; QU: estação quente-úmida; FS: fria-seca.
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Número de ninhos (número de
células) – Araras – QU
123
(823)
96
(657)
101
(515)
121
(683)
Número de ninhos (número de
células) – Araras – FS
86
(662)
31
(254)
17
(89)
19
(121)
Número de ninhos (número de
células) – Rifaina – QU
246
(1498)
84
(398)
Número de ninhos (número de
células) – Rifaina – FS
249
(1650)
41
(262)
Comprimento dos ninhos (cm)
A: 1,05-61,5
28,0±0,4
A: 8,6-44,0
21,3±0,4
A: 11,7-46,7
25,1±0,5
A: 5,1-19,2
24,1±0,5
Diâmetro dos ninhos (mm)
A: 5,1-19,2
9,0±0,1
A: 4,5-17,5
9,2±0,2
A: 3,1-16,6
6,7±0,1
A: 3,5-11,4
6,5±0,2
Número de células por ninho
(ninhos completos)
7±3.0
(n = 475)
8±2.0
(n = 84)
5±2.0
(n = 197)
6±2.0
(n = 109)
r (Pearson) 0.34* 0.33* 0.02 0.01
* P < 0.05
82
Tabela II. Média ± erro padrão e dimorfismo sexual (DS) (dimorfismo sexual para tamanho de corpo foi expresso pela razão do valor médio de cada
característica nas fêmeas sobre o valor médio do traço nos machos) de cinco caracteres morfológicos de machos e fêmeas de Trypoxylon. CAA – comprimento da asa anterior,
LAA – largura da asa anterior, CAP – comprimento da asa posterior e LAP – largura da asa posterior. Valores de teste t comparando as características de machos e fêmeas são
apresentados (n = número de observações)
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Característica
Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos
Peso (mg)
(n)
78,44±0,52
(1066)
67,73±0,45
(1213)
72,75±0,78
(207)
55,56±0,74
(210)
32,74±0,45
(274)
25,93±0,54
(248)
26,95±0,46
(226)
21,08±0,43
(168)
DS 1,16 1,31 1,26 1,28
CAA (mm)
(n)
10,27±0,15
(77)
7,76±0,08
(23)
10,64±0,06
(37)
9,85±0,05
(43)
7,74±0,05
(108)
7,24±0,04
(82)
7,40±0,04
(90)
6,64±0,04
(76)
DS 1,32 1,08 1,07 1,11
LAA (mm) 3,33±0,02
3,22±0,05
3,13±0,02
2,97±0,01
2,31±0,01
2,16±0,01
2,15±0,01
1,96±0,01
DS 1,03 1,05 1,07 1,10
CAP (mm) 8,21±0,06 7,81±0,12 8,18±0,05
7,48±0,04
5,89±0,04
5,48±0,03
5,63±0,03
5,00±0,04
DS 1,05 1,09 1,07 1,12
LAP (mm) 2,37±0,02* 2,33±0,03* 2,24±0,01
2,18±0,01
1,71±0,01
1,65±0,01
1,60±0,01
1,51±0,01
DS 1,02 1,03 1,04 1,06
*P > 0,05
83
Tabela III. Coeficiente de variação de cinco caracteres medidos em machos e fêmeas de espécies de
Trypoyxlon: peso, comprimento da asa anterior (CAA), largura da asa anterior (LAA), comprimento da asa
posterior (CAP) e largura da asa posterior (LAP).
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Traço
Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos
Peso (mg) 21,85 22,92 15,44 21,53 23,92 32,16 25,71 26,27
CAA (mm) 6,16 7,13 5,35 5,42 5,63 6,88 4,58 7,03
LAA (mm) 6,31 6,84 4,82 4,83 5,45 6,27 4,68 6,12
CAP (mm) 6,32 7,33 6,00 5,65 5,63 7,17 4,84 7,57
LAP (mm) 6,26 6,29 4,26 4,42 6,15 6,19 4,91 5,94
Tabela IV. Correlação de Pearson entre os cinco caracteres analisados: Peso (mg), CAA (mm) – comprimento
da asa anterior, LAA (mm) – largura da asa anterior, CAP (mm) – comprimento da asa posterior e LAP (mm) –
largura da asa posterior em quatro espécies de Trypoxylon.
Fêmeas Machos
T. rogenhoferi
Peso CAA LAA CAP Peso CAA LAA CAP
CAA 0,81 0,76
LAA 0,75 0,95 0,79 0,97
CAP 0,82 0,99 0,93 0,76 0,99 0,98
LAP 0,74 0,92 0,93 0,90 0,83 0,93 0,93 0,92
T. lactitarse
CAA 0,69 0,48
LAA 0,68 0,91 0,33 0,83
CAP 0,66 0,99 0,91 0,44 0,97 0,85
LAP 0,65 0,85 0,91 0,83 0,27* 0,72 0,86 0,77
T. aurifrons
CAA 0,62 0,70
LAA 0,59 0,97 0,60 0,91
CAP 0,62 0,98 0,90 0,68 0,98 0,90
LAP 0,56 0,87 0,88 0,85 0,67 0,87 0,88 0,85
T. nitidum
CAA 0,52 0,75
LAA 0,49 0,92 0,74 0,96
CAP 0,54 0,98 0,92 0,75 0,99 0,92
LAP 0,43 0,85 0,89 0,83 0,72 0,93 0,96 0,93
*P > 0,05
84
Tabela V. Razão sexual (fêmeas : machos) em espécies de Trypoxylon coletadas em duas áreas do estado de São Paulo em diferentes épocas de coleta. Os valores de χ
2
1
comparando a razão sexual observada (obs.) com a esperada de 1:1 são apresentados.
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Área Estação Ano
Obs. χ
2
1
Obs. χ
2
1
Obs. χ
2
1
Obs. χ
2
1
Araras Quente-úmida 2003-2004 101:127 2,97 57:60 0,08 44:38 0,44 141:100 6,96*
2004-2005 69:72 0,06 65:66 0,12 48:48 0,00 89:86 0,05
2005-2006 45:45 0,00 31:38 0,71 31:10 10,76* 8:3 0,29
2006-2007 210:214 0,04 32:16 5,33* 4:4 0,00
Fria-seca 2004 127:79 11,18* 29:12 7,05* 13:10 0,39 34:19 4,25
2005 69:72 0,06 65:66 0,12 48:48 0,00 89:86 0,05
2006 9:10 0,05 5:2 1,29 3:2 0,20 6:0 -
626:624 0,00 249:249 0,00
150:117 4,08 284:216 9,25*
Rifaina Quente-úmida 2004-2005 227:329 18,71*
64:83 2,47
2005-2006 13:7 1,80
2006-2007 109:214 0,06
28:39 1,81
2005 196:212 0,63
15:25 0,81
2006 209:263 6,18*
13:18 1,16
754:1025 41,28*
120:165 7,11*
* P < 0,05
85
Tabela VI. Média ± erro padrão da fecundidade das fêmeas fundadoras (número de células por ninho) e pesos
(mg) de machos e fêmeas de quatro espécies de Trypoxylon emergidos em laboratório. As espécies foram
coletadas em duas áreas do estado de São Paulo em duas estações: (QU: quente-úmida; FS: fria-seca). Teste t
comparando as características de indivíduos produzidos nas estações.
Araras Rifaina
Espécie/Estação Fecundidade Fêmea (mg) Macho (mg) Fecundidade Fêmea (mg) Macho (mg)
T. rogenhoferi
7,9±0,26 83,63±0,95 74,52±0,88 7,1±0,16 75,97±0,60 64,96±0,49
QU
7,3±0,3
(n = 88)
82,46±1,33
(n = 425)
75,11±1,22
(n = 458)
6,6±0,2
(n = 173)
71,87±0,81
(n = 349)
62,15±0,68
(n = 550)
FS
8,8±0,4
(n = 55)
83,97±1,44
(n = 201)
73,56±1,21
(n = 166)
7,8±0,2
(n = 159)
80,38±0,89
(n = 405)
67,77±0,70
(n = 475)
t 2,83 0,78 0,87 3,64* 7,08* 5,71*
T. lactitarse
7,8±0,22 72,75±0,78 55,56±0,54
QU
7,7±0,2
(n = 64)
74,11±0,93
(n = 185)
56,80±0,90
(n = 180)
FS
8,3±0,5
(n = 20)
68,90±1,61
(n = 64)
51,92±1,90
(n = 69)
t 1,12 2,88* 2,87*
T. aurifrons
5,6±0,24 31,73±0,58 23,50±0,56 5,4±0,26 33,64±0,65 27,78±0,80
QU
5,6±0,3
(n = 73)
32,70±0,55
(n = 127)
24,26±0,58
(n = 100)
4,8±0,3
(n = 75)
35,47±0,91
(n = 92)
23,93±0,60
(n = 122)
FS
5,4±0,5
(n = 15)
25,95±0,93
(n = 23)
19,71±0,90
(n = 17)
6,7±0,5
(n = 34)
32,10±1,52
(n = 28)
25,57±1,54
(n = 43)
t 0,34 4,33* 2,88* 3,70* 2,05* 0,27
T. nitidum
6,3±0,24 26,95±0,46 21,07±0,43
QU
6,2±0,3
(n = 94)
27,48±0,61
(n = 238)
21,47±0,57
(n = 189)
FS
7,0±0,6
(n = 15)
24,00±0,95
(n = 46)
18,33±0,87
(n = 27)
t 1,19 2,74* 2,48*
*P < 0,05.
86
Tabela VII. Número de machos e fêmeas emergidos de cada célula de ninhos-armadilha de quatro espécies de
Trypoxylon. As células são numeradas a partir da extremidade oposta à entrada do ninho.
Espécie Célula
T. rogenhoferi
1
ª
2
ª
3
ª
4
ª
5
ª
6
ª
7
ª
8
ª
9
ª
10
ª
11
ª
12
ª
13
ª
14
ª
15-17
ª
Macho 259 267 202 153 114 64 39 29 8 8 2 6 1
Fêmea 35 67 103 122 124 137 106 86 75 80 34 16 10 3 4
T. lactitarse
Macho 43 38 37 40 27 19 15 6 7 3 1 1
Fêmea 18 19 28 23 31 35 24 19 10 8 1 1 1
T. aurifrons
Macho 37 35 24 24 18 14 12 5 3 1
Fêmea 25 32 40 28 30 10 9 2 5 2 1 1
T. nitidum
Macho 14 3 2 3 6 2 1 1 4
Fêmea 2 9 9 9 6 3 2 1 2 1
Tabela VIII. Herdabilidade ± erro padrão para peso de machos e fêmeas de espécies de Trypoxylon.
Área
T. rogenhoferi T. lactitarse T. aurifrons T. nitidum
Araras
Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea
nº ninhos 97 85 54 48 32 42 42 52
Nº amostras 313 303 183 164 91 145 131 196
h
2
0,77±0,1 0,59±0,2 0,70±0,1 0,43±0,2 1,00±0,1 0,70±0,1 0,97±0,1 0,72±0,1
Rifaina
nº ninhos 229 142 37 30
Nº amostras 712 426 106 85
h
2
0,95±0,1 0,75±0,1 0,45±0,1 0,82±0,1
87
Tabela IX. Média ± erro padrão de pesos de machos e fêmeas de espécies de Trypoxylon emergidos em ninhos
com diferentes números de células. Os valores de F (ANOVA) são apresentados.
Peso (mg)
Espécie
Nº células por
ninho
Macho Fêmea
T. rogenhoferi
1-4 62,55±1,76 73,47±1,91
5-9 65,93±0,68 75,88±0,78
10-14 71,43±0,90 81,52±0,88
15-20 74,40±5,05 93,04±3,07
F 11,89* 16,19*
T. lactitarse
1-4 52,68±1,67 72,20±9,82
5-9 56,07±0,84 72,91±0,99
10-14 58,53±3,37 75,25±2,06
F 2,41 0,85
T. aurifrons
1-3 25,50±0,85 31,60±0,58
4-6 25,80±0,68 32,71±0,65
7-9 26,25±1,28 33,81±1,17
10-14 26,34±3,65 34,76±1,41
F 0,70 2,74*
T. nitidum
1-3 18,90±1,82 21,30±2,18
4-6 18,98±1,07 26,25±0,95
7-9 19,34±0,76 25,47±0,89
10-13 20,84±0,85 27,03±1,39
F 0,93 3,68*
* P < 0,05
88
Figura 1. Asas direitas anterior (a) e posterior (b) de Trypoxylon aurifrons destacando os caracteres estudados.
CAA: comprimento da asa anterior, LAA: largura da asa anterior, CAP: comprimento da asa posterior e LAP:
largura da asa posterior.
a)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
[4]-6
[6]-8
[8]-10
[10]-12
[12]-14
[14]-16
[16]-[18]
Diâmetro (mm)
b)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
[4]-6
[6]-8
[8]-10
[10]-12
[12]-14
[14]-16
[16]-[18]
Diâmetro (mm)
c)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
[3]-5
[5]-7
[7]-9
[9]-11
[11]-13
[13]-[15]
Diâmetro (mm)
d)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
[3]-5
[5]-7
[7]-9
[9]-11
[11]-[13]
Diâmetro (mm)
Figura 2. Proporção de machos e fêmeas de a) Trypoxylon rogenhoferi; b) Trypoxylon lactitarse; c) Trypoxylon
aurifrons; d) Trypoxylon nitidum em cada classe de diâmetro do ninho (mm).
CAA
a)
LAA
b)
CAP
LAP
89
y = -0.0226x + 0.8484
R
2
= 0.0177
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
567891011121314151617
Diâmetro (mm)
Arcosseno % Machos/Total
y = -0.0436x + 0.9645
R
2
= 0.1267
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516
Número de Células
Arcosseno % Machos/Total
y = -0.0389x + 0.9218
R
2
= 0.0238
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Diâmetro (mm)
Arcosseno % Machos/Total
y = -0.1256x + 1.3701
R
2
= 0.2881
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
12345678910111213
Número de Células
Arcosseno % Machos/Total
Figura 3. Regressão linear do diâmetro e do número de células dos ninhos-armadilha sobre o arcosseno da
porcentagem de machos de a) e b) Trypoxylon rogenhoferi (F = 1,87; gl = 105; P = 0,17; F = 15,09; GL = 105; P
= 0,00, respectivamente) e c) e d) Trypoxylon aurifrons (F = 0,93; gl = 39; P = 0,66; F = 15,38; GL = 22; P =
0,00, respectivamente).
c) d)
a) b)
90
a)
Trypoxylon rogenhoferi
78.27
75.01
69.62
73.39
72.92
59.86
75.20
82.63
84.00
81.12
85.10
84.47
76.25
79.38
Dez/03-Mar/04
Abr/04-Out/04
Nov/04-Mar/05
Abr/05-Out/05
Nov/05-Mar/06
Abr/06-Out/06
Nov/06-Mar/07
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Peso (mg)
M
a
c
h
o
s
F
ê
m
e
a
s
b)
Trypoxylon lactitarse
59.15
47.17
58.00
53.08
50.97
58.50
57.14
74.06
70.62
76.65
65.75
67.00
73.20
77.38
Dez/03-Mar/04
Abr/04-Out/04
Nov/04-Mar/05
Abr/05-Out/05
Nov/05-Mar/06
Abr/06-Out/06
Nov/06-Mar/07
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
Peso (mg)
Macho
Fêmea
6,87*
5,60*
8,68*
5,99*
6,43*
2,73*
7,08*
1,57
3,35*
3,77*
4,78*
8,74*
2,95*
2,31*
91
c)
Trypoxylon aurifrons
22.23
19.30
27.10
20.80
20.86
19.00 19.00
31.11
24.11
34.74
27.00
31.93
29.00
32.50
Dez/03-Mar/04
Abr/04-Out/04
Nov/04-Mar/05
Abr/05-Out/05
Nov/05-Mar/06
Abr/06-Out/06
Nov/06-Mar/07
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
Peso (mg)
Macho
Fêmea
d)
Trypoxylon nitidum
22.39
17.67
20.31
20 .00
20.67
28.01
23.77
26.58
26.33
30.75
23.00
Dez/03-Mar/04
Abr/04-Out/04
Nov/04-Mar/05
Abr/05-Out/05
Nov/05-Mar/06
Abr/06-Out/06
Nov/06-Mar/07
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Peso (mg)
Macho
Fêmea
6,14*
2,46*
5,95*
1,88*
6,72*
3,16*
6,55*
5,91*
5,71*
6,49*
2,66*
3,14*
92
e)
Trypoxylon rogenhoferi
61.36
70.71
45.67
65.70
63.43
69.96
82.88
58.00
78.20
73.99
Nov/04-Mar/05
Abr/05-Out/05
Nov/05-Mar/06
Abr/06-Out/06
Nov/06-Mar/07
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Peso (mg)
Macho
Fêmea
f)
Trypoxylon aurifrons
26.32
26.04
28.29
28.56
32.53
33.08
30.43
40.18
Nov/04-Mar/05
Abr/05-Out/05
Nov/05-Mar/06
Abr/06-Out/06
Nov/06-Mar/07
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
Peso (mg)
Macho
Fêmea
Figura 4. Variação sazonal do peso (mg) de adultos de espécies de Trypoxylon coletados em Araras (a – d) e
Rifaina (e – f). Os valores apresentados no gráfico correspondem às médias e o desvio padrão está representado
pelas barras verticais de cada ponto. Os valores nas caixas representam o teste t comparando aos pesos (mg) de
machos e fêmeas para cada estação. * P < 0,05.
4,45*
5,19*
6,61*
6,35*
3,47*
3,27*
3,51*
3,40*
6,25*
93
Figura 5. Número de ninhos de: a) Trypoxylon rogenhoferi; b) Trypoxylon lactitarse; c) Trypoxylon aurifrons e
d) Trypoxylon nitidum em cada classe de intervalo de tempo (dias) de acordo com a emergência do primeiro
macho com a primeira fêmea de cada ninho. Valores nulos representam emergência simultânea, valores
negativos, emergência anterior do macho e valores positivos, emergência anterior d fêmea.
a)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
<-10
-6 a -10
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6 a 10
>10
Intervalo de tempo (dias)
Número de ninhos
machos emergindo
depois que as
fêmeas
machos
emergindo antes
que as fêmeas
b)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
<-4
-2
-1
0
1
2
3
4
>4
Intervalo de tempo (dias)
Número de ninhos
machos emergindo
depois que as
fêmeas
machos
emergindo antes
que as fêmeas
c)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<-4
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
>4
Intervalo de tempo (dias)
Número de ninhos
machos emergindo
depois que as
fêmeas
machos
emergindo antes
que as fêmeas
d)
0
10
20
30
40
50
60
<-4
-2
-1
0
1
2
>4
Intervalo de tempo (dias)
Número de ninhos
machos emergindo
depois que as
fêmeas
mac ho s
emergindo antes
que as fêmeas
94
a)
y = 0.6798x + 30.356
R
2
= 0.4714
30
40
50
60
70
80
90
100
110
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Peso de machos (mg)
Peso de fêmeas (mg) .
b)
y = 0.765x + 26.569
R
2
= 0.5105
40
50
60
70
80
90
100
30 40 50 60 70 80
Peso de machos (mg)
Peso de fêmeas (mg) .
c)
y = 0.6564x + 16.588
R
2
= 0.2198
10
20
30
40
50
10 20 30 40
Peso de machos (mg)
Peso de fêmeas (mg) .
d)
y = 0.3427x + 19.507
R
2
= 0.1725
10
20
30
40
50
10 20 30 40
Peso de machos (mg)
Peso de fêmeas (mg) .
Figura 6. Correlação entre os pesos médios de machos e fêmeas do mesmo ninho de a) Trypoxylon rogenhoferi
(n = 156 ninhos; P = 0,00); b) Trypoxylon lactitarse (n = 20 ninhos; P = 0,00); c) Trypoxylon aurifrons (n = 38
ninhos; P = 0,00) e d) Trypoxylon nitidum (n = 38 ninhos; P = 0,01).
95
4.5 Caracterização Alozímica, Estrutura Genética Populacional e Intranidal de Vespas
do Gênero Trypoxylon (Hymenoptera: Crabronidae)
4.5.1 Introdução
O estudo da genética das populações naturais foi consideravelmente facilitado
com o desenvolvimento de métodos de análise que resultou na descrição de grande número de
marcadores moleculares. Neste sentido, a detecção dos polimorfismos enzimáticos
representou passo significativo na mudança paradigmática que a genética das populações
sofreu a partir dos anos 60. A eletroforese em gel de amido descrita por Smithies (1955),
associada a procedimentos histoquímicos, resultou na técnica do zimograma (Hunter e Market
1957), em que variantes enzimáticas poderiam ser detectadas sob o suporte eletroforético.
Esta técnica passou a ser uma ferramenta muito útil na caracterização genética de populações
(Avise 1974) em razão de seu baixo custo, facilidade e rapidez laboratoriais e à grande
quantidade de dados que são produzidos.
Numerosos estudos em insetos são conduzidos empregando-se alozimas para
estimar níveis de variabilidade genética, estrutura populacional e hibridação, verificar
características do comportamento reprodutivo, tal como a sistema de acasalamento, além de
ajudar a resolver controvérsias e a identificar táxons desconhecidos (Alfenas 1998). As
alozimas são também úteis nos estudos de parentesco, uma vez que são marcadores co-
dominantes, sendo o heterozigoto caracterizado por um fenótipo diferente dos homozigotos.
A ordem Hymenoptera é extremamente diversa, abrange mais de 120 mil
espécies descritas e centenas a serem descobertas (Gauld e Bolton 1996; Goulet e Huber
1993). É constituída de grupos que apresentam diferentes estágios de socialidade, variando
desde comportamento solitário, caracterizado pela independência das fêmeas na construção e
aprovisionamento de seus ninhos (Michener 1974), até comportamento eusocial, definido
como a presença permanente de castas e cuidado aloparental (Crespi e Yanega 1995).
Na maioria dos Himenópteros, os machos não auxiliam na construção do
ninho, tendo um rápido contato com a fêmea apenas na cópula. No entanto, uma característica
peculiar do gênero de vespa solitária
Trypoxylon (Trypargilum) é o comportamento de guarda
exibido pelos machos: eles permanecem por um extenso período junto ao ninho, ajudando a
fêmea em sua construção (Richards 1934; Brockmann 1992; Brockmann e Grafen 1989;
Coville 1982).
96
Um benefício do comportamento de guarda é a defesa do ninho contra parasitas
e outros inimigos naturais (Coville 1982). Krombein (1967) sugere que um importante
aspecto é a prevenção de usurpação do ninho por outras fêmeas da mesma ou de diferentes
espécies. Machos também expulsam outros machos da mesma espécie que tentam entrar no
ninho. Além disso, a ocorrência de repetidas cópulas no interior do ninho imediatamente antes
da oviposição sugere que o comportamento de guarda assegura ao macho a paternidade da
prole, diminuindo o efeito de machos rivais (Coville 1982).
A literatura sobre a genética de populações de vespas
Trypoxylon
(Trypargilum)
restringe-se aos dados relatados por Peruquetti (2003) em populações de T.
rogenhoferi
Kohl 1884 e T. albitarse Fabricius 1804. O objetivo deste trabalho foi
caracterizar polimorfismos protéicos em quatro espécies de
Trypoxylon (Trypargilum): T.
aurifrons
Shuckard 1937, T. nitidum Smith 1856, T. lactitarse Saussure 1867 e T. rogenhoferi
e, a partir destes marcadores, verificar possíveis mudanças na estrutura populacional ao longo
do tempo e investigar a estrutura genética intranidal, a fim de avaliar o significado funcional
do comportamento de macho-guarda.
4.5.2 Material e Métodos
Amostragem das espécies.
Ninhos das espécies de Trypoxylon (Trypargilum)
foram coletados em três áreas localizadas no estado de São Paulo: o
campus de Araras
(22º18'S, 47°22'W, 629 m) da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) durante
Dezembro de 2003 a Março 2007; o
campus da UFSCar em São Carlos (22°01'S, 47º53'W,
850 m), durante Novembro de 2004 a Novembro de 2006 e a Fazenda Rio Branco em Rifaina
(20º04'S, 47°25'W, 575 m), durante Novembro de 2004 a Março de 2007.
As espécies foram amostradas por meio de ninhos-armadilha feitos com
bambus. Estes ninhos foram levados ao Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros
(LGEH), onde foram abertos. Os pupários foram colocados individualmente em frascos de
vidro, identificados inclusive com a posição em que se encontravam no ninho e mantidos à
temperatura ambiente até a emergência do adulto, momento que as espécies eram
identificadas. Os adultos foram sexados e mantidos a -20°C até o momento das análises.
Análises Eletroforéticas. Extratos de cabeça e mesossoma de adultos ou de
pupas das espécies de
Trypoxylon (Trypargilum) foram utilizados para as análises
eletroforéticas (Tabela I). Foi utilizada a técnica de eletroforese horizontal em gel de amido a
14% (Penetrose
TM
30, Corn Products Brazil S.A.) de acordo com o método de Smithies
97
(1955). As soluções-tampão utilizadas nas cubas e no preparo dos géis estão apresentadas na
Tabela II.
As amostras foram homogeneizadas em 100 ou 200 µL de solução 0,1% 2-
mercaptoetanol e centrifugadas a 4.000 rpm por quinze minutos à temperatura ambiente. Os
sobrenadantes obtidos foram embebidos em papel Whatman nº3 (5x5mm) e aplicados no gel.
Para a detecção da atividade enzimática foram utilizadas misturas de reação
específicas para cada enzima estudada, segundo os protocolos descritos em Harris e
Hopkinson (1976). Os sistemas enzimáticos analisados em cada espécie estão apresentados na
Tabela III. Para todos os sistemas polimórficos, as variantes eletroforéticas foram nomeadas
de acordo com o sistema de Hutchinson
et al. (1983), que denomina 100 a variante mais
comum em cada loco e as demais são nomeadas de acordo com a distância relativa à variante
100.
Análises de dados. As variantes eletroforéticas detectadas foram interpretadas
como produtos de alelos codominantes diferentes de um gene. Portanto, os termos variante
enzimática e alelo serão utilizados alternativamente, referindo-se ora ao produto gênico, ora
ao gene alelo que a determina. A partir da definição dos genótipos de cada indivíduo para os
locos enzimáticos estudados, foram calculadas as freqüências alélicas para cada população
amostrada. Uma fêmea de cada ninho analisado foi considerada para estimar os parâmetros
populacionais. Para as quatro espécies de
Trypoxylon, estes parâmetros foram estimados a
partir de toda a amostra. Entretanto, para as amostras de
T. aurifrons provenientes de Araras e
Rifaina e de
T. nitidum proveniente de Araras, estes parâmetros foram também estimados a
partir da subdivisão destas populações por ano de coleta (Tabela 1).
Foram estimados alguns parâmetros genéticos utilizando o sofware Genepop
versão 3.3 (Raymond e Rousset 1995), como: i) proporção de locos polimórficos por espécie;
ii) proporção de machos diplóides; iii) equilíbrio de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de
ligação; iv) heterozigosidade intra-loco e média; v) estatística-F.
Um loco foi considerado polimórfico quando a freqüência do alelo mais
comum foi menor que 95%. A fim de quantificar a produção de machos diplóides na
população foi utilizada a proporção de machos que são dipóides (φ), definida como o número
de machos diplóides sobre o total de machos (diplóides e haplóides).
Foram estimadas a heterozigosidade intra-loco observada (
H
o
, dada pela
freqüência do genótipo heterozigoto na população) e esperada (H
e
, dada pela freqüência do
genótipo heterozigoto esperada em uma população em EHW, ou seja,
2pq) e as
heterozigosidades médias observada e esperada. Para se obter a heterozigose média, as
98
proporções obtidas para cada loco foram somadas e divididas pelo número total de locos
analisados.
Como parâmetros populacionais foram estimados o Equilíbrio de Hardy-
Weinberg (teste de
χ
2
a um nível de significância de 5% entre valores observados e esperados)
e o desequilíbrio de ligação. Uma população é considerada estar em Equilíbrio de Hardy-
Weinberg (EHW) quando as freqüências alélicas obedecem à proporção
p
2
, 2pq e q
2
dos
respectivos genótipos, onde
p e q são as freqüências dos alelos na população (p+q=1).
Estatisticamente, ao analisar dois locos, é esperado que os alelos de um determinado loco em
EHW não estejam associados com os alelos presentes em outro loco também em EHW. O
desequilíbrio de ligação (LD) mede a associação não randômica dos alelos em dois locos
distintos.
A diferenciação genética das subpopulações de
T. aurifrons e T. nitidum foi
verificada pelo componente F
st
da estatística F (Weir e Cockerham 1984), o qual mede a
variância da freqüência alélica entre as subpopulações e varia de zero a um (teste de
χ
2
a um
nível de significância de 5%).
O parentesco médio intranidal das espécies de
Trypoxylon (Trypargilum) foi
estimado utilizando pelo menos três fêmeas emergidas do mesmo ninho (parentesco de ninho)
e o parentesco médio populacional foi estimado a partir das amostras de população (uma
fêmea por ninho). As análises foram feitas no aplicativo para Excel GeneAlEx (Genetic
Analysis in Excel – Version 6; 2006). O parentesco e seu erro-padrão foram estimados
mediante a estatística
r (Queller e Goodnight 1989), definida como a probabilidade de um
alelo no indivíduo
x ser idêntico por descendência a um alelo do indivíduo y. A fórmula geral
derivada pelos autores é:
∑∑∑
∑
∑∑
−
−
=
l
x
kx
l
y
kx
pp
pp
r
*)(
*)(
onde,
p
x
é a freqüência do alelo encontrado no loco k e posição alélica l; p
y
é a freqüência do
mesmo alelo em um grupo de indivíduos encontrados na mesma população onde está inserido
o indivíduo
x; e p* é a freqüência do alelo na população em conjunto, excluindo da mesma
todos os possíveis parentes de
x (Queller e Goodnight 1989). Os valores teóricos de r são 0,5
(irmãs completas), 0,25 (meio-irmãs) e 0,0 (indivíduos não aparentados). Valores negativos
de
r podem ocorrer se as freqüências gênicas dos indivíduos comparados diferirem em direção
oposta à média populacional (Queller e Goodnight 1989). Esta estatística exige fraca ou
99
nenhuma seleção atuando sobre o marcador genético; portanto, os locos devem estar em EHW
e não apresentar desequilíbrio de ligação.
As inferências de paternidade foram realizadas da seguinte forma: ii) o número
de machos parentais foi estimado a partir de ninhos com, no mínimo, duas fêmeas e um
macho; ii) o número de fêmeas fundadoras de cada ninho foi inferido a partir dos haplótipos
de, pelo menos, três indivíduos do ninho, sendo pelo menos um deles macho.
4.5.3 Resultados
Caracterização Alozímica.
Melhor resolução e maior atividade das enzimas
de
T. aurifrons, T. nitidum e T. rogenhoferi foram obtidas em tampão tris-citrato pH 7,5 e em
tampão tris-citrato pH 8,0 para
T. lactitarse. Para as esterases das quatro espécies, dentre os
substratos fluorogênicos utilizados, o que apresentou melhor atividade foi o acetato e
propionato de umbeliferona e dentre os ésteres de naftol, a visualização ocorreu com α-naftil
acetato.
As análises eletroforéticas de
T. aurifrons demonstraram a presença de uma
região de atividade esterásica. Quatro variantes foram comuns às três áreas (110, 105, 100 e
85) e uma (90) foi restrita a Araras e Rifaina (Figura 1a). Os sistemas PGM e ICD também
apresentaram polimorfismo, caracterizado por três (105, 100 e 95) e duas (102 e 100)
variantes, respectivamente, para as três áreas amostradas (Figuras 1b e c) e uma variante
exclusiva (110) de PGM em Rifaina.
Os adultos de
T. nitidum coletados em Araras apresentaram duas regiões de
atividade esterásica polimórficas: EST-1 e EST-2, que apresentaram duas (100 e 90) e três
(105, 100 e 85) variantes, respectivamente (Figura 2a). Foram encontrados polimorfismos
para os sistemas PGM, com três variantes (102, 100 e 95) e ICD, com duas (100 e 90)
(Figuras 2b e c, respectivamente).
Em amostras de
T. lactitarse, provenientes de Araras, duas regiões de esterase
(EST-1 e EST-2) foram identificadas e ambas foram polimórficas, apresentando duas (100 e
90) e três variantes (110, 100 e 95), respectivamente (Figura 3a). Uma região polimórfica em
PGM foi observada, contendo duas variantes (105 e 100) (Figura 3b) e outra em MDH, com
os alelos 100 e 90 (Figura 3c).
As amostras de
T. rogenhoferi coletadas em Araras revelaram uma região
polimórfica de esterase (EST-1), com três variantes (110, 100 e 90), uma de ICD, com as
variantes 110, 100 e 90 e uma de MDH com 110 e 100 (Figuras 4a-c). Em Rifaina, além
100
destes sistemas polimórficos, esta espécie também apresentou polimorfismo para EST-2 (duas
variantes: 110 e 100) e PGM-1 (duas variantes: 105 e 100) (Figura 4e) somente em pupas, e
para PGM-2 e β-HBDH (110 e 100) (Figuras 4d e 4f). A utilização de pupas desta espécie
permitiu verificar que o padrão da MDH nesta fase do desenvolvimento apresenta uma região
extra de atividade.
A estrutura quaternária das enzimas pode ser inferida a partir do padrão
eletroforético dos heterozigotos. As análises eletroforéticas dos extratos de heterozigotos das
espécies de
Trypoxylon para EST-2 e PGM evidenciaram padrão de duas bandas, sugerindo
que estas enzimas possuem uma estrutura monomérica (Figuras 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4d e
4e). No entanto, o padrão eletroforético dos heterozigotos para EST-1, ICD, MDH e α-GPDH
era constituído de três bandas, demonstrando que estas enzimas exibem estrutura dimérica
(Figuras 1c, 2c, 3c, 4a, 4b e 4c).
Medidas de Diversidade Genética e Estrutura Populacional. De maneira
geral, as espécies de
Trypoxylon apresentaram baixo polimorfismo enzimático, variando de
11% a 31% (Tabela IV). Heterozigosidade média para estas espécies de
Trypoxylon também
foi baixa (Tabela IV), apresentando valores semelhantes a outros himenópteros
(0,051±0,049DP; n = 69).
Do total de 14 locos enzimáticos testados em
T. aurifrons nas três localidades,
apenas três foram polimórficos (21%) (Tabelas IV e V). Não foram observados machos
diplóides para esta espécie. Em Araras e Rifaina, devido às baixas freqüências dos alelos
EST-
2
110 e 90, os genótipos relativos a estes alelos foram agrupados aos dos alelos 105 e 85,
respectivamente. Da mesma forma, os dados referentes aos alelos
PGM 105 e 110 das
amostras de Rifaina foram agrupados. Considerando todas as fêmeas analisadas para a
população de
T. aurifrons de Araras, apenas o loco EST-2 não se encontrou em EHW (Tabela
IV) em razão da falta significativa de heterozigotos na população (Tabela VIII); não foi
observado desequilíbrio de ligação entre os locos.
Ao dividir a população de
T. aurifrons de Araras em três subpopulações (de
acordo com o período de coleta) foi possível verificar que o loco
EST-2 apresentou valores
significativos de χ
2
para EHW em 2003/2004 e 2005, mas não em 2006/2007 e o alelo mais
freqüente (
100) foi comum nas três situações (Tabela VI). Em PGM, na primeira e na última
coleta foi amostrado o alelo
105, que apresentou baixa freqüência em ambas as situações; uma
diminuição na freqüência do alelo
100 do loco PGM foi verificada ao longo das coletas e o
mesmo ocorreu para o alelo
ICD 102 (Tabela VI). Os maiores valores de heterozigosidade
intra-loco foram observados para o loco
ICD, nas duas primeiras subpopulações e PGM na
101
última (Tabela VII). Apenas o loco EST-2 da primeira subpopulação apresentou
heterozigosidade observada significativamente diferente da esperada (Tabela VII) em razão
da falta de heterozigotos. Os valores de F
st
não foram estatisticamente diferentes de zero
(Tabela VIII), não havendo, portanto, estruturação populacional temporal.
A população de
T. aurifrons de Rifaina apresentou desvio do esperado de
EHW para o loco
PGM ao considerar todas as fêmeas analisadas (Tabela V). Não foi
observado desequilíbrio de ligação para os alelos em nenhum loco. Ao analisar a população
de Rifaina subdividida por época de coleta, foi encontrado desvio significativo do EHW
apenas para o loco
PGM do segundo período (Tabela VI); neste loco foi observado um
aumento na freqüência do alelo
105 da primeira para a segunda época, o mesmo ocorrendo
para o alelo
ICD 102 (Tabela VI). Os maiores valores de heterozigosidade intra-loco foram
observados para o loco
PGM, que foram semelhantes em ambas subpopulações (Tabela VII).
O teste de F
st
revelou subestruturação populacional para a amostra coletada nesta localidade
(Tabela VIII).
Em São Carlos, além dos alelos
105, 100 e 85, observou-se o alelo 110 a uma
freqüência de 0,05, sendo que seus fenótipos foram agrupados aos do alelo
105 nas análises.
Não foi verificado desequilíbrio de ligação nesta população entre os locos. O loco
PGM foi o
que apresentou maior valor de heterozigosidade (Tabela VII).
Em
Trypoxylon nitidum, dos 13 locos enzimáticos testados, quatro foram
polimórficos (31%) (Tabelas IV e V). Não foram observados machos diplóides para esta
espécie. A população de
T. nitidum de Araras apresentou desvios para o EHW nos locos EST-
1
e EST-2 (Tabela VI) e não apresentou desequilíbrio de ligação entre os locos.
Ao analisar a população de
T. nitidum subdividida, apenas no primeiro período
de coleta foram verificados desvios de EHW em
EST-1 e EST-2 (Tabela VI). Observou-se um
aumento na freqüência dos alelos
100, 105 e 102 para os locos EST-1, EST-2 e PGM,
respectivamente, da primeira para a segunda época de coleta (Tabela VI). No loco
PGM, o
alelo
95 foi exclusivo da primeira subpopulação e um aumento do alelo 100 de ICD foi
observado ao longo do tempo (Tabela VI). Em ambas as subpopulações os locos com maior
heterozigosidade foram
EST-2 e ICD (Tabela VII). Valores de F
st
foram significativos (Tabela
VIII) e, portanto, foi observada subestruturação populacional.
Em Trypoxylon lactitarse proveniente de Araras o grau de polimorfismo
encontrado foi de 17% (três locos polimórficos em 18) (Tabelas IV e V) e apenas o loco
EST-
2
não se apresentou em equilíbrio de HW (Tabela V). Não foi observado desequilíbrio de
ligação entre os locos. A maior heterozigosidade intra-loco foi encontrada para
EST-2 (Tabela
102
VII). Do total de machos analisados (n = 79), dois foram heterozigotos (φ = 0.03) para o loco
MDH.
A freqüência de polimorfismo em
T. rogenhoferi foi de 11% (dois locos em 18
analisados) (Tabela IV e V). Os locos
EST-1 e MDH apresentaram-se polimórficos para a
população de Araras, sendo que o primeiro não se apresentou em EHW (Tabela V). Na
população de Rifaina, apesar de apresentar mais locos que mostraram polimorfismo, estes não
foram considerados polimórficos uma vez que o alelo mais freqüente apresentou uma
freqüência maior que 95%. Desta forma, não foram realizadas análises estatísticas para os
dados referentes a esta espécie.
Parentesco Intranidal. Apesar de serem observados locos que não se
apresentavam em EHW, o parentesco foi calculado utilizando todos os marcadores. O
parentesco médio populacional foi estimado separadamente para as populações de
T.
aurifrons
de Araras e Rifaina e para a população de T. nitidum e T. lactitarse de Araras, sendo
0,166±0,023, 0,160±0,020, 0,231±0,08 e 0,195±0,12, respectivamente.
Quanto ao parentesco médio intranidal, de maneira geral, a presença do guarda
pode garantir a ele a paternidade da progênie feminina. No entanto, para alguns ninhos
analisados, os valores de parentesco não puderam ser adequadamente distinguidos entre zero
ou 0,75 (Tabela VII). Em 37,5% dos ninhos de
T. aurifrons provenientes de Araras os valores
de parentesco não foram estatisticamente diferentes de 0,75 (intervalo de confiança de 95%) e
para os ninhos desta espécie provenientes de Rifaina esta estimativa foi de 70%. Já em
T.
nitidum
e em T. lactitarse os valores foram de 26,3% e 53,8%, respectivamente.
A partir dos ninhos em que foi possível estimar os genótipos dos machos-
guarda (suposto pai) (ninhos com pelo menos duas fêmeas e um macho: número de ninhos =
64 de
T. aurifrons; 22 de T. nitidum e 22 de T. lactitarse), foi verificado que para a maioria
deles (70%
T. aurifrons; 72% em T. nitidum e 77% em T. lactitarse) a prole pode ser
explicada por uma fêmea fundadora em sistema monogâmico. Portanto, na maioria dos
ninhos, o macho-guarda parece garantir a paternidade da prole feminina.
No entanto, resultados que não são explicados por esta hipótese foram
detectados, sendo observada a presença de mais de um genótipo parental: a ocorrência de
fenótipos incompatíveis com a monandria entre a prole feminina é
indicativo de acasalamento
múltiplo. Estes resultados foram observados em 19 ninhos de
T. aurifrons, em seis de T.
nitidum
e em cinco de T. lactitarse, em que a poliandria foi detectada em um ou dois locos
(Tabela X).
103
Além disso, evidências de associação e/ou usurpação também puderam ser
inferidas. A partir de ninhos com pelo menos duas fêmeas, a “herança” foi verificada pela
presença de fenótipos incompatíveis com a hipótese de uma única fêmea fundadora. Em
T.
aurifrons
, um dos 100 ninhos estudados apresentou incompatibilidade fenotípica dos
indivíduos emergidos no mesmo ninho e em
T. lactitarse, essa incompatibilidade foi vista em
dois dos 29 ninhos (Tabela XI).
4.5.4 Discussão
Variabilidade Genética.
Em Hymenoptera, a variabilidade genética é baixa,
com valores de heterozigosidade média igual a 0,05±0,05 (Packer e Owen 1990; Packer
et al.
1992; Shoemaker
et al. 1992; Rosenmeir e Packer 1993, Kukuk e Sage 1994; Chapman e
Stewart 1996; Boato e Battisti 1996; Takahashi
et al. 2001; Boraschi et al. 2005; Peruquetti
2003).
Dos 18 locos enzimáticos estudados, três ou quatro destes exibiram
polimorfismo (11% a 31%) nas espécies de
Trypoxylon. A heterozigosidade média verificada
não diferiu do valor médio descrito para a maioria dos himenópteros. De maneira geral, esta
ordem apresenta baixa variação gênica quando comparada com outros insetos (Crespi 1991) e
algumas explicações têm sido propostas para explicar esta redução. Uma delas é a
haplodiploidia, o qual reduz o tamanho efetivo da população, aumenta a taxa de fixação dos
alelos, dificulta a obtenção de um polimorfismo estável e aumenta a ligação gênica e o “efeito
carona” devido aos menores níveis de recombinação (Crozier 1971; Lester e Selander 1979;
Pamilo e Crozier 1981; Avery 1984; Owen 1985). Além disso, características
comportamentais podem igualmente justificar o baixo polimorfismo nestes insetos: em
himenópteros sociais, como poucos indivíduos são responsáveis pela reprodução na colônia, a
variabilidade genética é diminuída, diferentemente do que ocorre em espécies solitárias, cujo
potencial de variação pode ser maior (Pamilo
et al. 1978).
Os dados aqui apresentados mostraram valores de heterozigosidade média
semelhantes aos relatados por Peruquetti (2003) para
T. albitarse. No entanto, este autor
descreve um maior grau de polimorfismo e de heterozigosidade em populações de
T.
rogenhoferi
provenientes de Luis Antônio e São Carlos (SP) quando comparado aos nossos
resultados para esta espécie. Dentre os 15 locos estudados por Peruquetti (2003), oito
mostraram-se polimórficos. O maior nível de variação detectado foi atribuído por aquele autor
ao fato da análise alozímica ter sido realizada em pupas, fase na qual algumas enzimas
104
exibem expressão diferencial. Entretanto, no presente estudo, apesar de serem utilizados
adultos e pupas de
T. rogenhoferi, a variabilidade genética desta espécie foi muito baixa,
prejudicando a estimativa dos parâmetros genéticos.
Estrutura Populacional. Os resultados sobre a estruturação populacional de T.
aurifrons
de Rifaina e T. nitidum de Araras indicam que estas populações apresentam-se
subdivididas temporalmente em decorrência, possivelmente, do método de amostragem
adotado: a não reposição dos indivíduos ao local de coleta e a entrada de novos indivíduos na
população, causando flutuações nas freqüências alélicas, observação de alelos exclusivos em
cada período e valores significativos de χ
2
para o EHW quando utilizada toda a amostra.
Esta subestruturação temporal das populações de
Trypoxylon não é um
resultado esperado considerando-se o comportamento filopátrico das fêmeas deste gênero
(Peruquetti 2003). Mudanças nas freqüências alélicas ao longo do tempo são esperadas
quando um pequeno número de indivíduos coloniza uma área e, com o passar do tempo, há
migração (Sugg
et al. 1996). No entanto, Molumby (1997) relata a existência de filopatria
diferenciada entre os sexos em
Trypoxylon: as fêmeas permanecem nos locais de emergência
(onde nidificariam) e os machos ficam nestes locais por um período variável, dispersando-se
posteriormente. Ao estudar populações de
T. rogenhoferi e T.albitarse, Peruquetti (2003)
confirmou este comportamento de dispersão e filopatria de machos e fêmeas destas espécies.
O comportamento de dispersão do macho torna menos provável o cruzamento
entre irmãos e irmãs. Peruquetti (2003) evidenciou este resultado pela não significância do
estimador F
is
para as populações analisadas e pela ausência de machos com genótipos
diplóides (heterozigotos). No presente estudo, das três espécies em que foi possível a análise
dos dados genéticos,
T. lactitarse foi a única que apresentou machos diplóides. Este resultado
pode ser um indicativo de endogamia para esta população.
Em Hymenoptera, a haplodiploidia arrenótoca é observada na maioria das
espécies. A presença de machos diplóides é considerada custosa (Owen e Packer 1994) e sua
ocorrência tem sido investigada nas espécies de aculeados (Roubik
et al. 1996; Takahashi et
al.
2002; Souza et al. em preparação). De acordo com Cook (1993), o modelo CSD
(Complementary Sex Determination) é o que melhor explica o mecanismo de determinação
do sexo na maioria das espécies de Hymenoptera. Neste, o sexo é determinado por múltiplos
alelos de um loco único; os indivíduos heterozigotos se desenvolvem em fêmeas, enquanto
que indivíduos hemi ou homozigotos se desenvolvem em machos (Whiting 1939). Segundo
este modelo, a endogamia leva à maior homozigose dos alelos sexuais e, assim, à ocorrência
de machos diplóides.
105
Vale ressaltar que os machos heterozigotos de T. lactitarse foram coletados no
último ano de análise, período em que a população estava em declínio (Capítulo 1). Desta
forma, foi possível verificar que o método de amostragem adotado pode causar conseqüências
como a subestruturação e a endogamia para as populações de
Trypoyxlon.
Parentesco intranidal. Os valores de parentesco médio estimado entre os
indivíduos das populações de
T. aurifrons, T. nitidum e T. lactitarse foram baixos. Este
resultado permite afirmar que a maioria das fêmeas de cada espécie, provenientes das
localidades estudadas, não é geneticamente relacionada.
Valores não significativamente diferentes de 0,75 de parentesco intranidal são
esperados quando o ninho é formado por irmãs completas, isto é, um único macho é
responsável pela paternidade dos ninhos. Nas espécies de
Trypoxylon aqui estudadas, T.
aurifrons
(proveniente de Rifaina) foi aquela que apresentou maior número de ninhos em que
a paternidade pode ser atribuída a um único macho (70%), enquanto que para as outras
espécies esta estimativa foi baixa. Em vários destes ninhos, os valores de parentesco não
puderam ser distinguidos entre zero ou 0,75. Ainda, valores negativos e significativos de
r
foram encontrados, indicando que as freqüências alélicas dos indivíduos encontrados num
ninho diferem em direção oposta em relação à média populacional (Queller e Goodnight
1989).
Em
T. albitarse e T. rogenhoferi, Peruquetti (2003) encontrou que na maioria
dos ninhos desta espécie a paternidade da progênie feminina devia-se à presença do macho-
guarda. Mas, assim como neste trabalho, Peruquetti (2003) obteve estimativas de parentesco
com erros-padrão elevados. Este autor discute dois fatores que podem reduzir o parentesco
entre as fêmeas nascidas em um mesmo ninho: i) mais de uma fêmea ovipositando em um
mesmo ninho (usurpação/associação) e ii) acasalamentos múltiplos. A presença de ninhos em
que se observou incompatibilidade de genótipos para uma hipótese de monoginia e monandria
sugere a ocorrência de ambos os fatores para as espécies de
Trypoxylon estudadas.
A guarda do ninho. Quando a fêmea acasala-se mais de uma vez, ela cria a
oportunidade de competição entre os espermas dos seus parceiros, a qual determina qual
macho fertiliza o maior número de ovos (Alcock 1991). Parker (1984) verificou que há
competição espermática em insetos e o último macho a se acasalar antes da oviposição
freqüentemente tem a vantagem de fertilizar os ovos. Este processo chama-se precedência
espermática e é encontrada na maioria dos himenópteros estudados (Michener 1974). A
ocorrência de competição espermática nas espécies de insetos tem resultado em
comportamentos de acasalamento que são explicados por evolução convergente (Alcock
106
1991). Uma tática comum é a de permanecer junto à fêmea momentos antes da oviposição e
após a cópula. Dessa forma, este macho encontra-se em posição de repelir possíveis machos
competidores (Parker 1970; Alcock 1983).
O benefício direto do macho em se manter guarda é a redução da probabilidade
da fêmea se acasalar novamente com machos rivais antes da oviposição e, conseqüentemente,
causar uma eliminação ou diluição espermática. No entanto, este comportamento apresenta
custos (Alcock 1991). A teoria evolutiva prevê que a guarda deva evoluir somente se os
benefícios reprodutivos deste comportamento excederem os custos. Ainda, é esperado que
algumas condições estejam associadas ao surgimento desta característica, como a falta de
fêmeas receptivas, acasalamento múltiplo das fêmeas receptivas e alta competição pelas
fêmeas receptivas (Yamamura 1986). Estas condições favorecem o comportamento de guarda
dos machos por eles terem a chance de repelir seus oponentes.
Em esfecídeos, o comportamento de guarda de ninhos pelos machos é restrito a
alguns representantes (Brockmann 1992) e provavelmente é derivado do hábito territorial do
macho (Alcock 1975; Alcock
et al. 1978; Brockmann e Grafen 1989). Machos de algumas
espécies de esfecídeos usualmente mantêm-se próximos aos agregados de ninhos, defendendo
a área contra outros machos e este comportamento de guarda certamente reduz o impacto de
competidores e alguns inimigos naturais (Coville e Coville 1980). Além disso, auxiliam
indiretamente na construção do ninho. Brockmann e Grafen (1989) demonstraram que as
fêmeas de
T. politum assistidas por machos guardas levam menos tempo para aprovisionarem
suas células de cria. Conseqüentemente, estes ninhos foram menos parasitados, já que foram
completados mais rapidamente.
Em espécies de
Trypoxylon (Trypargilum) as fêmeas são maiores que os
machos e são produzidas em células de cria com mais aprovisionamento (Molumby 1997;
Peruquetti e Del Lama 2003a). Molumby sugere que o dimorfismo sexual poderia facilitar a
evolução do comportamento de guarda do ninho nas espécies de
Trypargilum: o macho
“ajudaria” sua parceira a aprovisionar melhor as células de cria para que prole feminina fosse
produzida, beneficiando-se, portanto, de seu comportamento.
Um outro aspecto importante do gênero
Trypargilum é a independência de
fêmeas na construção do ninho. Assim como a maioria dos esfecídeos, as fêmeas são
solitárias e cada uma constrói e aprovisiona seus próprios ninhos. Construções simultâneas de
ninhos não ocorrem nas espécies desse grupo (Amarante 1991; Brockmann 1992; Molumby
1997; Peruquetti 2003). Por estes motivos (guarda do ninho e única fêmea) é possível testar
nos ninhos deste grupo uma herança monândrica e monogínica dos locos alozímicos.
107
Em parte dos ninhos das espécies de Trypoxylon estudadas foi possível
verificar que a “herança” não estava de acordo com os padrões esperados, sendo encontrados
ninhos com mais de um macho parental. Coville e Coville (1980) sugerem que é possível que
haja estratégias de acasalamento alternativas dos machos de
Trypargilum. Assim, os machos
que não apresentam comportamento de guarda copulariam com as fêmeas enquanto estas
estivessem fora de seus ninhos.
Cópulas extra-par podem ocorrer nestas espécies enquanto as fêmeas estão
forrageando (Coville e Coville 1980; Garcia e Adis 1995) e a ausência do macho-guarda no
ninho pode resultar em estrutura genética intranidal mais complexa pela paternidade associada
a mais de um macho parental. No entanto, é muito rara a observação de ninhos sem a presença
do macho-guarda. Em estudos de observação de espécies de
Trypoxylon (Coville e Coville
1980; Garcia e Adis; Brockmann e Grafen 1989) tem sido notado que em todos os ninhos a
presença do macho é essencial para que a fêmea comece a construir o ninho e as múltiplas
cópulas no interior deste, momentos antes da oviposição, são confirmadas pelos autores acima
citados. Desta maneira, é possível sugerir que a existência de ninhos em que a paternidade
deve ser atribuída a mais de um macho pode ser resultado da baixa eficiência na eliminação
dos espermatozóides de machos competidores pelo macho-guarda (Simmons 2001, 2005).
Em contraste com o princípio de Bateman (1984), no qual apenas machos se
beneficiariam com o aumento do número de cópulas, estudos atuais têm mostrado que as
fêmeas também recebem benefícios com acasalamentos extra-par. Várias hipóteses sobre
benefício genético são propostas para explicar a evolução da poliandria (Simmons 2005).
Vários outros estudos em insetos e aracnídeos, (Konior
et al. 2001; Pai e Yan 2002; Watson
1991), répteis (Olsson
et al. 1994), aves (Kempenaers et al. 1998) e mamíferos (Hooglund
1998) têm demonstrado correlação positiva entre o grau de poliandria e o sucesso de
oviposição ou viabilidade da prole.
Em algumas espécies de aves, tem sido discutido que a razão dos
acasalamentos extra-par das fêmeas é a de aumentar o seu sucesso reprodutivo, chocando uma
maior proporção de ovos (Gray 1997). Em insetos sociais, alguns estudos evidenciaram que
maior produtividade e resistência a doenças da colônia estavam associadas a rainhas que
apresentaram múltiplos acasalamentos (Hughes e Boomsma 2004; Wiernasz
et al. 2001), e
estes resultados têm sido utilizados para confirmar a hipótese de diversidade genética na
evolução da poliandria.
A observação de ninhos em que foi inferida uma associação e/ou usurpação de
fêmeas foi relatada em
T. albitarse e em T. rogenhoferi por Peruquetti (2003). Neste trabalho,
108
o autor discute que a nidificação não foi conjunta ou simultânea, havendo um intervalo entre a
nidificação das várias fêmeas em um mesmo ninho, uma vez que se observou fenótipos
incompatíveis em posições terminais do ninho e pela presença de uma fêmea com fenótipo
diferente do fenótipo da prole em ninho já terminado. Contudo, os ninhos observados neste
trabalho apresentaram fenótipos incompatíveis em indivíduos que se encontravam nas células
de cria intermediárias, sugerindo associação simultânea de fêmeas, o que contraria as
observações de Amarante (1991), Brockmann (1992), Molumby (1997) e Peruquetti (2003).
No presente estudo, procurou-se inferir o sistema de acasalamento dos adultos
na natureza mediante uma abordagem genética indireta, estimando-se o nível de parentesco
genético e a herança dos fenótipos alozímicos entre a prole de cada ninho. No entanto, o baixo
polimorfismo enzimático em himenópteros, incluindo as espécies do gênero
Trypoxylon, faz
com que esta metodologia tenha pouca aplicabilidade neste grupo (Garnery
et al. 1992),
principalmente para o objetivo pretendido. Desta forma, os resultados de acasalamento extra-
par e associação e/ou usurpação podem estar subestimados. Nos últimos anos, estudos com
espécies que apresentam comportamento monogâmico têm verificado que a estrutura genética
intranidal não confirma o esperado para tal comportamento (Akçay e Roughgarden 2007).
Portanto, estudos de biologia da nidificação e observação de acasalamento aliados a
marcadores genéticos mais polimórficos, como os microssatélites, permitirão estabelecer com
maior acurácia o comportamento de nidificação e o sistema de acasalamento nas espécies de
Trypoxylon, bem como o sucesso reprodutivo de machos e fêmeas de acordo com suas
estratégias reprodutivas.
109
Tabela I. Número de amostras e de ninhos utilizados em análises eletroforéticas de quatro espécies de
Trypoxylon.
Espécie Área - Época
Número de amostras
(machos/fêmeas
ou pupas)
Número
de ninhos
Número
de fêmeas
(população)
Araras (2003/2004) 98 (34/64) 42 32
Araras (2005) 59 (29/30) 22 16
Araras (2006/2007)
22 (7/15) 13 10
Rifaina (2004/2005) 128 (58/70) 43 34
Rifaina (2006/2007)
62 (28/34) 48 46
T. aurifrons
São Carlos (2004/2006) 30 (11/19) 13 13
Araras (2003/2004) 253 (110/143) 58 52
T. nitidum
Araras (2005/2006) 45 (15/30) 29 20
T. lactitarse Araras (2005/2006) 156 (79/77) 34 34
Araras (2006/2007) 39 (18/21) 8 6
T. rogenhoferi
Rifaina (2006/2007)
58 (3/55)
58 pupas
17 13
Tabela II. Soluções-tampão e condições eletroforéticas usadas para as análises alozímicas em espécies de
Trypoxylon.
Código Sistema
Tampão da cuba
(eletrodos)
Tampão do Gel
Condições
(Amperagem/hora)
A TC 7,5
tris 100 mM + ácido cítrico 28
mM, pH 7.5
Diluído 8x 55 mA, 5:30h
B TC 7,5
tris 100 mM + ácido cítrico 28
mM, pH 7.5
Diluído 10x 60 mA, 5:00h
C TC 8,0
tris 250 mM + ácido cítrico 57
mM, pH 8.0
tris 17 mM + ácido
cítrico 2,3 mM, pH 8.0
55 mA, 5:30h
D TC 8,0 borato 300 mM, pH 8.0
tris 17 mM + ácido
cítrico 2,3 mM, pH 8.0
30 mA, 4:00h
110
Tabela III. Sistemas enzimáticos, classificação e abreviação de acordo com “Enzyme Commission” (EC) e as
respectivas soluções-tampão utilizadas em cada sistema (Tabela II).
Sistema Enzimático Classificação Tampão Resolução
Aconitase
l
ACO – EC 4.2.1.3 A S
Aldolase
l
ALD – EC 4.1.2.13 A S
Adenilato quinase
a,r
AGK – EC 2.7.3.3 D I
Enzima málica
a,n,l,r
ME – EC 1.1.1.40 A, B, D I
Esterases
a,n,l,r
EST – EC 3.1.1.1 A, B, D S
Fosfoglicomutase
a,n,l,r
PGM – EC 2.7.5.1 A, B S
Glicose-fosfato isomerase
a,n,l,r
GPI – EC 5.3.1.9 A, B S
Fumarase
l
FUM – EC 4.2.1.2 A S
6-fosfogliconato desidrogenase
a,n,l,r
6PGDH – EC 1.1.1.44 A, B S
Glicose-6-fosfato desidrogenase
a,l,r
G6PDH – EC 1.1.1.49 A, B S
Hexoquinase
a,n,l,r
HK – EC 2.7.1.1 A, I
Isocitrato desidrogenase
a,n,l,r
ICD – EC 1.1.1.42 A, B, S
Leucil aminopeptidase
a,n,l,r
LAP – EC 3.4.11.1 D S
Malato desidrogenase
a,n,l,r
MDH – EC 1.1.1.37 A, B, D S
Manose-6-fosfato isomerase
l
MPI – EC 5.3.1.8 A, B I
Peptidases
a,n,l,r
PEP – EC 3.4.xx D S
β-Hidroxibutirato desidrogenase
a,n,l,r
βHBDH – EC 4.1.3.2 A, B, D S
α-Glicerofosfato desidrogenase
a,n,l,r
αGPDH – EC1.1.1.8 A, D S
a = Trypoxylon aurifrons; n = T. nitidum; l = T. lactitarse; r = T. rogenhoferi; S = satisfatória; I =
insatisfatória.
Tabela IV. Número de locos enzimáticos analisados, grau de polimorfismo, número efetivo de alelos e
heterozigosidade média para cada espécie de Trypoxylon coletada em três localidades do estado de São Paulo.
Espécie
Número de locos
analisados
Número (e proporção)
de locos polimórficos*
Número efetivo
de alelos
Heterozigosidade
média (n)
T. aurifrons 14 3 (21%) 22 0,042±0,087 (112)
T. nitidum 13 4 (31%) 19 0,040±0,069 (39)
T. lactitarse 18 3 (17%) 23 0,022±0,056 (18)
T. rogenhoferi 18 2 (11%) 27 0,004±0,007 (36)
* critério de 95% (informações sobre a freqüência alélica: Tabela V)
111
Tabela V. Freqüências alélicas observadas e testes de χ
2
para verificação da hipótese nula de aderência ao
Equilíbrio de HW (EHW) em espécies de Trypoxylon coletadas em três localidades do estado de São Paulo. HW:
ns = não significativo,
*
P<0.05,
**
P<0.01,
***
P<0.001.
Espécie Loco Localidade Alelo EHW
EST-2
105 100 85
Araras 0,14 0,70 0,16 χ
2
(3)
= 32,44
***
Rifaina 0,06 0,73 0,21 χ
2
(3)
= 3,02
ns
São Carlos 0,23 0,50 0,27 χ
2
(3)
= 1,21
ns
PGM
105 100 95
Araras 0,03 0,67 0,30 χ
2
(3)
= 3,53
ns
Rifaina 0,17 0,53 0,30 χ
2
(3)
= 16,52
***
São Carlos 0,36 0,64 χ
2
(3)
= 3,59
ns
ICD
102 100
Araras 0,72 0,28 χ
2
(1)
= 0,01
ns
Rifaina 0,69 0,31 χ
2
(1)
= 1,47
ns
T. aurifrons
São Carlos 0,80 0,20 χ
2
(1)
= 0,63
ns
EST-1
100 90
Araras 0,74 0,26 χ
2
(1)
= 14,48
***
EST-2
105 100 85
Araras 0,15 0,71 0,14 χ
2
(3)
= 11,76
**
PGM
102 100 95
Araras 0,03 0,93 0,04 χ
2
(3)
= 6,82
ns
ICD
100 90
T. nitidum
Araras 0,68 0,32 χ
2
(1)
= 1,40
ns
EST-1
100 90
Araras 0,99 0,01 -
EST-2
110 100 95
Araras 0,04 0,49 0,47 χ
2
(3)
= 8,86
*
PGM
105 100
Araras 0,06 0,94 χ
2
(1)
= 0,13
ns
MDH
100 90
χ
2
(1)
= 0,13
ns
T. lactitarse
Araras 0,84 0,16 χ
2
(1)
= 1,27
ns
EST-1
110 100 90
Araras 0,08 0,88 0,04 χ
2
(3)
= 12,03
**
Rifaina 0,03 0,96 0,02 -
ICD
110 100 90
Araras 0,04 0,96 -
Rifaina 0,02 0,98 -
110 100
MDH Araras 0,92 0,08 χ
2
(1)
= 0,10
ns
Rifaina 0,01 0,99 -
EST-2
110 100
Rifaina 0,03 0,97 -
PGM-1
105 100
T. rogenhoferi
Rifaina 0,97 0,03 -
PGM-2
110 100
Rifaina 0,04 0,96 -
Β-HBDH
110 100
-
Rifaina 0,99 0,01 -
112
Tabela VI. Freqüências alélicas em locos enzimáticos de populações de Trypoxylon subdivididas por época de
coleta, provenientes de três cidades do estado de São Paulo.
Espécie Loco Localidade (Época) Alelos Teste de HW
EST-2
105 100 85
Araras (2003/2004) 0,17 0,66 0,17 χ
2
(3)
= 27,85
***
Araras (2005) 0,09 0,78 0,13 χ
2
(3)
= 9,21
*
Araras (2006/2007) 0,10 0,70 0,20 χ
2
(3)
= 3,42
ns
Rifaina (2004/2005) 0,04 0,69 0,27 χ
2
(3)
= 0,49
ns
Rifaina (2006/2007) 0,08 0,76 0,16 χ
2
(3)
= 3,12
ns
PGM 105 100 95
Araras (2003/2004) 0,05 0,73 0,22 χ
2
(3)
= 2,90
ns
Araras (2005) 0,63 0,37 χ
2
(3)
= 1,20
ns
Araras (2006/2007) 0,05 0,50 0,45 χ
2
(3)
= 1,13
ns
Rifaina (2004/2005) 0,03 0,50 0,67 χ
2
(3)
= 0,56
ns
Rifaina (2006/2007) 0,27 0,56 0,17 χ
2
(3)
= 11,43
**
ICD 102 100
Araras (2003/2004) 0,77 0,23 χ
2
(1)
= 2,56
ns
Araras (2005) 0,69 0,31 χ
2
(1)
= 0,43
ns
Araras (2006/2007) 0,65 0,35 χ
2
(1)
= 2,09
ns
T. aurifrons
Rifaina (2004/2005) 0,63 0,37 χ
2
(1)
= 3,56
ns
Rifaina (2006/2007) 0,73 0,27 χ
2
(1)
= 0,09
ns
EST-1 100 90
Araras (2003/2004) 0,69 0,31 χ
2
(1)
= 12,91
***
Araras (2005/2006) 0,92 0,08 χ
2
(1)
= 0,10
ns
EST-2 105 100 85
Araras (2003/2004) 0,13 0,75 0,12 χ
2
(3)
= 10,19
**
Araras (2005/2006) 0,23 0,60 0,17 χ
2
(3)
= 2,97
ns
PGM 102 100 95
Araras (2003/2004) 0,01 0,93 0,05 χ
2
(3)
= 4,49
ns
Araras (2005/2006) 0,07 0,93 χ
2
(3)
= 0,13
ns
ICD 105 100
Araras (2003/2004) 0,74 0,26 χ
2
(1)
= 0,01
ns
T. nitidum
Araras (2005/2006) 0,50 0,50 χ
2
(1)
= 2,57
ns
HW: ns = não significativo,
*
P<0.05,
**
P<0.01,
***
P<0.001.
113
Tabela VII. Heterozigosidade intra-loco observada e esperada e heterozigosidade média (± Erro padrão) em espécies de Trypoxylon coletadas em três localidades do estado
de São Paulo durante três anos. *Valores significativos de χ
2
.
Heterozigosidade Heterozigosidade Heterozigosidade
Espécies
Localidade
Época
Loco
Obs. Esp.
Localidade
(Época) Obs. Esp.
Localidade
(Época) Obs. Esp.
EST-2 0,10 0,24* 0,18 0,21 0,35 0,32
PGM 0,18 0,23 0,23 0,30 0,36 0,34
Araras
(Total)
ICD
0,20 0,20
Rifaina
(Total)
0,19 0,22
São Carlos
(Total)
0,20 0,17
Média 0,034 0,048 Média 0,043 0,052 Média 0,065 0,059
EP 0,021 0,020 EP 0,020 0,020 EP 0,021 0,021
EST-2 0,09 0,26* 0,21 0,23
PGM 0,16 0,21 0,23 0,27
Araras
(2003/2004)
ICD
0,23 0,18
Rifaina
(2004/2005)
0,16 0,24
Média 0,034 0,046 Média 0,043 0,053
EP 0,021 0,020 EP 0,020 0,020
EST-2 0,09 0,19 0,16 0,20
PGM 0,17 0,24 0,23 0,30
Araras
(2005)
ICD
0,25 0,22
Rifaina
(2006/2007)
0,21 0,20
Média 0,036 0,046 Média 0,043 0,050
EP 0,022 0,020 EP 0,020 0,020
EST-2 0,15 0,24
PGM 0,30 0,29
Araras
(2006/2007)
ICD
0,05 0,24
Média 0,036 0,055
T. aurifrons
EP 0,024 0,020
EST-1 0,09 0,19
EST-2 0,18 0,23
PGM 0,06 0,07
Araras
(Total)
ICD 0,18 0,22
Média 0,039 0,178
EP 0,017 0,004
T. nitidum
Araras EST-1 0,09 0,22
114
EST-2 0,15 0,21
PGM 0,05 0,06
(2003/2004)
ICD 0,20 0,19
Média 0,038 0,052
EP 0,067 0,090
EST-1 0,08 0,08
EST-2 0,25 0,29
PGM 0,08 0,07
Araras
(2005/2006)
ICD 0,14 0,26
Média 0,042 0,054
EP 0,077 0,102
EST-2 0,18 0,27
PGM 0,06 0,06
MDH 0,16 0,14
Média 0,022 0,157
T. lactitarse
Araras
(Total)
EP 0,056 0,106
115
Tabela VIII. a) Valores de F
st
par-a-par para as subpopulações de Trypoxylon aurifrons e Trypoxylon nitidum
analisadas para alozimas, provenientes de duas localidades do estado de São Paulo. As letras sobrescritas
indicam a significância dos valores de χ
2
.
T. aurifrons
Araras (2003/2004) Araras (2005)
Araras (2005) 0,00884
a
Araras (2006/2007) 0,02677
b
-0,02394
c
T. aurifrons
Rifaina (2004/2005)
Rifaina (2006/2007) 0,04767
d
T. nitidum
Araras (2003/2004)
Araras (2005/2006) 0.01869
e
a
= 0,42040;
b
= 0,48044;
c
= 0,92205;
d
= 0,00059;
e
= 0,0086.
Tabela IX – Parentesco médio entre as fêmeas de Trypoxylon que emergiram de mesmo ninho, coletadas em
duas localidades do estado de São Paulo. N = número de fêmeas analisadas por ninho; R (±EP) = grau de
parentesco médio e erro-padrão (Jackknife sobre ninhos); IC 95% = intervalo de confiança.
Araras Rifaina
Ninho N R (±EP) IC 95% Ninho N R (±EP) IC 95%
T. aurifrons T. aurifrons
34 3 1 2 5 0,34 (0,13) -0,68 a 0,66
117 3 1 23 3 -0,77 (0,94) -0,97 a 1,00
118 3 1 411 3 1
219 4 0,28 (0,32) -0,61 a 0,88 571 3 0,12 (0,32) -1,08 a 1,00
287 3 0,50 (0,21) -0,80 a 1,00 160 3 0,78 (0,06) -1,18 a 1,00
291 4 0,19 (0,40) -0,58 a 0,85 1263 4 0,81 (0,02) -0,81 a 0,78
445 5 -0,78 (0,99) -0,44 a 0,72 1264 4 0,60 (0,06) -0,81 a 0,78
506 3 1 1265 3 1
509 4 0,09 (0,51) -0,57 a 0,88 1335 5 1
589 4 0,12 (0,50) -0,55 a 0,84 12 4 0,81 (0,01) -0,81 a 0,75
592 3 1 17 3 0,63 (0,09) -1,21 a 1,00
805 3 1 286 4 0,78 (0,16) -0,80 a 0,78
1005 5 0,55 (0,09) -0,49 a 0,71 289 4 1
1200 3 1 1183 4 0,30 (0,19) -0,79 a 0,78
1218 3 1 1202 6 0,47 (0,04) -0,59 a 0,56
T, nitidum 1205 4 0,46 (0,11) -0,79 a 0,78
18 3 1 1213 3 0,29 (0,11) -0,10 a 1,00
45 3 -0,03 (0,69) -1,98 a 1,00 410 5 0,11 (0,29) -0,63 a 0,60
91 5 0,34 (0,44) -0,96 a 1,00 1431 3 0,66 (0,09) -1,10 a 1,00
92 5 -0,88 (0,98) -0,89 a 1,00
101 4 1
118 4 1
125 4 1
285 6 1
288 7 1
289 8 0,33 (0,32) -0,69 a 1,00
372 3 1
404 4 0,14 (0,57) -1,42 a 1,00
429 5 1
503 6 0,26 (0,41) -0,91 a 0,95
116
515 3 0,48 (0,42) -1,72 a 1,00
546 3 1
582 7 1
583 4 1
586 3 1
T, lactitarse
706 5 0,16 (0,44) -1,33 a 0,81
724 3 -0,18 (0,61) -0,88 a 1,00
795 3 -0,25 (0,87) 1,94 a 1,00
796 3 0,69 (0,23) -1,58 a 1,00
830 4 -0,25 (0,88) -0,96 a 1,00
879 3 1
1050 3 0,81 (0,14) -1,58 a 1,00
1084 5 0,47 (0,15) -1,25 a 0,81
1323 3 1
1588 3 -0,25 (0,88) -0,83 a 1,00
1590 3 0,37 (0,33) -0,88 a 1,00
1591 6 0,88 (0,02) -0,76 a 0,75
1653 4 0,69 (0,16) -1,76 a 1,00
117
Tabela X. Ninhos cujos fenótipos aloenzimáticos indicam acasalamentos extra-par de fêmeas das espécies de
Trypoxylon amostradas em duas localidades do estado de São Paulo. Os possíveis fenótipos parentais estão
também apresentados.
Espécie Localidade Amostra Sexo
EST-2 PGM ICD
T. aurifrons Araras 219.1 M 100 95 102
219.2 F 100/100
100/100
102/100
219.4 F 100/100
95/95
102/102
219.5 F 100/100 100/100 -
219.6 F 100/100 100/95 102/100
Mãe 100/100 100/95 102/100
Pai 100
100 e 95
102
291.1 F 85/85 100/100 102/102
291.2 F 85/85 100/100 102/102
291.3 F
85/85 100/95
102/102
291.4 M 85 100 102
291.5 M 100 100 102
291.6 F
105/100 110/100
102/102
Mãe 100/85 100/95 102/102
Pai
105 e 85 110 e 100
102
506.1 M 100 100 100
506.3 F
100/100 100/100
102/100
506.6 F 105/100 100/100 102/100
506.7 F
105/105 105/105
102/100
Mãe 105/100 105/100 100
Pai
105 e 100 105 e 100
102
509.1 M 100 100 102
509.2 F 105/105 100/100 102/102
509.3 F 105/100
100/100
102/102
509.4 F 105/100
105/105
102/102
509.5 F 105/100 100/100 102/102
Mãe 105/100 105/100 102/102
Pai 105
105 e 100
102
526.2 M 105 100 -
526.3 M 105 100 -
526.4 M 105 100 102
526.5 F 105/105 100/100
102/102
526.6 F 105/105 100/95
100/100
Mãe 105_ 100/95 102
Pai 105 100
102 e 100
805.1 F 100/100 100/100
100/100
805.2 M 100 100 102
805.4 F 100/100 100/100
102/102
805.5 F 100/100 100/100 102/100
Mãe 100_ 100_ 102/100
Pai 100 100
102 e 100
1005.3 M 100 100 102
1005.4 F 100/100 95/95 102/102
1005.5 F 100/100 100/100 102/100
118
1005.6 F 100/100 100/95 102/102
1005.7 F 100/100 100/95 102/102
1005.9 F 100/100 100/95 102/102
Mãe 100 100/95 102/100
Pai 100 100 e 95 102
1021.6 F 100/100 100/95 102/100
1021.7 F 100/100
100/100
100/100
1115.2 M 85 100 100
1115.5 M 100 95 100
1118.1 F 100/85
95/95
102/100
1118.3 F 100/85
100/100
102/100
Mãe 100_ 100/95 102_
Pai 85
100 e 95
100
Rifaina 2.1 M 100 95 -
2.3 M 100 100 -
2.4 F 85/85 100/95 -
2.5 F 100/85 95/95 -
2.7 F
105/100
100/95 -
2.8 F
100/85
95/95 -
2.9 F 105/100 95/95 -
Mãe 100/85 100/95
Pai
85 e 105
95
171.1 M 100 100 100
171.2 F 100/85 100/95 100/100
171.3 F 100/85 100/100 102/100
171.4 F 100/85
100/95
102/100
171.5 F 100/100
105/100
100/100
Mãe 100/85 100/95 102/100
Pai 100
105 e 100
100
284.1 M 85 100 100
284.2 M 85 100 100
284.3 F 100/85
95/95
100/100
284.4 F 100/85
100/100
100/100
284.5 M 85 100 100
Mãe 85/85 100/95 100/100
Pai 100
100 e 95
100
286.1 F 100/85
100/100
102/100
286.2 F 100/100 100/95 102/100
286.3 F 100/100 100/95 102/100
286.5 M 85 95 102
286.6 F 100/100
95/95
102/100
Mãe 100/85 100/95 100
Pai 100
100 e 95
102
951.2 M
85/85 100/100
102/102
951.3 M 100 95 102
951.6 F
100/100
100/95 102/100
951.7 F 100/85 100/100 102/102
951.9 F 100/100
95/95
102/100
Mãe 100/85 100/95 102/100
119
Pai
100 e 85 100 e 95
102
955.1 M 100 100 102
955.2 F 100/100 100/95
102/102
955.8 F 100/100
95/95 100/100
955.9 F 100/100
100/100
102/100
Mãe 100/100 100/95 102/100
Pai 100
100 e 95 102 e 100
1052.1 M 105 105 102
1052.2 F 105/100 105/100
102/102
1052.3 F 105/100 105/105
100/100
Mãe 105/105 105/100 102/100
Pai 100 105
102 e 100
1202.1 M 100 105 102
1202.2 F 100/85 105/100 102/100
1202.3 F 100/85
100/95
102/100
1202.4 F 100/85
105/100
102/100
1202.5 F 100/85 105/100 102/100
1202.6 F 100/85 105/100 102/100
1202.7 F 100/85
100/100
102/100
Mãe 100_ 105/100 102_
Pai 85
100 e 95
100
1203.1 M 85 100 100
1205.1 M 85 100 100
1205.2 F 100/85
105/105
102/100
1205.3 F 100/85 105/100 102/100
1205.4 F 100/85
100/100
102/100
1205.5 M 85 100 100
1205.6 F 100/85 105/100 102/100
1205.7 M 85 100 100
1205.8 M 85 100 100
Mãe 85/85 105/100 100
Pai 100
105 e 100
102
1233.5 F 105/85 100/95 102/100
1233.6 F
105/85
100/95 102/100
1233.7 M 100 100 100
1233.8 F
100/100
100/100 102/100
Mãe
105/100
100/95 100
Pai
100 e 85
100 102
1264.1 M 100 100 102
1264.2 F
100/85
105/100 102/102
1264.3 F
100/100
105/100 102/100
1264.4 F
105/100
105/100 102/102
1264.5 F
100/100 100/100
102/100
1264.6 F 105/100
105/105
102/102
1264.7 F 100/100 105/105 102/102
Mãe 105/100 105/100 102/100
Pai
100 e 85 105 e 100
102
Espécie Localidade Amostra Sexo
EST-1 EST-2 PGM ICD
T. nitidum Araras 35.1 M - 105 100 -
120
35.2 F -
100/85 100/100
-
35.5 F -
105/105 102/102
-
Mãe 105/100 100_
Pai
105 e 85 102 e 100
91.1 F 90/90 105/100 100/95 100/100
91.2 F - 100/100 100/95 100/100
91.3 F - 100/100 95/95 100/100
91.5 M - 100 95 100
91.6 F 90/90 100/100
102/95
100/100
91.7 F 90/90 100/100
100/100
100/100
Mãe 90 100/100
100/95
100/100
Pai 90 100
102 e 100
100
92.1 F - 100/100 100/95 100/100
92.2 F - 100/100 100/95 100/100
92.3 M - 100 95 100
92.4 M - 100 95 100
92.5 M - 100 95 100
92.6 F -
100/100
95/95 100/100
92.7 F -
105/85
100/95 100/100
92.8 F - 105/85 100/95 100/100
Mãe 105/100 100/95 100/100
Pai
100 e 85
95 100
289.1 M 90 100 100 100
289.2 M 100 100 100 100
289.4 F 100/90 100/100 100/100 100/100
289.5 F 90/90 100/100 100/100 100/100
289.6 F 90/90 100/100 100/100 100/100
289.7 F 100/90 100/100 100/100 100/100
289.8 F 100/90
100/100
100/100 100/100
289.9 F
90/90 85/85
100/100 100/100
289.11 F
100/100
100/85 100/100 100/90
289.12 F 100/90 100/100 100/100 100/100
Mãe 100/90 100/85 100/100 100/90
Pai
100 e 90 100 e 85
100 100
370.1 M 90 85 100 100
370.4 F 100/100
85/85
100/100 100/100
370.6 F 100/90
100/100
100/100 100/100
Mãe 100/90 100/85 100/100 100/100
Pai 100
100 e 85
100 100
404.1 M 100 85 100 90
404.1 M 100 100 100 100
404.2 F 100/100
85/85
100/100 90/90
404.4 M 100 100 100 90
404.5 F 100/100
100/100
100/100 100/90
404.6 F 100/90 100/85 100/100 100/90
404.7 M 100 85 100
404.8 F 100/90 100/85 100/100 90/90
404.9 M 100 100 100 90
404.11 M 100 100 100
121
Mãe 100/90 100/85 100/100 100/90
Pai 100
100 e 85
100 90
Espécie Localidade Amostra Sexo
MDH EST-2 PGM
T. lactitarse Araras 706.1 M 110 100 100
706.3 F 110/100
100/100
105/100
706.4 F 110/100
95/95
105/100
706.5 F 110/100 100/95 105/100
706.7 F 110/100 95/95 105/100
706.9 F 110/100 100/95 105/100
Mãe 110/110 100/95 100/100
Pai 100
100 e 95
105
795.2 M 110 95 100
795.3 M 110 100 100
795.5 M 110 100 100
795.6 F 110/110 100/100 100/100
795.7 M 110 100 100
795.8 M 110 95 100
795.9 F 110/110
100/100 100/100
795.10. F 110/110
95/95 105/100
Mãe 110/110 100/95 100/100
Pai 110
100 e 95 105 e 100
812.1 M 110 100 100
812.2 M 110 110 100
812.3 F
110/100 110/95
100/100
812.5 M 110 100 100
812.6 M 110 110 100
812.7 M 110 100 100
812.8 F 110/110 110/110 100/100
Mãe 110/110 110/100 100/100
Pai
110 e 100 110 e 95
100
830.1 M 110 95 100
830.2 M 110 95 100
830.3 M 110 100 100
830.4 F 110/110 100/100 100/100
830.5 F 110/110 95/95 100/100
830.6 M 110 95 100
830.7 M 110 95 100
830.8 F 110/110
95/95
100/100
830.9 F 110/110
100/100
100/100
830.10. M 110 100 100
Mãe 110/110 100/95 100/100
Pai 110
100 e 95
100
1588.1 M 110 95 100
1588.3 F 110/100
95/95
100/100
1588.4 M 110 100 100
1588.6 F 110/100 95/95 100/100
1588.7 F 110/110
100/100
105/100
Mãe 110/100 100/95 100/100
Pai 110
100 e 95
100
122
Tabela XI. Ninhos em que os fenótipos aloenzimáticos observados indicam associação de fêmeas e/ou
usurpação de ninhos das espécies de Trypoxylon amostradas em Araras – SP.
Espécie Amostra Sexo
EST-2 PGM ICD MDH
T. aurifrons 445.1 M 110 95 102
445.2 F
100/85
100/95 102/100
445.3 F
110/110
100/100 102/102
445.4 F
105/105
100/95 102/102
445.5 F 110/100 100/95 102/102
445.6 F 105/100 100/95 102/102
T. lactitarse
724.2 M 95 100
100
724.3 M
95
100
100
724.4 M 100 100
110
724.5 F 95/95 100/100
110/110
724.6 F 110/110 100/100
110/100
724.7 M
100
100
110
724.8 F 110/110 100/100
110/110
724.9 M
110
100
110/100
850.1 M
110
100 110
850.2 M
100
100 110
850.3 M
95
100 110
850.4 F 110/95 100/100 110/100
850.5 F 95/95 100/100 110/100
850.6 M 95 100 110
850.1 M 110 100 110
123
Figura 1. Padrão eletroforético de a) esterase, b) fosfoglicomutase, e c) isocitrato desidrogenase em extratos de
Trypoxylon aurifrons obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 7,5.
Figura 2. Padrão eletroforético de a) esterase, b) fosfoglicomutase e c) isocitrato desidrogenase em extratos de
Trypoxylon nitidum obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 7,5.
EST-2
105
PGM
105
PGM
110
PGM
95
b)
ICD
102
ICD
100
c)
EST-2
100
EST-2
85
PGM
100
a)
EST-2
105
PGM
105
PGM
110
PGM
95
b)
ICD
102
ICD
100
c)
EST-2
100
EST-2
85
PGM
100
a)
EST-1
100
EST-1
90
EST-2
105
EST-2
100
EST-2
85
PGM
100
PGM
95
PGM
102
ICD
90
ICD
100
b) c)a)
EST-1
100
EST-1
90
EST-2
105
EST-2
100
EST-2
85
PGM
100
PGM
95
PGM
102
ICD
90
ICD
100
b) c)a)
124
Figura 3. Padrão eletroforético de a) esterase, b) fosfoglicomutase e c) malato desidrogenase em extratos de
Trypoxylon lactitarse obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 8,0.
MDH
110
c)
MDH
100
EST-2
95
EST-2
100
EST-2
110
EST-1
a)
PGM
105
PGM
100
b)
MDH
110
c)
MDH
100
EST-2
95
EST-2
100
EST-2
110
EST-1
a)
PGM
105
PGM
100
b)
125
Figura 4. Padrão eletroforético de a) esterase, b) isocitrato desidrogenase, c) malato desidrogenase, d)
fosfoglicomutase-2, e) fosfoglicomutase-1 e f) β-hidroxibutirato desidrogenase em extratos de Trypoxylon
rogenhoferi obtido em gel de amido em tampão tris-citrato pH 7,5.
PGM-2
110
d)
PGM-2
100
PGM-1
105
PGM-1
100
e)
β-HBDH
110
β-HBDH
100
f)
PGM-2
110
d)
PGM-2
100
PGM-1
105
PGM-1
100
e)
β-HBDH
110
β-HBDH
100
f)
ICD
110
ICD
100
ICD
90
b)
MDH
100
MDH
110
c)
EST-1
110
EST-1
100
EST-1
90
a)
ICD
110
ICD
100
ICD
90
b)
MDH
100
MDH
110
c)
EST-1
110
EST-1
100
EST-1
90
a)
126
4.6 Caracterização do DNA mitocontrial de Trypoxylon (Trypargilum) nitidum
(Hymenoptera: Crabronidae)
4.6.1 Introdução
O DNA mitocondrial das células animais é uma molécula circular, de fita
dupla, pequena, podendo variar de 6 Kb a 2000Kb (Brown 1983; Nahum 2001; Palmer
et al.
2000; Parker
et al. 1998), tendo uma estrutura simples (não possui DNA repetitivo,
transposons, íntrons ou pseudogenes). É um genoma haplóide, possui herança materna, não
apresenta recombinação. Esta molécula possui altas taxas de substituição, de inserções e
deleções, que fazem com que seqüências mitocondriais modifiquem-se de forma mais rápida
do que seqüências nucleares, tendo assim altas taxas de evolução (Ballard e Whitlock 2004;
Hurst e Jiggins 2005; Moritz
et al. 1987; Sbisá et al. 1997). Estas características fazem do
mtDNA uma molécula extremamente útil para as análises de alta resolução do processo
evolutivo.
O conteúdo em termos de genes é extremamente conservado, cerca de 90% do
genoma consiste de regiões codificantes, apresentando dois genes para subunidades
ribossômicas (12S e 16S), 22 para os RNA transportadores (tRNA), três para as subunidades
da enzima citocromo oxidase (COI, II e III), um para o citocromo B, dois para as subunidades
da ATPase (6 e 8) e sete para as subunidades da NADH desidrogenase. Existindo também
uma região não-codificadora, rica em A+T nos invertebrados, responsável pela origem da
replicação e transcrição da molécula (Moritz
et al. 1987; Nahum 2001) (Figura 1).
Figura 1. Representação do DNA mitocondrial de Apis mellifera. Fonte: http://inapicoltura.org
127
Algumas de suas seqüências são extremamente conservadas. Assim,
comparações de genótipos nucleares e mitocondriais podem ajudar a reconhecer indivíduos
híbridos, acasalamentos preferenciais e efeitos estocásticos sobre variantes para os quais o
táxon ancestral era polimórfico, podendo-se gerar inferências filogenéticas (Sunnucks 2000).
Por outro lado, muitas seqüências do genoma nuclear constituem uma fonte
rica de marcadores genéticos devido ao alto grau de variabilidade que possuem. Dessa forma,
esses marcadores vêm proporcionando avanços no estudo de genética de populações (Arias e
Infante-Malachias 2001; Pereira 2000).
Este trabalho teve como objetivo amplificar o genoma mitocondrial de
Trypoxylon nitidum, a partir da utilização de primers heterólogos e apresentar algumas
seqüências de parte deste genoma.
4.6.2 Material e Métodos
Amostras e Extração de DNA.
Foram amostrados 18 indivíduos de T.
nitidum
, coletados por meio de ninhos-armadilha em duas regiões do estado de São Paulo: 13
em Araras (22º18’S, 47°22’W, 629 m) e cinco em São Carlos (22°01’S, 47º53’W, 850 m).
A extração total do DNA seguiu o protocolo de Sheppard e McPheron (1991),
com pequenas modificações, como o acréscimo de 1 µl de proteinase K (20mg/ml) por 200 µl
de solução. Esse protocolo é baseado em extrações sucessivas com fenol e clorofórmio, e
apresenta um rendimento muito maior por tórax macerado, bem como uma maior quantidade
do DNA obtido.
Amplificação por PCR (“Polymerase chain reaction”). Para a amplificação
do genoma mitocondrial foram utilizados
primers universais derivados de insetos (“UBC
Insect Mitochondrial DNA
Primers Kit”) (Simon et al., 1994) e outros desenhados no
laboratório de Genética e Evolução de Abelhas (Tabela I). Foram amplificados fragmentos
que compreendem os genes: cytB, ND2, COI, COII e 16S.
128
Tabela I. Pares de primers testados para a amplificação do genoma mitocondrial via PCR de Trypoxylon
nitidum, suas localizações (genes onde se ancoram), seqüências e referências bibliográficas.
Código Nome
Seqüência (5’
→3’)
Referência
Genes
Principais
A
mtD 2
mtD 9
GCTAAATAAGCTAACAGGTTCAT
CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC
(Simon et al. 1994) ND2, COI
B
COI-IIF
mtD18
TCTATACCACGACGTTATTC
CCACAAATTTCTGAACATTGACCA
(Hall e Smith 1991)
(Simon
et al. 1994)
COII
C
mtD19
mtD 22
GAAATTTGTGGAGCAAATCATAG
TCAACAAAGTGTCAGTATCA
(Simon et al. 1994)
ATPases 8 e
6, COIII
D
Seq 18
8467 F
GAACTATCAATTTGATATTG
GGAATTTTTTTTTGAATGAAA
(Francisco et al. 2001) ND3, ND5
E
mtD 24
mtD 28
GGAGCTTCAACATGAGCTTT
ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
(Simon et al. 1994)
ND4, ND6,
cytB
F
mtD 26
mtD 30
TATGTACTACCATGAGGACAAATATC
ATTCAGGATCGTAAAGGTCC
(Simon et al. 1994) cytB, ND1
G
Mel 3
16S F
TAAAGTTAAAAAAGCAACTC
CACCTGTTTATCAAAAACATGTCC
(Francisco et al. 2001)
(Hall e Smith 1991)
ND1, 16S
H
16S R
mtD 36
CGTCGATTTGAACTCAAATCATG
AAACTAGGATTAGATACCCTATTAT
(Hall e Smith 1991)
(Simon
et al. 1994)
16S, 12S
I
mtD 8
mtD 12
CAACATTTATTTTGATTTTTTGG
TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA
(Simon et al., 1994) COI
J
Seq 21
Mel 2
CTATTAAAACAATTGGTCATC
TGGAAAAATAATAATTG
(Silvestre e Arias, não
publicado)
COI
K
mtD 35
mtD 3
AAGAGCGACGGGCGATGTGT
TGGGGTATGAACCCAGTAGC
(Simon et al. 1994) A+T
L
AMB 01
AMB 02
TGATAAAAGAAATATTTTGA
CATGATCCTGGGGTACTT
(Arias et al. 1998) ND2
M
8321 R
mtD 23
TTATATATCTAATTCTAT
GCTAATATAGCAGCTCCTCC
(Silvestre e Arias, não
publicado)
(Simon
et al. 1994)
ND4
N
mtD 24
mtD 27
GGAGCTTCAACATGAGCTTT
CCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA
(Simon et al. 1994) ND4, ND6
O
AMB 19
16S F
AAATCCAAATCAAGGATACA
CACCTGTTTATCAAAAACATGTCC
(Arias et al. 1998)
(Hall e Smith 1991)
ND1, 16S
As reações de PCR foram realizadas num volume total de 50µl, contendo 2,5
µl de tampão de reação
Taq com KCl; 2,5µl de tampão de Taq com (NH
4
)
2
SO
4
; 5 µl de
dNTPs 2mM de cada; 3,0µl de MgCl
2
25mM; 2,5µl de cada primer 20 µM; 2,5 U de Taq
129
DNA polimerase (Kit Fermentas); de 1µl de DNA, e o volume final foi completado com H
2
O
deionizada e estéril. As condições de amplificação foram: desnaturação inicial por 5 min a
94°C, seguindo para 35 ciclos de: desnaturação a 94°C (1 min); anelamento a 42°C (1 min e
20 seg) e elongação a 64°C (2 min). Por fim, foi realizado um passo extra de extensão a 64°C
por 10 min.
Os produtos amplificados foram analisados eletroforeticamente em gel de
agarose 0,8%, posteriormente corado com brometo de etídeo. Os fragmentos foram
visualizados em luz ultravioleta (UV) e registrados com o auxílio de uma câmara digital
Canon.
Clonagem dos produtos de PCR e identificação dos plasmídeos
recombinantes.
Os fragmentos resultantes da reação de PCR foram ligados em plasmídeo
específico: pGem-T Easy Vector System (PROMEGA). As reações seguiram as instruções do
fabricante. Para obter um DNA mais limpo e concentrado, foi realizada uma precipitação do
DNA: 40 µl do produto de PCR foram precipitados com 10 µl de acetato de amônio 7,5 M
(temperatura ambiente) e 100 µl de etanol absoluto (temperatura ambiente). Esta mistura foi
deixada por 5 min., à temperatura ambiente. Em seguida, foi centrifugado a 12000 rpm por 5
min., à temperatura ambiente, e o sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado com 100
µl de etanol 70 %, e em seguida centrifugado a 12000 rpm por 5 min. Por fim, o precipitado
foi seco à vácuo e ressuspendido em 10 µl de 1X TE (10mM Tris e 1mM EDTA), dos quais 3
µl foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% para uma quantificação visual
antes de montar as ligações.
A preparação de células competentes de
Escherichia coli foi realizada de
acordo com o protocolo descrito por Sambrook
et al., (1989). Estas células foram
posteriormente transformadas com os plasmídeos recombinantes de acordo com o seguinte
protocolo: 100 µl de células foram incubados com 30 ng de plasmídeo recombinante por 15
min. no gelo, em seguida a 37 °C por 5 min. e por mais 15 min. no gelo; 250 µl de meio LB
foram acrescentados (à temperatura ambiente); seguiu-se uma incubação a 37 °C sob agitação
por uma hora; as células foram plaqueadas em meio LB-ágar com ampicilina (0,15 mg/ml) e
X-Gal (0,10 mg/ml) e incubadas durante a noite a 37°C. Em média, 10 colônias brancas
(contendo plasmídeo recombinante) de cada transformação foram inoculadas em 5 ml de meio
LB e incubadas durante a noite a 37ºC sob agitação.
Os plasmídeos recombinantes foram extraídos por meio de minipreps de
acordo com o protocolo descrito no manual Automated DNA Sequencing Chemistry Guide da
130
Perkin Elmer Corporation. Para a certificação do tamanho do inserto, uma alíquota de 10 %
do volume de cada miniprep foi digerida com 5 U da enzima de restrição
Eco RI. Vale
observar que os vetores utilizados apresentam dois sítios de restrição para essa enzima, os
quais flanqueiam o inserto; assim quando ocorre a digestão, o inserto é isolado do plasmídeo.
Após uma hora de digestão, o processo foi interrompido e as digestões submetidas à
eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os géis foram corados com brometo de etídeo e os
fragmentos visualizados através de luz ultravioleta (UV). Foram considerados positivos os
clones que apresentaram os insertos de tamanho compatível com o produto de PCR
correspondente.
Seqüenciamento automático. Os clones positivos foram seqüenciados
utilizando-se o conjunto de reagentes “Big Dye Terminator v.3.1” (Applied Biosystems) para
seqüenciamento automático. Esse conjunto é baseado na incorporação de dideoxinucleotídeos
marcados com fluorocromos (
dye terminators). As condições foram otimizadas com o
propósito de utilizar apenas 25% da quantidade recomendada de reagentes, e
conseqüentemente maximizando o aproveitamento do material. As concentrações de DNA
molde e de
primer seguiram as instruções do fabricante.
As amostras foram analisadas em um seqüenciador automático, modelo ABI-
PRISM 3100 (Perkin Elmer). Foram utilizados nas reações os
primers universais
complementares à região do plasmídeo (M13 forward e M13 reverse). Para cada região foram
seqüenciadas e alinhadas as duas fitas de DNA de um mínimo de dois clones, para uma maior
precisão da seqüência.
Alinhamento de nucleotídeos. O alinhamento das seqüências de DNA foi
realizado para cada gene individualmente, usando-se o programa de alinhamento CLUSTAL
W (Thompson
et al. 1994) e ajustado manualmente.
4.6.3 Resultados
Dos 15 pares de
primers utilizados em T. nitidum, sete (B, C, D, F, H, I e L –
Código Tabela I) apresentaram padrão de amplificação dos fragmentos de mtDNA. Os
fragmentos obtidos apresentaram variações (pb) aos esperados para
A. mellifera (Tabela II).
131
Tabela II. Tamanho dos fragmentos esperado para Apis meliffera e observado em Trypoxylon nitidum obtidos
pela utilização dos pares de primers. O código segue na Tabela I.
Primers
(código)
Tamanho esperado
(pb)
Tamanho observado
(pb)
B 900 1.100
C 1.700 1.000
D 2.350 1.300
F 1.700 1.800
H 1.800 1.700
I 880 1.000
L 1.700
1.700
A revelação via gel de agarose corado com brometo de etídio dos fragmentos
de DNA amplificados via PCR permitiu a visualização do tamanho dos fragmentos de cada
região (Figuras 2a e b).
Figura 2. Padrão de amplificação dos locos flanqueados pelos primers: a) Seq18 + 8467 F e mtD 26 + ntD 30;
b) 16S R + mtD 36 e mtD 8 + mtD 12; A = água (controle negativo da PCR); M = marcadores (φX e λ-Hind).
De acordo com o mapa do mtDNA de
A. mellifera é esperado que as regiões
amplificadas em
T. nitidum tenham a seguinte distribuição (Figura 3). A partir destes
resultados, foram escolhidas as regiões C, D, F, H e I (Código Tabela I) do mtDNA de
T.
nitidum
para seqüenciamento, no entanto, resultado positivo foi encontrado apenas para as
regiões F e H.
AM
1300 pb
1800 pb
a)
Seq 18 + 8467 F mtD 26 + mtD 30
AM
1300 pb
1800 pb
a)
Seq 18 + 8467 F mtD 26 + mtD 30
1700 pb
1000 pb
b)
16S R + mtD 36
mtD 8 + mtD 12
AM
1700 pb
1000 pb
b)
16S R + mtD 36
mtD 8 + mtD 12
AM
132
Figura 3. Mapa do mtDNA de Apis mellifera e localização dos primers utilizados para amplificação dos
fragmentos de interesse em Trypoxylon nitidum que apresentaram sucesso (entre parênteses está o tamanho de
cada fragmento amplificado).
RNA Ribossômico – Subunidades 16S e 12S (parciais). Parte do gene do
RNA Ribossômico 12S foi estudado a partir da utilização dos pares de primers 16S R + mtD
36 (Código F – Tabela I).
Esta região flanqueia parte da região 16S e 12S (Figura 1). A
amplificação desta região gerou um fragmento em
T. nitidum que apresentou 1.700pb. Em
Apis mellifera o tamanho do fragmento observado é de aproximadamente 1.800pb.
Foram seqüenciados cerca de 1.000pb desta região. Esta porção do gene de
T.
nitidum
foi alinhada e comparada com A. mellifera (Figura 4).
(1.700pb)
amb 2
amb 1
mtD 8
mtD 12
(1.000pb)
COI-II F
mtD 18
(1.100pb)
(1.000pb)
mtD 22
mtD 19
SEQ 18
(1.300pb)
8467 F
8321 R
mtD 23
(1.000pb)
mtD 24
(1.300pb)
mtD 27
mtD 26
(1.800pb)
mtD 30
16S R
16S F
mtD 36
(1.700pb)
(1.700pb)
(1.700pb)
amb 2
amb 1
mtD 8
mtD 12
(1.000pb)
COI-II F
mtD 18
(1.100pb)
(1.000pb)
mtD 22
mtD 19
SEQ 18
(1.300pb)
8467 F
8321 R
mtD 23
(1.000pb)
mtD 24
(1.300pb)
mtD 27
mtD 26
(1.800pb)
mtD 30
16S R
16S F
mtD 36
(1.700pb)
(1.700pb)
133
Figura 4. Análise da região 16S+12S seqüenciada de Trypoxylon nitidum: alinhamento das seqüências de
nucleotídeos das espécies Ap (Apis mellifera) e Tn (Trypoxylon nitidum).
O tamanho dos fragmentos apresentou uma diferença de 56pb para as duas
espécies, sendo de
T. nitidum o maior fragmento. Das 247 substituições, 132 foram
sinônimas. Diferenças de tamanhos e substituições são passíveis nestas regiões comparadas
àquelas responsáveis por genes que codificam proteínas, pois não há comprometimento das
bases em formar os códons, mas apenas em gerar uma estrutura secundária adequada para a
sua função (Wolstenholme 1992). A diferença verificada pode ser considerada pequena, visto
que entre os genes codificadores para proteínas entre
A. meliffera e Melipona bicolor há
variaçõs de até 102 pb, no caso de Cyt B (Silvestre 2002).
134
Cyt B – Citocromo B – e Região ND1 – NADH desidrogenase subunidade
1 – (parciais).
Parte do gene para Cyt B e a região ND1 foram estudados a partir da utilização
dos pares de primers mtD 26 + mtD 30. A amplificação desta região gerou um fragmento em
T. nitidum que apresentou 1.800pb. Em Apis mellifera esta região apresenta 1.700pb.
Foram seqüenciados cerca de 600pb desta região. Esta porção do gene de
T.
nitidum
foi alinhada e comparada com A. mellifera (Figura 5).
Figura 5. Análise da região Cyt B+ND1 seqüenciada de Trypoxylon nitidum: alinhamento das seqüências de
nucleotídeos das espécies Ap (Apis mellifera) e Tn (Trypoxylon nitidum).
O tamanho dos fragmentos apresentou uma diferença de 48pb para as duas
espécies, sendo de
A. meliffera o maior fragmento. Das 240 substituições, 107 foram
sinônimas.
Os genes cyt B e ND1 estão entre os mais conservados do genoma
mitocondrial de insetos (Simon
et al. 1994) e este grande número de substituições foi um
achado inesperado.
135
4.6.4 Discussão
No presente estudo foi verificada a possibilidade de se utilizar
primers de
mtDNA heterólogos universais de insetos para estudos genéticos em
Trypoxylon nitidum,
indicando a possibilidade de ser densenvolver marcadores exclusivos para espécies deste
gênero.
O DNA mitocondrial tem confirmado ser uma importante ferramenta em
estudos populacionais e filogenéticos de insetos (Simon
et al. 1994). Diversos genes
mitocondriais de uma grande variedade de organismos já têm suas seqüências publicadas e os
genomas mitocondriais de muitas espécies já foram totalmente seqüenciados e estão dispostos
em bancos de dados. Em abelhas, contamos na literatura com a disponibilidade da seqüência
completa do mtDNA da abelha
Apis mellifera (Crozier e Crozier 1993), o seqüenciamento
completo de uma abelha sem ferrão,
Melipona bicolor (Silvestre e Arias, não publicado,
GenBank AF466146) e mais recentemente, o seqüenciamento completo do DNA mitocondrial
de
Bombus ignitus (Cha et al. 2007). Em vespas não parasitóides, poucos são os trabalhos que
relatam seqüências do DNA mitocondrial e nenhum relato é encontrado em
Trypoxylon.
A literatura que vem sendo reportada abre novas perspectivas para estudos
populacionais, filogenéticos e de evolução do comportamento social em himenópteros, além
de auxiliar no mapeamento de sítios de restrição e no desenho de
primers para amplificação
de regiões de interesse específico (Arias e Sheppard 1996; Arias e Sheppard 2005; Costa
et al.
2003; Fernandes-Salomão
et al. 2002; Raffiudin e Crozier 2007; Silvestre 2002). Esforços
adicionais são necessários para que novos dados possam se somar aos aqui apresentados para
Trypoxylon nitidum, de forma que em breve se possa contar com esta útil ferramenta para
estudos de Genética Evolutiva e de Populações deste importante grupo de vespas.
136
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
Desde que Richards (1934) sumarizou a maioria das observações publicadas
sobre o gênero
Trypoxylon, numerosos estudos foram surgindo e, a partir do trabalho de
Coville (1982), que resumiu os dados encontrados no subgênero
Trypargilum das espécies
norte-americanas, esforços foram investidos no conhecimento da biologia das espécies de
Trypoxylon das regiões temperadas.
Características particulares do grupo, tais como sazonalidade, forrageamento,
inimigos naturais, arquitetura intranidal, razão sexual, tempo de desenvolvimento e
comportamento de adultos são os principais alvos de estudo, os quais têm contribuído para o
conhecimento de aspectos ecológicos e evolutivos (padrões de riqueza e abundância, padrão
de distribuição temporal e espacial, interações inter- e intra-específicas, estabelecimento de
cadeias alimentares, investimento parental, cuidado parental, comportamento social) do
gênero
Trypoxylon e da ordem Hymenoptera.
Um dos aspectos mais interessantes deste gênero é o fato dos machos
permanecerem junto ao ninho enquanto a fêmea fundadora está forrageando. Do ponto de
vista evolutivo, este comportamento, muito raro entre os himenópteros, além de proteger a
prole contra parasitóides e outros inimigos naturais, pode assegurar ao macho a paternidade
da prole feminina.
Até o momento, a maioria dos estudos em
Trypoxylon buscou estudar a
biologia de nidificação destas espécies e poucas são as que buscaram estabelecer o significado
funcional do comportamento de macho-guarda (Coville e Coville 1980; Brockmann 1992;
Brockmann e Grafen 1989). Apenas Peruquetti (2003), utilizando marcadores genéticos,
objetivou investigar a associação deste comportamento e a garantia da paternidade.
O presente trabalho relata dados sobre a biologia de nidificação de espécies de
Trypoxylon que ainda não eram conhecidos na literatura (T. aurifrons e T. nitidum) e contribui
com novas informações sobre espécies já estudadas (
T. rogenhoferi e T. lactitarse). Podem ser
citadas as seguintes contribuições para o conhecimento das vespas do gênero
Trypoxylon:
•
Dados sobre a sazonalidade, distribuição espacial, forrageamento e
inimigos naturais de quatro espécies de
Trypoxylon coletadas em três
regiões do estado de São Paulo. Foram verificados padrões de
distribuição e forrageamento espécie-específicos e inimigos naturais
137
comuns. Os dados produzidos sugerem a ocorrência de competição
aparente entre as espécies deste grupo;
•
Aspectos da biologia de nidificação e arquitetura intranidal de T.
aurifrons
, espécie pouca conhecida da literatura;
•
Descrição dos tipos de pupários de T. rogenhoferi e T. lactitarse e
verificação do efeito do diâmetro do tubo e do sexo na sua
determinação;
•
Informações para as quatro espécies de Trypoxylon sobre o dimorfismo
sexual, a razão sexual e fatores que afetam seu desvio. Verificação do
investimento parental sazonal, da herdabilidade para tamanho de corpo
e sua possível relação com o sucesso reprodutivo;
•
Caracterização dos padrões de alozimas de espécies ainda não
estudadas geneticamente (
T. lacitarse, T. aurifrons e T. nitidum). Com
esta metodologia, foi possível verificar que, embora a maioria dos
ninhos apresentem progênies que se ajustam a um padrão de
monogamia/monandria, foi observado ninhos com acasalamentos extra-
par.
Desta forma, concluimos que fatores sazonais apresentam grande influência
sobre os aspectos da biologia de nidificação de
T. rogenhoferi, T. lactitarse, T. aurifrons e T.
nitidum
- estas espécies nidificam preferencialmente na estação quente-chuvosa. Foi visto que
o padrão de distribuição espacial destas espécies pode ser definido por uma competição
aparente, mediada pela existência de inimigos naturais comuns, uma vez que estas não
competem por presas e tubos para nidificação. A razão sexual destas espécies não difere de
1:1 e, sendo as fêmeas significativamente maiores que os machos, maior alocação de recursos
é desviada para este sexo nas quatro espécies estudadas. Além disso, a observação de que
qualidade e quantidade da prole mostraram-se associadas, é um resultado importante a ser
explorado em trabalhos futuros. Por fim, as análises genéticas indicaram a influência do
método de coleta sobre a estrutura populacional, a existência de machos diplóides e
acasalamentos extra-par.
Diante destes achados, este trabalho abre perspectivas para estudos
subseqüentes, que exigirão a utilização de metodologias mais adequadas para responder
questões ainda não esclarecidas em
Trypoxylon:
138
• O acompanhamento diário da nidificação será requerido para responder
as questões sobre o tempo de construção do ninho e o tempo de
desenvolvimento dos imaturos. Além disso, a observação, marcação e
captura dos parentais esclarecerão acerca da alocação de recursos destas
espécies, contribuindo para a estimativa da herdabilidade para tamanho
de corpo por meio de regressão linear entre parentais e progênie e
verificando a relação existente entre quantidade e qualidade da prole.
Estes métodos permitirão ainda verificar o comportamento de machos e
fêmeas durante a nidificação.
•
A utilização de outros marcadores genéticos, como o DNA
mitocondrial, permitirá verificar a estrutura da população destas vespas,
caracterizando comportamentos de dispersão ou filopatria. Além disso,
análises de parentesco por marcadores mais eficientes, como
microssatélites espécie-específicos, permitirão estabelecer a genética da
prole e dos respectivos parentais.
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