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Dedicatória
Juliany Gomes Quitzan
Juliany Gomes Quitzan
Avaliação funcional e histológica do
enxerto tubular de matriz acelular
arterial heteróloga como substituto da
uretra em coelhos
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Bases Gerais da Cirurgia, Área de Agressão, Reparação,
Regeneração e Transplante de Tecidos e Órgãos, da
Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista – UNESP, para obtenção do Título de
Doutor.
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Souza Trindade Filho
Botucatu - SP
2009
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Dedicatória
Juliany Gomes Quitzan
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Quitzan, Juliany Gomes.
Avaliação funcional e histológica do enxerto tubular de matriz acelular
arterial heteróloga como substituto da uretra em coelhos / Juliany Gomes
Quitzan. – Botucatu : [s.n.], 2009
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista, 2009.
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Souza Trindade Filho
Assunto CAPES: 40102009
1. Uretra – Cirurgia. 2. Coelho como animal de laboratório. 3. Enxerto
arterial.
CDD 617.462
Palavras-chave: Coelho; Matriz acelular de aorta; Uretra.
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Dedicatória
Juliany Gomes Quitzan
Dedicatória
Dedicatória
Juliany Gomes Quitzan
e um dia já homem feito e realizado, sentires
que a terra cede a teus pés, que as tuas terras te
desmoronam, que não há ninguém a tua volta
para te estender a mão, esquece a maturidade,
passa pela mocidade, volta à tua infância e
balbucia entre lágrimas e esperanças as últimas
palavras que te restarão na alma: minha Mãe,
meu Pai”.
edico este trabalho aos meus queridos
pais, Luiz Carlos e Elma, pelo carinho e
respeito com que me educaram. Agradeço
pelas oportunidades a mim proporcionadas,
independente do sacrifício necessário, por suas
preocupações, pelas noites mal dormidas e
pelos fios de cabelos brancos... Tenho certeza
de que vocês jamais mediram esforços para
que eu chegasse até aqui. Amo vocês!
D
S
“
Agradecimentos Especiais
Juliany Gomes Quitzan
Agradecimentos especiais
Agradecimentos Especiais
Juliany Gomes Quitzan
Ao Prof. Dr. José Carlos Souza Trindade
Filho, orientador desta pesquisa, agradeço
pela simplicidade na transmissão de seus
conhecimentos, paciência e compreensão
durante minhas ausências. Agradeço ainda
pela confiança depositada, proporcionando a
oportunidade do meu ingresso ao
Departamento de Urologia.
Agradecimentos Especiais
Juliany Gomes Quitzan
Às minhas queridas irmãs, Alexandra, Patrícia e Karla, que
testemunharam meus esforços, sempre me incentivando a alcançar
meus sonhos e realizar meus projetos de vida.
Aos meus filhos tão amados, Willy e Scott, meus companheiros,
cuja sensibilidade indescritível me fazem ter certeza de que o
verdadeiro e sincero amor, aquele que perdoa, compreende e
fortalece, realmente existe.
Aos animais que participaram deste experimento, sem o qual não
poderíamos realizar buscas em benefício da humanidade. A estes
seres inocentes e dóceis, todo o meu respeito e eterno agradecimento.
Agradecimentos
Juliany Gomes Quitzan
Agradecimentos
Agradecimentos
Juliany Gomes Quitzan
Certa noite eu tive um sonho...
Sonhei que estava andando na praia com o Senhor e através do
céu, passavam cenas da minha vida.
Para cada cena que passava, percebi que eram deixados dois
pares de pegadas na areia: um era meu e o outro era do Senhor.
Quando a última cena passou diante de nós, olhei para trás, para
as pegadas na areia e notei que muitas vezes, no caminho da
minha vida, havia apenas um par de pegadas na areia.
Notei também que isso aconteceu nos momentos mais difíceis e
angustiosos do meu viver. Isso me aborreceu deveras e perguntei
então ao Senhor:
- Senhor, Tu me disseste que, uma vez que resolvi te seguir, Tu
andarias sempre comigo, em todo o caminho. Contudo, notei que
durante as maiores atribulações do meu viver, havia apenas um
par de pegadas na areia. Não compreendo porque nas horas em
que eu mais necessitava de Ti, Tu me deixaste sozinho.
O Senhor me respondeu:
- Meu querido filho. Jamais eu te deixaria nas horas de provas e
de sofrimento. Quando viste, na areia, apenas um par de pegadas,
eram as minhas. Foi exatamente aí que eu te carreguei nos braços.
A Deus, por ser fonte de inspiração nas
minhas dúvidas e incertezas, conduzindo-me
pela estrada certa.
Agradecimentos
Juliany Gomes Quitzan
À Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP e ao Curso de
Pós-Graduação em Bases Gerais da Cirurgia, pela oportunidade
oferecida para a concretização deste trabalho.
À CAPES,, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior, pela bolsa concedida.
Aos docentes do Departamento de Urologia da Faculdade de
Medicina de Botucatu – UNESP, especialmente ao Prof. Titular
José Carlos S. Trindade, Prof. Dr. Carlos Márcio N. de Jesus e
Prof. Dr. Aparecido Donizette Agostinho, pela atenção e
amizade.
Ao Prof. Dr. João Luiz Amaro, pelos longos anos de amizade e
atenção, pelas palavras de apoio e incentivo e por ser um exemplo
de dedicação a esta Universidade.
À Profa. Dra. Renée L. Amorim, patologista e docente do
Departamento de Clínica Veterinária – UNESP, pelo auxílio
durante a análise histopatológica.
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Padovani, docente do
Departamento de Bioestatística do Instituto de Biociências –
UNESP, pela análise estatística dos resultados.
À querida amiga Daniela Campagnol, por sempre ter me recebido
com tanto carinho, pelo seu apoio fundamental em fases tão
desafiadoras da minha vida.
Aos amigos Paulo Kawano, Ana Cláudia Kochi, Hamilto e
Érica Yamamoto, e aos mascotinhos Rafaela e Gustavo, por todos
os bons momentos proporcionados, por serem SEMPRE amigos de
todas as horas.
Agradecimentos
Juliany Gomes Quitzan
Ao CESUMAR, Centro de Ensino Superior de Maringá, pelo
apoio e incentivo para a conclusão desta etapa.
Aos amigos e alunos do CESUMAR, Centro de Ensino Superior de
Maringá, especialmente ao Prof. Dr. Raimundo Tostes,
Coordenador do Curso de Medicina Veterinária, pela compreensão
durante meus períodos de ausência.
Aos funcionários do Laboratório Experimental de Urologia da
Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, José Lucas de
Carvalho e Mara Seabra, pelos auxílios imprescindíveis durante a
fase experimental.
Ao Laboratório Experimental de Cirurgia da Faculdade de
Medicina – UNESP, especialmente ao funcionário Carlos
Edwalter Bardela, pela grande ajuda durante a realização dos
exames radiográficos.
Ao funcionário da Seção de Fotografias da UNESP, Silvio, pela
atenção e enorme paciência durante as longas manhãs que
passamos juntos. E, acima de tudo, pelo profissionalismo e
dedicação com os registros fotográficos.
Às funcionárias da Biblioteca Central de Botucatu – UNESP,
Selma, pelo serviço catalográfico e Rosemary Cristina da Silva,
pela amizade sincera e apoio na correção das referências.
À coordenadora da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de
Medicina de Botucatu – UNESP, Janete Aparecida H. Nunes
Silva e aos funcionários Regina Célia Spadin, Nathanael P.
Salles e Lílian C. N. Bianchi Nunes, por serem sempre tão
atenciosos.
Agradecimentos
Juliany Gomes Quitzan
À Adnice e Abílio, não só pela brilhante capacidade, competência e
responsabilidade na formatação e impressão da Tese, mas pela
amizade e carinho, cuja distância jamais será suficiente para
abalar.
À Andréa e Gláucia Chiamente, pelos anos de amizade e
principalmente por estarem sempre prontas a me ouvir, pelo apoio
em todos os momentos.
Aos meus queridos amigos Fabíola, Fábio Bim, Família Ramos
e Família Bettini, minhas famílias em Maringá, por serem
companheiros e me proporcionarem tantos bons momentos.
A todos os amigos que tanto amo, aos que direta ou indiretamente
contribuíram para a execução deste projeto. Àqueles cuja barreira
geográfica não foi suficiente para nos afastar....Enfim, algumas
páginas seriam necessárias para citá-los mas infinitas seriam
incapazes de expressar meus sentimentos.
Nota Explicativa
Juliany Gomes Quitzan
Nota explicativa
Nota Explicativa
Juliany Gomes Quitzan
A forma de apresentação desta Tese de Doutorado segue uma
nova orientação da coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bases
Gerais da Cirurgia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, com o
objetivo de facilitar sua publicação em revista científica. Está dividida em
dois capítulos.
O capítulo 1º corresponde à revisão da literatura a respeito da
reconstrução uretral, citando os modelos experimentais e aplicações clínicas
de diferentes materiais utilizados em uretroplastias.
O capítulo 2º refere-se ao trabalho intitulado: “Avaliação
funcional e histológica do enxerto tubular de matriz acelular arterial
heteróloga como substituto da uretra em coelhos”, a ser posteriormente
submetido à publicação.
Tal proposta visa ao aprendizado do pós-graduando em redação
de artigos científicos e divulgação do conhecimento, contemplando, assim,
os objetivos finais dos programas de pós-graduação.
Sumário
Juliany Gomes Quitzan
Sumário
Sumário
Juliany Gomes Quitzan
CAPÍTULO 1 __________________________________
17
1. REVISÃO DE LITERATURA .....................................................
36
2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................
CAPÍTULO 2 __________________________________
51
RESUMO ..........................................................................................
52
SUMMARY ......................................................................................
54
1. INTRODUÇÃO................... ..........................................................
56
2. OBJETIVOS ..................................................................................
58
3. MATERIAIS E MÉTODOS ..........................................................
59
3.1- Preparo da matriz acelular heteróloga ...................................
59
3.2- Grupos experimentais e delineamento experimental .............
60
3.3- Parâmetros estudados ............................................................ 65
3.4- Análise estatística dos resultados .......................................... 67
4. RESULTADOS .............................................................................
68
4.1- Peso corpóreo dos animais ....................................................
68
4.2- Avaliação clínica ...................................................................
69
4.3- Avaliação radiográfica ..........................................................
70
4.3.1 – Avaliação de estenose ..............................................
70
4.3.2 – Avaliação de fístula ..................................................
73
4.4. Avaliação anatomopatológica da uretra ................................
75
4.4.1 – Avaliação macroscópica ..........................................
75
4.4.2 – Avaliação microscópica ...........................................
76
5. DISCUSSÃO .................................................................................
84
6. CONCLUSÕES .............................................................................
99
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................
100
APÊNDICE .......................................................................................
108
ANEXO .............................................................................................
110
A B
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
17
Capítulo I – Revisão de Literatura
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
18
O tratamento cirúrgico das más formações congênitas,
como epispádia e hipospádia e da estenose de uretra representa um desafio
devido à frequente ocorrência de complicações como fístulas, estenoses,
deiscências, entre outras. O sucesso das uretroplastias é influenciado pela
experiência e habilidade do cirurgião, uso de material cirúrgico adequado e
seleção da técnica apropriada
1
. O urologista deve ter o conhecimento de
diferentes técnicas, uma vez que uma única uretroplastia não é aplicável a
todas as afecções uretrais
1,2
.
Dentre as anomalias congênitas que ocorrem no trato
urinário destaca-se a hipospádia, uma deformidade causada pela ausência
de fusão das placas uretrais durante o desenvolvimento embrionário
3
.
Tendências familiares e fatores genéticos estão relacionados à etiologia
desta má formação, bem como o uso de hormônios durante a gestação.
Mulheres submetidas ao uso de dietiestilbestrol apresentaram proles com
maior incidência de hipospádia e outras anormalidades uretrais
1
. Fatores
ambientais também foram apontados como influentes na ocorrência de
hipospádia, uma vez que produtos bioacumulativos causadores de
contaminação do meio ambiente acumulam-se no tecido adiposo de peixes,
pássaros e mamíferos marinhos e são considerados disruptores endócrinos
para humanos
4
.
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
19
Normalmente a união das placas ocorre na superfície
ventral da glande, completando o desenvolvimento da uretra em torno do
quinto mês
3
. O desenvolvimento uretral e genital normal é dependente dos
níveis hormonais intra-uterinos durante a maturação embriológica
5
. Os
níveis maternais de progesterona podem afetar a concentração de
diidrotestosterona
5
e, se há interrupção do estímulo androgênico o meato se
forma em um ponto distal ao ponto de fusão
3
.
O meato ectópico caracteriza a hipospádia em distal ou
anterior quando este se abre no terço distal do pênis ou acima dele,
perfazendo aproximadamente 65% dos casos. A posição subcoronal é a
mais comum. Nas hipospadias posteriores, o meato está localizado
proximalmente, na região escrotal ou perineal
1
.
Além do desenvolvimento incompleto da uretra, os
pacientes acometidos pela hipospádia apresentam com frequência uma
curvatura peniana ventral (“corda”), em decorrência de tecido fibroso e
inelástico que se prolonga a partir do meato ectópico para o sulco coronal
3
.
A curvatura é mais significante quanto mais proximal estiver localizado o
meato uretral ectópico. A presença da placa uretral, deformidade na
configuração da glande e ausência de prepúcio ventral (capuchão) são
outras características que podem ser observadas em pacientes com
hipospádia
4
.
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
20
Das afecções traumáticas que causam estenose uretral, 60 a
80% são de origem iatrogênica, secundárias às infecções uretrais,
cateterismo prolongado e cirurgias transuretrais
1,7
. A uretra pode ser ainda
lesionada por espículas ósseas associadas a fraturas pélvicas
8
, por armas
brancas e projéteis balísticos
9
.
Nas lesões estenóticas menos complexas, uretrotomia e
dilatação uretral são os tratamentos utilizados com maior frequência
8,9
,
apesar dos altos índices de recorrência e provável necessidade de reparo
cirúrgico futuro
9
. Estenoses não complicadas, com 1 cm ou menos de
comprimento, podem ser tratadas com sucesso por meio de ressecção e
anastomose término-terminal
10
. Um levantamento recente, avaliando 153
pacientes com estenose bulbar, mostrou que 90,8% evoluíram com bom
prognóstico. Neste estudo, os piores resultados foram observados nos
pacientes com histórico de tratamentos anteriores
11
.
Em casos extremos, envolvendo pacientes com histórico de
cirurgias prévias e alto grau de deformidade ou ainda para correções das
anomalias congênitas como hipospádia, a uretroplastia com outro tecido ou
material torna-se necessária. Inúmeras pesquisas destinam-se a encontrar
um substituto uretral ideal, com o objetivo principal de evitar múltiplas
cirurgias
12,13
, reação tecidual exacerbada, estenose e fístula, fatores
potencias que podem comprometer a patência do lúmen uretral
2
. O material
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
21
utilizado deve ser biocompatível, apresentar estabilidade química com a
urina, impedindo sua passagem para o tecido adjacente, possuir resistência
mecânica à tração, permitir epitelização de sua luz e neovascularização
14
.
Além disso, não deve conter pêlos ou porosidades que permitam
incrustrações calcáreas ou bacterianas
15
, sendo resistente à infecções
16
.
A reconstrução uretral pode ser feita com diferentes tecidos
autólogos tais como pele, mucosa bucal ou vesical, veia, segmentos
gastrointestinais e ureter ou por materiais sintéticos como silicone, teflon,
dacron. Nos últimos anos, destacam-se as pesquisas utilizando biomateriais
acelulares como submucosa intestinal, mucosa vesical, colágeno bovino,
colágeno vesical e artéria
15,17
.
O tecido autólogo ideal deve ser facilmente obtido e,
principalmente, promover neovascularização
14
. Também contribui para o
sucesso no uso de enxertos a boa vascularização do leito receptor e
imobilidade para permitir adequadas trocas nutricionais entre o enxerto e o
leito
8,18
, pois inicialmente o enxerto sobrevive pela difusão de nutrientes
entre doador e receptor. Esta fase é chamada embebição e dura
aproximadamente 48 h. Após este período, novos vasos são formados para
nutrirem o enxerto entre o 2 e 4 dias pós-operatório e a circulação é
restabelecida
18
.
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
22
Diversos tecidos doadores autólogos, utilizados em ensaios
experimentais ou clínicos, mostraram suas vantagens e desvantagens. A
reconstrução primária utilizando retalhos vascularizados de prepúcio ou
pele do pênis é indicada como primeira opção na maioria das
uretroplastias
19,20
. A técnica de Snodgrass é atualmente uma das mais
utilizadas em hipospádias distais, com tubulização da placa uretral incisada,
observando-se aproximadamente 10% de complicações
21
. Quando a
localização do meato é proximal, a técnica do prepúcio transverso
pediculado (onlay island flap) passa a ser uma alternativa viável
19
. Os
resultados obtidos dependem também da anomalia a ser corrigida e do local
da implantação do enxerto ou retalho. Casos severos de hipospádia,
pacientes submetidos à múltiplas cirurgias ou submetidos à postectomia do
capuchão não são beneficiados por esta técnica
9,22
.
Quando não há disponibilidade para o uso de retalho
vascularizado, pode-se optar pelos enxertos de pele
14,18,22,23
. A necessidade
de local doador com ausência de pêlos é uma das dificuldades desta técnica
e, dentre os enxertos de pele extragenital, pode-se utilizar pele da região
inguinal, supraclavicular, crista ilíaca, coxa e nádegas
24
, de espessura total
ou parcial. Além da cicatriz e deformidade cosmética, o uso da pele tem
sido associado à morbidade devido ocorrência de contratura do enxerto
22
,
formação de estenoses, divertículos, cálculos e fístulas
25-29
. Atualmente,
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
23
este tipo de enxerto não apresenta aplicação prática na reconstrução uretral,
ficando seu uso restrito em substituição à túnica albugínea na Doença de
Peyronie
30
.
A túnica vaginal é um tecido estudado em uretroplastias
devido à facilidade de obtenção, com baixa morbidade, ausência de pêlos e
resistência à tensão. Avaliações experimentais demonstraram complicações
com enxerto tubulizado, em comparação aos bons resultados observados
com a utilização onlay
12
. Segundo os autores, a contração das fibras
cremastéricas foi responsável pela morte de todos os animais que receberam
o enxerto na forma de tubo. O sucesso no reparo da uretra dorsal com
enxerto de túnica vaginal em coelhos também foi relatado por Calado et
al
20
. A aplicação clínica desta técnica em pacientes com estenose anterior
foi satisfatória, promovendo patência funcional e anatômica da uretra
31
.
As mucosas vesical e bucal foram outros materiais
alternativos pesquisados para a correção do defeito uretral, desde a metade
do século passado
32,33
. Após os resultados obtidos ao longo do tempo,
prevaleceu como primeira escolha o enxerto de mucosa bucal.
A mucosa vesical apresenta como principais vantagens a
adaptação deste tecido à urina
18,23
, a fina espessura permitindo nutrição por
ação capilar e o alto potencial de regeneração, associado a um baixo
metabolismo basal
8
. Na década de 80, estudos com este material
apresentaram até 95% de sucesso
34
. Hendren e Redá
35
descreveram o uso
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
24
desta mucosa na uretroplastia de 35 pacientes, sendo 34 tubulizadas, e não
observaram fístulas e estenoses. Entretanto, outros autores não alcançaram
resultados tão expressivos com a implantação da mucosa vesical na uretra e
relataram complicações em até 69% das cirurgias realizadas
26,36-38
.
Apesar dos diversos relatos de ocorrência de fístulas e
estenoses, o prolapso de mucosa vesical pelo meato uretral é citado como
complicação frequente
18,23,35,39
. Alguns autores referem que não há
necessidade de retalho maior do que o necessário, pois a retração não é tão
importante como nos casos da pele e o excesso de comprimento do enxerto
predisporia à eversão e prolapso
18,39
. Os diâmetros maiores ainda podem
dobrar sobre si dentro da glande, dificultando vascularização e aumentando
a possibilidade de contração e fibrose
40
. A associação de segmentos de pele
na porção distal para proteger a mucosa vesical do contato direto com o ar é
citada como opção cirúrgica viável para evitar tais complicações
36
.
Contra-indicações para a utilização de mucosa vesical são
bexiga não complacente, secundária à quadros neurogênicos, infecções de
repetição, vesicostomia prévia e extrofia vesical. Adicionalmente; a
necessidade de incisão cirúrgica abdominal para coleta deste tecido é
invasiva e aumenta a morbidade do procedimento
9,37,41
. Este relevante
aspecto também deve ser considerado em cirurgias onde segmentos
intestinais do íleo
42
, apêndice
43
, ureter
44
e peritôneo
45,46
foram utilizados
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
25
como alternativa para reconstrução uretral, apesar dos resultados
satisfatórios referidos pelos autores.
A mucosa bucal apresentou grande aceitação como
substituto uretral
47,48
e, a partir da década de 90 há relatos de excelentes
resultados observados nas primeiras citações clínicas
49
, mesmo quando
utilizada em pacientes submetidos à múltiplas cirurgias para correção de
hipospádia
50
. No reparo de estenoses de uretra bulbar, a média de sucesso
da técnica foi de até 90%
51,52
. Barbagli et al.
10,53
demonstraram índices
semelhantes de bons resultados com a utilização do enxerto em diferentes
localizações na uretra bulbar (lateral, dorsal ou ventral).
As características favoráveis ao bom resultado deste
material em uretroplastias incluem ausência de pêlos, facilidade de
obtenção, presença de um fino epitélio, rico em elastina e lâmina própria
bem vascularizada, facilitando a embebição e inosculação do enxerto
54
e
maior resistência à infecção
55
. Alguns autores consideram que as vantagens
da mucosa bucal e os resultados satisfatórios, comparáveis aos índices de
sucesso das reconstruções uretrais primárias, a tornam o material de escolha
nas uretroplastias complexas
55, 56
.
A superioridade da mucosa bucal é evidente em vários
relatos da literatura. Estudos experimentais de uretroplastias comparando
mucosa vesical, mucosa bucal e pele peniana observaram menor incidência
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
26
de estenose, reação inflamatória e fibrose nos animais tratados com mucosa
bucal
37
. O uso de pele peniana na reconstrução uretral apresentou 27% de
falhas
57
, comparado à 16% de complicações com enxerto de mucosa
bucal
58
. A pele peniana, apesar de ser o material sugerido em considerável
número de uretroplastias, apresenta elasticidade inferior à mucosa bucal
59
.
As complicações no local de coleta da mucosa bucal
ocorrem em menos de 30% dos casos
60
e incluem hemorragia intra-
operatória, hematoma facial, lesões inadvertidas de ducto parotídeo
60-62
e
retração da cicatriz, com distorção facial ou labial
61
. Alterações de
sensibilidade devido à lesão neurológica ou dor são os principais
inconvenientes observados a longo prazo
60-62
.
Enxertos tubulizados, incluindo tubos de mucosa bucal,
estão associados a maior número de complicações, principalmente
estenoses e fístulas, quando comparados com enxertos “onlay”
37,55,62-66
. Na
literatura nacional, Paulo et al.
67
observaram 30% de estenose 60 dias após
uretroplastias tubulares em cães.
A eliminação da linha de sutura longitudinal para a
confecção do tubo pode diminuir a formação de fístulas, além de diminuir o
tempo cirúrgico e morbidade do procedimento
68,69
. Considerando-se estas
particularidades, a busca de opções por enxertos tubulares incentivou novas
pesquisas.
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
27
O enxerto de veia é um biomaterial autólogo tubular citado
na literatura em reconstrução uretral experimental
41,68,70
. Segundo Foroutan
et al.
41
, veias como safena e jugular externa são facilmente acessíveis e a
excisão não provoca efeitos adversos significativos no paciente. Baixos
índices de estenose e fístula foram relatados. O uso do enxerto de veia
invertida, quando comparado ao enxerto sem eversão, parece estar
relacionado a menores índices de complicação, provavelmente devido à
melhor nutrição através do endotélio.
Shaeer e El-Sadat
69
relataram sucesso clínico com o uso da
veia safena para correção de hipospádia. O calibre adequado ao da uretra,
elasticidade e eliminação de sutura longitudinal são citados pelos autores
como vantagens da técnica. O procedimento de coleta da veia apresenta
menor morbidade se comparado ao acesso abdominal, mas o acréscimo no
tempo cirúrgico deve ser analisado.
Materiais sintéticos apresentam como vantagens a pronta
disponibilidade em diversos tamanhos e formatos, com conseqüente
diminuição do tempo cirúrgico e facilidade de obtenção
15
. Dentre eles,
foram utilizados em uretroplastias experimentais próteses de silicone
71,72
,
teflon
73
, dacron siliconizado
74-76
e politetrafluoretileno (Gore-tex)
77
.
Apesar da melhor proliferação celular observada nos tubos de dacron
siliconizado, infecções, calcificações, fístulas, reações imunológicas do tipo
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
28
corpo estranho e extrusão do enxerto ocorreram com frequência,
demonstrando a baixa biocompatibilidade destes materiais em longo prazo,
sem integrar-se ao tecido do hospedeiro
16,78
. As próteses sintéticas
inabsorvíveis cederam então cada vez mais espaço ao uso de materiais
biodegradáveis que viabilizassem a regeneração tecidual, com formação de
neouretra.
Atualmente, a engenharia de tecidos tem oferecido novas
oportunidades terapêuticas em situações onde os tratamentos urológicos
convencionais podem ser ineficazes
79
. Transplante celular e bioengenharia
são os princípios básicos desta ciência e coordenam o desenvolvimento de
substitutos biológicos, por meio de tecnologia in vitro ou in vivo
17,28
.
A tecnologia in vitro envolve o desenvolvimento
laboratorial de cultivos celulares, utilizados para estimular regeneração de
determinado tecido. Já a tecnologia in vivo viabiliza materiais
biodegradáveis, conhecidos como matrizes, com função de determinar a
orientação e direção do crescimento celular, considerando-se a reparação
natural dos tecidos
17,28
. A combinação de ambas estas técnicas é frequente,
associando-se, por exemplo, a implantação de matrizes previamente
semeadas com células cultivadas
17,63,80
.
As matrizes extracelulares absorvíveis são gradativamente
substituídas pelo tecido local em crescimento, fornecendo um suporte
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
29
estrutural e proteínas necessárias para replicação celular, como peptídeos de
adesão e fatores de crescimento
28
. Outro ponto importante é a baixa
antigenicidade, por ser avascular e acelular
81
. Três classes de biomateriais
destacam-se no desenvolvimento de matrizes utilizadas em tecidos
geniturinários – polímeros sintéticos, materiais naturais (colágeno) e tecidos
acelulares (submucosa vesical, submucosa intestinal suína, artérias)
28
.
Dentre as matrizes sintéticas utilizadas para reconstrução
uretral, há relatos de estudos experimentais com malha composta por
hialuronan
82
e ácido poliglicólico, associado
83
ou não ao ácido
polihidroxibutírico
84
. A avaliação histológica destes trabalhos mostrou
completa regeneração do urotélio e degradação dos polímeros
82-84
.
Embora a possibilidade de reprodução em larga escala com
propriedades controladas (desidratação, microestrutura) seja uma
característica favorável ao uso de matrizes sintéticas, materiais naturais e
tecidos têm vantagens biológicas, causando mínima reação no hospedeiro
28
.
Porém, quando os tecidos são utilizados como matéria-prima para
confecção da matriz, é necessário instituir rigoroso preparo que garanta a
descelularização.
Métodos físicos, químicos e enzimáticos têm sido
propostos para otimizar o nível de remoção celular. O protocolo de
descelularização deve garantir a máxima preservação da matriz acelular,
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
30
sem alterar sua estabilidade biomecânica
85,86
. As substâncias utilizadas
neste processo precisam ainda ter mínimo efeito residual, para não inibir o
crescimento celular após implantação da matriz no organismo
85
.
A descelularização física pode ser obtida por agitação,
congelamento, dissecção dos tecidos ou aplicação de força mecânica. Em
intestino delgado e bexiga urinária, órgãos com planos de dissecção
caracterizados, os dois últimos métodos são efetivos e causam mínima
ruptura na arquitetura tridimensional da matriz
87
. A submucosa intestinal
suína (SIS) é um importante exemplo de matriz obtida por este método.
Os detergentes iônicos são efetivos na solubilização de
membranas celulares citoplasmáticas e nucleares. O desoxicolato de sódio
(DCA) e o dodecil sulfato de sódio (SDS) pertencem a esta classe e são
utilizados para a descelularização de tecidos. O DCA é um detergente
extraído da bile, mas seu uso isolado não promove eficiente remoção de
células. Pode ser associado a métodos enzimáticos ou a outros detergentes
(não iônicos/ mistos)
87
. É empregado na confecção de diferentes matrizes,
incluindo enxertos valvares
88,89
. Em uretroplastias, segmentos de bexiga
90
,
uretra
13,91,92
e aorta
93
descelularizados por este método foram utilizados em
ensaios experimentais.
O dodecil sulfato de sódio (SDS) faz parte da composição
química de muitos cosméticos, produtos para higiene e limpeza. A
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
31
investigação das suas propriedades aplicadas à bioengenharia é observada
principalmente nas pesquisas cardiovasculares, envolvendo
descelularização de próteses valvares
61,94,95
. Schaner et al.
86
referem que o
detergente é capaz de lisar células uniformemente, em todas as camadas do
tecido.
Um exemplo de detergente não iônico bastante citado em
processos de descelularização é o Triton-X. Diversos estudos citam seu uso
em associação com o hidróxido de amônio, no preparo de matriz de
submucosa vesical
63,66,96,97
. Esta substância age rompendo interações entre
lipídeos e proteínas.
No Brasil, Goissis et al.
98
descreveram técnica utilizando
DMSO e ácido bórico para descelularização de vasos sanguíneos,
originando uma matriz tubular de colágeno e elastina. Segundo os autores, a
melhor preservação estrutural ocorreu nas matrizes arteriais. Além do
conhecimento e análise das diferentes técnicas existentes, a escolha do
adequado método de descelularização deve ser baseada nas características
individuais de cada tecido
87
.
O SIS é a matriz acelular mais estudada em reconstruções
urológicas. Trata-se da submucosa dissecada do jejuno de porcos,
comercializada na forma estéril, em diferentes apresentações
17,28,91
. Sua
estrutura é formada basicamente por fibronectina, glicosaminoglicanas,
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
32
colágeno Tipo I e Tipo IV e, apesar de sua fina espessura (0,1mm),
apresenta propriedades mecânicas satisfatórias. Os primeiros relatos do SIS
no trato urinário focaram sua utilização em ampliações vesicais
99,100
,
provando que o material forneceu uma base estrutural, permitindo
regeneração e remodelação da bexiga. Os bons resultados encorajaram
pesquisadores a testarem o material em uretroplastias.
Esta membrana foi inicialmente implantada na uretra de
coelhos
27
. Os autores demonstraram crescimento de células epiteliais, com
regeneração da parede uretral previamente lesionada, resultado semelhante
ao observado em pesquisas subsequentes
101,102
. Nos enxertos onlay, não
ocorreram casos de estenose
27,102
e fístulas com o uso do SIS em 4 camadas
não ultrapassaram 6%
102
. Por outro lado, o número de camadas do SIS não
pareceu influenciar a ocorrência de fístula, conforme descrito por
Kawano
29
, em 2007. Neste experimento, a porcentagem de fístula entre os
grupos que envolviam o uso de SIS com 1 ou 4 camadas foi a mesma
(8,3%). Grossklaus et al.
2
sugeriram a utilização do SIS em ilha para
prevenção de fístula em uretrotomias experimentais, obtendo bons
resultados.
As pesquisas experimentais forneceram uma base sólida
para o uso do SIS em casos clínicos. Em Milão, onde 20 pacientes foram
submetidos à uretroplastia peniana ou bulbar utilizando SIS, não houve
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
33
relato de infecção ou rejeição e 85% apresentaram boa evolução, incluindo
calibre uretral adequado, observado na cistoscopia
103
.
Contudo, nem todos os cirurgiões obtiveram resultados
satisfatórios em seus pacientes. Soergel et al.
104
relataram 33% de
complicações com o SIS em correções de hipospádias complexas, taxa esta
superior à obtida com utilização de outros enxertos, como pele ou túnica
vaginal. No reparo uretral endoscópico com tubo de SIS, o insucesso da
técnica deveu-se à contratura do enxerto e formação de estenose
105
. Diante
dos dados apresentados nos diferentes trabalhos, é possível concluir que os
melhores resultados foram obtidos com o uso de enxerto onlay de SIS,
quando comparado com o enxerto semi-tubular
106
ou tubular do mesmo
material
101,105
, apesar da regeneração urotelial observada.
Outros tipos de matrizes acelulares feitas a partir de
diferentes tecidos, como bexiga, uretra
81
ou vasos sanguíneos
98
ainda não
estão comercialmente disponíveis
81
. Possuem características semelhantes ao
SIS
81
, permitindo crescimento endotelial, muscular e de vasos sangüíneos
93
.
A matriz acelular obtida a partir da submucosa vesical
suína é um exemplo deste material
78,107
, que foi utilizado para correção de
defeitos experimentais em uretra ventral. No estudo, não foram relatadas
ocorrência de estenose ou disfunções miccionais e feixes organizados de
fibras musculares estavam evidentes aos 6 meses de pós-operatório
107
.
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
34
Enxertos de submucosa vesical obtidas de doador falecido
foram confeccionados e avaliados por Atala et al.
108
. Os autores relataram
sua experiência com o uso da matriz acelular homóloga em pacientes com
hipospádia e, apesar do grupo restrito (4 pacientes), os resultados foram
promissores, com ocorrência de uma fístula. Em pacientes com estenose
uretral, o uso onlay desta matriz foi acompanhado por bons resultados, onde
24 de 28 pacientes não apresentaram complicações durante
acompanhamento médio de 37 meses
97
.
Semelhante ao SIS e aos materiais autólogos descritos
anteriormente, a utilização de matriz acelular vesical tubulizada
63,80
não
demonstrou os mesmos índices de sucesso referidos com seu uso onlay,
sendo que os animais envolvidos nos estudos apresentaram estenoses
importantes e fístulas. O cultivo in vitro com posterior implantação de
células autólogas epidermais
63
ou da musculatura lisa
80
na matriz acelular
tubulizada otimizou significativamente estes resultados, com total
integração da matriz ao tecido do hospedeiro. Os autores consideraram a
necessidade de semeadura celular em casos onde a tubulização da matriz
vesical seja necessária
63,80
.
A confecção de matrizes acelulares a partir de materiais
tubulares reúne a vantagem da eliminação da confecção do tubo,
considerando-se as já citadas complicações inerentes a este procedimento.
A uretra oriunda de diferentes espécies animais (hamster
109
, coelho
13,91,109
ou cão
91,92,99
) serviu como base para a criação de matrizes em diversas
Capítulo I
Juliany Gomes Quitzan
35
pesquisas. A utilização das matrizes como enxertos homólogos
13,92,99,109
ou
heterólogos
91,109,
na uretroplastia mostrou bons resultados nos defeitos com
até 1 cm de comprimento
13,91,109
. A ocorrência de fístula foi citada apenas
nos enxertos uretrais homólogos
91,92
. Nos implantes heterólogos, observou-
se presença de feixes de fibras musculares na matriz, integração à uretra,
neovascularização e mínima reação, sem sinais de rejeição
91
. Altas taxas de
insucesso foram relatadas nos enxertos homólogos com 3 cm de
comprimento, utilizados para restabelecer viabilidade uretral em cães
92
.
Em 2000, Parnigotto et al.
93
, descreveram o uso de aorta
torácica acelular homóloga na substituição uretral em coelhos. Reações
cicatriciais, fibrose e resposta inflamatória foram mínimas em todos os
animais, havendo integração completa da matriz ao hospedeiro aos 3 meses
de pós-operatório.
A aorta acelular também foi avaliada por Trindade Filho
15
em uretra de coelho, na forma onlay. Os resultados foram satisfatórios, não
havendo diferenças consideradas significantes entre o uso de aorta acelular
e mucosa bucal autóloga.
Considerando-se os importantes benefícios inerentes ao uso
de matrizes acelulares, dentre elas a pronta disponibilidade do material, sem
necessidade de procedimento adicional para coleta do enxerto, e a redução
do tempo cirúrgico, bem como da morbidade pós-operatória, os resultados
promissores apresentados em uretroplastia justificam o contínuo
investimento em pesquisas nesta área.
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Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
51
Capítulo 2 – Avaliação funcional e histológica do enxerto
tubular de matriz acelular arterial heteróloga como
substituto da uretra em coelhos
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
52
RESUMO
Introdução – Deformidades uretrais e estenoses severas geralmente
requerem técnicas de uretroplastia com tecido adicional. Dentre as diversas
possibilidades, destaca-se recentemente a utilização de matrizes acelulares
desenvolvidas por bioengenharia. O objetivo deste estudo foi avaliar o
comportamento funcional e histológico da matriz acelular arterial
heteróloga, quando implantada na uretra de coelhos
Materiais e Métodos – Para o preparo da matriz, a artéria aorta abdominal
de suíno foi coletada e submetida a tratamento com SDS, sendo
posteriormente armazenada em álcool 70º. Foram utilizados doze coelhos,
machos, com peso médio de 3 kg, distribuídos por sorteio em dois grupos:
(AO) – secção completa da uretra e implante de segmento tubular de matriz
acelular de aorta, com 1 cm de extensão e (TT) - secção completa da uretra
e sutura término-terminal. Uretrografia retrógrada foi realizada após 15
(M2) e 90 dias (M3), quando os animais foram eutanasiados. As
radiografias foram analisadas quanto à presença de fístula e/ou estenose. A
avaliação histopatológica por Hematoxilina-eosina, Tricrômico de Masson
e Calleja caracterizou a presença de inflamação, hiperplasia epitelial, vasos
sanguíneos, tecido conjuntivo, muscular e elástico nos diferentes grupos.
Resultados – Foram registrados 2 óbitos em cada grupo, sendo estes
animais excluídos do estudo. Em M2, 36,3% de estenose foi observada nos
animais do Grupo AO (p<0,05). Em M3, animais dos Grupos AO e TT
apresentaram estenose, sendo que a diferença entre os grupos não foi
significante (p>0,05). Maior porcetagem de fístula ocorreu no Grupo AO,
em M3 (p<0,05). A avaliação macro e microscópica não nos permitiu
identificar a região da matriz acelular nos animais deste grupo. Ausência de
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
53
células gigantes tipo corpo estranho bem como maior presença de
hiperplasia epitelial (p<0,001) e vasos sanguíneos (p<0,005) foram
observadas nas lâminas destes animais. As fibras musculares estavam em
intensa quantidade na lâmina própria dos animais do Grupo TT (p<0,01).
Não houve diferença estatística entre a quantidade de fibras elásticas dos
diferentes grupos.
Conclusões – Houve boa incorporação da matriz acelular à uretra no Grupo
AO, não sendo observados sinais de rejeição. Porém, complicações (fístulas
e estenoses) ocorreram com maior frequência nos animais deste grupo. No
período proposto, não houve regeneração muscular satisfatória no no Grupo
AO, mas intensa vascularização e epitelização que ocorreram na matriz.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
54
SUMMARY
Introduction – Severe urethral deformities and stenosis usually require
urethroplasty with additional tissue. Among various possibilities, use of
acellular matrix is a recent advance developed by bioengineering. The aim
of this study was to evaluate the histological and functional behavior of
heterologous acellular aortic matrix, when implanted in the urethra of
rabbits.
Material and Method – Abdominal aorta was taken from swine, processed
with SDS and stored in alcohol, in order to obtain tubular acellular matrix.
Twenty-four male rabbits, weighing 3 kg, were randomly divided in two
groups: (AO)- complete urethral section and replacement with a 1 cm
acellular aortc matrix tubular graft and (TT)- complete urethral section and
end-to-end anastomosis. A retrograde urethrogram was performed at 15
(M2) and 90 (M3) days after surgery, when the animals were euthanized.
The exams were analised for presence of fistula and/or strictures. Standard
histological analysis with Hematoxylin-eosin, Masson’s Trichrome and
Calleja characterized the inflammation, epithelial hyperplasia, blood
vessels, muscle fibers, collagen and elastic fibers content, in different
groups.
Results – Two animals of each group died during the study and were
excluded. In M2, 36.3% of strictures was observed in the animals of Group
AO (p <0,05). In M3, strictures occurred in both groups, but this difference
was not significant (p> 0,05). A greater percentage of fistula occurred in
Group AO, in M3 (p <0,05). The gross and microscopic evaluations did not
allow us to identify the acellular matrix region in this group. Absence of
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
55
foreign body giant cells, increased presence of epithelial hyperplasia (p
<0,001) and blood vessels (p <0,005) were observed. Muscle fibers were
abundant in lamina propria of the animals in the Group TT (p <0,01). There
was no statistical difference between the amount of elastic fibers in the two
groups.
Conclusions - In Group AO, acellular matrix was well incorporated in the
urethra, without rejection signs. However, fistulas and strictures occurred
more frequently in animals of this group. After 90 days, muscle
regeneration was not satisfactory in Group AO, but intense vascularization
and epithelialization developed in the matrix.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
56
1. INTRODUÇÃO
A uretroplastia é realizada com frequência na rotina
urológica, para corrigir enfermidades congênitas, estenoses e afecções
traumáticas da uretra
1
. A reparação de longos segmentos uretrais ou
deformidades graves geralmente requer a utilização de tecidos adicionais.
Tecidos autólogos de diversas fontes têm sido empregados, incluindo pele
genital
2
ou extragenital
3,4
, mucosa vesical
5,6
, túnica vaginal
7,8
, mucosa
bucal
9,10
e veia
11,12
. Entretanto, diversas complicações podem ocorrer, como
retração do enxerto, estenose e fístula
13
. Melhores resultados são
observados com a utilização de mucosa bucal
14
mas, de modo similar aos
demais tecidos, a necessidade de realização de uma segunda incisão para
obtenção do enxerto aumenta a morbidade do procedimento
15
.
Atualmente, as inovações tecnológicas têm proporcionado
o desenvolvimento laboratorial de substitutos teciduais, por meio da
bioengenharia de tecidos
16
. Estes materiais são capazes de auxiliar a
regeneração e reparação de lesões no trato urinário, objetivando restaurar a
função normal de determinada estrutura ou órgão
16,17
.
Neste contexto, as matrizes extracelulares absorvíveis
destacam-se por possuírem características favoráveis ao crescimento
tecidual. Polímeros absorvíveis ou materiais biológicos podem servir como
matéria-prima para confecção destas matrizes
18
. Quando tecidos biológicos
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
57
são utilizados, há necessidade de cuidadoso preparo, envolvendo
principalmente a adequada descelularização
19
. Este procedimento é
responsável pela baixa antigenicidade do material
19,20
. Inúmeras pesquisas
desenvolvidas demonstram bons resultados envolvendo matrizes acelulares
em cirurgias reconstrutivas uretrais, como o SIS (submucosa intestinal
suína)
21,22
e matriz acelular de mucosa vesical
23
.
Tecidos tubulares acelulares (uretra e aorta)
24,25
são opções
possíveis em reconstruções uretrais onde o enxerto onlay não é suficiente
para reparar a lesão. Entretanto, a utilização de tubos em uretroplastia
encontra-se em constante aperfeiçoamento, uma vez que apresentam taxas
de complicações superiores à técnica onlay
12,26
. Até o momento não há
relatos na literatura utilizando matriz acelular arterial heteróloga em
substituições uretrais. Considerando a necessidade de aperfeiçoamento da
técnica tubular e diante das diferentes possibilidades oferecidas pela
bioengenharia, decidimos pela criação de uma matriz acelular tubular de
aorta, avaliando seu comportamento quando implantada na uretra.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
58
2. OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo concentraram-se em:
1) desenvolver técnica de descelularização para a produção de matriz
acelular de aorta suína;
2) avaliar o comportamento deste enxerto tubular, quando implantado na
uretra de coelhos, por meio de acompanhamento clínico, avaliação
radiográfica e histopatológica;
3) comparar o conjunto de respostas do organismo à matriz acelular
heteróloga com um grupo de animais submetidos à uretroplastia sem
utilização de enxerto.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
59
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi realizado após análise pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal, da Faculdade de Medicina de Botucatu, com
aprovação em 28 de junho de 2007 (Anexo 1).
3.1- PREPARO DA MATRIZ ACELULAR HETERÓLOGA
A artéria aorta abdominal foi coletada de porcos
eutanasiados na Rotina Experimental de Laparoscopia dos Laboratórios
Experimentais da Faculdade de Medicina de Botucatu. Os fragmentos de
artéria, calibrados com sonda 10 Fr, foram lavados com solução salina
estéril a 0,9% e submetidos à dissecção microscópica, para retirada da
maior quantidade possível de tecido conjuntivo. Estes fragmentos foram
então submersos em solução contendo SDS (dodecil sulfato de sódio) 0,1%,
a 37° C, por um período de 15 horas, sendo posteriormente lavados, sob
agitação, com PBS (solução salina tamponada) acrescido de 10% de sulfato
de gentamicina. Foram feitas cinco lavagens, com duração de 10 minutos
cada. A ausência de elementos celulares foi confirmada pela análise
histológica (Figura 1) e as matrizes acelulares foram individualmente
armazenadas em álcool 70º, até o uso. Para avaliar a ausência de
contaminação do material, desde a coleta da artéria até o momento da sua
utilização, foram realizadas culturas em 3 amostras aleatórias.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
60
Figura 1 – A- Aorta suína, antes do processo de descelularização (HE, 10x);
B- Aorta suína, após descelularização (HE, 10x); C- Disposição das fibras
elásticas na aorta acelular (Calleja, 20x).
3.2- GRUPOS EXPERIMENTAIS E DELINEAMENTO
EXPERIMENTAL
Foram utilizados 24 coelhos machos, da raça North Folk,
fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual Paulista-
UNESP, distribuídos, por sorteio, em dois grupos experimentais: (AO) –
secção completa da uretra e implante de segmento tubular de matriz
acelular de aorta, com 1 cm de extensão e (TT) - secção completa da uretra
e sutura término-terminal.
O dia da cirurgia foi considerado o momento inicial do
estudo (M1). Após serem devidamente pesados, os animais receberam
como medicação pré-anestésica a acepromazina (1 mg/kg) e cloridrato de
fentanila (3 µg/kg), via subcutânea. A indução anestésica foi feita com
cloridrato de xilazina (5 mg/kg) e cloridrato de quetamina (30 mg/kg), via
A
B
C
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
61
intra-muscular. Em seguida, realizou-se a anestesia epidural com lidocaína
associada à bupivacaína (0,2 ml/kg total, na proporção de 1:1). Os animais
receberam fluidoterapia de manutenção, mediante cateterização da veia
marginal da orelha. Em caso de necessidade, a complementação anestésica
durante a cirurgia foi feita com diazepan (1 mg/kg) e cloridrato de
quetamina (2 mg/kg), via intravenosa.
Para o procedimento cirúrgico, realizado em condições
estéreis, a pele do prepúcio foi reparada (nylon 4-0), expondo a região
perineal. A uretra foi cateterizada com sonda uretral 10 Fr e a porção distal
do pênis do coelho foi fixada com ponto de reparo (nylon 4-0). Procedeu-se
à incisão da pele e subcutâneo, exatamente entre o pênis e o ânus. A uretra
foi dissecada, reparada e submetida apenas à incisão transversal. No Grupo
AO, a matriz acelular foi fixada à uretra com auxílio de quatro pontos de
reparo (vycril 7-0) e suturada com pontos contínuos, com o mesmo fio. Ao
final, fez-se síntese do subcutâneo e pele em planos separados, com pontos
simples isolados. A sequência cirúrgica pode ser observada na Figura 2.
No Grupo TT não foi realizado colocação da matriz, sendo
feita a secção e posterior sutura término-terminal dos segmentos uretrais,
utilizando-se sutura contínua (Vicryl 7-0), entre 2 pontos de reparo. A
sonda uretral foi mantida por 24 horas em todos os animais.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
62
Figura 2– A- Exposição da região perineal, por meio de pontos de reparo no
prepúcio; B- Sondagem e dissecção da uretra; C- Posicionamento da matriz
acelular, com 1 cm de comprimento; D- Aspecto final da anastomose.
A B
C
D
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
63
A uretrografia foi realizada com 15 (M2) e 90 dias (M3) de
pós-operatório (PO), utilizando-se arco cirúrgico de radioescopia, Marca
Phillips, Modelo BV-300. Os animais foram tranquilizados com
acepromazina (1 mg/kg) e cloridrato de fentanila (3 µg/kg), via intra-
muscular e efetuou-se injeção de contrastre radiológico iodado pela sonda
uretral, previamente introduzida e fixada na extremidade distal da uretra. Os
exames foram gravados e posteriormente salvos em arquivos digitais, para
documentação e análise.
Os animais receberam 5 mg/kg/dia de Enrofloxacina e 3
mg/kg/dia de Cetoprofeno, iniciados no momento da indução anestésica e
mantidos até o quinto dia PO, via subcutânea.
As alterações clínicas em decorrência de estenoses
obstrutivas e/ou fístulas foram acompanhadas durante todo o estudo.
No momento M3, após uretrocistografia, a eutanásia foi
realizada com tiopental sódico (50 mg/kg) e aplicação complementar de
cloreto de potássio, ambos por via intravenosa. A seguir, procedeu-se a
retirada do pênis em bloco, com incisão próxima ao púbis. A peça foi fixada
em formaldeído a 10%, por 10 dias. Após este período, a uretra foi
dissecada e avaliada macroscopicamente (Figura 3).
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
64
O implante foi então seccionado longitudinalmente. Os
segmentos de uretra foram preparados em blocos de parafina e as lâminas
foram coradas com hematoxilina e eosina (HE), tricrômio de Masson (TM)
e Calleja sem permanganato (CLJ).
A B
Figura 3 – A- Uretra dissecada, separada do corpo cavernoso, após fixação
em formalina; B- Uretra cateterizada, antes da secção longitudinal
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
65
3.3- PARÂMETROS ESTUDADOS
As variações do peso entre M1 e M3 foram comparadas
entre os diferentes grupos. Durante todo o estudo, os animais foram
diariamente observados para que possíveis alterações clínicas decorrentes
de estenose/obstrução uretral ou fístulas fossem detectadas. A estrangúria
foi identificada quando os animais realizavam esforço abdominal e pouca
urina era eliminada pelo meato uretral. Foi considerada estenose a redução
superior a 10% da luz uretral, observada pela urografia, em M2 e M3.
A análise das lâminas foi realizada sem que o examinador
tivesse prévio conhecimento dos grupos estudados. Os segmentos de tecido
foram avaliados quanto à presença de processo inflamatório, epitelização do
enxerto, presença de fibras musculares, fibras elásticas, colágeno e vasos
sanguíneos na lâmina própria. A classificação destas alterações baseou-se
em escore estabelecido de 0 a 3 (0-ausente, 1- leve, 2-moderado e 3-
intenso). A média do escore foi obtida pela análise de 4 campos por lâmina.
A intensidade de fibras colágenas, quantidade de fibras
musculares, elásticas e de células inflamatórias foi avaliada de forma
subjetiva, sendo estimada em função da área ocupada na lâmina, no
aumento de 20 vezes.
Com relação ao epitélio, a presença de uma a duas camadas
celulares na área cirúrgica foi considerada como hiperplasia leve, três
camadas como moderada e quatro ou mais camadas como hiperplasia
intensa. As avaliações foram feitas com aumento de 40 vezes (Figura 4).
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
66
Figura 4 – A- Hiperplasia epitelial leve; B- Hiperplasia epitelial intensa
(HE, 40x).
A ocorrência de até 3 vasos por campo foi considerada
vascularização leve, 4 a 5 vasos moderada e, acima de 5 vasos por campo,
vascularização intensa, observados com aumento de 20 vezes (Figura 5).
Figura 5 – A- Vascularização leve(*); B- Vascularização intensa (HE, 40x).
A
B
* *
*
A B
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
67
3.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
O estudo do peso corpóreo, envolvendo diferentes
momentos de avaliação, foi feto pela análise de variância para o modelo de
medidas repetidas, em grupos independentes.
Em relação às variáveis inflamação, hiperplasia, fibras
elásticas, musculares, colágenas e vasos sanguíneos, utilizou-se teste não
paramétrico de Mann-Whitney para grupos independentes.
O estudo da associação ente grupos e ocorrência de
complicações (fístula, estenose) nos diferentes momentos foi realizado o
teste de Goodman para contrastes entre e dentro de populações
multinomiais.
Para indicação das significâncias, foram consideradas letras
minúsculas na comparação dos grupos, fixado o momento de avaliação e
letras maiúsculas para comparação de momentos de avaliação, dentro do
grupo. Duas proporções seguidas de uma mesma letra minúscula não
diferem entre si quanto às respostas dos grupos. Duas proporções seguidas
de uma mesma letra maiúscula, não diferem quanto às respostas dos
momentos de avaliação, dentro do grupo em consideração.
Todas as discussões do presente trabalho foram realizadas
no nível de 5% de significância.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
68
4. RESULTADOS
4.1- PESO CORPÓREO DOS ANIMAIS
Os 24 coelhos estudados apresentavam peso médio de 3,1
0,3 kg no momento M1. A tabela abaixo contém a média e desvio padrão
do peso dos animais, nos momentos M1 e M3.
TABELA 1 – Média e desvio-padrão do Peso dos animais (kg),
segundo grupos e momentos de avaliação.
Grupo
Pré-operatório
M1
90 dias PO M3
Resultado por
momento
AO
2,98 0,26 3,64 0,62
p<0,005
TT
3,18 0,37 4,00 0,35
P<0,001
Resultado por
grupo
p>0,05 p>0,05
Na Tabela 1, observamos que os animais de ambos os
grupos apresentaram ganho de peso em M3, com relação ao momento M1.
Esta diferença de peso foi estatisticamente significante dentro do Grupo AO
(p<0,005) e TT (p<0,001). Não há diferença significativa do ponto de vista
estatístico entre os dois grupos, nos momentos avaliados.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
69
4.2- AVALIAÇÃO CLÍNICA
No Grupo TT, 4 dos 12 animais (33,3 %) apresentaram
estrangúria no PO imediato. Destes, 2 evoluíram com severa estenose e
vieram a óbito nos primeiros dias de PO. Um animal apresentou pequena
fístula, com fechamento espontâneo, observada no 26º dia PO. Este animal
evoluiu bem até o final do estudo e houve cicatrização espontânea da
fístula.
No Grupo AO, observou-se no decorrer do estudo que 5
animais (41,6%) apresentaram estrangúria, sendo registrados 2 óbitos
(33,3%), - 1 na primeira semana e outro aos 30 dias de PO.
Dos 12 animais operados em cada grupo, seguiram até o
final do experimento, fazendo parte da análise anatomopatológica, 10
animais do Grupo AO e 10 animais do Grupo TT. Os animais com óbito
registrado antes de 90 dias de pós-operatório foram excluídos.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
70
4.3- AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA
4.3.1 – AVALIAÇÃO DE ESTENOSE
A tabela abaixo mostra a frequência de estenose e sua
respectiva significância estatística, nos diferentes grupos e momentos.
TABELA 2 – Frequência de resposta da variável estenose, segundo grupos
e momentos de avaliação.
Momentos Grupos Estenose
N Animais
AO
4 (0,36) bA 11
M2
TT
0 (0,00) aA 10
AO 4 (0,40) aA 11
M3
TT
3 (0,30) aA 10
No Grupo TT, 10 animais foram submetidos ao exame
radiográfico realizado nos momentos M2 e M3 enquanto que no Grupo AO
11 animais foram radiografados em M2 e 10 em M3.
Aos 15 dias de pós-operatório (M2), 36% dos animais
(4/11) do Grupo AO apresentaram estenose. Houve diferença significante
em relação ao Grupo TT (p<0,05), onde não foi observado alteração em
nenhum animal. Em 2 animais (18,2%) do Grupo AO, notou-se
irregularidade na parede da uretra, com falhas de preenchimento pelo
contraste, sem estenose (Figura 6).
B
A
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
71
Figura 6 – Grupo AO- A- Estenose em M2 (animal 25); B- Estenose e
fístula, com extravasamento de contraste (seta) em M2 (animal 13); C e D-
Urografia do animal 24, mostrando irregularidade na parede da uretra em
M2 e ausência de estenose em M3, respectivamente.
A
D
B
C
D
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Juliany Gomes Quitzan
72
Em M3, aos 90 dias de pós-operatório, a incidência de
estenose foi de 30% (3/10) para o Grupo TT (Figura 7) e 40% para o Grupo
AO, sem diferenças estatísticas.
Figura 7 – Grupo TT- A e B- Estenose (animal 31 e 19, respectivamente), C
e D - Uretrografias normais (animal 11 e 30). Todas as radiografias foram
realizadas em M3.
B
D
B
A
B
C
D
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
73
4.3.2 – AVALIAÇÃO DE FÍSTULA
A Tabela 3 mostra a frequência de fístula e sua respectiva
significância estatística, nos diferentes grupos e momentos.
TABELA 3 – Frequência de resposta da variável fístula, segundo grupos e
momentos de avaliação.
Momentos Grupos Estenose
N Animais
AO
1 (0,09) aA 10
M2
TT
0 (0,00) aA 10
AO
3 (0,30) bA 10
M3
TT
0 (0,00) aA 10
Nenhuma fístula foi observada pela uretrografia nos
animais do Grupo TT. Apesar de um animal ter apresentado clinicamente
fístula puntiforme, nas radiografias realizadas em M2 e M3 não foi
identificado extravasamento de contraste.
Nos animais do Grupo AO, a taxa de ocorrência de fístulas
foi de 9% em M2 e 30% em M3, apresentando diferença significativa neste
último momento, comparada ao Grupo TT (p<0,05).
A B
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
74
Os achados radiográficos, expressos em porcentagem,
podem ser observados no Gráfico 1.
0
20
40
60
80
100
% animais
Estenose Fístula Estenose Fístula
M2 M3
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 1 – Distribuição da porcentagem de ocorrência de fístula e estenose
nos diferentes grupos, em M2 e M3.
*
*
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
75
4.4- AVALIAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA URETRA
4.4.1 – AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
A avaliação macroscópica realizada após a eutanásia
possibilitou observar maior aderência dos tecidos adjacentes à uretra nos
animais do Grupo AO que possuíam fístula urinária. Após fixação em
formalina 10%, a secção longitudinal do pênis nos permitiu confirmar a
presença das fístulas evidenciadas pelo exame radiográfico (Figura 8A).
Não foi possível distinguir a aorta implantada do tecido uretral em nenhum
destes animais (Figura 8B.).
Figura 8- A- Fístula (seta) e aspecto uniforme da mucosa uretral, após fixação em
formol (Grupo AO); B- Uretra de um dos animais do Grupo AO, sem limites entre
matriz e tecido normal, após eutanásia.
A
B
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
76
4.4.2 – AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA
As medianas individuais dos parâmetros avaliados,
encontradas em cada grupo, estão apresentadas na Tabela 4.
TABELA 4 – Mediana e valores mínimo e máximo das variáveis, segundo
grupos.
Grupos Estatística
Variável
AO TT
Valor p
Inflamação
2,0 (1,0-3,0) 1,5 (1,0-3,0) p>0,05
Epitélio
3,0 (2,0-3,0) 1,0 (1,0-2,0) p<0,001*
Vasos
2,5 (1,0-3,0) 1,0 (1,0-2,0) p<0,005*
Tec. Conj.
3,0 (2,0-3,0) 2,0 (1,0-3,0) p>0,05
F. musculares
1,0 (1,0-2,0) 3,0 (3,0-3,0) p<0,001*
F. Elásticas
2,0 (1,0-3,0) 2,5 (1,0-3,0) p>0,05
A intensidade da reação inflamatória foi comparada em
função dos grupos estudados, por meio da coloração HE, e está
representada no Gráfico 2. 100% dos animais de ambos os grupos
apresentaram graus variados de inflamação, sendo que a maior porcentagem
de inflamação leve foi registrada no Grupo TT (50%). Em 20% dos animais
de ambos os grupos ocorreu reação inflamatória intensa (Figura 9),
caracterizada predominantemente por células mononucleares. As diferenças
entre os grupos não foram significativas (p>0,05).
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
77
0
20
40
60
80
100
% animais
Leve Moderado Intensa
Inflamação
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 2 – Distribuição da porcentagem de animais dos diferentes grupos,
segundo a intensidade do infiltrado inflamatório.
Figura 9 – Infiltrado inflamatório intenso na lâmina própria de animal do
Grupo AO (HE, 20x).
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
78
A hiperplasia epitelial, avaliada pelas lâminas coradas com
HE, foi considerada severa em 70% dos animais do grupo AO, com
presença de 4 ou mais camadas de células localizadas sobre a membrana
basal . Por outro lado, no Grupo TT observou-se maior número de animais
com hiperplasia leve, totalizando 60%. Considerou-se presença de
hiperplasia moderada em 30% dos animais do Grupo AO e 40% do Grupo
TT (Gráfico 3). A diferença entre a hiperplasia observada nos dois grupos
foi significativa, do ponto de vista estatístico (p<0,001).
0
20
40
60
80
100
% animais
Leve Moderada Intensa
Hiperplasia epitelial
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 3 – Distribuição da porcentagem de animais dos diferentes grupos,
segundo a intensidade da hiperplasia epitelial.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
79
O número de vasos sangüíneos na lâmina própria também
foi avaliado pelo HE e está representado no Gráfico 4. No grupo AO, 90%
dos animais apresentaram quantidade moderada e intensa de vasos nesta
camada, enquanto que no Grupo TT a maioria apresentou leve quantidade
(80%) (p<0,005).
0
20
40
60
80
100
% animais
1-3/campo 4-5/campo >5/campo
Vasos sangüíneos
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 4 – Distribuição da porcentagem de animais dos diferentes grupos,
segundo a quantidade de vasos sangüíneos presentes na lâmina prórpia.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
80
A área da lâmina própria da uretra ocupada pelo tecido
conjuntivo denso foi analisada pelas lâminas coradas com Tricrômico de
Masson. Independente da técnica de uretroplastia realizada, o acúmulo leve
de colágeno ocorreu em pequena porcentagem dos animais. O acúmulo
moderado de fibras colágenas foi evidenciado em 75% do Grupo TT,
enquanto que a maior porcentagem de animais com intensa quantidade de
colágeno (62,5%) estava presente no Grupo AO (Gráfico 5). Entretanto,
esta diferença entre os grupos não foi significativa pela análise estatística
(p>0,05).
0
20
40
60
80
100
% animais
Leve Moderado Intenso
Colágeno
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 5 – Distribuição da porcentagem de animais dos diferentes grupos,
segundo a intensidade de fibras colágenas na lâmina própria.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
81
Para analisar a presença de fibras musculares na lâmina
própria da uretra, também foram examinadas as lâminas coradas com TM
(Figura 10). Em 100% dos animais do Grupo TT, observou-se intensa
quantidade de fibras musculares (p<0,001). Nos animais do Grupo AO,
foram identificadas apenas presença leve (60%) e moderada (40%) de
musculatura. A representação destes valores pode ser observada no
Gráfico 6.
0
20
40
60
80
100
% animais
Leve Moderada Intensa
Fibras musculares
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 6 – Distribuição da porcentagem de animais dos diferentes grupos,
de acordo com a presença de fibras musculares na lâmina própria.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
82
Figura 10 – A- Escore 2 para fibras colágenas e 3 para fibras musculares (Grupo
TT), opondo-se à maior quantidade de colágeno (escore 3) e poucas fibras
musculares (escore 1-seta), mostradas na Figura B (Grupo AO) (TM, 40x).
Ao analisar as lâminas coradas pelo Calleja, pode-se notar
a quantidade de fibra elástica presente na lâmina própria da uretra,
representada no Gráfico 7. No Grupo AO, 25% dos animais apresentaram
quantidade leve e 75% quantidade moderada de fibras elásticas na uretra.
Somente animais do Grupo TT apresentaram intensa quantidade de fibras
elásticas (40%). Em duas lâminas, posteriormente identificadas como sendo
de animais do Grupo AO, pode-se notar a presença de focos de fibras
elásticas na lâmina própria (Figura 11).
A
B
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
83
0
20
40
60
80
100
% animais
Leve Moderada Intensa
Fibras elásticas
Grupo AO
Grupo TT
Gráfico 7 – Distribuição da porcentagem de animais dos diferentes grupos,
segundo a intensidade de fibras elásticas (p>0,05).
Figura 11 – A – Foco de fibras elásticas, desorganizadas (Grupo AO); B-
Disposição de fibras elásticas (escore 3) em animal do Grupo TT (CJP,
20x).
A
B
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
84
5. DISCUSSÃO
O desenvolvimento de matrizes acelulares absorvíveis foi
recentemente proposto como uma opção nos casos onde há necessidade do
uso de substitutos uretrais alternativos. Matrizes obtidas de diferentes
modelos animais têm demonstrado melhor regeneração uretral, quando
comparadas com o uso de matrizes absorvíveis sintéticas
27
. Nossa proposta
foi avaliar a incorporação da artéria aorta de suíno na uretroplastia tubular
em coelhos.
O coelho é considerado um bom modelo experimental
devido similaridade da anatomia e o tamanho do pênis com o de uma
criança
1,28
, sendo o animal mais utilizado em pesquisas que envolvem o
reparo de lesões uretrais. Outras vantagens, também observadas por
diferentes pesquisadores, incluem a facilidade de manipulação dos animais,
baixo custo para manutenção e simplicidade do acesso cirúrgico
24,29
. A
histologia da uretra normal e em diferentes condições patológicas é bem
documentada na literatura, facilitando a comparação entre os estudos
29
.
Consideramos ainda a experiência do nosso grupo experimental, adquirida
em trabalhos anteriores envolvendo uretroplastias
22,30
.
Enxertos de matrizes acelulares podem ser obtidos de
diferentes fontes doadoras, como submucosa intestinal, bexiga, uretra e
vasos sangüíneos
16
. A estrutura da matriz fornece um suporte adequado
para replicação celular, sendo absorvida e substituída por tecido regenerado
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
85
do hospedeiro. Quando a matriz é tubular, como a artéria, elimina-se o
tempo gasto para a confecção do tubo e a linha de sutura longitudinal
12,26
,
otimizando o tempo cirúrgico. Apesar de estar disponível na forma tubular,
não há impedimento para que o cirurgião utilize patch da artéria em
reconstruções onlay. Em comparação às veias, as artérias são caracterizadas
por alta susceptibilidade à remoção de células e melhor preservação da
matriz de colágeno e elastina
31
. As veias também apresentam como
inconveniente a maior predisposição para formar criptas e pólipos
32
.
A fonte da matriz acelular afeta a qualidade de crescimento
do tecido, mas ainda não foi comprovado qual o melhor animal para uso
1
. A
escolha do animal depende de considerações éticas, da proporção entre o
material e o receptor, dos custos e da viabilidade para sua obtenção. No
Brasil, a espécie suína é abatida diariamente para consumo, facilitando o
acesso à matéria-prima para confecção das matrizes, com comprimento e
diâmetros variados, oferecendo a oportunidade de criação de um banco de
tecidos acelulares.
Para que bons resultados fossem obtidos com o uso da
matriz heteróloga, um passo fundamental foi a escolha do método de
descelularização. Este processo confere alta biocompatibilidade à matriz,
por diminuir a antigenicidade do material e a sensibilização do
hospedeiro
20
. As diferentes técnicas de descelularização propostas
consideram a eficácia da remoção celular, associada à manutenção da
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
86
integridade da matriz. Nós optamos pelo método químico utilizando o
dodecil sulfato de sódio (SDS), considerando-se relatos de sucesso da
descelularização de tecidos vasculares com o uso deste detergente
20,33
.
Não há relatos na literatura descrevendo técnicas de
uretroplastia com matriz acelular previamente preparada com SDS. Estudos
que utilizaram uretra homóloga
25,34-36
ou heteróloga
27
obtiveram a
descelularização por meio do desoxicolato de sódio (DCA). Tanto o SDS
quanto o DCA são classificados como detergentes iônicos. A técnica com
DCA, inicialmente descrita por Meezan et al. e modificada por Probst et
al.
37
inclui o tratamento prévio com DNAse, um detergente enzimático. A
associação é necessária, pois o DCA usado isoladamente não promove
remoção celular completa.
A ação do DCA na descelularização de ureter
38
foi
comparada com outros diferentes tratamentos, incluindo SDS, detergente
não-iônico (Triton-X) e detergente enzimático (tripsina). A melhor taxa de
descelularização e organização das fibras colágenas foi obtida com o
Triton-X, seguida pelo DCA. Entretanto, os detergentes utilizados na
descelularização de matrizes provenientes de tecidos urológicos parecem
não ter a mesma eficácia quando utilizados em vasos e valvas sangüíneas.
Isto realmente comprova que os protocolos variam de acordo com o tecido
a ser descelularizado
19
. Como exemplo, tecidos valvares tratados com
Triton-X
167
demonstraram perda de substâncias que estimulam angiogênese
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
87
e adesão celular (glicosaminoglicanas, laminina e fibronectina). Remoção
incompleta de células de vasos sanguíneos também foi relatada
19
. Com
relação ao DCA, de acordo com Gilbert et al
19
, este detergente tende a
causar grande desarranjo na arquitetura da matriz, quando comparado ao
SDS.
O SDS tem sido associado à eficiente remoção celular de
tecidos vasculares
20
. Mudanças nas propriedades mecânicas de tecidos
vasculares
40
bem como nas concentrações de colágeno e glicosaminas não
foram alteradas após o tratamento com SDS
41
. Utilizamos a concentração
de 0,1%, uma vez que as concentrações superiores a 0,05% estão
relacionadas à melhor taxa de descelularização e preservação da matriz
20
.
Amostras de tecido tratadas com álcool etílico 75%, após a
descelularização, apresentaram concentração residual de SDS 23 vezes
menor, com satisfatório crescimento celular, quando comparadas às
amostras lavadas com solução alcalina
41
. No presente estudo, optamos pelo
armazenamento das matrizes em álcool 70%, diminuindo o efeito residual
do SDS e a possibilidade de contaminação dos fragmentos. O resultado
negativo das culturas realizadas aleatoriamente durante o estudo, em todas
as fases do preparo da matriz, confirmaram a esterilização das amostras.
Outro diferencial proposto em nosso estudo foi a utilização
da anestesia epidural. Apesar das particularidades anatômicas inerentes aos
lagomorfos, que dificultam a intubação orotraqueal, a utilização da
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
88
anestesia inalatória foi citada em diversas pesquisas
23,27,34
. Porém, não
foram encontrados relatos de utilização da técnica epidural em
uretroplastias experimentais em coelhos. No presente estudo, a via epidural
proporcionou uma anestesia segura, por um tempo prolongado
(aproximadamente 90 minutos), evitando a necessidade de doses adicionais
de anestésicos, como ocorre quando protocolos dissociativos são
instituídos
22,24
. A estabilidade do paciente durante a cirurgia resultou em
ausência de óbitos em decorrência do procedimento anestésico.
Com relação ao procedimento cirúrgico, adotou-se a
distância de 2 cm do meato uretral externo para a fixação da parte superior
do enxerto, cujo tamanho foi padronizado em 1 cm. Após a eutanásia, o
pênis foi retirado em bloco, sendo a uretra incisada longitudinalmente desde
o púbis até o meato uretral, abrangendo toda a região do enxerto. Esta
margem de segurança possibilitou evitar o uso de sutura inabsorvível para
demarcar a área substituída pela aorta acelular. O fio inabsorvível pode ter
influência negativa no estudo da resposta do organismo ao enxerto
27,29,34
,
apesar deste procedimento ser adotado em diversos trabalhos experimentais,
envolvendo uretroplastias parciais
42,43
ou tubulares
25,35
. A uretra bulbar do
coelho é recoberta por uma escassa quantidade de tecido e a inflamação
local prejudica diretamente o restabelecimento da lesão uretral
29
. Foi
observado ainda que a persistência do material de sutura na região
periuretral está associada à ocorrência de fístulas
29,34
.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
89
A derivação urinária também é considerada controversa no
pós-operatório de uretroplastias. A ausência de contato entre a urina e a área
recém-operada pode propiciar melhores condições de cicatrização local,
protegendo a anastomose durante a primeira semana
44
. Quando enxertos são
utilizados, a presença do cateter promove sua estabilização
45
. A imobilidade
e a vascularização do leito receptor garantem a melhor incorporação do
enxerto
46
. Em estudos experimentais, menores números de complicações
foram relatados em animais mantidos com cateterização uretral
5,27,28
.
Porém, a cateterização prolongada pode causar inflamação exacerbada e
ressecamento da uretra, prejudicando a cicatrização
45
.
Os benefícios obtidos com a manutenção da sondagem
contrapõem-se a algumas dificuldades técnicas, encontradas nos
experimentos com coelhos. Theodorescu et al.
47
relataram a facilidade de
obstrução do cateter no pós-operatório devido a urina concentrada deste
animal, rica em cristais de fosfato. Outro obstáculo comum é a eficaz
manutenção da sonda. Os resultados satisfatórios com a sondagem bem
como sua permanência por tempo determinado foram observados com
maior freqüência nos estudos em que os animais eram mantidos contidos no
PO
5,28,45
, impossibilitando-os de acessar a região perineal. Porém,
independente da restrição física, a maioria dos trabalhos refere perda
prematura do cateter
1,5,27,28,45
. Além disso, os coelhos fazem coprofagia e a
restrição a este hábito é considerada fonte de estresse ao animal, podendo
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
90
levá-lo a óbito. A cistostomia também é referida na literatura como método
viável de derivação em uretroplastias
44,48
, apesar da maior morbidade do
procedimento.
Parnigotto et al.
24
, assim como outros autores que utlizaram
matrizes acelulares em uretroplastia de coelhos
22,23,42
, não mantiveram a
derivação urinária. O baixo índice de complicações relatado, mesmo em
reconstruções tubulares
24
, sugere que a presença da sonda não é o principal
fator que interfere na viabilidade do enxerto e patência do lúmen uretral.
Em nosso estudo, optamos por manter a sondagem uretral apenas nas
primeiras 24 horas de PO, sendo que 100% dos animais perderam
espontaneamente o cateter.
Apesar das diferentes técnicas propostas na literatura, a
incidência de fístulas uretrocutâneas é ainda considerada a complicação
mais comum em uretroplastias
42
. O material de sutura pode ser fator
predisponente para sua ocorrência. No presente trabalho, utilizamos ácido
poliglicólico nas uretroplastias. Cimador et al.
49
, analisando 535 pacientes
submetidos à correção de hipospádia, afirmaram que fios de sutura com
absorção lenta, como o ácido poliglicólico, podem reduzir a incidência de
fístulas por promoverem um tempo de contato maior entre as extremidades
reparadas. Entretanto, segundo os autores, a meticulosa realização da
técnica e a experiência do cirurgião são fatores de maior relevância na
análise das fístulas. Corroborando esta afirmação, a origem do fio não
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
91
pareceu ter influências sobre a casuística de fístulas observadas em nosso
estudo, uma vez que estas foram detectadas apenas nos animais do Grupo
AO. A ocorrência das fístulas provavelmente esteve mais relacionada a
pouca vascularização do leito, a instabilidade do enxerto e a interposição da
sutura da uretra com a pele.
Inicialmente, já familiarizados com a anatomia da genitália
do coelho e sabendo da escassez de tecido que encontraríamos para recobrir
o enxerto, propusemos um terceiro grupo utilizando túnica vaginal para
envolver a matriz de aorta, com a finalidade de mantê-la distante da sutura
de pele. A ocorrência de estenose e retenção urinária foram responsáveis
pelo óbito de todos os animais, com menos de 30 dias (Apêndice).
Resultados similares foram relatados por Theodorescu et al.
28
. Segundo os
autores, que utilizaram enxerto tubulizado de túnica na substituição uretral,
os óbitos observados ocorreram em virtude da contração das fibras
cremastéricas e conseqüente estenose. Poderíamos ter otimizado os
resultados obtidos com o uso de um retalho de túnica, de modo similar ao
realizado por Snow
50
para previnir fístulas em correções de hipospádias,
com bons resultados. Mas, para não alterar o delineamento do estudo e da
aleatoreidade dos procedimentos cirúrgicos, optamos por não dar
seguimento a este grupo.
Para identificar as estenoses uretrais, utilizamos a
uretrografia retrógrada, método citado em grande parte dos estudos clínicos
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
92
e experimentais
7,22,26
e considerado o padrão-ouro para o diagnóstico de
estenoses uretrais. A uretrografia identificou diminuição do lúmen uretral
em animais de ambos os grupos. Apesar do maior número de estenoses
observados no Grupo AO, em M3, esta diferença não foi estatisticamente
significante. A simples manipulação da uretra delgada e da pele da região
genital do coelho pode predispor à inflamação e fibrose
29
, causando
estenose, independente do uso de enxertos. A incidência de fístula e
estenose observada em nosso estudo é inferior a alguns relatos da
literatura
35,51-53
, que chegam a ter índice de 100% destas complicações em
reconstrução uretral tubular com matriz acelular
35,52
. Porém, no estudo em
que há maior similaridade com nossa metodologia, onde matriz acelular
arterial homóloga
24
foi utilizada em coelhos, não foram observadas
estenoses em 12 meses de seguimento.
Ainda é relevante ressaltar que os fios de sutura com absorção
lenta, apesar da sua possível contribuição evitando o aparecimento de
fístulas, podem aumentar o risco de estenose devido à prolongada reação
tecidual durante a absorção da sutura
54
. De fato, ao observarmos as lâminas
coradas pelo HE, concluímos que tanto os animais do Grupo AO quanto do
Grupo TT apresentaram inflamação uretral moderada na lâmina própria,
cujas medianas não mostraram diferença estatística entre si. A reação
inflamatória caracterizada pelo predomínio de células mononucleares
denota a cronicidade do processo. Entretanto, a ausência de células gigantes
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
93
tipo corpo estranho nos animais do Grupo AO confirmam a antigenicidade
do material utilizado. Na presença de matrizes extracelulares
biodegradáveis, a reação imunogênica não deve ocorrer se o material foi
adequadamente processado
47
.
Não só a reação inflamatória exacerbada como também o
excesso desorganizado de fibras colágenas aumentam o risco de estenose
nas uretroplastias
32
. A resposta do hospedeiro é afetada também pela taxa
de degradação da matriz. O processo de degradação da matriz no Grupo AO
foi acompanhado por maior depósito de fibras colágenas na lâmina própria.
A quantidade de colágeno avaliada não foi considerada significante do
ponto de vista estatístico, mas a maior concentração nos animais que
receberam a aorta mostra que a fibrose é proporcional à injúria cirúrgica,
como também observado em outras pesquisas com matriz em substituição
uretral tubular
11,35
.
Com relação ao Grupo TT, a menor lesão uretral foi
acompanhada por menor acúmulo de colágeno. De modo similar a outros
autores, mínima ou nenhuma evidência de fibrose foi identificada em
pequenas lesões uretrais, substutídas com patch de matriz acelular
23
.
Kawano, em 2007
22
, não observou em seu estudo a correlação entre fibrose
e estenose, conforme citado por Trindade Filho
30
, ambos utilizando patch
de diferentes matrizes. Isto indica que não só o tamanho da matriz como
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
94
também a sua constituição pode interferir no processo cicatricial e formação
de fibrose.
Shokeir et al.
35
acrescentam ainda que o comprimento
circunferencial do enxerto está diretamente relacionado à ocorrência de
fibrose e estenose, o que justifica a maior ocorrência destas alterações na
presença de tubos uretrais, como observado pela nossa análise das lâminas
coradas com Tricrômico de Masson.
A matriz ideal deve também permitir a epitelização de seu
lúmen e promover vascularização
47
. Para que isto ocorra, o enxerto precisa
ser incorporado ao receptor, ocorrendo cicatrização mediante regeneração
tecidual da área lesionada. Grande parte dos pesquisadores refere o
crescimento do urotélio na matriz acelular 2 a 3 semanas após sua
implantação
23,24,34
. Também observamos completa epitelização da neouretra
dos animais do Grupo AO, com hiperplasia acentuada, caracterizada por 3
ou mais camadas de células epiteliais. A presença de várias camadas
epiteliais nos animais que receberam matriz também foi demonstrada por
Shaul et al.
1
, observando o comportamento de enxerto tubulizado de
peritôneo na uretra.
A hiperplasia epitelial do Grupo AO diferiu de modo
significativo da regeneração observada na uretroplastia término-terminal do
Grupo TT, caracterizada em sua maioria por 2 camadas celulares. O mesmo
não foi encontrado por outros autores, que identificaram 3 a 4 camadas de
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
95
epitélio estratificado colunar em coelhos submetidos à simples
uretrotomia
55
.
Abaixo do epitélio, vasos sanguíneos e numerosas fibras
musculares orientadas longitudinalmente são encontrados na lâmina própria
da uretra
34
. Observamos que as análises a respeito da quantidade de vasos
por campo e da ocupação dos campos por fibras musculares apresentaram
diferenças estatísticas significantes, sendo que maior número de vasos foi
visto nos animais do Grupo AO enquanto que os animais do Grupo TT
apresentaram maiores áreas de lâmina própria ocupada por fibras
musculares. Resultados equivalentes foram relatados por Sievert et al.
34
,
que avaliaram uretroplastia término-terminal e implante de matriz acelular
homóloga em coelhos, com maior neovascularização nos animais tratados
com o implante e maior quantidade de fibras musculares nas uretroplastias
término-terminais, após três meses.
Comparando-se o comportamento da matriz uretral acelular
heteróloga e homóloga
25
, a melhor resposta de regeneração uretral ocorreu
na matriz homóloga, com neovascularização, epitelização e regeneração
muscular ocorrendo em maior intensidade e menor tempo, sugerindo que o
enxerto heterólogo requer um intervalo de tempo maior para ter a mesma
aparência histológica que o homólogo. Ambos os enxertos apresentaram
regeneração funcional, sem sinais de rejeição.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
96
Apesar de termos observado presença de feixes de fibras
musculares nas uretroplastias com matriz acelular, acreditamos que o tempo
de observação dos animais foi relativamente curto para avaliarmos a
efetividade desta regeneração. Nuininga et al.
15
não observaram feixes de
fibras musculares no SIS, após 36 semanas de sua implantação uretral,
enquanto que Rotariu
43
relatou completa regeneração de todas as camadas
da uretra, após 18 semanas.
Em nosso estudo, a matriz acelular de aorta foi utilizada na
uretroplastia do Grupo AO. A aorta é uma artéria elástica, com predomínio
de elastina em suas paredes, além de colágeno e glicosaminoglicanas. No
entanto, além dos vasos sangüíneos e fibras musculares, a uretra também
possui lâminas elásticas, localizadas na lâmina própria
31
. Não foi possível
discernir nestes animais as fibras elásticas uretrais das fibras da matriz.
Apesar de não termos encontrado diferença significativa entre os dois
grupos, 50% dos animais do Grupo TT apresentaram intensa quantidade de
fibras elásticas nas lâminas coradas pelo Calleja. A menor agressão
cirúrgica promovida pela uretrotomia foi responsável pela maior
integridade da estrutura uretral original. Por outro lado, o fato de não
termos encontrado maior quantidade de fibras elásticas nos animais do
Grupo AO, que receberam uma matriz rica neste componente, nos permite
afirmar que aos 3 meses grande parte deste material havia sido absorvido.
Em alguns animais foi possível visualizar aglomerados desorganizados de
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
97
fibras elásticas na lâmina própria, logo abaixo do epitélio, sugerindo
resquícios de matriz.
As alterações histopatológicas que caracterizaram os
diferentes grupos estudados não possibilitaram determinar macro ou
microscopicamente os limites entre a matriz acelular e a uretra normal.
Outros autores que realizaram uretroplastia tubular em coelhos citam a
impossibilidade de diferenciação entre a matriz e a uretra, com um período
de observação semelhante
24,25,51
. Diversos artigos que utilizaram matrizes
acelulares em reconstrução parcial de uretra referem integração completa,
em média aos 90 dias
23,42,43
. Deve-se considerar, entretanto que a área dos
enxertos tubulares é proporcionalmente maior, se comparada ao enxerto
onlay, necessitando de um tempo maior para completa absorção. Atala et
al.
21
afirmou ser difícil definir o período exato para que ocorra o completo
remodelamento devido às várias fontes de matrizes. Quando matriz arterial
homóloga foi utilizada na uretroplastia de coelhos, observou-se integração
após 3 meses, mas a disposição de fibras colágenas e musculares similar à
uretra normal foi vista apenas com 12 meses
24
. Acreditamos que o período
proposto em nosso estudo foi relativamente curto para observarmos
completa reorganização da estrutura uretral.
Mesmo considerando os sucessos após reconstruções
tubulares, tanto em ensaios experimentais
24
como clínicos
12
, resultados
obtidos com enxertos onlay de matriz permanecem superiores, semelhante
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
98
ao que ocorre com enxertos autólogos. A faixa de uretra que permanece
íntegra nas reconstruções onlay diminui a contração circunferencial do
enxerto, mantendo sua estabilidade e alinhamento. A maior preservação de
tecido que ocorre nas uretroplastias onlay atua como um bom leito para o
enxerto, garantindo neovascularização mais rápida e eficiente nestes
modelos
56
.
Os benefícios proporcionados pelo uso de matriz acelular
incluem sua pronta utilização e regeneração uretral, mas estenoses ainda
ocorrem em altas proporções nos materiais tubulares
35,51,53
. Para otimizar
nossos resultados, consideramos que algumas possibilidades seriam
aumentar o diâmetro do enxerto, realizar suturas oblíquas e sobrepor à
matriz um retalho vascularizado de túnica vaginal.
Poderíamos ainda associar cultura de células do
hospedeiro, feita a partir de biópsia prévia, ao uso da matriz. Alguns
estudos que realizaram semeadura dos tubos com cultura de células
35,51
relatam índices superiores de sucesso . Os resultados promissores, com
significativa diminuição de complicações nestes grupos, pode ser a
alternativa futura para viabilizar a implantação das matrizes acelulares em
seres humanos.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
99
6. CONCLUSÕES
Os resultados deste trabalho permitem concluir que:
1. O método desenvolvido no presente estudo, utilizando SDS e álcool, foi
eficiente para promover a descelularização e conservação da aorta,
tornando-a uma matriz acelular para pronta utilização.
2. Não houve diferença significante na incidência de estenose entre os
grupos AO e TT no momento M3, mas a ocorrência de fístula foi maior
nos animais do Grupo AO.
3. A matriz acelular heteróloga utilizada na uretroplastia de coelhos
apresentou boa integração para o período estudado, com intensa
epitelização e vascularização. Contudo, neste período não houve
regeneração muscular satisfatória.
Capítulo II
Juliany Gomes Quitzan
100
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Apêndice
Juliany Gomes Quitzan
108
Apêndice
Apêndice
Juliany Gomes Quitzan
109
Ilustrações referentes ao grupo associando o uso da túnica vaginal à
matriz acelular – realização da técnica em 6 animais.
Figura I- A e B – Ilustração do retalho vascularizado de túnica, envolvendo a matriz; C-
Fístula e estenose, observadas aos 15 dias de PO; D- Estenose.
A
B
D
C
Anexo
Juliany Gomes Quitzan
110
Anexo
Anexo
Juliany Gomes Quitzan
111
ANEXO 1 - Certificado da Comissão de Ética na Experimentação Animal
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