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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
VETERINÁRIA
Avaliação da resposta de neutrófilos em gatos naturalmente
infectados pelo vírus da leucemia felina (FeLV) e
caracterização de redes extracelulares de neutrófilos (NETs)
em felinos.
AMANDA BRITO WARDINI
Sob a Orientação da Professora
Lucia Helena Pinto da Silva
e Co-orientação da Professora
Maria das Graças Miranda Danelli
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2009
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre
em Microbiologia Veterinária, no
Curso de Pós-Graduação em
Microbiologia Veterinária.
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UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos
636.80896
W256a
T
Wardini, Amanda Brito, 1983-
Avaliação da resposta de
neutrófilos em gatos naturalmente
infectados pelo vírus da leucemia
felina (FeLV) e caracterização de
redes extracelulares de neutrófilos
(NETs) em felinos. / Amanda Brito
Wardini – 2009.
48f. : il.
Orientador: Lucia helena Pinto
da Silva.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Curso de Pós-Graduação
em Microbiologia Veterinária.
Bibliografia: f. 39-48
1. Gato - Doenças – Teses. 2.
Leucose em animais – Teses. 3.
Leishmaniose – Teses. I. Silva,
Lucia helena Pinto da, 1975-. II.
Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro. Curso de Pós-Graduação
em Microbiologia Veterinária. III.
Título.
Bibliotecário: _______________________________
Data: ___/___/______
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AGRADECIMENTOS
Ao longo da minha vida e da realização deste trabalho pessoas muito especiais
estiveram ao meu lado:
Aos meus pais, pela educação, carinho, dedicação e amor. Por estarem sempre ao meu lado,
pelo exemplo de homem e mulher que vocês representam para mim.
Aos meus queridos irmãos e melhores amigos Érica e Júnior. Por todo carinho, apoio e
preocupação. Sei que estarão sempre ao meu lado.
A minha tia Cristina que por tantas vezes esteve sempre pronta a ajudar nos momentos em
que precisei.
A minha madrinha Ângela pelo incentivo e apoio principalmente nos momentos finais.
A Professora e amiga Lucia por esses dois anos de orientação feitos com tanta dedicação e
carinho, pelos ensinamentos e paciência.
A Professora e amiga Graça Danelli que me acompanha desde o início da graduação, e foi de
fundamental importância na minha formação científica.
A Aline pela sua amizade sincera e verdadeira esteve sempre presente nas coletas com os
gatos mais bravos, por ficar até tarde da noite no laboratório quando eu precisava.
Ao Professor Carlos Mazur pelas palavras de apoio nos momentos de aflição e pelos
ensinamentos durante seis anos que trabalhamos juntos.
A todo o pessoal do Laboratório de Viroses Veterinária, Nadia, Natália e Lilian, minhas
estagiárias que também contribuíram para a realização desse trabalho, Verônica e Isabela.
A Professora Elvira Saraiva, do Laboratório de Imunobiologia das Leishmanioses da UFRJ, e
aos seus estudantes Anderson, Michele e Deivid pela contribuição e colaboração para a
realização deste trabalho.
RESUMO
WARDINI, Amanda Brito. Avaliação da resposta de neutrófilos em gatos naturalmente
infectados pelo vírus da leucemia felina e caracterização de redes extracelulares de
neutrófilos em felinos (NETs). 2009. 48p Dissertação (Mestrado em Microbiologia
Veterinária). Instituto de Veterinária, Departamento de Microbiologia e Imunologia
Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2009.
O vírus da leucemia felina (FeLV) é um patógeno de grande importância em medicina
veterinária, que afeta felinos no mundo todo. A infecção pelo FeLV leva a desordens
proliferativas e degenerativas. A mais devastadora conseqüência da doença é a síndrome da
imunodeficiência, que afeta a funcionalidade de células da imunidade inata e adaptativa,
tornado esses animais suscetíveis a infecções oportunistas. O objetivo do nosso estudo foi
avaliar os parâmetros clínicos e hematológicos de animais FeLV-, FeLV+ assintomáticos e
sintomáticos naturalmente infectados; caracterizar e quantificar a formação de redes
extracelulares de neutrófilos (NETs) em felinos, assim como comparar a capacidade
microbicida e fagocítica dos neutrófilos desses grupos na infecção pelo protozoário
Leishmania in vitro. Nossos resultados mostraram que os animais FeLV+ sintomáticos
apresentavam desordens clínicas relacionadas a infecção por FeLV e a principal alteração
hematológica encontrada nesses animais foi anemia e linfopenia. Os animais FeLV+
assintomáticos estavam clinicamente saudáveis, porém linfopenia foi observada em alguns
animais. A formação de NETs em neutrófilos felinos estimulados com o protozoário
Leishmania foi caracterizada tanto por microscopia óptica quanto por imunofluorescência. As
NETs liberadas pelos neutrófilos felinos também são compostas de DNA e histona de forma
semelhante as descritas em neutrófilos humanos, bovinos, peixes. Nenhuma alteração da
capacidade fagocítica nos neutrófilos dos animais FeLV + foi observada quando comparada
aos animais FeLV-. Entretanto, a função microbicida dos neutrófilos dos animais FeLV+
sintomáticos estava comprometida, já que os neutrófilos desses animais não controlaram a
infecção por Leishmania in vitro, assim como não foi observado um aumento da quantidade
de NETs liberada após estímulo com o parasita quando comparado com os neutrófilos dos
animais FeLV- e/ou FeLV+ assintomáticos. Os neutrófilos dos animais FeLV+ assintomáticos
ainda possuem mecanismos que controlam a infecção in vitro e liberam NETs de forma
semelhante aos dos animais não infectados. A análise dos linfóctios mostrou um aumento da
porcentagem de CD8
+
nos animais FeLV+ sintomáticos e a relação CD4
+
/CD8
+
apresentou
diminuição nos animais FeLV+. A partir dos resultados podemos concluir que a infecção por
FeLV afeta funcionalidade de células imunes e essa imunossupressão causada pelo FeLV
pode levar os animais a susceptibilidade a doenças oportunistas semelhantes aos humanos
infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). A urbanização e o aumento do
número de casos de leishmaniose assim como o aparecimento de casos de leishmaniose felina
sugerem que a infecção por FeLV possa contribuir para que esses animais se tornem
suscetíveis a leishmaniose e potencias reservatórios desta zoonose.
Palavras-chave: Vírus da leucemia felina, NETs, Leishmaniose.
ABSTRACT
WARDINI, Amanda Brito. Evaluation of immune response of neutrophils in naturally
feline leukemia virus infected cats and characterization of feline neutrophil extracellular
traps (NETs). 2009. 48p. Dissertation (Master Science in Veterinary Microbiology) Instituto
de Veterinária, Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica , RJ, 2009. 67p.
The feline leukemia virus (FeLV) is a pathogen of great importance in veterinary
medicine that affect cats in worldwide. The FeLV infection leads to proliferative and
degenerative disorders. The most devastating consequence of the disease is the
immunodeficiency syndrome, which affects as innate immune cells as adaptative immune
cells, becoming these animals susceptible to opportunist infections. The aim of our study was
to evaluate clinical and hematological parameters on naturally acquired FeLV infection,
characterize and quantify neutrophils exrtacellular traps (NETs) on felines, as well as,
compare the phagocytic and microbicide functions of neutrophils during Leishmania protozoa
infection in vitro. Our results showed that FeLV+ symptomatic animals had clinical disorders
related to FeLV infection. The main hematological disorder observed was anemia and
lymphopenia. FeLV+ asymptomatic animals were clinically healthy, however, lymphopenia
was also observed. The release of neutrophil extracellular traps on felines was characterized
by optical and fluorescence microscopy. Feline NETs are composed of DNA and histone
similar to human, bovine and fish NETs. It was not observed any alteration on phagocytic
capacity of neutrophils from FeLV+ animals compared to FeLV- ones. However, neutrophils
microbicide function of FeLV+ symptomatic animals was committed, since these animals did
not control Leishmania in vitro infection. In addition FeLV+ symptomatic neutrophils did not
increase NETs release when stimulated with parasite compared to neutrophils from FeLV+
asymptomatic and/or FeLV- animals. Neutrophils from FeLV+ asymptomatic animals still
have mechanism, which are able to control Leishmania infection in vitro and release NETs in
a similar way to neutrophils from FeLV- animals. Lymphocytes analysis showed an increase
on percentage of CD8
+
cells on FeLV+ symptomatic animals and a reduction on CD4
+
/CD8
+
ratio on FeLV+ animals. In conclusion FeLV infection affects immune cells functions and this
immunossupression leads to susceptibility to opportunists’ infections similar to human
infected with human immunodeficiency virus (HIV). The urbanization and the increase on
leishmaniasis cases as well as the appearance of feline leishmaniasis reports suggest that
FeLV infection could contribute to feline leishmaniasis and FeLV+ animals could be potential
reservoir of this zoonose.
Keywords: Feline leukemia virus, NETs, Leishmaniasis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: “Immunoblot” para proteína de p24 do vírus da imunodeficiência felina
(FIV)..............................................................................................................
Figura 2: Índice endocítico, neutrófilos purificados de animais FeLV-, FeLV+
assintomáticos e FeLV+ sintomáticos incubados com promastigotas de Leishmania
amazonensis in vitro.............................................................................
Figura 3: Caracterização das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) felinos
por microscopia óptica.............................................................................................
Figura 4: Caracterização das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) felinos
por microscopia de fluorescência.............................................................................
Figura 5. Caracterização das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) felinos
por microscopia de fluorescência na ausência ou presença de DNAse ..................
Figura 6. Quantificação das NETs no sobrenadante de neutrófilos purificados de
animais FeLV-, FeLV+ assintomáticos e FeLV+ sintomáticos...............................
Figura 7. Comparação da quantidade de NETs no sobrenadante de neutrófilos
purificados de animais FeLV- , FeLV+ assintomáticos e FeLV+ sintomáticos na
ausência ou presença de Leishmania ......................................................................
Figura 8. Análise dos linfócitos T de sangue periférico dos animais FeLV-,
FeLV+ assintomáticos e sintomáticos.....................................................................
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28
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................
2 REVISÃO Bibliográfica.....................................................................................
2.1.1 Vírus da leucemia felina........................................................................
2.1.2 Estrutura do vírus..................................................................................
2.1.3 Subgrupos do FeLV...............................................................................
2.1.4 Transmissão............................................................................................
2.1.5 Fases da infecção....................................................................................
2.1.6 Imunidade...............................................................................................
2.1.7 Categorias de infecção...........................................................................
2.1.8 Desordens clínicas associadas a uma viremia persistente..................
2.1.9 Imunossupressão....................................................................................
2.2 Neutrófilos.................................................................................................
2.3 Rede Extracelular de Neutrófilos............................................................
2.4 Leishmaniose.............................................................................................
2.4.1 Ciclo de vida...........................................................................................
2.4.2 Papel dos neutrófilos na infecção por Leishmania..............................
2.4.3 Leishmaniose felina................................................................................
3 MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................
3.1 Animais......................................................................................................
3.2. Parâmetros clínicos analisados...............................................................
3.3. Hemograma.............................................................................................
3.4. Imunoblot para diagnóstico do vírus da imunodeficiência felina.......
3.5 Purificação das células mononucleares e granulócitos..........................
3.6 Parasitas.....................................................................................................
3.6.1. Cultivo in vitro.......................................................................................
3.7 Ensaios imunológicos................................................................................
3.7.1 Fagocitose...............................................................................................
3.7.2. Sobrevivência........................................................................................
3.7.3 Citometria de Fluxo...............................................................................
3.8 Caracterização das redes extracelular em neutrófilos felinos............
3.8.1 Por microscopia óptica..........................................................................
3.8.2 Por Imunofluorescência.......................................................................
3.8.3 Quantificação das NETs........................................................................
4 RESULTADOS .................................................................................................
4.1 Immunoblot para o Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV)...............
4.2 Avaliação Clínica......................................................................................
4.3 Parâmetros Hematológicos......................................................................
4.4 Ensaios imunológicos................................................................................
4.5 Caracterização e Quantificação das Redes Extracelulares de
neutrófilos...............................................................................................................
4.6 Citometria de Fluxo..................................................................................
5 DISCUSSÃO .....................................................................................................
01
02
02
02
02
03
03
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04
05
05
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16
18
18
18
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28
6 CONCLUSÕES .................................................................................................
7 ANEXOS ............................................................................................................
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
34
35
39
1
1 INTRODUÇÃO
O vírus da leucemia felina (FeLV) é a principal causa de morte não acidental entre os
felinos. A infecção pelo FeLV tem como conseqüência: imunossupressão, anemias e
desordens proliferativas como linfomas e leucemia. A síndrome da imundeficiência felina
(FAIDS) é fatal e similar a AIDS humana, desta forma a infecção por FeLV é uma doença de
importância veterinária e serve como modelo, sob determinados aspectos, para neoplasias,
anemias e imunodeficiências humanas. Os animais infectados pelo FeLV podem permanecer
por longos períodos assintomáticos. Os animais infectados e doentes possuem uma
expectativa de vida curta e desenvolvem doenças relacionadas ao FeLV graves e fatais.
Os neutrófilos são células da resposta imune inata e desempenham um papel
importante na eliminação de diversos micro-organismos. Vários estudos com neutrófilos
felinos infectados pelo FeLV demonstraram uma deficiência na capacidade fagocítica e
microbicida dessas células. Animais persistentemente infectados se tornam imunossuprimidos
e assim, estão mais suscetíveis a infecções oportunistas.
Recentemente um novo mecanismo microbicida foi descrito em neutrófilos
denominado “neutrophil extracellular traps” (NETs). Esse novo mecanismo envolve um
processo de morte celular distinta de necrose e apoptose, onde o conteúdo nuclear e granular é
lançado para o meio extracelular. Essas redes possuem a capacidade de ligar e matar
patógenos. As NETs já foram descritas em neutrófilos humanos, bovinos e de peixes
estímulados por bactérias, fungos, protozoários, IL-8, PMA ou LPS.
A leishmaniose é considerada pela Organização Mundial de Saúde uma das principais
doenças infecto-contagiosas de maior relevância, com grande impacto na saúde pública
mundial. Os cães desempenham um papel fundamental como reservatório da Leishmania em
áreas urbanas endêmicas. Porém, estudos sorológicos foram realizados em diversas partes do
mundo para entender melhor o papel da população felina na epidemiologia da doença. No
Brasil já foram relatados diversos casos de leishmaniose felina nas cidades do Rio de Janeiro,
São Paulo, Belo Horizonte e no estado do Mato Grosso do Sul. Fatores como desmatamento,
crescimento urbano desordenado, e a facilidade de mobilização por humanos e animais podem
contribuir para o surgimento de novos hospedeiros para leishmaniose. Desta forma não se
pode descartar a possibilidade de felinos servirem como potencial reservatório do parasita.
O objetivo geral do nosso estudo foi avaliar e comparar a resposta imunológica dos
animais naturalmente infectados pelo FeLV nas fases sintomática e assintomática da doença
na infecção por Leishmania amazonensis in vitro.
No intuito de alcançar tal objetivo, traçamos as seguintes metas:
• Avaliar clinicamente os animais FeLV+ e não infectados, considerando as alterações
clínicas causadas pelo FeLV.
• Comparar a capacidade fagocítica e microbicida dos neutrófilos dos animais
infectados e/ou não infectados pelo FeLV
• Analisar a porcentagem de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
, assim como, a relação
CD4
+
/CD8
+
através da citometria de fluxo.
• Caracterizar a formação de NETs em neutrófilos felinos estimulados pelo parasita
Leishmania amazonensis in vitro.
• Comparar e quantificar a liberação de NETs em neutrófilos felinos in vitro de
animais não infectados e/ou infectados pelo FeLV.
2
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.1 Vírus da leucemia felina
O vírus da leucemia felina (FeLV) é um gammaretrovírus da família Retroviridae
subfamília Oncornaviridae, de transmissão horizontal com distribuição mundial, que afeta
gatos domésticos e, esporadicamente, gatos selvagens (DANIELS et al., 1999,
LEUTENEGGER et al., 1999). Foi descrito pela primeira vez em 1964, por Willian Jarret em
um estudo sobre o aparecimento de linfomas em uma colônia de gatos (JARRET et al., 1964).
A incidência da infecção está diretamente associada à densidade da população felina e ao
modo de vida dos animais. A incidência entre os animais sadios é de aproximadamente 5%,
porém é particularmente elevada entre os animais doentes (11,3% a 19,4%) (BRALEY,
1994).
2.1.2 Estrutura do vírus
O FeLV é um vírus RNA de fita simples, possui a enzima transcriptase reversa que
permite ao vírus realizar uma cópia de DNA do seu material genético, que logo é inserido no
material genético do hospedeiro. Desta forma, o vírus pode estabelecer infecções persistentes.
Seu core interno é formado por uma proteína de capsídeo p27 e é recoberto por um envelope
com duas glicoproteínas principais, a gp70 de superfície, que está envolvida na ligação a
célula hospedeira e a p15E, uma proteína transmembrana responsável por quadros de
imunossupressão (CANEY, 2000; LINENBERGER e ABKOWITZ, 1995). Os gatos que
produzem altos títulos de anticorpos contra a gp70 estão geralmente protegidos contra a
viremia persistente e as enfermidades associadas ao FeLV (CANEY, 2000). Anticorpos para
p27 não impedem a viremia, acredita-se que os complexos imunes de antígeno p27-anticorpo
sejam importantes na patogênese da doença imunomediada em gatos infectados (BARR,
1998). Esta proteína está presente em grande quantidade no plasma de gatos persistentemente
infectados, a detecção deste antígeno é útil para detectar a infecção pelo FeLV.
2.1.3 Subgrupos do FeLV:
A habilidade de o vírus levar a um processo denominado de interferência por
superinfecção, onde a célula infectada passa a não expressar o receptor viral e assim fica
impedida de ter novos ciclos de infecção, permitiu a identificação de 4 subgrupos de FeLV
(SARMA e LOG, 1973). O FeLV é transmitido horizontalmente e causa ambas doenças
imunossupressivas e neoplásicas em gatos infectados. O FeLV-A, um vírus monotrópico, é o
mais encontrado em gatos naturalmente infectados, por essa razão é considerado a forma mais
transmissível do FeLV. Este vírus utiliza a proteína transportadora de tiamina (feTHTR1)
como receptor celular (RUSSEL e JARRETT, 1978, MENDONZA et al., 2006). As infecções
crônicas pelo FeLV-A nos gatos aumentam as chances de mutações no gene que codifica as
proteínas de envelope levando ao desenvolvimento de novos subgrupos virais que
reconhecem novos receptores celulares. (OVERBAUGH et al., 2001; ROHN e
OVERBAUGH, 1999). A partir da recombinação do provírus de FeLV-A, integrado ao DNA
celular do hospedeiro com seqüências retrovirais endógenas incompletas, presentes no
genoma felino e normalmente nunca expressas, podem formar o FeLV-B, que utiliza para sua
entrada na célula hospedeira duas proteínas transportadoras de fosfato, fePit1 e fePit2
(ANDERSON et al., 2001; TAKEUCHI et al., 1992). O FeLV-B está presente em
aproximadamente 40% dos isolamentos e sempre com o FeLV-A, o que aumenta o poder
patogênico deste último e está frequentemente associado à linfossarcomas. Especula-se, que o
3
subgrupo FeLV-C seja resultante de mutações que ocorrem no sítio de ligação ao receptor, na
região hipervariável 1 do gene que codifica a proteína do envelope viral (gp70) do FeLV-A
(ROJKO e HARDY, 1994; VERBRAT et al., 1983). Essas mutações levam o FeLV-C a
utilizar como receptor funcional a proteína transportadora heme FLVCR (QUINGLEY et al.,
2000). Encontrado em 1% a 2% dos casos está associado à aplasia ou hipoplasia eritróide da
medula óssea, tendo como resultado uma anemia grave, frequentemente, um prognóstico
reservado (CANEY, 2000). O FeLV-T assim como o FeLV-B também utiliza o receptor
fePit-1, porém ele necessita de uma segunda proteína do hospedeiro como co-receptor
denominada FELIX (CHENG et al., 2007 ). FELIX é uma proteína expressa principalmente
no tecido linfóide, o que explica o tropismo limitado desse subgrupo por células T in vitro
(LAURING et al., 2001).
2.1.4 Transmissão:
A principal forma de transmissão do FeLV é por contato oronasal entre um gato
infectado, que elimina o vírus pela saliva, urina e fezes, e um suscetível (ROJKO e HARDY,
1994; ROMATOWSKI e LUBKIN, 1997). O FeLV está presente em outros líquidos
corporais incluindo lágrima, leite e plasma, a transmissão pode ocorrer pelo leite e pela
placenta. Os filhotes que escapam da infecção via útero ou leite provavelmente se tornarão
virêmicos pelos cuidados de limpeza da gata matriz (AUGUST, 1992). Geralmente, os
animais adquirem o vírus pela saliva infectada, facilitada pelo contato íntimo e contínuo entre
os animais, por meio de brigas, ou com material contaminado (vasilhas de água e comida,
caixa de micção e defecação), principalmente em locais, onde a densidade populacional dos
animais é alta. O FeLV também pode ser transmitido pelo uso de materiais contaminados
como instrumentos e agulhas e/ou por transfusão sanguínea (JARRET e HOISE, 2006).
A patogenia da infecção pelo FeLV é dependente de uma série de fatores do hospedeiro
e do vírus que determinam, se um gato exposto ao FeLV se tornará persistentemente virêmico
ou se recuperará. Entre os fatores virais podemos citar a dose viral, a virulência da linhagem
viral e duração da exposição ao vírus. Em relação ao hospedeiro, a fase da vida em que o
animal é exposto afeta drasticamente o resultado da infecção. Os gatos infectados entre os 4 e
5 meses de vida são mais suscetíveis à infecção pelo FeLV, após esse período os animais
desenvolvem resistência a doença e a probabilidade de se infectarem é significativamente
menor (JARRET e HOISE, 2006).
2.1.5 Fases da infecção:
A infecção por FeLV pode ser dividida em 6 fases: Fase 1 (um a sete dias): após a
exposição de um gato ao FeLV, a replicação inicial do vírus se dá no epitélio faringiano em
especial nos macrófagos e linfócitos B tonsilares. Essas células são carreadas para os
linfonodos submandibulares, onde ocorre a replicação local (ROJKO e HARDY, 1994).
Fase 2 e 3 (dois a quatorze dias): esta fase é caracterizada pela viremia associada a
células mononucleares, que facilita a distribuição do FeLV para outros sítios, infectando as
células em divisão dos tecidos linfóides, levando a uma infecção linfóide sistêmica (ROJKO
E HARDY, 1994).
Fase 4 (duas a quatro semanas): esta é a fase mais crítica da infecção. O tropismo do
FeLV por células em rápida divisão nos centros dos folículos linfóides, nas criptas do epitélio
intestinal e nas células progenitoras da medula óssea pode levar a infecção intestinal e
hemolinfática. (ROJKO e HARDY, 1994). Se a replicação viral ocorrer de maneira rápida e
resultar em altos títulos virais, o sistema imune não controla de forma eficiente à infecção. A
competência do sistema imune do animal nesta fase é que determinará a conseqüência final da
4
infecção, os gatos que responderem de maneira adequada podem desenvolver infecções
latentes, extintas ou seqüestrada (ROJKO e HARDY, 1994).
Fase 5 (quatro a seis semanas): nesta fase neutrófilos, plaquetas e linfócitos FeLV
positivos (FeLV+) originados de células precursoras da medula óssea infectadas são liberados
para a corrente sanguínea, caracterizando uma viremia persistente. Cerca de 30% dos gatos
expostos ao vírus evoluem para a viremia persistente (ROJKO e HARDY, 1994).
Fase 6 (seis semanas a anos): ocorre infecção dos tecidos glandulares e epiteliais
garantindo a excreção de partículas infecciosas na saliva, urina e lágrimas (ROJKO e
HARDY, 1994).
2.1.6 Imunidade:
A proteção conferida aos animais após exposição ao FeLV possui caráter tanto humoral
quanto celular. Os anticorpos vírus-neutralizantes se dirigem contra as proteínas de envelope e
transmembrana, gp70 e p15-E, respectivamente (RUSSEL e JARRET, 1978; NICK et al.,
1990). Os animais que se recuperam da infecção pelo FeLV apresentam altos títulos de
anticorpos, filhotes nascidos de gatas imune ao FeLV podem permanecer protegidos por
transferência passiva de anticorpos maternos por 2 a 3 meses de vida (JARRET et al., 1977).
Para a resposta imune contra o FeLV ser eficaz é necessário que o hospedeiro elimine o
vírus livre no plasma, assim como as células infectadas. A resposta imune envolve tanto a
participação de anticorpos quanto de linfócitos T. A imunidade mediada por células é
responsável pela rápida remoção de células infectadas pelo vírus, devido ao aparecimento dos
linfócitos T citotóxicos (LT CD8
+
) no sangue dos gatos dentro de 1 a 2 semanas após a
infecção (JARRET E HOISE, 2006). Os LT CD8
+
vírus-específico também são importantes
na imunidade protetora vacinal. Altos títulos dessas células são encontrados no sangue e
tecido linfóide de gatos protegidos pela vacina FeLV-DNA ou naqueles que se recuperam de
uma infecção natural (HANLON et al., 2001; FLYNN et al., 2000). A fase da vida em que o
animal se infecta é um outro fator de grande importância, que contribui para uma resposta
imune eficaz contra o vírus. Acredita-se que a susceptibilidade para o FeLV é idade
dependente, gatos acima de quatro meses se tornam menos susceptíveis à infecção, a
capacidade dos macrófagos, das células “natural killer” (NK), do sistema complemento e da
produção de anticorpos estão mais desenvolvidas (ROJKO E HARDY, 1994).
2.1.7 Categorias de infecção:
Após exposição ao vírus, os gatos podem ser classificados em uma das quatro categorias
de infecção de acordo com a resposta imune produzida.
1) Persistentemente virêmicos: ocorrem em cerca de 30% dos gatos infectados e estes
animais não possuem anticorpos neutralizantes (BARR, 1998). Nestes casos a resposta imune
do animal não é capaz de impedir a multiplicação viral permitindo a progressão por todas as
seis fases da infecção. Tanto o vírus livre quanto o vírus associado às células estão presentes
no sangue, havendo disseminação da infecção para tecidos glandulares e epiteliais e liberação
oronasal do vírus (SPARKERS, 1997). Esses animais estão predispostos a morte por doenças
relacionadas ao FeLV em um período de dois a cinco anos.
2) Infecção extinta: os gatos apresentam uma resposta imune eficaz, capaz de eliminar o
vírus e tornam-se resistentes a infecções futuras. Possuem altos títulos de anticorpos vírus
neutralizantes na circulação contra a gp 70 (SOUZA e TEIXERA, 2003).
3) Viremia transitória (latente): ocorre quando o gato é infectado, porém não é capaz de
eliminar completamente o vírus. O FeLV não é encontrado no plasma desses animais, por isso
5
não são capazes de transmitir a doença e todos os testes são negativos. A infecção persiste em
baixos níveis dentro do genoma das células e pode durar por meses ou anos (ROJKO e
KOCIBA, 1991). Geralmente esses gatos podem progredir para uma infecção extinta. Não
está descartada a reativação viral em casos de tratamento com altas doses de corticóides,
estresse, doenças bacterianas ou virais (ROJKO e HARDY, 1994).
4) Atípica: um pequeno número de gatos faz uma infecção localizada, a qual é
caracterizada pela replicação viral em determinados tecidos, tais como epitélio mamário,
salivar e urinário, resultando em um baixo nível de proteína p27 no plasma. Os animais com
infecção atípica também podem desenvolver viremia persistente.
2.1.8 Desordens clínicas associadas a uma viremia persistente:
Os sinais clínicos associados à infecção pelo FeLV causam tanto desordens
proliferativas como degenerativas, todas potencialmente fatais. As afecções mais freqüentes
são linfoma (linfossarcoma), leucemia linfóide e mielóide, anemias, imunossupressão,
enterite, supressão da medula óssea e distúrbios reprodutivos. De um modo geral os sintomas
clínicos de gatos virêmicos variam dependendo do tipo de doença e dos órgãos afetados. Os
animais podem apresentar febre, letargia, emagrecimento progressivo, anorexia, mucosas
pálidas, gengivite/estomatite, diarréia e abscessos que não cicatrizam (SOUZA e TEIXERA,
2003).
2.1.9 Imunossupressão:
A mais devastadora conseqüência da viremia pelo FeLV é a síndrome da
imunodeficiência. O FeLV se replica rapidamente nas células em divisão do sistema imune,
incluindo linfócitos, neutrófilos, monócitos, e macrófagos. Anormalidades na resposta imune
humoral e mediada por células já foram descritas. Depressão paracortical dos linfócitos nos
linfonodos e atrofia tímica (ANDERSON et al., 1971; PERRYMAN et al., 1972), diminuição
da blastogênese linfocítica (COCKERELL E HOOVER, 1977), redução na produção de
anticorpos para antígenos timo-dependentes em animais naturalmente infectados, tornando
esses susceptíveis à infecções oportunistas (TRAININ et al., 1983; WERNICKE et al., 1986).
Um estudo realizado em gatos infectados experimentalmente com a quimera FeLV-FAIDS
61E/C demonstrou que na fase pré-clínica da imunideficiência as células T CD4
+
são as
primeiras a serem afetadas (14 semanas após a infecção). Os linfócitos T CD8
+
e B
permanecem normais, sofrendo queda na fase mais avançada da doença. Na fase clínica foi
observada perda progressiva de peso, anemia arregenerativa, diarréia intermitente, e infecções
oportunistas foram observadas em 50% dos gatos infectados (QUACKENBUSH et al., 1990)
O início da doença clínica é precedido pelo acúmulo de DNA viral não integrado na medula
óssea, linfonodo e intestino (MULLINS et al., 1986).
A susceptibilidade dos granulócitos a infecção pelo FeLV leva a diminuição do número e
função dessas células, o que gera a falha na resposta imune inata desses animais. O principal
mecanismo que leva a neutropenia é o efeito citopático sobre as células precursoras dos
neutrófilos, chamadas de CFU-GM. (HOOVER et al., 1987). As proteínas do FeLV são
expressas pelas CFU-GM, onde a resposta de anticorpos anti-FeLV lisam essas células. Gatos
com infecções persistentes e latentes podem apresentar um número suficiente de neutrófilos
na circulação, porém podem estar com sua função prejudicada (ROJKO e HARDY, 1994).
Importantes mecanismos microbicidas como a fagocitose, ativação de proteína kinase C, do
“burst” oxidativo e a capacidade em gerar peróxido de hidrogênio nos fagolisossomos são
prejudicados nos animais infectados o que explica o aumento de infecções secundárias nos
gatos FeLV+ (LAFRADDO et al., 1986, 1987).
6
2.2 Neutrófilos:
Os granulócitos são células do sistema mielóide derivadas da medula óssea e podem
ser classificados de acordo com as características da coloração de seus grânulos com
hematoxilina e eosina em eosinófilos (vermelho claro); basófilos (azul escuro) e neutrófilos
(rosa).
Os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa contra micro-organismos
invasores, durante uma infecção são as primeiras células a serem recrutadas para o local da
inflamação, onde tem um papel essencial na eliminação dos micro-organismos
(BRINKMANN E ZYCHLISNKY, 2007). São os elementos celulares mais numerosos e
importantes da resposta imune inata. Podem reconhecer, ingerir e destruir vários tipos de
patógenos sem o auxílio da resposta imune adaptativa. Constituem cerca de 60 a 75% dos
leucócitos sanguíneos na maioria dos carnívoros, portanto deficiências na função dos
neutrófilos levam a sérias infecções, fatais se não tratadas (TIZARD, 2002).
No citoplasma dessas células existem três principais tipos de grânulos ricos em
enzimas: os grânulos primários ou azurófilos possuem a enzima mieloperoxidase, proteases
neutras como a elastase e hidrolases ácidas como a ß-glicuronidase e catepsina B; os grânulos
secundários ou específicos são compostos por lisozima e lactoferrina, uma proteína
conjugadora de ferro; e os terciários que contém gelatinase e receptores de superfície
(TIZARD, 2002).
A ligação do patógeno aos receptores de superfície dos neutrófilos leva a fagocitose,
um processo ativo no qual o patógeno é englobado em uma vesícula denominada fagossoma.
Os neutrófilos eliminam os micro-organismos através de mecanismos oxigênio-dependente e
oxigênio-independente. A atividade microbicida oxigênio-dependente envolve a enzima
NADPH oxidase, que unida à membrana do fagossoma transfere dois elétrons para molécula
de oxigênio formando o ânion superóxido (O
2
-
). As moléculas de O
2
-
interagem
espontaneamente com a água e formam peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). Coletivamente, ânion
superóxido, dióxido e peróxido de hidrogênio são chamados se “reactive oxigen species”
(ROS) (HAMPTON et al., 1998; BRINKMANN E ZYCHLISNKY, 2007). Os mecanismos
oxigênio-independente incluem a liberação de enzimas líticas dos grânulos citoplasmáticos,
como as proteínas catiônicas e as defensinas. No fagossoma, o patógeno é exposto a altas
concentrações de ROS e peptídeos antimicrobianos, juntos são responsáveis pela morte dos
micro-organismos (KLEBANOFF, 1999).
2.3 Rede Extracelular de Neutrófilos:
Recentemente foi descrito um novo mecanismo microbicida para neutrófilos
denominado de NETose onde redes extracelulares de neutrófilos,“Neutrophil Extracellular
Traps” (NETs), são capazes de conter e matar alguns microrganismos. Essas redes são
capazes de se ligar às bactérias gram-positivas, gram-negativas assim como fungos e
protozoários. São abundantes nos locais de inflamação, como nos casos de apendicite humana
e em modelos experimentais de shigellosis (BRINKMANN et al., 2004, BRINKMANN E
ZYCHLISNKY, 2007, FUCHS et al., 2007, GUIMARÃES-COSTA, et al. manuscrito
submetido). Este mesmo mecanismo já foi descrito em bovinos afetados por mastite clínica e
subclínica e em peixes (LIPPOLIS et al., 2006; PALIC et al., 2007).
As NETs são estruturas complexas compostas por “filamentos” de aproximadamente
15nm de diâmetro, formados por DNA, histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4), e proteínas
granulares (elastase, mieloperoxidase, catepsina G, lactoferrina, e gelatinase) (BRINKMANN
et al., 2004, BRINKMANN E ZYCHLISNKY, 2007, PALIC´ et al., 2007). Foi demonstrado
que os neutrófilos podem liberar as NETs quando ativados por IL-8, lipopolissacarídeo (LPS),
7
bactéria ou fungo (FUCHS et al., 2007; URBAN et al., 2006). Recentemente, foi mostrado
que o parasita Leishmania, um protozoário intracelular, é capaz de induzir a liberação NETs
em neutrófilos humanos (GUIMARÃES-COSTA, et al., manuscrito submetido).
Cerca de aproximadamente 1/3 dos neutrófilos in vitro liberam NET, essa ativação
envolve receptores semelhantes a Toll (“toll-like receptor” – TLR), citocinas e receptores Fc.
A liberação das NETs se inicia a partir de um processo de morte celular ativo que depende da
ativação da enzima NADPH oxidase e da formação de ROS. Após a ativação da célula e a
formação de ROS, a membrana nuclear se desintegra, o núcleo perde sua característica
lobular, assim como a integridade dos grânulos. O material nuclear se mistura aos
componentes dos grânulos e a NET é liberada quando a membrana celular é rompida por um
processo de morte celular distinto de necrose e/ou apoptose, denominado “NETose”
(BRINKMANN E ZYCHLISNKY, 2007).
Estudos já demonstraram a importância da formação de ROS e NADPH oxidase para a
formação das NETs, a utilização de um inibidor de NADPH oxidase, difenil iodônio (DPI),
impediu a produção de ROS e a formação de NET, em neutrófilos humanos in vitro
estimulados com Staphylococcus aureus ou PMA (FUCHS et al., 2007). Outra evidência que
confirma a importância desta enzima para a liberação de NET é que o acréscimo de catalase
exógena, que degrada H
2
O
2
em oxigênio molecular e água, as culturas de neutrófilos humanos
in vitro bloqueia a formação de NET, enquanto que a adição de um inibidor de catalase tem
um efeito oposto (BRINKMANN E ZYCHLISNKY, 2007). Outra comprovação da
participação de ROS na NETose vem dos estudos realizados com neutrófilos isolados de
pacientes que sofrem de doença granulomatosa crônica (DGC), causada por uma mutação na
enzima NADPH oxidase, onde as células são incapazes de produzir ROS e liberar NET
mesmo sob ativação de PMA. Os neutrófilos desses pacientes também não apresentam as
mudanças morfológicas típicas para a formação da NET como a quebra do envoltório nuclear
e a mistura dos componentes nucleares e granulares no citoplasma da célula. Entretanto, essas
células quando estimuladas com glucose oxidase (GO), que é capaz de gerar peróxido de
hidrogênio exógeno, produzem NETs de forma similar a neutrófilos de pacientes saudáveis
(FUCHS et al., 2007). Nas infecções, a formação de ROS contribui para a morte do patógeno
intrafagossomal, e a morte mediada por NET contribui para morte de patógenos no meio
extracelular (FUCHS et al., 2007).
Em 2008 Baker et al. descreveram a formação de NETs circulantes em crianças com
malária. As estruturas extracelulares foram observadas em esfregaços sanguíneos e eram
formadas de DNA, além disso, apresentavam eritrócitos infectados pelo Plasmodium
falciparum aderidos à rede. A formação de NET em casos de malária parece de grande
importância na patogênese da doença. Sua liberação parece estimular a formação de
anticorpos antinucleares, contribuindo para a uma resposta autoimune falciparum-induzida
(BAKER et al., 2008).
A presença de NETs foi descrita também para outras espécies animais. Palic et al.
(2007) descreveram pela primeira vez em neutrófilos de peixe a liberação de NETs em células
estimuladas com PMA. As imagens obtidas das células estimuladas pelo PMA permitiram
visualizar a presença de DNA e mieloperoxidase nas NETs. Uma outra espécie estudada
foram os bovinos, onde Lipollis et al. (2006) demonstraram a formação de NET em
neutrófilos bovinos estimulados com PMA, demonstrando a importância desse mecanismo no
gado de leite em quadros de mastite clínica.
A formação de redes extracelulares não parece ser um mecanismo microbicida
exclusivo dos neutrófilos. Estudos recentes demonstraram através de microscopia eletrônica e
imunofluorescência a formação de estruturas semelhantes às NETs em mastócitos, compostas
de DNA, histona, peptídeos antimicrobianos como LL37 e triptase. Assim como ocorre na
formação das NETs, a produção dessas redes extracelulares por mastócitos também é
8
dependente de ROS acompanhada por destruição do envoltório nuclear, que podem ser
ativados por PMA, H
2
O
2,
ou patógenos bacterianos (VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE et al.,
2008).
2.4 Leishmaniose:
Em 1885 Cunningham descreveu pela primeira vez os parasitas do gênero Leishmania
e mais tarde em 1900 por Leishman e em 1903 por Donovan. Distribuída mundialmente está
presente em 22 países do Novo Mundo (a maioria em desenvolvimento) e em 66 nações do
Velho Mundo, esta parasitose é considerada pela Organização Mundial de Saúde uma das
principais doenças infecto-contagiosas com grande impacto na saúde pública mundial
(http://www.who.int/emc/diseases/leish/leisgeo1.html). As manifestações clínicas desta
doença podem se apresentar de diferentes formas: lesões cutâneas ulceradas na pele,
inflamação e destruição da mucosa e/ou infecção visceral disseminada (kalazar) (MURRAY
et al 2005). As três manifestações clínicas da doença causam 112.000 mortes por ano, com
incidência anual de 500.000 novos casos ao ano para a forma visceral e 1,5 milhão de casos
para a forma cutânea. (http://www.who.int/tdr/).
Pertencentes a Ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, os parasitas do
gênero Leishmania são dimórficos, encontrados na forma flagelada, extracelular, denominada
promastigota no trato digestivo do inseto-vetor (LAINSON E SHAW, 1987) e a forma
amastigota, caracterizada pela ausência de flagelo livre, se encontra nos macrófagos onde se
multiplica no interior dos vacúolos (ROSSEAU et al, 2001). Os dípteros flebotomíneos, da
família Psychodidae são responsáveis pela transmissão do parasita. Os gêneros Phlebotomus
transmitem as espécies de Leishmania no Velho Mundo, e Lutzomyia as espécies do Novo
Mundo.
Esta doença é causada por 20 espécies de Leishmania com diversas manifestações
clínicas. A leishmaniose cutânea pode ser causada por diversas espécies como L. major, L.
tropica, e L. (L.) aethiopica no Velho Mundo; e no Novo Mundo pelas espécies do complexo
mexicana: L. mexicana, L. (L) amazonenesis, L.(V.) braziliensis, L. (V) panamensis, L. (V)
peruviana, L. (V) guyanensis, L. (V.) lainsoni, L (V.) shawi, L. (V.) naiffi e mais
recentemente, L. (V.) lindenbergi (MURRAY et al., 2005). Caracterizada pelo aparecimento
de lesões nas áreas expostas ao vetor, que podem ser únicas ou múltiplas como pápulas,
nódulos e nódulos ulcerados. Podem sofrer cura espontânea em indivíduos
imunocompetentes. Na leishmaniose muco-cutânea ulcerações progressivas do nariz e boca se
estendem para a faringe e laringe, podendo causar destruição do septo nasal. Essas úlceras não
sofrem cura espontânea e são observadas geralmente meses ou anos depois do primeiro
episódio de leishmaniose cutânea, quando os macrófagos da mucosa naso-orofaringeana são
parasitados. A leishmaniose visceral é causada pela L. (L.) donovani e L. (L.) infantum no
Velho Mundo e L. (L.) chagasi no Novo Mundo. Os principais sintomas são: febre, fadiga,
perda de peso, hepatomegalia, esplenomegalia, dor abdominal, diarréia e aumento dos
linfonodos (CHAPUIS et al., 2007).
2.4.1 Ciclo de vida:
A leishmaniose é o resultado da infecção do hospedeiro mamífero pela Leishmania
através da picada do vetor infectado pelo parasita. Muitas espécies de mamíferos como
roedores, canídeos, humanos são susceptíveis a Leishmania. As espécies de animais
domésticas e selvagens agem como reservatório do protozoário, e a doença nos humanos é
considerada uma zoonose. Os flebotomíneos ao realizarem o repasto sanguíneo no hospedeiro
vertebrado infectado ingerem as formas amastigotas do parasita iniciando o ciclo de vida. No
9
interior da matriz peritrófica, as formas amastigotas se transformam em promastigotas
procíclicas (não-infectantes), possuem corpo celular ovóide e flagelo. Essas formas se
multiplicam ativamente e após o rompimento da matriz peritrófica através da secreção de
quitinase pelos parasitas, eles se ligam às células epiteliais do intestino inserindo o seu flagelo
entre as microvilosidades (SCHLEIN et al, 1991). Após a eliminação dos restos da digestão,
as promastigotas migram para a probóscide, durante essa migração as promastigotas passam
pelo processo de diferenciação chamado metaciclogênese, onde passam de um estágio não-
infectante (procíclico), para um estágio infectante (metacíclico), sendo estas, as formas
transmitidas pelo inseto em um próximo repasto sanguíneo (SACKS et al., 1985).
2.4.2 Papel dos neutrófilos na infecção por Leishmania:
O papel da imunidade mediada por célula e particularmente dos linfócitos nas
infecções por Leishmania está bem estabelecido, porém, o papel dos polimorfonucleares e
principalmente dos neutrófilos ainda é pouco conhecido. (ROUSSEAU et al., 2001). Os
neutrófilos interagem com monócito, células dendríticas, células T e B através do contato
célula – célula ou por secreção de produtos, e estão envolvidos na resposta inflamatória e
reparação dos tecidos (NATHAN, 2006). A habilidade com que os neutrófilos podem
responder a um processo inflamatório agudo, e fagocitar de forma eficiente uma variedade de
patógenos sugere que essas células podem ser o alvo inicial da infecção por Leishmania
(PETERS et al., 2008).
A leishmaniose é iniciada pela picada do flebótomo infectado e deposição das formas
promastigotas na pele do hospedeiro vertebrado. Durante a transmissão do parasita, a picada
gera uma pequena hemorragia nos capilares, essa injúria tecidual produz uma rápida resposta
inflamatória marcada por um infiltrado de neutrófilos no local, seguido por um recrutamento
de macrófagos. Recentemente foi demonstrado, por microscopia de 2 fótons, em
camundongos picados por flebotomíneos, que os neutrófilos são as primeiras células que
chegam ao local da injúria provocada pela picada do inseto. O principal objetivo do neutrófilo
é reparar os danos teciduais, sendo também capaz de fagocitar com eficiência os parasitas
inoculados pelo flebótomíneo (PETERS et al., 2008).
Os polimorfonucleares possuem um tempo de vida muito limitado e entram em
apoptose em aproximadamente 6 a 12 horas. O neutrófilo infectado por Leishmania atrasa o
processo de apoptose por 2 a 3 dias (AGA et al., 2002). Embora a Leishmania possa
sobreviver no neutrófilo, a multiplicação do parasita na célula não é observada e o parasita
permanece em sua forma promastigota (ZANDBERGEN et al., 2004). Coincidentemente, os
neutrófilos se tornam apoptóticos no pico de migração dos macrófagos para o tecido infectado
(SUNDERKO¨TTER et al., 1993). Os neutrófilos apoptóticos liberam fatores quimiotáticos
para os macrófagos como MIP1 β (Macrophage Inflammatory Protein 1-β). A fagocitose
dessas células pelos macrófagos libera mediadores anti – inflamatórios como TGF – β1
(Transforming Growth Factor- β1) e PGE
2
(Prostaglandin E2)
,
que bloqueiam a ativação dos
macrófagos (FADOK et al., 1998; FREIRE-DE-LIMA et al., 2006; VOLL et al., 1997). Os
parasitas utilizam, portanto os polimorfonucleares como células hospedeiras intermediárias e
modulam a apoptose espontânea dessas células e sua capacidade de atrair os macrófagos
(ZANDBERGEN et al., 2004). A ingestão de neutrófilos apoptóticos infectados com
Leishmania pelos macrófagos pode ser, portanto, um meio ideal de entrada do parasita. Este
método de entrada silenciosa do parasita na célula alvo da infecção recebe a denominação
“cavalo de Tróia”, pois nenhum mecanismo microbicida efetor é ativado contra o parasita.
Por outro lado, outros estudos já demonstraram in vivo, que os neutrófilos estão
presentes na fase inicial da infecção nas áreas de destruição dos parasitas (POMPEU et al.,
1991; BEIL et al., 1992) e podem eliminar os parasitas in vitro (CHANG, 1981a; CHANG,
10
1981b) sugerindo que essas células podem estar envolvidas na inibição do crescimento do
parasita. Um mecanismo exato de destruição da Leishmania ainda não está estabelecido. Ao
contrário do que ocorre com as células apoptóticas, a ingestão de neutrófilos necróticos ativa
macrófagos através da liberação de mediadores pró-inflamatórios (SAVILL et al., 2000). A
fagocitose desses neutrófilos necróticos tem a capacidade de estimular MIP -2, IL – 8, TNF –
α (fator de necrose tumoral-α), o que contribui para o controle da carga parasitária (FADOK
et al., 2001).
Ribeiro-Gomes et al. (2004, 2007) demonstrou que a interação da elastase neutrofílica
(NE) com macrófagos na infecção por Leishmania major em camundongos induz a atividade
leishmanicida nos macrófagos de forma dependente de TNF-α. A utilização do anticorpo anti-
TNF-α, extingue completamente a atividade leishmanicida, propiciando o aumento da carga
parasitária in vitro e in vivo. A elastase neutrofílica já foi identificada como indutora do TNF-
α, a inibição da NE também inibe a atividade leishmanicida levando a aumento da carga
parasitária.
Recentemente foi mostrado que os neutrófilos podem migrar para o linfonodo após
infecção com promastigotas de L. major e produzem IL-12 e IFN-gama, importantes citocinas
na diferenciação dos linfócitos T para um fenótipo T “helper” 1 (Th1), que tem um papel
fundamental no controle da infecção por Leishmania (DOS SANTOS et al., 2008). Do mesmo
modo foi mostrado que a depleção de neutrófilos na infecção por L. donovani leva a um
aumento do número de parasitas no baço e na medula óssea. A depleção de neutrófilos no
baço está associada a um aumento na produção de IL-4 e IL-10, citocinas que levam a uma
indução preferencial para a resposta do tipo Th2, que levam a susceptibilidade à doença
(MCFARLANE et al., 2008).
2.4.3 Leishmaniose felina:
Muitas espécies de mamíferos selvagens e domésticos são consideradas reservatórios
do protozoário no ciclo da Leishmania spp. Entre os animais domésticos, os cães estão
envolvidos na transmissão para os seres humanos principalmente nos casos de leishmaniose
visceral por L. chagasi (SIMÕES-MATTOS et al., 2004). Porém, a marcada urbanização das
leishmanioses pode envolver outras espécies domésticas na epidemiologia dos focos
endêmicos (DESJEUX, 2002). Apesar de a leishmaniose felina (LF) ser considerada rara, já
foram descritos diversos casos ao redor do mundo. Até o momento já foram relatados 28
casos de LF sendo 11 (39,3%) no Novo Mundo e 17 (60,7%) no Velho Mundo. Entre os casos
relatados no Novo mundo, dez foram na América do Sul e um na América do Norte no estado
do Texas, Estados Unidos (SIMÕES-MATTOS et al., 2004).
A LF pode ser causada por várias espécies de Leishmania, Passos et al.(1996)
publicaram um caso de infecção natural por Leishmania (Viannia) na região metropolitana de
Belo Horizonte, no estado de Minas Gerais. O animal apresentava uma lesão na região
interdigital, foram observadas raras formas amastigotas na lesão e o PCR confirmou a espécie
do parasita. Em 2004 foram descritos mais dois casos de leishmaniose cutânea no estado do
Rio de Janeiro. Foram observados úlceras e nódulos na face e no plano nasal, com observação
de formas amastigotas nas lesões em um dos gatos, a espécie envolvida foi caracterizada por
PCR como Leishmania (V.) braziliensis (SCHUBACH et al, 2004). No estado do Mato
Grosso do Sul em 2005 foi encontrado um caso de LF por Leishmania (L.) amazonensis, com
lesões nodulares no nariz, orelhas e região interdigital de todas as patas (SOUZA et al 2005).
A forma cutânea difusa da doença foi descrita em um felino no Texas causada por L.
mexicana em 1984, com presença de grandes quantidades de formas amastigotas nas lesões
(BARNES et al., 1993). Um único relato de LF causada por Leishmania (Leishmania) chagasi
foi descrito na cidade de Cotia no estado de São Paulo em 2004, além da lesão nodular no
11
plano nasal que revelou diversas formas amastigotas intra e extracelular, o animal apresentava
perda de peso e aumento dos gânglios linfáticos (SAVANI et al., 2004).
Estudos sorológicos vêm sendo realizados na população felina para o melhor
entendimento do papel desses animais na epidemiologia da doença e sua relação com doenças
imunossupressoras como o vírus da leucemia felina (FeLV) e o vírus da imunodeficiência
felina (FIV). Em um estudo realizado na Espanha a soropositividade dos animais para
anticorpos contra Leishmania foi de 60% nos animais testados, e presença do kDNA da L.
infantum foi detectada em 25,7% dos animais, 36% dos animais positivos na sorologia para
Leishmania eram positivos para o FeLV e a produção de anticorpos contra o parasita nesses
animais parecia estar comprometida (MARTÍN-SÁNCHEZ et al., 2007). Em Jerusalém um
estudo utilizando 106 gatos demonstrou soropositividade para Leishmania infantum em 6,7%
dos animais testados, resultado semelhante aos estudos realizados em cães da mesma região.
Análise do sangue encontrado nos flebótomos dessa região revelou que 20% dos vetores se
alimentavam do sangue de gatos, este contato entre vetor e gato pode ser suficiente para
contribuir com a disseminação da doença (NASEREDDIN et al., 2008). Na região noroeste
do Mediterrâneo um estudo utilizando 445 gatos pesquisou anticorpos específicos para L.
infantum e revelou que 6,29% dos animais testados para ELISA – protA eram positivos e
5,25% eram positivos para o teste de ELISA – IgG (SOLANO-GALLEGO et al., 2007). Os
dados de pesquisas sorológicas para a LF ainda são muito controversos, na Itália testes
utilizando imunofluorescência indireta para pesquisa de anticorpo revelou uma prevalência de
0,9% na região da Toscana e Liguria, no entanto na Sicília foi de 62% (PENISSI et al., 1998).
Baseado nos relatos de casos de LF e nos estudos sorológicos pode-se concluir que a
leishmaniose deve ser incluída no diagnóstico diferencial das dermatites e doenças sistêmicas
nos gatos que residem em áreas endêmicas. Mudanças ambientais, crescimento desordenado,
mobilidade de animais e humanos são fatores que contribuem para mudanças na distribuição
geográfica e incorporação de novos hospedeiros para as leishmanioses. Portanto pode-se
especular que gatos domésticos possuem algumas das propriedades necessárias para servir
como potencial reservatório do parasita Leishmania.
12
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais:
Este estudo foi realizado no Laboratório de Viroses Veterinária na Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro e contou com a colaboração do Laboratório de Imunologia
das Leishmanioses da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Os gatos utilizados neste estudo são de proprietários que autorizaram a utilização de
seus animais nos estudos através da assinatura de um termo de consentimento (Anexo A).
Vinte e sete gatos machos com idade entre 01 ano e 07 anos foram empregados no estudo n =
9/grupo. Os animais foram divididos em três grupos: 01- animais sadios e não infectados, 02-
animais positivos para FeLV assintomáticos, isto é, sem sinais clínicos da doença e 03-
animais positivos para FeLV sintomáticos, apresentando quadro clínico relacionado a
leucemia viral felina. Os animais foram diganósticado como FeLV+ através da realização de
ensaio de imunofluorescência (Kit comercial), para a pesquisa do antígeno p27 em células
sanguíneas. Todos os animais foram testados para o vírus da imunodeficiência felina (FIV)
pela técnica de “immunoblot” com pesquisa de anticorpo contra a proteína p24. Para a coleta
das amostras, os animais foram contidos manualmente, o sangue foi coletado através da veia
cefálica, armazenados em tubos heparinizados a temperatura ambiente até o momento do
experimento. Este estudo está sob avaliação da Comissão de Ética do Instituto de Veterinária
da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro sob processo n° 013837.
3.2. Parâmetros clínicos analisados:
Para cada gato foi preenchida uma ficha com histórico do animal e avaliação de
critérios clínicos como peso, temperatura, apetite, hidratação, avaliação das mucosas,
linfonodos e presença de massas tumorais (Anexo B)
3.3. Hemograma:
Para a realização do hemograma foram utilizadas as amostras coletadas em tubos
heparinizados. A determinação do volume globular foi realizada através da técnica
microhematócrito segundo metodologia descrita por Jain et al. (1993). A contagem de
hemácias, plaquetas e leucócitos foram realizados em hemocitômetro. Hemácias e plaquetas
foram diluídas na proporção 1:200 em solução salina 0,9% e solução de Rees-Ecker,
respectivamente. Os leucócitos foram diluídos na proporção 1:20 em Líquido de Tuerck. Os
esfregaços sanguíneos foram corados pelo método Panótico Rápido e utilizados para a
contagem diferencial de glóbulos brancos por microscopia óptica. A concentração de proteína
plasmática total foi determinada por refratometria. A contagem de reticulócitos foi realizada
em todos os animais que apresentavam anemia, utilizou-se 0, 1 ml de sangue que foi incubado
a 37°C juntamente com 0,1ml do corante Azul de Cresil Brilhante durante vinte minutos.
Posteriormente foram confeccionados esfregaços, e através de microscopia óptica
determinou-se o percentual de reticulócitos em relação ao número de 1000 eritrócitos.
3.4. Imunoblot para diagnóstico do vírus da imunodeficiência felina:
A fim de descartar a possibilidade de possuirmos gatos FIV+ dentro dos grupos
estudados foi feito “immunoblot” para a proteína p24 do vírus da imunodeficiência felina
(FIV). Os controles positivos e negativos eram plasmas provenientes de gatos testados por
13
nested PCR para FIV. Primeiramente, as membranas de nitrocelulose com poros de 0,2 µm
(Bio Rad), contendo a proteína p24 recombinante, foram incubadas com os soros dos animais
diluídos 1:10 em PBS (Phosphate Buffer Saline 0,001M) contendo 5% de leite em pó
desnatado (Molico, Nestlé) por 2 horas sob agitação. Após esse período, as membranas foram
lavadas com PBS tween 0,2% pH 7,2 e incubadas com o conjugado anti– IgG felino (Rivetti,
2006) diluído 1:125 por 1 hora. Seguiram-se duas lavagens em PBS tween 0,2% e uma
lavagem apenas em PBS. A reação foi revelada com solução de Tris 0,15M pH 7,6 e 3,3’ –
Diaminobenzidina (60mg/100mLH
2
O destilada.) (Sigma, Saint Louis, MO).
3.5 Purificação das células mononucleares e granulócitos:
As células mononucleares e os granulócitos foram purificados de sangue periférico por
gradiente de Ficoll Histopaque (Sigma, Saint Louis, MO). Para a purificação dos granulócitos
utilizou-se o Ficoll de densidade 1,119 e para separação dos mononuclares o Ficoll de
densidade 1,007. O sangue total foi dispensado sob o gradiente de Ficoll 1,077 e 1,119. As
células foram centrifugadas a 400 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 – 26°C).
Após a centrifugação o anel de granulócitos, formado entre o Ficoll 1,119 e 1,077, e os
mononucleares, na interface entre o plasma e o Ficoll 1,077, foram coletados separadamente.
As células foram lavadas em PBS a 400 x g por 10 minutos. Após a lavagem, os granulócitos
foram ressuspensos em 1mL de meio RPMI 1640 (Sigma, Saint Louis, MO) e os
mononucleares em 1mL de PBS para a contagem em hemocitômetro. A viabilidade celular
foi avaliada pelo corante vital azul de Trypan
3.6 Parasitas:
3.6.1. Cultivo in vitro:
Promastigotas de L. amazonensis (MHOM /BR/75/Josefa) foram mantidas a 26°C em
meio “Schneider’s Insect Medium” (Sigma, Saint Louis, MO) suplementado com 10% de soro
fetal bovino (Cripion, SP, Brasil) inativado pelo calor e 10% de urina humana. As culturas
foram mantidas por repiques a cada três dias, com inóculo de 5-10% v/v.
Para os experimentos foram utilizadas culturas de fase estacionária com 5 ou 6 dias de
cultivo. As células foram lavadas em PBS a 1.922 xg por 13 min a temperatura ambiente.
Após a lavagem os parasitas foram contados em hemocitômetro.
3.7 Ensaios imunológicos:
3.7.1 Fagocitose:
Neutrófilos (10
5
neutrófilos/ poço).separados em gradiente de densidade foram
plaqueados em lamínulas de vidro de 13 mm
2
pré- tratadas com poli-l-lisina a 0.001% (Sigma,
Saint Louis, MO)em placas de 24 poços. As células foram infectadas com promastigotas de
fase estacionária de L. amazonensis (5 parasitas/ neutrófilo) e incubados a 34°C com 5% de
CO
2
. Após 1 hora, as células foram lavadas em PBS, coradas pelo método Panótico Rápido. O
Índice Endocítico (% de neutrófilos infectados x número de parasitas /neutrófilos) foi obtido
através da contagem de no mínimo 200 células em duplicata.
3.7.2. Sobrevivência:
14
Os neutrófilos purificados foram plaqueados (1 x 10
5
neutrófilos/ poço) em placas de
96 poços e infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis na proporção
parasita:neutrófilo de 5:1. As células foram incubadas a 34°C com 5% de CO
2.
Como controle
positivo, formas promastigotas de fase estacionária foram distribuídas nos poços e mantidas
sob as mesmas condições de incubação. Após 1 hora foi adicionado meio “Schneider’s Insect
Medium” (Sigma, Saint Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cripion,
SP, Brasil) e 10% de urina humana em todos os poços totalizando um volume final de 200uL.
As placas foram mantidas a 26°C por 48 horas. Após esse período, o número de parasitas
viáveis foi contado em hemocitômetro em triplicata e o resultado expresso em % de
sobrevivência em relação ao controle (100%).
3.7.3 Citometria de Fluxo:
A proporção de linfócitos CD4
+
/CD8
+
foi determinada através da citometria de fluxo.
A suspensão de células mononucleares obtidas da purificação em gradiente de densidade foi
ajustada para 10
6
células/mL. As células foram incubadas com 4% de soro de gato por pelo
menos 30 minutos para bloquear ligações inespecíficas. Em seguida foram adicionados os
anticorpos monoclonais (AcMos) anti – CD4 conjugado a isotiocianato de fluoresceína
(FITC;1:20) e/ou anti– CD8 conjugado a ficoeritrina (PE;1:20) (Santa Cruz Biotechnology) e
incubadas por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após a incubação, as células
foram centrifugados a 400 x g por 5 minutos e ressuspensas em 1 mL de PBS com 1%
formalina (Vetec), preservando a 4°C e ao abrigo da luz até o momento da leitura. A análise
dos dados foram realizadas no citômetro de fluxo (BD FACScalibur) empregando o software
Cell-Quest versão 3.3 (Becton & Dickinson – Mountain View, CA, USA) com aquisição de
no mínimo 10.000 eventos para cada amostra.
3.8 Caracterização das redes extracelular em neutrófilos felinos:
3.8.1 Por microscopia óptica:
Lamínulas de vidro de 13 mm
2
em placas de 24 poços para cultura de células foram
tratadas com poli-l-lisina a 0.001% (Sigma, Saint Louis, MO), os neutrófilos separados em
gradiente de densidade foram distribuídos sobre as lamínulas (1 x 10
5
neutrófilos/ poço). As
células foram infectadas com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis
(5parasitas/ neutrófilo) e incubados a 34°C com 5% de CO
2
. Após 1 hora, as células foram
lavadas com PBS, coradas pelo método Panótico Rápido e posteriormente coladas com
entelan (Merck) em lâminas de vidro. A formação das NETs foi observada por microscopia
óptica de campo claro.
3.8.2 Por Imunofluorescência:
Neutrófilos (1 x 10
5
neutrófilos/ poço) purificados foram plaqueados em lamínulas de
vidro de 13 mm
2
pré-tratadas com 0,001% de poli-l lisina em placas de 24 poços (Sigma,
Saint Louis, MO). As células foram infectadas com promastigotas de fase estacionária de L.
amazonensis (5parasitas/ neutrófilo) na presença ou não de DNAse (100UI/mL)e incubados a
34°C/5% de CO
2
. Após 1 hora de incubação, as células foram lavadas com PBS e fixadas com
paraformaldeído a 2%. Para caracterizar os principais componentes da NET, as lâminas foram
15
lavadas em PBS/1%BSA e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com o anticorpo
anti–histona H2A produzido em camundongo diluído 1:800 em PBS /BSA1%.
Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas com o anticorpo secundário
anti – camundongo conjugado a Texas Red (1:500) em PBS/BSA 1% por 1 hora à
temperatura ambiente ao abrigo da luz. As lâminas foram lavadas novamente em PBS e
incubadas com DAPI (5ug/mL) por 5 minutos no escuro. As lâminas foram montadas sobre
Vectashield (Vector) e observadas em microscópio de Imunofluorescência (Zeiss).
3.8.3 Quantificação das NETs:
Neutrófilos purificados (5 x 10
5
) foram estimulados ou não com promastigotas de fase
estacionária de L. amazonensis em uma proporção parasita:neutrófilo de 5:1 a 34°C 5% de
CO
2
por 1 hora. Após esse período foram adicionadas as enzimas de restrição ECOR1 e
HINDII 50UI/mL (GibcoBRL) nas culturas e incubadas por 1 hora à 34°C/5%CO2. Após a
incubação, as células foram centrifugadas a 400 x g por 5 minutos para retirada dos
neutrófilos,e o sobrenadante congelado. No caso das células infectadas com Leishmania, o
sobrenadante das culturas foram submetidas a mais uma centrifugação de 10.000 rpm 40
segundos para precipitar os parasitas e logo em seguida o sobrenadante foi congelado. O DNA
no sobrenadante das culturas foi quantificado pelo kit Picogreen dsDNA (Invitrogen) de
acordo com as informações do fabricante. O DNA de esperma de salmão foi utilizado como
padrão (Promega).
3.9 Análise estatística:
As análises estatísticas foram realizadas usando o programa GraphPad Prisma
(GraphPad, San Diego, CA). Os dados de Sobrevivência, quantificação do DNA e citometria
de fluxo para os linfócitos CD4
+
e CD8
+
foram analisados pelo teste não paramétrico
Kruskall-Wallis. Os ensaios de fagocitose e parâmetros hematológicos foram analisados por
Análise de Variância (ANOVA). As diferenças entre as médias foram consideradas
significativas quando p < 0,05.
16
4 RESULTADOS
4.1 Immunoblot para o Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV):
Todos os animais infectados pelo FeLV utilizados neste estudo, foram negativos para
a pesquisa de anticorpo contra a proteína p24 do FIV. Apenas um gato do grupo de animais
não infectados apresentou anticorpos para a proteína p24, esse animal foi descartado do
estudo (Fig. 1).
17
Figura 1. “Immunoblot” para diagnóstico do vírus da imunodeficiência felina
(FIV). Os plasmas de todos os animais estudados foram testados para presença de
anticorpos contra a proteína p24 do FIV. (+) = controle positivo, (-) = controle
negativo, Seta = animal positivo com anticorpos contra p24, n = 9/grupo.
FeLV-
FeLV+ Assint.
FeLV+ Sint.
+ -
FeLV-
FeLV+ Assint.
FeLV+ Sint.
+ -
p 24
r
FIV
18
4.2 Avaliação Clínica:
Todos os animais foram avaliados clinicamente, levando em consideração a presença
de sintomas típicos da infecção por FeLV. Os animais não infectados e FeLV+ assintomáticos
não apresentaram nenhum tipo de alteração durante o exame clínico. O grupo de animais
FeLV+ sintomático apresentava sintomas característicos de uma infecção progressiva do vírus
da leucemia viral felina n = 9/grupo (Tabela 1). Caquexia estava presente em 7 (77%) dos
animais, 5 (55%) apresentavam mucosas hipocoradas, manifestações clínicas como poliartrite,
enterite, icterícia, tosse, espirro e secreções nasais foram detectadas em 1 (11%) dos gatos. 2
(22%) dos animais tinham gengivite, 4 (44%) apresentavam algum tipo de desordem
proliferativa (linfoma medular, renal, mediastínico e multicêntrico) e 3 (33%) tinham
linfonodos aumentados.
Tabela 1. Sintomas clínicos dos animais FeLV + sintomáticos
Sintomatologia
Gatos
1
2
3
4
5
6
7 8 9
Caquexia X
X
X
X
X
X
X
Enterite X
Icterícia X
Rinotraqueíte X
Poliartrite X
Gengivite X
X
Mucosas hipocoradas X
X
X
X
X
Linfoma X
X
X X
Linfonodos aumentados X
X X
Desidratação X
X
X
4.3 Parâmetros Hematológicos:
A análise e comparação dos dados hematológicos entre os três grupos de animais
revelou anormalidades dos parâmetros hematológicos nos animais FeLV+. Anemia estava
presente em 6/9 (64%) dos animais FeLV + sintomáticos, entre esses animais 2/6 (30%) não
apresentavam resposta reticulocitária adequada. Os animais FeLV+ assintomáticos, assim
como, os animais não infectados não apresentavam alterações nos valores de hematócrito
(Tabela 2).
A concentração de proteína plasmática total e a contagem de plaquetas não revelaram
diferença significativa entre os grupos, apenas 1 (11%) dos animais FeLV+ sintomáticos
apresentou hipoproteinemia. A presença de trombocitopenia discreta foi observada em 2
(22%) dos animais FeLV+ assintomáticos e sintomáticos (Tabela 2).
A contagem de leucócitos totais no sangue periférico revelou anormalidades desses
valores nos animais infectados. A presença de leucopenia foi observada em 3 (33%) dos
animais FeLV+ assintomáticos e 4 (44%) nos animais FeLV+ sintomáticos. A presença de
leucocitose (21.350/µL) foi observada em apenas um animal do grupo FeLV+ sintomático.
Não houve diferença significativa entre os grupos como mostra a tabela 2.
Na contagem diferencial de leucócitos, os neutrófilos apresentaram alterações nos
valores de normalidade, sendo observado quadros de neutrofilia (16.152/µL) e neutropenia
(2.190/µL) nos animais FeLV+ sintomáticos. Para a população de linfócitos, anormalidades
19
no número de células foram observadas nos dois grupos de gatos infectados. Alterações
morfológicas das células foram vistas apenas no grupo FeLV+ sintomático (linfócitos
reativos, presença de nucléolo, linfócitos atípicos).
4.4 Ensaios imunológicos:
Neutrófilos de animais FeLV negativo, FeLV+ assintomáticos e/ou sintomáticos
foram incubados com promastigotas do parasita Leishmania in vitro, a fim de verificar e
comparar a capacidade fagocítica e microbicida dessas células. Nossos resultados mostraram
que a infecção por FeLV não afeta a capacidade fagocítica dos neutrófilos, já que os
neutrófilos dos grupos estudados interagiram de forma semelhante com o parasita Leishmania
após 1 hora de interação in vitro (Fig. 2A). Entretanto a capacidade microbicida das células
dos animais FeLV+ sintomáticos está diminuída, uma vez que os neutrófilos desses gatos não
conseguem controlar a infecção in vitro pelo parasita Leishmania, há um aumento de 40% na
sobrevivência do parasita após interação com neutrófilos de gatos FeLV+ sintomáticos em
relação à sobrevivência dos mesmos que entraram contato com neutrófilos de animais FeLV-
e/ou FeLV+ assintomáticos (Fig. 2B).
Tabela 2. Parâmetros Hematológicos Analisados.
Parâmetros Hematológicos FeLV
Negativo
Positivo
Assintomático
Positivo
Sintomático
Hematócrito (%) 41 ± 4
a
37 ± 4
a
24 ± 10
b
Proteína plasmática total (g/dl) 7,65 ± 1,46
a
7,12 ± 0,74
a
7,38 ± 0,88
a
Plaquetas (x 10
3
/uL) 318,4 ± 151,4
a
280,8 ± 121,5
a
279,1 ± 91,09
a
Leucócitos totais (x 10
3
/uL) 9,26 ± 2,32
a
7,51 ± 3,26
a
10,45 ± 6,98
a
Neutrófilos (x 10
3
/uL) 6,84 ± 2,40
a
4,22 ± 2,51
b
6,36 ± 5,00
a
Linfócitos (x 10
3
/uL) 1,442 ± 0,870
a
2,05 ± 1,56
a
3,50 ± 4,992
a
Monócitos (x 10
3
/uL) 0,36 ± 0,25
a
0,29 ± 0,19
a
0,30 ± 0,20
a
Eosinófilos (x 10
3
/uL) 0,73 ± 0,32
a
0,72 ±0,74
a
0,29 ± 0,40
a
a
. Dados não apresentam diferença estatística p>0,05
b
. Dados apresentam diferença estatística p<0,05.
Dados são expressos como média ± SD, n≥ 8 animais/grupo
20
0
25
50
75
100
FeLV- FeLV + a. FeLV + s.
*
*
% Sobrevivência
0
5
10
15
20
25
30
35
FeLV negativo
FeLV + sintomático
FeLV + assintomático
Figura 7: Média do índice de infectividade
% Índ ice de infectiv ida de
Figura 2.
Neutrófilos purificados de animais FeLV-, FeLV+
assintomáticos e FeLV+ sintomáticos foram incubados com
promastigotas de Leishmania amazonensis in vitro na proporção de
1N:5L a 34ºC/5%CO
2
. Após 1 hora de interação, o índice endocítico
foi avaliado (A) e a capacidade microbicida dos neutrófilos foi
determinada através da sobrevivência do parasita após 48 horas (B),
*p< 0,05. Dados são expressos como média ±SD. n ≥ 8 animais/grupo.
FeLV+ a. = FeLV+ assintomático
FeLV+ s. = FeLV+ sintomático
B
A
21
4.5 Caracterização e Quantificação das Redes Extracelulares de Neutrófilos:
Nossos resultados mostram que neutrófilos de felinos liberam NETs de forma
semelhante aos neutrófilos humanos, bovinos e peixes, após interação com o parasita
intracelular Leishmania in vitro. Foi observada a presença das NETs e muitos parasitas
aderidos a essas redes (Fig. 3 A e B). A fim de caracterizar os componentes das NETs de
felinos por microscopia de fluorescência, nós observamos que as NETS de felinos são
compostas de DNA, já que foram coradas por DAPI que se liga a DNA e histona uma vez que
reagiram com o anticorpo anti-histona H2A. (Fig. 4). A fim de confirmar que as que as
estruturas em forma de redes observadas eram as NETs, neutrófilos estimulados com
Leishmania foram incubados com DNAse, onde observamos apenas a presença de alguns
vestígios de NETs, já que parte foi degrada pela DNAse (Fig. 5).
A quantificação das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) liberadas no
sobrenadante de neutrófilos de animais FeLV negativos e FeLV+ assintomáticos estimulados
com Leishmania, mostra que há um aumento de seis vezes e quatro vezes, respectivamente, na
quantidade de NETs liberada em relação ao controle não estimulado (Fig. 6A e 6B). Já nos
neutrófilos de animais FeLV+ sintomáticos não se observa um aumento significativo da
quantidade de NETs liberada após estímulo com o parasita (Fig. 6C).
A comparação da quantidade NETs presente no sobrenadante de neutrófilos não
estimulados mostra que os animais infectados pelo FeLV apresentam uma maior quantidade
de NETs basal, com diferença estatística significativa em relação ao grupo FeLV-. No
entanto, após estímulo com o parasita os neutrófilos dos animais FeLV+ sintomáticos não
aumentam a quantidade de NETs liberada (Fig. 7A e 7B).
22
Figura 3.
Caracterização das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) felinos por
microscopia óptica. Neutrófilos purificados de sangue periférico foram incubados
com promastigotas de Leishmania amazonensis in vitro na proporção de 1N:5L a
34ºC/5%CO2. Após 1 hora de interação, as células foram fixadas e coradas com
panótico. N = neutrófilos; P= parasita; setas = NETs, setas largas = parasitas presos
às NETs. Barra = 20mm.
p
p
p
N
N
N
N
p
p
N
B A
23
A
B
C
N
p
p
p
p
p
N
N
Figura 4.
Caracterização das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) felinos.
Neutrófilos purificados de sangue periférico foram incubados com promastigotas de
Leishmania amazonensis in vitro na proporção de 1N:5L a 34ºC/5%CO2. Após 1-2
horas de interação, as células foram fixadas com PF 2% e incubadas com DAPI
(5ng/mL) (A,B) e anti-histona H2A (1:800) (C). Em A sobreposição de imagem por
contraste interferencial e fluorescência. N = neutrófilos; P= parasita; setas = NETs.
Barra = 20mm
24
Figura 5.
Caracterização das redes extracelulares de neutrófilos (NETs) felinos.
Neutrófilos purificados de sangue periférico foram incubados com promastigotas
de Leishmania amazonensis in vitro na proporção de 1N:5L a 34ºC/5%CO
2
na
ausência (A,B) ou presença de DNAse (C,D) [50UI/mL]. Após 1-2 horas de
interação, as células foram fixadas com PF 2% e incubadas com DAPI (5ug/mL).
(A,C) Sobreposição de imagens obtidas por contraste interferencial e
fluorescência. N = neutrófilos; P= parasitas; setas = NETs; (*) = vestígios de
NETs, degradadas pela DNAse. Barra = 20mm
N
N
N
p
p
N
p
p p
p
*
*
p
*
*
*
p p
p
p
*
A
B
C D
25
N N+ L
0
1000
2000
3000
**
ng/mL
N N+ L
0
1000
2000
3000
4000
ng/mL
C
B
A
Figura 6.
Quantificação das NETs no sobrenadante de
neutrófilos purificados de animais FeLV- (A), FeLV+
assintomáticos (B) e FeLV+ sintomáticos (C), estimulados
com promastigotas de Leishmania in vitro. A quantidade de
NET liberada foi quantificada utilizando o kit picogreen
dsDNA. Dados são expressos como média ± SD, *p<0,002;
**p<0,02. n ≥ 8 animais/grupo. DNA de esperma de salmão
foi utilizado como padrão. N= neutrófilos, N+L= neutrófilos +
Leishmania.
N N + L
0
250
500
750
1000
1250
*
ng/mL
26
Figura 7. Comparação da quantidade de NETs no sobrenadante de
neutrófilos purificados de animais FeLV- , FeLV+ assintomáticos e
FeLV+ sintomáticos na ausência (A) ou presença de Leishmania (B).
A quantidade de NET liberada foi quantificada utilizando o kit
picogreen dsDNA. Dados são expressos como média ± SD, *p<0,001;
n ≥ 8 animais/grupo. DNA de esperma de salmão foi utilizado como
padrão.
FeLV+ a. = FeLV+ assintomático
FeLV+ s. = FeLV+ sintomático
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
*
ng/mL
B
A
0
1000
2000
3000
4000
FeLV-
FeLV a.
FeLV s.
ng/mL
27
4.6 Citometria de Fluxo:
Um outro aspecto analisado foi à relação de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
. A
porcentagem dos linfócitos T CD4
+
circulantes não apresentou diferença significativa entre os
grupos estudados (Fig. 8A), embora tenha sido observada uma tendência à redução no número
de células CD4
+
nos animais FeLV+. Entretanto, o mesmo não foi observado para linfócitos T
CD8
+
, onde os animais FeLV+ sintomáticos apresentaram maior porcentagem dessas células.
Já os animais FeLV+ assintomáticos apresentam um leve aumento do número de células
CD8
+
, mas que não foi estatisticamente significativo (Fig. 8B). A relação CD4
+
/CD8
+
nos
animais FeLV+ apresentou uma diminuição em relação ao animais FeLV- (Fig. 8C).
28
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
*
% Células CD8+
C
B
A
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
*
*
CD4/CD8
FeLV-
FeLV a.
FeLV s.
Figura 8
. Análise dos linfócitos T de sangue periférico dos
animais FeLV-, FeLV+ assintomáticos e sintomáticos. Células
mononucleares foram purificadas e incubadas com anticorpos
monoclonais anti-CD4-FITC e anti-CD8-PE. A percentagem de
células CD4+ (A), CD8+ (B) e a razão CD4/CD8 (C) foi
determinada por citometria de fluxo. Foram analisados no
mínimo 10.000 eventos. Dados são expressos como média ±
SD,* p<0,05. n ≥ 6 animais/grupo.
20
30
40
50
% células CD4+
29
5 DISCUSSÃO
A infecção permanente pelo FeLV tem como conseqüência o desenvolvimento de
desordens tanto proliferativas como degenerativas, potencialmente fatais. Os sinais clínicos
observados em gatos positivos ocorrem em função dos efeitos específicos do vírus ou devido
às infecções secundárias e oportunistas (HAGIWARA et al., 1997). As afecções mais
freqüentes são linfomas, leucemias mielóide e linfóide, anemias, imunossupressão, enterite,
supressão da medula óssea e distúrbios reprodutivos (JARRET e HOSIE, 2006). Na avaliação
clínica dos animais deste estudo foram observados quadros clínicos relacionados com
infecção permanente pelo FeLV. As principais alterações encontradas nesses animais foram
caquexia, mucosa hipocoradas e linfomas renal, medular e mediastínico(Tabela 1). Outras
alterações observadas com menor freqüência foram as poliartrite, gengivite, enterite, icterícia
e infecção respiratória superior. A poliartrite é causada por imunocomplexos circulantes em
conjunção com o FeLV; o animal apresenta pirexia, inapetência, perda de peso e massa
muscular (ROJKO e HARDY, 1994). A enterite, caracterizada pela destruição das células
epiteliais intestinais, pode estar associada ao FeLV-FAIDS (KIPAR et al, 2000).
O FeLV se replica nas células progenitoras dos eritrócitos na medula óssea, esta
replicação pode gerar anemia ou doenças proliferativas da série eritróide. A anemia é a
seqüela mais comum encontrada na infecção por FeLV. Os gatos virêmicos geralmente
desenvolvem anemia por hemólise, displasia medular ou aplasia eritróide (COTTER E
ESSEX, 1977; COTTER et al., 1975). A principal alteração hematológica encontrada nos
animais FeLV+ sintomáticos foi anemia e em alguns casos arregenerativa com baixa
contagem de reticulócitos.
Apesar de serem constatadas alterações condizentes com infecção pelo FeLV a
comparação dos valores das médias de linfócitos e neutrófilos não revelou diferença
estatística significante (p> 0,05), devido a grande variação dos animais testados (Tabela 2).
Na contagem total e diferencial dos leucócitos foram observadas alterações individuais
sem diferença estatística na comparação das médias. No grupo de animais FeLV+
sintomáticos a linfopenia estava presente em 66% (6) das amostras analisadas e, apenas dois
animais apresentavam linfocitose. Um desses animais apresentava linfoma renal, onde os
linfócitos representavam 84% (14.154/µL) dos leucócitos circulantes, apresentando-se
atípicos, com características blásticas, podendo assim caracterizar uma leucemia linfóide. O
outro animal apresentava uma linfocitose mais discreta de 38% (8113/µL), sem alterações
morfológicas. A contagem dos neutrófilos estava normal em 55% (5) dos animais, 22% (2)
apresentaram neutropenia e 11% (1) neutrofilia. Os animais FeLV+ assintomáticos apesar de
se apresentarem clinicamente saudáveis, 55% (5) tinham linfopenia, 11% (1) tinha
neutropenia. Estudos utilizando gatos virêmicos saudáveis demonstrou queda na produção de
IL-2 pelas células TCD4
+
em resposta ao mitógeno Concavalina A, demonstrando que embora
gatos FeLV+ estejam clinicamente saudáveis, podem estar imunossuprimidos e desenvolver
doenças relacionadas ao FeLV ou infecções oportunistas secundárias (TOMPKINS et al.,
1989).
A leucocitose neutrofilica está presente em aproximadamente 1/3 dos animais
virêmicos, em resposta a infecções bacterianas e inflamação (HARDY, 1982). Hoffmann-
Jagielska et al. (2005) não encontraram alterações nas células brancas de animais
naturalmente infectados assintomáticos, com exceção de discreta linfopenia. Quackenbush et
al. (1990) observaram apenas anemia e linfopenia em gatos experimentalmente infectados
com FeLV-FAIDS.
As alterações observadas em nosso estudo são condizentes com a infecção persistente
pelo FeLV. Contudo, para a realização dos ensaios foram utilizados animais a campo. Alguns
desses animais receberam atendimento veterinário e eram medicados adequadamente, faziam
30
uso de antiretroviral, antibioticoterapia e quimioterapia. Outros animais não faziam uso de
nenhum tipo de medicação. Além disso, as alterações na avaliação dos parâmetros
hematológicos também não são exclusivas da infecção pelo FeLV, infecções oportunistas e
secundárias podem ser responsáveis por alterações hematológicas como Mycoplasma
haemofelis, infecções do trato respiratório superior e gengivites podem levar a alterações
hematológicas.
Os neutrófilos desempenham um papel essencial na resposta imune inata, sendo as
primeiras células a serem recrutadas durante a infecção para a eliminação de micro-
organismos. Kiehl et al. (1987) mostraram que os neutrófilos de animais SPF, com idade entre
3 meses e 19 meses, infectados experimentalmente com FeLV e clinicamente doentes
apresentavam uma diminuição significativa na quimiotaxia dessas células in vitro, porém essa
diferença não foi observada nos animais infectados sem sintomas clínicos. Hoffman–Jagielska
et al. (2005) mostraram que os neutrófilos de animais FeLV+ clinicamente saudáveis
apresentavam uma atividade fagocítica levemente reduzida, entretanto não havia diferença no
número de partículas fagocitadas pelos neutrófilos dos grupos FeLV- e FeLV+
assintomáticos. Entretanto, nossos resultados mostram que após 1 hora de incubação com o
parasita in vitro, neutrófilos isolados de animais naturalmente infectados pelo FeLV
sintomáticos e/ou assintomáticos não mostraram diferença na interação dessas células com o
parasita quando comparados com neutrófilos de animais não infectados (Fig. 2 A) Além
disso, não houve diferença nem na % de neutrófilos infectados e nem no número de
parasitas/neutrófilo o que sugere que a capacidade de reconhecimento e englobamento de
partículas dessas células não estão afetados pela infecção viral. Os neutrófilos dos três grupos
foram capazes de reconhecer e fagocitar o parasita Leishmania de forma semelhante.
Recentemente foi descrita a formação de redes extracelulares liberadas em neutrófilos
humanos. As NETs são compostas por DNA, histona e proteínas granulares. Essas estruturas
constituem um novo mecanismo microbicida e são liberadas quando os neutrófilos entram em
contato com bactérias, fungos, protozoários e/ou são estimulados com PMA, IL-8 e LPS
(BRINKMANN et al., 2004; URBAN et al., 2006; PALIC et al., 2007; BAKER et al., 2008,
FUCHS et al., 2007; COSTA, et al., manuscrito submetido).
O processo de liberação das NETs é dependente da formação de ROS. A formação das
NETs também foi descrita em outras espécies como em neutrófilos de peixe e bovinos
(PALIC et al., 2007; LIPOLLIS et al., 2006). No presente estudo caracterizamos pela primeira
vez a formação de NETs em neutrófilos felinos estimulados com o protozoário Leishmania
tanto por microscopia óptica quanto por imunofluorescência. As NETs liberadas pelos
neutrófilos felinos também são compostas de DNA e histona (Fig. 3 e 4). Na presença de
DNAse, observamos uma redução da presença das NETs, confirmando que o DNA é o
componente estrutural das NETs de felinos assim como nas outras espécies estudadas(Fig. 5).
O papel dos neutrófilos na infecção por Leishmania tem sido amplamente estudado.
Os neutrófilos são as primeiras células que chegam ao local da picada do flebotomíneo, vetor
do Leishmania (PETERS et al., 2008). Estudos com neutrófilos murinos têm mostrado a
participação dessas células no início da infecção. Recentemente foi mostrado que os
neutrófilos podem migrar para o linfonodo após infecção com promastigotas de L. major e
produzem IL-12 e IFN-gama, citocinas que levam a diferenciação dos linfócitos T para um
fenótipo T “helper” 1 (Th1), que tem um papel fundamental no controle da infecção por
Leishmania (DOS SANTOS et al., 2008). Da mesma forma foi mostrado que a depleção de
neutrófilos na infecção por L. donovani leva a um aumento do número de parasitas no baço e
na medula. A depleção de neutrófilos no baço está associada a um aumento na produção de
IL-4 e IL-10, citocinas que levam a uma indução preferencial para a resposta do tipo Th2
(MCFARLANE et al., 2008).
31
Além disso, Ribeiro-Gomes et al. (2007) mostrou que a interação da elastase do
neutrófilo com macrófagos in vitro ativa os macrófagos e induz mecanismos microbicidas
dependentes de TNF-α. A indução desta atividade microbicida nos macrófagos dada pela
interação com neutrófilos ou elastase purificada é dependente de TLR-4 (“Toll-like receptor”-
4).
A infecção por FeLV afeta a funcionalidade dos neutrófilos, o que pode tornar então
esses animais mais suscetíveis a infecção pela parasita Leishmania. Nossos resultados
mostraram que neutrófilos de animais FeLV+ sintomáticos não conseguem controlar a
infecção pelo parasita Leishmania quando comparados ao neutrófilos de animais FeLV-,
sugerindo uma deficiência na sua atividade microbicida (Fig. 2B). Ao contrário dos resultados
da literatura, os animais FeLV+ assintomáticos conseguiram eliminar o parasita de forma
semelhante aos animais FeLV-. O mesmo foi observado para a liberação de NETs, onde os
animais FeLV+ sintomáticos não aumentam a liberação de NETs quando estimulados com o
parasita, enquanto os animais FeLV+ assintomáticos liberam NETs de forma semelhante aos
animais FeLV- quando estimulados com Leishmania(Fig. 6), evidenciando uma supressão de
um dos mecanismos microbicida dos neutrófilos desses animais, já que a formação das NETs
em neutrófilos humanos depende da ativação de NADPHoxidase e da formação de ROS. Isto
sugere que os animais FeLV+ assintomáticos não possuem sua capacidade microbicida
totalmente suprimida e que outros mecanismos podem ser ativados a fim de eliminar o
parasita. Outro fato observado, é que a quantidade de NETs basal nos neutrófilos dos animais
FeLV+ sintomáticos é maior do que nos neutrófilos dos animais FeLV- e FeLV+
assintomáticos (Fig. 7), o que sugere que a própria infecção viral pode estar estimulando a
liberação de NET, entretanto a NET liberada por essas células não parece ser capaz e/ou
suficiente para controlar a infecção pela Leishmania in vitro.
A proteína kinase C é um ativador fundamental para a sinalização intracelular de
vários eventos celulares, inclusive na ativação da enzima NADPH oxidase, responsável pela
formação de ROS, um importante mecanismo microbicida dos neutrófilos. Lewis et al. (1986)
observou uma diminuição na ativação de neutrófilos de gatos infectados experimentalmente
pelo FeLV durante fagocitose de partículas opsonizadas pelo soro em relação aos animais não
infectados. O mesmo foi observado em neutrófilos de animais FeLV(-) pré-incubados com
soro de animais FeLV+.
Dezzutti et al. (1989, 1990) mostraram que neutrófilos de gatos, com idade entre 3
meses e 3 anos, expostos ao FeLV experimentalmente virêmicos e/ou não virêmicos
apresentavam uma diminuição na ativação da proteína kinase C estimulados com PMA. No
entanto neutrófilos de animais saudáveis infectados com FeLV inativado ou em contato com
proteínas do FeLV in vitro não levou a supressão da explosão respiratória, sugerindo que
outro mecanismo independente do vírus esteja presente. De forma semelhante foi mostrado
que neutrófilos expostos ao FeLV inativado ou a proteína purificada p15E in vitro tem uma
diminuição na resposta ao Ca
+
ionóforo, no entanto somente os neutrófilos expostos ao FeLV
inativado inibiu a resposta dos neutrófilos estimulados com partículas de látex (LAFRADO et
al., 1987, 1989). Além disso, foi mostrado que neutrófilos de animais FeLV+ assintomáticos
naturalmente infectados, possuem uma atividade oxidativa menor quando estimulados com
Escherichia coli e/ou PMA (HOFFMAN–JAGIELSKA et al., 2005).
Na infecção pelo FeLV fatores relacionados ao hospedeiro são de grande importância
no resultado final da infecção como idade, estado imune e carga viral a qual o animal é
exposto (JARRET e HOISE, 2006). Nosso estudo utilizou animais naturalmente infectados
com idade acima de 12 meses até 7 anos, como não foi possível identificar a qual carga viral
esses animais foram expostos, e em que fase da infecção eles se encontravam, isso pode
explicar as diferenças encontradas nos resultados do nosso estudo. Em estudos realizados a
campo, esses fatores não podem ser controlados, podendo influenciar na resposta imune do
32
hospedeiro. Grant e Essex (1980) estudaram a resposta imune ao FeLV em animais de
diferentes idades. Filhotes entre 3 e 4 meses de idade são mais susceptíveis a infecção
transmitida naturalmente. A possível explicação entre essa diferença na susceptibilidade ao
vírus é que filhotes são menos imunocompetentes do que animais adultos. Os filhotes
tornaram-se doentes logo após a infecção apresentando quadros de anemia, tumores linfóides
e infecção pelo vírus da peritonite infecciosa felina. Outros estudos laboratoriais com filhotes
infectados com FeLV também demonstraram que esses animais são mais susceptíveis aos
efeitos patológicos do vírus (ESSEX et al., 1971).
A leishmaniose é uma doença zoonótica endêmica e com grande impacto em saúde
pública e possui um amplo espectro de manifestações clínicas que vão de lesões cutâneas de
cura espontânea a forma visceral e fatal da doença. Várias espécies de vertebrados são
consideradas reservatórios do parasita, incluindo animais domésticos e selvagens. Casos de
leishmaniose em felinos são raros, mas têm sido relatados casos de leishmaniose felina
cutânea e visceral na América, Europa, Ásia e África. No Brasil, foram relatados casos de
leishmaniose felina em Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro, São Paulo e Belo Horizonte (DA
SILVA et al., 2008; De SOUZA et al. 2005; SAVANI et al., 2004; SCHUBACH et al., 2004;
PASSOS et al., 1996).
A susceptibilidade dos animais FeLV+ a infecções oportunistas é amplamente
discutida. Uma grande variedade de manifestações clínicas ocorre em gatos infectados com
retrovírus, incluindo, doenças gastrointestinais, respiratórias, do sistema nervoso central,
doenças oftálmicas, hepáticas, dermatológicas e hematológicas. Esses sinais clínicos são
normalmente atribuídos à infecção viral primária, mas como FeLV leva a uma
imunossupressão é provável que infecções oportunistas secundárias sejam a causa de tais
manifestações clínicas (LAPPIN, 1995. GEORGE et al., 2002). De acordo com os nossos
resultados os neutrófilos dos animais FeLV+ sintomáticos não conseguem controlar a
infecção por Leishmania in vitro, o que o torna um potencial reservatório doméstico da
leishmaniose. A maioria dos animais FeLV+ assintomáticos como passar do tempo progridem
para o quadro clínico da doença, tornando- se também potenciais reservatórios desta zoonose.
O FeLV se replica rapidamente nas células em divisão do sistema imune, incluindo os
linfócitos. Essas células podem estar reduzidas numericamente ou funcionalmente. A falência
das células T induzida pelo FeLV pode ocorrer pela falha de algum estímulo durante a
ativação direta da célula (ROJKO e HARDY, 1994). Alguns trabalhos mostram que a proteína
p15E diminui a mobilidade do receptor de concavalina A (ConA), um mitógeno de célula T,
comprometendo a ativação das células T (DUNLAP et al., 1979). Além disso, a p15E
interfere na ação da IL-2, inibindo a expressão de seus receptores nas células T. A IL-2 é
liberada por células T “helper” CD4
+
ativadas, sendo necessária para manter a ativação das
células T, recrutar novos linfócitos e auxiliar a produção de anticorpos pelas células B na
resposta a antígenos timo-dependentes (HARDY e ESSEX, 1986; TRAININ et al., 1983).
Nossos resultados mostraram que apesar de não apresentarem diferença significativa
na comparação das médias, a percentagem de linfócitos TCD4
+
dos animais FeLV+ tem
tendência a redução do seu número em comparação aos animas FeLV- (Fig. 8A). A
porcentagem de células CD8
+
nos animais FeLV+ sintomáticos mostrou um aumento
significativo e nos animais FeLV+ assintomáticos esse aumento ocorreu de forma discreta
(Fig. 8B). A relação CD4
+
/CD8
+
nos animais FeLV+ apresentou uma diminuição significativa
em relação ao grupo FeLV- (Fig. 8C).
Segundo Hofmann-Lehmann et al. (1997) em um estudo com animais
experimentalmente infectados com FeLV-A, foi observado uma redução do número de
linfócitos CD4
+
e CD8
+
a longo prazo, sem alteração na relação CD4
+
/CD8
+
. Outro estudo
realizado com gatos de 8 semanas de idade infectados experimentalmente com a classe FeLV-
FAIDS, foi observado uma diminuição significativa das células CD4
+
nos animais infectados
33
em relação ao controle. As alterações nos linfócitos CD8
+
foram discretas, as porcentagens
dessas células foram similares à porcentagem encontrada nos animais controles (Quackenbush
et al. 1990). Hoffmann-Fezer et al. (1996) obtiveram resultados semelhantes aos nossos no
estudo envolvendo 58 animais naturalmente infectados, onde foi observada uma diminuição
da porcentagem de células T CD4
+
e aumento das células T CD8
+
, a razão CD4
+
/CD8
+
também ficou reduzida.
34
6 CONCLUSÕES
Os neutrófilos felinos são capazes de emitir NETs.
As NETs nos neutrófilos felinos são compostas de DNA e histona.
As NETs parecem ser um mecanismo imune inato conservado entre as diferentes
espécies.
Os gatos FeLV+ sintomáticos apresentam atividade microbicida reduzida dos
neutrófilos.
Os gatos FeLV+ assintomáticos ainda possuem mecanismos que controlam a infecção
por Leishmania in vitro.
Os gatos podem representar um potencial reservatório para a leishmaniose.
35
7 ANEXOS
A – Termo de consentimento para utilização do animal no estudo
B – Modelo de ficha para avaliação clínica.
36
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA
BR 465 – KM-07 – Centro – Seropédica, CEP: 23890-000
Telefone: (21) 2682-1711
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Autorizo ao Instituto de Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro a utilização de materiais biológicos, dados e imagens obtidos do
animal __________________, da espécie ______________, raça
____________________, sexo ________, idade _________, para fins de
pesquisa, ensino e extensão.
Nome do Proprietário: __________________________________
Nº. de Identidade: ______________________________________
Seropédica (RJ), ____/ ____/ _____
__________________________________
Assinatura
Anexo A – Termo de consentimento para utilização dos animais no estudo
37
Projeto de Mestrado
FICHA DE AVALIAÇÃO
DATA: _____/_____/_____
Dados do animal
Nome:____________________________________________________
Raça:____________ Pelagem: ____________ Sexo: F ( ) M ( ) Idade: _________
Dados do proprietário
Nome: ____________________________________ Telefone: ___________________________
Endereço: _____________________________________________________________________
Ficha Clínica
1- Procedência:
Pet Shop ( ) Gatil ( ) Pego na rua ( ) Abrigo ( ) Desconhecida ( ) Outros: _____________
2 - Castrado? S ( ) N ( )
3 - Vacinas:
Raiva ( )Quádrupla ( ) Quádrupla+FeLV ( ) Nunca foi vacinado ( )
4 - Acesso à rua:
Diário ( ) Já teve em algum momento ( ) Nunca ( )
5 - Possui outros gatos? S ( ) N ( )
Quantos? _______ Têm acesso à rua? S ( ) N ( ) São vacinados? S ( ) N ( )
Compartilham pote de água e comida? S ( ) N ( )
Já apresentaram alguma patologia? S ( ) N ( )
Obs: __________________________________________________________________________
Anexo B – Modelo de ficha para avaliação clínica
38
Anamnese
1 – Temperatura: _______ Hipertermia ( ) Normal ( ) Hipotermia ( )
2 – Peso: ______ kg Normal ( ) Magro ( ) Caquético ( ) Obeso ( )
3 – Desidratação: Ausente ( ) Leve ( ) Moderada ( ) Grave ( )
4 – Mucosas: Normal ( ) Levemente hipocorada ( ) Hipocorada ( ) Muito hipocorada ( )
5 – Linfonodos: Sem alteração: ( ) Aumentado ( ) Quais? ______________________
6 – Apetite: Normal ( ) Reduzido ( ) Sem apetite ( )
7 – Ingestão de água: Normal ( ) Aumentada ( ) Diminuída ( )
8 – Fezes: Normal ( ) Diarréica ( )
9 – Estado geral: Ótimo ( ) Bom ( ) Regular ( )
10 – Linfomas: Mediastínico( ) Multicêntrico( ) Alimentar( ) Extranodais( )
Observações sobre o quadro clínico:
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
___________________________________
Medicação prescrita para terapia de suporte:
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________
Exames solicitados:
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
Contato:
Amanda Brito Wardini e-mail: amandawardi[email protected].br
39
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