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Universidade Federal do Rio de Janeiro
CARACTERIZAÇÃO DOS PERFIS DE ATIVAÇÃO DE
CÉLULAS DENDRÍTICAS DURANTE A
IMUNOSSUPRESSÃO PÓS-SEPSE DE MANEIRA
DEPENDENTE DA EXPRESSÃO DE TLR2
Cristiane Sécca da Silva
2009
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CARACTERIZAÇÃO DOS PERFIS DE ATIVAÇÃO DE CÉLULAS
DENDRÍTICAS DURANTE A IMUNOSSUPRESSÃO PÓS-SEPSE
DE MANEIRA DEPENDENTE DA EXPRESSÃO DE TLR2
Cristiane Sécca da Silva
Dissertação apresentada ao
Departamento de Imunologia do
Instituto de Microbiologia e
Imunologia, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como requisito para
obtenção do título de Mestre em
Ciências (Microbiologia).
Orientadoras: Cláudia Farias Benjamim
e Maria Bellio.
Rio de Janeiro
2009
ii
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Cristiane Sécca da Silva
Participação do Receptor TLR2 na Ativação de Células Dendríticas
Durante a Imunossupressão Pós-Sepse Grave
Dissertação apresentada ao Departamento de Imunologia do Instituto de
microbiologia e imunologia, da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como requisito para obtenção do título de Mestre em ciências
(microbiologia).
Aprovado por:
_____________________________________
Profª Dra. Christianne Bandeira de Melo- IBCCF- UFRJ
_____________________________________
Profª Dra. Luciana Barros Arruda –IMPPG-UFRJ
_____________________________________
Profº Dr. Alexandre Morrot- IMPPG-UFRJ
_____________________________________
Profº Dr. Alberto Félix Antônio da Nóbrega- IMPPG -UFRJ (revisor)
____________________________________
Profº Dr. Cáudio de Azevedo Canetti - IBCCF- UFRJ (suplente externo)
____________________________________
Profª Dra. Ligia Maria Torres Peçanha- IMPPG-UFRJ (suplente interno)
Fevereiro de 2009
iii
Este trabalho foi realizado no Laboratório de inflamação e câncer,
Departamento de Farmacologia, Instituto de Cências Biomédicas (ICB),
Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de
Janeiro, sob a orientação da Prof(a). Cláudia Farias Benjamim e da Prof(a).
Maria Bellio.
iv
Ficha catalográfica
v
v
Sécca, Cristiane da Silva
Participação do receptor TLR2 na ativação de células dendríticas
durante a imunossupressão pós-sepse grave/ Cristiane Sécca da Silva- Rio
de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2009.
xviii, 59f. :il. ;31 cm.
Orientadoras: Cláudia Farias Benjamim e Maria Bellio.
Dissertação (mestrado) – UFRJ/ IMPPG/ Programa de Pós-graduação
em ciências (microbiologia), 2009.
Referências bibliográficas: f. 60-64.
1. Imunossupressão. 2. Dendríticas. 3. Medula Óssea. 4. TLR2. I. Bellio,
Maria e Benjamim, Cláudia Farias. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Istituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Programa de
pós graduação em ciências (microbiologia). III. Título.
“Viver e não ter vergonha de
ser feliz, cantar a beleza de
ser um eterno aprendiz”
Luiz Gonzaga
vi
Agradecimentos
A Deus, sempre;
A minha família, sem palavras, impossível seria expressar a minha gratidão
a vocês;
Aos meus amigos, sempre munidos de um sorriso nos bons momentos e de
uma “injeção de ânimo” nos maus. Não poderia citar nomes pois seriam
muitos e não gostaria de correr o risco de esquecer de algum;
A Cláudia Farias Benjamim por ter aceitado me orientar no mestrado
mesmo sem me conhecer direito, me dando inúmeras oportunidades de
aprendizado durante esses 2 anos, incluindo o acompanhamento do
processo de “montagem” de um laboratório (que no início definitivamente
não se parecia com um e hoje está muito melhor do que poderíamos
imaginar 2 anos atrás). Pelo seu empenho em conseguir reagentes, por
aceitar minhas idéias e por me dar liberdade de escolher com o que eu
quero trabalhar;
A Maria Bellio pelos TLR2-/-, por ter se mostrado sempre disponível para
tirar dúvidas com relação a protocolos experimentais e pelos auxílios de
bancada até altas horas da madrugada;
Ao professor Marcelo Torres Bozza por ter aberto seu laboratório,
disponibilizado reagentes e pelas idéias na recorreção do meu projeto;
A todos os alunos do laboratório: Carlos Antunes, Cyntia Pecli, Janaina
Barros, Leandro Ladislau, Raphael Molinaro e Vanessa Martins pela
mágica capacidade de criar sorrisos e risadas nos dias mais cansativos
compondo um ambiente sem igual (em especial ao Carlos e ao Leandro
pela ajuda na bancada no experimento de coleta de órgãos periféricos e à
Vanessa pelo auxilio com o programa de referências);
Ao Fábio Mesquita pelo auxilio com os experimentos com corpúsculos,
que assim como o experimento citado no item anterior não entrou na tese,
mas o que vale é a intenção.
Aos ex-alunos Èrico Soledade, Ariane Brogliato e Alessandra Monteiro
pelos momentos de descontração e mais risadas;
vii
Ao Dr. Steve Kunkel pelos anticorpos;
A CAPES pelo financiamento do projeto.
viii
Lista de abreviaturas
APC- célula apresentadora de antígenos
BMDCs- células dendríticas derivadas de medula óssea
CARS- síndrome da resposta compensatória anti-inflamatória
CASP - modelo experimental de peritonite séptica polimicrobiana por
implante de um “stent” no colon ascendente
CCS- centro de ciências da saúde
CEUA- comissão de uso de animais
CLP- ligadura e perfuração do ceco
DCs- células dendríticas
DCregs- células dendríticas regulatórias
FACS- ensaio de citometria de fluxo
GPI- glicosilfosfatidilinositol
IL- interleucina
IFN- γ- interferon gama
LPS- lipopolissacarídeo
LTA- ácido lipoteicóico
MFI- intensidade média de fluorescência
MHC II- complexo de histocompatibilidade principal do tipo II
MyD88- fator de diferenciação mielóide 88
NF-kB - fator nuclear kappa-B
NO - óxido nítrico
ix
OPD- o-fenilenediamina-dihidrocloreto
PAMPs- padrões moleculares associados a patógenos
PBS- solução salina de fosfato tamponada
PBS-T20- PBS + 0,05% Tween20
PPRs- receptors de padrão molecular
SIRS- síndrome da resposta inflamatória sistêmica
SFB- soro fetal bovino
TLRs- receptores semelhantes a Toll
TNF-α- Fator de necrose tumoral alfa
x
Índice de Figuras
Figura 1- Taxas de mortalidade hospitalar por sepse grave no período
de 2004 a 2007 em diferentes países desenvolvidos e em
desenvolvimento................................................................................2
Figura 2- Sepse: conceitos utilizados na classificação.....................4
Figura 3- Relação entre SIRS, sepse, sepse grave e choque
séptico................................................................................................6
Figura 4- Liberação de citocinas durante as fases inicial e tardia da
sepse...................................................................................................7
Figura 5- Seqüência de eventos que culminam com o
estabelecimento de um quadro de imunossupressão após uma sepse
grave...................................................................................................9
Figura 6- Ativação das células dendríticas por receptores de padrão
molecular...........................................................................................14
Figura 7- Modelo experimental de CLP murino utilizado para a
indução de sepse grave......................................................................18
Figura 8- Sobrevida de animais C57BL/6 e TLR2-/- ao CLP.........28
Figura 9- Aumento da expressão de TLR2 nas BMDCs de animais
sham e CLP......................................................................................30
Figura 10 – Expressão de MHCII na superfície de BMDCs de
animais sham e CLP.........................................................................32
Figura 11- Comparação da expressão de MHCII entre animais
C57BL/6 e TLR2-/-...........................................................................34
Figura 12- Expressão de CD80 pelas BMDCs de animais sham e
CLP...................................................................................................36
Figura 13- Comparação da expressão de CD80 entre animais
C57BL/6 e TLR2
-/-
...........................................................................38
xi
Figura 14- Comparação da capacidade fagocítica das BMDCs de
animais sham e CLP........................................................................40
Figura 15- Comparação da capacidade fagocítica das BMDCs em
função da presença de TLR2 nos grupos sham e CLP......................42
Figura 16- Produção deTNF-α pelas BMDCs obtidas a partir de
animais durante o quadro de imunosupressão pós-septica 15d após o
CLP...................................................................................................44
Figura 17- Produção de IL-10 pelas BMDCs obtidas a partir de
animais durante o quadro de imunosupressão pós-septica 15d após o
CLP...................................................................................................46
Figura 18- Produção de IL-12 pelas BMDCs obtidas a partir de
animais durante o quadro de imunosupressão pós-septica 15d após o
CLP...................................................................................................48
Figura 19- Esquema das alterações nas DCs periféricas mantidas a
longo prazo após um quadro de sepse grave.....................................52
Figura 20- Alterações das BMDCs na imunosupressão pós-sepse
induzidas em um cenário sem o TLR2..............................................58
Índice de Tabelas
Tabela 1- Principais ligantes identificados dos TLRs.......................11
xii
Resumo
A modulação da resposta imune adaptativa pela resposta imune inata
é um processo dependente da capacidade de apresentação antigênica
mediada pelas células dendríticas (DCs), juntamente com moléculas
efetoras derivadas destas células como citocinas e quimiocinas.
Recentemente, foram demonstradas evidências de que a imunossupressão
observada após eventos de inflamação sistêmica, como o observado na
sepse, resulta de uma disfunção da atividade destas células.
Dados prévios do nosso grupo mostram que DCs pulmonares de
animais pós-sépticos apresentam uma maior expressão de TLR2,
correlacionada a uma alta taxa de mortalidade após uma infecção
secundária. Além disto, DCs derivadas de medula óssea (BMDCs) de
animais que nunca sofreram sepse, restauraram as taxas de sobrevida de
animais imunocomprometidos à infecção secundária por um fungo
oportunista. Estes resultados sugerem que o TLR2 possivelmente participa
da alteração da função das DCs, mantida a longo prazo após a sepse,
contribuindo para a subseqüente imunossupressão. Então, nosso objetivo
principal neste estudo foi caracterizar o perfil de ativação das BMDCs de
animais C57BL/6 e TLR2
-/-
durante a imunossupressão pós-sepse grave.
Para isso, animais C57BL/6 ou TLR2
-/-
foram submetidos a um
modelo experimental de sepse grave de ligação e perfuração cecal (CLP).
Não foram observadas diferenças nas taxas de mortalidade pelo CLP entre
animais C57BL/6 e TLR2
-/-
. As BMDCs destes animais obtidas 15 dias
após o CLP foram estimuladas in vitro com Pam
3
Cys ou LPS. Essas células
foram analisadas para a expressão de moléculas marcadoras de ativação
celular como MHC II e CD80, e para o perfil de produção de citocinas,
além de serem testadas quanto à sua capacidade fagocítica.
xiii
As BMDCs obtidas 15 dias após o CLP a partir de animais
selvagens (WT) apresentaram uma maior expressão de TLR2 na superfície
comparadas às BMDCs obtidas do grupo sham quando estimuladas com
LPS ou Pam
3
Cys. Interessantemente, as células obtidas a partir do grupo
CLP de animais TLR2
-/-
expressaram mais MHC II e CD80 comparadas às
BMDCs de animais WT quando estimuladas in vitro com LPS. Além disto,
essas células produziram significativamente menos IL-10 e IL-12 também
quando comparadas aos WT. Esses dados sugerem que o TLR2 apresenta
um papel na indução das disfunções celulares durante a imunossupressão
pós-sepse, pois as BMDCs obtidas de animais TLR2
-/-
, após um episódio de
sepse grave, apresentaram uma melhor capacidade de maturação, frente ao
estimulo com LPS.
xiv
Abstract
Dendritic cells (DC) are known to be essential immune cells in the
launch of adaptive immunity. The modulation of adaptive immunity by
innate immunity is dependent on DC cellular functions as APCs and on the
DC-derived effector molecules such as cytokines and chemokines. Recent
evidence has also identified that immunosuppression following severe
systemic inflammation, such as found in sepsis, is a result of depletion in
DC numbers and a later dysfunction in DC activity.
Previous data from our group showed that pulmonary DCs from
post-septic mice express higher TLR2 levels , which correlate with higher
mortality after secondary infection. Moreover,, bone marrow-derived DCs
(BMDCs) from naive animals restored the survival rates of
immunocompromised animals to a secondary infection with an
opportunistic fungus. These results suggest that TLR2 may participate on
the sustained DC dysfunction initiated by life-threatening inflammation,
which contributes to the subsequent immunosuppression. Therefore, our
aim in this study was to characterize the activation profile of BMDC from
C57BL/6 e TLR2
-/-
mice during the development of immunosuppression
following severe sepsis.
In order to do so, C57BL/6 or TLR2-/- mice were subjected to a
severe sepsis model known as cecal ligation and puncture (CLP). We found
that there is no difference between the mortality induced by CLP in
C57BL/6 or TLR2
-/-
animals. BMDCs were obtained 15 days after CLP
from these mice and stimulated “in vitro” with Pam
3
Cys or LPS. These
cells were analyzed for the expression of maturation markers such as MHC
II and CD80 molecules, and cytokine profile production.
xv
First, BMDCs obtained 15 days after CLP from wild type (WT) mice
presented a higher expression of TLR2 on the cell surface compared to
BMDCs obtained from the sham group of mice when stimulated with LPS
or Pam
3
Cys. Interestingly, cells obtained from the CLP group of TLR2
-/-
mice expressed more MHC II and CD80 compared to the BMDCs from
WT when stimulated in vitro with LPS. Moreover, these cells also
produced significantly lower levels of IL-10 and IL-12 when compared
with the WT group.
These data suggests us that TLR2 plays an important role favoring
the susceptibility observed in post-septic mice, since BMDCs after severe
sepsis presented a more mature profile in response to a challenge with LPS,
when obtained from TLR2-/- mice.
xvi
Sumário
1- Introdução................................................................................................1
1.1- Sepse: Morbidade e Mortalidade................................................1
1.2- Classificação e Fisiopatologia da Sepse.....................................3
1.3- As Fases Inicial e Tardia da Sepse e a Imunossupressão...........6
1.4- Receptores “Toll-like”................................................................9
1.5- Células Dendríticas, TLRs e a Sepse.........................................13
1.6- O Modelo Experimental: CLP...................................................17
1.7- Hipótese.....................................................................................18
2- Objetivo Principal...................................................................................20
2.1-Objetivos Específicos.................................................................20
3- Metodologia............................................................................................21
3.1-Animais.......................................................................................21
3.2- Modelo de indução de sepse: CLP.............................................21
3.3- Tratamento com antibiótico.......................................................22
3.4-Cultura de células dendríticas derivadas de medula óssea
(BMDCs)...........................................................................................22
3.5- Purificação e estímulo das BMDCs em cultura.........................23
3.6- Quantificação de citocinas.........................................................24
3.7- Citometria de Fluxo (FACS).....................................................24
3.8- Ensaio de fagocitose..................................................................25
3.9- Análise estatística......................................................................26
4- Resultados...............................................................................................27
4.1- Sobrevida de animais C57BL/6 e TLR2-/- ao CLP..................27
4.2- Aumento de expressão de TLR2 em BMDCs de animais
CLP....................................................................................................29
xvii
4.3- Expressão de MHCII pelas BMDCs de animais sham e CLP em
animais selvagens e TLR2-/- ............................................................31
4.4- Comparação da expressão de MHCII entre animais C57BL/6 e
TLR2-/- .............................................................................................33
4.5- Expressão de CD80 pelas BMDCs de animais sham e CLP em
animais selvagens e TLR2-/- ............................................................35
4.6- Comparação da expressão de CD80 entre animais C57BL/6 e
TLR2-/-..............................................................................................37
4.7- Fagocitose pelas BMDCs de animais sham e CLP de animais
C57BL/6 e TLR2-/- .........................................................................39
4.8- Comparação da capacidade fagocítica das BMDCs em função da
presença de TLR2 nos grupos sham e CLP.......................................41
4.9- Perfil de produção de TNF-α pelas BMDCs..............................43
4.10 - Produção de IL-10 pelas BMDCs...........................................45
4.11 - Produção de IL-12 pelas BMDCs...........................................47
5- Discussão................................................................................................49
6- Conclusões..............................................................................................60
6.2- Conclusão geral....................................................................................61
7- Referências Bibliográficas......................................................................62
xviii
1-Introdução
1.1-Sepse: Morbidade e Mortalidade
A sepse é descrita como a décima causa de morte nos EUA
(HOYERT et al., 2001), a sua freqüência anual excede atualmente 750.000
casos com uma taxa de mortalidade anual de 28,6% nos hospitais deste país
(BONE et al., 1994; ANGUS et al., 2001).
No Brasil, um estudo multicêntrico realizado com 2419 pacientes,
em 50 hospitais de todas as regiões do país – SEPSE BRASIL – revelou
que as incidências de sepse, sepse grave ou choque séptico nos pacientes
internados em unidades de terapia intensiva somaram 16,9% dos casos de
internação, e a taxa de mortalidade foi de 15%, 35,6% e 63,8%, para cada
uma das classificações, respectivamente (SALES et al., 2005). Em outro
estudo de mesma natureza, foi mostrada uma incidência de 25% de sepse
grave entre os pacientes de UTI em hospitais públicos e privados de
diferentes regiões do país, com uma taxa de mortalidade de 35% no período
de maio de 2001 a janeiro de 2002 (SILVA et al., 2004). Em outro estudo
mais recente, foi mostrado que no período de 2004 a 2007, a mortalidade
hospitalar devido a casos de sepse grave foi maior no Brasil, com uma taxa
de 56%, do que em países desenvolvidos, que tiveram uma taxa média de
30%, ou mesmo do que em outros países em desenvolvimento, que tiveram
uma taxa média de mortalidade de 45%, conforme mostrado na figura 1
(TELES et al., 2008).
Figura 1- Taxas de mortalidade hospitalar por sepse grave no período de 2004 a
2007 em diferentes países desenvolvidos e em desenvolvimento. O Brasil apresentou
as mais altas taxas de mortalidade por sepse grave quando comparado a países
desenvolvidos como Austrália, Canadá e Alemanha e a outros países em
desenvolvimento como India e Argentina. Figura retirada de Teles et al., 2008.
Além das altas taxas de mortalidade associadas ao quadro agudo de
sepse, dados da literatura mostram que pacientes que se recuperam de um
quadro séptico grave apresentam um índice de mortalidade de 26% no
período de um ano (PERL et al., 1995; QUARTIN et al., 1997). Com um
aumento do tempo de acompanhamento dos pacientes, foi observado que
80% dos pacientes acometidos de sepse grave que obtiveram alta,
faleceram em um período de 8 anos de outras doenças as quais tiveram sua
incidência associada a sepse, como neoplasias, doenças crônicas de
pulmão, fígado e rins, infecções, desordens hematológicas e
imunodeficiências (QUARTIN et al., 1997). Também foi demonstrado que
a vida-média do paciente pós-séptico correlaciona-se com a severidade da
sepse. Estas últimas observações foram as primeiras que sugeriram uma
forte correlação entre sepse e outras patologias a princípio não relacionadas
ao evento séptico inicial.
1.2- Classificação e Fisiopatologia da Sepse
A sepse é a resposta inflamatória sistêmica do organismo frente ao
estímulo infeccioso. A manifestação clínica da sepse é conseqüência de
uma resposta inflamatória intensa do hospedeiro contra um patógeno, que
pode se manifestar por hipotensão, coagulopatia e disfunção dos órgãos
(BONE et al., 1994). Durante uma infecção, o organismo responde
inicialmente através de uma inflamação localizada, liberando mediadores
inflamatórios na tentativa de eliminar o agente agressor. No caso da
resposta do organismo não ser capaz de eliminar ou conter o estímulo,
ocorre proliferação e disseminação do agente patogênico com liberação
exacerbada de mediadores inflamatórios de maneira sistêmica, atingindo
órgãos distais.
Existem 3 pontos principais que devem estar presentes em um
quadro de inflamação sistêmica para que esta seja classificada como sepse:
1º- A presença de um foco infeccioso, como agente causal.
2º- Um quadro de inflamação exacerbada e sistêmica, que tenta
combater a infecção disseminada.
3º- A presença de alterações no componente cardiovascular do
organismo (principalmente a coagulopatia disseminada em função das altas
taxas de liberação de TNF-α no contexto inflamatório e, algumas vezes,
hipotensão, devido a intensa liberação de NO e aminas vasoativas).
Na sepse estes processos fisiopatológicos ocorrem
concomitantemente e estão intimamente relacionados conforme
esquematizado na figura 2.
Figura 2- Sepse: Conceitos utilizados na classificação. O esquema mostra os três
pontos essenciais envolvidos na classificação da patologia da sepse dispostos na forma
de um triângulo cujas linhas representam a interação entre os fatores.
Muitas vezes a sepse é designada simplesmente como síndrome da
resposta inflamatória sistêmica (SIRS, do inglês “systemic inflammatory
response syndrome”), esta denominação porém, apesar de não estar
incorreta é incompleta. A SIRS se caracteriza pela resposta do organismo a
um insulto variado, com a presença de pelo menos 2 dos seguintes critérios:
febre (temperatura maior que 38ºC), hipotermia (temperatura menor que
36ºC) taquicardia (freqüência cardíaca maior que 90 batimentos/min),
taquipnéia (freqüência respiratória maior que 20 respirações/min ou PaCO2
menor que 32 mmHg), e contagem de leucócitos maior que 12.000/mm3 ou
menor que 4.000/mm3 (SILVA et al., 2004).
Na verdade, a sepse é uma SIRS associada a um quadro infeccioso.
A denominação SIRS foi criada para incluir tanto a sepse quanto doenças
semelhantes provenientes de causa não infecciosa, como trauma, isquemia,
queimadura, pancreatite e hemorragia.
As manifestações clínicas na sepse são conseqüências do quadro
inflamatório, que geralmente resultam em injúria tecidual e subseqüente
disfunção de órgãos. Estas alterações podem levar a ocorrência de falência
múltipla de órgãos (FMO), o que confere à sepse um alto índice de
mortalidade. Falência respiratória é a mais comum, seguida por falência
cardiovascular, renal e hepática (MARTIN et al., 2003).
Dentro da classificação de sepse, existe uma subclassificação que
constitui o quadro chamado de sepse grave, que se caracteriza por um
quadro em que o paciente apresenta hipotensão, devido à liberação
exagerada e sistêmica de mediadores inflamatórios causadores de
vasodilatação (histaminas e NO, principalmente), e falência de pelo menos
um órgão. Além deste quadro, existe um outro considerado ainda mais
grave em que o organismo não responde mais ao tratamento com
vasoconstrictores e a hipotensão pode levar o indivíduo à morte, o que
caracteriza o choque séptico. As relações entre SIRS, sepse, sepse grave e
choque séptico estão esquematizadas na Figura 3.
Figura 3- Relação entre SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico. A sepse é
representada no diagrama através de uma intercessão entre uma SIRS e uma doença
infecciosa. Dentro da classificação de sepse encontramos ainda a classificação de sepse
grave e o choque séptico em graus crescentes de severidade. Figura adaptada de Bone
et al., 1992.
É interessante ainda observar que, na clínica, frequentemente
quadros de SIRS a princípio não relacionados à infecção, muitas vezes
evoluem para esta, que em geral se dissemina em função da incapacidade
do organismo de combatê-la devido às alterações no sistema imunológico
no cenário de inflamação sistêmica. O paciente passa a apresentar então um
quadro de sepse, que pode ainda evoluir para sepse grave e choque séptico.
1.3- As Fases Inicial e Tardia da Sepse e a Imunossupressão
Os eventos patológicos podem ser subdivididos em uma fase inicial e
uma fase tardia. A fase inicial é caracterizada pela liberação de mediadores
pró-inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6 e quimiocinas, que é
conhecida como SIRS. Subsequentemente, a resposta pró-inflamatória
inicial é compensada pela liberação de mediadores antiinflamatórios, como
a IL-10 e o TGF-β. Esta fase foi denominada como síndrome da resposta
antiinflamatória compensatória (CARS, do inglês “compensatory anti-
inflammatory response syndrome”) (DINARELLO et al., 2000). As
alterações no processo de reparo com a polarização da resposta para um
perfil Th2 e a indução de células T regulatórias, além da liberação
excessiva de mediadores anti-inflamatórios na fase tardia, são alguns dos
fatores envolvidos no quadro de imunossupressão pós-sepse, em que
ocorrem diversas alterações imunes no organismo a longo prazo, conforme
o esquema da figura 4.
Figura 4- Liberação de citocinas durante as fases inicial e tardia da sepse. A
sepse é caracterizada por uma exuberante produção inicial de citocinas pro-
inflamatórias, seguida pela liberação de citocinas regulatórias anti-inflamatórias, que
permanece por tempo indeterminado. Figura adaptada de Poll et al., 1999.
Conseqüentemente, o organismo já não responde mais
adequadamente frente a um estímulo inflamatório, tornando-se susceptível
a infecções relacionadas ou não ao evento séptico inicial. Neste cenário o
pulmão é um dos primeiros órgãos afetados, pois se torna uma das
principais portas de entrada de patógenos oportunistas, visto estar em
constante contato com o meio externo através do ar inspirado.
Esse quadro de imunossupressão também se encontra em outras
doenças que envolvem processo inflamatório intenso e sistêmico como
queimaduras, pancreatites e pneumonia (RODGERS et al., 2000;
OPENSHAW et al., 2003).
O termo imunossupressão pós-sepse reflete a presença de alterações
nas células do sistema imune e no perfil de citocinas/quimiocinas, com
predomínio da produção de mediadores regulatórios, além de alterações na
expressão de receptores “Toll like” (TLRs). A presença destas alterações
leva a um aumento do risco de desenvolvimento de infecções secundárias
subseqüentes à sepse (WANG e DENG, 2008). Estes receptores
influenciam a resposta imune inata e adquirida mediada por diversos tipos
celulares, dentre os quais pode-se destacar as células dendríticas, os
macrófagos e os polimorfonucleares. Estas células, na fase tardia da sepse,
se encontram alteradas em órgãos distais como o pulmão, como ilustrado
na Figura 5.
Estas alterações permanecem no organismo tempo indeterminado, e
recentemente, este quadro foi associado a alterações epigenéticas em
células imunes (WEN et al., 2008).
Figura 5- Seqüência de eventos que culminam com o estabelecimento de um
quadro de imunossupressão após uma sepse grave. A evolução da doença ocorre
com a ativação da resposta imune inata inicial do hospedeiro contra os patógenos que
afeta sistemicamente o organismo, incluindo o pulmão. No pulmão, o perfil de diversas
citocinas e quimiocinas encontra-se alterado, além da expressão de TLRs, contribuindo
para que o hospedeiro apresente um quadro de imunossupressão. Figura de Benjamim
et al., 2004.
1.4- Receptores “Toll-like”
Os receptores da família “Toll”, primeiramente descritos em
Drosophila, cujos homólogos correspondentes em mamíferos são
conhecidos como receptores “Toll-like” (TLRs), são importantes
componentes da imunidade inata. Ao reconhecer padrões moleculares
associados a patógenos (PAMPs) derivados de protozoários, bactérias,
vírus e fungos, os TLRs desencadeiam a resposta inata e modulam a
resposta adaptativa (Takeda et al., 2001). Até o momento, já foram
identificados onze TLRs (TLR1-TLR11) em humanos e doze em
camundongos. Os TLRs são proteínas transmembrana, expressas por
diversos tipos celulares incluindo as células do sistema imunitário
responsáveis pela primeira linha de defesa, como os macrófagos, as células
dendríticas, e os neutrófilos, além de células epiteliais de mucosa e células
endoteliais da derme (IMLER e HOFFMANN, 2001).
Nos últimos anos a imunobiologia dos TLRs tem sido foco de vários
experimentos configurando um dos temas mais estudados no campo da
imunologia. Este fato se deve à percepção de um imenso potencial
terapêutico relacionado à ativação ou inibição específica de alguns desses
receptores, através principalmente de possíveis agonistas e antagonistas que
estão sendo estudados e que possibilitariam a manipulação destas vias de
sinalização. Diferentes cascatas de sinalização intracelulares são iniciadas
pelos TLRs e culminam com a ativação de fatores de transcrição nuclear
como o fator nuclear kappa B (NF-κB) e o fator regulador de interferon
(IRF-3/7). Estes fatores nucleares vão atuar na célula induzindo a produção
de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, que por sua vez vão participar
da resposta imune do indivíduo, influenciando diretamente no prognóstico
de diversas patologias (PANDEY e AGRAWAL, 2006). Além disto, estes
receptores promovem uma conexão entre a imunidade inata e a adaptativa,
pois além de induzir a produção de citocinas e quimiocinas envolvidas em
ambas as respostas, sua ativação é capaz de induzir a maturação das células
apresentadoras de antígenos (APCs). Estas aumentam a expressão de
moléculas co-estimulatórias (CD80, CD86 e CD40) e de moléculas de
MHC de classe II em suas superfícies. A expressão destas moléculas pelas
APCs é essencial para a apresentação antigênica aos linfócitos T e portanto,
para a iniciação da imunidade adaptativa (AKIRA et al., 2001; BARTON e
MEDZHITOV, 2002).
O reconhecimento de patógenos pelas células da imunidade inata foi
considerado completamente inespecífico por muitos anos. Isto porque estas
células reconhecem antígenos que não são específicos de uma única
espécie de patógeno, diferentemente dos linfócitos, que são as principais
células efetoras da imunidade adaptativa, mas sim padrões moleculares
comuns a grupos inteiros de patógenos e que não estão presentes no
hospedeiro, os acima citados PAMPs. Entretanto, estruturas microbianas
distintas são reconhecidas por diferentes TLRs. Por exemplo, o receptor
TLR2, que é o alvo de estudo do presente trabalho, é essencial para a
detecção de ácido lipoteicóico presente na parede de bactérias Gram-
positivas. O TLR4 reconhece o lipopolissacarídeo (LPS) presente na parede
de bactérias Gram-negativas, o TLR9 reconhece os fragmentos de DNA
bacteriano (CpG DNA), o TLR3 reconhece a dupla fita de RNA viral e os
TLR7 e TLR8 reconhecem fita simples de RNA de patógenos. Os
principais ligantes de TLRs descobertos estão relacionados na tabela 1.
Tabela 1. Principais ligantes identificados dos TLRs. Figura de Pandey e Agraal,
2006.
Assim, embora esses receptores reconheçam genericamente PAMPs,
apresentam especificidade com relação aos seus ligantes, permitindo ao
organismo direcionar o tipo de resposta que este irá apresentar frente ao
invasor (AKIRA et al., 2001).
TLR2 é um dos TLRs mais estudados e reconhece PAMPs de
bactérias Gram-positivas como o ácido lipoteicóico (LTA), lipoproteínas
bacterianas di e triaciladas, lipoarabinomananas de micobactérias
(WIELAND et al., 2004), âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) do
Trypanossoma cruzi (CAMPOS et al., 2001), porinas de bactérias do
gênero Neisseria e componentes do zymosam de leveduras (SATO, et al.
2003). Ainda não está claro como um único receptor consegue reconhecer
uma variabilidade tão grande de ligantes. Entretanto, o fato deste receptor
formar dímeros em associação com os TLRs 1 e 6, faz aumentar as
possibilidades deste receptor reconhecer mais ligantes (TAKEUCHI et al.,
2001; TAKEUCHI et al., 2002). A associação do TLR2 com TLR1
reconhece preferencialmente lipopeptídeos triacetilados (TAKEUCHI et
al., 2002) enquanto que a associação de TLR2 com TLR6 reconhece
lipopeptídeos diacetilados (TAKEUCHI et al., 2001).
O reconhecimento de componentes fúngicos pelo TLR2 parece estar
relacionado a uma associação deste receptor ao receptor dectina-1 com uma
potencialização da ativação na presença de ligantes β-glicanos (GANTNER
et al., 2003). Surpreendentemente, a expressão do receptor TLR2 e sua
atividade tem sido descritas como fenômenos positivamente regulados por
moléculas pró e anti-inflamatórias, como o TNF-α e glicocorticóides,
respectivamente (SHUTO et al., 2002; HERMOSO et al., 2004). A maioria
dos receptores TLRs descritos mediam a diferenciação de células
dendríticas provedoras de um padrão de resposta do tipo Th1 (DC1),
enquanto os receptores de padrão moleculares da imunidade inata que
levam a diferenciação da célula dendrítica para o tipo DC2, que promove
um perfil de resposta do tipo Th2, ainda não estão elucidados. A ativação
do receptor TLR2 foi correlacionada tanto a um perfil de resposta Th1
(ZHOU et al., 2008) como de uma resposta do tipo Th2 (REDECKE et al.,
2004). Em outro trabalho, a ativação de DCs in vitro com o ligante sintético
de TLR2, Pam
3
Cys, foi correlacionado a um perfil de produção de citocinas
do padrão Th2 por essas células (AGRAWAL et al., 2003; REDECKE et
al., 2004).
1.5- Células Dendríticas, TLRs e a Sepse
A indução de uma resposta imune protetora depende da interação
entre células T naive antígeno específicas e células apresentadoras de
antígenos (APC). Devido às suas características de migração, expressão de
moléculas de MHCII e de moléculas coestimulatórias, as DCs são
consideradas APCs profissionais. Estas se apresentam como sentinelas que
patrulham a periferia onde reconhecem sinais de perigo endógenos e
componentes de patógenos através de receptores de padrão molecular
(PRRs, do inglês “pattern recognition receptors”) que levam a sua ativação.
Dentre esses PPRs, podemos destacar duas classes mais amplamente
estudadas que são os TLRs, que respondem principalmente a sinais
externos através do reconhecimento de PAMPs, e os receptores do tipo
NOD, que além de reconhecer componentes de patógenos, reconhecem
principalmente sinais endógenos associados a “perigo”, como moléculas
associadas ao stress celular.
Quando ativadas, as DCs migram para os órgãos linfóides
secundários, onde completam seu estágio de maturação, expressando em
sua superfície moléculas coestimulatórias e moléculas de MHCII,
associadas aos antígenos capturados na periferia e processados para serem
apresentados aos linfócitos T e B, conforme esquematizado na figura 6
(BANCHEREAU e STEINMAN, 1998).
Figura 6- Ativação das células dendríticas por receptores de padrão molecular. Ao
serem ativadas pelos ligantes de receptores de padrão as DCs aumentam a expressão de
moléculas relacionadas a apresentação antigênica como moléculas co-estimulatórias e a
molécula de MHCII. No exemplo, a ligação de PAMPs aos TLRs ou de ligantes de
receptores do tipo NOD levam a ativação da célula, com conseqüente ativação do fator
de trascrição nuclear NF-kB, levando não apenas ao aumento da expressão das
moléculas já citadas, como também à produção e secreção de citocinas que irão
direcionar o perfil de resposta durante a ativação dos linfócitos T CD4.
Através do reconhecimento de PAMPs distintos por diferentes
TLRs, a DC ativada poderá induzir a montagem de diferentes tipos de
resposta “T helper”. O tipo Th1, que produz principalmente IFN-γ, é o
padrão de resposta indicado no controle de patógenos intracelulares. O tipo
Th2, que produz principalmente IL4, IL-5, IL-13 e IL-10 é o padrão ideal
no combate a infecções por helmintos. E o padrão Th17, que produz
principalmente IL-17, está envolvido no combate a algumas infecções
fúngicas e a bactérias extracelulares. A ativação de uma resposta “T
helper” adequada no combate a um agente infeccioso é crucial para a
resolução da infecção. A ativação dos TLRs pelos PAMPs do agente em
questão é um fator determinante no padrão de resposta “T helper” a ser
montada. Entretanto, a relação entre a ativação de distintos TLRs por
diferentes PAMPs numa mesma DC e a seleção de um perfil “T helper” de
resposta, ainda não está bem caracterizada (MEDZHITOV, 2007).
Durante uma sepse polimicrobiana ocorre a ativação concomitante de
múltiplos TLRs. Em um estudo realizado com animais BALB/c, que
carregam uma mutação no gene para TLR4, e com animais C3H/HeJ
mutantes para o mesmo gene (ambos não responsivos ao LPS), não foram
observadas diferenças nas taxas de mortalidade destes animais em relação
aos seus respectivos controles selvagens quando submetidos a um modelo
experimental de peritonite séptica polimicrobiana por ligação e perfuração
do ceco (CLP, do inglês “cecal ligation and puncture”) (ECHTENACHER
et al., 2001). Em um modelo experimental de peritonite séptica por
implante de um “stent” no colon ascendente (CASP, do inglês “colon
ascendens stent peritonitis”), foi demonstrado que a sobrevida de animais
deficientes para o TLR2, para o TLR4, ou para ambos, foi comparável a
dos animais selvagens. Entretanto, animais deficientes para MyD88, uma
molécula comum à via de sinalização de múltiplos TLRs, submetidos ao
mesmo modelo, apresentaram uma menor taxa de mortalidade. O autor
propõe que múltiplos TLRs estejam envolvidos na indução da inflamação
exacerbada que leva a morte na fase aguda da sepse e que a falta de apenas
um ou dois destes receptores seja compensada pelos demais
(WEIGHARDT et al., 2002). Entretanto, a retirada de um único TLR, no
caso o TLR9, no modelo de CLP resultou em um incremento da sobrevida
mostrando um papel crucial para este TLR na mortalidade durante a fase
aguda da sepse. Neste mesmo trabalho, a proteção observada ao CLP foi
associada a um aumento nos números de granulócitos e DCs peritoneais
nos animais TLR9
-/-
em relação aos controles selvagens. A transferência
adotiva de DCs de animais TLR9
-/-
foi suficiente para proteger o animal
selvagem do CLP, gerando um aumento do influxo peritoneal de
granulócitos (PLITAS et al., 2008).
Assim, como a maioria das células imunes, as DCs também são
afetadas pela sepse. DCs provenientes do baço e linfonodos de animais
sépticos se mostraram maduras, expressavam moléculas coestimulatórias,
mas falharam em induzir uma resposta do tipo Th1 após o estímulo com
LPS (FLOHE et al., 2006). Recentemente foi descrita uma população de
células dendríticas regulatórias (DCregs), CD11c
low
/CD45RB
high
,
produtoras de IL-10. A administração destas células em animais
submetidos ao CLP reduziu significativamente a letalidade durante a fase
inicial, mesmo quando administradas 6 horas após a cirurgia. Além disto,
animais que receberam essas DCregs mostraram uma redução significativa
nos níveis de apoptose em timócitos quando submetidos ao CLP (FUJITA
et al., 2006). Sabe-se que a apoptose de linfócitos, especialmente no timo
contribui para a letalidade na sepse (HOTCHKISS et al., 2000).
Recentemente, a polarização da resposta para um padrão Th2 associada à
imunossupressão pós-séptica foi relacionada a alterações epigenéticas na
região promotora do gene da IL-12 nas DCs, fazendo com que DCs de
animais CLP produzissem significativamente menos desta citocina em
comparação às DCs de animais controle falso-operados (sham) na fase
tardia da doença (WEN et al., 2008).
1.6- O Modelo Experimental: CLP
O modelo experimental para indução de sepse utilizado no presente
trabalho é o modelo murino de peritonite séptica de ligação e perfuração do
ceco- CLP. Dentre os modelos experimentais de sepse, o CLP é o que
melhor mimetiza a ocorrência clínica da peritonite séptica polimicrobiana,
tanto qualitativamente como quantitativamente (WICHTERMAN et al.,
1980; FINK e HEARD, 1990). Semelhante ao que se observa na clínica, a
morte do animal no modelo de CLP é causada pelos efeitos diretos das
bactérias e por uma intensa resposta inflamatória sistêmica frente aos
patógenos (BONE et al., 1994). No presente trabalho, utilizamos um
modelo de CLP que induz uma sepse grave, onde 100% dos animais
morrem, quando não tratados com antibióticos, e 40% quando tratados.
Este modelo encontra-se esquematizado na figura 7.
Figura 7- Modelo experimental de CLP murino utilizado para a indução de sepse
grave. Neste modelo, o ceco dos animais previamente anestesiados é ligado e perfurado
9 vezes com uma agulha de calibre pré-determinado (21Gauge), para a obtenção de uma
sepse grave.
No modelo experimental de sepse grave induzido por CLP e seguido
de antibioticoterapia acima descrito, a imunossupressão pôde ser observada
numa fase mais tardia da sepse, através da susceptibilidade a uma infecção
pulmonar secundária pelo conídio do Aspergillus fumigatus (BENJAMIM
et al., 2003). A infecção secundária por este fungo se mostrou um ótimo
modelo para o estudo da imunossupressão pós sepse. Este é um patógeno
oportunista de alta incidência nas vias aéreas e tornou-se uma importante
causa de morte em casos de infecções pulmonares nas últimas duas
décadas, em função do aumento do número de pacientes imunossuprimidos
(FRASER et al., 1979; GROLL et al., 1996). Os conídios são
eficientemente destruídos nos pulmões de pessoas saudáveis mas, em
pessoas imunossuprimidas, estes germinam e formam hifas invadindo o
A
A
n
n
e
e
s
s
t
t
e
e
s
s
i
i
a
a
d
d
o
o
Antibioticoterapia
5, 24 e 48 horas
após a cirurgia
Ligação do
- 40% de mortalidade
com o tratamento com
antibióticos
-100% de mortalidade sem
o tratamento
CLP Grave
(9 perfurações, 21G)
tecido e causando pneumonia severa e progressiva, podendo até se
disseminar para outros órgãos. A primeira linha de defesa contra o fungo
são os macrófagos alveolares e os neutrófilos (MEHRAD et al., 1999).
1.7- Hipótese
Em modelo murino de imunossupressão pós-sepse, a instilação
intrapulmonar de células dendríticas obtidas da médula óssea (BMDCs) de
camundongos sham, que não sofreram sepse, ofereceu proteção frente à
infecção secundária por A. fumigatus em camundongos pós-sépticos (fase
tardia). O restabelecimento da função destas células pode sugerir uma
estratégia interessante para reverter à imunossupressão induzida pela sepse
(BENJAMIM et al., 2005). Neste mesmo trabalho foi mostrado um
aumento de mRNA para TLR2 nas DCs de pulmão dos animais submetidos
ao CLP, que são os animais que se mostraram susceptíveis a infecção
secundária com conídios de A. fumigatus.
Considerando os seguintes fatos:
1º- A ativação de DCs por um ligante de TLR2 leva, em algumas
situações, a um perfil de resposta do tipo Th2 (AGRAWAL et al., 2003;
REDECKE et al., 2004).
2º-o perfil de resposta ideal no combate a aspergilose pulmonar
invasiva é o perfil Th1.
3º- Na imunossupressão pós-sepse ocorre uma falha na indução da
resposta de perfil Th1 (BENJAMIM et al., 2005; WEN et al., 2008).
Nós levantamos a hipótese de que o aumento de TLR2 nas DCs
durante a imunossupressão pós-sepse estaria envolvido na polarização para
o perfil de resposta Th2 observado nesta patologia. Isto levaria o animal a
uma maior susceptibilidade à infecção secundária por A. fumigatus e por
outros patógenos em que a resposta Th1 seja requerida para o combate a
infecção.
Com o objetivo de testar esta hipótese, no presente trabalho nos
propomos caracterizar o perfil de ativação das BMDCs obtidas a partir de
animais em um quadro de imunossupressão pós-sepse na presença e na
ausência de expressão do TLR2.
2- Objetivo Principal
Caracterizar o perfil de ativação das BMDCs de animais C57BL/6 e
TLR2
-/-
durante a imunossupressão pós-sepse grave.
2.1- Objetivos específicos
1- Comparar a sobrevida de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
submetidos ao CLP.
2- Comparar a expressão de TLR2 nas DCs provenientes de
animais C57BL/6 submetidos ao CLP ou sham operados.
3- Caracterizar o perfil de citocinas produzido pelas BMDCs
obtidas de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
, submetidos ao CLP
ou sham operados.
4- Comparar a capacidade fagocítica das BMDCs provenientes
de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
submetidos ao CLP ou sham
operados.
3- Metodologia
3.1-Animais
Camundongos C57BL/6, pesando entre 20-24 g, de ambos os sexos,
foram gentilmente doados pelo biotério da Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ). Os animais TLR2
-/-
,
previamente descritos (TAKEUCHI et
al., 1999) possuem o mesmo “background” genético dos animais
C57BL/6
e
são mantidos no biotério de animais transgênicos (LAT) do Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Fº, (UFRJ). Os protocolos utilizados envolvendo
procedimentos com os animais de experimentação foram realizados de
acordo com as diretrizes da Comissão de Uso de Animais (CEUA) do
centro de ciências da saúde (CCS) da UFRJ, conforme o protocolo nº
DFBCICB 028. Os grupos experimentais utilizados foram sempre de
animais do mesmo sexo equiparados pelo peso.
3.2- Modelo de indução de sepse: CLP
Camundongos C57BL/6 e TLR2
-/-
foram previamente anestesiados
intraperitonealmente com uma solução de Ketamina e Xilazina (112,5
mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente). Após serem anestesiados, a cavidade
abdominal foi aberta com uma incisão de 1,5 cm, o ceco identificado,
exposto e ligado com linha de algodão (4-0) de forma a não obstruir a
passagem entre íleo e ceco. Em seguida, o ceco foi perfurado 9 vezes com
agulha de 21G para induzir a sepse grave (grupo CLP). O ceco foi
recolocado na cavidade abdominal e fechado com auxílio de grampo
cirúrgico 9 mm. Após o procedimento cirúrgico, os animais receberam a
administração subcutânea de solução salina (1,0 ml), para reposição
volêmica. Os animais controles ou falsos operados (grupo sham) foram
abertos e o ceco exposto, mas não foram ligados e perfurados. Os animais
submetidos ao procedimento sham ou CLP receberam tratamento com
antibiótico como descrito abaixo.
3.3- Tratamento com antibiótico
O antibiótico utilizado foi o Ertapenem (Invanz, Merck) que foi
preparado no dia do uso em solução salina estéril na concentração de 75
mg/kg com administração de 200 µL por animal. O antibiótico foi
administrado intraperitonealmente nos animais CLP e sham após 5, 24 e 48
horas da cirurgia.
3.4-Cultura de células dendríticas derivadas de medula óssea
(BMDCs)
As medulas ósseas de animais submeditos ao CLP ou sham operados
foram lavadas assepticamente em meio RPMI completo (suplementado
com estreptomicina 100 µg/ml, penicilina 100 U/ml, 2β-mercaptoetanol 50
µM, AAs não essenciais 0,1 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1
mM, hepes 5,2 g/L, bicarbonato de sódio 2 g/L) com 10% de soro fetal
bovino (GIBCO) a partir dos fêmures de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
. Foi
feito um “pool” de células obtidas a partir de animais sham ou CLP,
C57BL/6 ou TLR2
-/-
(utilizando sempre no mínimo 3 animais por grupo) .
As hemácias foram removidas por lise com ACK (155 mM NH4Cl / 1 mM
KHCO3 / 0.5 mM EDTA, pH 7.2) e as células foram ressuspensas
novamente em meio RPMI completo com 10% SFB na concentração de 10
6
células por ml. As células foram colocadas em cultura, em atmosfera com
5% CO
2
por 7 dias na presença de 10 ng/ml de GM-CSF e IL-4 (R&D).
Este método foi adaptado do protocolo estabelecido por (INABA et al.,
1992).
3.5-Purificação e estímulo das BMDCs em cultura
Após 7 dias de cultura, as BMDCs foram coletadas, centrifugadas a
400 rcf por 8 minutos, ressuspensas em HANK´S sem Ca
++
e Mg
++
e
ajustadas para uma concentração de 10
6
céls/ml. Foi preparado um
gradiente a base de Percoll (OPTI-PREP, SIGMA) a 11,5%. Cinco
mililitros de OPTI-PREP foi adicionado a tubos Falcon de 15 ml e o
mesmo volume (5 ml) da suspensão das células foi adicionada sobre o
mesmo. Os tubos foram centrifugados por 15 min a 600 rcf a temperatura
ambiente. Após a centrifugação, o anel de células disposto entre o OPTI-
PREP e o HANK´S correspondente a fração de células mononucleares foi
coletado com uma pipeta e ressuspenso em 15 ml de HANK’S sem Ca
++
e
Mg
++
. As células foram centrifugadas novamente a 400 rcf por 8 minutos
para a remoção de vestígios do gradiente e ressuspensas em meio RPMI
completo. As células foram plaqueadas em placa de 96 poços na
concentação de 10
6
células/ml em um volume final de 200 µl e incubadas a
37ºC com uma atmosfera de 5% de CO
2
por 24 h. Após esse período as
células foram estimuladas com 1 µg/ml de LPS, purificado a partir de
E.coli (SIGMA), 25 µg/ml de Pam
3
Cys (N-α-Palmitoyl-S-[2,3-
bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-L-cysteine Palmitoyl-Cys((RS)-2,3-
di(palmitoyloxy)-propyl)-OH) (EMC), ou meio RPMI (controle) e
incubadas por mais 24 h. Após este período, estas células foram utilizadas
para os experimentos de caracterização fenotípica por citometria de fluxo
ou para o ensaio de fagocitose.
3.6- Quantificação de citocinas
Os sobrenadantes das culturas dos poços de BMDCs estimulados
com LPS, Pam
3
Cys ou meio (RPMI) foram utilizados para a quantificação
de TNF-α, IL-10, e IL-12. O volume recolhido foi centrifugado e o
sobrenadante isento de células foi guardado a –20°C até o dia da dosagem.
Placas de 96 poços foram cobertas com anticorpo específico anti-TNF-α (2
µg/ml), anti-IL10 ou anti IL-12 (PeproTech). Estes anticorpos foram
diluídos em solução de ligação (0.05% Tween-20, 0.1% BSA em PBS) e
incubados por 18 horas a 4°C. As placas então foram lavadas quatro vezes
com PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T20) (Sigma). As ligações não
específicas foram bloqueadas com PBS + 1% BSA por 2 h a temperatura
ambiente. Amostras e o padrão de TNF-α, IL-10 e IL-12 foram adicionadas
nas placas e incubadas por 24 horas. As placas foram lavadas com PBS-
T20 e os anticorpos biotinilados específicos para cada citocina foram
adicionados. Após 1 hora, as placas foram lavadas mais 4 vezes com PBS-
T20, o conjugado avidina-peroxidase segundo as especificações do
fabricante (PeproTech) foi adicionado em cada poço e as placas foram
incubadas por mais 30 minutos. As placas foram lavadas com PBS-T20
mais 4 vezes e incubadas com 0,4 mg/ml do subtrato OPD (o-
fenilenediamina-dihidrocloreto, Sigma) em tampão citrato pH 5,0. Após 20
minutos, a reação foi interrompida com HCl 1N e a densidade ótica (DO)
foi quantificada a 490nm em espectrofotômetro (Spectra Max-250,
Molecular Devices).
3.7- Citometria de Fluxo (FACS)
A caracterização fenotípica das células foi realizada através da
marcação com anticorpos monoclonais conjugados a moléculas
fluorescentes. Para isto, as células das culturas obtidas conforme explicado
no item 5 foram coletadas, centrifugadas a 400 rcf por 8 minutos e
ressuspensas em tampão de FACS (PBS, 1%BSA, 0,1% azida sódica) .
Para marcação da superfície, 10
6
células foram incubadas com anti-
CD16/CD32 (B&D Pharmingen) para bloqueio do receptor para Fc por 15
minutos a 4°C. Foram adicionados os anticorpos anti-TLR2-Pe, anti-IA
b
-
FITC (anti MHCII de animais C57BL/6), anti-CD80-FITC e anti CD11c-
Cy5 (B&D Pharmingen) por 20 minutos a 4°C no escuro (as concentrações
dos anticorpos utilizadas em todas as marcações foram as sugeridas pelo
fabricante). As células foram lavadas uma vez em tampão de FACS e
adquiridas no FACSCalibur (CellQuestTM software; Becton and
Dickinson, Mountain View, CA). Os dados foram analisados no programa
FCS Express V 3.00. Para a análise, a população de BMDCs foi
selecionada em uma região correspondente a população mais freqüente
pelos parâmetros tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) a qual
chamaremos de gate. Após a seleção das células neste primeiro gate,
utilizamos um segundo gate de células CD11c
+
como critério de seleção.
As expressões de IA
b
, CD80 ou TLR2 foram analisadas por histogramas
apenas nas células presentes na interseção dos dois gates.
3.8- Ensaio de fagocitose
O ensaio de fagocitose foi realizado através da adição de 10
9
/ml
partículas de látex fluorescentes, marcadas com fluoresceina (FITC),
(Polysciences,) por poço contendo 2.10
5
BMDCs obtidas conforme descrito
no item 5. As células foram incubadas na presença do látex a 37ºC com
uma atmosfera de 5% de CO2 por 30 minutos. Após este período, as
células foram lavadas 2 vezes com tampão de FACS gelado, para
interromper o processo de fagocitose e remover as partículas de látex não
internalizadas. As células foram ressuspendidas em tampão de FACS e
incubadas com anti-CD16/CD32 (B&D Pharmingen) para bloqueio do
receptor para Fc por 15 minutos a 4°C. Foram adicionados o anticorpos
monoclonais anti-CD11c-Cy5 (B&D Pharmingen) por 20 minutos a 4°C no
escuro (as concentrações dos anticorpos utilizadas em todas as marcações
foram as sugeridas pelo fabricante). As células foram lavadas mais uma vez
em tampão de FACS e ressuspensas no mesmo tampão e adquiridas no
FACSCalibur (CellQuestTM software; Becton and Dickinson, Mountain
View, CA). Os dados foram analisados no programa FCS Express V 3.00.
Para a análise, a população de BMDCs foi selecionada em um gate pelos
parâmetros FSC e SSC e em um segundo gate de células CD11c
+
.
Fluorescência do látex foi lida no canal FL1-H e foi analisada por
histogramas apenas nas células presentes na interseção dos dois gates.
3.9- Análise estatística
Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente através do
teste Logrank Qui-quadrado para curvas de sobrevivência no programa
Grafh Pad prism 4. Os valores obtidos foram representados pela media e
pelo erro padrão da média e foram comparados pelo teste t-Student
realizado no mesmo programa. Foram consideradas diferenças
significativas os valores de p < 0,05.
4- Resultados
4.1-Sobrevida de animais C57BL/6 e TLR2-/- ao CLP
Primeiramente, comparamos a sobrevida de animais selvagem e
TLR2
-/-
quando submetidos ao CLP para a indução de uma sepse grave (9
furos, com uma agulha de 21 G) ou ao procedimento controle de
laparotomia sem ligação ou perfuração sham. Os animais receberam
antibioticoterapia 5, 24 e 48hrs após o procedimento e tiveram sua
sobrevida acompanhada por 15 dias. Não foi observada diferença estatística
entre as curvas de sobrevivência dos grupos C57BL/6 e TLR2
-/-
CLP
(Figura 8). Os grupos sham não apresentaram mortalidade.
A mortalidade observada nos animais selvagens submetidos ao CLP
foi a esperada para este modelo de acordo com os dados da literatura, com
40% de mortalidade na fase inicial até o terceiro dia (BENJAMIM et al.,
2003). Diferente dos animais selvagens, os nocautes de TLR2 apresentaram
aproximadamente a mesma mortalidade até o oitavo dia, sugerindo um
prolongamento da fase inicial da sepse até este período, embora, como já
dito, a diferença estatística entre as duas curvas de sobrevivência não seja
significativa. A partir deste dado, resolvemos adotar o dia 15 para nossos
estudos de imunossupressão por ser um dia em que os animais não
apresentam mais mortalidade ou sinais de fase aguda e por se encontrar
dentro de um período no qual já foi descrito o quadro de imunossupressão
para este modelo de CLP (BENJAMIM et al., 2005; WEN et al., 2008).
0 3 6 9 12 15
0
25
50
75
100
CLP B6
Sham B6
CLP TLR2
Sham TLR2
Dias
% de sobrevida
Figura 8- Sobrevida de animais C57BL/6 e TLR2
-
/
-
submetidos ao CLP.
Animais C57BL/6 e TLR2
-/-
foram submetidos ao modelo CLP para a indução
de uma sepse grave (9 furos, com uma agulha de 21G) ou ao procedimento
controle de laparotomia sem ligação ou perfuração sham
. Estes receberam
antibio
ticoterapia 5, 24 e 48hrs após o procedimento e tiveram sua sobrevida
acompanhada por 15dias (n=21 para o grupo C57BL/6 CLP,
n=18 para o
grupo TLR2
-/-
CLP e n=11 para os grupos sham C57BL/6 e TLR2
-/-
). Não foi
observada diferença estatística entre os grupos CLP C57BL/6 e TLR2
-/-
.
Comparando-se os grupos sham
e CLP tanto para os selvagens como para os
nocaute foi observada diferença com p< 0,05.
4.2- Aumento de expressão de TLR2 em BMDCs de animais CLP
Em seguida analisamos a expressão do TLR2 nas BMDCs obtidas a
partir de animais selvagens 15 dias após o CLP. As células obtidas e
purificadas segundo descrito na metodologia foram submetidas à análise
por citometria de fluxo. Selecionou-se uma primeira região gate contendo a
população homogênea mais frequente na cultura, em gráfico do tipo “Dot
Plot” de tamanho (FSC) x granulosidade (SSC) e, em um segundo gate, a
população positiva para a expressão de CD11c, conforme mostrado na
figura 9 a e b.
A pureza de células CD11c
+
obtidas após o gradiente foi de 60%, a
mesma obtida no trabalho que utiliza estas células como terapia para
reversão da imunossupressão (BENJAMIM et al., 2005).
A partir destes gates, analisamos a população de células dendríticas
CD11c
+
para a expressão de TLR2 em sua superfície e observamos um
aumento da expressão deste receptor nas BMDCs estimuladas com LPS ou
Pam
3
Cys do grupo CLP em comparação ao sham (Figura 9c).
Figura 9-Aumento da expressão de TLR2 nas BMDCs de animais sham e CLP. As
BMDCs foram obtidas a partir de animais selvagens sham e CLP, com 15 dias de
cirurgia. Após a diferenciação in vitro e a purificação, as células foram plaqueadas e
estimuladas com LPS (1µg/ml ), Pam
3
Cys (25µg/ml) ou meio (controle) por 24 hrs.
Após este período as células foram marcadas e analisadas por citometria de fluxo. (A)
As células foram selecionadas em um “Dot Plot” de tamanho FSC x granulosidade SSC.
(B) Um segundo gate foi feito a partir das células do gate 1 que expressavam CD11c.
(C) A expressão de TLR2, analisada nas células localizadas na interseção dos dois gates
estava aumentada no grupo CLP em comparação ao sham para os grupos estimulados
com LPS ou Pam
3
Cys. O grupo controle sem estímulo (SE) recebeu adição do volume
correspondente ao estímulo de meio RPMI. A linha vermelha corresponde ao grupo
CLP e a preta ao sham. Esse experimento é representativo de 2 experimentos
independependentes.
A
B
TLR2
SE LPS Pam
3
Cys
C
4.3- Expressão de MHCII pelas BMDCs de animais sham e CLP
em animais selvagens e TLR2
-/-
Com objetivo de avaliar a ativação das BMDCs de animais selvagens
e TLR2
-/-
submetidos ao CLP e sham operados frente a um estímulo
secundário, comparamos a expressão de moléculas marcadoras de ativação
na superfície destas células. Nos animais selvagens foi observada uma
discreta redução na expressão de MHCII no grupo CLP em comparação ao
sham tanto nos grupos estimulados in vitro com LPS ou Pam
3
Cys como no
grupo sem estímulo. Nas BMDCs dos animais nocaute, também foi
observada uma redução de expressão de MHCII no grupo CLP em
comparação ao sham sem estímulo, entretanto para o grupo estimulado com
LPS foi observado um aumento da expressão desta molécula no grupo CLP
em comparação ao sham. Na figura 10 temos os histogramas de um
experimento representativo que compara a expressão de MHCII entre
animais sham e CLP. As intensidades médias de fluorescêcia (MFIs) para
grupos selvagens para este experimento foram: sham= 31,18 e CLP= 24,99
para os grupos estimulados com LPS; sham= 30,1 e CLP= 21,38 para os
grupos estimulados com Pam
3
Cys e sham= 33,81 e CLP= 21,25 para os
controles não estimulados. Nos animais TLR2
-/-
, as MFIs para os grupos
estimulados com LPS foram sham= 31,04 e CLP= 41,21. Para os grupos
sem o estímulo (grupo controle), as MFIs foram sham= 39,58 e CLP=
28,41.
Figura 10 – Expressão de MHCII na superfície de BMDCs de animais sham e CLP.
Foram obtidas BMDCs a partir de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
, sham e CLP, com 15
dias de cirurgia. Após a diferenciação in vitro e a purificação , as células foram
plaqueadas e estimulas com LPS (1µg/ml ), Pam
3
Cys (25µg/ml) ou meio (controle) por
24 hrs. Após este período as células foram marcadas e analisadas por citometria de
fluxo. As células foram selecionadas como na figura anterior e analisadas para a
expressão de MHCII, a linha vermelha corresponde ao grupo CLP e a preta ao sham.
SE= controle sem estímulo.
Esse experimento é representativo de 2 experimentos
independependentes.
sham
CLP
LPS Pam
3
Cys SE
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
16
32
48
64
MFIs: 31,18
24,99
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
23
46
69
92
MFIs: 30,1
21,38
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
13
25
38
50
MFIs: 33,81
21,25
C57BL/6
TLR2-/-
MHCII
LPS SE
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
14
28
41
55
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
7
14
20
27
MFIs: 39,58
28,41
MFIs: 31,04
41,21
4.4- Comparação da expressão de MHCII entre animais
C57BL/6 e TLR2
-/-
Para melhor analisar a importância do TLR2 nas alterações de
expressão de MHCII em animais sham e CLP, re-analisamos os dados do
experimento mostrados no ítem anterior, comparando a expressão desta
molécula entre BMDCs de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
nos grupos sham e
CLP. Primeiramente observamos uma tendência a um aumento de
expressão desta molécula nos nocautes em comparação aos selvagens tanto
no grupo sham como no CLP não estimulados. Nos grupos estimulados
com LPS, não foi observada diferença de expressão para os sham,
entretanto, no grupo CLP, foi observado uma maior de expressão de
MHCII nas células provenientes de animais nocaute em relação às dos
selvagens. Não foram observadas diferenças na expressão de MHCII nos
grupos sham, estimulados com LPS entre BMDCs de animais C57BL/6 e
TLR2
-/-
. Os histogramas comparativos da expressão de MHCII pelas
BMDCs de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
de um experimento representativo
podem ser observados na figura 11.
C57BL/6
TLR2-/-
sham
CLP
MHCII
MFIs: 24,99
41,21
MFIs: 21,25
28,41
SE LPS
MFIs: 31,18
31,04
MFIs: 33,81
39,58
Figura 11-
Comparação da expressão de MHCII entre animais C57BL/6 e
TLR2
-/-
. BMDCs de animais sham e CLP, com 15 dias de cirurgia,
foram obtidas
a partir de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
e comparadas para a expressão de MHCII
entre os grupos selvagem e nocaute. Após a diferenciação in vitro e a purificação
,
as células foram plaqueadas e estimulas com LPS (1µg/ml), Pam
3
Cys (25µg/ml)
ou me
io (controle) por 24 hrs. Após este período as células foram marcadas e
analisadas por citometria de fluxo. As células foram selecionadas em um Dot Plot
de tamanho x granulosidade e em um segundo gate
para as células que
expressavam CD11c e analisadas para
a expressão de MHCII, a linha azul
corresponde ao grupo TLR2KO e a preta ao C57BL/6. SE= controle sem
estímulo. Esse experimento é representativo de 2 experimentos
independependentes.
4.5- Expressão de CD80 pelas BMDCs de animais sham e CLP
em animais selvagens e TLR2
-/-
Com o mesmo objetivo de verificar a maturação das BMDCs frente a
um estímulo secundário com LPS ou Pam
3
Cys, avaliamos também a
expressão da molécula coestimulatória CD80 na superfície das BMDCs dos
grupos sham e CLP de animais selvagens e deficientes em TLR2. Nas
células provenientes dos animais selvagens foi observada uma discreta
redução desta molécula no grupo CLP em comparação ao sham quando
estimuladas com LPS. Entretanto, nos grupos estimulados com Pam
3
Cys ou
sem estímulo não foram observadas diferenças com relação à expressão
desta molécula. Nas células provenientes dos animais nocaute observamos
um aumento de expressão desta molécula no grupo CLP em comparação ao
sham quando estimulados com LPS, enquanto para o grupo sem estímulo
não foram observadas diferenças. Os histogramas comparativos da
expressão de CD80 pelas BMDCs de animais sham e CLP de um
experimento representativo podem ser observados na figura 12. As MFIs
para grupos selvagens neste experimento foram: sham= 57,31 e CLP=
36,82 para os grupos estimulados com LPS; sham= 38,43 e CLP= 29,69
para grupos estimulados com Pam
3
Cys e sham= 29,28 e CLP= 26,05 para
os controles não estimulados. Nos animais TLR2-/-, as MFIs para os
grupos estimulados com LPS foram sham= 38,96 e CLP= 47,63. Para os
grupos sem o estímulo (grupo controle), as MFIs foram sham= 25,43 e
CLP= 29,04.
Figura 12- Comparação da expressão de CD80 entre animais C57BL/6 e TLR2
-/-
.
BMDCs de animais sham e CLP, com 15 dias de cirurgia, foram obtidas a partir de
animais C57BL/6 e TLR2
-/-
e comparadas para a expressão de CD80 entre os grupos
selvagem e nocaute. Após a diferenciação in vitro e a purificação , as células foram
plaqueadas e estimulas com LPS (1µg/ml ), Pam
3
Cys (25µg/ml) ou meio (controle SE)
por 24 hrs. Após este período as células foram marcadas e analisadas por citometria de
fluxo. As células foram selecionadas em um Dot Plot de tamanho x granulosidade e em
um segundo gate para as células que expressavam CD11c e analisadas para a expressão
de CD80. A linha azul corresponde ao grupo TLR2KO e a preta ao C57BL/6. Esse
experimento é representativo de 2 experimentos independependentes.
CD80
C57BL/6
TLR2-/-
LPS Pam
3
Cys SE
MFIs: 57,31
36,82
MFIs: 38,43
29,69
MFIs: 29,28
26,05
LPS SE
MFIs: 38,96
47,63
MFIs: 25,43
29,04
sham
CLP
4.6- Comparação da expressão de CD80 entre animais C57BL/6 e
TLR2
-/-
Para comparar a maturação das BMDCs frente a um estímulo
secundário, de maneira dependente da expressão do TLR2, re-analisamos
os dados do experimento mostrados no ítem anterior comparando a
expressão da molécula coestimulatória CD80 entre BMDCs de animais
C57BL/6 e TLR2
-/-
nos grupos sham e CLP. Nesta análise, observamos
primeiramente uma maior expressão desta molécula nas células dos
nocautes em relação às dos selvagens nos grupos CLP. Esta diferença é
mais evidente no grupo estimulado com LPS, embora também tenha sido
observado no grupo não estimulado. Para o grupo sham, foi observado que
o nocaute expressa níveis inferiores de CD80 em relação ao selvagem
quando ambos são estimulados com LPS, não tendo sido observadas
diferenças de expressão desta molécula entre nocaute e selvagem no grupo
sham, sem estímulo. Os histogramas comparativos da expressão de CD80
pelas BMDCs de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
de um experimento
representativo podem ser observados na figura 13.
Figura 13- Comparação da expressão de CD80 entre animais C57BL/6 e TLR2
-
/
-
.
BMDCs de animais sham
e CLP, com 15 dias de cirurgia, foram obtidas a partir de animais
C57BL/6 e TLR2
-/-
e comparadas para a expressão de CD80 entre os grupos selvagem e
nocaute. Após a diferenciação in vitro
e a purificação , as células foram plaqueadas e
estimuladas com LPS (1µg/ml ), Pam
3
Cys (25µg/ml) ou meio (SE= controle sem estímulo
) por
24 hrs. Após este período as células foram marcadas e analisadas por citometria de fluxo. As
células foram selecionadas em um “Dot Plot”
de tamanho x granulosidade e em um segundo
“gate” para as células que expressavam CD11c e analisadas para a expressão de CD80. .
A
linha azul corresponde ao grupo TLR2KO e a preta ao C57BL/6. Esse experimento é
representativo de 2 experimentos independependentes.
47,63
C57BL/6
TLR2-/-
sham
CLP
SE LPS
CD80
MFIs: 26,05
29,04
MFIs: 36,82
47,63
MFIs: 57,31
38,96
MFIs: 29,28
25,43
4.7- Fagocitose pelas BMDCs de animais sham e CLP de animais
C57BL/6 e TLR2-/-
Outro parâmetro utilizado para avaliar diferenças funcionais entre as
BMDCS de animais sham e CLP de animais selvagens e TLR2
-/-
foi a
análise da capacidade fagocítica destas células. Para isto realizamos um
ensaio de fagocitose por citometria de fluxo com látex fluorescente.
Neste ensaio observamos que, tanto para os nocautes como para os
selvagens, as BMDCs provenientes de animais CLP apresentaram uma
melhor capacidade fagocítica tanto nos grupo estimulados como nos sem
estímulo. Os histogramas comparativos da capacidade fagocítica das
BMDCs de animais sham e CLP de um experimento representativo podem
ser observados na figura 14. As MFIs para este experimento para os grupos
selvagens foram: sham= 792,89 e CLP= 1419,98 para os grupos
estimulados com LPS; sham= 798,73 e CLP=1043,14 para os grupos
estimulados com Pam
3
Cys e sham= 564,55 e CLP=651,34 para os
controles não estimulados. Nos animais TLR2-/- , as MFIs para os grupos
estimulados com LPS foram sham= 329,02 e CLP= 886,32. Para os grupos
sem o estímulo (grupo controle), as MFIs foram sham= 264,65 e CLP=
657,14.
Figura 14- Comparação da capacidade fagocítica das BMDCs de animais sham e
CLP. BMDCs obtidas a partir de animais C57BL/6 e TLR2-/- , sham e CLP, com 15
dias de cirurgia foram comparadas com relação a sua capacidade fagocítica. Após a
diferenciação in vitro e a purificação, as células foram plaqueadas e estimuladas com
LPS (1µg/ml ), Pam
3
Cys (25µg/ml) ou meio (SE= controle sem estímulo ) por 24 hrs.
Após este período as placas receberam 10
3
partículas de látex fluorescente/célula e
foram incubadas por mais 30 minutos. Após esse período, as células foram lavadas para
a remoção das partículas não fagocitadas, marcadas e analisadas por citometria de fluxo.
As células foram selecionadas em um gate de tamanho x granulosidade e em um
segundo gate para as células que expressavam CD11c e analisadas para a expressão da
fluorescência do látex, a linha vermelha corresponde ao grupo CLP e a preta ao sham.
Látex
C57BL/6
TLR2-/-
LPS PAM3CYS SE
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
16
32
47
63
MFIs:
792,89
1419,98
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
13
25
38
50
MFIs:
798,73
1043,14
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
9
18
26
35
MFIs:
564,55
651,34
LPS SE
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
6
13
19
25
MFIs:
329,02
886,32
FL1-H
Count
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0
6
13
19
25
MFIs:
264,65
657,14
sham
CLP
4.8- Comparação da capacidade fagocítica das BMDCs em
função da presença de TLR2 nos grupos sham e CLP
Para observar a presença de um possível papel para o TLR2 na
capacidade fagocítica das BMDCs, re-analisamos os dados do experimento
mostrados no ítem anterior, comparando a capacidade fagocítica das
BMDCs entre animais C57BL/6 e TLR2
-/-
. Nestas análises, observamos
que para os grupos sham e CLP estimulados com LPS e para o grupo sham
não estimulado, as células dos animais selvagens apresentaram maior
capacidade fagocítica do que a dos nocautes. Os histogramas comparativos
da capacidade fagocítica pelas BMDCs de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
de
um experimento representativo podem ser observados na figura 15.
C57BL/6
TLR2-/-
SE LPS
sham
CLP
Látex
MFIs:
651,34
657,14
MFIs:
564,55
264,65
MFIs:
792,89
329,02
MFIs:
1419,98
886,32
Figura 15-
Comparação da capacidade fagocítica das BMDCs em função da
presença de TLR2 nos grupos sham e CLP.
BMDCs obtidas a partir de animais
C57BL/6 e TLR2
-/-
, sham
e CLP, com 15 dias de cirurgia foram comparadas com
relação a sua capacidade fagocítica. Após a diferenciação in vitro
e a purificação , as
células foram plaqueadas e estimuladas com LPS (1µg/ml ), Pam
3
Cys (25µg/ml) ou
meio (SE= controle sem estímulo) por 24 hrs.
Após este período as células receberam
5x10
9
part
ículas de látex fluorescente/ml e foram incubadas por mais 30 minutos. Após
esse período, as células foram lavadas para a remoção das partículas não fagocitadas,
marcadas e analisadas por citometria de fluxo. As células foram selecionadas
em um
Dot Plot de tamanho x granulosidade e em um segundo “gate”
para as células que
expressavam CD11c e analisadas para a expressão da fluorescência do látex. A
linha
azul corresponde ao grupo TLR2
-/-
e a preta ao C57BL/6. Esse experimento é
representativo de 2 experimentos independependentes.
4.9-Perfil de produção de TNF-α pelas BMDCs
Para analisar o perfil de citocinas produzido pelas BMDCs obtidas a
partir de animais em um quadro de imunossupressão pós-séptica de
maneira dependente e independente do TLR2, obtivemos estas células a
partir de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
15d após a cirurgia, igualmente aos
experimentos anteriores. As células foram purificadas e estimuladas in
vitro com LPS, Pam
3
Cys ou como controle adicionamos meio. Após 24hrs
o sobrenadante das culturas foi coletado e analisado por ELISA para a
produção citocinas pró e anti-inflamatórias.
Primeiramente observamos a produção de TNF-α. Não foram
observadas diferenças na produção desta citocina entre os grupo sham e
CLP tanto de animais selvagens como dos nocautes estimulados com LPS.
Para os grupos estimulados com Pam
3
Cys, também não foram observadas
diferenças entre sham e CLP nos selvagens. Para as BMDC obtidas de
animais TLR2
-/-
não houve indução da produção desta citocina para o
estímulo com Pam
3
Cys comprovando que os animais são nocautes.
Também não foram observadas diferenças comparando tanto o grupo sham
como o CLP entre os grupos selvagem e nocaute estimulados com LPS.
- - - - + + + +
0
100
200
300
Sham
B6 TLR2 B6 TLR2
Pam3Cys
CLP
B
TNF-
α
α
α
α
pg/ml
- - - - + + + +
0
100
200
300
400
500
600
700
LPS
B6 TLR2 B6 TLR2
†
A
TNF-
α
α
α
α
pg/ml
Figura 16- Produção de TNF-α pelas BMDCs obtidas a partir de animais C57BL/6 e TLR2
-
/
-
durante o quadro de imunossupressão pós-séptica 15d após o CLP. BMDCs foram o
btidas a
partir de animais sham e CLP, C57BL/6 e TLR2-/- , purificadas e estimuladas in vitro
com LPS
(1µg/ml)(A), Pam
3
Cys (25 µg/ml)(B) ou meio de cultura (controle) por 24h. Após
esse período, o
sobrenadante foi coletado e analisado por ELISA para a produção de TNF-α. .
Os resultados foram
expressos como média e erro padrão da média.
Esse experimento é representativo de 2
experimentos independependentes.
4.10 - Produção de IL-10 pelas BMDCs
Analisamos também a produção de IL-10 pelas BMDCs de animais
C57BL/6 e TLR2
-/-
. Observamos uma redução na produção desta citocina
em BMDCs de animais TLR2
-/-
em relação aos C57BL/6 tanto no grupo
sham como no CLP estimulados com LPS. Também foi observada uma
redução na produção de IL-10 no grupo CLP em relação ao sham nas
células dos animais nocaute estimuladas in vitro com LPS. Além disto, foi
observado um aumento na produção de IL-10 pelas BMDCs do grupo CLP
em relação ao sham de animais C57BL/6 quando estimuladas in vitro com
Pam
3
Cys.
Figura 17- Produção de IL-10 pelas BMDCs obtidas a partir de animais C57BL/6 e
TLR2
-/-
durante o quadro de imunossupressão pós-séptica 15d após o CLP.
BMDCs foram obtidas a partir de animais sham e CLP, C57BL/6 e TLR2-/-, purificadas
e estimuladas in vitro com LPS (1µg/ml)(A), Pam
3
Cys (25 µg/ml)(B) ou meio de
cultura (controle) por 24h. Após esse período, o sobrenadante foi coletado e analisado
por ELISA para a produção de IL-10. Os resultados foram expressos como média e erro
padrão da média. (* = P< 0,05 entre sham e CLP para o mesmo grupo de animal com a
mesma condição de estímulo, †= P<0,05 entre TLR2-/- e C57BL/6 para um mesmo
grupo (sham ou CLP), estimulados com LPS. Esse experimento é representativo de 2
experimentos independependentes.
- - - - + + + +
0
100
200
300
400
500
600
700
Sham
B6 TLR2 B6 TLR2
Pam3Cys
CLP
*
B
IL-10 pg/ml
- - - - + + + +
0
250
500
750
1000
1250
LPS
B6 TLR2 B6 TLR2
†
†
*
A
IL-10 pg/ml
4.11 - Produção de IL-12 pelas BMDCs
Com relação à produção de IL-12, foi observada uma redução na
produção desta citocina pelas BMDCs de animais TLR2
-/-
em relação aos
selvagens, tanto no grupo sham como no grupo CLP, estimulados com
LPS. Comparando-se as células dos grupos CLP em relação aos sham,
observamos uma redução na produção desta citocina para os grupos
estimulados com LPS tanto dos animais C57BL/6 como dos TLR2
-/-
. Para
os selvagens ainda foi observada esta redução (CLP em relação ao sham)
para o estímulo com Pam
3
Cys.
- - - - + + + +
0
100
200
300
LPS
2500
2750
3000
3250
3500
†
†
**
B6 TLR2 B6 TLR2
A
IL-12 pg/ml
- - - - + + + +
0
100
200
300
Sham
B6 TLR2 B6 TLR2
Pam3Cys
CLP
**
1000
2000
3000
B
IL-12 pg/ml
Figura 18- Produção de IL-12 pelas BMDCs obtidas a partir de animais
C57BL/6 e
TLR2-/- durante o quadro de imunossupressão pós-séptica
15d após o CLP.
BMDCs foram obtidas a partir de animais sham e CLP, C57BL/6 e TLR2-/-
, purificadas
e estimuladas in vitro com LPS (1µg/ml)(A), Pam3cys (25 µg/ml)(B) ou meio de cultura
(controle) por 24h. Após esse período, o sobrenadante foi coletado e analisado po
r
ELISA para a produção de IL-12. Os resultados foram
expressos como média e erro
padrão da média. (* = P< 0,05 entre sham e CLP para os grupos C57BL/6 ou TLR2-/-
estimulados com LPS, †= P<0,05 entre TLR2-/-
e C57BL/6 para um mesmo grupo
(sham ou CLP), estimulados com LPS, ** = P< 0,01 entre sham e CLP para
animais
C57BL/6 estimulados com Pam3Cys
). Esse experimento é representativo de 2
experimentos independependentes.
5- Discussão
Apesar dos avanços realizados na área de diagnósticos, a sepse não
tem um tratamento adequado, mantendo altos índices de mortalidade
(SILVA et al., 2006). Estima-se que as taxas de mortalidade associadas à
sepse sejam na verdade muito superiores às encontradas na literatura, pois
pacientes recuperados são mandados para casa e não são acompanhados
por longos períodos, exceto em casos em que se realizam estudos
epidemiológicos. Não existem políticas de acompanhamento de pacientes
sépticos a longo prazo visando uma prevenção de doenças associadas à
sepse. Na realidade não existe atualmente nem mesmo algum tipo de
tratamento preventivo, embora seja sabido que pacientes recuperados de
um quadro de sepse apresentam um índice de mortalidade maior do que
aqueles que nunca passaram pelo quadro, por um período de, no mínimo, 5
anos (O'BRIEN et al., 2007). Pacientes sépticos adquirem um desequilíbrio
imunológico heterogêneo que varia não apenas de indivíduo para
indivíduo, mas também ao longo do tempo. A resposta imune individual à
sepse pode ser modulada por uma variedade de fatores como a natureza da
infecção por si só, a composição genética do hospedeiro, morbidades
associadas e a presença de fatores externos como medicações e transfusões
sanguíneas. Sendo assim, pacientes sépticos não formam um grupo
homogêneo, dificultando o desenvolvimento de terapias efetivas, uma vez
que estas, para serem ao máximo eficazes, deveriam ser individualizadas.
Alguns pacientes necessitariam da inibição da resposta inflamatória
enquanto outros, especialmente aqueles que sobreviveram à fase inicial da
sepse, necessitariam de terapias que estimulassem o sistema imune e
restabelecessem a capacidade de desenvolver uma resposta imune efetiva
(WANG e DENG, 2008).
Terapias celulares vem sendo amplamente estudadas em patologias
em que se deseja regular a resposta imune, não apenas adequando-a ao tipo
de resposta que seria o mais eficaz, como também amplificando a resposta
contra o agente causal. Terapias neste sentido com DCs ativadas in vitro
vem sendo utilizadas em estudos com HIV e câncer com resultados
promissores (LU et al., 2004; TATSUTA et al., 2008).
Foi demonstrado que a transferência de BMDCs de animais sadios
para animais imunossuprimidos recupera a resistência destes últimos ao
desafio com patógeno oportunista A. fumigatus (BENJAMIM et al., 2005).
Este trabalho mostra que a imunossupressão pós-sepse também é uma
doença em que o paciente possivelmente se beneficiaria com uma terapia
celular com BMDCs.
No presente trabalho, tivemos como objetivo principal caracterizar
alterações observadas nas BMDCs de animais que se encontram em um
quadro de imunossupressão pós-séptica. Para isto, utilizamos o mesmo
protocolo do estudo citado acima para que pudéssemos trabalhar com a
população de BMDCs que apresentou a capacidade de recuperar o animal
imunossuprimido.
Primeiramente, observamos que as BMDCs provenientes de animais
em um quadro de imunossupressão pós-séptica apresentaram uma maior
expressão de TLR2 na superfície quando estimuladas in vitro.
Considerando que as DCs dos órgãos periféricos, como o pulmão, sofrem
altas taxas de apoptose após a sepse e são repostas a partir da medula
(WEN et al., 2008), estes dados corroboram com os resultados de
Benjamim et al, que demonstrou um aumento de TLR2 nas DCs do pulmão
de animais imunossuprimidos após CLP (BENJAMIM et al., 2005). Em
nossos dados, esse aumento foi visto apenas para os grupos estimulados.
Entretanto, como o pulmão é um órgão em constante contado com o meio
externo (através do ar inspirado) é provável que as DCs do pulmão dos
animais pós-sépticos do referido trabalho, tenham tido contato com
PAMPs. Outros trabalhos também relacionam sepse a um aumento de
expressão de TLRs pelas células do sistema imunitário. Em um destes
trabalhos, o aumento da expressão dos TLR 2 e 4 em órgãos como o
pulmão, o fígado e o baço foi correlacionado a um aumento da mortalidade
na fase aguda da sepse em camundongos submetidos ao CLP (WILLIAMS
et al., 2003). Em outro trabalho, foi observado um aumento da expressão
destes mesmos receptores em polimorfonucleares e mononucleares
derivados do sangue periférico de pacientes sépticos (HARTER et al.,
2004). Além disto, foi relatado um aumento de expressão de TLR2 na
superfície de monócitos de pacientes com choque superantigênico
(HOPKINS et al., 2008).
Nossos dados mostram que células precursoras da medula óssea de
animais pós-sépticos induzidas a se diferenciarem em DCs in vitro,
aumentam a expressão de TLR2 quando estimuladas com LPS ou
Pam
3
Cys. Este fato nos sugere que a sepse promove alterações nos
precursores leucocitários na medula óssea, que se mantém a longo prazo,
mesmo após o processo de diferenciação das células do sistema imunitário.
Isto explicaria a deficiência observada na resposta imune durante a fase
tardia da sepse. Entretanto, mais estudos são necessários para se
caracterizar as alterações induzidas nestes precurssores durante a sepse e as
conseqüências dessas alterações a longo prazo.
Recentemente, foi demonstrado que DCs de baço de animais
submetidos ao CLP grave, apresentam, numa fase tardia, alterações
epigenéticas responsáveis pela redução da produção de IL-12. Este fato
pode justificar a polarização da resposta para o perfil Th2 observada
durante o quadro de imunossupressão pós-séptica (WEN et al., 2008).
Durante a sepse, ocorre intensa depleção de células do sistema imunitário
nos órgãos periféricos por apoptose, estas células são repostas a partir de
células precursoras da medula. A partir destes dados, o autor elabora a
hipótese de que durante o evento séptico, ocorrem alterações epigenéticas
nos precursores leucocitários da medula óssea. Essas alterações podem se
manter a longo prazo e são observadas nas DCs de órgãos periféricos
(WEN et al., 2008). Essa teoria, esquematizada na figura 19, explicaria as
alterações nas BMDCs de animais pós-sépticos por nós observadas.
Figura19 - Esquema das alterações nas DCs periféricas mantidas a longo prazo
após um quadro de sepse grave. Durante a sepse ocorre uma depleção de DCs no baço
e no pulmão. Novas células chegam da medula para repovoar os órgãos, possívelmente
já carregando alterações epigenéticas. Na periferia, ao encontrar um novo desafio
(patógeno) essas células respondem de maneira alterada produzindo mais citocinas
relacionadas a um padrão Th2 como IL-10 e IL-13 e menos citocinas relacionadas a um
padrão Th1 como a IL-12. Essas alterações são características da imunossupressão pós-
sepse grave. Figura retirada de Wen et al., 2008
.
Para verificarmos se o TLR2 apresenta algum papel nas alterações a
longo prazo observadas nas DCs de animais pós-sépticos, passamos a
utilizar animais TLR2
-/-
, submetidos ao CLP, para a obtenção destas
células.
Primeiramente, observamos que os animais TLR2
-/-
apresentaram um
percentual de sobrevida ao CLP semelhante ao dos selvagens. Esses dados
estão de acordo com os dados de Weighardt et al. para o modelo de CASP
(WEIGHARDT et al., 2002).
Nos experimentos com os nocautes, observamos a capacidade destas
BMDCs em se ativarem frente a um estímulo secundário com ligantes de
TLRs. Para isto, comparamos a expressão das moléculas associadas à
apresentação antigênica MHCII e CD80, na superfície das BMDCs de
animais nocautes para TLR2 ou selvagens, previamente submetidos ao
CLP e seus controles sham após essas células serem estimulas in vitro de
maneira dependente e independente de TLR2.
Nestas análises, observamos que as BMDCs de animais selvagens
submetidos ao CLP apresentaram características de células menos ativadas,
visto a redução na expressão de MHCII, mesmo quando estimuladas in
vitro com LPS ou Pam
3
Cys. Nas BMDCs proveniente de animais TLR2
-/-
também foi observada uma redução de expressão desta molécula no grupo
CLP em relação ao grupo sham não estimulado. Entretanto, quando
estimuladas com LPS, as BMDCs do grupo CLP de animais TLR2
-/-
apresentaram uma maior capacidade de ativação aumentando a expressão
de MHCII e da molécula co-estimulatória CD80. Além disto, comparando-
se as BMDCs de animais nocautes e selvagens no grupo CLP, observamos
um aumento de expressão de MHCII e CD80 nas BMDCs dos TLR2
-/-
em
relação as dos C57BL/6 após a estimulação com LPS, mostrando que as
BMDCs de animais TLR2
-/-
foram mais capazes de maturar frente a um
desafio secundário com LPS do que as obtidas a partir de um animal
selvagem. Em conjunto, estes dados sugerem um papel do TLR2 nas
alterações celulares durante a sepse que perduram por um período
indeterminado. Este fenômeno inclui alterações nas células precursoras da
medula óssea que, mesmo após a sua diferenciação, mantém este perfil
alterado, conforme foi demonstrado em nosso estudo para as células
dendríticas derivadas de medula.
Outro parâmetro por nós avaliado foi a capacidade fagocítica das
BMDCs de animais submetidos ao CLP ou sham operados de maneira
dependente ou independente de TLR2. Observamos uma redução da
capacidade fagocítica das BMDCs de animais TLR2
-/-
em relação às células
dos animais selvagens tanto no grupo sham como no CLP, sugerindo um
papel para o TLR2 na fagocitose pelas BMDCs. Além disto, observamos
um aumento da capacidade fagocítica das BMDCs dos grupos CLP em
relação as dos sham. Nas BMDCs de animais selvagens, esse aumento foi
mais evidente nos grupos estimulados com LPS ou Pam
3
Cys. Entretanto,
este fato não parece ter relação com a expressão do TLR2, uma vez que
verificamos igualmente um aumento da capacidade fagocítica do grupo
CLP em relação ao sham nas BMDCs de animais TLR2
-/-
. Alguns trabalhos
na literatura estabelecem correlações entre sinalização via TLRs e
fagocitose. Em um destes trabalhos, foi mostrado que ligantes de TLRs
aumentaram a fagocitose de Escherichia coli e Staphylococcus aureus em
cultura por macrófagos murinos e humanos. Neste trabalho, foi mostrada a
indução da expressão de receptores do tipo “scavenger” (relacionados à
fagocitose), via ativação de TLRs, na superfície de macrófagos através de
um mecanismo dependente de MyD88, IRAK4 e p38. É sugerido pelo
autor que este seja um mecanismo evolutivamente bastante conservado,
tendo sido observado em camundongos e humanos, sugerindo que essa via
seja importante na eliminação de bactérias. Neste mesmo trabalho, após
infecção, vários TLRs promoveram a fagocitose através da indução da
expressão de genes relacionados com o potencial fagocítico destas células
como os gens sr-a, lox-1 e marco. O TLR9 foi o TLR mais eficiente nesta
indução, seguido pelo TLR2, e pelo TLR7. Os TLRs 4 e 3 foram os mais
fracos nesta indução (DOYLE et al., 2004). Em outro trabalho, o papel dos
TLRs 2 e 4 foi avaliado para a fagocitose de conídios de Aspergillus
fumigatus por macrófagos murinos da linhagem celular J774, e de
macrófagos álveolares murinos das linhagens C3H/HeN (TLR4
+/+
e
TLR2
+/+
), C3H/HeJ (TLR2
+/+
e TLR4
d/d
) e C3H/HeJ TLR2
-/-
(TLR2
-/-
e
TLR4
d/d
). Neste trabalho foi observado que a ausência do TLR2 funcional,
mas não do TLR4, leva a uma redução na fagocitose dos conídios
(LUTHER et al., 2007). Também foi sugerido um papel para os receptores
TLR2 e TLR3 na fagocitose de promastigotas de L. donovani por
macrófagos da linhagem celular murina RAW 264.7. Neste modelo, as
células foram silenciadas para a expressão de TLR2 ou TLR3, através de
iRNA e primadas com INF-γ antes da interação com os parasitas, e em
ambos os casos houve uma redução significativa da internalização dos
parasitas (FLANDIN et al., 2006). Nossos dados estão de acordo com os
trabalhos acima relacionados e sugerem um papel para o TLR2 na
fagocitose também pelas BMDCs uma vez que nas células dos animais
TLR2
-/-
foi observada uma redução da capacidade fagocítica. Em nossos
experimentos, utilizamos esferas de látex inertes juntamente ou não com
ligantes de TLRs. Um fato interessante é que mesmo nos grupos que não
receberam os ligantes, foi observada a redução da capacidade fagocítica
nos nocautes. Isto possivelmente se explica pelo fato de estas células terem
tido contato com PAMPs enquanto precursoras na medula óssea.
Para melhor caracterizar os diferentes perfis de ativação das BMDCs
obtidas a partir de animais em um quadro de imunossupressão pós-séptica
de maneira dependente e independente do TLR2, analisamos a produção de
citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α e a IL-12 e anti-inflamatórias
como a IL-10.
Os níveis de TNF-α foram semelhantes nos grupos sham e CLP
estimulados in vitro com LPS ou Pam
3
Cys nas BMDCs tanto de animais
selvagens como dos nocautes. Com relação aos níveis de IL-10, nossos
dados corroboram com a presença de um papel para o TLR2, durante a
sepse, participando de um cenário que leva à geração de células dendríticas
alteradas. Este papel se evidencia a partir da observação de que na ausência
deste receptor durante o evento séptico, geramos células que, após um
estímulo secundário com um ligante de outro TLR (LPS), apresentam uma
redução na produção de IL-10. Além disto, este receptor participa também
da resposta na fase tardia, pois o estímulo das BMDCs do animal selvagem
com o seu ligante específico (Pam
3
Cys) mostrou um aumento da
capacidade das BMDCs do grupo CLP em produzir essa citocina, a qual
sabidamente pode exercer uma função regulatória, em relação ao sham.
Com relação aos níveis de IL-12 observamos primeiramente uma
redução na produção desta citocina nos grupos CLP em relação aos sham
estimulados com LPS ou Pam
3
Cys. Estes dados estão de acordo com os
dados encontrados na literatura que mostram uma deficiência na produção
desta citocina relacionada à polarização da resposta para o perfil Th2 na
imunossupressão pós-séptica. Em um destes trabalhos, a redução da
produção desta citocina por DCs periféricas foi observada até pelo menos 6
semanas após o CLP (WEN et al., 2008). É interessante ressaltar que neste
trabalho foi utilizado o mesmo modelo de CLP grave (9 perfurações com
uma agulha de 21G) utilizado por nós no presente trabalho. Além disto,
observamos uma redução na produção desta citocina nos animais nocaute
sham e CLP, estimulados com LPS em comparação com o animal
selvagem. Esses dados sugerem que diferentemente de nossa hipótese
inicial, o TLR2 não parece contribuir para a polarização da resposta para
um perfil Th2, pelo menos com relação à redução da produção de IL-12.
Entretanto, este receptor parece apresentar um papel importante tanto na
ativação das BMDCs como no aumento de produção de IL-10, a mais
clássica citocina supressora, por estas células durante a imunossupressão
pós–séptica.
O aumento de produção de IL-10 e a redução da produção de IL-12
são fatos relacionados à fase tardia da sepse (BENJAMIM et al., 2005;
WEN, et al. 2006). Trabalhos na literatura reportam um papel para a IL-10
na redução da produção de IL-12 in vivo e in vitro (MOORE et al., 2001;
ZHOU et al., 2004). Entretanto, foi demonstrado que na imunossupressão
pós-séptica essa redução não se dá devido ao aumento da IL-10, pois DCs
esplênicas obtidas a partir de animais em uma fase tardia de sepse
produziram menos IL-12 quando estimuladas com LPS mesmo na presença
de anticorpos bloqueadores da IL-10. Neste trabalho, a redução da
produção de IL-12 observada nas DCs na fase tardia da sepse foi
relacionada a alterações epigenéticas (WEN et al., 2008).
Em conjunto, nossos dados sugerem um papel para o TLR2 expresso
durante a fase inicial da sepse na composição de um cenário que gera
alterações nas células precursoras da medula. Entretanto, não sabemos
ainda se esse mecanismo ocorre de maneira direta, através da sinalização
via TLR2 nas próprias células da medula, ou indireta, através da
sinalização de células do sistema imunitário na periferia, que ativadas na
presença do TLR2 possivelmente liberam mediadores de maneira sistêmica
que podem estar atuando nas células precursoras na medula, contribuindo
para sua alteração. Essas alterações são mantidas por um período
indeterminado mantendo-se inclusive após a diferenciação destas células
em células dendríticas. Já foi demonstrado que essas células dendríticas
alteradas apresentam um papel importante na imunossupressão pós-sepse
grave (BENJAMIM et al. 2005; WEN et al. 2008). A partir da
determinação de um papel para o TLR2 no cenário responsável pelas
alterações das DCs durante a sepse, trabalhamos com uma nova hipótese de
que a resposta induzida pelas BMDCs de animais TLR2
-/-
apresenta um
perfil de resposta diferente da dos selvagens, conforme esquematizado na
figura 20, possivelmente mais adequado no combate a desafios
secundários. Entretanto, mais experimentos são necessários para verificar
esta hipótese, como a caracterização do perfil de resposta “T helper”
induzido por essas BMDCs alteradas, e a eficácia do combate a patógenos
oportunistas ou mesmo a células tumorais em modelos experimentais de
desafios secundários em animais TLR2
-/-
durante a imunossupressão pós-
sepse.
Se esta hipótese for confirmada, possivelmente uma estratégia
interessante para a prevenção da imunossupressão pós-sepse poderia ser
idealizada a partir do desenvolvimento de antagonistas do TLR2, que
poderiam ser utilizados durante a fase aguda da sepse, previnindo essas
alterações.
Figura 20- Alterações das BMDCs na imunossupressão pós-sepse induzidas em um
cenário sem o TLR2. BMDCs de animais TLR2
-/-
em um quadro de imunossupressão
pós-séptica apresentaram fenótipo diferente das observadas em BMDCs de animais
selvagens, como o aumento de expressão de MHCII, CD80, e uma redução da produção
de IL-10 e IL-12 frente a um estímulo secundário com LPS. Entretando ainda não
sabemos o que esperar da resposta induzida neste novo cenário de sepse tardia.
SEPSE
DCs ALTERADAS
ÓRGÃOS PERIFÉRICOS
ESTÍMULO
(LPS)
ALTERAÇÔES NA
M.O.
REPOVO
AMENTO
COM CÉLULAS
DA M.O.
CONTROLE DE
DESAFIOS
SECUNDÁRIOS?
IL-10, IL-12
PARTICIPAÇÃO DO
TLR2
MHCII, CD80
PERFIL DE RESPOSTA
“T HELPER” INDUZIDA ?
6- Conclusões
1- Animais TLR2
-/-
e C57BL/6 apresentaram taxas de mortalidade ao
CLP equiparáveis.
2- BMDCs de animais CLP apresentaram maior expressão de TLR2
em sua superfície quando estimuladas in vitro com Pam
3
Cys ou LPS.
3- BMDCs do grupo CLP de animais TLR2
-/-
apresentaram uma
melhor capacidade em maturar frente a um desafio secundário com LPS,
aumentando a expressão de MHCII e CD80 na superfície em comparação
com as BMDCs do mesmo grupo para animais C57BL/6.
4- BMDCs animais C57BL/6 apresentaram melhor capacidade
fagocítica comparadas às BMDCs de animais TLR2
-/-
.
5- BMDCs de animais C57BL/6 e TLR2
-/-
, sham e CLP produziram
quantidades equiparáveis de TNF-α quando estimuladas com LPS.
6- BMDCs de animais TLR2
-/-
produziram menos IL-10 comparadas
às BMDCS de animais C57BL/6 tanto no grupo sham como no CLP
estimulados com LPS.
7- Também foi observada uma redução na produção de IL-10 no
grupo CLP em relação ao sham nas células dos animais nocaute
estimuladas in vitro com LPS.
8- BMDCs de animais C57BL/6 do grupo CLP produziram mais IL-
10, comparadas ao sham, quando estimuladas in vitro com Pam
3
Cys.
9- BMDCs de animais TLR2
-/-
produziram menos IL-12 em relação
aos selvagens, tanto no grupo sham como no grupo CLP, estimulados com
LPS.
10- BMDCS dos grupos CLP produziram menos IL-12 em relação
aos sham, tanto para os grupos dos animais C57BL/6 como dos TLR2
-/-
estimulados com LPS. Para os selvagens ainda foi observada esta redução
(CLP em relação ao sham) para o estímulo com Pam
3
Cys.
6.2-Conclusão geral
Em conjunto, nossos dados sugerem um papel para o TLR2 expresso
durante a fase inicial da sepse na composição de um cenário que gera
alterações nas células precursoras da medula. Essas alterações são mantidas
por um período indeterminado mantendo-se inclusive após a diferenciação
destas células em células dendríticas.
Além disto, o TLR2 apresentou também um papel na fase tardia da
sepse modulando a produção da citocina anti-inflamatória IL-10.
7- Referências Bibliográficas
Agrawal, S., A. Agrawal, et al. (2003). "Cutting Edge: different toll-like receptor
agonists instruct dendritic cells to induce distinct Th responses via differential
modulation of extracellular signal-regulated kinase-mitogen-activated protein
kinase and c-Fos." J Immunol 171(10): 4984-9.
Akira, S., K. Takeda, et al. (2001). "Toll-like receptors: critical proteins linking innate
and acquired immunity." Nat Immunol 2(8): 675-80.
Angus, D. C., W. T. Linde-Zwirble, et al. (2001). "Epidemiology of severe sepsis in the
United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care." Crit
Care Med 29(7): 1303-10.
Banchereau, J. and R. M. Steinman (1998). "Dendritic cells and the control of
immunity." Nature 392(6673): 245-52.
Barton, G. M. and R. Medzhitov (2002). "Control of adaptive immune responses by
Toll-like receptors." Curr Opin Immunol 14(3): 380-3.
Benjamim, C. F., C. M. Hogaboam, et al. (2003). "Septic mice are susceptible to
pulmonary aspergillosis." Am J Pathol 163(6): 2605-17.
Benjamim, C. F., S. K. Lundy, et al. (2005). "Reversal of long-term sepsis-induced
immunosuppression by dendritic cells." Blood 105(9): 3588-95.
Bone, R. C. (1994). "Sepsis and its complications: the clinical problem." Crit Care Med
22(7): S8-11.
Campos, M. A., I. C. Almeida, et al. (2001). "Activation of Toll-like receptor-2 by
glycosylphosphatidylinositol anchors from a protozoan parasite." J Immunol
167(1): 416-23.
Dinarello, C. A. (2000). "Proinflammatory cytokines." Chest 118(2): 503-8.
Doyle, S. E., R. M. O'Connell, et al. (2004). "Toll-like receptors induce a phagocytic
gene program through p38." J Exp Med 199(1): 81-90.
Echtenacher, B., M. A. Freudenberg, et al. (2001). "Differences in innate defense
mechanisms in endotoxemia and polymicrobial septic peritonitis." Infect Immun
69(12): 7271-6.
Echtenacher, B., K. Weigl, et al. (2001). "Tumor necrosis factor-dependent adhesions as
a major protective mechanism early in septic peritonitis in mice." Infect Immun
69(6): 3550-5.
Fink, M. P. and S. O. Heard (1990). "Laboratory models of sepsis and septic shock." J
Surg Res 49(2): 186-96.
Flandin, J. F., F. Chano, et al. (2006). "RNA interference reveals a role for TLR2 and
TLR3 in the recognition of Leishmania donovani promastigotes by interferon-
gamma-primed macrophages." Eur J Immunol 36(2): 411-20.
Flohe, S. B., H. Agrawal, et al. (2006). "Dendritic cells during polymicrobial sepsis
rapidly mature but fail to initiate a protective Th1-type immune response." J
Leukoc Biol 79(3): 473-81.
Fraser, D. W., J. I. Ward, et al. (1979). "Aspergillosis and other systemic mycoses. The
growing problem." Jama 242(15): 1631-5.
Fujita, S., K. Seino, et al. (2006). "Regulatory dendritic cells act as regulators of acute
lethal systemic inflammatory response." Blood 107(9): 3656-64.
Gantner, B. N., R. M. Simmons, et al. (2003). "Collaborative induction of inflammatory
responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2." J Exp Med 197(9): 1107-17.
Groll, A. H., P. M. Shah, et al. (1996). "Trends in the postmortem epidemiology of
invasive fungal infections at a university hospital." J Infect 33(1): 23-32.
Harter, L., L. Mica, et al. (2004). "Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on
leukocytes from patients with sepsis." Shock 22(5): 403-9.
Hermoso, M. A., T. Matsuguchi, et al. (2004). "Glucocorticoids and tumor necrosis
factor alpha cooperatively regulate toll-like receptor 2 gene expression." Mol
Cell Biol 24(11): 4743-56.
Hopkins, P. A., A. C. Pridmore, et al. (2008). "Increased surface toll-like receptor 2
expression in superantigen shock." Crit Care Med 36(4): 1267-76.
Hotchkiss, R. S., K. C. Chang, et al. (2000). "Caspase inhibitors improve survival in
sepsis: a critical role of the lymphocyte." Nat Immunol 1(6): 496-501.
Imler, J. L. and J. A. Hoffmann (2001). "Toll receptors in innate immunity." Trends
Cell Biol 11(7): 304-11.
Inaba, K., M. Inaba, et al. (1992). "Generation of large numbers of dendritic cells from
mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage
colony-stimulating factor." J Exp Med 176(6): 1693-702.
Lu, W., L. C. Arraes, et al. (2004). "Therapeutic dendritic-cell vaccine for chronic HIV-
1 infection." Nat Med 10(12): 1359-65.
Luther, K., A. Torosantucci, et al. (2007). "Phagocytosis of Aspergillus fumigatus
conidia by murine macrophages involves recognition by the dectin-1 beta-glucan
receptor and Toll-like receptor 2." Cell Microbiol 9(2): 368-81.
Martin, G. S., D. M. Mannino, et al. (2003). "The epidemiology of sepsis in the United
States from 1979 through 2000." N Engl J Med 348(16): 1546-54.
Medzhitov, R. (2007). "Recognition of microorganisms and activation of the immune
response." Nature 449(7164): 819-26.
Mehrad, B., R. M. Strieter, et al. (1999). "Role of TNF-alpha in pulmonary host defense
in murine invasive aspergillosis." J Immunol 162(3): 1633-40.
Moore, K. W., R. de Waal Malefyt, et al. (2001). "Interleukin-10 and the interleukin-10
receptor." Annu Rev Immunol 19: 683-765.
O'Brien, J. M., Jr., N. A. Ali, et al. (2007). "Sepsis." Am J Med 120(12): 1012-22.
Pandey, S. and D. K. Agrawal (2006). "Immunobiology of Toll-like receptors: emerging
trends." Immunol Cell Biol 84(4): 333-41.
Openshaw, P. J., G. S. Dean, et al. (2003). "Links between respiratory syncytial virus
bronchiolitis and childhood asthma: clinical and research approaches." Pediatr
Infect Dis J 22(2 Suppl): S58-64; discussion S64-5.
Perl, T., L Dvorak , et al. (1995). "Long-term survival and function after suspected
Gram-negative sepsis." Jama 274(4): 338-345.
Plitas, G., B. M. Burt, et al. (2008). "Toll-like receptor 9 inhibition reduces mortality in
polymicrobial sepsis." J Exp Med 205(6): 1277-83.
Quartin, A. A., R. M. Schein, et al. (1997). "Magnitude and duration of the effect of
sepsis on survival. Department of Veterans Affairs Systemic Sepsis Cooperative
Studies Group." Jama 277(13): 1058-63.
Redecke, V., H. Hacker, et al. (2004). "Cutting edge: activation of Toll-like receptor 2
induces a Th2 immune response and promotes experimental asthma." J Immunol
172(5): 2739-43.
Rodgers, G. L., J. Mortensen, et al. (2000). "Predictors of infectious complications after
burn injuries in children." Pediatr Infect Dis J 19(10): 990-5.
Sales J., D. C. e. a. (2005). "Brazil: an epidemiological study in intensive care units."
Critical Care 9 (S1): 197.
Sato, M., H. Sano, et al. (2003). "Direct binding of Toll-like receptor 2 to zymosan, and
zymosan-induced NF-kappa B activation and TNF-alpha secretion are down-
regulated by lung collectin surfactant protein A." J Immunol 171(1): 417-25.
Shuto, T., A. Imasato, et al. (2002). "Glucocorticoids synergistically enhance
nontypeable Haemophilus influenzae-induced Toll-like receptor 2 expression via
a negative cross-talk with p38 MAP kinase." J Biol Chem 277(19): 17263-70.
Silva, E., N. Akamine, et al. (2006). "Surviving sepsis campaign: a project to change
sepsis trajectory." Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 6(2): 217-22.
Silva, E., A. Pedro Mde, et al. (2004). "Brazilian Sepsis Epidemiological Study
(BASES study)." Crit Care 8(4): R251-60.
Takeuchi, O., T. Kawai, et al. (2001). "Discrimination of bacterial lipoproteins by Toll-
like receptor 6." Int Immunol 13(7): 933-40.
Takeuchi, O., S. Sato, et al. (2002). "Cutting edge: role of Toll-like receptor 1 in
mediating immune response to microbial lipoproteins." J Immunol 169(1): 10-4.
Takeuchi, O., K. Hoshino, et al. (1999). "Differential roles of TLR2 and TLR4 in
recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components."
Immunity 11(4): 443-51.
Tatsuta, K., S. Tanaka, et al. (2008). "Complete elimination of established
neuroblastoma by synergistic action of gamma-irradiation and DCs treated with
rSeV expressing interferon-beta gene." Gene Ther.
Teles, J. M., E. Silva, et al. (2008). "Surviving sepsis campaign in Brazil." Shock 30
Suppl 1: 47-52.
Wang, T. S. and J. C. Deng (2008). "Molecular and cellular aspects of sepsis-induced
immunosuppression." J Mol Med 86(5): 495-506.
Weighardt, H., S. Kaiser-Moore, et al. (2002). "Cutting edge: myeloid differentiation
factor 88 deficiency improves resistance against sepsis caused by polymicrobial
infection." J Immunol 169(6): 2823-7.
Wen, H., Y. Dou, et al. (2008). "Epigenetic regulation of dendritic cell-derived
interleukin-12 facilitates immunosuppression after a severe innate immune
response." Blood 111(4): 1797-804.
Wen, H., C. M. Hogaboam, et al. (2006). "Severe sepsis exacerbates cell-mediated
immunity in the lung due to an altered dendritic cell cytokine profile." Am J
Pathol 168(6): 1940-50.
Wen, H., M. A. Schaller, et al. (2008). "Dendritic cells at the interface of innate and
acquired immunity: the role for epigenetic changes." J Leukoc Biol 83(3): 439-
46.
Wichterman, K. A., A. E. Baue, et al. (1980). "Sepsis and septic shock--a review of
laboratory models and a proposal." J Surg Res 29(2): 189-201.
Williams, D., Ha, T, Li, C, Kalbfleisch, JH, Schweitzer, J, Vogt, W , Browder, IW
(2003). "Modulation of tissue Toll-like receptor 2 and 4 during the early phases
of polymicrobial sepsis correlates with mortality. Crit Care Med 31: 1808-18."
Crit Care Med 31: 1808-1818.
Zhou, C., X. D. Kang, et al. (2008). "A synthetic Toll-like receptor 2 ligand decreases
allergic immune responses in a mouse rhinitis model sensitized to mite
allergen." J Zhejiang Univ Sci B 9(4): 279-85.
Zhou, L., A. A. Nazarian, et al. (2004). "Interleukin-10 inhibits interleukin-12 p40 gene
transcription by targeting a late event in the activation pathway." Mol Cell Biol
24(6): 2385-96.
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