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Papel antagônico das isoformas óxido
nítrico sintase constitutiva (cNOS) e
induzida (iNOS) em camundongos
nocautes para 5-lipoxigenase infectados
com Trypanosoma cruzi.
CAROLINA PANIS
LONDRINA
2009
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS PATOLÓGICAS
CAROLINA PANIS
Papel antagônico das isoformas óxido nítrico sintase constitutiva
(cNOS) e induzida (iNOS) em camundongos nocautes para 5-
lipoxigenase infectados com Trypanosoma cruzi.
Defesa de Dissertação
apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Patologia
Experimental, da
Universidade Estadual de
Londrina.
Orientador: Prof. Dr. Phileno Pinge Filho
LONDRINA-PARANÁ
2009
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Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
P192p Panis, Carolina.
Papel antagônico das isoformas óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS) e
induzida (iNOS) em camundongos nocautes para 5-lipoxigenase infectados
com Trypanosoma cruzi / Carolina Panis. – Londrina, 2009.
93 f. : il.
Orientador: Phileno Pinge Filho
Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) − Universidade Estadual
de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em
Patologia Experimental, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Patologia experimental – Teses. 2. Chagas, Doença de – Estudos experi-
mentais – Teses. 3. Tripanosomatideos – Teses. I. Pinge Filho, Phileno. II. Uni-
versidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________
Profa. Dra. Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro
________________________________________________________
Profa. Dra. Edna Maria Vissoci Reiche
________________________________________________________
Prof. Dr. Phileno Pinge Filho
A Deus, por me conduzir nesta jornada da vida.
Ao meu esposo e filho, pela compreensão e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus, soberano, por me dar forças para enfrentar e
vencer todos os desafios da vida, sempre.
Gostaria de agradecer por ter “nascido cientista”, por ter tido uma infância adubada pela
curiosidade e pelo estímulo do pai que não teve estudo, mas que apostou tudo na filha...
Que ensinou a reconhecer as serpentes peçonhentas, que contava histórias sobre a
Amazônia que conheceu e onde contraiu malária (e quase bateu as botas!). Aqui, com
certeza, nasceu meu gosto pela imunoparasitologia! Meus profundos e eternos
agradecimentos ao meu maior Professor, meu pai, Carlos Roberto Panis.
Agradeço à minha mãe, Sueli, que me ensinou a nunca desistir, a correr atrás dos meus
sonhos e que talvez seja a pessoa que mais acredite em mim. Agradeço a você mãe, por me
ensinar os sentimentos mais nobres do ser humano e os verdadeiros valores da vida.
Obrigada aos meus irmãos, Tuco, Beto, Cris e Bilu, pelo convívio, incentivo e admiração.
Ao meu esposo e meu filho, agradeço pela compreensão por todas as noites em que tive que
chegar tarde por causa dos experimentos, por todos os finais de semana em que me ausentei
para cuidar dos animais, por nunca reclamar quando eu chegava com cheirinho de
biotério... Obrigada pelo amor incondicional e pelo apoio, sem vocês eu jamais teria
conseguido. Amo muito todos vocês!
Agradeço pelos obstáculos que me foram impostos por Deus para que eu crescesse como
ser humano e, por nos momentos mais difíceis, colocar as pessoas certas no nosso caminho.
Quando decidi que ia largar tudo para correr atrás daquilo que eu realmente queria fazer,
procurei o Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental da UEL e me candidatei
à vaga do curso de mestrado, sem orientador definido. Foi onde teve início a minha história
com meu orientador, Prof. Dr. Phileno Pinge Filho, que não apenas aceitou me orientar
como mestranda, mas que me ensinou muito da sua experiência de vida. Agradeço ao Prof.
Phileno, meu pai científico a quem muito admiro, pela oportunidade de me tornar uma
pessoa melhor, pelos ensinamentos, pela paciência nas horas difíceis, pela tolerância, pela
compreensão, enfim por me trazer para a luz!Valeu PH!
Ao longo destes 10 anos de UEL, desde a graduação, fui agraciada pelo convívio com
muitos cientistas e de cada um absorvi o máximo que pude; special thanks para a Prof. Dra.
Marta Marques de Souza, minha mãe científica, pela oportunidade de me desenvolver
cientificamente na graduação; à Prof. Dra Edna Maria Vissoci Reiche, pelo convívio e
pelos ensinamentos que me fizeram optar pela Imunologia; Prof. Dra Marli Cardoso
Martins Pinge pelos bons momentos de discussão sobre NO sintases e a sua família, pela
compreensão nos momentos em que tivemos que dividir o tempo do chefe!!! Ao Dr.
Rubens Cecchini, obrigada por compartilhar sua imensa sabedoria e me dar a oportunidade
de me desenvolver enquanto aluna e por me aceitar como aluna do Doutorado em seu
laboratório, muito obrigada.
À melhor equipe de laboratório com a qual já trabalhei até hoje: Vera Tatakihara e Vanessa
Jacob Victorino. À Vera, por estar sempre à postos, sábados, domingos, feriados.... Devo
muito á você, pois todas as oportunidades que tive desde que me formei tiveram um
empurrãozinho seu... Valeu! Vanessa, minha irmã científica, meus braços direito e
esquerdo!!! A única que resistiu a todos os experimentos, sem jamais desistir, sou sua fã
menina! Obrigada de coração!
Muito obrigada aos colegas de turma, aos docentes do curso, aos funcionários do
Departamento de Ciências Patológicas, em especial aos técnicos Zui e Pedrinho, obrigada
pela paciência e pelos ensinamentos; ao Departamento de Patologia do Hospital
Universitário, especialmente à Dra Tânia Mazzuco Longo e a técnica Lucia pelos
ensinamentos e pela oportunidade de sempre aprender algo novo.
Agradeço ainda Prof. Dra Sueli Fumie Ogatta e Prof. Lucy Megumi, do Departamento de
Microbiologia, por compartilhar seus conhecimentos e laboratório várias e várias vezes...
Obrigada a todos estagiários do laboratório de Microbiologia e ao técnico Ediel por tudo.
Pessoal do interlaboratório: S. Adernaldo, D. Irene e Mary, agradeço pelo auxílio na
manutenção dos animais do biotério.
Agradeço a CAPES/CNPq pelo financiamento do projeto.
E finalmente, a todos aqueles que participaram deste trabalho e que o tornaram possível,
meus sinceros agradecimentos.
“Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes mas
não esqueço de que minha vida é amaior empresa do mundo, e posso
evitar que ela vá à falência.
Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver apesar de todos os
desafios, incompreensões e períodos de crise.
Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar um autor
da própria história. É atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de
encontrar um oásis no recôndito da sua alma.
É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida.
Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos.
É saber falar de si mesmo.
É ter coragem para ouvir um “não”.
É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta.
Pedras no caminho?
Guardo-as todas, um dia vou construir
um castelo…”
Fernando Pessoa
APOIO FINANCEIRO
CAPES
FAEP/UEL
FUNDAÇÃO ARAUCÁRIA (EDITAL UNIVERSAL, PROCESSO 8427)
RESUMO
Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, o
principal mecanismo efetor contra o parasita consiste na produção de óxido nítrico (NO)
por macrófagos ativados pelo IFN-γ, TNF-α e leucotrienos. Animais deficientes em óxido
nítrico sintase induzível (iNOS) apresentam aumento da susceptibilidade à infecção, com
elevada parasitemia e queda da sobrevida. Neste estudo, investigamos o papel
das
isoformas óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS) e induzível (iNOS) em camundongos
nocautes para 5-lipoxigenase (5-LO) no curso da infecção aguda por T. cruzi.
Camundongos isogênicos selvagens (129 WT) e nocautes para a produção de leucotrienos
(5-LO
-/-
) foram infectados intraperitonialmente com 5 x 10
3
formas tripomastigotas
sanguíneas e tratados com inibidores farmacológicos para cNOS (L-NAME) e iNOS
(aminoguanidina), 4 horas após início da infecção, durante 12 dias para obtenção das
amostras de plasma e por 30 dias para avaliação da carga parasitária e sobrevida. Os
parâmetros avaliados foram: determinação da carga parasitária, sobrevida, parasitismo
cardíaco, produção de nitrito (como estimativa da produção de NO) plasmático e perfil de
citocinas durante a infecção. Para determinação dos níveis de NO, realizou-se a adaptação,
padronização e validação de uma técnica para dosagem de nitrito plasmático, partindo-se da
desproteinização das amostras e tratamento com esferas de cádmio sensibilizadas com
cobre para conversão do nitrato a nitrito, com posterior detecção pela reação de Griess. Este
micrométodo mostrou-se adequado e sensível para a detecção de nitrito em plasma e soro
de camundongos, apresentando características como fácil execução, baixo custo e rapidez
na obtenção de resultados. Em relação à infecção por T. cruzi, o bloqueio da iNOS com
aminoguanidina promoveu aumento significativo da carga parasitária e redução da
sobrevida em ambas linhagens de camundongos, sendo este efeito mais pronunciado nos
animais nocautes para 5-LO, indicando que o controle da carga parasitária mediado pelo
NO (via iNOS) é parcialmente dependente de leucotrienos. Neste estudo demonstrou-se
pela primeira vez a participação da cNOS no controle da carga parasitária e a produção de
NO na ausência da 5-LO durante a fase aguda da infecção experimental por T. cruzi. O
bloqueio com L-NAME levou à redução da carga parasitária sanguínea e cardíaca em
relação aos animais infectados não tratados nas duas linhagens, sugerindo que a presença da
cNOS exerce um efeito modulador favorável ao parasita. A iNOS é uma importante fonte
de produção de NO durante a infecção, já que seu bloqueio provocou queda nos níveis de
NO plasmático em ambas linhagens. O bloqueio da cNOS levou à redução da produção de
NO apenas na ausência de 5-LO, indicando que a cNOS é uma importante fonte de NO na
ausência de leucotrienos. O perfil de citocinas observado foi influenciado pela 5-LO, tanto
nas condições basais como durante a infecção por T. cruzi. Adicionalmente, os resultados
demonstram que a o bloqueio das enzimas iNOS e cNOS promovem alterações importantes
nos níveis de citocinas dos padrões Th1 e Th2 produzidas na fase aguda da infecção.
Finalizando, nossos dados evidenciam pela primeira vez a existência de ações antagônicas
exercidas pelas enzimas iNOS e cNOS no circuito complexo formado por leucotrienos,
óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias durante a fase aguda da infecção com o
protozoário T. cruzi.
ABSTRACT
During Trypanosoma cruzi infection, causative agent of Chagas’ disease, the
major effector mechanism against parasite is the production of nitric oxide (NO) by IFN-γ,
TNF-α and leukotrienes activated macrophages. Nitric oxide synthase (iNOS) knockout
mice showed increased susceptibility to infection, high parasitemia and reduction of
survival. In the present study, we investigated the role of nitric oxide synthase isoforms,
cNOS (constitutive isoform) and iNOS (inducible isoform) in 5-lipoxygenase knockout
mice (5-LO
-/-
) during acute phase of T. cruzi infection. Isogenic wild type (129 WT) and
knockout mice (5-LO
-/-
, deficient in leukotrienes production) were infected intraperitonially
with 5 x 10
3
trypomastigotes forms and treated at different time intervals after T. cruzi
infection with iNOS inhibitor (aminoguanidine) or cNOs inhibitor (L-NAME), initiated 4
hours after infection, during 12 days to plasma acquirement and 30 days to access blood
parasitemia and survival rates. The parameters evaluated were: blood parasitemia, survival
rates, cardiac parasitism, nitrite production (as estimative of NO levels) and cytokine
profile. To determine NO levels, we adapted a method to detect nitrite in plasma,
employing sample desproteinization and treatment with cadmium granules sensitized by
copper to convert nitrate to nitrite and detect the formed product by Griess reaction. This
micromethod showed adequability and sensitivity to detect nitrite levels in mice samples,
also demonstrated that is fast (about 2 hours to perform 96 samples), easy, reliable, has low
cost (because cadmium granules regenerate after use) and good sensitivity when tested in
biological samples. During T. cruzi infection iNOS blockage showed an increase in blood
parasitemia and reduction of survival rates in both mice, indicating that this isoform is
necessary in parasite control. We showed for the first time cNOS participation in the course
of infection. L-NAME treatment provoked reduction of blood parasitemia and number of
amastigotes nests in all animals, suggesting that cNOS is an important mediator to the
parasite burden during infection. iNOS is an important source of NO during infection
because its blockage provoked reduction in NO levels to both mice strains . cNOS blockage
decreased NO production, suggesting that cNOS is an important source of NO when
leukotrienes are lacking. Cytokine profile was influenced by 5-LO in both basal levels and
T. cruzi infection and the NOS inhibition promoted several changes in Th1/Th2 response
during acute phase. Finally, our data showed for the first time antagonics actions exerted by
iNOS and cNOS in the complex leukotrienes, NO and pro-inflammatory cytokines circuit
during acute phase of T. cruzi infection.
Lista de abreviaturas e siglas
129 WT – linhagem de camundongo selvagem, controle de camundongos nocautes para 5-
lipoxigenase
5-HEPETE - ácido 5-hidroperoxi-eicosatetraenóico
5-LO
-/-
- linhagem de camundongo nocaute para 5-lipoxigenase
AG – aminoguanidina
BLT – receptores de leucotrienos transmembrana
cNOS – óxido nítrico sintase constitutiva
COX – cicloxigenase
Cys-LT – cisteinil leucotrienos
DC – doença de Chagas
DNA – ácido desoxiribonucléico
ERN – espécies reativas de nitrogênio
FLAP - proteína de ativação da 5-LO
GMP – guanidina monofosfato
IFN- γ - interferon gama
IL – interleucina
INF – infectado
iNOS – óxido nítrico sintase induzível
KO – nocaute
L-NAME - NG-nitro-L-arginine methyl ester
LTA4 – leucotrieno A4
LTB4 – leucotrieno B4
LTC4 – leucotrieno C4
LTs- Leucotrienos
LXs – lipoxinas
MHC - complexo de histocompatibilidade principal
mRNA – RNA mensageiro
NF-κB – fator de transcrição nuclear kappa B
NK – célula natural killer
NO – óxido nítrico
NO
2
-
- nitrito
NOS – óxido nítrico sintase
PAMPs – padrões moleculares associados a patógenos
PBS – solução tampão fosfato
PGs – prostaglandinas
RNA – ácido desoxiribonucléico
TGF-β – fator de crescimento transformador beta
TLRs – toll like receptors
TNF-α - fator de necrose tumoral alfa
TXs – tromboxanas
WT – tipo selvagem (wild type)
Lista de figuras
Figura 1
Síntese de leucotrienos a partir de lipídeos de membrana..............................
24
Figura 2
Esquema global das reações envolvidas na determinação de nitrito plasmático
empregando-se o método de Cádmio-Cobre.................................................................. 31
Figura 3
Modelo de distribuição da curva padrão e amostras em microplaca de 96
poços................................................................................................................................35
Representação esquemática da placa de Multi-Analyte Profiler
ELISArray.......................................................................................36
Figura 5
Avaliação da produção de nitrito em função do tempo
.........................................................................................................................................40
Figura 6
Rendimento da conversão de nitrato a nitrito .................................................
42
Figura 7
Curva padrão de nitrito de sódio (NaNO
2
) .....................................................
4
4
Figura 8
Comparação da dosagem de nitrito no plasma pelo método de Griess
associado ou não ao tratamento prévio da amostra com esferas de cádmio...................48
Figura 9
Parasitemia de camundongos infectados com T. cruzi, determinada pela
metodologia de Pizzi e Brenner (1962) ..........................................................................52
Figura 10
Sobrevivência de camundongos infectados com T. cruzi, infectados
intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas ...............................................53
Figura 11
Quantificação do número de ninhos de amastigotas de T. cruzi no tecido
cardíaco de camundongos 129 WT e 5-LO
-/-
no 12
0
dia pós-
infecção............................................................................................................................54
Figura 12
-
Produção de nitrito plasmático em camundongos selvagens (129WT) e
nocaute para produção de leucotrienos (5-LO
-
/
-
) no12
0
dia pós-infecção .....................
5
6
Figura 13 - Perfil de citocinas em camundongos selvagens (129WT) e nocaute para
produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção, tratados com
aminoguanidina...............................................................................................................59
Fi
gura 14
-
Perfil de citocinas em camundongos selvagens (129WT) e nocaute para
produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção, tratados com L-
NAME.............................................................................................................................60
Figura 15
-
Perfil de citocinas em camundongos selvagens (129WT) e nocaute para
produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção, tratados com
aminoguanidina e L-NAME............................................................................................61
Lista de tabelas
Tabela 1. Dados complementares obtidos a partir da padronização em microplaca do
método descrito por Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998)...................................46
Lista de Quadros
Quadro 1 - Inibidores, mecanismo de ação, doses diárias e grupos
experimentais empregados para avaliação da participação das NOS na
infecção aguda experimental por T. cruzi.......................................... 29
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................
1
2. OBJETIVOS ............................................................................................
26
2.1 Objetivo Geral .............................................................................................
26
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................
27
3.1 Animais e reagentes .................................................................................
27
3.2 Infecção por T. cruzi.................................................................................
28
3.3 Tratamentos ................................................................................................
28
3.4 Determinação da carga parasitária e taxa de sobrevida ........
29
3.5 Preparo e coleta das amostras ...............................................
30
3.6 Determinação de nitrito plasmático como estimativa das
concentrações plasmática e tecidual de óxido nítrico (NO)...............
30
3.6.1 Validação e padronização da técnica de dosagem de nitrito
utilizando-se o sistema cádmio-cobre .............................................
30
3.6.1.1 Determinação do tempo médio de incubação ...............................................
31
3.6.1.2 Rendimento percentual da conversão de nitrato a nitrito ...............................
32
3.6.2 Adaptação do método de dosagem de nitrito plasmático utilizando-se o
sistema cádmio-cobre para plasma de camundongos ................................................
32
3.6.2.1 Processamento das amostras ..........................................................................
33
3.6.2.1.1 Desproteinização ..............................................................................
33
3.6.2.1.2 Ativação dos grânulos de cádmio........................................................
33
3.6.2.1.3 Redução de nitrato a nitrito.................................................................
34
3.6.2.1.4 Preparo da curva padrão......................................................................
34
3.6.2.1.5 Reação de Griess.................................................................................
35
3.7 Dosagem de citocinas plasmáticas.......................................................
36
3.8 Análise histopatológica do tecido cardíaco e determinação do
parasitismo cardíaco ............................................................................................
38
3.9 Análise Estatística ..........................................................................................
38
4. RESULTADOS...........................................................................................
39
4.1 Adaptação, validação e padronização da técnica para dosagem de nitrito
plasmático. .................................................................................................................
39
4.1.1 Determinação do tempo médio de incubação ...................................................
39
4.1.2 Rendimento percentual da conversão de nitrato a nitrito ..................................
41
4.1.3 Curva padrão de nitrito......................................................................................
43
4.1.4 Adaptação do método em microplaca: dados complementares.........................
45
4.1.5 Avaliação da sensibilidade do método de dosagem de nitrito plasmático
utilizando-se o sistema cádmio-cobre em relação à reação de Griess........................
47
4.2 5-LO participa do controle da carga parasitária durante a infecção por T.
cruzi.............................................................................................................................
50
4.3 Efeitos antagônicos do bloqueio da iNOS e cNOs sobre a carga parasitária de
camundongos 5-LO
-/-
..................................................................................................
51
4.4 A produção de NO durante a infecção aguda por T. cruzi é dependente de
iNOS e cNOS, ocorrendo na ausência de leucotrienos...............................................
4.5 Perfil de citocinas plasmáticas..............................................................................
56
57
4.5.1 A produção basal de citocinas plasmáticas é influenciada pela 5-LO..............
4.5.2 A infecção com T. cruzi provoca aumento dos níveis de IL-6 e IFN-γ
plasmáticos .................................................................................................................
4.5.3 O perfil de citocinas produzidas durante a infecção é alterado pelo bloqueio
das NOS......................................................................................................................
5 DISCUSSÃO...........................................................................................................
6 CONCLUSÕES......................................................................................................
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................
58
58
58
62
71
72
1
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 O ciclo biológico do Trypanosoma cruzi e doença de Chagas (DC)
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é um parasita hemoflagelado, pleomórfico,
pertencente ao reino Protozoa, classe Kinetoplastidea, ordem Kinetoplastida, família
Trypanosomatidae. Estudos sobre as características biológicas deste parasita vêm sendo
realizados há mais de um século, desde sua descoberta em mamíferos silvestres. Chagas
(1909) relatou dimorfismo do parasita na corrente sanguínea destes animais, caracterizando
a existência das formas tripomastigotas delgadas e formas largas que variam de acordo com
a cepa do parasita e a fase da infecção.
As formas evolutivas do T. cruzi foram classificadas de acordo com a
emergência do flagelo e posição do cinetoplasto em relação ao núcleo (NEWTON, 1968,
DE SOUZA, 1984). São descritas as formas epimastigotas (flagelo e cinetoplasto anteriores
ao núcleo, presentes apenas tubo digestivo do vetor e em meio de cultivo axênico),
tripomastigotas (flagelo e cinetoplasto posteriores ao núcleo, formas infectantes presentes
no sangue do hospedeiro vertebrado e em culturas de células), amastigotas (formas
proliferativas no interior de células do hospedeiro vertebrado ou em cultura de células, com
pequeno flagelo) e esferomastigotas (no estômago do vetor) (BRENNER, 1973, SOUZA,
2000).
Devido às variações existentes em relação à severidade das infecções por T.
cruzi, foram propostas diversas classificações filogenéticas (revisado por MOMEN, 1999)
baseadas em marcadores enzimáticos e no DNA presente no cinetoplasto (DEVERA,
2
FERNANDES, COURA, 2003). Atualmente, são descritas duas linhagens genéticas
principais denominadas T. cruzi I e T. cruzi II, biologicamente distintas e com ampla
heterogeneidade gênica (FERNANDES et al., 1999). Estudos indicam que a infecção
humana deve-se ao grupo II (cepas CL e Y) (GAUNT & MILES, 2000), enquanto o grupo I
(cepas F, Tulahen, M226, Sylvio-X10, Dm28c, Dm30 e Guafitas) predomina no ciclo
silvestre do parasita (RISSO et al., 2004).
Estruturalmente, os tripanossomatídeos apresentam uma superfície celular de
composição variável conforme a forma evolutiva. A membrana celular é composta de
bicamada lipídica, proteínas associadas e esteróis (SOUZA, 2000), como o ergosterol
(sintetizado pelo protozoário) e colesterol (captado no soro do hospedeiro), além da
presença de uma mitocôndria, cinetoplasto e um flagelo altamente antigênico (BRENNER,
1973).
A utilização de culturas in vitro de T. cruzi em camadas de células tem
permitido o estudo do processo de invasão, replicação e diferenciação do parasita
(BURLEIGH & ANDREWS, 1995), contribuindo para o entendimento do seu ciclo de
vida.
Inicialmente, a infecção por T. cruzi era transmitida na natureza através do ciclo
silvestre entre triatomíneos e mamíferos (TEIXEIRA et al., 2001), mas devido à ocupação
predatória do ambiente silvestre pelo homem transformou-se em uma antropozoonose, onde
o homem e os animais domésticos constituíram o ciclo doméstico e peridomiciliar do
parasita (FORATTINI, 1980).
Uma das principais formas de transmissão da DC é a vetorial, através de
diferentes espécies de insetos hemípteros, conhecidos popularmente como barbeiros,
3
pertencentes à ordem Hemiptera, família Reduviidae, subfamília Triatominae, gêneros
Triatoma ssp., Panstrogylus ssp., e Rhodnius ssp.. As principais espécies transmissoras do
T. cruzi no Brasil são o Triatoma infestans, Triatoma sordida e o Panstrogylus megistus
(TOLEDO et al., 1997). Os triatomíneos são insetos ovíparos que depositam seus ovos em
cavidades escuras no solo e paredes e após seu completo desenvolvimento em indivíduos
adultos vivem por até 15 meses, podendo infestar rapidamente habitações precárias
(BLITZMAN, 2007).
O ciclo biológico do T. cruzi tem início quando o vetor adquire o parasita
durante o repasto sanguíneo através da ingestão de sangue do homem ou hospedeiros
vertebrados infectados contendo as formas tripomastigotas infectantes. A picada do inseto é
indolor e permite que o mesmo se alimente com aproximadamente 0,5 mL de sangue
(LANA & TAFURI, 2005).
No estômago do vetor, ocorre a transformação destas formas em
esferomastigotas e epimastigotas, que migram para o intestino, aderindo à superfície
epitelial e multiplicando-se. Ao atingirem o reto, transformam-se em tripomastigotas
metacícilicas que são eliminadas juntamente com as fezes e urina do inseto triatomíneo
(GARCIA, GONZALEZ, AZAMBUJA, 1999).
O ciclo evolutivo no hospedeiro vertebrado tem início quando o vetor elimina
formas tripomastigotas nas fezes e urina durante seu repasto sanguíneo no homem e
mamíferos. A saliva do inseto contém substâncias que desencadeiam resposta inflamatória
local da picada que provocam sensação de prurido local (SOUZA, 2000) e levam o
indivíduo a coçar o local, arrastando as fezes contaminadas para o interior da porta de
entrada criada na pele.
4
A invasão das células pelas formas tripomastigotas envolvem o
reconhecimento inato do parasita através de padrões de seqüências moleculares associadas
ao patógeno (PAMPs) por receptores do tipo toll-like do complexo TLR2 – TLR6 e TLR4
(GAZZINELLI & DENKERS, 2006), receptores NOD-like, helicases RIG-like (MEYLAN,
TSCHOPP, KARIN, 2006) e receptores de manose (KAHN et al., 1996; MEIRELLES et
al., 1999) que detectam a infecção e sinalizam entre a resposta imune inata e adaptativa
(SABROE et al., 2008). Quando a infecção ocorre através da via oral, o processo de
invasão é determinado pela expressão de glicoproteínas de superfície do parasita, como
gp82, gp35/50 e gp90, que regulam a capacidade de invasão da mucosa gástrica em cada
cepa do parasita (YOSHIDA, 2006; YOSHIDA, 2008).
Neste processo, ocorre adesão do parasita à superfície celular do hospedeiro
através da interação com glicoproteínas de superfície, como o ácido siálico retirado do
hospedeiro pelas transialidases expressas principalmente pelas formas metacíclicas (KAHN
et al., 1996). O ácido siálico incorporado ao parasita facilita a interação, reconhecimento e
entrada do mesmo na célula hospedeira, além de inibir a deposição da fração C3b do
complemento e o seu reconhecimento do pelos fagócitos (SCHENKMAN et al., 1994).
Em seguida o parasita invade a célula num processo semelhante à endocitose,
formando com a membrana celular o vacúolo parasitóforo (ANDRADE, 2000), evadindo-
se da digestão celular em pH ácido pela secreção da proteína formadora de poros
denominada Tc-Tox (ANDREWS, 1993; HYBISKE & STEPHENS, 2008) para o
citoplasma da célula, onde sofre alterações bioquímicas que permitem sua transformação na
forma amastigota citoplasmática (BURLEIGH & ANDREWS, 1995).
5
Inicia-se assim o ciclo de divisão intracelular, com duração de 4 a 5 dias, onde
as formas amastigotas multiplicam-se e diferenciam-se em tripomastigotas, liberadas para a
corrente sanguínea através do processo de ruptura celular para completar o ciclo evolutivo
do parasita através da infecção de novas células (SOUZA, 2000). São liberadas
aproximadamente 500 formas tripomastigotas por parasita interiorizado inicialmente
(DVORAK, 1975).
A lise prematura de algumas células libera formas amastigotas capazes de
invadir fagócitos, sobreviver à fagocitose e contribuir para a sustentação do ciclo de vida do
parasita (FERNANDES et al., 2006). Estudos realizados em culturas de células revelaram
que vários tipos celulares, fagocíticos ou não, podem ser infectados pelas formas
metacíclicas (BURLEIGH & ANDREWS, 1995), existindo um tropismo do parasita pelo
tecido cardíaco (BRENNER, 1973).
6
1.2 Doença de Chagas Humana
As doenças tropicais negligenciadas caracterizam-se por uma série de infecções
causadas por fungos, bactérias e parasitas e são apontadas como a principal causa de
morbidade e mortalidade nas regiões menos desenvolvidas dos países pobres da América
Latina. As principais doenças que se enquadram neste perfil são tricuríase, ascaridíase,
ancilostomíase e doença de Chagas (HOTEZ et al., 2008).
A Doença de Chagas (DC) ou tripanossomíase americana é uma antropozoonose
amplamente distribuída nas Américas e que tem como agente etiológico o protozoário T.
cruzi (Schizotrypanum cruzi). Encontra-se distribuída por 18 países, do sul dos Estados
Unidos até a Patagônia (CDC, 2007), onde existem de 16 a 18 milhões de pessoas
infectadas e cerca de 100 milhões sob risco de contrair a doença, que responde por
aproximadamente 20.000 mortes a cada ano, além do aparecimento de 50.000 novos casos
na América Latina anualmente (HOTEZ et al., 2008).
Além dos números alarmantes para a saúde pública, na última década a DC foi
considerada pelo Banco Mundial como a mais séria das doenças parasitárias da América
Latina, apresentando um impacto socioeconômico maior do que a soma dos efeitos de todas
as outras doenças parasitárias (DIAS et al., 2002), representando uma perda econômica aos
países endêmicos de mais de seis bilhões de dólares por ano (DIAS et al., 1999).
No Brasil, a DC apresenta uma prevalência de 0,17% em crianças, totalizando
cerca de 8 milhões de pessoas infectadas (DIAS, 1999). Registros oficiais de óbitos
indicam que no Brasil ocorram aproximadamente 6000 mortes de pacientes chagásicos
7
crônicos por ano (CHAPADEIRO, 1999) e redução aproximada de 9 anos na expectativa de
vida de portadores crônicos (BLITZMAN, 2007).
A DC constitui um sério problema médico-social, ocorrendo principalmente em
áreas rurais ou periurbanas onde prevaleçam condições precárias de habitação que
permitam o contato entre o inseto vetor e o ser humano (SCHMUÑIS, 2000, KROPF,
2005). Pode ser transmitida de diversas formas, sendo a transmissão vetorial a mais
importante, já que responde por mais de 80% dos casos de infecção humana (DIAS et al.,
1999). Outras formas de infecção incluem transfusão sanguínea (15% dos casos),
transmissão congênita (aproximadamente 4% dos casos), alimentos contendo fezes do
inseto (transmissão oral), transplantes de órgãos e acidentes de laboratório (DIAS, 2006;
GIDDINGS et al., 2006).
A história natural da DC caracteriza-se pelo desenvolvimento de três formas
clínicas evolutivas: forma aguda, forma latente ou indeterminada e forma crônica
(CHAPADEIRO, 1999). A forma aguda inicia-se a partir da picada do inseto até
aproximadamente 30 dias após (BLITZMAN, 2007) e caracteriza-se por infecção aguda
generalizada por T. cruzi, com elevada parasitemia, grandes quantidades de amastigotas
intrateciduais, infiltrado inflamatório tecidual abundante e lesão miocárdica intensa (RASSI
et al., 2000).
A forma aguda afeta principalmente crianças e apresenta período de incubação
de 5 a 14 dias e revela sintomas inespecíficos de início súbito (febre, calafrios, mal-estar,
hepatoesplenomegalia) que nem sempre se manifestam e dificultam o diagnóstico da fase
aguda da DC, impedindo o tratamento farmacológico que é eficaz somente nesta fase
(NETO, 1998; DIAS, 1999).
8
Durante a fase aguda, é possível verificar-se em 4% dos casos a presença do
sinal de Romanã, lesão caracterizada por reação de hipersensibilidade no complexo
oftalmoganglionar que indica a porta de entrada da infecção. Cerca de 5% dos indivíduos
infectados vão a óbito durante a fase aguda por morte súbita (ANDRADE, 2000),
principalmente crianças, devido à falência cardíaca congestiva ou meningoencefalite
(BLITZMAN, 2007).
Indivíduos que sobrevivem à infecção aguda desenvolvem uma resposta
imunológica eficiente que reduz a parasitemia no sangue e tecidos, evoluindo cronicamente
na forma indeterminada (assintomática) ou desenvolver sintomas cardíacos/digestivos
(MARINHO et al., 1999).
A forma latente ou indeterminada, onde se encontram cerca de 60% das pessoas
infectadas, caracteriza-se na fase crônica por um período assintomático que inicia semanas
após a aquisição da infecção e estende-se com evolução benigna por muitos anos
(BLITZMAN, 2007). Estudos longitudinais demonstram que aproximadamente 50% dos
indivíduos infectados não apresentam sintomas clínicos (CHAPADEIRO, 1999), sendo que
a maioria inexplicavelmente permanece nesta fase pelo resto de suas vidas sem desenvolver
a doença (MACEDO, 1999). Pode ainda ocorrer reativação da fase aguda da DC em
indivíduos imunossuprimidos, como transplantados ou infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana (DIAS, 1999).
Após 10 a 30 anos de infecção, ocorrem os sintomas mais severos da doença,
onde se observa comprometimento associado do aparelho digestório (10% dos casos) e,
principalmente, do tecido cardíaco (13% dos casos), que contribui substancialmente para as
9
altas taxas de morbidade e mortalidade por DC (MAGUIRRE et al., 1987; WANDERLEY
et al., 1994; DIAS, 1999), caracterizando a forma crônica da doença.
Na fase crônica da doença, a forma cardíaca descrita inicialmente por Chagas e
Vilella em 1922, é evidenciada pela cardiomiopatia inflamatória de evolução fatal,
acompanhada clinicamente por arritmias, fenômenos tromboembólicos, insuficiência
cardíaca congestiva e cardiomegalia. Ocorrem lesões no sistema de condução cardíaco,
alterações vasculares e lesão apical que contribuem para a destruição progressiva do
miocárdio (ANDRADE, 2000).
Os danos cardíacos observados na fase aguda da infecção por T. cruzi ocorrem
principalmente devido ao rompimento dos ninhos de amastigota teciduais e pela liberação
de antígenos que se ligam à superfície celular, a qual se torna alvo dos anticorpos
produzidos contra o parasita. Na fase crônica, a auto-imunidade dos linfócitos T CD
4
+
é
apontada como causa da destruição cardíaca progressiva, além do envolvimento de diversos
fatores como mimetismo molecular, apresentação de antígenos próprios e desregulação da
resposta imune (SOARES & SANTOS, 1999).
O prognóstico da cardiopatia chagásica crônica depende do grau de
comprometimento cardíaco, da cardiomegalia e do grau de insuficiência cardíaca, podendo
ocorrer óbito por falência cardíaca ou morte súbita por bloqueio na condução do estímulo
átrio-ventricular (BLITZMAN, 2007), além da redução da expectativa de vida para
aproximadamente 60 anos de idade (MAGUIRRE et al., 1987). Mesmo após 100 anos da
descoberta da DC, a cardiomiopatia chagásica crônica é descrita como a causa mais comum
de miocardite em todo o mundo (MAGUIRRE, 2006).
10
A resposta imunológica gerada contra o parasita também promove lesões
teciduais, associadas ao processo auto-imune de destruição do tecido cardíaco ou à
produção de mediadores inflamatórios contra o parasita e seus antígenos teciduais
(GIRONES & FRESNO, 2003).
No acometimento crônico do trato digestório, ocorrem alterações
anatomopatológicas denominadas “megas”, caracterizadas por distúrbios de deglutição
(megaesôfago) e constipação (megacólon), decorrentes do comprometimento do sistema
nervoso entérico, hipertrofia e inflamação teciduais (ANDRADE, 2000).
O tratamento da DC constitui-se basicamente em terapêutica farmacológica
específica contra o parasita, particularmente em casos agudos, congênitos, acidentes de
laboratório e em casos crônicos de baixa idade e de infecção recente, além do tratamento
sintomático durante o curso da infecção crônica (DIAS, 1999; BLITZMAN, 2007).
Existem duas drogas disponíveis para o tratamento específico da DC, o
nifurtimox (Lampit®, Bayer Healthcare) e o benzonidazol (Rochagan®, Roche
Pharmaceutical, cuja patente foi doada ao Ministério da Saúde, Brasil), com índice de cura
que varia de 30 a 70%, dependendo da cepa do parasita (DIAS, 1999). Entretanto, devido à
baixa especificidade da sintomatologia da DC na fase aguda, a maioria dos indivíduos
infectados não se trata a tempo e tornam-se portadores crônicos da doença (AMATO-
NETO, 1998, CANÇADO, 2002).
Pesquisas para o desenvolvimento de vacinas contra o T. cruzi têm sido
realizadas utilizando frações de DNA do parasita (FUJIMURA et al. 2001), terapia gênica
(GARG, TARLETON, 2002) e tripanossomatídeos antigenicamente semelhantes (BASSO
et al. 2004), com poucos resultados satisfatórios para ensaios clínicos em humanos.
11
Nos últimos anos, houve redução dos casos agudos de DC nos países do Cone
Sul (SCHOFIELD et al., 1999), à medida que aumenta a prevenção da doença através da
melhoria das condições de habitação, controle dos bancos de sangue e, principalmente, da
erradicação dos vetores (DIAS et al., 1999). No Brasil de 1986 a 1996, houve redução de
96% no índice de infecção em crianças de 0 a 14 anos (BLITZMAN, 2007) e, em 2006, o
Brasil foi certificado como área livre de transmissão da DC por T. infestans, considerado o
principal vetor da doença (BRASIL, 2006).
Apesar da erradicação do vetor, atualmente a principal via de contágio por T.
cruzi é a infecção oral, respondendo por mais de 50% dos casos agudos da DC na região
amazônica, além dos surtos observados em Santa Catarina e no Pará ocorridos devido a
ingestão de caldo de cana e açaí, respectivamente, contendo triatomíneos infectados
(BRASIL, 2005).
Pode-se afirmar que a descoberta feita por Carlos Chagas compõe um dos
episódios mais importantes da história da medicina. Ao longo do centenário da descoberta
da DC, milhares de pesquisas foram e continuam sendo realizadas pela comunidade
científica mundial, do âmbito molecular ao socioeconômico, na tentativa de propor
soluções que melhorem as condições dos pacientes chagásicos. Somando-se a estes
esforços, existe a necessidade da consolidação de estratégias preventivas, investimento
maciço em pesquisa básica e clínica e ações políticas governamentais para que mudanças
reais neste cenário possam ser observadas num futuro próximo.
12
1.1.3 Doença de Chagas Experimental e resposta imunológica ao T. cruzi
1.1.1 – Participação das citocinas
A primeira infecção experimental com o T. cruzi foi feita por Oswaldo Cruz,
em 1909 (ANDRADE, 2008). O modelo murino tem sido o mais utilizado nos protocolos
experimentais para estudo da DC (COSTA, 1999), já que a infecção chagásica experimental
realizada em camundongos apresenta características similares à humana, com elevada
parasitemia durante a fase aguda e presença de infiltrados parasitários no tecido cardíaco
(BRENNER, 1973), sendo por isso amplamente utilizada como modelo para o estudo dos
mecanismos fisiopatológicos da doença e resistência do hospedeiro (ALIBERTI et al.,
1999).
Na maioria das vezes, a inoculação é feita pela via intraperitoneal, utilizando-se
formas parasitárias tripomastigotas coletadas diretamente do sangue, das fezes do inseto
vetor (triatomíneo) ou formas metacíclicas provenientes de meios de cultivo líquido ou em
cultivos de células (ANDRADE, 2008).
A habilidade dos parasitas em sobreviver no hospedeiro depende de uma série
de mecanismos envolvendo a relação parasita-hospedeiro, como capacidade de evasão,
características do microrganismo e resposta imunológica. A evolução da infecção no
modelo murino varia de acordo com a raça, idade, via de inoculação, cepa do parasita
utilizada e sexo do hospedeiro (HAUSCHKA, 1974; ROWLAND et al., 1995; ROGGERO
et al. 2002; TATAKIHARA et al., 2008).
13
As cepas de T. cruzi compõem uma população heterogênea, com efeitos
biológicos distintos (BRENNER, 1973). A cepa Y, descoberta e isolada por Silva e
Nussenzweig (1950), é altamente virulenta por ser capaz de levar à morte linhagens de
camundongos susceptíveis inoculados intraperitonealmente por volta de 2 a 3 semanas de
infecção. Estes parasitas têm um ciclo de vida constante, o que os torna bons modelos
experimentais (PINTO et al., 1999). Apresenta tropismo por macrófagos esplênicos, fígado
e medula óssea, enquanto outras cepas infectam principalmente tecidos musculares (MELO
& BRENNER, 1978).
Desde sua descoberta, a DC tem sido descrita como uma doença causada pelos
danos gerados pela resposta inflamatória e imunológica à invasão dos tecidos por T. cruzi
(COSTA, 1999). O perfil de resistência ou susceptibilidade ao T. cruzi no modelo murino
depende, além das características do parasita, da imunidade inata e adquirida mediada por
macrófagos, natural killers (NK), células T e linfócitos B (TARLETON, 1995;
GAZZINELLI et al., 1998, LIEKE et al., 2006).
Também estão envolvidos na resposta ao parasita citocinas e mediadores
inflamatórios produzidos durante a infecção (ABRAHANSOHN, 1998; PINGE FILHO et
al., 1999; MICHAILOWSKY et al., 2001), com importância evidenciadas através de
estudos realizados em camundongos nocautes (KO) e pelo emprego de inibidores
farmacológicos de etapas responsáveis pela produção destas moléculas (MALVEZI et al.,
2004; KOGA et al., 2006, BORGES, 2007).
O reconhecimento inato dos parasitas envolve o reconhecimento de PAMPs
específicos através dos TLRs presentes nos macrófagos (HARRIS et al., 2006). Logo nas
primeiras horas de infecção, os parasitas são fagocitados pelos macrófagos, induzindo uma
14
resposta inata do organismo que desencadeia nas células NK a produção de interferon gama
(IFN-γ), estimulando nos macrofagos a produção de citocinas pro-inflamatórias e
mediadores com atividade tripanocida (CARDILLO et al., 2002).
O controle do parasitismo na fase aguda da DC depende basicamente da ação
de citocinas sobre os macrófagos. Tratamento de macrófagos in vitro com citocinas do
padrão Th1, como interferon gama (IFN-γ), interleucina 12 (IL-12) e fator de necrose
tumoral (TNF-α), resultam em morte eficiente das amastigotas intracelulares; já a adição de
citocinas do padrão Th2, como o fator de crescimento tumoral (TGF-β) e interleucina 10,
(IL-10) inibem a ação tripanocida de macrófagos ativados (ABRAHAMSON, 1998).
Durante a primeira semana de infecção, ocorre o estímulo para a produção e
proliferação substancial de linfócitos e, ao mesmo tempo em que a IL-2 é produzida, seus
receptores são expressos na superfície das células T (IL-2R) e liberados na sua forma
solúvel (sIL-2R) (PAKIANATHAN & KUHN, 1992), sob forte influencia de moléculas
inflamatórias como os leucotrienos (MARCINKIEWICZ et al., 1997).
Em torno da segunda semana de infecção, ocorre um pico de imunossupressão,
onde ocorre baixa produção de IL-2 (KIERZENBAUM & SZTEIN, 1994) e ausência de
respostas proliferativas de linfócitos T frente à mitógenos, mediadas principalmente pela
produção de prostaglandinas (PINGE-FILHO, TADOKORO, ABRAHAMSON, 1999).
Nesta fase, também é relatada a presença de fatores supressores do parasita, como
glicoproteínas de membrana, proteínas secretadas pelo parasita e antígenos de superfície
(SCHONECK et al., 1994; KIERSZENBAUM et al., 1999).
A produção inicial de IFN-γ pelas células NK é dependente da sua indução nos
macrófagos estimulada pela IL-12 (ALIBERTI et al., 1996), num mecanismo dependente
15
de IL-2 (SILVA & ABRAHAMSON, 2001).O papel da IL-12 no controle da infecção
chagásica in vivo foi demonstrado através do tratamento de camundongos infectados com
anticorpos anti IL-12, revelando altos níveis de parasitemia e mortalidade em relação aos
controles. No mesmo estudo, o tratamento dos animais com anti-IFN-γ ou anti-TNF-α
inibiu o efeito protetor da administração de IL-12 exógena (SILVA et al., 1998).
A administração de IL-12 em animais infectados leva à redução da parasitemia
e queda da mortalidade, mediadas pelo aumento na produção de IFN-γ e TNF-α, indicando
que esta citocina constitui um dos mecanismos de resistência à infecção por T. cruzi
(HUNTER, SLIFER, ARAÚJO, 1996).
O IFN-γ é descrito como a principal citocina mediadora de resistência à
infecção por T. cruzi, por induzir a ativação dos macrófagos e exercer papel central no
controle sobre a carga parasitária através da produção de óxido nítrico (NO) (VESPA,
CUNHA, SILVA, 1994; CARDILLO et al., 1996). Um dos mecanismos envolvidos na
resistência do hospedeiro induzida por IFN-γ na infecção é dependente de TLRs (KOGA et
al.; 2006), sendo sua produção inicial durante a fase aguda realizada por células NK
(CARDILLO et al., 2002).
O primeiro estudo relatando o papel do TNF-α na infecção por T. cruzi foi
realizado por Tarleton (1988), onde se demonstrou que o parasita é um potente indutor da
produção desta citocina por macrófagos e células esplênicas, tanto in vivo como in vitro.
Posteriormente, o TNF-α foi associado à resistência à infecção por T. cruzi (SILVA et al.,
1995) e descrito como fator de regulação negativa no processo de hematopoiese e
desenvolvimento da anemia observada durante a fase aguda da infecção (MALVEZI et al,
2004).
16
Outra citocina pró-inflamatória, a interleucina 6 (IL-6), é uma citocina
multifuncional que possui propriedades indutoras sobre a síntese de anticorpos em células
B, síntese hepática de proteínas de fase aguda e diferenciação de linfócitos T citotóxicos
(VAN SNICK, 1990). Estudos demonstram que durante a infecção in vitro com T. cruzi há
produção de IL-6 por células endoteliais (TANOWITZ et al., 1992) e monócitos aderentes
(VAN VOORHIS, 1992); in vivo,os níveis de IL-6 elevam-se precocemente na fase aguda
da infecção concomitantemente à produção de proteínas de fase aguda nos animais
(TRUYENS et al., 1994; CARDONI et al., 1997).
A participação da IL-1β como mediador pró-inflamatório durante a infecção
está bastante relacionada ao desenvolvimento da atividade hipertrófica cardíaca em animais
infectados por T. cruzi tanto nos estágios iniciais como na fase crônica da doença
(PETERSEN & BURLEIGH, 2003).
Enquanto a IL-12, TNF-α e IFN-γ são descritos como mediadores de resistência
à infecção, as citocinas predominantes no padrão Th2, como TGF-β e IL-10, estão
associados à susceptibilidade (SILVA et al., 1998) por possuir propriedades inibitórias
sobre a proliferação de células T, reduzir a expressão de moléculas do complexo de
histocompatibilidade principal (MHC) e a maturação de células dendríticas, necessários
para a resposta à infecção por T. cruzi (TAYLOR et al, 2006). O TGF-β é descrito como a
principal molécula capaz de controlar a produção de NO alterando o mecanismo pós
transcricional da iNOS, desestabilizando seu mRNA, retardando a síntese da proteína
funcional e acelerando sua degradação (MACMICKING, XIE, NATHAN, 1997).
17
Recentemente, Costa e colaboradores (2006) demonstraram que o interferon do
tipo I (INF α e β) exerce um importante papel no controle da parasitemia na fase aguda da
infecção, sendo este mecanismo mediado pela produção de NO.
1.1.2 – Óxido nítrico (NO) na DC
A produção aumentada de IFN-γ e TNF-α durante a fase aguda da DC,
induzem nos macrófagos através das vias JAK/STAT e NF-κB a expressão da óxido nítrico
sintase induzível (iNOS), uma importante fonte de produção da molécula tripanocida óxido
nítrico (NO) (XIE, WHISNANT, NATHAN, 1993).
O NO tem sido objeto de diversas pesquisas desde a descoberta de seus efeitos
biológicos na década de 80 (FURCHGOTT & ZAWADSKI, 1980). É considerado um
radical livre e atua como molécula mensageira em diversos processos fisiológicos, como
regulação do tônus vascular e neurotransmissão, através do estímulo da síntese de GMP
cíclico (BLOODSWORTH, O’DONNEL , FREEMAN, 2000). Seu envolvimento nos
processos de agressão e defesa é descrito em diversas doenças (MORI & GOTOH, 2004).
A produção do NO é catalizada pelas isoformas da enzima óxido nítrico sintase
(NOS), divididas em constitutivas, cálcio-dependentes (cNOS, nNOS ou NOS I, eNOS ou
NOS III) e induzível, cálcio independente (iNOS ou NOS II). As NOS oxidam a L-arginina
como substrato para produção de L-citrulina e liberação da molécula de NO
(BLOODSWORTH, O’DONNEL, FREEMAN, 2000). A molécula de NO é relativamente
pequena e apresenta características lipofílicas, permitindo rápida difusão e reação com uma
grande diversidade de estruturas biológicas intracelulares, metaloproteínas e outras
18
moléculas de radicais livres (superóxido, radicais alcoxil e peroxil) (MAYER &
HEMMENS, 1997).
As NOS estão presentes em células endoteliais vasculares, células cardíacas,
plaquetas, células musculares lisas, células neuronais, macrófagos, células NK, fibroblastos
e neutrófilos (MONCADA & HIGGS, 1991; LINDE et al., 2007). A manifestação de
efeitos biológicos é dependente da química do ambiente e influenciada pela presença das
diferentes espécies reativas de nitrogênio (ERN) geradas: ânion nitroxil, óxido nitroso,
cátion nitrosil, ácido nitroso, dióxido de nitrogênio, dinitrogênio tetraóxido, peroxinitrito e
cátion nitril, sendo que os principais produtos estáveis do metabolismo do NO são as
moléculas de nitrito e nitrato (DENICOLA, SOUZA, RADI, 1998).
A variação nos níveis de NO são capazes de regular ativação e expressão da
iNOS e cNOS. Concentrações fisiológicas de NO inibem a transcrição da iNOS através da
inativação do NF-κB, mantendo a atividade da cNOS (COLASANTI, PERSICHINI,
MENEGAZZI, 1995; COLASANTI, SUZUKI, 2000). Entretanto, quando os níveis de NO
se elevam, as moléculas não são suficientes para manter o NF-kB suprimido, criando
condições para superexpressão da iNOS (KANO, LEE, ZHANG, 2000).
A indução da expressão do mRNA da iNOS ocorre através da ação do fator de
transcrição nuclear kappa (NF-kB) sobre seu gene e é mediada por citocinas pró-
inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α), processos infecciosos e LPS (MELDRUM, 1998;
KELLY et al., 1996). A expressão da iNOS dependente de NF-kB via estímulos
inflamatórios requer uma inibição inicial da cNOS (PALOMBA et al., 2004), pois a
produção de NO constitui um dos mecanismos de resistência à infecção por parasitas
intracelulares que, paradoxalmente, contribui para os mecanismos imunopatológicos de
19
diversas doenças (MACMICKING, XIE, NATHAN, 1997). As lesões produzidas pelo NO
dependem de sua combinação com outros radicais livres, como o ânion superóxido,
produzindo uma espécie altamente reativa denominada peroxinitrito, capaz de ligar-se a
estruturas celulares como proteínas e DNA (MALVEZI et al.; 2004).
Estudos utilizando N-nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME) para bloquear a
produção de NO via cNOS, demonstraram sua participação como reguladora negativa da
migração e adesão leucocitária em modelos de isquemia e reperfusão (KUBES, SUZUKI,
GRANGER, 1991), evidenciando seu importante papel na estabilidade endotelial para
contrapor a resposta inflamatória inicial (FARREL & BLAKE, 1996).
A participação do NO derivado das NOS constitutivas em processos patológicos é
pouco conhecida, tendo sido descrita em modelos de doenças neurológicas (ZHENG et al.,
1993). Já a produção de NO derivado da iNOS por macrófagos ativados é descrita como
principal mecanismo microbicida em diversas infecções ocasionadas por patógenos
intracelulares, como Leishmania major, T. cruzi, Toxoplasma gondii e Plasmodium
falciparum (JAMES, 1991).
Durante a infecção por T. cruzi, o NO é descrito como o principal mecanismo
efetor contra o parasita observado experimentalmente (TALVANI et al., 2002), já que a
administração de inibidores da produção de NO (PETRAY et al., 1994) ou utilização de
animais nocautes para iNOS (HOLSCHER et al, 1998; BORGES, 2007) levam ao aumento
da parasitemia e redução da sobrevida dos animais durante a fase aguda da DC.
Um dos principais inibidores empregados com a finalidade de bloquear a produção
de NO derivado da iNOS é a aminoguanidina (AG), uma droga inativadora suicida que age
20
preferencialmente sobre esta enzima. A AG mimetiza a L-arginina, substrato natural das
NOS, sendo metabolizada pela enzima em um intermediário altamente reativo que ataca a
estrutura enzimática causando sua inativação (LEE et al., 2005). No modelo de infecção por
T. cruzi, a AG tem sido amplamente empregada para elucidar o papel do NO derivado da
iNOS sobre diversos parâmetros envolvidos na infecção, tanto in vivo quanto in vitro
(VESPA et al, 1994; CUMMINGS & TARLETON, 2004).
A produção de peroxinitrito pelos macrófagos é capaz de levar formas
tripomastigotas do parasita à morte e dificultar a motilidade, replicação e metabolismo
energético das formas epimastigotas. Além disso, esta molécula é capaz de ocasionar a
nitração de proteínas do parasita, agindo como um mecanismo antiparasitário (NAVILIAT
et al.; 2005).
Por outro lado, o NO causa lesões celulares na membrana eritrocitária do
hospedeiro (tanto a forma radical livre como o peroxinitrito), além de ocasionar um
impacto negativo sobre o processo de hematopoiese durante o curso da infecção aguda
(MALVEZI et al., 2004).
Como uma das principais características da DC é a infecção de células-alvo
específicas, como os cardiomiócitos, a função normal do tecido cardíaco encontra-se
comprometida ao longo da evolução da doença. Após invasão destas células pelo parasita,
ocorre a liberação local de citocinas, induzindo a expressão da iNOS e produção de NO,
com conseqüente disfunção cardíaca e cardiomiopatia (FICHERA et al., 2004; LINDE et
al. 2007). Observa-se a superexpressão da iNOS nos cardiomiócitos desde o início da
infecção e da cNOS nos primeiros 5 dias (CHANDRASEKAR et al., 2000).
21
Vespa e colaboradores (1994) investigaram a participação do NO no controle da
parasitemia e sobrevida através do bloqueio farmacológico da iNOS em camundongos
C57BL/6 e verificaram perda da resistência à infecção por T. cruzi, além da ação
tripanocida in vitro deste mediador. Em contrapartida, Cummings e Tarleton (2004)
relataram em seu estudo empregando animais nocautes para iNOS que estes animais
apresentaram perfil de sobrevida semelhante aos animais selvagens e atribuem as
diferenças observadas em relação à outros estudos à não especificidade dos bloqueadores
de iNOS, que poderiam estar agindo simultaneamente no bloqueio das outras isoformas
(também importantes para a producão de NO).
Existem relatos sobre a participação estágio-dependente do NO na DC, indicando
que esta molécula só é necessária na fase aguda da infecção (SAEFTEL, BERNHARD,
HOERAUF, 2001). Desta forma, são necessários estudos adicionais sobre o papel do NO
no curso da infecção experimental por T. cruzi, bem como sobre a participação das
diferentes fontes de produção de NO.
22
1.1.3 – Eicosanóides
Os primeiros estudos que descreveram o papel das prostaglandinas (PGs)
surgiram na década de 30 (KURZROK e LIEB, 1930; VON EULER, 1936; GOLDBLATT,
1937) através da observação do efeito do líquido seminal sobre a contractilidade uterina.
Estudos posteriores demonstraram que estas substâncias estão presentes em todos os
tecidos de diferentes organismos, desde as bactérias até os mamíferos (NOVERR et al.,
2003). PGs, prostaciclinas (PCs), tromboxanas (TXs), leucotrienos (LTs) e lipoxinas (LXs)
constituem o grupo das substâncias denominadas eicosanóides (RODRIGUES, 1992).
Os eicosanóides são produzidos por ação das ciclooxigenases (COX) ou da
araquidonato 5-lipoxigenase (5-LO) sobre o ácido araquidônico da membrana plasmática,
sob influência de estímulos fisiológicos e patológicos (SAMUELSSON et al., 1967;
NUGTEREN et al., 1967).
As 5-LO constituem uma família de enzimas que oxidam ácidos graxos
insaturados da membrana celular em hidroperóxidos bioativos e leucotrienos
(BLOODSWORTH, O’DONNEL, FREEMAN, 2000), em questão de segundos a minutos
(LEWIS et al., 1990).
A síntese de LTs a partir do ácido araquidônico (Figura 1) inicia-se a partir da
ação da 5-LO sobre os lipídeos insaturados da membrana celular, originando o ácido 5-
hidroperoxi-eicosatetraenóico (5-HPETE). A partir a ação conjunta com a proteína de
ativação da 5-LO (FLAP), tem origem o leucotrieno A4 (LTA4), que rapidamente é
23
convertido em leucotrieno B4 (LTB4) pela LTA4 hidrolase ou conjugado com glutationa
reduzida para formar leucotrieno C4 (LTC4) (AUSTEN, 2008).
A produção de LTs ocorre principalmente nos neutrófilos, macrófagos,
eosinófilos, mastócitos, basófilos e células dendríticas, sendo que as demais células
possuem receptores para LTA4 e realizam sua captação ou biossíntese transcelular
(PETERS-GOLDEN & HENDERSON, 2007).
A transcrição dos genes que regulam a biossíntese dos LTs é influenciada por
citocinas (COWBURN, HOLGATE, SAMPSON, 1999), como TGF-β (SERIO et al., 2003)
e IL-4 (HSIEH et al., 2001).
Os LTs são divididos em duas classes, os cisteinil leucotrienos (cys-LT) e o
LTB4. O LTB4 exerce um potente efeito de quimioatração sobre polimorfonucleares e
linfócitos T, causando a ligação entre a resposta imune inata e adaptativa, sendo capazes de
promover a regulação da resposta imunológica através da ativação e recrutamento dos
leucócitos. Este efeito modulador imunológico e quimiotático do LTB4 ocorre através da
sinalização via moléculas de BLT1 e BLT2 (receptores transmembrana acoplados a
proteína G) e pela indução do aumento na expressão de moléculas de adesão nas células
endoteliais (QIU et al., 2006).
Os LTs participam de diversos processos patológicos como doenças
inflamatórias (LEVY et al., 2001), processos alérgicos, câncer (PETERS-GOLDEN,
HENDERSON, 2007) e doenças cardiovasculares (GHAZALPOUR et al., 2006). A
participação destes mediadores no controle de processos infecciosos é descrita tanto para
parasitas extracelulares, como Strongyloides stercoralis (MACHADO et al., 2005), como
intracelulares do gênero Leishmania (SEREZANI et al., 2006).
24
Figura 1 – Síntese de leucotrienos a partir de lipídeos de membrana. FLAP = proteína de
ativação da 5-lipoxigenase, 5-LO = 5-lipoxigenase, 5-HPETE = ácido 5-hidroperoxi-
eicosatetraenóico, LTA4 = leucotrieno A4, LTB4 = leucotrieno B4, LTC4 = leucotrieno
C4, LTD4 = leucotrieno D4, LTE4 = leucotrieno E4.
25
Na década de 80, estudos revelaram o papel regulatório destes mediadores
durante a infecção por T. cruzi. Inicialmente, foi relatada a ação de LTB4 in vitro
estimulando a fagocitose de macrófagos infectados com o parasita (WIRTH,
KIERSZENBAUM, 1985). Aliberti e colaboradores (1999) demonstraram que moléculas
quimioatratoras que atuam sobre receptores acoplados a proteína G, participam da cascata
de eventos que desencadeia a produção de NO e morte do parasita. Mais tarde, os LTs
foram descritos como mediadores de resistência à infecção in vivo por T. cruzi por induzir a
produção de óxido nítrico nos macrófagos infectados, concentração e tempo-dependente,
desencadeada pelo aumento na expressão da iNOS (TALVANI et al., 2002).
Os LTs também desempenham papel regulador sobre a produção de algumas
citocinas, direcionando o padrão de resposta imune para Th2 através do estímulo na
produção de IL-10 e inibição da produção de IL-12 (SZCZEPAN et al., 2005). Na infecção
por T. cruzi, o LTB4 é descrito como potente indutor da produção de TNF-α em
macrófagos peritoniais murinos (TALVANI et al.; 2002). O papel dos LTs sobre a
produção de outras citocinas e a inter-regulação entre estes mediadores na infecção por T.
cruzi permanece pouco explorado.
Recentemente, nosso laboratório demonstrou a participação dos LTs no
controle da carga parasitária, sobrevida, parasitismo cardíaco e estresse oxidativo em
camundongos selvagens (129 WT) e nocautes (5-LO
-/-
) infectados por T. cruzi durante a
fase aguda (BORGES, 2007). Desta forma, para evidenciar as inter-relações existentes
entre leucotrienos, óxido nítrico e citocinas, decidimos investigar o envolvimento da cNOS
sobre o curso da infecção, produção de NO e perfil de citocinas pró-inflamatórias
produzidas durante a fase aguda da infecção experimental por T. cruzi.
26
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Com base nos dados expostos, neste trabalho investigamos o papel das
isoformas óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS) e induzida (iNOS) em camundongos
nocautes para 5-lipoxigenase infectados com T. cruzi.
2.2 Estratégias Experimentais
Avaliar o efeito do bloqueio da cNOS e iNOS em linhagens de camundongos
isogênicos selvagens (129 WT) e nocautes (5-LO
-/-
) durante a fase aguda da infecção por
T. cruzi (cepa Y) através dos seguintes parâmetros:
Determinação da carga parasitária sanguínea,
Determinação da taxa de sobrevida dos animais;
Determinação do parasitismo cardíaco;
Dosagem de óxido nítrico plasmático;
Quantificação de nitrito plasmático para estimativa da produção de NO durante a
infecção;
Dosagem de citocinas plasmáticas.
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais e reagentes
Foram utilizados camundongos 129 WT e 5 LO
-/-
(CHEN et al.,
1994), isogênicos, com 8 a 12 semanas de vida. Os camundongos 5 LO
-/ -
foram obtidos no Jackson Laboratory- USA e gentilmente cedidos pelo Dr.
Fernando Cunha da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Os animais foram mantidos no Biotério de Camundongos
Isogênicos do Departamento de Ciências Patológicas, Universidade Estadual
de Londrina, Londrina-PR, em condições padronizadas dentro de gaiolas
coletivas contendo no máximo 5 animais, com alimentação especial para
camundongos (Nuvital CR1) e água esterilizada ad libitum.
Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê
de Ética e Pesquisa da Universidade Estadual de Londrina (Processo
28568/05, CEEA 54/05) e estão de acordo com as recomendações do Código
Brasileiro para Utilização de Animais de Laboratório.
Aminoguanidina (Sigma) e L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester,
Sigma) foram dissolvidos em solução tampão fosfato (PBS) pH 7.2 e NaCl 0.9%,
respectivamente. Todas as soluções dos reagentes foram preparadas na hora da utilização
sob condições estéreis.
28
3.2 Infecção por T. cruzi
A cepa Y do T. cruzi (SILVA & NUSSENZWEIG, 1953),
gentilmente cedida pelo Dr. Paulo Araújo do Departamento de Imunologia
da Universidade Estadual de Campinas, foi mantida por passagens semanais
em camundongos isogênicos Balb/c através da injeção intraperitonial de
2x10
5
formas tripomastigotas.
Para infecção dos grupos experimentais, foi coletado sangue de
camundongos infectados anestesiados através de punção cardíaca. As
formas móveis foram contadas em Câmara de Neubauer para determinação
do inoculo de 5x10
3
, que foi injetado intraperitonealmente nos animais dos
grupos experimentais infectados.
3.3 Tratamentos
O tratamento dos camundongos foi iniciado 4 horas após a
infecção com T. cruzi. Durante 30 dias ininterruptos os animais dos grupos
experimentais receberam injeções intraperitoniais diárias de tampão PBS
contendo ou não os inibidores enzimáticos (listados no quadro 1). As doses
de inibidores utilizadas basearam-se em protocolos descritos por estudos
prévios que comprovaram sua eficácia (GARDINER et al., 1990, MARTINS
et.al., 1999; MALVEZI et. al., 2004; MEHANNA et. al., 2007). Os grupos
experimentais foram compostos de 3 a 5 camundongos e representativos de
29
3 a 6 experimentos distintos (variando conforme parâmetro analisado) e
estão representados no quadro a seguir:
Quadro 1 – Inibidores, mecanismo de ação, doses diárias e grupos
experimentais empregados para avaliação da participação das NOS na
infecção aguda experimental por T. cruzi.
Inibidor Mecanismo de ação Dose diária Grupos
experimentais
Aminoguanidina
Inibição preferencial de iNOS 50 mg/Kg/dia 129 WT
129 5-LO
- / -
L-NAME Inibição preferencial de cNOS
20 mg/Kg/dia 129 WT
129 5-LO
- / -
Legenda: iNOS (óxido nítrico sintase induzível), cNOS (óxido nítrico sintase
constitutiva), 129 WT (animais selvagens, portadores de 5-lipoxigenase), 5-LO
- / -
(animais nocautes para 5-lipoxigenase), L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester).
3.4 Determinação da carga parasitária e taxa de sobrevida
A avaliação da concentração de parasitas circulantes nos grupos de animais
infectados foi realizada através de contagem em microscópio óptico do número de parasitas
circulantes em 5 µL de sangue caudal heparinizado, alternadamente, a partir do 5
0
dia pós-
infecção. Os resultados foram expressos em número de parasitas por mililitros de sangue,
30
conforme descrito por Brener (1962). A taxa de sobrevida dos animais infectados tratados
ou não com inibidores foi avaliada durante 30 dias.
3. 5 Preparo e coleta das amostras
No 12° dia os animais foram anestesiados para coleta de sangue
heparinizado por punção cardíaca. Em seguida, os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical para remoção cirúrgica do tecido
cardíaco, que foi fixado em formalina tamponada para posterior análise
histopatológica. O sangue total foi centrifugado a 1500 rpm/15minutos/4
0
C
e o plasma obtido foi aliquotado e estocado a -20
0
C para posterior análise.
3.6 Determinação de nitrito plasmático como estimativa das
concentrações plasmática de óxido nítrico (NO).
3.6.1 Validação e padronização da técnica de dosagem de nitrito
utilizando-se o sistema cádmio-cobre.
Para estimativa da concentração de NO nas amostras, foi realizada
a padronização e adaptação da técnica de determinação de nitrito em plasma
humano descrita por Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998) para
utilização de amostras biológicas de camundongos e determinação
simultânea de 40 duplicatas de amostras em microplaca. O método baseia-se
na redução de nitrato a nitrito mediada por reações de óxi-redução ocorridas
31
entre o nitrato presente na amostra e o sistema cádmio-cobre dos reagentes
(Figura 2), com posterior diazotação e detecção colorimétrica do
azocomposto formado pela adição do reagente de Griess a 550 nm (GRIESS,
1879).
Figura 2 – Esquema global das reações envolvidas na determinação de nitrito plasmático
empregando-se o método de Cádmio-Cobre seguido da reação de Griess.
3.6.1.1 Determinação do tempo médio de incubação
Foi realizada adaptação, validação e padronização da técnica para dosagem de
nitrito plasmático descrita por Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998) em soro humano
para plasma e soro de camundongos. Inicialmente, determinou-se qual o tempo médio de
incubação da amostras com as esferas de cádmio ativadas a ser utilizado nesta reação, de
forma a se obter o maior rendimento possível da conversão de nitrato a nitrito.
Para avaliar a produção de nitrito em relação ao tempo (em minutos) de uma
solução de nitrato de sódio 50 µM a 25
0
C, incubou-se 300 µL da solução de nitrato sob
agitação constante com esferas de cádmio previamente tratadas em tampão sulfato de cobre
5 mM, em diferentes tubos (um para cada tempo experimental). As amostras foram
incubadas durante 90 minutos, com leituras para determinação da concentração de nitrito a
cada 10 minutos, pela adição do reagente de Griess, com posterior leitura a 550 nm em
32
espectrofotômetro e determinação das concentrações de nitrito utilizando-se curva padrão
como referência.
3.6.1.2 Rendimento percentual da conversão de nitrato a nitrito
Para avaliar o rendimento da conversão de nitrato a nitrito neste sistema, foram
preparadas soluções de nitrato de sódio com concentrações crescentes, de 0 a 250 µM, a
partir de uma solução estoque de 500 µM.
Alíquotas de 300 µL de cada solução foram incubadas com 400-600 mg de
grânulos de cádmio previamente recobertos por sulfato de cobre 5 mM durante 10 minutos.
Após incubação e retirada das esferas, adicionou-se 300 µL de reagente de Griess, com
posterior leitura a 550 nm em espectrofotômetro. Em seguida, as concentrações iniciais de
nitrato das amostras foram comparadas à quantidade de nitrito produzida em cada uma
delas.
3.6.2 Adaptação do método de dosagem de nitrito plasmático utilizando-se o sistema
cádmio-cobre para plasma de camundongos.
Realizou-se a dosagem de nitrito plasmático para avaliar a sensibilidade da
metodologia empregando o sistema cádmio-cobre em relação à reação de Griess. Animais
C57BL/6, com 8 semanas de vida, foram anestesiados e puncionados na região cardíaca
para coleta de sangue heparinizado. O plasma obtido foi desproteinizado e separado em 2
aliquotas, uma para a reação de Griess e outra para incubação com esferas de cádmio.
33
3.6.2.1 Processamento das amostras
3.6.2.1.1 Desproteinização
Para uso no ensaio, as amostras previamente coletadas foram descongeladas em
banho de gelo. Em um tubo plástico de 1,5 mL, adicionou-se 60µL de amostra, 50µL de
ZnSO
4
75mM (2,156g em 100mL H
2
O deionizada) e, após homogeneização em vórtex (30
segundos), as amostras foram centrifugadas por 2 minutos a 10000 rpm a 4
0
C. Em seguida,
foram adicionados 70µL de 55mmol/L NaOH (220mg em 100mL H
2
O destilada) e
novamente homogeneizado em vórtex por 30 segundos. As amostras foram submetidas à
centrifugação por 5 minutos a 10000 rpm a 4
0
C, com posterior recuperação de 250 µL do
sobrenadante, adicionando-se 50µL de tampão glicina-NaOH 45g/L pH 9,7 (4,5g em
100mL H
2
O destilada).
3.6.2.1.2 Ativação dos grânulos de cádmio
Os grânulos estocados em H
2
SO
4
100mM foram lavados com H
2
O destilada três
vezes e, após, deixados em contato com solução de CuSO
4
5mM (124,84mg em 100mL em
tampão glicina-NaOH 15g/L pH 9,7) por 5 minutos. Os grânulos ativos foram utilizados
dentro de 10 min e aqueles que ficaram pretos mesmo após serem lavados com H
2
SO
4
foram descartados em recipiente apropriado para descarte de resíduos sólidos contendo
metais pesados do Departamento de Química da UEL.
34
3.6.2.1.3 Redução de nitrato a nitrito
Foram adicionados 400 mg de grânulos de cádmio ativados (esgotados em papel
de filtro para retirar o excesso de tampão CuSO
4
) ao sobrenadante recuperado em tampão,
deixando a mistura sob agitação contínua por 10 minutos. Após este tempo, as amostras
foram transferidas para outro tubo, para determinação de nitrito por meio da reação de
Griess.
3.6.2.1.4 Preparo da curva padrão
Solução estoque de 250 µM de NaNO
2
100mM (69mg em 10mL H
2
O destilada)
foram preparadas no momento do uso e diluídas seriadamente até 7,8 até 125 µM na
microplaca, conforme esquematizado abaixo.
Ponto
Concentração
µ
µµ
µM
Solução de NaNO2
H
2
O
destilada
(µ
µµ
µL)
Volume final
(µ
µµ
µL)
P1
125
50
µ
L da solução
estoque
50 100
P2 62,5
50
µ
L da solução
P1
50 100
P3 31,25
50
µ
L da solução
P2
50 100
P4 15,625
50
µ
L da solução
P3
50 100
P5 7,8125
50
µ
L da solução
P4
50 100
Branco 0 ------ 100 100
35
3.6.2.1.5 Reação de Griess
Para cada ponto da curva e amostra, foi feita a seguinte reação, em triplicata:
Figura 3 – Modelo de distribuição da curva padrão e amostras em microplaca de 96 poços.
Para cada poço, adicionou-se 50 µL de amostra + 50 µL de Reagente de Griess
(Sulfanilamida: 0,4 g sulfanilamida em 20 mL Ácido Fosfórico 5% - proteger da luz;
NEED, naftiletildietilamina: 40mg em 20mL H
2
O destilada – protegido da luz). Em
seguida, a placa foi incubada a temperatura ambiente durante 10 minutos, e medida sua
absorbância a 550 nm em leitor de microplaca.
36
3.7 Dosagem de citocinas plasmáticas
Foi realizada dosagem das citocinas plasmáticas IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, 1L-17A, IL-23, IFN-γ, TNF-α E TGF-β1,
utilizando-se o kit Multi-Analyte Profiler ELISArray® (Superarray
Bioscience Corporation, CAT#1026 A). O kit foi desenvolvido para
determinar simultaneamente o perfil de 12 citocinas dos padrões
Th1/Th2/Th0/Th17, empregando-se o método de ELISA sandwich.
Utilizou-se pool de amostras de plasma obtidas dos grupos
experimentais (3 a 5 animais por grupo), de 3 experimentos distintos,
distribuídos em placas de 96 poços previamente sensibilizadas com os
anticorpos de captura específicos para cada anticorpo (Figura 4).
Figura 4 – Representação esquemática da placa de Multi-Analyte Profiler
ELISArray®.
tiras
37
Para cada tira (strip) existem 8 poços previamente sensibilizados pelo fabricante
com anticorpos de captura para cada citocina, havendo 12 tiras totais na placa, cada um
correspondendo a uma citocina específica. Na linha A da placa foram adicionados os
controles negativos e na linha H os controles positivos de cada citocina. Os controles
positivos foram obtidos a partir da diluição de recombinantes e os controles negativos
foram obtidos pela adição de tampão de diluição da amostra, fornecidos prontos pelo
fabricante.
Nas linhas B a G, foram distribuídas as amostras em duplicata; portanto, para
cada placa foi possível analisar o perfil de citocinas de 3 grupos experimentais. Após
distribuição das amostras e controles nas respectivas tiras, a placa foi incubada por 2 horas
a temperatura ambiente, lavada e incubada com as soluções de anticorpos de detecção por 1
hora a temperatura ambiente.
Após remoção da solução de anticorpos de detecção com tampão de lavagem,
adicionou-se na placa solução contendo o complexo avidina-peroxidase, incubada durante
30 minutos a temperatura ambiente protegida da luz. Esta solução foi removida após a
incubação por lavagem da placa e em seguida foi adicionada solução reveladora, incubada
por 15 minutos a temperatura ambiente protegida da luz. Em seguida, foi adicionada
solução de bloqueio da reação, que desenvolveu coloração amarela. A absorbância das
amostras foi determinada a 450 nm em leitor de microplaca, 20 minutos após adição da
solução de bloqueio.
Os dados obtidos foram expressos em unidades arbitrárias (D.O.), de acordo
com os valores de absorbância obtidos.
38
3.8 Análise histopatológica do tecido cardíaco e determinação do
parasitismo cardíaco
O tecido cardíaco foi processado segundo o método de Preece
para análise histológica (BEÇAK et. al., 1970). Foi realizada fixação em
formalina tamponada 10%, desidratação do material em álcool (Biotec,
Brasil), diafanização em xilol (Biotec, Brasil) e inclusão em parafina. O
material foi seccionado em micrótomo rotativo (Reichert-Jung,Histocut
820) em cortes de 5 µm e corados por hematoxilina- eosina.
Nas amostras de animais infectados (tratados ou não) foi realizada
contagem do número de ninhos de amastigotas em microscopia óptica
(400x) presentes na superfície total de cada corte, em triplicata.
3.9 Análise Estatística
Os dados foram coletados de 2 experimentos distintos e apresentados como
média ± SD e a comparação entre os grupos de animais infectados e controles foi realizada
através do teste t de Student e ANOVA one-way, seguido do Teste de Bonferroni,
utilizando o programa GrapPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA),
considerando-se p< 0,05 como significativo de diferença entre os grupos.
39
4 RESULTADOS
4.1 Adaptação, validação e padronização da técnica para dosagem de nitrito
plasmático.
4.1.1 Determinação do tempo médio de incubação
Foi realizada adaptação, validação e padronização da técnica para dosagem de
nitrito plasmático descrita por Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998) em soro humano
para plasma e soro de camundongos.
Inicialmente, determinou-se qual o tempo médio de incubação da amostras com
as esferas de cádmio ativadas a ser utilizado nesta reação, de forma a se obter o maior
rendimento possível da conversão de nitrato a nitrito.
Para avaliar a produção de nitrito em relação ao tempo (em minutos) de uma
solução de nitrato de sódio 50 µM a 25
0
C, incubou-se as soluções de nitrato sob agitação
constante com esferas de cádmio previamente tratadas em tampão sulfato de cobre 5 mM.
Para determinação da concentração de nitrito adicionou-se reagente de Griess, com
posterior leitura a 550 nm em espectrofotômetro e determinação das concentrações de
nitrito utilizando-se curva padrão como referência.
Observou-se que o primeiro pico de produção de nitrito atingido foi de 22 µM
aos 10 minutos de reação e que até 70 minutos de reação a conversão de nitrato a nitrito se
manteve entre 20 e 28 µM. Desta forma, o tempo médio de incubação da amostra com
esferas de cádmio ativadas escolhido para todas as reações testadas neste trabalho foi 10
minutos (Figura 5).
40
Figura 5 – Avaliação da produção de nitrito em função do tempo. Foi realizada a
incubação de uma solução de nitrato de sódio 50 µM com esferas de cádmio previamente
tratadas com tampão sulfato de zinco 5 mM em glicina 15 g/mL, pH 9.7. Para cada tempo
testado foram utilizados tubos diferentes, as amostras permaneceram a 25
0
C, sob agitação
constante. Para determinação da concentração de nitrito, adicionou-se reagente de Griess a
cada tubo teste em proporções equivalentes ao volume de amostra, determinando-se em
seguida a absorbância a 550 nm em espectrofotômetro. A concentração de cada amostra foi
obtida a partir de uma curva padrão de NaNO
2
. O gráfico expressa o resultado de um
experimento representativo das análises.
41
4.1.2 Rendimento percentual da conversão de nitrato a nitrito
Para avaliar o rendimento da conversão de nitrato a nitrito neste sistema, foram
preparadas soluções de nitrato de sódio com concentrações crescentes de 0 a 250 µM. Após
incubação com grânulos de cádmio por 10 minutos, alíquotas da amostra foram adicionadas
ao mesmo volume de reagente de Griess, com posterior leitura a 550 nm em
espectrofotômetro.
Em seguida, as concentrações iniciais de nitrato das amostras foram
comparadas à quantidade de nitrito produzida em cada uma delas. A figura 6 mostra a
quantidade de nitrito produzida em cada solução de nitrato de sódio testada. Observa-se que
até o ponto onde adiciona-se 60 µM de nitrato, ocorre uma conversão do mesmo em nitrito
que varia entre 5 µM e 20 µM. Após este ponto, a produção de nitrito em cada solução de
nitrato passou a equivaler aproximadamente a metade da concentração desta solução. O
rendimento médio calculado para esta conversão foi de 53, 09%.
42
Figura 6 – Rendimento da conversão de nitrato a nitrito. Partindo-se de concentrações
crescentes de nitrato de sódio (0 a 250 µM), incubou-se as soluções com esferas de cádmio
previamente sensibilizadas com tampão sulfato de zinco 5 mM em glicina 15 g/mL, pH 9.7.
Para cada concentração testada as amostras permaneceram a 25
0
C, sob agitação constante.
Para determinação da concentração de nitrito, adicionou-se reagente de Griess a cada tubo
teste em proporções equivalentes ao volume de amostra, determinando-se em seguida a
absorbância a 550 nm em espectrofotômetro. A concentração de cada amostra foi obtida a
partir de uma curva padrão de NaNO
2
. Em seguida, calculou-se o rendimento percentual da
conversão de nitrato a nitrito em cada ponto. O gráfico expressa o resultado de um
experimento representativo das análises. O gráfico expressa o resultado de um experimento
representativo das análises.
43
4.1.3 Curva padrão de nitrito
Para determinar a concentração de nitrito das amostras, utilizou-se uma curva
padrão de nitrito de sódio. Os pontos foram obtidos através de diluções de uma solução
estoque de NaNO
2
na concentração de 250 µM, diluida seriadamente de 125 µM a 7,8 µM,
utilizando-se como branco da reação água miliQ. Em seguida, adicionou-se volume
equivalente de reagente de Griess a todos os poços, com leitura a 550 nm em
espectrofotômetro após 10 minutos de incubação a temperatura ambiente, protegido da luz.
A figura 7 mostra a correlação entre os valores das absorbâncias a 550 nm
(O.D.) e a concentração de nitrito presente em cada ponto da curva, que posteriormente foi
utilizada para determinação da concentração das amostras testadas através da regressão
linear dos pontos e obtenção da equação da reta. Para cada reação, foi preparada uma nova
solução estoque e uma curva padrão.
44
Figura 7 – Curva padrão de NaNO
2
. Para determinar a concentração de nitrito das
amostras, utilizou-se uma curva padrão de nitrito de sódio, a partir da diluição seriada da
solução estoque de NaNO
2
250 µM. Após adição do reagente de Griess, determinou-se a
absorbância a 550 nm em espectrofotômetro, expressa no gráfico como D.O . A equação da
reta foi obtida a partir da regressão linear dos pontos. O gráfico expressa o resultado de um
experimento representativo das análises.
D.O
550 nm
NaNO2
45
4.1.4 Adaptação do método em microplaca: dados complementares
O método descrito por Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998) executa todo
o protocolo experimental em tubos de ensaio, empregando um volume inicial de amostra de
300 µM, obtendo-se um volume final de reação de 2.700 µL. A adaptação deste método
para a microplaca de 96 poços consistiu na utilização de um volume de amostra de 60 µL,
obtendo-se um volume final de reação de 500 µL, reduzindo em 6 vezes o volume
necessário de amostra e reagentes (Tabela 1).
Além de reações com plasma de camundongos, também foram testadas reações
de soro obtendo-se os mesmos resultados. Utilizando-se a aliquota de 60 µL de plasma,
obteve-se a possibilidade de trabalhar em quadruplicata de cada amostra. O tempo de
execução do teste em microplaca, considerando-se a utilização de 96 poços foi de 2 horas,
permitindo a análise de pelo menos 28 amostras, simultaneamente à curva padrão.A
linearidade do teste foi observada entre 0 e 500 µM.
A imprecisão intra-ensaio (within-run) foi realizada através da repetição de 10
vezes a mesma amostra, dentro do mesmo teste e a imprecisão inter-ensaio (betwen-day)
pela repetição de uma amostra em 10 reações distintas executadas em dias diferentes. O
principal interferente identificado durante a adaptação e padronização do teste foi a
hemólise, que elevou as concentrações de nitrito nas amostras. Desta forma, todas amostras
hemolisadas obtidas nos testes biológicos foram desconsideradas para esta análise.
46
Tabela 1 – Dados complementares obtidos a partir da padronização em microplaca do
método descrito por Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998) para determinação da
concentração de nitrito plasmático.
Parâmetros Resultados
Volume de amostra inicial 60uL
Tipo de amostra Plasma, soro
Número de repetições por alíquota de amostra quadruplicata
Volume de reagente de Griess por poço 50 uL
Tempo de execução aproximado (96 poços) 2 horas
Intervalo e linearidade do teste (NaNO
2
)
0 – 500 uM (R=0,99825
±
0,000957,
n=8)
Rendimento médio da conversão nitrato-nitrito 53,09%
Tempo médio da conversão nitrato-nitrito 10 minutos, estável por 70 minutos a
25
0
C
Imprecisão intra-ensaio
4,16%
±
0,002, n=10
Imprecisão inter-ensaio
6,22%
±
0,005, n=10
Interferentes identificados no teste Hemólise
47
4.1.5 Avaliação da sensibilidade do método de dosagem de nitrito plasmático
utilizando-se o sistema cádmio-cobre em relação à reação de Griess.
Realizou-se a dosagem de nitrito plasmático para avaliar a sensibilidade da
metodologia empregando o sistema cádmio-cobre em relação à reação de Griess.
Camundongos C57BL/6 (n=10), com 8 semanas de vida, foram anestesiados e
puncionados na região cardíaca para coleta de sangue heparinizado. O plasma obtido foi
desproteinizado e separado em 2 aliquotas, uma para a reação de Griess e outra para
incubação com esferas de cádmio.
De acordo com a figura 8, a dosagem de nitrito plasmático nas amostras que
receberam apenas o reagente de Griess foi de 1,87±0,6 µM, n=8, enquanto que os plasmas
tratados com esferas de cádmio sensibilizadas com cobre revelaram níveis de nitrito de
11,4±1,28, n=10 . Assim, o aumento na sensibilidade de detecção do nitrito observada
empregando-se o tratamento da amostra com as esferas de cádmio foi 6 vezes maior em
relação à reação empregando apenas o reagente de Griess.
48
Griess Cd+Griess
0
2
4
6
8
10
12
14
NO
2
-
µ
M
Figura 8 – Comparação da dosagem de nitrito no plasma pelo método de Griess associado
ou não ao tratamento prévio da amostra com esferas de cádmio. Plasma desproteinizado de
animais controle C57BL/6 foi adicionado ao reagente de Griess apenas (Griess) ou sofreu
tratamento com esferas de cádmio sensibilizadas com cobre e posterior adição ao reagente
de Griess (Cd+Griess). As concentrações de nitrito foram determinadas após leitura a 550
nm, empregando-se curva padrão como referência. * indica diferença estatística
significativa (p< 0,0001, teste T de Student).
*
49
4.2 5-LO participa do controle da carga parasitária durante a infecção por T. cruzi
Para avaliar o curso da fase aguda da infecção chagásica experimental,
utilizamos duas linhagens de camundongos susceptíveis à infecção por T. cruzi (cepa Y),
129 WT (linhagem selvagem) e 5-LO
-/-
(nocautes para 5-lipoxigenase, deficiente na
produção de leucotrienos), tratadas ou não com os inibidores da produção de NO, L-NAME
(para inibição da cNOS) e aminoguanidina (para bloqueio da iNOS).
A figura 9 mostra o curso da infecção nestes animais, infectados com 5x10
3
formas tripomastigotas de T. cruzi intraperitonialmente. O pico de infecção ocorreu por
volta do sétimo dia em ambas as linhagens (129 WT e 5-LO
-/-
) infectadas sem tratamento
(INF) e os animais nocautes para 5-LO apresentaram maiores níveis de parasitemia ao
longo da infecção, reduzindo o número de parasitas circulantes posteriormente ao grupo
selvagem ao longo da infecção.
Em relação à sobrevida dos animais, observou-se que todos os animais
selvagens sem tratamento (129 WT, Figura 10A) sobreviveram até o trigésimo dia de
infecção, sendo que 60% dos animais da linhagem nocaute (5-LO
-/-
) foram a óbito dentro
deste período (Figura 10B), evidenciando a participação da 5-LO na sobrevivência e
resistência à infecção por T. cruzi.
O parasitismo cardíaco dos animais 5-LO
-/-
(Figura 11) revelou uma contagem
do número de ninhos de amastigotas 4 vezes maior em relação aos animais selvagens
(13,66±1,56 versus 3,32±0,51), indicando que o controle do número de ninhos e
multiplicação do parasita no tecido cardíaco está associado à presença da 5-LO.
50
4.3 Efeitos antagônicos do bloqueio da iNOS e cNOs sobre a carga parasitária de
camundongos 5-LO
-/-
Corroborando achados demonstrados em estudos anteriores, nossos dados
evidenciam a participação da iNOS ao longo da infecção aguda por T. cruzi, demonstrada
através da utilização de bloqueio farmacológico desta enzima. Os animais receberam a
primeira dose de inibidor 4 horas após a infecção e o tratamento foi mantido durante 30
dias, para avaliação da taxa de sobrevida e parasitemia. O grupo de animais controle
recebeu injeção intraperitonial de tampão PBS (INF) e o grupo experimental recebeu
injeção de aminoguanidina (AG, 50 mg/kg/dia). Observou-se elevação do número de
parasitas no tratamento com aminoguanidina (AG) nas duas linhagens (Figura 9).
Em relação à sobrevida, o tratamento com aminoguanidina provocou a morte de
50% dos animais 129 WT até o 28
0
dia após a infecção; já nos animais nocautes, observou-
se início dos óbitos no 22
0
dia e morte de 100% do grupo até o trigésimo dia (Figura 10).
A contagem do número de ninhos no tecido cardíaco (Figura 11) no grupo
tratado com aminoguanidina revelou aumento do parasitismo cardíaco em ambas as
linhagens de maneira semelhante (28,33±4,33 para os animais selvagens e 33,01±10,81 nos
camundongos nocautes), demonstrando que a 5-LO não participa deste processo na
ausência de iNOS.
Para avaliar a participação da cNOS no curso da infecção aguda por T. cruzi, os
animais receberam injeção de L-NAME (20 mg/kg/dia) durante 30 dias. Observou-se que o
bloqueio da cNOS provocou queda do número de parasitas nos animais de ambas linhagens
(Figura 9 A e B) e que, para os animais nocautes, este tratamento decresce o número de
parasitas na circulação a níveis indetectáveis. A sobrevida dos animais selvagens (Figura
51
10) tratados com L-NAME é de 90% ao final de 30 dias e, para a linhagem 5-LO
-/-
, o
tratamento com L-NAME provocou a morte de 100% dos animais dentro de 22 dias.
Demonstrou-se que o bloqueio da cNOS proporciona o controle do parasitismo
cardíaco nos animais nocautes para 5-LO, pois o tratamento com L-NAME provocou
redução significativa do número de ninhos de amastigotas no tecido cardíaco. Os animais
selvagens tratados com L-NAME não apresentaram alterações na contagem de ninhos
cardíacos (Figura11).
Para avaliar o efeito conjunto da iNOS e cNOS sobre a infecção, os grupos
experimentais receberam injeções simultâneas de aminoguanidina e L-NAME. Observou-se
que o tratamento com aminoguanidina + L-NAME (AG+LNAME) levou ao aumento da
carga parasitária apenas na linhagem 129 WT, com novo pico ao 17
0
dia, provocando
redução do número de parasitas na linhagem nocaute até o 11
0
dia e elevação da carga
parasitária a partir do 13
0
dia (Figura 9). O efeito deste bloqueio simultâneo sobre a taxa de
sobrevivência dos animais selvagens não provocou redução significativa da sobrevida,
enquanto que a linhagem nocaute apresentou 100% de óbitos no 17
0
dia (Figura 10). O
parasitismo cardíaco apresentou queda significativa nos animais com o bloqueio simultâneo
das NOS, independentemente da presença de leucotrienos (Figura 11).
52
0
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
0
5.0×10
5
1.0×10
6
1.5×10
6
INF
I+AG
I+LN
I+AG+LN
129 WT
A
*
*
*
Dias após a infecção com T. cruzi
Parasitas/mL
0
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
0
5.0×10
5
1.0×10
6
1.5×10
6
INF
I+AG
I+LN
I+AG+LN
5-LO
-/-
*
*
B
Dias após a infecção com T. cruzi
Parasitas/mL
Figura 9 – Parasitemia de camundongos infectados com T. cruzi, determinada pela
metodologia de Pizzi e Brenner (1962). A parasitemia foi quantificada através do número
de formas tripomastigotas/mL de sangue total. Os resultados foram expressos como
média±desvio padrão, representativos de 5 animais, de 3 experimentos independentes. Os
resultados foram comparados por ANOVA seguida de teste de Bonferroni, * p< 0,05 indica
resultados estatisticamente diferentes. INF=animais infectados, I+AG=animais infectados
tratados com aminoguanidina, I+LN=animais infectados tratados com L-NAME,
I+AG+LN=animais infectados tratados com aminoguanidina e L-NAME.
53
0 10 20 30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
INF
INF+AG
INF+LN
INF+AG+LN
129 WT
Dias após a infecção com T. cruzi
Sobrevivência %
*
0 10 20 30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
INF
5-LO
-/-
INF+AG+LN
INF+AG
INF+LN
*
*
*
Dias após a infecção com T. cruzi
Sobrevivência %
Figura 10 – Sobrevivência de camundongos infectados com T. cruzi, infectados
intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas. Os tratamentos foram iniciados 4
horas após a infecção e mantidos durante 30 dias. Os tratamentos administrados nos
animais foram injeção de tampão PBS (INF), aminoguanidina 50 mg/kg/dia(AG), L-
NAME 20 mg/kg/dia ou aminoguanidina + L-NAME (AG+L-NAME). Os resultados foram
expressos como média±desvio padrão, representativos de 5 animais, de 3 experimentos
independentes. Os resultados foram comparados por ANOVA seguida de teste de
Bonferroni, * p< 0,05 indica resultados estatisticamente diferentes. INF=animais
infectados, I+AG=animais infectados tratados com aminoguanidina, I+LN=animais
infectados tratados com L-NAME, I+AG+LN=animais infectados tratados com
aminoguanidina e L-NAME.
54
INF INF+AG INF+LNAME
INF+AG+LNAME
0
10
20
30
40
129 WT
*
*
*
A
Ninhos de amastigotas/coração
INF INF+AG INF+LNAME
INF+AG+LNAME
0
10
20
30
40
50
5-LO
-/-
*
B
*
*
Ninhos de amastigotas/coração
Figura 11 – Quantificação do número de ninhos de amastigotas de T. cruzi no tecido
cardíaco de camundongos 129 WT e 5-LO
-/-
no12
0
dia pós-infecção. Os animais foram
infectados intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas e os tratamentos foram
iniciados 4 horas após a infecção, mantidos durante 12 dias. Os tecidos foram fixados em
formalina 10%, desidratados em concentrações crescentes de álcool, diafanizados em xilol
e inclusos em parafina. Cortes de 5 µ foram corados por hematoxilina-eosina e analisados
em microscopia de luz, aumento de 400 x. Os resultados foram expressos como
média±desvio padrão, representativos de 5 animais, de 3 experimentos independentes. Os
resultados foram comparados por ANOVA seguida de teste de Bonferroni, * p<0,05 indica
resultados estatisticamente diferentes. INF=animais infectados, I+AG=animais infectados
tratados com aminoguanidina, I+LN=animais infectados tratados com L-NAME,
I+AG+LN=animais infectados tratados com aminoguanidina e L-NAME.
55
4.4 A produção de NO durante a infecção aguda por T. cruzi é dependente de iNOS e
cNOS, ocorrendo na ausência de leucotrienos.
A produção do NO derivado da iNOS durante a infecção por T. cruzi é descrita
como fator imprescindível para sobrevivência do hospedeiro; entretanto, a participação da
cNOS na produção de NO durante a infecção ainda não foi descrita para este modelo, bem
como o papel dos leucotrienos neste processo. Assim, decidimos investigar qual o papel das
NOS na produção de NO na presença (camundongos 129 WT) ou ausência (camundongos
5-LO
-/-
) de leucotrienos, através da utilização dos bloqueadores de cNOS (L-NAME) e
iNOS (aminoguanidina), associados ou não, através da dosagem de nitrito plasmático
empregando a técnica de dosagem por cádmio padronizada.
Nossos resultados demonstraram que nos animais controles existe uma
produção basal de nitrito, independentemente da presença de leucotrienos (Figura 12). A
infecção por T. cruzi elevou os níveis de nitrito nos animais 129 WT de 8,44 ±1,47 para
59,78±13,69 e nos animais nocautes de 8,24 ±1,39 para 91,04±22,16, indicando que a
produção de NO durante a infecção é maior nos camundongos que não produzem
leucotrienos.
O tratamento com aminoguanidina foi capaz de reduzir os níveis de nitrito na
linhagem 129 WT (de 59,78±13,69 nos animais infectados para 16,96±6,54 nos tratados) e
na linhagem 5-LO
-/-
(de 91,04±22,16 nos infectados para 39,56±12,57 nos tratados). A
inibição da cNOS levou à queda significativa na produção de NO apenas nos animais
nocautes (de 91,04±22,16 nos infectados para 38,79±16,9 nos tratados). A inibição
simultânea da iNOS e cNOS levou à queda significativa apenas nos animais 5-LO
-/-
(de
91,04±22,16 nos infectados para 35,17±14,63 nos tratados).
56
CTR INF INF+AG INF+LNAME
INF+AG+LNAME
0
20
40
60
80
100
120
*
129 WT
A
NO
2
-
µ
µ
µ
µ
M
CTR INF INF+AG
INF+LNAME
INF+AG+LNAME
0
20
40
60
80
100
120
* *
*
5-LO
-/-
B
NO
2
-
µ
µ
µ
µ
M
Figura 12 – Produção de nitrito plasmático em camundongos selvagens (129WT) e
nocautes para produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção. Os animais foram
infectados intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas e os tratamentos foram
iniciados 4 horas após a infecção, mantidos durante 12 dias. Os tratamentos administrados
nos animais foram injeção de tampão PBS (INF), aminoguanidina 50 mg/kg/dia(AG), L-
NAME 20 mg/kg/dia ou aminoguanidina + L-NAME (AG+L-NAME). Os resultados foram
expressos como média±desvio padrão, representativos de 3 animais, de 3 experimentos
independentes. Os resultados foram comparados por ANOVA seguida de teste de
Bonferroni, * p< 0,05 indica resultados estatisticamente diferentes. CTR=animais controle
não infectados, INF=animais infectados, I+AG=animais infectados tratados com
aminoguanidina, I+LN=animais infectados tratados com L-NAME, I+AG+LN=animais
infectados tratados com aminoguanidina e L-NAME.
57
4.5 Perfil de citocinas plasmáticas
4.5.1 A produção basal de citocinas plasmáticas é influenciada pela 5-LO.
A figura 13 mostra o perfil de citocinas nos animais selvagens (129 WT) e
nocautes para 5-LO (5-LO
-/-
). Animais controle nocautes apresentam menores níveis de
produção de IL-6 em relação aos animais da linhagem selvagem controle, entretanto,
apresentam maior produção de IL-13, IL-17a, IL-23 e TGF-β.
4.5.2 A infecção com T. cruzi provoca aumento dos níveis de IL-6 e IFN-γ
γγ
γ plasmáticos
Observa-se aumento na produção de IL-6 e IFN-γ durante a fase aguda da
infecção por T. cruzi, tanto nos animais selvagens como nos nocautes, embora este aumento
tenha sido relativamente maior na ausência de leucotrienos (Figura 13).
4.5.3 O perfil de citocinas produzidas durante a infecção é alterado pelo bloqueio das
NOS.
Como a produção de NO é diretamente influenciada pelo padrão de citocinas
produzidas durante a infecção, investigamos o perfil destes mediadores nos animais através
do bloqueio farmacológico da iNOS e cNOS.
Na linhagem selvagem, o bloqueio da iNOS levou ao aumento nos níveis
plasmáticos de IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, INF-γ, TNF-α e TGF-β e redução nos níveis de IL-
58
6, em comparação aos infectados não tratados. Em relação aos animais infectados sem
tratamento, os nocautes infectados apresentaram queda na produção de IL-6 após o
tratamento com aminoguanidina.
A inibição da cNOS (Figura 14) provocou aumento na produção de IL-10 nos
animais selvagens e levou ao aumento significativo nos níveis de INF-γ nos animais
nocautes em relação aos animais infectados sem tratamento.
O bloqueio simultâneo de cNOS e iNOS (Figura 15) provocou aumento do
IFN-γ, TNF-α e TGF-β nos animais selvagens, enquanto que nos nocautes tratados
observou-se queda dos níveis de IL-6 e aumento nos níveis de IL-10, IL-12, IL-13, IL-17a,
IL-23, IFN-γ, TNF-α e TGF-β.
59
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
Controle
Infectado
Infectado+AG
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Infectado
Infectado+AG
Controle
129 WT
IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17a IL-23 IFN- γ TNF-α TGF-β
O.D.
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
Controle
InfectadoInfectado+AG
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Infectado
Infectado+AG
Controle
5-LO
-/-
IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17a IL-23 IFN- γ TNF-α TGF-β
O.D.
Figura 13– Perfil de citocinas em camundongos selvagens (129WT) e nocautes para
produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção. Os animais foram infectados
intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas (Infectados e Infectados+AG) e os
tratamentos foram iniciados 4 horas após a infecção, mantidos durante 12 dias. Os
tratamentos administrados nos animais foram injeção de tampão PBS (Controles e
Infectados), aminoguanidina 50 mg/kg/dia(AG). Os resultados foram expressos como
média±desvio padrão, representativos de um pool de 12 animais, de 3 experimentos
independentes. Os resultados foram comparados por ANOVA seguida de teste de
Bonferroni, * p< 0,05 indica resultados estatisticamente diferentes.
60
C o n tro le
In fe cta do
In fe ctad o + L N A M E
C o n tro le
Infe cta d o
In fe cta d o + LN A M E
C o ntro le
In fe cta do
Infe ctad o + L N A M E
C o n tro le
In fe cta d o
In fe cta d o + LN A M E
C o n tro le
Infe ctad o
Infe cta d o + L N A M E
C o n tro le
In fe cta d o
In fe cta do + L N A M E
C o n tro le
Infe ctad o
In fe cta d o + L N A M E
C o ntro le
In fe cta do
Infe cta d o + L N A M E
C o n tro le
Infe cta d o
In fe cta do + L N A M E
C o ntro le
In fe cta do
Infe cta d o + L N A M E
C o n tro le
In fe cta d o
In fe cta do + L N A M E
C o n tro le
Infe ctad o
In fe cta d o + LN A M E
0.0 0
0.2 5
0.5 0
0.7 5
1.0 0
1.2 5
Inf ec tad o
Inf ec tad o+LNA ME
Contr ole
12 9 W T
IL -2 IL -4 IL -5 IL -6 IL -1 0 IL -12 IL-1 3 IL -1 7 a IL-2 3 IF N - γ TN F -α TG F -β
O .D .
C o n tro le
Infe ctad o
Infe ctad o + L N A M E
C o n trole
Infe ctad o
In fe cta do + L N A M E
C o n tro le
In fe cta do
In fe cta do + L N A M E
C o n tro le
Infe ctad o
Infe ctad o + L N A M E
C o n trole
Infe ctad o
Infe ctad o + L N A M E
C o n tro le
In fe cta do
In fe cta do + L N A M E
C on tro le
In fe cta do
Infe ctad o + L N A M E
C o n trole
Infe ctad o
Infe ctad o + L N A M E
C o n trole
In fe c ta d o
In fe cta do + L N A M E
C on tro le
In fe cta do
Infe ctad o + L N A M E
C o n tro le
Infe ctad o
Infe ctad o + L N A M E
C o n trole
In fe c ta d o
Infe ctad o + L N A M E
0.0 0
0.2 5
0.5 0
0.7 5
1.0 0
1.2 5
In f ec tad o
In f ec tad o+LNA ME
Con tro le
5-L O
-/-
IL -2 IL-4 IL -5 IL -6 IL -1 0 IL -1 2 IL -1 3 IL -1 7 a IL -2 3 IF N - γ TN F -α TG F -β
O .D.
Figura 14 – Perfil de citocinas em camundongos selvagens (129WT) e nocautes para
produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção. Os animais foram infectados
intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas (Infectados e Infectados+L-
NAME) e os tratamentos foram iniciados 4 horas após a infecção, mantidos durante 12
dias. Os tratamentos administrados nos animais foram injeção de tampão PBS (Controles e
Infectados), L-NAME 20mg/kg/dia. Os resultados foram expressos como média±desvio
padrão, representativos de um pool de 12 animais, de 3 experimentos independentes. Os
resultados foram comparados por ANOVA seguida de teste de Bonferroni, * p< 0,05 indica
resultados estatisticamente diferentes.
61
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
129 WT
IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17a IL-23 IFN- γ TNF-α TGF-β
O.D.
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
Infectado
Infectado+AG+LNAME
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Infectado
Infectado+AG+LNAME
Controle
5-LO
-/-
IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17a IL-23 IFN- γ TNF-α TGF-β
O.D.
Figura 15 – Perfil de citocinas em camundongos selvagens (129WT) e nocautes para
produção de leucotrienos (5-LO
-/-
) no12
0
dia pós-infecção. Os animais foram infectados
intraperitonealmente com 5x10
3
formas tripomastigotas (Infectados e infectados+AG+L-
NAME) e os tratamentos foram iniciados 4 horas após a infecção, mantidos durante 12
dias. Os tratamentos administrados nos animais foram injeção de tampão PBS (Controles e
Infectados) ou aminoguanidina 50mg/kg/dia+L-NAME 20mg/kg/dia. Os resultados foram
expressos como média±desvio padrão, representativos de um pool de 12 animais, de 3
experimentos independentes. Os resultados foram comparados por ANOVA seguida de
teste de Bonferroni, * p< 0,05 indica resultados estatisticamente diferentes.
62
5 DISCUSSÃO
Existem diversos métodos para a estimativa dos níveis de NO em amostras
biológicas. Ensaios que medem diretamente a concentração de NO são denominados
métodos diretos, enquanto que aqueles que estimam a presença do NO a partir de seus
metabólitos estáveis são denominados indiretos. Os métodos indiretos, embora não
permitam acessar as concentrações de NO especificamente, são os mais empregados na
pesquisa devido sua fácil execução, baixo custo, boa sensibilidade e, principalmente, por
permitir a detecção dos níveis de metabólitos estáveis do NO, como o nitrito e nitrato
(ARCHER, 1993).
A reação de Griess ou ensaio de diazotização (GRIESS, 1879) é considerada a
técnica padrão para a mensuração colorimétrica dos níveis de produção de nitrito
inorgânico. Esta reação sofreu diversas adaptações ao longo dos anos e tem sido
amplamente empregada em diferentes modelos experimentais (ARCHER, 1993).
Entretanto, sua capacidade de determinação de nitrito em amostras de plasma e soro é
praticamente nula.
Navarro-Gonzálvez e colaboradores (1998) descreveram um método de
detecção de nitrito em amostras biológicas humanas utilizando reações de óxi-redução
mediadas pelo complexo cádmio-cobre para potencializar sua sensibilidade, convertendo
todo o nitrato presente na amostra em nitrito, com posterior detecção pela reação de Griess.
Nesta técnica, os autores realizam a incubação da amostra com grânulos de cádmio
previamente ativados em solução tampão sulfato de cobre que permitem a obtenção dos
níveis séricos basais de nitrito, pela conversão do nitrato presente na amostra.
63
Neste trabalho, adaptamos este método descrito por Navarro-Gonzálvez e
colaboradores (1998) para a determinação simultânea de várias amostras empregando
microplacas de 96 poços. O volume de amostra necessário foi de 60 µL, o que representa
uma economia de 80% no volume de amostra e de reagentes empregados na técnica
utilizada como referência (macrométodo). A execução do teste em microplaca
(micrométodo) permitiu a análise simultânea de 40 amostras em duplicata, num período de
2 horas, enquanto que a execução do macrométodo consumiu aproximadamente 5 horas
para o mesmo número de amostras, possibilitando a obtenção dos mesmos resultados
obtidos pelo micrométodo.
Posteriormente, foi realizada a detecção de nitrito plasmático em amostras de
camundongos C57BL/6, tratadas ou não previamente com grânulos de cádmio ativados,
com posterior adição do reagente de Griess e leitura a 550 nm. Nossos resultados mostram
que quando a amostra sofre tratamento prévio com grânulos de cádmio, seus níveis de
nitrito apresentam-se 6 vezes maiores em relação aos níveis de amostras nas quais
adicionou-se apenas o reagente de Griess.
Isso ocorre porque os grânulos de cádmio ativados pelo cobre promovem a
redução das moléculas de nitrato, presentes em grande concentração na amostra, em nitrito
(GREEN et al., 1992). O micrométodo mostrou-se adequado e sensível para a detecção de
nitrito em plasma e soro de camundongos, apresentando características como fácil
execução, baixo custo e rapidez na obtenção de resultados. Desta forma, as análises para
determinação dos níveis plasmáticos de NO realizadas neste estudo foram determinadas
pelo micrométodo descrito neste trabalho.
A infecção aguda por T. cruzi caracteriza-se pela produção de uma resposta
inflamatória complexa, envolvendo diversos mediadores como NO (BOGDAN, 2001),
64
prostaglandinas (PINGE-FILHO et al., 1999), citocinas (TANOWITZ et al.,1992) e
leucotrienos (TALVANI et al.; 2002).
Os LTs são mediadores lipídicos sintetizados a partir do ácido araquidônico por
um complexo enzimático intracelular em resposta a agentes infecciosos. Estas substâncias
apresentam propriedades biológicas como potencialização da capacidade fagocítica de
macrófagos e neutrófilos, além de potencializar a produção de mediadores com capacidade
microbicida por estas células (PETERS-GOLDEN et al., 2005).
Estudos anteriores realizados em nosso laboratório (BORGES, 2007) revelaram
que a 5-LO exerce papel fundamental no controle da carga parasitária e no estresse
oxidativo durante a fase aguda da infecção experimental por T. cruzi. O mesmo perfil de
resposta dos animais foi observado neste estudo, onde foi possível detectar um aumento na
susceptibilidade dos animais aos parâmetros analisados durante o curso da infecção nos
animais deficientes em 5-LO.
Em modelos de infecção utilizando bloqueio genético ou farmacológico da
síntese de LTs, observa-se prejuízo da resposta de eliminação do agente (PETERS-
GOLDEN et al., 2005). Serezani e colaboradores (2006), em seu estudo sobre o papel dos
leucotrienos na infecção por Leishmania amazonensis demonstraram, através de um
mecanismo dependente da produção de NO, que estes mediadores são fundamentais para a
resistência do hospedeiro à infecção parasitária.
A participação do NO produzido pela iNOS no controle da carga parasitária foi
investigada previamente em nosso laboratório por Malvezi e colaboradores (2004).
Utilizando-se animais C57BL/6 nocautes para iNOS, observou-se aumento significativo da
carga parasitária e queda na sobrevida destes animais, confirmando os resultados obtidos
previamente em outros estudos (SAEFTEL, FLEISCHER, HOERAUF, 2001). O bloqueio
65
da iNOS com aminoguanidina observado promoveu aumento significativo da carga
parasitária e redução da sobrevida em ambas linhagens de camundongos, sendo este efeito
mais pronunciado nos animais nocautes para 5-LO, indicando que o controle da carga
parasitária mediado pelo NO (via iNOS) é parcialmente dependente de leucotrienos.
Neste estudo demonstra-se pela primeira vez a participação da cNOS sobre a
carga parasitária sanguínea e a produção plasmática de NO durante a fase aguda da
infecção experimental por T. cruzi na ausência de LTs. O bloqueio com L-NAME levou à
redução da carga parasitária sanguínea e cardíaca em relação aos animais infectados não
tratados nas duas linhagens, sugerindo que a presença da cNOS exerce um efeito
modulador positivo sobre o parasita. Estudos conduzidos por diversos pesquisadores têm
demonstrado exaustivamente o papel central do NO derivado da iNOS sobre o curso da
infecção (VESPA et al., 1994; MALVEZI et al., 2004), sem entretanto, discutir o papel da
cNOS neste processo.
Observou-se redução da sobrevida dos animais nocautes em relação aos
selvagens ao longo da infecção; além disso o efeito de todos os bloqueios farmacológicos
foi mais intenso na ausência de LTs, indicando que estes mediadores são elementos
fundamentais para a sobrevida dos animais tanto na presença como na ausência das NOS.
Durante a fase aguda da infecção chagásica, as células do tecido cardíaco são
infectadas pelo parasita, que forma ninhos de amastigotas por toda a extensão cardíaca
(CHANDRASEKAR et al., 1998). Para evidenciar a participação da 5-LO e das NOS sobre
o controle do parasitismo cardíaco, foi realizada a análise histopatológica do tecido
cardíaco para contagem do número de ninhos de amastigotas teciduais. Os resultados
mostram que na ausência de 5-LO o número de ninhos no coração em relação aos animais
66
selvagens quadruplica e que na ausência de iNOS o parasitismo apresenta-se
significativamente elevado em ambas linhagens.
Os cardiomiócitos são descritos como tipos celulares que expressam iNOS
durante a infecção por T. cruzi e que são capazes de limitar a multiplicação e crescimento
do parasita (FICHERA et al., 2004), indicando assim que o bloqueio na produção de NO
dos animais consiste na perda de um importante mecanismo tripanocida cardíaco. A
presença da cNOS no tecido cardíaco foi descrita por Chandrasekar e colaboradores (2000),
que detectaram sua expressão a partir da 36
a
hora em ratos infectados por T. cruzi. Nossos
dados indicam que existe participação da cNOS durante toda a fase aguda da infecção nos
animais nocautes, onde ocorreu queda do parasitismo cardíaco em níveis inferiores aos dos
animais infectados sem tratamento, sugerindo a ativação deste mecanismo na ausência da
5-LO.
Os dados obtidos neste trabalho sobre o parasitismo cardíaco dos animais
sugerem que existe uma participação da iNOS no controle do parasitismo cardíaco
independentemente de leucotrienos (embora na ausência destes mediadores isoladamente
tenha-se observado aumento do parasitismo) e que na ausência da 5-LO a cNOS favorece a
multiplicação intracelular do parasita.
Diversos estudos demonstram que a produção de NO em diferentes células é
mediada por leucotrienos, podendo ser concentração-dependente (SEREZANI et al.; 2006;
TALVANI et al.; 2002; LARFARS et al.; 1999; GOLDMAN et al.; 1993). Neste trabalho
demonstramos que a produção basal de NO nos animais deficientes em 5-LO é semelhante
aos níveis observados nos animais selvagens. Durante a infecção, houve grande produção
de NO pelos animais nocautes, em quantidade significativamente superior aos níveis dos
67
animais selvagens, indicando que a presença de leucotrienos neste modelo de infecção não
é essencial para que haja produção de NO.
Os efeitos fisiológicos do NO são determinados pela atividade da cNOS, já que
o NO é produzido por um curto período de tempo e em baixas concentrações. Em
contrapartida, a iNOS é responsável pelos efeitos patológicos do NO, já que neste caso
ocorre a produção sustentada deste mediador em altas concentrações (CECCHINI et al.;
2008).
Nós observamos que a iNOS parece ser uma importante fonte de produção de
NO durante a infecção, já que seu bloqueio provocou queda nos níveis de NO plasmático
em ambas linhagens. O bloqueio da cNOS levou à redução da produção de NO apenas na
ausência de 5-LO, indicando que a cNOS é uma importante fonte de NO na ausência de
leucotrienos. Em ambos os casos, pode-se afirmar que a produção de NO em altos níveis
promove seu efeito tripanocida e, ao mesmo tempo, respondeu por alterações deletérias no
animal, observadas pela má evolução do estado geral dos animais infectados (dados não
mostrados).
Nosso trabalho demonstrou pela primeira vez que o perfil de citocinas é
influenciado pela 5-LO, tanto nas condições basais como durante a infecção por T. cruzi.
Adicionalmente, demonstramos que as NOS promovem alterações importantes nos níveis
de citocinas produzidas no curso da fase aguda da infecção. É descrita a existência de um
mecanismo altamente complexo que atua sobre a inter regulação entre a produção de
citocinas, atividade das NOS e produção de NO, envolvendo diferentes vias sinalizadoras
que regulam de positiva ou negativamente este processo (BOGDAN, 2001).
68
Pinge-Filho e colaboradores (1999) demonstraram que durante a fase aguda da
infecção por T. cruzi ocorre supressão das respostas linfoproliferativas, que pode ser
explicada por uma diminuição na produção de IL-2 e produção de prostaglandinas.
Interessantemente, nossos dados mostram que a infecção, de fato, promoveu
queda nos níveis de IL-2, como demonstrado anteriormente, mas essa diminuição ocorreu
de maneira independentemente da presença ou da ausência de LTs, sugerindo que
metabólitos decorrentes da ativação da 5-LO, ao contrário dos metabólitos oriundos da
ativação da via da cicloxigenase, parecem não atuar de maneira importante na modulação
negativa da IL-2 durante a imunossupressão que ocorre na fase aguda da infecção com T.
cruzi.
Animais controle nocautes apresentaram menores níveis basais de IL-6 em
relação aos animais selvagens controle, o que pode estar relacionado à sua deficiência na
produção de leucotrienos e, conseqüentemente, baixa capacidade em gerar uma resposta
inflamatória satisfatória pelos linfócitos T (PETERS-GOLDEN & HENDERSON, 2007).
Apesar da baixa produção de IL-6, estes animais apresentam níveis plasmáticos elevados de
IL-13, IL-17a, IL-23 e TGF-β em relação aos animais selvagens, podendo este aumento
estar associado a uma resposta compensatória fisiológica à ausência de leucotrienos.
A infecção por T. cruzi desencadeia a produção de uma série de mediadores,
como as citocinas e o NO, que atuam sobre as células estimulando os mecanismos
imunológicos efetores (CUMMINGS & TARLETON, 2004). Nossos dados demonstram
que as duas linhagens de camundongos analisadas são capazes de responder à presença do
parasita através da produção de citocinas, embora sejam observados perfis distintos.
69
Observou-se aumento na produção das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IFN-γ durante a
fase aguda da infecção por T. cruzi, tanto nos animais selvagens como nos nocautes.
Os altos níveis de IL-6 observados podem estar associados ao papel desta
citocina sobre a resposta inflamatória aguda à infecção, através da ativação e diferenciação
de linfócitos T, estímulo da produção hepática de proteínas de fase aguda e produção de
anticorpos pelos linfócitos B (FEGHALI & WRIGHT, 1997). Embora a deficiência de 5-
LO seja um provável fator limitante para a geração da resposta inflamatória nos animais
nocautes, foi observada a produção de citocinas pró-inflamatórias (e de NO) durante a
infecção, indicando que estes mecanismos sejam independentes.
O bloqueio da iNOS levou ao aumento nos níveis plasmáticos de IL-2, IL-4, IL-
10, IL-13, IFN-γ, TNF-α e TGF-β e redução nos níveis de IL-6, na linhagem selvagem em
comparação aos infectados não tratados, enquanto os nocautes apresentaram apenas queda
na produção de IL-6. O perfil de citocinas observado nos animais selvagens durante o
bloqueio da iNOS sugere uma mudança do padrão de resposta celular, com produção
significativa de citocinas do padrão Th2. IFN-γ e TNF-α são mediadores essenciais para
que haja produção de NO e combate ao parasita (CUMMINGS & TARLETON, 2004),
portanto, seus níveis elevados podem estar refletindo uma produção aumentada destas
citocinas para estimular os macrófagos de forma a elevar os baixos níveis de NO
observados durante o bloqueio da iNOS.
A inibição da cNOS durante a infecção promoveu aumento na produção de IL-
10 nos animais selvagens e aumento nos níveis de IFN-γ nos nocautes. Observa-se a
mudança do perfil de citocinas nestes animais, sendo que na ausência de cNOS a linhagem
selvagem sofre alteração do padrão de citocinas Th1 para Th2. Esta mudança no padrão de
70
citocinas não alterou os padrões avaliados durante o curso da infecção nos animais
selvagens (parasitismo cardíaco, sobrevida, parasitemia, produção de NO), indicando que a
cNOS não participa dos mecanismos regulatórios de defesa destes animais em resposta ao
T. cruzi.
A participação da cNOS no curso da infecção aguda pelo T. cruzi mostrou-se
bastante pronunciada nos animais nocautes para 5-LO. O bloqueio da cNOS induziu
aumento dos níveis plasmáticos de IFN-γ, indicando que na sua presença há inibição dos
mecanismos microbicidas contra o parasita. O IFN-γ é descrito como principal indutor da
produção de NO (MARTIN, NATHAN, XIE, 1994); entretanto, este aumento de IFN-γ não
foi suficiente para manter ou elevar os níveis de NO produzidos pela iNOS em reposta à
infecção durante o bloqueio da cNOS.
O bloqueio da produção de NO pela cNOS e iNOS simultaneamente provocou
aumento dos níveis de IFN-γ, TNF-α e TGF-β nas duas linhagens, demonstrando que estas
enzimas participam dos processos que regulam os padrões de citocinas produzidos em
resposta ao T. cruzi. Nos nocautes, o bloqueio das NOS promoveu queda dos níveis de IL-6
e aumento nos níveis de IL-10, IL-12, IL-13, IL-17a e IL-23, direcionando a resposta
imunológica para a produção de citocinas do padrão Th2 na ausência de leucotrienos.
Em resumo, observa-se que as isoformas da NOS estudadas apresentam efeitos
antagônicos em resposta à infecção aguda por T. cruzi. A cNOS parece atuar por meio de
mecanismos que favorecem a sobrevivência do parasita, enquanto a iNOS modula a
infecção potencializando os mecanismos tripanocidas do hospedeiro. Estudos adicionais
são necessários para elucidar os mecanismos moleculares que regulam este sistema e
permitir melhor entendimento do seu papel no curso da infecção chagásica.
71
6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos permitem concluir que:
A 5-LO participa do controle da carga parasitária durante a infecção por
T. cruzi;
Observa-se efeitos antagônicos do bloqueio da iNOS e cNOs sobre a
carga parasitária, parasitismo cardíaco e sobrevida de camundongos 5-
LO
-/-
;
Os resultados observados nos animais nocautes tratados com L-NAME
sugerem que a cNOS apresenta um efeito modulador positivo sobre o
parasita ao longo da infecção;
A produção de NO durante a infecção aguda por T. cruzi é dependente
de iNOS e cNOS, ocorrendo na ausência de leucotrienos;
A produção basal de citocinas plasmáticas é influenciada pela 5-LO;
A infecção com T. cruzi provoca aumento dos níveis de IL-6 e INF-γ e
queda nos níveis de IL-2 plasmáticos, sendo que o perfil de citocinas
produzidas durante a infecção é modulado pelas NOS.
Observa-se a mudança do perfil de citocinas nos animais nocautes,
sendo que na ausência de cNOS, a linhagem selvagem altera o padrão
de citocinas deTh1 para Th2.
72
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