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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE, UNICENTRO-PR
EXTRATOS ETANÓLICOS E OLEOSOS DE
PRÓPOLIS: QUANTIFICAÇÃO E ATIVIDADE
BIOLÓGICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
LILIAN BURIOL
Guarapuava-PR
2008
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LILIAN BURIOL
EXTRATOS ETANÓLICOS E OLEOSOS DE PRÓPOLIS: QUANTIFICAÇÃO E
ATIVIDADE BIOLÓGICA
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Centro-Oeste, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em
Química Aplicada, área de concentração em
Metodologias Analíticas e Aplicações, para a
obtenção do título de Mestre.
Prof(a). Dr(a). Yohandra Reyes Torres
Orientadora
GUARAPUAVA-PR
2008
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LILIAN BURIOL
EXTRATOS ETANÓLICOS E OLEOSOS DE PRÓPOLIS: QUANTIFICAÇÃO E
ATIVIDADES BIOLÓGICAS
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Centro-Oeste, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em
Química Aplicada, área de concentração em
Metodologias Analíticas e Aplicações, para a
obtenção do título de Mestre.
Aprovada em de de
Prof(a). Dr(a). Membro da Banca:................................................................................................
Prof(a). Dr(a). Membro da Banca:................................................................................................
Prof(a). Dr(a). Yohandra Reyes Torres
Orientador(a)
GUARAPUAVA-PR
2008
Dedico este trabalho a minha família,
especialmente aos meus pais Adil e Rosa
Buriol que sempre me deram força e incentivo
em todos os momentos, e aos meus irmãos
Vivian e Felipe Buriol pelo carinho e
compreensão.
AGRADECIMENTOS
No decorrer deste trabalho, contei com a ajuda e atenção de diversas pessoas. A todas o meu
reconhecimento.
A Deus pela vida.
A minha orientadora pelos conhecimentos transmitidos, pela sua calma, paciência e dedicação
para a realização deste trabalho.
A UNICENTRO e Fundação Araucária pelas instalações para a realização do trabalho.
Aos amigos pelo apoio, em especial a Daiane Finger por poder contar com sua ajuda.
As amigas Michelli Massaroli e Juliana Cheleski pelo auxílio na revisão bibliográfica, com o
envio de artigos.
Aos colegas por estarem presentes na minha caminhada.
A tia Clélia pelo auxílio.
A professora Sueli Pércio Quináia pelo empréstimo de materiais e contribuição efetiva para o
desenvolvimento da pesquisa realizada.
Aos professores Fauze Jacó Anaissi e Carlos Alberto Policiano pelo empréstimo de materiais.
A professora Herta Dalla Santa pela disponibilidade do laboratório de microbiologia do
Departamento de Engenharia de Alimentos e auxílio para a realização dos testes
antimicrobianos.
Aos professores do grupo de pesquisa do Laboratório de Orgânica e Tecnológica, Marcos
Roberto da Rosa e Julio Murilo Trevas dos Santos pela colaboração quando necessário.
Ao grupo de pesquisadores do Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade
Federal do Ceará pela realização dos testes de atividade citotóxica.
Aos técnicos dos laboratórios de ensino pela disponibilidade de materiais.
SUMÁRIO
Lista de Símbolos e Abreviaturas ..............................................................................i
Resumo ..........................................................................................................................iii
Abstract..........................................................................................................................iv
1. Introdução.................................................................................................................1
2. Objetivos.................................................................................................................... 4
3. Referencial Teórico ..................................................................................................5
3.1. Abelhas ...................................................................................................................5
3.2. Própolis ...................................................................................................................7
3.3. Extração dos Componentes da Própolis ..................................................................10
3.4. Composição Química da Própolis ...........................................................................12
3.4.1. Compostos Fenólicos da Própolis ........................................................................15
3.5. Análise Quantitativa e Qualitativa da Própolis .......................................................17
3.6. Atividades Biológicas da Própolis ..........................................................................21
3.7. Toxicidade da Própolis ...........................................................................................27
4. Materiais e Métodos.................................................................................................28
4.1. Local do Experimento ............................................................................................28
4.2. Material Experimental ............................................................................................28
4.2.1. Amostras de Própolis ...........................................................................................28
4.2.2. Análises Espectrofotométricas ............................................................................28
4.2.3. Testes Antimicrobianos .......................................................................................29
4.2.4. Testes Citotóxicos ................................................................................................29
4.3. Métodos ..................................................................................................................30
4.3.1. Preparação dos Extratos de Própolis ...................................................................30
4.3.1.1. Extração das Amostras de Própolis para a Obtenção de Extratos Etanólicos . .30
4.3.1.2. Extração das Amostras de Própolis para a Obtenção de Extratos Oleosos ......30
4.3.2. Métodos Espectrofotométricos ............................................................................33
4.3.2.1. Quantificação de Fenóis Totais pelo Método Folin-Ciocalteau .......................33
4.3.2.2. Quantificação de Flavonóides por Complexação com Cloreto de Alumínio ...34
4.3.3. Análises Estatísticas ............................................................................................35
4.3.4. Avaliação da Atividade Antimicrobiana .............................................................35
4.3.4.1. Preparo das Amostras para os Testes Antimicrobianos ....................................35
4.3.4.2. Teste de Difusão em Ágar pelo Método de Poços.............................................35
4.3.5. Avaliação da Atividade Citotóxica ......................................................................37
5. Resultados e Discussões ...........................................................................................38
5.1. Análise do Rendimento da Extração, Teores de Fenóis Totais e Flavonóides em Extratos
Etanólicos e Oleosos de Própolis ...................................................................................38
5.2. Testes Biológicos in vitro .......................................................................................50
5.2.1. Atividade Antimicrobiana de Extratos Etanólicos e Oleoso de Própolis ............50
5.2.2. Atividade Citotóxica de Extratos Etanólicos e Oleoso de Própolis .....................56
5.3. Análise das Componentes Principais ......................................................................58
5.3.1. Primeira Análise das Componentes Principais ....................................................58
5.3.2. Segunda Análise das Componentes Principais ....................................................61
6. Conclusões ................................................................................................................65
7. Referências Bibliográficas ......................................................................................66
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
a.C. antes de Cristo
DNA ácido desoxirribonucleico
URSS União das Repúblicas Socialistas Soviéticas
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
UV-VIS ultravioleta-visível
GC-MS cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas
ESI(-)-MS espectrometria de massas por ionização com eletrospray no modo negativo
MTT sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium
DEQ Departamento de Química
DEALI Departamento de Engenharia de Alimentos
UFC Universidade Federal do Ceará
P.A. para análise
ATCC American Type Culture Collection
TSB tripticase de soja
EEP30 extrato de própolis obtido com 30 % v/v de etanol em água
EEP50 extrato de própolis obtido com 50 % v/v de etanol em água
EEP70 extrato de própolis obtido com 70 % v/v de etanol em água
EEP80 extrato de própolis obtido com 80 % v/v de etanol em água
EEP95 extrato de própolis obtido com 95 % v/v de etanol em água
EEP100 extrato de própolis obtido com etanol ablsoluto
EOP10 extrato de própolis obtido com óleo vegetal, 10 dias de extração
EOP30 extrato de própolis obtido com óleo vegetal, 30 dias de extração
EOP90 extrato de própolis obtido com óleo vegetal, 90 dias de extração
AlCl
3
cloreto de alumínio
DMSO dimetilsulfôxido
UV ultravioleta
ACP análise dos componentes principais
NCI National Cancer Institute
USA United States of America (Estados Unidos da América)
viii
RESUMO
Lilian Buriol. Extratos Etanólicos e Oleosos de Própolis: Quantificação e Atividade
Biológica.
A própolis é uma substância resinosa encontrada em colméias de abelhas. Para a sua
elaboração os insetos coletam o material de diversas espécies vegetais. Devido à grande
biodiversidade da flora brasileira, há uma grande diversificação dos componentes químicos
presentes na própolis deste país. Com isso é de grande interesse quantificar os teores de fenóis
totais e flavonóides presentes nos extratos de própolis, pois essas classes de compostos são
responsáveis pelas atividades farmacológicas relacionadas à própolis como: antimicrobiana,
antioxidante, antitumoral, antiinflamatória entre outras. Esta pesquisa teve como objetivo
comparar extratos de própolis da região de Prudentópolis/Paraná, obtidos com óleo vegetal e
com soluções etanólicas, quanto a seus teores de compostos fenólicos e atividades
antimicrobianas e citotóxicas. Os resultados obtidos das quantificações mostraram que o óleo
de canola extraiu compostos fenólicos e flavonóides da própolis, embora com rendimentos
menores se comparados com as extrações etanólicas. Os testes antimicrobianos in vitro
apontaram que o extrato oleoso, de maneira similar aos extratos etanólicos da própolis,
apresentou atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram positivas Staphylococcus
aureus e Listeria monocytogenes. Quanto à atividade citotóxica o extrato oleoso de própolis
mostrou efeito antiproliferativo contra todas as linhagens de células tumorais humanas
testadas tendo maior especificidade contra células tumorais de cólon e glioblastoma. Esse
estudo é de máxima importância para o desenvolvimento posterior de novos produtos a base
de extratos oleosos de própolis.
Palavras-Chave: Própolis, compostos fenólicos, atividades biológicas.
ix
ABSTRACT
Lilian Buriol. Ethanolic and Oil Propolis Extracts: Quantitation and Biological Activity.
Propolis is a resinous hive product collected by honeybees from various plant sources.
Due to the wide biodiversity found in Brazilian vegetable species, propolis from this country
has a striking variability in its chemical composition. That is why it is important to quantify
total phenolic compounds and flavonoids in propolis extracts. Those are the main classes of
compounds which are responsible for pharmacological properties which have been reported to
propolis such as: antimicrobial, antioxidative, antitumour, anti-inflammatory, among other
properties. The main objective of this research was to compare propolis extracts from around
the city of Prudentopolis (Parana State/ Brazil), made with vegetable oil and ethanolic
solutions, regarding to their phenolic contents, antimicrobial and cytotoxic activities.
Quantitative analyses indicated that canola oil extracted phenolic compounds and flavonoids
from propolis, although with lower yield if compared to ethanolic extractions. In vitro
antimicrobial tests showed that the oil extract, as well as the ethanolic propolis extracts,
possessed antibacterial activity against Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and
Listeria monocytogenes. Regarding to cytotoxic activity, propolis oil extracts showed
antiproliferative effect toward all human tumoural cell lines tested, with greater specificity
against colon tumoural and glioblastoma cells. The current study is of major importance for
subsequent development of new products containing oil extract preparations from propolis.
Keywords: propolis, phenolic compounds, biological activities.
x
1. INTRODUÇÃO
A própolis é um material resinoso produzido pelas abelhas. Para a sua fabricação elas
coletam material de diversas partes das plantas como flores, brotos, etc. Ainda para a
elaboração, dentro da colméia, elas adicionam alguns componentes como ceras e/ou realizam
modificações dando origem à resina
1-3
.
As abelhas, na colméia, utilizam a própolis para diversas finalidades. Um dos
principais empregos é para manter o ambiente asséptico, devido às propriedades
antimicrobianas presentes na resina
1,4
. Devido à presença dessa atividade é de grande interesse
o seu estudo para uso, posterior, da própolis em benefício da saúde humana.
Numerosas atividades terapêuticas já foram encontradas na própolis. Essas atividades
estão relacionadas aos compostos químicos que possui, principalmente, aos compostos
fenólicos com ênfase nos ácidos fenólicos e nos flavonóides. Dentre as atividades
encontradas, podemos citar: a antimicrobiana
4-24
, a antioxidante
4,5,8,11,13,14,16,18,25-27
, a
antiinflamatória
4,8,16,18,29
,
a anticariogênica
3,30
, e a citotóxica
7,8,16,28,31-34
. Por possuir essas
propriedades houve um crescente interesse pela resina.
A grande biodiversidade da flora do Brasil agrega valores importantes para a própolis
brasileira. Neste país as abelhas coletam o material para a produção da própolis de diferentes
espécies vegetais, o que dá origem a uma própolis diferenciada da própolis européia,
especialmente, pela sua variedade em composição química a qual é fortemente dependente da
região de origem. Essa diversidade química, por conseqüência, faz com que os diferentes
tipos de própolis possam apresentar diferentes indicações terapêuticas
2,4,16,35
.
Países como o Japão e a Alemanha importam grandes quantidades de própolis do
Brasil
36
. Esse enorme interesse pode estar relacionado à presença de compostos fenólicos na
resina, principalmente aos ácidos fenólicos, os quais se encontram em maiores quantidades
em relação aos flavonóides, quando comparados com própolis de países de clima
temperado
7,16,33,37
. Isso faz com que a própolis do Brasil possua grande importância
econômica.
A própolis produzida na região de Prudentópolis/Paraná é umas das melhores do
mundo. A riqueza e diversidade da flora da região possibilitam encontrar uma variedade de
mais de 400 tipos de mel e própolis. A região é considerada um centro de excelência para o
desenvolvimento da atividade apícola e, portanto, oferece condições para o desenvolvimento
de estudos relacionados a essa atividade
38
.
xi
A empresa Campolin & Schmidt LTDA (Figura 1), situada na cidade de
Prudentópolis/Paraná, produz e comercializa produtos que contém derivados apícolas como
mel e própolis. Esta companhia vende seus produtos para o mercado nacional e internacional,
principalmente para o Japão. A empresa, buscando agregar valores aos seus produtos,
estabeleceu um convênio com o Grupo de Pesquisa em Química Orgânica e Tecnologia do
Departamento de Química da UNICENTRO. No âmbito desse convênio são realizadas
pesquisas que objetivam, principalmente, o desenvolvimento de novos produtos à base de mel
e própolis.
Figura 1. Foto externa da Empresa Campolin & Schmidt LTDA.
A pesquisa desenvolvida teve como objetivo a utilização de óleo de canola para a
extração da própolis, e a verificação de sua capacidade de extração dos componentes
bioativos presentes na resina para, posteriormente, realizar a transformação dos extratos
oleosos de própolis em produtos comercializáveis. O uso de óleo vegetal para a extração da
própolis não é uma prática completamente nova. Existem algumas patentes que tratam do uso
xii
desse solvente, porém no melhor do nosso conhecimento não existem estudos químicos ou
biológicos suficientes que justifiquem o uso de óleo vegetal na extração da própolis, embora
no mercado encontrem-se alguns produtos contendo própolis in natura em óleo vegetal
13,39,40
.
Em estudos anteriores verificou-se qualitativamente que o extrato de própolis obtido
com etanol 95 % apresenta grande similaridade em composição química com o extrato oleoso.
A técnica utilizada para tal análise foi espectrometria de massas com ionização por
electrospray ESI(-)-MS
41
.
Para esse estudo escolheu-se um óleo vegetal comestível; o óleo de canola. Esse óleo
foi selecionado por possuir vantagens em relação aos outros óleos (de girassol, de milho, de
soja, entre outros) por apresentar baixo índice de gordura saturada e elevados teores de
gorduras insaturadas o que pode reduzir o risco de algumas doenças como circulatórias e
coronárias. Quando o óleo de canola é comparado com o etanol, solvente comumente usado
na extração da própolis e preparo de seus produtos comercializáveis, este também apresenta
vantagens, o óleo vegetal conserva características organolépticas da própolis como: o aroma,
não causa alergia e nem desprazer no gosto, além de ser possível à introdução em cápsulas
gelatinosas o que não é possível observar utilizando o etanol como solvente extrator.
Para alcançar os objetivos propostos realizou-se a comparação química quantitativa de
extratos etanólicos e oleosos de própolis e avaliaram-se os teores dos componentes químicos
bioativos como o teor de fenóis totais e de flavonóides, por meio dos métodos
espectrofotométricos de Folin-Ciocalteu e complexação com cloreto de alumínio,
respectivamente. Verificou-se, também, a presença das atividades antimicrobiana e citotóxica
dos extratos obtidos. Essas atividades são amplamente relatadas para extratos etanólicos de
própolis.
xiii
2. OBJETIVOS
Objetivo Geral:
Este estudo teve como objetivo geral comparar extratos de própolis da região de
Prudentópolis/Paraná, obtidos com óleo vegetal e soluções etanólicas, quanto à sua
composição química e atividade biológica.
Objetivos Específicos:
- comparar os rendimentos de extração de extratos de própolis da região de
Prundentópolis/Paraná, obtidos com composições de solventes diferentes;
- comparar quantitativamente os extratos oleosos e etanólicos quanto aos teores de compostos
fenólicos e flavonóides;
- avaliar a atividade antimicrobiana de extratos oleoso e etanólicos de própolis;
- avaliar a atividade citotóxica frente a linhagens de células tumorais, de origem humana, de
extratos oleoso e etanólicos de própolis.
xiv
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1. Abelhas
As abelhas são insetos que habitam o planeta Terra há milhões de anos. Essa
existência foi comprovada por alguns poucos registros fósseis encontrados na atual República
Dominicana (Caribe), na Silícia (Mediterrâneo) e em New Jersey (América do Norte)
16,42
.
Os primeiros registros da utilização da própolis foram relatados pelos povos hindus, os
quais utilizavam a resina como agente cicatrizante em 6000 a.C. Outros povos especialmente
os chineses, os greco-romanos e os tibetanos apreciavam os produtos apícolas em 5000 a.C..
Porém, segundo estudos históricos, os primeiros apicultores foram os egípcios e a prática
dessa atividade foi imortalizada em pinturas nas paredes de suas pirâmides e em túmulos de
faraós (Figura 2). Os egípcios criavam abelhas em potes de barro, no ano de 2400 a.C e
utilizavam-se dos produtos das abelhas com fins medicinais para prevenir ou curar
doenças
42-46
.
Figura 2. Pinturas realizadas pelos egípcios em túmulo de faraós
42
.
xv
As abelhas possuem importantes funções, desde os tempos antigos até hoje,
contribuindo para o meio ambiente, pois por serem polinizadoras garantem a continuidade das
espécies vegetais, contribuem para a agricultura por aumentarem sensivelmente a produção de
frutos e sementes e para a medicina por fornecerem produtos de grande valor medicinal como
o mel, a própolis e a geléia real
42,46
.
No Brasil, o início da técnica da atividade apícola pode ser atribuído à introdução da
abelha européia Apis mellifera (Figura 3) trazida pelos jesuítas, no século XVI e instalada no
sul do país. Quando foram expulsos, os religiosos tiveram que abandonar essa atividade e por
conseqüência as abelhas se espalharam livremente por todo território
42
.
Figura 3. Representação da espécie de abelhas Apis mellifera
42
.
Em 1839, o Padre Antônio Carneiro Aureliano trouxe, de Portugal, diversas colméias
de abelhas. Até meados de 1956, as abelhas encontradas no território brasileiro eram
praticamente todas de origem européia. A partir desse ano, também houve a vinda de abelhas
africanas para o melhoramento dos produtos apícolas
42
.
As abelhas da espécie Apis mellifera vivem em diferentes climas e vegetações. Devido
a esse comportamento foram surgindo, no decorrer dos anos, diversas subespécies com
diferentes características e adaptadas a diversas condições ambientais. A diferenciação dessas
subespécies só é possível com o uso de medidas morfológicas ou por análise de DNA. A
partir dessas análises pode-se citar: Apis mellifera mellifera (abelha real, alemã, comum ou
xvi
negra), Apis mellifera ligustica (abelha italiana), Apis mellifera caucásica, Apis mellifera
carnica (abelha carnica) e Apis mellifera scutellata (abelha africana)
47
.
Atualmente, as abelhas que habitam o território brasileiro são um híbrido das abelhas
européias (Apis mellifera mellifera, Apis mellifera ligustica, Apis mellifera caucásica, Apis
mellifera carnica) com a abelha africana Apis mellifera scutellata
42,47
. No sul do Brasil
predominam características de abelhas européias, enquanto no norte há predominância das
características de abelhas africanas
47
.
É interessante ressaltar que além das abelhas introduzidas no Brasil, Apis mellifera,
existem também outros tipos desses insetos, como as abelhas nativas as quais, em sua grande
maioria, são típicas do nosso ecossistema. Essas abelhas são conhecidas cientificamente como
Meliponídeos. Elas são chamadas de sem ferrão, por possuírem um ferrão atrofiado que não
serve para a sua defesa
42
.
As abelhas da espécie Apis mellifera vivem em um sistema ordenado de extrema
organização e disciplina. Estima-se que cada colméia possui cerca de 80.000 abelhas e cada
uma possui sua função específica na colméia. Elas se dividem em três classes principais: as
operárias, os zangões e a rainha
42,43,48
.
As operárias são responsáveis por todo trabalho realizado. Elas têm a função de cuidar
da alimentação e higiene da colméia, além da busca de materiais para a produção de própolis,
mel entre outros. Os zangões não possuem ferrão e são responsáveis pelo acasalamento com a
abelha rainha que por sua vez é responsável pela reprodução da espécie
42,43,48
.
Atualmente os grandes centros de apicultura no país estão situados nos estados do
Paraná (na região de Prudentópolis) e São Paulo (nas regiões de Ribeirão Preto e Rio Claro).
Os maiores importadores da própolis brasileira são o Japão e a Alemanha
36
.
3.2. Própolis
As abelhas, responsáveis pela produção da própolis, coletam o material de ramos,
flores, brotos e exsudados de árvores e os levam para a colméia. Após algumas modificações
e/ou introdução de enzimas salivares, cera e pólen, dão origem a uma mistura complexa de
substâncias resinosas e balsâmicas que é a própolis
1-3,7,42
.
Na colméia, a própolis é utilizada para muitos fins; para combater inimigos naturais
como fungos e bactérias, para embalsamar pequenos insetos mortos pelas abelhas, evitando
sua putrefação, para a higienização, para fechar frestas reduzindo a entrada de vento frio e
xvii
como material de construção no interior da colméia, soldando favos e quadros e envernizando
o interior dos alvéolos para que a rainha faça a postura
1-3,7,42
. A Figura 4 apresenta um
esquema de produção e utilização da própolis pelas abelhas.
Figura 4. Esquema de produção e utilização da própolis pelas abelhas
42
.
xviii
A retirada da própolis da colméia é feita pelo apicultor junto com a retirada do mel. O
produto bruto coletado deve ser pesado e encaminhado à seleção. Nesta etapa ocorre a
separação de impurezas, de animais mortos, de pedaços de madeiras ou de cera. Após esse
processo, a própolis é embalada em sacos plásticos devidamente lacrados e armazenada em
locais escuros e frescos, preferencialmente a temperaturas menores que 10 °C
42,49
. Própolis
fresca não deve ser misturada com própolis velha, pois com um longo tempo de
armazenamento ela pode perder ou diminuir suas características ou atividade biológica
49
.
As características da própolis como coloração e consistência são bastante
diversificadas. Estas são influenciadas por vários fatores desde a espécie vegetal de onde o
material é coletado, a época de colheita e os materiais introduzidos durante a elaboração, bem
como a espécie de abelha. A cor varia de marrom até verde escuro
18,45
. A própolis esverdeada
é a mais bem cotada no mercado internacional devido à relação de sua coloração com a sua
composição química rica em ácidos fenólicos
50
. A resina possui odor característico que pode
variar dependendo da amostra
18,45
.
Devido às suas propriedades medicinais a própolis tem sido utilizada desde a
antiguidade pela humanidade, principalmente, pelos povos egípcios, como mencionado, e
romanos, para curar lesões corporais e para embalsamar mortos
3,33,45
.
Na África do Sul, no final do século XIX, a própolis era utilizada como cicatrizante e
na segunda guerra mundial foi empregada em diversas clínicas soviéticas. Também na antiga
União das Repúblicas Socialistas Soviéticas (URSS) em 1957 a própolis foi utilizada como
anestésico. Em 1967, na Romênia foi usada em tratamentos dermatológicos por sua ação
antifúngica. Em 1968, na Polônia no estudo das propriedades bactericidas e 1990, na Itália na
inibição de vários vírus como a herpes
3
.
O primeiro trabalho publicado no Brasil sobre a própolis foi no ano de 1984. Esse
estudo concluiu que a resina possuía grandes efeitos de inibição contra a bactéria
Staphylococcus aureus, demonstrando a característica antimicrobiana presente na própolis. A
primeira patente brasileira sobre a própolis surgiu em 1995 para o uso em tratamentos
odontológicos na prevenção de cáries e gengivites
3,51
. Em 1999, ocorreu o primeiro Simpósio
Brasileiro sobre Própolis e Apiterápicos
3
.
Desde a década de 1980 a própolis vem sendo largamente utilizada em suplementos
alimentares e em bebidas como preventivo de doenças. Atualmente no mercado, tanto
xix
nacional como internacional, existem vários produtos contendo própolis entre eles, balas,
xampus, pastas de dentes, sabonetes, cápsulas gelatinosas, entre outros
8,13,18,29,40,52
.
3.3. Extração dos Componentes da Própolis
Para a obtenção dos componentes químicos da própolis empregam-se diferentes
métodos de extração. Os mais comumente utilizados são a extração por maceração e por
soxhlet. O último é o mais eficiente por possuir melhor rendimento de extração e extrair
maiores quantidades dos compostos químicos de interesse, porém emprega altas temperaturas
que podem decompor substâncias naturais termicamente instáveis
6,53
.
Devido à própolis ser uma mistura muito complexa de substâncias de polaridade
variada dificilmente encontra-se um único solvente que extraia todos os componentes de
interesse, por isso encontram-se na literatura científica diversos solventes para a obtenção de
extratos de própolis. O solvente mais utilizado é o etanol em concentrações que variam desde
30% v/v em água até etanol absoluto
13,46,53
. É relatado também o uso farmacêutico de extratos
de própolis aquoso
27
. Com a finalidade de identificação dos componentes químicos da
própolis outros solventes também são empregados na extração como é o caso do
metanol
50,54,55
. A glicerina e o propilenoglicol são utilizados no preparo de produtos
farmacêuticos e cosméticos
17,29
.
Konishi e colaboradores analisaram a influência de agentes solubilizantes na extração
dos componentes bioativos da própolis coletada em Atibaia/São Paulo, e a atividade
antimicrobiana dos extratos resultantes. Os solventes extratores utilizados foram: Álcool
etílico; álcool etílico + água deionizada (1 + 1, v/v) + polissorbato 80 a 0,5 % (m/v); álcool
etílico + água deionizada (1 + 1, v/v) + laurilsulfato de sódio a 0,1 % (m/v); álcool etílico +
propilenoglicol (1 + 1, v/v) e álcool etílico + polietilenoglicol 400 (1 + 1, v/v). Esses
pesquisadores realizaram esse estudo pela necessidade de encontrar um solvente adequado
para a solubilização dos compostos químicos de interesse terapêutico que permitisse o preparo
de formulações apropriadas ao consumo humano. Constataram que para todas as cinco
extrações realizadas obtinham-se rendimentos de 20 a 30 %
19
.
Para a verificação da composição química da própolis brasileira e suas atividades
antimicrobianas, Bankova e colaboradores utilizaram o etanol 70 % como solvente extrator
6
.
Para o estudo dos extratos de própolis e suas aplicações, quantificação de flavonóides e
determinação das atividades antimicrobianas, antioxidante e antiinflamatórias, Park e
xx
colaboradores utilizaram como solvente extrator a água e diversas concentrações de etanol em
água (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % e 95 %), para verificar qual
solvente, era mais adequado para as finalidades citadas
13
. Em outra pesquisa realizada por
Park e colaboradores para a verificação da composição química e origem botânica da própolis
da região sul do Brasil, Argentina e Uruguai, o solvente extrator utilizado foi o etanol 80 %
56
.
Para avaliar as atividades antioxidante e antitumoral de amostra de própolis chilena, Russo e
colaboradores utilizaram como solvente extrator o etanol 60 %
28
.
Cunha e colaboradores realizaram estudos para avaliar como o método de extração da
própolis, o solvente empregado, entre outros, poderiam influenciar no rendimento da extração
e nos teores de compostos fenólicos. Para tal utilizaram amostras de própolis provenientes dos
estados de São Paulo e Minas Gerais. No estudo, realizaram a extração por maceração
utilizando como solvente extrator variadas concentrações de etanol em água, como, 30 %, 50
%, 70 % e etanol absoluto, além do álcool hidratado comercial. Também realizaram a
extração por soxhlet utilizando como solvente extrator o etanol absoluto. Estes pesquisadores
concluíram que o melhor rendimento de extração foi obtido através da extração por soxhlet.
Utilizando o método por maceração, a extração aumenta à medida que aumenta a quantidade
de etanol no solvente, estabilizando com a concentração de 70 % v/v. O solvente álcool
hidratado comercial não aumentou significativamente o rendimento de extração
53
.
Empregando outros solventes extratores, para a análise da própolis, Funari e Ferro
50
e
Wosky e Salatino
54
fizeram a extração utilizando o metanol. Nagai e colaboradores utilizaram
extratos aquosos para a verificação da atividade antioxidante da própolis
27
.
Atualmente existem diversas patentes referentes à extração da própolis para a
obtenção do extrato de própolis ou da própolis seca. Para tal, são empregados diversos tipos
de solventes. Os mais comumente relatados são à base de etanol (diferentes concentrações de
etanol em água). Outros solventes extratores também são encontrados, como o óleo vegetal e
soluções aquosas
39,57-60
.
xxi
3.4. Composição Química da Própolis
A composição química da própolis é bastante complexa e variada dependendo
principalmente das espécies vegetais de onde as abelhas coletam a matéria prima para sua
elaboração que, por sua vez, está vinculada com a região de localização das colméias
2,4,16,35,61
.
Em países de clima temperado da Europa, da América do Norte e regiões da Ásia, as
abelhas coletam geralmente material de uma única espécie vegetal, a Populus L, com isso a
composição química da própolis dessas regiões é bastante uniforme
7,16,18,45,56
. Geralmente a
própolis européia contém compostos fenólicos como flavonóides (flavonas e flavanonas),
ácidos fenólicos e seus ésteres; predominando na sua composição os flavonóides
6,7,16,20
.
Nos países de clima tropical, como é o caso do Brasil, há diversas espécies vegetais
que podem ser utilizadas para a fabricação da própolis, pois a biodiversidade é grande em
virtude das diferenças climáticas. Dentre as espécies identificadas citam-se o alecrim do
campo (Baccharis dracunculioflia), assa-peixe (Vernonia polyanthes), aroeira (Myracrodruon
urundeuva) e eucalipto (Eucalyptus ssp)
16,18,45,62
. Na própolis brasileira, há um maior
predomínio dos ácidos fenólicos em relação aos flavonóides, encontrando comumente
derivados do ácido cinâmico
16,20,33
.
Park e colaboradores classificaram a própolis do Brasil em doze grupos de acordo com
as características fisicoquímicas e propriedades biológicas. As amostras de própolis
proveniente da região sul do Brasil foram classificadas em cinco grupos, as amostras de
própolis proveniente da região nordeste foram classificadas em seis grupos e as amostras de
própolis provenientes da região sudeste foram classificadas em apenas um. Isso demonstra a
grande biodiversidade da flora brasileira e que a as abelhas das regiões nordeste e sul coletam
o material de uma maior quantidade de espécies vegetais que as da região sudeste
18
.
Outro estudo realizado por Park e colaboradores, conclui que as amostras de própolis
provenientes de países como Argentina e Uruguai não variam tanto na composição química,
quanto as amostras coletadas na região sul do Brasil. Da classificação em cinco grupos os
pesquisadores identificaram a origem vegetal de um grupo que é pertencente a Populus alba,
semelhante com as dos países da Argentina e Uruguai
45,56
.
Isla e colaboradores utilizaram amostras de própolis provenientes de várias regiões do
norte da Argentina, para a realização de diversos estudos. Dentre eles, a verificação da
composição química. Estes pesquisadores relataram que a maioria dos flavonóides
encontrados nas amostras de própolis Argentina eram similares aos encontrados em uma
xxii
amostra no sul do Brasil. Dentre os compostos semelhantes estão a pinocembrina 1, a crisina
2, a galangina 3 entre outros
11
.
No nordeste brasileiro existe também outro tipo de resina chamada de própolis
vermelha. Devido à origem geográfica, esta possui coloração, característica e componentes
químicos diferenciados da resina de outras regiões
5
.
Outro importante parâmetro a ser considerado a respeito dos componentes químicos da
própolis é a influência das estações do ano. Em zonas temperadas do hemisfério norte, as
abelhas coletam material para a produção de própolis só no verão (incluído o final da
primavera e início do outono), enquanto no Brasil, a própolis é coletada durante todo o
ano
37,63
.
Bankova e colaboradores verificaram a variação da composição química da própolis
do Brasil, coletada em Botucatu, de acordo com as estações do ano. Para a extração,
utilizaram o etanol 70 %. Notou-se que a porcentagem dos extratos secos e as concentrações
de certos componentes químicos variaram dependendo da estação. Utilizando-se amostras de
própolis produzidas por abelhas européias, o ácido ferúlico 4 possui maiores quantidades do
composto no outono, enquanto que o ácido caféico 5 possui maior concentração na primavera.
Variações também ocorrem nos flavonóides em que a canferida 6 possui maiores teores na
primavera e no verão
37
.
Outros fatores que, também, influenciam na composição química são as secreções
metabólicas adicionadas pelas abelhas durante a elaboração da resina e de materiais
introduzidos durante a elaboração da própolis
2
. De acordo com a literatura analisada
verificou-se que a própolis contém 50-60 % de resinas e bálsamos, 30-40 % de ceras, 5-10 %
de óleos essenciais, 5 % de grãos de pólen, além de microelementos como alumínio, cálcio,
estrôncio, ferro, cobre, manganês e pequenas quantidades de vitamina B
1
, B
2
, B
6
, C e E
1
.
Os componentes químicos da própolis de maior interesse por seu potencial
farmacológico são os compostos fenólicos com ênfase nos flavonóides e ácidos fenólicos. Em
própolis de diferentes zonas climáticas, já foram encontrados mais de 200 tipos desses
compostos
50
.
xxiii
Pinocembrina 1 Crisina 2
Galangina 3 Ácido ferúlico 4
Ácido caféico 5 Canferida 6
xxiv
3.4.1 Compostos Fenólicos da Própolis
Os compostos fenólicos pertencem a uma classe que inclui uma grande diversidade de
estruturas simples e complexas. Sua característica principal é possuir pelo menos um anel
aromático no qual, ao menos, um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila
(Figura 5)
62
.
Figura 5. Estrutura básica de um composto fenólico.
Os flavonóides são uma das classes de compostos fenólicos mais importantes dentre os
produtos de origem natural. A estrutura básica é representada por 15 átomos de carbono em
seu núcleo fundamental (dispostos em uma configuração C
6
-C
3
-C
6
), constituída de duas
fenilas ligadas por uma cadeia de três carbonos entre elas, de acordo com a Figura 6
62
. Os
flavonóides pinocembrina 1 e apigenina 7 são comumente encontrados na própolis
62,64
.
Figura 6. Núcleo fundamental dos flavonóides.
Os ácidos fenólicos, que também constituem o grupo dos compostos fenólicos, são
caracterizados por possuir um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais
grupamentos hidroxilas e/ou metoxila na molécula. Esses compostos podem ser divididos em
derivados formalmente do ácido benzóico 8, como o ácido gálico 9 e derivados do ácido
cinâmico 10, como o ácido p-cumárico 11
62,65
.
xxv
Apigenina 7
Ácido benzóico 8 Ácido gálico 9
Ácido cinâmico 10 Ácido p-cumárico 11
xxvi
3.4. Análise Quantitativa e Qualitativa da Própolis
Para a quantificação de compostos fenólicos, podem-se utilizar técnicas como
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrofotometria no UV-VIS. A primeira
é mais precisa, porém a segunda também traz bons resultados, além de ser uma técnica
simples e barata
11,53,64
.
Na literatura é frequentemente encontrado o método espectrofotométrico (UV-VIS)
utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau para a quantificação de compostos fenólicos
presentes na própolis. Também tem sido empregado para a verificação de teores em suco de
uvas
66
, pitanga
67
, extrato aquoso de broto de feijão
68
e plantas medicinais
69
.
A determinação de fenóis totais utilizando o método Folin-Ciocalteau é muito
presente, na literatura, por possuir uma boa reprodutibilidade
14,20,25,26,53,54,70
. Este método
(Folin-Ciocalteau) é baseado em uma reação de oxidação-redução em condições alcalinas em
que o íon fenolato é oxidado enquanto o reagente Folin (tungstênio e molibdênio) é reduzido
tornando a solução azul. Muitos compostos ativos na própolis, como ácidos fenólicos e
flavonóides possuem um núcleo fenólico obtendo-se uma boa eficiência
53,70
.
Para a quantificação de flavonóides é muito utilizado o método espectrofotométrico
através da complexação com cloreto de alumínio
14,25,26,50,54,64,70
. Nesta técnica, o cátion
alumínio forma complexos estáveis com os flavonóides em metanol ocorrendo um desvio
batocrômico do máximo de absorção. No entanto, como indicado por vários pesquisadores,
deve-se ter em conta que o método produz valores inferiores aos reais, uma vez que as várias
classes de flavonóides apresentam variações de absorção na região do comprimento de onda
escolhido para análise
50,54,64,70
.
Wosky e Salatino utilizaram amostras de própolis provenientes dos estados de São
Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul para a verificação do teor de fenóis totais e
flavonóides. Esses pesquisadores concluíram que os teores de fenóis variam em torno de 8,78
e 13,72 % m/m e de flavonóides em torno de 0,77 e 2,69 % m/m
54
.
Cunha e colaboradores realizaram a quantificação de fenóis totais em amostras
provenientes dos estados de São Paulo e de Minas Gerais e encontram variações entre 6,41 e
15, 24 % m/m
53
.
xxvii
Além desses pesquisadores, Funari e Ferro também verificaram o teor de flavonóides
através do método de complexação com cloreto de alumínio. Utilizaram amostras de própolis
do estado de São Paulo e obtiveram o teor de 2,64 %
50
.
De acordo com Koru e colaboradores diferentes amostras de própolis da Turquia
possuem grande similaridade no teor de flavonóides. Quando comparado quantitativamente o
teor de flavonóides com amostras de própolis provenientes do Brasil, as da Turquia possuem
maiores teores, reforçando a observação de que a própolis brasileira possui menores
quantidades desses compostos
12
.
Para a realização de análise qualitativa dos componentes da própolis, vários métodos
são utilizados. Os mais comumente empregados são a Cromatografia Gasosa acoplada a
Espectrômetro de Massas (GC-MS)
6,37
e HPLC
56
.
Com esses conhecimentos e o interesse do nosso grupo de pesquisa em Química
Orgânica e Tecnologia no desenvolvimento de produtos a base de própolis, já foi iniciado o
estudo químico qualitativo de extratos etanólico e oleoso da própolis de Prudentópolis. Os
extratos foram analisados por (ESI(-)-MS) e foi verificado que vários componentes químicos
presentes no extrato etanólico também estavam presentes no extrato oleoso. Os componentes
identificados foram o ácido p-cumárico 11, o ácido caféico 5, o ácido 2,2-dimetil-2H-1-
benzopirano-6-propenóico 12, o ácido 3-prenil-4-hidroxinâmico 13, o ácido 3,4-diidróxi-5-
prenilcinâmico 14, a canferida 6, o ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (Artepillin C) 15, a
diidrocanferida 16, o betuletol 17, o ácido 3-prenil-4-diidrocinamoloxi-cinâmico 18, o ácido
3-O-dicafeoilquinico 19 e o ácido 4-hidroxi-3-(E)-(4-hidroxi-3-metil-2-butenil)-5-prenil
cinâmico 20
41
.
xxviii
Ácido 2,2-dimetil-2H- Ácido 3-prenil-4-hidroxicinâmico 13
1-benzopirano-6-propenóico 12
Ácido 3,4-diihidróxi-5-prenilcinâmico 14 Ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico
(Artepillin C) 15
Diihidrocanferida 16 Betuletol 17
xxix
Ácido 3-prenil-4-diihidrocinamoloxi-cinâmico 18
Ácido 3-O-dicafeoilquinico 19
Ácido 4-hidroxi-3-(E)-(4-hidroxi-3-metil-2-butenil)-5-prenil cinâmico 20
xxx
3.6. Atividades Biológicas da Própolis
As atividades biológicas estão intimamente relacionadas com a composição química
da própolis e esta com a origem vegetal e geográfica. Desta maneira os diferentes tipos de
própolis podem variar em composição química qualitativa e/ou quantitativa podendo
apresentar indicações terapêuticas distintas. Esses efeitos estão atribuídos, principalmente, aos
compostos fenólicos que compõe a própolis destacando-se os ácidos fenólicos e os
flavonóides
7,45
.
Vários autores afirmam que a intensidade das atividades biológicas da própolis é
maior em regiões tropicais do planeta e menor em regiões temperadas, devido à
biodiversidade de cada região
4,16
.
A maioria dos estudos sobre as atividades terapêuticas da própolis tem sido realizada
com seus extratos etanólicos sendo descritas numerosas atividades como antimicrobiana
4-24
,
antioxidante
4,5,8,11,13,14,16,18,25-27
, antiinflamatória
4,8,16,18,29
,
anticariogênica
3,30
, citotóxica
7,8,16,28,31-34
e
anti-HIV
34
. Devido a essas propriedades houve um aumento na demanda por produtos naturais
contendo extratos de própolis.
Dentre as atividades atribuídas à própolis, a antimicrobiana é a mais conhecida e
comprovada cientificamente. Essa atividade está presente em todas as amostras de própolis,
uma vez que, as abelhas utilizam a resina como um anti-séptico, revestindo toda a superfície
interna da colméia e embalsamando insetos mortos nela
1,4
. No entanto, segundo vários
pesquisadores, o maior ou menor grau de inibição da própolis em relação aos diferentes
microorganismos testados pode ser influenciado por fatores como a técnica utilizada na
extração da própolis, o solvente utilizado na extração, a metodologia de condução de ensaios
e a época do ano que foi produzida a resina
71
.
Pesquisas foram realizadas para verificar se a bactéria Erwinia amyloyora, responsável
por uma doença dentro de colméias, sobrevive em presença de própolis e notou-se que a
resina inibe esse microorganismo. Com isso, o fato de a bactéria não sobreviver na própolis
evidencia a presença de substâncias inibitórias a este patógeno
71
.
Algumas técnicas utilizadas para a realização destes testes são os testes de difusão em
ágar, pelos métodos de poços, de cilindro e de disco
6,10,12,17,21,45,71
. Para esses estudos,
utilizaram-se diversas bactérias tanto Gram-negativas quanto Gram-positivas. Dentre as
Gram-negativas podemos citar Pseudomonas aeruginosas, Escherichia coli, Salmonella
typhimurium e dentre as Gram-positivas estão Staphylococcus aureus, Streptococcus
xxxi
mutans
2,4,21-23,24
. Comparando os tipos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas em
diversos estudos, verificou-se que a resina possui maior eficácia contra bactérias Gram-
positivas
4,9,10,15,23,24
.
Tosi e colaboradores avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato oleoso de
própolis proveniente da Itália. Diversas bactérias foram testadas, entre elas Staphylococcus
aureus (Gram-positiva) e Escherichia coli (Gram-negativa). O extrato oleoso de própolis
mostrou boa atividade e atividade moderada respectivamente para essas bactérias
17
.
Para a bactéria Staphylococcus aureus, Gram-positiva, comprovou-se que quase todos
os extratos de própolis possuem atividade inibitória. Porém, Silva e colaboradores relataram
que o extrato etanólico de uma própolis originária do estado da Paraíba, não apresenta tal
efeito
72
.
A odontologia é uma das áreas da medicina aonde a própolis vem sendo muito
utilizada e encontram-se na literatura numerosos artigos que descrevem suas aplicações nessa
área. Koo e colaboradores realizaram testes microbiológicos contra a bactéria Streptococcus
mutans. Essa bactéria é responsável pela formação da placa bacteriana e está envolvida no
processo de dissolução do dente, causado quando o pH da boca se torna ácido, formando a
cárie. Para esses estudos, os pesquisadores utilizaram três tipos de amostras de própolis
oriundos de regiões diferentes do Brasil: da Bahia, de Minas Gerais e do Rio Grande do Sul.
A própolis da Bahia mostrou melhor eficácia quando comparada com as outras
30,73
.
Koo e colaboradores continuaram seus estudos contra a bactéria Streptococcus
mutans, em testes contra a cárie dentária. Utilizaram amostras de própolis proveniente dos
estados de Minas Gerais e de São Paulo. Os testes foram realizados in vivo em ratos e
humanos voluntários. Nos primeiros, houve a redução de 60 a 70 % da placa bacteriana e nos
últimos de 40 %. Embora a própolis, substância natural, reduza apenas 40 % da placa
bacteriana em humanos, não produz efeito colateral ao contrário da cloroexdina, substância
química que reduz 70 %, porém pode causar efeitos colaterais
30
.
Park e colaboradores classificaram as amostras de própolis, coletadas de diferentes
regiões do Brasil, em doze grupos, de acordo com suas características físico-químicas e
propriedades biológicas. Verificaram se as amostras de própolis obtidas desses doze grupos
possuíam atividade antimicrobiana contra Streptococcus mutans e contra Staphylococcus
aureus. Constataram que alguns tipos de própolis possuem atividade contra tais bactérias,
enquanto que outros não, dependendo de sua região de origem e concluíram que para o
xxxii
combate da bactéria Streptococcus mutans é interessante utilizar a própolis proveniente da
Bahia e/ou do Paraná e para a bactéria Staphylococcus aureus é mais indicado utilizar a resina
produzida na Bahia, pois esta inibiu fortemente a bactéria. Assim, é necessário utilizar à
própolis específica para o combate das bactérias em questão
18
.
Alguns compostos isolados da própolis mostram atividade antimicrobiana, por
exemplo: a galangina 3, pertencente ao grupo dos flavonóis, a pinocembrina 1 e a
pinobanksina 21 pertencente ao grupo das flavanonas
12,36,50
. Dentre os ácidos fenólicos a ação
antibactericida está relacionada aos ácidos ferúlico 4, cafeico 5, derivados do ácido cinâmico
10
28,50
. Constata-se então, que o mecanismo da atividade antimicrobiana é complicado e pode
ser atribuída ao sinergismo entre alguns componentes químicos, principalmente os
flavonóides e ácidos fenólicos
2,63
.
Pinobanksina 21
Os extratos de própolis geralmente apresentam atividade antioxidante. Várias doenças,
no organismo humano, estão relacionadas ao aumento de radicais livres como doenças
cardiovasculares, doenças neurológicas, doenças psiquiátricas, envelhecimento precoce,
diabetes entre outras
4
. Vários componentes químicos presentes na própolis que apresentam
atividade antioxidante já foram isolados, tanto flavonóides como a canferida 6, quanto ácidos
fenólicos e seus ésteres como o ácido caféico 5
4,8,16,65
.
Os extratos de própolis têm sido analisados em testes para avaliar sua atividade
citotóxica. Um dos procedimentos geralmente empregado para esses testes é do MTT, 3-(4,5-
dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium. Este método é rápido, econômico e
amplamente utilizado para a verificação quantitativa de efeitos nas células
28,74
. Nestes estudos
utilizaram-se diferentes culturas e linhagens celulares como carcinoma renal, carcinoma
cervical, carcinoma de mama entre outros
32,34
.
xxxiii
Diversos compostos fenólicos apresentaram tal atividade é o caso do ácido cafeico 5 e
seus derivados, de derivados prenilados do acido cinâmico e cumárico, como o Artepillin C
15, da quercetina 22 e da galangina 3
2,34,63
.
Quercetina 22
O composto Artepillin C 15 possuí grande interesse devido as suas propriedades
biológicas, entre elas a antitumoral, aumentando a resposta imunológica contra a leucemia,
além de apresentar atividades antimicrobiana e antioxidante. Devido a essa grande
importância, Paredes-Gusman e colaboradores realizaram estudos para a verificação da
presença desse composto em amostras de própolis brasileira. Concluíram que as amostras
coletadas nos estados de São Paulo, Mato Grosso do Sul, Goiás, sul de Minas Gerais e Paraná
apresentaram tal componente quimico o qual está diretamente relacionado com a origem
botânica
75
.
A própolis que contém grande teor de Artepillin C 15 é considerada de excelente
qualidade e por isso a resina brasileira é extensamente utilizada em produtos alimentícios
como balas e chocolates, com o propósito de manter ou melhorar a saúde humana
6,75
.
Outros estudos biológicos realizados a partir da classificação da própolis brasileira em
doze grupos feita por Park e colaboradores, foram a determinação da atividade citotóxica em
várias linhagens de células tumorais como carcinoma renal, carcinoma nasofaringeal,
adenocarcinoma ileocecal e adenocarcinoma de mama e anti-HIV, contra o vírus da AIDS.
Todos os testes foram realizados in vitro, utilizando extrato etanólico de própolis.
Verificaram-se boas porcentagens de inibição para as atividades citotóxicas utilizando
própolis provenientes do sul e nordeste brasileiro e contra a atividade do vírus da AIDS a
própolis paranaense mostrou boa eficiência
34
.
Estudos foram realizados, também a partir da classificação em doze grupos, com
extratos de própolis contra a toxicidade da dioxina, um organoclorado altamente tóxico e
carcinogênico que provém quase que exclusivamente da ingestão alimentar (especialmente de
xxxiv
carne e de peixes). O estudo mostrou que os flavonóides, principalmente as flavonas e os
flavonóis agliconados presentes na resina, têm grande poder de inibição dessa toxicidade. Os
grupos que apresentaram boa eficiência foram os grupos situados nos estados do Paraná e de
São Paulo
76,77
.
Para a verificação da atividade antitumoral, em ratos, Orsolic e colaboradores
utilizaram extrato aquoso de própolis e compostos polifenólicos, como ácido cafeico 5, para
posterior comparação. Concluíram que medicando os ratos com o extrato aquoso de própolis e
com o ácido fenólico, houve um prolongamento de vida nos animais. Quando realizados
testes in vivo contra macrófagos, os compostos polifenólicos mostraram melhor atividade que
o extrato aquoso de própolis
32
.
Banskota e colaboradores estudaram a composição química da própolis localizada na
região tropical do Brasil e verificaram que alguns compostos apresentavam atividade
citotóxica contra fibrosarcoma e carcinoma de cólon. Alguns compostos isolados que
mostraram boa atividade foram, a canferida 6, o betuletol 17, a ermanina 23
31
.
Outra atividade comumente encontrada em extratos de própolis é a antiinflamatória. O
termo inflamação pode ser definido como uma mudança do equilíbrio morfológico em uma
área específica do tecido causada por vários tipos de agentes: físicos, químicos ou
biológicos
16,29
.
Pesquisadores já têm isolado alguns compostos da própolis que apresentam atividade
antiinflamatória; o ácido cafeico 5, o ácido salicílico 24, o ácido ferúlico 4, a apigenina 7 e a
galangina 3
2,7
, porém deve-se também considerar o efeito de sinergismo entre os
compostos
4,16,29
.
Ermanina 23 Ácido salicílico 24
Baseado na literatura, a Tabela 1 mostra alguns dos compostos químicos identificados
por espectrometria de massas nos extratos etanólico 95 % e oleoso de própolis de
Prudentópolis
41
e atividades biológicas relatadas para os mesmos
8
:
xxxv
Tabela 1. Compostos químicos presentes nos extratos etanólico 95 % e oleoso de própolis de
Prudentópolis
41
e atividades biológicas
8
.
Composto Atividade
Ácido p-cumárico 11 - Antimicrobiana, contra a bactéria
Helicobacter pylori (ulcera gastrointestinal).
- Antiinflamatória
Ácido caféico 5 - Antioxidante
- Antiinflamatório
Ácido 2,2-dimetil-2H-1-benzopirano-6-
propenóico 12
- Antioxidante
- Antitumoral (derivados prenilados)
- Antibacteriana
Ácido 3-prenil-4-hidroxinâmico 13
- Hepatoprotetora
- Antioxidante
- Antibacteriana
Ácido 3,4-diidróxi-5-prenilcinâmico 14 - Antioxidante
Canferida 6
- Hepatoprotetora
- Citotóxica (contra fibrosarcoma humano
HT1080, celulas de carcinoma murine colon
26-L5)
- Antioxidante
Ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico
(Artepillin C) 15
- Ativa o sistema imunológico
- Antitumoral
- Antioxidante
- Antimicrobiana, contra a bactéria
Trypanosoma cruzi
Betuletol 17
- Hepatoprotetora
- Citotóxica (contra fibrosarcoma humano
HT1080, celulas de carcinoma murine colon
26-L5)
- Antioxidante
- Antiinflamatório
Ácido 3-prenil-4-diidrocinamoloxi-cinâmico
18
- Hepatoprotetora
- Antioxidante
Ácido 3-O-dicafeoilquinico 19
- Hepatoprotetora
- Antioxidante
xxxvi
3.7. Toxicidade da Própolis
Diversos estudos já foram realizados quanto à toxicidade da própolis. Inúmeros efeitos
terapêuticos são atribuídos à resina o que torna necessário a verificação dos efeitos colaterais,
pois a extração da própolis tem por finalidade a obtenção de produtos comercializáveis
principalmente destinados ao consumo humano
78
.
Várias pesquisas demonstram que alguns compostos químicos presentes na própolis
podem causar dermatite alérgica em praticamente todas as partes do corpo
2,33,78
. A dermatite
alérgica ocorre geralmente em pessoas que possuem alergia a picadas de abelhas e explica-se
devido às secreções glandulares que se encontram nos produtos apícolas em forma de enzima.
Alguns autores afirmam que os responsáveis pelas alergias são os constituintes presentes nos
brotos de álamo, principalmente, os derivados do ácido caféico 5
52
.
Araujo e colaboradores estudaram a toxicidade aguda (processo tóxico cujos sintomas
aparecem nas primeiras 24 horas após a exposição às substâncias) de uma amostra de própolis
proveniente do estado do Paraná em camundongos e verificaram que não houve nenhuma
manifestação maléfica no sistema nervoso central e na atividade motora
79
. A toxicidade
aguda, por via oral, também foi validada em ratos e não se observou nenhum efeito
maléfico
29
.
Em outro estudo, realizado por Ribeiro e colaboradores, para avaliar se amostras de
própolis originárias do estado de Minas Gerais possuíam efeitos colaterais sobre o peso
corporal e sobre os metabolismos protéico, lipídico, mineral e de carboidratos de coelhos
saudáveis, concluiu-se que nas condições estudadas não houve mudanças significativas
78
.
Experimentos realizados em ratos, com extrato etanólico de própolis por via oral,
mostraram que a própolis não demonstra nenhuma alteração nesses animais, pois nenhuma
mudança na aparência clínica, comportamento, peso e mortalidade foram verificados
52
.
A literatura analisada deixa claro que a própolis possui grande efeito terapêutico,
porém Ribeiro e colaboradores alertam para o cuidado quanto a seu uso. Efeitos indesejáveis
podem ser observados caso haja ingestão de uma superdosagem da substância
78
.
Sforcin, alerta quanto à presença de partículas radioativas presente nos solos que
podem contaminar as plantas, os insetos, os produtos e consequentemente o homem
33
.
xxxvii
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Local do Experimento
O trabalho experimental foi realizado utilizando-se da infra-estrutura de pesquisa
disponível no Laboratório de Química Orgânica e Tecnologia do Departamento de Química
(DEQ) da UNICENTRO e nos laboratórios multiusuários do DEQ. Os testes antimicrobianos
foram executados no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Engenharia de
Alimentos (DEALI) da UNICENTRO. Já os testes citotóxicos foram realizados na
Universidade Federal do Ceará (UFC) pelo grupo de pesquisadores do Laboratório de
Oncologia Experimental.
4.2. Material Experimental
4.2.1. Amostras de Própolis
As amostras de própolis, proveniente das abelhas Apis mellifera, foram coletadas no
inicio do ano de 2005. Tais amostras foram fornecidas pela empresa de derivados apícolas
Campolin & Schmidt LTDA da cidade de Prudentópolis, região sudeste do Paraná, devido ao
convênio estabelecido com o Grupo de Pesquisa em Química Orgânica e Tecnologia.
Até o momento de sua trituração, a própolis foi armazenada em freezer a temperaturas
em torno de - 10 °C. Posteriormente, foram realizadas extrações com diferentes solventes a
temperatura ambiente e sob agitação magnética em agitador magnético Fisatom Mod. 752A.
Para a obtenção dos diferentes extratos de própolis realizou-se a evaporação do solvente em
evaporador rotativo Fisatom Mod. 803. Para as extrações oleosas utilizou-se o óleo de canola
obtido comercialmente e para as extrações etanólicas utilizou-se o etanol de grau P.A..
4.2.2. Análises Espectrofotométricas
Os reagentes e solventes utilizados nas análises espectrofotométricas foram de grau
P.A. e espectrofotométrico, respectivamente. As análises foram realizadas no
espectrofotômetro UV-VIS Varian Cary 50 Bio locado no Bloco de Química no CEDETEG,
UNICENTRO.
xxxviii
Na determinação de fenóis totais empregou-se uma solução estoque de 0,1 g de ácido
gálico em 100 mL de metanol para o preparo de soluções padrão e construção da curva de
calibração. Para todas as reações preparou-se uma solução saturada de carbonato de sódio e
tartarato de sódio e potássio a partir de 20 g de carbonato de sódio e 1,2 g de tartarato de
sódio e potássio em 100 mL de água destilada. O reagente Folin-Ciocalteau foi adquirido
comercialmente pronto para o uso.
Na determinação de flavonóides, para o preparo de soluções-padrão e construção da
curva de calibração, utilizou-se uma solução estoque de quercetina contendo 0,025 g de
quercetina em 25 mL de metanol. Para as reações utilizou-se uma solução de cloreto de
alumínio 5 % m/v em metanol.
4.2.3. Testes Antimicrobianos
Utilizaram-se os microorganismos patogênicos disponíveis no laboratório de
microbiologia do Departamento de Engenharia de Alimentos da UNICENTRO, sendo estes:
Bactérias Gram-positivas: Staphylococcus aureus (American Type Culture Collection) ATCC
25923; Listeria monocitogenes ATCC 19111. Bactérias Gram-negativas: Escherichia coli
ATCC25922; Salmonella tiphimurium ATCC 14028; Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853.
Para o meio de cultura preparou-se um caldo de tripticase de soja (TSB), onde em 1 L
de água destilada adicionaram-se 30 g de TSB e 15 g de ágar. A diluição foi realizada com
aquecimento a temperaturas em torno de 60 a 80 °C utilizando uma chapa de aquecimento da
Fisatom Mod. 752A.
Para a esterilização do material utilizou-se a autoclave Vertical Phoenix e para os
procedimentos decorrentes a câmara em fluxo Logen Scientific. Foram utilizados outros
materiais complementares como o swab, tubo de duran, placas de petri e paquímetro.
4.2.4. Testes Citotóxicos
Nos testes para determinação da atividade citotóxica dos extratos de própolis foram
utilizadas quatro linhagens de células tumorais humanas: HL-60 (leucemia), HCT-116
(cólon), MDA/MB-435 (mama) e SF-295 (glioblastoma) doadas pelo National Câncer
Institute, USA. Todas as linhagens celulares foram mantidas em meio de cultura RPMI,
xxxix
suplementado com 10 % de soro fetal bovino, 2 mM de glutamina e 1 % de antibióticos (100
U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina), a 37 °C, em atmosfera com 5 % de CO
2
e 95 % de umidade
.
A leitura da absorbância foi realizada em Espectrofotômetro de placa DTX-880,
Beckman Coulter.
4.3. Métodos
4.3.1. Preparação dos Extratos de Própolis
4.3.1.1. Extração das Amostras de Própolis para a Obtenção de Extratos
Etanólicos
Para as extrações das amostras de própolis foram preparadas soluções etanólicas com
as seguintes proporções de etanol em água: 30 %, 50 %, 70 %, 80 % 95 % v/v. O etanol
absoluto também foi utilizado como solvente extrator. Tomaram-se alíquotas de
aproximadamente 5 g de própolis triturada e adicionou-se 25 mL de cada solvente,
respectivamente. Deixou-se em contato a temperatura ambiente, com agitação ocasional,
durante 10 dias.
Após os 10 dias de extração, filtrou-se a vácuo e o filtrado foi mantido no freezer a
temperatura em torno de - 10 °C, durante uma noite, para a precipitação das ceras.
Imediatamente, após a sua retirada do freezer fez-se uma nova filtração a vácuo e o filtrado
remanescente foi submetido à evaporação auxiliado pelo evaporador rotativo com banho de
água em temperatura inferior a 60 °C e pressão reduzida, para a obtenção dos extratos secos.
A Figura 7 ilustra o processo de extração e obtenção dos extratos secos. Os extratos obtidos
foram denominados de acordo com a concentração de etanol em água na sua extração, EEP30
(extrato etanólico 30 %), EEP50 (extrato etanólico 50 %), EEP70 (extrato etanólico 70 %),
EEP80 (extrato etanólico 80 %), EEP95 (extrato etanólico 95 %) e EEP100 (extrato obtido
com o etanol absoluto).
4.3.1.2. Extração das Amostras de Própolis para a Obtenção de Extratos Oleosos
Os extratos oleosos foram obtidos a partir da realização de extrações durante 10, 30 e
90 dias. Tomaram-se alíquotas de aproximadamente 5 g de própolis triturada, adicionou-se 25
xl
mL de óleo de canola e realizou-se a extração a temperatura ambiente com agitação
magnética.
Após o tempo estabelecido de extração, fez-se a filtração a vácuo, utilizando papel de
filtro quantitativo. O filtrado foi submetido a partições com metanol/água destilada (8 + 2). A
fase metanólica aquosa foi mantida no freezer a temperatura de - 10 °C, durante uma noite,
para a precipitação das ceras. Imediatamente após a sua retirada do freezer fez-se uma nova
filtração a vácuo e o filtrado remanescente foi submetido à evaporação auxiliado do
evaporador rotativo, em banho de água a temperatura inferior de 60 °C e pressão reduzida,
para a obtenção dos extratos secos oleosos. A Figura 7 esquematiza o processo de preparação
destes extratos. Os extratos obtidos foram denominados de acordo com o tempo de agitação
na sua extração, EOP10 (extrato oleoso obtido após 10 dias), EOP30 (extrato oleoso obtido
após 30 dias), EOP90 (extrato oleoso obtido após 90 dias).
xli
Figura 7. Extração e obtenção dos extratos secos de própolis.
xlii
4.3.2. Métodos espectrofotométricos
4.3.2.1. Quantificação de Fenóis Totais pelo Método Folin-Ciocalteau
Para elaboração da curva de calibração foram usadas soluções de concentração
conhecida de ácido gálico em metanol (1 a 165 μg/mL) preparadas a partir de uma solução
estoque (1000 μg/mL). Dessas soluções de referência retiraram-se alíquotas de 150 μL e
misturaram-se em balão volumétrico de 5 mL com 500 μL de Folin-Ciocalteau e 500 μL de
solução saturada de carbonato de sódio e tartarato de sódio e potássio. Ajustou-se o volume
do balão volumétrico com água destilada. De acordo com outros trabalhos que empregam o
Método de Folin-Ciocalteau para determinação de fenóis totais, esperou-se 30 min para
ocorrer a reação redox e fez-se a leitura da absorbância no espectrofotômetro na região do
visível no comprimento de onda de λ= 700 nm
53
.
Para determinação do teor de fenóis nos extratos de própolis preparou-se uma solução
onde 25 mg de cada extrato foram dissolvidos, separadamente, em 25 mL de metanol em
balão volumétrico. A partir de cada solução retiraram-se alíquotas de 150 μL e repetiu-se o
mesmo procedimento descrito para as soluções padrão para realizar a reação com o reagente
de Folin-Ciocalteau e a leitura da absorbância, conforme ilustra a Figura 8. Para cada extrato
as análises foram realizadas em triplicatas.
Figura 8. Determinação do teor de fenóis totais nos extratos de própolis.
xliii
4.3.2.2. Quantificação de Flavonóides por Complexação com Cloreto de Alumínio
Para elaboração da curva de calibração usaram-se soluções de concentração conhecida
de quercetina em metanol (1 a 75 μg/mL) preparadas a partir de uma solução estoque (1000
μ/mL). Dessas soluções de referência retiraram-se alíquotas de 500 μL e misturaram-se em
balão volumétrico de 5 mL com 1000 μL de metanol e 250 μL de solução de cloreto de
alumínio 5 % m/v. Esperou-se 30 min para ocorrer a reação de complexação, e fez-se a leitura
da absorbância no espectrofotômetro na região do visível no comprimento de onda de λ=
425nm
50,54
.
Para determinação do teor de flavonóides nos extratos de própolis prepararam-se
soluções dissolvendo 25 mg de cada extrato em 25 mL de metanol, separadamente, em balão
volumétrico. A partir dessas soluções retiraram-se alíquotas de 500 μL e repetiu-se o mesmo
procedimento descrito para as soluções-padrão para realizar a reação com o cloreto de
alumínio e as medidas de absorbância, como representado na Figura 9. Para cada extrato as
análises foram realizadas em triplicatas.
Figura 9. Determinação do teor de flavonóides nos extratos de própolis.
xliv
4.3.3 Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram feitas utilizando o método das componentes principais.
Os resultados obtidos com a determinação de fenóis totais e flavonóides e rendimentos de
extração nos extratos oleosos e etanólicos foram avaliados segundo a análise multivariada. A
análise estatística dos resultados provenientes dos extratos etanólicos e oleosos de própolis,
quanto aos teores de substâncias fenólicas e rendimentos de extração foi realizada usando o
software Statistica 6.0.
4.3.4. Avaliação da Atividade Antimicrobiana
Todo material utilizado para os testes antimicrobianos (teste de difusão em ágar) foi
esterilizado em autoclave por 15 minutos a 120 °C.
4.3.4.1. Preparo das Amostras para os Testes Antimicrobianos
Para a realização desses testes pesaram-se quantidades apropriadas dos extratos de
própolis EEP95, EEP70, EEP30 e EOP90 e prepararam-se soluções de concentrações 10 %
m/v. Os solventes utilizados foram etanol 95 %, etanol 70 %, etanol 30 % e etanol 80 %
respectivamente.
4.3.4.2. Teste de Difusão em Ágar pelo Método de Poços
Para o preparo do meio de cultura das bactérias, em placas de petri, adicionaram-se
aproximadamente 18 mL do caldo TSB e esperou-se a sua secagem, conservando-se em
geladeira. Usaram-se as bactérias que estavam praticamente inativas armazenadas em
geladeira em caldo TSB. Para reativar pegou-se uma alçada de cada caldo que continha o
microorganismo e adicionou-se em um tubo de ensaio com aproximadamente 9 mL de TSB e
incubou-se na estufa a 37 °C por 24 h. Fez-se a diluição com 9,9 mL de TSB e 0,1 mL do
caldo contendo o microorganismo.
Nas placas de petri, devidamente preparadas, semearam-se os microorganismos com
auxilio de swab. Após levou-se todo o material necessário para dentro de uma câmara de
fluxo onde foram feitos os poços com tubo de duran e adicionou-se com micropipetas 50 μL
de cada solução 10 % m/v contendo os extratos de própolis. Como controle negativo utilizou-
xlv
se etanol 95 %, 70 %, 30 % e 80 % respectivamente. Para o controle positivo utilizou-se o
antibiótico gentamicina por possuir atividade contra todas as bactérias testadas em uma
concentração de 50 μg/mL. As placas foram incubadas a 37 °C por 24 h e mediu-se o halo de
inibição com o auxílio do paquímetro, conforme esquematizado na Figura 10.
Figura 10. Procedimento do teste de difusão em Ágar com poços dos extratos de própolis.
xlvi
4.3.5. Avaliação da Atividade Citotóxica
Os extratos de própolis EEP30, EEP70, EEP95 e EOP90 foram avaliados quanto à
capacidade citotóxica frente a 4 linhagens de células tumorais humanas – HL-60 (leucemia),
HCT-116 (cólon), MDA/MB-435 (mama) e SF-295 (glioblastoma). O método empregado foi
o colorimétrico, baseado na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de
tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente
nas células metabolicamente ativas (Método de MTT)
74
. Todas as linhagens celulares
utilizadas foram mantidas em meio RPMI suplementado com 10 % de soro fetal bovino, 2
mM de glutamina e 1 % de antibióticos (100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de
estreptomicina), a 37 °C, em atmosfera com 5 % de CO
2
e 95 % de umidade
.
Os extratos foram dissolvidos, separadamente, em dimetilsulfôxido (DMSO) puro e
estéril na concentração estoque de 10 mg/mL. Cada solução do extrato de própolis foi diluída
seriadamente em meio RPMI (0,09-50 μg/mL) e adicionada a placas de 96 poços contendo as
células previamente plaqueadas (100 μL da solução do extrato de própolis por poço).
Após 72 h de incubação em estufa, a 37 °C e 5 % de CO
2
, as placas foram centrifugadas,
o sobrenadante aspirado e 150 μL de MTT 10 % m/v foram adicionados por poço. Após
incubação, a 37 °C por 3 h, as placas foram novamente centrifugadas e aspiradas. O precipitado
foi ressuspendido em 150 μL de DMSO e a leitura feita a 595 nm em Espectrofotômetro de
placa DTX-880. O quimioterápico doxorubicina foi usado como controle positivo.
xlvii
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1. Análise do Rendimento da Extração, Teores de Fenóis Totais e Flavonóides
em Extratos Etanólicos e Oleosos de Própolis
As Figuras 11, 12, 13 e 14 apresentam as curvas de calibração obtidas para o cálculo
dos teores de fenóis totais e flavonóides para os extratos etanólicos e oleosos de própolis.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Absorbância
Concentração de ácido gálico (ug/mL)
Figura 11. Curva de calibração para determinação de fenóis totais em extratos etanólicos
(λ = 700 nm).
Dados obtidos: y = (- 0,003 ± 0,008) + (0,0040 ± 0,0001) x , R = 0,9986.
xlviii
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Absorbância
Concentração de quercetina (ug/mL)
Figura 12. Curva de calibração para determinação de flavonóides em extratos etanólicos
(λ = 425 nm).
Dados obtidos: y = (- 0,001 ± 0,005) + (0,0051 ± 0,0001) x, R = 0,9990.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Absorbância
Concentração de ácido gálico (ug/mL)
Figura 13. Curva de calibração para determinação de fenóis totais em extratos oleosos
(λ = 700 nm).
Dados obtidos: y = (0,012 ± 0,008) + (0,0024 ± 0,0001) x, R = 0,9952.
xlix
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Absorbância
Concentração de quercetina (ug/mL)
Figura 14. Curva de calibração para determinação de flavonóides em extratos oleosos,
(λ = 425 nm).
Dados obtidos: y = (- 0,008 ± 0,004) + (0,0052 ± 0,0001) x, R = 0,9994.
Os comprimentos de onda utilizados para a quantificação de fenóis totais e flavonóides
foram 700 nm e 425 nm, respectivamente. A escolha de ambos os comprimentos de onda foi
baseada no estudo de artigos científicos que realizaram essas quantificações em extratos de
própolis
53,54
.
Na própolis, geralmente são encontrados diversas classes de flavonóides, como
flavonas, flavonóis, flavanonas, entre outras. A quercetina 22 e a galangina 3, as quais
pertencem ao grupo dos flavonóis, absorvem fortemente no comprimento de onda de 425 nm
em soluções metanólicas de cloreto de alumínio. Já, os complexos derivados de flavonas,
como a crisina 2, não absorvem nesse comprimento de onda, de 425 nm, mas sim em
comprimentos inferiores, causando uma subestimativa nas determinações ricas em flavonas.
Por isso, o valor medido encontra-se aquém do real, sendo tanto mais próximo do real quanto
maior a concentração de flavonóis na amostra. Esse comprimento de onda é selecionado
devido à quercetina (flavonol) ser o mais comum dos flavonóides encontrados em fontes
vegetais. Em 425 nm outras substâncias fenólicas, como ácidos fenólicos, não absorvem em
presença de cloreto de alumínio, não havendo interferências para a quantificação de
flavonóides
64
.
l
Como observado nas Figuras 11, 12, 13 e 14 foram obtidos bons coeficientes de
correlação para a correlação linear. Com isso, as curvas de calibração permitem avaliar com
segurança os teores de fenóis totais e flavonóides presentes nas amostras. Todas as
absorbâncias utilizadas para os cálculos situaram-se entre 0,0039 a 0,6514.
A Tabela 2 mostra os resultados obtidos e o limite de confiança respectivamente para
95 % de probabilidade. O t de student utilizado foi o tabelado para 2 graus de liberdade uma
vez que as medidas foram realizadas em triplicatas.
Tabela 2. Rendimentos médios e teores de fenóis e flavonóides dos extratos etanólicos e
oleosos.
Extrato Tempo
de
agitação
(dias)
Rendimento
da extração
(%)
m/m
Teor de
fenóis
totais no
extrato
seco (%)
m/m
Teor de
fenóis
totais
extraído da
própolis
bruta (%)
m/m
Teor de
flavonóides
no extrato
seco (%)
m/m
Teor de
flavonóides
extraído da
própolis
bruta
(%)
m/m
EEP30 10 16, 35±0,67 15,95±0,84 2,61±0,15 2,77±0,10 0,46±0,02
EEP50 10 30,38±0,32 12,01±0,50 3,65±0,15 3,91±0,10 1,19±0,02
EEP70 10 54,10±4,74 10,96±0,05 5,93±0,02 5,05±0,10 2,74±0,05
EEP80 10 48,81±5,56 10,68±0,55 5,21±0,27 4,59±0,15 2,24±0,05
EEP95 10 45,04±1,64 8,55±0,35 3,86±0,15 4,21±0,15 1,90±0,05
EEP100 10 37,67±7,52 8,77±0,10 3,30±0,02 4,80±0,02 1,81±0,02
EOP10 10 4,90±1,27 4,68±0,82 0,23±0,05 2,25±0,32 0,12±0,02
EOP30 30 9,96±1,51 5,94±0,25 0,59±0,02 3,90±0,62 0,39±0,05
EOP90 90 14,35±2,95 8,25±0,57 1,19±0,10 4,22±0,02 0,61±0,02
* Para todos os limites de confiança mencionados na tabela, n = 3.
li
Ao analisar os rendimentos de extração obtidos a partir das extrações etanólicas na
Tabela 2 (podendo ser melhor visualizado na Figura 15) verificou-se que os rendimentos
maiores foram obtidos quando utilizado como solvente extrator o etanol 70 % v/v seguido do
etanol 80 % v/v. Com menores proporções de etanol em água (30 % v/v e 50 % v/v de etanol)
se obtiveram os menores rendimentos de extração para solventes etanólicos.
Figura 15. Rendimentos dos extratos etanólicos obtidos com diferentes proporções de etanol
em água (extração por 10 dias).
Cunha e colaboradores realizaram estudos do rendimento de extração utilizando
diversas concentrações de etanol em água como solvente extrator. A própolis utilizada foi
originária dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Concluíram que o rendimento de
extração aumenta na proporção em que aumenta a quantidade de etanol no solvente,
estabilizando em 70 % v/v de etanol
53
. Resultado expressivo quando comparado com os
resultados obtidos, nesse estudo, o qual apresenta maiores rendimentos de extração com
maiores quantidades de etanol em relação à água, porém tendo seu ápice no etanol 70 %.
Em relação aos extratos oleosos, observa-se na Tabela 2 e na Figura 16, que quanto
maior o tempo de extração melhor é o seu rendimento. Portanto o extrato obtido após 90 dias
lii
de extração é o que apresentou melhor rendimento para as extrações oleosas. Porém, o ganho
no rendimento foi inexpressivo em relação ao tempo longo de extração por 90 dias.
Figura 16. Rendimentos dos extratos oleosos utilizando diferentes tempos de extração.
Quando comparados os rendimentos dos extratos etanólicos e oleosos, verificou-se
que qualquer concentração de etanol em água apresenta melhor eficiência na extração que o
óleo de canola. As extrações com etanol 30 % v/v e com óleo de canola por 90 dias
apresentaram rendimentos semelhantes.
Os teores das substâncias ativas da própolis, fenóis totais e flavonóides foram
expressos de duas maneiras diferentes; em relação ao teor ou porcentagem dos mesmos nos
extratos secos etanólicos ou oleosos para conhecer quais extratos são mais ricos nessas
substâncias e em relação aos teores extraídos da própolis in natura para se avaliar qual
composição do solvente foi mais efetiva na extração das substâncias ativas.
Na Tabela 2 e Figura 17, nota-se que o teor de fenóis totais em relação aos extratos
secos etanólicos é maior para EEP30, ocorrendo uma diminuição quando se aumenta a
proporção de etanol no solvente extrator. Quando o teor de fenóis é relacionado à própolis
bruta, como verificado na Tabela 2 e Figura 18, os EEP70 e EEP80, apresentaram
porcentagens maiores de extração de fenóis, pois com esses solventes o rendimento de
extração da própolis também foi maior.
liii
Figura 17. Porcentagem de fenóis totais nos extratos etanólicos secos.
Figura 18. Porcentagem de fenóis totais extraídos da própolis bruta pelos solventes
etanólicos.
liv
A partir da análise dos teores de fenóis nos extratos oleosos, apresentados na Tabela 2
e Figuras 19 e 20, verificou-se que EOP90 é o que apresentou maior teor de fenóis totais em
relação ao extrato seco; o teor aumenta quanto maior o tempo de extração. Quando analisado
o teor de fenóis totais em relação à própolis bruta das amostras oleosas, o EOP90 também
apresentou melhor porcentagem, pois apresenta um melhor rendimento de extração quando
comparado com os outros.
Figura 19. Porcentagem de fenóis totais nos extratos oleosos secos obtidos com tempos de
extração diferentes.
lv
Figura 20. Porcentagem de fenóis totais extraídos da própolis bruta pelo solvente oleoso em
tempos de extração diferentes.
Comparando os extratos etanólicos e oleosos, verificou-se que todos os etanólicos
apresentaram teores de fenóis maiores, porém o EEP95 e o EEP100 apresentam uma
similaridade nos teores em relação ao EOP90. No entanto deve-se destacar que todos os
extratos etanólicos foram obtidos por maceração durante apenas 10 dias e com agitação
ocasional.
Cunha e colaboradores calcularam os teores de fenóis totais em relação ao extrato seco
de amostras de própolis de São Paulo e Minas Gerais, utilizando diferentes concentrações de
etanol em água como solvente extrator, e encontraram variações dos teores entre 6,41 e 15, 24
% m/m. No nosso trabalho o conteúdo de fenóis totais obtido nos extratos secos etanólicos
variou entre 8,55 e 15,95 % (m/m)
53
.
Wosky e Salatino também realizaram estudos quanto ao teor de fenóis totais em
extratos metanólicos de própolis brasileira de São Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul,
e relataram que o teor dessas substâncias encontrava-se entre 8,78 e 13,72 % m/m, resultados
similares ao desse estudo
54
.
Em relação ao teor de flavonóides nos extratos secos etanólicos, pôde-se verificar na
Tabela 2 e Figura 21 que os extratos obtidos com etanol 70 % v/v a etanol absoluto são os que
lvi
apresentaram melhor porcentagem. Diferentemente dos teores de fenóis totais, o teor de
flavonóides em relação ao extrato seco aumenta ao passar de etanol 30 % v/v a 70 % v/v,
tendo-se um valor máximo para a extração com etanol 70 % v/v. Na medida em que a
proporção de etanol no solvente extrator aumenta além de 70 % ocorre uma diminuição dos
teores de flavonóides nos extratos voltando a aumentar quando a extração realiza-se com
etanol absoluto.
Figura 21. Porcentagem de flavonóides nos extratos etanólicos secos.
Quando analisado o teor de flavonóides em relação à própolis bruta nos extratos
etanólicos (Tabela 2 e Figura 22) observou-se um padrão similar aos teores de fenóis totais,
ou seja, os EEP70 e EEP80 são os que mostram maior porcentagem de extração de
flavonóides a partir da própolis bruta.
lvii
Figura 22. Porcentagem de flavonóides extraídos da própolis bruta pelos solventes
etanólicos.
Para as amostras oleosas registradas na Tabela 2 e Figuras 23 e 24, o EOP90
apresentou melhor teor de flavonóides em relação ao extrato seco e à própolis in natura
porém, não se diferencia muito do EOP30.
Figura 23. Porcentagem de flavonóides nos extratos oleosos secos obtidos com tempos de
extração diferentes.
lviii
Figura 24. Porcentagem de flavonóides extraídos da própolis bruta pelo solvente oleoso em
tempos de extração diferentes.
Wosky e Salatino verificaram o teor de flavonóides em extratos metanólicos de
própolis provenientes dos estados de São Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Os
valores encontrados por esses pesquisadores situam-se na faixa de 0,77 a 2,69 % m/m, em
relação à própolis bruta
54
. Esses valores estão próximos aos encontrados neste trabalho, para
os extratos etanólicos de própolis, que está entre 0,46 a 2,74 % m/m.
Pesquisas de quantificação de flavonóides também foram realizados por Funari e
Ferro. Estes pesquisadores utilizaram à própolis proveniente do estado de São Paulo, e como
solvente extrator utilizaram o metanol. O valor encontrado por eles foi de 2,64 %
50
, o qual
também está próximo ao encontrado neste trabalho para os EEP70 e EEP80.
lix
5.2. Testes Biológicos in vitro
Para a realização dos testes biológicos utilizaram-se os extratos de própolis EEP30,
EEP70, EEP95 e EOP90. Escolheram-se esses extratos considerando-se alguns parâmetros. O
EEP30 apresentou um menor rendimento de extração, porém um maior teor de fenóis em
relação ao extrato seco. Já EEP70 apresentou o maior rendimento de extração e a maior
eficiência na extração de fenóis e flavonóides a partir da própolis bruta. Também esta é a
porcentagem de etanol geralmente utilizada para o preparo de produtos com fins
farmacológicos. O EEP95 é comumente relatado nos artigos científicos estudados. O EOP90 é
o extrato de interesse, pois se almeja a preparação de produtos contendo extrato oleoso de
própolis, o qual futuramente com algumas modificações, poderá se tornar um produto
comercializável e de grande valia para a saúde humana. Escolheu-se o extrato oleoso obtido a
partir de 90 dias de extração por apresentar melhor rendimento e maiores teores de fenóis
totais e flavonóides em relação ao extrato seco e a própolis bruta considerando apenas os
extratos oleosos.
5.2.1. Atividade Antimicrobiana de Extratos Etanólicos e Oleoso de Própolis
A atividade antimicrobiana da própolis é muito importante para a vida na colméia e
independente da origem, todos os tipos de própolis apresentam essa propriedade
6
. Tem sido
reportado que a atividade antibacteriana da própolis deve-se a efeitos sinergísticos entre
flavonóides, ácidos fenólicos e seus derivados que estão presentes majoritariamente na
própolis
2,6,63
.
A Tabela 3 apresenta os resultados dos testes antimicrobianos considerando apenas o
raio dos halos de inibição com seus desvios-padrão, respectivamente.
lx
Tabela 3. Atividade antibacteriana de extratos etanólicos e oleoso de própolis expressa pelo
halo de inibição (mm) (n=3).
Extrato Escherichi
a coli
Staphylococcu
s aureus
Pseudomona
s aeruginosa
Listéria
monocytogene
s
Salmonella
typhimuriu
m
EEP30* NO 11,40±0,95 NO 5,28±0,44 NO
EEP70* 8,82±0,53 8,66±0,45 2,02±0,24 10,88±0,50 NO
EEP95* 4,86±0,42 4,79±0,53 NO 6,83±0,28 NO
EOP90* NO 8,05±0,57 NO 10,63±1,00 NO
Gentamicina
(controle
positivo)**
18,03 18,5 19,15 22,90 12,80
NO = não observado
* Extratos testados com uma concentração de 10 % m/v
** Concentração da Gentamicina de 50 μg/mL
Nenhuma solução etanólica utilizada como controle negativo apresentou atividade
contra as bactérias testadas.
De acordo com a Tabela 3, verifica-se que o extrato EEP70 apresentou atividade
contra todas as bactérias testadas, com exceção de Salmonella typhimurium. Este extrato foi o
único a apresentar atividade, embora fraca, contra Pseudomonas aeruginosa. Isso pode estar
relacionado ao maior teor de flavonóides contido no extrato EEP70.
Para a Escherichia coli, os únicos extratos que apresentaram atividade inibitória foram
os extratos etanólicos EEP70 e EEP95, porém o EEP70 apresentou maior inibição do
crescimento da bactéria.
Lê-se na Tabela 3 e Figura 25 que para a bactéria Staphylococcus aureus o EEP30 é o
que apresentou uma melhor atividade. Isso pode ser explicado devido a esse extrato
apresentar uma maior quantidade de fenóis totais. Pode-se considerar também que a presença
de compostos mais polares da própolis, pode resultar em uma melhor atividade contra a
bactéria Staphylococcus
6
.
No entanto, deve-se considerar que os resultados de algumas pesquisas indicam que o
halo de inibição observado no Teste de Difusão em Ágar pode ser resultado da difusão maior
ou menor dos compostos no Ágar. De acordo com Sawaya e colaboradores, esses testes
lxi
podem ser influenciados por componentes hidrossolúveis presente no extrato de própolis
testado0. Os extratos que contém maiores quantidades de compostos hidrossolúveis, como os
extratos 30 % e 50 % de etanol em água, podem apresentar melhor difusão no ágar e
consequentemente resultar em um maior halo de inibição
22
.
Figura 25. Halo de inibição referente à bactéria Staphylococcus aureus.
Park e colaboradores realizaram estudo da atividade antimicrobiana para a bactéria
Staphylococcus aureus. Utilizaram própolis proveniente do estado de Minas Gerais. Para essa
pesquisa eles variaram a concentração de etanol em água de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %,
60 %, 70 %, 80 %, 90 % e 95 %. Constataram que para a inibição da bactéria Staphylococcus
aureus os extratos que apresentaram melhor eficiência foram os de concentrações 60 %, 70 %
e 80 % de etanol em água. O extrato de própolis 30 % também apresentou atividade, porém
inferior. Esses resultados são diferentes dos obtidos neste trabalho. Porém é interessante
ressaltar que o método empregado por esses pesquisadores foi de difusão em ágar utilizando
disco, e principalmente, que a origem vegetal das amostras de própolis são diferentes
13
.
De acordo com Tosi e colaboradores o extrato oleoso obtido de própolis italiana, que
possui composição química diferenciada da própolis brasileira, apresentou atividade de
inibição moderada contra a bactéria Escherichia coli e boa atividade de inibição contra a
bactéria Staphylococcus aureus. Contudo, o método utilizado para a verificação de tal
lxii
atividade foi o de difusão em ágar com disco, diferentemente do utilizado nessa pesquisa de
difusão em ágar realizada por poços
17
Para a Listéria monocytogenes todos os extratos apresentaram atividade. Novamente,
dentre os extratos etanólicos, EEP70 é o que possui maior poder de inibição, porém o extrato
oleoso EOP90 apresentou-se igualmente efetivo, como verificado na Figura 26.
Figura 26. Halo de inibição referente à bactéria Listéria monocytogenes.
Os resultados dos testes antimicrobianos mostram que todos os extratos etanólicos e
oleoso testados apresentaram atividade contra as bactérias Gram-positivas Staphylococcus
aureus (Figura 27) e Listeria monocitogenes. Já para as Gram-negativas, utilizando o método
de difusão em ágar, apenas EEP95 e EEP70 inibiram a bactéria Escherichia coli (Figura 28) e
apenas o EEP70 apresentou alguma atividade contra a bactéria Pseudomonas aeruginosa.
Para a Salmonella typhimurium, bactéria Gram-negativa, nenhum extrato apresentou alguma
inibição pelo método utilizado.
Esses resultados reforçam dados encontrados na literatura onde as amostras de
própolis, na forma de extratos etanólicos, possuem maior atividade inibitória para as bactérias
Gram-positivas, porém, alguns extratos podem apresentar inibição moderada contra as
bactérias Gram-negativas
4,23
.
lxiii
Legenda:
A: Controle positivo, halo de inibição do antibiótico Gentamicina.
B: 1 = Extrato etanólico de própolis 95 % (apresentou atividade)
2 = Extrato etanólico de própolis 70 % (apresentou atividade)
C: Extrato oleoso de própolis (apresentou atividade)
D: Extrato etanólico de própolis 30 % (apresentou atividade)
* Controle negativo de etanol em água (nenhum controle negativo apresentou
atividade)
Figura 27. Teste de difusão em ágar com poços para a bactéria Staphylococcus aureus,
Gram-positiva.
lxiv
Legenda:
A: Controle positivo, halo de inibição do antibiótico Gentamicina.
B: 1 = Extrato etanólico de própolis 95 % (apresentou atividade)
2 = Extrato etanólico de própolis 70 % (apresentou atividade)
C: Extrato oleoso de própolis (não apresentou atividade)
D: Extrato etanólico de própolis 30 % (não apresentou atividade)
* Controle negativo de etanol em água (nenhum controle negativo apresentou
atividade)
Figura 28. Teste de difusão em ágar com poços para a bactéria Escherichia coli,
lxv
Gram-negativa.
5.2.2. Atividade Citotóxica de Extratos Etanólicos e Oleoso de Própolis
Na Tabela 4 são apresentados os resultados obtidos quanto à atividade citotóxica in
vitro dos extratos de própolis etanólicos EEP30, EEP70, EEP95 e o oleoso EOP90, frente às
linhagens tumorais humanas de leucemia (HL-60), carcinoma de mama (MDA/MB-435),
carcinoma de cólon (HCT-116) e glioblastoma (SF-295).
Segundo critérios estabelecidos pelo “National Cancer Institute (NCI, USA)”, o valor
limite de CI
50
para extratos com atividade citotóxica promissora é de 30 µg/mL
80
.
Tabela 4. Atividade citotóxica in vitro dos extratos de própolis frente às linhagens tumorais
humanas de leucemia (HL-60), carcinoma de mama (MDA/MB-435), carcinoma de
cólon (HCT-116) e glioblastoma (SF-295) (μg/mL).
Extrato Leucemia Carcinoma de
cólon
Carcinoma de
mama
Glioblastoma
EEP30 > 50 > 50 26,0 ± 6,2 > 50
EEP70 4,8 ± 1,1 0,9 ± 0,5 27,2 ± 5,6 > 50
EEP95 > 50 > 50 35,3 ± 9,1 > 50
EOP90 15,7 ± 4,7 0,8 ± 0,1 22,6 ± 5,1 3,1 ± 1,3
* Valores originados de experimentos independentes (n=2) e apresentados como CI
50
obtidos
por regressão não-linear ± desvio padrão.
Tendo em conta que os extratos que utilizaram menor concentração ao inibir mais de
50 % das células são os que possuem maior efeito antiproliferativo verificou-se que, dentre os
extratos testados, o EOP90 mostrou potencial citotóxico contra todas as linhagens celulares
testadas (Tabela 4). Também este extrato foi o único que apresentou atividade contra SF-295
mostrando uma CI
50
de 3,1 µg/mL.
Referente ao teste para células tumorais de leucemia (HL-60) os extratos que
apresentaram atividade foram o EEP70 e o EOP90, mas o que apresentou melhor efeito de
inibição foi o EEP70.
Assim como o extrato EEP70, o EOP90 revelou maior especificidade e efeito
antiproliferativo contra células tumorais de cólon (HCT-116).
Todos os extratos de própolis testados, etanólicos e oleoso mostraram potencial
citotóxico contra carcinoma de mama (MDA/MB-435). Nota-se através da Figura 29 que o
extrato oleoso apresentou melhor atividade.
lxvi
Figura 29. Comparação da concentração dos extratos de própolis para inibição de 50 % das
células tumorais de carcinoma de mama.
De acordo com os resultados da atividade citotóxica, percebe-se que o extrato oleoso
possui compostos químicos muito importantes, os quais são responsáveis pelas atividades
antitumorais observadas. Faz-se necessário um estudo químico e biológico mais aprofundado
desse extrato.
lxvii
5.3. Análise das Componentes Principais
Para melhor comparar os extratos etanólicos e oleosos de própolis quanto às variáveis
consideradas e correlacionar esses dados com o tipo de solvente e tempo de extração
empregado foi feita a análise das componentes principais (ACP).
A análise das componentes principais é uma técnica de projeções de multivariáveis
que possuem os objetos ou casos e as variáveis. Os objetos ou casos são as entidades que
foram medidas que, nessa pesquisa, foram os extratos de própolis obtidos com solventes de
composições diferentes. As variáveis são as características medidas ou atribuídas a um
determinado objeto.
A análise das componentes principais busca a associação entre os objetos ou caos, e
entre estes, e as variáveis através de agrupamentos
5.3.1. Primeira Análise das Componentes Principais
Para a primeira análise das componentes principais, utilizaram-se como objetos ou
casos as amostras de extratos etanólicos, EEP30, EEP50, EEP70, EEP80, EEP95, EEP100 e
de extratos oleosos, EOP10, EOP30 e EOP90. As variáveis consideradas foram: Solvente de
extração, tempo de extração, rendimento de extração, teor de fenóis em extrato de própolis,
teor de flavonóides em extrato de própolis, teor de fenóis em relação à própolis in natura, teor
de flavonóides em relação à própolis in natura. A Figura 30 mostra a relação dos extratos de
própolis com as variáveis consideradas.
lxviii
Legenda:
-Grupo situado em torno do eixo positivo do Fator 1: EOP10, EOP30 e EOP90.
-Grupo situado no quadrante negativo de x e positivo de y: EEP30 e EEP50.
-Grupo situado no quadrante negativo de x e y: EEP70, EEP80, EEP95 e EEP100.
Figura 30. Análise de componentes principais para fenóis totais e flavonóides em extratos
de própolis obtidos com solventes de composições diversas.
lxix
Entre os casos avaliados pela ACP, observou-se a formação de 3 grupos diferentes
considerando as variáveis estudadas.
O grupo encontrado em torno do eixo positivo do Fator 1 reúne os extratos oleosos. As
três amostras oleosas foram deixadas extraindo por um período de extração diferente (10, 30 e
90 dias) e verificou-se que quanto maior o tempo de extração, maiores são os rendimentos de
extração e os teores de fenóis totais e flavonóides em relação ao extrato seco e à própolis
bruta para os extratos oleosos. No entanto os extratos EOP30 e EOP90 mostraram-se
próximos na Figura 30 e são semelhantes em relação a algumas variáveis não sendo
necessária a extração por 90 dias. Porém, os extratos oleosos se diferenciam dos extratos
etanólicos por apresentarem os menores rendimentos de extração e menores teores de fenóis
totais e flavonóides.
No quadrante negativo de x e positivo de y encontram-se os extratos EEP30 e EEP50 e
as variáveis consideradas são o rendimento de extração e o teor de fenóis totais em relação ao
extrato seco. Os dois parâmetros possuem relações com os dois extratos, pois as duas
amostras possuem menores rendimentos de extrações, porém apresentam maiores teores de
fenólicos totais em relação ao extrato seco quando comparados com as demais amostras.
Também pode-se considerar que o extrato EEP30, que se encontra mais distante da origem
dos eixos, é um ponto extremo, ou seja, um extrato que apresenta propriedades diferentes dos
restantes extratos analisados.
Por último, o grupo dos extratos EEP70, EEP80, EEP95 e EEP100, situado no
quadrante negativo de x e y. Este grupo relaciona-se com quatro variáveis: o teor de fenóis
totais em relação à própolis bruta, o solvente utilizado, o teor de flavonóides em relação à
própolis bruta e o teor de flavonóides em relação ao extrato seco. Em relação ao solvente
utilizado, nota-se que são as amostras obtidas com maior concentração de etanol. Analisando
os teores de flavonóides em relação ao extrato seco e à própolis bruta os quatro extratos são os
que possuem as maiores porcentagens. Devido a essas relações existentes entre essas quatro
amostras, pode-se levar em consideração também o teor de fenóis totais em relação à própolis
bruta que diminui ao passar do extrato 70 % v/v a etanol absoluto.
lxx
5.3.2. Segunda Análise das Componentes Principais.
Na segunda análise das componentes principais (Figura 31) consideraram-se, além das
variáveis consideradas na primeira análise de PCA, as atividades antibacterianas e citotóxicas
apresentadas pelos extratos testados, EEP30, EEP70, EEP95 e EOP90.
Assim podemos observar a relação desses objetos ou casos com as variáveis: Tempo
de extração, teor de fenóis totais em relação ao extrato seco, teor de fenóis totais em relação à
própolis bruta, teor de flavonóides em relação ao extrato seco, teor de flavonóides em relação
à própolis bruta, solvente, bem como a atividade antibacteriana contra: Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosas e Listéria monocytogenes e atividade
antitumoral contra células tumorais humanas: leucemia, carcinoma de mama, carcinoma de
cólon e glioblastoma.
lxxi
Legenda:
- Caso situado no eixo negativo do Fator 1: EEP30.
- Caso situado no quadrante negativo de x e positivo de y: EEP70.
- Caso situado no quadrante positivo de x e y: EOP90
- Caso situado em cima do eixo negativo do Fator 1: EEP95
Figura 31. Análise de componentes principais da relação dos teores de fenóis totais e
flavonóides com os testes biológicos para os extratos EEP30, EEP70, EEP95 e
EOP90.
lxxii
Através da Figura 31 verifica-se que, com exceção do extrato EEP95 situado no eixo
negativo do Fator 1, cada extrato apresentou-se em quadrantes diferentes, não se observando a
formação de grupos entre esses casos. Porém os extratos EEP70 e EEP95 demonstram alguma
proximidade, uma vez que, esses extratos apresentam os maiores rendimentos de extração e os
maiores teores de fenólicos e flavonóides extraídos da própolis bruta, quando comparados
com o extrato EEP30 e o extrato oleoso EOP90 analisados pela PCA. Em relação a sua
atividade antibacteriana foram os únicos extratos a apresentar atividade contra Escherichi coli
e somente EEP70 mostrou inibição contra a bactéria Gram negativa Pseudomonas
aeruginosa.
O extrato EEP30, situado bem distante da origem do sistema de coordenadas, no
quadrante positivo de x e negativo de y, se diferencia de todos os extratos por apresentar os
menores rendimentos de extração, porém o maior teor de fenólicos totais no extrato e ainda
apresentar melhor atividade contra a bactéria Staphylococcus aureus. Também EEP30
somente apresentou atividade citotóxica contra células de carcinoma de mama.
O caso situado no quadrante positivo de x e y é o extrato oleoso 90 dias. Este caso está
relacionado com as variáveis: tempo de extração, bactérias Listéria monocytogenes e
Staphylococcus aureus e células tumorais carcinoma de cólon, leucemia e glioblastoma.
EOP90 foi obtido após extração por 90 dias, enquanto que, os demais extratos após 10 dias de
extração. O extrato oleoso mostrou inibição apenas contra as bactérias Gram positivas
Listéria monocytogenes e Staphylococcus aureus. Ainda mostrou excelente desempenho nos
testes de atividade citotóxica contra todas as células testadas, principalmente contra células
tumorais de carcinoma de cólon e gliobastoma seguido por células de leucemia. Apenas os
extratos EOP90 e EEP70 (ambos no eixo positivo do Fator 2) apresentaram atividade contra
células tumorais leucêmicas.
lxxiii
6. CONCLUSÕES
A partir da análise dos rendimentos de extração, teores de fenóis totais e flavonóides
em relação à massa do extrato seco e da própolis bruta e atividades antimicrobiana e
citotóxica, conclui-se que:
- obtêm-se extratos de própolis com maior rendimento quando se emprega etanol 70 % como
solvente extrator;
- o solvente mais eficiente para a extração da própolis, considerando maiores rendimentos de
extração dos compostos da resina como um todo e das substâncias fenólicas principalmente os
flavonóides foi o etanol 70 %.
- em relação ao teor de fenóis totais nos extratos de própolis, o extrato mais rico em
compostos fenólicos é o obtido com etanol 30 %. Considerando apenas a classe de compostos
fenólicos classificada como flavonóides, o extrato mais rico nesses compostos é o obtido com
etanol 70 %;
- nos testes antimicrobianos todos os extratos testados, tanto etanólicos como os oleosos,
apresentaram atividade inibitória contra as bactérias Gram-positivas testadas. O extrato obtido
com etanol 70 % apresentou atividade contra todas as bactérias testadas, com exceção de
Salmonella typhimurium. Somente para Staphylococcus aureus o extrato obtido com etanol 30
% apresentou halo de inibição maior que o extrato 70 %. Este estudo mostra que apesar de ser
relatado freqüentemente o efeito antibacteriano da própolis, é necessária a escolha certa do
solvente extrator quando se deseja potencializar seu efeito antimicrobiano;
- o óleo de canola empregado na extração da própolis possui baixo poder de extração dos
compostos da própolis, sendo necessário um tempo muito longo de agitação;
- porém, os resultados obtidos tanto nos testes antimicrobianos como de citotoxicidade
mostraram que o extrato oleoso possui substâncias bioativas da própolis e apresentou
resultados comparáveis ou melhores, contra algumas linhagens de células tumorais, que os
extratos etanólicos. A extração da própolis com óleo comestível é promissora sendo
necessários, portanto, estudos que objetivem o aprimoramento do solvente extrator e/ou
processo de extração com óleo para haver melhores rendimentos e conseqüentemente
melhores teores de fenóis totais e flavonóides em relação à própolis bruta.
Em relação à análise estatística, utilizando o método das componentes principais,
verificaram-se agrupamentos e correlações coerentes entre os casos e entre esses e as
variáveis consideradas.
lxxiv
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