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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
VANESSA FONTANA
Análise da expressão gênica em células-tronco mesenquimais de medula
óssea humana durante o comprometimento com a linhagem osteogênica
Ribeirão Preto - SP
2009
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VANESSA FONTANA
Análise da expressão gênica em células-tronco mesenquimais de medula
óssea humana durante o comprometimento com a linhagem osteogênica
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Genética da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Genética
Orientador: Prof. Dr. Geraldo A. S. Passos
Ribeirão Preto - SP
2009
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FONTANA, V.
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS DE MEDULA ÓSSEA HUMANA DURANTE O
COMPROMETIMENTO COM A LINHAGEM OSTEOGÊNICA.
RIBEIRÃO PRETO, 2009
128p. il., 30cm.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM GENÉTICA - FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO –
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO.
ORIENTADOR: PASSOS, GERALDO A.S
.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Vanessa Fontana
Análise da expressão gênica em células-tronco mesenquimais de medula óssea
humana durante o comprometimento com a linhagem osteogênica.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Genética da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto para
obtenção do título de Mestre.
Área de concentração: Genética
Aprovado em: ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho...
...com muito carinho e admiração ao meu grande amor e companheiro Ronaldo pelo
apoio e incentivo incondicional em todos os momentos desta jornada. À minha mãe
e meu irmão Vitor que estiveram sempre presentes mesmo geograficamente
distantes. Aos colegas e amigos do grupo de Imunogenética Molecular.
AGRADECIMENTOS
Em especial, agradeço ao Prof. Geraldo, meu orientador, pelo acolhimento e confiança que sempre
demonstrou ter por mim. Por permitir que eu me tornasse parte de uma grande equipe, acolhedora e
cientificamente produtiva, o laboratório Imunogenética Molecular. Obrigada por tornar minha primeira
experiência em pesquisa tão agradável e rica em aprendizado.
Aos colegas e amigos do laboratório de Imunogenética Molecular pelo companheirismo e pelas
alegrias que marcaram estes três anos de convivência. Vocês estarão sempre em meu coração.
À toda a equipe das células-tronco coordenada pelo Prof. Dr. Geraldo Passos: as alunas Janaína,
Adriane, Rayana, Glauce e os pesquisadores Profa. Dra. Karina F. Bombonato-Prado e Adalberto L. Rosa.
Ao Renato David Puga pela criação do programa de extração de dados do GNF Symatlas que foi de
extrema importância para a realização deste trabalho e certamente vai contribuir para inúmeros outros.
À Profa. Dra. Belinda Simões pela concessão das medulas ósseas fornecidas pelo Serviço de Transplante
de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.
À Profa. Dra. Elza Sakamoto-Hojo e sua equipe pela colaboração e disponibilização do laboratório
para a realização de alguns experimentos.
Aos Profs.: Dr. Adalberto L. Rosa e Dr. Paulo Tambasco de Oliveira e sua equipe pela colaboração e
disponibilização do laboratório para a realização de experimentos de cultura e imunofluorescência indireta.
Aos docentes, pós-graduandos, funcionários e especialmente ao coordenador Prof. Dr. Ademilson
Espencer Egea Soares da Pós-Graduação do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto por toda a dedicação visando manter a excelência da nossa Pós-graduação.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Fundação de
Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro de suma importância
para o desenvolvimento desse projeto.
RESUMO
FONTANA, V. Análise da expressão gênica em células-tronco mesenquimais de
medula óssea humana durante o comprometimento com a linhagem
osteogênica. 2009. 128 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
As células-tronco são definidas como células capazes de auto-renovação e
diferenciação em células especializadas. Dentre as células-tronco adultas, as
mesenquimais ocupam uma posição de destaque. São células multipotentes que
podem originar células de origem mesodérmica, como osteoblastos, adipócitos e
condrócitos. Além disso, vários estudos demonstraram que essas células também
podem se diferenciar em células de origem extra-mesenquimal, como neurônios e
hepatócitos, fenômeno este denominado plasticidade. Aspectos moleculares
envolvidos com a plasticidade das células-tronco adultas, bem como durante o
processo de comprometimento e diferenciação em células especializadas não estão
completamente elucidados. Considera-se que as células-tronco expressam, embora
em baixos níveis, uma gama diversa de genes relacionados aos diferentes destinos
de diferenciação. Durante a diferenciação o repertório de genes expressos seria
reduzido, acompanhado do aumento nos níveis de expressão de uma coleção
menor de genes que orientariam a especialização celular. Para o presente estudo
adotamos essa hipótese e elaboramos um sistema-modelo experimental no qual
células-tronco mesenquimais de medula óssea humana foram induzidas in vitro à
diferenciação em osteoblastos. As células-tronco mesenquimais foram obtidas de
três doadores saudáveis de medula óssea e induzidas quimicamente à diferenciação
em osteoblastos (meio α-MEM acrescido de dexametasona, ácido ascórbico e β-
glicerofosfato) durante 24 h, 48 h, 7 dias e 21 dias. O RNA total foi extraído das
culturas de células indiferenciadas (0h) e durante o processo de diferenciação (24 h,
48 h, 7 d e 21 d). Todo o processo de diferenciação foi monitorado com ensaios
bioquímicos e por imunocitoquímica. Para avaliar a expressão gênica das células-
tronco e durante o processo de diferenciação utilizamos a tecnologia dos cDNA
microarrays. Os dados foram analisados com auxílio de programas de bioinformática
especializados. Um banco público de dados de expressão gênica (GNF Symatlas)
também foi consultado, o que nos auxiliou na interpretação dos dados. Sondas de
cDNA fluorescentes (Cy3) oriundas das amostras de RNA foram hibridizadas com
os cDNA microarrays (4.500 seqüências alvo). Um pool de cDNAs irrelevantes
marcados com Cy5 foi usada como referência na hibridização. A expressão gênica
diferencial durante a diferenciação foi analisada pelo método SAM (significance
analysis of microarrays) (FDR < 5%). Os genes diferencialmente expressos foram
classificados segundo sua representação tecidual de acordo com os valores de
expressão obtidos do banco de dados GNF Symatlas. Além disso, foi avaliada por
RT-PCR semiquantitativa, a expressão de genes relacionados à osteogênese
(ALPL, osteocalcina, COL1A1, RUNX2 e osteopontina), e um marcador de
adipócitos, PPARG. Observamos que as células-tronco mesenquimais no seu
estado “tronco” expressam, em níveis similares, genes característicos das linhagens
osteo e adipocítica. Entretanto, ao longo do comprometimento com a linhagem
osteoblástica o número de genes modulados (reprimidos e induzidos) é crescente.
Revelamos que nas fases iniciais da diferenciação osteoblástica in vitro os genes
que representam células-tronco adultas foram reprimidos. Entretanto, com o avanço
do comprometimento com a linhagem osteoblástica observamos que certos genes
foram induzidos como, por exemplo, BMP1, SMAD7, IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN,
CDH8, GDF10 e SCARB2, todos relacionados à osteogênese. Nossos resultados
são importantes para um melhor entendimento das bases genético-moleculares
associadas ao potencial “plástico” e de diferenciação das células-tronco
mesenquimais.
Palavras chave: célula-tronco mesenquimal, plasticidade, diferenciação,
osteogênese, expressão gênica.
ABSTRACT
FONTANA, V. Gene expression analysis of mesenchymal stem cells from
human bone marrow during the osteogenic commitment. 2009. 128 f. Master’s
Dissertation –Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão
Preto, 2009.
Stem cells (SC) are defined by their property of self-renewal and differentiation into
specialized cells. The adult mesenchymal stem cells (MSC) correspond to a special
type of them. MSC are multipotent and can differentiate into several cell types of
mesodermal origin, including osteoblasts, adipocytes and condroblasts. Also, their
capacity to differentiate into extra-mesenchymal cells, such as neurons and
hepatocytes, was demonstrated and this phenomenon was termed plasticity.
Nevertheless, the molecular basis of adult SC plasticity, as well during their
commitment and differentiation into specialized cells isn’t completely elucidated. It
was hypothesized that SC express, although at low levels, many genes related to the
differentiation cues that they could assume. According to this hypothesis, the
repertory of genes is reduced during differentiation, at the same time that
upregulating the expression of “specialized” genes, which characterize the future
tissue. In this study, we adopted this hypothesis and to test it we used an in vitro
osteogenic differentiation model-system. Mesenchymal stem cells were obtained
from bone marrow of three healthy donors and induced to differentiate into
osteoblasts in α-MEM media supplemented with dexametasone, ascorbic acid and
betaglycerol phosphate during 24 h, 48 h, 7 and 21 days. The differentiation process
was monitored by biochemical and immunocytochemistry assays. The total RNA was
obtained from undifferentiated (0 h) and differentiated cells. To evaluate gene
expression during the differentiation, we used the cDNA microarray technology.
Fluorescent Cy3 cDNA probes originated from SC RNA samples were hybridized
with a cDNA microarray containing 4,500 target sequences. A pool of irrelevant
cDNA was labeled with Cy5 and used as reference. The differential gene expression
during differentiation was analyzed by SAM (Significance Analysis of Microarrays)
method (FDR < 5%). The public gene expression database (GNF Symatlas) was
used to annotate the tissue representation of the modulated genes. The expression
of some specific genes related to osteogenesis (ALPL, osteocalcin, COL1A1, RUNX2
e osteopontin) and an adipocyte marker (PPARG) was evaluated by semi-
quantitative RT-PCR. It was observed that MSC in their “stem state” express, at
similar levels, representative genes of the osteo and adipocyte lineages. However,
during the osteoblastic differentiation process the number of modulated genes
(repressed or induced) increased. It was observed that at early in vitro osteoblastic
differentiation, adult SC characteristics genes were downregulated. Conversely, the
osteoblastic commitment of these cells displayed upregulation of specific genes
related to bone formation (BMP1, SMAD7, IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN, CDH8,
GDF10 and SCARB2). These results are important to provide a better understanding
of the genetic and molecular basis of the plasticity and commitment phenomenon of
adult MSC.
Key words: mesenchymal stem cells, plasticity, differentiation, osteogenesis, gene
expression.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Possíveis explicações para a plasticidade celular. (a) Células de um determinado
tecido podem existir em um órgão não-relacionado. (b) Fusão celular. (c)
Transdiferenciação. (d) Persistência de células-tronco pluripotentes em tecidos adultos.
Fonte: Verfaillie, 2002.............................................................................................................19
Figura 2. Multipotencialidade das células-tronco mesenquimais de medula óssea. A
habilidade de diferenciação em células da linhagem mesodérmica está representada por
setas contínuas. As setas descontínuas referem-se à controversa capacidade de se
diferenciar em outras linhagens (ectodérmica e endodérmica). Fonte: Ucelli;
Moretta;
Pistoia
, 2008..........................................................................................................................25
Figura 3. Representação esquemática da hipótese de Zipori. (a) Célula-tronco expressando
vários genes (RNAm) relacionados aos diferentes “destinos” de diferenciação. (b) Célula
diferenciada expressando um número menor de genes (genes induzidos) cujas funções são
relacionadas com a célula especializada. Fonte: Zipori, 2004b .............................................30
Figura 4. Pipeline utilizado na análise de dados de microarrays. O banco de dados GNF
SymAtlas foi utilizado na busca da representação tecidual dos genes diferencialmente
expressos ...............................................................................................................................58
Figura 5. Proliferação celular de células-tronco mesenquimais em cultura obtidas após 7, 14
e 21 dias cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de diferenciação (MED) ..............63
Figura 6. Viabilidade celular de células-tronco mesenquimais obtidas após 7, 14 e 21 dias
cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de diferenciação (MED)..............................64
Figura 7. Quantidade de proteínas totais (µg/10
4
células) em células-tronco mesenquimais
obtidas após 7, 14 e 21 dias cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de
diferenciação (MED)...............................................................................................................64
Figura 8. Imunofluorescência indireta para fosfatase alcalina. A: Células-tronco
mesenquimais após 7 dias em cultura em meio mínimo (controle) e B: Células-tronco
mesenquimais após 7 dias em cultura em meio de diferenciação osteogênico. A marcação
em vermelho revela a proteína fosfatase alcalina (ALP). Em verde (faloidina) evidencia-se o
citoesqueleto e, em azul (DAPI) o núcleo celular. Microscópio de fluorescência; aumento de
40x..........................................................................................................................................65
Figura 9. Atividade de fosfatase alcalina (U/L/10
4
células) em células-tronco mesenquimais
obtidas após 7, 14 e 21 dias cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de
diferenciação (MED)...............................................................................................................66
Figura 10. Coloração de matriz mineralizada com Alizarin Red. A: Células-tronco
mesenquimais após 21 dias de cultivo em meio mínimo (controle) e B: Células-tronco
mesenquimais após 21 dias de cultivo em meio de diferenciação osteogênica. Em vermelho
observa-se a presença de nódulos de mineralização. Microscópio de contraste de fase
invertido, aumento de 40 X.....................................................................................................66
Figura 11. Eletroforese de RNA total em gel de agarose. Avaliação da integridade do RNA
total das amostras experimentais. Gel de agarose desnaturante 1% corado com brometo de
etídeo. Visualização em transiluminador UV..........................................................................67
Figura 12. Eletroforese de RNA total em gel de agarose. Avaliação da integridade do RNA
total das amostras experimentais. Gel de agarose desnaturante 1% corado com brometo de
etídeo. Visualização em transiluminador UV..........................................................................68
Figura 13. Expressão gênica avaliada por RT-PCR semiquantitativa. A expressão dos genes
ALPL, COL1A1, BGLAP, SPP1, RUNX2 e PPARG em amostras de cDNA de células-tronco
mesenquimais indiferenciadas (0 h) e células em diferenciação in vitro após 24 hs, 48 hs, 7
d e 21 dias ..............................................................................................................................70
Figura 14. Imagens típicas de lâminas de microarrays. Cada lâmina é composta de 4.500
clones de cDNA em duplicata. Em vermelho são os sinais gerados pelo fluoróforo Cy5 (RNA
de referência) e em verde estão os sinais gerados pelo fluoróforo Cy3 (amostras
experimentais) ........................................................................................................................72
Figura 15. Gráfico típico gerado pelo programa SAM a partir de uma análise pareada (por
exemplo, 0 h vs 7 dias de diferenciação). Cada ponto representa um gene, os pontos em
vermelho representam genes induzidos e os verdes reprimidos. A linha tracejada representa
o valor delta. FDR = 0,05........................................................................................................74
Figura 16. Número de genes modulados durante a diferenciação segundo as análises
pareadas feitas com o programa SAM. Número de genes modulados nas células
diferenciadas versus indiferenciadas em diferentes tempos..................................................74
Figura 17. Gráfico típico do banco GNF Symatlas da expressão de um dado gene em
diferentes tecidos humanos....................................................................................................76
Figura 18. Porcentagem dos genes induzidos após 24 h de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados ....................................................................................78
Figura 19. Porcentagem dos genes reprimidos após 24 h de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados...........................................................................78
Figura 20. Porcentagem dos genes induzidos após 48 h de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados ....................................................................................78
Figura 21. Porcentagem dos genes reprimidos após 48 h de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados...........................................................................79
Figura 22. Porcentagem dos genes induzidos após 7 d de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados ....................................................................................79
Figura 23. Porcentagem dos genes reprimidos após 7 d de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados ....................................................................................79
Figura 24. Porcentagem dos genes induzidos após 21 d de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados ....................................................................................80
Figura 25. Porcentagem dos genes reprimidos após 21 d de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados...........................................................................80
Figura 26. Quantificação relativa correspondente ao gene da fibronectina (FN1) no tempo
zero e após diferentes períodos de diferenciação de células-tronco in vitro..........................81
Figura 27. Quantificação relativa correspondente ao gene ITGA5 no tempo zero e após
diferentes períodos de diferenciação de células-tronco in vitro..............................................81
LISTA DE TABELAS
Tabela I - Primers utilizados nas reações de RT-PCR semi-quantitativa...............................48
Tabela II - Primers utilizados nas reações de Real Time PCR...............................................61
Tabela III - Genes diferencialmente expressos e relacionados à osteogênese .....................75
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..............................................................................................................15
1.1 Diferenciação celular..................................................................................................15
1.2 Células-tronco: definição e classificação ...................................................................16
1.3 Células-tronco adultas e plasticidade celular.............................................................17
1.4 Células-tronco mesenquimais: características e potencial de diferenciação.............20
1.5 Células-tronco mesenquimais: diferenciação em osteoblastos .................................26
1.6 Bases moleculares da plasticidade celular ................................................................29
1.7 Medidas de expressão gênica usando microarrays...................................................31
2 OBJETIVOS..................................................................................................................34
2.1 Objetivo geral .............................................................................................................34
2.2 Objetivos específicos..................................................................................................34
3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ...........................................................................36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................38
4.1 Processamento das medulas ósseas e isolamento das células tronco mesenquimais .38
4.2 Cultura das células-tronco mesenquimais e indução da diferenciação em
osteoblastos .....................................................................................................................39
4.3 Ensaios de osteogênese ............................................................................................40
4.3.1 Determinação da proliferação e viabilidade celular.........................................40
4.3.2 Determinação de proteínas totais....................................................................41
4.3.3 Avaliação imunocitoquímica para fosfatase alcalina .......................................41
4.3.4 Determinação da atividade de fosfatase alcalina por reação enzimática........42
4.3.5 Avaliação da formação de matriz mineralizada...............................................43
4.4 Avaliação da integridade do RNA total.......................................................................43
4.5 Avaliação quantitativa e qualitativa das amostras de RNA total por
espectrofotometria............................................................................................................44
4.6 Obtenção do RNA de referência ................................................................................45
4.7 Avaliação da expressão de genes relacionados à osteogênese e adipogênese por
RT- PCR semiquantitativa................................................................................................46
4.8 Biblioteca de cDNAs humanos...................................................................................48
4.9 Amplificação dos insertos de cDNA para a preparação dos microarrays..................49
4.10 Purificação dos produtos de PCR ............................................................................50
4.11 Preparação das lâminas de microarrays..................................................................50
4.12 Preparação das sondas de cDNA fluorescentes......................................................51
4.13 Hibridação com os microarrays................................................................................54
4.14 Aquisição das imagens de hibridação......................................................................54
4.15 Análise dos dados dos microarrays .........................................................................55
4.16 Anotação da representação tecidual pela expressão gênica...................................56
4.17 Confirmação dos dados de microarrays por Real Time PCR ..................................59
5 RESULTADOS..............................................................................................................63
5.1 Ensaios de osteogênese ............................................................................................63
5.1.1 Proliferação e viabilidade celular .....................................................................63
5.1.2 Determinação de proteínas totais....................................................................64
5.1.3 Avaliação imunocitoquímica para fosfatase alcalina .......................................65
5.1.4 Determinação da atividade de fosfatase alcalina por reação enzimática........65
5.1.5 Avaliação da formação de matriz mineralizada...............................................66
5.2 Avaliação da integridade do RNA total.......................................................................67
5.3 Avaliação da expressão de genes relacionados à osteogênese e adipogênese por
RT- PCR semiquantitativa................................................................................................68
5.4 Imagens dos microarrays ...........................................................................................71
5.5 Análise dos dados dos microarrays ...........................................................................73
5.6 Anotação da representação tecidual pela expressão gênica.....................................75
5.7 Confirmação dos dados de microarrays por Real Time PCR ....................................80
6 DISCUSSÃO .................................................................................................................83
6.1 Ensaios de osteogênese ............................................................................................83
6.1.1 Proliferação e viabilidade celular .....................................................................83
6.1.2 Determinação de proteínas totais....................................................................83
6.1.3 Determinação da atividade enzimática da fosfatase alcalina e sua localização
por imunocitoquímica................................................................................................83
6.1.4 Formação de matriz mineralizada ...................................................................84
6.2 Avaliação da expressão de genes relacionados à osteogênese e adipogênese por
RT- PCR semiquantitativa................................................................................................84
6.3 Análise dos dados dos microarrays ...........................................................................88
6.4 Anotação da representação tecidual pela expressão dos genes...............................92
7 CONCLUSÕES .............................................................................................................95
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................97
ANEXOS ........................................................................................................................106
INTRODUÇÃO
Introdução
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Diferenciação celular
O organismo de um mamífero é composto de mais de 250 tipos celulares
derivados de uma única célula inicial, o zigoto. Ao longo do desenvolvimento
embrionário, células filhas são geradas por meio de divisões sucessivas, e se
organizam em três folhetos germinativos classificados de acordo com a localização
no embrião. O ectoderma constitui a camada mais externa, o mesoderma é a
camada intermediária e o endoderma, o folheto mais interno. Nos três folhetos
germinativos as células continuam a se dividir e se especializam gradativamente em
estrutura e função, isto é, se diferenciam (GENESER, 2003).
Pode-se definir a diferenciação celular como o processo pelo qual se originam
as diferenças entre as células de um indivíduo, caracterizada pela especialização
gradual das células em termos estruturais e funcionais. Em geral, a diferenciação
celular é acompanhada da perda simultânea de outras possibilidades de
diferenciação, ou seja, perda da potência (GENESER, 2003).
De acordo com a potência ou capacidade de diferenciação, o zigoto tem
capacidade máxima de diferenciação, é dito totipotente. Ao longo do
desenvolvimento embrionário as células se tornam mais comprometidas com uma
linhagem celular e consequentemente menos potentes. O comprometimento,
também designado determinação celular precede a diferenciação morfológica e
funcional. Diz-se que uma célula sofreu determinação ou comprometimento quando
estabeleceu o seu destino (GENESER, 2003).
Introdução
16
As células do endoderma formarão os epitélios, sistema nervoso e grande
parte dos órgãos sensoriais. O mesoderma participa da formação dos tecidos
conjuntivos, inclusive sangue, ossos, cartilagens, adipócitos, fibroblastos, músculos
e contribui com a formação dos vasos sanguíneos, cavidades do corpo, gônadas e
rins. O mesênquima é o tecido conjuntivo do embrião que se origina principalmente
do mesoderma. Ele é composto de células precursoras de vários tipos de células do
tecido conjuntivo, músculo cardíaco, músculo liso, endotélio, linfonodos, entre
outros. O endoderma forma o revestimento da maior parte do trato digestivo e
respiratório (O’RAHILLY; MULLER, 2005).
O fenômeno da diferenciação celular é guiado por modificações na atividade do
material genético, uma vez que todas as células possuem material genético idêntico. A
morfologia e função de cada tipo celular se devem à expressão de alguns genes
específicos de cada tipo celular. A atividade dos genes durante a diferenciação é um
processo bastante complexo e pouco compreendido, mas concebe-se que sua
regulação deve ocorrer durante a transcrição de RNAs mensageiros (RNAm) e/ou por
interações entre os próprios transcritos (RNAm e microRNAs).
1.2 Células-tronco: definição e classificação
As células-tronco, em termos funcionais, são definidas como células dotadas
de capacidade de auto-renovação que estão no topo da hierarquia de uma linhagem
e podem gerar células diferenciadas de um dado tecido (KOOY et al., 2000).
Com base na sua origem e propriedades biológicas, as células-tronco podem
ser classificadas em embrionárias ou adultas. As células-tronco embrionárias são
derivadas da camada interna do embrião no estágio de blastocisto e possuem
capacidade de dar origem a mais de 200 tipos celulares (ZHANG et al., 2006).
Introdução
17
As células-tronco adultas estão presentes em órgãos ou tecidos diferenciados
(BARRY; MURPHY, 2004) e são responsáveis pela manutenção da integridade dos
tecidos, pelo reparo diante de lesões e pela remodelação dos tecidos (ZAGO;
COVAS, 2006).
De acordo com o potencial de diferenciação, as células-tronco podem ser
divididas em quatro categorias: totipotentes, pluripotentes, multipotentes e
oligopotentes (ZHANG et al., 2006).
As células-tronco totipotentes têm o potencial de diferenciação em células dos
três folhetos embrionários (ectodérmico, mesodérmico e endodérmico) bem como
nos anexos embrionários. Uma célula deste tipo é capaz de originar um ser humano
completo quando implantada em um útero normal. Em mamíferos apenas os zigotos
são totipotentes (ZHANG et al., 2006).
Na fase de blastocisto, as camadas mais internas podem originar qualquer
tipo celular, mas a placenta se originará apenas da camada mais externa. As células
da camada interna são chamadas pluripotentes, estas continuam a se dividir e são
progenitores de tecidos das três camadas germinativas (ZHANG et al., 2006).
As células multipotentes podem se diferenciar em alguns tipos celulares dentro de
um determinado órgão. Células-tronco oligopotentes podem originar poucos tipos
celulares especializados (ZHANG et al., 2006).
1.3 Células-tronco adultas e plasticidade celular
As células-tronco adultas têm sido isoladas de uma ampla variedade de
tecidos, incluindo hematopoiético, neural, gastrointestinal, epidermal, hepático
Introdução
18
(JIANG et al., 2002), vascular, muscular, pancreático (SPEES et al., 2003), cordão
umbilical (KIM et al., 2004; LEE et al., 2004), dentre outros.
O papel fisiológico destas células em adultos ainda não está claro. Entretanto,
sua evidente capacidade de diferenciação in vitro em vários tecidos está sendo
explorada visando a regeneração de tecidos (BOCELLI-TYNDALL et al. 2007).
As células-tronco tecido-específicas, até recentemente, eram consideradas
como capazes de se diferenciar somente em células do tecido de origem
(multipotentes), entretanto, estudos recentes mostraram que estas células podem
se diferenciar em outras linhagens além das do tecido de origem (JIANG et al.,
2002).
Esta mudança de paradigma com relação à potência das células-tronco
adultas é definida como plasticidade celular. A definição mais aceita de plasticidade
se refere às descobertas de novas habilidades das células-tronco adultas de
atravessar barreiras de linhagem e adotar fenótipos funcionais de células de outros
tecidos (HERZOG et al., 2003).
Experimentos in vivo demonstram a plasticidade por meio de modelos de
lesão induzida e observação da migração e diferenciação das células-tronco adultas
para as áreas lesadas regenerando estas regiões (HERZOG et al., 2003). Quatro
hipóteses são propostas para explicar a plasticidade observada em experimentos in
vivo (Figura 1).
A primeira delas é atribuída à presença de células-tronco em um dado tecido
que poderiam se diferenciar em células de um tecido não-relacionado, dando a falsa
impressão de plasticidade (VERFAILLIE, 2002).
Um mecanismo alternativo seria a fusão celular de uma célula-tronco adulta
com uma célula diferenciada, o que converteria o padrão de expressão da célula-
Introdução
19
tronco no padrão da célula diferenciada. Entretanto, experimentos in vitro têm
mostrado que este parece ser um evento bastante raro (1/10
4
a 1/10
6
) (JIANG et al.,
2002; HERZOG et al., 2003; VERFAILLIE, 2002).
Há ainda a possibilidade de uma célula diferenciada sofrer reprogramação
genética e tornar-se pluripotente, fenômeno denominado transdiferenciação ou
desdiferenciação (VERFAILLIE, 2002).
Uma quarta explicação seria a permanência de células-tronco pluripotentes
em tecidos adultos (JIANG et al., 2002; VERFAILLIE, 2002). A presença de células
pluripotentes no organismo adulto não é aceita integralmente na comunidade
científica, principalmente devido às contradições nos experimentos realizados in vitro
e in vivo.
Figura 1. Possíveis explicações para a plasticidade celular. (a) Células de um determinado
tecido podem existir em um órgão não-relacionado. (b) Fusão celular. (c)
Transdiferenciação. (d) Persistência de células-tronco pluripotentes em tecidos adultos.
Fonte: Verfaillie, 2002.
Introdução
20
Song e Tuan (2004) mostraram que células-tronco mesenquimais humanas,
conhecidas como células pré-comprometidas com a linhagem mesenquimal podem
sofrer transdiferenciação in vitro em outros tipos celulares de acordo com o estímulo
externo que recebem. Concluíram que quando trocado o agente indutor de
diferenciação, as células totalmente diferenciadas (osteoblastos, condrócitos e
adipócitos) poderiam sofrer transdiferenciação a um estágio indiferenciado através
de reprogramação genética. Conseguiram originar adipócitos e condrócitos a partir
de osteoblastos derivados de CTMs, bem como osteócitos e condrócitos a partir de
adipócitos e, osteoblastos e adipócitos a partir de condrócitos.
Outros estudos mostraram uma série de eventos de transdiferenciação:
células de músculo esquelético (células satélites) em células sanguíneas (TSAI;
KITTAPPA; MCKAY, 2002; CAPLAN; BRUDER, 2001); do sistema nervoso central
em musculares, hepatócitos, miocárdio e neurais; hematopoéticas em epitélio e
tecidos endodérmicos e ectodérmicos (TSAI; KITTAPPA; MCKAY, 2002).
A falta de consenso na literatura envolve o fato de que os dados coletados
são geralmente baseados em características morfológicas e ensaios
imunohistoquímicos, o que pode ser insuficiente para concluir que estas células irão
se integrar funcionalmente nos tecidos. Segundo Grove, Bruscia e Krause (2004) e
Verfaillie (2002) sem a prova funcional in vivo não se pode concluir que estas células
são efetivamente plásticas.
1.4 Células-tronco mesenquimais: características e potencial de diferenciação
Dentre os diversos tipos de células-tronco adultas, as células-tronco
mesenquimais (CTM) compõem um grupo que vem despertando particular interesse.
Introdução
21
Segundo Minguell, Erices e Conget (2001): “A multipotencialidade, bem como a
facilidade de isolamento e sua expansão in vitro tornam as células-tronco
mesenquimais uma alternativa terapêutica atrativa com um amplo espectro de
aplicações clínicas no contexto de terapia celular.”
O interesse neste tipo celular cresceu exponencialmente nos últimos anos
devido ao seu grande potencial de uso na regeneração de tecidos e órgãos lesados,
como vem sendo demonstrado em inúmeros estudos clínicos e pré-clínicos (BARRY;
MURPHY, 2004).
Encontra-se em andamento cerca de 2.200 ensaios clínicos com células-
tronco registrados no NIH (National Institutes of Health, USA), a maioria utilizam
células de medula óssea, destes 52 são com células-tronco mesenquimais
purificadas (http://www.clinicaltrials.gov). As CTMs estão sendo testadas para o
tratamento de doenças cardíacas isquêmicas e degenerativas, lesões ósseas,
condrais, tendinosas, pulmonares, da medula espinhal, do sistema nervoso central,
do fígado e em doenças genéticas como a osteogênese imperfeita (ZAGO; COVAS,
2006).
A presença de células-tronco não-hematopoiéticas na medula óssea foi
inicialmente sugerida por Cohnheim, em 1867. A partir da década de 1970,
Friedenstein, Gorskaja e Kulagina (1976 apud PROCKOP, 1997) consolidou a
hipótese de que a medula óssea continha células aderentes de forma fibroblastóide,
que se multiplicavam rapidamente, dotadas de habilidade em se transformarem em
colônias que se assemelhavam com ossos e cartilagem.
Dando continuidade ao trabalho de Friedenstein, outros autores
estabeleceram que estas células, agora denominadas células-tronco mesenquimais
Introdução
22
eram multipotentes e poderiam se diferenciar em osteoblastos, condroblastos,
adipócitos e eventualmente mioblastos. (PROCKOP, 1997).
Na medula óssea elas fornecem o suporte para células-tronco
hematopoiéticas, e estão sendo usadas em protocolos de transplante para aumentar
a “pega” do enxerto. Outra propriedade interessante é a sua habilidade de reduzir a
proliferação de linfócitos. Recentemente CTMs expandidas ex vivo tem sido usadas
com sucesso para tratar doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD- Graft-
versus-host disease), demonstrando serem dotadas de propriedade
imunossupressoras (BOCELLI-TYNDALL et al., 2007; AGGARWAL; PITTENGER,
2005).
Além disso, estas células possuem habilidade quimiotática e de migração
para áreas de lesão ou inflamação, propriedade conhecida como homing
(AGGARWAL; PITTENGER, 2005).
Como parte do nicho das células-tronco hematopoiéticas, as CTMs participam
na regulação da sobrevivência, quiescência e diferenciação em células sanguíneas
maduras. As CTMs exercem uma influência na formação inicial de linfócitos B, sendo
a interação com as células estromais da medula óssea fundamental para o
desenvolvimento normal dos progenitores de linfócitos B. Foi demonstrado que a
galectina-1 (Gal-1) é um ligante da célula estromal para o receptor pré-B humano,
que é indispensável para a sobrevivência do linfócito B imaturo. Interessantemente,
a galectina-1 é altamente expressa em CTMs (AGGARWAL; PITTENGER, 2005).
Nos estudos com células de medula óssea já era conhecida a existência de
um grande número de células que se aderiam ao plástico na cultura, proporcionando
um micro-ambiente para o crescimento das CT hematopoéticas e para a
diferenciação em granulócitos e eritrócitos. Observou-se que os precursores
Introdução
23
hematopoéticos interagiam diretamente com estas células aderentes, e estas
compartilhavam muitas características com as CTMs (PROCKOP, 1997).
Pittenger et al. (1999) realizaram o isolamento, a expansão e a caracterização
destas células a partir de medula óssea humana extraída da crista ilíaca. Estas
células multipotentes, responsáveis pela composição em torno de 0,001% a 0,01%
das células nucleadas da medula óssea adulta, crescem in vitro de maneira
aderente, como células fibroblastóides em meio de cultura apropriado. Observou-se
ainda a capacidade das células expandidas de se diferenciar, mediante estímulos
específicos em linhagens mesenquimais tais como: ossos, cartilagens, adipócitos,
tendões, músculos e estroma medular.
Do ponto de vista fisiológico, a diferenciação de CTM em osteoblastos é
importante na manutenção das espículas trabeculares ósseas que compõem a
medula óssea. Por outro lado, com a idade, a medula é parcialmente substituída por
tecido adiposo, o que explicaria a diferenciação em adipócitos. Com relação aos
condroblastos, pode estar relacionada ao reparo inicial de fraturas (PROCKOP,
1997).
As CTMs são encontradas tipicamente na fração estromal da medula óssea
adulta, porém nos últimos anos, células exibindo características morfológicas de
CTM foram isoladas de tecido adiposo (ZUK et al., 2001), trabéculas ósseas
(SOTTILE et al., 2002), cordão umbilical (LEE et al., 2004; KIM et al., 2004) sangue
fetal, fígado, pulmão, vilo coriônico da placenta e fluido amniótico (JACKSON et al.,
2007).
A presença destas células em sangue periférico adulto é controversa. O estudo
conduzido por Zvaifler et al. (2000) mostra que existem CTMs no sangue periférico de
indivíduos normais. Outro trabalho mostra que são encontradas em todos os tecidos
Introdução
24
exceto em sangue periférico, sugerindo um novo nicho para estas células, o
compartimento perivascular (DA SILVA MEIRELLES; CHAGASTELLES; NARDI, 2006).
O método de isolamento tradicional baseia-se no fato de que as CTMs
aderem seletivamente em superfícies plásticas, enquanto as hematopoiéticas são
removidas com as trocas de meio de cultura. Não há um marcador específico que a
identifique, diferentes grupos têm optado por uma variedade de combinações de
marcadores, a maioria inclui CD29 e CD105 (JACKSON et al., 2007).
Em virtude do aumento significativo no interesse clínico e biológico nas CTM
nas últimas duas décadas, o Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee do
ISCT (The International Society for Cellular Therapy) gerou dois artigos com o intuito
de uniformizar a nomenclatura e identificação destas células.
Com o objetivo de promover o uso de uma terminologia padronizada para
facilitar o intercâmbio de conhecimento entre pesquisadores da área, propuseram
que as células aderentes ao plástico, atualmente chamadas células-tronco
mesenquimais, sejam nomeadas células estromais mesenquimais multipotentes. A
terminologia células-tronco mesenquimais deve ser utilizada apenas para um
subgrupo destas células que demonstrem atividade de células-tronco através de
critérios mínimos (HORWITZ et al., 2005).
Três critérios mínimos foram propostos para definir CTM: aderência ao
plástico quando mantidas em cultura; expressão das moléculas de superfície
CD105, CD73 e CD90, e não devem expressar CD45, CD34, CD14 ou CD11b,
CD79a ou CD19 e HLA-DR; diferenciação em osteblastos, condroblastos e
adipócitos in vitro (DOMINICI et al., 2006).
Introdução
25
A versatilidade e a abundância de fontes para obtenção destas células são
notáveis. Assim como as demais células-tronco adultas, vários estudos demonstram
a plasticidade destas células in vivo e in vitro (Figura 2).
Figura 2. Multipotencialidade das células-tronco mesenquimais de medula óssea. A
habilidade de diferenciação em células da linhagem mesodérmica está representada por
setas contínuas. As setas descontínuas referem-se à controversa capacidade de se
diferenciar em outras linhagens (ectodérmica e endodérmica). Fonte: Ucelli;
Moretta;
Pistoia
, 2008.
Um trabalho de bastante impacto foi desenvolvido por Jiang et al. (2002). O
estudo evidencia a existência de uma subpopulação de CTMs, as MAPCs
(multipotent adult progenitor cells) capaz de se diferenciar in vitro em células com
características de mesoderma (endotélio), endoderma (hepatócitos) e
neuroectoderma (astrócitos, oligodendrócitos e neurônios). Demonstraram que estas
células eram capazes de se inserir nos tecidos quando injetadas em animais sadios.
A existência de evento de fusão celular foi excluída, sugerindo a permanência de
células-tronco pluripotentes em tecidos adultos.
Introdução
26
Após transplante de medula óssea ou de CT hematopoéticas em humanos,
foram detectados mioblastos esqueléticos, mioblastos cardíacos, endotélio, epitélio
hepático, do ducto biliar, do pulmão, da pele e do intestino e células
neuroectodérmicas de origem do doador (JIANG et al., 2002).
A diferenciação de células-tronco mesenquimais em células neurais foi
demonstrada em vários trabalhos tanto in vitro como in vivo. Entretanto a
capacidade de geração de neurônios com capacidade funcional é hipotética. De
acordo com o estudo de Mareschi et al. (2006), a presença de marcadores e
morfologia neurais, somadas às propriedades eletrofisiológicas características,
demonstram a capacidade de células-tronco mesenquimais de medula óssea gerar
células que se assemelham a neurônios.
Reyes et al. (2002) mostrou que as MAPCs diferenciam em células com
morfologia e fenótipo endotelial tanto in vitro quanto in vivo. Ferrari e Mavilio (2002)
mostraram que as células de medula óssea entravam em processo de diferenciação
miogênica frente a danos musculares, participando assim do reparo muscular.
Outros estudos sugerem que CTMs podem dar origem a endotélio,
hepatócitos, células neurais após injeção em blastocistos (TSAI; KITTAPPA;
MCKAY, 2002; MINGUELL; ERICES; CONGET, 2001; CAPLAN; BRUDER, 2001).
1.5 Células-tronco mesenquimais: diferenciação em osteoblastos
O sistema-modelo de diferenciação in vitro em osteoblastos a partir de
células-tronco mesenquimais é um modelo clássico e de fácil reprodutibilidade para
estudos de diferenciação celular.
Introdução
27
Jaiswal et al. (1997) desenvolveram um sistema-modelo de indução de
diferenciação de CTMs humanas adultas em osteoblastos. O protocolo otimizado
inclui meio de cultura (DMEM ou α-MEM) suplementado com indutores (100 nM
dexametasona; 10 nM beta-glicerolfosfato e 0,05 nM ácido ascórbico).
Os glicocorticóides endógenos estão envolvidos no remodelamento e
formação ósseos. A dexametasona é um potente corticosteróide muito utilizado na
avaliação de respostas celulares in vitro. O ácido ascórbico, essencial em culturas
de células osteogênicas, funciona como cofator na hidroxilação de resíduos de lisina
e prolina do colágeno, atuando ainda como promotor da síntese de matriz óssea
protéica (JAISWAL et al., 1997).
Segundo Long (2001) define-se como osteopoiese o processo de
desenvolvimento de células ósseas que gera osteoblastos a partir de células-tronco
mesenquimais. O termo osteogênese deve ser reservado para a geração de matriz
óssea mineralizada por osteoblastos maduros.
A indução da osteopoiese é observada pelo aparecimento de morfologia de
osteoblastos (forma cubóide), pelo aumento na atividade de fosfatase alcalina e
formação de matriz extracelular mineralizada (JAISWAL et al., 1997).
Quatro estágios na maturação destas células são definidos de acordo com
critérios morfológicos e histoquímicos: pré-osteoblasto, osteoblasto, osteócito e
células de revestimento ósseo (AUBIN,1998).
Segundo Long (2001) pode-se compartimentalizar de acordo com o estágio
do desenvolvimento em: CTM, células osteoprogenitoras, pré-osteoblastos e
osteoblastos. Os osteoprogenitores seriam células comprometidas com a linhagem
óssea.
Introdução
28
Osteoblastos são definidos como células pós-proliferativas, cubóides,
fortemente positivas para fosfatase alcalina, que revestem a matriz óssea em
regiões ativas de produção de matriz. Os osteoblastos podem ainda ser identificados
pela capacidade de sintetizar macromoléculas fenótipo-específicas, como proteínas
da matriz óssea, receptores de hormônios, citocinas e fatores de crescimento. O
fenótipo de um osteoblasto maduro é definido pela habilidade de síntese de tecido
mineralizado, conhecido como osso (AUBIN,1998).
Uma pequena proporção de osteoblastos (10-20%) é incorporada dentro da
matriz extracelular recém formada, estes fazem parte do mais maduro estágio de
diferenciação da linhagem osteoblástica, os osteócitos. Os osteócitos são menores
que os precursores, perdem muitas organelas citoplasmáticas e são considerados
metabolicamente inativos (AUBIN,1998).
No esqueleto adulto, a maioria das superfícies ósseas que não estão sendo
remodeladas são cobertas por uma camada de células finas e elongadas, as células
de revestimento ósseo, que representam a forma inativa do osteoblasto em termos
de produção de matriz (AUBIN,1998).
Os ossos são responsáveis pelas funções: locomoção, suporte e proteção de
órgãos vitais (encéfalo, medula espinhal, coração e pulmões), suporte da
hematopoiese na medula óssea, reserva de minerais, especialmente cálcio, apoio
para músculos, ligamentos e tendões.
Aproximadamente 10% da massa óssea de um indivíduo é renovada por ano.
A deposição óssea e a reabsorção, efetuados por, respectivamente, osteoblastos e
osteoclastos, são processos dinâmicos que ocorrem continuadamente (COHEN,
2006).
Introdução
29
A compreensão dos processos celulares e mecanismos moleculares da
formação óssea requer a identificação de componentes (genes) envolvidos no
comprometimento das CTMs, proliferação de osteoprogenitores, diferenciação e
mineralização (LONG, 2001; NAKASHIMA; CROMBRUGGHE, 2003).
A obtenção de osteoblastos funcionais a partir de células-tronco
mesenquimais tem sido utilizada amplamente na engenharia de tecidos e terapia
celular. Ohgushi et al. (2004) coordenou um estudo envolvendo mais de 30
pacientes usando células-tronco mesenquimais autólogas para reconstrução de
ossos após excisão cirúrgica. As células foram extraídas da medula óssea e
cultivadas sobre próteses de hidroxiapatita e fosfato tricálcio e então implantadas
nos locais lesados.
Infusões intravenosas de CTM humanas expandidas ex vivo foram bem
toleradas em pacientes voluntários e parecem ser seguras (DEANS; MOSELEY,
2000).
1.6 Bases moleculares da plasticidade celular
A propriedade das células-tronco mesenquimais obtidas de tecidos adultos de
gerar células de origem mesenquimal e extra-mesenquimal está bem demonstrada
por meio de ensaios in vitro, porém pouco se conhece sobre os mecanismos
moleculares subjacentes. É fundamental estudar a expressão gênica de populações
de células mesenquimais adultas para conseguirmos melhor entendimento das
bases molecular da plasticidade celular.
Zipori (2005) defende a hipótese se que as células-tronco não possuem um
grupo de genes que as especifiquem, já que a auto-renovação não é específica de
Introdução
30
células-tronco e pode acontecer por vias moleculares alternativas. Propõe ainda o
conceito de “stem state”, colocando a propriedade “tronco” como um estado e não uma
entidade, e sugere que a plasticidade seja a característica principal do “stem state”.
Segundo o autor, as células-tronco indiferenciadas expressam, embora em
baixos níveis, um grupo de genes relacionados aos destinos de diferenciação que
elas podem assumir. Durante a diferenciação o repertório de genes expressos seria
reduzido, acompanhado do aumento nos níveis de expressão de uma pequena
coleção de genes, que orientam a especialização celular (Zipori, 2004a) (Figura 3).
As células-tronco mesenquimais são bastante plásticas, entretanto, até o
momento não foram demonstrados os passos intermediários de cada cascata de
diferenciação. Zipori (2005) argumenta que as células-tronco mesenquimais podem
assumir diferentes destinos sem a necessidade de um longo processo de
comprometimento. No organismo adulto elas são rapidamente mobilizadas mediante a
existência de lesões teciduais. Segundo o autor, essas células se encontram em um
estado “standby”, no qual muitas famílias gênicas que caracterizam células
diferenciadas são expressas em baixos níveis tornando a célula apta a mudar
rapidamente para uma determinada direção mediante estímulo externo (Zipori, 2004b).
Figura 3. Representação esquemática da hipótese de Zipori. (a) Célula-tronco expressando
vários genes (RNAm) relacionados aos diferentes “destinos” de diferenciação. (b) Célula
diferenciada expressando um número menor de genes (genes induzidos) cujas funções são
relacionadas com a célula especializada. Fonte: Zipori, 2004b.
Introdução
31
Woodbury, Reynolds e Black (2002) relatam a expressão de genes de
linhagens mesodérmicas, endodérmicas, ectodérmicas e germinativas em células-
tronco mesenquimais indiferenciadas antes de qualquer estímulo de diferenciação.
Os autores sugerem que as estas células são “multidiferenciadas” ao invés de
indiferenciadas. A conclusão do trabalho é que as mudanças moleculares que
ocorrem durante a diferenciação neural são modulações quantitativas na expressão
de genes, e não apenas a indução de genes neurais.
Tremain et al. (2001) usando a técnica de microSAGE (Microserial Analysis of
Gene Expression) catalogaram pouco mais de 2000 seqüências transcritas por uma
colônia de células-tronco mesenquimais humanas derivadas de uma única célula.
Observaram ainda a expressão simultânea de transcritos característicos de células
estromais, osteoblastos, mioblastos, condrócitos, endotélio, epitélio e células da
linhagem neural.
1.7 Medidas de expressão gênica usando microarrays
Os cDNAs microarrays constituem uma tecnologia que possibilita a
mensuração da expressão de RNAs mensageiros de vários genes em um único
ensaio de hibridação, tornando-se uma ferramenta atrativa para a obtenção de uma
visão global do estado de células em termos de expressão gênica em diferentes
situações fisiológicas ou patológicas. O poder dos microarrays como ferramenta
experimental deriva da sua especificidade e afinidade da complementariedade das
bases (BROWN; BOTSTEIN, 1999).
Os microarrays consistem em arranjos de seqüências de DNA ou de
oligonucleotídeos depositados, com o uso de robôs de alta precisão, ordenadamente
em suportes sólidos, como lâminas de vidro. Amostras de RNAm são copiadas em
Introdução
32
cDNA e marcadas com fluorocromos e então hibridadas com os microarrays. Após a
hibridação, as imagens são capturadas com auxílio de um scanner especializado, as
intensidades de cada spot de hibridação (ponto no microarray) são convertidas em
valores numéricos (quantificação das intensidades de hibridação) e finalmente
analisadas com auxílio de programas de matemática, estatística e bioinformática
dedicados à análise de dados de arrays (HARRINGTON; ROSENOW; RETIEF, 2000).
A principal aplicação dos microarrays é a determinação dos níveis de expressão
gênica relativa. Os perfis de expressão gênica são fontes valiosas de informação que
permitem fazer comparações entre diferentes tecidos, backgrounds genéticos, estados
de doenças ou entre as mais diversas situações experimentais (STOUGHTON, 2005).
Os microarrays também podem ser utilizados para análise de DNA genômico,
possibilitando a determinação do número de cópias de genes no genoma,
identificação de mutações pontuais, genotipagem ou ainda na identificação de
interações entre proteínas e seqüências de DNA (STOUGHTON, 2005).
Essa tecnologia representou uma opção importante e apropriada para testarmos a
hipótese de Zipori sobre a plasticidade de expressão gênica das células-tronco. Os
resultados gerados com os arrays podem contribuir para uma melhor compreensão dos
mecanismos subjacentes à plasticidade de células-tronco adultas e à diferenciação celular.
O sistema-modelo de diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais
de medula óssea em osteoblastos está bem caracterizado, desde a composição do
meio de cultura com os indutores da osteogênese até os parâmetros de avaliação da
diferenciação (PROCKOP 1997, PITTENGER et al., 1999).
Alinhada à hipótese de Zipori, a proposta deste trabalho é avaliar, por cDNA
microarrays, o fenômeno da plasticidade de expressão gênica de células-tronco
adultas utilizando o sistema-modelo de diferenciação supracitado.
OBJETIVOS
Objetivos
34
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão gênica das células-tronco mesenquimais de medula
óssea humana indiferenciadas e durante sua diferenciação in vitro em osteoblastos,
utilizando a tecnologia dos cDNA microarrays.
2.2 Objetivos específicos
- Isolar células-tronco mesenquimais de medula óssea humana e induzí-las à
diferenciação em osteoblastos.
- Confirmar a diferenciação por meio de:
a) parâmetros bioquímicos: atividade de fosfatase alcalina e determinação de
proteínas totais
b) avaliação da formação de matriz mineralizada rica em cálcio
c) imunocitoquímica para fosfatase alcalina.
- Avaliar e comparar os níveis de expressão das 4.500 seqüências de cDNA
humanas por meio da técnica de microarrays em diferentes fases da diferenciação
em osteoblastos.
- Anotação da representação tecidual pela expressão gênica utilizando dados do
banco GNF SymAtlas.
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Delineamento experimental
3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
PROCESSAMENTO DE MEDULA ÓSSEA
ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
AMOSTRAS
EXPERIMENTAIS
24 h 48 h 21 d7d
TÉCNICAS MOLECULARESENSAIOS DE OSTEOGÊNESE
MINERALIZAÇÃOBIOQUÍMICOS
VIABILIDADE/
PROLIFERAÇÃO
CELULAR
PROTEÍNAS
TOTAIS
FOSFATASE
ALCALINA
AMOSTRAS DE
REFERÊNCIA
EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL
PREPARAÇÃO DAS SONDAS CY3 / CY5
HIBRIDAÇÃO COM OS MICROARRAYS
PROCESSAMENTO DAS IMAGENS
0 h
ANÁLISE DOS DADOS
IMUNOHISTOQUÍMICA
RT PCR
REAL TIME PCR (CONFIRMAÇÃO)
36
3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e métodos
38
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Processamento das medulas ósseas e isolamento das células tronco
mesenquimais
Células de medula óssea humana foram separadas de aspirados coletados
de doadores normais realizados pelo Serviço de Transplante de Medula Óssea do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP com a
colaboração da Profa. Dra. Belinda Pinto Simões.
O presente trabalho foi realizado após aprovação do Comitê de Ética da
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, USP e mediante esclarecimento e
termo de consentimento (anexo A) assinado pelos doadores. Todo o trabalho foi
realizado com material cedido por três doadores normais.
As células coletadas durante o procedimento convencional de transplante de
medula óssea foram filtradas e o material retido no filtro foi recolhido em meio de
transporte, composto de α-MEM (Minimum Essential Medium Eagle Alpha
Modification – Sigma) acrescido de 500 µg/mL gentamicina (Sigma) e 3 µg/mL
anfotericina B (Sigma). É importante salientar que as células-tronco mesenquimais
empregadas em nosso modelo experimental não seriam utilizadas nos transplantes,
pois o referido procedimento é realizado com células-tronco hematopoiéticas.
As suspensões de células foram centrifugadas a 2.000 rpm por 5 minutos e o
meio de cultura e a gordura removidos com pipeta volumétrica em câmara de fluxo
laminar. As células foram ressuspendidas em meio essencial mínimo (α-MEM
suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (Gibco), 50 µg/mL gentamicina e 0,3
µg/mL anfotericina B), colocadas em frascos plásticos de cultura de 75 cm
2
(Corning)
Materiais e métodos
39
e cultivadas em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
a 37ºC até atingirem
confluência. Os meios foram trocados a cada três dias, permitindo que apenas as
células aderentes se mantivessem na cultura.
4.2 Cultura das células-tronco mesenquimais e indução da diferenciação em
osteoblastos
Atingida confluência maior que 90%, as células aderentes foram repicadas.
Para isso, o meio de cultura foi removido, as células lavadas três vezes com 10 mL
de PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) e em seguida incubadas a
37ºC com solução contendo tripsina 0,25% (Gibco) e EDTA 1 mM. Passados 10
minutos, foi adicionado α-MEM contendo 10% SBF para inativar a tripsina. A
suspensão foi centrifugada 2.000 rpm por 5 minutos e ressuspendida em meio de
cultura contendo SBF. O número de células viáveis foi determinado através da
contagem em câmara de Neubauer diluídas 1:2 com o corante azul de Tripan 1%.
Foram adicionadas 8x10
4
células em frascos de cultura de 75 cm
2
(Corning).
Estas foram cultivadas em meio essencial mínimo (α-MEM suplementado com 10%
de Soro Bovino Fetal e 50 µg/mL gentamicina e 0,3 µg/mL anfotericina B) até
atingirem confluência de 50-70%. Os frascos foram divididos em cinco grupos
segundo a fase de diferenciação: células indiferenciadas; diferenciadas durante 24
h; 48 h; 7 dias e 21 dias. Nos frascos correspondentes aos quatro últimos grupos o
meio foi substituído pelo meio de diferenciação composto de α-MEM suplementado
com 10% de soro fetal bovino, 50 µg/mL gentamicina, 0,3 µg/mL anfotericina B,
acrescido dos indutores de diferenciação em osteoblastos: 10
-7
M dexametasona
Materiais e métodos
40
(Sigma), 5 µg/mL de ácido ascórbico (Sigma) e 2,16 g/mL de β-glicerofosfato
(Sigma).
4.3 Ensaios de osteogênese
O sistema-modelo de diferenciação em osteoblastos utilizado neste trabalho é
um modelo consolidado e bastante citado na literatura especializada. Ainda assim,
optou-se por confirmar e monitorar a diferenciação das células aderentes de medula
óssea em osteoblastos por meio de ensaios de proliferação e viabilidade celular,
determinação de proteínas totais e fosfatase alcalina e produção de matriz
mineralizada pelas células com fenótipo de osteoblastos.
Para tais ensaios 2 x 10
4
células/poço foram colocadas em placas de cultura
de 24 poços (TPP) e cultivadas em meio essencial mínimo e meio de diferenciação
em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
a 37ºC.
4.3.1 Determinação da proliferação e viabilidade celular
Ao final de 7, 14 e 21 dias em cultura, as células foram removidas das placas
com solução contendo tripsina 0,25% (Gibco) e EDTA 1 mM, diluídas 1:2 com o
corante azul de Tripan 1% (Sigma) e contadas em câmara de Neubauer.
A viabilidade celular foi calculada como porcentagem de células viáveis com
relação ao número total de células contadas. Foram consideradas células inviáveis
aquelas cuja coloração mostrou-se azulada ao microscópio óptico, indicando que a
integridade da membrana plasmática foi afetada, o que permitiu a entrada do
corante na célula.
Materiais e métodos
41
4.3.2 Determinação de proteínas totais
A determinação de proteínas totais foi realizada segundo o método de Lowry. O
meio de cultura dos poços foi removido, os poços lavados três vezes PBS aquecido a
37°C e então preenchidos com 2mL de água deionizada. As placas foram colocadas
por 20 minutos a -20ºC e posteriormente 15 minutos a 37ºC. Repetido o ciclo por 5
vezes, a suspensão de células lisadas foram vigorosamente homogeneizadas.
Para a determinação de proteínas totais, 1mL da suspensão de cada poço foi
transferido para tubos de ensaio devidamente identificados, misturados com 1 mL de
solução de Lowry Reagent (Sigma) e deixados em repouso à temperatura ambiente por
20 minutos. Após esse período, foi adicionado a cada tubo 0,5 mL da solução de
reagente de Folin e Ciocalteu’s phenol Reagent (Sigma) e novamente deixados em
repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a absorbância de cada
tubo foi medida em espectrofotômetro (Ultrospec 2100, GE Healthcare) no comprimento
de onda de 680nm. A concentração de proteínas totais expressa em µg/mL, em cada
poço foi calculada a partir de uma curva padrão preparada com soroalbumina bovina.
4.3.3 Avaliação imunocitoquímica para fosfatase alcalina
Para a imunolocalização da fosfatase alcalina, as células foram cultivadas
durante 7 dias sobre lamínulas Thermanox (Nunc) nos meios mínimo e de
diferenciação. Posteriormente, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% em
PBS por 10 minutos, e depois lavadas com PBS. A permeabilização foi feita com
solução de Triton X-100 a 0,5% em PBS por 10 minutos, seguida de bloqueio com
leite desnatado a 5% em PBS por 30 minutos.
O anticorpo primário (Monoclonal Hybridoma B4-78, Developmental Studies
Hybridoma Bank, Iowa City, IA), que reconhece a isoforma bone/liver/kidney da
Materiais e métodos
42
fosfatase alcalina diluído 1:100; foi incubado por 1 hora em atmosfera úmida. Em
seguida procedeu-se a lavagem com PBS por 3 vezes, incubou-se com o anticorpo
secundário diluído 1:200 (Anti-coelho marcado com Alexa Flúor 594; Molecular
Probes). Para a visualização do citoesqueleto (actina) e dos núcleos de células
aderidas foram utilizados, respectivamente, faloidina conjugada com Alexa Fluor 488
diluído 1:200 (Molecular Probes) e DAPI diluído 1:300 (Molecular Probes). Após
montagem das lamínulas com meio de montagem ProLong Antifade (Molecular
Probes), as marcações foram analisadas sob epifluorescência em microscópio de luz
(Leica). Todas as etapas de imunolocalização foram realizadas no Laboratório de
Cultura de Células do Departamento de Morfologia da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto, USP, sob a supervisão da Profa. Dra. Karina F. Bombonato-Prado.
4.3.4 Determinação da atividade de fosfatase alcalina por reação enzimática
Foram utilizadas as mesmas suspensões de células lisadas aplicadas na
determinação de proteínas totais. A atividade de fosfatase foi medida através do Kit
Fosfatase alcalina – Ensaio de ponto final (Labtest). Em tubos de ensaio foram
colocados 0,5 mL de solução de tampão alcalino, os quais foram mantidos em
banho a 37°C. Um volume de 50 µL do reagente 1 (substrato timolftaleína
monofosfato) foi acrescido em todos os tubos e incubados por 5 minutos.
Acrescentou-se 50 µL das amostras e solução padrão (45 U/L) nos respectivos
tubos. Após incubação por 10 minutos cronometrados adicionou-se 2 mL do
reagente de cor às reações. Estas foram lidas a 590nm e a determinação de
fosfatase alcalina foi dada segundo a equação:
FA (U/L)= Abs teste x45
Abs Padrão
Materiais e métodos
43
4.3.5 Avaliação da formação de matriz mineralizada
Ao final de 21 dias em placas de cultura, o meio foi removido, os poços
lavados três vezes com PBS pré-aquecido a 37°C e incubados com solução de
formalina 10% por algumas horas. Em seguida, as células foram desidratadas com
soluções de concentrações crescentes de etanol (30% a 96%). Os poços secos
foram cobertos com o corante Alizarin red S (Sigma) 20 mg/mL pH 4,2 por 10
minutos. Os poços foram lavados com água destilada e então visualizados e
fotografados em microscópio.
4.4 Avaliação da integridade do RNA total
As células mantidas em cultura correspondentes aos cinco grupos:
indiferenciadas (cultivadas em meio essencial mínimo), diferenciadas (cultivadas em
meio de diferenciação) durante 24 h, 48 h, 7 dias e 21 dias foram removidas dos
frascos de cultura com solução contendo tripsina 0,25% e EDTA 1 mM, lavadas com
PBS estéril e contadas em câmara de Neubauer.
As células foram divididas em tubos eppendorf contendo até 10
6
células/tubo
e submetidas ao procedimento de extração de RNA total segundo o protocolo do Kit
SV Total RNA Isolation System (Promega), que inclui os passos de lise das células,
purificação do RNA, tratamento com DNAse e eluição do RNA com água livre de
nuclease fornecido pelo fabricante.
Devido à baixa concentração de RNA obtida, optou-se por re-precipitar as
amostras de RNA com isopropanol. Adicionados 3 volumes de isopropanol gelado
sobre a solução aquosa de RNA, estas foram incubadas a –20º C por 18 horas e
então centrifugadas a 12000 x g por 10 minutos. O precipitado de RNA foi lavado
com etanol 75% e ressupenso em 15 µL de água livre de nuclease.
Materiais e métodos
44
4.5 Avaliação quantitativa e qualitativa das amostras de RNA total por
espectrofotometria
A quantificação de RNA total foi realizada por leitura espectrofotométrica em
comprimento de onda UV (260nm) usando cubetas de quartzo. As soluções de RNA
foram diluídas 1:50 com água milli-Q autoclavada e lidas num espectrofotômetro
(Ultrospec 2100, GE Healthcare) nos comprimentos de onda 230nm, 260nm e
280nm. A quantidade de RNA total é dada pela multiplicação do valor de
absorbância a 260nm pelo fator 40, o que permite a estimativa da concentração de
RNA total em µg/mL.
O grau de pureza das soluções de RNA foi avaliado pelas razões A
260
/A
280
e
A
260
/A
230.
Uma solução pura de RNA apresenta razão A
260
/A
280
em torno de 2,0.
Razões inferiores a 1,7 são indicativas de contaminação com proteínas. A razão
A
260
/A
230
pode variar de 1,8 a 2,2, entretanto, razões inferiores podem indicar
contaminação com guanidina e/ou fenol. No presente trabalho, utilizamos somente
preparações puras de RNA.
A integridade do RNA foi avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose
1% com formaldeído (eletroforese desnaturante). Um total de 35 mL de agarose
fundida em água milli-Q autoclavada foi acrescido de 10 mL de formaldeído 37%
(Merck) e 11 mL de tampão de migração 5X (20,6 g de MOPS dissolvidos em 800
mL de acetato de sódio 50 mM pH 7,0; 10 mL de EDTA 0,5 M pH 8,0; volume final
ajustado para 1L). Paralelamente procedeu-se a desnaturação das amostras de
RNA contendo 3 µg de RNA total em um volume de 4,5 µL, acrescida de 2 µL de
tampão de migração 5X. 3,5 µL de formaldeído 37% e 10 µL de formamida. Esta
reação foi incubada por 15 minutos a 65ºC em banho-maria e imediatamente
resfriada em banho de gelo.
Materiais e métodos
45
Às amostras desnaturadas foram acrescentados 1 µL de solução de brometo
de etídeo diluído 1:3 (solução estoque 10mg/mL) e 2 µL de dye loading solution
(1/10 do volume) e aplicadas no gel de agarose. A corrida eletroforética foi realizada
a 80V durante 90 minutos e em seguida foram visualizadas e fotografadas em
transiluminador UV.
4.6 Obtenção do RNA de referência
Em experimentos de expressão gênica em grande escala, um RNA de
referência deve conter a totalidade dos transcritos que compõe o microarray. Para
atingir tal objetivo o nosso laboratório utiliza um pool de RNA derivado de
quantidades equimolares extraídos de quatro linhagens celulares humanas. É
importante salientar que o RNA de referência não corresponde ao controle
experimental, que neste experimento são as células-tronco não-tratadas com os
indutores de diferenciação (cultivadas em meio essencial mínimo).
As linhagens empregadas para o preparo do pool de referência foram: U343
MG-a, uma linhagem tumoral de astrocitoma, gentilmente cedida pelo Prof. Dr.
Carlos Gilberto Carlotti Jr. (Depto de Cirurgia da FMRP – USP), foi cultivada em
meio de cultura HAM F10 + DMEM suplementado com 15% de SBF. A linhagem
HeLa, uma linhagem de carcinoma de colo de útero, cedida pela Profa. Dra. Enilza
Maria Espreafico (FMRP – USP) foi cultivada sob as mesmas condições da linhagem
U343 MG-a. A linhagem tumoral de laringe, a Hep-2, cedida pelo Prof. Dr. Eurico de
Arruda Neto (FMRP – USP), assim como a linhagem linfocítica Jurkat, também
cedida pela Profa. Dra. Enilza Maria Espreafico (FMRP – USP), foram cultivadas em
meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SBF.
Materiais e métodos
46
Atingida a confluência das linhagens aderentes (U343 MG-a, Hep-2 e HeLa) e
não-aderentes (Jurkat) seguiu-se a extração de RNA total com o reagente Trizol
(Invitrogen).
Para cada frasco de cultura de 75 cm
2
(Corning), foram adicionados 7,5 mL de
Trizol, homogeneizado vigorosamente e incubado por 15 minutos. A solução foi
coletada em tubo de centrífuga de fundo cônico acrescentando-se 1,4 mL de salina
0,9% tratada com DEPC (inibidor de RNAse) e 1,4 mL de clorofórmio (Merck). Após
vigorosa agitação, os tubos foram centrifugados a 12.000 x g por 15 minutos. A fase
aquosa (superior) foi removida para um novo tubo e foram adicionados 3 volumes de
isopropanol. No dia seguinte, os tubos foram centrifugados a 12.000 x g por 10
minutos e os precipitados foram lavados duas vezes com etanol 75%. O precipitado
de RNA foi eluído em 100 µL de água tratada com DEPC. As soluções de RNA
foram avaliadas quali e quantitativamente conforme descrito anteriormente.
Concluída a extração de RNA das quatro linhagens, foram combinadas
quantidades idênticas de RNA de cada uma delas, aliquotadas em tubos contendo
10 µg a uma concentração de 2 µg/µL e armazenadas a -80ºC.
4.7 Avaliação da expressão de genes relacionados à osteogênese e
adipogênese por RT- PCR semiquantitativa
Para avaliar a expressão de genes relacionados à osteogênese e um gene
relacionado ao fenótipo de adipócitos, durante o comprometimento com a linhagem
dos osteoblastos, efetuamos reações de RT-PCR (Reverse Transcriptase –
Polymerase Chain Reaction) semiquantitativa. As amostras dos cinco grupos citados
anteriormente foram avaliadas segundo a expressão dos genes: ALPL (alkaline
phosphatase), BGLAP (bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein), também
Materiais e métodos
47
conhecida como osteocalcina, COL1A1 (collagen, type I, alpha 1), RUNX2 (runt-
related transcription factor 2), SPP1 (secreted phosphoprotein 1), também conhecida
como osteopontina, e um marcador de adipócitos, PPARG (peroxisome proliferator-
activated receptor gamma), além do gene usado como constitutivo GAPDH
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).
Os primers foram desenhados com auxilio do software Primer3
(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) conforme mostrados na
Tabela I. Para os genes que apresentavam transcritos alternativos, tomou-se o
cuidado de desenhar primers que amplificassem todos os transcritos com o mesmo
tamanho molecular.
A primeira etapa foi a síntese de cDNA. As reações de transcrição reversa
foram realizadas com 2 µg de RNA total, 1 µL de oligo (dT) 1 µg/ µL, 1 µL de mix de
nucleotídeos (2 mM), 4 µL de 5 X First Strand Buffer (Invitrogen), 2 µL de DTT 0,1 M,
1 µL de inibidor de RNAse 40 U/µL (Promega) e 1 µL de transcriptase reversa 200
U/µL (SuperScript II- Invitrogen), volume final de 20 µL. As reações foram realizadas
no termociclador MasterCycler Gradient (Eppendorf), a 42°C por 50 minutos
seguidos de 15 minutos a 70ºC. Em seguida, estas amostras foram diluídas 1:2 com
água milli-Q autoclavada e armazenada a -20°C. A segunda etapa, a PCR semi-
quantitativa foi feita até a diluição 1: 2048. Foram adicionados a 2 µL da reação de
síntese cDNA puro ou diluído, 17 µL de água milli-Q autoclavada, 2,5 µL de tampão
10 X (Invitrogen), 1 µL de mix de nucleotídeos 2 mM, 1 µL de cada primer 10 µM
(forward e reverse), 0,5 µL de Taq DNA Polimerase (Invitrogen). O protocolo de
amplificação foi semelhante para todos os genes: 94ºC por 5 minutos; 30 ciclos de
94°C por 45 segundos, temperatura variável de acordo com o gene (tabela II) por 45
segundos, 72ºC por 45 segundos; 72ºC por 10 minutos e 4ºC por 10 minutos.
Materiais e métodos
48
Para a análise dos produtos amplificados, uma alíquota de 10 µL foi aplicada
em gel de agarose 1,5% em tampão TAE 1 X (Tris-acetato 0,04 M, EDTA 1 mM)
contendo brometo de etídeo. Após 2 horas de eletroforese a 80 V, o gel foi
visualizado e fotografado.
Tabela I - Primers utilizados nas reações de RT-PCR semi-quantitativa.
Número de acesso
(GenBank)
Símbolo
do gene
Primer Seqüência
Amplicon
(pb)
Tm
NM_000478.3 ALPL
ALPL (F)
ALPL (R)
5’-CCACGTCTTCACATTTGGTG-3’
5’-AGACTGCGCCTGGTAGTTGT-3’
196 57ºC
NM_199173.2 BGLAP
BGLAP (F)
BGLAP (R)
5’-GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG-3’
5'-CTGGAGAGGAGCAGAACTGG-3'
230 57ºC
NM_000088.3 COL1A
COL1A (F)
COL1A (R)
5’-GTGCTAAAGGTGCCAATGGT-3’
5'-CTCCTCGCTTTCCTTCCTCT-3'
228 57ºC
NM_001024630.2;
NM_001015051.2
e NM_004348.3
RUNX2
RUNX2 (F)
RUNX2 (R)
5’-CCTTGGGAAAAATTCAAGCA-3’
5'-AACACATGACCCAGTGCAAA-3’
181 57ºC
NM_001040058.1;
NM_000582.2;
NM_001040060.1
SPP1
SPP1 (F)
SPP1 (R)
5’-GCCGAGGTGATAGTGTGGTT-3’
5'-GTGGGTTTCAGCACTCTGGT-3'
242 57ºC
NM_002046.3 GAPDH
GAPDH (F)
GAPDH (R)
5’-CTGCACCACCAACTGCTTA-3’
5’-CATGACGGCAGGTCAGGTC-3’
296 60ºC
NM_138712.3;
NM_005037.5;
NM_138711.3;
NM_015869.4
PPARG
PPARG (F)
PPARG (R)
5’-GAGCCCAAGTTTGAGTTTGC-3’
5’-CTGTGAGGACTCAGGGTGGT-3’
198 57ºC
4.8 Biblioteca de cDNAs humanos
O laboratório de Imunogenética Molecular (Depto de Genética – FMRP –
USP) mantém uma biblioteca de cDNAs humanos com cerca de 9.000 clones
provenientes do IMAGE Consortium (http://image.llnl.gov), cedida pela Dra.
Catherine Nguyen (INSERM U928 de Marseille-Luminy – França). A caracterização
completa desta biblioteca foi realizada, a qual é composta de clones cujos insertos
Materiais e métodos
49
têm de 0,5 a 1,5 Kb clonados em três vetores: Lafmid, Bluescript e pT7T3. As
freqüências da representação dos 229 tecidos humanos são mostradas no Anexo B.
Os clones também foram classificados de acordo com a distribuição cromossômica
(Anexo C) o processo biológico no qual estão envolvidos (Anexo D), além da grande
porcentagem de expressed sequence tags (ESTs), às quais poderão ser atribuídas
funções. As seqüências depositadas no microarray utilizado nesse trabalho podem
ser recuperadas on-line no endereço URL (www.rge.fmrp.usp.br/passos/hs_array).
4.9 Amplificação dos insertos de cDNA para a preparação dos microarrays
A amplificação foi realizada de acordo com uma modificação do protocolo
descrita por Hedge et al., (2000). Os clones de E. coli repicados em placas de 96
poços contendo meio de cultura 2X LB + ampicilina foram incubados durante 16
horas. A seguir uma alíquota de 10 µL da cultura foi diluída 1:10 com água milli-Q
estéril e transferida para outra placa de 96 poços. Estas placas foram incubadas a
95
o
C por 10 minutos para lise das células e liberação dos plasmídeos. Após
centrifugação a 4000xg por 5 minutos e 10µL do sobrenadante foi adicionado a 40µL
de um mix para PCR contendo KCl 50 mM, Tris 10 mM pH 8.0, MgCl
2
1,5 M, solução
de dNTP (2mM), primers com seqüências consenso aos três vetores presentes na
biblioteca (10µM), primer LBP 1S (5´-TGTGGATTGTGAGCGGATAA-3´) e primer
1AS (5´-GGGTTGAATTAGCGGAACG-3´), Taq DNA polimerase (5U/µL) em volume
final de 50 µL. Os insertos foram amplificados segundo o programa descrito por
Menossi et al., (2000): 5 minutos a 94°C, seguidos de 30 ciclos (94°C, por 30
segundos; 55°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos), seguida por uma extensão
final de 7 minutos a 72°C e 5 minutos a 4 °C. As reações foram realizadas em um
Materiais e métodos
50
termociclador MasterCycler Gradient (Eppendorf), em placas de PCR seladas com
adesivo laminado para evitar evaporação.
4.10 Purificação dos produtos de PCR
Concluída a amplificação, os produtos de PCR foram purificados com etanol.
O volume final de cada reação (50 µL) foi transferido para placas de cultivo com
fundo em “U” e foram adicionados 10 µL de acetato de sódio 3M pH 4,8 e 200 µL de
etanol absoluto. As placas foram incubadas por 16 horas (overnight) a –20
o
C,
centrifugadas a 4000xg por 60 minutos a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e os
precipitados ressuspensos em 175 µL de etanol 70%. As placas foram novamente
centrifugadas a 4000xg por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi novamente
desprezado e após a secagem dos precipitados estes foram ressuspensos em 12 µL
de água milliQ estéril. Para avaliar a pureza dos produtos amplificados, uma alíquota
de 2 µL foi aplicada em gel de agarose 1% contendo brometo de etídeo, visualizado
em transluminador U.V. e fotografado.
4.11 Preparação das lâminas de microarrays
Aos produtos de PCR previamente amplificados e purificados, foi adicionado o
mesmo volume de reagente D (GE Healthcare). Estes produtos de foram
transferidos para placas de 384 wells (Genetix) e depositados em lâminas de vidro
medindo 2,5 x 7,5 cm com auxílo de um Array Spotter Generation III (Amersham
Molecular Dynamics). As lâminas de vidro são próprias para microarrays, tratadas
com amino-propil-silano (lâminas Corning UltraGAPS 40015). O robô spotter
Materiais e métodos
51
deposita 0,9 nL em cada ponto da lâmina, constituindo uma densidade de 9.000
pontos por lâmina, que representam 4.500 clones em duplicata. As lâminas secas
passaram por um cross-linking para fixar o cDNA nas lâminas (UV 500 mJ) por meio
de um aparelho de crosslink Hoefer UV Crosslinker e posteriormente foram
armazenadas à vácuo em dessecador para prevenir da oxidação. Além dos 4.500
cDNAs, as lâminas contêm seqüências de DNA controles que servem para monitorar
a qualidade das sondas marcadas com fluoróforo (Lucidea Universal ScoreCard -
Amersham Biosciences). Os controles incluem seqüências de cDNA de organismos
filogeneticamente distantes (A. thaliana) para avaliar o grau de hibridação
inespecífica (background); seqüências de cDNA de genes constitutivos humanos
que servem para avaliar a qualidade das amostras utilizadas nas hibridações; e
seqüências de regiões intergênicas de leveduras complementares ao RNAm (spike
mix Cy3 e Cy5) incorporado nas reações de preparações das sondas, estas servem
como controles da preparação da sonda.
4.12 Preparação das sondas de cDNA fluorescentes
No presente trabalho definiu-se como sondas as preparações de cDNA
marcadas com fluorocromo Cy3 (verde) originadas das amostras de RNA total das
células-tronco. Os clones de cDNA (ou seqüências de cDNA) presentes no
microarray foram definidas como alvos.
No preparo das sondas, os RNAm (presentes nas amostras de RNA total)
foram copiadas em cDNA os quais foram marcados com o fluoróforo Cy3. Para isso
utilizamos o kit Amersham CyScribe Post-Labelling (GE Healthcare). A primeira
etapa da reação envolve reação de síntese de cDNA e a incorporação de um
Materiais e métodos
52
nucleotídeo modificado (aminoalil-dUTP ou AA-dUTP) e posterior degradação da fita
molde do mRNA com solução alcalina. Em seguida o cDNA contendo aminoalil-
dUTP é purificado para a remoção dos nucleotídeos livres e oligômeros através de
coluna cromatográfica GFX (GE Healthcare). A próxima etapa envolve a
incorporação do fluoróforo às fitas de cDNA, por reação de seu grupamento NHS –
éster com os grupos aminoalil dos nucleotídeos modificados. Uma nova etapa de
purificação cromatográfica é feita para remover fluoróforos não-incorporados,
minimizando assim a hibridação inespecífica. Neste trabalho optamos pelo sistema
monocolor, ou seja, todas as amostras referentes aos cinco grupos analisados foram
marcadas com Cy3 (fluoróforo verde). Somente os RNAs (cDNAs) de referência
foram marcados com Cy5 (fluoróforo vermelho). O sistema monocolor uniformiza a
intensidade da fluorescência dentro de um mesmo grupo de amostras.
Primeira etapa: Incorporação do AA-dUTP (dUTP amino alil)
Em tubos eppendorf em banho de gelo foram adicionados 10 µg de RNA total
das amostras das células-tronco ou dos RNAs de referência, acrescido de 1 µL de
primer randômico, 3 µL de oligo (dT) e 0,5 µL de spike mix (RNA complementar ao
Scorecard depositado na lâmina). A reação foi ajustada a um volume final de 11 µL e
incubada a 70ºC por 5 minutos seguidos de 5 minutos a 4ºC em termociclador
MasterCycler Gradient (Eppendorf). A extensão da cadeia de cDNA foi realizada
adicionando-se um mix contendo: 4 µL de tampão CyScript; 2 µL de DTT 0,1 M; 1 µL
de mix de nucleotídeos; 1 µL de AA-dUTP e 1 µL de transcriptase reversa (CyScript).
A reação foi incubada no termociclador a 42ºC por 1,5 h. Em seguida, adicionou-se 2
µL de NaOH 2,5 M para a degradação do mRNA, incubando a 37ºC por 15 minutos.
Ao final da incubação, foram adicionados 20 µL de Hepes 2 M.
Materiais e métodos
53
Purificação do cDNA modificado com AA-dUTP
Às colunas de purificação GFX foram colocados 500 µL de capture buffer e
em seguida os cDNAs foram adicionados e homogeneizados. A centrifugação foi
efetuada a 13.800 x g por 30 segundos, e o líquido do tubo coletor foi descartado. As
colunas foram lavadas por 3 vezes com 600 µL de etanol 80% seguidos de
centrifugação a 13.800 x g por 30 segundos. As colunas foram transferidas para
tubos eppendorf de 1,5 mL e o cDNA purificado foi eluído com 60 µL de bicarbonato
de sódio 0,1 M pH 9,0.
Segunda etapa: Marcação do cDNA modificado com CyDye
Os cDNAs modificados foram transferidos para tubos contendo CyDye NHS
éster (Cy3 para as amostras das células-tronco e Cy5 para RNAs (cDNAs) de
referência) e incubados por 1 hora em ambiente protegido da luz. Posteriormente
foram adicionados 15 µL de hidroxilamina 4 M e a reação foi incubada por 15
minutos à temperatura ambiente.
Purificação do cDNA marcado com CyDye
Foram colocados 500 µL de capture buffer nas colunas de purificação GFX e
em seguida os cDNAs foram adicionados e homogeneizados. A centrifugação foi
efetuada a 13.800 x g por 30 segundos, e o líquido do tubo coletor foi descartado. As
colunas foram lavadas por 3 vezes com 600 µL da solução wash buffer seguidos de
centrifugação a 13.800 x g por 30 segundos. As colunas foram transferidas para
tubos eppendorf de 1,5 mL e o cDNA marcado foi eluído com 60 µL da solução
elution buffer pré-aquecida a 65ºC.
Quantificação do CyDye incorporado no cDNA
As amostras foram diluídas 1:100 e lidas em espectrofotômetro nos
comprimentos de onda 550nm para Cy3 e 650nm para Cy5 usando cubetas de
Materiais e métodos
54
quartzo. Cada amostra (Cy3) foi agrupada com uma referência (Cy5) de acordo com
as absorbâncias mais próximas. As soluções contendo as sondas (cDNA marcado)
foram evaporadas em uma centrífuga à vácuo (Speed Vac Plus SC110A - Savant).
Os liofilizados foram dissolvidos em 6 µL de água livre de nucleases, desnaturado a
95ºC por 5 minutos e imediatamente resfriado em banho de gelo. Em seguida foram
adicionados à reação 1,5 µL de poli-A
80
(poli-A
80
a 1 mg/mL) e incubados a 75ºC por
45 minutos. Finalmente a cada reação foram acrescentados 55 µL de água, 63 µL de
formamida e 125 µL de tampão de hibridação e a reação está pronta para o
processo de hibridação.
4.13 Hibridação com os microarrays
As lâminas previamente preparadas foram colocadas nas câmaras de
hibridação do equipamento Lucidea Automated Slide Processor (Amersham
Biosciences), o qual realiza controle automático de hibridação e lavagens sucessivas
e controladas por um software. As sondas foram injetadas em câmaras individuais
de cada lâmina no aparelho com auxílio de uma seringa Hamilton de vidro. A
hibridação e posteriores lavagens seguiu por 15 h a 42ºC. A seqüência de lavagens
foi: 1X SSC/ 0,2% SDS; 0,1X SSC/ 0,2% SDS e 0,1X SSC. A última lavagem foi feita
com isopropanol e as lâminas foram aquecidas a 42ºC para secagem.
4.14 Aquisição das imagens de hibridação
As lâminas foram colocadas num aperellho Array Scanner (Amersham
Molecular Dynamics), e lidas sob os comprimentos de onda de excitação do laser
Materiais e métodos
55
532nm (para o Cy3) e 633 nm (Cy5). Dois arquivos foram gerados, um para cada um
dos canais de fluorescência e as imagens de sobreposição foram visualizadas com
auxílio do software ImageQuant (Amersham Molecular Dynamics). Ao final dos
experimentos obtiveram-se triplicatas biológicas dos cinco grupos experimentais
(células indiferenciadas; células diferenciadas com 24h, 48h, 7d e 21 d) provindas de
três doadores de medula óssea. Considerando que cada lâmina possui clones em
duplicata, o experimento constituiu-se ainda de duplicatas técnicas (réplicas),
provindas da mesma amostra de RNA.
4.15 Análise dos dados dos microarrays
A análise segue o pipeline da ilustrado na Figura 4, inclui os passos de
processamento das imagens, normalização dos valores numéricos e análise da
expressão diferencial.
Processamento das imagens
O processamento das imagens foi feito com o uso do software Spotfinder
criado pelo TIGR (The Institute for Genomic Research, http://www.tigr.org/) para a
análise de arquivos gerados por experimentos de microarrays. O software utiliza
algoritmos que delimitam a área do spot (ponto de hibridação), calculam a
intensidade do sinal e corrigem através da subtração do background (sinal
inespecífico, externo à área do spot).
Normalização dos dados
A normalização dos dados foi realizada no ambiente estatístico R, com o
auxílio dos pacotes LIMMA, Bioconductor, Aroma e KTH. Foram aplicados métodos
de normalização Printtip Lowes e re-escalonamento dos valores M pelo valor MAD
Materiais e métodos
56
(Median Absolute Deviation). A normalização elimina os erros sistemáticos gerados
ao longo da realização do experimento, tornando possível a comparação dos dados
intra e entre as lâminas.
Análise da expressão gênica diferencial
A análise da expressão gênica foi realizada pelo aplicativo MultiExperiment
Viewer (MEV) desenvolvido pela TIGR. O aplicativo possui módulos analíticos que
permitem a visualização dos dados de microarrays, bem como a identificação de
genes e padrões de expressão de interesse. Foi empregado neste trabalho o
algoritmo SAM (Significance Analysis of Microarrays), que é uma modificação do
teste t voltado para análise estatística de grande quantidade de dados de array. O
teste permite identificação de genes significantes baseados na expressão diferencial
entre grupos de amostras (TUSHER; TIBSHIRANI; CHU, 2001). Optou-se pelo
desenho de análise duas classes pareadas, comparando as células indiferenciadas
(controle) com cada grupo de células diferenciadas (24h, 48h, 7d e 21 d) do mesmo
doador, resultando assim em quatro análises diferentes. O SAM estima o FDR
(False Discovery Rate), que é a proporção dos genes que podem ter sido
erroneamente identificados.
4.16 Anotação da representação tecidual pela expressão gênica
Os genes diferencialmente expressos determinados pelo software SAM foram
localizados no banco de dados SymAtlas v1.2.4 disponibilizado pelo The Genomics
Institute da Novartis Research Foundation (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/). O
banco contém dados de expressão gênica gerados a partir de experimentos de
Materiais e métodos
57
microarrays Affymetrix de 46 tecidos, órgãos e linhagens celulares humanas (SU et
al., 2002).
Utilizando os símbolos dos genes diferencialmente expressos buscamos no
SymAtlas os valores numéricos de expressão nos tecidos, cujos resultados foram
salvos em arquivos (.txt). Com o uso de uma ferramenta desenvolvida pelo
estudante de pós-graduação Renato David Puga (http://gbi.fmrp.usp.br/symatlas),
baseada em linguagem de programação Perl, o programa calcula a mediana desses
valores nos diferentes tecidos e classifica como 1 (um) os valores maiores que a
mediana e como 0 (zero) os valores menores ou iguais a mediana. Desta forma
tornou-se possível classificar os genes como representantes dos tecidos, i.e, genes
cuja expressão é maior que a mediana de expressão dos tecidos analisados.
Materiais e métodos
58
TIGR Spotfinder
Ambiente R
MultiExperimentViewer
GNF SymAtlas
Delimitação da área dos pontos
Aplicação das grids
Quantificação da intensidade dos pontos
Correção: subtração do background
Exclusão dos valores nulos e negativos
Geração de arquivos .tav
Representação tecidual dos genes diferencialmente expressos
Normalização intra-lâminas (Printtip Lowess)
Geração de arquivos .mev
Normalização entre lâminas (Escalonamento de valores MAD)
Análise estatística SAM (Significance Analysis of Microarrays)
Genes diferencialmente expressos
Desenho: duas classes pareadas
Figura 4. Pipeline utilizado na análise de dados de microarrays. O banco de dados GNF
SymAtlas foi utilizado na busca da representação tecidual dos genes diferencialmente
expressos.
Materiais e métodos
59
4.17 Confirmação dos dados de microarrays por Real Time PCR
As reações de transcrição reversa foram realizadas com 2 µg de RNA total, 1
µL de oligo (dT) 1 µg/ µL, 1 µL de mix de nucleotídeos (2 mM), 4 µL de 5 X First
Strand Buffer (Invitrogen), 2 µL de DTT 0,1 M, 1 µL de inibidor de RNAse 40 U/µL
(Promega) e 1 µL de transcriptase reversa 200 U/µL (SuperScript II- Invitrogen),
volume final de 20 µL. As reações foram realizadas no termociclador MasterCycler
Gradient (Eppendorf), a 42°C por 50 minutos seguidos de 15 minutos a 70ºC. Em
seguida, estas amostras foram diluídas 1:2 com água milli-Q autoclavada e
armazenada a -20°C. Os primers (Tabela II) foram desenhados com o uso do
software Primer3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) com os
seguintes parâmetros: tamanho de 18-22 pb; tamanho do amplicon de 100-150 pb e
Tm (Temperature of melting) em torno de 60ºC. Os primers foram verificados quanto
à complementaridade com seqüências inespecíficas
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e à localização em éxons diferentes para
evitar amplificação de eventual DNA genômico presente na amostra. Além dos
genes alvo, foram desenhados primers para dois genes constitutivos, GAPDH
(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) e HPRT1(Hypoxanthine
phosphoribosyltransferase 1).
As reações de Real Time PCR foram realizadas no equipamento 7500 Real
Time PCR System (Applied Biosystems), que se utiliza compostos que emitem
fluorescência na detecção quantitativa de seqüências de ácidos nucléicos
(equipamento disponibilizado pela Profa. Dra. Zilá Luz Paulino Simões neste
Departamento). Utilizamos o ensaio de quantificação relativa (RQ - Relative
Materiais e métodos
60
Quantification) que permite determinar mudanças na expressão de genes em uma
amostra com relação a uma amostra designada como calibrador.
O método químico utilizado foi o SYBR
®
Green, um corante que emite
fluorescência quando ligado em DNA de dupla fita. Sendo assim, a cada ciclo, o
número de fitas duplas é duplicado e a fluorescência gerada é detectada pelo
equipamento em tempo real. O primeiro passo foi a realização de ensaios de
dissociação com amostras diluídas até 1: 10000 para verificar se havia amplificação
inespecífica com cada um dos primers.
As reações de Real Time PCR foram feitas a partir de 1 µL dos cDNAs
sintetizados conforme descrito acima, acrescidos de 10 µL de SYBR
®
Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems), 7,4 µL de água milli-Q autoclavada, 0,8 µL de cada
primer 10 µM (forward e reverse). Para cada amostra foram feitas reações em
triplicata. Para a escolha do gene constitutivo mais adequado às nossas amostras,
utilizamos o software BestKeeper (PFAFFL et al., 2004). O aplicativo é utilizado para
definir, dentre genes candidatos a constitutivos, aquele que apresenta menor
variabilidade de expressão para cada conjunto de amostras.
Os valores numéricos de C
t
(Cycle Threshold) que são inversamente
proporcionais à quantidade de RNA na amostra foram usados em cálculos
subseqüentes. A média das triplicatas de cada gene foi calculada para todas as
amostras, e foi subtraído do C
t
do gene constitutivo:
∆C
t
= C
t(gene)
-
C
t (constitutivo)
O ∆C
t
foi subtraído da amostra escolhida como calibrador, resultando no ∆∆C
t
:
∆∆C
t
= ∆C
t
-
∆C
t (calibrador)
Então o RQ foi calculado para cada gene em cada amostra conforme a equação:
RQ = 2
–∆∆Ct
Materiais e métodos
61
Tabela II - Primers utilizados nas reações de Real Time PCR
Número de acesso
(GenBank)
Símbolo
do gene
Primer Seqüência
Amplicon
(pb)
Tm
NM_002205.2 ITGA5
ITGA5 (F)
ITGA5 (R)
5’-CCAAGGGGAATCAGAACTCA-3’
5’-TGGAGCAGGCCCAAATATAG-3’
124 60ºC
NM_000194.1 HPRT1
HPRT1 (F)
HPRT1 (R)
5’-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3’
5’-CTGCATTGTTTTGCCAGTGT-3’
111 60ºC
NM_002046.3 GAPDH
GAPDH (F)
GAPDH (R)
5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’
5’-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3’
112 60ºC
NM_212482.1;
NM_212475.1;
NM_002026.2;
NM_212478.1;
NM_212476.1;
NM_212474.1
FN1
FN1 (F)
FN1 (R)
5’-AAAATGGCCAGATGATGAGC-3’
5’-TGCCACTGTTCTCCTACGTG-3’
121 60ºC
RESULTADOS
Resultados
63
5 RESULTADOS
5.1 Ensaios de osteogênese
5.1.1 Proliferação e viabilidade celular
As células-tronco mesenquimais cultivadas em meio mínimo apresentaram
uma taxa de proliferação celular constante ao longo dos 21 dias. Entretanto, as
células cultivadas em meio de diferenciação apresentaram uma taxa de proliferação
celular reduzida em comparação com as células indiferenciadas (Figura 5).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
71421
Período (dias)
nº de células (X 10
4
)
MEM
MED
Figura 5. Proliferação celular de células-tronco mesenquimais em cultura obtidas após 7, 14
e 21 dias cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de diferenciação (MED).
As células mantidas em ambos os meios de cultivo, meio mínimo e meio de
diferenciação, mostraram viabilidade superior a 85% em todos os períodos
estudados (Figura 6).
Resultados
64
80
85
90
95
100
71421
Período (dias)
Células viáveis (%)
MEM
MED
Figura 6. Viabilidade celular de células-tronco mesenquimais obtidas após 7, 14 e 21 dias
cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de diferenciação (MED).
5.1.2 Determinação de proteínas totais
Foi observado que, enquanto há um decréscimo na quantidade de proteínas
totais nas células mantidas em meio mínimo, as células em diferenciação aumentam
a quantidade de proteínas com relação ao número de células (Figura 7).
0
5
10
15
20
25
71421
Período (dias)
ug ptn/ 10
4
células
MEM
MED
Figura 7. Quantidade de proteínas totais (µg/10
4
células) em células-tronco mesenquimais
obtidas após 7, 14 e 21 dias cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de
diferenciação (MED).
Resultados
65
5.1.3 Avaliação imunocitoquímica para fosfatase alcalina
A avaliação da morfologia destas células revelou que o citoesqueleto das
células-tronco mesenquimais cultivadas em meio mínimo é mais alongado enquanto
as células cultivadas em meio de diferenciação osteogênica têm um formato
poligonal. Com relação à expressão de fosfatase alcalina, as células cultivadas
durante 7 dias em meio de diferenciação possuem conteúdo consideravelmente
maior desta proteína quando comparadas às células controle (figura 8).
Figura 8. Imunofluorescência indireta para fosfatase alcalina. A: Células-tronco mesenquimais
após 7 dias em cultura em meio mínimo (controle) e B: Células-tronco mesenquimais após 7
dias em cultura em meio de diferenciação osteogênico. A marcação em vermelho revela a
proteína fosfatase alcalina (ALP). Em verde (faloidina) evidencia-se o citoesqueleto e, em azul
(DAPI) o núcleo celular. Microscópio de fluorescência; aumento de 40x.
5.1.4 Determinação da atividade de fosfatase alcalina por reação enzimática
A atividade de fosfatase alcalina (Figura 9) das células em diferenciação
aumenta com a exposição aos agentes indutores da diferenciação, enquanto que a
células indiferenciadas mantém sua atividade constante.
A
B
Resultados
66
0
1
2
3
4
5
6
7
8
71421
Período (dias)
U/L/10
4
células
MEM
MED
Figura 9. Atividade de fosfatase alcalina (U/L/10
4
células) em células-tronco mesenquimais
obtidas após 7, 14 e 21 dias cultivadas em meio mínimo (MEM) ou em meio de
diferenciação (MED).
5.1.5 Avaliação da formação de matriz mineralizada
Ao final de 21 dias em cultura, observa-se a intensa coloração dos nódulos de
mineralização, que se apresentam coalescentes, nas células cultivadas em meio de
diferenciação, enquanto que nas células cultivadas em meio mínimo não há nódulos
de mineralização (Figura 10).
Figura 10. Coloração de matriz mineralizada com Alizarin Red. A: Células-tronco
mesenquimais após 21 dias de cultivo em meio mínimo (controle) e B: Células-tronco
mesenquimais após 21 dias de cultivo em meio de diferenciação osteogênica. Em
vermelho observa-se a presença de nódulos de mineralização. Microscópio de contraste
de fase invertido, aumento de 40 X.
Resultados
67
5.2 Avaliação da integridade do RNA total
A integridade dos RNAs mensageiros foi inferida com base na integridade das
bandas correspondentes aos RNAs ribossômicos 18S e 28S, comprovando a
qualidade do processo de extração, conforme mostrado na Figura 11.
Figura 11. Eletroforese de RNA total em gel de agarose. Avaliação da integridade do RNA
total das amostras experimentais. Gel de agarose desnaturante 1% corado com brometo de
etídeo. Visualização em transiluminador UV.
As amostras referentes ao RNA de referência também foram avaliadas em
eletroforese em gel. Devido ao uso de método de extração diferente, além das
bandas correspondentes aos RNAs ribossômicos (RNAr) 18S e 28S, podemos
observar a banda referente ao RNAr 5S junto com os RNAs transportadores (RNAt),
todas apresentaram-se íntegras, conforme Figura 12.
RNAr 28 S
RNAr 18 S
Resultados
68
Figura 12. Eletroforese de RNA total em gel de agarose. Avaliação da integridade do RNA
total das amostras experimentais. Gel de agarose desnaturante 1% corado com brometo de
etídeo. Visualização em transiluminador UV.
5.3 Avaliação da expressão de genes relacionados à osteogênese e
adipogênese por RT- PCR semiquantitativa
O objetivo deste ensaio foi avaliar a expressão de RNAs mensageiros de
alguns genes importantes no processo de osteogênese (ALPL, COL1A1, BGLAP,
SPP1, RUNX2) e um gene relacionado à diferenciação em adipócitos (PPARG)
durante a diferenciação osteogênica. A Figura 13 mostra a expressão destes genes
nos tempos 0 h (controle), e 24 h, 48 h, 7 d e 21 d de diferenciação in vitro de
células-tronco mesenquimais de medula óssea.
O GAPDH foi escolhido como gene de expressão constitutiva, comportando-
se de maneira muito semelhante em todas as amostras analisadas.
O gene PPARG, relatado na literatura como um marcador da diferenciação
em adipócitos, mostrou-se como um gene de alta expressão em células
indiferenciadas e de expressão crescente ao longo da diferenciação em
osteoblastos.
RNAr 28 S
RNAr 18 S
RNAr 5S + RNAt
Resultados
69
O gene da fosfatase alcalina (ALPL) mostrou uma expressão importante no
controle (0 h), e um pico de expressão após 7 dias de diferenciação.
O gene do colágeno tipo 1A1 (COL1A1) apresentou uma expressão
importante no controle, mantendo-se estável após 24 horas e subsequentemente
apresentou uma redução na sua expressão.
O gene RUNX2 teve sua expressão relativamente constante ao longo da
diferenciação e assim como os anteriores, apresentou uma importante expressão
nas células-tronco mesenquimais indiferenciadas.
O gene da osteopontina (SPP1) comportou-se como um gene de baixa
expressão, apresentando uma expressão discretamente maior nas células com 21
dias de diferenciação.
A expressão do gene osteocalcina (BGLAP) mostrou-se bastante baixa em
todas os tempos de diferenciação analisados, com expressão detectável apenas nos
tempos 24 h e 7 dias.
Resultados
70
GAPDH PPARG
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
0 h
24 h
48 h
7 d
21 d
ALPL COL1A1
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
0 h
24 h
48 h
7 d
21 d
BGLAP SPP1
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
0 h
24 h
48 h
7 d
21 d
RUNX2
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
0 h
24 h
48 h
7 d
21 d
Figura 13. Expressão gênica avaliada por RT-PCR semiquantitativa. A expressão dos
genes ALPL, COL1A1, BGLAP, SPP1, RUNX2 e PPARG em amostras de cDNA de
células-tronco mesenquimais indiferenciadas (0 h) e células em diferenciação in vitro
após 24 hs, 48 hs, 7 d e 21 dias.
Resultados
71
5.4 Imagens dos microarrays
As lâminas de microarrays contêm 4.500 clones em duplicata, sendo que
cada spot possui diâmetro de 250 µm e espaçamento entre eles de 30 µm. As
lâminas utilizadas na confecção dos arrays são lâminas especiais tratadas com
amino-propil-silano, o que proporciona ligação com moléculas de DNA (carregadas
negativamente). As condições de deposição dos clones, como temperatura e
umidade, possuem impacto significante no tamanho e forma dos spots. A
temperatura utilizada foi de, em média, 24,6ºC e a umidade de 55%.
Para cada sonda marcada com Cy3 (amostras) foi preparada uma sonda
marcada com Cy5 (RNA de referência). No total foram utilizadas 15 lâminas, sendo
triplicatas biológicas de 5 situações experimentais: culturas de célula-tronco
mesenquimais indiferenciadas (0 h), células em diferenciação por 24 h, 48 h, 7 d e
21 dias. As imagens resultantes destas hibridações foram obtidas por escaneamento
a laser. A figura 14 representa uma das imagens obtidas dos nossos microarrays.
Resultados
72
Figura 14. Imagens típicas de lâminas de microarrays. Cada lâmina é composta de
4.500 clones de cDNA em duplicata. Em vermelho são os sinais gerados pelo fluoróforo
Cy5 (RNA de referência) e em verde estão os sinais gerados pelo fluoróforo Cy3
(amostras experimentais).
Resultados
73
5.5 Análise dos dados dos microarrays
Os dados numéricos gerados pelo programa Spotfinder, foram normalizados
no ambiente estatístico R. No aplicativo MEV, os valores foram filtrados, seguindo na
análise apenas os genes expressos em, no mínimo, 80% dos experimentos. Uma
matriz de expressão foi gerada, com os valores representados na forma de razão
logarítmica (log
2
Cy5/Cy3). A expressão gênica diferencial foi determinada pelo
algoritmo SAM, de acordo com a distância métrica baseada na correlação de
Pearson. Os perfis de expressão gênica foram comparados de acordo com o
desenho de duas classes pareadas, ou seja, células-tronco indiferenciadas (0 h)
versus diferenciadas (24 h, 48 h, 7 d, 21d).
O programa SAM gera um gráfico (Figura 15) que mostra os genes cujas
diferenças de expressão (controle vs experimental) foram consideradas significantes
sob ponto de vista estatístico. Os pontos em vermelho são genes induzidos e em
verde reprimidos. O valor delta, que determina o limiar de inclusão dos genes nos
grupos induzidos e reprimidos é calculado com base no FDR (False Discovery Rate)
escolhido pelo usuário do software. O FDR (no presente trabalho fixado em 0,05) é a
proporção dos genes que podem ter sido erroneamente identificados por chance
como sendo significantes. Portanto, só foram considerados aqueles genes com valor
de FDR ≤ 0,05.
Resultados
74
Figura 15. Gráfico típico gerado pelo programa SAM a partir de uma análise pareada (por
exemplo, 0 h vs 7 dias de diferenciação). Cada ponto representa um gene, os pontos em
vermelho representam genes induzidos e os verdes reprimidos. A linha tracejada representa
o valor delta. FDR = 0,05.
Observamos que a modulação da expressão gênica é intensa ao longo da
diferenciação osteogênica in vitro das células-tronco mesenquimais de medula
óssea. O número de genes modulados com significância estatística é maior após 7
dias em meio de diferenciação, correspondendo a 19,5% dos genes analisados
(3.161 genes analisados).
A Figura 16 mostra o número de genes modulados e o tipo de modulação nas
células diferenciadas frente às células indiferenciadas (0 h).
24 h
48 h
7 d
21 d
Reprimidos
Induzidos
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Período em diferenciação
Genes (nº)
Reprimidos
Induzidos
Figura 16. Número de genes modulados durante a diferenciação segundo as análises
pareadas feitas com o programa SAM. Número de genes modulados nas células
diferenciadas versus indiferenciadas em diferentes tempos.
Resultados
75
As listas dos genes reprimidos e induzidos após 7 dias de diferenciação estão
apresentadas respectivamente nos anexos E e F.
As informações relevantes sobre os clones diferencialmente expressos (nome,
localização cromossômica, descrição da função, dentre outras) foram atualizadas no
banco de dados S.O.U.R.C.E. (Stanford Online Universal Resource for Clones and
ESTs disponível em (http://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch) que compila
informações de vários bancos de dados públicos (DIEHN et al., 2003).
Dentre os genes diferencialmente expressos, encontramos alguns pertencentes
a famílias gênicas relacionadas ao processo de osteogênese, conforme mostrado na
Tabela III. Todos os genes são induzidos ao longo da diferenciação.
Tabela III - Genes diferencialmente expressos e relacionados à osteogênese.
Símbolo do
gene
UGCluster Nome do gene Tempo de
diferenciação
BMP1 Hs.1274
Bone morphogenetic protein 1
7 d
FN1 Hs.203717
Fibronectin 1
24 h, 7 d e 21 d
ITGA5 Hs.505654
Integrin, alpha 5 (fibronectin receptor, alpha
polypeptide)
24 h, 7 d e 21 d
IGFBP4 Hs.462998
Insulin-like growth factor binding protein 4
24 h, 7 d e 21 d
BGN Hs.821
Biglycan
24 h e 7 d
CDH8 Hs.368322
Cadherin 8, type 2
48 h
SMAD7 Hs.465087
SMAD family member 7
21 d
GDF10 Hs.2171
Growth differentiation factor 10
7 d
5.6 Anotação da representação tecidual pela expressão gênica
O objetivo de buscar os genes no banco de dados GNF Symatlas foi analisar
se havia diferença no número de genes modulados relacionados aos diferentes
Resultados
76
tecidos. A Figura 17 mostra um gráfico típico do banco GNF Symatlas da expressão
de um dado gene em diferentes tecidos humanos.
Figura 17. Gráfico típico do banco GNF Symatlas da expressão de um dado gene em
diferentes tecidos humanos.
Resultados
77
A intenção principal desta busca foi avaliar se havia uma hiper-
representatividade de genes relacionados à linhagem osteogênica no grupo dos
genes induzidos, e quais tecidos tinham maior representatividade do grupo dos
genes reprimidos.
Convencionou-se que um gene é representante de um tecido quando este
gene tem uma expressão maior do que a sua mediana calculada a partir dos dados
de todos os tecidos. Dentre os tecidos disponíveis no Symatlas, foram escolhidos
aqueles que têm alguma associação com células às quais as células-tronco
mesenquimais possuem a capacidade de se diferenciar, ou seja, relacionados à
propriedade plasticidade das células-tronco, e tecidos relacionados à localização
destas células. Escolhemos ainda as células CD34+, que também são células-
tronco, que co-habitam a medula óssea com as CTM.
Os tecidos e/ ou células escolhidos foram: adipócitos, células de medula
óssea CD105+, células de medula óssea CD34+, miócitos cardíacos, músculo
esquelético, músculo liso, encéfalo e medula óssea.
Para cada análise realizada (0 h versus 24 h; 0 h versus 48 h; 0 h versus 7 d;
0 h versus 21d) os genes induzidos e reprimidos foram analisados separadamente.
Cada gene foi avaliado segundo sua expressão nos 8 tecidos citados. Os gráficos
representados nas Figuras 18 a 25, mostram para cada grupo de genes (induzidos
ou reprimidos) a porcentagem de genes representantes de cada tecido.
Resultados
78
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO- CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc é f a lo
Medula óssea
Figura 18. Porcentagem dos genes induzidos após 24 h de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados.
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc éf a lo
Medula óssea
Figura 19. Porcentagem dos genes reprimidos após 24 h de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados.
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc éf a lo
Medula óssea
Figura 20. Porcentagem dos genes induzidos após 48 h de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados.
Resultados
79
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc éf a lo
Medula óssea
Figura 21. Porcentagem dos genes reprimidos após 48 h de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados.
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc é f alo
Medula óssea
Figura 22. Porcentagem dos genes induzidos após 7 d de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados.
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
En c éf a lo
Medula óssea
Figura 23. Porcentagem dos genes reprimidos após 7 d de diferenciação classificados como
representantes dos tecidos indicados.
Resultados
80
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc éf a lo
Medula óssea
Figura 24. Porcentagem dos genes induzidos após 21 d de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados.
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%
Adipócitos
MO-CD105+Endotelial
MO-CD34+
Miócitos cardíacos
Músculo esquelético
Músculo liso
Enc é f a lo
Medula óssea
Figura 25. Porcentagem dos genes reprimidos após 21 d de diferenciação classificados
como representantes dos tecidos indicados.
5.7 Confirmação dos dados de microarrays por Real Time PCR
As mesmas amostras utilizadas na preparação das sondas foram submetidas a
Real Time PCR para alguns dos genes que se mostraram diferencialmente expressos
nas análises feitas pelo SAM. Foram feitas triplicatas experimentais de cada uma das
três amostras provenientes de doadores independentes (triplicatas biológicas).
Os genes escolhidos para a confirmação foram ITGA5 e FN1, ambos
induzidos de acordo com a análise estatística feita pelo SAM.
Resultados
81
O gene constituitivo mais apropriado para estas amostras, de acordo com o
software BestKeeper, foi o GAPDH. Os gráficos foram construídos de acordo com os
valores de RQ (Relative Quantification), calculados utilizando como calibrador a média
dos valores de ∆C
t
obtidas com as amostras correspondentes às células indiferenciadas.
Observou-se que há bastante variabilidade entre as amostras de diferentes
doadores, representados pelos desvios padrões nos gráficos correspondentes.
Ambos os genes, FN1 e ITGA5, apresentam valores médios de expressão
maiores (induzidos) em todos os tempos de indução da diferenciação com relação
às células indiferenciadas, em concordância com os resultados dos microarrays
(Figuras 26 e 27).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0h 24h 7d 21d
Amostras
RQ
Figura 26. Quantificação relativa correspondente ao gene da fibronectina (FN1) no tempo
zero e após diferentes períodos de diferenciação de células-tronco in vitro.
0
1
2
3
4
5
6
7
0h 24h 7d 21d
Amostras
RQ
Figura 27. Quantificação relativa correspondente ao gene ITGA5 no tempo zero e após
diferentes períodos de diferenciação de células-tronco in vitro.
DISCUSSÃO
Discussão
83
6 DISCUSSÃO
6.1 Ensaios de osteogênese
6.1.1 Proliferação e viabilidade celular
A capacidade proliferativa, assim como a viabilidade destas células em cultura
foram confirmadas. A redução na taxa de proliferação observada nas células após
14 dias em meio de diferenciação pode ser atribuída à progressiva redução da
capacidade de auto-renovação e conseqüente especialização da célula em uma
célula funcional, neste cado em direção aos osteoblastos.
6.1.2 Determinação de proteínas totais
Á medida que as células vão se diferenciando em osteoblastos a quantidade
de proteínas totais aumenta proporcionalmente ao número de células. Os
osteoblastos são células maduras cuja principal característica é a síntese de
grandes quantidades de matriz extracelular.
Grande parte desta matriz é protéica, composta por colágeno tipo I (90%),
seguindo-se por osteocalcina, sialoproteína óssea, osteopontina e proteoglicanas
(AUBIN,1998).
6.1.3 Determinação da atividade enzimática da fosfatase alcalina e sua
localização por imunocitoquímica
Ambos os ensaios demonstram um maior conteúdo de fosfatase alcalina nas
células em diferenciação osteogênica comparativamente às células-tronco
indiferenciadas.
Discussão
84
A fosfatase alcalina está bem caracterizada como um marcador das fases
iniciais da osteopoiese (COHEN, 2006). O produto deste gene é uma enzima
glicosilada ligada à membrana presente em uma variedade de tecidos. Em
osteoblastos, seu papel envolve a geração de fosfato inorgânico para a
mineralização a partir de ésteres de fosfato, como o β-glicerofosfato (ADDISON et
al., 2007).
6.1.4 Formação de matriz mineralizada
A propriedade de sintetizar matriz mineralizada é uma das principais funções
dos osteoblastos maduros. Sendo assim a presença de nódulos de mineralização
após 21 dias em meio osteogênico comprova a diferenciação em osteoblastos
funcionais.
6.2 Avaliação da expressão de genes relacionados à osteogênese e
adipogênese por RT- PCR semiquantitativa
Foram analisadas as expressões de genes marcadores de duas linhagens às
quais as células-tronco mesenquimais podem se diferenciar, osteoblastos e
adipócitos.
O gene PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor-gama) é um
membro da família de receptores nucleares de hormônios, responsável pela
regulação da expressão de genes específicos de adipócitos e é essencial para a
formação de células adiposas maduras. Ele é um fator de transcrição induzido por
ligante que controla a expressão de genes alvo através do remodelamento de
cromatina e modificações nas histonas (DAVID et al., 2007).
Discussão
85
Os genes ALPL (fosfatase alcalina), BGLAP (osteocalcina), COL1A1, RUNX2
e SPP1 (osteopontina), são genes relacionados ao processo de diferenciação em
osteoblastos. Duas observações importantes foram feitas com esses genes. A
primeira é a de que as células-tronco mesenquimais em cultura expressam RNAm
de genes marcadores de células diferenciadas, por exemplo ALPL, PPARG, RUNX2
e COL1A1. A segunda é que um gene envolvido na regulação da diferenciação em
adipócitos apresenta expressão crescente durante a diferenciação em uma linhagem
distinta, os osteoblastos.
A primeira observação é concordante com a hipótese de Zipori (2004a;
2004b; 2005) e das observações feitas por Woodbury, Reynolds e Black (2002), que
consideram que as células-tronco se apresentam em um estado “multidiferenciado”,
com expressão de genes relacionados aos diferentes destinos de diferenciação que
elas podem assumir.
Entretanto, a crescente expressão do gene PPARG ao longo da diferenciação
em osteoblastos, comprovada por alguns ensaios, como presença de matriz
mineralizada, é discordante da hipótese de Zipori.
Segundo Zipori, durante a diferenciação o repertório de genes seria reduzido,
acompanhado do aumento nos níveis de expressão de uma pequena coleção de
genes, que orientam a especialização celular, neste caso, genes relacionados à
osteogênese.
Diversos estudos têm demonstrado que a diferenciação em osteoblastos
ocorre em detrimento da diferenciação em adipócitos, com participação dos dois
principais fatores de transcrição relacionados às duas linhagens: PPARG e RUNX2.
Akune et al. (2004) avaliando os efeitos da deleções do gene PPARG na
osteoblastogênese, conclui que nos camundongos heterozigotos e homozigotos
Discussão
86
para essa deleção ocorriam aumento da osteoblastogênese. O resultado sugere que
o PPARG funciona como um supressor do comprometimento e diferenciação com a
linhagem osteoblástica, já que nas células progenitoras com a deleção a
diferenciação ocorria espontaneamente, com indução do gene RUNX2.
Outro estudo (LECKA-CZERNIK et al., 1999) mostra que nas células
estromais de medula óssea transfectadas com uma construção de expressão de
PPARG, ocorria a supressão da expressão de RUNX2, COL1A e osteocalcina,
conhecidos marcadores da linhagem dos osteoblastos.
A presença de transcritos, e não necessariamente proteínas, relacionados à
linhagem adipogênica, mesmo nas células derivadas de células-tronco que estão
comprometidas com a linhagem osteogênica pode estar relacionada à capacidade
de transdiferenciação destas células, ou seja, mesmo comprometidas elas podem se
desdiferenciar e rapidamente seguir um novo caminho de diferenciação.
O fator de transcrição RUNX2 (Runt-related transcription factor), também
chamado de Cbfa1 (core-binding factor-1) é o primeiro fator específico de
osteoblastos a ser identificado, ele tem um importante papel na manutenção do
fenótipo osteo (Long, 2001). O RUNX2 é uma subunidade de um fator de transcrição
heterodimérico que é composto das subunidades α e β. A subunidade α é um
homólogo estrutural do gene runt de Drosophila (NAKASHIMA; CROMBRUGGHE,
2003).
Mutações neste gene causam anormalidades no esqueleto, pois ocorre falha
na diferenciação de osteoblastos (LONG, 2001). A inativação de Cbfb causa
letalidade em camundongos devido à ausência da hematopoiese hepática.
Entretanto, expressando Cbfb em embriões, o camundongo sobrevive até o
nascimento, porém com marcante retardo na diferenciação em osteoblastos e na
Discussão
87
formação óssea. Esta disfunção óssea é menos severa que a causada por
inativação de RUNX2, indicando que este controla a formação óssea até certo
ponto, mesmo na ausência de Cbfb (NAKASHIMA; CROMBRUGGHE, 2003).
Observou-se uma alta expressão de fosfatase alcalina detectada por RT-PCR
quando comparada à detecção da enzima por imunofluorescência indireta nas
células-tronco indiferenciadas. Parece não haver uma relação direta entre
quantidade de RNAm e da proteína corrrespondente, fosfatase alcalina, nestas
células.
Sabe-se que a ALPL é um marcador das fases iniciais de diferenciação em
osteoblastos e que sua expressão é estimulada por β-glicerofosfato, conhecido por
promover mineralização em culturas de células (ORIMO; SHIMADA, 2008).
O colágeno tipo I é o produto primário dos osteoblastos durante a formação
da matriz óssea, constituindo 90% do total de matriz orgânica no osso. Ele é
expresso no estágio de pré-osteoblasto e apresenta indução precoce no processo
de diferenciação. Entretanto, existem discrepâncias com relação aos resultados de
expressão deste gene encontradas na literatura. Alguns autores relatam alta
expressão durante estágios proliferativos e outros detectam RNAm apenas em
estágios finais de maturação (AUBIN,1998).
Cabe ressaltar que se trata de um experimento in vitro que pode não
reproduzir alguns resultados de experimentos in vivo, devido às enormes
divergências com relação ao ambiente ao qual a célula está inserida. Modelos de
diferenciação in vitro são simplificações excessivas e servem apenas para guiar o
estudo de questões de difícil acesso no organismo vivo, como é o caso da
diferenciação celular.
Discussão
88
Os genes SPP1 e BGLAP não apresentaram expressão detectável nas
células-tronco indiferenciadas, comportando-se efetivamente como marcadores da
diferenciação em osteoblastos. Ambos mostraram-se como genes de expressão
baixa no sistema-modelo de diferenciação utilizado.
Apesar da osteocalcina (BGLAP) não exercer um papel crítico na
diferenciação e formação ósseas, esta proteína representa expressão altamente
restrita à linhagem dos osteoblastos (LECLERC et al., 2005). Estudos in vivo
mostram que a expressão deste gene é inibida por glicocorticóides, o que poderia
explicar a baixa expressão em nosso modelo experimental, que inclui o glicorticóide
dexametasona.
A osteopontina (SPP1) é uma das mais abundantes proteínas não-
colagenosas que compõem a matriz extracelular em tecidos ósseos. Ela é secretada
por osteoblastos e tem sido sugerido que ela tem um papel importante no
metabolismo ósseo, mediando adesão celular e migração. Esta proteína parece
inibir a mineralização através do bloqueio da formação dos cristais de hidroxiapatita
(ALFORD; HANKENSON, 2006).
6.3 Análise dos dados dos microarrays
A análise feita com o programa SAM revelou um grande número de genes
modulados durante a diferenciação das células-tronco mesenquimais em
osteoblastos. Muitos genes são induzidos com apenas 24 horas no meio de
diferenciação, entretanto o pico de modulação aparece após 7 dias. O pico de
modulação coincide com o momento de maior expressão de fosfatase alcalina
detectada por RT-PCR.
Discussão
89
A fosfatase alcalina é um marcador da formação óssea. A isoforma tecido-não
específica tem um papel chave na mineralização óssea, pois promove a formação
de cristais de hidroxiapatita nas vesículas extracelulares formadas pelos
osteoblastos. A ALPL degrada pirofosfato inorgânico presente na matriz extracelular,
o qual inibe a formação de hidroxiapatita, permitindo assim que o fosfato inorgânico
reaja com o cálcio para formar hidroxiapatita. O papel desta enzima na
mineralização óssea foi confirmado por estudos de pacientes com hipofosfatasia,
caracterizada por defeito no gene da fosfatase alcalina. Os portadores deste defeito
apresentam hipomineralização de tecidos rígidos e elevados níveis plasmáticos de
pirofosfato inorgânico (ORIMO; SHIMADA, 2008).
Dentre os genes induzidos (Tabela III) estão os genes BMP1, SMAD7,
IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN, CDH8, GDF10 e SCARB2.
As BMPs (bone morphogenetic proteins) constituem uma família de fatores de
crescimento pertencentes à superfamília TGFβ. As proteínas desta família possuem
papéis relevantes no desenvolvimento neural, cardíaco, de cartilagens e formação
óssea (CHEN; ZHAO; MUNDY, 2004). As proteínas TGF-β parecem permanecer de
forma latente na matriz óssea, sendo ativadas pelo ambiente ácido dos osteoclastos.
A ativação deste fator de crescimento resulta na estimulação das células
osteogênicas (LONG, 2001).
As proteinases BMP1 são importantes no processamento de precursores de
proteínas funcionais que compõe a matriz extracelular, incluindo colágenos tipo I, II,
III, IV, VII e XI, as proteoglicanas biglicanas e osteoglicana, componentes de
laminina e lisil-oxidase. As BMP1 afetam a morfogênese ativando BMP2 e BMP4
pela clivagem do antagonista extracelular cordina (GE; GREENSPAN, 2006).
Discussão
90
Um estudo conduzido por LEE et al. (1997) sugere que BMP1 é induzida pela
ativação de TGFβ1. Estes dados indicam um papel das proteinases BMP1 como
reguladores da sinalização TGFβ com deposição de matriz extracelular, processo
pelo qual os osteoblastos são responsáveis na formação óssea.
Dentre as BMPs, a BMP2 está intimamente associada diferenciação de
osteoblastos. A proteína BMP2 recombinante por si só induz a formação óssea in
vivo e, em modelos in vitro, induz o aparecimento de fenótipo de osteoblasto,
identificado pela expressão dos marcadores fosfatase alcalina, osteocalcina e PTH
(hormônio paratireoideano) (THIES et al., 1992). Sabe-se que a ativação das vias
TGF-β e BMP2 aumentam a atividade transcricional do RUNX2 através da ativação
de Smad 1 e 3 (NAKASHIMA; CROMBRUGGHE, 2003).
Associadas à transdução de sinal acopladas aos receptores de BMPs estão
as proteínas Smads 1,5 e 8, que traduzem o sinal do receptor para genes alvo no
núcleo. Entretanto as Smads 6 e 7 são conhecidas como inibitórias. Existem
evidências de que elas antagonizam a sinalização TGFβ em culturas celulares. A
sinalização TGFβ induz a expressão de Smad7, sugerindo sua participação em um
mecanismo de retroalimentação negativa da sinalização TGFβ (NAKAO et al., 1997).
Além da TGF-β, outro grupo de citocinas exercem um papel central na
osteogênese, as IGFs (insulin-like growth factors), atuando no equilíbrio entre
reabsorção e formação óssea. Os mais abundantes mitógenos na matriz extracelular
humana são IGF-II e TGF-β (LONG, 2001).
As IGFs são sintetizadas pelos osteoblastos, tem ação autócrina e parácrina
estimulando a proliferação destes, através de MAPs quinases (ERK-1 e ERK-2),
atingindo alvos como c-myc. As IGFBPs (IGF-binding proteins) inibem a atividade
Discussão
91
biológica das IGFs. Em osteoblastos trabeculares ósseos são encontradas as
IGFBPs 3, 4 e 5. A produção das IGFBPs 4 e 5 é inibida pelo TGF-β (LONG, 2001).
A IGFBP4 é um importante componente do sistema IGF em muitos tecidos,
incluindo gônadas e ossos. O efeito inibitório in vivo foi demonstrado pela injeção de
IGFBP4 recombinante em osso parietal e conseqüente inibição da formação óssea
induzida por IGF (MAZERBOURG et al., 2004).
As proteínas de matriz extracelular constituem importantes sinais que
influenciam vários aspectos do ciclo de vida dos osteoblastos durante o
desenvolvimento e no processo de turnover dos ossos maduros.
As integrinas, uma família de glicoproteínas transmembrana que consistem
das cadeias α e β, são os principais receptores de superfície responsáveis pela
adesão celular à matriz. Os osteoblastos expressam uma variedade de integrinas
que se ligam às proteínas de matriz: osteopontina, osteocalcina, vitronectina,
colágeno tipo I, trombospondina e fibronectina. Os osteoblastos expressam altos
níveis de integrinas α5β1, αvβ3 de αvβ5, enquanto os pré-osteoblastos expressam
menores quantidades (CHENG et al., 2000).
A diferenciação de osteoblastos é inibida pela disrupção das interações entre
fibronectina e integrina, com supressão da formação de nódulos de mineralização e
retardo na expressão de genes tecido-específicos, como a osteocalcina. Os
osteoblastos são dependentes de fibronectina para a sobrevivência, na ausência de
tal proteína ocorre apoptose maciça. Entretanto, em osteoblastos maduros a
apoptose ocorre quando os receptores de proteoglicanas e as proteoglicanas de
matriz são perturbados (DAMSKY, 1999).
As proteoglicanas são cruciais durante a osteogênese de células-tronco
mesenquimais, especialmente para o processo de mineralização. A proteoglicana
Discussão
92
biglica é altamente expressa em ossos e parece ser essencial para interações com
colágeno tipo I e na regulação da deposição mineral e morfologia dos cristais
(MÜLLER et al., 2008).
Durante a diferenciação a partir de progenitores mesenquimais, as células
osteogênicas expressam um variável repertório de caderinas. As caderinas R- e -4
são reprimidas durante a diferenciação enquanto as -11 e N- são induzidas. As
caderinas são importantes na adesão celular e na elaboração do fenótipo completo
de osteoblasto (STAINS; CIVITELLI, 2005).
O GDF10 (growth differentiation factor) é um membro da família das BMPs,
que atua regulando crescimento e diferenciação celular através de sua atividade
proteolítica. O GDF10 é altamente relacionado com BMP3 e é expresso em ossos,
sugerindo sua participação na morfogênese de tecidos esqueléticos (CUNNINGHAM
et al., 1995).
6.4 Anotação da representação tecidual pela expressão dos genes
A primeira observação foi a de que a proporção dos genes representantes
dos tecidos não varia muito entre os diferentes tempos de diferenciação. Em parte,
isto se deve ao fato de que a maioria dos genes revelados como modulados nas
quatro análises pareadas são comuns em todos os tempos analisados. Sendo
assim, a discussão foi feita com base na representatividade dos genes induzidos e
dos genes reprimidos durante a diferenciação osteogênica independentemente do
tempo de diferenciação.
Discussão
93
Analisando os genes induzidos nas células em diferenciação, observamos
que as células CD34+, músculo liso, miócitos cardíacos e células CD105+ são as
células onde há maior representatitividade em todos os tempos analisados.
De fato, a inexistência de dados de expressão gênica de tecido ósseo ou
osteoblastos no banco de dados GNF SymAtlas dificultou a identificação de genes
induzidos relacionados à linhagem osteogênica. Outro fator limitante se deve à
composição do nosso array, que não foi construído visando o estudo da
diferenciação osteogênica, contendo poucos genes relevantes para o processo.
Com relação aos genes reprimidos, estes representaram prinicipalmente
células CD34+ e CD105+.
Sabe-se que a molécula de superfície CD34 é o principal marcador das
células-tronco hematopoiéticas (KRAUSE et al., 1994), uma das células-tronco
adultas mais bem estudadas. Da mesma forma, CD105 é um dos marcadores das
células-tronco mesenquimais, conforme proposto pela The International Society for
Cellular Therapy (DOMINICI et al., 2006).
Isto mostra que a repressão da transcrição gênica ao longo da diferenciação
das células-tronco mesenquimais adultas se deu principalmente com os genes
representantes das duas principais células-tronco adultas, a célula-tronco
mesenquimal e a célula-tronco hematopoiética.
CONCLUSÕES
Conclusões
95
7 CONCLUSÕES
A reprodução do sistema-modelo in vitro de diferenciação de células-tronco
mesenquimais humanas em osteoblastos foi alcançada com sucesso no presente
trabalho. Os resultados contribuem para uma visão abrangente, do ponto de vista
molecular, do comprometimento e diferenciação de uma célula-tronco adulta, a
célula-tronco mesenquimal.
A análise por microarrays revelou que a modulação da expressão gênica é
intensa durante a transição de uma célula em estado tronco ou ainda “plástico”, para
um estado diferenciado. Tal modulação atinge um pico após 7 dias de diferenciação
in vitro e, de acordo com a representatividade tecidual, a maioria dos genes
reprimidos são representantes das duas principais células-tronco adultas, a
mesenquimal e a hematopoiética. Dentre os genes induzidos observamos alguns
relacionados ao processo de osteogênese.
Além disso, nossos resultados mostraram que uma célula-tronco apresenta
expressão de genes marcadores de células diferenciadas como os adipócitos e os
osteoblastos, em concordância com a hipótese de Zipori (2004a; 2004b; 2005).
Nossos resultados são importantes para um melhor entendimento dos
processos genético-moleculares da diferenciação de células-tronco mesenquimais
adultas em osteoblastos e mostraram que a hipótese de Zipori procede. As células-
tronco expressam uma diversidade de genes, os quais representam os vários
tecidos nos quais elas poderão se diferenciar. Durante o processo de diferenciação
essa diversidade de expressão diminui e há tendência de indução de genes
relacionados com o tecido especializado.
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ANEXOS
Anexos
107
ANEXO A
ESCLARECIMENTOS AOS SUJEITOS DA PESQUISA
O senhor (a) está sendo convidado (a) a participar de um estudo a ser realizado na
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, intitulado
“Uso de cDNA Microarrays na Análise do Transcriptoma Durante a Diferenciação de
Células Tronco Humanas em Osteoblastos ”. O estudo tem como objetivo comparar a
transformação de células-tronco de origens diferentes (de medula óssea e do cordão
umbilical humanos) em osteoblastos através da análise dos genes destas células. Não será
realizado nenhum outro procedimento além daquele que você será submetido no seu
tratamento de rotina. Portanto, ao concordar em participar, você não correrá nenhum tipo
de risco a mais. Você não terá que pagar nenhuma taxa por isso e receberá o
acompanhamento e a assistência normalmente dados aos pacientes submetidos à
procedimentos cirúrgicos rotineiros. Esta pesquisa não trará danos a você porque nós
vamos utilizar apenas tecidos que são usualmente descartados de procedimentos cirúrgicos
de transplante (medula óssea) ou após o parto (cordão umbilical). Esta pesquisa poderá
trazer benefícios na compreensão da natureza e qualidade de células-tronco específicas de
cada tecido, nos deixando mais próximos em utilizá-las como meio de substituir células
danificadas por doenças ou traumas.
Além disso, você terá a garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou
esclarecimento de qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e
outras situações relacionadas à pesquisa. A qualquer momento poderá desistir de participar
do estudo sem que isso traga prejuízo à continuidade do seu tratamento. Você não será
identificado e todos os dados serão confidenciais, ou seja, mantidos em segredo.
Você ainda poderá solicitar qualquer informação adicional aos pesquisadores responsáveis:
Prof. Dr. Geraldo A. S. Passos. Fone: (16) 3602-3030
Prof
a
. Dr
a
. Karina Fittipaldi Bombonato Prado. Fone: (16) 3602-4052
Anexos
108
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu ___________________________________________________, abaixo assinado, tendo
sido devidamente esclarecido sobre todas as condições que constam do documento
“ESCLARECIMENTOS AO SUJEITO DA PESQUISA”, de que trata o Projeto de
Pesquisa intitulado “Uso de cDNA Microarrays na Análise do Transcriptoma Durante
a Diferenciação de Células Tronco Humanas em Osteoblastos”, que tem como
pesquisador responsável o Prof. Dr. Geraldo A. S. Passos, especialmente no que diz
respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, aos riscos e aos
benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como a forma de
indenização por danos decorrentes da pesquisa, declaro que tenho pleno conhecimento dos
direitos e das condições que me foram assegurados, a seguir relacionados:
1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer
dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e outras situações relacionadas
com a pesquisa e o tratamento a que serei submetido.
2. A liberdade de retirar o meu consentimento e deixar de participar do estudo, a qualquer
momento, sem que isso traga prejuízo à continuidade do meu tratamento.
3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da
informação relacionada a minha privacidade.
4. O compromisso de que me será prestada informação atualizada durante o estudo, ainda
que esta possa afetar a minha vontade de continuar dele participando.
5. O compromisso de que serei devidamente acompanhado e assistido durante todo o período
de minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu
tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa.
6. O compromisso de que não serão realizados quaisquer outros procedimentos além
daqueles necessários para o tratamento. Portanto, não haverá qualquer risco ou
desconforto adicional.
Anexos
109
7. O compromisso de que não haverá despesas extras e de que esta pesquisa não me trará
nenhum tipo de dano.
Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e
que, livremente, manifesto a minha vontade em participar do referido projeto.
Ribeirão Preto, _____ de _________ de 200_.
______________________________
Assinatura do paciente
Anexos
110
ANEXO B
Representatividade dos clones de cDNA em relação aos diferentes tecidos e
linhagens de células utilizados na construção da biblioteca humana IMAGE.
Tecidos Freqüência (%)
Cérebro infantil 7.50
Placenta 5.57
Baço e fígado fetal 5.47
Coração fetal 4.65
Melanócito 3.47
Mama 3.08
Célula B 3.06
Cérebro 3.06
Útero gravídico 2.97
Pulmão fetal 2.96
Cólon 2.62
Lesão de esclerose múltipla 2.53
Tumor ovariano 2.45
Cérebro fetal 2.14
Epitélio pigmentado da retina 1.92
Célula T da linhagem Jurkat 1.91
Cerebelo 1.61
Coração 1.49
Pulmão 1.44
Tumor glandular da paratireoíde 1.44
Baço fetal 1.34
Fibroblasto 1.30
Glândula pineal 1.29
Cóclea fetal 1.22
Ilhotas pancreáticas 1.20
Endotélio 1.19
Precursor neuronal.nt2 1.19
Fígado 1.17
Testículo 1.15
Músculo 1.15
Carcinoma de colo da linh. Hcc 1.09
Células Hela 1.05
Próstate 1.03
Embrião de 8 semanas 0.85
Vesícula biliar 0.83
Hipocampo 0.79
Tumor pacreático 0.79
Tumor de endométrio 0.78
Célula T ativada 0.75
Embriãode 12 semanas 0.75
Carcinoma de pulmão 0.68
Tireoíde 0.66
Ovário 0.62
Linfoma de célula T 0.59
Neuroepitélio nt 2 rami 0.58
Embrião 0.52
Anexos
111
Rim fetal 0.51
Tumor de testículo 0.50
Retina fetal 0.50
Leucócitos 0.44
Epidídimio 0.42
Tumor de útero 0.41
Embrião de 9semanas 0.41
Carcinoma de cólon linh.caco2 0.40
Epitélio olfatório 0.37
Tumor de pele 0.37
Útero 0.35
Tumor colo retal 0.34
Baço 0.33
Tumor de glândula adrenal 0.33
Osso 0.30
Próstata neoplásica 0.30
Embrião de 6 semanas 0.25
Pancreas 0.24
Tumor de prostate 0.24
Fígado fetal 0.23
Intestino Delgado 0.23
Aorta 0.21
Glândula adrenal infantil 0.21
Membrana sinovial 0.20
Linhagem de fígado helpq2 0.20
Rim 0.20
Adrenal 0.16
Próstata 0.16
Corpúsculo ciliar ocular 0.16
Glândula tireoíde 0.16
Epidídimio 0.16
Tecido adipose 0.16
Olho 0.16
Medula óssea 0.14
Pele fetal 0.14
Pele 0.11
Adenocarcinoma de cólon 0.11
Timo 0.11
Glândula pituitária 0.10
Sangue 0.10
Mucosa do cólon 0.10
Tecido adipose 0.10
Linh. De tumor pancreático 0.08
Córtex cerebral 0.08
Tumor pulmonar 0.07
Epitélio de sarcoma 0.07
Monócito estimulado 0.07
Tonsila 0.07
Córnea 0.06
Miosarcoma abdominal 0.06
Embrião de sete semanas 0.06
Intestino 0.06
Prepúcio 0.06
Timo 0.06
Epiderme 0.06
Omentum 0.04
Anexos
112
Adenocarcinoma 0.04
Cabeça e pescoço 0.04
Músculo fetal 0.04
Pool 0.04
Macrófago 0.04
Lesões fetais de esclerose múltipla 0.04
Tumor de traqueía 0.04
Glândula adrenal fetal 0.04
Nódulo linfoíde 0.04
Linhagem de hipocampo 0.03
Embrião inteiro 0.03
Carcinoma de célula pequena 0.03
Melanoma melanocítico da linhagem mdr high 0.03
Células B namalwa 0.03
Linhagem de adenocarcinoma de endométrio 0.03
Linhagem de adenocarcinoma mamário 0.03
Linfoma 0.03
Carcinoma de célula grande 0.03
Medula 0.03
Linhagem de adenocarcinoma 0.03
Estômago 0.03
Células de neuroblastoma 0.03
Linhagem de testículo 0.03
Veia umbilical 0.03
Célula germinativa 0.03
Linhagem celular de carcinoma embrional 0.03
Carcinoíde 0.03
Hemisfério cerebral direito 0.03
Leiomiosarcoma 0.03
Glândula adrenal 0.03
Plaqueta 0.03
Melanoma melanocítico 0.03
Pool de cólon, rim e estômago 0.03
Leucemia de célula T 0.03
Tumor de célula nervosa 0.03
Córtex cerebral 0.03
Linfócitos de sangue perférico 0.03
Linhagem de leiomiosarcoma 0.03
Placenta normal 0.03
Carcinoma hepatocelular 0.03
Epitélio pigmentar da retina 0.03
Linhagem celular primária de célula B de tonsilas 0.03
Linfonodo 0.03
Mama normal 0.03
Amigdala 0.03
Coriocarcinoma 0.03
Tumor de esôfago 0.03
Pool de cérebro, pulmão e testículo 0.01
Pool de tumor 5 0.01
Adenocarcinoma de pulmão 0.01
Oligodendroglioma anaplásico 0.01
Leucócito 0.01
Célula metastática 0.01
Linfoma histiocítico 0.01
Pool de pâncreas 0.01
Córtex motor cerebral 0.01
Anexos
113
Pool de pulmão 0.01
Neuroecderme primitiva 0.01
Tumor renal 0.01
Lobo frontal cerebral 0.01
Tumor de epidídimio 0.01
Carcinoma embrionário 0.01
Glioblastoma 0.01
Pool de rearranjos de cél mielóide 18 cml
cases.bcr.abl
0.01
Linhagem de hipernefroma 0.01
Carcinoma epitelial 0.01
Tumor 0.01
Múculo esquelético 0.01
Ilhota pancreática purificada 0.01
Estômago 0.01
Retinoblastoma 0.01
Linhagem de adenocarcinoma duodenal 0.01
Epitélio normal 0.01
Striatum cerebral 0.01
Tecido hepático não tumoral 0.01
Córtex temporal cerebral 0.01
Lobo frontal cerebral 0.01
Insulinoma 0.01
Tumor juvenil granular 0.01
Pnet 0.01
Osteosarcoma 0.01
Linhagem de carcinoma hepatocelular 0.01
Cólon normal 0.01
Linhagem de carcinoma epitelial 0.01
Tecido de tumor ovariano 0.01
Meduloblastoma 0.01
Endometriose ovariana em metástase 0.01
Paratireoide 0.01
Pool 0.01
Iris 0.01
Adenocarcinoma de célula renal 0.01
Gordura marrom 0.01
Glioblastoma com amplificação egfr 0.01
Melanoma melanocítico com alto mdr 0.01
Córtex occiptal cerebral 0.01
Pituitária 0.01
Adenocarcinoma moderadamente diferenciado 0.01
Adipose 0.01
Carcinoma não diferenciado 0.01
Cristalino 0.01
Tronco cerebral 0.01
Orelha 0.01
Tumor de omentum maior 0.01
Linfoma burkit 0.01
Linfócitos 0.01
Córtex frontal cerebral 0.01
Epitélio pigmentar da retina normal 0.01
Melanoma 0.01
Esôfago 0.01
Osso fetal 0.01
Linhagem de hipotálamo 0.01
Anexos
114
Linhagem celular da córtex adrenal 0.01
Linhagem celular de papiloma transicional 0.01
Epitélio pigmentar da retina fetal 0.01
Teratocarcinoma fetal 0.01
Raiz do gânglio dorsal 0.01
Nervo normal 0.01
Veia umbilical neonatal 0.01
Feocromacitoma 0.01
Células leucêmicas mielógenas agudas 0.01
Pulmão normal 0.01
Hipotálamo 0.01
Glândula salivar 0.01
Pulmão embrionário 0.01
Pool do tumor wilms primário 0.01
Linhagem de carcinoma 0.01
Células de leucemia mielógena crônica 0.01
Neuroblastoma 0.01
Anexos
115
ANEXO C
Distribuição cromossômica das seqüências de cDNA da biblioteca IMAGE.
0
2
4
6
8
10
12
12345678910111213141516171819202122XY
Cromossomos
Porcentagem (%)
Anexos
116
ANEXO D
Freqüência dos clones da biblioteca IMAGE de acordo com o processo
biológico.
010203040
Freqüência
Apoptose
Metástase
Replicação
Ciclo celular
Regulação Gênica
Angiogênese
Desenvolvimento
Transdução de sinal
Resposta Imune
Sinalização Celular
Transcrição
Supressão de Tumor
Oncogenes
Reparo de DNA
Comportamento
Infecção
Anexos
117
ANEXO E
Lista de genes reprimidos após 7 dias de indução química da diferenciação.
Análise SAM, FDR ≤ 0,05.
Símbolo do
gene
UGCluster Nome
ACVRL1 Hs.591026 Activin A receptor type II-like 1
ADAM12 Hs.655388 ADAM metallopeptidase domain 12 (meltrin alpha)
ADCY1 Hs.192215 Adenylate cyclase 1 (brain)
ALPP Hs.284255 Alkaline phosphatase, placental (Regan isozyme)
ANAPC7 Hs.529280 Anaphase promoting complex subunit 7
APPL2 Hs.506603 Adaptor protein, phosphotyrosine interaction, PH domain and
leucine zipper containing 2
ARHGEF7 Hs.508738 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 7
ATP7B Hs.492280 ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide
BCAT1 Hs.438993 Branched chain aminotransferase 1, cytosolic
BEAN Hs.97805 Brain expressed, associated with Nedd4
BTRC Hs.696242 Beta-transducin repeat containing
C13orf27 Hs.398111 Chromosome 13 open reading frame 27
C14orf112 Hs.137108 Chromosome 14 open reading frame 112
C9orf165 Hs.522085 Chromosome 9 open reading frame 165
CAMK2G Hs.699281 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) II
gamma
CDKL3 Hs.105818 Cyclin-dependent kinase-like 3
CEP72 Hs.591741 Centrosomal protein 72kDa
CHM Hs.496449 Choroideremia (Rab escort protein 1)
CHST11 Hs.17569 Carbohydrate (chondroitin 4) sulfotransferase 11
CINP Hs.129634 Cyclin-dependent kinase 2-interacting protein
CMBL Hs.192586 Carboxymethylenebutenolidase homolog (Pseudomonas)
CNPY1 Hs.146751 Canopy 1 homolog (zebrafish)
COL6A2 Hs.420269 Collagen, type VI, alpha 2
COTL1 Hs.289092 Coactosin-like 1 (Dictyostelium)
CPEB3 Hs.131683 Cytoplasmic polyadenylation element binding protein 3
CRHBP Hs.115617 Corticotropin releasing hormone binding protein
CRISPLD1 Hs.436542 Cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 1
CTNNA2 Hs.167368 Catenin (cadherin-associated protein), alpha 2
Anexos
118
CWC15 Hs.503597 CWC15 homolog (S. cerevisiae)
CXXC1 Hs.180933 CXXC finger 1 (PHD domain)
CYP26B1 Hs.91546 Cytochrome P450, family 26, subfamily B, polypeptide 1
DARS Hs.503787 Aspartyl-tRNA synthetase
DDX47 Hs.504828 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 47
DDX55 Hs.286173 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 55
DENND1C Hs.236449 DENN/MADD domain containing 1C
DERL1 Hs.241576 Der1-like domain family, member 1
DFNA5 Hs.520708 Deafness, autosomal dominant 5
DTNA Hs.695993 Dystrobrevin, alpha
FAM108B1 Hs.380389 Family with sequence similarity 108, member B1
FLJ41352 Hs.535622 FLJ41352 protein
FTSJ2 Hs.279877 FtsJ homolog 2 (E. coli)
GAL3ST3 Hs.208343 Galactose-3-O-sulfotransferase 3
GLE1L Hs.522418 GLE1 RNA export mediator-like (yeast)
GOLGA1 Hs.133469 Golgi autoantigen, golgin subfamily a, 1
GRM2 Hs.121510 Glutamate receptor, metabotropic 2
HDAC4 Hs.20516 Histone deacetylase 4
HNRPM Hs.465808 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M
IGSF1 Hs.22111 Immunoglobulin superfamily, member 1
KCMF1 Hs.654968 Potassium channel modulatory factor 1
KHSRP Hs.699378 KH-type splicing regulatory protein (FUSE binding protein 2)
KIAA0319 Hs.26441 KIAA0319
KIAA0841 Hs.7426 KIAA0841
KLHL9 Hs.657270 Kelch-like 9 (Drosophila)
LCA5 Hs.21945 Leber congenital amaurosis 5
LMTK3 Hs.207426 Lemur tyrosine kinase 3
LOC147343 Hs.380030 Hypothetical protein LOC147343
LOC150568 Hs.107284 Hypothetical protein LOC150568
LOC152485 Hs.133916 Hypothetical protein LOC152485
LOC339674 Hs.517656 Hypothetical protein LOC339674
LOC51057 Hs.414952 Hypothetical protein LOC51057
LOC645561 Hs.527211 Hypothetical LOC645561
LRRN2 Hs.26312 Leucine rich repeat neuronal 2
MAP2K1 Hs.145442 Mitogen-activated protein kinase kinase 1
MED21 Hs.286145 Mediator complex subunit 21
MKLN1 Hs.44693 Muskelin 1, intracellular mediator containing kelch motifs
MLF2 Hs.524214 Myeloid leukemia factor 2
Anexos
119
MOBP Hs.121333 Myelin-associated oligodendrocyte basic protein
MRPS6 Hs.302742 Mitochondrial ribosomal protein S6
NBPF12 Hs.568235 Neuroblastoma breakpoint family, member 12
NSL1 Hs.497692 NSL1, MIND kinetochore complex component, homolog (S.
cerevisiae)
OR2C3 Hs.23491 Olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 3
PDIA3 Hs.591095 Protein disulfide isomerase family A, member 3
PDPK1 Hs.459691 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1
POU2F3 Hs.227115 POU class 2 homeobox 3
PPP1R11 Hs.82887 Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 11
PQLC2 Hs.647620 PQ loop repeat containing 2
PRKAA1 Hs.43322 Protein kinase, AMP-activated, alpha 1 catalytic subunit
PRKDC Hs.700597 Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide
PRPSAP1 Hs.77498 Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase-associated protein 1
PRR6 Hs.433422 Proline rich 6
PSG5 Hs.654415 Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5
PTGIR Hs.458324 Prostaglandin I2 (prostacyclin) receptor (IP)
PWP2 Hs.449076 PWP2 periodic tryptophan protein homolog (yeast)
RAD51L3 Hs.631757 RAD51-like 3 (S. cerevisiae)
RASGRP1 Hs.591127 RAS guanyl releasing protein 1 (calcium and DAG-regulated)
RASIP1 Hs.233955 Ras interacting protein 1
RBM7 Hs.533736 RNA binding motif protein 7
RSBN1 Hs.486285 Round spermatid basic protein 1
RYR1 Hs.466664 Ryanodine receptor 1 (skeletal)
S100P Hs.2962 S100 calcium binding protein P
SH3GL3 Hs.270055 SH3-domain GRB2-like 3
SNX10 Hs.571296 Sorting nexin 10
SNX26 Hs.515364 Sorting nexin 26
SPIN1 Hs.146804 Spindlin 1
STRA6 Hs.24553 Stimulated by retinoic acid gene 6 homolog (mouse)
TMEM107 Hs.513933 Transmembrane protein 107
TMLHE Hs.133321 Trimethyllysine hydroxylase, epsilon
TNIK Hs.34024 TRAF2 and NCK interacting kinase
TRIM58 Hs.323858 Tripartite motif-containing 58
TRRAP Hs.203952 Transformation/transcription domain-associated protein
TSKU Hs.8361 Tsukushin
TTLL12 Hs.517670 Tubulin tyrosine ligase-like family, member 12
WARS2 Hs.523506 Tryptophanyl tRNA synthetase 2, mitochondrial
Anexos
120
WDR40A Hs.699347 WD repeat domain 40A
WWC3 Hs.527524 WWC family member 3
YTHDF3 Hs.491861 YTH domain family, member 3
ZFAND6 Hs.654787 Zinc finger, AN1-type domain 6
ZNF641 Hs.23492 Zinc finger protein 641
ZNF691 Hs.20879 Zinc finger protein 691
Anexos
121
ANEXO F
Lista de genes induzidos após 7 dias de indução química da diferenciação.
Análise SAM, FDR < 0,05.
Símbolo do
gene
UGCluster Nome
ABCB8 Hs.647118 ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 8
ACACB Hs.234898 Acetyl-Coenzyme A carboxylase beta
ACP5 Hs.1211 Acid phosphatase 5, tartrate resistant
ADAMTS1 Hs.643357 ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1
ADCY7 Hs.513578 Adenylate cyclase 7
ALCAM Hs.591293 Activated leukocyte cell adhesion molecule
ALDH3A2 Hs.499886 Aldehyde dehydrogenase 3 family, member A2
ANKRD34 Hs.620591 Ankyrin repeat domain 34
ANKRD49 Hs.29052 Ankyrin repeat domain 49
AOF1 Hs.484813 Amine oxidase (flavin containing) domain 1
APLP2 Hs.695920 Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2
ARHGEF7 Hs.508738 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 7
ARPC2 Hs.529303 Actin related protein 2/3 complex, subunit 2, 34kDa
ARRB1 Hs.503284 Arrestin, beta 1
ASB3 Hs.40763 Ankyrin repeat and SOCS box-containing 3
ASGR1 Hs.12056 Asialoglycoprotein receptor 1
ATP1B3 Hs.477789 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 3 polypeptide
ATP4A Hs.36992 ATPase, H+/K+ exchanging, alpha polypeptide
ATP6AP2 Hs.700634 ATPase, H+ transporting, lysosomal accessory protein 2
ATR Hs.271791 Ataxia telangiectasia and Rad3 related
ATXN7L3 Hs.512651 Ataxin 7-like 3
BGN Hs.821 Biglycan
BIN1 Hs.193163 Bridging integrator 1
BLZF1 Hs.130746 Basic leucine zipper nuclear factor 1 (JEM-1)
BMP1 Hs.1274 Bone morphogenetic protein 1
BZW2 Hs.487635 Basic leucine zipper and W2 domains 2
C11orf59 Hs.530753 Chromosome 11 open reading frame 59
C11orf9 Hs.473109 Chromosome 11 open reading frame 9
C12orf52 Hs.524762 Chromosome 12 open reading frame 52
C14orf102 Hs.528131 Chromosome 14 open reading frame 102
C17orf55 Hs.631762 Chromosome 17 open reading frame 55
Anexos
122
C1orf2 Hs.348308 Chromosome 1 open reading frame 2
C20orf103 Hs.22920 Chromosome 20 open reading frame 103
C5orf30 Hs.482976 Chromosome 5 open reading frame 30
C6orf148 Hs.433062 Chromosome 6 open reading frame 148
C9orf167 Hs.495541 Chromosome 9 open reading frame 167
CABLES2 Hs.301040 Cdk5 and Abl enzyme substrate 2
CABP5 Hs.117694 Calcium binding protein 5
CACNA1E Hs.437444 Calcium channel, voltage-dependent, R type, alpha 1E subunit
CALU Hs.7753 Calumenin
CAPN10 Hs.112218 Calpain 10
CCDC35 Hs.647273 Coiled-coil domain containing 35
CCDC94 Hs.21811 Coiled-coil domain containing 94
CCNG1 Hs.79101 Cyclin G1
CCNG2 Hs.13291 Cyclin G2
CDKN2D Hs.435051 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2D (p19, inhibits CDK4)
CENTA1 Hs.644629 Centaurin, alpha 1
CHMP6 Hs.514560 Chromatin modifying protein 6
CMBL Hs.192586 Carboxymethylenebutenolidase homolog (Pseudomonas)
CNTNAP2 Hs.655684 Contactin associated protein-like 2
COG7 Hs.185807 Component of oligomeric golgi complex 7
COL6A3 Hs.233240 Collagen, type VI, alpha 3
CORO1B Hs.6191 Coronin, actin binding protein, 1B
CPD Hs.446079 Carboxypeptidase D
CPNE8 Hs.40910 Copine VIII
CRADD Hs.591016 CASP2 and RIPK1 domain containing adaptor with death
domain
CRIPAK Hs.26410 Cysteine-rich PAK1 inhibitor
CSGlcA-T Hs.647084 Chondroitin sulfate glucuronyltransferase
CSTF2T Hs.591358 Cleavage stimulation factor, 3' pre-RNA, subunit 2, 64kDa, tau
variant
CTSA Hs.652282 Cathepsin A
DAZAP2 Hs.369761 DAZ associated protein 2
DCLRE1C Hs.656065 DNA cross-link repair 1C (PSO2 homolog, S. cerevisiae)
DDX5 Hs.279806 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 5
DIP2B Hs.505516 DIP2 disco-interacting protein 2 homolog B (Drosophila)
DIXDC1 Hs.655626 DIX domain containing 1
DKFZp761E198 Hs.591957 DKFZp761E198 protein
DKFZp761P0423 Hs.657673 Homolog of rat pragma of Rnd2
Anexos
123
DLG3 Hs.522680 Discs, large homolog 3 (neuroendocrine-dlg, Drosophila)
DLX6 Hs.249196 Distal-less homeobox 6
DLX6 Hs.249196 Distal-less homeobox 6
DNAJA1 Hs.445203 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 1
DSC2 Hs.95612 Desmocollin 2
EIF1 Hs.150580 Eukaryotic translation initiation factor 1
EIF4G1 Hs.433750 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, 1
ELAVL4 Hs.213050 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 4 (Hu
antigen D)
EPAS1 Hs.468410 Endothelial PAS domain protein 1
EPS15 Hs.83722 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15
EVL Hs.125867 Enah/Vasp-like
EXOC3 Hs.646923 Exocyst complex component 3
FAM33A Hs.463607 Family with sequence similarity 33, member A
FAM46A Hs.10784 Family with sequence similarity 46, member A
FBXL3 Hs.508284 F-box and leucine-rich repeat protein 3
FER1L4 Hs.72222 Fer-1-like 4 (C. elegans)
FIGN Hs.593650 Fidgetin
FLJ11171 Hs.72782 Hypothetical protein FLJ11171
FLJ31438 Hs.468590 Hypothetical protein FLJ31438
FLJ37078 Hs.694857 Hypothetical protein FLJ37078
FLJ43663 Hs.150556 Hypothetical protein FLJ43663
FN1 Hs.203717 Fibronectin 1
FOXN3 Hs.434286 Forkhead box N3
FXR2 Hs.52788 Fragile X mental retardation, autosomal homolog 2
GAPVD1 Hs.495134 GTPase activating protein and VPS9 domains 1
GCN1L1 Hs.298716 GCN1 general control of amino-acid synthesis 1-like 1 (yeast)
GDF10 Hs.2171 Growth differentiation factor 10
GJA5 Hs.447968 Gap junction protein, alpha 5, 40kDa
GLRX3 Hs.42644 Glutaredoxin 3
GNAZ Hs.584760 Guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha z
polypeptide
GNB1 Hs.700577 Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta
polypeptide 1
GNB4 Hs.173030 Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta
polypeptide 4
GNG12 Hs.700661 Guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 12
GNG13 Hs.247888 Guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 13
Anexos
124
GNPDA1 Hs.633853 Glucosamine-6-phosphate deaminase 1
GOLPH3 Hs.408909 Golgi phosphoprotein 3 (coat-protein)
GPR158 Hs.499108 G protein-coupled receptor 158
GPX3 Hs.663430 Glutathione peroxidase 3 (plasma)
GSTP1 Hs.523836 Glutathione S-transferase pi
HADHB Hs.534639 Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-
Coenzyme A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase
(trifunctional protein), beta subunit
HAX1 Hs.199625 HCLS1 associated protein X-1
HCRTR1 Hs.388226 Hypocretin (orexin) receptor 1
HINT1 Hs.483305 Histidine triad nucleotide binding protein 1
HIPK3 Hs.201918 Homeodomain interacting protein kinase 3
HMGCL Hs.533444 3-hydroxymethyl-3-methylglutaryl-Coenzyme A lyase
(hydroxymethylglutaricaciduria)
HNRPF Hs.808 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F
HPN Hs.182385 Hepsin (transmembrane protease, serine 1)
HSPA1L Hs.690634 Heat shock 70kDa protein 1-like
HSU79275 Hs.598507 Hypothetical protein HSU79275
HTRA1 Hs.501280 HtrA serine peptidase 1
HYAL3 Hs.129910 Hyaluronoglucosaminidase 3
IGFBP4 Hs.462998 Insulin-like growth factor binding protein 4
IMPA2 Hs.367992 Inositol(myo)-1(or 4)-monophosphatase 2
IMPDH1 Hs.654401 IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase 1
ITFG1 Hs.42217 Integrin alpha FG-GAP repeat containing 1
ITGA5 Hs.505654 Integrin, alpha 5 (fibronectin receptor, alpha polypeptide)
ITPKB Hs.528087 Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B
JMJD2C Hs.157106 Jumonji domain containing 2C
KCNF1 Hs.23735 Potassium voltage-gated channel, subfamily F, member 1
KCNIP4 Hs.655705 Kv channel interacting protein 4
KCNT2 Hs.657046 Potassium channel, subfamily T, member 2
KCTD12 Hs.693617 Potassium channel tetramerisation domain containing 12
KIAA1409 Hs.126561 KIAA1409
KIAA1729 Hs.455089 KIAA1729 protein
KIDINS220 Hs.9873 Kinase D-interacting substrate of 220 kDa
KIF1C Hs.435120 Kinesin family member 1C
KLHDC2 Hs.509264 Kelch domain containing 2
KLHL25 Hs.498371 Kelch-like 25 (Drosophila)
KLHL3 Hs.655084 Kelch-like 3 (Drosophila)
Anexos
125
KSR1 Hs.133534 Kinase suppressor of ras 1
LCORL Hs.446201 Ligand dependent nuclear receptor corepressor-like
LGALS1 Hs.445351 Lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)
LHFP Hs.507798 Lipoma HMGIC fusion partner
LIMCH1 Hs.335163 LIM and calponin homology domains 1
LOC286440 Hs.348844 Hypothetical protein LOC286440
LOC348692 Hs.656781 Hypothetical protein LOC348692
LOC643837 Hs.133183 Hypothetical protein LOC643837
LOC645323 Hs.12827 Hypothetical LOC645323
LOC728517 Hs.568606 Hypothetical protein LOC728517
LRCH2 Hs.65366 Leucine-rich repeats and calponin homology (CH) domain
containing 2
LSM1 Hs.425311 LSM1 homolog, U6 small nuclear RNA associated (S.
cerevisiae)
MAGIX Hs.193170 MAGI family member, X-linked
MAP3K10 Hs.466743 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 10
MAP4K2 Hs.534341 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 2
MAP7D3 Hs.446275 MAP7 domain containing 3
MARCH1 Hs.696248 Membrane-associated ring finger (C3HC4) 1
MARK3 Hs.35828 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3
MAST2 Hs.319481 Microtubule associated serine/threonine kinase 2
ME3 Hs.199743 Malic enzyme 3, NADP(+)-dependent, mitochondrial
MED13 Hs.282678 Mediator complex subunit 13
MEIS3 Hs.380923 Meis homeobox 3
MFAP5 Hs.512842 Microfibrillar associated protein 5
MICAL2 Hs.501928 Microtubule associated monoxygenase, calponin and LIM
domain containing 2
MIER3 Hs.657594 Mesoderm induction early response 1, family member 3
MLLT1 Hs.699150 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog,
Drosophila); translocated to, 1
MORF4L1 Hs.374503 Mortality factor 4 like 1
MRE11A Hs.192649 MRE11 meiotic recombination 11 homolog A (S. cerevisiae)
MRVI1 Hs.501898 Murine retrovirus integration site 1 homolog
MSN Hs.87752 Moesin
MYH9 Hs.474751 Myosin, heavy chain 9, non-muscle
NACA Hs.505735 Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit
NAT9 Hs.144058 N-acetyltransferase 9
NFIA Hs.191911 Nuclear factor I/A
Anexos
126
NFKBIE Hs.458276 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-
cells inhibitor, epsilon
NNMT Hs.503911 Nicotinamide N-methyltransferase
NOMO1 Hs.583391 NODAL modulator 1
NPTXR Hs.91622 Neuronal pentraxin receptor
NRD1 Hs.584782 Nardilysin (N-arginine dibasic convertase)
NRGN Hs.524116 Neurogranin (protein kinase C substrate, RC3)
NUMB Hs.654609 Numb homolog (Drosophila)
OAS3 Hs.528634 2'-5'-oligoadenylate synthetase 3, 100kDa
OGT Hs.405410 O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) transferase (UDP-N-
acetylglucosamine:polypeptide-N-acetylglucosaminyl
transferase)
OTOF Hs.91608 Otoferlin
P4HB Hs.464336 Procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-
hydroxylase), beta polypeptide
PAP2D Hs.483948 Phosphatidic acid phosphatase type 2
PCMTD1 Hs.308480 Protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase
domain containing 1
PCNP Hs.654949 PEST proteolytic signal containing nuclear protein
PCYOX1 Hs.591572 Prenylcysteine oxidase 1
PDE4D Hs.654358 Phosphodiesterase 4D, cAMP-specific (phosphodiesterase E3
dunce homolog, Drosophila)
PDGFRB Hs.509067 Platelet-derived growth factor receptor, beta polypeptide
PDHX Hs.502315 Pyruvate dehydrogenase complex, component X
PDK2 Hs.256667 Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 2
PDYN Hs.22584 Prodynorphin
PER1 Hs.445534 Period homolog 1 (Drosophila)
PIK3AP1 Hs.310456 Phosphoinositide-3-kinase adaptor protein 1
PKN3 Hs.300485 Protein kinase N3
POLE Hs.657680 Polymerase (DNA directed), epsilon
PON1 Hs.370995 Paraoxonase 1
PPP1CB Hs.591571 Protein phosphatase 1, catalytic subunit, beta isoform
PPP1R9B Hs.514323 Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 9B
PREPL Hs.444349 Prolyl endopeptidase-like
PRKAR1B Hs.520851 Protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type I, beta
PRSS23 Hs.25338 Protease, serine, 23
PSMB1 Hs.352768 Proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 1
PSMD10 Hs.522752 Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase,
10
Anexos
127
PSMD5 Hs.193725 Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 5
PXMP3 Hs.437966 Peroxisomal membrane protein 3, 35kDa (Zellweger syndrome)
RAB2A Hs.369017 RAB2A, member RAS oncogene family
RAB37 Hs.592097 RAB37, member RAS oncogene family
RAI16 Hs.491223 Retinoic acid induced 16
RBJ Hs.434993 Rab and DnaJ domain containing
RBM23 Hs.4997 RNA binding motif protein 23
RBMS2 Hs.645521 RNA binding motif, single stranded interacting protein 2
REC8 Hs.419259 REC8 homolog (yeast)
RECQL4 Hs.31442 RecQ protein-like 4
RNF149 Hs.142074 Ring finger protein 149
RNF216L Hs.520636 Ring finger protein 216-like
RP13-102H20.1 Hs.22905 Hypothetical protein FLJ30058
RPN1 Hs.518244 Ribophorin I
RSPO2 Hs.444834 R-spondin 2 homolog (Xenopus laevis)
SCARB2 Hs.349656 Scavenger receptor class B, member 2
SEPP1 Hs.700640 Selenoprotein P, plasma, 1
SERHL Hs.656672 Serine hydrolase-like
SETMAR Hs.475300 SET domain and mariner transposase fusion gene
SGCB Hs.438953 Sarcoglycan, beta (43kDa dystrophin-associated glycoprotein)
SH2D3C Hs.306412 SH2 domain containing 3C
SH3TC2 Hs.483784 SH3 domain and tetratricopeptide repeats 2
SHC1 Hs.433795 SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein
1
SHC1 Hs.433795 SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein
1
SLC12A5 Hs.21413 Solute carrier family 12, (potassium-chloride transporter)
member 5
SLC19A3 Hs.221597 Solute carrier family 19, member 3
SLC44A2 Hs.631631 Solute carrier family 44, member 2
SNAP29 Hs.108002 Synaptosomal-associated protein, 29kDa
SORCS1 Hs.591915 Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 1
SOX1 Hs.202526 SRY (sex determining region Y)-box 1
SPRY2 Hs.18676 Sprouty homolog 2 (Drosophila)
STAG1 Hs.412586 Stromal antigen 1
STARD7 Hs.469331 StAR-related lipid transfer (START) domain containing 7
STIP1 Hs.337295 Stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing
protein)
Anexos
128
STYX Hs.364980 Serine/threonine/tyrosine interacting protein
SUHW4 Hs.511477 Suppressor of hairy wing homolog 4 (Drosophila)
SULT2B1 Hs.369331 Sulfotransferase family, cytosolic, 2B, member 1
SV2B Hs.592018 Synaptic vesicle glycoprotein 2B
SVEP1 Hs.522334 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain
containing 1
SVEP1 Hs.522334 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain
containing 1
SYP Hs.632804 Synaptophysin
TCBA1 Hs.656604 T-cell lymphoma breakpoint associated target 1
THOC2 Hs.592243 THO complex 2
TICAM2 Hs.696163 Toll-like receptor adaptor molecule 2
TMEM102 Hs.655662 Transmembrane protein 102
TMEM138 Hs.406530 Transmembrane protein 138
TMEM176B Hs.648445 Transmembrane protein 176B
TNKS1BP1 Hs.530730 Tankyrase 1 binding protein 1, 182kDa
TNRC4 Hs.26047 Trinucleotide repeat containing 4
TP53I11 Hs.554791 Tumor protein p53 inducible protein 11
TRAK2 Hs.152774 Trafficking protein, kinesin binding 2
TRHDE Hs.199814 Thyrotropin-releasing hormone degrading enzyme
TRIM13 Hs.436922 Tripartite motif-containing 13
TRIM2 Hs.435711 Tripartite motif-containing 2
TRIM22 Hs.501778 Tripartite motif-containing 22
TRIP10 Hs.515094 Thyroid hormone receptor interactor 10
TTYH1 Hs.268728 Tweety homolog 1 (Drosophila)
UBAP2 Hs.493739 Ubiquitin associated protein 2
VGLL3 Hs.435013 Vestigial like 3 (Drosophila)
VGLL3 Hs.435013 Vestigial like 3 (Drosophila)
WDR57 Hs.33962 WD repeat domain 57 (U5 snRNP specific)
ZADH1 Hs.632344 Zinc binding alcohol dehydrogenase, domain containing 1
ZC3H6 Hs.190477 Zinc finger CCCH-type containing 6
ZCCHC6 Hs.655162 Zinc finger, CCHC domain containing 6
ZNF236 Hs.189826 Zinc finger protein 236
ZNF44 Hs.656794 Zinc finger protein 44
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