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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL
DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DISSERTAÇÃO
Estudo sobre a contaminação com espécies
toxígenas, potencialmente produtoras de
micotoxinas, em rações destinadas
à alimentação de eqüinos.
Kelly Moura Keller
2009
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2
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DDO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ESTUDO SOBRE A CONTAMINAÇÃO COM ESPÉCIES TOXÍGENAS,
POTENCIALMENTE PRODUTORAS DE MICOTOXINAS,
EM RAÇÕES DESTINADAS À ALIMENTAÇÃO DE EQÜINOS.
KELLY MOURA KELLER
Sob a Orientação do Professor
Carlos Alberto da Rocha Rosa
E Co-Orientação da Professora
Lilia Renée Cavaglieri
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências, no Curso de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias,
Área de Concentração em Sanidade
Animal
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2009
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636.1
K29e
T
Keller, Kelly Moura, 1981-
Estudo sobre a contaminação com
espécies toxígenas, potencialmente
produtoras de micotoxinas, em rações
destinadas à alimentação de eqüinos
/ Kelly Moura Keller – 2009.
64f. : il.
Orientador: Carlos Alberto da
Rocha Rosa.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Curso de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias.
Bibliografia: f. 45-54
1. Cavalo – Alimentação e rações
- Teses. 2. Fungos – Teses. 3.
Micotoxinas – Teses. I. Rosa,
Carlos Alberto da Rocha, 1953-. II.
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro. Curso de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias. III.
Título.
4
Dedico este trabalho à
Dedico este trabalho à Dedico este trabalho à
Dedico este trabalho à
minha família e amigos, em
minha família e amigos, em minha família e amigos, em
minha família e amigos, em
especial minha mãe, por seu
especial minha mãe, por seu especial minha mãe, por seu
especial minha mãe, por seu
amor
amoramor
amor e dedicação a todo
e dedicação a todo e dedicação a todo
e dedicação a todo
instante...
instante...instante...
instante...
6
AGRADECIMENTOS
Ao nobre amigo, o cavalo, motivo pelo qual eu ingressei na carreira de veterinária e
que também foi a motivação para esta pesquisa. Parte fundamental da minha vida até hoje.
À toda minha família, por sempre ter me apoiado e incentivado e pela compreensão
dos momentos de ausência e mal-humor, em especial à minha mãe Cleide e irmão Luiz.
Ao Professor Carlos Alberto da Rocha Rosa pela orientação e pela amizade que
cultivamos há vários anos, por sempre ter aberto novas portas para o meu crescimento.
Às Professoras Lilia Renée Cavaglieri e Ana Maria Dalcero por todos os ensinamentos
transmitidos, na prática laboratorial. Por terem me acolhido tão carinhosamente em suas casas
e terem me dado o apoio necessário à conclusão deste trabalho.
À Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e os vários amigos que fiz nesta
instituição desde os tempos da graduação, e que sempre me apoiaram nessa caminhada:
Beatriz Dias Queiroz, Carla Alves Soleiro, Thais Ferreira Fagundes, Juliana Gliosci
Delliveneri, entre outros.
À Universidad Nacional de Río Cuarto – Argentina onde também pude fazer muitos
amigos, os quais agradeço no nome da Profa. Carina Magnoli, que juntamente com minhas
co-orientadoras, me passou valiosos ensinamentos, especialmente em taxonomia de
Penicillium.
Ao CNPq, órgão financiador desses anos de pesquisa.
Aos funcionários do Projeto Sanidade Animal: Luiz Jorge, Joel, Valéria, Sr. Adevaldo
e Valcir pela amizade e suporte técnico às nossas atividades.
À todos os meus amigos do Núcleo de Pesquisas Micológicas e Micotoxicológicas da
UFRRJ, tanto os atuais quanto as pessoas com quem convivi em anos anteriores. Cada um
com sua particularidade, contribuindo para o nosso crescimento e aprendizado de vida. Esta
família que começou pequenininha com apenas três estagiários e que hoje conta com mais de
quinze. Convivendo com alegria, companheirismo e muito trabalho em grupo: Luiz Antonio
Moura Keller, Águida Aparecida de Oliveira, Tatiana Xavier de Almeida, Ana Cláudia
Marassi, Michele Valadares Deveza, Beatriz de Sousa Monteiro, Lucila Maria Teixeira
Nunes, César Daniel Krüger, Marco Antonio Andrade Rodrigues, além de todas as “minhas”
estagiárias mais recentes.
À todos vocês, e àqueles que eu possa ter deixado de mencionar, o meu muito
obrigada!
RESUMO
KELLER, Kelly Moura Estudo sobre a contaminação com espécies toxígenas,
potencialmente produtoras de micotoxinas, em rações destinadas à alimentação de
eqüinos. 2009. 64p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Sanidade Animal).
Instituto de Veterinária, Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2009.
A maioria dos alimentos, cereais e outros produtos agrícolas são muito sensíveis à
contaminação por fungos capazes de produzir micotoxinas. Micotoxinas são metabólitos
secundários tóxicos que podem provocar efeitos adversos, tais como carcinogênese,
teratogênese, nefrotoxicidade e imunossupressão, levando a inúmeras patologias e
conseqüentes perdas econômicas. Aspergillus, Penicillium e Fusarium são os gêneros mais
freqüentemente envolvidos em casos de micotoxicoses em animais e humanos. Em eqüinos,
as micotoxicoses estão principalmente relacionadas com alimentos baseados em milho
contaminado com fumonisinas (FBs), produzida por F. verticillioides. Estas micotoxinas são
responsáveis pela leucoencefalomalácia eqüina (LEME), uma doença neurológica aguda e
fatal caracterizada por sintomas neurotóxicos. Mais de uma micotoxina pode existir
simultaneamente em um determinado produto ou ingrediente. Geralmente, os efeitos dessas
toxinas tendem a ser aditivos e em resposta sinérgica, aumentando o risco e perigo para a
saúde animal e a produtividade. Aflatoxinas (AFs) são micotoxinas produzidas por A. flavus e
A. parasiticus. A aflatoxina B
1
(AFB
1
) é a mais freqüentemente detectada e que tem sido
descrita como a mais forte substância hepatocarcinógena biologicamente sintetizada, que pode
afetar os seres humanos e animais. A determinação da qualidade micológica e
micotoxicológica, o controle de alimentos e produtos destinados ao consumo eqüino são
fatores críticos para melhorar a produção animal e seu desempenho. Os objetivos deste estudo
foram: 1) determinar a ocorrência de Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium spp., 2)
detectar e quantificar FB
1
e AFB
1
em alimentos para eqüinos. Sessenta amostras de diferentes
rações comerciais, aveia e ração batida na fazenda foram coletadas aleatoriamente a partir de
diferentes estabelecimentos hípicos localizados no Rio de Janeiro e Seropédica, entre Junho
de 2003 a Junho de 2006. A análise da micobiota foi feita pelo método de diluição em placa
sobre os meios de cultivo dicloran rosa bengala cloranfenicol agar (DRBC), dicloran glicerol
18% agar (DG18) e Nash-Snyder agar. As contagens fúngicas totais foram expressas em
UFC/g. Foram determinadas a freqüência de isolamento (%) dos gêneros fúngicos e a
densidade relativa das espécies. A determinação das micotoxinas foi feita utilizando kits
comerciais ELISA (Beacon Analytical Systems Inc.). As contagens fúngicas totais foram
similares em ambos os meios DRBC e DG18. As maiores contagens foram observadas em
amostras de aveia e ração batida na fazenda. Aspergillus (43%), Penicillium (26%) e
Fusarium (11%) foram os gêneros mais freqüentemente isolados. Aspergillus niger (27%), A.
flavus (25%), Penicillium corylophilum (19%), P. fellutanum (14%) e Fusarium verticillioides
(100%) apresentaram as maiores densidades relativas. Setenta e cinco por cento das amostras
apresentaram contaminação com FB
1
com níveis de não detectado a 8,5 µg.g
-1
. Apenas duas
amostras foram negativas para contaminação por AFB
1
com intervalo de 0,5 a 99,4 µg.kg
-1
.
Recomenda-se que o milho contaminado ou subprodutos seja limitado a um máximo de 20%
da dieta de eqüinos. Mesmo que a quantidade de micotoxinas produzidas não seja suficiente
para causar efeitos adversos nos animais, é um sinal de que os alimentos serão menos
nutritivos. Também é necessário estabelecer limites máximos de contagens fúngicas para
espécies potenciais produtoras de AFs e FBs.
Palavras chave: fungos, micotoxinas, equinos.
8
ABSTRACT
KELLER, Kelly Moura. Study on contamination with toxigenic species, potentially
producing mycotoxins, in feeds intended for feeding horses. 2009. 64p. Dissertation
(Master’s Degree in Veterinary Sciences, Animal Health). Veterinary Institute, Veterinary
Microbiology and Immunology Department, Federal Rural University of Rio de Janeiro,
Seropédica, RJ, 2009.
Most feedstuffs, cereal crops and other agricultural commodities are very susceptible to
contamination by molds able to produce mycotoxins. Mycotoxins are toxic secondary
metabolites that can cause adverse effects such as carcinogenesis, teratogenesis,
nephrotoxicity and immunosuppression, leading to numerous pathologies and consequent
economic losses. Aspergillus, Penicillium and Fusarium are the most frequently genera
involved in animal and human cases of mycotoxicoses. In equines, mycotoxicoses are mainly
related to corn based feedstuffs consumption contaminated with fumonisins (FBs) produced
by F. verticillioides. These mycotoxins are responsible for equine leukoencephalomalacia
(ELEM), an acute and fatal neurological disease characterized by neurotoxic symptoms. More
than one mycotoxin may exist simultaneously in a particular commodity or ingredient.
Generally, the effects of these toxins tend to add up in synergic response, increasing the risk
and hazard to animal health and productivity. Aflatoxins (AFs) are mycotoxins produced by
A. flavus and A. parasiticus. Aflatoxin B
1
(AFB
1
) is the most frequently detected and it has
been described as the strongest biologically synthesized hepatocarcinogenic substance that
can affect humans and animals. Checking the mycological and mycotoxicological quality,
control of feedstuffs and commodities destined to equine consumption is critical for
improving animal production and performance. The purposes of this study were: 1) to
determine the occurrence of Aspergillus spp., Penicillium spp. and Fusarium spp., 2) to detect
and quantify FB
1
and AFB
1
in equine feedstuffs. Sixty samples from different commercial
feeds, oats and farm-made feeds were randomly collected from different studs located in Rio
de Janeiro and Seropédica, from June 2003 to June 2006. Analysis of the mycobiota was
made by the plate dilution spread method onto dichloran rose bengal chloranphenicol agar
(DRBC), dichloran glycerol 18% agar (DG18) and Nash-Snyder culture media. Total fungal
counts were expressed as CFU/g. The isolation frequency (%) of fungal genera and relative
density (%) of fungal species were determined. Mycotoxins determination was done using
commercial ELISA kits (Beacon Analytical Systems Inc.). Total fungal counts were similar
on both DRBC and DG18 media. The highest counts were from oats and farm-made feeds.
Aspergillus (43%), Penicillium (26%) and Fusarium (11%) were the most frequently isolated
genera. Aspergillus niger (27%), A. flavus (25%), Penicillium corylophilum (19%), P.
fellutanum (14%) and Fusarium verticillioides (100%) had the highest relative densities.
Seventy five percent of the samples showed FB
1
contamination with range from not detected
to 8.5 µg.g
-1
. Only two samples were negative for AFB
1
contamination with range from 0.5 to
99.4 µg.kg
-1
. It is recommended that contaminated corn or corn by-products be limited to no
more than 20% of the diet for equids. Even if the amount of mycotoxins produced is not
enough to cause adverse effects in animals, it is a sign that the feed will be less nutritious. It is
also necessary to establish maximum limits of fungal counts for potential AFs and FBs
species.
Key words:
fungi, mycotoxins, horses.
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1: Potencial toxígeno das principais espécies de Aspergillus que
contaminam produtos vegetais.
9
Tabela 2: Potencial toxígeno das principais espécies de Penicillium que
contaminam produtos vegetais.
14
Tabela 3: Potencial toxígeno das principais espécies de Fusarium que contaminam
produtos vegetais.
17
Tabela 4: Contagem total dos fungos filamentosos isolados de alimentos
fornecidos à eqüinos.
33
Tabela 5: Percentual de amostras contaminadas acima dos limites recomendados. 34
Tabela 6: Média e desvio padrão dos níveis de FB
1
quantificados através de
ELISA, nas diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
39
Tabela 7: Média e desvio padrão dos níveis de AFB
1
quantificados através de
ELISA, nas diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
40
10
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1: Diagrama parcial do estudo do complexo do agronegócio do cavalo. 3
Figura 2: Exemplo de ração comercial para eqüinos. 4
Figura 3: Características morfológicas básicas representativas do gênero
Aspergillus.
7
Figura 4: “a – e”, tipos de ramificações do conidióforo: a e b, simples; c,
biverticilado; d, triverticilado; e, quaterverticilado. “f – k”, tipos de
colônias: f, aveludada; g, algodonosa; h, funicular; i - k, fasciculada.
10
Figura 5: A-B colônia aveludada. B típico exsudato amarelo. C colônia aveludada
que está se tornando fasciculada com o tempo. D grandes e compactas
cabeças conidiais. E colônia flocosa. F esclerócios. G-I colônias
fasciculadas. J blocos de massas conidiais em colônia de 10 dias de
idade. K-L colônia sinemmata.
12
Figura 6: Chave taxonômica básica para o gênero Penicillium e seus teleomorfos. 13
Figura 7: a, Macroconídios; b, Microconídios; c, Monofiálides. 16
Figura 8: a, Disposição de clamidosporos; b, Conídios em cadeia e falsa cabeça
(círculo vermelho).
16
Figura 9: Esquema do provável modo de atuação das fumonisinas. 22
Figura 10: Esquema de diluição de amostra e contagem padrão de unidades
formadoras de colônias (UFC g
-1
).
28
Figura 11: Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero Aspergillus
nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições de temperaturas.
29
Figura 12: Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero
Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N em três
regimes de temperatura (5, 25 e 37° C).
29
Figura 13: Esquema de incubação das cepas do gênero Fusarium nos diferentes
meios de cultivo até sua identificação final.
30
Figura 14: Princípio de purificação das colunas de imunoafinidade. 32
Figura 15: Freqüência (%) de gêneros fúngicos isolados dos alimentos destinados à
eqüinos.
35
Figura 16: Densidade relativa (%) de espécies de Aspergillus em alimentos
destinados à eqüinos.
36
Figura 17: Densidade relativa (%) de espécies de Penicillium em alimentos
destinados à eqüinos.
37
Figura 18: Níveis de contaminação de FB
1
quantificados através de ELISA, nas
diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
39
Figura 19: Regressão linear do kit ELISA para quantificação de FB
1
. 40
Figura 20: Níveis de contaminação por AFB
1
quantificados através de ELISA, nas
diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
41
Figura 21: Regressão linear do kit ELISA para quantificação de AFB
1
. 41
Figura 22: Percentual de amostras dos alimentos destinados à eqüinos,
contaminadas segundo cada legislação.
42
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO DE LITERATURA
3
2.1 Complexo do agronegócio do cavalo no Brasil 3
2.2 Os Fungos 5
2.2.1 Gênero Aspergillus 7
2.2.2 Gênero Penicillium 10
2.2.3 Gênero Fusarium 15
2.4 Micotoxinas e micotoxicoses: características gerais 18
2.5 Aflatoxinas 19
2.6 Fumonisinas 20
2.6.1. Modo de atuação das fumonisinas 21
2.7- Outras micotoxinas de importância para os eqüinos 23
2.7.1 Ocratoxina A 23
2.7.2 Citrinina 23
2.7.3 Eslaframina 23
2.7.4 Toxinas tremorgênicas 24
2.7.5 Tricotecenos 24
2.7.6 Zearalenona 24
2.7.7 Rubratoxinas 25
2.8 Métodos de detecção das micotoxinas 25
2.9 Estudos preliminares 26
3. MATERIAL E MÉTODOS
27
3.1 Amostragem 27
3.2 Determinação da micoflora 27
3.3 Isolamento e identificação fúngica 28
3.4 Caracterização do perfil toxígeno das espécies isoladas 30
3.5 Detecção e quantificação de AFB
1
e FB
1
por ELISA 31
3.6 Detecção e quantificação de AFB
1
por HPLC 31
3.7 Análises estatísticas 32
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
33
4.1 Contaminação fúngica 33
4.2 Determinação da micobiota 35
4.3 Perfil toxígeno: habilidade como produtor 38
4.4 Análises micotoxicológicas 38
4.4.1 Fumonisina B
1
38
4.4.2 Aflatoxina B
1
40
5. CONCLUSÕES
44
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
45
7. ANEXO
55
A - PRANCHAS FOTOGRÁFICAS
55
12
1- INTRODUÇÃO
Os negócios que envolvem a criação e utilização do cavalo ocupam uma posição de
destaque nos países desenvolvidos e em muitos daqueles em desenvolvimento, como o Brasil;
porém, ao contrário de bovinos, aves, suínos e ovinos, os eqüinos não aparecem com destaque
nas pesquisas e censos governamentais.
O Brasil conta com o terceiro maior rebanho eqüino do mundo, com 5,9 milhões de
cabeças (IBGE, 2003), e o agronegócio do cavalo movimenta cerca de 7,3 bilhões de
reais/ano. Podemos dividir este complexo de atividades em diferentes segmentos e dentro
destes, os cavalos de trabalho, os cavalos de esporte, e o segmento consumidor de carne
ocupam destaque.
Nosso país é o 5º maior exportador mundial de carne de cavalo, movimentando cerca
de R$ 80 milhões/ano. A categoria de cavalos de esportes e de trabalho movimenta cerca de
R$ 840 milhões/ano e engloba diversas atividades.
Neste contexto, o segmento de rações e medicamentos veterinários são responsáveis
pelos elevados gastos impostos aos proprietários destes animais, por isso faz-se necessário um
rigoroso controle de qualidade das rações destinadas à alimentação de eqüinos através, por
exemplo, do reconhecimento de espécies fúngicas toxígenas, a fim de preservar a saúde
animal, minimizando os gastos com medicamentos e veterinários.
Os cereais pertencem, desde épocas remotas, à categoria dos nutrientes essenciais à
humanidade. Eles serviam como unidade de medida na antiguidade, sendo usados até mesmo
para o pagamento de impostos e tributos. Com o decorrer dos anos quase não houve
mudanças no papel nutricional destes nutrientes, que constituem a base da alimentação, não só
do homem, mas também das diferentes espécies animais: bovinos, eqüinos, caninos, felinos,
pássaros, peixes, roedores, etc. Como características nutricionais gerais destacamos a alta
concentração de amido, bons níveis de proteína, excelente digestibilidade e baixos teores de
fibras. Os principais cereais utilizados em formulações de rações para eqüinos são: milho,
aveia, trigo e soja, entre outros.
Os fungos (também denominados mofos ou bolores) são microrganismos
multicelulares e filamentosos, que ao infectarem os grãos e alimentos podem produzir
substâncias tóxicas tais como micotoxinas. O prejuízo causado pelas toxinas de fungos não
deve ser menosprezado, pois ao serem ingeridas, inaladas ou absorvidas pela pele podem
causar manifestações de sua ação que podem variar de vômitos ocasionais a convulsões e
morte repentina. No caso de grãos, estes podem ser infestados durante o cultivo ou no período
pós-collheita. Desta forma, os fungos são classificados em fungos do campo e fungos do
armazenamento.
Muitas espécies podem desenvolver-se utilizando os grãos como substrato, no entanto
Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium spp. são as mais encontradas; sob condições de
armazenagem, com temperatura e atividade de água adequadas, as espécies dos gêneros
Aspergillus e Penicillium são as que mais proliferam, enquanto que as espécies de Fusarium
são capazes de crescer e produzir suas toxinas ainda no campo.
Uma ou mais micotoxinas podem ocorrer simultaneamente em determinado substrato,
e geralmente apresentam efeitos sinérgicos, o que aumenta o risco e preocupação com relação
à saúde e produtividade animal. As fumonisinas (FBs) são uma família de toxinas produzidas
principalmente por F. verticillioides e F. proliferatum, que são contaminantes amplamente
encontrados no milho e em seus produtos derivados. Elas são as causadoras da
leucoencefalomalácia eqüina. Já as aflatoxinas (AFs) são produzidas pelos fungos A. flavus e
01
1
A. parasiticus, os quais podem crescer em grande variedade de substratos quando
inadequadamente armazenados. Estas toxinas são potentes causadoras de câncer hepático.
Há grande interesse em estudos que permitam avaliar o risco micotoxicológico das
rações para eqüinos de modo a prever a possibilidade de ocorrência de micotoxicoses
primárias que afetariam os parâmetros produtivos desses animais; e micotoxicoses
secundárias, no caso de ingestão de carnes contaminadas, o que representaria problema para
saúde pública. Devido ao potencial de contaminação destas rações por fungos e suas
micotoxinas e o fato de ainda ser muito escassa a disponibilidade deste tipo de informação
com estudos de monitoramento rotineiro, tanto no Brasil quanto no mundo, há relevância
neste trabalho.
1.1- Hipótese
Os alimentos fornecidos à eqüinos são suscetíveis a contaminação pelas principais
espécies de fungos toxígenos e suas micotoxinas.
1.2- Objetivos
a) Objetivo Geral
Estabelecer a ocorrência de espécies dos gêneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium
potencialmente produtoras de micotoxinas e determinar a presença de aflatoxina B
1
(AFB
1
) e
fumonisina B
1
(FB
1
) em amostras de rações e aveia laminada achatada, destinadas ao
consumo eqüino.
b) Objetivos Específicos
1) Realizar a enumeração quantitativa dos propágulos fúngicos das amostras coletadas.
2) Determinar a freqüência da micobiota total realizando sua identificação taxonômica
em nível de gênero.
3) Isolar e identificar espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium,
estabelecendo a densidade relativa de cada um.
4) Caracterizar o perfil toxígeno das espécies isoladas dos gêneros Aspergillus e
Penicillium através da técnica de cromatografia em camada delgada, TLC (thin layer
chromatography).
5) Detectar e quantificar AFB
1
e FB
1
presentes nas amostras utilizando a técnica de
ensaio imunoenzimático, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
6) Detectar e quantificar AFB
1
presentes nas amostras utilizando a técnica de
cromatografia de imunoafinidade, IAC (immunoaffinity chromatography)/
cromatografia líquida de alta eficiência, HPLC (high performance liquid
chromatography).
7) Avaliar os resultados obtidos e realizar análise estatística.
02
1
14
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1- Complexo do agronegócio do cavalo no Brasil
O estudo do complexo do agronegócio cavalo (CNA, 2004) é resultado de pesquisa
encomendada pela Confederação Nacional de Agricultura e que dimensiona econômica e
socialmente a eqüinocultura brasileira. Apresento aqui partes deste amplo estudo para que
possam correlacionar melhor o panorama atual com esta pesquisa.
O termo “agribusiness” foi utilizado pela primeira vez em outubro de 1955 por John
Davis referindo-se à todas atividades existentes desde a produção e distribuição dos insumos
utilizados na atividade produtiva “dentro da porteira”, a própria atividade, até a
comercialização (o que inclui armazenamento, processamento e distribuição) dos produtos e
subprodutos originários da atividade agropecuária. A tradicional classificação das atividades
em setores estanques – primário, secundário e terciário – tornou-se obsoleta. O complexo do
agronegócio do cavalo engloba diversas atividades (Figura 1), além de gerar milhares de
empregos diretos e indiretos.
Figura 1- Diagrama parcial do estudo do complexo do agronegócio do cavalo.
Fonte: ESTUDO DO COMPLEXO DO AGRONEGÓCIO CAVALO, Centro de
Estudos Avançados em Economia Aplicada (CEPEA)/ Escola Superior de Agricultura
Luiz de Queiroz (ESALQ)/ Universidade de São Paulo (USP).
03
1
O cavalo exerceu um importante papel na formação econômica, social e política do
Brasil. No aspecto econômico, desempenhou as funções de sela (para o vaqueiro e o peão, nas
lides comuns à pecuária); de carga (nos comboios); e, de tração (“motor” de veículos de carga
e de moendas). No aspecto social – englobando exibicionismo, vaidade, orgulho e
diferenciação social. A partir da segunda metade do século XIX, destacam-se no aspecto
social, as atividades de esportes e lazer, como corrida e salto.
O papel do cavalo militar vai além dos aspectos de segurança, tendo sido relevante no
desenvolvimento de outras áreas, como a educação e o esporte. Na educação, um bom
exemplo é a contribuição do Tenente-Coronel Moniz de Aragão, patrono da Veterinária do
Exército. Nos primeiros anos do século passado, ele foi o idealizador e primeiro diretor da
Escola de Veterinária, pioneiro no Brasil.
Passando por várias designações, historicamente, a equitação sempre fez parte do
treinamento militar. No esporte, até o ano passado, o Exército mantinha a Escola de Equitação
localizada na cidade do Rio de Janeiro, no mesmo aquartelamento do Regimento Escola de
Cavalaria. Atualmente estas duas unidades encontram-se fisicamente isoladas, porém muito
próximas e englobam um efetivo superior a 300 animais. No Exército, os eqüinos são
utilizados para diversas finalidades, tais como: ações de garantia da lei e da ordem nos
Regimentos de Cavalaria; participação em cerimonial militar (desfiles, guarda de honra e
escoltas de autoridades); patrulhamento em organizações militares e nos campos de instrução;
instrução militar nas escolas de formações de oficiais e praças; produção de imunobiológicos
(soro antiofídico); prática desportiva, integrando comissões de desportos nacionais; atividades
de eqüoterapia; e, programas de estudos e melhoramentos da eqüídeocultura nacional, na
Coudelaria de Rincão.
Um outro segmento, o do cavalo de trabalho caracteriza-se por animais alimentados
com volumoso de beira de estrada ou pasto, milho e farelo de trigo. Eventualmente, utilizam
ração, porém de baixo custo. Já a categoria de esportes inclui os centros de treinamento,
jockeys, propriedades particulares e hípicas; e os cavalos aí incluídos são animais que
potencialmente consomem, em média, 4,5 kg de ração por dia (Figura 2).
Figura 2- Exemplo de ração comercial para eqüinos.
Fonte: ESTUDO DO COMPLEXO DO AGRONEGÓCIO CAVALO, CEPEA/ESALQ/USP.
Atualmente, o mercado total de ração é de 320.000 toneladas anuais, mas estima-se
que o potencial do negócio no Brasil seja de 1 milhão de toneladas anuais. O setor nacional é
disputado por mais de 30 empresas produtoras de rações comerciais para eqüinos; três destas
detêm 78% do mercado brasileiro. Em pesquisa de campo (CNA, 2004) encontrou-se que o
consumo médio diário de ração é de 5,12 kg/animal, quantidade um pouco superior aos dados
obtidos na pesquisa de mercado. Isto porque uma parcela da ração fornecida aos cavalos é
04
1
16
fabricada “batida” na própria propriedade. Estima-se que o mercado de rações para eqüinos
movimente R$ 53.440.000,00 anualmente.
Um outro segmento importante trata-se do mercado consumidor de carne. Como
atrativos esta apresenta uma agradável cor vermelha e baixo teor de gordura quando
comparada com a carne bovina. No Brasil, a quase totalidade da produção de carne eqüina
destina-se ao mercado externo, sendo desprezível o valor comercializado internamente. Deve-
se destacar que a legislação brasileira não permite que um matadouro de bovinos ou outro
animal também realize abate de eqüinos. Sendo assim, apenas sete frigoríficos – distribuídos
nos Estados do Rio Grande do Sul, Paraná e Minas Gerais – respondem pela totalidade do
comércio externo de carne de cavalo.
O volume de exportações brasileiras desta carne tem crescido anualmente. Nos últimos
15 anos, entre 1990 e 2005, as exportações setuplicaram, passando de menos de US$ 5
milhões para valores próximos a US$ 34 milhões, com crescimento médio anual de 13,8%.
Entre os destinos das exportações brasileiras destacam-se Bélgica e Holanda (juntos,
respondem por 50,5% das exportações), além de Itália, Japão e França.
Apesar de tudo isso, o principal uso do cavalo no Brasil é ainda o de apoio às
diferentes atividades agropecuárias, especialmente na lida do gado bovino. O recente e
significativo crescimento da pecuária bovina foi acompanhado por aumento na demanda por
eqüinos para lida. Não obstante a importância do cavalo como animal de trabalho existe uma
tendência de crescimento na participação do cavalo de lazer na tropa nacional. Um indicador
desta tendência é o crescimento do número de eventos esportivos. Trata-se de um fenômeno
mundial, que também ocorre no Brasil.
2.2- Os Fungos
A micologia de alimentos foi negligenciada por vários anos devido a pouca
importância dada aos fungos. Estes microrganismos eram vistos, quando contaminantes,
apenas pelo aspecto estético. A partir do momento em que se descobriu a importância
econômica, por serem deteriorantes, e de saúde pública, por seus metabólitos tóxicos, que
revestia sua ação a micologia de alimentos deixa de ser um ponto de interesse apenas dos
micologistas e toma seu lugar no contexto da ciência e tecnologia de alimentos, saúde das
populações e sanidade animal.
Os fungos juntamente com outros microrganismos, através de um conjunto de
enzimas, têm grande relevância na decomposição da matéria orgânica na biosfera, sendo de
vital importância na continuidade do ciclo vital. Esta habilidade em degradar substâncias das
mais diversas possíveis pode vir a ter efeitos benéficos ou não (SAMSON et al., 2000).
Além da capacidade deteriorante, os fungos quando presentes em produtos agrícolas,
alimentos e rações, e sob condições de temperatura e umidade adequadas, são capazes de
produzir metabólitos tóxicos, como resultado do seu metabolismo, e dentre estes, há a
formação de micotoxinas. As micotoxinas são produtos tóxicos do metabolismo secundário de
algumas espécies de fungos que contaminam principalmente produtos vegetais. Elas são
produzidas durante o processo metabólico fúngico, quando este é privado de um ou mais
nutrientes importantes, em presença de umidade e temperatura adequadas (ROSA, 2002).
Causam quadros de intoxicação e morte, de acordo com a quantidade ingerida, tempo de
exposição, idade, raça, sexo ou toxinas envolvidas.
A contaminação fúngica causa inúmeros prejuízos sobre a produtividade agropecuária.
São responsáveis pela contaminação de parte significativa das safras agrícolas, principalmente
em países de clima tropical úmido, em que as tecnologias agrícolas adequadas, principalmente
de colheita e pós-colheita, nem sempre estão disponíveis (PIMENTEL, 1991; RUSTOM,
1997).
05
As condições ideais ao desenvolvimento de fungos são bastante similares às condições
requeridas para a produção de micotoxinas. A temperatura ótima para seu crescimento está
situada na faixa de 20 - 30ºC. A atividade de água (a
w
) do substrato é muito importante;
valores de a
w
inferiores a 0,62 impedem a germinação de qualquer microrganismo. A umidade
absoluta do substrato é susceptível a influência da umidade relativa do meio ambiente;
podendo, desta forma, tender a hidratação, desidratação ou ao equilíbrio. A luz é essencial
para que algumas espécies de fungos tenham o processo germinativo induzido e finalizado,
influenciando tanto o crescimento vegetativo como a produção de toxinas. O pH (potencial
hidrogeniônico) tem efeito mínimo no metabolismo primário, exercendo maior influência na
produção da micotoxina. Os fungos podem se desenvolver na ampla faixa de pH de 2 a 8,
onde o pH ótimo está entre 4 a 6,5 (GIMENO, 2008).
Os fungos de campo, como os gêneros Fusarium e Alternaria crescem sob condições
que ocorrem antes da colheita. Usualmente requerem umidade relativa acima de 80% e teor de
umidade no grão superior a 22%. Geralmente não crescem após a colheita porque as
condições de armazenamento não propiciam a umidade necessária. Primariamente são
invasores de sementes de plantas.
Os fungos de armazenamento, como os gêneros Aspergillus e Penicillium
normalmente invadem os grãos intactos antes da colheita. Umidade relativa de 70% e teor de
umidade no grão de 14-24% favorecem o crescimento fúngico. Condições que lesam a
cutícula dos grãos (p.ex. insetos, estresse pela seca, colheita mecânica e secagem com ar
quente) podem aumentar a invasão fúngica por favorecer o acesso do fungo ao substrato.
A contaminação dos alimentos por fungos toxígenos é um fato preocupante, assim, a
implementação de medidas de controle, e o melhoramento de metodologias analíticas
objetivando respostas mais acuradas e sensíveis para a confirmação e quantificação destes
contaminantes, tornam-se a cada dia mais importantes.
Na prática, todos os ingredientes destinados ao consumo humano ou animal têm sido
expostos em algum momento no tempo à contaminação fúngica. A natureza e extensão da
contaminação determinam a presença ou ausência de micotoxina no produto. A identificação
do fungo contaminante pode ser de valor diagnóstico, mas, conclusões positivas apenas
podem ser feitas pela extração e identificação da(s) toxina suspeita(s), pois, o fungo pode
estar presente e a toxina não, e o contrário também é verdadeiro; além do que uma espécie
pode produzir mais de uma toxina, e algumas micotoxinas podem ter mais de um produtor.
Em termos gerais, algumas das formas que se tem citadas para minimizar e/ou evitar
os graves problemas que o crescimento e proliferação fúngica podem provocar nos alimentos
e nos animais que os consomem são (GIMENO, 2008):
1) Compra e recepção de matérias primas de excelente a boa qualidade micológica,
com valores de umidade, em geral, menor que 12,5% e menor que 9% para algumas
oleaginosas.
2) Armazenamento em condições de a
w
igual ou inferior a 0,65 e temperatura a 20ºC a
través de sistemas de monitoramento.
3) Higiene e limpeza regular das instalações e dos meios de transportes.
4) Sistemas de fumigação e desratização para não permitir o desenvolvimento de
insetos, ácaros e roedores.
5) Uso de agentes fungistáticos de amplo espectro ou misturas sinérgicas.
6) Sistemas de ventilação para controlar rapidamente a temperatura e umidade do
local.
7) Sistemas de amostragem e análises periódicas para conhecer a todo o momento as
condições de armazenamento.
06
18
2.2.1- Gênero Aspergillus
Com grande importância na contaminação de alimentos, o gênero Aspergillus possui
mais de 200 espécies, é filamentoso, cosmopolita e um fungo distribuído amplamente na
natureza. É comumente isolado do solo, debris de plantas e, ambientes fechados; encontram-
se em maior abundância nas regiões de climas tropicais e subtropicais (PITT; HOCKING,
1997).
Este é um gênero de particular importância devido ao fato de que várias espécies são
capazes de crescer e produzir metabólitos em baixas atividades de água e altas temperaturas
(MOSS, 1991). Possuem grande versatilidade metabólica e habilidade para dispersar seus
conídios pelo ambiente (PITT, 1981).
São bem conhecidos por causarem três sinais clínicos diferentes: infecções
oportunistas, onde a imunossupressão é o fator predisponente; estados alérgicos e toxicoses.
Estas infecções podem variar desde uma participação local até disseminação completa, daí
chamarmos de aspergilose. Entre todos os fungos filamentosos, o gênero Aspergillus é, em
geral, o mais isolado em infecções invasivas. Quase todos os órgãos ou sistemas do corpo
podem ser envolvidos, por exemplo: oncomicose, sinusite, aspergilose cerebral, meningite,
endocardite, miocardite, aspergilose pulmonar, osteomielite, otomicose, endoftalmite,
aspergilose cutânea, aspergilose hepato-esplênica, etc. São comuns as infecções respiratórias
em aves e o aborto micótico em bovinos e ovinos causados por este fungo.
As espécies do gênero Aspergillus caracterizam-se por seus distintos conidióforos. A
base destes, forma um “T” ou “L” que os conecta com uma célula vegetativa chamada de
célula pé, ou ainda uma célula separada. O pé estende-se desde a célula pé até expandir-se no
ápice em uma vesícula que pode ter diferentes formas. Em algumas espécies, os conídios
nascem de estruturas denominadas fiálides unidas diretamente à vesícula e formam cabeças
aspergilares unisseriadas. Em outras espécies, há uma segunda camada de células entre a
vesícula e as fiálides. A esta camada chamamos de métulas e formam cabeças aspergilares
bisseriadas (Figura 3). Estas características estáveis, combinadas com outras primárias e
secundárias constituem a base para a taxonomia clássica do gênero (BARROS, 2006).
Figura 3- Características morfológicas básicas representativas do gênero Aspergillus.
Fonte: SAMSON et al. (2000).
07
As características macroscópicas mais importantes, do ponto de vista taxonômico, são:
Cor das colônias. Está determinada pela cor dos conídios e constitui uma
característica importante para a classificação dos subgêneros.
Diâmetro das colônias. Consiste em medir o diâmetro da colônia logo após o período
de incubação de 7 dias. A velocidade de crescimento e a termotolerância são caracerísticas
importantes na identificação.
Cor do micélio. O micélio está composto pelas células vegetativas a partir das quais
nascem os conidióforos. O micélio geralmente é branco, porém algumas espécies produzem
micélios coloridos característicos.
Cor do reverso da colônia. É incolor a pálido ou amarelo na maioria dos isolados;
entretanto, pode ser de laranja ao roxo no A. versicolor.
Formação de esclerócios. Certas espécies de Aspergillus produzem esclerócios que
são estruturas formadas por massas compactas de hifas e que não contém conídios. Variam de
tamanho e podem ter forma esférica, subesférica ou elipsoidal. A cor também varia de
amarelo a marrom e preto. Os esclerócios funcionam como estruturas de sobrevivência que o
fungo utiliza para permanecer no solo e contém uma grande quantidade de metabólitos
tóxicos (WICKLOW, 1990). Estes metabólitos são isolados exclusivamente nestas estruturas
fúngicas que em combinação com as aflatoxinas podem formar um grande sistema de defesa
químico para a proteção dos esclerócios da predação dos insetos (DOWD, 1992; WILLETS;
BULLOCK, 1992).
Formação de cleistotécios. São formados nas espécies com estágio sexual
(teleomorfo), são estruturas que não têm uma abertura natural e que contém ascos com
ascosporas (esporos sexuados).
As características microscópicas mais importantes do ponto de vista diagnóstico são:
Conidióforo. Usualmente os conidióforos não são ramificados e estão compostos por
três partes: a célula pé, o pé e a vesícula. A maioria dos conidióforos são não septados, porém
podem se observadas septações em certas espécies. A superficie externa ou parede do
conidióforo pode ser lisa ou rugosa.
Cabeça conidial. As características da cabeça conidial como sua cor, forma e tamanho
são importantes critérios de diagnóstico. A disposição das fiálides sobre a vesícula determina
a forma, que pode variar de colunar a radiada.
Vesícula. A vesícula é o ápice engrossado do conidióforo. Sua forma pode variar de
globosa, hemisférica, elíptica a alongada (forma de clavas).
Esterigmas. Os esterigmas são células conodiógenas especializadas, as quais
desenvolvem-se sobre a área fértil da vesícula. Estes sobre a vesícula podem ser unisseriados
ou biseriados, dependendo se uma ou duas camadas de células estão presentes,
respectivamente. Os esterigmas primários (primeira camada) são chamados de métulas,
enquanto que os secundários (segunda camada) são as fiálides. Nas espécies unisseriadas, as
08
20
fiálides são produzidas diretamente das vesículas, e nas espécies bisseriadas, as fiálides
surgem das métulas.
Conídios (Esporos assexuados). Os conídios, também chamados de esporos, são
estruturas reprodutivas assexuadas que servem fundamentalmente para a dispersão. Estes
podem ser uni ou multinucleados e sua forma, tamanho e a textura de superfície são
características diagnósticas importantes.
Células de Hülle. São células estéreis grandes, de paredes grossas, que carregam um
pequeno lúmem e podem estar associadas com os cleistotécios em algumas espécies.
Parede dos cleistotécios e ascosporos. A textura da parede dos cleistotécios junto com
a cor, forma e ornamentação dos ascosporos são as características mais importantes na
determinação das espécies teleomórficas (KLICH, 2002).
Quase 50 espécies de Aspergillus são reconhecidas como capazes de produzir
metabólitos tóxicos, porém as micotoxinas mais importantes encontradas em alimentos são:
aflatoxinas, ocratoxina A (OTA), esterigmatocistina e ácido ciclopiazônico (Tabela 1).
Tabela 1- Potencial toxígeno das principais espécies de Aspergillus que contaminam
produtos vegetais.
Espécies de
Aspergillus
Micotoxinas
A. aculeatus Ácido Secalônico D
A. candidus Ácido Kójico, Candidulina, Terfenilina, Xantoacina
A. clavatus Citochalasina E, Patulina, Clavatol, Triptoquivalonas
A. carbonarius Rubrofusarina B, Ocratoxina A
A. carneus Citrinina
A. flavus Aflatoxinas B
1
e B
2
,
Aflatrem, Ácido Aspergílico, Ácido
Ciclopiazônico, Ácido Kójico, Aflavininas, Ácido 3-
Nitropropiônico, Paspalininas
A. fumigatus Fumitremorgens A e C, Gliotoxinas, Fumigaclavinas, Fumitoxinas,
Fumigatinas, Fumagilinas, Espinulosinas, Triptoquivalinas,
Verruculogem
A. niger Ocratoxinas, Malforminas, Naftoquinonas
A. niveus Citrinina
A. nomius Aflatoxinas (B
1
, B
2
, G
1
e G
2
), Ácido Aspergílico, Ácido Kójico
A. ochraceus Ocratoxinas, Ácido Penicílico, Ácido Kójico, Ácido Secalônico A,
Xantomegnina, Viomeleina
A. oryzae Ácido Ciclopiazônico, Ácido Kójico, Ácido 3-Nitropropiônico
A. parasiticus Aflatoxinas (B
1
, B
2
, G
1
e G
2
), Ácido Aspergílico, Ácido Kójico,
Aflavininas
A. tamarii Ácido Ciclopiazônico, Ácido Kójico
A. terreus Citrinina, Patulina, Citreoviridina, Mevinolina, Territrems, Ácido
Terréico, Terramide A
A. versicolor Esterigmatocistina, Versicolorinas, Nidulotoxinas
A. wentii Metilxantonas, Ácido 3-Nitropropiônico, Ácido Kójico
Fonte: FRISVAD; SAMSON (1991); PITT; HOCKING (1997).
09
2.2.2- Gênero Penicillium
Os membros deste gênero apresentam grande importância quando se refere à
contaminação alimentar; são encontrados em todo o mundo (no solo, vegetação em
deterioração e no ar), podendo crescer em baixas temperaturas e a
w
.
O gênero apresenta várias espécies e se associa com dois teleomorfos incluídos nos
gêneros Eupenicillium e Talaromyces. As características macroscópicas mais importantes, do
ponto de vista taxonômico, são:
Diâmetro, textura e cor do reverso das colônias. As colônias apresentam geralmente
crescimento rápido, têm a textura variando de aveludada, algodonosa, funicular ou fasciculada
e simnemata (Figura 4 e 5). O reverso da placa é geralmente pálido a amarelado.
Figura 4- “a – e”, tipos de ramificações do conidióforo: a e b, simples; c, biverticilado; d,
triverticilado; e, quaterverticilado. “f – k”, tipos de colônias: f, aveludada; g,
algodonosa; h, funicular; i - k, fasciculada.
Fonte: SAMSON et al. (2000).
Cor dos conídios e do micélio. As colônias são inicialmente brancas e transforma-se
em verde azul, verde cinzento, cinza verde-oliva, amarelo ou roseadas conforme os conídios
vão sendo produzidos.
Produção de pigmentos solúveis e/ou exsudatos. A produção de pigmento que se
difunde no meio de cultivo é uma característica útil para classificação, entretanto este
mecanismo está sob regulação genética então podem ou não ser expressos. Isso deve ser
enfatizado, pois o fato de determinada cepa não apresentar pigmentação não deve ser
encarado de forma negativa para sua caracterização na espécie. Com relação a produção de
exsudatos, algumas espécies são capazes de liberar gotículas a partir do micélio,
especialmente quando crescem sobre o meio agar Czapek extrato de levedura. Esta é uma
característica marcante para algumas espécies; a cor e extensão da produção deste exsudato
são ferramentas taxonômicas importantes. (Figura 5)
10
22
Formação de esclerócios. Sua presença, tamanho e cor são de importância diagnóstica
(Figura 5).
Produção de gimnotécios ou cleistotécios. Estruturas grandes características da
reprodução sexual dos fungos as quais vão conter os ascos com os ascosporos em seu interior.
O que diferencia estes dois tipos é: os cleistotécios são formados por um corpo esférico de
paredes lisas e os gimnotécios formados por paredes de hifas.
As características microscópicas mais importantes do ponto de vista taxonômico são:
Conidióforo. Consiste de uma estipe distinta que culmina em um pincel; são hialinos,
com hifas septadas, são simples ou ramificados. E isto irá determinar a divisão taxonômica
primária deste gênero em quatro subgêneros: Aspergilloides, Furcatum, Biverticillium e
Penicillium.
Tipo de pincel. As fiálides podem ser produzidas individualmente, em grupos ou
ramificadas em métulas, formando um pincel. Podendo ser então: monoverticilados,
biverticilados, terverticilados e/ou quaterverticilados (Figura 4).
Número e disposição das métulas por estipe. O número irá variar segundo a
complexidade do pincel. Quando a disposição é irregular, de forma lateral e terminal sobre a
estipe estamos dentro do subgênero Furcatum, seção Divaricatum. E quando a disposição é
regular, de forma terminal sobre a estipe, estamos dentro do subgênero Furcatum, seção
Furcatum.
Forma das fiálides. Existem dois tipos: ampuliformes e acerosas. As ampuliformes
são semelhantes a garrafas e as acerosas são semelhantes a agulhas de pinheiro, com lados
paralelos que convergem numa forma cônica para um orifício estreito.
Tamanho relativo entre fiálides e métulas. A relação entre o tamanho destas duas
estruturas, juntamente com a taxa de crescimento no meio agar nitrato glicerol a 25%, é de
fundamental importância na separação nos subgêneros Furcatum e Biverticillium.
Tamanho e textura da estipe, que pode ser lisa ou rugosa.
Diâmetro, textura e tamanho dos conídios.
Forma, ornamentação e tamanho dos ascos e ascosporos.
11
Figura 5- A-B colônia aveludada. B típico exsudato amarelo. C colônia aveludada que
está se tornando fasciculada com o tempo. D grandes e compactas cabeças conidiais. E
colônia flocosa. F esclerócios. G-I colônias fasciculadas. J blocos de massas conidiais em
colônia de 10 dias de idade. K-L colônia sinemmata.
Fonte: FRISVAD; SAMSON (2004)
12
24
Um problema importante quando se quer estabelecer a ocorrência de Penicillium é que
na maioria dos casos não se realiza a identificação em nível de espécies devido a sua
complexidade (Figura 6).
Figura 6- Chave taxonômica básica para o gênero Penicillium e seus teleomorfos.
Preenchimento em amarelo para gêneros; roxo para subgêneros e verde para seções. G25N refere-se ao meio de
cultivo agar nitrato glicerol a 25%.
Fonte: PITT (1988).
Diversas espécies de Penicillium são reconhecidas como capazes de produzir
metabólitos tóxicos, porém as micotoxinas mais importantes encontradas em alimentos são:
ocratoxina A (OTA), patulina, citrinina e citreoviridina (Tabela 2).
Penicillium
e
teleomorfos
cleistotécio
(ou esclerócio)
sem gimnotécio
ou cleistotécio
gimnotécio
Eupenicillium Penicillium Talaromyces
monoverticilado biverticilado terverticilado
quaterverticilado
fiálides ampuliformes
G25N > 10mm
fiálides acerosas
G25N < 10mm
Furcatum Biverticillium
pincéis regulares com
métulas terminais
Furcatum
Aspergilloides Penicillium
pincéis irregulares com
métulas terminais,
subterminais ou baixas
Divaricatum
13
Tabela 2- Potencial toxígeno das principais espécies de Penicillium que contaminam
produtos vegetais.
Espécies de
Penicillium
Micotoxinas
P. aethiopicum Griseofulvina, Viridicatumtoxina
P. aurantiogriseum Ácido Penicílico, Roquefortina C, Xantomegnina, Viomeleim,
Verrucosidina
P. brevicompactum Ácido Micofenólico
P. camemberti Ácido Ciclopiazônico
P. chrysogenum Roquefortina C, Ácido Ciclopiazônico
P. citreonigrum Citreoviridina
P. citrinum Citrinina
P. commune Ácido Ciclopiazônico, Ácido Ciclopáldico, Ácido Ciclopólico,
Ciclopiamina, Palitantina, Rugulovasinas
P. crustosum Penitrem A
P. expansum Patulina, Citrinina
P. funiculosum Patulina
P. griseofulvum Patulina, Ácido Ciclopiazônico, Roquefortina C, Griseofulvina
P. hirsutum Roquefortina C, Ácido Ciclopiazônico
P. islandicum Cicloclorotina, Islanditoxina, Leuteoskyrina, Eritroskyrina
P. janczewskii Griseofulvina, Penitrem A
P. janthinellum Toxinas Tremorgênicas
P. oxalicum Ácido Secalônico D
P. paxilli Verruculogem, Paxiline (Toxinas Tremorgênicas)
P. purpurogenum Rubratoxinas
P. raistrickii Griseofulvina, Toxinas Tremorgênicas
P. roqueforti PR Toxina, Patulina, Ácido Penicílico, Roquefortina C, Ácido
Micofenólico
P. rugulosum Rugulosina
P. simplicissimum Verruculogem, Fumitremorgem B, Ácido Penicílico,
Viridicatumtoxina
P. variabile Rugulosina
P. verrucosum Ocratoxina A, Citrinina
P. viridicatum Xantomegnina, Viomeleim, Vioxantina
Fonte: PITT; HOCKING (1997).
14
26
2.2.3- Gênero Fusarium
Dentre os fungos filamentosos contaminantes de alimentos de maior importância
encontramos, juntamente com Aspergillus e Penicillium, o gênero Fusarium (SIDHU, 2002).
Espécies desse gênero encontram-se amplamente distribuídas em plantas e no solo, sendo um
importante fitopatógeno. É encontrado na micoflora de produtos como arroz, feijão, soja,
milho, dentre outros grãos. Enquanto as espécies mais comuns são encontradas em áreas
tropicais e subtropicais, outras têm predileção por clima mais frio, habitando o solo dessas
regiões.
Apesar de ser importante fitopatógeno e contaminante, espécies deste gênero podem
causar diversas infecções em humanos, conhecidas como fusarioses, exemplo disso são
algumas micoses oportunistas. A espécie mais virulenta é o F. solani, que freqüentemente
promove infecções cutâneas em traumas na pele. Já as infecções disseminadas costumam
ocorrer em imunossuprimidos, pacientes com neutropenia e em transplantados.
Tem-se constituindo esse gênero cerca de vinte espécies, distribuídas em 12 seções.
Podem-se citar como espécies mais comuns o F. solani, F. oxysporum e F. chlamydosporum.
A seção Liseola é a mais importante, pois contem espécies potencialmente produtoras das
micotoxinas mais comuns, como o F. verticillioides e F. graminearum; a ingestão de grãos
contaminados com tais toxinas pode levar a ocorrência de sintomas alérgicos ou
carcinogênese se houver consumo prolongado.
São aspectos macroscópicos desse grupo de fungos o crescimento de colônias
algodonosas a lanosas, planas e de crescimento vasto. A coloração da colônia varia de branco,
creme, bronze, salmão, avermelhada, amarelada, ao violeta, rosa ou roxo. E o reverso pode ser
sem cor, bronze, vermelho, roxo ou amarronzado.
Podem apresentar esporodóquios, que são um conjunto de hifas com conidióforos na
superfície, e podem ser observados nas cores creme ao bronze ou alaranjado, exceto a espécie
F. solani que produz esporodóquios de cor azul ou azul-esverdeado.
Possuem características microscópicas bem distintas; apresentam hifas septadas,
conidióforos, fiálides, macroconídios e microconídios (Figura 7). Em adição, clamidosporos
podem ser produzidos por várias espécies (Figura 8).
As fiálides são cilíndricas com um pequeno colarete, únicas ou são produzidas como
um complexo sistema de ramos, as monofiálides ou polifiálides.
Os macroconídios são produzidos a partir de fiálides em conidióforos ramificados ou
não ramificados. Possuem dois ou mais septos, de paredes finas, lisas e em formato cilíndrico.
Podem possuir uma célula basal distinta em formato de pé.
Já os microconídios são formados em conidióforos únicos longos ou curtos. Possuem
um septo ou ocasionalmente de 2 a 3 septos. São lisos, hialinos, ovóides, cilíndricos,
piriformes, etc...; arranjados em falsas cabeças ou falsas cabeças e conídios em cadeia (Figura
8).
Clamidosporos, quando presentes, são encontrados soltos, em pares ou em cadeias.
Tem a parede lisa ou rugosa, hialina, sendo intercalados ou terminais.
Todos esses achados macroscópicos e microscópicos são pontos chaves para se
identificar as espécies de Fusarium.
15
Figura 7- a, Macroconídios; b, Microconídios; c, Monofiálides.
Fonte: NELSON; TOUSSOUN; MARASAS (1983).
Figura 8- a, Disposição de clamidosporos; b, Conídios em cadeia e falsa cabeça (círculo
vermelho).
Fonte: NELSON; TOUSSOUN; MARASAS (1983); DRAF (2008).
Dentre as toxinas produzidas por Fusarium, as mais importantes são: fumonisinas,
zearalenona e tricotecenos (Tabela 3). Os tricotecenos formam um grupo de mais de 50
compostos relacionados e que têm como núcleo químico básico os 12,13-epoxitricotecenos.
Dentre estas substâncias, ressaltamos a T-2 toxina, diacetoxiscirpenol (DAS), neosolaniol,
nivalenol, diacetilnivalenol, deoxinivalenol (DON), HT-2 toxina, fusarenona X e a roridina.
c
a
b
b
a
16
28
Tabela 3- Potencial toxígeno das principais espécies de Fusarium que contaminam
produtos vegetais.
Espécies de
Fusarium
a
Micotoxinas
F. acuminatum T-2 toxina, Moniliformina, HT-2 Toxina, Diacetoxiscirpenol,
Monoacetoxiscirpenol, Neosolaniol, Beauvericina
F. anthophilum Beauvericina
F. avenaceum Moniliformina, Beauvericina
F. cerealis Nivalenol, Fusarenona-X (4-Acetil-NIV), Zearalenona,
Zearalenoles (α e β isômeros)
F. chlamydosporum Moniliformina
F. culmorum Deoxinivalenol (Vomitoxina), Zearalenona, Nivalenol,
Fusarenona-X (4-Acetil-NIV), Zearalenoles (α e β isômeros),
Mono-acetildeoxinivalenol (3-AcDON, 15-AcDON)
F. equiseti Zearalenona, Zearalenoles (α e β isômeros), Monoacetoxiscirpenol,
Diacetoxiscirpenol, Nivalenol, Diacetilnivalenol, Fusarenona-X (4-
Acetil-NIV), Fusarocromanona, Beauvericina
F. graminearum Deoxinivalenol (Vomitoxina), Zearalenona, Nivalenol,
Fusarenona-X (4-Acetil-NIV), Mono-acetildeoxinivalenol (3-
AcDON, 15-AcDON), Di-acetildeoxinivalenol, Diacetilnivalenol
F. heterosporum Zearalenona, Zearalenoles (α e β isômeros)
F. nygamai Beauvericina, Fumonisina B
1
, Fumonisina B
2
F. oxysporum Moniliformina, Beauvericina
F. poae Diacetoxiscirpenol, Nivalenol, Fusarenona-X (4-Acetil-NIV),
Monoacetoxiscirpenol, T-2 toxina, HT-2 Toxina, Neosolaniol,
Beauvericina
F. proliferatum Fumonisina B
1
, Beauvericina, Moniliformina, Fusaproliferina,
Fumonisina B
2
F. sambucinum Diacetoxiscirpenol, T-2 toxina, Neosolaniol, Zearalenona,
Monoacetoxiscirpenol, Beauvericina
F. semitectum Zearalenona, Beauvericina
F. sporotrichioides T-2 toxina, HT-2 Toxina, Neosolaniol, Monoacetoxiscirpenol,
Diacetoxiscirpenol
F. subglutinans Beauvericina, Moniliformina, Fusaproliferina
F. tricinctum Moniliformina, Beauvericina
F. verticillioides Fumonisina B
1
, Fumonisina B
2
, Fumonisina B
3
Fonte: LOGRIECO et al. (2002).
a
Nomenclatura de Fusarium de acordo com NELSON; TOUSSOUN; MARASAS (1983).
17
2.4- Micotoxinas e micotoxicoses: características gerais
As micotoxinas têm 100 vezes mais potencial carcinogênico relativo do que as outras
categorias de substâncias encontradas em dietas como: as sintéticas (pesticidas e aditivos);
condimentos e compostos formados durante o cozimento de alimentos (aminas heterocíclicas,
benzopirenos e etc..) (MILLER, 1996).
Estas toxinas ocorrem em uma ampla variedade de substratos e têm sido implicadas
em uma série de patologias humanas e animais (RINALDI, 1983; CAST, 2003; DILKIN;
MALLMANN, 2004; MORGAVY; RILEY, 2007). Entretanto o que preocupa, não é a
ocorrência em altos níveis, mas a ocorrência destes produtos do metabolismo fúngico em
pequenas quantidades em produtos vegetais básicos e seus subprodutos industrializados. A
ingestão diária e constante de pequenas quantidades destes compostos através de alimentos
essenciais, sem dúvida, terá papel importante na indução ou modulação de patologias no
homem e nos animais e justifica estudos interdisciplinares com a finalidade de melhorar o
diagnóstico e as medidas preventivas.
Quando as toxinas fúngicas são ingeridas ou inaladas em determinadas concentrações
pelos animais ou pelo homem produzem um quadro clínico-patológico conhecido como
micotoxicoses. Estas podem ser definidas como primárias ou secundárias de acordo com a
forma de sua entrada no organismo. A primária ocorre com o consumo direto dos produtos
contaminados, e a secundária ocorre ao se ingerir leite, carne ou derivados de animais que
foram alimentados com forragem contaminada. As características de uma micotoxicose são:
enfermidade não contagiosa; o tratamento com drogas produz pouco ou nenhum efeito; o
problema é estacional devido as condições climáticas que afetam o desenvolvimento fúngico;
o surto está comumente associado com um alimento ou forragem específico, onde o exame do
material suspeito revela sinais de atividade fúngica (LILLEHOJ, 1991).
As alterações associadas com as micotoxicoses são: reações alérgicas,
imunossupressão, quadros nervosos e hemorrágicos, diminuição da eficiência produtiva e
reprodutiva, deficiências metabólicas e bioquímicas, gastroenterites, enfermidades
autoimunes, deficiências em vitaminas e/ou minerais, alterações genéticas, teratogênicas,
carcinogênicas, incluso a morte em alguns casos (CAST, 2003; HUSSEIN; BRASEL, 2001).
A ocorrência de micotoxicoses entre os animais domésticos é reflexo do sistema
produtivo adotado pelos criadores. Quanto mais evoluído for, maior será a utilização de
alimentos concentrados, a base de grãos, tornando maior a probabilidade de intoxicação pelas
micotoxinas (ROSA, 2002).
18
30
2.5- Aflatoxinas
As aflatoxinas são produzidas principalmente por Aspergillus flavus e Aspergillus
parasiticus. A AFB
1
, mais freqüente e mais tóxica, é reconhecida como o mais potente
hepatocarcinógeno de origem biológica para o homem e os animais (IARC, 1993). Estas
toxinas são encontradas como contaminantes naturais de cereais e rações e em baixas
concentrações produzem alterações sobre o metabolismo, provocando lentamente sérios danos
à saúde e produtividade do animal. Os efeitos mais freqüentemente observados são a
diminuição da velocidade de crescimento e da eficiência alimentar, causados pela redução do
metabolismo protéico e absorção de gorduras e a supressão da resposta imune. Os grãos
estocados inadequadamente, com umidade e temperatura acima de 14% e 20%,
respectivamente, podem potencialmente serem colonizados.
Produtos de origem animal podem apresentar teores residuais de aflatoxinas
biotransformadas através do sistema misto oxidase hepático do animal que as ingeriu, tais
como a aflatoxina M
1
(AFM
1
), o aflatoxicol (AFL), a AFB
2
, além da própria AFB
1
. Estas
substâncias têm sido detectadas em leite e derivados; ovos e derivados; fígado, músculo e
derivados cárneos.
Casos suspeitos de aflatoxicose eqüina aguda já foram descritos causando necrose
hepática centrolobular com extensa hemorragia cardíaca e gastrointestinal, porém não se tem
determinada a LD
50
(dose letal para 50% dos indivíduos) e não há sinais patognomônicos ou
lesões típicas associadas com esta espécie. (ALLER; EDDS; ASQUITH, 1981). Os sinais
clínicos observados incluem depressão do sistema nervoso central, anorexia, perda de peso,
icterícia e hemorragias subcutâneas (GREENE; OEHME, 1975; ASQUITH; EDDS, 1980). A
necropsia evidenciou fígado gordo e frágil, rins friáveis e pálidos, petéquias epi e
endocardiais, miocárdio pálido, enterites hemorrágicas, hiperplasia de dutos biliares e edema
cerebral. A concentração de AFB
1
em rações analisadas nestes episódios variou de 216 a 940
ppb (partes por bilhão, equivalente a µg/kg), enquanto que a concentração foi de 6500 ppb de
AFB
1
no amendoim utilizado como matéria-prima (ANGSUBHAKORN et al., 1981).
O aluminosilicato de cálcio e sódio hidratado tem alta afinidade pela aflatoxina e
podem adsorvê-la, reduzindo sua absorção do trato gastrointestinal. Vitamina E e selênio
suplementares também têm sido usados com sucesso apenas parcial.
A legislação brasileira (MAPA, 1988) admite um nível de contaminação máximo por
aflatoxinas totais equivalente a 50 ppb; válido para qualquer matéria prima a ser utilizada
diretamente ou como ingrediente em rações destinadas ao consumo animal. Cerca de 1% da
AFB
1
ingerida na alimentação animal irá aparecer excretada no leite na forma de AFM
1
, que é
seu metabólito hidroxilado. Por conta disso, houve um aumento expressivo de países que
criaram regulamentação específica para estas micotoxinas. Porém as leis referem-se
especificamente aos ruminantes; será que este mesmo mecanismo não ocorre, por exemplo,
com o leite de éguas que pode ser utilizado pelas pessoas que apresentam intolerância à
lactose bovina? E neste caso, o limite aceito pela comunidade européia é de cinco ppb na
alimentação animal e correspondentemente 0,05 ppb no leite. Vale ressaltar que mesmo se
desconsiderarmos este fato, o limite estabelecido pela comunidade européia para rações
animais é de 20 ppb (GMP, 2008), menos da metade limite praticado em nosso país.
19
2.6- Fumonisinas
As micotoxicoses em eqüinos estão relacionadas principalmente com a ingestão de
rações a base de milho contaminado por fumonisinas, toxinas produzidas por fungos
pertencentes ao gênero Fusarium, sendo F. verticillioides o maior produtor. Estas micotoxinas
foram descobertas recentemente, e já foram identificados seis tipos sendo a FB
1
a mais
comum e mais tóxica. Este grupo de toxinas é responsável por lesões hepáticas e a FB
1
é
causadora da leucoencefalomalácia eqüina (LEME),
A LEME é uma doença não infecciosa esporádica e altamente fatal que afeta o sistema
nervoso central de cavalos e outros eqüídeos. Foi descrita no início do século XX por Bucley;
McCallum (1901) e caracterizada por encefalite hemorrágica aguda acometendo os eqüinos de
Maryland (EUA). Butler (1902) foi quem confirmou experimentalmente a doença, após a
administração oral de milho mofado a eqüinos. Wilson; Maranpot (1971) conseguiram
reproduzir experimentalmente a doença através da administração oral à eqüinos de milho
contaminado artificialmente com F. verticillioides, isolados de cereal envolvido com surto da
doença no Egito.
No Brasil, a doença foi descrita pela primeira vez em São Paulo por Rego (1950),
entretanto a relação entre LEME e o fungo só foi estabelecida por Riet-Correa et al. (1982)
quando da descrição de três surtos da toxicose no Rio Grande do Sul. Em 1988, após a
descoberta das fumonisinas, realizada por Gelderblom et al. (1988), Marasas et al. (1988)
conseguiu reproduzir experimentalmente a LEME em eqüino que recebeu 0,125mg/kg de
peso vivo (PV) de FB
1
purificada por via endovenosa durante nove dias (dose total: 276mg).
Os sinais clínicos da micotoxicose tornaram-se aparentes no 8
o
dia após a inoculação e
consistiam de apatia, tremores musculares, paresia do lábio inferior e língua, convulsões
tetânicas e morte. À necropsia, foram observados edema cerebral acentuado e necrose focal
bilateral da medula oblonga. As alterações bioquímicas observadas no soro sangüíneo foram
pequena elevação das enzimas aspartato transferase (AST) e gama glutamil transferase
(GGT). A confirmação do papel da FB
1
pura na apresentação dos sintomas foi realizada por
Kellerman et al. (1990). Neste trabalho, os autores induziram LEME através da administração
oral de FB
1
a dois eqüinos, sendo que um deles recebeu FB
1
(50% de pureza) em 21 doses de
1,25mg a 4mg/kg /PV durante período de 33 dias (dose total de 8,925g) e o outro animal
recebeu 1 a 4mg/kg/PV de FB
1
pura durante 24 dias (dose total de 8,417g). Entre o 24
o
e o 30
o
dias após a dosificação oral, os animais desenvolveram sinais neurotóxicos que incluíam
alterações no comportamento, incoordenação, paralisia dos lábios e língua e tremores
musculares. Após a eutanásia, realizada no início do aparecimento dos sinais, os autores
observaram lesões típicas da doença com a presença de necrose cavitária ou amolecimento da
substância branca de ambos hemisférios cerebrais.
Wilson et al. (1990) avaliaram a toxicidade in vivo de alimentos de eqüinos
provenientes de diferentes haras, e semelhante a ROSS et al. (1991) detectaram níveis entre 1
ppm e 126 ppm de fumonisina B
1
em alimentos balanceados de eqüinos associados com
LEME. Vesonder; Haliburton; Golinsky (1989) associaram a LEME com a presença de F.
verticillioides em amostras de alimento balanceado, milho e aveia, semelhante aos resultados
obtidos por Sydenham et al. (1992) que relacionaram a contaminação de rações por com
fumonisinas com surtos de micotoxicoses nos animais.
Diversas micotoxinas de Fusarium podem co-ocorrer em um ingrediente particular ou
em rações comerciais. Em geral, combinações de toxinas deste gênero resultam em efeitos
aditivos; interações de sinergismo e/ou potencialização e representam grande preocupação
para a saúde e produtividade dos animais domésticos (D'MELLO; PLACINTA;
MACDONALD, 1999).
20
32
Com relação aos limites máximos admissíveis para esta classe de micotoxinas,
podemos dizer que praticamente não há regulamentação específica, talvez justificada por sua
descoberta tardia. Em Junho de 2000, o FDA (Food and Drug Administration) estabelecia
como normativa o limite de cinco ppm de fumonisinas na alimentação de eqüídeos sem,
contudo, ultrapassar 20% do peso da dieta seca. Posteriormente, estudo realizado pela Food
and Agriculture Organization of the United Nations mostrava que apenas seis países no
mundo inteiro já haviam fixado seus valores limites (FAO, 2003), sendo: 4 países = 1000 ppb
ou 1 ppm (equivalente a 1 µg/g); 1 país = 2 ppm; e 1 país = 3ppm. No Brasil ainda não há
legislação específica apesar da importância destas micotoxinas no cultivo do milho.
2.6.1. Modo de atuação das fumonisinas
O modo de atuação das fumonisinas ainda não é perfeitamente conhecido, mas Wang
et al. (1991), propuseram que a FB
1
poderia intervir na biossíntese de esfingolipídios ou
turnover de esfingosina, pois existe uma similaridade desta com a molécula de FB
1
(Figura 9).
A inibição de biossíntese dos esfingolipídios pode ter um profundo efeito sobre a célula, uma
vez que esses componentes têm papel importante na estrutura da membrana, comunicação
celular, interação intracelular e matriz celular, regulação de fatores de crescimento, como
mensageiro de vários fatores, incluindo fator de necrose de tumor, interleucina
1
e fator de
crescimento de nervos.
A inibição desta via metabólica resulta na depleção do complexo esfingolipídio,
aumento intracelular da concentração de esfinganina livre, ou em menor grau de esfingosina
livre, e um aumento dos produtos de clavagem. O acúmulo das bases esfingóides é a causa
primária da toxicidade das fumonisinas. A alteração no metabolismo dos esfingolipídios pode
ser monitorada, já que alguma esfinganina que acumula na célula pode aparecer no sangue
periférico. Wang et al. (1992) alimentaram pôneis com dietas contendo 44µg/g de FB
1
durante 10 dias e observaram, no vigésimo dia do experimento, elevação no nível de
esfinganina, cerca de 2,7 vezes. As elevações das enzimas séricas ocorreram somente após 10
dias, indicando que os níveis de esfinganina e esfingosina podem ser utilizados como
marcadores de exposição animal as fumonisinas.
21
Figura 9- Esquema do provável modo de atuação das fumonisinas.
Palmitoil-
CoA
ALTERADO
Metabolismo esfingolipídios
I
ndu
z
id
o
por fumonisinas (FBs)
NORMAL
Metabolismo esfingolipídios
Produtos
lipídicos
ESFINGOSINA
(SO)
esfingolipídios
comple
x
os
Ceramida
Dihidroceramida
Serina
ESFINGANINA
(SA)
3
-
cetoesfinganina
SO
SA/
SO
<
Urina, tecidos e
sangue
S
O
SA
SA/
SO
>
Urina, tecidos e
sang
u
e
membranas
biológicas
esfingolipídios
comple
x
os
Dihidroceramida
ESFINGANINA
(SA)
Serina
Palmitoil-
CoA
3
-
cetoesfinganina
ESFINGOSINA
(SO)
Ceramida
Produtos
lipídicos
Ceramida
Ceramida
F
F
B
B
s
s
membranas
biológicas
SA
22
34
2.7- Outras micotoxinas de importância para os eqüinos
2.7.1 Ocratoxina A
As ocratoxinas são produzidas por fungos dos gêneros Penicillium e Aspergillus,
principalmente por P. verrucosum e A. ochraceus. O P. verrucosum é muito encontrado como
contaminante de cereais em regiões de clima temperado, mas também está significativamente
presente em carnes refrigeradas nas regiões subtropicais. Existem sete tipos de ocratoxinas,
sendo as mais importantes as do tipo “A”, tipo “B” e tipo “C”.
A ocratoxina A (OTA) é a mais
abundante e mais tóxica deste grupo, podendo desencadear inúmeros efeitos tóxicos em aves
e mamíferos, como teratogênese, carcinogênese, imunossupressão e principalmente
nefrotoxidade. A nefropatia micotóxica é uma doença fatal, que clinicamente se apresenta
com falhas renais progressivas, acompanhada por anemia (supressão da hematopoiese), sem
hipertensão e depressão. Morfologicamente causa atrofia dos túbulos proximais renais, fibrose
cortical, assim sendo, pelo impedimento da função tubular, ocasiona-se oligúria. Com a
ingestão continuada, podem surgir neoplasias no trato urinário, como tumores bilaterais,
pélvicos ou uretrais, de progressão lenta, e microcistos renais; além dos efeitos
imunossupressor sobre o timo, baço e linfonodos, embriotoxidade e teratogenia.
2.7.2 Citrinina
É uma importante micotoxina nefrotóxica para o homem, bovinos, eqüinos, cães, e
principalmente para suínos e aves. É produzida por espécies dos gêneros Aspergillus e
Penicillium, destacando-se entre estes, o A. niveus, A. terreus, P. citrinum, P.verrucossum e P.
viridicatum. Fungos citrinogênicos têm sido isolados de amendoim, arroz, aveia, centeio,
cevada, milho, trigo e ração. A citrinina, assim como a OTA, está relacionada com a
ocorrência da nefropatia micotóxica na ingestão de cereais mofados, a qual foi também
diagnosticada no Brasil, em animais que se alimentavam com cevada fermentada de
cervejaria. Esta micotoxicose caracteriza-se por ser de caráter crônico com baixa mortalidade,
causando lesões de caráter hemorrágico, alterações séricas, necrose hepática e renal, com
fibrose intersticial, e cardiotoxidade. Tanto nos casos de intoxicação por ocratoxinas quanto
por citrinina, o uso de carvão ativado reduz a absorção destas em nível gastrointestinal, mas
usualmente não é prático para os casos de exposição crônica. Devido ao fato dos animais
sobreviventes ou convalescentes sofrerem de insuficiência renal crônica, a ingestão de
proteínas deve ser limitada, além de ser necessário um tratamento de apoio adequado, o que
implica em gastos e queda de performance.
2.7.3 Eslaframina
É um alcalóide indolizidínico, produzida pelo fungo Rhizoctonia leguminicola que
infesta o trevo vermelho e, ocasionalmente, outras leguminosas. Tem sua produção favorecida
no frio e com tempo úmido, especialmente durante o período de recrescimento das
forrageiras. Apresenta propriedades parassimpatomiméticas e imita a ação da acetilcolina,
ligando-se aos seus receptores. Os eqüinos são altamente susceptíveis e os sinais clínicos
desenvolvem-se rapidamente, muitas vezes dentro de 1-3 horas após o consumo de forrageiras
contaminadas. Salivação profusa é uma resposta clínica característica, sendo também
observados lacrimejamento moderado, micção freqüente, diarréia, timpanismo, rigidez e
interrupção da produção de leite. A atropina pode ser usada no tratamento sintomático da
salivação e diarréia, e são necessários observação e cuidados de apoio geral para a
desidratação e a dificuldade respiratória.
23
2.7.4 Toxinas tremorgênicas
Tremórgenos são um grupo de toxinas produzidas por diferentes fungos: o fungo
endofítico Acremonium lolii, que produz o lolitremo B e comumente infecta o azevém,
produzindo o quadro conhecido como cambaleio por azevém. O Claviceps paspali é um ergot
de cor pálida, globóide e rugoso que produz paspalitremo A e B, paspalanina e ácido lisérgico
e parasita o paspalum. P. crustosum, P. cyclopium, P. palitan e P. puberulum produzem
penitrem A. Estas micotoxinas são caracterizadas por uma molécula de indol, que é parte de
uma estrutura anelar complexa que inclui o ácido lisérgico. Os derivados do ácido lisérgico
estão associados com a redução da concentração ou da função dos aminoácidos inibitórios
(GABA e glicina), podendo ocorrer aumento da liberação de neurotransmissores e
despolarização prolongada, e facilitação da transmissão sináptica no final da placa motora.
Um segundo mecanismo potencial é a vasoconstrição dos vasos cerebrais o que pode levar a
anóxia cerebral. Os efeitos observados incluem tremores leves de cabeça e pescoço, rigidez,
ataxia, hipermetria, opistótonos e convulsões. Alguns animais podem tornar-se hostis ferindo-
se a si próprios ou a outros. A morbidade é tipicamente alta, mas a mortaliade é baixa. Carvão
vegetal ativado e catárticos salinos são úteis para a descontaminação por via oral. Medicações
que aumentam a concentração de glicina (p.ex. mefenesina e nalorfina) no sistema nervoso
central podem reduzir os efeitos dessas micotoxinas.
2.7.5 Tricotecenos
Dentre estas substâncias, ressaltamos a T-2 toxina, o DON, o DAS e o nivalenol,
importantes por estarem relacionadas com diversas patologias animais. Os sintomas mais
comuns relacionados com este tipo de intoxicação incluem perda de peso e redução na
conversão alimentar, êmese, recusa de alimentos, diarréia sanguinolenta, hemorragias, aborto,
distúrbios nervosos, além de inibirem a síntese de ácido nucléico e proteína. Também são
facilmente absorvidos pela pele, podendo causar irritação local, inflamação, descamação,
hemorragia subepitelial e necrose.
2.7.6 Zearalenona
A zearalenona (ZEA) ou toxina F-2 é produzida principalmente por F. roseum e F.
graminearum, e apresenta atividade estrogênica quando consumida através de ração
contaminada, em particular nos períodos frios, onde há oscilação de temperatura. Seus efeitos
estrogênicos são claramente observados nos suínos, pois são mais susceptíveis, sendo os
efeitos mais pronunciados nas fêmeas. Representados clinicamente nas fêmeas por
infertilidade, falso cio, diminuição da ovulação, fetos poucos desenvolvidos, tumefação
vulvar, aumento e prolapso do útero e reto e aumento das glândulas mamárias nas fêmeas
imaturas. Nos machos, apresentam-se atrofia testicular, infertilidade e aumento das glândulas
mamárias. O carvão ativado liga-se à ZEA no trato gastrointestinal e ajuda a prevenir o ciclo
êntero-hepático. A adição da argila bentonita em dietas contaminadas é considerada útil no
controle dos efeitos tóxicos.
24
36
2.7.7 Rubratoxinas
Certas espécies do gênero Penicillium, em especial Penicillium rubrum, são
importantes por produzirem rubratoxinas, as quais podem potencializar as ações das
aflatoxinas. Uma exposição crônica as rubratoxinas produz extensos danos nos tecidos vivos
que consiste basicamente de necrose hemorrágica.
2.8- Métodos de detecção das micotoxinas
O TLC é um dos métodos mais antigos e continua a ser utilizado como método oficial
de análise para algumas micotoxinas (SCOTT, 1990). É econômica, rápida e prática
especialmente quando se necessita analisar muitas amostras, havendo a possibilidade de fazer
uma detecção multitoxinas. O inconveniente desta técnica é, muitas vezes, o seu limite de
detecção; não conseguindo demonstrar níveis muito baixos de toxinas. Vem sendo utilizada
como método de triagem.
O HPLC é o método mais freqüente e amplamente utilizado, sendo inclusive adotado
como método oficial para análise de várias micotoxinas (TRUCKSESS, 2006). É uma técnica
cara e demorada especialmente na análise de várias micotoxinas, que devem ser quantificadas
em separado; as concentrações mínimas detectáveis em geral são bem baixas; o sistema de
quantificação com detector de fluorescência proporciona resultados mais exatos e com menor
variabilidade.
Os métodos imunológicos têm sido largamente utilizados devido à sua sensibilidade,
especificidade, rapidez, simplicidade e baixo custo. Utilizam anticorpos específicos para
isolar e/ou detectar as micotoxinas nos alimentos. A base destes métodos é a interação entre
antígenos (toxinas fúngicas) e anticorpos específicos, produzidos num organismo animal,
geralmente o coelho, pelos linfócitos B. Entre os métodos imunológicos utilizados na
dosagem das micotoxinas os mais comuns são o ELISA, aprovado como método oficial da
AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para triagem de aflatoxinas, RIA (radio-
imuno-assay) e IAC. As duas técnicas, RIA e ELISA, são baseadas na competição de ligação
entre a toxina não marcada proveniente da amostra e a marcada sobre os locais específicos do
anticorpo; a IAC é uma técnica cromatográfica baseada diretamente na ligação antígeno
(toxina) com o anticorpo fixado numa coluna.
Os inferiores limites de detecção que se conseguem com o ELISA em detrimento do
RIA, e a complexidade do equipamento indispensável para a aplicação do método RIA, para
além do inconveniente que envolve o trabalho com material radioativo, levou à utilização do
ELISA e IAC, até porque existem kits de aplicação que permitem a sua utilização rápida por
uma pessoa não especializada em técnicas imunológicas. A IAC, em que as colunas contêm
anticorpos seletivos imobilizados, tornou-se um método muito válido pois ''com as colunas de
imunoafinidade o procedimento para o pré-tratamento da amostra total é reduzido a uma única
extração em fase sólida'' (MORTIMER et al., 1987).
25
2.9- Estudos preliminares
Estudos prévios permitiram aportar os primeiros dados sobre a freqüência de toxinas e
de fungos toxígenos em alimentos destinados ao consumo de eqüinos nas cidades do Rio de
Janeiro e de Seropédica (KELLER et al., 2007). Os autores observaram que a maioria dos
alimentos avaliados apresentou valores de contagens da carga fúngica superiores aos limites
recomendados (GMP, 2008). O gênero Aspergillus foi o mais freqüente, tendo o A. flavus
como espécie predominante. Os níveis de contaminação por AFB
1
estiveram entre 0,01 e 99,4
µg/g, e para FB
1
os valores foram desde 0,01 até 7,49 mg/g.
Ao buscarmos na literatura mundial estudos similares à este proposto nos deparamos
com uma enorme lacuna; as investigações realizadas especificamente na espécie eqüina são
muito antigas, a maioria das vezes através de infecção experimental. Os dados mais recentes
referem-se à avaliação de surtos esporádicos, onde o alimento suspeito era então analisado.
Reveste, portanto de grande importância o monitoramento micotoxicológico rotineiro, para
que possa ser feita uma avaliação de risco e assim prevenir o surgimento da doença.
26
38
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostragem
Um total de 60 amostras representativas de alimentos fornecidos à eqüinos foram
coletadas de diferentes estabelecimentos hípicos, localizados nas cidades do Rio de Janeiro e
Seropédica, escolhidos por conveniência de facilidade para obtenção das amostras. O período
total de coletas foi compreendido entre Junho de 2003 a Junho de 2006.
Dentre as amostras coletadas temos: alimentos balanceados completos dos principais
fabricantes e marcas comerciais à disposição no mercado nacional brasileiro; alimentos
balanceados completos fabricados no próprio estabelecimento (“ração batida”); e amostras de
aveia laminada achatada que pode ser utilizada como única fonte de carboidratos da dieta ou
como suplemento em programas nutricionais para cavalos de alta performance.
Quanto aos estabelecimentos hípicos, buscou-se englobar todos os segmentos do
agronegócio eqüestre, dessa forma temos representantes do cavalo militar (Polícia Militar e
Exército), do cavalo de trabalho (de lida com o gado bovino) e do cavalo de esporte/lazer em
todos os seus níveis, desde o cavalo submetido à atividade física leve, até o cavalo de alta
performance (Grande Prêmio).
A partir das amostras primárias (40kg), foram coletadas sub-amostras (1kg) das
porções superior, intermédia e inferior das embalagens onde o alimento estava armazenado.
Estas sub-amostras foram homogeneizadas e quarteadas para obter-se uma amostra
representativa de 1kg (amostra de laboratório). A amostra de laboratório foi inteiramente
triturada, homogeneizada e quarteada para obter-se duas sub-amostras de análise (prova e
contra-prova), as quais foram armazenadas a 4ºC até o seu uso.
3.2 Determinação da micoflora
A enumeração quantitativa de fungos filamentosos em unidades formadoras de
colônias por grama de alimento (UFC g
-1
) foi realizada segundo metodologia de diluição
decimal seriada em placas descrita por Pitt; Hocking (1997), conforme a seguir: agitou-se em
liquidificador, em copo estéril, 10 gramas da amostra em 90 mL de água destilada. Este
diluente foi escolhido por ser deletério para as leveduras, já que o objetivo neste trabalho era
o de recuperar a micobiota fúngica filamentosa dos substratos (ICMSF, 1986). A partir desta
diluição inicial (10
-1
) prepararam-se diluições decimais seriadas até 10
-4
. Inoculou-se (em
triplicata) alíquotas de 0,1 ml de cada uma das diluições em três meios de cultivo: agar
dicloran rosa de bengala cloranfenicol (DRBC) (PITT; HOCKING, 1997); agar dicloran
glicerol a 18% (DG18) (HOCKING; PITT, 1980) e o Nash Snyder agar (NSA) (NELSON;
TOUSSOUN; MARASAS, 1983). As placas foram incubadas a 25º C por cinco a sete dias
em estufas microbiológicas com controle eletrônico de temperatura. Todas as placas foram
observadas diariamente, selecionando-se para enumeração aquelas que continham em torno
de 10 a 100 UFC g
-1
.
27
Figura 10- Esquema de diluição de amostra e contagem padrão de unidades formadoras
de colônias (UFC g
-1
).
3.3 Isolamento e identificação fúngica
A identificação, em nível de gênero, de todas as colônias consideradas como
diferentes foi realizada segundo Samson et al. (2000), de acordo com suas características
macro e microscópicas. As colônias fúngicas identificadas como Aspergillus e Penicillium
foram subcultivadas em tubos inclinados de agar extrato de malte (MEA) e as de Fusarium
utilizaram agar V-8 (V8) para a posterior identificação em espécies.
As cepas de fungos isoladas foram então identificadas segundo as chaves taxonômicas
apropriadas de cada grupo particular: Klich (2002) para o gênero Aspergillus, Pitt (1988) para
o gênero Penicillium e Nelson; Toussoun; Marasas (1983), com modificações, para espécies
pertencentes ao gênero Fusarium.
A classificação de Aspergillus spp. foi baseada na semeadura padrão em três meios
básicos (Figura 11): agar Czapek extrato de levedura (CYA); agar Czapek extrato de levedura
sacarose a 20% (CY20S) e agar extrato de malte (MEA). Foi preparada uma suspensão de
conídios a partir de cada cepa, em 0,5 mL de meio agar semi-sólido (0,2% de agar-agar e
0,05% de Tween 80
TM
, distribuído em tubos microtubos, esterilizados por autoclavação a
120ºC por 15 minutos). A seguir, introduziu-se uma alça de platina em forma de agulha na
suspensão de conídios inoculando-a nos meios de cultivo.
1 mL
10
-
1
10
-
2
10
-
3
10
-
4
0,1 mL
DRBC, DG18 e NSA em
triplicata
28
40
CYA 25° CYA 37° MEA 25° CY20S 25°
Figura 11- Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero Aspergillus nos
meios CYA, MEA e CY20S em duas condições de temperaturas.
A chave proposta para Penicillium spp. foi baseada na semeadura em três meios
básicos como: CYA; MEA e G25N (Figura 12); para maior eficiência e aproveitamento do
sistema, certas placas de Petri foram inoculadas com duas cepas diferentes a serem testadas
(PITT, 1988); a preparação do inóculo e inoculação nos meios de cultivo foi igual à utilizada
para Aspergillus spp.
Figura 12- Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero Penicillium a
serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N em três regimes de temperatura (5, 25
e 37° C).
Fonte: PITT (1988).
As colônias de Fusarium spp. foram semeadas para cultivo monospórico nos meios
agar folhas de bananeira (BLA), modificando a metodologia original que utiliza o meio agar
folhas de cravo (CLA) e no meio agar batata dextrose (PDA), em tubo inclinado. As colônias
foram incubadas por 7 dias a 24°C obedecendo fotoperíodo de 12 horas de luz branca e 12
horas de luz negra (Figura 13). O cultivo monospórico consiste em recolher pequena
1
1
1 1 1
1
1
1
1
1
1
1
29
quantidade de micélio da colônia subcultivada e agitá-lo em tubo com cerca de 10 mL de água
destilada estéril. O conteúdo é então vertido sobre placa contendo agar água a 2% e
homogeneizado em movimentos em forma de “8” sobre a bancada. O sobrenadante é
descartado e a placa é incubada a temperatura ambiente inclinada em ângulo aproximado de
45º. Após período aproximado de 12 horas, as placas são examinadas através de lupa em
busca de conídios germinados isolados. Um único conídio por vez é então recortado e
transferido para os meios indicados.
Figura 13- Esquema de incubação das cepas do gênero Fusarium nos diferentes meios de
cultivo até sua identificação final.
3.4 Caracterização do perfil toxígeno das espécies isoladas
As espécies pertencentes às seções Flavi e Nigri do gênero Aspergillus e cepas de P.
citrinum isoladas foram analisadas quanto a capacidade toxígena por cultivo em agar leite de
coco (CAM), em placas de Petri de 90mm (LIN; DIANESE, 1976). Posteriormente, as placas
foram incubadas à temperatura de 25ºC por sete dias. As placas foram examinadas no sexto e
sétimo dias em Cromatovisor Prodicil
MR
equipado com lâmpada de radiação ultravioleta de
30 watts com comprimento de onda de 365 nm, onde verificou-se a presença ou não de halo
de fluorescência no meio.
Após a verificação de fluorescência, todas as placas, tanto as de colônias positivas
como as negativas, tiveram seu conteúdo completamente raspado e triturado em gral e pistilo
juntamente com 30 mL de clorofórmio para a extração da toxina. O macerado foi filtrado
obtendo-se o extrato clorofórmico que a seguir foi concentrado, a um volume final de
aproximadamente 2 mL, em rotavapor acoplado com banho maria a 40ºC. Os extratos foram
testados qualitativamente através de TLC para confirmação dos resultados obtidos por CAM.
Foram empregadas placas de 20x20 cm de sílica gel 60 com 0,2 mm de espessura.
Estas placas foram previamente ativadas por 60 minutos em temperatura de 130ºC. Foram
aplicados 5 µL de cada extrato e dos padrões em pontos eqüidistantes. Após o
desenvolvimento por 50 minutos em cromatotanque saturado, a cromatoplaca foi observada
em cromatovisor sob radiação UV de λ=365nm, para evidenciação das manchas fluorescentes
características.
Colônia crescida em NSA
Subcultivo em meio V8
Cultivo Monospórico
BLA
PDA
Incubação:
7 dias a 24ºC
luz branca 12h
luz negra 12h
Classificação
30
42
3.5 Detecção e quantificação de AFB
1
e FB
1
por ELISA
Foram utilizados kits comerciais desenvolvidos e produzidos pela Beacon Analytical
Systems Inc. (Portland, Maine – EUA). O kit Beacon em placa utiliza o método de ELISA
competitivo indireto para análise quantitativa das micotoxinas.
A toxina foi extraída da amostra agitando-a com metanol e água, conforme as
instruções do fabricante para cada tipo de micotoxina (BEACON, 2008a,b). O extrato obtido
foi filtrado e depois testado através do imunoensaio. O conjugado micotoxina-HRP-enzima
foi pipetado nos poços, seguido dos calibradores ou extratos de amostras. Em seguida,
pipetou-se a solução de anticorpo anti-micotoxina para iniciar a reação. Durante um período
de incubação de 10 minutos a toxina na amostra compete com o conjugado micotoxina-HRP-
enzima por um número limitado de anticorpos anti-toxina que por sua vez se ligarão aos
anticorpos secundários que estão imobilizados no interior dos poços. Passado o período de
incubação, o conteúdo dos poços foi descartado e os mesmos foram lavados para remoção de
qualquer conjugado ou toxina que não tenha se ligado ao anticorpo. Um substrato foi
adicionado nos poços e qualquer conjugado micotoxina-HRP-enzima ligado aos anticorpos
converteu a solução à cor azul. Seguindo uma incubação de 10 minutos, a reação foi
interrompida e a intensidade da cor de cada poço foi lida. As amostras de cores desconhecidas
foram comparadas com as cores dos calibradores e a concentração de toxina das amostras foi
obtida.
Resultados semiquantitativos foram obtidos por simples comparação das absorvâncias
das amostras com a dos calibradores. Amostras contendo cores mais claras que um poço de
calibrador tiveram uma concentração de toxina maior que a do calibrador. Amostras que
contiveram cores mais escuras tiveram uma concentração menor que a do calibrador. Uma
interpretação quantitativa requereu um gráfico das absorvâncias dos calibradores (eixo X)
vezes o logaritmo da concentração dos mesmos (eixo Y). Uma linha reta foi traçada através
dos pontos dos calibradores e as absorvâncias das amostras foram inseridas nesta linha. O
ponto correspondente do eixo Y foi a concentração da amostra em questão.
Os calibradores (padrões) de AFB
1
utilizados no kit corresponderam a 0, 2, 8, 20 e 80
µg/L (ppb), e para FB
1
foram 0, 0,3, 1, 3 e 6 µg/mL (ppm).
3.6 Detecção e quantificação de AFB
1
por HPLC
Utilizou-se a metodologia de extração de micotoxinas proposta por Soares; Rodriguez-
Amaya (1989). O extrato clorofórmico obtido foi evaporado até secura, sendo acondicionado
em frasco âmbar, e armazenado em freezer até a etapa de purificação.
Para purificação dos extratos foram utilizados colunas de imunoafinidade (Figura 14)
desenvolvidas e produzidas pela Beacon Analytical Systems Inc. (Portland, Maine – EUA)
(BEACON, 2008c). O extratos secos foram ressuspendidos em 1 mL de clorofórmio e seu
volume foi totalmente passado pelas colunas em uma taxa de 1 gota por segundo. A seguir, as
colunas foram lavadas com 2 mL de água e eluídas com 1 mL de metanol. O extrato eluído foi
recolhido e acondicionado em novo frasco para imediatamente ser submetido à HPLC.
31
Figura 14 – Princípio de purificação das colunas de imunoafinidade.
Fonte: AMADO (2008).
Foi utilizado cromatógrafo líquido de alta eficiência (Waters Associates®, Inc.,
Miliford, M.A. - EUA) equipado com uma bomba Waters (modelo 510) de sistema isocrático,
injetor Rheodyne (Rheodyne®, Cotati, California – EUA) com loop de 20 µL, detector
Merck-Hitachi UV-VIS L-4250 ajustado para comprimento de onda de 350 nm e integrador
Merck Hitachi D-2500. As separações foram desenvolvidas em coluna de sílica (VARIAM™,
Wallnut Crek, CA – EUA) de 150 x 4,6 mm i.d., de partícula com 5 µ de diâmetro. O padrão
de AFB
1
(Sigma Co, St. Louis - EUA), foi calibrado segundo a metodologia descrita no
manual de métodos oficiais de análises da AOAC (1990). Depois de diluído e quantificado
(10,4 µg mL
-1
) por espectrofotômetro Shimadzu mod. 2001 (Shimadzu Co.®, Kyoto, Japão),
o padrão foi armazenado em frasco âmbar e mantido em freezer a –18ºC. A fase móvel para
HPLC em fase normal foi acetato de etila: n-hexano (3: 2,5 - v/v), com fluxo de 1,5 mL/min.
Foram feitas diluições seriadas do padrão e análise no cromatógrafo líquido de alta eficiência
para se obter a curva de calibração, de onde foram extraídos os limites de detecção e de
quantificação da técnica.
3.7 Análises estatísticas
As análises dos dados foram realizadas por análise de variância (ANOVA). Todos os
dados foram transformados usando a função logarítmica log10 (x + 1) antes da ANOVA. O
teste de Duncan foi utilizado na comparação dos dados de enumeração fúngica nos diferentes
meios de cultivo, e o teste LSD de Fisher foi o escolhido para a comparação dos dados de
quantificação das micotoxinas. As análises foram conduzidas usando o programa
computacional PROC GLM em SAS (SAS Institute, Cary, NC).
32
44
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- Contaminação fúngica
A carga fúngica contaminante feita através da enumeração dos propágulos fúngicos e
expressa por unidades formadoras de colônia por grama de amostra analisada (UFC g
-1
) está
apresentada na tabela 4.
Tabela 4- Contagem total dos fungos filamentosos isolados de alimentos fornecidos à
eqüinos.
Contagem de propágulos fúngicos (UFC g
-1
)
AB
Meios de Cultivo
Alimentos
DRBC DG18 NSA
Aveia achatada
1,3 x 10
5
± 1,3 x 10
5 a
(1,0 x 10
4
a 4,8 x 10
5
)
1,5 x 10
5
± 1,5 x 10
5 a
(4,0 x 10
4
a 3,8 x 10
5
)
7,8 x 10
4
± 7,8 x 10
4 a
(1,0 x 10
4
a 2,0 x 10
5
)
Ração batida
6,7 x 10
5
± 1,1 x 10
6 a
(4,0 x 10
4
a 3,0 x 10
6
)
7,4 x 10
4
± 3,2 x 10
4 ab
(3,0 x 10
4
a 1,0 x 10
5
)
3,6 x 10
5
± 3,6 x 10
5 a
(ND
a 8,0 x 10
5
)
Rações esforços
Leves
9,3 x 10
4
± 3,2 x 10
5 b
(ND
a 1,7 x 10
6
)
1,7 x 10
5
± 7,1 x 10
5 bc
(ND
a 3,8 x 10
6
)
8,6 x 10
3
± 2,5 x 10
4 b
(ND
a 1,0 x 10
5
)
Rações esforços
moderados
1,1 x 10
3
± 1,9 x 10
3 b
(ND
a 6,0 x 10
3
)
3,8 x 10
3
± 6,0 x 10
3 c
(ND
a 2,2 x 10
4
)
4,8 x 10
2
± 8,2 x 10
2 b
(ND
a 3,0 x 10
3
)
Rações esforços
intensos
1,3 x 10
3
± 2,9 x 10
3 b
(ND
a 1,0 x 10
4
)
2,3 x 10
3
± 5,8 x 10
3 c
(ND
a 2,0 x 10
4
)
3,0 x 10
3
± 8,9 x 10
3 b
(ND
a 3,0 x 10
4
)
A
valores das médias ± desvio padrão.
B
intervalo dos valores máximos e mínimos.
ND não detectado. Limite de detecção da técnica: 10
2
UFC g
-1
.
a
médias com mesma letra nas colunas são equivalentes, de acordo com o teste de Duncan: DRBC e NSA (P =
0,0001), DG18 (P < 0,001).
O meio DRBC utilizado para contagem geral é o que melhor expressa a qualidade
higiênica dos alimentos, pois permite que a micobiota presente no alimento tenha condições
ideais de crescimento. Assim, os resultados mostram que as maiores contaminações foram
33
apresentadas por amostras de aveia laminada e ração batida, e as menores, pelas de rações
comerciais. A sigla GMP refere-se a uma coletânea de recomendações de boas práticas
fabricação, de modo a padronizar os produtos do setor de alimentação animal quanto aos
teores máximos permitidos para diversos contaminantes. O limite máximo para assegurar a
qualidade higiênica dos produtos é de 1,0 x 10
4
UFC g
-1
(GMP, 2008) e na tabela 5 estão
apresentados os percentuais de amostras acima deste valor.
Tabela 5- Percentual de amostras contaminadas acima dos limites recomendados.
Alimentos DRBC DG18 NSA
Aveia achatada 80 % 100 % 80 %
Ração batida 100 % 100 % 80 %
Rações esforços leves 26 % 33 % 11 %
Rações esforços moderados 0 15 % 0
Rações esforços intensos 0 10 % 10 %
O meio DG18 é seletivo para fungos xerofílicos, ou seja, aqueles que suportam
crescimento em baixas a
w
. Percebemos que todas as amostras de aveia e de ração batida
apresentaram altas contagens neste meio, o que constitui um alto potencial de risco, já que
neste grupo estão incluídos dois dos principais gêneros toxígenos, como Aspergillus e
Penicillium. Isso indica que, quando o fungo encontrar condições ambientais adequadas, ele
poderá proliferar e produzir toxinas e isso é comum nos casos de armazenagem imprópria em
lugares quentes e úmidos.
O meio NSA é seletivo para fungos do gênero Fusarium. Trata-se de um fungo
fitopatógeno, que em geral infecta os cereais ainda no campo. Diversos tratamentos químicos
e físicos (tais como extrusão e peletização) são utilizados no processamento de rações, com o
objetivo de incrementar a eficiência de sua utilização, aproveitando melhor o potencial do
animal. Estes processos melhoram a eficiência alimentar devido à combinação da umidade,
calor e pressão, que gelatinizam ou rompem a estrutura das partículas dos alimentos,
melhorando assim a utilização dos nutrientes.
A maioria dos autores concorda que a peletização diminui a carga bacteriana e
microbiana das rações, evitando a deterioração dos nutrientes e transmissão de patógenos.
Estudo realizado em 1995 (GIMENO, 2008), avaliando uma ração para leitões peletizada a
100°C com uma pressão de 1 a 2 kg/cm
2
, concluíram que o processo empregado pode reduzir
a carga bacteriana inicial ao redor de 6 vezes e em 20 vezes a carga máxima em relação a
ração farelada. A peletização a 100°C elimina a presença de coliformes na ração e pode
reduzir a carga inicial de proteolíticos em mais de sete vezes. Os fungos podem ser reduzidos
em 15 vezes sua carga inicial e em sete vezes sua carga máxima na ração peletizada. Estes
dados comprovam os nossos resultados onde foi observada diferença significativa entre as
contagens dos alimentos comerciais para os não-comerciais em todos os meio de cultivo. Não
foi observada diferença significativa entre os alimentos não-comerciais e as amostras de
rações esforços leves no meio de cultivo DG18; isso pode ser em parte explicado pela
qualidade das matérias-primas utilizadas neste tipo de formulação; muitas indústrias utilizam
neste segmento de rações grãos de cereais que apresentam algum tipo de dano, pois estes são
adquiridos por um preço mais barato; e deixam para utilizar aqueles grãos perfeitos e intactos
para as formulações mais caras.
Ressalta-se ainda o fato de que as micotoxinas, geralmente apresentam grande
estabilidade química, o que permite a sua persistência no alimento, mesmo após a remoção
34
46
dos fungos pelos processos de industrialização. Outro aspecto importante da ação dos fungos
é o impacto sobre o valor nutricional das matérias primas utilizadas na elaboração de rações,
causando empobrecimento energético dos grãos (CHELKOWSKY, 1991).
4.2- Determinação da micobiota
Foram isoladas 293 cepas fúngicas pertencentes a seis gêneros filamentosos, além da
ordem Mucorales, conforme figura 15. Os fungos dos gêneros Aspergillus e seus teleomorfos
(43%), Penicillium e seus teleomorfos (26%) e Fusarium (11%) foram os mais freqüentes na
micoflora isolada. Estes gêneros englobam a grande maioria das espécies citadas na literatura
como produtoras de micotoxinas.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Aspergillus e
teleomorfos
Penicillium e
teleomorfos
Fusarium Cladosporium Mucorales Alternaria Moniliella
Gêneros Fúngicos
Freqüência de Isolamento (%)
Figura 15- Freqüência (%) de gêneros fúngicos isolados dos alimentos destinados à
eqüinos.
Devido à escassez de dados na literatura sobre a avaliação micotoxicológica de rações
destinadas ao consumo eqüino, iremos relacionar este estudo com investigações realizadas em
diferentes matérias primas e com rações terminadas de outras espécies animais, onde o milho
seja ingrediente básico na dieta. Assim, Rosa et al. (2006) e Oliveira et al. (2006)
encontraram resultados similares aos nossos quando estudaram a micobiota toxígena de
produtos vegetais e rações destinadas à alimentação de frangos de corte em quatro fábricas de
rações do Estado do Rio de Janeiro. Estes autores observaram que o gênero Aspergillus, foi o
mais freqüente (41%), seguido por Penicillium sp. (40%) e Fusarium sp. (15 %), dentre
outros.
Também foram similares aos nossos, os estudos de monitoramento micológico
realizados na Argentina em amostras de rações para frangos de corte, as quais foram coletadas
durante dois anos de diferentes fábricas. Estas também demonstraram a presença destes três
35
gêneros toxígenos como os mais freqüentes; além disso, foram isoladas em menor
porcentagem, espécies dos gêneros Cladosporium (Prancha 1) e Alternaria (Prancha 2), entre
outros (DALCERO et al. 1997, 1998; MAGNOLI et al. 2002). Os gêneros Aspergillus,
Penicillium e Fusarium também foram reportados como os mais ocorrentes em amostras de
rações para suínos e coelhos daquele país (MAGNOLI et al. 2005, GONZÁLEZ- PEREYRA
et al. 2008). Na Argentina, as rações peletizadas de frangos e suínos contém
aproximadamente 60% de milho. E nas rações para coelhos, o milho é substituído por alfafa,
aveia e cevada, de acordo com a disponibilidade no mercado. Estas amostras aproximam-se
muito, portanto, dos ingredientes utilizados em rações para eqüinos.
Neste estudo, treze espécies de Aspergillus foram identificadas nas amostras
analisadas, além do estado teleomórfico Eurotium sp., conforme figura 16 e pranchas 3 a 11.
O A. niger foi a espécie mais freqüente (27%), seguido pelo A. flavus (25%), que é citado
como potencial produtor de AFB
1
e AFB
2
. Outro fungo de importância isolado foi o A.
ochraceus, que juntamente com o A. niger são citados na literatura como potenciais
produtores de OTA em países de climas tropical e subtropical (ABARCA et al., 2001;
MAGNOLI et al., 2007).
O estudo anteriormente citado com rações para suínos na Argentina encontrou A.
flavus, A. niger e A. parasiticus como os mais isolados, com freqüências de isolamento de até
14%, 8% e 6%, respectivamente. Fraga et al. (2007) analisaram amostras de milho e de rações
para os diferentes estágios de criação de frangos de corte no Estado do Rio de Janeiro. A.
flavus, A. candidus e espécies de Eurotium foram as mais observadas nas amostras de milho e
ração inicial. Já nas amostras de ração de terminação, os mais freqüentes foram novamente A.
flavus, espécies de Eurotium e A. niger, além de A. sydowii e A. versicolor. Percebemos que
todos os fungos citados foram isolados em diferentes porcentagens no nosso trabalho, com
exceção de A. parasiticus, o qual só esteve presente nos trabalhos argentinos; fato este
interessante já que a ecofisiologia de A. flavus e A. parasiticus é muito similar (PITT;
HOCKING, 1997).
0
4
8
12
16
20
24
28
A
. nige
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A
.
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A. candidus
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fo
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A.
syd
o
wi
i
A. terreus
Espécies Fúngicas
Densidade relativa (%)
Figura 16- Densidade relativa (%) de espécies de Aspergillus em alimentos destinados
à eqüinos.
36
48
Quanto ao gênero Penicillium, treze espécies foram identificadas neste estudo, além de
uma cepa do gênero Eupenicillium, sua forma teleomórfica, conforme figura 17 e pranchas 12
a 18. P. corylophilum foi a espécie mais freqüente (19%), seguido por P. fellutanum (14%).
Em geral, grande variedade de espécies deste gênero, têm sido isoladas de diferentes rações
para animais (ROSA et al. 2006; MAGNOLI et al., 2005). Espécies biverticiladas e
terverticiladas pertencentes aos subgêneros Furcatum, Biverticillium e Penicillium são as mais
freqüentes. As espécies P. funiculosum, P. citrinum, P. simplicissimum, P. commune, P.
brevicompactum e P. raistrickii são potenciais produtoras de metabólitos secundários tóxicos,
como: patulina, citrinina, ácidos penicílico, ciclopiazônico e micofenólico, além de toxinas
tremorgênicas, respectivamente (PITT; HOCKING, 1997). A presença destas cepas em rações
animais implica em elevado risco, pois a maioria destes compostos já tiveram sua toxicidade
demonstrada em experimentos com animais (LACEY, 1990).
0
3
6
9
12
15
18
21
P
.
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E
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u
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.
Espécies Fúngicas
Densidade relativa (%)
Figura 17- Densidade relativa (%) de espécies de Penicillium em alimentos destinados
à eqüinos.
A única espécie de Fusarium isolada foi F. verticillioides (100%). Fusarium verticillioides, F.
proliferatum e F. subglutinans são as espécies mais comumente associadas com a
contaminação do milho e seus produtos derivados. F. verticillioides está associado à doenças
que ocorrem em todos os estágios de desenvolvimento do cultivo de milho, infectando raízes,
caules e grãos. Este fungo não só é o mais comum patógeno do milho, mas está também entre
os fungos mais encontrados em plantas assintomáticas. Ele é quase que um companheiro
constante do cultivo de milho e suas sementes (MUNKVOLD; DESJARDINS, 1997).
37
4.3- Perfil toxígeno: habilidade como produtor
Dentre as cepas de Penicillium citrinum isoladas, todas revelaram fluorescência
amarelada e foram capazes de produzir citrinina quando cultivadas em CAM e confirmadas
por TLC. Quanto as cepas de A. niger, 30% se mostraram fluorescentes, de coloração
esverdeada e foram ocratoxígenas (OTA), enquanto que 25% das cepas de A. flavus
produziram uma fluorescência azulada (Prancha 19) e foram aflatoxígenas (AFB
1
e AFB
2
).
A presença de espécies aflatoxígenas e ochratoxígenas evidencia a necessidade de
serem aprofundadas as pesquisas; seria importante manter o estudo na tentativa de quantificar
OTA e citrinina, já que encontram-se presentes cepas produtoras. Percebe-se que a
determinação da micoflora é de grande importância porque pode prover informações sobre as
micotoxinas que potencialmente estariam presentes na amostra.
4.4- Análises micotoxicológicas
4.4.1- Fumonisina B
1
A análise por ELISA indicou contaminação por FB
1
em cerca de 75% das amostras; na
figura 18 podemos verificar o nível de contaminação por cada tipo de alimento e na tabela 6
observamos as médias obtidas. Vale ressaltar que 100% das amostras de ração batidas
apresentaram contaminação e nos níveis mais elevados. Foi obtido um bom coeficiente de
determinação para o kit, R
2
=0,98, conforme figura 19.
Fusarium verticillioides e F. proliferatum, são os dois principais produtores de FBs.
Estas duas espécies são as de maior importância e reconhecidas por infectarem com
freqüência cultivos de milho em todo o mundo (MARASAS et al, 1984; ROSS et al, 1990;
NELSON, 1992). Isso explica em parte porque as culturas de aveia não exibem níveis altos,
as quais em geral, conforme citação na literatura, apresentam contaminação mais elevada de
citrinina e tricotecenos.
Com respeito às rações terminadas, estudos conduzidos por Dupuy et al. (1993)
demonstraram a termoestabilidade desta micotoxina diante dos diferentes tratamentos
térmicos a que é submetido este cereal na fabricação de alimentos. Outros autores citam que a
FB
1
tem uma meia vida aproximada de 10 min a 150ºC, 38 min a 125ºC, 175 min a 100ºC, e 8
h a 75°C (DOKO; VISCONTI, 1994; DOMBRINK-KURTZMAN et al., 2000). Este fato
pode explicar porque há uma diferença significativa nos níveis de contaminação das amostras
de ração batida, que não sofrem nenhum tratamento térmico, para as amostras de rações
comerciais, submetidas a peletização e/ou extrusão. Entretanto, como os próprios autores
indicam, não há destruição completa da molécula de FB
1
, apresentando níveis residuais que
necessitariam de outros processos de detoxificação.
38
50
4,8
8,5
3
0,22
0,17
0,31
0
3
7,5
0,24
0
20
40
60
80
100
aveia ração batida ração
esforços
leves
ração
esforços
moderados
ração
esforços
intensos
Porcentagem de amostras
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
FB
1
µg g
-1
contaminadas
não
contaminadas
valores mínimos
de FB1
valores máximos
de FB1
Figura 18- Níveis de contaminação de FB
1
quantificados através de ELISA, nas
diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
Tabela 6- Média e desvio padrão dos níveis de FB
1
quantificados através de ELISA, nas
diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
FB
1
(µg g
-1
ou ppm)
Alimentos
média ± desvio padrão
Aveia achatada 0,05
± 0,11
a
Ração batida 5,05
± 1,80
b
Rações esforços leves 0,75
± 0,96
a
Rações esforços moderados
1,24
± 2,53
a
Rações esforços intensos 1,40
± 1,11
a
a
médias com mesma letra nas colunas são equivalentes, de
acordo com o teste LSD de Fisher (P ≤ 0,05).
39
y = -1,3725x + 1,7765
R
2
= 0,9862
-0,20
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Absorvância (450nm)
Log
10
concentraçóes
Calibradores
Amostras
Lineal (Calibradores)
Figura 19- Regressão linear do kit ELISA para quantificação de FB
1
.
4.4.2- Aflatoxina B
1
Somente duas amostras foram negativas para aflatoxinas; as amostras de aveia
apresentaram a menor média, enquanto que as de ração esforços leves a maior, conforme
figura 20. O valor da média e desvio padrão dos demais substratos estão representados na
tabela 7 e nos mostram que não houve diferença significativa entre os alimentos analisados.
Também foi obtido um bom coeficiente de determinação neste kit, R
2
=0,98 (Figura 21).
Tabela 7- Média e desvio padrão dos níveis de AFB
1
quantificados através de ELISA,
nas diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
AFB
1
(µg Kg
-1
ou ppb)
Alimentos
média ± desvio padrão
Aveia achatada 1,99
± 2,71
a
Ração batida 4,92
± 5,74
a
Rações esforços leves 10,17
± 20,06
a
Rações esforços moderados
7,19
± 9,96
a
Rações esforços intensos 8,27
± 4,20
a
a
médias com mesma letra nas colunas são equivalentes, de
acordo com o teste de LSD de Fisher (P ≤ 0,05).
40
52
99,4
38,1
15
2,9
2,5
0,8
0,5
0,9
14,8
6,7
0
20
40
60
80
100
aveia ração batida ração
esforços
leves
ração
esforços
moderados
ração
esforços
intensos
Porcentagem de amostras
0
20
40
60
80
100
120
AFB
1
µg kg
-1
contaminadas
não
contaminadas
valores mínimos
de AFB1
valores máximos
de AFB1
Figura 20- Níveis de contaminação por AFB
1
quantificados através de ELISA, nas
diferentes categorias de alimentos fornecidos à eqüinos.
y = -2,6808x + 3,4561
R
2
= 0,9832
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Absorvância (450nm)
Log
10
das concentraçóes
Calibradores
Amostras
Lineal (Calibradores)
Figura 21- Regressão linear do kit ELISA para quantificação de AFB
1
.
41
93%
2%
5%
amostras abaixo dos limites
20 ppb: limite UE para alimentaçáo animal
50 ppb: limite Brasil para alimentaçáo animal
Estudos mostram que temperaturas acima de 150ºC são necessárias para se conseguir
destruição parcial da molécula; os resultados dependerão ainda da interação de diversos
outros fatores como: tipo de alimento, carga inicial contaminante, tempo/temperatura de
exposição, entre outros. As aflatoxinas apresentam altas temperaturas de decomposição,
variando entre 237°C a 306°C (HAMEED, 1993; RUSTOM, 1997). Percebemos com isso que
as aflatoxinas são e continuarão sendo um grande problema enquanto não forem atingidas
medidas de controle antes da colheita e pós-colheita. Antes da colheita devem-se utilizar
variedades de cereais mais resistentes e boas práticas agrícolas; e a contaminação pós-colheita
pode ser minimizada com boas práticas na secagem, separação dos grãos, transporte e
armazenamento.
Nossos resultados indicam que 93% das amostras analisadas estiveram abaixo dos
limites máximos permitidos pela legislação atual (Figura 22). As leis brasileiras permitem
níveis de até 50 ppb de aflatoxinas totais nas matérias primas utilizadas para alimentação
animal (MAPA, 1988), porém a implicação na saúde humana, os efeitos na saúde dos
eqüinos, assim como os prejuízos econômicos da contaminação dos alimentos por
micotoxinas, geram necessidades urgentes de que esta legislação, que já é muito antiga, seja
revista e de que se estabeleçam mecanismos de controle capazes de serem atingidos níveis
muito mais baixos. Os atuais limites máximos regulamentados na União Européia (EU, 2001)
são mais restritivos: 20ppb de aflatoxinas totais, trazendo fortes implicações econômicas para
os países exportadores, como o Brasil, que vêm enfrentando sérias dificuldades para manter e
alcançar novos mercados.
Figura 22- Percentual de amostras dos alimentos destinados à eqüinos, contaminadas
segundo cada legislação.
2 rações esforços leves e
1 esforços moderados
1
raç
ão
esforços
leves
42
54
Após curva de calibração da técnica de HPLC utilizada em nossas amostras, foram
obtidas as seguintes referências: Limite de detecção = 1 ppb; Limite de quantificação = 3 ppb;
Recuperação média para AFB
1
= 88%; e Tempo de retenção médio = 3,2 min.
Para comparação entre os resultados de AFB
1
quantificados através de ELISA e de
HPLC utilizamos a correlação de Pearson, obtendo cerca de 70% de similaridade. Percebe-se
com isso que, a metodologia de ELISA é muito rápida e prática, permitindo a avaliação de
grande número de amostras em curto período de tempo e sem requerimento de técnicos
especialistas no manuseio do equipamento; sendo, portanto de fundamental serventia aos
profissionais/proprietários a campo que necessitam de um diagnóstico rápido, para que se
estabeleçam medidas de proteção ao plantel. Entretanto, quando se busca uma avaliação
precisa, com grande confiança dos níveis de contaminação, deve-se utilizar o método de
HPLC.
Existiu uma co-ocorrência de FB
1
e AFB
1
em 72% das nossas amostras analisadas,
fato este agravante já que a FB
1
interage com a AFB
1
acelerando o processo de formação do
câncer hepático em animais de experimentação (GELDERBLOM et al., 2002). Estudos
desenvolvidos em frangos, indicam efeitos aditivos destas duas micotoxinas (KUBENA et al.,
1995), enquanto em outro estudo os autores concluíram que somente a AFB
1
manifestava seus
efeitos (WEIBKING et al., 1994). Em suínos, as pesquisas indicam efeitos sinérgicos
(HARVEY et al., 1995).
43
5- CONCLUSÕES
Os alimentos fornecidos aos eqüinos encontram-se contaminados por diversas espécies
potencialmente toxígenas, elevando o risco da ocorrência de micotoxicoses de evolução
crônica.
Os tratamentos térmicos a que são submetidos os alimentos durante seu beneficiamento e
industrialização reduzem consideravelmente a carga microbiana total quando
comparados com amostras “naturais”.
AFB
1
e FB
1
foram co-ocorrentes nas amostras, todavia este tema é bastante controverso e
não há descrição dos efeitos desta interação na espécie eqüina. Bem como a interação
com outras micotoxinas, já que também se encontravam presentes espécies produtoras de
citrinina e o OTA.
A metodologia mais adequada na detecção e determinação de micotoxinas nos alimentos
será a combinação do ELISA com o HPLC, destinando-se as colunas de IAC à
purificação das amostras.
O ELISA poderá ser utilizado para uma detecção rápida e quantificação de várias amostras
ao mesmo tempo; e a IAC/HPLC poderá ser utilizada para a análise quantitativa das
amostras positivas nas quais deseje-se obter maior especificidade e um limite de detecção
mais baixo. O TLC servirá perfeitamente para os casos onde apenas a análise qualitativa/
semiquantitativa, seja suficiente.
44
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1
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52
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1
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1
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SYDENHAM, E.W.; NELSON, H.A.; ROSS, P.F. A mycological evaluation and in vivo
toxicity evaluation of feed from 41 farms with equine leukoencephalomalacia. Journal
of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 2, n. 4, p. 352-354, 1990.
54
66
ANEXO
A - PRANCHAS FOTOGRÁFICAS
Página
Prancha 1: Características microscópicas de Cladosporium sp. 56
Prancha 2: Características microscópicas de Alternaria sp. 56
Prancha 3: Características macroscópicas de Aspergillus niger isolado de alimentos
destinados à eqüinos.
57
Prancha 4: Características macroscópicas de Aspergillus flavus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
57
Prancha 5: Características macro e microscópicas de Aspergillus ochraceus isolado
de alimentos destinados à eqüinos.
58
Prancha 6: Características macroscópicas de Aspergillus fumigatus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
58
Prancha 7: Características macroscópicas de Aspergillus caespitosus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
59
Prancha 8: Características macroscópicas de Aspergillus ustus isolado de alimentos
destinados à eqüinos.
59
Prancha 9: Características macroscópicas de Aspergillus sydowii isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
60
Prancha 10: Características macroscópicas de Aspergillus terreus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
60
Prancha 11: Cleistotécio: estrutura característica de Eurotium sp. Estado
teleomórfico do gênero Aspergillus.
60
Prancha 12: Características macroscópicas de Penicillium corylophilum isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
61
Prancha 13: Características macroscópicas de Penicillium felutanum isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
61
Prancha 14: Características macroscópicas de Penicillium funiculosum isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
62
Prancha 15: Características macroscópicas de Penicillium canescens isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
62
Prancha 16: Características macro e microscópicas de Penicillium citrinum isolado
de alimentos destinados à eqüinos.
63
Prancha 17: Características macroscópicas de Penicillium simplicissimum isolado
de alimentos destinados à eqüinos.
63
Prancha 18: Características macroscópicas de Penicillium commune isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
64
Prancha 19: Fluorescência azulada obtida a partir de uma cepa de Aspergillus
flavus.
64
55
Prancha 1- Características microscópicas de Cladosporium sp.
Prancha 2- Características microscópicas de Alternaria sp.
56
68
Prancha 3- Características macroscópicas de Aspergillus niger isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 4- Características macroscópicas de Aspergillus flavus
isolado de alimentos destinados à eqüinos.
CYA 25ºC
CYA
37
ºC
CY
20S
25ºC
ME
A 25ºC
CYA 25ºC
CYA
37
ºC
CY
20S
25ºC
ME
A 25ºC
57
Prancha 5- Características macro e microscópicas de Aspergillus ochraceus
isolado de alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 6- Características macroscópicas de Aspergillus fumigatus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
CY
20S
25ºC
1000x
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
CY
20S
25ºC
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
58
70
Prancha 7- Características macroscópicas de Aspergillus caespitosus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 8- Características macroscópicas de Aspergillus ustus isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
CYA
37
ºC
CY
20S
25ºC
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
CY
20S
25ºC
59
Prancha 9- Características macroscópicas de Aspergillus sydowii isolado de alimentos
destinados à eqüinos.
Prancha 10- Características macroscópicas de Aspergillus terreus isolado de alimentos
destinados à eqüinos.
Prancha 11- Cleistotécio: estrutura característica de Eurotium sp. Estado teleomórfico
do gênero Aspergillus.
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
CY
20S
25ºC
60
72
Prancha 12- Características macroscópicas de Penicillium corylophilum isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 13- Características macroscópicas de Penicillium felutanum isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
61
Prancha 14- Características macroscópicas de Penicillium funiculosum isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 15- Características macroscópicas de Penicillium canescens
isolado de alimentos destinados à eqüinos.
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
62
74
Prancha 16- Características macro e microscópicas de Penicillium citrinum
isolado de alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 17- Características macroscópicas de Penicillium simplicissimum
isolado de alimentos destinados à eqüinos.
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
63
Prancha 18- Características macroscópicas de Penicillium commune isolado de
alimentos destinados à eqüinos.
Prancha 19- Fluorescência azulada obtida a partir de uma cepa de
Aspergillus flavus.
CYA 25ºC
ME
A 25ºC
G25N
25ºC
64
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