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Análise da Expressão de MMP-2, -9, -14,
TIMP-1,-2 e RECK em Granulomas e
Cistos Periapicais
Everdan Carneiro
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru, da Universidade de
São Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em
Odontologia, na área de Endodontia.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Brandão Garcia
BAURU
2006
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Carneiro, Everdan
C215a Análise da expressão de MMP-2, -9 e -14, TIMP-
1, -2 e RECK em granulomas e cistos periapicais. – Bauru,
2006.
99p. : il. ; 30 cm.
Tese. (Doutorado) -- Faculdade de Odontologia
de Bauru. Universidade de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Brandão Garcia
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e
científicos, a reprodução total ou parcial desta
dissertação/tese, por processos fotocopiadores e outros
meios eletrônicos.
Assinatura:
Data de aprovação pelo comitê de Ética em pesquisa da
FOB: 05 de outubro de 2005.
A cópia do parecer de aprovação encontra-se no capítulo
“Apêndice”
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iii
EVERDAN CARNEIRO
20 de abril de 1976
Caçador – SC
Nascimento
Filiação
Fermiano Paes Carneiro Júnior
Rita Maria Pelegrinello Carneiro
1994-1998
Curso de Odontologia
Pontifícia universidade Católica do Paraná (PUC-PR)
1999-2000
Curso de Especialização em Endodontia
Faculdade de Odontologia de Bauru (USP)
2001-2003
Curso de Pós-Graduação em Endodontia, em nível de
Mestrado, na Faculdade Odontologia de Bauru (USP)
2003- 2006
Professor de Endodontia da Universidade do Oeste
Catarinense (UNOESC - Joaçaba)
2003-2006
Curso de Pós-Graduação em Endodontia, em nível de
Doutorado, na Faculdade Odontologia de Bauru (USP)
Associações IADR – International Association for Dental Research
SBPqO – Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica
ABO – Associação Brasileira de Odontologia
iv
Dedicatória
A Deus
Sempre presente em minha vida iluminando meus caminhos.
À Maria Amélia Busato
Por se deixar viver dentro de mim...
Pela sabedoria em dosar paciência, bom humor, ânimo e incentivo.
Obrigado por criticar, dividir e me amar tanto!
Aos meus pais Fermiano e Rita
Pelo imenso amor, afeto e compreensão...
Obrigado pelo exemplo de vida e pelos ensinamentos que vão além dos
livros...
Ao meu irmão Gonçalo
Pela amizade ímpar e companheirismo.
Obrigado pelo apoio pessoal e profissional.
À minha irmã Taciana (in memorian)
Pelo curto tempo que passamos juntos...
Pude compreender na sua ausência, quando ainda pequeno, que algumas
coisas na vida são inestimáveis...
Saudades...
v
Agradecimentos
Ao professor Dr. Roberto Brandão Garcia, pela valiosa e competente
orientação. Pelo exemplo sereno de como conduz as situações; o que
certamente propiciou meu crescimento científico, profissional e pessoal.
Foram cinco anos de convívio... Certamente sempre será meu referencial
de sabedoria, honestidade e busca incansável pelo conhecimento.
Muito Obrigado
vi
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Ivaldo Gomes de Moraes
Pelo constante incentivo desde a especialização. Um exemplo de ser
humano que desenvolveu a capacidade de ouvir... Agradeço de coração
pela oportunidade de conhecê-lo e toda amizade e carinho que sempre
me dedicou.
Obrigado pelo “mel”, alimento muitas vezes necessário que propiciou
forças para continuar...
Ao Professor Dr. José Mauro Granjeiro
Exemplo de sinceridade e competência. Fonte inesgotável de perguntas e
amor pela pesquisa. Obrigado pelo convívio enriquecedor e carinho que
sempre demonstrou.
À Professora Vânia Portela Dietzel Westphalen
Por ser responsável pelo meu interesse e amor à Endodontia. Pessoa
notável que colaborou decisivamente em minha formação.
Obrigado pela confiança em mim depositada, pela integridade e
honestidade demonstradas em todos esses anos de amizade, meu eterno
agradecimento e consideração.
Aos Professores Clóvis Monteiro Bramante e Norberti Bernardineli
Agradeço a oportunidade, apoio e confiança em mim depositada desde o
início de minha atividade clínica e especialmente docente. Obrigado pelos
ensinamentos e experiências transmitidas.
À Professora Dra.Vanessa Lara
Obrigado por me ensinar que sempre precisamos de um plano B. Admiro
muito a sua maneira de orientar, equilibrando disciplina e descontração
para executar as atividades.
À Professora Dra.Maire Sogayar
Pelo seu jeito cativante de ser, confiando a oportunidade de realizar o
Real time RT-PCR no seu laboratório.
vii
Ao Professor Dr. Gustavo Garlet
Obrigado pela orientação e dedicação dispensada, não medindo esforços
para contribuir com o trabalho e discutir minhas dúvidas.
Aos meus amigos, verdadeiros irmãos:
Renato
Obrigado pela amizade e companheirismo, sempre presentes, que
permanecerão pelo resto de minha vida... Você sabe o quanto foi
essencial para realização deste trabalho, muitas vezes me orientando.
Admiro muito sua inteligência e capacidade incansável de questionar.
Ulisses
Obrigado por ser meu espelho profissional. Você sabe que sempre
procurei ser um pouco “Ulisses” (monitor, especialista, mestre e doutor).
Agradeço de coração todo carinho sempre dispensado.
Fábio
Obrigado pelo convívio, companheirismo, ensinamentos e momentos de
descontração compartilhados.
À amiga-irmã Fernanda
Pela amizade fiel e sincera. Tenho certeza que não nos encontramos por
acaso nesta jornada. Saiba que te admiro muito.
Aos meus amigos e colegas de Doutorado Silvana, Graziela, Viviane,
Giovana e Rogério, pelo convívio agradável e troca de ensinamentos.
À Família Letra Menezes
Pelo convívio sempre receptivo e pelas diárias de hotel. Agradeço
especialmente a Ariadne pela amizade e ao Lucas por fazer parte desta
etapa, possibilitando muita descontração.
viii
À Família Gomes de Moraes
Pelo carinho dispensado e por fazerem de sua casa, a minha. Obrigado
pela atenção e sensibilidade.
Aos amigos Dani, Bruno e Tânia...
Que fizeram da Histo minha segunda casa.
Aos meus amigos de Pós-graduação
Rodrigo, Diego, Leonardo e Rosário pelo convívio sincero e divertido.
À Rita Figueira
Pela disposição e paciência, deixando seus compromissos para auxiliar a
parte laboratorial deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Endodontia: Sueli, D. Neide,
Edimauro e Patrícia, pela consideração, colaboração e atenção sempre
dispensadas.
À Fatiminha
Agradeço pela dedicação, amizade e carinho.
À minha amiga Luci Binder
Obrigado pela amizade fiel, essencial para meu crescimento profissional.
ix
SUMÁRIO
Lista de Figuras.............................................................................................. xii
Lista de Abreviaturas e Símbolos................................................................... xiv
Resumo.......................................................................................................... xv
1 Introdução................................................................................................... 02
2 Revisão da Literatura.................................................................................. 08
2.1 Peridontites Apicais Crônicas................................................................... 08
2.2 Matriz Extracelular.................................................................................... 17
2.3 Metaloprotease da Matriz......................................................................... 18
2.3.1 Estrutura e Função das MMPs.............................................................. 20
2.3.2 Metaloprotease da matriz na Polpa e em Lesões Periapicais.............. 24
2.4 Inibidores Teciduais de Metaloproteases (TIMPs)................................... 29
2.5 Gene supressor RECK............................................................................. 30
3 Proposição.................................................................................................. 35
4 Material e Métodos...................................................................................... 37
4.1 Amostras teciduais de lesões periapicais para RT-PCR.......................... 37
4.2 Preparação do RNA Total........................................................................ 37
4.3 Ensaios de RT-PCR................................................................................. 38
4.3.1 Síntese da primeira fita do cDNA.......................................................... 38
4.3.2 Controle da qualidade do cDNA............................................................ 39
4.4 Confirmação dos genes por Real-Time PCR........................................... 39
4.4.1 Desenho dos “primers”.......................................................................... 39
4.4.2 Confirmação da expressão diferencial.................................................. 41
x
4.4.3 Análise estatística................................................................................. 43
4.5 Amostras teciduais de lesões periapicais para imuno-histoquímica ....... 44
4.5.1 Controle positivo e negativo.................................................................. 46
5 Resultados.................................................................................................. 48
5.1 Expressão da matriz metaloprotease-2 em granulomas, cistos e
cicatriz periapicais..........................................................................................
48
5.2 Expressão da matriz metaloprotease-9 em granulomas, cistos e
cicatriz periapicais..........................................................................................
49
5.3 Expressão de RECK em granulomas, cistos e cicatriz periapicais.......... 50
5.4 Expressão de TIMP-1 em granulomas, cistos e cicatriz periapicais........ 51
5.5 Expressão de TIMP-2 em granulomas, cistos e cicatriz periapicais........ 52
5.6 Expressão da matriz metaloprotease-14 em granulomas, cistos e
cicatriz periapicais..........................................................................................
53
5.7 Correlação entre os níveis de transcritos para MMP-2, -9, -14, TIMP-1,
-2 e RECK......................................................................................................
54
5.8 Imunomarcação de MMP-2 e -9 para granulomas periapicais.................
6 Discussão....................................................................................................
58
62
6.1 Metodologia.............................................................................................. 62
6.1.1 Real time PCR....................................................................................... 62
6.1.2 Imuno-histoquímica............................................................................... 67
6.2 Resultados............................................................................................... 69
7 Conclusões.................................................................................................. 78
Referências Bibliográficas.............................................................................. 80
Abstract.......................................................................................................... 99
xi
Apêndice
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Níveis médios de expressão das MMP-2 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais.............................................................................
49
Figura 2 – Níveis médios de expressão das MMP-2 nos grupos das
amostras (gráfico de dispersão).....................................................................
49
Figura 3 - Níveis médios de expressão das MMP-9 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais.............................................................................
50
Figura 4 - Níveis médios de expressão das MMP-2 nos grupos das
amostras (gráfico de dispersão).....................................................................
50
Figura 5 - Níveis médios de expressão de RECK entre granulomas, cistos
e cicatriz periapicais......................................................................................
51
Figura 6 - Níveis médios de expressão de RECK nos grupos das amostras
(gráfico de dispersão).....................................................................................
51
Figura 7 – Níveis médios de expressão de TIMP-1 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais.............................................................................
52
Figura 8 – Níveis médios de expressão das TIMP-1 nos grupos das
amostras (gráfico de dispersão).....................................................................
52
Figura 9 – Níveis médios de expressão de TIMP-2 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais............................................................................
53
Figura 10 – Níveis médios de expressão das TIMP-2 nos grupos das
amostras (gráfico de dispersão)....................................................................
53
Figura 11 – Níveis médios de expressão de MMP-14 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais.............................................................................
54
xiii
Figura 12 – Níveis médios de expressão das MMP-14 nos grupos das
amostras (gráfico de dispersão).....................................................................
54
Figura 13 – Correlações positivas e não significantes..................................
55
Figura 14 – Seqüência gráfica de correlações positivas...............................
56
Figura 15 – Seqüência gráfica de correlações não significantes..................
57
Figura 16 – Imunomarcação para MMP-2 (A) 40X; (B) 100X.......................
58
Figura 16 – Imunomarcação para MMP-2 (C) 40X.......................................
59
Figura 17 - Imunomarcação para MMP-9 (D) 40X; (E, F) 100X; (G) 40X.....
59
Figura 18 - Imunomarcação para CD68+ (H) 40X; (B) 100X; (C) 40X..........
60
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS
ºC
100X
40X
cDNA
CD68+
DAB
Graus Celsius
Aumento de 100 vezes
Aumento de quarenta vezes
Ácido desoxirribonucléico complementar
imunohistoquimicamente positivo para o cluster de
diferenciação sessenta e oito
Diaminobenzidina
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent
Assay)
KDa
Ig
Quilodaltons
Imunoglobulina
IL Interleucina (interlukin)
PBS
PBSA
Solução salina tamponada com fosfato e magnésio
PBS sem cálcio ou magnésio
PCR
PGE2
PMN
PM
pH
mM
MEC
MMP
Reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)
Prostaglandina E dois
Polimorfonucleares
Peso molecular
Potencial de hidrogênio
Milimolar
Matriz extracelular
Metaloprotease de matriz
xv
RealTimePCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa
RECK
RNAm
Reversão induzida por proteína rica em cisteína com Kazal
motif (Reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal
motifs)
Ácido Ribonucléico mensageiro
RT Transcrição reversa (reverse transcription)
SD
TE
TGF-β
Desvio padrão (Standart deviation)
Solução tampão (10mM Tris-Cl pH 7,5 e 1 mM EDTA)
Fator de crescimento Transformante β (transforming growth
factor β)
TIMP Inibidor tecidual de metaloprotease ( tissue inhibitor of
metalloptroteinase)
TNF
Fator de necrose tumoral (Tumor necrosis factor)
Resumo
xvi
A degradação de proteínas da matriz extracelular pelas metaloproteases da matriz
(MMPs) ocorre nos processos fisiológicos (turnover) bem como nos processos
patológicos (inflamação, neoplasias, etc). A atividade das MMPs nos tecidos é
regulada, naturalmente, por um grupo de inibidores teciduais de metaloproteases
(TIMPs). Recentemente, um novo inibidor de MMPs, chamado RECK (proteína
indutora de reversão rica em cisteína com domínios Kazal) foi identificado. Neste
estudo, verificamos os níveis de transcritos para metaloproteases da matriz (MMP-2,
-9 e -14), inibidores teciduais de metaloproteases (TIMP-1 e -2) e RECK, por meio
da técnica de Real-Time RT-PCR, assim como as células envolvidas em granulomas
periapicais para MMP-2 e -9, por meio de marcações de imuno-histoquímica. As
amostras deste estudo foram coletadas de cirurgias paraendodônticas, sendo 15
submetidas ao Real-Time RT PCR (8 granulomas periapicais, 6 cistos periapicais e 1
cicatriz apical), e 10 para imuno-histoquímica (10 granulomas periapicais). Os
resultados para o Real-Time PCR demonstraram que houve a expressão de MMP-2,
-9, -14, TIMP-1, -2, e RECK em granulomas e cistos periapicais, não havendo
diferença estatisticamente significante entre as duas patologias periapicais frente
aos genes testados. Todavia, quando o grupo lesão periapical (granuloma e cisto
periapical) foi confrontado frente aos genes pesquisados, houve uma correlação
significativa entre os níveis de transcritos para MMP-2, -9 e -14, TIMP-1, -2 e RECK.
Para as imunomarcações nos granulomas periapicais, a MMP-2 apresentou um
padrão mais difuso, dispondo-se perifericamente às células e dispersas pela MEC,
em comparação com a MMP-9 que apresentou um padrão mais localizado e restrito.
Os macrófagos foram às células que mais expressaram estas metaloproteases da
matriz.
INTRODUÇÃO
Introdução
2
1 INTRODUÇÃO
A infecção bacteriana na polpa dentária induz uma resposta inflamatória,
que, não sendo tratada, determina a sua destruição e conseqüente
contaminação do sistema de canais radiculares e túbulos dentinários,
desencadeando, por sua vez, infecção no periodonto apical. A persistência
desse evento provoca a migração, ativação e a interação coordenada de
células imuno-competentes
45
, caracterizando a periodontite apical. Essa
reação de defesa do periodonto apical frente à persistência dos agentes
irritantes contidos no sistema de canais radiculares infectados provoca a
cronificação da periodontite apical e com o decorrer do tempo, a reabsorção
dos tecidos paraendodônticos apicais.
A estrutura histopatológica das periodontites apicais crônicas ou lesões
inflamatórias periapicais crônicas compreende, a partir do forame apical, as
zonas necrótica e exsudativa, granulomatosa e fibrosa infiltradas
29, 104
, por
células imunocompetentes em interação, como os leucócitos
polimorfonucleares, macrófagos, linfócitos T, B e plasmócitos. Os tecidos
granulomatoso e fibroso, representantes da atividade proliferativa da
inflamação crônica, desenvolvem-se e ocupam o espaço deixado pelo osso
reabsorvido.
29, 93
Nas lesões inflamatórias periapicais crônicas estão incluídos
granulomas e cistos, sendo ambas as patologias que representam dois
estágios de desenvolvimento de um mesmo processo inflamatório. Os fatores
Introdução
3
que determinam a transformação cística de alguns granulomas, bem como o
mecanismo envolvido para sua formação, ainda são controversos.
64
O conceito básico do tratamento do sistema de canais radiculares se
baseia na remoção mecânica e química dos irritantes do interior de canais
infectados, sua modelagem, sua obturação e selamento coronário, procurando
bloquear a micro infiltração de fluidos, bactérias, propiciando o reparo de
lesões periapicais. Entretanto, os mecanismos intrínsecos que mantêm a lesão
periapical permanacem obscuros e as ferramentas de diagnóstico disponíveis
não são capazes, ainda, de avaliar aqueles mecanismos, a progressão da
periodontite apical crônica nem, tampouco, prever a sua futura exarcebação.
93
Todavia, parece que o interesse maior está fundamentado em conhecer a
progressão ou expansão das periodontites apicais crônicas, aplicando para
isso, conceitos microbiológicos, patológicos, imunológicos e de biologia
molecular.
As interações celulares com a matriz extracelular são essenciais para
um normal desenvolvimento e funcionabilidade do organismo humano. A
modulação destas interações entre célula e matriz ocorre por meio da ação de
um único sistema proteolítico, responsável pela hidrólise de uma variedade de
componentes da matriz extracelular. Para a manutenção da integridade e
composição da estrutura da matriz, aquele sistema enzimático tem um papel
principal no controle de sinais licitados pelas moléculas da matriz, regulando a
proliferação, diferenciação e morte celular. A renovação e remodelação da
matriz extracelular (MEC) devem ser altamente reguladas. A proteólise
Introdução
4
descontrolada contribui para um desenvolvimento anormal e geração de muitas
condições patológicas.
46
O colágeno é a principal proteína destruída durante o desenvolvimento
das lesões periapicais, determinando a degradação dos feixes de fibras
colágenas que ligam os dentes ao osso circundante.
93
A degradação
colagênica se dá por um grande grupo de enzimas, conhecidas por
metaloproteases da matriz (MMPs), que regulam o equilíbrio entre célula e
matriz. As MMPs são endopeptidases zinco dependentes, conhecidas por suas
habilidades de clivar um ou muitos constituintes da matriz extracelular, bem
como proteínas não pertencentes a mesma. Elas compreendem uma ampla
família de proteases que dividem elementos estruturais e funcionais comuns.
9,
30, 46, 56, 82, 98
A degradação de proteínas da matriz extracelular pelas MMPs ocorre na
sua renovação (turnover) e nos processos inflamatórios. Essa degradação
requer a atividade de muitas endopeptidases diferentes, de acordo com o
substrato. Essas enzimas estão em baixo nível em tecidos normais e
aumentadas durante a inflamação.
98, 77
. As endopeptidases são produzidas por
células residentes no tecido conjuntivo em resposta aos estímulos bacterianos
e às citocinas. Por outro lado, várias proteinases são produzidas, também, por
células inflamatórias, como as colagenases (MMP-1 e/ou MMP-8), elastase e
gelatinase (MMP-2 e/ou MMP-9), as quais irão promover a desnaturação do
colágeno ou gelatina da matriz extracelular.
46, 56
Na inflamação, as MMPs-9
são principalmente secretadas por leucócitos polimorfonucleares neutrófilos
(PMNs) e macrófagos.
98
Introdução
5
Ampla evidência existe no papel das MMPs nos processos fisiológico e
fisiopatológico das interações entre célula e matriz extracelular,incluindo
embriogênese, reparo, inflamação, artrite e câncer. A associação de MMPs
com metástase de câncer tem seu interesse aumentado consideravelmente
porque estas proteases representam um alvo atrativo para o desenvolvimento
de novos medicamentos antimetastáticos, que objetivam a atividade inibitória
de MMP.
A atividade das MMPs nos tecidos é regulada, naturalmente, por um
grupo de inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). Um desequilíbrio
entre produção de MMPs e TIMPs pode permitir a destruiçao tecidual.
43, 90
Recentemente, um novo inibidor de MMPs, chamado RECK (proteína indutora
de reversão rica em cisteína com domínios Kazal) foi identificado. RECK é uma
glicoproteína de ancoragem em membranas celulares, cuja estrutura é
diferente das TIMPs, expressada em vários tecidos normais, mas não
identificada em células derivadas de tumores. A RECK inibe MMPs-9, -2 e -14,
funcionando também, como um regulador estrutural de processo de renovação
(turnover) da matriz extracelular.
82
A RECK inibe a MMP-9 de dois modos:
supressão da sua secreção e direta inibição de sua atividade enzimática.
92
Nos últimos anos, as MMPs têm sido alvo de atenção em endodontia,
18,
30, 42, 56, 64, 77, 98, 99
, devido à suas atividades de degradação da matriz
extracelular nos processos inflamatórios. A expressão de MMPs nas células
inflamatórias
72
em granulomas e cistos periapicais
77
tem sido pesquisada,
objetivando conhecer melhor o mecanismo de formação e expansão daquelas
lesões.
Introdução
6
Sabendo que a glicoproteina RECK inibe a atividade das MMPs -2, -9, e
-14 e que metaloproteases da matriz e seus inibidores estão presentes em
lesões periapicais, se torna válido um estudo que verifique os níveis de
transcritos por meio da técnica da transcrição reversa pela reação em cadeia
da polimerase (Real Time RT-PCR), assim como identificar as células que
expressam MMP-2 e -9 em granulomas periapicais, por meio de marcações de
imuno-histoquímica.
REVISÃO DE LITERATURA
Revisão da Literatura
8
2 REVISÃO DA LITERATURA
A revisão da literatura será dividida nos seguintes tópicos: Periodontites
apicais crônicas com ênfase em granuloma apical e cisto periodontal apical,
matriz extracelular, metaloprotease da matriz, inibidores teciduais de
mataloproteases (TIMPs) e RECK.
2.1 Periodontites Apicais Crônicas
As periodontites apicais crônicas ou simplesmente lesões inflamatórias
periapicais crônicas são respostas inflamatórias a agentes microbianos do
sistema de canais radiculares
41, 50, 88
. Estas lesões, conforme os tipos celulares
inflamatórios presentes, mostram a participação concomitante das reações
inflamatórias não específicas e a de especificidade imunológica.
66, 108
A infecção da cavidade pulpar resulta na contaminação dos tecidos
periapicais ocorrendo, desse modo, à colonização bacteriana e,
consequentemente a reação inflamatória e degradação da estrutura tecidual do
periápice
93
. Essa reação inflamatória ou periodontite apical desencadeia uma
reação imune contra a proliferação bacteriana, gerando numerosos mediadores
inflamatórios de uma variedade de células, visando à destruição dos patógenos
invasores. Esse mecanismo imunopatológico envolve as reações de
hipersensibilidade, podendo ser mediada por anticorpos (hipersensibilidade
Revisão da Literatura
9
humoral) ou por células (hipersensibilidade celular). Ainda por analogia às
reações imunes de proteção, a resposta humoral é conhecida por
hipersensibilidade imediata e a celular por hipersensiblidade tardia.
29
Na formação, desenvolvimento e perpetuação da periodontite apical, a
cooperação entre subpopulações funcional e fenotipicamente diferentes de
macrófagos e linfócitos T, resultam em um balanço equilibrado de processos de
proteção e de destruição tecidual. Devido ao fluxo contínuo de microrganismos
e seus produtos, do sistema de canais radiculares infectados, a lesão periapical
não é autolimitante, apesar do poderoso mecanismo de defesa montado pelo
sistema imunoinflamatório do hospedeiro. Portanto, a efetiva desinfecção do
sistema de canais radiculares é essencial para que o reparo possa ocorrer.
14,
63
MÁRTON; KISS
45
, em 2000, descrevem em uma revisão sobre reações
imunes em periodontites apicais, enfatizando que, apesar das reações do
organismo frente aos agentes bacterianos possuírem caráter defensivo, a
destruição de componentes do tecido periapical é inevitável, resultando,
inclusive na reabsorção óssea. O entendimento do equilíbrio dinâmico entre
mecanismo defensivo e destrutivo pode fornecer bases para melhor
entendimento de sinais e sintomas das periodontites apicais crônicas,
influenciando nas estratégias de tratamento.
A histopatologia de lesões periapicais crônicas representa uma estrutura
de defesa e uma de manutenção altamente organizada, ou seja, as contínuas
produção e difusão de antígenos para o periodonto apical em hospedeiro
Revisão da Literatura
10
sensível induzem, ao lado das reações imunitárias de proteção, reações que
causam danos aos tecidos locais.
29
O aspecto microscópico de um típico granuloma periapical demonstra
uma estrutura, a partir do forame apical, formada pelas zonas necrótica,
exsudativa, granulomatosa e fibrosa
45
e, de acordo com as zonas de
predominância, as lesões podem ser classificadas como exsudativas,
granulomatosas, granulofibróticas e fibrosadas.
104
Lesões exsudativas são
caracterizadas pela necrose extensa e exsudação com edema intersticial,
correspondendo às lesões incipientes agudas ou aos períodos de exacerbação
aguda das periodontites periapicais crônicas.
As células inflamatórias que compõem basicamente uma lesão
periapical são: leucócitos polimorfornucleares neutrófilos, linfócitos T e B,
plasmócitos e macrófagos, além de componentes quimiotáticos presentes na
região apical e as imunoglobulinas
29, 44
. Em áreas de necrose e de exsudação
em infecções periradiculares, os leucócitos polimorfonucleares neutrófilos
representam a primeira linha de defesa contra invasão bacteriana oriunda de
canais radiculares infectados. Devido a sua função de fagocitose e de
promover a morte bacteriana, essas células destroem e eliminam a maioridade
dos microrganismos, prevenindo a expansão da lesão. Os neutrófilos estão
presentes, também, na zona granulomatosa de uma lesão periapical, de
permeio aos linfócitos, plasmócitos, eosinófilos e elementos fibrovasculares. A
sua presença de fato é menos notada em zonas granulomatosas, porque a
infecção microbiana nesta zona é menor, contudo sua função antimicrobiana
persiste, contribuindo para resistir à invasão bacteriana, bem como ao ingresso
Revisão da Literatura
11
de partículas de membranas patogênicas, antígenos, toxinas e enzimas,
provenientes dos canais radiculares e de zonas exsudativas.
65
Eosinófilos são encontrados na zona granulomatosa das periodontites
apicais crônicas, representando a menor população do infiltrado de leucócitos
polimorfonucleares.
29, 45, 107
As imunoglobulinas (Ig) estão presentes nas periodontites apicais
crônicas participando da reação de hipersensibilidade imediata, além do
envolvimento em processos infecciosos exsudativos agudos.
48
Imunoglobulinas do tipo IgG, IgM, IgA e IgE acompanhadas de fragmentos do
complemento são observadas em lesões periapicais em diversos estudos
38, 51,
52, 94
As IgG e IgA são percebidas em alta concentração em granulomas
periapicais, nas paredes e fluídos císticos
35
. Os linfócitos B e suas progênitas,
os plasmócitos, que produzem IgG, IgA, IgM são evidenciados em tecidos
granulomatosos periapicais humanos e em modelos experimentais em animais.
83 106
Estudos de imuno-histoquímica e quantificação de imunoglobulinas, por
métodos de imunoensaio, confirmaram a produção local destas por meio dos
níveis de RNA mensageiro (RNAm).
94
Comparando as populações de linfócitos B e T, as periodontites apicais
crônicas demonstram um excesso de células T sobre os linfócitos B, visto tanto
em humanos como em lesões periapicais induzidas em ratos.
1, 34, 62
Este dado,
aliado à presença constante de macrófagos, confirma a predominância da
reação de hipersensibilidade tardia no mecanismo de formação das lesões
inflamatórias crônicas.
29
Revisão da Literatura
12
Linfócitos T e B predominam em lesões periapicais e tem papel
importante na resposta imune antígeno-específica.
107
A proporção de
Linfócitos T é maior que a de Linfócitos B nas lesões periapicais e a proporção
entre linfócitos-supressores/citotóxicos (LT-8) e os linfócitos-auxiliares (LT-4)
tem importância durante a fase de progressão das lesões.
6, 23, 80
Os LT - 8
participam ativamente no processo de estabilização das lesões periapicais
inflamatórias, e os LT-4 têm participação na fase inicial ou destrutiva das
lesões.
37, 44, 65
Isso sugere o porquê LT-8 são encontrados em maior
concentração que os LT-4 nos cistos em relação aos granulomas apicais.
72
Os macrófagos, em concomitância com os linfócitos, desenvolvem nas
periodontites apicais crônicas, ações de defesa e de desenvolvimento da lesão,
sendo recrutados por múltiplos fatores quimiotáticos. Nos processos
infecciosos com predominância de macrófagos, independente de sua
localização, há a caracterização do autêntico granuloma, um exemplo é na
hanseníase e na tuberculose. Nestas patologias não há destruição total dos
agentes infecciosos, estes permanecem em parasitismo no interior dos
macrófagos, determinando a continuidade dos granulomas. A persistência e
interação dos microrganismos com os macrófagos estimula sua atividade
secretora, resultando em liberação de enzimas hidrolíticas com destruição local
dos tecidos. A destruição tecidual, associada ao mecanismo imunológico que
mobiliza e ativa os macrófagos, constitui os elementos mais importantes do
mecanismo formador dos granulomas infecciosos. A cronicidade dos
granulomas infecciosos representa, portanto, um estado de imunodeficiência,
Revisão da Literatura
13
pois, neste caso, os linfócitos T sensíveis, não ativam suficientemente os
macrófagos para induzir a destruição do agente infeccioso.
29
A periodontite apical crônica ou lesão inflamatória periapical crônica,
denominada também de granuloma periapical, não tem a composição celular
predominantemente macrofágica e sendo assim, histopatologicamente, não se
trata de um autêntico granuloma. Todavia tal denominação ficou consagrada na
Odontologia. Na formação do granuloma periapical, representado
principalmente por macrófagos, linfócitos e plasmócitos, estão envolvidos
fenômenos imunopatológicos, especialmente relacionados à hipersensibilidade
celular; isto ocorre quando o agente indutor tem poder imunogênico. Na
ausência desta condição, o granuloma é dito do tipo corpo estranho, fato
observado no extravasamento de alguns cimentos, pastas obturadoras e guta-
percha.
21, 55
A periodontite apical crônica instalada pode evoluir gradativamente à
custa da proliferação fibro-angioblástica e acúmulo de células inflamatórias na
área periodontal em torno do forame apical, determinando, ao longo do tempo,
reabsorção óssea, cementária e dentinária nos períodos mais prolongados. No
interstício da lesão periapical, há infiltração de polimorfonucleares neutrófilos e
pequenos focos de destruição tecidual, como resultado do primeiro contato
com as bactérias e seus produtos. A partir desta região, as bactérias e seus
produtos, que vencem esta barreira, serão reconhecidos pelos linfócitos e
digeridos pelos macrófagos.
19, 98
No granuloma periapical (periodontite apical crônica granulomatosa),
tem-se como principal elemento caracterizador a presença de eventos
Revisão da Literatura
14
morfológicos e imunopatológicos de uma lesão inflamatória crônica
granulomatosa, de longa duração, com caráter predominantemente proliferativo
e induzido por agentes agressores de origem bacteriana advindos do canal
radicular. Sua finalidade está relacionada com a localização e delimitação dos
agentes agressores aos limites do periápice, revelando a persistência do
agente agressor no local, provocando a ocorrência de fenômenos
imunopatológicos específicos importantes na manutenção da periodontite
apical crônica como a presença constante de células imunocompetentes, de
imunoglobulinas, de componentes do complemento, bem como inúmeros
outros mediadores químicos, incluindo as várias citocinas e fatores de
crescimento.
45
O granuloma periapical pode demonstrar na sua estrutura:
a) Cordões e ilhotas de células epiteliais, proliferantes ou não,
originadas dos restos epiteliais de Malassez;
b) Células espumosas ou pseudoxantomatosas, representadas
pelos macrófagos carregados de lipídios decorrentes da
liberação constante de células mortas;
c) Corpúsculo hialino de Russel, representados por formações
eosinofílicas esféricas isoladas ou em forma de aglomerados,
correspondentes aos plasmócitos com perda da capacidade
secretória de proteínas imunoglobulinas;
d) Cristais de colesterol, parte dos lipídios liberados em
decorrência da morte celular não difusível e nem fagocitada,
cristaliza-se no espaço intercelular.
Revisão da Literatura
15
Clinicamente, o granuloma apical é quase sempre assintomático. O
paciente pode, ocasionalmente, fornecer uma história de dor que, mais tarde,
diminui ou desapareceu. A radiografia, na fase inicial da sua formação, poderá
mostrar um espessamento pronunciado do pericemento apical e à medida que
a periodontite apical crônica evolui, pela neoformação tecidual e conseqüente
reabsorção do osso, aparece com uma área radiolúcida, de forma circular ou
ovóide, estendendo-se apicalmente.
21
A origem do cisto periodontal apical (periodontite apical cística) está no
granuloma apical, a partir de seu componente epitelial derivado dos restos
epiteliais de Malassez. Esses restos são estimulados pela reação inflamatória
periapical instalada, entram em proliferação, invadindo a estrutura do
granuloma periapical, aumentando, gradativamente, a massa de tecido epitelial
29
e formando, concomitantemente, a micro cavitação cística, cujo mecanismo
está fundamentado em várias teorias.
45, 64
As condições indutoras para provocar a proliferação epitelial dependem
da diminuição da tensão de oxigênio, aumento da tensão de gás carbônico,
associados a uma redução do pH. Estabelecida à fase de iniciação da
cavitação cística, os cistos periodontais apicais apresentam crescimento
contínuo e lento, provocado pela pressão hidrostática intra-cavitária, que se
enriquece de líquido gradativamente à custa da pressão oncótica do líquido
cístico.
29
Enfocando aspectos microscópicos e imunohistoquímicos do cisto
periodontal apical ROCHA
71
em 1991, descreveu que o epitélio de revestimento
da cavidade cística não se apresenta contínuo na maioria dos casos, existindo
Revisão da Literatura
16
áreas de interrupção onde se encontra infiltrado inflamatório composto,
predominantemente, por linfócitos T e macrófagos em grande quantidade,
denotando um provável reconhecimento antigênico do epitélio cístico, o qual na
sua grande maioria apresenta-se estratificado pavimentoso, não queratinizado.
As camadas superficiais, desse epitélio, geralmente estão desorganizadas e
ausentes, determinando irregularidades na sua superfície. De permeio às
células epiteliais, geralmente há exuberante infiltração de leucócitos
polimorfonucleares neutrófilos, caracterizando a exocitose neutrofílica.
Subjacente ao epitélio de revestimento o infiltrado inflamatório crônico é bem
definido e composto por macrófagos e linfócitos, do tipo T e B, sendo que estes
estão localizados mais difusamente na parede cística.
Na parede do cisto periodontal apical podem ser encontradas áreas
típicas do granuloma apical antecedente, especialmente quando a
transformação cística foi recente. Nos cistos maiores e mais velhos, a parede
cística é fibrosa, densa e colagenizada, apresentando-se com graus variáveis
de infiltração inflamatória mononuclear, ora focal ou difusa. A distribuição dos
linfócitos T e dos macrófagos denota uma íntima relação com a presença do
epitélio cístico de revestimento; sua localização, concentração e migração
parecem estar relacionadas para a destruição daquele tecido de revestimento.
29
A presença de cristais de colesterol constitui um dos achados mais
comuns no cisto peridontal apical. Sua localização é variável, podendo ocupar
grande parte do lume e da parede cística. O conteúdo cístico revela-se, ainda,
constituído por material amorfo, possivelmente pelo alto teor protéico, presença
Revisão da Literatura
17
marcante de células pseudoxantomatosas, leucócitos mononucleares e
polimorfonucleares, hemáceas, células epiteliais descamadas.
5, 29
A terapêutica endodôntica só consegue ser amplamente discutida
quando os princípios biológicos são conhecidos, contudo, as ferramentas
diagnósticas conhecidas são ainda incapazes de precisar a progressão das
periodontites apicais, nem tampouco, prever sua futura exacerbação. Baseado
nisso, a imunopatologia envolvendo as conseqüências da necrose pulpar deve
ser constantemente estudada.
2.2 Matriz extracelular
A matriz extracelular (MEC) é definida como uma rede complexa de
componentes protéicos, proteoglicanos e glicoproteínas secretados, que
circundam os fibroblastos, unindo as células e mantendo a estrututra
tridimensional do corpo. A MEC proporciona, portanto, suporte mecânico para
as células e integridade estrutural para os tecidos.
22, 33, 67
A MEC compreende uma rede dinâmica de macromoléculas interativas
como colágenos, proteínas não colagênicas, fibras elásticas e proteoglicanos.
69
Tradicionalmente era vista como um substrato estável para as células e
como determinante da arquitetura tecidual, no entanto mais funções foram
conhecidas, como a de papel instrutivo, provendo informações estruturais para
integrinas e outras moléculas da superfície celular, servindo assim de
Revisão da Literatura
18
reservatório para fatores de crescimento.
2
Desta forma, os componentes da
matriz modulam o comportamento celular, criando ambientes celulares
influentes. A renovação (turnover) da MEC é parte integral de processos
normais e patológicos como desenvolvimento, remodelamento tecidual,
crescimento e diferenciação celular, invasão e metástase.
101
O remodelamento do tecido é um processo chave no desenvolvimento
normal, na cura de doenças, no remodelamento ósseo e no desenvolvimento
embrionário, bem como em condições patológicas como invasão celular,
metástase e angiogênese tumoral.
4, 8, 24, 53, 68, 73, 78
A degradação da MEC é mediada por algumas famílias de proteinases
extracelulares. Tais famílias incluem as serinas–proteases, cisteína-proteases
e metaloproteases da matriz (MMPs).
8
2.3 Metaloprotease da matriz
Proteases extracelulares são necessárias em diversos processos
relacionados com o desenvolvimento normal e com doenças. A habilidade de
degradar proteínas extracelulares é essencial para células individuais
interagirem com o ambiente ao redor e para organismos multicelulares se
desenvolverem e funcionarem normalmente.
86
Uma família de enzimas foi
identificada em diferentes espécies, desde hidras até humanos, e chamadas,
coletivamente, de metaloproteases de matriz (MMPs), dada sua dependência
Revisão da Literatura
19
de íons metálicos para atividade catalítica e sua potente habilidade em
degradar proteínas estruturais da MEC.
87
Além dos substratos da MEC, as
MMPs também são capazes de clivar moléculas de superfície celular de
diversas maneiras.
85
Dada a ampla variedade de proteínas que as MMPs são
capazes de modificar, tais enzimas influenciam diversos processos fisiológicos
e patológicos, incluindo aspectos do desenvolvimento embriogênico,
morfogênese tecidual, processo de reparo e doenças inflamatórias.
84
As MMPs são enzimas-chave responsáveis pela renovação da MEC e
exercem um importante papel no desenvolvimento e na progressão de
patologias humanas.
3, 8, 33, 53, 78
MMPs compreendem um grupo de contínuo
crescimento de enzimas proteolítica, dependentes de zinco que, de acordo com
a especificidade do substrato e a homologia de seus domínios, são
subdivididas em colagenases, gelatinases, estromelisinas (lisinas do estroma)
e MMPs do tipo membrana.
8
Juntas estas enzimas são capazes de degradar
toda a estrutura protéica da MEC.
Devido à habilidade de alterar o destino celular e o desenvolvimento
tecidual, as MMPs necessitam estar sob rígido controle. Primeiramente, foi
demonstrado que as MMPs são sintetizadas como zimogênios inativos que
requerem ativação
31
e , posteriormente, mostrou-se a existência de inibidores
endógenos de MMPs, chamados inibidores teciduais de metaloproteases
(TIMPs).
7
Depois disso, outros níveis de controle têm sido elucidados, no
entanto, muitas etapas de complexidade ainda permanecem obscuras. Além
disso, existem várias MMPs, cada uma com seu próprio perfil de expressão,
localização na superfície celular, ativação, inibição e degradação, bem como
Revisão da Literatura
20
seu próprio, às vezes amplo, espectro de substratos preferenciais. Desta
maneira, múltiplas modificações, cada uma com seu próprio perfil regulatório,
controlam as diferentes funções das MMPs in vivo. A multiplicidade das MMPs,
com funções distintas e, às vezes, sobrepostas, provavelmente atua como uma
proteção contra qualquer perda de controle regulatório.
86
2.3.1 Estrutura e função das MMPs
A primeira publicação sobre metaloprotease da matriz foi em 1962 por
Gross e Lapière. Eles observaram que durante o processo de metamorfose da
rã, quando ocorre a reabsorção da sua cauda, havia a liberação de uma
enzima que poderia atacar a tríplice hélice do colágeno. Desde então, várias
MMPs têm sido estudadas e classificadas em 5 classes principais
(colagenases, gelatinases, estromalisinas, tipo membrana e outras, incluindo
matrilisinas), baseado na especificidade do substrato e na sua homologia
interna.
81
Metaloproteases da matriz são expressas por células estromais em
respostas a estímulos, como também, pela maioria das células inflamatórias
que invadem o tecido durante eventos de remodelamento in vivo. A presença
do RNA mensageiro em células lesionadas e atividade de MMPs em lesões
indicam o papel destas enzimas em processos patológicos.
Revisão da Literatura
21
Enzimas proteolíticas são classificadas como exopeptidases e
endopeptidases com base na ocorrência de clivagem de pontes peptídicas
terminais ou internas, respectivamente. A maioria das endopeptidases é
classificada como serina, cisteína, aspartato ou metaloprotease, baseado no
seu mecanismo catalítico e sensibilidade a inibidores.
Um total de 25 MMPs de vertebrados e 22 MMPs homólogas de
humanos foram identificadas.
86
Cada uma das MMPs de vertebrados possui
substratos distintos e, às vezes, comuns sendo que juntas elas são capazes de
clivar numerosos substratos extracelulares, incluindo, virtualmente, todas as
proteínas da MEC.
84
As MMPs são referidas pelo seu nome ou de acordo com uma
nomenclatura numérica seqüencial reservada para as MMPs de vertebrados.
Além disso, elas são comumente agrupadas de acordo com suas unidades de
domínio estrutural. Todas as MMPs possuem uma seqüência de sinalização N-
terminal (ou pré-domínio), o qual é removido após direcionar a síntese da
enzima para o retículo endoplasmático. Desta forma, a maioria das MMPs são
secretadas; no entanto, seis destas apresentam domínio transmembrana e são
expressas como enzimas de superfície celular. O pré-domínio é seguido por
um pró-dominio, o qual mantem a latência da enzima até que este seja
removido ou alterado.
54
Gelatinase A e B (MMP-2 e MMP-9, respectivamente) são distinguidas
pela inserção de três repetições cabeça-cauda ricas em cisteína, em seus
domínios catalíticos. As MMPs do tipo membrana (MT-MMPs) possuem um
domínio transmembrana de alça única e uma curta cauda C-terminal
Revisão da Literatura
22
citoplasmática (MMPs 14, 15, 16 e 24) ou um domínio C-terminal hidrofóbico
que atua como um sinal de ancoramento à membrana por
glicosilfosfatidilinositol (GPI) (MMP-17 e MMP-25). Estes domínios exercem um
papel essencial na localização de diversos eventos importantes de proteólise
que ocorrem na superfície celular.
86
A atividade da gelatinase A foi observada no tecido sinovial reumatóide
por Harris e Krane em 1972, que em retrospecto, era possivelmente a MMP-2.
A atividade da gelatinase foi separada da colagenase-1 e da estromalisina-1
em meio de cultura de osso de coelho por Sellers et al, em 1978. No ano
seguinte, Liotta achou uma enzima similar em tumor de rato que digeria a
membrana basal do colágeno tipo IV. Isto permitiu uma denominação inicial de
colagenase Tipo IV, contudo atualmente, uma denominação mais
corriqueiramente encontrada é 72 kDa gelatinase. MMP-2 foi purificada de
culturas de tumor de ratos, osso de coelhos, pele humana e tecido gengival. A
seqüência da MMP-2 inclui um domínio com uma tripla repetição de
fibronectina tipo II inserida no seu domínio catalítico, contribuindo para a
ligação da enzima ao substrato da gelatina, isto faz da MMP-2, uma das
metaloproteinases com estrutura mais longa.
103
A gelatinase dos leucócitos polimorfonucleares foi descrita por Sopata et
al em 1974, era uma forma latente ativada por mercúrio. Uma enzima similar
encontrada em macrófagos de coelhos era capaz de digerir colágeno tipo V,
permitindo uma designação inicial de colagenase Tipo V. A atividade da
colagenase e da gelatinase de neutrófilos foi separada, as enzimas purificadas
e caracterizadas seguindo a seqüência de cDNA. Gelatinase B,
Revisão da Literatura
23
estruturalmente, é a maior da gelatinases, incluindo três domínios de
fibronectina e um domínio tipo colágeno tipo V. O peso molecular de cerca de
92000 daltons permitiu uma outra designação; 92 kDa gelatinase. A TIMP-1 se
liga a proMMP-9, produzindo um complexo que serve para regular a ativação e
subseqüente atividade da enzima.
103
A metaloprotease da matriz tipo-membrana-1 (MT1-MMP) ou
metaloprotease da matriz 14 (MMP-14) apresenta um domínio transmembrana
que pode ativar a ligação da pro-MMP-2 na superfície celular. Esta enzima é
detectada em neoplasias malignas, no desenvolvimento embrionário, placenta
e cartilagem.
103
Devido ao fato das MMPs degradarem as proteínas da MEC, sua
principal função tem sido referida como remodeladora dessa matriz. No
entanto, as MMPs também atuam em substratos não pertencentes à matriz,
incluindo reguladores de crescimento da superfície celular e ligados à matriz.
Portanto, a regulação coordenada das MMPs e dos TIMPs governa a clivagem
e a liberação de importantes fatores de crescimento e receptores da superfície
celular.
16
Estudos in vitro mostraram que a MMP-2 e MMP-9 são capazes de
clivar proteoliticamente TGF-β. Além disso, análises fenotípicas de
camundongos transgênicos indicam que ocorre interação genética entre MMPs
e a cascata de sinalização de TGF-β.
97, 106
Revisão da Literatura
24
2.3.2 Metaloprotease da matriz na Polpa e em Lesões Periapicais
As MMPs são enzimas responsáveis pela degradação da matriz
extracelular e estão presentes em condições inflamatórias como nas pulpites e
periodontites. BIRKEDAL-HANSEN
9
em 1995, relata que as MMPs são
expressas em baixo nível nos tecidos normais, mas aumentadas durante a
inflamação.
Em endodontia, as MMPs tem ganhado atenção em diversão estudos.
O’BOSKEY; PANAGAKOS
60
em 1998, propuseram que citocinas estimulam os
níveis de produção de MMP-2 e MMP-9 em células do tecido conjuntivo pulpar
humano em cultura de células e que estas MMPs podem desempenhar um
papel importante na inflamação pulpar. No mesmo ano, TJADERHANE et al.
96
sugerem que MMPs são ativadas por ácidos bacterianos e tem um papel
crucial na destruição da dentina por cáries.
Utilizando de experimentos em cultura de células pulpares humanas,
NAKATA et al.
56
, em 2000, observaram a influência de extratos bacterianos
anaeróbicos na produção de MMPs ( MMP-1 e -2) e de TIMPs (TIMP-1 e -2),
por meio do teste ELISA. As bactérias gram negativas escolhidas foram:
Prevotella intermédia, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis
e Porphyromonas gingivalis por estarem associadas à inflamação da polpa
dentária. O estudo demonstrou que as células pulpares foram estimuladas a
produzir MMP-1 e MMP-2 quando em contatos com o extrato bacteriano. Já a
produção de TIMP-1 foi insignificantemente aumentada e os níveis de TIMP-2
Revisão da Literatura
25
foram diminuídos quando em contato com o extrato, permitindo um aumento da
produção de MMPs.
No ano seguinte, CHANG et al.
18
procuraram verificar os efeitos de
algumas citocinas: interleucina-1, fator de crescimento transformante-β,
inibidores da síntese de proteína - cycloheximide (CD) e inibidores da proteína
C quinase na produção e secreção de MMPs em cultura de células humanas,
usando para isso o método da zimografia. A principal gelatinase secretada pela
cultura de células pulpares foi a MMP-2, que migrou para a banda de 72 kDa; a
menor banda observada foi de 92kDa, correspondendo a MMP-9. Com este
estudo, foi observado que citocinas inflamatórias e agentes farmacológicos
estimulam os níveis de produção de MMP-2, e esta pode desempenhar um
papel importante na inflamação.
As colagenases (MMP-1 e MMP-8) e as gelatinases (MMP-2 e MMP-9)
estão presentes em fluidos de cistos radiculares. A expressão de MMP-8
aparece também em linhagem de células polimorfonucleadas, fibroblastos de
polpas dentárias, odontoblastos, células epiteliais e células plasmáticas. Já os
macrófagos expressam várias MMPs, incluindo colagenase 1 (MMP-1),
gelatinase (MMP-2 e MMP-9), estromalisinas (MMP-3, MMP-7 e MMP-12).
98
Durante o tratamento endodôntico, ocorre um decréscimo no exsudato
proveniente dos canais radiculares e consequentemente nos níveis de MMP-8.
Utilizando estudos com a MMP-8 e por meio de análises de Western Blotting e
imuno-histoquímica, WAHLGREN et al.
98
, em 2002, coletaram exsudatos de
canais radiculares durante cada uma das três sessões utilizadas na terapia
endodôntica. A diminuição dos níveis de MMP-8 após a primeira sessão, se
Revisão da Literatura
26
deu pela remoção do tecido pulpar e em casos de necropulpectomia pela
instrumentação dos canais. A presença da degradação de proteínas da matriz
extracelular indica a fase ativa no sítio inflamatório. Hipoteticamente, se numa
terceira sessão houvesse ausência de MMP-8 no exsudato de canais
radiculares, haveria reflexos de desaparecimento da inflamação e indícios de
cura da peridontite apical. A presença dos níveis de MMP-8 no exsudato de
canais radiculares serve de indicador bioquímico para a monitorização dos
níveis de inflamação do tecido periapical.
Em 2002, SHIN et al.
77
pesquisaram os níveis de MMP-1, -2 e -3 em
polpa e lesões periapicais, por meio de estudos em imuno-histoquímica e teste
ELISA. Neste estudo, os resultados da imunomarcação sugeriram que MMP-1
e MMP-3 são secretadas por leucócitos polimorfonucleares (PMNs),
macrófagos, plasmócitos e linfócitos e apareceram localizadas na matriz
extracelular ao redor destas. A MMP-2 foi mais observada em processos
agudos, e imunomarcadas em células inflamatórias e fibroblastos. O teste
ELISA inclui ambas as formas de MMP, ativa e latente, então a concentração
elevada de MMPs nem sempre indica o estado de destruição tecidual.
Contudo, as MMPs aparecem ser positivamente relacionadas com os sintomas
dos pacientes, o qual se deve a elevação dos níveis de PGE2, induzindo a
produção de colagenase em macrófagos.
GUSMAN; SANTANA; ZEHNDER
30
, em 2002, por meio de estudos de
zimografia e testes ELISA, compararam os níveis de MMP-1, MMP-2, MMP-3 e
MMP-9 em polpas sadias e inflamadas. Os autores observaram que os altos
níveis de MMP-9 em polpas inflamadas e sua correlação com atividade
Revisão da Literatura
27
gelatinolítica são sugestivas, apresentado papel chave como mediador do
processo inflamatório pulpar humano. Na inflamação, a MMP-9 é abundante,
sendo secretada, principalmente por leucócitos polimorfonucleares. Por isso, os
neutrófilos e suas enzimas, podem ser a causas principais da caracterização
da pulpite aguda. As demais MMPs estudadas não apresentaram aumento
significativo entre as condições de normalidade para a patológica.
Após induzir lesões periapicais em ratos, LIN et al.
42
, em 2002,
observaram a expressão de MMP-1, TIMP-1, IL-6 e COX-2. A imuno-
histoquímica e a hibridização in situ foram realizadas nos períodos
experimentais (5, 10, 15 e 20 dias após a indução da lesão periapical). A
proposta do estudo foi a administração de meloxican em um grupo de ratos e
outros não receberam este tratamento. Os resultados demonstraram que uma
redução de 43% da perda óssea (reabsorção óssea) e simultânea queda na
percentagem da expressão de MMP-1 e IL-6 m-RNA. A COX-2 desempenha
um importante papel na patogênese da lesão periapical por modular
indiretamente a expressão de MMP-1 e IL-6.
Por meio de um estudo em culturas de células humanas, pulpares e do
ligamento periodontal humanos, CHANG et al.
17
, em 2002, estimularam a
secreção de metaloprotease da matriz, quando bacteróides produtores de
pigmentos negros eram colocados em contato com o meio de cultura. As
bactérias testadas, Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gengivalis,
são especialmente associadas às infecções e abcessos de origem
endodôntica. A zimografia demonstrou que a MMP que mais foi secretada
migrou para 72 kDa, correspondendo a MMP-2, em menor número a MMP-9
Revisão da Literatura
28
(92 kDa) apareceu em segundo lugar. Nos períodos avaliados de 1, 4 e 8 dias,
a MMP-2 apareceu aumentar seu nível de expressão, enquanto que a MMP-9
não alterou seu padrão de expressão em relação ao tempo.
PALOSSAARI et al.
64
, em 2003, estudaram o perfil da expressão de 19
matriz metaloproteinases (MMPs) e seus inibidores teciduais específicos
(TIMP-1, -2 e -3) em cultura de odontoblastos humanos e em tecido pulpar. A
metodologia foi composta por experimentos com RT-PCR (reverse
transcriptase polymerase chain reaction), Western Blotting e zimografia. Outro
objetivo deste estudo foi analisar a influência do fator de crescimento
transformante-β (TGF- β) e da proteína morfogenética óssea- 2 (BMP-2), nos
níveis de expressão das MMPs. Os resultados demonstraram que
odontoblastos e o tecido pulpar expressam MMP-1, -2, -9, -10, -11, - 13, -14, -
15, -16, -17, -19, -20 e -23, como também as TIMP-1, -2 e -3. A MMP-3 e a
MMP-12 não foram expressas na polpa e nos odontoblastos. As MMP-7, --8, -
24 e -25 foram expressas somente nos odontoblastos. O TGF- β sozinho e
junto com a BMP-2 significantemente regularam positivamente a atividade de
MMP-9 em odontoblastos, com resposta negativa ao tecido pulpar. Os autores
concluíram que as MMPs desempenham um importante papel no processo
fisiológico e patológico do complexo dentina-polpa, uma vez que participam na
mineralização e nos processos de reparação tecidual, onde ocorrem mudanças
na organização da matriz do tecido pulpar.
Em 2004, HUANG et al.
32
, também em cultura de células pulpares
humanas, procuraram estudar os efeitos de vários agentes farmacológicos:
Herbamicin A (inibidor da tirosina quinase), dexametazona (NF-kB) , NS-398
Revisão da Literatura
29
(inibidor seletivo da COX-2), SB203580 (inibidor p38), PD098059 (inibidor ERK)
e LY294002 (inibidor PI3K) na produção e secreção de MMPs. Por meio da
zimografia, nos períodos de 1, 2 e 4 dias, a principal MMP secretada foi a
MMP-2, uma banda menor de MMP-9 foi observada. O estudo demonstrou que
dentre os fármacos estudados, o NS-398, a dexamethazona e herbamicin A
podem regular a produção de MMP-2.
Em 2005, LEONARDI; CALTABIANO; LORETO
40
estudaram por meio
de estudo de imunohistoquímica a expressão de MMP-13 (colagenase-3) em
lesões periapicais. Foram selecionados para o estudo 17 granulomas
periapicais, sendo destes 10 epiteliados. A proposta do trabalho foi verificar,
por meio de avaliação qualitativa da imunomarcações, se a presença de MMP-
13 é verificada em maior grau nos granulomas com epitélio. Os resultados
demonstraram que a MMP-13 estão em maior número nestes casos,
influenciando não somente a migração epitelial, mas também a invasão deste
no tecido de granulação.
2.4 Inibidores Teciduais de Metaloproteases (TIMPs)
Inibidores teciduais de metaloproteases são os maiores inibidores
celulares de MMPs. Quatro TIMPs (-1, -2, -3 e -4) tem sido clonadas,
purificadas e caracterizadas, apresentando muitas similaridades básicas,
todavia exibem distintas características estruturais, propriedades bioquímicas e
Revisão da Literatura
30
padrões de expressão. Isto sugere que cada TIMP possui um específico papel
in vivo.
4
As TIMPs são proteínas multifuncionais, possuem peso molecular em
torno de 21 KDa e são secretadas na MEC, contudo podem ser encontradas
próximas à superfície celular quando associadas com alguma outra proteína
ligada à membrana, por exemplo a TIMP-2.
4
São expressas por muitos tipos
celulares incluindo fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células
endoteliais.
9
As TIMPs interferem no crescimento e sobrevivência celular. Distúrbios
entre MMPs e TIMPS estão envolvidas na etiologia de algumas doenças como
a artrite, enfisema pulmonar, arteriosclerose e periodontites, na qual a perda da
MEC é a maior característica.
Por esta razão existe um grande interesse no
desenvolvimento de inibidores sintéticos de MMPs, o qual poderiam ser usados
na terapia médica e odontológica.
81
2.5 Gene Supressor RECK
O fenômeno da reversão de células transformadas e tumorais para um
fenótipo normal, têm permitido abordar o papel de oncogenes e de genes
supressores de tumor não só no controle da proliferação celular normal como,
também, na transformação celular, e nos mecanismos de transdução de sinais.
57
Revisão da Literatura
31
Com o objetivo de estudar os mecanismos moleculares envolvidos na
transformação maligna têm-se isolado e caracterizado cDNAs, os quais,
quando super-expressos, induzem a reversão fenotípica da linhagem DT, uma
sublinhagem de células NIH-3T3 transformadas com v-Ki-ras.
36, 57, 58, 91, 92
Utilizando esta abordagem, foi isolado um cDNA que codifica uma nova
glicoproteína de membrana denominada RECK (reversion-inducing cysteine-
rich protein with Kazal motifs).
92
Tanto o cDNA humano quanto o de camundongo codificam para uma
proteína composta por 971 resíduos de aminoácidos, demonstrando uma
identidade de 93% entre ambos. A proteína RECK é rica em cisteína e contém
regiões hidrofóbicas tanto na região NH2- terminal quanto na porção COOH-
terminal. A seqüência peptídica da proteína humana madura expressa em
células de mamíferos, indica que a porção NH2- hidrofóbica terminal (26
resíduos) funciona como um sinal peptídico, enquanto que a porção COOH-
terminal parece funcionar como um sinal para a âncora de
glicosilfosfatidilinusitol pela qual RECK é ancorada a membrana plasmática. A
porção mediana da proteína contém três domínios semelhantes aos inibidores
de serina-proteases: domínios condizentes com “motifs” de Kazal. Além disso,
foram detectadas duas regiões de repetição de fraca homologia com o fator de
crescimento epidermal, “motif” de cisteína e cinco sítios com potencial de
glicosilação.
92
O gene RECK é expresso em diversos tecidos humanos normais,
porém, sua expressão é reprimida durante a transformação celular, uma vez
que a expressão deste gene não foi detectada nas inúmeras linhagens
Revisão da Literatura
32
tumorais analisadas. A expressão constitutiva do gene RECK em linhagens
celulares malignas, incluindo HT1080, B16, SW48, A549, HeLa e A673, resulta
em supressão da atividade invasiva e metastática destas células. Além disso,
estudos demonstram que a forma solúvel da proteína RECK retém a habilidade
de supressão da invasão tumoral. Análise de meio condicionado de culturas
celulares em ensaios de zimografia, mostraram que a atividade de uma
metaloproteinase de matriz (MMP-9), enzima envolvida em processos de
invasão tumoral e metástase por meio da degradação do colágeno da matriz
extracelular, estava drasticamente reduzida nos transfectantes de RECK.
Ensaios de Northern Blot sugeriram que tal regulação era um evento pós-
transcricional, já que não foram observados diferenças nos níveis de mRNA.
Além disso, demonstrou-se que a associação de RECK com a membrana
plasmáica era necessária para a supressão da atividade de MMP-9 já que a
forma solúvel de RECK não apresentou tal resultado.
92
Por meio de ensaios bioquímicos, foi mostrado que a proteína RECK
purificada se liga a MMP-9 e inibe a sua atividade proteolítica, sendo este
mecanismo ainda não explorado.
92
A proteína RECK solúvel purificada parece ser capaz de se ligar a
proMMP-9 purificada e inibir a atividade proteolítica desta enzima in vitro. No
entanto, o potencial de inibição parece ser menor que o observado para inibir
TIMP-1. O truncamento artificial da porção COOH terminal e/ou a possibilidade
de inativação durante a purificação podem refletir o potencial relativamente
baixo de inibição da atividade de MMP-9 mediada por RECK na membrana da
célula. É interessante notar que uma proteína relatada como sendo relacionada
Revisão da Literatura
33
com inibidores de uma classe de proteases (serina-proteases) mostra-se capaz
de regular um membro de outra classe de protases (MMPs).
92
Relatos recentes mostram que RECK regula negativamente, além da
MMP-9, duas outras MMPs: MMP-2 e MT1-MMP
61
; revisto por RHEE;
COUSSENS
70
em 2002. O processamento da pro-MMP-2 ocorre por meio de
duas clivagens proteolíticas consecutivas, as quais ocorrem, preferencialmente,
na membrana plasmática.
25
Têm sido descrito que o restabelecimento da
expressão de RECK em linhagem de fibrossarcoma resulta em uma diminuição
tanto da forma intermediária quanto da forma ativa de MMP-2, sugerindo que
RECK regula a ativação da pro-MMP-2 por inibir duas enzimas proteolíticas
necessárias para o seu processamento, especificamente as enzimas MT1-
MMP e a própria MMP-2 ativa.
61
As funções biológicas de RECK in vivo foram exploradas, recentemente,
por meio de experimentos com camundongos “Knock-out” e de ensaios de
tumorigenicidade em camundongos “nude”.
61
Camundongos no qual a proteína
RECK funcional está ausente morrem em torno do décimo dia da fase
embrionária com deficiências de fibras de colágeno, desorganização da lâmina
basal e comprometimento do desenvolvimento vascular. Este fenótipo foi
parcialmente suprimido pelo “knock-out” do gene correspondente à MMP-2,
indicando que a regulação da atividade de MMP-2 mediada por RECK tem um
papel fisiológico.
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
37
4- MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostras teciduais de lesões periapicais para RT-PCR
Os tecidos provenientes de 15 cirurgias paraendodônticas, foram
coletados, lavados em solução salina para remoção do excesso de sangue e
divididos em 2 partes relativamente iguais. Esses tecidos periapicais coletados
foram procedentes de casos clínicos onde foi constatado insucesso após
retratamento endodôntico da clínica de Endodontia da Faculdade de
Odontologia de Bauru. Uma parte da amostra foi acondicionada em solução de
formol tamponado à 10% (Merck, Darmstedt, Germany) e encaminhada para o
Serviço de Patologia da Faculdade de Odontologia de Bauru para laudo
anatomopatológico; a outra parte foi colocada em contato com RNAlater®
(Ambion, Texas, USA) e mantida em -70ºC, para posterior obtenção do RNA
total. Após análise microscópica dos tecidos coletados, 8 eram granulomas
periapicais, 6 cistos periapicais e 1 cicatriz apical. Os tecidos em RNAlater®
foram encaminhados para o IQ (Instituto de Química da Universidade de São
Paulo), para realização dos ensaios em RT-PCR.
4.2 Preparação de RNA total
Os tecidos foram macerados manualmente em cadinho de porcelana na
presença de nitrôgenio líquido e, posteriormente, lisados em solução de
isotiocianato de guanidina 4M, citrato de sódio 25mM pH 7, e
Material e Métodos
38
betamercaptoetanol 0,1M. Os tecidos lisados foram transferidos para tubos de
polialômero contendo solução de cloreto de césio 5,7M, acetato de sódio 25mM
pH5,0 e centrifugados a 37000rpm por, aproximadamente, 18 horas a 20
o
C.
20
O precipitado de RNA foi redissolvido em volume adequado de água estéril.
Após a quantificação espectrofotométrica, a qualidade do RNA é visualizada
em gel de agarose contendo tiocianato de guanidina 20mM.
4.3 Ensaios de Real Time PCR
4.3.1 Síntese da primeira fita do cDNA
O RNA total resultante do item 4.2 foi utilizado como molde (template)
para a síntese de cDNA em uma reação de transcrição reversa. Desta forma,
foram preparadas as reações contendo 1µg de RNA total, proveniente de cada
uma das amostras utilizadas separadamente, adicionando para cada reação:
1µL de Oligo dT 500ηg/ml (Amersham Biosciences, Inglaterra), 0,5µL de
“Random Primer” 100ηg/µL e H
2
O para um volume final de 12µL. As amostras
foram incubadas a 75
o
C por 10 minutos e, em seguida, adicionou-se 7µl de
uma solução contendo 2µl de Buffer 5x para a enzima Super Script (Invitrogen,
Califórnia, USA), 2µL de DTT (Ditiotrietol) e 0,5µL de RNase OUT 40U/µL e
2,5µL de H
2
O foram adicionados para cada amostra de RNA. Houve uma nova
incubação de 25
o
C por 10 minutos, 42
o
C por 2 minutos, sendo então
adicionado 1µL da enzima SuperScript 200U/µl (Invitrogen Carlsbad, Califórnia,
USA).
Material e Métodos
39
A reação enzimática ocorreu num período de incubação de 2 horas a
42
o
C. Em seguida, para inativação da enzima, a amostra foi incubada a 72
o
C
por 10 minutos. Visando degradar o RNA, foi adicionado 1µL de RNase H
5U/µL em cada tubo e estes novamente foram incubados a 37
o
C por 30
minutos seguidos por mais 10 minutos à 72
o
C, para inativação da RNase H.
Posteriormente, as amostras foram diluídas em 60µL de TE.
4.3.2 Controle da qualidade do cDNA
Para confirmar a qualidade do cDNA sintetizado, foram realizadas, como
controle, reações de PCR utilizando um diferente conjunto de “primer” (para o
gene GAPDH) e, como molde, o cDNA sintetizado em 4.3.1. Cada reação foi
montada de forma que apresentasse uma concentração final de 1x para o
Tampão de Reação (Biolase), 1,5mM de MgCl2, 0,2mM de dNTP, 0,2µM do
“primer” (Forward e Reverse), enzima Taq (Biolase) e a fita molde (template).
Nas reações onde foi utilizado o “primer” GAPDH foi utilizado um
programa de 94
o
C por 2 minutos, 35 ciclos de 94
o
C por 30 segundos, 56
o
C por
30 segundos e 72
o
C por 45 segundos e, após os ciclos, 72
o
C por 6 minutos. As
reações foram posteriormente analisadas em um gel de agarose 1% contendo
Brometo de Etídeo.
4.4 Confirmação dos genes por Real-Time PCR
4.4.1 Desenho dos “primers”
Material e Métodos
40
Os “primers” que foram utilizados para a amplificação dos genes nos
experimentos de Real-Time PCR foram desenhados com o auxílio do programa
PrimerExpress (Applied Biosystems, Califórnia, USA), o qual desenha “primers”
com as características necessárias para os experimentos de Real-Time PCR
no termociclador ABI 5700. As principais características destes oligos são:
amplificar fragmentos cujo tamanho máximo não exceda 20bp, quantidade
moderada de CG (40-60%), não possuir a capacidade de anelar entre si ou
formarem estrutura secundária, temperatura de anelemamento entre 58
o
C e
60
o
C.
11
Levando-se em consideração os parâmetros acima enumerados, os
"primers" foram desenhados para cada um dos genes estudados:
hRECK
F: 5' TGCAAGCAGGCATCTTCAAA 3'
R: 5' ACCGAGCCCATTTCATTTCTG 3'
hGAPDH
F: 5' ACCCACTCCTCCACCTTTGA 3'
R: 5' CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT 3'
hMMP-2
F: 5' AGCTCCCGGAAAAGATTGATG3'
R: 5' CAGGGTGCTGGCTGAGTAGAT3'
Material e Métodos
41
hMMP-9
F: 5' CCTGGAGACCTGAGAACCAATC3'
R: 5' GATTTCGACTCTCCACGCATCT3'
hMMP-14
F: 5’GCAGAAGTTTTACGGCTTGCA3’
R: 5’TCGAACATTGGCCTTGATCTC3’
hTIMP-1
F: 5' CCGCAGCGAGGAGTTTCTC3’
R: 5' GAGCTAAGCTCAGGCTGTTCCA3’
hTIMP-2
F: 5' TGAGCACCACCCAGAAGAAGA3’
R: 5' AGGAGATGTAGCACGGGATCA3’
4.4.2 Confirmação da expressão diferencial
Para a quantificação do produto formado durante a reação de Real-Time
PCR foi utilizado o reagente SYBR® Green Dye (Applied Biosystems,
Califórnia, USA). O SYBER Green Dye possui afinidade pela menor curva da
dupla fita de DNA. Quando não está ligado ao DNA, emite uma pequena
fluorescência no comprimento de onda de 520ηm, entretanto, quando se liga a
dupla fita de DNA, a fluorescência é aumenta cerca de 100 vezes, permitindo
então a detecção do produto do PCR em tempo real.
39
Material e Métodos
42
O gerenciamento do termociclador e a coleta dos dados gerados durante
a amplificação são realizados pelo programa ABI-Manager SDS (Roche).
Utilizando o mesmo programa, foi escolhida a concentração de “primers” que
resultaram em uma formação de “primer-dimer” mínima, ou inexistente, e a
menor variação entre as duplicatas.
Todas as reações de Real-Time PCR foram realizadas em duplicata.
Como fita molde, foi utilizado 3µL de cDNA sintetizado anteriormente, 3µL de
“primer” na concentração final de 600ηM e 6µL do SYBER Green Dye. O
aparelho ABI 5700 trabalha com placas de 96 poços, e todas as reações foram
montadas tomando-se precauções para que na placa não se depositasse pó,
talco ou outras partículas que pudessem interferir na leitura da fluorescência.
Na análise inicial dos dados, realizada por meio do programa ABI-
Manager SDS, foi definido, manualmente, um limiar que estivesse na fase
exponencial de amplificação do gene. Assim que é selecionado o limiar, da
intersecção deste com a curva de amplificação, é obtido o Ct daquela amostra
“Threshold Cycle” (Limiar do Ciclo), que é definido como o ciclo onde a
fluorescência se encontra estatisticamente acima do background. Assim, temos
que, quanto maior a concentração de um gene, mais rapidamente a sua curva
de amplificação irá atingir o limiar e menor será o seu Ct. Conseqüentemente,
quanto menor a sua concentração, maior o seu Ct. Portanto, podemos dizer
que a diferença de expressão de um gene, que está sendo analisado em
diferentes amostras, pode ser dada pela diferença dos seus Cts frente a um
determinado limiar.
Material e Métodos
43
Quando se analisam duas ou mais amostras em um experimento de
Real-Time PCR, tem-se freqüentemente uma variação da concentração de
cDNA entre elas, então, para que os dados possam ser comparados, é
necessário que estes sejam previamente normalizados. Para análise dos dados
provenientes de experimentos de Real-Time PCR foi realizada uma
quantificação relativa por meio da obtenção de uma curva de um gene que não
possui alteração de expressão nas amostras analisadas, e então, para cada
amostra, a expressão do gene que está sendo estudada foi determinada em
função da expressão do gene controle. Assim, para cada cDNA analisado eram
feitas duas reações, uma utilizando “primers” para o gene analisado e a outra
utilizando “primers” para um controle interno. Terminada a reação, era
fornecido ao ABI-Manager SDS um limiar e então o programa retornava o Ct de
cada reação.
A partir desses cálculos, foi possível analisar a diferença de formação do
produto do PCR, que está diretamente ligado à expressão do gene entre as
amostras analisadas.
4.4.3 Análise estatística
Análise entre granulomas e cistos periapicais foram realizados por meio
do teste “t”. Para todas as análises, valores de p<0,05 foram considerados
estatisticamente significantes. Todos os testes estatísticos foram realizados por
meio do programa GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc, EUA).
Material e Métodos
44
A correlação de transcritos para MMP-2, -9 e -14, TIMP-1, -2 e RECK foi
realizado pelo teste de Pearson, com o auxílio do GraphPad Prism 3.0 software
(GraphPad Software Inc, EUA)
4.5 Amostras teciduais de lesões periapicais para Imuno-histoquímica
Os tecidos provenientes de 30 cirurgias paraendodônticas foram
coletados, lavados em soro fisiológico, acondicionados em solução de formol à
10% e encaminhada para o Serviço de Patologia da Faculdade de Odontologia
de Bauru para laudo anatomopatológico. Esses tecidos periapicais coletados
foram procedentes de casos clínicos onde foi constatado insucesso após
retratamento endodôntico da clínica de Endodontia da Faculdade de
Odontologia de Bauru. As lâminas dos tecidos biopsiados foram analisadas,
selecionando uma amostra somente constituída de 10 granulomas periapicais.
Os critérios de inclusão e exclusão da amostra destinada à imuno-histoquímica
foram:
• Tamanho do tecido coletado: Amostras de granulomas que
tiverem um fragmento mínimo de 0,8 x 0,8.
• Amostras de tecido mais representativas, com história clínica e
evolução do caso clínico foram incluídas.
• Pacientes com histórico de medicação antiinflamatória e
antibiótica prévia a cirurgia foram excluídos. Diversos estudos
demonstram a interferência na produção de MMP na presença de
fármacos.
32, 64
Material e Métodos
45
O exame microscópico da lâmina coradas em hematoxilina e eosina foi
realizado. Uma vez a amostra selecionada, os blocos de parafina contendo as
lesões foram cortados em 3µm e depositados em lâminas silanizadas (Super
Frost Plus, Erviegas Instrumental Cirúrgico Ltda, São Paulo, Brasil).
A caracterização imuno-histoquímica das células foi realizada usando-
se o método da imunoperoxidase (Streptoavidina-Biotina) e seguiu o seguinte
protocolo para sua execução:
As amostras selecionadas foram desparafinizadas e hidratadas por meio
de imersão em xilol (3 banhos de 5 minutos cada), álcool absoluto (1 vez por 3
minutos cada), álcool etílico 95% (1 vez por 3 minutos), álcool 70% (1 vez por 3
minutos), solução fosfato salina tamponada (PBS), por 5 minutos. Seguidos de
incubação em peróxido de hidrogênio a 3%, diluído em PBS, pH 7.2 por 40
minutos, para bloqueio da peroxidase endógena. Após esta etapa, as lâminas
foram novamente lavadas em PBS por 5 minutos e imersas em tampão citrato
(DAKO-P4809), pH = 6.0, aquecido a 95
0
C, para exposição antigênica, por 20
minutos. Após serem lavadas em PBS por 5 minutos, todas as lâminas foram
incubadas com soro de leite a 3% em água destilada por 20 minutos, a fim de
se obter o bloqueio das ligações protéicas inespecíficas. Em seguida as
lâminas foram secas com papel absorvente e incubadas com os anticorpos
primários, por 18 horas. Foram utilizados anticorpos policlonais anti-MMP-2
(8B4 sc – mouse 13595, Santa Cruz Biotechnology INC, Santa Cruz, CA, USA),
anti-MMP-9 (C20 sc- goat 6840, Santa Cruz Biotechnology) e anticorpos
policlonais anti-CD68 (C18 sc- goat 7082, Santa Cruz Biotechnology) diluídos
Material e Métodos
46
em PBS associado a 1% de soro albumina bovina (PBS-BSA 1%). Para a
MMP-2, -9 e CD68+ a diluição foi de 1:100.
Após o período de incubação com o anticorpo primário, as amostras
foram lavadas em PBS e incubadas com anticorpo secundário universal (Kit
DAKO, LSAB + systems-HRP – KO690), utilizado conforme fabricação do
fabricante. Esse anticorpo secundário é biotinilado, associado à biotina e
moléculas de streptoavidina conjugada com a peroxidase. Após esta etapa, as
lâminas são novamente lavadas por 5 minutos em PBS e posteriormente
incubadas em uma solução de 3,3’-Diaminobenzidina (DAB) diluída em
temperatura ambiente (KitDako – líquido DAB substrate –chromogen system).
Após este tempo, as lâminas foram lavadas em água destilada, desidratadas
com alccóis, pasadas em xilol (3 vezes) e coradas com hematoxilina de Harrys
por 5 minutos. Após este processo as lâminas foram montadas com Entellan.
4.5.1 Controle positivo e negativo
O controle positivo para as reações envolvendo Metaloproteases foi o
câncer de mama humano
40
que foi processado da mesma maneira que as
amostras testes. O controle positivo é indicativo da correta preparação da
amostra e realização adequada de todas as etapas da coloração. Para o
controle negativo foi utilizado o tecido deste estudo (granuloma periapical), não
contendo o antígeno alvo, ou seja, não aplicando o anticorpo primário,
substituíndo por PBS-BSA a 1%.
Resultados
48
5 RESULTADOS
As 15 amostras coletadas (14 lesões periapicais entre granulomas e
cistos e 01 cicatriz periapical) foram submetidas ao Real time RT-PCR.
5.1 Expressão das MMP-2 em granulomas, cistos e cicatriz periapicais.
Os níveis médios da expressão relativa das MMP-2 apareceram nas
amostras pesquisadas (Figuras 1 e 2), alternado seus níveis entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais. Entre os granulomas e cistos periapicais, os níveis
de expressão desta metaloprotease da matriz não apresentaram diferença
estatisticamente significante, quando comparadas entre si. A amostra C3, na
figura 1, um cisto periapical, apresentou o maior pico de expressão de MMP-2.
Os menores índices (abaixo de 0,2) de granulomas e cistos periapicais
(amostras G1, C4, G7 e G8) se equipararam à cicatriz periapical (Figura 1).
Resultados
49
G1 G2 G3 C1 G4 G5 C2 C3 C4 C5 G6 G7 C6 G8 CP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
MMP-2
C CISTO
G GRANULOMA
CP CICATRIZ PERIAPICAL
Amostras
Figura 1
Expressão relativa
MMP-2
cistos granulomas cicatriz
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Amostras
Figura 2
Expressão relativa
Figura 1: Níveis médios de expressão das MMP-2 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais. Figura 2: Níveis médios de expressão das MMP-2
nos grupos das amostras (gráfico de dispersão).
5.2 Expressão das MMP-9 em granulomas, cistos e cicatriz periapicais
Os níveis médios da expressão relativa das MMP-9 apareceram nas
amostras pesquisadas comportando-se de forma diferente quando comparadas
à MMP-2 (Figura 3 e 4). Entre os granulomas e cistos periapicais, os níveis de
expressão de MMP-9 não apresentaram diferença estatisticamente significante,
quando comparadas entre si. A amostra C6, um cisto periapical, apresentou o
maior pico de expressão de MMP-9. Os menores índices foram das amostras
de granulomas G1, G7 e G8 e de cistos C4 e C5, se equiparando à cicatriz
periapical.
Resultados
50
G1 G2 G3 C1 G4 G5 C2 C3 C4 C5 G6 G7 C6 G8 CP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
MMP-9
C CISTO
G GRANULOMA
CP CICATRIZ PERIAPICAL
Amostras
Figura 3
Expressão relativa
MMP-9
cistos granulomas cicatriz
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Amostras
Figura 4
Expressão relativa
Figura 3: Níveis médios de expressão das MMP-9 entre granulomas, cistos
e cicatriz periapicais. Figura 4: Níveis médios de expressão das MMP-9 nos
grupos das amostras (gráfico de dispersão).
5.3 Expressão de RECK em granulomas, cistos e cicatriz periapicais
Os níveis médios da expressão relativa de RECK apresentaram-se,
razoavelmente, bem uniformes entre as amostras pesquisadas, independente
do diagnóstico anatomopatológico, não havendo diferença estatística
significante entre as patologias estudadas.
Os valores médios da expressão relativa de RECK de granulomas,
cistos e cicatriz periapicais são demonstrados na figura 5 e 6. A amostra C3,
um cisto periapical, revela um alto índice de expressão relativa de RECK em
relação às demais amostras, que mantiveram um padrão de expressão bem
menor (Figura 5).
Resultados
51
G1 G2 G3 C1 G4 G5 C2 C3 C4 C5 G6 G7 C6 G8 CP
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
0.055
0.060
0.065
0.070
0.075
0.080
0.085
RECK
C CISTO
G GRANULOMA
CP CICATRIZ PERIAPICAL
Amostras
Figura 5
Expressaõ relativa
RECK
cistos granulomas cicatriz
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
Amostras
Figura 6
Expressão relativa
Figura 5: Níveis médios de expressão de RECK entre granulomas, cistos e
cicatriz periapicais. Figura 6: Níveis médios de expressão de RECK nos grupos
das amostras (gráfico de dispersão).
5.4 Expressão de TIMP-1 em granulomas, cistos e cicatriz periapicais
Os níveis médios da expressão relativa de TIMP-1 se apresentaram bem
uniformes entre as amostras pesquisadas, independente do diagnóstico
anatomopatológico, não havendo diferença estatística significante entre as
patologias estudadas.
Os valores médios da expressão relativa de TIMP-1 de granulomas,
cistos e cicatriz periapicais são demonstrados na figura 7 e 8. A exceção
ocorreu na amostra C2, um cisto periapical, que revelou um alto índice de
expressão relativa de TIMP-1 em relação às demais, que mantiveram um
padrão de expressão menor e mais uniforme(Figura 7).
Resultados
52
G1 G2 G3 C1 G4 G5 C2 C3 C4 C5 G6 G7 C6 G8 CP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
TIMP-1
C CISTO
G GRANULOMA
CP CICATRIZ PERIAPICAL
Amostras
Figura 7
Expressaõ relativa
TIMP-1
cistos granulomas cicatriz
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Amostras
Figura 8
Expressão relativa
Figura 7: Níveis médios de expressão de TIMP-1 entre granulomas, cistos e
cicatriz periapicais. Figura 8: Níveis médios de expressão de TIMP-1 nos
grupos das amostras (gráfico de dispersão).
5.5 Expressão de TIMP-2 em granulomas, cistos periapicais e cicatriz
periapicais
Os níveis médios da expressão relativa de TIMP-2 aparecem nas
amostras pesquisadas, comportando-se de forma diferente quando
comparadas à TIMP-1 (Figura 9). Entre os granulomas e cistos periapicais, os
níveis médios de expressão deste inibidor de metaloprotease da matriz não
apresentaram diferença estatisticamente significante, quando comparadas
entre si. A amostra C3 e C6, cistos periapicais, que revelaram um alto índice de
expressão relativa de TIMP-2 em relação às demais, que mantiveram um
padrão de expressão menor e mais uniforme (Figura 7).
Resultados
53
G1 G2 G3 C1 G4 G5 C2 C3 C4 C5 G6 G7 C6 G8 CP
0.0
0.1
0.2
0.3
TIMP-2
C CISTO
G GRANULOMA
CP CICATRIZ PERIAPICAL
Amostras
Figura 9
Expressaõ relativa
TIMP-2
cistos granulomas cicatriz
0.0
0.1
0.2
0.3
Amostras
Figura 10
Expressão relativa
Figura 9: Níveis médios de expressão de TIMP-2 entre granulomas, cistos e
cicatriz periapicais. Figura 10: Níveis médios de expressão de TIMP-2 nos
grupos das amostras (gráfico de dispersão).
5.6 Expressão de MMP-14 em granulomas, cistos e cicatriz periapicais
Os níveis médios da expressão relativa de MMP-14 aparecem nas amostras
pesquisadas (Figura 11 e 12), alternando seus níveis entre granulomas, cistos
e cicatriz periapical. Entre os granulomas e cistos periapicais os níveis de
expressão desta metaloprotease da matriz não apresentaram diferença
estatisticamente significante, quando comparadas entre si.
Resultados
54
G1 G2 G3 C1 G4 G5 C2 C3 C4 C5 G6 G7 C6 G8 CP
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.10
0.11
0.12
MMP- 1 4
C CISTO
G GRANULOMA
CP CICATRIZ PERIAPICAL
Amost r as
Figura 11
Expressão relativa
MMP-14
cistos granulomas cicatriz
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
Amostras
Figura 12
Expressão relativa
Figura 11: Níveis médios de expressão de MMP-14 entre granulomas,
cistos e cicatriz periapicais. Figura 10: Níveis médios de expressão de MMP-14
nos grupos das amostras (gráfico de dispersão).
5.7 Correlação entre a expressão de transcritos para MMP-2, -9 e -14,
TIMP-1, -2 e RECK
Os resultados para cada gene pesquisado não apresentaram
significância estatística quando confrontados entre granulomas e cistos
periapicais (teste “t”). Baseado nisso, correlacionou-se os resultados do grupo
lesão periapical (dados das amostras de granulomas e cistos periapicais
mediante a expressão de cada gene) entre os primers testados. Para isso, o
Resultados
55
teste de Pearson foi realizado com o auxílio do GraphPad Prism 3.0 software
(GraphPad Software Inc, EUA) e valores considerados estatisticamente
significantes foram identificados (p<0,05) (Figura 13).
MMP-2 / TIMP-2
P<0,0007
MMP-2 / RECK P<0,0011
MMP-2 / MMP-14 P<0,0169
MMP-9 / TIMP-2 P<0,0224
MMP-9 / MMP-14 P<0,007
TIMP-2 / RECK P<0,0005
TIMP-2 / MMP-14 P<0,0004
MMP-2 / MMP-9 NS
MMP-2 / TIMP-1 NS
MMP-9 / TIMP-1 NS
MMP-9 / RECK NS
TIMP-1 / TIMP-2 NS
RECK / MMP-14 NS
TIMP-1 / RECK NS
TIMP-1 / MMP-14 NS
Figura 13: Correlações positivas e não significantes (NS).
Resultados
56
MMP-2 x TIMP-2
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0.0
0.1
0.2
0.3
TIMP-2
MMP- 2
MMP-2 x RECK
0.25 0.50 0.75 1.00
-0.01
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
RECK
MMP-2
MMP-2 x MMP-14
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
MMP-14
MMP-2
MMP-9 x TIMP-2
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.0
0.1
0.2
0.3
TIMP-2
MMP- 9
MMP-9 x MMP-14
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
MMP - 1 4
MMP-9
TIMP-2 x RECK
0.1 0.2 0.3
-0.01
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
RECK
TIMP-2
TIMP-2 x MMP-14
0.0 0.1 0.2 0.3
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
MMP-14
TIMP-2
Figura 14: Seqüência gráfica de correlações positivas
Resultados
57
MMP-2 x MMP-9
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
MMP- 9
MMP- 2
MMP-2 x TIMP-1
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
TIMP- 1
MMP- 2
MMP-9 x TIMP-1
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
TIMP- 1
MMP- 9
MMP-9 x RECK
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
RECK
MMP- 9
TIMP-1 x TIMP-2
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0.0
0.1
0.2
0.3
TIMP- 2
TIMP-1
RECK x MMP-14
0.000 0.025 0.050 0.075 0.100
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
MMP - 1 4
RECK
TIMP-1 x RECK
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
RECK
TIMP-1
TIMP-1 x MMP-14
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
MMP - 1 4
TIMP-1
Figura 15: Seqüência gráfica de correlações não significantes.
Resultados
58
5.8 Imunomarcação de MMP-2 e -9 para Granulomas periapicais
As MMP-2 e -9 foram observadas abundantemente em células
mononucleares, dispersas através no tecido de granulação das lesões
periapicais. A MMP-2 foi expressa num padrão mais difuso, pericelular como
também dispersas através da matriz extracelular, de acordo com as figuras 16A
e 16B. A figura 16C foi o controle negativo. Por outro lado, a MMP-9 foi
expressa num padrão mais localizado, tanto intra como pericelular, conforme
demonstram as figuras 17D, 17E e 17F. A figura 17G corresponde ao controle
negativo. Alguns polimorfonucleares neutrófilos expressaram MMP-9 (figura
17F).
A confirmação de essas células mononucleares serem macrófagos se
deu por meio de imunomarcações de CD68+, conforme figuras 18H e 18I,
sendo que a figura 18J foi o controle negativo.
Figura 16: Imunomarcação para MMP-2 (A) 40X; (B) 100X.
A
B
Resultados
59
Figura 16: Imunomarcação para MMP-2 (C) 40X, Controle Negativo.
Figura 17: Imunomarcação para MMP-9 (D) 40X; (E , F) 100X; (G) 40X
D
E
F
C
G
Resultados
60
Figura 18: Imunomarcação para CD68+ (H) 40X; (I) 100X; (J) 40X
I
H
J
DISCUSSÃO
Discussão
62
6 DISCUSSÃO
6.1 Metodologia
6.1.1 Real Time PCR
A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction- PCR) é
a amplificação enzimática de uma seqüência específica de DNA in vitro,
visando a produção de milhões de cópias dessa seqüência. Essa técnica foi
descrita por Kary Mullis, no final dos anos 80, e tem revolucionado a genética
molecular, pois possibilita uma nova estratégia na análise dos genes por meio
de uma técnica de alta especificidade, alta sensibilidade e rapidez.
12, 13, 26, 49, 74
A reação em cadeia de polimerase explora a capacidade de duplicação
do DNA. Uma fita simples de DNA é usada como molde para a síntese de
novas cadeias complementares sob a ação da enzima polimerase, capaz de
adicionar os nucleotídeos presentes na reação, segundo a fita molde. A
polimerase do DNA requer, entretanto, um "ponto de início" ligado à fita molde
que servirá de apoio para que os nucleotídeos subseqüentes sejam
adicionados. Esse ponto de início da síntese é fornecido por um
oligonucleotídeo que se hibridiza (se anela) à fita molde simples, o qual é
denominado de “primer”. Ambas as fitas simples iniciais servem de fita molde
para a síntese, desde que se forneçam “primers” específicos a cada uma delas.
Dessa forma, a região do DNA genômico a ser sintetizada é definida pelos
“primers”, que se anelam especificamente às suas seqüências complementares
na fita molde, delimitando o fragmento de DNA que se deseja amplificar.
Discussão
63
Na prática, o que se faz é adicionar, em um tubo de ensaio, uma
quantidade muito pequena de DNA genômico, mais os quatro nucleotídeos que
compõem a cadeia de DNA (dCTP, dATP, dGTP e dTTP), a enzima polimerase
do DNA, os oligonucleotídeos que servirão de “primers” e a solução tampão, a
qual fornecerá as condições de pH e salinidade para que a síntese se
processe. Uma alta temperatura (geralmente 94oC por 5 minutos) é necessária
para provocar o rompimento das pontes de hidrogênio entre ambas as cadeias
de DNA, causando a desnaturação da molécula. Em seguida, a temperatura é
rebaixada (30 a 60 ºC por 30 segundos) quando, então, os “primers” têm a
oportunidade de se anelarem às suas seqüências complementares do DNA
genômico. Finalmente, a temperatura é colocada em torno de 72 ºC (por 2 a 5
minutos); essa temperatura é ideal para que a polimerase do DNA utilizada na
reação atue, dirigindo a síntese de novas cadeias. Ao repetirem-se, esses três
tipos de passos (desnaturação, anelamento e síntese), por cerca de 30 ciclos,
produzirão mais de 250 milhões de cópias de uma determinada seqüência de
DNA em fita dupla, uma vez que o número de cópias cresce de modo
exponencial a cada ciclo. Após a primeira desnaturação do DNA genômico, o
tempo de aquecimento a 94 ºC pode ser reduzido para 30 segundos nos ciclos
subseqüentes, tendo em vista que a renaturação da molécula será dificultada.
26
A reação em cadeia de polimerase quando parte do RNA é chamada de
transcrição reversa (RT-PCR). Neste estudo, as lesões periapicais foram
maceradas, e após lise tecidual e tratamento adequado, forneceram o RNA, do
qual, verificada sua qualidade, foi sintetizado o cDNA. O Real Time RT-PCR
Discussão
64
permite a detecção e quantificação das seqüências gênicas (primers) em
estruturas teciduais.
Desde a publicação da técnica do PCR, intensos são os estudos dessa
em Medicina e Odontologia. A literatura odontológica relata diversos estudos
dessa técnica, envolvendo a doença periodontal, cárie dentária, infecções
endodônticas e câncer bucal.
74
Utilizando-se de um estudo de Real Time RT-PCR, GARLET
28
em 2004,
procurou examinar os mecanismos pelos quais as citocinas TNF-α, IFN-у, IL-
12, IL-4 e IL-10 modulam o curso da doença periodontal inflamatória num
modelo experimental, em camundongos. Para a quantificação dos genes de
citocinas e quimiocinas, assim como a quantificação da carga bacteriana no
tecido periodontal, o autor utilizou também foi o sistema SYBERGreen no
aparelho ABI5700 (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido).
Em Endodontia, BOGEN; SLOTS
10
em 1999 estudaram usando a
técnica do PCR, a prevalência de Porphyromonas endodontalis, P. gingivalis,
P. intermédia e P. nigrescens em 20 lesões periapicais, todas essas cepas
coletadas da região apical de tratamentos endodônticos que obtiveram
insucesso, por meio de cirurgias parendodônticas. Os autores concluíram que
bactérias anaeróbias, produtoras de pigmentos negros, parecem não constituir
a maioria das bactérias em lesões chamadas refratárias e o seu baixo número
nessas sugerem a relativa estabilidade e natureza crônica das patologias
apicais.
A técnica do PCR foi utilizada também por SIQUEIRA JÚNIOR et al.
79
em 2001, para verificar a ocorrência de cepas de bactérias produtoras de
Discussão
65
pigmentos negros em abcessos perirradiculares agudos. Nesse estudo foram
utilizadas lesões de origem endodôntica (granulomas e cistos periapicais)
obtidas de cirurgias paraendodônticas. Contudo, a utilização da técnica do Real
Time RT-PCR não foi verificar microrganismos existentes em tais lesões, mas
sim estudar a expressão de metaloprotease-2, -9 e -14, TIMP-1 e -2 e RECK,
enzimas e proteínas relacionadas ao metabolismo da matriz extracelular, na
tentativa de sugerir alguma relação que possa contribuir para um conhecimento
mais profundo do processo evolutivo das lesões inflamatórias de origem
endodôntica.
Contudo, nessa técnica de RT-PCR podem ocorrer erros,
especialmente, quando as amostras são coletadas de diferentes indivíduos.
Um método para minimizar estes erros e compensar as variações de amostra
para amostra é a amplificação, simultaneamente, de um RNA conhecido, o qual
servirá de controle interno, normalizando os valores. O ideal é que o controle
endógeno deve ser expresso no mesmo nível do RNA da amostra a ser
estudada. Os RNAs mais comumente utilizados são o GAPDH, β-actina e RNA
ribossômicos. (Bustin AS, 2000).
PALOSSAARI et al.
64
em 2003, trabalhando com cultura de células da
polpa dental humana, estudaram a expressão relativa de várias MMPs, dentre
elas MMP-2 e -9, aplicando a técnica do Real Time PCR, tendo como o
controle endógeno o 18S RNA ribossômico. YANG et al.
105
em 2002, utilizaram
como controle a β-actina, para detectar os níveis de TIMP-1 na presença e
ausência de IL-1α e TGF-β, em cultura de fibroblastos humanos. Em 2001,
SATOYOSHI et al.
76
se propuseram a detectar os níveis de expressão de
Discussão
66
MMP-2 e -9 na mineralização da matriz dentinária em cultura de células
fibroblásticas, utilizando como controle o GAPDH. Sugeriram que o aumento
dos níveis de expressão de MMP-2 no Real time PCR, em relação ao tempo,
podem interferir no processo de mineralização dentinária, fato esse não
observado para MMP-9.
No presente estudo, o controle endógeno, tanto para as MMPs, TIMPs e
RECK, foi realizado com o gene GAPDH, utilizado em diversos estudos
76, 102
bem como no Instituto de Química da Universidade de São Paulo, onde
realizou-se o Real Time RT-PCR, que utiliza o gene GAPDH rotineiramente,
fazendo parte do protocolo de padronização dos resultados dos experimentos
lá desenvolvidos. Todavia, existem estudos que questionam que os níveis do
RNAm do GAPDH, que não são sempre constantes, indicando a β-actina como
controle endógeno.
12, 28, 49
Outros estudos experimentais indicam, ainda, que a
normalização de amostras in vivo deve ser confrontada com o RNAr ou RNA
total da amostra, não necessitando de um gene conhecido para o controle
endógeno.
13
A maior expressão do gene RECK possui correlação direta com a baixa
invasividade e melhor prognóstico de câncer. Essa proteína regula
negativamente a MMP-2, -9 e MMP-14. Estudos de RECK, com auxílio do
Real-Time RT-PCR, têm demonstrado que sua expressão relativa aumenta na
presença de tumores agressivos e seu índice de expressão é muito baixo nos
tecidos normais.
43, 61, 82
Discussão
67
6.1.2 Imuno-histoquímica
O termo imuno-histoquímica surgiu da associação: imunologia,
histologia e química. Tal termo compreende o processo de identificação de
antígenos em secções de tecidos com o auxílio de anticorpos específicos. Na
imuno-histoquímica, alguns conceitos devem ser revistos como o anticorpo
monoclonal, que corresponde ao reconhecimento de um receptor ou um
epítopo ou policlonal, reconhecimento de mais receptores ou epítopos. Os
anticorpos utilizados neste estudo foram policlonais (MMP-2 e -9).
Os anticorpos policlonais diferem entre si, não só pelos determinantes
antigênicos que são capazes de reconhecer, como também pela afinidade com
que os mesmos são reconhecidos pelos antígenos, isto é, com que força ou
intensidade ocorre a interação entre o antígeno e o anticorpo.
Para MMP-2 e -9, os anticorpos utilizados foram para MMP-2 (sc- 13595
- Santa Cruz Biotecnology Inc.), MMP-9 (sc 6840 - Santa Cruz Biotecnology
Inc.) e CD68+ (SC-7082 Santa Cruz Biotecnology Inc.), todos diluídos na
proporção de 1:100 em 0,1% PBS/BSA.). O processo de diluição é indicado
pelo fabricante na sua bula (data-sheet).
Utilizou-se, como protocolo de imunomarcação, o método da
imunoperoxidase, sugerido em vários estudos de imuno-histoquímica.
27, 40, 42,
47, 72, 89, 95, 99
As amostras submetidas ao Real-Time RT-PCR demonstraram a
expressão relativa dos níveis de transcritos para MMPs -2, -9 e -14, TIMP -1, -2
Discussão
68
e RECK encontradas nos tecidos das lesões periapicais coletados. Neste
estudo, a imuno-histoquímica confirma os achados nos granulomas, pois
identifica as populações celulares que estão expressando as MMPs -2 e -9, por
isso a importância da associação desses dois testes.
FURUMOTO et al.
27
em 2001, associaram as duas metodologias já
mencionadas para estudar a expressão do gene RECK em cânceres
hepatocelular. A partir disso foi encontrado RNAm expresso em tecidos
tumorais, quando se sabe que, nessas condições, sua expressão é reprimida
durante a transformação celular; a imuno-histoquímica confirmou os achados
do PCR, mostrando nesse mesmo tecido marcações no seu estroma. A
expressão de RECK em cânceres pancreáticos, estudado por MASUI et al.
47
em 2003, utilizando a imuno-histoquímica e a zimografia, sugeriu que quando o
gene RECK é expresso, a atividade de MMP-2 não é inibida, ocorrendo,
consequentemente, a invasão tumoral e a metástase.
SHIN et al.
77
em 2002, associaram imuno-histoquímica e ELISA para
verificação dos níveis de expressão de MMP-1, -2 e -3 em tecido pulpar e
lesões periapicais. Além da imunolocalização, as concentrações de MMPs
foram verificadas. Um fato interessante é que o teste ELISA forneceu ambas as
formas, ativa e latente, das concentrações de MMP, verificando que elevadas
concentrações nem sempre podem indicar, nesse tipo de teste, o estado de
destruição tecidual. WAHLGREN et al.
98
em 2002, analisaram os níveis de
MMP-8 em polpa dental, em exsudatos e lesões periapicais, utilizando duas
metodologias: Western blot e imuno-histoquímica. Com isso, verificaram que a
presença de MMP-8 em polpas inflamadas e tecidos periapicais indica que
Discussão
69
essa enzima tem um papel na inflamação pulpar e periapical, participando da
degradação da MEC, sugerindo, também, que a análise de MMP-8 no exsudato
pode indicar e monitorar a atividade inflamatória.
Atualmente em pesquisa, há uma tendência de associar metodologias
que possibilitam um maior número de testes para detectar e confirmar a
expressão de uma determinada substância. A biologia molecular possui muitos
recursos que, quando associados, garantem maior confiabilidade aos
resultados obtidos.
6.2 Resultados
As lesões inflamatórias periapicais, granulomas e cistos radiculares
representam dois diferentes estágios de desenvolvimento de uma resposta
imunopatológica da estrutura apical. Esse processo inflamatório crônico
caracterizado por um infiltrado persistente leva à reabsorção óssea e radicular.
Os fatores que determinam a transformação cística estão presentes em alguns
granulomas e todo mecanismo que envolve aquela transformação e posterior
desenvolvimento é controverso.
1, 93, 99
As metaloproteases da matriz (MMPs), responsáveis pela degradação
da MEC, são expressas em níveis baixos nos tecidos normais, mas
aumentadas durante o processo inflamatório. Por isso, em Odontologia, as
MMPs vêm sendo amplamente estudadas em Periodontia e Endodontia.
81, 98
Os resultados do estudo em questão demonstraram que a imuno-
histoquímica de MMP-2 e -9, para granuloma periapical, que células
Discussão
70
mononucleares dispersas pelo tecido de granulação se apresentaram
imunomarcadas (Figura 16A, 16B, 17D, 17E e 17F) . Imunomarcação para
CD68+ mostrou que os macrófagos foram as principais células envolvidas na
expressão dessas metaloproteases da matriz em todas as amostras
examinadas (Figura 18I e 18J). As imunomarcações se apresentaram
heterogêneas entre si, contudo tal fato pode ser justificado pelo resultado
anatomopatológico, isto é, os granulomas periapicais demonstraram uma
morfologia variada e diferente intensidade de componentes celulares.
40
Tais
variações aparecem por conta do estágio em que a lesão se apresenta.
Granulomas com intenso infiltrado inflamatório do tipo linfohistioplasmocitário
podem estar em fase evolutiva diferente de um outro granuloma com
característica predominantemente fibroblástica e colagênica, tendo de permeio
essas esparsas células inflamatórias.
É importante salientar, ainda, que há diferença na distribuição dos
macrófagos nas lesões periapicais
15
. A maior concentração de células
inflamatórias ocorre na região central dos granulomas periapicais, em
decorrência do estímulo flogógeno mais intenso.
72
MARTON; KISS
45
, em
2000, corroboraram tal assertiva, afirmando que a maior concentração de
células mononucleares ocorre na região central dos granulomas periapicais
devido à proximidade do forame apical.
A expressão de MMP-2 em células inflamatórias e fibroblastos de
granulomas e cistos periapicais foi observada por SHIN et al.
77
em 2002,
contudo a expressão de MMP-1 e -3 foram mais intensas.
Discussão
71
A MMP-2, no presente experimento, apresentou um padrão mais difuso
de imunomarcação, perifericamente às células e dispersa pela MEC,
provavelmente pelo fato de aquela metaloprotease da matriz ser responsável
pela ativação de outras enzimas, como a interação com TIMP-2 e MMP-14, que
ocorre na superfície da membrana citoplasmática.
59, 70, 75, 100
Em comparação
com a MMP-2, a MMP-9 apresentou um padrão mais localizado e restrito,
sugerindo que essa MMP frequentemente é expressa em sítios ativos de
destruição celular e de inflamação aguda, associada à polimorfonucleares
neutrófilos.
30, 103
Os resultados oriundos do Real-Time PCR mostraram que houve a
expressão de MMP-2, -9, -14, TIMP-1, -2, e RECK em granulomas e cistos
periapicais, não havendo diferença, estatisticamente significante, entre as duas
patologias periapicais frente aos genes testados.
A cicatriz periapical apresentou a expressão relativa de MMP-2 e -14
TIMP-1 e -2 e RECK superior ao apresentado em algumas amostras de
granulomas e cistos periapicais, exceto para a MMP-9. Todavia, não mostrou
nenhum pico de níveis de transcritos significativa. Isso, provavelmente, dá-se
pela dinâmica envolvendo o remodelamento do tecido cicatricial que provoca a
diminuição da sua matriz extracelular.
9, 30, 81, 103
Essa amostra de cicatriz
periapical apresentou no exame anatomopatológico tecido bem colagenizado,
áreas de depósito basofílico semelhantes a calcificações distróficas, com
discreto infiltrado inflamatório mononuclear focal e disposição perivascular; foi
anexada às amostras a fim de representar um controle negativo em relação
aos processos patológicos inflamatórios pesquisados (granulomas e cistos
Discussão
72
periapicais). Contudo, os resultados demonstraram que sua expressão relativa
não serve de controle conforme dito anteriormente. Esse fato reflete a
dificuldade em estabelecer parâmetros de comparação nesse tipo de estudo,
onde não se conhece o estágio da lesão coletada, pois todas provêm de
cirurgias paraendodônticas; desse modo sendo diferente de estudos em lesões
induzidas num modelo animal, que apresenta um quadro evolutivo conhecido.
28
A análise da diferença na quantificação dos níveis de transcritos de
MMP-2, -9, -14, TIMP-1, -2 e RECK em lesões periapicais revelou uma
expressão significativa de MMPs, TIMPs e RECK em todas as lesões
estudadas.
As figuras de 1 a 12 mostram que a expressão relativa de MMP-2, -9 e -
14 oscilaram entre granulomas e cistos periapicais, bem como o de seus
inibidores, TIMP-1, -2 e RECK, não apresentando relação estatisticamente
significante.
Um fato interessante observado é que numericamente a expressão
relativa dos níveis de transcritos de RECK foi cerca de 10 vezes menor em
relação à TIMP-1 e -2. Um exemplo é a amostra C3 que teve o maior pico dos
níveis de transcritos de RECK, em torno de 0.065, em comparação à TIMP-1 e
-2, os níveis de transcritos para ambos os genes figuraram bem acima deste
valor.
Quando o grupo lesão periapical (granuloma e cisto periapical) foi
confrontado frente aos genes pesquisados, houve uma correlação significativa
Discussão
73
entre algumas expressões de transcritos para MMP-2, -9 e -14, TIMP-1, -2 e
RECK.
A MMP-2 apresentou correlação positiva com a TIMP-2 e MMP-14, ou
seja, quando aumentou a expressão de MMP-2 na amostra pesquisada, os
níveis de TIMP-2 e MMP-14 também se elevaram. Um dado importante deve
ser mencionado, o fato da expressão de MMP-2 apresentar correlação positiva
com TIMP-2, não significa que a primeira aumentou em função da segunda e
sim que os níveis de transcritos de ambas apresentaram-se aumentados na
amostra estudada. O Real Time RT-PCR quantifica os níveis de transcritos,
não podendo ser confrontado com trabalhos na literatura que observam
atividade enzimática ou protéica, pois em nosso estudo não temos a expressão
da enzima (MMP-2, -9 e -14) e nem da proteína (TIMP-1, -2 e RECK) na sua
forma ativa.
A ativação de algumas MMPs, como a MMP-2, requer a interação com
certas MMPs que estão associadas à membrana citoplasmática, como a MMP-
14, a qual, por sua vez, cliva uma porção do prodomínio de MMP-2 para
transformar sua forma latente em ativa
4, 70, 100
e também degrada vários
componentes da matriz extracelular, incluindo o colágeno I.
61
Um equilíbrio entre MMPs e TIMPS parece ser essencial para que não
haja destruição tecidual. A MMP-9 ou gelatinase B é altamente produzida em
processos inflamatórios agudos pulpares,
30
visto que essa enzima é expressa
por polimorfonucleares neutrófilos (PMN), macrófagos, queratinócitos e células
endoteliais
9
e sua produção não é constitutiva
97
, o que leva a crer que a sua
Discussão
74
ausência num tecido pulpar normal possa representar um indicador de polpa
saudável.
30
A MMP-9 apresentou correlação positiva com a TIMP-2 e com a MMP-
14. A MMP-9 tem seu nível de expressão controlado em resposta a citocinas e
fatores de crescimento. A TIMP-2 tem uma alta afinidade com seus receptores,
possuindo funções variadas conforme o tecido onde é expressa, inibindo a
migração celular por meio da supressão da atividade de MMPs, principalmente
a MMP-14, tendo a capacidade ainda de inibir a angiogênese. Em modelos de
neoplasias malignas de colo retal, ela promove apoptose; contudo, em
linhagens de células de melanoma, ela protege da apoptose.
4
Neste estudo foi
observada uma correlação positiva de TIMP-2 com MMP-2, -9, -14 e RECK.
Somente com TIMP-1 houve uma correlação não significante.
Este é o primeiro estudo envolvendo RECK em lesões periapicais. Os
resultados conseguidos nessa pesquisa demonstraram a presença dos níveis
de transcritos nas amostras pesquisadas. É importante ressaltar que a
presença da expressão de RECK no Real-time PCR não demonstra o quanto
da enzima ou proteína será transcrita. Todavia, existem estudos que sugerem
ser as TIMPs os maiores inibidores de MMPs, enquanto RECK parece ter uma
atividade inibitória modesta.
59
No estudo em tela, para ajudar a confirmar tal
hipótese na amostra estudada, a imuno-histoquímica parece ser fundamental.
A localização de RECK e TIMPs são diferentes, ou seja, enquanto a
primeira se encontra ancorada na membrana citoplasmática, as TIMPs são
secretadas e difusas. A concentração de RECK na membrana plasmática
Discussão
75
proporciona uma efetiva regulagem dos eventos proteolíticos locais, que
permeiam a superfície celular.
47
Diversos estudos com neoplasias malignas envolvendo RECK, em
tecidos tumorais, por ser um inibidor da MMP-2, -9 e 14, demonstram que a
sua supressão determina aumento das MMPs.
27, 43, 59, 61, 92
Desse modo, o
melhor prognóstico em pacientes portadores de neoplasias malignas são
aquelas que expressam RECK.
27
Quando o sinal oncogênico é liberado,
diminui-se a expressão de RECK e ocorre um aumento de MMP-9.
92
Contudo,
tem se observado uma forte ligação de RECK com MMP-2 e MMP-14.
43, 59, 100
Em contraste, MASUI et al.
47
em 2003, afirmam que nenhuma correlação é
estabelecida entre expressão de RECK e ativação de MMP-9.
O crescimento vascular é vital para que o desenvolvimento embrionário
aconteça. Nessa fase, o equilíbrio dinâmico entre os componentes da MEC é
necessário para que ocorra a angiogênese. A concentração inibitória de RECK
sobre MMP-2, -9 e -14 é necessária perto de células endoteliais para que
essas proliferem, possibilitando a ocorrência de neoformação de vasos
sangüíneos. Estudos em camundongos que apresentam ausência de RECK,
na sua fase embrionária, morrem no décimo dia, diferente de ausência de
MMP-2, TIMP-1 e TIMP-2, que não apresenta influência no desenvolvimento
embrionário. Por outro lado, quando MMP-14 é suprimida, os camundongos
apresentam anormalidade óssea após o nascimento.
59, 61
Um complexo mecanismo molecular envolve a dinâmica do processo
evolutivo de granulomas e cistos periapicais. Os níveis de expressão de MMP-
2, -9, -14, TIMP-1 e -2 e RECK e suas correlações positivas e não significantes
Discussão
76
variaram, provavelmente de acordo com o estágio evolutivo em que a lesão
periapical se encontrava. Estudos futuros com MMPs e TIMPs serão
importantes para ajudar a entender o processo de desenvolvimento das
periodontites apicais crônicas.
CONCLUSÕES
Conclusões
78
CONCLUSÕES
De acordo com a metodologia empregada, foi possível concluir:
1. Os níveis de transcritos para as enzimas (MMP-2, -9 e -14) e proteínas
(TIMP-1, -2 e RECK) variou entre as amostras de granulomas e cistos
periapicais estudadas;
2. A expressão relativa dos níveis de transcritos do gene RECK foi menor do
que TIMP-1 e -2, quando comparados entre si na amostra estudada;
3. As imunomarcações nos granulomas periapicais para MMP-2 apresentou um
padrão mais difuso em comparação com a MMP-9 que apresentou um padrão
mais localizado e restrito;
4. Nas imunomarcações para MMP-2 e -9, em granulomas periapicais, os
macrófagos são as células que mais expressaram estas metaloproteases da
matriz.
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Abstract
99
ABSTRACT
Degradation of extracellular matrix (ECM) proteins by matrix metalloproteinases
(MMPs) occurs during matrix turnover and pathologic processes (inflammation,
cancers). MMP activity in the tissues is regulated in part by a group of tissue
inhibitors (TIMPs). Recently, a new MMP inhibitor called RECK (reversion
inducing cysteine-rich protein with a Kazal motif) has been identified. In this
study, we verified the message (mRNA) for MMPs (MMP-2, -9 e -14), tissue
inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1 e -2) and RECK, through a Real-Time
RT-PCR technique, as well as the cells expressing MMP-2 and -9 in periapical
granulomas using immunohistochemistry. Samples were collected during
periapical surgery, of which 15 were used for Real-Time RT PCR (8 periapical
granulomas, 6 periapical cysts and 1 apical scar), and 20 for
immunehistochemistry (10 periapical granulomas). The results for Real-Time
PCR showed MMP-2, -9, -14, TIMP-1, -2, and RECK expression in periapical
granulomas and cysts, with no significant statistical differences between the two
periapical pathologies regarding the genes tested. However, when the group
periapical lesion (granuloma and cyst) was confronted with the genes tested,
there was a significant correlation in some mRNA expression for MMP-2, -9, -
14, TIMP-1, -2 and RECK. Regarding immunostainings in the periapical
granulomas, MMP-2 was more diffusely expressed, being located peripherally
to the cells and dispersed through the ECM, when compared to MMP-9 which
presented a more localized and restrained pattern. Macrophages were the most
abundant cells expressing these MMPs.
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