Download PDF
ads:
0
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
ÁLVARO BEZERRA CARDOSO
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO COMPARATIVO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM
RATOS APÓS O USO DE BIOMATERIAIS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA
João Pessoa – PB
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
ÁLVARO BEZERRA CARDOSO
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO COMPARATIVO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM
RATOS APÓS O USO DE BIOMATERIAIS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA
Tese apresentada ao Programa Integrado de Pós-
Graduação em Odontologia da Universidade
Federal da Paraíba e Universidade Federal da
Bahia para obtenção do título de Doutor em
Odontologia
Área de Concentração: Estomatologia
Orientadores: Fabiano Gonzaga Rodrigues
Francisco de Assis Limeira Júnior
João Pessoa – PB
2008
ads:
2
DATA DA DEFESA DE TESE: 12 de dezembro de 2008
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Prof. Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues
Orientador
_______________________________________
Profª. Drª. Tânia Lemos Coelho Rodrigues
Examinadora Interna
_______________________________________
Profª. Drª. Andressa Feitosa Bezerra de Oliveira
Examinadora Interna
_______________________________________
Prof. Dr. Riedel Frota
Examinador Externo
_______________________________________
Prof. Dr. José Rodrigues Laureano Filho
Examinador Externo
_________________________________________
Prof. Dr. Francisco de Assis Limeira Júnior
Suplente Interno
_________________________________________
Prof. Dr. José Ivo Queiroz do Amaral
Suplente Externo
3
A Deus, por estar sempre do meu lado em todos os momentos da minha vida,
dando-me forças e sabedoria para tantas conquistas.
À minha família que sempre apoiou minhas escolhas, em especial aos meus irmãos
(Germano, Henrique e Rafael), por fazerem parte da minha vida, e juntamente
comigo, comemorarem mais um trabalho realizado.
Aos meus pais, Paulo e Ismênia, exemplos constantes de amor aos filhos, por me
ensinarem carinhosamente a enfrentar cada etapa da vida, incentivando e apoiando
todos os meus projetos. Meu eterno amor e gratidão.
4
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Aos Professores Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues e Dr. Francisco de Assis
Limeira Júnior, exemplos de dedicação, seriedade e profissionalismo na pesquisa
odontológica; por acreditarem em meu potencial e pelo apoio em todos os
momentos, minha imensa gratidão por orientarem este trabalho e pelos valiosos
ensinamentos durante o curso de pós-graduação.
5
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal da Paraíba, por me acolher nos últimos cinco anos,
durante os cursos de mestrado e de doutorado, nesta instituição de bases
educacionais sólidas.
Aos Professores do Programa Integrado de Pós-Graduação em Odontologia da
Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia, em especial
ao Dr. Ricardo Cavalcanti Duarte (coordenador do programa), ao Dr. Lino João da
Costa (Coordenador da área de concentração em Estomatologia), à Dra. Tânia
Lemos Coelho Rodrigues e à Dra. Maria Sueli Marques Soares, pela
oportunidade de realizar o curso de Doutorado em Estomatologia, assim como pelas
sinceras amizades conquistadas.
Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica e ao Laboratório de
Experimentação Animal, ambos da Universidade Federal da Paraíba, por permitir a
realização da parte experimental do trabalho, cedendo os animais e o ambiente
dentro de condições idéias de criação e manutenção, assegurando a confiabilidade
desta pesquisa.
6
Ao Senhor Luis Crispim, funcionário do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da
Universidade Federal da Paraíba, pela colaboração no cuidado e manutenção dos
animais utilizados durante todo o trabalho.
Aos Acadêmicos Carol, Lariane, Suennya e Thiago (Odontologia – UFPB), em
especial a Isa (Ciências Biológicas – UFPB) e ao Adelmo (Odontologia – UFPE),
pelo carinho e ajuda no trato com os animais, a participação de todos vocês foram
de fundamental importância na fase experimental deste trabalho.
À Faculdade de Odontologia de Pernambuco – FOP/UPE, em especial ao Prof.
Dr. Emanuel Sávio de Souza Andrade, pela disponibilização do laboratório de
Patologia Bucal, colaborando no desenvolvimento desta pesquisa.
Aos técnicos em patologia Armando (FOP/UPE) e Catarina, pela valiosa
contribuição no processamento das lâminas.
Ao Laboratório de Patologia Geral do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal da Paraíba, por ceder os microscópicos para análise
histológica, em especial à Profa. Dra. Cláudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo,
pela orientação na interpretação dos dados histológicos, sua participação foi de
extrema valia, engrandecendo a realização deste trabalho.
7
Ao Prof. Dr. Leonardo Vidal Batista e ao acadêmico Thallys do Departamento de
Informática da Universidade Federal da Paraíba, por tornarem possível a realização
da análise morfométrica desta pesquisa.
A todos os amigos do doutorado em Estomatologia (UFPB), em especial, Allan
Ullisses, Marcos Paiva, Luís Carlos, Andréa Queiroga e Giliara Carol, pela
convivência e amizade.
Ao grande amigo Ricardo Gurgel, pela amizade sincera e apoio desde os tempos
da especialização em cirurgia e mestrado em Diagnóstico Bucal. Esse trabalho
também é fruto de todo seu empenho e compromisso com o conhecimento científico,
com sua ajuda pudemos vencer diversos obstáculos e comemorar juntos mais essa
conquista.
A todos os professores da Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da
Universidade de Pernambuco, em especial, Dr. Belmiro Vasconcelos, Dr. Caubi
Figueiredo, Dr. Emanuel Dias, Dr. Laureano Rodrigues e Dr. Ricardo Holanda,
pela amizade e todos os ensinamentos na área de cirurgia; exemplos a serem
seguidos.
Ao fraterno amigo Riedel Frota, sempre disposto a ajudar, exemplo de dedicação e
profissionalismo na construção do conhecimento científico, pela amizade e apoio
constantes, minha eterna gratidão pelo incentivo e convívio em família.
8
Ao meu primo Pedro Paulo, à sua querida esposa Luciana e seus filhos Pedro
Filho e Nádia, por todos os momentos de alegria e descontração em família,
acolhendo-me fraternalmente em sua casa.
À família Oliveira Buril, por me acolher carinhosamente, em especial a Juliana
Buril, por toda compreensão e amor, a sua dedicação e companhia vem sendo
muito especial na construção de mais uma etapa de minha vida.
Aos amigos de plantão do Hospital Getúlio Vargas, em especial, Bruno de Lira,
Nelson Studart, Jorge Orestes, Jorge Luís, Lauro, Sérgio e Selenildo, pelos
momentos de descontração e amizade sincera.
A todos os Amigos, que de forma direta ou indiretamente, contribuíram e torceram
em favor da realização deste trabalho.
Muito obrigado a todos!
9
"É melhor tentar e falhar,
que preocupar-se e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver ..."
(Martin Luther King)
10
RESUMO
1
A presente pesquisa é um estudo experimental que avaliou a reparação óssea em
ratos, utilizando biomateriais de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz
inorgânica esponjosa e colágeno bovino) e sintética (cerâmica de hidroxiapatita + β -
tricálcio-fosfato). Foram utilizados 36 ratos, machos e wistar albinos, distribuídos
aleatoriamente em dois grupos com 18 animais cada e com a denominação G1
(bovino) e G2 (sintético). Foi confeccionado um defeito de 5,0 mm de diâmetro no
osso parietal em cada lado da sutura sagital do animal, onde o lado esquerdo
correspondeu ao experimento (preenchido por biomaterial de origem bovina ou
sintética) e o lado direito ao controle (preenchido por coágulo sanguíneo). Após os
períodos de 15, 30 e 45 dias do procedimento cirúrgico, os espécimes foram
enviados para processamento histológico e analisados em microscopia óptica. As
imagens obtidas foram segmentadas e submetidas à análise morfométrica para
avaliação da reparação óssea (quantificação de matriz óssea neoformada). Os
dados foram processados no programa SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) 13.0 para Windows, sendo a análise estatística com nível de significância
de 5%. Os resultados demonstraram que, embora sem diferença estatisticamente
significante, os defeitos ósseos submetidos aos biomateriais de origem bovina e
sintética apresentaram uma melhor reparação óssea em comparação ao controle,
sendo a matriz óssea neoformada (µm
2
1
Este trabalho está de acordo com as normas de documentação da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
NORMAS TÉCNICAS (ABNT), a saber: NBR 6022, Informação e Documentação – Referências –
Elaboração, ago. 2002. NBR 14724, Informação e Documentação – Trabalhos acadêmicos –
Apresentação, 2006.
) maior nos defeitos ósseos preenchidos por
osso de origem bovina. Conclui-se que os biomateriais utilizados contribuíram no
processo de reparação dos defeitos ósseos.
Palavras-chave: Regeneração Óssea. Materiais Biocompatíveis. Ratos.
11
ABSTRACT
This present experimental study evaluated the bone repair in rats following the use of
bovine (cortical organic matrix, cancellous inorganic matrix e bovine collagen) and
synthetic (hydroxiapatite + β-tricalcium-phosphate) origin biomaterials. Thirty six
Wistar albinus male rats were studied in two randomized groups with eighteen
animals: G1 (bovine) and G2 (synthetic). A 5,0 mm in diameter defect was
confectioned in both parietal bones in each side of the sagital medium suture of the
animal, where the left side corresponded to the experiment (filled with bovine or
synthetic bone) and the right side to the control (empty surgical cavity). The
specimens at 15, 30 and 45 days after the surgical procedure were sent for
histological processing and analyzed by optical microscopy. The images were
segmented and subjected to morphometric data analysis for evaluation of bone
repair (neoformed bone matrix quantification). The statistics analysis was performed
by the statistical program SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 13.0 for
Windows, considering significance of 5%. The results showed that, although there
was no statistically significant difference between groups, the defects submitted to
bovine and synthetic origin biomaterials presented better bone repair, being the
neoformed bone matrix (µm
2
) greater to bovine bone. Therefore, we concluded that
the biomaterials used in this study contributed to the bone healing process.
Key-words: Bone Regeneration. Biocompatible Materials. Rats
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Rato Wistar, macho albino, adulto jovem
56
Figura 2
Animais acondicionados em gaiolas plásticas
57
Figura 3
Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica
59
Figura 4
Anti-sepsia e infiltração anestésica local
60
Figura 5
Incisão linear através da pele e periósteo
61
Figura 6
Exposição da calvária após descolamento e afastamento do
retalho 61
Figura 7
Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo:
biomaterial
bovino (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica
esponjosa e colágeno bovino) 62
Figura 8
Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo:
biomaterial sintético (cerâmica de hidroxiapatita + β -tricálcio-
fosfato) 62
Figura 9
Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0)
63
Figura 10
Sutura contínua festonada da pele (mononylon 5-0)
63
Figura 11
Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos
espécimes 65
Figura 12
Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana
66
Figura 13
Imagem do defeito ósseo do grupo G2A (biomaterial de origem
sintética – experimento) com 45 dias 69
Figura 14
Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo
que será segmentada em sete classes 69
13
Figura 15
Classe utilizada para cálculo da área (µm
2
) da matriz óssea
neoformada 69
Figura 16
Grupo 1A - 15 dias. Defeito ósseo em toda extensão. Partículas
do biomaterial (*). Bordas do defeito (>). H.E. 75
Figura 17
Grupo 1A - 15 dias. Neoformação óssea a partir da borda do
defeito (>). H.E. 75
Figura 18
Grupo 1A - 15 dias. Detalhe da figura 17, evidenciado
neoformação óssea (*) significativa a partir da borda do defeito.
H.E. 75
Figura 19
Grupo 1A - 15 dias. Formação de trabécula óssea (*) entre as
partículas do biomaterial. H.E. 75
Figura 20
Grupo 1A - 30 dias. Neoformação de tecido ósseo (*) entre o
biomaterial implantado. Bordas do defeito (>). H.E. 77
Figura 21
Grupo 1A - 30 dias. Neoformação óssea na borda do defeito (>).
H.E. 77
Figura 22
Grupo 1A – 30 dias. Maior aumento da figura 21, evidenciando a
formação da trabécula óssea (*). H.E. 77
Figura 23
Grupo 1A – 30 dias. Formação de tecido ósseo no interior do
defeito (*).H.E. 77
Figura 24
Grupo 1A – 30 dias. Pavimentação osteoblástica (>) a partir da
trabécula óssea neoformada. H.E. 77
Figura 25
Grupo 1A – 45 dias. Extensa neoformação de tecido ósseo (*).
Bordas do defeito (>). H.E. 79
Figura 26
Grupo 1A – 45 dias. Neoformação óssea (*) nas adjacências das
partículas do biomaterial. H.E. 79
14
Figura 27
Grupo 1A – 45 dias. Trabécula óssea incipiente (*), evidenciando
pavimentação osteoblástica (>). H.E.
79
Figura 28
Grupo 1B – 15 dias. Ausência de neoformação óssea no interior
da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 83
Figura 29
Grupo 1B – 15 dias. Neoformação óssea (>) incipiente na borda
do defeito. H.E. 83
Figura 30
Grupo 1B – 15 dias. Detalhe da figura 29, exibindo a
neoformação da trabécula óssea (*). H.E. 83
Figura 31
Grupo 1B – 30 dias. Defeito ósseo sem evidência de
neoformação óssea no interior da cavidade (*). Bordas do defeito
(>). H.E. 85
Figura 32
Grupo 1B – 30 dias. Presença de neoformação óssea incipiente
(*) a partir da borda do defeito. Vasos sanguíneos congestos (>)
em meio a tecido conjuntivo fibroso. H.E. 85
Figura 33
Grupo 1B – 30 dias. Detalhe da figura 32, evidenciando a
neoformação óssea incipiente (*) a partir da borda do defeito.
H.E. 85
Figura 34
Grupo 1B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando neoformação
incipiente de tecido ósseo (*) no interior da cavidade. Bordas do
defeito (>). H.E. 87
Figura 35
Grupo 1B – 45 dias. Neoformação óssea a partir da borda do
defeito (>). H.E. 87
Figura 36
Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da trabécula óssea neoformada (*)
no interior do defeito. H.E. 87
15
Figura 37
Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da figura 35, exibindo a
neoformação de tecido ósseo a partir da borda do defeito (*).
H.E.
87
Figura 38
Grupo 2A – 15 dias. Defeito ósseo, exibindo as partículas do
biomaterial (*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E. 91
Figura 39
Grupo 2A – 15 dias. Neoformação óssea incipiente (>) na borda
do defeito. H.E. 91
Figura 40
Grupo 2A – 15 dias. Detalhe da figura 39, evidenciando a
pavimentação osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea.
Presença de vasos sanguíneos congestos (*). H.E. 91
Figura 41
Grupo 2A – 30 dias. Defeito ósseo, exibindo neoformação óssea
a partir das bordas do defeito (>). H.E. 93
Figura 42
Grupo 2A – 30 dias. Neoformação óssea (>) a partir da borda do
defeito e das partículas do biomaterial. H.E. 93
Figura 43
Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a
trabécula óssea neoformada (*) entre as partículas do
biomaterial. H.E. 93
Figura 44
Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a
neoformação óssea a partir da borda do defeito (*). H.E. 93
Figura 45
Grupo 2A – 45 dias. Neoformação óssea em toda extensão da
cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 95
Figura 46
Grupo 2A – 45 dias. Tecido ósseo neoformado (*) a partir da
borda do defeito (>), estendendo-
se para o interior do defeito.
H.E. 95
16
Figura 47
Grupo 2A – 45 dias. Trabéculas ósseas no interior do defeito (*)
nas adjacências das partículas do biomaterial. H.E.
95
Figura 48
Grupo 2B – 15 dias. Defeito ósseo sem evidência de
neoformação óssea no interior da cavidade (*). Bordas do defeito
(>). H.E. 99
Figura 49
Grupo 2B – 15 dias. Neoformação óssea incipiente a partir da
borda do defeito (>). H.E. 99
Figura 50
Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 49, exibindo trabécula
óssea neoformada (*) e atividade osteoblástica nas adjacências
(>). H.E. 99
Figura 51
Grupo 2B – 30 dias. Ausência de neoformação óssea no interior
da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 101
Figura 52
Grupo 2B – 30 dias. Tecido conjuntivo no interior do defeito
ósseo com presença de vasos sanguíneos congestos (>). H.E. 101
Figura 53
Grupo 2B – 30 dias. Osso neoformado a partir da borda do
defeito (*). H.E. 101
Figura 54
Grupo 2B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando tecido
conjuntivo fibroso no interior da cavidade (*) e presença de
neoformação óssea incipiente (>) a partir das bordas do defeito.
H.E. 103
Figura 55
Grupo 2B – 45 dias. Detalhe da figura 54, exibindo a
neoformação óssea incipiente a partir da borda do defeito (>).
H.E. 103
Figura 56
Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 54, evidenciando tecido
conjuntivo fibroso com vasos sanguíneos congestos (>). H.E. 103
17
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1
Média da área (µm
2
112
) da matriz óssea neoformada segundo o
grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias
18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Infiltrado inflamatório segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação 105
Tabela 2
Vascularização segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação 106
Tabela 3
Reação de corpo estranho (RCE) segundo o grupo, o subgrupo e
o tempo de avaliação 107
Tabela 4
Tecido conjuntivo fibroso segundo o grupo, o subgrupo e o tempo
de avaliação 108
Tabela 5
Atividade osteoblástica segundo o grupo, o subgrupo e o tempo
da avaliação 109
Tabela 6
Neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação 110
Tabela 7
Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação
óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação 111
Tabela 8
Média e desvio padrão da área (µm
2
111
) da matriz óssea
neoformada segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45
dias
19
LISTA DE QUADROS
Quadro 01
Divisão dos grupos de acordo com a origem do biomaterial e o
período de observação 58
20
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BMP .................... Proteína morfogenética óssea
Ca .................... Cálcio
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2 ......
CCS .................... Centro de ciências da saúde
Hidroxiapatita
CFB .................... Cálcio fosfato bifásico
EEB .................... Encefalopatia espongiforme bovina
FOP .................... Faculdade de Odontologia de Pernambuco
G1 .................... Grupo - enxerto de origem bovina
G1A .................... Subgrupo experimental do G1
G1B .................... Subgrupo controle do G1
G2 .................... Grupo - enxerto de origem sintética
G2A .................... Subgrupo experimental do G2
G2B .................... Subgrupo controle do G2
HA .................... Hidroxiapatita
HE .................... Hematoxilina / eosina
IGF .................... Fatores de crescimento semelhante à insulina
IL-1 .................... Interleucina-1
IL-2 .................... Interleucina-2
L*a*b* .................... Sistema de cores definidas pelo brilho (L*) e pelas
coordenadas de cromaticidade (a* e b*)
LEA .................... Laboratório de experimentação animal
LTF .................... Laboratório de tecnologia farmacêutica
21
n .................... Número
OA .................... Osso autógeno
P .................... Nível de significância
PDGF .................... Fator de crescimento derivado de plaquetas
PGA .................... Ácido poliglicólico
PLGA .................... Ácido poli-lático-co-ácido glicólico
PLLA .................... Ácido Poli-L-lático
RCE .................... Reação de corpo estranho
RGB .................... Sistema de cores aditivas formado por vermelho (Red),
verde (Green) e Azul (Blue)
rpm .................... Rotações por minuto
SID .................... Submucosa de intestino delgado porcina
SPSS .................... Statistical Package for the Social Sciences
TCF .................... Tecido conjuntivo fibroso
TCP .................... Tricálcio fosfato
TGF-β .................... Fator transformador de crescimento β
UFBA .................... Universidade Federal da Bahia
UFPB .................... Universidade Federal da Paraíba
UPE .................... Universidade de Pernambuco
22
LISTA DE SÍMBOLOS
% .................... Percentual
β .................... Letra grega “beta”
µm .................... Micrômetro
® .................... Marca registrada
: .................... Razão
+ .................... Sinal de mais
< .................... Menor que
> .................... Maior que
= .................... Igual a
± .................... Sinal de mais ou menos
cm .................... Centímetros
g .................... Grama
Kg .................... Quilograma
mg .................... Miligrama
ml .................... Mililitro
mm .................... Milímetro
N-cm .................... Newton centímetro
ºC .................... Grau Celsius
rpm .................... Rotações por minuto
23
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
27
2 REVISÃO DE LITERATURA
31
2.1 REGENERAÇÃO ÓSSEA
31
2.1.1 Resposta Biológica aos Biomateriais Substitutos Ósseos
33
2.2 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS
34
2.2.1 Origem
35
2.2.2 Composição Química
36
2.2.3 Mecanismo de Ação
37
2.3 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA
38
2.4 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM SINTÉTICA
43
3 PROPOSIÇÃO
51
3.1 OBJETIVO GERAL
51
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
51
4 HIPÓTESES
53
5 MATERIAIS E MÉTODOS
55
5.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA
55
5.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA
56
5.3 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS
56
5.4 ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS
57
5.5 GRUPOS DE ESTUDO
57
5.6 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS
58
5.7 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
58
24
5.7.1 Anestesia Geral
59
5.7.2 Técnica Cirúrgica
60
5.8 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA E
SINTÉTICA UTILIZADOS
64
5.9 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS
65
5.10 OBTENÇÃO DOS ESPÉCIMES APÓS OS PERÍODOS DE 15, 30 E
45 DIAS
65
5.11 ANÁLISE HISTOLÓGICA
66
5.12 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
68
5.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA
69
5.14 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
70
5.15 FONTE DE FOMENTOS
70
6 RESULTADOS
72
6.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA
72
6.1.1 Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento)
72
6.1.2 Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle)
80
6.1.3 Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento)
88
6.1.4 Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle)
96
6.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
104
6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
104
6.3.1 Infiltrado Inflamatório
104
6.3.2 Vascularização
105
6.3.3 Reação de Corpo Estranho (RCE)
107
6.3.4 Tecido Conjuntivo Fibroso (TCF)
107
6.3.5 Atividade Osteoblástica
108
25
6.3.6 Neoformação óssea
109
7 DISCUSSÃO
114
8 CONCLUSÃO
123
REFERÊNCIAS
125
APÊNDICE
132
ANEXO
133
26
Introdução
27
1 INTRODUÇÃO
O tecido ósseo possui características biológicas que promovem sua regeneração
espontânea quando lesionado, repondo a porção perdida (TAGA et al., 1997). Em
grande parte, isto se deve a habilidade dos fatores de crescimento em direcionar as
células-tronco para as vias condrogênica e osteogênica, e ao papel das forças
mecânicas que estimulam a remodelação óssea (SICCA et al., 2000; CARNEIRO et
al., 2005).
Há situações em que a capacidade de reparo é limitada pelo tamanho da perda
óssea como aquelas causadas por trauma, patologias ou conseqüência de
procedimentos cirúrgicos diversos. Nestes casos, o defeito ósseo torna-se crítico a
reparação espontânea, onde se faz necessário o uso de enxertos para um correto
tratamento e bom prognóstico (CARNEIRO et al., 2005).
A reconstrução do tecido ósseo tem despertado grande interesse por parte das
diversas especialidades cirúrgicas (MARQUES et al., 1982; VOLPON, XAVIER,
GONÇALVES, 1982; RIOS et al., 1996; LIRA, 1998), onde nos métodos tradicionais
de tratamento tem-se utilizado o enxerto ósseo autógeno. Isto se deve a sua
propriedade osteogênica e facilidade de incorporação em comparação aos tipos
homógenos e xenógenos. No entanto, a utilização dos enxertos ósseos autógenos
agrega riscos ao paciente, incluindo a realização de mais um sítio operatório com
incisão cirúrgica adicional, aumento da morbidade pós-operatória, debilitação da
área doadora e quantidade óssea disponível limitada, principalmente em crianças e
28
adultos que se submeteram a procedimentos cirúrgicos anteriores (FIGUEIREDO et
al., 2001, SANADA et al., 2003; 2004; SASSIOTO et al., 2004; TUDOR et al., 2008).
Desta forma, tem-se procurado criar ou extrair da natureza materiais que substituam
o osso ou que, associados a ele ou a outros materiais, promovam o incremento da
reparação e neoformação óssea, sendo assim, biocompatíveis, osteocondutores,
osteogênicos e/ou osteoindutores (FROTA, 2006). Dentro deste contexto, observam-
se diversos trabalhos sobre o estudo da reparação óssea, utilizando os mais
diversos biomateriais, tais como: polímero de mamona (JACQUES, J. W. et al.,
2004; LAUREANO FILHO, J. R. et al., 2007), hidroxiapatita sintética (LIMEIRA
JÚNIOR, 2004; SOCCOL et al, 2006), β-tricálcio fosfato (FROTA, 2006), osso bovino
orgânico (MARINS et al, 2004; GERBI et al., 2003; PINHEIRO et al., 2003) e
inorgânico (PINHEIRO et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; ZAMBUZZI et al.,
2005, 2006).
Os derivados inorgânicos sintéticos como a hidroxiapatita e fosfato tricálcio, têm
recebido grande atenção como materiais de preenchimento, espaçadores e
substitutos para os enxertos ósseos, principalmente devido a sua
biocompatibilidade, bioatividade e características de osteocondução em relação ao
tecido hospedeiro (DAMIEN, PARSONS, 1991; SICCA et al., 2000; MOREIRA et al.,
2003; SANADA et al., 2003).
O papel de carreador dos fatores de indução óssea pode ser desempenhado pelo
osso bovino cortical ou medular, macro ou microgranular, desproteinizado. Além de
fornecerem uma estrutura de suporte e osteocondução, podem prover também um
29
alto conteúdo de cálcio e fósforo, essenciais para a neoformação do tecido ósseo
(SCIADINI et al., 1997; YUKNA et al., 1998; SICCA et al., 2000; ZAMBUZZI et al.,
2005, 2006).
Neste sentido, este estudo tem como finalidade contribuir para o conhecimento do
comportamento da reparação óssea quanto à utilização dos biomateriais de origem
bovina e sintética.
30
Revisão de Literatura
31
2 REVISÃO DE LITERATURA
Defeitos ósseos de origem genética e/ou subseqüentes a traumas, bem como
ressecções tumorais ou reabsorção óssea após perda dentária, tem constituído uma
barreira primária nas reconstruções ósseas antes de reabilitações orais (TUDOR et
al, 2008).
O tratamento de lesões ósseas extensas do complexo buco-maxilo-facial deve ser
realizado pela técnica do enxerto autógeno, quando o tecido ósseo vital é retirado de
uma área doadora e rapidamente transferido para o local da lesão. Entretanto, esse
procedimento nem sempre pode ser realizado pelo cirurgião devido à dificuldade de
obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora (TAGA et al, 1997).
O desenvolvimento dos biomateriais, especialmente dos substitutos ósseos, é
atualmente objeto de intensa pesquisa para utilização em cirurgia ortopédica,
traumatológica e buco-maxilo-facial. Desta forma, com intuito de suprir as limitações
conseqüentes ao uso de enxerto autógeno e/ou de bancos de osso, os biomateriais
vêm sendo utilizados com perspectiva de uma reconstituição do tecido ósseo, seja
no reforço de uma estrutura ou preenchimento de um defeito (GUTIERRES et al.,
2006).
2.1 REGENERAÇÃO ÓSSEA
Os eventos que ocorrem durante a cicatrização normal de feridas de tecidos moles
também ocorrem na reparação de um osso lesado e dividem-se basicamente em
32
três estágios (inflamatório, fibroblástico e remodelador). Embora não ocorram
mutuamente exclusivos, participam dessa seqüência de forma bem definida e
interdependente. O estágio inflamatório inicia-se no momento que ocorre a lesão
tecidual, e na ausência de fatores que prolonguem a inflamação, dura de 3 a 5 dias,
apresentando duas fases: a vascular e a celular. O estágio fibroblástico inicia-se a
partir da formação dos fios de fibrina que derivam da coagulação sanguínea e se
entrecruzam nas feridas, formando uma rede sobre a qual os fibroblastos podem
iniciar a precipitação de substância fundamental e tropocolágeno. No estágio final da
reparação (remodelador), muitas das fibras colágenas depositadas aleatoriamente
são destruídas à medida que são substituídas por novas fibras orientadas para
melhor resistir às forças de tensão sobre a ferida (HUPP, 2005).
A resposta adaptativa do osso após um trauma se expressa basicamente pela
instalação de um processo inflamatório, similar ao de outros tecidos, contudo, devido
a consistência elevada do osso, o edema e os mecanismos vasculares são limitados
e restritos. O tecido ósseo exacerba outros mecanismos, também presentes nos
tecidos moles, mas não com a mesma magnitude. Assim, destaca-se a presença de
uma reatividade celular proeminente e a formação do calo ósseo como fenômeno
reparativo fundamental. Também é destacado o fato de haver um processo
hemorrágico inicial importante, seguido de coagulação e formação de trombo intra-
ósseo (DOUGLAS, 2006)
Os osteoblastos e osteoclastos estão envolvidos na reconstrução e remodelação do
tecido ósseo lesado. As células osteogênicas (osteoblastos), importantes para a
reparação óssea, são derivadas de três fontes: periósteo, endósteo e células
33
mesenquimais pluripotentes indiferenciadas circulantes. Os osteoclastos, derivados
de células precursoras de monócitos, funcionam para reabsorver osso necrótico e
osso que necessita ser remodelado. Os osteoblastos depositam o osteóide que, se
mantido completamente imóvel durante o processo de cicatrização, chega à
calcificação (HUPP, 2005).
2.1.1 Resposta Biológica aos Biomateriais Substitutos Ósseos
A incorporação de biomateriais substitutos ósseos apresenta 5 estágios: 1)
inflamatório, promovendo uma resposta celular do hospedeiro; 2) revascularização
do tecido; 3) osteocondução, na qual o enxerto tem a função de arcabouço para o
crescimento de vasos e formação de osso; 4) osteoindução, em que as células
mesenquimais do hospedeiro são induzidas por proteínas morfogenética óssea
(BMP) encontradas no biomaerial a se transformarem em osteoblastos e 5)
remodelação óssea com características de formação e reabsorção contínua de osso
(SOCCOL et al., 2006).
Após a implantação de um biomaterial, ocorre a formação de um hematoma com
uma resposta do tipo inflamatória com aderência e revestimento de glicoproteínas ao
material. Por processo de quimiotaxia, numerosas células são recrutadas para o
local: neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos (reação de corpo estranho).
Estas últimas exercem atividade fagocitária e estimulam a ação dos linfócitos,
fibroblastos, osteoclastos e células polimorfonucleares. Em seguida, inicia-se a
angiogênese, com a migração e proliferação de células endoteliais. Estas irão formar
uma rede de capilares que constituíra o suporte vascular. Posteriormente, a ação de
34
citoquinas (IL-1 e IL-2) e de diversos fatores de crescimento (TGF-β, PDGF, IGF,
BMP’s) vão promover a diferenciação das células mesenquimais pluripotentes com a
formação de matriz óssea e de osso imaturo. Por fim, a maturação e a remodelação
encerram este processo (GUTIERRES, 2006).
O processo de incorporação do osso cortical difere do esponjoso devido a lenta
revascularização do primeiro, o que diminui a possibilidade de anastomoses término-
terminais, levando o dobro do período de tempo para este processo. O retardo é
proveniente da estrutura arquitetônica do osso cortical, uma vez que a atividade
osteoclástica precede a revascularização. Desta forma, os osteoclastos promovem o
aumento da porosidade, podendo chegar a 50%, fazendo o material perder a
resistência mecânica. Outra diferença é a tendência do osso cortical em permanecer
com uma parte viável e outra necrótica, enquanto o esponjoso tende a ser
completamente substituido com o tempo (PINTO, MIYAGUSKO, PEREIRA, 2003).
2.2 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS
Na busca de desenvolver substitutos biológicos para restaurar, manter ou melhorar a
função de diversos tecidos, várias estratégias tem sido utilizadas, tais como: 1)
reposição com biomaterial sintético; 2) biomateriais xenógenos submetido à ligação
cruzada para estabilização; 3) células presas em câmeras de difusão, micro-
cápsulas ou que cresceram sobre substratos reabsorvíveis; 4) substâncias capazes
de induzir a proliferação celular e tecidual (fatores de crescimento e morfogenes),
destinadas e/ou implantadas em local adequado (SICCA et al., 2000).
35
Neste contexto, é crescente o interesse no desenvolvimento de biomaterias que
possuam propriedades biológicas e físico-químicas adequadas para o tratamento de
perdas ósseas (SANADA et al, 2003). Desta forma, as características desejadas de
um material ósseo-substituto são: biocompatibilidade, previsibilidade, aplicação
clínica sem riscos trans-operatórios e mínimas reações pós-operatórias, além de
aceitação por parte do paciente (SICCA et al, 2000).
2.2.1 Origem
Os biomateriais podem ser obtidos de diferentes origens e classificados como:
autógeno, alógeno, aloplástico e xenógeno.
1) Autógeno – Origina-se do mesmo individuo. É considerado a referência (padrão
ouro) devido as suas vantagens biológicas e potencial osteogênico, mas apresenta
desvantagens, tais como: morbidade da área doadora e disponibilidade limitada
(CONZ; GRANJEIRO; SOARES, 2005; SCHLEGEL et al, 2006; ADEYEMO et al,
2008).
2) Alógeno – Obtido de uma mesma espécie através de banco de ossos humanos.
Apresenta risco de contaminação, necessidade de armazenamento especial e
controle rígido de infecção (American Academy of Periodontology - AAP, 2001;
SANADA et al, 2003; CONZ;GRANJEIRO; SOARES, 2005).
3) Aloplástico – derivados inorgânicos como o fosfato tricálcio e a hidroxiapatita
sintética. Apresenta vantagem em relação aos auto e aloenxerto devido à sua fácil
36
esterilização e armazenamento. Já as suas desvantagens incluem graus variáveis
de reabsorção, pouca ação em defeitos diafisários, entre outros (SOCCOL et al,
2006).
4) Xenógeno – Obtido de outra espécie. Usualmente de origem bovina, vem
apresentando resultados promissores e mostra-se como uma alternativa à
intervenção cirúrgica de uma área doadora (autógeno) ou aos riscos de
contaminação e custos com exames laboratoriais (alógeno). No entanto, a
capacidade de reparo pode variar de acordo com a forma e tamanho das partículas
do material (SANADA et al, 2003; CONZ;GRANJEIRO; SOARES, 2005).
2.2.2 Composição Química
Segundo Gutierres (2008), quanto a sua composição química, os biomateriais
podem ser divididos em 4 classes:
1) Metais e ligas metálicas - p. ex.: titânio (ELIAS, 2008).
2) Cerâmicas - p. ex.: materiais cerâmicos à base de fosfato de cálcio, tais como:
fofato tricálcio – TCP (FROTA, 2006) e hidroxiapatita – HA (LIMEIRA JÚNIOR,
2004).
3) Polímeros - p. ex.: poliuretana de mamona (LAUREANO FILHO et al., 2007),
PLLA (ácido poli-L-lático), PGA (ácido poliglicólico) e PLGA (ácido poli-lático-co-
ácido glicólico) (SAKATA; ALBERTO-RINCON; DUEK, 2004).
37
4) Compósitos – p. ex.: compósito de biovidro-polihidroxibutirato (GUERRA NETO;
PAIVA; COSTA, 2005)
2.2.3 Mecanismo de Ação
Quanto ao mecanismo da ação, os biomateriais podem ser classificados em:
osteocondutores, osteogênicos, osteopromotores e osteoindutores.
1) Osteocondução – É a habilidade para suportar o crescimento ósseo ao longo de
uma superfície de contato. A capacidade osteocondutora é atribuída ao material,
geralmente inorgânico, que orienta a proliferação celular, permitindo a aposição de
tecido ósseo originado de células osteoprogenitoras já existentes (SANADA et al,
2003; TUDOR et al, 2008).
2) Osteopromoção – É a habilidade para atuar separando células com
características distintas, como fibroblastos e osteoblastos. Na regeneração tecidual
guiada os materiais osteopromotores buscam impedir que fibroblastos proliferem
para dentro da região do defeito ósseo em detrimento dos osteoblastos que
proliferam mais lentamente (SANADA et al, 2003).
3) Osteoindução – É a habilidade para induzir células mesenquimais indiferenciadas
a se diferenciarem em osteoblastos (SANADA et al, 2003).
38
4) Osteogênese – É a habilidade para estimular a formação de osso diretamente a
partir de osteoblastos, o que é feito geralmente por materiais orgânicos (SICCA et al,
2000).
2.3 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA
Materiais xenógenos vêm sendo pesquisados como biomateriais desde os anos 60,
incluindo ensaios clínicos para o preenchimento de defeitos ósseos (MELCHER;
DENT, 1962; SCOOP; KASSOUNY; MORGAN, 1966).
O advento de novos biomateriais xenógenos, como o osso bovino que se comporta
como promotor da reparação e carreador de fatores de indução óssea, parece
representar o futuro da reconstrução de defeitos ósseos. Entretanto, há uma
preocupação constante com a apresentação destes biomateriais, tais como: forma e
tamanho. O papel de carreador dos fatores de indução óssea potencialmente pode
ser desempenhado pelo osso bovino medular ou cortical, macro ou microgranular,
desproteinizado ou desmineralizado (CARNEIRO et al, 2005).
O processamento do osso bovino pode resultar em dois tipos distintos de material: o
inorgânico e o orgânico. 1) O osso bovino inorgânico é livre de proteínas e células, e
está caracterizado pelo elevado conteúdo de hidroxiapatita. A desproteinização é
obtida através de tratamento térmico a temperaturas superiores a 300
0
C, mas
quanto mais alta a temperatura, menor a possibilidade de bioabsorção do material.
Por outro lado, o tratamento com solventes orgânicos, álcalis e ácidos com
concentração e temperatura controlada leva à remoção de células, detritos celulares
39
e várias proteínas não colágenas, bem como a porção mineral, deixando um
arcabouço protéico constituído basicamente de colágeno tipo I e pequena
quantidade de fatores de crescimento, como a proteína morfogenética óssea. 2) O
osso bovino orgânico, adequadamente processado e desmineralizado, proporciona
um material de enxerto poroso constituído principalmente de colágeno bovino tipo I,
que apresenta grande homologia com o colágeno humano. Possui, ainda, traços de
fatores de crescimento que podem estimular a osteogênese (SANADA et al, 2003).
Wenz; Oesch; Hortst (2001) avaliaram o risco de transmissão da encefalopatia
espongiforme bovina - EEB (“doença da vaca louca”) através de biomateriais
derivados de osso bovino. Os autores utilizaram o Bio-Oss
®
e o Osteograf
®
e
concluíram através de evidência teórica e experimental que estes biomateriais não
apresentam risco de transmissão de EEB para os pacientes.
Indovina e Block (2002) avaliaram a reparação óssea em alvéolo após a extração de
pré-molares superiores e inferiores em cães, utilizando biomateriais derivados de
osso bovino inorgânico (Bio-Oss
®
) e de fosfato de cálcio (embarc
®
e Bone Source
®
).
Os autores realizaram avaliações clínica e radiográfica com 2, 4, 6 e 8 semanas e,
após oito semanas, o osso alveolar foi removido e submetido à avaliação histológica.
Todos os alvéolos cicatrizaram sem sinais de infecção. Clinicamente, não houve
diferenças entre os grupos. Radiograficamente, o grupo com osso bovino
apresentou, juntamente com o controle, uma maior radiopacidade em comparação
com os grupos que utilizaram material a base de fosfato de cálcio. Estes pareciam
permanecer intactos sem reabsorção e substituição. Na análise histológica, foi
observada eventual reação de corpo estranho nos dois grupos com fosfato de cálcio,
40
onde o alvéolo permanecia predominantemente preenchido pelo material
implantado. No grupo controle observou-se formação óssea, assim como no grupo
com osso bovino que apresentou neoformação óssea entre as partículas do material
remanescente. Portanto, histologicamente, houve diferença significativa dos grupos
controle e com osso bovino em comparação aos dois grupos com fosfato de cálcio.
Sanada et al. (2003) avaliaram a biocompatibilidade de blocos de osso bovino
esponjoso acelular e desmineralizado (Gen-Ox
®
). Foram utilizados 30 ratos albinos
(Wistar) divididos aleatoriamente em grupos com períodos de 3, 7, 14, 21 e 28 dias.
Blocos de 5,0 x 12,0 mm do material foram implantados no músculo abdutor da coxa
dos animais. Tomadas radiográficas foram realizadas antes do sacrifício dos
animais. Na avaliação histológica dos períodos de 3 e 7 dias, foi evidenciado
processo inflamatório agudo, caracterizado pela presença de neutrófilos, reabsorção
do coágulo sanguíneo e angiogênese. Entre 14 e 21 dias, houve reabsorção do
material implantado e sua substituição por tecido conjuntivo fibroso. Com 28 dias, na
maioria dos casos, observaram-se apenas pequenos fragmentos da matriz
implantada envolto por tecido conjuntivo. Radiograficamente, não foi evidenciada
presença de mineralização. Com base nos resultados, os autores concluíram que o
biomaterial derivado da matriz de osso esponjoso bovino desmineralizado em bloco
é biocompatível quando implantado em tecido conjuntivo intramuscular de ratos,
sendo absorvido e substituído por tecido conjuntivo característico da região, sem
qualquer indício de ocorrência de osteogênese ectópica.
Num estudo experimental, Marins et al. (2004), avaliaram a reparação óssea em
defeitos de 8,0 mm no osso parietal de ratos, utilizando o osso bovino orgânico
41
(Gen-Ox
®
). Os animais foram divididos em dois grupos, onde no primeiro, os defeitos
ósseos eram preenchidos por matriz bovina orgânica e no segundo grupo, por
coágulo sanguíneo. Os resultados demonstraram que o material testado foi
lentamente reabsorvido, favorecendo angiogênese, adesão e migração celular e
neoformação óssea a partir das bordas da lesão. Entretanto, alguns animais
apresentaram reação granulomatosa de corpo estranho com a presença de
inúmeras células gigantes que impediram a neoformação óssea local. Os autores
atribuíram este fato, à ausência de desmineralização e à falta de remoção de fatores
antígenos durante o processamento do biomaterial. Foi concluído que o osso bovino
orgânico, quando bem controlada a qualidade da produção do material, apresenta
uma ótima alternativa para a reparação óssea devido à sua alta capacidade
osteocondutora.
Thorwarth et al. (2006), num estudo experimental prospectivo, avaliaram a formação
óssea da matriz bovina inorgânica (Bio-Oss
®
) associada ou não ao osso autógeno
numa proporção de 3:1. Foram criados defeitos ósseos de 8,0 mm na calota
craniana de porcos. A análise histológica identificou osseointegração em ambos os
grupos nos tempos avaliados, no entanto, a avaliação microradiográfica demonstrou
um significante aumento da neoformação óssea no grupo que fez uso da matriz
inorgânica associada ao enxerto autógeno após 6 e 8 semanas. Os autores
concluíram que a melhor reparação óssea aconteceu devido à osteoindução
promovida por elementos celulares transplantados com o osso autógeno.
Serra-Silva; Albergaria-Barbosa; Mazzonetto (2006) avaliaram clinica e
radiograficamente o comportamento da associação de matriz orgânica de osso
42
bovino (Gen-Ox
®
) com proteína morfogenética de osso bovino (Gen-Pro
®
), na
proporção 5:1, em comparação ao enxerto de osso autógeno proveniente do ramo
mandibular na promoção da reparação óssea no levantamento do seio maxilar.
Foram utilizados 10 pacientes com a necessidade de levantamento bilateral do seio
menor que 6,0 mm determinado por tomografia computadorizada. Em todos os
pacientes, um lado foi determinado como experimental (associação de enxerto
bovino) e o outro controle (enxerto autógeno). Após o período de 6 a 11 meses, os
implantes eram colocados. A avaliação foi através de radiografia panorâmica e
avaliação trans-operatória da formação óssea da área enxertada e estabilidade dos
implantes. Os resultados mostraram uma melhor formação óssea e estabilidade
inicial dos implantes no grupo controle, embora no grupo experimental, o torque para
colocação dos implantes tenha sido maior que 30 N-cm.
Tudor et al. (2008) avaliaram a regeneração óssea em defeitos de 10,0 mm
realizados no osso frontal de porcos. Foram utilizados nove animais onde cada um
teve dez defeitos, sendo nove divididos para a formação de três grupos
experimentais: 1 - osso autógeno, 2 - osso alógeno (Puros
®
) e 3 - osso bovino
(Navigraft
®
); e um defeito para o grupo controle. Os animais foram observados com
1, 8 e 12 semanas. Com base nos resultados, após 12 semanas, todos os materiais
testados promoveram a completa formação óssea do defeito e o grupo controle
apresentou aproximadamente 75% de preenchimento ósseo. Através da
microradiografia, observou-se, entre os materiais testados, uma taxa de
mineralização de 5 a 10% menor em comparação ao enxerto de osso autógeno.
Entretanto, não se observou diferença estatística entre os grupos experimentais.
43
2.4 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM SINTÉTICA
Materiais aloplásticos vêm sendo utilizados no preenchimento de cavidades ósseas
na tentativa de induzir reparação óssea. No início dos anos 70, muitos
pesquisadores começaram a estudar um grupo de materiais sintéticos constituídos
de cerâmicas de fosfato de cálcio. Nos anos 80, uma série de artigos foi publicada,
avaliando os diversos aspectos destas cerâmicas. Estes materiais são
biocompatíveis, pois não induzem qualquer reação adversa, além de conter cálcio e
fosfato, os quais são presentes no tecido ósseo (BUCHAIM et al, 2002).
É possível produzir materiais cerâmicos sintéticos com uma composição semelhante
à matriz óssea inorgânica e sem limitações em termos de quantidade disponível.
Entre eles, temos: 1) sulfato de cálcio, 2) biovidros e 3) materiais cerâmicos à base
de fosfato de cálcio (fosfato tricálcio – TCP, hidroxiapatita – HA, biocompósitos à
base de fosfato de cálcio e cimentos de cerâmica injetáveis) (GUTIERRES et al.,
2006).
A cerâmica de hidroxiapatita tem sido estudada por tratar-se de uma substância
bioativa não tóxica, que provoca pouca reação tecidual, apresentando-se como um
importante recurso para a substituição óssea (MOREIRA et al, 2003).
Materiais de fosfato de cálcio podem ser encontrados na natureza (hidroxiapatita de
coral) ou sintetizados por métodos de precipitação que utilizam reagentes químicos.
A hidroxiapatita, Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
, é a biocerâmica de fosfato de cálcio mais
conhecida e estudada. Nas áreas médica e odontológica, o termo “hidroxiapatita” é
44
muitas vezes usado para descrever os materiais de fosfato de cálcio. Geralmente,
estas biocerâmicas são aceitas como osteocondutoras e não osteoindutoras (CONZ;
GRANJEIRO; SOARES, 2005).
Tem sido mostrado que materiais denominados como hidroxiapatita pura
apresentam biocompatibilidade diferente daqueles formados pela mistura de
hidroxiapatita e fosfato tricálcio. Resultados preliminares utilizando cultura de células
sugerem que a presença de maior porcentagem de microporos (< 10 µm) interfere
negativamente com a biocompatibilidade da hidroxiapatita. Tais evidências sugerem
que o comportamento biológico destas cerâmicas é dependente de vários fatores,
tais como: composição química e características físicas finais do produto (ROSA;
SHAREEF; NOORT, 2000).
A hidroxiapatita sintética consiste em um material inorgânico comumente usado em
falha óssea e constituinte da fase mineral dos tecidos calcificados. Pode ser utilizada
em defeito ósseo sem carga ou em falha onde a carga, estresse de torção ou
cisalhamento é neutralizado por implante rígido, como placa e parafusos (SOCCOL
et al, 2006).
Orr et al. (2001) avaliaram propriedades mecânicas compressivas de defeitos
ósseos de 3,5 mm de diâmetro por 8,0 mm de profundidade confeccionados na
porção distal do fêmur de coelhos. Foram utilizados os biomateriais derivados de
osso bovino inorgânico (Bio-Oss
®
) e de hidroxiapatita sintética (Calcitek
®
)
comparados com o grupo controle (sem preenchimento do defeito) e com o grupo
anatômico (sem o defeito). Os grupos foram avaliados nos seguintes períodos: osso
45
bovino inorgânico (2, 6 e 26 semanas), hidroxiapatita sintética (6 e 26 semanas),
grupo controle (2, 6 e 26 semanas) e o grupo anatômico (2 semanas). Os resultados
mostraram não haver diferença das forças compressivas no período de 2 semanas
entre o grupo que utilizou o osso bovino inorgânico e o grupo anatômico. Nos
períodos de 2, 6 e 26 semanas, o grupo do osso bovino inorgânico apresentou força
compressiva maior que o grupo controle. O grupo da hidroxiapatita sintética teve
força compressiva bem maior que o grupo controle e o grupo do osso bovino
inorgânico nos tempos de 6 e 26 semanas, apresentando diferença estatística
significante. Quanto ao módulo de elasticidade, o grupo do osso bovino inorgânico
apresentou valores bem próximos do grupo controle, portanto sem diferença
estatística, enquanto que o grupo da hidroxiapatita sintética obteve valores
significativamente maiores que os citados grupos.
Buchaim et al. (2002) analisaram a reparação óssea em defeitos ósseos realizados
na tíbia de ratos Wistar submetidos ao alcoolismo crônico experimental. No grupo
experimental, os animais recebiam álcool etílico diluído a 6% como dieta líquida,
sendo subdivididos em experimental-1 onde o defeito permanecia sem
preenchimento e experimental-2 quando preenchido por hidroxiapatita sintética
associada ao β-tricalcio-fosfato (Gen-Phos
®
), na proporção de 70 e 30%,
respectivamente. O grupo controle diferiu do experimental apenas na dieta líquida
constituída por água, apresentando controle-1 (defeito sem preenchimento) e
controle-2 (preenchido por Gen-Phos
®
). Os animais do grupo experimental foram
gradualmente adaptados ao álcool, recebendo uma dieta líquida de álcool etílico a
2% na primeira semana, a 4% na segunda e 6% na terceira. Após o período de
adaptação, os ratos receberem a dieta líquida de álcool etílico a 6% por 60 dias para
46
serem submetidos aos procedimentos cirúrgicos. Todos os grupos foram avaliados
microscopicamente nos tempos de 10, 20 e 40 dias. Os resultados mostraram que
uma dieta alcoólica conduziu a uma neoformação óssea mais discreta de todos os
espécimes em todos os períodos observados, causando preenchimento ósseo
incompleto da cavidade cirúrgica após 40 dias de reparo. A neoformação óssea foi
mais favorável em alguns animais que tiveram a implantação do Gen-Phos
®
após 20
dias de reparo.
Horch et al. (2006) estudaram o efeito a longo prazo da cerâmica de beta-tricálcio
fosfato (β-TCP - Cerasorb
®
) em diferentes sítios da reconstrução alveolar. Cento e
cinqüenta e dois (152) pacientes foram avaliados, onde a maioria das indicações
para o β-TCP foi para o preenchimento de cistos mandibulares (n=52), seguido de
fissura alveolar (n=38), defeitos periodontais (n=24) e aumento de assoalho do seio
maxilar (n=16). Nos defeitos maiores que 2,0 cm de diâmetros, o β -TCP foi
combinado com enxerto autógeno esponjoso, na proporção de 1:1, proveniente da
região retro-molar, da tuberosidade ou do mento mandibular. Avaliação clínica,
radiológica e por ultrasonografia (na verificação da presença de micropartículas do
material nos nódulos linfáticos regionais) foi realizada com 4, 12 e 52 semanas no
pós-operatório. Em 16 casos, foram realizadas biópsias que demonstraram completa
regeneração óssea. Este fato foi possível devido à necessidade de um segundo
procedimento cirúrgico para remoção de material de fixação (placas e parafusos)
e/ou para inserção de implantes dentários. Distúrbios na cicatrização foram
observados em 9,2% dos pacientes, perda parcial do material em 5,9%, enquanto
que a perda total em 2%. Devido à sua versatilidade, baixa taxa de complicações e
47
bons resultados ao longo prazo, o β-TCP sintético apresentou-se como adequado
material para o preenchimento de defeitos ósseos em região alveolar.
Fujita et al. (2003) analisaram as diferenças na osteogênese e reabsorção da
hidroxiapatita (HA) e do β-tricálcio-fosfato (β-TCP ) sob a forma de blocos com
macro e microporos. Os materiais foram implantados entre o osso parietal e o
periósteo de ratos Wistar e avaliados com 1, 2, 4, 8 e 24 semanas. Os resultados
obtidos demonstraram que a força compressiva foi maior para a HA e a
concentração de íons Ca foi maior para o β-TCP nos períodos de 4 e 8 semanas. Na
análise histomorfométrica, observou-se que a neoformação óssea aumentou com o
tempo, porém foi significantemente maior nos poros do bloco de HA em comparação
ao β-TCP em 24 semanas. No mesmo período, houve uma grande diminuição na
quantidade remanescente do bloco de β-TCP, apresentando diferença significativa
quando comparado a HA que se manteve praticamente estável durante todo este
período. Os autores concluíram que os blocos de HA são mais adequados,
considerando o modelo utilizado, para implantação do tipo onlay.
Miranda et al. (2005) realizaram um estudo experimental comparativo de enxerto
ósseo orgânico (osso autógeno – crista ilíaca) e material inorgânico (Osteosynt
®
-
hidroxiapatia + tricálcio-fosfato) em fraturas de rádio em coelhos. Foram utilizados 20
animais, divididos em 2 grupos, que se submeteram a remoção de um segmento
osteoperiosteal em todo seu diâmetro com 1 cm de comprimento. No grupo 1,
colocaram-se fragmentos de enxerto orgânico e no grupo 2, fragmentos do material
inorgânico. Os animais foram sacrificados com 15, 30, 45, 60 e 75 dias. Na
avaliação radiográfica, foi possível observar a completa reparação óssea em todos
48
os grupos, sendo de forma mais rápida com menor tempo de evolução no grupo 2
que utilizou o osso inorgânico; fato esse confirmado pela análise histológica. Como
conclusão, os autores afirmam que o material ósseo inorgânico pode ser usado de
rotina em cirurgia ortopédica, proporcionando uma cicatrização óssea precoce.
Soccol et al. (2006) avaliaram os biomateriais de hidroxiapatita de cálcio sintético
(HA) e submucosa de intestino delgado porcina (SID) no preenchimento de defeitos
ósseos de 0,75 x 1,5 cm criados em mandíbula de ratos Wistar. Foram utilizados 24
animais divididos aleatoriamente em dois grupos: 1 (HA) e 2 (SID), sendo
padronizado à esquerdo o preenchimento do defeito com o material e à direita o não
preenchimento serviu de controle. Após 40 dias, procedeu-se a eutanásia dos
animais e por conseqüente a análise macroscópica e histomorfométrica das peças.
Os resultados evidenciaram uma melhor neoformação óssea com a utilização da
hidroxiapatita (76,64%) quando comparado ao grupo da submucosa de intestino
delgado porcina (63,64%). Entretanto, os dois biomateriais mostraram-se efetivos
quando comparados ao controle.
Fellah et al. (2008) estudaram a osteogenecidade da cerâmica de cálcio fosfato
bifásico - CFB (MBCP
®
), constituída por hidroxiapatita + β -tricálcio fosfato na
proporção de 60/40, em comparação ao osso autógeno (OA). A cerâmica foi
sinterizada nas temperaturas de 1050, 1125 e 1200
o
C, produzindo diferentes micro-
porosidades. Os materiais foram implantados em locais ectópicos (músculo para-
espinhal) e ortotópicos (osso femural) de cabras e analisados nos períodos de 6 e
12 semanas. Para implantação intramuscular, foram criados 4 diferentes grupos: 1)
OA, 2) CFB 1050
o
C, 3) CFB 1125
o
C e 4) CFB 1200
o
C. No preenchimento dos
49
defeitos ósseos além dos grupos anteriormente citado foi adicionado um quinto para
controle (sem preenchimento) Com base nos dados obtidos, a propriedade de
osteoindução não foi observada em nenhum dos grupos estudados após os
períodos de observação nos locais ectópicos (musculatura para-nasal). Nos ossos
femorais, os materiais foram colocados dentro de um cilindro de politetrafluoroetileno
e implantados em defeitos críticos de 9,0 mm de diâmetro por 10,0 mm de
profundidade. Para os grânulos de CFB 1050 e 1125
o
C, observou-se formação
óssea tanto no período de 6 quanto de 12 semanas. Para o grânulo de 1200
o
C,
houve presença de mineralização discreta apenas em 12 semanas. Os defeitos sem
preenchimento não apresentaram formação óssea. Os enxertos autógenos foram
completamente reabsorvidos nos dois locais estudados. Desta forma, os autores
concluíram que o biomaterial ósseo de origem sintética pode apresentar estabilidade
e propriedades osteogênicas superiores que o enxerto autógeno em defeitos críticos
confeccionados em osso femoral de cabras.
50
Proposição
51
3 PROPOSIÇÃO
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar histomorfometricamente a reparação óssea após a utilização de biomateriais
de origem bovina e sintética em defeitos de 5,0 mm de diâmetro na calvária de ratos
Wistar nos períodos de 15, 30 e 45 dias.
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Avaliar comparativamente o processo de reparo de defeitos ósseos padronizados
em calvária de ratos Wistar, submetidos a:
1) Biomaterial de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica
esponjosa e colágeno bovino).
2) Biomaterial de origem sintética (cerâmica de hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato)
52
Hipóteses
53
4 HIPÓTESES
HIPÓTESE H
0
Os biomateriais de origem bovina e sintética não estimulam reparação óssea em
defeitos de 5,0 mm
de diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
HIPÓTESE H
1
Os biomateriais de origem bovina e sintética estimulam reparação óssea em defeitos
de 5,0 mm
de diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
HIPÓTESE H
2
O biomaterial de origem bovina estimula uma melhor reparação óssea em
comparação ao de origem sintética em defeitos de 5,0 mm
de diâmetro
confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
HIPÓTESE H
3
O biomaterial de origem sintética estimula uma melhor reparação óssea em
comparação ao de origem bovina em defeitos de 5,0 mm
de diâmetro
confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
54
Materiais e Métodos
55
5 MATERIAIS E MÉTODOS
A presente pesquisa baseou-se num estudo experimental que foi realizado no
Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB.
5.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA
Foram utilizados 36 ratos machos albinos (Rattus norvegicus da família Muridae, da
variedade Wistar), adultos jovens, com massa corporal variando entre 270 e 370g,
advindos do Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade
Federal da Paraíba – LTF / UFPB (Figura 1). O tamanho da amostra configurada foi
baseado na literatura científica correlata, na qual se pôde constatar um número de
animais compatível com a necessidade de resultados confiáveis, do ponto de vista
de significância estatística, bem como com o respeito às questões bioéticas
(LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR, 2004).
56
Figura 1 – Rato Wistar, macho albino, adulto jovem.
5.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA
Clinicamente, os animais que apresentassem lesão da dura-máter, infecção,
deiscência da sutura e exposição do enxerto, bem como, alguma patologia no
transcorrer dos períodos de experimentação seriam excluídos e substituídos. Do
ponto de vista histológico, seriam excluídos os espécimes que apresentassem perda
do material testado durante o processamento da amostra e os com interposição de
tecido mole (tecido intracraniano) na área avaliada.
5.3 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS
Os animais foram acondicionados em gaiolas plásticas atapetadas com maravalha
de pinus, sendo 3 animais por gaiola (Figura 2). Os animais foram mantidos no
Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB na temperatura de 23ºC ±
57
2ºC, ciclo claro-escuro de 12 horas. A limpeza das gaiolas foi efetuada segundo o
protocolo do Laboratório.
Figura 2 - Animais acondicionados em gaiolas plásticas
5.4 ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS
Os animais receberam ração sólida peletizada
2
Os 36 ratos foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos G1 (bovino) e G2
(sintético) com 6 animais para os períodos de 15, 30 e 45 dias (Quadro 1). Em cada
animal, foram confeccionados dois defeitos de 5,0 mm de diâmetro no osso parietal
em cada lado da sutura sagital, de forma que o lado esquerdo correspondeu ao
experimento (G1A - preenchido pelo osso de origem bovina ou G2A – osso de
com alto teor de proteína (20 a 27%)
e água ad libitum.
5.5 GRUPOS DE ESTUDO
2
Labina
®
- Purina Nutrimentos
58
origem sintética) e o lado direito ao controle (G1B ou G2B - preenchido pelo coágulo
sanguíneo).
Quadro 1 – Divisão dos grupos de acordo com a origem do biomaterial e o período
de observação
G 1
G 2
DIAS
(Origem Bovina)
(Origem Sintética)
15
6
6
30
6
6
45
6
6
TOTAL
18
18
5.6 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS
Cada gaiola foi identificada individualmente, bem como cada animal, onde
constaram: nome do experimento, responsável pela pesquisa, grupo, massa
corporal do animal, datas do nascimento, cirurgia e sacrifício. A identificação foi
realizada em formulário especifico e com lápis pincel na cauda do rato, onde cada
animal conteve marcações específicas, identificando seu grupo (Apêndice).
5.7 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os procedimentos de anestesia geral e técnica cirúrgica seguiram os princípios
descritos por Frota (2003, 2006), a saber:
59
5.7.1 Anestesia Geral
Para a anestesia geral dos animais, foi utilizado Cloridrato de Quetamina a 5% (60-
90 mg/kg)
3
e Cloridrato de Xilazina a 2% (4-8 mg/kg)
4
Figura 3 - Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica
e aplicados no músculo da
coxa do animal, obtendo-se um período de aproximadamente duas horas de
anestesia. Imediatamente após a anestesia, foi realizada a tricotomia da região
mediana da calota craniana dos ratos e os animais foram imobilizados em uma
mesa cirúrgica específica pela região temporal através de pinos de contensão
lateral, bem como pelos incisivos superiores e inferiores em local específico (Figura
3).
3
Vetanarcol
®
- König
4
Dorcipec
®
- Vallée
60
5.7.2 Técnica Cirúrgica
Primeiramente, foi realizada a anti-sepsia da região da calota craniana, com
Polivinilpirrolidona-iodo
5
a 10% na região a ser incisada. Após aposição dos campos
operatórios, promoveu-se a infiltração anestésica local de 0,1ml de Cloridrato de
Lidocaína com Adrenalina
6
Figura 4 - Anti-sepsia e infiltração anestésica local
, na concentração de 1:200.000 (Figura 4). Este
procedimento foi adotado, com o intuito de diminuir o sangramento no trans-
operatório e promover um maior conforto no pós-operatório imediato.
Em seguida, realizou-se uma incisão linear através da pele e do periósteo, indo da
região fronto-nasal a protuberância occipital externa, com o uso de uma lâmina de
bisturi
7
número 15, montada em cabo de bisturi
8
do tipo Bard-Parker número 3
(Figura 5). Com o destaca-periósteo
9
5
Povidine Degermante
®
- Ceras Johnson
6
Xylocaína
®
com Epinefrina 1:200.000 – Astra Zeneca
7
Feather Safety Razor CO., LTD. Medical Division
8
Bard-Parker
TM
9
Quinelato Schobell Industrial Ltda
de Molt, efetuou-se o descolamento do retalho
e o seu afastamento através de descoladores delicados (Figura 6).
61
Figura 5 - Incisão linear através da pele e periósteo
Figura 6 – Exposição da calvária após descolamento e afastamento do retalho
Através de uma broca trefina
10
de 5,0 mm de diâmetro, foi realizada uma ostectomia,
utilizando uma peça de mão reta para micro motor elétrico
11
acionado a uma
velocidade de 30.000 rpm. A irrigação foi externa com uso de soro fisiológico
12
10
Sistema de implantes PPMM
11
Beltec
®
- modelo LB 100
12
Soro Fisiológico
®
- Darrow
0,9%,
evitando, assim, um superaquecimento e subseqüente necrose óssea. A ostectomia
criou um defeito ósseo circular de 5,0 mm de diâmetro e de espessura total
(aproximadamente 0,5 mm), no lado esquerdo (localização mais caudal) e direito
62
(localização mais cefálica), na região parietal, tendo-se o cuidado de não
comprometer a dura-máter. O preenchimento do defeito ósseo no lado esquerdo
(experimento) foi feito com biomaterial de origem bovina (grupo G1) ou sintética
(grupo G2) e no lado direito (controle) com coágulo sanguíneo. (Figuras 7 e 8).
Figura 7 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial
bovino (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino)
Figura 8 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial
sintético (cerâmica de hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato)
63
Por último, foi confeccionada a sutura interrompida simples para o periósteo e a
sutura contínua simples para a pele foi confecionada com o fio de poliamida
13
Figura 9 – Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0)
(mononylon 5-0) (Figuras 9 e 10).
Figura 10 – Sutura contínua simples da pele (mononylon 5-0)
13
Ethicon
®
- Johnson & Johnson
64
5.8 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA
Os biomateriais substitutos ósseos de origem bovina e sintética utilizados
apresentavam a seguinte composição, respectivamente:
Gen-mix®
14
Gen-phos®
Material composto, microgranular (0,25 - 1,0 mm), liofilizado, contendo osso bovino
desproteinizado e osso bovino desmineralizado.
Composição:
1. Matriz orgânica de osso bovino cortical (0,5 cc)
2. Matriz inorgânica de osso bovino esponjoso (0,5 cc)
3. Colágeno bovino aglutinante (0,5 cc)
15
Material ósseo cerâmico bifásico, biocerâmica sintética, de alta pureza, porosa e
microgranular (0,5 – 0,75 mm)
Composição:
1. Hidroxiapatita porosa absorvível (60 - 70%)
2. β-tricálcio-fosfato (30 - 40%)
14
Genius - Baumer S.A., Mogi Mirim/SP.
15
Genius - Baumer S.A., Mogi Mirim/SP.
65
5.9 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS
Os animais foram mantidos a temperatura corpórea, sendo acondicionados em
ambiente sem ar condicionado, com o intuito de o ambiente permanecer aquecido
no período pós-anestésico, evitando assim, hipotermia corporal, depressão cardio
respiratória e óbito (HARKNESS, WAGNER, 1993). Foi efetuada a limpeza da ferida
cirúrgica, para que os animais que despertassem primeiro da anestesia não
ficassem estimulados a praticar o canibalismo, devido ao odor exalado pelo sangue
presente na ferida cirúrgica. A dieta foi mantida (FIGUEIREDO, TAKITA,
GOLDENBERG, 1997).
5.10 OBTENÇÃO DOS ESPÉCIMES APÓS OS PERÍODOS DE 15, 30 E 45 DIAS
Após a realização da anestesia geral, o procedimento cirúrgico para obtenção dos
espécimes iniciou com uma incisão trapezoidal de espessura total, abrangendo os
tecidos moles da região parietal da calota craniana (Figura 11).
Figura 11 – Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos espécimes
66
Posteriormente, efetuou-se a ressecção parcial da calota craniana, utilizando uma
broca carbide
16
número 702, montada em peça de mão reta e acionada por micro-
motor elétrico, a uma velocidade de 30.000 rpm. A ostectomia foi realizada com
margem de segurança para não haver um superaquecimento do espécime, com
conseqüente necrose e alteração dos resultados (Figura 12). A eutanásia dos
animais foi através da dose letal do anestésico.
Figura 12 – Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana
5.11 ANÁLISE HISTOLÓGICA
O processamento histológico foi realizado no laboratório de Patologia Bucal da
Faculdade de Odontologia de Pernambuco – FOP / UPE. Os espécimes foram
fixados em formol neutro (paraformaldeído 4%), à temperatura ambiente e
posteriormente descalcificados em solução de ácido nítrico a 0,5% por 15 dias. Após
a descalcificação, os espécimes foram lavados em água corrente, por 24 horas,
desidratados em cadeia crescente de álcool (70 a 100%), diafanizados em banhos
16
Dentoflex Instrumentos Cirúrgicos
Partículas do biomaterial implantado
após obtenção do espécime
67
de xilol e incluídos em parafina. Os espécimes foram seccionados em cortes semi-
seriados de 3,0 µm no maior diâmetro do defeito e corados por Hematoxilina e
Eosina (H.E.).
A análise histológica foi realizada no Laboratório de Patologia Geral do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba - CCS / UFPB. Foram
utilizados como parâmetros histológicos: infiltrado inflamatório, vascularização,
reação de corpo estranho (RCE), tecido conjuntivo fibroso (TCF), atividade
osteoblástica e neoformação óssea. Para a avaliação dos resultados histológicos
nos diferentes parâmetros, foi utilizado (1) para presente e (0) para ausente. Quando
presente, o infiltrado inflamatório e a vascularização foram classificados como leve
(1), moderado (2) e intenso (3); a atividade osteoblástica em (1) presente e (2)
fortemente presente; e, a neoformação óssea, segundo os aspectos, a saber:
1) Leve – neoformação óssea incipiente restrita às bordas do defeito ósseo;
2) Leve-moderada – neoformação óssea mais marcante, representada pela
deposição de trabéculas a partir das bordas do defeito ósseo;
3) Moderada – neoformação óssea a partir da borda do defeito ósseo e no interior do
mesmo, mas em áreas restritas;
4) Moderada-intensa – neoformação óssea a partir da borda e no interior do defeito
ósseo quase preenchendo toda a extensão deste;
5) Intensa – Preenchimento do defeito ósseo por trabéculas de osso neoformado,
em toda sua extensão, mas não em espessura;
6) Completa – Preenchimento total do defeito ósseo por trabéculas de osso
neoformado, tanto em extensão como em espessura.
68
5.12 ANÁLISE MORFOMETRICA
A análise morfométrica foi realizada no departamento de informática da
Universidade Federal da Paraíba - UFPB, por dois observadores independentes,
quantificando a área (µm
2
) de matriz óssea neoformada, através do método de
segmentação de imagens (QUEIROGA et al., 2008) (Figuras 13, 14 e 15).
Passos da Segmentação de Imagens:
1. Transformação da imagem do sistema RGB para o sistema L*a*b*
2. Segmentação utilizando o algoritmo k-médias com 7 clusters (classes) a partir das
bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*.
3. Nova segmentação usando o k-médias com 3 clusters a partir da classe da
segmentação anterior que apresentou a região de neoformação óssea.
4. Binariazação da imagem pelo método de Otsu.
5. Contagem de pixels com valor “1” (brancos) da imagem binária para mensurar a
área (em pixels).
6. Cálculo da área (em µm²) a partir de dados obtidos usando uma escala como
referência.
69
Figura 13 – Imagem do defeito ósseo do grupo G2A (biomaterial de origem
sintética – experimento) com 45 dias
Figura 14 – Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo que será
segmentada em sete classes
Figura 15 – Classe utilizada para cálculo da área (µm
2
matriz óssea neoformada
) da
5.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Na análise dos dados foram obtidas distribuições absolutas e percentuais (Técnicas
de Estatística Descritiva) e foram utilizados os seguintes testes estatísticos: Qui-
quadrado de Pearson (ou Exato de Fisher quando as condições para utilização do
70
teste Qui-quadrado não foram verificadas), teste de Mann-Whtiney, Wilcoxon
pareado e F (ANOVA) para medidas repetidas com comparações LSD (Least
significance diference).
O nível de significância utilizado na decisão dos testes estatísticos foi de 5,0%. Os
dados foram digitados na planilha Excel e o software utilizado para a obtenção dos
cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na
versão 13.
5.14 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O estudo foi desenvolvido segundo as normativas contidas no Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal e após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal
do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba –
LTF / UFPB (ANEXO 2).
5.15 FONTE DE FOMENTOS
Os itens de consumo para realização da pesquisa foram financiados pelo próprio
pesquisador.
71
Resultados
72
6 RESULTADOS
Os dados foram descritos para os grupos G1 (bovino) e G2 (sintético), sendo G1A e
G2A para os subgrupos experimentais e G1B e G2B para os controles.
6.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Em todos os espécimes estudados, independentemente do grupo e do tempo de
observação, foram verificadas a presença de tecido conjuntivo fibroso e a ausência
de reação de corpo estranho. Os demais parâmetros histológicos (inflamação,
vascularização, atividade osteoblástica e neoformação óssea) estiveram presentes,
variando quanto à classificação.
6.1.1 Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento)
15 dias
Das seis amostras deste subgrupo, uma foi excluída devido à perda da peça durante
o processamento histológico. Dos cinco animais, a inflamação observada variou de
leve a moderada, sendo três casos para a forma leve e dois para a moderada. A
vascularização foi moderada em dois casos e intensa em três. A atividade
osteoblástica foi fortemente presente em quatro animais e presente em apenas um.
A neoformação óssea apresentou-se como leve em apenas um caso, leve-moderada
em dois e moderada nos outros dois (Figuras 16, 17,18 e 19).
73
30 dias
A inflamação foi leve em todos os animais e a vascularização evidenciada foi
predominantemente intensa, com apenas um caso da forma leve. A atividade
osteoblástica foi fortemente presente nos seis casos. A neoformação óssea teve as
formas leve-moderada, moderada e moderada-intensa, cada uma com dois casos
(Figuras 20, 21, 22, 23 e 24).
45 dias
A inflamação identificada foi leve para os seis animais e a vascularização intensa,
com exceção de um caso em que se apresentou de forma leve. Em todos os
animais, a atividade osteoblástica foi fortemente presente. A neoformação óssea foi
predominantemente moderada, apresentando apenas um caso moderado-intenso e
outro da forma intensa (Figuras 25, 26 e 27).
74
PRANCHA 01
Fotomicrografias do Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento 15
dias)
Figura 16 - Grupo 1A - 15 dias. Defeito ósseo em toda extensão. Partículas do
biomaterial (*). Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 17 – Grupo 1A - 15 dias. Neoformação óssea a partir da borda do defeito (>).
H.E.
Figura 18 - Grupo 1A - 15 dias. Detalhe da figura 17, evidenciado neoformação
óssea (*) significativa a partir da borda do defeito. H.E.
Figura 19 - Grupo 1A - 15 dias. Formação de trabécula óssea (*) entre as partículas
do biomaterial. H.E.
76
PRANCHA 02
Fotomicrografias do Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento 30
dias)
Figura 20 - Grupo 1A - 30 dias. Neoformação de tecido ósseo (*) entre o biomaterial
implantado. Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 21 - Grupo 1A - 30 dias. Neoformação óssea na borda do defeito (>). H.E.
Figura 22 – Grupo 1A – 30 dias. Maior aumento da figura 21, evidenciando a
formação da trabécula óssea (*). H.E.
Figura 23 – Grupo 1A – 30 dias. Formação de tecido ósseo no interior do defeito
(*).H.E.
Figura 24 – Grupo 1A – 30 dias. Pavimentação osteoblástica (>) a partir da trabécula
óssea neoformada. H.E.
78
PRANCHA 03
Fotomicrografias do Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento 45
dias)
Figura 25 – Grupo 1A – 45 dias. Extensa neoformação de tecido ósseo (*). Bordas
do defeito (>). H.E.
Figura 26 - Grupo 1A – 45 dias. Neoformação óssea (*) nas adjacências das
partículas do biomaterial. H.E.
Figura 27 - Grupo 1A – 45 dias. Trabécula óssea incipiente (*), evidenciando
pavimentação osteoblástica (>). H.E.
80
6.1.2 Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle)
15 dias
Nos seis animais da amostra, a inflamação observada foi predominantemente
moderada, apresentando apenas dois casos na forma leve. Em sua maioria, a
vascularização identificada foi intensa, tendo apenas um caso leve e outro
moderado. A atividade osteoblástica esteve presente em quatro casos e fortemente
presente em dois casos. A neoformação óssea, em sua maioria, foi do tipo leve,
apresentando um espécime leve-moderado e outro moderado (Figuras 28,29 e 30).
30 dias
Dos seis espécimes deste subgrupo, um foi excluído devido à perda da peça durante
o processamento histológico. Entre os cinco casos, a inflamação apresentou-se na
forma leve. A vascularização foi leve apenas para um caso, tendo a forma moderada
em dois espécimes e intensa para os demais. A atividade osteoblástica foi presente
em quatro espécimes e apenas um foi identificado como fortemente presente. A
neoformação óssea foi predominantemente leve, apresentando apenas um caso
leve-moderado (Figuras 31, 32 e 33).
45 dias
Nos seis espécimes, a inflamação foi leve e a vascularização intensa. A atividade
osteoblástica foi presente em apenas um caso, sendo os demais identificados como
81
fortemente presente. A neoformação óssea foi leve em apenas um caso, leve-
moderada em dois e moderada nos outros três (Figuras 34, 35, 36 e 37).
82
PRANCHA 04
Fotomicrografias do Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle 15
dias)
Figura 28. Grupo 1B – 15 dias. Ausência de neoformação óssea no interior da
cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 29. Grupo 1B – 15 dias. Neoformação óssea (>) incipiente na borda do
defeito. H.E.
Figura 30. Grupo 1B – 15 dias. Detalhe da figura 29, exibindo a neoformação da
trabécula óssea (*). H.E.
84
PRANCHA 05
Fotomicrografias do Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle 30
dias)
Figura 31 – Grupo 1B – 30 dias. Defeito ósseo sem evidência de neoformação óssea
no interior da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 32 – Grupo 1B – 30 dias. Presença de neoformação óssea incipiente (*) a
partir da borda do defeito. Vasos sanguíneos congestos (>) em meio a tecido
conjuntivo fibroso. H.E.
Figura 33 – Grupo 1B – 30 dias. Detalhe da figura 32, evidenciando a neoformação
óssea incipiente (*) a partir da borda do defeito. H.E.
86
PRANCHA 06
Fotomicrografias do Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle 45
dias)
Figura 34 – Grupo 1B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando neoformação incipiente
de tecido ósseo (*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 35 – Grupo 1B – 45 dias. Neoformação óssea a partir da borda do defeito (>).
H.E.
Figura 36 – Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da trabécula óssea neoformada (*) no
interior do defeito. H.E.
Figura 37 – Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da figura 35, exibindo a neoformação de
tecido ósseo a partir da borda do defeito (*). H.E.
88
6.1.3 Grupo 2A (enxerto de origem sintética – experimento)
15 dias
Entre os seis animais, a inflamação identificada foi predominantemente moderada,
com exceção de dois casos que foram leve. A vascularização teve dois casos do tipo
moderado e os demais na forma intensa. A atividade osteoblástica teve apenas um
espécime do tipo presente, sendo os demais fortemente presente. A neoformação
óssea foi leve em um caso, leve-moderada em quatro e moderada em outro (Figuras
38, 39 e 40).
30 dias
A inflamação foi leve para os seis casos e a vascuarização intensa na maioria dos
espécimes, tendo apenas um na forma leve. A atividade osteoblástica foi fortemente
presente em todos os animais. A neoformação óssea foi predominantemente leve-
moderada, apresentando apenas dois casos do tipo moderado (Figuras 41, 42, 43 e
44).
45 dias
Nos seis animais, a inflamação identificada foi leve. A vascularização foi leve em
apenas um caso, moderada em dois e intensa nos outros três. A atividade
osteoblástica foi fortemente presente em todos os espécimes. A neoformação óssea
89
apresentou-se nas formas moderada, moderada-intensa e intensa, cada uma com
dois casos (Figuras 45, 46 e 47).
90
PRANCHA 07
Fotomicrografias do Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento
15 dias)
Figura 38 – Grupo 2A – 15 dias. Defeito ósseo, exibindo as partículas do biomaterial
(*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 39 – Grupo 2A – 15 dias. Neoformação óssea incipiente (>) na borda do
defeito. H.E.
Figura 40 – Grupo 2A – 15 dias. Detalhe da figura 39, evidenciando a pavimentação
osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea. Presença de vasos sanguíneos
congestos (*). H.E.
92
PRANCHA 08
Fotomicrografias do Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento
30 dias)
Figura 41 – Grupo 2A – 30 dias. Defeito ósseo, exibindo neoformação óssea a partir
das bordas do defeito (>). H.E.
Figura 42 – Grupo 2A – 30 dias. Neoformação óssea (>) a partir da borda do defeito
e das partículas do biomaterial. H.E.
Figura 43 – Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a trabécula
óssea neoformada (*) entre as partículas do biomaterial. H.E.
Figura 44 – Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a neoformação
óssea a partir da borda do defeito (*). H.E.
94
PRANCHA 09
Fotomicrografias do Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento
45 dias)
Figura 45 – Grupo 2A – 45 dias. Neoformação óssea em toda extensão da cavidade
(*). Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 46 – Grupo 2A – 45 dias. Tecido ósseo neoformado (*) a partir da borda do
defeito (>), estendendo-se para o interior do defeito. H.E.
Figura 47 – Grupo 2A – 45 dias. Trabéculas ósseas no interior do defeito (*) nas
adjacências das partículas do biomaterial. H.E.
96
6.1.4 Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle)
15 dias
Dos seis casos, a inflamação foi leve em dois espécimes e moderada em quatro. A
vascularização identificada foi leve em apenas em um caso, moderada em três e
intensa no outros dois. A atividade osteoblástica foi predominantemente presente,
excetuando um caso fortemente presente. A neoformação óssea foi leve em cinco
espécimes e apenas um foi leve-moderado (Figuras 48, 49 e 50).
30 dias
Entre os seis espécimes, a inflamação foi leve em sua maioria, excetuando um caso
do tipo moderado. A vascularização foi leve em dois casos, moderada em três e
intensa em um. A atividade osteoblástica foi presente em quatro animais,
apresentando-se fortemente presente nos outros dois. A neoformação óssea foi
predominantemente leve com quatro casos e leve-moderada nos outros dois
(Figuras 51, 52, 53).
45 dias
A inflamação foi predominantemente leve, excetuando um caso moderado. Dos seis
animais, um apresentou vascularização leve e os demais na forma intensa. A
atividade osteoblástica foi presente e fortemente presente com três casos cada. A
97
neoformação óssea identificada foi leve em três espécimes, leve-moderada em dois
e moderada em um (Figuras 54, 55 e 56).
98
PRANCHA 10
Fotomicrografias do Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle 15
dias)
Figura 48 – Grupo 2B – 15 dias. Defeito ósseo sem evidência de neoformação óssea
no interior da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 49 – Grupo 2B – 15 dias. Neoformação óssea incipiente a partir da borda do
defeito (>). H.E.
Figura 50 – Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 49, exibindo trabécula óssea
neoformada (*) e atividade osteoblástica nas adjacências (>). H.E.
100
PRANCHA 11
Fotomicrografias do Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle 30
dias)
Figura 51 – Grupo 2B – 30 dias. Ausência de neoformação óssea no interior da
cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.
Figura 52 – Grupo 2B – 30 dias. Tecido conjuntivo no interior do defeito ósseo com
presença de vasos sanguíneos congestos (>). H.E.
Figura 53 – Grupo 2B – 30 dias. Osso neoformado a partir da borda do defeito (*).
H.E.
102
PRANCHA 12
Fotomicrografias do Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle 45
dias)
Figura 54 – Grupo 2B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando tecido conjuntivo
fibroso no interior da cavidade (*) e presença de neoformação óssea incipiente (>) a
partir das bordas do defeito. H.E.
Figura 55 – Grupo 2B – 45 dias. Detalhe da figura 54, exibindo a neoformação óssea
incipiente a partir da borda do defeito (>). H.E.
Figura 56 – Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 54, evidenciando tecido conjuntivo
fibroso com vasos sanguíneos congestos (>). H.E.
104
6.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA
A análise morfométrica da matriz neofomada foi realizada através do método de
segmentação de imagens em sete classes nos períodos de 15, 30 e 45 dias. No
entanto, aos 15 e 30 dias, não foi possível a segmentação adequada das imagens
para a contagem da área (µm
2
) nos subgrupos experimentais e controles dos grupos
1 e 2. Para o tempo de avaliação de 45 dias, observou-se uma área
correspondentemente maior no subgrupo experimental do grupo 1 (14.872,88 ±
5.826,09) em relação ao grupo 2 (10.598,37 ± 3.071,55).
6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados são apresentados segundo o grupo (1 ou 2), subgrupo (experimento
ou controle) e tempo de avaliação (15, 30 ou 45 dias).
6.3.1 Infiltrado Inflamatório
De acordo com a Tabela 1, na avaliação com 15 dias, todos os animais
apresentaram inflamação que variou de leve a moderada, tanto nos subgrupos
experimentais quanto controles, independentemente do grupo (1 ou 2). As
freqüências foram de dois a quatro casos. Aos 30 e 45 dias, todos os subgrupos
experimentais apresentaram inflamação leve e nos subgrupos controles, com
exceção de um caso no grau moderado para ambos os tempos no grupo 2, todos
tiveram inflamação leve. Os resultados estatísticos não foram significantes (p >
0,05).
105
Tabela 1 – Infiltrado inflamatório segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação
Grupo
Avaliação/Subgrupo
Inflamação
I
II
Valor de p
n
%
n
%
• 15 dias
Experimental
Leve
3
60,0
2
33,3
p
(1)
= 0,567
Moderada
2
40,0
4
66,7
TOTAL
5
100,0
6
100,0
Controle Leve
2
33,3 2 33,3 p
(1)
= 1,000
Moderada
4
66,7
4
66,7
TOTAL
6
100,0
6
100,0
•
30 dias
Experimental
Leve
6
100,0
6
100,0
**
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Leve
5
100,0
5
83,3
p
(1)
= 1,000
Moderada
-
-
1
16,7
TOTAL
5
100,0
6
100,0
•
45 dias
Experimental
Leve
6
100,0
6
100,0
**
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Leve
6
100,0
5
83,3
p
(1)
= 1,000
Moderada
-
-
1
16,7
TOTAL
6
100,0
6
100,0
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
(1) Através do teste Exato de Fisher.
6.3.2 Vascularização
Em relação ao estudo da vascularização (Tabela 2), na avaliação com 15 dias, todos
os animais dos subgrupos experimentais encontravam-se com vascularização
moderada a intensa, onde as freqüências variaram de um a quatro casos. Nos
subgrupos controles, os espécimes tiveram vascularização leve, moderada e
intensa, variando de um a quatro casos. Com 30 dias, nos subgrupos experimentais,
o grau de vascularização intenso foi predominante e apenas um animal em ambos
os grupos (1 e 2) apresentou vascularização leve. Quanto aos subgrupos controles,
106
a vascularização foi leve, moderada e intensa, variando de um a três casos. Aos 45
dias, cada subgrupo experimental teve apenas um caso de vascularização leve,
sendo os demais espécimes do grau intenso, com exceção do grupo 2 que
apresentou dois casos da forma moderada. Nos subgrupos controles, a maioria dos
casos foram de vascularização intensa e apenas um, em ambos os grupos (1 e 2)
foram da forma leve. Os resultados não foram estatisticamente significantes (p >
0,05).
Tabela 2 – Vascularização segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação
Grupo
Avaliação/Subgrupo
Vascularização
I
II
Valor de p
n
%
n
%
•
15 dias
Experimental
Moderada
2
40,0
2
33,3
p
(1)
= 1,000
Intensa
3
60,0
4
66,7
TOTAL
5
100,0
6
100,0
Controle
Leve
1
16,7
1
16,7
p
(1)
= 0,740
Moderada
1
16,7
3
50,0
Intensa
4
66,7
2
33,3
TOTAL
6
100,0
6
100,0
•
30 dias
Experimental
Leve
1
16,7
1
16,7
p
(1)
= 1,000
Intensa 5 83,3 5 83,3
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Leve
1
20,0
2
33,3
p
(1)
= 1,000
Moderada
2
40,0
3
50,0
Intensa 2 40,0 1 16,7
TOTAL
5
100,0
6
100,0
• 45 dias
Experimental
Leve
1
16,7
1
16,7
p
(1)
= 0,697
Moderada
-
-
2
33,3
Intensa
5
83,3
3
50,0
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Leve
1
16,7
1
16,7
p
(1)
= 1,000
Intensa
5
83,3
5
83,3
TOTAL
6
100,0
6
100,0
(1) Através do teste Exato de Fisher.
107
6.3.3 Reação de Corpo Estranho (RCE)
Segundo a Tabela 3, não foram verificados reação de corpo estranho em nenhum
dos animais analisados, independentemente do grupo, subgrupo e tempo de
avaliação.
Tabela 3 – Reação de corpo estranho (RCE) segundo o grupo, o subgrupo e o
tempo de avaliação
Grupo
Avaliação/Subgrupo
RCE
I
II
Valor de p
N
%
n
%
•
15 dias
Experimental
Ausente
5
100,0
6
100,0
**
Controle
Ausente
6
100,0
6
100,0
**
•
30 dias
Experimental
Ausente
6
100,0
6
100,0
**
Controle
Ausente
5
100,0
6
100,0
**
•
45 dias
Experimental
Ausente
6
100,0
6
100,0
**
Controle
Ausente
6
100,0
6
100,0
**
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
6.3.4 Tecido Conjuntivo Fibroso (TCF)
A Tabela 4 mostra que em todos os animais analisados, independentemente do
grupo, subgrupo e tempo de avaliação, foi verificada a presença de tecido conjuntivo
fibroso.
108
Tabela 4 – Tecido conjuntivo fibroso segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação
Grupo
Avaliação/ Subgrupo
TCF
I
II
Valor de p
n
%
n
%
•
15 dias
Experimental
Presente
5
100,0
6
100,0
**
Controle
Presente
6
100,0
6
100,0
**
•
30 dias
Experimental
Presente
6
100,0
6
100,0
**
Controle
Presente
5
100,0
6
100,0
**
•
45 dias
Experimental
Presente
6
100,0
6
100,0
**
Controle
Presente
6
100,0
6
100,0
**
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
6.3.5 Atividade Osteoblástica
Segundo a Tabela 5, na avaliação com 15 dias, a atividade osteoblástica nos
subgrupos experimentais apresentou-se, em sua maioria, fortemente presente com
80,0% no grupo 1 e 83,3% no grupo 2. Os animais dos subgrupos controles tiveram
a predominância do tipo presente, sendo quatro casos no grupo 1 (66,7%) e cinco
no grupo 2 (83,3%). Após 30 dias, os subgrupos experimentais tiveram atividade
osteoblástica fortemente presente em 100% dos espécimes e os subgrupos
controles apresentaram a maioria presente, sendo 80,0% no grupo 1 e 66,7% no
grupo 2. Com 45 dias, todos os animais dos subgrupos experimentais tiveram
atividade osteoblástica fortemente presente (100%). O subgrupo controle do grupo 1
apresentou a maioria fortemente presente (83,3%), enquanto do grupo 2 foi
igualmente presente (50%) e fortemente presente (50%). Não se verificou diferenças
109
significantes entre os grupos para nenhum dos subgrupos e tempo de avaliação (p >
0,05).
Tabela 5 – Atividade osteoblástica segundo o grupo, o subgrupo e o tempo da
avaliação
Grupo
Avaliação/subgrupo
Atividade
I
II
Valor de p
osteoblástica
N % n %
•
15 dias
Experimental
Presente
1
20,0 1 16,7 p
(1)
= 1,000
Fortemente presente
4
80,0
5
83,3
TOTAL
5
100,0
6
100,0
Controle
Presente
4
66,7
5
83,3
p
(1)
= 1,000
Fortemente presente 2 33,3 1 16,7
TOTAL
6
100,0
6
100,0
•
30 dias
Experimental
Fortemente presente
6
100,0
6
100,0
**
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Presente
4
80,0 4 66,7 p
(1)
= 1,000
Fortemente presente
1
20,0
2
33,3
TOTAL
5
100,0
6
100,0
•
45 dias
Experimental
Fortemente presente
6
100,0
6
100,0
**
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Presente
1
16,7
3
50,0
p
(1)
= 0,545
Fortemente presente
5
83,3
3
50,0
TOTAL
6
100,0
6
100,0
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
(1) Através do teste Exato de Fisher.
6.3.6 Neoformação óssea
A Tabela 6 mostra os resultados da neoformação óssea segundo o grupo, o
subgrupo e o tempo de avaliação, classificando-a em: 1) leve, 2) leve-moderada, 3)
moderada, 4) moderada-intensa, 5) intensa e 6) completa. Não houve diferenças
estatisticamente significantes (p > 0,05).
110
Tabela 6 – Neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação
Grupo
Período/ Grupo
Neoformação óssea
I
II
Valor de p
N
%
n
%
• 15 dias
Experimental
Leve
1
20,0
1
16,7
p
(1)
= 0,740
Leve-moderada
2
40,0
4
66,7
Moderada
2
40,0
1
16,7
TOTAL
5
100,0
6
100,0
Controle
Leve
4
66,7
5
83,3
p
(1)
= 1,000
Leve-moderada
1
16,7
1
16,7
Moderada
1
16,7
-
-
TOTAL
6
100,0
6
100,0
•
30 dias
Experimental
Leve-moderada
2
33,3
4
66,7
p
(1)
= 0,481
Moderada 2 33,3 2 33,3
Moderada-intensa
2
33,3
-
-
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Leve
4
80,0
4
66,7
p
(1)
= 1,000
Leve-moderada 1 20,0 2 33,3
TOTAL
5
100,0
6
100,0
• 45 dias
Experimental
Moderada
4
66,7
2
33,3
p
(1)
= 0,610
Moderada-intensa
1
16,7
2
33,3
Intensa
1
16,7
2
33,3
TOTAL
6
100,0
6
100,0
Controle
Leve
1
16,7
3
50,0
p
(1)
= 0,766
Leve-moderada
2
33,3
2
33,3
Moderada
3
50,0
1
16,7
TOTAL
6
100,0
6
100,0
(1) Através do teste Exato de Fisher.
Na tabela 7, após a obtenção da média dos escores da neoformação óssea,
observou-se que nos períodos de 15 e 30 dias os valores dos subgrupos
experimentais foram maiores no grupo 1. Após 45 dias, o grupo 2 apresentou uma
média superior no subgrupo experimental. No entanto, não foi possível identificar
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p > 0,05).
111
Tabela 7 – Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação óssea
segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação
Tipo de enxerto
Avaliação
Subgrupo
I
II
Valor de p
(Média
±
DP)
(Média
±
DP)
%
•
15 dias
Experimental
2,20
±
0,84
2,00
±
0,63
p
(1)
= 0,604
Controle
1,50
±
0,84
1,17
±
0,41
p
(1)
= 0,727
•
30 dias
Experimental
3,00
±
0,89
2,33
±
0,52
p
(1)
= 0,275
Controle
1,20
±
0,45
1,33
±
0,52
p
(1)
= 1,000
•
45 dias
Experimental
3,50
±
0,84
4,00
±
0,89
p
(1)
= 0,470
Controle
2,33
±
0,82
1,67
±
0,82
p
(1)
= 0,316
(1) Através do teste de Mann-Whitney.
A Tabela 8, evidencia a média da área (µm
2
) da matriz óssea neoformada na
avaliação de 45 dias, sendo os valores correspondentemente mais elevados nos
subgrupos experimental e controle do grupo 1, entretanto, sem diferenças
estatisticamente significante (p > 0,05) (Gráfico 1).
Tabela 8 – Média e desvio padrão da área (µm
2
) da matriz óssea neoformada
segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias
Grupo
Subgrupo
I
II
Valor de p
(Média
±
DP)
(Média
±
DP)
•
Experimental
14872,88
±
5826,09
10598,37
±
3071,55
p
(1)
= 0,222
•
Controle
5952,89
±
3899,53
3689,09
±
2194,10
p
(1)
= 0,222
(1) Através do teste de Mann-Whitney.
112
Gráfico 1 – Média da área (µm
2
) da matriz óssea neoformada segundo o grupo e o
subgrupo na avaliação de 45 dias
14872,88
10598,37
5952,89
3689,09
0
4000
8000
12000
16000
Enxerto I
Enxerto II
· Experimental
· Controle
113
Discussão
114
7 DISCUSSÃO
A reconstrução do complexo Buco-Maxilo-Facial decorrente de perdas ósseas,
preferencialmente deveria ser realizada pela técnica que utilizasse o enxerto
autógeno. Isto ocorre quando o tecido ósseo vital é removido de uma área doadora
e, no mesmo tempo cirúrgico, transferido para a região a ser reconstruída. No
entanto, nem sempre esse procedimento pode ser realizado devido à dificuldade de
obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora, além do potencial aumento da
morbidade com um procedimento cirúrgico adicional (TAGA et al., 1997).
Por essas razões, uma série de pesquisas tem sido realizada com o intuito de
desenvolver materiais que possuam propriedades de biocompatibilidade e
osteocondução (ZAMBUZZI et al., 2005). Desta forma, biomateriais xenógenos como
a matriz orgânica e inorgânica de osso bovino, assim como de origem sintética, a
hidroxiapatita e o tricálcio fosfato, apresentam-se como substitutos ósseos viáveis
nas cirurgias reconstrutivas de pequenas áreas.
Para o tratamento de defeitos ósseos do complexo Buco-Maxilo-Facial, vários
modelos animais têm sido propostos no desenvolvimento de um protocolo padrão
(TAGA et al., 1997; BUCHAIM et al, 2002; LIMEIRA JÚNIOR, 2004; FELLAH et al.,
2008). A calvária de animais é usualmente utilizada para avaliação de materiais
osteopromotores (HANDSCHEL et al., 2002; LAUREANO FILHO et al., 2007;
TUDOR et al, 2008). Neste trabalho, o uso da calota craniana de ratos adultos
Wistar foi devido à disponibilização de um osso de origem embrionária, semelhante
ao dos maxilares. O osso parietal é formado por uma placa que apresenta corticais
115
externa e interna compactas, relativamente espessas, com faixa intermediária
estreita de osso medular e com ossificação intramembranosa (CRUMP et al., 1996;
FROTA, 2006). Adicionado a isso, além do baixo custo, o modelo permite um
manejo relativamente fácil na avaliação da reparação óssea (JONES et al., 2007).
Para obter resultados confiáveis dos materiais testados, o modelo animal deve
permitir a reprodutibilidade de seus resultados e possível comparação entre as
amostras. A reparação nos defeitos ósseos do modelo não deve realizar-se
espontaneamente durante o período de observação, sendo, portanto, definido como
tamanho crítico (HOLLINGER; KLEINSCHMIDT, 1990; SCHLEGEL et al, 2006).
Para esta pesquisa, foi utilizado o defeito ósseo de 5,0 mm de diâmetro, definido
como limite crítico para o osso parietal de ratos Wistar (BOSH; MELSEN;
VARGEVIK, 1998; JONES et al., 2007). Isto permitiu um estudo pareado, pois a
ostectomia pôde ser realizada bilateralmente à sutura mediana, o que evitou o seio
sagital, prevenindo a sua ruptura e conseqüente possibilidade de morte do animal
por hemorragia. Adicionalmente, o acesso cirúrgico foi único e não houve
dificuldades no manuseio dos biomateriais quanto a sua inserção nas cavidades
ósseas, assim como no fechamento da ferida.
Os biomateriais utilizados na presente pesquisa foram o composto de hidroxiapatita
e tricálcio fosfato (Gen-phos®) e o enxerto de matriz orgânica e inorgânica de osso
bovino (Gen-mix®). Estes biomateriais são de micro partículas com características
osteocondutoras e reabsorção relativamente lenta. Estas propriedades foram
observadas ao longo da pesquisa e revelaram-se positivas, uma vez que foi
116
observado um melhor processo de reparo do experimento em comparação ao
controle.
Para Sicca et al. (2000), o tamanho dos grânulos dos diferentes tipos dos
biomateriais é um fator importante para o sucesso do reparo ósseo. Contudo, os
autores acreditam não haver uma definição clara de qual tamanho é adequado para
cada tecido ou condição clínica, uma vez que as características físico-químicas de
cada biomaterial e/ou do defeito ósseo também afetam a resposta tecidual. Este fato
foi observado por Mankani et al. (2001) que demonstraram que partículas de
hidroxiapatita / tricálcio fosfato com 0,1 - 0,25 mm de tamanho resultavam em maior
formação óssea. Em outro estudo, Moreira et al. (2003) observaram a influência
sobre a integração óssea da hidroxiapatita (HA) em relação ao tamanho dos
grânulos do biomaterial, onde as partículas de menores dimensões (212µm)
promoveram uma maior velocidade e melhor qualidade do processo de reparo
ósseo. No entanto, o efeito do tamanho dos grânulos quando da utilização de matriz
inorgânica e orgânica de osso bovino parece não interferir na reparação óssea.
Sicca et al. (2000) observaram não haver diferença na resposta celular ao osso
cortical bovino implantados em subcutâneo de ratos na forma micro (0,25 – 1,0 mm)
e macro granular (1,0 – 2,0 mm). Em outro estudo, sobre o processo de reparo de
defeitos ósseos preenchidos por osso medular bovino, Carneiro et al. (2005)
constataram resultados semelhantes para ambas as formas das partículas do
biomaterial.
No presente estudo, o composto hidroxiapatita sintética / tricálcio fosfato (HA/TCP)
utilizado foi o microgranular com partículas de 0,5 a 0,75 mm, ou seja, entre 500 a
117
750 µm. Este fato pode explicar o melhor desempenho do biomaterial de origem
bovina sobre o HA/TCP, uma vez que para o primeiro, o tamanho dos grânulos
parece não influenciar no processo de reparo. Embora os resultados não tenham
sido estatisticamente significantes e ambos os biomateriais tenham tido resultados
superiores ao controle, partículas menores de HA (< 0,5 mm) possivelmente
contribuiriam na reparação óssea.
Buchaim et al. (2002) observaram que o Gen-phos® apresentou baixa neoformação
óssea no período de 10 dias, onde foi evidenciada exuberante reação inflamatória
induzida pelo material. O processo de reparo do defeito ósseo em tíbia de ratos foi
mais significativo a partir dos 20 dias, provavelmente devido à incorporação do
cálcio e do fosfato nos tecidos fagocitados pelos osteoblastos, observando uma
diminuição do infiltrado inflamatório.
O declínio da resposta inflamatória, em relação ao tempo, também foi observado por
Zambuzzi et al. (2006), que verificou, ainda, o aumento da vascularização do tecido
conjuntivo após a utilização da matriz inorgânica bovina em tecido subcutâneo de
ratos. Resultados estes que corroboram com Carneiro et al. (2005) em relação a
matriz orgânica bovina, tanto na forma micro quanto macro granular.
Os grupos 1 e 2 desta pesquisa apresentaram comportamento semelhante aos
estudos acima mencionados. Ambos os grupos exibiram uma reação inflamatória
inicialmente leve a moderada, que diminuiu de intensidade quando se prolongava o
tempo de observação, e um tecido conjuntivo com grau moderado de vasos
sanguíneos, cuja vascularização se maximizou com o tempo. Em um primeiro
118
momento, de acordo com Frota (2006), a reação inflamatória ao biomaterial é
esperada e pode inibir a resposta à reparação inicial pela perpetuação da sua fase
inflamatória. No entanto, a inflamação tecidual não é decorrente, exclusivamente, do
biomaterial utilizado, mas também inerente ao próprio processo de reparação
tecidual. Portanto, os resultados do presente estudo corroboram com as
observações de Frota (2006), visto que o processo inflamatório foi evidenciado em
ambos os subgrupos, experimental e controle, entretanto, com graus variáveis de
intensidade.
Segundo Al Ruhaimi (2000), a presença de células gigantes multinucleadas,
caracterizando uma reação inflamatória do tipo corpo estranho é claramente
conhecida como inibidora da neoformação óssea. Este fato foi evidenciado por
Marins et al. (2004), após o uso de osso bovino orgânico em calvária de ratos. Os
autores observaram, em alguns espécimes com um e três meses, a presença de
focos de corpo estranho e de reação granulomatosa próximos do biomaterial,
juntamente com aglomerados de macrófagos e células gigantes multinucleadas
rodeados por linfócitos e quase nenhuma formação óssea. Aos poucos casos
constatados foram atribuídos a provável descalcificação incompleta do biomaterial
durante sua produção.
Por outro lado, Fujita et al. (2003), após a implantação de blocos de hidroxiapatita
(HA) e β-tricálcio-fosfato (β-TCP) sobre o osso parietal de ratos, entre o periósteo e
a superfície óssea, identificaram a presença de reação de corpo estranho (RCE)
junto ao biomaterial, no entanto, sem proximidade da matriz óssea neoformada. Isto
se deve ao fato que os biomateriais de origem bovina ou sintética, quando
119
implantados em tecido subcutâneo, induzem reação granulomatosa do tipo corpo
estranho devido à tentativa do organismo em promover a reabsorção dos mesmos.
Ressalta-se que este fato não implica necessariamente na inexistência de
biocompatibilidade.
Desta forma, parece comum este tipo de reação ao material quando implantado em
tecido mole, sendo a reação minimizada no uso em defeitos ósseos (FELLAH et al,
2007). Em conformidade com tais observações, nesta pesquisa chamou bastante
atenção o fato de não ter sido observada a reação de corpo estranho em nenhum
dos grupos, seja no experimento ou controle, independente do período observado.
O tecido conjuntivo fibroso (TCF) foi identificado em todos os espécimes desta
amostra, evidenciando variações quanto à sua celularidade do tecido ao longo do
tempo, o que corrobora com os achados de Thorwarth et al. (2006) que observaram
uma ampla quantidade de tecido conjuntivo fibroso com potencial osteogênico após
o uso da matriz bovina inorgânica. Diferentemente de Handschel et al. (2002), em
seu estudo sobre o tricálcio fosfato, no qual não houve presença de fibrose entre as
partículas do biomaterial, possibilitando uma maior integração do mesmo ao osso.
Em todos os animais deste estudo, foi visualizada a atividade osteoblástica nos
grupos 1 e 2, entretanto a atividade osteoblástica esteve, nos subgrupos
experimentais, mais fortemente presente em comparação ao controle. Os achados
histológicos mostraram pavimentação osteoblástica em trabéculas ósseas
neoformadas, tanto a partir das bordas do defeito quanto da superfície das partículas
do biomaterial, o que vai de encontro aos resultados de Handschel et al. (2002) que
120
atribuiram ao tricálcio fosfato (TCP) a ausência de osteocondutividade quando
implantados na calvária de ratos Wistar. No entanto, esta propriedade do TCP foi
relatada por Frota (2006), assim como da hidroxiapatita por Limeira Júnior (2004).
A neoformação óssea esteve presente em todos os espécimes da amostra. No
entanto, exibiu maior intensidade nos subgrupos experimentais, principalmente nos
períodos de 30 e 45 dias. O padrão da reparação óssea foi muito semelhante nos
grupos 1 e 2, ou seja, houve um aumento gradativo da reparação com o tempo,
sendo tal aumento sempre mais elevado em comparação aos subgrupos controles.
Estes resultados estão em conformidade com os achados de autores que
trabalharam com matriz óssea bovina (TAGA et al, 1997; MARINS et al., 2004;
TUDOR et al., 2008) e com Hidroxiapatia / tricálcio fosfato (BUCHAIM et al., 2002;
MIRANDA et al, 2005; FELLAH et al., 2007).
No presente estudo, a matriz óssea neoformada foi submetida à análise
morfométrica através do método de segmentação de imagens (QUEIROGA et al.,
2008). Para a segmentação, foi utilizado o algoritmo k-médias com 7 clusters
(classes) a partir das bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*. No entanto, nos períodos
de 15 e 30 dias, as imagens segmentadas não apresentaram classes que pudessem
ser aproveitadas no cálculo de área (µm²). Desta forma, apenas o período de 45 dias
foi considerado. Este fato pode ter ocorrido em função da neoformação óssea
incipiente e da presença marcante das partículas dos biomateriais nos períodos de
15 e 30 dias que provavelmente dificultaram uma dissociação efetiva das imagens.
121
Segundo a tabela 7, os subgrupos experimentais tiveram as médias dos escores da
neoformação óssea ligeiramente maiores para o grupo 1 aos 15 e 30 dias e para o
grupo 2 aos 45 dias. Estes valores foram muito próximos e não foi possível
determinar diferença estatisticamente significante entre os grupos. No entanto, a
tabela 8 mostra que a média das áreas da matriz óssea neoformada (µm²) foi maior
para o grupo 1 aos 45 dias. Isto evidencia uma melhor tendência do grupo 1 para
reparação óssea, porém não se pôde também constatar diferença significante.
A reparação óssea nos subgrupos controles ocorreu basicamente a partir das
bordas do defeito e de forma incipiente em comparação aos subgrupos
experimentais. Estes, por sua vez, apresentaram neoformação óssea entre as
partículas do biomaterial, principalmente aos 30 e 45 dias. Neste último período, foi
possível a identificação do preenchimento de toda extensão do aspecto basilar do
defeito ósseo na maioria dos animais dos grupos 1 e 2.
Diante do exposto acima, a presente pesquisa evidenciou que os biomateriais
testados apresentaram características semelhantes com relação à influência sobre o
metabolismo do tecido ósseo, sendo, portanto, osteocondutores. Desta forma, estão
indicados como substitutos do tecido ósseo na reparação de defeitos ósseos.
122
Conclusão
123
8 CONCLUSÃO
De acordo com os dados obtidos nesta pesquisa, pode-se concluir que:
• Os defeitos ósseos submetidos aos biomateriais de origem bovina (matriz
orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino) e sintética
(cerâmica de hidroxiapatita + β -tricálcio-fosfato) apresentaram uma melhor
reparação óssea em comparação ao controle nos períodos de 15, 30 e 45 dias.
• O biomaterial de origem bovina apresentou uma reparação mais precoce e uma
maior deposição de matriz óssea neoformada (µm
2
).
124
Referências
125
REFERÊNCIAS
ADEYEMO, W. L.; REUTHER, T.; BLOCH, W. et al. Healing of onlay mandibular
bone grafts covered with collagen membrane or bovine bone substitutes: A
microscopical and immunohistochemical study in the sheep. Int J Oral Maxillofac
Surg, v.37, p. 651-659, 2008).
AL RUHAIMI, K. A. Bone graft substitutes: a comparative qualitative histologic review
of current osteoconductive grafting materials. Int J Oral Maxillofac Implants, v. 16,
n. 1, p. 105-114, 2000.
ALTMAN, D. G. Practical Statistics for Medical Research. London: Chapman and
Hall, 1991, 611 p.
American Academy of Periodontology. Tissue banking of bone allografts used in
periodontal regeneration. J. Periodontol, v. 72, p. 834-838, 2001.
BOSH, C., MELSEN, B., VARGEVIK, K. Importance of the critical-size bone defect in
testing bone-regeneration materials. J. Craniofac. Surg., v.9, n.4, p.310-316, 1998.
BUCHAIM, R. L.; ROQUE, D. D.; ROQUE, J. S. et al. Gen-phos® em cavidades
cirúrgicas realizadas em tíbia de ratos submetidos ao alcoolismo crônico
experimental. Estudo microscópico. Rev FOB, v.10, n.1, p.17-22, 2002.
CARNEIRO, E.; GARCIA, R. B.; OLIVEIRA, R. C et al. Microscopic and radiographic
analysis of the effect of particle size of demineralized bovine cancellous bone matrix
on the repair of bone defects in femurs of rabbits. J Appl Oral Sci, v.13, n. 2, p. 157-
162, 2005.
CONZ, M. B.; GRANJEIRO, J. M.; SOARES, G. A. Physicochemical characterization
of six commercial hydroxyapatites for medical-dental applications as bone graft. J
Appl Oral Sci, v.13, n. 2, p. 136-140, 2005.
CRUMP, T. B.; RIVERA-HIDALGO, F.; HARRINSON, J. W. et al. Influence of three
membrane types on healing of bone defects. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod, v. 82, p. 365-374, 1996.
DAMIEN, C. J.; PARSON, J. R. Bone graft and bone graft substitutes: a review of
current technology and applications. J Appl Biomater, v.2, n. 3, p. 187-208, 1991.
126
DOUGLAS, C. R. Consolidação Óssea. In: MANGANELLO-SOUZA, L. C.; LUZ, J. G.
C. Traumatismo Buco-Maxilo-Facial. 3ª. ed. São Paulo: Roca, cap. 3, p. 57-66,
2006.
ELIAS, C. N.; OSHIDA, Y. ; LIMA, J. H. C. et al. Relationship between surface
properties (roughness, wettability and morphology) of titanium and dental implant
removal torque. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, v.
1, n. 3, p. 234-242, 2008.
FELLAH, B. H., JOSSELIN, N., CHAPPARD, D. et al. Inflammatory reaction in rats
muscle after implantation of biphasic calcium phosphate micro particles. J Mater Sci
Mater Med, v. 18, n. 2, p. 287-294, 2007.
FELLAH, B. H.; GAUTHIER, O.; WEISS, P. et al. Osteogenicity of biphasic calcium
phosphate ceramics and bone autograft in a goat model. Biomaterials, v. 29, p.
1177-1188, 2008.
FIGUEIREDO, A. S., TAKITA, L. C., GOLDENBERG, S. Comparação entre a
hidroxiapatita porosa de coral e o enxerto ósseo autógeno em coelhos. Acta Cir
Bras, v.12, n.2, p.84-88, 1997.
FIGUEIREDO, A. S.; FAGUNDES, D. J.; NOVO, N. F. et al. Comparação entre
hidroxiapatita porosa de coral e enxerto ósseo autógeno em coelhos. Acta Cir Bras,
v. 16, n. 3, 2001.
FIGUEIREDO, A. S. et al. Osteointegração de osso bovino desvitalizado,
hidroxiapatita de coral, poliuretana de mamona e enxerto autógeno em coelhos.
Acta Cir Bras, v. 19, n. 4, p. 370-382, 2004.
FROTA, R. Avaliação histológica da reparação óssea na calota craniana de
ratos utilizando enxerto de β-tricálcio fosfato. 2003. 98 f. Dissertação (Mestrado
em Cirurgia Buco-Maxlio-Facial) – Universidade de Pernambuco, Faculdade de
Odontologia de Pernambuco, Camaragibe.
FROTA, R. Estudo da radiopacidade e avaliação morfológica da reparação
óssea utilizando-se β-tricálcio fosfato e polímero de mamona como implantes.
2006. 113 f. Tese (Doutorado em Cirurgia Buco-Maxlio-Facial) – Universidade de
Pernambuco, Faculdade de Odontologia de Pernambuco, Camaragibe.
127
FUJITA, R.; YOKOYAMA, A.; KAWASAKI, T. et al. Bone augmentation osteogenesis
using hydroxyapatite and β-tricalcium phosphate blocks. J Oral Maxillofac Surg, v.
61, p. 1045-1053, 2003.
GERBI, M. E. M.; PINHEIRO, A. L. B.; LIMEIRA JÚNIOR, F. A. et al. Assessment of
bone repair associated to the use of organic bovine bone and membrane irradiated
with 830nm. SPIE, Lasers in Dentistry IX. v. 4950, p. 137-143, 2003.
GUERRA NETO, M.; PAIVA A. O; COSTA, N. G. Caracterização de compósitos
biovidro-polihidroxibutirato quanto à morfologia e microdureza. Revista Matéria, v.
10, n. 1, p. 31 – 36, 2005.
GUTIERRES, M.; LOPES, M. A.; HUSSAIN, N. S. et al. Substitutos Ósseos –
conceitos gerais e estado atual. ARQUIVOS DE MEDICINA, v. 19, n. 4, p. 153-162,
2006.
HARKNESS, J. E.; WAGNER, J. E. Biologia e clínica de coelhos e roedores. 3.ed.
São Paulo: Roca, 1993.
HANDSCHEL, J.; WIESMANN, H. P.; STRATMANN, U. et al. TCP is hardly resorbed
and not osteoconductive in a non-loading calvarial model. Biomaterials, v.23, p.
1689-1695, 2002.
HOLLINGER, J. O.; KLEINSCHMIDT, J. C. The critical size defect as an
experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg, v. 2, p.237-243,
1990.
HORCH, H. H.; SADER, R.; PAUTKE, C. et al. Synthetic, pure-phase beta-tricalcium
phosphate ceramic granules (Cerasorb®) for bone regeneration in the reconstructive
surgery of the jaws. Int J Oral Maxillofac Surg, v.35, p. 708-713, 2006.
HUPP, J. R. Reparação das feridas. In: PETERSON, L. J. et al. Cirurgia Oral e
Maxilofacial Contemporânea. 4ª. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, cap. 4, p. 53-68,
2005.
INDOVINA, A; BLOCK, M. S. Comparison of 3 bone substitutes in canine extraction
sites. J Oral Maxillofac Surg, v. 60, p. 53-58, 2002.
128
JACQUES, J. W.; FAGUNDES, D. J.; FIGUEIREDO, A. S. et al. O papel da
poliuretana de mamona como substituto do enxerto ósseo autógeno em coelhos.
Rev. Col. Bras. Cir., v. 31, n. 4, p. 236-241, jul. / ago., 2004.
JONES, L.; THOMSEN, J. S., MOSEKILDE, L. et al. Biomechanical evaluation of rat
skull defects, 1, 3, and 6 months after implantation with osteopromotive substances.
J CranioMaxillofac Surg, v.35, n. 8, p. 350-357, 2007.
LAUREANO FILHO, J. R.; BRANCO, B. L. C.; ANDRADE, E. S. S. et al.
Comparação histológica entre o osso desmineralizado e polímero de mamona sobre
a regeneração óssea. Rev Bras Otorrinolaringol, v. 73, n. 2, p. 186-192, 2007.
LIMEIRA JÚNIOR, F. A.; PINHEIRO, A. L. B.; GERBI, M. E. M. M. et al. Assessment
of bone repair following the use of anorganic bone graft and membrane associated or
not to 830nm laser light. SPIE, Lasers in Dentistry IX, v. 4950, p. 30-36, 2003.
LIMEIRA JÚNIOR, F. A. Estudo do reparo de defeitos ósseos irradiados com
laser λ830nm submetidos ou não a implante de hidroxiapatita sintética e/ou
membrana de osso bovino. 2004. 149 f. Tese (Doutorado em Odontologia: Laser
em Odontologia) – Universidade Federal da Bahia, Salvador.
LIRA, H. G. Contribuição ao estudo da cirurgia pré-protética: enxertos ósseos. Rev.
Bras. Implant., p. 11-14, jul./dez. 1998.
MANKANI, M. H., KUZNETSOV, S. A., FOWLER, B. et al. In vivo bone formation by
human bone marrow stromal cells: effect of carrier particle size and shape.
Biotechnol Bioeng, v. 72, n. 1, p. 96-107, 2001.
MARINS, L. V.; CESTARI, T. M.; SOTTOVIA, A. D. et al. Radiographic and
histological study of perennial boné defect repair in rat calvária after treatment with
blocks of porous bovine organic graft material. J Appl Oral Sci, v. 12, n. 1, p. 62-69,
2004.
MARQUES, A.; LEITE, J. B. F.; MARZIONA, F. et al. Implante ósseo liofilizado.
Estudo experimental em cobaias. Acta Oncológica Brasileira, v.2, n.1, p. 15-18,
jan./abr., 1982.
MELCHER, A. H.; DENT, H. D. The use of heterogenous anorganic bone as an
implant material in oral procedures. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, v. 15, p. 996-
1000, 1962.
129
MIRANDA, E. S.; CARDOSO, F. T. S.; MEDEIROS FILHO, J. F. et al. Estudo
experimental comparativo no uso de enxerto ósseo orgânico e inorgânico no reparo
de fraturas cirúrgicas em rádio de coelhos. ACTA ORTOP BRAS, v.13, n. 5, p. 245-
248, 2005.
MOREIRA, A. S. B.; PASTORELI, M. T.; DAMASCENO, L. H. F. et al. Estudo
experimental da influência das dimensões dos grânulos de hidroxiapatita na
integração óssea. ACTA ORTOP BRAS, v. 11, n. 4, p. 240-250, 2003.
ORR, T. E.; VILLARS, P. A.; MITCHELL, S. L. et al. Compressive properties of
cancellous bone defects in a rabbit model treated with particles of natural bone
mineral and synthetic hydroxyapatite. Biomaterials, v. 22, p. 1953-1959, 2001.
PINHEIRO, A. L. B.; GERBI, M. E. M. M.; LIMEIRA JÚNIOR, F. A. et al. Assessment
of boné repair associated with the use of organic bovine bone Gen-ox® organic and
membrane irradiated with 830 nm. International Congress Series, v.1248, p. 441-
443, 2003.
PINHEIRO, A. L. B.; LIMEIRA JÚNIOR, F. A.; GERBI, M. E. M. et al. Effect of 830-
nm laser light on the repair of bone defects grafted with inorganic bovine bone and
decalcified cortical osseous membrane. Journal of Clinical Laser Medicine &
Surgery. v. 21, n. 6, p. 383-388, 2003.
PINTO, A. V. S., MIYAGUSKO, J. M., PEREIRA, L. A. V. Aumento ósseo com
enxerto autógeno - Áreas doadoras intrabucais. In: CARDOSO, R. J. A.; MACHADO,
M. E. L. Odontologia, arte e conhecimento: dentistica, prótese, ATM e
implantodontia. 1ª ed. São Paulo: Artes Médicas, v. 3, 2003.
QUEIROGA, A. S.; SOUSA, F. B.; ARAÚJO, J. M. S. de et al. Evaluation of the bone
repair in femur of rats submitted to laser therapy in different wavelenghts an images.
Laser Physics Letters, v. 9, p. 71-79, 2008.
RIOS, A. L. B. B.; BARBOSA, C. E. M.; ABI RACHED, R. S. G. et al. Comportamento
biológico de implantes de osso bovino anorgânico em arco zigomático de ratos.
Estudo histológico. Rev. Odontol. UNESP, São Paulo, v. 25, n. esp., p. 87-101,
1996.
ROSA, A. L.; SHAREEF, M. Y.; NOORT, R. Efeito das condições de preparação e
sinterização sobre a porosidade da hidroxiapatita. Pesqui Odontol Bras, v. 14, n. 3,
p. 273-277, 2000.
130
SAKATA, M. M.; ALBERTO-RINCON, M. C.; DUEK, E. A. R. Estudo da interação
polímero/cartilagem/osso utilizando poli (ácido lático-co-ácido glicólico) e poli (p-
dioxanona) em condilo femural de coelhos. Polímeros: Ciência e Tecnologia, v. 14,
n. 3, p. 176-180, 2004.
SANADA, J. T.; RODRIGUES, J. G. R.; CANOVA, G. C. et al. Análise histológica,
radiográfica e do perfil de imunoglobulinas após implantação de enxerto de osso
esponjoso bovino desmineralizado em bloco em músculo de ratos. J Appl Oral Sci,
v. 11, n. 3, p. 209-215, 2003.
SASSIOTO, M. C. P.; INOUYE, C. M.; AYDOS, R. D. et al. Estudo do reparo ósseo
com matriz óssea bovina desvitalizada e calcitonina em ratos. Acta Cir Bras, v. 19,
n. 5, p. 495-503, 2004.
SCHLEGEL, K. A.; LANG, F. J.; DONATH, K. et al. The monocortical critical size
bone defect as an alternative experimental model in testing bone substitute
materials. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 102, n. 1, p. 7-13,
2006).
SCIADINI, M. F.; DAWSON, J. M.; JOHNSON, K. D. Evaluation of bovine-derived
bone protein with a natural coral carrier as a bone-graft substitute in a canine
segmental defect model. J Orthop Res, v. 15, n. 6, p. 844-857, 1997.
SICCA, C. M.; OLIVEIRA, R. C.; SILVA, T. L. et al. Avaliação microscópica e
bioquímica da resposta celular a enxertos de osso cortical bovino em subcutâneo de
ratos. Efeito do tamanho da partícula. Rev. FOB, v. 8, n. 1/2, p. 1-10, 2000.
SOCCOL, A. T.; BETTEGA, S.; NORONHA, L. et al. Comparação entre os
bioenxertos de hidroxiapatita de cálcio e submucosa de intestino delgado porcino no
preenchimento de defeitos ósseos criados em mandíbula de ratos. Rev Bras
Otorrinolaringol, v.72, n. 2, p. 195-199, 2006.
SCOPP, I. W.; KASSOUNY, D. Y.; MORGAN, F. H. Bovine bone (Boplant). J
Periodontol, v. 37, p. 400-407, 1966.
SERRA-SILVA, F. M. S.; ALBERGARIA-BARBOSA, J. R.; MAZZONETTO, R.
Clinical evaluation of association of bovine organic osseous matrix and bovine bone
morphogenetic protein versus autogenous bone graft in sinus floor augmentation. J
Oral Maxillofac Surg, v. 64, p. 931-935, 2006.
TAGA, R; CESTARI, T. M.; SILVA, T. L. et al. Reparo de defeito ósseo perene em
crânio de cobaia pela aplicação de osseobond. Rev. Bras. Implant., p. 13, jan./fev.,
1997.
131
THORWARTH, M.; SCHLEGEL, K. A.; WEHRHAN, F. et al. Acceleration of de novo
bone formation following application of autogenous bone to particulated anorganic
bovine material in vivo. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 101,
n. 3, p. 309-316, 2006.
TUDOR, C.; SROUR, S.; THORWARTH, M. et al. Bone regeneration in osseous
defects – application of particulated human and bovine materials. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 105, n. 4, p. 430-436, 2008.
VOLPON, J. B.; XAVIER, C. A. M.; GONÇALVES, R. P. Enxerto homólogo de osso
cortical granulado e descalcificado na correção de falha óssea diafisária. Estudo
experimental em coelhos. Rev. Brasil. Ortop., v. 17, n. 1, p. 11-19, jan. 1982.
WENZ, B.; OESCH, B.; HORST, M. Analysis of the risk of transmitting bovine
pongiform encephalopathy through bone grafts derived from bovine bone.
Biomaterials, v. 22, p. 1599-1606, 2001.
YUKNA, R. A.; CALLAN, D. P.; KRAUSER, J. T et al. Multi-center clinical evaluation
of combination anorganic bovine-derived hydroxyapatite matrix (ABM)/cell binding
peptide (P-15) as a bone replacement graft material in human periodontal osseous
defects. 6-month results. J Periodontol, v. 69, n. 6, p. 655-663, 1998.
ZAMBUZZI, W. F.; OLIVEIRA, R. C.; ALANIS, D. et al. Microscopic analisys of
porous microgranular bovine anorganic boné implanted in rat subcutaneous tissue. J
Appl Oral Sci, v. 13, n. 4, p. 382-386, 2005.
ZAMBUZZI, W. F.; OLIVEIRA, R. C.; PEREIRA, F. L. et al. Rat subcutaneous tissue
response to macrogranular porous anorganic bovine bone graft. Braz Dent J, v.17,
n. 4, p. 274-278, 2006.
ZAR, J. H. Biostatistical Analysis. New Jersey: Prentice Hall. 4
a
. ed, 1999, 929 p.
132
APÊNDICE - IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS
PESQUISA:
Estudo histomorfometrico comparativo da reparação óssea em
ratos após o uso de enxertos de origem bovina e sintética.
RESPONSÁVEIS PELA PESQUISA:
Orientadores - Fabiano Gonzaga Rodrigues
Francisco de Assis Limeira Júnior
Doutorando - Álvaro Bezerra Cardoso
GRUPO*:
Animais**
Nascimento
Peso
Cirurgia
Sacrifício
01
02
03
04
05
06
* Identificação dos grupos:
01 círculo – 15 dias
02 círculos – 30 dias
03 círculos – 45 dias
** Identificação dos animais:
01 – I 02 - II 03 - III 04 - IIII 05 - IIIII 06 - IIIIII
133
ANEXO
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo