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1
MICHELE PACHECO GARCIA
ALTERAÇÕES FISIOLÓGI
CAS E AVALIAÇÃO DO E
STRESSE
OXIDATIVO DURANTE O
DESENVOLVIMENTO E A
SENESCÊNCIA DE FOLHA
S DE SOJA,
GLYCINE MAX
L.
VIÇOSA
MINAS GERAIS
–
BRASIL
2009
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal, para obtenção
do título de
Magister Scientiae
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2
MICHELE PACHECO GARCIA
ALTERAÇÕES FISIOLÓGI
CAS
E AVALIAÇÃO DO ESTR
ESSE
OXIDATIVO
DURANTE O DESENVOLV
IMENTO E A SENESCÊNC
IA DE
FOLHAS DE SOJA,
GLYCINE MAX
L.
Aprovada
:
31 de outubro de 2008
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de V
içosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal, para obtenção
do título de
Magister Scientiae
Prof
ª. Andréa Miyasaka de Almeida
(Co
-
orientadora)
Dr
a
.
Kacilda Naomi Kuki
Prof
. Rolf Puschmann
Prof
. Marco Aurélio Ped
ron e Silva
(Orientador)
Prof
. José Cambraia
ads:
3
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Fisiologia
Vegetal, pela oportunidade de realização do curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão de bolsa de estudos.
Ao professor Marco Aurélio Pedron e Silva, pela orientação,
dedicação, paciência, compreensão e pelos conhecimentos transmitidos.
Obrigada pelo exemplo de competência, ética e responsabilidade.
Aos professores Fábio Murilo DaMatta, Andréa Miyasaka de Almeida,
Marco Antônio Oliva Cano, José Cambraia, Rolf Puschmann e
Everaldo
Gonçalves de Barros pela colaboração na realização desse trabalho, seja
por sugestões, seja por empréstimos de aparelhos e drogas
necessários.
Aos professores do curso de Fisiologia Vegetal e à professora Marília
Ventrella, pelos ensinamentos transmitidos.
Aos técnicos e funcionários dos Laboratórios 349, 250 e 310 e da
Unidade de Crescimento de Plantas (UCP) pela vasta contribuição e
solidariedade: Carlos Raimundo, Geraldo, Antônio Cordeiro, Mercês,
Reginaldo, Oswaldo, Bhering, João Bosco, Rogério.
Ao pessoal da casa de vegetação do Bioagro pelas urgências
atendidas: Cuppertino, José Carlos, Nilton.
Aos meus colegas de curso e/ou de
trabalho pela convivência e ajuda,
em especial Agnaldo Chaves, Carla Quinhones, Danilo Daloso, Diego
Carretero, Eduardo Gusmão, Elaine Cabrini, Fábio Santos, Gabriela Leão,
Gládis Jucoski, Gustavo Kling, Ricardo Wolfgramm, Rogério Ribas, Samuel
Cordeiro,
Waldir Diola, Werner Antunes.
Às minhas estagiárias Nilmara, Aline, Marcela e Nayara. Sem elas o
trabalho seria muito mais difícil.
Aos meus amigos de sempre Desirèe, Vanessa (mãe), Fernanda,
Marcela, Juliana, Carla, Vanessa, Eryckson, Marlon, Flávia, Tenille, Karen,
Marcus Vinícius, Thalita. Muito obrigada por estarem sempre ao meu lado,
mesmo que distantes.
4
Às pessoas que convivi nesse período, que me ajudaram, me
ofereceram apoio e fizeram de Viçosa um lar: Otávia, Igor, Frederico, Rafael,
Henrique, Fernanda, Rafael (Fino), Fábio (Gaúcho), Daniela, Patrik, Fabrício
(Tiger). Além de me aconselharem a não desistir, deram motivos suficientes
para que isso não acontecesse.
Às minhas companheiras de república Juliana, Silvana e em especial
Marina, que se tornou muito mais que vizinha de quarto: uma amiga
essencial. Obrigada pelos últimos meses!
À minha família, por compartilhar comigo minhas angústias, dores,
pelo apoio, amor, atenção, paciência e força incondicionais, que foram base
para a realização desse
trabalho como um todo. Mãe, pai, irmã, irmão: vocês
são minha vida!
Às minhas avós Josina e Mariana.
À UFMS e todos os professores que me ajudaram a construir a base
para chegar até aqui. Em especial, Leandro Aguiar e Liliane Camargos, que
me deram a opor
tunidade de conhecer a pesquisa e aprender essa área.
E principalmente a Deus, pela vida e proteção constante ao longo
dela.
5
BIOGRAFIA
MICHELE PACHECO GARCIA, filha de Eliones Garcia dos Santos e
Ana Cristina Pacheco Garcia, nascida em Três Lagoas/MS no dia 03 de
maio de 1984.
Em 2001 concluiu o Ensino Médio no Colégio Hermezindo Alonso
Gonzáles
– Funlec e em 2002 ingressou no curso de Licenciatura em
Ciências Biológicas na Universidade Federal do Mato Grosso do Sul
(UFMS), campus de
sua cidade natal, diplomando-
se em fevereiro de 2006.
Em outubro de 2006 iniciou o curso de Mestrado em Fisiologia
Vegetal na Universidade Federal de Viçosa (UFV), defendendo sua tese em
outubro de 2008.
6
CONTEÚDO
RESUMO
................................................................................................
..................
8
ABSTRACT
................................................................................................
..............
10
1
–
INTRODUÇÃO
................................
................................
................................
...
12
2
–
OBJETIVOS
................................
................................
................................
.......
17
3
–
MATERIAIS E MÉTODOS
................................................................
.................
18
3.1
–
Material vegetal e cultivo
................................................................
........
18
3.2
– Determinação de teores de clorofilas e carotenóides
............................
19
3.3
–
Determinação de trocas gasosas
................................
...........................
19
3.4
– Avaliação de danos celular
es
................................................................
.
20
3.4.1
–
Peroxidação de lipídios
................................
...............................
20
3.4.2
–
Extravasamento de eletrólitos
................................
.....................
20
3.5
–
Determinação do teor de peróxido de hidrogênio
................................
..
21
3.6
–
Avaliação de atividades enzimáticas
................................
......................
21
3.6.1
–
Obtenção dos extratos enzimáticos
................................
............
21
3.6.2
–
Dismutas
e do superóxido
(SOD, EC 1.15.1.1)
...........................
22
3.6.3
–
Catalase
(CAT, EC 1.11.1.6)
................................
.......................
22
3.6.4
–
Peroxidase (POX, EC 1.11.1.7)
................................
..................
22
3.6.5
–
Peroxidase do ascorbato
(APX, EC 1.11.1.11)
...........................
23
3.6.6
–
Redutase da glutationa (GR, EC 1.6.4.2)
................................
...
23
3.7
–
Análise Q
uantitativa de Proteína
................................
............................
24
3.8
– Análises estatísticas
................................
................................
...............
24
4
–
RESULTADOS
................................
................................
................................
...
25
7
4.1
–
Amostragem do processo de desenvolvimento
................................
.....
25
4.2
–
Teores de clorofilas e de carotenóides
................................
...................
27
4.3
–
Trocas gasosas
................................................................
......................
33
4.4
–
Danos celulares
................................................................
......................
36
4.4.1
–
Concentraçõ
es de aldeído malônico
................................
...........
36
4.4.2
–
Percentagens de extravasamento de eletrólitos
.........................
38
4.5
– Teores de peróxido de hidrogênio
................................
..........................
39
4.6
–
Atividades enzimáticas
................................
................................
...........
41
5
–
CONCLUSÕES
................................................................................................
..
49
6
–
REFERÊNCIAS BIBLIOG
RÁFICAS
................................................................
..
50
APÊNDICE
................................
................................
................................
...............
59
8
RESUMO
GARCIA, Michele Pacheco, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, Outubro
de 2008. Alterações Fisiológicas e avaliação do estresse oxidativo
durante o desenvolvimento e a senescência de folhas se soja,
Glycine
max
L. Orientador: Marco Aurélio Pedron e Silva. Co-orientadores: Andréa
Miyasaka de Almeida e Fábio Murilo DaMatta.
Foram avaliadas diversas alterações fisiológicas e o estresse
oxidativo ao longo do desenvolvimento de folhas de soja, Glycine max
,
variedade MG/BR 46 (Conquista), em dois diferentes grupos de plantas: com
órgãos reprodutores intactos, cujas plantas seguiram o ciclo normal até a
senescência e com órgão reprodutores removidos, a fim de prolongar o ciclo
de vida, retardando a senescência foliar. Foram avaliados: teores de
clorofilas e carotenóides, parâmetros de trocas gasosas, atividades de
algumas enzimas do sistema antioxidativo, teores de peróxido de hidrogênio,
além de danos celulares. As folhas analisadas das plantas desenvolvendo
normalmente apresentaram progressiva degradação de clorofilas e
carotenóides (em menor proporção), fato que resultou na coloração amarela
característica de folhas senescentes, enquanto as plantas desfloradas
mantiveram suas folhas verdes. A degradação dos pigmentos resultou em
queda acentuada das taxas de assimilação líquida de carbono (A) nas
plantas com órgãos reprodutores intactos, além de ter ocorrido queda na
condutância estomática (
gs
) e aumento na razão entre a concentração
interna e ambiente de CO
2
(Ci/Ca). Ao contrário, as plantas com órgãos
9
reprodutores removidos apresentaram menor queda em A, gs e Ci/Ca, que
se mantiveram constantes após a ligeira queda inicial. O percentual de
extravasamento de eletrólitos em plantas em senescência natural aumentou
ao longo do desenvolvimento, mas não foi acompanhado de aumento de
aldeído malônico (MDA). Em plantas desfloradas o extravasamento foi
inicialmente constante, seguido de queda com o início da senescência, mas,
por outro lado, os níveis finais de MDA foram duas vezes maiores que os
iniciai
s. As folhas das plantas intactas apresentaram baixos teores de
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), ao contrário das plantas desfloradas. A baixa
atividade da dismutase do superóxido (SOD) em plantas senescendo
normalmente, além das atividades elevadas de peroxidase (POX) e
peroxidase do ascorbato (APX), devem ter sido as responsáveis pelos
baixos níveis de H
2
O
2
nessas plantas. Inversamente, a atividade intensa de
SOD e a baixa atuação de POX e APX em plantas desfloradas contribuíram
para os altos teores de peróxido de hidrogênio. A catalase (CAT) teve sua
atividade em queda ao longo do experimento, nas folhas de ambos os
tratamentos, indicando que a enzima não teve participação importante na
remoção de H
2
O
2
. Nos trifólios das plantas dos dois tratamentos, a redu
tase
da glutationa (GR) teve sua atividade inicialmente elevada, seguida de
queda drástica até o final do experimento. Tais resultados indicam que o
estresse oxidativo não foi o fator determinante da senescência foliar natural
das plantas de soja utilizada
s no presente experimento.
10
ABSTRACT
GARCIA, Michele Pacheco, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, O
ctober,
2008.
Physiological changes and evaluation of oxidative stress during
leaf
development and senescence
in
soybean,
Glycine
max
L.
Adviser
:
Marco Aurélio Pedron e Silva.
Co
-advisers: Andréa Miyasaka de Almeida
and Fábio Murilo DaMatta
Physiological changes and oxidative stress were studied in
soybean
leaves,
Glycine max, variety MG / BR 46 (Conquista) during the
ir
development
. In a group of plants the reproductive organs were removed,
in
an attempt to extend the
ir
life cycle,
retarding
the
ir leaf senescence. In the
control plants the floweres were not removed and the plants followed their
normal cycle until
natural
senescence.
Control
plants developed normally
,
exhibiting
progressive degradation of chlorophylls and carotenoids (in low
proportion),
with
the characteristic yellow color of senescent leaves. On the
other hand, plants with no flower kept their leaves green until the end of the
experiment
. The degradation
of the
pigments
led to a
sharp decline
in
carbon
assimilation rates (A) in control
plants
, in which also occurred a decrease in
stomatal conductance (g
s
) and increase in the ratio between the internal and
ambient CO
2
concentration (C
i
/C
a
). In contrast, plants with
out flowers
showed
a
minor drop in A
,
g
s
and C
i
/C
a
.
The
proportion of electrolyte leakage
increased
in the control plants throughout their development. Leaves of
control
plants showed low
er
levels of hydrogen peroxide (H
2
O
2
),
in contrast
with a great increase observed in
plants
with no
flowers
. The low activity of
superoxide dismutase (SOD) in
control
plants
in addition to the high activity
11
of peroxidases (POX) and ascorbate peroxidase (APX) are likely respons
ible
for
the
low levels of H
2
O
2
in
tho
se plants. Conversely, the intense activity of
SOD and the low performance of POX and APX in plants without flowers
might have contributed to the high levels of hydrogen peroxide. Catalase
(CAT) activity dropped contin
uously
in the leaves of the two kind of plants
,
indicating that t
his
enzyme does not play a fundamental role
in the removal of
reactive oxygen species during this senescence. In both kind of plants
,
the
activity of glutathione reductase had
initially
incre
ased, followed by a sharp
decrease
until the end of the experiment. The results of this experiment
suggest that oxidative stress is not the determinant factor associated with
leaf senescence process in soybean plants.
12
1
–
INTRODUÇÃO
A soja (Glycine max L.) é uma
planta
herbácea pertencente à família
Leguminosae
e sub-
família
Fabaceae
, que apresenta grande diversificação
genética e morfológica em função do elevado número de variedades e
cultivares. É amplamente utilizada na alimentação humana, tendo papel
semelhante
à carne, leite e manteiga, pois tem elevada quantidade de
pr
oteínas e gordura (Gomes, 1976).
Inúmeros estudos têm destacado o potencial de fitoquímicos
presentes na soja, como as saponinas e isoflavonas no controle de
diferentes enfermidades. Os grãos de soja compõem-se basicamente de
proteínas, glicídios e lipídios, contendo também cálcio, fósforo e ferro
(Sgarbieri et al, 1981). Além da proteína, a soja fornece os ácidos graxos
essenciais, algumas vitaminas e compostos fitoquímicos, como as
isoflavonas, que apresentam importante propriedade de atividade
antioxidante (Esaki et al, 1999). Além disso, no campo, é forragem de
primeira ordem, enriquece o solo com o nitrogênio que retira do ar
atmosférico, humifica-
o
com seu sistema radicular, ao encerrar seu ciclo
vital
, quando toda sua volumosa massa vegetal não é usada como adubo
verde e ainda protege o solo contra erosão e ação direta do sol (Gomes,
1976).
Sendo uma espécie monocárpica, a soja possui um controle
c
orrelativo,
sendo que sua senescência foliar inicia quando o fim do seu
desenvolvimento
é alcançado, com o enchimento dos grãos, cessando
assim o seu ciclo reprodutivo único. Dessa forma, o desenvolvimento
13
reprodutivo governa a senescência foliar e a remoção dos órgãos
reprodutivos pode reverter a destruição das folhas senescentes (Lim et al,
2007
).
Em qualquer espécie vegetal, a senescência não ocorre
desordenadamente, sendo que sua indução e seu progresso são
controlados em resposta a fatores ambientais, como desidratação e baixa
temperatura, além de uma regulação diferencial programada de uma série
de genes relacionados à senescência (SAGs) (Gan e Amasino, 1997; Biswal
et al, 1999; Yoshida, 2003).
Além de fatores externos, há interferência também de fatores internos
como sinalizadores da senescência, entre eles, os hormônios. Os principais
hormônios envolvidos são as auxinas, citocininas e giberelinas, que inibem a
senescência, e ácido abscísico e etileno, que a induzem. A regulação da
senescência também conta com a participação do ácido jasmônico e do
ácido salicílico (Gan e Amasino, 1997).
Na senescência monocárpica, além das estruturas reprodutivas,
outras partes da planta podem participar como controles correlativos. As
raízes, por exemplo, tem importante papel na manutenção das folhas,
principalmente através da produção de citocininas
(Noodén
et al, 2004). As
citocininas
podem aumentar
a
quantidade de flores e frutos em soja,
sugerindo que esse hormônio atua redirecionando o movimento de
assimilados na planta, prevenindo a abscisão desses órgãos (Reese et al,
1995; Nagel et al, 2001).
A maioria dos estudos moleculares
que
visa
m o melhor entendimento
sobre a senescência foliar tem sido feita em Arabidopsis thaliana. Apesar de
ter um ciclo muito curto, Arabidopsis não é uma planta monocárpica,
portanto as descobertas a respeito do controle genético de sua senescência
podem não revelar os mecanismos envolvidos na senescência foliar de
outras plantas, como a soja (Lim
et al
, 2007).
A morte de grupos de células faz parte do desenvolvimento de muitos
organismos, podendo também ser resposta a estresses bióticos e abióticos.
A morte celular programada pode ser um processo auto
-
destrutivo, envolvido
na formação de elementos traqueais e degeneração da camada de al
eurona
durante a germinação, por exemplo (Jones e Dangl, 1996). Pode também
14
estar associada ao processo de senescência, que envolve
uma
desmontagem ordenada de componentes celulares e permite um
aproveitamento máximo de nutrientes para as outras partes da
planta
(Lim
et
al
, 2007)
No
decorrer da senescência
,
dentre outras
altera
ções,
observa-
se
aumento nas espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs são
produzidas durante o metabolismo aeróbico normal, pela interação do O
2
e
elétrons provindos da cadeia de transporte de elétrons dos cloroplastos e
das mitocôndrias (Bor et al, 2003). A susceptibilidade ao estresse oxidativo
depende do balanço global entre a produção de oxidantes e a capacidade
antioxidante da célula (Prochazkova
et al
., 2001).
As espéci
es
reativas de oxigênio incluem o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
),
o ânion superóxido (O
.
2
-
), e o radical hidroxil (HO), os quais podem
causar danos às macromoléculas celulares
.
Os danos provocados pelas
EROs podem ser evitados por sistemas antioxidativos enzimáticos e não-
enzimáticos. No sistema antioxidativo enzimático em plantas superiores,
destacam
-se as enzimas dismutase
do
superóxido (SOD), catalase (CAT) e
peroxidase
do
ascorbato (APX), além de outras peroxidases (POX) e
redutase da glutationa (GR). A SOD catalisa a dismutação do superóxido,
mantendo baixos níveis desse radical, sendo o H
2
O
2
produto de sua reação.
A CAT
converte
o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água e a APX
catalisa a oxidação do ascorbato à monodesidroascorbato (MDHA), usando
peróx
ido de hidrogênio como oxidante (Jimenez et al., 2002
).
Além disso, as
plantas contam com mecanismos não enzimáticos, envolvendo compostos
como o ácido ascórbico e a glutationa, que são encontrados em altas
concentrações no cloroplasto e outros compartimen
tos (Mittler, 2002).
Durante a senescência foliar
monocárpica em arroz,
Srivalli e Khanna
-
Chopra (2001)
observ
aram
aumento no estresse oxidativo nas células,
devido ao declínio de SOD e CAT e posterior indução de novas isoformas
,
menos ativas
. O aumento n
a atividade de CAT logo após o florescimento em
soja sugere que as folhas aumentam a sua capacidade de catalisar
a
decomposição do peróxido de hidrogênio em água. Porém, quando se
aproxima mais da senescência (25 dias após o florescimento), essa
15
habilidade
decresce com a queda da atividade dessa enzima (Fu et al
,
2000).
Além da destruição das EROs, as células também contam com
sistemas capazes de reduzir a sua produção, como parte do seu sistema de
proteção contra o estresse oxidativo. Algumas formas de se reduzir a
produção de EROs envolvem a dissipação de energia entre o fluxo de
elétrons da cadeia respiratória e a síntese de ATP (Maxwell et al., 1999;
Considine
et al., 2003). Para isso, as plantas podem se utilizar de duas
proteínas mitocondriais: a oxidase alternativa (AOX) e a proteína
desacopladora (UCP) (Sluse
et al
, 2000, 2002).
As células da folha sofrem mudanças
ordenadas
em sua estrutura, no
metabolismo e na expressão gênica (Lim et al, 2007), ao longo do processo
de senescência. Os plastídios do mesofilo são as primeiras organelas a
sofrer mudanças dramáticas; cloroplastos e peroxissomos sofrem conversão
em gerontoplastos e glioxissomos, respectivamente, indicando que a
senescência é um fenômeno de diferenciação e não apenas uma forma de
necrose.
As células do mesofilo são as primeiras e estão entre as principais a
tornar
em
disponível quase todo o recurso da folha durante a senescência
.
Ocorre o aumento na atividade metabólica, responsável por converter o
material celular acumulado durante a fase de crescimento, havendo hidrólise
de macromoléculas para remobilização de nutrientes (Lim e Nam, 2005
).
Células senescentes passam por reorganização interna e são
metabolicamente ativas, sendo que várias rotas são ativadas e continuam
ocorrendo ao longo d
o processo de senescência.
O deslocamento de nutrientes em plantas monocárpicas parece ser
parte de uma estratégica reprodutiva que otimiza o ciclo vital da
espécie
(Noodén
et al, 2004). Nesse grupo de plantas
acredita
-
se
que o
desenvolvimento dos frutos retira carboidratos e minerais (principalmente
nitrogênio e fósforo) das partes vegetativas, levando-as à morte (Marschner,
1995).
Vários parâmetros fisiológicos podem ser utilizados para
indic
ar a
senescência, entre eles o sintoma de clareamento, típico em folhas. Essas
mudanças estruturais são acompanhadas por variações bioquímicas, como
16
catabolismo das clorofilas e progressiva perda de proteínas cloroplastídicas,
como a Rubisco e as proteínas do sistema coletor de luz (
Brouquisse
et al
,
2001).
Também po
de
ocorrer descréscimo de carotenóides, além do
acúmulo de outros pigmentos e compostos secundários. Em folhas de soja
,
Fu
et al (2000) verificaram o decréscimo nos
teores
de clorofila e
carotenóides durante a senescência. Um evento importante é a
desmonta
gem do aparato fotossintético, com decréscimo na atividade
fotossintética (Woolhouse, 1984; Grover et al, 1992). Essa ocorrência,
acompanhada por um suave decréscimo na
extinção
fotoquímica do
fotossistema
II
, em folhas senescentes, pode expor as folhas a um excesso
de energia de excitação, a qual, se não dissipada seguramente, pode
resultar em danos ao F
SII
, em conseqüência da redução dos seus centros
de reação (Demming-
Adams
et al, 1992). O declínio na capacidade
fotossintética acompanhando a senescência foliar foi uma das primeiras
observações
deste processo em plantas superiores (Yoo et al, 2003). Ao
contrário dos cloroplastos, núcleo e mitocôndrias se mantêm intactos até o
último estádio, por serem requeridos para viabilidade celular (
Simeonova
et
al
, 2
000).
A fim de contribuir para o conhecimento dos diversos aspectos
envolvidos no desenvolvimento e na senescência das folhas de soja, julgou-
se importante avaliar as modificações fisiológicas, desde a sua formação e
amadurecimento até a finalização de seu processo de senescência e
abscisão. Além disso, procurou-se observar o efeito da remoção das flores
no processo de senescência foliar. Foram avaliados parâmetros de trocas
gasosas, danos celulares e a participação de enzimas do sistema
antioxidativo durante este processo, comparando plantas desenvolvendo
normalmente com outras cuja senescência foi retardada pela remoção dos
órgãos
reprodutores.
17
2
–
OBJETIVOS
Esse trabalho teve como propósito acompanhar e comparar algumas
respostas fisiológicas em folhas de plantas de soja com órgãos reprodutores
intactos (senescência normal) e folhas de plantas com órgãos reprodutores
removidos (senescência retardada), em diferentes estádios de
desenvolvimento.
O objetivo principal foi confirmar a hipótese de que o desenvolvimento
de flores e frutos governa a senescência foliar da soja, pelo
desencadeamento de estresse oxidativo. Para isso, foram avaliados diversos
aspectos fisiológicos, relacionados com atividade fotossintética e com
possíveis danos oxidat
ivos.
18
3
–
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Sementes de soja (Glycine max L.) da variedade MG/BR 46
(Conquista), fornecidas pelo Departamento de Fitotecnia da Universidade
Federal de Viçosa, foram selecionadas e tratadas co
m fungicida e inoculante
(composto por bactérias do gênero Rhizobium, com turfa como substrato).
Em seguida, foram colocadas para germinar em uma mistura de solo,
esterco de curral curado e areia (3:1:1, v/v/v), em vasos plásticos de 3L.
A
adubação e a correção da acidez dessa mistura foram feitas de acordo com
análise de solo e recomendações técnicas para a cultura (Ribeiro, 1999).
Três plantas por vaso permaneceram em casa de vegetação, no período de
fevereiro a junho de 2008, onde tiveram irrigação apropriada (solo mantido
na sua capacidade de campo) e foram tratadas com inseticidas e fungicidas
apropriados, quando necessário.
O experimento contou com dois tratamentos primários: plantas com
órgãos reprodutivos intactos, que tiveram seu ciclo de vida sem i
nterferência
e plantas com órgãos reprodutivos removidos, por retirada manual de suas
flores. Estes dois grupos de plantas foram acompanhados ao longo de todo
o seu ciclo vital.
Todas as avaliações, nos dois tratamentos, foram feitas nos folíolos
do 6º nó (4ª folha trifoliolada) e as análises de trocas gasosas e pigmentos
foram iniciadas aos 22 dias, quando as folhas já se apresentavam
19
completamente expandidas e fotossinteticamente ativas. Aos 43 dias após o
plantio, foram iniciados os outros tipos de anál
ises.
Até o início da senescência,
todas
as avaliações foram feitas em
intervalos semanais, à semelhança do executado por Fu et al, 2000. Após o
início da senescência, os intervalos foram de 3 dias, até a ocorrência da
abscisão do quarto trifólio.
3.2
Determinação de clorofilas e de carotenóides
Os teores de pigmentos (clorofila a, b e carotenóides) foram
determinados de acordo com método descrito por Wellburn (1994). Dois
discos foliares com diâmetro de 0,5 cm foram colocados em recipientes
contendo
5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) saturado com carbonato de
cálcio (CaCO
3
). Após 6 horas em temperatura ambiente, as absorbâncias
dos extratos foram lidas a 480 nm, 649,1 nm e 665,1 nm, e os teores dos
pigmentos determinados e expressos em
µ
g
cm
-2
.
3.3
Tr
ocas gasosas
As avaliações relacionadas com as trocas gasosas foram iniciadas
após completa expansão dos folíolos, e foram feitas sempre às 9h. As taxas
de assimilação líquida do carbono (A), condutância estomática (g
s
),
transpiração e a razão entre a concentração interna e ambiente de CO
2
(C
i
/C
a
) foram medidas em sistema aberto, sob luz saturante artificial de 1000
µmo
l m
-2
s
-1
e temperatura e concentração de CO
2
ambiente, com analisador
de gás infravermelho (IRGA) portátil (Li-6400 Li-Cor, USA), seguindo o
método descrito por Vu
et al
(1986).
20
3.
4
Análises de danos celulares
3.4
.1 Peroxidação de Lipíd
i
os
Dan
os celulares foram avaliados por meio de peroxidação de lipídi
os,
via acúmulo de aldeído malônico (MDA), conforme descrito por Cakmak &
Horst (1991). Para isso, 0,150 g de folíolos foram homogeneizados em 2 mL
de solução contendo 0,1% de ácido tricloroacético (TCA). O homogeneizado
foi centrifugado a 12000
g
por 15
min
utos
. Todas as etapas foram realizadas
a 4
o
C. Alíquotas de 0,5 mL do sobrenadante foram adicionadas a 1,5 mL de
solução de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,5% em TCA 20% e todas as
amostras foram incubadas a 90
o
C por 20
min
utos
. A reação foi paralisada
em banho de gelo, seguido de centrifugação a 13000 g por 4
min
utos
. A
absorbância do sobrenadante foi lida a 532 nm, descontando-se a
absorbância inespecífica a 600 nm. A concentração de MDA foi calc
ulada
utilizando
-se o coeficiente de absortividade de 155 mM
-1
cm
-1
(Heath &
Packer, 1968).
3.
4
.2
Extravazamento
de eletrólitos
Os
danos celulares foram avaliados também por meio de
extravazamento
de eletrólitos,
conforme
descrito por Lima et al (2002). Para
isso, 10 discos de 1,2 cm foram colocados em 15 mL de água miliQ e
deixados por 6 horas à temperatura ambiente (média de 25
o
C). A
condutância inicial (Ci) foi estimada utilizando um condutivímetro
(Biosystems LTDA, São José dos Pinhais, PR, Brasil). Após essa leitura, as
mesmas amostras foram colocadas em estufa a 90
o
C por 2 horas e feita
uma segunda leitura (Cf). A permeabilidade relativa foi calculada pela
relação Ci/(Ci+Cf) x 100 (Tarhanen et al, 1999) e o resultado foi expresso
em percentagem.
21
3.5
Peróxido de Hidrogênio
Amostras de 0,1 g de folíolos foram trituradas em nitrogênio líquido e
então homogeneizadas em 2 mL de tampão fosfato de potássio 50
mM,
pH
6,5 contendo hidroxilamina 1 mM. Após filtração através de 4 camadas de
gaze, o homoge
neizado foi centrifugado a 10000
g
por 15
min
utos
. Todas as
etapas foram realizadas a 4
o
C (Kuo e Kao, 2003).
Alíquotas de 25 µL do sobrenadante foram adicionadas a um meio de
reação contendo FeNH
4
(SO
4
) 100
µM,
ácido sulfúrico 25 mM, laranja de
xilenol 250 µM e sorbitol 100
mM
, para volume final de 2 mL. As amostras
foram mantidas no escuro por 30 min
utos
e a absorbância determinada a
560
nm. Brancos para os reagentes e dos extratos vegetais foram
preparados em paralelo e subtraídos das amostras, segundo Gay e Gebicki
(2000). As concentrações de H
2
O
2
nas amostras foram estimadas com base
em curva de calibração preparada com padrõe
s de H
2
O
2
.
3.
6
Atividades enzimáticas
3.6
.1 Obtenção dos extratos enzimáticos
Para a determinação das atividades das enzimas peroxidases totais
(POX), catalase (CAT), peroxidade do ascorbato (APX) e dismutase do
superóxido (SOD), foram utilizados extratos enzimáticos brutos obtidos por
meio da homogeneização de 0,3
g de folíolos
. Estes foram fragmentado
s em
almofariz, em 2 mL de solução de extração, constituída de EDTA 0,1 mM em
tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,8, fluoreto de fenilmetilsulfônic
o
(PMSF) 1 mM e polivinil-
poli
-pirrolidona (PVPP) 1%. O homogeneizado foi
ce
ntrifugado por 15 minutos, a 12.000 g, a 4
o
C e o sobrenadante utilizado
nas avaliações enzimáticas e nas dosagens de proteína.
22
3.6.2
Dismutase do superóxido (SOD, EC 1.15.1.1)
A atividade da dismutase do superóxido foi determinada de acordo
com Giannopolitis e Ries (1977). Alíquotas de 40 µL de extrato enzim
ático
bruto foram adicionadas a um meio de reação constituído de tampão fosfato
de sódio 50 mM pH 7,8, contendo
metionina 1
3 mM, azul de p
-
nitro tetrazólio
(NBT) 75 µM, EDTA 0,1 mM e riboflavina 2 µM (Del Longo et al, 1993). A
reação
foi conduzida a 25
o
C numa câmara de reação sob iluminação de uma
lâmpada fluorescente de 15W mantida no interior de uma caixa fechada.
Após 5 minutos de exposição à luz, a iluminação foi interrompida e a
formazana azul produzida pela fotorredução do NBT foi medida a 560 nm. A
absorbância a 560 nm de um meio de reação exatamente igual ao anterior,
mas mantido no escuro por tempo igual, serviu de branco e foi subtraída da
leitura da amostra que recebeu iluminação. Uma unidade de SOD foi
definida como a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a
fotorredução do NBT (Beauchamp & Fridovich, 1971).
3.6
.3 Catalase (CAT, EC 1.11.1.6)
A atividade da CAT foi determinada segundo Havir e McHale (1987).
Alíquotas de 100 µL do extrato enzimático foliar bruto foram adicionadas a
2,9
mL de um meio de reação contendo tampão fosfato de potássio 50
mM
pH7,0, e H
2
O
2
12,5
mM. O decréscimo na absorbância a 240 nm, a 25
o
C, foi
medido durante o primeiro minuto da reação. A atividade enzimática foi
calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar de 36 M
-1
cm
-1
(Anderson
et al
, 1995) e
resultado
expresso em
µmol min
-1
mg
-
1
proteína.
3.6.4
Peroxidases (PO
X, EC 1.11.1.7)
A atividade das POX foi determinada seguindo-se os procedimentos
descritos por Kar e Mishra (1976). Alíquotas de 50 µL do extrato enzim
ático
bruto de folhas foram adicionadas a 2,95 mL de uma mistura de reação
23
constituída de tampão fosfato de potássio 25 mM pH 6,8, pirogalol 20 mM e
H
2
O
2
20 mM. O acréscimo na absorbância a 420 nm, a 25
o
C foi medido
durante o primeiro minuto de reação pela produção de purpurogalina. A
atividade enzimática foi calculada usando o coeficiente de extinção molar
de
2,47
mM
-1
cm
-1
(Chance & Maehley, 1955) e o resultado expresso em µmol
min
-
1
mg
-
1
proteína.
3.6
.5
Peroxidase do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11)
A atividade da APX foi determinada de acordo com o método de
Nakano e Asada (1981), e modificado por Koshiba (1993). Alíquotas de 200
µL de extrato enzimático foliar bruto foram adicionadas a 2,8
mL de um meio
de reação constituído de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0, ácido
ascórbico 0,8 mM e H
2
O
2
1
mM
. O decréscimo na absorbância a 290
nm,
a
25
o
C, foi medido durante o primeiro minuto de reação. A atividade
enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar de 2,8
mM
-1
cm
-1
(Nakano & Asada, 1981) e o resultado expresso em mol min
-1
mg
-
1
proteína.
3.
6
.6 Redutase da glutationa (GR, EC 1.6.4.2)
O extr
ato enzimático bruto, para
a determinação da atividade da GR
, foi
obtido pela homogeneização de 0,15 g de folíolos em 2,0 mL de solução de
extração, constituída de água destilada, EDTA 1 mM, tampão fosfato de
potássio 100 mM pH 7,5, DTT 1 mM, ß-
mercaptoeta
nol 10 mM, i
soascorbato
10
mM, Triton x100 0,1% e PVPP. O homogeneizado foi centrifugado por 15
min
utos
, a 15.000 g, e o sobrenadante utilizado para determinação da
atividade da GR. A seqüência de eventos foi executada a 4°C e a
absorbância
lida a 340nm. D
eterminou
-se a atividade da GR segundo
Carlberg e Mannervik (1985) e o resultado foi expresso em mol min
-1
mg
-
1
proteína.
24
3.7
Análise Quantitativa de Proteínas
As
proteínas das amostras das folhas utilizadas foram quantificadas
de acordo com método de Bradford (1976). Foram utilizados 5 µL de extrato
e 95 µL de água para 900 µL de Reagente de Bradford. As absorb
ância
foram lidas a 595 nm, e os dados finais foram utilizados para expressar as
atividades das enzimas, por mg de proteína.
3.8
Delineament
o experimental e análises estatísticas
O delineamento experimental empregado foi o inteiramente
casualizado, em esquema fatorial 2x13 (2 tratamentos e 13 datas de
avaliações), sendo 6 repetições para cada tratamento e data de análise
,
para as avaliações de trocas gasosas. Para as avaliações de pigmentos o
esquema fatorial foi 2x14, sendo 5 repetições para cada tratamento. Para as
demais avaliações, foi feito fatorial 2x11, sendo 4 repetições para cada
tratamento
.
Para as análises estatísticas, foi utilizado o programa Sisvar 5.0, da
Universidade Federal de Lavras. Além disso, para descrever um modelo de
resposta ao longo
do
desenvolvimento das plantas, foi realizada análise de
regressão,
utilizando o programa
OriginPro 7.0.
25
4
–
RESULT
ADOS E DISCUSSÃO
4.1 Processo de desenvolvimento da planta
A T
abela
1 mostra, de forma resumida, as principais alterações
observadas ao longo do ciclo de vida das plantas mantidas com órgãos
reprodutores intactos da variedade de soja,
MG/BR 46 (Conquist
a
).
Tabela 1: Principais eventos ao longo do ciclo vital de plantas de soja (
Glycine
max
),
variedade MG/BR 46, com desenvolvimento normal (órgãos reprodutores
intactos), cultivadas em casa de vegetação.
Dias após
germinação
Data
Coleta
Eventos
13/02/08
Plantio
20/02/08
Germinação total (Estádio VE)
3
23/02/08
Cotilédones completamente expandidos (Estádios VC e V1)
7
27/02/08
Surgimento do 2º trifólio (Estádio V2)
22
13/03/08
1
4º trifólio completamente expandido (Estádio V4)
Início de análises
de trocas gasosas e pigmentos
29
20/03/08
2
5º trifólio completamente expandido (Estádio V5)
36
27/03/08
3
Início do florescimento (Estádio R1)
43
03/04/08
4
Início de coletas para análises restantes
50
10/04/08
5
Formação de vagens (Estádio R4)
57
17
/04/08
6
Surgimento de novos ramos
64
24/04/08
7
Enchimento de grãos (Estádio R5)
70
30/04/08
8
Novos trifólios
78
08/05/08
9
Novos trifólios
85
15/05/08
10
Amadurecimento de grãos e início da senescência (Estádio R7)
92
22/05/08
11
Novos trifólios
99
29/05/08
12
Queda dos cotilédones
103
02/06/08
13
Início da abscisão dos primeiros trifólios (Estádio R8)
106
05/06/08
14
Senescência total e abscisão do 4º trifólio
26
As plantas que tiveram seus órgãos reprodutores removidos
mantiveram suas folhas sempre verdes e maiores, além de apresentarem
maior número de ramos laterais (Figura 1). A variedade escolhida, MG/BR
46 (Conquista), é considerada de ciclo semi-tardio, de 110 a 140 dias. A
melhor época de cultivo em campo é de 15 de outubro a 15 de novemb
ro,
época do ano em que o período de luz chega a quase 14 horas/dia
(primavera/verão). Acredita-se que devido à época do experimento, às
condições de casa de vegetação (incluindo radiações menores) e pela soja
responder a fotoperíodo curto, seu ciclo tenha sido um pouco reduzido.
Durante o período inicial de cultivo, o máximo de luz que se teve foi pouco
mais de 12 horas/dia em Viçosa (Fonte: br.weather.com), entre plantio e
florescimento, fase decisiva para o ciclo da soja.
Figura 1: Estádios finais de plantas de soja (Glycine max
),
variedade MG/BR 46
,
nos dois tratamentos: plantas com órgãos reprodutores removidos e plantas com
órgãos reprodutores intactos.
Durante o desenvolvimento das plantas, há uma competição por
nutrientes entre os órgãos vegetativos e reprodutivos. Flores e frutos são
poderosos drenos de sais minerais, açúcares e aminoácidos, e acumulam
27
grandes quantidades dessas substâncias, o que resulta em decréscimo na
quantidade presente nas folhas. Os mecanismos pelo quais os frutos pod
em
desviar nutrientes do interior das folhas ainda não estão completamente
esclarecidos, mas alguns hormônios, especialmente citocininas e ácido
abscísico devem estar envolvidos (Noodén et al, 1990; Zacarias e Reid,
1990).
A senescência foliar é usualmente correlacionada com o decréscimo
de citocininas nas folhas (Noodén et al, 1997). As citocininas vindas da raiz
via xilema são conhecidas po
r
retardar a senescência foliar e seu declínio
pode ser importante na senescência das folhas de soja. As vagens reduz
em
a produção desse hormônio nas raízes, nos primeiros estádios de
desenvolvimento e esse decréscimo é requerido para a senescência
monocárpica em soja. Dessa forma, a remoção contínua das vagens causa
um aumento dos níveis de citocinina na seiva xilemática, os quais retardam
a senescência foliar (Noodén et al
,
1990). Em contraste, ácido abscísico é
considerado um promotor da senescência foliar (Tadas et al, 1999),
funcionando como sinalizador do transporte de assimilados para sementes e
frutos em desenvolv
imento (Yang
et al
,
1999).
4.2 Teores de clorofilas e de carotenóides
Os teores de clorofilas a, b e carotenóides no 4º trifólio das plantas
apresentaram variações semelhantes, mas dependentes do tipo de
tratamento (Figuras 2, 3 e 4, respectivamente). Os teores destes pigmentos
aumentaram significantemente nos dois tratamentos nas fases iniciais do
ciclo, porém nas plantas com órgãos reprodutores intactos observou-
se
queda drástica e significativa após a formação de vagens (iniciada aos 50
dias de idade) e início de enchimento dos grãos. Nas plantas com órgãos
reprodutores removidos, que não passaram por essas fases, os teores de
clorofilas a e b tenderam a permanecer estáveis, próximos aos valores
máximos (cerca de
20 µg c
m
-2
para clorofila a e de
8 µg
c
m
-2
para clorofila b)
até o fim do acompanhamento das plantas
.
Os teores de carotenóides totais
apresentaram leve tendência de decréscimo nas plantas com flores
28
removidas, ao contrário das outras, nas quais os níveis de carotenóides
caíram para abaixo de 0,5 µg cm
-2
ao final do ciclo. Os níveis máximos
de
carotenóides
alcançados
foram de aproximadamente 4 µg cm
-2
, em ambos
os tratamentos, por volta do 50º
ao 70º
dia.
Além disso, o pico máximo de clorofilas a e b nas plantas
com
órgãos
reprodutores
removido
s
foi por volta d
os 85 dias de idade, quando as plantas
com órgãos reprodutores intactos apresentaram queda drástica nestes
pigmentos. Em plantas de soja desfloradas continuamente,
Wittenbach
(1982) observou o mesmo resultado após quatro semanas.
0
20 40
60
80 100
120
0
5
10
15
20
25
Clorofila a (ug cm
-2
)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =2,23399+0,64216*** X-0,00596*** X
2
R
2
= 0,9169
Y =8,40429+0,2917** X-0,0018* X
2
R
2
= 0,4771
Figura 2 – Teor
es
de clorofila a no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade
MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos reprodutores
intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2). Níveis de
significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
Os níveis de clorofila a sempre se mantiveram acima dos níveis de
clorofila
b ao longo do desenvolvimento (Figuras 2 e 3), resultado também
obtido
por
Jiang et al (2006). Em plantas “desfloradas”, Crafts-Brandner e
29
Egli (1987)
observaram
declínio mais lento nos níveis de clorofilas, o que
resultou na man
utenção
das
folhas verdes, mesmo após a abscisão foliar
dos controles
.
0
20 40 60 80
100
120
0
3
6
9
12
15
Clorofila b (ug cm
-2
)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =-1,764+0,304*** X-0,002*** X
2
R
2
= 0,6230
Y =-2,169+0,236*** X-0,001*** X
2
R
2
= 0,6255
Figura
3 – Teor
es
de c
lorofila
b no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade
MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos reprodutores
intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2). Níveis de
significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
Alguns autores sugerem que reduções nas concentrações de
clorofilas podem estar associadas a processos fotooxidativos (Krause, 1988)
ou a alterações na organização dos fotossistemas, servindo como
fotoproteção (Ottander et al, 1995; Elvira et al, 1998; Kranner et al, 2002).
Essa queda pode estar associada à maior destruição de pigmentos para
realocação de nutrientes, como carbono, nitrogênio e magnésio, que
compõem a estrutura da clorofila, para o grão (Hayati et al, 1995), já que as
plantas senescendo normalmente tiveram maiores quedas que as plantas
desfloradas.
30
Os teores de carotenóides caíram significativamente a partir da fase
de enchimento de grãos (64 dias) em plantas senescendo normalmente,
enquanto que no outro grupo de plantas (Figura 4) houve apenas ligeira
queda, permanecendo em torno
de
3 µg cm
-2
. Além de sua função de
pigmentos acessórios na captação de luz, os carotenóides funcionam como
fotoprotetores, dissipando a energia armazenada, pela transferência de
excitação (Biswal, 1995). Se tal energia não for dissipada, pode ocorrer a
formação de oxigênio singleto (O
2
-
) e outras espécies reativas de oxigênio
(Asada, 1999). Portanto, essa queda nos teores de carotenóides em plantas
com órgão
s
reprodutores intactos é uma evidência do estresse oxidativo
relacionado com o processo de senescência e com a possível destruição do
aparato fotossintético
(
Jiang
et al
, 2005
).
O decréscimo nos
teores
de clorofilas e carotenóides durante a
senescência de folhas de soja também foi observado por Fu et al (2000),
visto
ser
uma das principais manifestações da senescência foliar
resultante
d
o declínio na razão síntese/degradação de pigmentos (Lu
et al
, 200
1).
31
0
20
40
60
80 100 120
0
1
2
3
4
5
6
Carotenóides (ug cm
-2
)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =0,706+0,129*** X-0,001*** X
2
R
2
= 0,8943
Y =2,617+0,049* X-3,862E-4* X
2
R
2
= 0,1399
Figura
4 – Teor
es
de
carotenóides
no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade
MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos reprodutores
intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2). Níveis de
significância:
*: 0
,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
Em relação à razão clorofila a/b (Figura 5), em plantas com órgãos
reprodutores intactos foi observada queda linear desde o início das coletas
até o final do ciclo, quando essa razão atingiu valor de 1,8. Em plantas com
órgãos reprodutores removidos, essa queda aconteceu de forma
aproximadamente linear até por volta de 85 dias de idade, seguida de
tendência de estabilização até o fim do experimento, com valores finais em
torno de 2,3. Estes dados confirmam a observação visual de que a
senescência do quarto trifólio foi retardada pela remoção de flores,
resultando em redução na degradação de clorofila a, que foi mais elevada
nas
plantas com flores intactas.
32
Tang
et al (2005) observaram queda na razão clo
rofila
a/b
durante a
senescência foliar de arroz e Camp et al (1982) observaram o mesmo em
trigo.
Quando a absorção de luz pelos pigmentos torna-
se
excedente à
capacidade de uso para produção de NADPH e ATP (
para
síntese de
carboidratos),
a fotossíntese é progressivamente inibida, ocorrendo
destruição dos pigmentos
,
quando
a condição adversa
se
prolonga. Diversos
agentes estressores (bióticos e abióticos) diminuem a concentração de
clorofila
a
nos tecidos fotossintéticos, tanto pelo aumento da degradação
q
uanto pela inibição da biossíntese (Gan, 2007).
0
20 40
60
80
100 120
0
1
2
3
4
5
6
7
Razão Clorofila a/Clorofila b
Dias após a germinação
T1
T2
Y =4,110-0,021*** X R
2
= 0,4875
Y =6,584-0,086*** X+4,419E-4*** X
2
R
2
= 0,2904
Figura 5 – Razão clorofila a/b no 4º trifólio de
soja,
Glycine max, variedade MG/BR
46,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos reprodutores intactos
(T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2). Níveis de significância:
*:
0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
33
4.3 Trocas Gasosas
As maiores taxas de assimilação líquida de carbono (A) no 4º trifólio
(Figura 6) ocorreram entre os 29 e 50 dias de idade, nos dois tratamentos,
que corresponde ao período após a expansão completa do 5º trifólio até
início da formação de vagens nas plantas intactas. Nas plantas controle
(órgãos reprodutores intactos) houve queda muito acentuada em
A
a partir
do 43º dia, chegando a valores inferiores a 1,5
µmol m
-2
s
-1
. Nas pl
antas com
órgãos reprodutores intactos, foram mantidos valores finais mais elevados
(em torno de 6,0 µmol m
-2
s
-1
) de A, ao final do experimento. A maior queda
da fotossíntese em plantas senescendo é, possivelmente, conseqüência da
queda dos
teores de
pigm
entos pres
entes nos cloroplastos (Figuras 2,
3 e 4)
e na condutância estomática (Figura 7).
Nos dois tratamentos, a maior capacidade de assimilação de CO
2
foi
apresentada na fase de início do florescimento, devido à funcionalidade
plena do aparato fotossintético. Essa capacidade se perdeu ao longo do
desenvolvimento, semelhante ao observado por Jiang
et
al, 2005. Essa
resposta também foi observada em folhas de trevo branco (Yoo et al, 2003)
e arroz (Tang et al, 2005). Em plantas de soja com órgãos reprod
utores
removidos o declínio menos acentuado nos valores de A foi observado
também por Lenz et al (1973), Thorne et al (1974), Mondal et al (1978),
Wittenbach (1982) e Fu et al (2000). Um detalhe importante é que folhas de
algumas espécies anuais exibem um progressivo declínio na razão
fotossintética depois da expansão total das folhas (Woolhouse, 1967; Jiang
et al, 1993). Isso justifica a menor, mas presente queda na fotossíntese,
mesmo no 4º trifólio de plantas com órgãos reprodutores removidos.
34
0
20 40
60
80
100
120
0
4
8
12
16
20
A (umol m
-2
s
-1
)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =11,989+0,197*** X-0,003*** X
2
R
2
= 0,9249
Y =14,960+0,058 X-0,001** X
2
R
2
= 0,7254
Figura 6 – Taxas de assimilação líquida de carbono (A) no 4º trifólio de
soja,
Glycine max, variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com
órgãos reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores rem
ovidos
(T2).
Níveis de significância:
*:
0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
A queda na condutância estomática (gs) foi constante nas plantas
intactas, até valores próximos de 0,05 mol m
-2
s
-1
, enquanto que nas plantas
desfloradas, após queda semelhante até cerca do 85º dia de idade, ocorreu
tendência à estabilização em valores em torno de 0,15 mol m
-2
s
-1
nas
últimas coletas (Figura 7).
As razões entre as concentrações interna e externa de CO
2
(Ci
/Ca)
variaram inicialmente de modo similar no 4º trifólio das plantas dos do
is
tratamentos, com ligeiro decréscimo entre 22 e 57 dias de idade (valores
próximos a 0,77). A partir de então, a razão Ci/Ca voltou a aumentar
ligeiramente nas plantas com flores intactas (chegando a quase 0,9) e
permaneceu constante naquelas que tiveram
suas flores removidas.
35
0
20 40 60 80 100 120
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
gs (mol m
-2
s
-1
)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =0,591-0,007*** X+2,282E-5* X
2
R
2
= 0,7257
Y =0,626-0,009*** X+4,189E-5** X
2
R
2
= 0,6879
Figura 7 – Condutância estomática (
gs
) no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos
reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
O presente trabalho foi realizado num período de transição de
estações.
O início, em fevereiro, foi caracterizado por chuva e calor,
condição bem diferente da encontrada nas etapas finais do trabalho, em
maio/junho, época com baixa umidade relativa do ar e início de frio. Tais
alterações ambientais podem justificar as quedas em A e
gs
, mesmo nas
plantas com órgãos reprodutores removidos. Nos dois casos, as reduções
na condutância estomática contribuíram para as quedas na atividade
fotossintética, além das reduções nos teores de clorofila.
36
0
20 40
60
80
100
120
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ci/Ca
Dias após a germinação
T1
T2
Y =0,993-0,009*** X+7,341E-5*** X
2
R
2
= 0,4811
Y =0,941-0,006*** X+3,545E-5** X
2
R
2
= 0,4460
Figura 8 – Razão entre a concentração interna e ambiente de CO
2
(Ci/Ca) no 4º
trifólio
de
soja,
Glycine max, variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento,
em plantas com órgãos reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos
reprodutores removidos (T2). Níveis de significância: *: 0,05 > p = 0,01; **: 0,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
Quando há alta atividade fotossintética, a quantidade interna de gás
carbônico tende a diminuir, pois o mesmo está sendo incorporado e, dessa
forma, há uma tendência de se promover maior abertura estomática, levando
à maior condutância estomática (Farquhar e Sharkey, 1982). Nas plantas
com órgãos reprodutores intactos, cuja fotossíntese teve queda significativa,
houve decréscimo acentuado em
gs
, levando ao aumento de CO
2
interno.
4.4 Danos celulares
4.4.1 Peroxidação de lipídios
No 4º trifólio das plantas intactas, os teores de aldeído m
alônico
(MDA) decresceram lenta e progressivamente dos 43 dias até o final do seu
ciclo vital (Figura 9), mantendo valores em torno de 55 mol g
-
1
MF.
37
Entretanto, nas plantas que tiveram as flores removidas, houve constante
aumento, atingindo valores em torno de 160 mol g
-
1
MF, cerca de três
vezes superiores ao mínimo, próximo aos 100 dias de idade. Aumento
semelhante também foi visualizado por Srivalli e Khanna-Chopra (2004), em
plantas de trigo com espiga removida.
A peroxidação de lipídios gera o aldeído malônico (MDA), que é um
produto da decomposição de ácidos graxos das biomembranas e é uma
forma de atestar a presença de radicais livres. (Lin e Kao, 2000; Munné-
Bosch
et al
, 2002). Prochazkova
et al
(2001) detectaram, em folhas de milho,
aumento na per
oxidação de lipídeos, assim como ocorreu em folhas de arroz
com senescência promovida por alagamento (Lin
et al
, 2000).
A elevação nos teores de MDA, indicativo de danos às membranas,
observada nos trifólios de plantas que tiveram suas flores removidas é
aparentemente contrária às expectativas. Essas plantas apresentaram
elevada atividade fotossintética, que requer integridade de membranas em
geral,
ao contrário das intactas.
38
0
20 40 60 80 100 120
0
40
80
120
160
200
MDA (nmol g
-1
MF)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =109,654-1,161 X+0,006 X
2
R
2
= 0,1790
Y =49,463-0,229 X+0,013 X
2
R
2
= 0,7322
Figura 9 – Concentrações de aldeído mal
ônico
no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos
reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
4.4
.2
Extravazamento
de Eletrólitos
O
extravazamento
de eletrólitos no 4º trifólio de plantas intactas
apresentou
ligeira
queda até cerca dos
60
dias de idade, seguida de
aumento
até o final do
experimento
, quando valores próximos a
7,5
% de
extravazamento
foram atingidos (Figura 10)
.
Nas
plantas com órgãos
reprodutores removidos também houve
queda
, que persistiu até cerca de 90
dias de idade, com tendência de estabilização do
extravazamento
até o final
do experimento
,
mantendo
valores
finais
médios de 4,7%
.
Durante a senescência, ocorrem alterações na permeabilidade das
membranas e a
redução
da capacidade de retenção de solutos (Ferguson
et
al
, 1973; Prochazkova et al., 2001)
.
Os maiores índices
de
extravazamento
39
de eletrólitos refletem
essa
m
ai
or
permeabilidade
, fato também ligado ao
estresse oxidativo (
Prochazkova
et al, 2001)
.
Em plantas senescendo
normalmente,
o grande percentual de
extravazamento
de eletrólitos não
coincide com as baixas conc
entrações
de
MDA
(Figura 9). Em plantas
desfloradas,
também há contradição, sendo que o baixo percentual de
extravazamento
não
condiz com
altas concentrações de MDA
.
0
20
40
60
80
100 120
0,0
1,5
3,0
4,5
6,0
7,5
9,0
Extravasamento de eletrólitos (%)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =9,281-0,151* X+0,001** X
2
R
2
= 0,5758
Y =10,234-0,132** X+7,742E-4* X
2
R
2
= 0,4807
Figura 10 –
Percentagens
de
extravazamento
de eletr
ólitos
no 4º trifólio de
soja,
Glycine max, variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com
órgãos reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos
(T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,00
1; ***: p < 0,001
.
4.5
Peróxido de Hidrogênio
No 4º trifólio das plantas com órgãos reprodutores intactos, os teores
de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
aumentaram em cerca de 50%, tendo seu
pico
de 67 µ
mol
g
-1
MF
entre
os 64º e 78º dias
,
seguido de q
ued
a com o
40
início do amadurecimento de grãos (Figura 11). Já em plantas com órgãos
reprodutores removidos
,
os
teores de peróxido de hidrogênio aumentaram
desde o início das avaliações, atingindo valores máximos (por volta de 180
µ
mol
g
-1
MF)
ao final das aval
iações
. Ressalta-se que, neste caso, os teores
de H
2
O
2
chegaram a ser cerca de três vezes superiores aos valores
encontrados no pico observado para plantas intactas.
A
remoção
de H
2
O
2
depende de um sincronismo elevado de todas as
enzimas antioxidativas (Ji
ang
et al, 2005).
Provavelmente,
a diminuição nos
teores de H
2
O
2
observada nos estádios finais das plantas senescendo
normalmente deve-se ao aumento das atividades das enzimas responsáveis
pela eliminação de H
2
O
2,
tais como APX e POX
.
Os níveis de EROs est
ão
sob controles enzimáticos e não enzimáticos, sendo que o aumento de
determinado intermediário (como o peróxido de hidrogênio, por exemplo)
pode
resulta
r no aumento da atividade de alguma enzima ou de algum
metabólito, como o
ascorbato (Dipierro
et al, 2005). Tal aumento na
atividade enzimática pode promover a queda na concentração desse
intermediário e de outras EROs. Os presentes dados são contrastantes com
os obtidos por Prochazkova et al (2001), que trabalhando com folhas de
milho
,
observaram
aumento nos teores de peróxido de hidrogênio durante a
senescência.
41
0
20 40 60 80
100
120
0
40
80
120
160
200
H
2
O
2
(umol g
-1
MF)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =-101,095+4,555* X-0,031* X
2
R
2
= 0,4482
Y =-163,984+5,128 X-0,019* X
2
R
2
= 0,7651
Figura 11 –
Teor
es
de peróxido de hidrogênio no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos
reprodut
ores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
Os elevados teores de H
2
O
2
são indicativos de estresse oxidativo, ao
contrário
do que se observou nas
folhas das plantas
-
controle, cujos níveis se
mantiveram
mais baixos que as plantas desfloradas
.
Os trifólios das plantas
com órgãos reprodutores removidos, por sua vez, apresentaram elevados
teores de peróxido de hidrogênio, mas mantiveram normal sua atividade
fotossintética, além de baixo
extravazamento
de eletrólitos.
4.6
Atividades Enzimática
s
Em plantas intactas,
a
atividade da SOD apresentou queda inicial
,
com
pequena estabilidade após os 64 dias de idade, mantendo valores
42
próximos a
7,0
U SOD
mg
-1
proteína
(Figura 12). Esse resultado está de
acordo com os baixos teores de peróxido de hidrogênio nesse tratamento
(Figura 11), pois seus níveis se mantiveram baixos, até o
final
do
experimento. Além
disso
, nos 4
os
trifólios dessas plantas, as enzimas que
catalisam a degradação dessa espécie reativa tiveram suas atividades em
altos níveis (dados mostrados a seguir)
,
o que deve ter colaborado para
manter baixa a concentração de peróxido de hidrogênio.
Nas plantas com órgãos reprodutores removidos
,
a SOD apresentou
queda na
atividade
até os 64º dias (Figura 12), sendo que as maiores
concentrações de peróxido de hidrogênio foram encontradas aos 70 dias de
idade (Figura 11). Além disso, os valores máximos de H
2
O
2
(180
µ
mol
g
-1
MF)
nessas plantas
ocorreram
por volta dos 92 dias de idade, momento
no
qual
a atividade da SOD se
elevou
novamente
,
até ating
ir
valores cerca de
15 vezes superiores aos iniciais
.
0
20 40 60
80
100
120
0
10
20
30
40
50
60
70
SOD (U SOD mg
-1
proteína)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =53,840-1,134** X+0,007** X
2
R
2
= 0,5464
Y =104,160-3,018** X+0,023** X
2
R
2
= 0,8646
Figura 12 – Atividade da dismutase do superóxido (SOD) no 4º trifólio de
soja,
Glycine max, variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com
43
órgãos reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos
(T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
A atividade da catalase no 4º trifólio das plantas, n
os
dois
tratamentos, caiu acentuada e progressivamente ao longo de todo o
desenvolvimento
,
atingindo
valores
três vezes menores que os iniciais
(Figura 13) e concluindo com tendência de estabilização ao final do
experimento. Esse decréscimo, também
obtido
por Fu
et al (2000), é um dos
fatores que podem contribuir para o acúmulo de peróxido de hidrogênio nas
plantas com órgãos reprodutores removidos (
Fig
ura
11
),
indicando que a
enzima não teve atividade suficiente para a decomposição do H
2
O
2
nessas
plantas
, ou sua atuação não esteve relacionada com a senescência.
O
balanço entre as atividades de SOD e APX ou CAT nas células é crucial
para determinar o nível de “steady-state” de peróxido de hidrogênio
(Mittler,
2002)
.
O elevado estresse também pode inibir a síntese da enzima ou levar a
uma mudança na montagem das suas subunidades (MacRae and
Fergusam, 1985; Somashekaraiah et al, 1992), o que pode explicar o
declínio em sua atividade. Essa resposta também foi relatada em trabalho
com
Arabidopsis thaliana
,
por Jung, 2004.
Mizuno
et al
(1998)
acreditam que
a proteção das plantas contra o acúmulo de peróxido vem de uma ação
conjunta das CATs com as APXs. As diferentes afinidades da APX e CAT
pelo H
2
O
2
sugerem
que a peroxidase do ascorbato é responsável pela fina
modulação de sinalização da espécie reativa, enquanto a catalase remove o
excesso durante o e
stress
e (Mittler, 2002). As plantas-controle podem t
er
apresentado essa
res
posta
, o que
explica
o decréscimo da atividade da
catalase
, visto que também houve decréscimo nas concentrações de
peróxido de hidrogênio.
44
0
20
40 60 80 100 120
0
100
200
300
400
500
CAT (umol min
-1
mg
-1
proteína)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =872,962-13,594** X+0,061* X
2
R
2
= 0,8930
Y =855,693-13,534*** X+0,059** X
2
R
2
= 0,9519
Figura 13 – Atividade da catalase (CAT) no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos
reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
As atividades de p
eroxidase
s totais (Figura 14) e p
eroxidase
do
ascorbato
(Figura
15) apresentaram
respostas
semelhantes nos 4
os
trifólios
das
plantas
-
controle.
Amb
as
tiveram queda em suas atividades no início da
floração, seguidas de
aumento
acentuado
após o amadurecimento de grãos
e início do
processo de senescência.
Fu
et al
(2000) també
m
obtiveram
esse
tipo de resposta em soja e sugerem que a queda nas concentrações de
peróxido de hidrogênio pode ser devida
à
alta capacidade de POX e APX de
catalisar
a degradação
de
peróxido de hidrogênio. O mesmo não aconteceu
nas plantas com órgãos reprodutores removidos, cujas
atividades
enzimáticas se
mantiveram
em baixos níveis, inclusive com ligeira
e
progressiva
queda
, no caso da POX (chegando a valores abaixo de 20 µ
mol
min
-1
mg
-1
p
ro
t
eí
na). Tais quedas podem justificar o acentuado aumento nos
níveis de H
2
O
2
nas plantas que tiveram suas flores removidas.
45
0
20 40 60 80
100 120
0
20
40
60
80
100
120
POX (umol min
-1
mg
-1
proteína)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =175,430-4,579** X+0,033*** X
2
R
2
= 0,4203
Y =38,935-0,208*** X R
2
= 0,5725
Figura 14 – Atividade da p
eroxidase
(POX)
no 4º trifólio de
soja,
Glycine max,
variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos
reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
O 4º trifólio das p
lantas
com órgãos reprodutores removidos não
apresentou
variações significati
vas
nas atividades da
APX
, que se
mantiveram
sempre muito baixas ao longo do desenvolvimento, com
val
ores
não variando muito de 750 n
mol
min
-1
mg
-1
p
roteína
(Fi
gura
15). A
s
plantas
com órgãos reprodutores intactos tiveram uma ligeira queda inicial seguida
por
forte
elevação em seus níveis, com o amadurecimento de grãos e início
da senescência (chegando a valores até onze vezes maiores que os da
s
plantas desfloradas). Resposta semelhante também foi encontrada em soja
exposta ao inseticida Deltamethrin (Bashir et al, 2007
),
onde o aumento em
sua atividade foi considerado indicativo
de
que
APX
atua para eliminar as
espécies reativas de oxigênio produzidas em condições de estresse
.
46
0
20 40 60 80
100
120
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
APX (nmol min
-1
mg
-1
proteína)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =8558,678-249,370 X+1,873 X
2
R
2
= 0,5084
Y =904,824-7,007 X+0,049 X
2
R
2
= 0,0151
Figura 15 – Atividade da
peroxidase
do ascorbato
(APX)
no 4º trifólio de
soja,
Glycine max, variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com
órgãos reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos
(T2).
Níveis de significância:
*: 0,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
Segundo
Lin & Kao (2000) e Alscher et al (2002), as SODs têm papel
importante e primário na redução da peroxidação de lipídios, preservando o
metabolismo celular contra ação dos radicais superóxidos (O
2
-
), uma vez
que as dismutases do superóxido catalisam a dismutação do ânion
superóxido (O
2
-
), formando peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (
Giannopolitis
et
al
, 1977).
No entanto, a eliminação de radicais superóxido pode não ser
completa,
e
parte de suas
moléculas é utilizada como substrato para originar
o radical hidroxila (HO ), juntamente com peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
(Scandalios, 1993). As peroxidases e
as
catalases
estão entre as enzimas
que destroem
o H
2
O
2
(Asada
et al
, 1987).
A
redutase
da glutationa teve sua atividade elevada intensamente da
fase de formação de vagens à de enchimento de grãos,
dos
50 a 85 dias de
47
idade (Figura 16), nos 4
os
trifólios das plantas nos dois tratamentos
,
atingindo valores próximos entre si (média de 29 nmol min
-1
mg
-1
p
roteína
).
Em plantas com órgãos reprodutores intactos, esse aumento pod
e
estar
relacionado às concentrações de peróxido de hidrogênio, que decresceram a
partir
do 64º dia de idade. Em seguida, a atividade de GR decresceu
drasticamente ao final do experimento
,
m
antendo
atividade nas plantas
desfloradas
pouco
menor à das
planta
s
que senesciam normalmente
.
Os
dois tipos de plantas apresentaram o mesmo padrão de atividade, o que
podem indicar que essa enzima, assim como a catalase, não esteve
envolvida no processo de senescência.
0
20 40 60 80
100 120
0
7
14
21
28
35
GR (nmol min
-1
mg
-1
proteína)
Dias após a germinação
T1
T2
Y =-77,195+2,430*** X-0,014*** X
2
R
2
= 0,6473
Y =-93,752+2,970*** X-0,019*** X
2
R
2
= 0,6042
Figura 16 – Atividade da
redutase
da glutationa
(GR)
no 4º trifólio de
soja,
Glycine
max
, variedade MG/BR 46
,
ao longo do desenvolvimento, em plantas com órgãos
reprodutores intactos (T1) e plantas com órgãos reprodutores removidos (T2).
Níveis de significância:
*: 0
,05 > p
= 0,01; **: 0
,01 > p
= 0,001; ***: p < 0,001
.
As
GRs
também atuam removendo o excesso de peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
). São enzimas dependentes de NAD(P)H, que catalisam a
redução da glutationa oxidada (GSSG) em duas moléculas de glutationa
48
reduz
ida (GSH) (Calberg e Mannervik, 1985). São componentes do ciclo
ascorbato
-glutationa, participando juntamente com as APXs, redutase
do
desidroascorbato (DHAR) e redutase
do
monodesidroascorbato (MDHAR)
na remoção do excesso de H
2
O
2
e outras espécies reativas de oxigênio
(Foyer
et al, 1997; Mittler, 2002). Além disso, a atividade da redutase
da
glutationa pode compensar os baixos níveis de catalase (Figura 13
)
e de
peroxidase do ascorbato (Figura 15) em plantas com órgãos reprodutores
removidos.
49
5
–
CONCLUSÕES
As
folhas das plantas com órgãos reprodutores intactos
avaliadas
apresentaram
perda de pigmentos, queda na atividade fotossintética, danos
celulares e estresse oxidativo, chegando à senescência do organismo como
um to
do
. De forma contrária
,
as folhas das plantas com órgãos reprodutores
removidos
mantiveram
suas funções
fisiológicas
próximas
ao normal até o
fim do experimento.
As plantas intactas chegaram à senescência, com queda nas
atividades fotossintéticas, que não
foram
acompanhadas por aumento na
peroxidação de lipídios nem na
produção de
H
2
O
2
. Esse
s resultados
indica
m
que a senescência deste grupo de plantas não deve ter sido causada e/ou
acompanhada p
or
estresse oxidativo.
Nas plantas desfloradas, apesar da intensa produção de H
2
O
2
, as
atividades das enzimas antioxidantes se mantiveram baixas. Nestas plantas,
a remoção dos órgãos reprodutores pode ter levado a estresse oxidativo. N
o
entanto,
tal estresse
não
resultou em senescência foliar, já que essas
plantas
ma
ntiveram suas folhas verdes e fotossinteticamente ativas até o
final
do experimento.
50
6
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APÊNDICES
Tabela 1: Teores de pigmentos ao longo do desenvolvimento de folhas de soja,
variedade MG/BR 46, nos diferentes tratamentos: T1 (plantas com órgãos
reprodutores intactos) e T2 (plantas com órgãos rep
rodutores removidos).
Clorofila a
Clorofila b
Razão Chla/Chlb
Carotenóides
Coletas
Dias
T1
T2
T1
T2
T1
T2
T1
T2
1
22
12,499
13,505
2,889
3,778
4,450
3,658
2,994
3,319
2
29
17,720
15,440
6,813
2,612
2,618
6,107
3,551
4,009
3
36
18,230
19,142
5,428
5,010
3,384
3,878
3,961
4,539
4
43
17,707
16,178
6,680
3,764
2,664
4,376
3,814
3,760
5
50
20,121
17,789
7,314
7,827
2,751
2,261
4,152
3,497
6
57
19,250
19,941
6,881
6,760
2,834
2,962
4,319
4,245
7
64
16,589
17,479
4,278
4,819
3,952
3,681
3,831
4,074
8
70
16,600
17,013
7,716
8,703
2,180
1,951
3,436
3,780
9
78
16,113
24,051
5,933
8,328
2,709
2,904
3,318
4,640
10
85
16,095
23,133
8,839
12,145
2,117
2,170
3,793
5,319
11
92
12,718
18,510
5,300
8,404
2,415
2,211
2,999
3,021
12
99
8,156
20,428
3,263
9,11
2
2,510
2,271
2,109
4,265
13
103
5,955
17,235
2,787
7,004
2,213
2,454
1,433
3,020
14
106
0,285
19,679
0,479
7,670
0,741
2,553
0,331
3,720
Tabela 2: Taxas de trocas gasosas ao longo do desenvolvimento de folhas de
soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes tratamentos: T1 (plantas com órgãos
reprodutores intactos) e T2 (plantas com órgãos reprodutores removidos).
A
gs
Ci/Ca
Coleta
Dia
T1
T2
T1
T2
T1
T2
1
22
13,56
13,35
0,439
0,418
0,82
0,82
2
29
17,10
17,17
0,476
0,456
0,79
0,78
3
36
15,12
1
5,37
0,347
0,339
0,77
0,75
4
43
14,00
14,81
0,195
0,214
0,72
0,72
5
50
16,53
15,66
0,347
0,359
0,76
0,78
6
57
12,35
14,11
0,200
0,231
0,68
0,66
7
64
15,05
16,33
0,363
0,360
0,77
0,75
8
70
10,25
10,72
0,102
0,106
0,60
0,55
9
78
9,31
7,71
0,181
0,103
0
,70
0,60
10
85
6,49
6,89
0,182
0,119
0,82
0,70
11
92
5,79
9,99
0,140
0,205
0,79
0,75
12
99
4,38
8,90
0,119
0,134
0,81
0,67
13
103
1,24
6,40
0,050
0,137
0,80
0,60
60
Tabela 3: Atividades de Catalase (µmoles.min
-1
.mg
-1
ptn), Ascorbato Peroxidase
(nmoles.min
-1
.mg
-1
ptn) e Peroxidase (µmoles.min
-1
.mg
-1
ptn) ao longo do
desenvolvimento de folhas de soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes
tratamentos: T1 (plantas com órgãos reprodutores intactos) e T2 (plantas com
órgãos reprodutores removidos).
CAT
APX
POX
Coletas
Datas
T1
T2
T1
T2
T1
T2
4
43
365,160
384,432
634,303
738,987
27,297
29,901
5
50
396,707
320,765
846,211
600,263
35,112
31,497
6
57
320,741
271,201
896,814
673,751
29,776
26,060
7
64
202,142
232,421
863,745
615,121
24,988
23,028
8
70
216,921
238,278
557,725
698,573
23,733
19,716
9
78
220,617
183,217
790,180
896,127
31,272
31,399
10
85
137,582
81,510
481,008
468,051
19,640
16,405
11
92
135,350
119,979
987,721
716,765
27,082
20,199
12
99
94,154
93,081
857,992
421,368
25,332
21,942
13
103
160,893
99,795
1642,256
1062,129
34,664
18,117
14
106
108,537
101,917
5489,233
621,517
109,095
14,170
Tabela 4: Atividades de Superóxido Dismutase (U SOD.min
-1
.mg
-1
ptn) e
Glutationa Redutase (nmolesNADPH.min
-1
.mg
-1
ptn) ao longo do
desenvolvimento de folhas de soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes
tratamentos: T1 (plantas com órgãos reprodutores intactos) e T2 (plantas com
órgãos reprodutores removidos).
SOD
GR
Coletas
Datas
T1
T2
T1
T2
4
43
18,966
4,085
7,298
6,626
5
50
12,221
15,492
7,380
7,779
6
57
10,940
14,890
5,580
3,601
7
64
6,070
9,307
10,040
9,979
8
70
7,465
4,848
29,210
31,082
9
78
5,615
4,890
29,294
27,204
10
85
4,912
6,774
31,473
27,882
11
92
8,442
13,746
23,031
24,408
12
99
6,858
13,262
21,314
15,268
13
103
6,140
21,797
18,788
11,723
14
106
6,950
62,222
17,907
9,313
61
Tabela 5: Teores de Ascorbato (µmoles.mg
-1
MF) ao longo do desenvolvimento
de folhas de soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes tratamentos: T1 (plantas
com órgãos reprodutores intactos) e T2 (plantas com órgãos reprodutores
removidos).
ASC
Coletas
D
atas
T1
T2
4
43
409,559
454,837
5
50
338,457
194,643
6
57
236,969
264,422
7
64
338,573
285,468
8
70
353,091
281,021
9
78
312,058
392,665
10
85
519,168
498,627
11
92
561,196
595,991
12
99
722,807
573,014
13
103
643,629
522,625
14
106
522,115
611,322
Tabela 6: Teores de Peróxido de Hidrogênio (µmoles.g
-
1
MF) ao longo do
desenvolvimento de folhas de soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes
tratamentos: T1 (plantas com órgãos reprodutores intactos) e T2 (plantas com
órgãos reprodutores removidos).
H2O2
Coletas
Datas
T1
T2
4
43
39,265
55,969
5
50
51,698
34,032
6
57
58,625
45,799
7
64
48,503
55,032
8
70
55,973
85,229
9
78
67,425
115,639
10
85
63,625
186,023
11
92
43,722
181,035
12
99
72,900
164,242
13
103
38,085
147,913
14
106
4,448
141,770
62
Tabela 7: Concentração de Aldeído Malônico (nmoles.g
-1
MF) ao longo do
desenvolvimento de folhas de soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes
tratamentos: T1 (plantas com órgãos reprodutores intactos) e T2 (plantas com
órgãos reprodutores removidos).
MDA
Coletas
Datas
T1
T2
4
43
80,814
81,268
5
50
57,161
79,468
6
57
66,532
61,110
7
64
52,194
57,059
8
70
49,369
70,539
9
78
71,024
127,622
10
85
76,376
161,909
11
92
46,891
144,633
12
99
46,904
176,835
13
103
51,910
151,178
14
106
64,984
147,191
Tabela 8: Concentração
de
Extravazamento
de Eletrólitos (%) ao longo do
desenvolvimento de folhas de soja, variedade MG/BR 46, nos diferentes
tratamentos: T1 (plantas com órgãos reprodutores intactos) e T2 (plantas com
órgãos reprodutores removidos).
Extravazamento
Coletas
D
atas
T1
T2
4
43
5,646
6,443
5
50
4,841
5,396
6
57
3,798
4,336
7
64
5,318
5,163
8
70
4,390
5,032
9
78
4,778
4,212
10
85
5,023
4,734
11
92
8,106
5,332
12
99
6,947
4,761
13
103
6,821
4,298
14
106
6,621
4,894
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