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PAULA RACHEL RABELO CORRÊA - BASILIO
Caracterização de isolados de Sphaeropsis sapinea e avaliação da
resistência em progênies de Pinus radiata
CURITIBA
2008
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PAULA RACHEL RABELO CORRÊA - BASILIO
Caracterização de isolados de Sphaeropsis sapinea e avaliação da
resistência em progênies de Pinus radiata
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre no
curso de pós-graduação em Engenharia
Florestal no setor de Ciências Agrárias, no
Centro de Ciências Florestais e da
Madeira, Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Celso Garcia Auer
Co-orientadores: Dr. Álvaro Figueredo dos Santos
Prof. Dr. Antonio Rioyei Higa
CURITIBA
2008
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2
3
DEDICATÓRIA
À minha família pelo exemplo,
pela força e orientação nos
momentos difíceis.
OFEREÇO
Aos meus amados filhos ,
Flávio Augusto,
Ana Carolina e Ana Paula pelo
apoio, incentivo e compreensão
em todos o momentos
DEDICO
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS por ter permitido está graça na minha vida e por ter
providenciado para o meu convívio pessoas tão maravilhosas que tanto
contribuíram para a realização deste trabalho, em especial:
Ao professor Dr Celso Garcia Auer pela orientação, incentivo e
amizade.
Ao professor Antonio Rioyei Higa, pelo apoio, pela confiança e pela
amizade porque sem ele eu nem teria começado esta jornada.
Ao Dr Álvaro Figueredo dos Santos, pelas orientações e apoio no
Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Florestas.
Á empresa Norske Skog Pisa Ltda, pelo apoio e confiança
demonstrado pelo meu trabalho. Agradecimento especial ao Henrique Just
Graeml e ao Admir Lopes Mora.
Ao Dr. Edilson Batista de Oliveira por seu auxílio, paciência e
principalmente, por usa amizade.
Ao Dr Marcos Deon Vilela de Resende e ao Diego Tyszka Martinez
pelo apoio, sugestões e auxílio no desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus queridos amigos Dra Juliana Vitória Bittencourt e Luciano
Medina de Macedo pelo apoio providencial sempre na hora certa.
Aos amigos e estagiários do LAMEF, pela compreensão e apoio nos
momentos mais difíceis, especialmente aos estagiários deste trabalho Bruno
Schultz e Douglas Zeni.
5
À minha amiga Carmem Daluz Ceccon pela sua compreensão, pelo
seu apoio e sua amizade durante toda a execução deste trabalho.
Aos professores do Curso de Pós-graduação em Engenharia Florestal
que contribuíram para a minha formação.
Aos funcionários do Curso de Pós-graduação em Engenharia Florestal
pelas orientações e auxílios prestados sempre que necessário.
Aos amigos e estagiários do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa
Florestas pelo apoio e auxílio nas tarefas diárias, em especial à Francine
Bontorin Silva e Suelen dos Santos Rego.
À Embrapa Florestas pelo apoio neste trabalho.
Á CAPES pelo apoio financeiro.
6
BIOGRAFIA
Paula Rachel Rabelo Corrêa – Basilio nasceu na cidade de Três Pontas
no estado de Minas Gerais em 15 de agosto de 1961. Iniciou seus estudos na
cidade natal onde ficou até os seus 16 anos, cursando o ensino fundamental e
o primeiro ano do segundo grau, na Escola “Coração de Jesus”. Finalizou o
segundo grau profissionalizante no Colégio Pitágoras, em Belo Horizonte,
como Técnica em Enfermagem, em 1979.
Em 1980 ingressou na Universidade Federal de Minas Gerais no curso
de Ciências Biológicas. Durante este período foi estagiária no Laboratório de
Microbiologia do solo sob orientação da Profa. Dra. Maria Celli Dantas Tavares.
Em 1985 recebeu o título de bacharel em Ciências Biológicas, com ênfase em
Microbiologia, defendendo a monografia “Isolamento de microrganismos
solubilizadores de fosfato”, sob orientação da Profa. Maria Celli. Em 1986
recebeu bolsa de aperfeiçoamento do CNPq para trabalhar no projeto
“Microrganismos solubilizadores de fosfato e solubilização quantitativa de
fosfatos naturais”, sob orientação da mesma professora.
Em 1988 ingressou no laboratório Gene, onde ficou sob orientação do
Prof. Dr. Sérgio Danilo Penna até 1991. Após este período, até o ano de 2001
foi professora do Ensino Médio, no sistema Objetivo e Positivo em Minas
Gerais e Santa Catarina, obtendo diversas premiações.
Em 2003, iniciou seu trabalho como pesquisadora voluntária no
Laboratório de Melhoramento Florestal (LAMEF/ UFPR), sob orientação do
Prof. Dr. Antonio Rioyei Higa. Em maio de 2006 ingressou no programa de pós
graduação em Engenharia Florestal, área de concentração Silvicultura, onde,
sob orientação do Prof. Dr. Celso Garcia Auer, obteve em 2007 o título de
Mestre em Engenharia Florestal.
7
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 17
2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 20
2.1 Pinus radiata...................................................................................... 20
2.1.1 Classificação botânica.................................................................... 20
2.1.2 Distribuição geográfica de Pinus radiata........................................ 21
2.1.3 limitações ecológicas da espécie................................................... 25
2.2 Sphaeropsis sapinea......................................................................... 26
2.2.1 A doença provocada pelo Sphaeropsis sapinea............................ 27
2.2.2 Métodos de controle de Sphaeropsis sapinea............................... 28
2.3 ESTUDOS DE CARACTERIZAÇÃO................................................. 30
2.3.1 Características morfológicas 30
2.3.2 Compatibilidade vegetativa............................................................ 32
2.3.3 Caracterização molecular de fungos fitopatogênicos..................... 32
2.3.4 Teste de agressividade em frutos de maçã var. Granny Smith...... 33
2.4 ESTUDOS DE AGRESSIVIDADE DE Sphaeropsis sapinea E
SELEÇÃO PRECOCE DE MATERIAL RESISTENTE...................
34
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 36
3.1 OBTENÇÃO DE ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea.................... 36
3.2.CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS DE
Sphaeropsis sapinea.........................................................................
40
3.2.1 Teste de compatibilidade vegetativa (CV)...................................... 40
3.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO Sphaeropsis sapinea......... 42
3.3.1 Metodologia de extração de DNA total de microrganismos........... 42
3.3.2 Técnica de RAPD em Sphaeropsis sapinea.................................. 44
3.3.3 Análise do polimorfismo................................................................. 44
3.4 AVALIAÇÃO DA AGRESSIVIDADE DE ISOLADOS DE
Sphaeropsis sapinea EM FRUTOS DE MAÇÃ..............................
45
3.5 AVALIAÇÃO DO TIPO DE INOCULAÇÃO, DA AGRESSIVIDADE
DE ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea E REGIME HÍDRICO NO
DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA EM MUDAS DE Pinus taeda
46
3.5.1 Tipo de inoculação......................................................................... 46
8
3.5.2 Regime hídrico da estufa................................................................ 46
3.5.3 Inoculação das mudas de Pinus taeda........................................... 47
3.5.4 Recuperação de Sphaeropsis sapinea de mudas de Pinus taeda 48
3.6 AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA E HERDABILIDADE DE
PROGÊNIES DE Pinus radiata À Sphaeropsis sapinea...................
48
3.6.1 Inoculação dos isolados Sphaeropsis sapinea em mudas de P.
radiata ............................................................................................
49
3.6.2 Recuperação de Sphaeropsis sapinea de mudas de Pinus
radiata.............................................................................................
49
3.6.3 Avaliação da herdabilidade para resistência das progênies de
Pinus radiata...................................................................................
50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................... 51
4.1 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS................. 51
4.1.1 Crescimento em meio de cultura.................................................... 51
4.1.2 Esporulação em meio de cultura.................................................... 51
4.2 TESTE DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA................................ 56
4.3
.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Sphaeropsis sapinea.......... 59
4.3.1 Resultado da técnica RAPD em Sphaeropsis sapinea.................. 59
4.3.2 Análise do polimorfismo................................................................. 62
4.4 AVALIAÇÃO DA AGRESSIVIDADE DE ISOLADOS DE
Sphaeropsis sapinea EM FRUTOS DE MAÇÃ..............................
66
4.5 AVALIAÇÃO DO TIPO DE INOCULAÇÃO, DA AGRESSIVIDADE
DE ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea E REGIME HÍDRICO NO
DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA EM MUDAS DE Pinus
taeda...............................................................................................
69
4.5.1 Recuperação de Sphaeropsis sapinea de lesões em mudas........ 71
4.6 AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA E HERDABILIDADE DE
PROGÊNIES DE Pinus radiata À Sphaeropsis sapinea...................
73
4.6.1 Avaliação da agressividade dos isolados e resistência das
progênies de Pinus radiata .........................................................
73
4.6.2 Avaliação da herdabilidade da resistência de progênies de Pinus
radiata contra Sphaeropsis sapinea..............................................
82
5 CONCLUSÕES................................................................................... 85
9
6 RECOMENDAÇÕES FINAIS.............................................................. 86
REFERÊNCIAS....................................................................................... 88
ANEXOS................................................................................................. 96
10
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 INFORMAÇÕES SOBRE OS ISOLADOS DE
Sphaeropsis sapinea E SUA ORIGEM.............................
38
TABELA 2 COMPARAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS
MORFOLÓGICAS DOS ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea..............................................................................
52
TABELA 3 AVALIAÇÃO DA COMPATIBILIDADE VEGETATIVA
ENTRE OS ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea.............
57
TABELA 4
LESÕES (CM) EM FRUTOS DE MAÇÃ VAR, GRANNY
SMITH INOCULADAS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea OBTIDOS DE Pinus spp......................................
67
TABELA 5
LESÕES (CM) EM MUDAS DE Pinus taeda
INOCULADAS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea OBTIDOS DE Pinus spp......................................
70
TABELA 6 AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS PARA REISOLAMENTO
DE Sphaeropsis sapinea APÓS INOCULAÇÃO EM
MUDAS DE Pinus taeda...................................................
72
TABELA 7 LESÕES (CM) PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO
DOS ISOLADOS SS1.3, SS2.4, SS4.10 DE Sphaeropsis
sapinea EM MUDAS DE PROGÊNIES DE Pinus
radiata...............................................................................
75
TABELA 8
SECAMENTO DE PONTEIROS PRODUZIDO PELA
INOCULAÇÃO DOS ISOLADOS SS1.3, SS2.4, SS4.10
DE Sphaeropsis sapinea EM MUDAS DE PROGÊNIES
DE Pinus radiata...............................................................
77
TABELA 9 CLASSES DE TAMANHO DAS LESÕES (CM)
PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO DOS ISOLADOS
MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea EM MUDAS
DE PROGÊNIES DE Pinus radiata....................................
79
11
TABELA 10 CLASSES DE GRAU DE SECAMENTO DE
PONTEIROS PELA INOCULAÇÃO DOS ISOLADOS
MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea NAS
MUDAS DE PROGÊNIES DE Pinus radiata......................
80
TABELA 11 MORTALIDADE (%) DAS MUDAS DE PROGÊNIES DE
Pinus radiata INOCULADAS COM OS ISOLADOS
MONOSPÓRICOS SS1.3, SS2.4, SS4.10 DE
Sphaeropsis sapinea.........................................................
81
TABELA 12 HERDABILIDADE PARA TAMANHO DE LESÕES
PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO DE ISOLADOS
MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata..........................................
84
TABELA 13 HERDABILIDADE PARA SECAMENTO DE
PONTEIROS PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO DE
ISOLADOS MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea
EM PROGÊNIES DE Pinus radiata...................................
84
12
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL DOS PLANTIOS DE P. radiata... 24
FIGURA 2 LOCAIS DE COLETA DE Sphaeropsis sapinea NA REGIÃO
SUL DO BRASIL.....................................................................
39
FIGURA 3 ESQUEMA DE PAREAMENTO DE DISCOS DE MICÉLIO-
ÁGAR CONTENDO DIFERENTES ISOLADOS DE
Sphaeropsis sapinea EM MEIO ÁGAR-ÁGAR PARA
AVALIAÇÃO DA COMPATIBILIDADE VEGETATIVA............
41
FIGURA 4 PICNÍDIO (SETA BRANCA) DE Sphaeropsis sapinea
FORMADO EM MEIO ACÍCULA-ÁGAR.................................
54
FIGURA 5 CONÍDIOS DE Sphaeropsis sapinea SOBRE MEIO ÁGAR-
ÁGAR......................................................................................
54
FIGURA 6 REAÇÃO DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA (CV –
SETA BRANCA) E INCOMPATIBILIDADE VEGETATIVA
(ICV – SETA AMARELA) ENTRE ISOLADOS
MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea EM MEIO AA...
58
FIGURA 7 PLACAS COM OS ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
MOSTRANDO MÉDIA COMPATIBILIDADE VEGETATIVA
(MCV - SETA AMARELA) E COMPATIBILIDADE
VEGETATIVA (CV – SETA VERDE) EM MEIO BDA..............
58
FIGURA 8 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DE RAPD EM Sphaeropsis
sapinea APRESENTANDO MONOMORFISMO ENTRE OS
ISOLADOS.............................................................................
60
FIGURA 9 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DE RAPD DE Sphaeropsis
sapinea APRESENTANDO POLIMORFISMO ENTRE
ISOLADOS.............................................................................
61
FIGURA 10 DENDROGRAMA DA DIVERGÊNCIA GENÉTICA A
PARTIR DO ÍNDICE DE SIMILARIDADE DE JACCARD.......
63
FIGURA 11 LESÕES EM FRUTOS DE MAÇÃ VAR. GRANNY SMITH
INOCULADAS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea...
68
13
ANEXOS
ANEXO 1 DADOS ORIGINAIS DAS LESÕES CAUSADAS POR
Sphaeropsis sapinea EM FRUTOS DE MAÇÃ VAR.
GRANNY SMITH.....................................................................
96
ANEXO 2 SECAMENTO DO PONTEIRO DE MUDAS DE Pinus taeda
CAUSADO POR ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea...................................................................................
97
ANEXO 3 ANÁLISE DE LESÕES (CM) EM PONTEIROS DE Pinus
taeda INOCULADOS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea OBTIDOS DE Pinus spp, EM TRÊS AMBIENTES
DIFERENTES.........................................................................
98
ANEXO 4 ANALISE DE VARIÂNCIA DO ENSAIO DE
AGRESSIVIDADE EM MUDAS DE Pinus taeda....................
99
ANEXO 5 ANALISE DE VARIÂNCIA PARA SECAMENTO DE
PONTEIRO DO ISOLADO MONOSPÓRICO SS1.3 DE
Sphaeropsis sapinea INOCULADO EM PROGÊNIES DE
Pinus radiata...........................................................................
99
ANEXO 6 ANALISE DE VARIÂNCIA PARA SECAMENTO DE
PONTEIRO DO ISOLADO MONOSPÓRICO SS2.4 DE
Sphaeropsis sapinea INOCULADO EM PROGÊNIES DE
Pinus radiata...........................................................................
99
ANEXO 7 ANALISE DE VARIÂNCIA PARA SECAMENTO DE
PONTEIRO DO ISOLADO MONOSPÓRICO SS4.10 DE
Sphaeropsis sapinea INOCULADO EM PROGÊNIES DE
Pinus radiata...........................................................................
99
ANEXO 8 ANALISE DE VARIÂNCIA PARA TAMANHO DE LESÕES
DO ISOLADO MONOSPÓRICO SS1.3 INOCULADO EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata..............................................
100
ANEXO 9 ANALISE DE VARIÂNCIA PARA TAMANHO DE LESÕES
DO ISOLADO MONOSPÓRICO SS2.4 INOCULADO EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata...............................................
100
14
ANEXO 10 ANALISE DE VARIÂNCIA PARA TAMANHO DE LESÕES
DO ISOLADO MONOSPÓRICO SS4.10 INOCULADO EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata..............................................
100
15
RESUMO
Sphaeropsis sapinea é conhecido como um importante patógeno de várias
espécies de Pinus, causando a seca de ponteiros e a morte de árvores em
plantios comerciais. Esse patógeno foi introduzido no Brasil, provavelmente,
durante as introduções do gênero Pinus. Seu primeiro relato ocorreu na década
de 1940, com os primeiros plantios de P. radiata no estado de São Paulo, os
quais foram dizimados. Um projeto de reintrodução dessa espécie florestal no
Brasil foi delineado para a seleção de famílias de P. radiata resistentes a S.
sapinea. Desse modo, este estudo objetivou a caracterização morfológica,
molecular e patogênica de isolados de S. sapinea, para escolher os isolados
mais agressivos para uso na seleção de material resistente. Quatro isolados da
região Sul do Brasil foram obtidos e a caracterização morfológica e patogênica
indicou que os isolados estudados pertencem ao morfotipo “A” de S. sapinea.
Houve diferenças na agressividade e na diversidade genética dos isolados em
todos os testes in vitro e in vivo. A maior herdabilidade de P. radiata para
tamanho das lesões foi obtida com o isolado SS1.3 (H
2
M
= 0,3357870),
enquanto que para secamento dos ponteiros a maior herdabilidade foi obtida
com o isolado SS2.4 (H
2
M
= 0,256347). Os resultados mostraram a
possibilidade de seleção precoce de material resistente à seca de ponteiros em
mudas de P. radiata.
Palavras-chave: agressividade, morfotipo, Pinus, resistência genética, seca de
ponteiros.
Título: Caracterização de isolados de Sphaeropsis sapinea e avaliação da
resistência em progênies de Pinus radiata.
16
ABSTRACT
Sphaeropsis sapinea is known as an important pathogen of some species of
Pinus, causing the tip blight and the death of trees in commercial plantings. This
pathogen was introduced in Brazil during introduction of genus Pinus hosts. The
first report of pathogen was done in 1940 decade, during introduction of P.
Radiata in São Paulo State, but these plantations were destroyed by S sapinea.
A project for the reintroduction of this forest species in Brazil was “delineado” for
the selection of families of P. radiata resistant against S. sapinea. For this
reason, the objective of this research was a morphological, molecular and
pathogenic characterization of S. sapinea isolates to select the more aggressive
for use in the selection of resistant material. Four isolates were obtained and
the morphological and pathogenic characterization indicated that the isolates
belong to the morphotipe “A” of S sapinea. There were differences in
aggressiveness and genetic diversity of isolates in all in vitro and in vivo tests.
The highest herdability of P. radiata for size of lesions was observed with isolate
SS1.3 (H
2
M
= 0,3357870), while the highest herdability of P. radiata for shoot
blight was observed with isolate SS2.4 (H
2
M
= 0,256347). The results had
shown to the possibility of “precocious” selection of resistant material to P.
radiata shoot blight.
Keywords: aggressiveness, genetic resistance, morphotype, Pinus, shoot
blight.
TItle: Characterization of Sphaeropsis sapinea isolates and evaluation of
the resistance of Pinus radiata progenies.
17
1 INTRODUÇÃO
O gênero Pinus é plantado em escala comercial, no Brasil, há mais de
30 anos, sendo que os mais extensos foram estabelecidos na região Sul e
Sudeste do Brasil, para atender uma demanda de matéria prima de qualidade
nas indústrias de celulose, papel, madeira serrada, resina, indústria de MDF, e
até mesmo no aproveitado como biomassa para geração de vapor e energia.
Este gênero apresenta uma boa adaptação para as condições edafo-climáticas
brasileiras, dependendo o seu sucesso da escolha correta da espécie, da área
escolhida para o seu estabelecimento e do manejo correto dos plantios
(SHIMIZU; MEDRADO, 2005).
Novas introduções de diversas espécies do gênero Pinus estão
ocorrendo, inclusive nas regiões tropicais, e o plantio está se expandindo para
todo o Brasil. O estabelecimento de florestas plantadas com pinus, quando
bem manejadas, fornecem madeira anteriormente originada da que até muito
da floresta nativa, como por exemplo, a mata com araucária (SHIMIZU;
MEDRADO, 2005).
O principal patógeno da seca de ponteiros é o fungo Sphaeropsis
sapinea (Fr.:Fr.) Dyko & Sutton (= Diplodia pinea (Desmaz.) J. Kickx f.), cuja
característica é atacar os plantios depois de uma condição de estresse
ambiental nas plantas hospedeiras, provocando a morte de mudas
recentemente plantadas ou de árvores em plantios já estabelecidos
(STANOSZ; CUMMINGS CARLSON, 1996). Este fungo é responsável também
por outras doenças em pinus como a queima das acículas, o tombamento, o
cancro, a murcha da copa e azulamento interno da madeira (STANOSZ;
CUMMINGS CARLSON, 1996; BLODGETT; STANOSZ, 1999; FLOWERS et.al,
2001). Estes sintomas podem não ser diferenciados de outros provocados por
outros patógenos e insetos, por isso, o diagnóstico requer o reconhecimento de
corpos de frutificação e conídios do S. sapinea nas hastes ou nas raízes
afetadas ou o isolamento do fungo em meio de cultura, no laboratório
(STANOSZ; CUMMINGS CARLSON, 1996).
Um importante passo que pode fornecer medidas mais eficientes para
o controle do S. sapinea é a seleção de indivíduos resistentes ao patógeno.
Mas, antes de se realizar esta seleção é importante o conhecimento dos
18
diferentes graus de agressividade do patógeno, pois variedades de plantas
suscetíveis inoculadas com isolados de baixa agressividade, poderão mostrar-
se falsamente resistentes (RODRIGUES CASSIOLATO, 1994).
No Brasil, o primeiro relato da ação do S. sapinea ocorreu na década
de 1940, durante a introdução de P. radiata no estado de São Paulo, mas estes
plantios foram totalmente dizimados pelo S. sapinea. No entanto, não foram
realizados estudos com o fungo S. sapinea para relação patógeno hospedeiro
e trabalhos dirigidos à seleção de materiais resistentes no Brasil.
Pinus radiata é uma das coníferas mais plantadas no mundo devido ao
seu rápido crescimento, as qualidades excepcionais de sua polpa na fabricação
de papel e às facilidades de serrar e entalhar sua madeira. Todas estas
qualidades fizeram com que esta espécie fosse introduzida com sucesso na
Austrália, Nova Zelândia e Espanha, sendo, também, a exótica mais plantada,
na Argentina, Chile, Uruguai, Kênia e África do Sul, totalizando seus plantios,
ao redor do mundo, quatro milhões de hectares (ROGERS, 2002).
Outros fatores que tornam esta espécie muito especial são a sua alta
produtividade (>20 m
3
.ha
-1
.ano
-1
), sua grande facilidade em adaptar-se a
diversos sítios e condições climáticas (TURNER; LAMBERT, 1986) e sua
capacidade em produzir mais madeira por hectare num espaço de tempo
menor, sendo por isso uma das espécies que fornece os maiores retornos
financeiros nas áreas plantadas (KREBS, 1976).
Em todos os aspectos, técnicos e comerciais, o Brasil apresenta
amplas condições para o plantio florestal, como áreas disponíveis com forte
apelo pelo ambiental e para o uso silvicultural, uma legislação atualizada que
favorece a formação e a colheita de florestas plantadas (HIGA; SILVA, 2006) e
variadas características edafoclimáticas capazes de suprir as necessidades da
maioria das espécies florestais. Acompanhando este favorável histórico
florestal brasileiro existe a boa adaptação desta espécie no Hemisfério Sul
justificando o interesse do Brasil pelo plantio do P. radiata.
Considerando a possibilidade de reintrodução de P. radiata no Brasil e
a ocorrência da seca de ponteiros, este trabalho teve como objetivos: (1) a
caracterização morfológica e molecular de isolados de S. sapinea da região Sul
do Brasil, (2) a agressividade em mudas de pínus, (3) a reação de progênies
19
importadas de P. radiata frente aos isolados de S. sapinea e (4) a seleção
precoce de material resistente.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Pinus radiata
2.1.1 Classificação botânica
A primeira notificação sobre a espécie P. radiata foi realizada por
Thomas Coulter em Monterey, na Califórnia, em 1830. O nome científico refere-
se às fortes marcas nas escamas de seus cones. O nome popular Pinho de
Monterey é relativo à península de onde ele é originário (POYTON, 1979;
MCDONALD; LAACKE, 2007). Esta espécie também é conhecida como pinho
insignis, pinho insular e pinheiro radiata (LAVERRY, 1986; EARLE, 2007;
MCDONALD; LAACKE, 2007; MILLER, 2008). A espécie P. radiata pertence ao
gênero Pinus cujos indícios geológicos sugerem ter surgido na terra a cerca de
100 milhões de anos atrás (SHAW, 1914, MILLAR, 2000).
A maioria das classificações para o gênero Pinus reconhece duas
maiores linhagens, o subgênero Strobus, reconhecido popularmente como “soft
pine”, e o subgênero Pinus, reconhecido popularmente como “hard pine”. Esta
classificação é baseada na filotaxia das suas acículas (SHAW, 1914; PRICE et
al.,1998; POYTON, 1979). Esta divisão é consistente com dados coletados da
anatomia da madeira e químicos secundários, e foram corroborados por
recentes estudos de filogenia usando ferramentas moleculares (PRICE et al.,
1998). A espécie P. radiata faz parte de um pequeno subgrupo dos pinus
conhecidos como “pínus costeiros de cone fechado” ou “pinus marítimos” e
está relacionada com o Pinus muricata e o Pinus atenuatta (PRICE et al.,
1998).
P. radiata é classificado como um pínus de cone fechado, relativamente
pequeno, em relação aos cones de outras coníferas. Essa espécie é de
crescimento rápido e precoce, comportando-se como pioneira e preferindo
expandir-se em ambientes queimados ou totalmente limpos. A maior
característica do P. radiata é o fato de manterem seus cones nas árvores
durante vários anos, abrindo e fechando as suas escamas, dependendo das
condições ambientais, permitindo assim, que suas sementes permaneçam
viáveis ao longo dos anos (FORDE,1964). As árvores com seus troncos
21
cônicos podem ficar arredondados, e até mesmo retos, alcançando em torno
de 15 a 30 m de altura e 30 a 90 cm de diâmetro. Sua casca, profundamente
sulcada, é cinza ou marrom escuro, podendo assumir uma coloração
avermelhada, ou azulada quando colonizada por fungos (CHOU, 1987; CHOU;
MACKENZIE, 1988). As folhas possuem um formato de agulhas bem delgadas
e são de um verde profundo e se organizam, densamente, nos galhos, de
forma solitária ou em grupos de três, cinco ou mais folhas. Nas árvores adultas,
estas folhas podem ter de 75 a 150 mm de comprimento, por 60 a 80 mm de
largura. As sementes, acima de 200 por cone, são elípticas, com seis mm de
comprimento, possuindo um anel marrom claro bem visível, de 25 mm de
comprimento ao redor delas (DALLIMORE; JACKSON,1966).
De acordo com Eldridge, 1978; Lavery, 1986 e Rogers, 2002 são
reconhecidos três variedades da espécie: variedade radiata, variedade binata e
variedade cedrosensis, representadas por cinco pequenas e separadas
populações de suas folhas e pelo formato piramidal de suas árvores (MARSH,
1978).
2.1.2 Distribuição geográfica de Pinus radiata
A distribuição natural de P. radiata é muito restrita. Esta espécie é
encontrada apenas em três pontos da costa da Califórnia ao sul de São
Francisco, e nas ilhas de Guadalupe e Cedros, no México (ELDRIDGE, 1978;
LAVERY, 1986; ROGERS, 2002).
A variedade radiata é formada pelas três populações presentes na costa
da Califórnia: a população Ano Novo, encontrada na latitude 37° 00´ N, a
população Monterey, encontrada na latitude 36° 50´ N e a população conhecida
por Cambria, encontrada na latitude 35° 50´ N (Califórnia, USA). A variedade
binata é encontrada naturalmente somente na Ilha de Guadalupe na latitude
29° 00´ N e a sua população recebe o mesmo nome da ilha (México). A
variedade cedrosensis é encontrada apenas na Ilha de Cedros, na latitude 28°
30´ N e a sua população recebe o mesmo nome da ilha continental (México),
(ELDRIDGE, 1978; LAVERY, 1986; ROGERS, 2002).
A maior floresta natural do P. radiata encontra-se na península de
Monterey, em Del Monte, cobrindo uma área de 5.500 a 6.000 ha. O clima
22
onde se encontram as populações nativas do P. radiata é basicamente
mediterrâneo, com chuvas moderadas em torno de 400 a 800 mm anuais bem
distribuídas, durante o inverno (75 %), que ocorrem de dezembro a março,
podendo ocorrer geadas fortes, mas restrita a três meses do inverno. No verão
as temperaturas são moderadas e as secas do verão são suavizadas pela
presença intensa dos nevoeiros vindos do mar (SCOTT,1960; OFFORD, 1964).
Revisão feita por Poyton (1979) indica que a espécie entrou na África do
Sul, antes de 1850, e depois foi trazida para a América do Sul e Oceania onde
se expandiu. A causa do sucesso desta espécie no Hemisfério Sul não é muito
bem explicada. Na Austrália, Ovington (1971), sugeriu que este sucesso
advinha de três fatores principais: (1) a falta de pragas e patógenos, quando
plantada longe do seu ambiente natural; (2) o desenvolvimento de modernas
técnicas silviculturais e técnicas pedológicas, e (3) a variabilidade genética e
plasticidade da espécie, como indicada pelo fato que dentro das plantações,
árvores expressam, de forma individual, diferentes graus de tolerância, para
cada fator limitante como: suscetibilidade a doenças, deficiências de nutrientes
e secas.
Lavery (1986) acredita que a redução na distribuição da espécie no seu
ambiente natural não foi acompanhada por uma redução na sua diversidade
genética. Este mesmo autor relatou que a espécie tinha, provavelmente, uma
capacidade genética latente, e sugere que isto pode ter acontecido pelas
características das primeiras plantações, onde os cruzamentos das árvores
eram livres e, logo após, iniciou-se os programas de seleção de árvores e os
programas de melhoramento. No caso de P. radiata é mais correto e relevante
estudar a sua plasticidade genética. A explicação, para esta plasticidade, pode
estar ligada ao fato de que a espécie evoluiu, largamente, na ausência de frio e
de seca, como fator limitante, no seu hábitat. Como conseqüência, a espécie
tornou-se extremamente oportunista mais que as outras coníferas, que
desenvolveram um mecanismo de gatilho, que paralisa o seu desenvolvimento,
quando o ambiente é desfavorável (LAVERY,1986).
Segue-se a descrição das localidades, onde a espécie foi introduzida
com sucesso. Estas localidades podem ser visualizadas na FIGURA 1.
Nova Zelândia: a introdução do P. radiata ocorreu no século XIV, sendo
comercializada pela primeira vez em 1876. As primeiras sementes foram da
23
variedade Monterey e da variedade Ano Novo, ambas da Califórnia (LAVERY,
1986).
Austrália: a primeira introdução da espécie foi realizada provavelmente com
material proveniente da Califórnia, para uso em parques e jardins. Atualmente,
as sementes dos plantios australianos de P. radiata são procedentes da Nova
Zelândia e de material próprio (LAVERY,1986).
Chile: a espécie foi introduzida em larga escala em 1885. O primeiro lote de
sementes veio, provavelmente, das regiões de Monterey e Ano Novo, na
Califórnia (POYNTON, 1979). Os plantios concentram-s entre as latitudes 36° e
38º S.
Espanha: a espécie é plantada na região Basca, no Norte e nordeste do país,
em 160 km ao longo da Baía de Biscay.
Portugal: a área plantada com o P. radiata ultrapassa 2.000 ha. Encontra
condições favoráveis na região litorânea ao norte do Tejo, em direção a região
de Lisboa, desde que os solos não sejam rasos e a área esteja sujeita a ventos
fortes (QUINTA DO PRAZO, 2007).
24
FIGURA 1: DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL DOS PLANTIOS DE P. radiata.
Círculos vermelhos indicam as principais áreas de plantio.
FONTE: CSIRO, 2000
25
2.1.3 Limitações ecológicas da espécie
Na Califórnia existe um balanço ecológico entre o P. radiata, o Quercus
sp (carvalho) e o bioma chaparral, com uma interação entre fogo e neblina
(RECHER, 1982). O fogo permite o P. radiata regenerar novas florestas, e se a
espécie conseguir sobreviver o ambiente fica propício para o crescimento dos
carvalhos. Para que esta interação aconteça, o P. radiata tem que conseguir
absorver bastante umidade trazida pelo mar. A circunstância propícia para esta
interação, segundo Recher (1982), está relacionada com a topografia da
região, que permite a umidade vinda do mar chegar até onde se encontra o P.
radiata, caso contrário a espécie não sobrevive.
De acordo com Flowers e Allen (2004), o P. radiata precisa de uma
média de chuva de 600 a 750 mm anuais para se desenvolver bem. Em
regiões onde o clima no verão é muito seco, e que podem ocorrer secas muito
drásticas, neste período, ou o solo da região for muito deficiente, o P. radiata
terá problemas de sobrevivência. Na região oeste da Austrália, onde este
fenômeno acontece normalmente, práticas silviculturais, como maior
espaçamento no plantio e poda alta, são adotadas para amenizar os danos que
podem provocar no plantio (MCKINNELL, 1981).
O frio excessivo é fator limitante para esta espécie porque o P. radiata
não forma botões dormentes verdadeiros e o frio forte e prolongado, abaixo de
0 ºC, por vários dias, compromete de forma definitiva o seu plantio. Se o
inverno não for excessivamente severo o P. radiata continuará crescendo,
durante todo o ano, sem entrar em dormência durante o inverno
(LAVERY,1986).
Na Austrália e Nova Zelândia as regiões que mais sofreram com
ataque de patógenos, foram aquelas com verão mais úmido. Na Nova Zelândia
duas zonas são consideradas problemáticas com relação à patógenos: as
regiões úmidas das ilhas ao Norte e as Ilhas Centrais da Nova Zelândia. Nesta
última zona citada, os plantios localizados nas latitudes 38º a 39º S com
maiores altitudes conseguiram controlar os ataques dos patógenos,
especialmente, Dothistroma pini e Cyclaneusma minus. Na Austrália o verão
muito úmido favorece o estabelecimento do fungo Dothistroma, especialmente
dentro das regiões New South Wales (NSW) entre as latitudes 34° e 36° S. Nas
26
regiões sul da Austrália o clima característico é o mediterrâneo, no qual o P.
radiata tem uma história de boa adaptação. As regiões de plantio com P.
radiata, na Austrália, são limitados pelo regime de chuvas e pela latitude. As
chuvas de verão ocorrem na região norte favorecendo os ataques do S.
sapinea e limitando a expansão do P. radiata para esta região, neste país
(LAVERY, 1986).
Depois de várias experiências em todo mundo, é razoável se concluir,
que os climas quentes e úmidos são extremamente inadequados para a
viabilidade do P. radiata, num plantio comercial. As limitações da espécie, para
implantação de plantios comerciais são: tempo de exposição à geada,
temperatura extremamente baixa, ou média anual baixa, calor excessivo no
verão favorecendo a ocorrência de doenças (OFFORD, 1964).
As características do solo também são fatores limitantes para a
espécie, uma vez que o P. radiata possui uma raiz muito profunda e necessita
de grande quantidade de água para seu crescimento (LAVERY,1986). Uma
revisão detalhada dos parâmetros que influenciam o crescimento do P. radiata
pode ser encontrada em Gandullo et al. (1974).
2.2 Sphaeropsis sapinea
O patógeno está atualmente classificado como Sphaeropsis sapinea
(Fr.: Fr.) Dyko & Sutton (= Diplodia pinea (Desm.) J. Kickx f.) (PHILLIPS, 2005,
SUTTON,1980).
O fungo S. sapinea possui forma conidiomata picnidial, imerso,
separado ou agregado, globoso, marrom escuro, unilocular, parede fina de
composição angular. Nos conídios desta espécie constata-se a presença de
um ostíolo central, circular e a presença de papilas (PHILLIPS, 2005). Quando
maturos alguns conídios do S. sapinea tornam-se septados (DE WET et al.,
2000).
Palmer et al. (1987) caracterizou dois grupos morfologicamente
diferentes de S. sapinea isolados, inicialmente, nos Estados Unidos, que foram
denominados como morfotipos “A” e “B”. Esta caracterização é baseada nas
dimensões dos conídios, na morfologia das paredes conidiais, no aspecto dos
micélios, na taxa de crescimento micelial, na virulência e nas características
27
moleculares (DE WET et al., 2000). Outros dois morfotipos foram classificados
para o S. sapinea: o morfotipo “I “e o morfotipo “C”. O morfotipo “I” foi
considerado através de análises moleculares relacionado com o fungo
Botryosphaeria obtusa. As análises com o morfotipo “C” revelaram que ele está
muito mais relacionado com o morfotipo “A“ do que com o morfotipo “B”, sendo
considerado, atualmente, como um variante do morfotipo “A” (BURGESS et al.,
2004).
2.2.1 A doença provocada por Sphaeropsis sapinea
S. sapinea pode sobreviver como endofítico ou saprofítico estando
presente em tecido vivo ou morto das acículas, caule e ramos. Como saprófita
ele pode permanecer na planta por muitos anos sem desenvolver a doença,
mas a árvore ganha um tom azulado na casca que prejudica o preço de venda
da madeira (DE WET et al., 2000). Os efeitos severos da doença estão
associados a situações de estresse na planta, como seca, temperatura
adversa, ou ainda, pela redução de sua resistência, quando esta sofre algum
tipo de injúria durante uma chuva de granizo ou podas (SMITH et al., 2000;
BLODGETT; STANOSZ, 1997; 1999). Tais fatores bióticos e abióticos
normalmente predispõem as árvores à doença e provoca a mortalidade de
árvores nos plantios comerciais (LAUGHTON, 1937; PALMER et al.,1987).
Sobre os tecidos infectados o S. sapinea forma os picnídios, únicos
corpos de frutificação conhecidos deste fungo. Estes parecem fundidos aos
tecidos dos hospedeiros (PALMER, 1983; 1987). São formados na
subepiderme, posteriormente tornando-se erumpentes. Quando os picnídios
amadurecem, eles se liberam os conídios que serão disseminados pelo vento
ou pela chuva (STANOSZ, 2002).
De acordo com Flowers et al. (2001) a infecção se estabelece com os
tubos germinativos dos conídios entrando através dos estômatos das acículas
nos brotos jovens no começo da primavera. Estes brotos jovens infectados
param de crescer, tornam-se turvos e logo morrem. Cones não infectados são
vistos ao lado de cones infectados o que sugere que a doença ocorre primeiro
em cones mais velhos e depois ocorre em cones mais novos. Depois de dois
ou três anos de infecção sucessivas, os topos das árvores ficam totalmente
28
danificados, resultando nos sintomas típicos da doença (GIESLER, 2003;
PETERSON, 1997; 2005), os quais são: necrose, seca e quebra dos ponteiros
e o declínio, sendo que este último é considerado o mais comum. Este fungo
pode ainda induzir, nas plantas atacadas, a formação de cancros, morte de
raízes e murcha da copa (AUER; GRIGOLETTI JUNIOR; SANTOS, 2001;
GIBSON, 1979; CHOU, 1987).
Também são importantes no estabelecimento da doença, as condições
ambientais propícias para a colonização do fungo. No caso de S. sapinea,
estas condições são as chuvas fortes no verão com injúrias nas plantações,
associadas a plantios estabelecidos em sítios inadequados com solos mal
drenados e pouco profundos.
Praticamente todas as espécies do gênero Pinus são atacadas pelo
fungo, mas existem diferenças entre as espécies na suscetibilidade ao ataque
(WINGFIELD, KNOX-DAVIES, 1980; SWART, WINGFIELD, 1991; CEDEÑO et
al., 2001). Na África do Sul, este fungo infecta P. patula e P. radiata e existem
relatos de infecção em raízes de P.taeda e P. elliottii, sendo que P. taeda
parece ser o mais suscetível. Também, neste caso, o fungo ocorre depois de
uma situação de estresse no plantio (TPCP, 2002). O P. radiata é considerado
uma das espécies mais suscetível ao S. sapinea. Em contrapartida, o P.
pinaster possui, segundo Garcia e Diez (2003) uma alta resistência a este
patógeno.
As árvores de P. radiata são suscetíveis ao fungo em todas as idades,
mas nos povoamentos mais antigos os danos provocados por seus ataques
são mais severos, principalmente nas árvores com 30 anos de idade
(PETERSON, 2005).
2.2.2 Métodos de controle de Sphaeropsis sapinea
O plantio de variedades resistentes é o melhor método de controle de
doenças de plantas porque proporciona vantagens como: baixo custo, fácil uso,
alta eficácia e ecologicamente desejável (MIZUBUTI; MAFFIA, 2006).
A qualidade da muda também é fator que merece atenção,
principalmente com relação ao sistema radicular. Em espécies florestais, a má
formação do sistema radicular, seja por recipiente ou por manejo inadequados
29
no viveiro, provoca enovelamento das raízes e predispõem estas mudas ao
estresse (GOMES, 2005). Quando ocorre deformidade no crescimento radicial,
as plantas ficam prejudicadas na absorção de água e nutrientes
comprometendo o seu desenvolvimento e favorecendo uma condição de
estresse e estabelecimento das doenças fúngicas. No caso da infecção
provocada pelo S. sapinea este pode ser um dos fatores principais para o
estabelecimento da doença (DE WET et al., 2000). A eliminação de focos
antigos do S. sapinea em árvores mais velhas é considerado, também, um
método de controle importante para o S. sapinea (STANOSZ; CUMMINGS
CARLSON, 1996).
Outra condição que merece atenção na relação patógeno-hospedeiro é
a infecção latente. Esta situação tem sido freqüentemente observada e é
considerada como importante, pois hospedeiro e parasita coexistem com
mínimo dano ao hospedeiro, sem apresentar sintomas, persistindo neste
quadro até que os sintomas surjam por condições favoráveis do ambiente, do
hospedeiro ou do patógeno (SINCLAIR, 1991). A infecção latente pode ser
reconhecida como um tipo de tolerância ou resistência da planta a certos
patógenos, resultado da co-evolução entre a planta e o patógeno, permitindo a
coexistência de hospedeiro e patógeno. A alta suscetibilidade individual das
plantas e a alta virulência dos patógenos podem ter sido eliminadas no início
do processo evolutivo. A informação sobre o tipo de infecção é importante no
controle de doenças de plantas e na obtenção de resistência ou tolerância a
um patógeno (GLIENKE, 1995). S. sapinea tem sido encontrado como
endofítico em cones e tecidos do tronco de árvores sadias e somente se a
planta ficar estressada é que os sintomas de doenças poderão aparecer
(STANOSZ; CUMMINGS CARLSON, 1996).
O maior problema para o P. nigra e para o P. radiata é o S. sapinea
porque o controle deste fungo por podas ou por pulverização é muito difícil e
geralmente ineficaz. A maioria das árvores afetadas morre ou tem que ser
removidas do plantio. As árvores novas, que ainda não estão produzindo cones
raramente são afetadas pela seca do ponteiro, se não existir um foco de
dispersão do inóculo no plantio, funcionando como fonte primária de dispersão
(HARTMAN et al., 2002; STANOSZ, 2002). De acordo com Stanosz (2002) a
severidade da doença provocada pelo S. sapinea difere dependendo do
30
morfotipo presente no local do plantio. O morfotipo “A” é considerado bastante
agressivo e neste caso o melhor fator de controle da doença é o plantio de
árvores resistentes, uma vez que o controle deste morfotipo tanto nos plantios
como nos viveiros através de fungicida não apresenta bons resultados.
Como forma de prevenção, Pataky (1997) recomendou observar as
exigências de sítio para cada espécie e evitar o plantio árvores novas próximo
de outras doentes ou em sítios favoráveis para o desenvolvimento da doença.
No Chile, os métodos de controle considerados mais eficazes para o
controle do S. sapinea são através de podas fitossanitárias preventivas e o
plantio de plantas resistentes (CORMA, 2003).
Apesar da grande importância, o conhecimento da forma de atuação
desses microrganismos endofíticos ainda é escasso. Plantas lenhosas e
perenes, cuja expansão dos plantios se faz cada vez mais por propagação
vegetativa, são hospedeiros estratégicos para esse grupo de microrganismos
(GLIENKE, 1995).
No Brasil, a técnica de propagação vegetativa em espécies do gênero
Pinus ainda está em fase de experimentação, mas em alguns países como
Chile e Argentina, esta técnica já faz parte da rotina das empresas. Neste caso,
uma das melhores estratégias para evitar doenças como a seca de ponteiro
provocada pelo S. sapinea seria a seleção e o plantio de clones resistentes
(STANOSZ, 2002).
2.3 ESTUDOS DE CARACTERIZAÇÃO
2.3.1 Características morfológicas
Na década de 1980, dois morfotipos (“A” e “B”) foram descritos para o
S. sapinea, baseado nas diferentes dimensões dos conídios, diferentes
dimensões e morfologia das paredes conidiais (SUTTON, 1980), na aparência
dos micélios, na taxa de crescimento em cultura, na agressividade e nos
padrões enzimáticos (PALMER et al.,1987; BLODGET; STANOSZ, 1999; DE
WET et al., 2002). O morfotipo “A” é caracterizado por apresentar um micélio
branco para cinza esverdeado, macio e com conídios de paredes lisas. O tipo
“B” tem um micélio branco para preto, prensado na superfície do ágar e com
31
paredes conidiais marcadas por depressões (WANG et al.,1986; PALMER et
al., 1987; DE WET et al., 2003).
Um terceiro morfotipo “C” foi descrito por De Wet et al. (2003)
baseando-se na morfologia dos seus esporos. Também por tecnologia
molecular, como por exemplo: Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) e
nas seqüências de rDNA. Este morfotipo apresenta micélio macio e conídios de
parede lisa como o tipo “A”, mas significativamente mais longos. De Wet et al.
(2003) descreveu este morfotipo de isolados obtidos do Norte da Indonésia. Os
trabalhos revelaram que o morfotipo “C” comportou-se como o mais agressivo
entre os três morfotipos, seguido pelo tipo “A” e depois pelo tipo “B”.
Outro morfotipo chamado de mortotipo “I” foi descrito por Hausner et al.
(1999) e depois relacionado com a espécie Botryospheria obtusa, através de
técnicas de seqüenciamento de DNA (DE WET et al., 2003).
Vários estudos realizados com isolados de S. sphaeropsis obtidos de
populações nativas e introduzidas de P. radiata, em várias partes do mundo,
mostram que o morfotipo “A” é mais amplamente distribuído e coloniza muitos
tipos de coníferas, enquanto que o tipo “B” e “C” possuem uma distribuição
mais restrita (WANG et al.,1985 e PALMER et al., 1987) sendo considerados
raros (DE WET et al., 2003). O morfotipo “C” foi isolado apenas em plantas
doentes na Indonésia, e os morfotipos “B” foram isolados no México, na
América do Norte e em 2001 na Venezuela em um trabalho de Cedeño et al.
(2001).
O morfotipo tipo “B” é considerado de baixa freqüência em plantações
exóticas de pínus no Hemisfério Sul. O morfotipo “A” se dissemina através de
sementes e o morfotipo “B” infecta o hospedeiro preferencialmente em
processo de pós–germinação (PALMER et al., 1987).
Trabalhando com dados morfológicos e patogênicos combinados com
uma genealogia gerada por dados de microsatélites, De Wet et al. (2003)
sugeriram que o morfotipo “B” fosse tratado como uma nova espécie, Diplodia
scrobiculata. Neste mesmo estudo, De Wet et al. (2003) relatam que o
morfotipo “C” deve ser considerado como um leve variante do morfotipo “A”,
porque nos resultados das análises moleculares estes morfotipos ficaram muito
próximos geneticamente um do outro. Divergências genéticas visíveis foram
encontradas sem nenhuma correlação com distribuição geográfica.
32
De Wet et al. (2000) afirmam que um grande esforço está sendo feito
nos EUA no sentido de caracterizar os morfotipos dos isolados de S. sapinea
usando as características morfológicas, moleculares e de virulência. Esta
caracterização é muito importante, porque a estratégia de ação para prevenir a
doença depende do morfotipo presente no local (BLODGETT; STANOSZ,
1999; DE WET et al., 2000; STANOSZ, 2002).
2.3.2 Compatibilidade vegetativa
Várias são as técnicas empregadas para análise de diversidade em
microrganismos, sendo mais comum as técnicas que fazem caracterização de
fenótipos. A compatibilidade vegetativa (CV) é uma característica fenotípica
muito usada no estudo de diversidade genotípica em fungos
(ANAGNOSTAKIS, 1983; LESLIE, 1993). Esta compatibilidade é medida pela
formação de micélios confluentes que são visualizados como um tufo
algodoado entre os isolados. Os isolados que apresentam crescimento
vegetativo e formam linhas com micélios confluentes, quando pareados, são
considerados vegetativamente compatíveis pela diferença ou similaridade dos
isolados. Esta característica é comandada por um loci chamado de vic loci
(LESLIE, 1993). Em S. sapinea este número ainda é desconhecido, mas em
Fusarium moniliforme sabe-se que este número é superior a 10 vic loci
(LESLIE, 1993).
2.3.3 Caracterização molecular de fungos fitopatogênicos
As técnicas baseadas em marcadores de DNA como não estão sujeitas
às influências do ambiente são extremamente eficazes para a complementação
da caracterização de isolados e de populações, uma vez que estas técnicas
detectam diretamente a variação genética. Os distintos tipos de marcadores
moleculares hoje disponíveis diferenciam-se pela tecnologia utilizada para
revelar variabilidade em nível de DNA, e assim variam quanto à habilidade de
detectar diferenças entre indivíduos, custo, facilidade de uso, consistência e
repetibilidade. Algumas destas técnicas se baseiam na amplificação aleatória
de fragmentos de DNA, através de reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
33
permitindo uma avaliação rápida da diversidade genética entre os indivíduos
isolados (GLIENKE, 1995).
A técnica de RAPD é uma técnica barata, amplamente utilizada, com
uma grande quantidade de marcadores já disponíveis e que não requer
nenhum trabalho preliminar antes de sua realização (GLIENKE, 1995). A
técnica de RAPD foi descrita por Willians et al. (1990) e permite identificar o
grau de similaridade entre genótipos no nível inter e intra-específico. O RAPD
baseia-se na repetição cíclica das seqüências complementares de DNA que
vão se anelando nos dois opostos de uma fita de DNA molde. Utiliza-se um
único primer de seqüência arbitrária, portanto sua seqüência alvo é
desconhecida. Com esta técnica é possível amplificar fragmentos não
específicos de DNA, utilizando oligonucleotídeos de 10 a 15 bases como
iniciadores da amplificação, numa PCR. Marcadores moleculares são
características de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos (GLIENKE,
1995).
Esta reação de RAPD é muito eficiente na identificação de
polimorfismo e pode ser usada para identificação e classificação de diferentes
variedades com respeito ao nível de similaridade genética. Esta técnica tem
gerado mapas genéticos detalhados em plantas (HALWARD et al.,1991) e
identificado diferentes isolados de Colletotrichum truncatum causador da
antracnose em soja (VASCONCELLOS et al.,1994). A diferenciação de
patógenos também é possível via RAPD, sendo possível separar linhagens
patogênicas e não patogênicas em grupos distintos (MANULIS et al.,1991).
2.3.4 Teste de agressividade em frutos de maçã var. Granny Smith
Um importante passo que pode fornecer medidas mais eficientes para
o controle da doença, é a seleção de indivíduos resistentes ao patógeno. Mas,
antes de se realizar esta seleção é importante o conhecimento dos diferentes
níveis de agressividade do fitopatógeno, pela possibilidade de erros na
indicação de resistência com o uso de isolados pouco agressivos
(RODRIGUES CASSIOLATO, 1994).
A avaliação inicial da agressividade entre isolados fitopatogênicos em
maçãs variedade Granny Smith pode ser útil na análise da agressividade e,
34
também, para a caracterização dos morfotipos. Com este objetivo, esta técnica
foi utilizada por De Wet et al. (2002) em maçãs do tipo Granny Smith onde
estes pesquisadores determinaram a agressividade e realizaram a
caracterização de vários morfotipos de S. sapinea. O teste com frutos de maçã
Granny Smith foram considerados, por estes autores, como rápidos, de baixo
custo, de fácil visualização e por oferecerem resultados confiáveis, prestando-
se, portanto, como testes de caracterização e determinação da agressividade
em S. sapinea.
2.4 ESTUDOS DE AGRESSIVIDADE DE Sphaeropsis sapinea E SELEÇÃO
PRECOCE DE MATERIAL RESISTENTE
Estudos de seleção precoce realizados para testar a resistência de
espécies de pínus a fungos podem produzir resultados confiáveis, quando
realizados sob condições de casa de vegetação (DE SOUZA et al., 1991;
1992). Os testes de seleção quando realizados no campo são caros e
requerem anos para se obter resultados confiáveis e assim mesmo, no que se
refere ao inóculo, nunca se sabe, com precisão, nas condições de campo, a
quantidade com que cada planta foi inoculada, uma vez que o inóculo é natural
(DE SOUZA et al., 1991, 1992).
A suscetibilidade dos hospedeiros ao S. sapinea não pode ser
determinada através da literatura, por causa da ausência de experimentos
realizados sob condições controladas e usando isolados do patógeno bem
caracterizado. Como conseqüência desta lacuna a relação do patógeno com os
vários hospedeiros que são atacados pelo fungo S. sapinea, apesar de
largamente estudada, não é compreendida. Esta compreensão surge, segundo
Blodget e Stanosz (1999) com estudos realizados em casa de vegetação com
inóculo bem caracterizado fornecendo informações para estudos de resistência
do hospedeiro. Esta estratégia de seleção precoce visando encontrar espécies
ou variedades resistentes ao S. sapinea auxilia os trabalhos de campo,
inclusive estimando os riscos de danos causados pela doença (BLODGETT;
STANOSZ, 1999).
Burdon (1982) inoculou artificialmente 100 mudas de P. radiata
oriundas de sementes colhidas de árvores aparentemente resistentes,
35
localizadas em um povoamento atacado pelo fungo S. sapinea. Ao mesmo
tempo foram inoculadas outras 300 mudas, oriundas de povoamento com
histórico de plantas jovens atacadas pelo S. sapinea e de povoamento sem
histórico da doença, como controle. Este trabalho mostrou que existem
diferenças individuais na resposta ao S. sapinea pelo hospedeiro e que estas
diferenças eram herdáveis e aditivas.
Swart e Wingfield (1991) inocularam com S. sapinea 6 diferentes
espécies de pinus cultivados na África do Sul, com objetivo de determinar a
suscetibilidade destas espécies ao patógeno e confrontaram os resultados
obtidos em casa de vegetação com os experimentos no campo e encontraram
consistência nos seus resultados.
Em trabalho semelhante, Blodgett e Stanosz (1999) inocularam
artificialmente, em casa de vegetação, mudas de vários hospedeiros do S.
sapinea. Os resultados destes experimentos mostraram que a incidência de
sintomas da doença diferenciou de acordo com o morfotipo inoculado, com os
diferentes hospedeiros e entre variedades dos hospedeiros. Os testes
realizados em casa de vegetação com metodologia padronizada para
inoculação do patógeno no hospedeiro visando determinar as diferenças de
agressividade entre os isolados em relação à suscetibilidade do hospedeiro
foram considerados satisfatórios.
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO DE ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
Os isolados do fungo empregados nesse estudo foram obtidos de
árvores com sintomas de ataque do patógeno, coletados de ponteiros de P.
taeda (São José do Ouro/RS e Rancho Queimado/SC) e de mudas mortas de
P. maximinoi (Santa Maria do Oeste/PR) e de cones doentes de Pinus sp.
(Curitiba/PR), no período de 2006 a 2007, conforme TABELA 1. Foi realizado
isolamento direto de conídios em meio de cultura ou por meio da esporulação
em material coletado doente mantido em câmara úmida e posterior
transferência de conídios para meio de cultura.
Para o isolamento direto em meio de cultivo dos isolados utilizou-se os
meios batata-ágar-dextrose-BDA (extrato comercial de batata e ágar, 39 g;
água destilada, 1000 mL) e o meio extrato de malte ágar – EMA (15 g de
extrato de malte, 20g de ágar e água destilada 1000 mL) e incubados por três a
quatro dias. Dos ponteiros e das mudas mortas foram retirados fragmentos de
tecidos doentes e frutificações. No caso dos cones foram removidas as
brácteas, lavadas as suas superfícies e cortadas em três a quatro segmentos.
No isolamento indireto, após confirmação ao microscópio da presença
de frutificações de S. sapinea no material doente, os picnídios formados foram
cuidadosamente retirados e colocados em tubos de Eppendorf com água
destilada estéril. Este material foi centrifugado rapidamente para sedimentação
dos resíduos e com auxílio de uma micropipeta retirou-se 300 μL do conteúdo
dos tubos e colocadas algumas gotas em placas com meio ágar-ágar - AA (20
g de ágar e água destilada, 1000 mL). Estas placas foram levadas ao
microscópio para confirmar a presença de conídios e depois os conídios foram
postos para germinar. Este período até que o primeiro conídio começasse a
germinar foi monitorado, sendo possível observar o momento exato da
germinação. Neste tipo de isolamento, os isolados monospóricos foram obtidos
diretamente, sem a obtenção dos isolados originais.
Para a obtenção das culturas monospóricas um quadrado de micélio de
cinco mm
2
foi retirado da colônia de cada isolado e colocado em placas de
Petri com o meio acícula de pínus-ágar - APA (20 g de ágar e água destilada,
37
1000 mL, suplementado com três a quatro acículas de pinus estéreis cortadas
em fragmentos de 1 cm e colocadas em placas de Petri autoclavadas e depois
recobertas com meio AA, antes da solidificação) de acordo com trabalho de
Basilio et al. (2007). As placas foram incubadas sob luz fluorescente, a 25 °C,
até os picnídios se desenvolverem. Os picnídios individualizados foram
suspensos, em água esterilizada e misturados com ajuda de um Vortex. Depois
eles foram plaqueados em placas com meio AA por uma noite, a 25 °C. Dessas
placas, os conídios germinados foram transferidos para o meio EMA a 25 °C e
cultivados por 7 dias, conforme utilizado por De Wet et al. (2000).
Para induzir a produção de picnídios e de conídios os isolados foram
transferidos para placas contendo meio APA e incubados a 25 ºC, sob luz
constante, conforme mencionado por De Wet et al. (2000). Os picnídios
individualizados (contendo conídios) foram colocados em tubos de ensaio com
água esterilizada, triturados com estilete e misturados com ajuda de um
agitador ou de forma manual. Alíquotas de 100 a 300 μl da suspensão de
conídios foram tomadas com uma micropipeta, plaqueados em meio AA, e
incubados por duas horas, a 25° C. Neste período de tempo, os conídios
iniciaram a germinação e a formação de hifas. Sob microscópio
estereoscópico, os conídios germinados foram coletados com um estilete,
transferidos para placas com meio extrato de EMA, cada placa com apenas um
conídio germinado. Posteriormente, as placas foram repicadas e mantidas em
câmara BOD, a 25 °C, para o desenvolvimento das colônias monospóricas.
Após a confirmação da identificação baseada na morfologia dos
conídios e picnídios segundo a descrição de Sutton (1980), os isolados
monospóricos cultivados em meio EMA ou meio BDA foram transferidos para
tubos de ensaio contendo BDA, cultivados, recobertos com óleo mineral
esterilizado e colocados em geladeira a 4 °C para fim de preservação.
Os isolados originais e os monospóricos estão listados na TABELA 1 e
sua origem podem ser visualizadas na FIGURA 2. Todos os isolados foram
identificados de acordo com as características dos conídios (SUTTON, 1980;
DE WET et. al., 2002) e estão armazenados em geladeira a 4 °C, para fins de
preservação.
38
TABELA 1 – INFORMAÇÕES SOBRE OS ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea E
SUA ORIGEM
ISOLADOS
ORIGINAIS/
ISOLADOS
MONOSPÓRICOS
LOCAL DA COLETA HOSPEDEIRO PARTE COLETADA
SS1
SS1.1
SS1.2
SS1.3
São José do Ouro/RS
Pinus taeda
Ponteiros doentes
SS2
SS2.4
SS2.5
SS2.6
Rancho Queimado/SC
Pinus taeda
Ponteiros doentes
SS3
SS3.7
SS3.8
SS3.9
Santa Maria do Oeste/PR
Pinus maximinoi
Mudas mortas
SS4
SS4.10
SS4.11
SS4.12
Curitiba/PR Pinus sp. Cones doentes
39
FIGURA 2 LOCAIS DE COLETA DE Sphaeropsis sapinea NA REGIÃO SUL
DO BRASIL.
Legenda: São José do Ouro – isolado SS1; Rancho Queimado –
isolado SS2; Santa Maria do Oeste – isolado SS3; Curitiba –
isolado SS4.
FONTE: LABORATÓRIO DE MONITORAMENTO – EMBRAPA
FLORESTAS (2007)
40
3.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea
A caracterização morfológica dos isolados de S. sapinea foi feita em
diferentes meios de cultura para observar o tipo de crescimento, a coloração do
micélio, a aparência das colônias e as diferenças entre os conídios, baseando-
se em trabalhos de Blodget e Stanosz (1999) e De Wet et al. (2002). Os
isolados foram cultivados nos meios BDA, EMA e APA. A velocidade de
crescimento dos isolados foi acompanhada diariamente até que as colônias
atingissem os bordos das placas. Avaliou-se, também, o aspecto do micélio e
sua coloração e a textura, em cada meio testado.
Os isolados SS1, SS2, SS3 e SS4 com seus respectivos isolados
monospóricos foram colocados em meio APA para formação de picnídios e
conídios, conforme metodologia citada no item 3.1. Os conídios foram
avaliados qualitativamente quanto às diferenças de tamanho, a textura da
parede e a presença de septos.
3.2.1 Teste de compatibilidade vegetativa (CV)
A diversidade genotípica dos isolados foi estimada usando-se teste de
compatibilidade vegetativa (Burgess et al., 2001).
Discos com micélio-ágar dos isolados SS1, SS2, SS3, SS4 e seus
monospóricos com sete a dez dias de crescimento foram transferidos para
placas de Petri com meio AA a uma distância de 1 cm entre si e incubados por
quatro dias em BOD, a 25° C. Estes discos foram distribuídos nas placas de
Petri de forma que em cada quarto da placa os isolados originais e seus
monospóricos (mesma origem) ficassem próximos (FIGURA 3), confrontando-
se entre si, e ao mesmo tempo, confrontando com os outros isolados das
outras origens.
Depois das comparações iniciais, onde todos os isolados foram
colocados para crescer juntos na mesma placa, foram realizadas comparações
com um menor número de isolados por placa de Petri, em geral de dois em
dois, ou no máximo, de três em três isolados monospóricos por placa.
41
FIGURA 3 ESQUEMA DE PAREAMENTO DE DISCOS DE MICÉLIO-ÁGAR
CONTENDO DIFERENTES ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
EM MEIO ÁGAR-ÁGAR PARA AVALIAÇÃO DA
COMPATIBILIDADE VEGETATIVA.
Isolado
SS2
Isolado
SS1
Isolado
SS4
Isolado
SS3
42
Cada isolado foi confrontado com ele mesmo, com os outros isolados
monospóricos obtidos do mesmo isolado original, e confrontado com os
isolados monospóricos obtidos de isolado monospórico das outras localidades.
Foi necessária a realização de todas estas comparações, inclusive do isolado
monospórico com ele mesmo, para que pudessem ser montados os padrões de
reações denominados de: compatibilidade vegetativa (CV), média
compatibilidade vegetativa (MCV) e incompatibilidade vegetativa (ICV), para
facilitar a análise das reações de compatibilidade.
Dois isolados monospóricos foram considerados vegetativamente
incompatíveis (ICV) quando se formou uma linha preta bem definida com
posterior formação de picnídios entre os isolados confrontados. Os isolados
monospóricos foram considerados como vegetativamente compatíveis (CV)
quando formou uma densa linha clara ou cinza com entrelaçamento micelial
entre eles. A média compatibilidade foi obtida quando apareceu uma linha fina
escura com algum entrelaçamento micelial entre os isolados confrontados. O
ponto de encontro entre as colônias dos isolados foi analisado ao microscópico
estereoscópico, de acordo com o observado por Burgess et al. (2001).
3.3
.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO Sphaeropsis sapinea
Para as análises moleculares, a numeração dos isolados foi organizada
como SS1 (4) com os monospóricos: SS1.1 (1), SS1.2 (2), SS1.3 (3); SS2 (8)
com os monospóricos SS2.4 (5), SS2.5 (6), SS2.6 (7); SS3 (12) com os
monospóricos: SS3.7 (9), SS3.8 (10), SS3.9 (11) e SS4.10 (13), SS4.11 (14),
SS4.12 (15). Os números entre parênteses correspondem à numeração que os
isolados receberam na eletroforese.
3.3.1 Metodologia de extração de DNA total de microrganismos
A extração de DNA dos fungos de S. sapinea foi realizada em amostras
obtidas de micélio cultivado em meio BDA. Para tanto dois métodos foram
testados: uma por meio de raspagem direta com alça de platina e a outra por
meio da remoção direta de aproximadamente um cm
2
de meio com bisturi
cirúrgico, eliminando-se o máximo do gel. Esses métodos fazem parte da rotina
43
de testes para extração de DNA em microrganismos do Laboratório de
Microbiologia Molecular do Departamento de Patologia Básica da Universidade
Federal do Paraná.
As amostras oriundas do meio BDA foram adicionadas a um tubo de
Eppendorf (2 mL) contendo cultura em meio liquido e o conjunto foi
centrifugado (2500 rpm), por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e então
adicionado 400 µL de CTAB
1
(brometo de cetiltrimetilamônio) 2X com uma
mistura de sílica e celite (2:1).
O conjunto foi homogeneizado e aplicado Sonicador, alternando com
banho de gelo de 2 x 30 minutos. Após esta etapa foi adicionado 250 µL de
CTAB, e colocado em banho maria a 65 ° C por 10 minutos.
O conjunto foi resfriado a temperatura ambiente e então adicionado
700 µL de CIA (clorofórmio-álcool isoamílico 24/1, v/v), agitando suavemente
por 2 minutos até a sílica soltar do fundo. Passou-se para centrifugação por 7
minutos a 12.000 rpm. Retirando-se cuidadosamente o sobrenadante (500 µL)
para outro tubo estéril e identificado. Adicionou-se o mesmo volume de CIA
(500 µL) nesse tubo de Eppendorf e centrifugado por 7 minutos a 12.000 rpm.
Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 2 volumes de etanol 96 % gelado
homogeneizando suavemente. O DNA foi precipitado, mínimo 2 horas no
freezer. Após este período centrifugou-se o DNA por 7 minutos a 12.000 rpm e
descartou-se o sobrenadante, com o auxílio de micropipeta, e secou-se a
temperatura ambiente. O DNA isolado foi ressuspendido em 50 µL de tampão
TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA
2
1 mM) 1x e armazenado em freezer.
A qualidade do DNA foi verificada utilizando-se gel de agarose a 1 %
corado em brometo de etídio e fotografado em fotodocumentador sistema
KODAK. A partir da foto foi estimada a concentração do DNA isolado.
1
2 % (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM
2
Ácido etilenodiamono tetracético
44
3.3.2 Técnica de RAPD em Sphaeropsis sapinea
Para a amplificação do DNA, pela técnica de RAPD, utilizou-se um Mix
contendo os seguintes elementos: 1,5 unidades da enzima Taq DNA
polimerase; 5 μM para cada dNTP; 3,0 μM de cloreto de magnésio (MgCl
2
); 0,4
μM de primers 20 mM de Tris-HCl pH 8,4; 5 mM KCl e 10 ng de DNA por 25 μL
de reação.
Foram utilizados 35 ciclos nas seguintes condições: 1 minuto a 92 ºC;
1,5 minutos a 37 ºC e 1 minuto a 72 ºC. Foram utilizados 5 minutos a 94 ºC
para desnaturação inicial e 5 minutos a 72 ºC de extensão final.
A mistura contendo 15 μL de cada amostra mais 5 μL de tampão de
carregamento foi aplicada no gel (1,5 %). Nas extremidades foram aplicado
marcador de peso molecular Ladder 100 pb (MPM). A corrida do DNA no gel foi
realizada sob voltagem constante de 3 V por cm.
Neste trabalho foram utilizados 11 primers aplicando-se a técnica de
Marcadores RAPD Os primers (iniciadores) utilizados foram OPA (07, 16, 10);
OPX (12, 13, 14, 11, 03, 17, 19), OPA 16; OPAX 19.
3.3.3 Análise de Polimorfismo
Após a corrida do gel de agarose, os perfis obtidos por RAPD foram
corados por 10 minutos com brometo de etídio. Por ser um agente intercalante,
ele permite que o DNA possa ser evidenciado e fotografado sob luz UV em
transluminador (GLIENKE, 1995).
A análise da variabilidade genética dos morfotipos foi realizada de
acordo com os princípios adotados de taxonomia numérica. Utilizou-se o
coeficiente de similaridade de Jaccard, que permite calcular similaridades com
base em variáveis binárias: (0) para ausência de banda e (1) para presença de
banda (GLIENKE,1995). Os morfotipos foram considerados como unidades e
bandas foram consideradas como as variáveis.
O coeficiente foi calculado segundo a fórmula J=M/P, onde M é o
número de concordâncias positivas, e P o número total de variáveis, subtraindo
45
as concordâncias negativas (SNEATH; SOKAL, 1973). Quanto maior for a
semelhança entre dois morfotipo, maior é o valor do coeficiente de similaridade.
O agrupamento dos morfotipos (unidades) foi realizado pelo método
UPGMA (Unweighted Pari-Group Method with Arithmetical Average). Este
agrupamento é um modelo hierárquico que permite a construção de
dendrogramas (SNEATH; SOKAL, 1973). Os dendrogramas foram elaborados
com auxílio do programa NTSYS-PC.
3.4 AVALIAÇÃO DA AGRESSIVIDADE DE ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea EM FRUTOS DE MAÇÃ
A agressividade dos isolados de S. sapinea foi inicialmente testada
usando-se a técnica de inoculação em frutos de maçã. Essa técnica foi
utilizada por De Wet et al. (2002) em frutos de maçã var. Granny Smith para
caracterizar os morfotipos de S. sapinea. Os isolados SS1, SS2, SS3 e SS4
foram cultivados em meio BDA para produção de inóculo (discos de micélio-
ágar).
Cada maçã foi desinfestada superficialmente com álcool 70 %.
Furadores de cortiça foram usados para fazer um orifício de cinco mm de
largura em um dos lados da maçã. Um disco de micélio-ágar foi retirado de
placas de Petri contendo meio BDA e colocado em cada orifício, que foram
recobertos com fita de PVC. Como testemunha utilizou-se disco de meio BDA
sem micélio. Cada isolado foi inoculado em três frutos, com cinco repetições,
em delineamento inteiramente casualizado. Os frutos foram mantidos por duas
semanas em BOD, a 25 °C, no escuro.
Foram realizadas duas medições, uma aos sete dias após a inoculação
(sete DAI) e outra medição aos 14 DAI. Com auxílio de uma régua foi medido o
tamanho das lesões no sentido vertical e no sentido horizontal.
46
3.5 AVALIAÇÃO DO TIPO DE INOCULAÇÃO, DA AGRESSIVIDADE DE
ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea E REGIME HÍDRICO NO
DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA EM MUDAS DE Pinus taeda
O ensaio foi realizado nas estufas do Laboratório de Melhoramento
Florestal – LAMEF/ UFPR, Curitiba, PR. Mudas de P. taeda, com
aproximadamente sete meses de idade, foram inoculadas com isolados de S.
sapinea.
A área do experimento continha duas estufas agrícolas, em forma de
túnel, com 5 m x 8 m recoberta por sombrite de 12 m x 20 m. Duas estufas
tinham 6 m de comprimento por 4 m de largura, estruturadas por tubos de PVC,
com 5,5 cm de diâmetro e 6 m de comprimento (normalmente usados em
estufas agrícolas) e recobertas com lona plástica transparente. Uma terceira foi
recoberta somente com sombrite 75 % de passagem de luz solar.
O monitoramento dos ambientes foi realizado medindo-se a quantidade
de água diária de cada estufa, através de provetas. Na área coberta apenas
pelo sombrite, a água da chuva foi coletada, separadamente, da água dos
aspersores. A temperatura e a umidade dentro das estufas foram monitoradas
diariamente, durante todo experimento, usando-se um Hobbo®. Este
equipamento foi aferido periodicamente com o termômetro de máximo e
mínimo e a umidade com o uso de termômetro de bulbo seco e úmido.
Neste ensaio avaliou-se o efeito do tipo de inoculação, do regime
hídrico no desenvolvimento da doença em casa de vegetação, da
agressividade dos isolados de S. sapinea.
3.5.1 Tipo de inoculação
Foram testados dois tipos de inoculação: com e sem injúria, com duas
testemunhas com e sem injúria.
3.5.2. Regime hídrico da estufa
Três regimes hídricos foram escolhidos para determinar o mais favorável
ao estabelecimento da doença: No ambiente 1, o regime foi de uma aspersão
47
diária (8:00 h) com 4 minutos de duração. No ambiente 2, o regime foi de duas
aspersões ao dia (9:00 h e 17:00 h), com 4 minutos de duração cada aspersão.
No ambiente 3 (sombrite), o regime foi três aspersões ao dia (9:30 h, 12:00 h e
18:00 com 20 minutos de duração cada aspersão).
As mudas foram submetidas a uma condição de estresse hídrico, antes
da inoculação, sem molhamento por sete dias, segundo De Wet et al. (2002).
3.5.3 Inoculação das mudas de Pinus taeda
Os isolados foram cultivados em meio BDA e
transferidos para meio AA
para produção do inóculo (disco de micélio-ágar). Para a inoculação, utilizaram-
se discos de micélio-ágar retirados do meio AA com 10 dias de crescimento.
Cada disco de meio AA, contendo ou não o fungo, foi fixado na planta com fita
adesiva por quatro dias. As plantas inoculadas foram mantidas em câmara
umedecida com água destilada, por 48 h. Depois deste período, as mudas
foram transferidas para as estufas e mantidas por cerca de 30 dias sob
observação.
Este experimento foi montado em delineamento em blocos ao acaso
com arranjo fatorial, num total de 864 plantas (12 isolados monospóricos, dois
tipos de inoculação, três regimes hídricos, três repetições, duas plantas por
parcela). Para as análises estatísticas foi feito ANOVA e teste de Duncan pelo
programa Statistic (1998).
Na avaliação da doença, mediu-se o comprimento da lesão com o
auxílio de uma régua, a partir do ponto de inoculação (BLODGETT; STANOSZ,
1999). Dois modos de avaliar a severidade foram empregados. No primeiro
modo, o comprimento da lesão foi avaliado de acordo com uma escala, que
variou de pequena (0 a 3 cm), média (4 a 7 cm) e grande (8 a 10 cm). No
segundo, o secamento do ponteiro foi avaliado de acordo com uma escala,
onde 0 significou ausência de sintoma da doença, 1 para o início de lesão, 2
quando houve seca de ponteiro, 3 para seca de ponteiro sem anelamento, 4
para seca de ponteiro com anelamento e 5 para muda morta (BURDON et.al.,
1982).
48
3.5.4 Recuperação de Sphaeropsis sapinea de mudas de Pinus taeda
Foram avaliadas três metodologias para confirmação da presença do
fungo nas lesões. A primeira metodologia foi através do reisolamento por meio
de amostragem das mudas inoculadas de P. taeda. Essa amostragem foi feita
através da coleta de material de cinco parcelas (duas plantas por parcela) em
cada bandeja do experimento para a realização do reisolamento em placas de
Petri com meio BDA, mantidas em BOD, a 25 ºC.
A segunda metodologia testada foi manter os ponteiros de todas as
plantas inoculadas em câmara úmida. Os ponteiros foram coletados após 1
mês de inoculação e mantidos em sacos plásticos individualizados,
devidamente identificados.
A terceira metodologia testada foi colocar os ponteiros em câmara úmida
dentro de gerbox com papel de filtro esterilizado e umedecido com água
destilada estéril. Todo o material foi analisado semanalmente, por 30 dias.
Após esse período, realizaram-se os exames dos ponteiros em microscópio
estereoscópico e montadas lâminas coradas com lactoglicerol-azul de metileno
para verificar a presença de picnídios ou conídios de S. sapinea.
3.6 AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE PROGÊNIES DE Pinus radiata À
Sphaeropsis sapinea
O experimento foi realizado em novembro de 2007 em estufa do
LAMEF-UFPR, com mudas de P. radiata com sete meses de idade, originadas
de sementes de 16 famílias selecionadas oriundas de um teste de progênie de
polinização controlada da Nova Zelândia. As sementes foram cedidas pelo
ENSIS – CSIRO/SCION.
As mudas foram produzidas em tubetões, usando-se o substrato
orgânico composto por casca de pínus compostada e vermiculita. O regime
hídrico e o tipo de inoculação mais favorável para o desenvolvimento da seca
de ponteiro em casa de vegetação foram escolhidos pelos resultados com os
testes realizados com mudas de P. taeda (regime hídrico com duas aspersões
diárias, com quatro minutos de duração cada, uma pela manhã e outra pela
tarde e inoculação com injúria).
49
3.6.1 Inoculação dos isolados Sphaeropsis sapinea em mudas de Pinus radiata
Os isolados monospóricos SS1.3, SS2.4 e SS4.10 de S. sapinea,
anteriormente avaliados, foram selecionados como os mais agressivos (itens
3.5 e 3.6) para esse ensaio. Os isolados foram cultivados em meio BDA e
transferidos para meio AA para produção do inóculo (disco de micélio-ágar).
Para a inoculação, utilizaram-se discos de micélio-ágar retirados do meio AA
com 10 dias de crescimento. Cada disco de meio, contendo ou não o fungo, foi
fixado em mudas de P. radiata com fita adesiva por quatro dias, conforme
metodologia do item 3.6.3. Durante 48 horas as mudas inoculadas foram
mantidas em câmara úmida com apenas água destilada. Depois deste período
as mudas foram transferidas para as estufas e mantidas por cerca de 10 dias
sob observação.
Na avaliação da doença, mediu-se o comprimento da lesão com o
auxílio de uma régua, a partir do ponto de inoculação (BLODGETT; STANOSZ,
1999). Dois modos de avaliar a severidade foram empregados. No primeiro
modo, o comprimento da lesão foi avaliado de acordo com uma escala, que
variou de pequena (0 a 3 cm), média (4 a 7 cm) e grande (8 a 10 cm). No
segundo, o secamento do ponteiro foi avaliado de acordo com uma escala,
onde 0 significou ausência de sintoma da doença, 1 para o início de lesão, 2
quando houve seca de ponteiro, 3 para seca de ponteiro sem anelamento, 4
para seca de ponteiro com anelamento e 5 para muda morta (BURDON et.al.,
1982).
3.6.2 Recuperação de Sphaeropsis sapinea de mudas de Pinus radiata
Os ponteiros de todas as mudas de P. radiata inoculadas foram
coletados e mantidos em sacos plásticos, devidamente identificados, para
posterior análise da presença ou ausência do patógeno. Os ponteiros das
mudas foram retirados, tomando-se o cuidado de incluir os pontos de
inoculação do fungo.
Os ponteiros foram analisados individualmente sob microscópico
estereoscópico em busca de picnídios ou conídios do S. sapinea. No caso
50
positivo da presença de picnídios e conídios de S. sapinea, foram montadas
lâminas coradas com lactoglicerol - azul de metileno para confirmação.
3.6.3 Avaliação de herdabilidade para resistência das progênies de Pinus
radiata
A herdabilidade de P. radiata foi determinada com base em duas
variáveis: o tamanho das lesões e o secamento dos ponteiros (item 4.6.2). O
delineamento utilizado foi o de blocos ao acaso com 16 progênies, quatro
tratamentos (três isolados monospóricos mais uma testemunha), com quatro
repetições e duas plantas por parcela. O coeficiente de herdabilidade foi
determinado de acordo com estudo de Cruz (2005) em nível de médias de
família, segundo a fórmula:
(1)
ONDE:
σ
2
m
=
Variância da progênie
σ
2
0
=
Variância do resíduo
r = Número de repetições do experimento
Qmp = Quadrado médio das progênies
Qme = Quadrado médio do resíduo
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS
4.1.1 Crescimento em meio de cultura
A metodologia de isolamento utilizada neste trabalho mostrou-se
adequada para a obtenção dos isolados de S. sapinea, verificando-se que o
fungo desenvolveu-se bem nos meios BDA e EMA a 25 ºC, sendo que em meio
BDA os isolados atingiram a borda da placa com cinco dias em média. Em
meio AA os isolados cresceram mais lentamente, demorando em média de 14
dias para atingir a borda da placa, dependendo do isolado monospórico, similar
ao crescimento em meio APA.
Em meio BDA, as colônias apresentaram inicialmente uma coloração
branca algodoada formando, aos poucos, raios esverdeados, visíveis, a
princípio, mais facilmente no fundo da placa. Com o tempo estes raios foram
tomando um tom verde-musgo a cinza-chumbo e com aspecto cotonoso. Em
meio APA, o micélio apresentou-se ralo de coloração escura e gelatinosa. No
meio AA, o micélio apresentou-se também ralo e de coloração cinza chumbo
sem a presença de picnídios.
4.1.2 Esporulação em meio de cultura
A metodologia utilizada neste trabalho para esporulação do fungo S.
sapinea, baseada em trabalho de De Wet et al. (2000) mostrou-se adequada
para este propósito. Com esta técnica foi possível obter picnídios e
quantidades adequadas de conídios, em meio APA, utilizado para produção de
isolados monospóricos.
Os isolados de S. sapinea comportaram-se de forma diferente em seu
crescimento e esporulação dependendo do meio em que foram cultivados, mas
conseguiram desenvolver-se em todos os meios testados. Os resultados
destas avaliações estão apresentados na TABELA 2.
52
TABELA 2 – COMPARAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
DOS ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
ISOLADO/
ISOLADOS
MONOSPÓRICOS
MEIOS
TESTADOS
CONÍDIOS
ESPORULAÇÃO
(formação de
conídios)
CRESCIMENTO
BDA APA AA
SS1
Coloração:
Verde musgo
para cinza
chumbo
Aspecto:
algodoado
Jovens:
hialino
sem septo
Maturos:
Marrom
um ou dois
septos
SS1 SS1
SS1.1
XXX X X X
SS1.2
XXX X X
SS1.3
XXX X X X
SS2
SS2 SS2
SS2.4
XX X X
SS2.5
XX X X X
SS2.6
XX X X
SS3
SS3 SS3
SS3.7
X X X
SS3.8
X X
SS3.9
X X
SS4
SS4 SS4
SS4.10
XX X X X
SS4.11
X X
SS4.12
XX X X
Avaliação qualitativa do crescimento micelial: X (crescimento baixo), XX (crescimento médio),
XXX (crescimento alto). Esporulação: X (baixa), XX (média), XXX (alta).
53
Os picnídios de S. sapinea apresentaram-se de forma variada,
normalmente globosos, imersos, separados ou agregados (PHILLIPS, 2005).
Na FIGURA 4, pode-se observar um picnídio de S. sapinea, produzido sobre
acícula em meio APA. Os conídios jovens tiveram aspecto hialino
permanecendo dentro do picnídio até amadurecerem quando passaram para
uma coloração marrom clara, e na maturidade, tornaram-se escuros, com
tonalidade marrom mostarda e marrom escuro. Os conídios jovens raramente
eram septados, como pode ser observado na FIGURA 5, mas com a
maturidade grande parte tornou-se septado. Na grande maioria dos casos foi
evidenciado apenas um septo em cada conídio, mas foi observado também
conídios com dois septos.
Verificou-se que existem diferenças na capacidade e na velocidade de
formação de picnídios in vitro entre os diferentes isolados. Os isolados SS1
(SS1.1, SS1.2 e SS1.3) foram os mais rápidos em iniciar a formação dos
picnídios no meio APA., conforme evidenciado na TABELA 2. Com sete dias
neste meio, os picnídios já podiam ser observados em cima das acículas. Após
14 dias, alguns picnídios dos isolados SS1 (SS1.1, SS1.2, SS1.3)
apresentaram conídios maturos. Para garantir uma maior quantidade de
conídios foi necessário deixar o material em incubação por 21 dias. Os isolados
SS2 (SS2.4, SS2 e SS2.6) e SS4 (SS4.10, SS4.11 e SS4.12) começaram a
formar os picnídios depois de 10 dias de incubação. Os conídios destes
isolados ficaram maturos depois de cerca de 21 dias de incubação.
54
FIGURA 4 - PICNÍDIO (SETA BRANCA) DE Sphaeropsis sapinea FORMADO
EM MEIO ACÍCULA-ÁGAR.
FONTE: CELSO GARCIA AUER, 2007
FIGURA 5 - CONÍDIOS DE Sphaeropsis sapinea SOBRE MEIO ÁGAR-ÁGAR.
FONTE: O autor, 2007
55
Os isolados SS3 (SS3.7, SS3.8, SS3.9) foram os mais lentos na
formação dos picnídios. Com estes isolados pode-se observar a formação de
picnídios sobre as acículas, somente após 21 dias de incubação e para se
obter uma boa quantidade de conídios maturos foi necessário deixá-los em
incubação por pelo menos 30 dias.
Outro aspecto observado foi a formação de picnídios no ponto de
retirada dos discos de micélio-ágar para a repicagem das colônias,
principalmente se estes isolados estavam crescendo em meios AA e APA. Para
que estes picnídios produzissem conídios maturos eram necessários que
permanecessem em incubação por mais 14 dias.
Para a obtenção de culturas monospóricas necessitou-se saber o tempo
exato em que os conídios começaram a germinar, para que sejam repicados
antes que os tubos germinativos se cruzem. Para o S. sapinea foi
recomendado deixar 8 horas germinando para depois iniciar o isolamento dos
conídios (BURGESS et al., 2001). Os testes realizados nesse trabalho
mostraram que os conídios de S. sapinea iniciaram sua germinação após 1
hora e 50 min. de incubação em meio AA. Com duas horas após o início da
germinação mais de 50 % dos conídios já estavam germinando.
A descrição do crescimento dos isolados SS1, SS2, SS3, SS4 e seus
monospóricos em meio BDA sugere que são morfotipos do tipo “A”. De acordo
com De Wet et al. (2002) e Stanosz (2002) é importante conhecer os
morfotipos presentes, pois as estratégias de controle de S. sapinea dependem
do morfotipo. O morfotipo “A” está mais amplamente distribuído e ataca vários
de coníferas. Os morfotipos “B” e “C” possuem uma distribuição mais restrita,
sendo considerados mais raros (WANG et al.,1985; PALMER et al., 1987). O
uso de fungicidas no viveiro não é eficaz no controle do morfotipo “A”, que é
mais agressivo. Para o morfotipo “A”, o plantio de árvores resistentes onde o
fungo tem maior probabilidade de ocorrer é o melhor método de controle
(STANOSZ, 2002).
56
4.2 TESTE DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA (CV)
Na TABELA 3 são apresentados os resultados do testes de CV entre
os isolados de S. sapinea. Foi evidente a formação de uma linha escura na
placa de Petri, quando estava ocorrendo incompatibilidade vegetativa (ICV)
entre os isolados. Esta linha escura, visualizada ao microscópio
estereoscópico, revelou a ausência de contato entre as colônias e a formação
de picnídios. Porém, quando não ocorreu formação de uma linha escura entre
os isolados observou-se a formação de um micélio claro-algodoado contínuo
entre eles, que ao microscópio revelou ser um entrelaçamento das hifas na
região de contato entre as colônias. Os isolados que formaram uma linha
escura e rala com formação de poucos picnídios foram considerados como
média compatibilidade vegetativa (MCV). Quando as placas de Petri foram
mantidas por um período acima de 30 dias, houve formação de picnídios entre
os isolados.
Os isolados SS1, SS2, SS3, SS4 e seus monospóricos comportaram-se
de modo a formarem grupos locais, como pode ser visto nas FIGURAS 6 e 7.
Em cada quarto da placa foi colocado um grupo diferente de isolados e pode-
se perceber que neste arranjo entre os isolados monospóricos geralmente
ocorreu CV e entre os isolados originais apareceu uma linha de ICV, similar ao
relatado por Burgess et al. (2002).
Na FIGURA 7 são mostrados casos de MCV e CV em S. sapinea. Na
FIGURA 7 A, pode-se observar uma linha escura e rala separando os isolados,
indicativa de MCV entre os isolados. Nas FIGURAS 7 B, C e D as colônias
foram consideradas CV. Esta reação é evidenciada pela formação de uma linha
branca formada por crescimento micelial entre eles (BURGESS et al., 2001).
57
TABELA 3 - AVALIAÇÃO DA COMPATIBILIDADE VEGETATIVA ENTRE OS
ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
PAREAMENTO ENTRE
ISOLADOS
/MONOSPÓRICOS
COMPATIBILIDADE
ASPECTO DAS COLÔNIAS NA
RERGIÃO DE CONTATO
MICELIAL
SS1
SS1.1 x SS1.1
CV Micélio claro denso
SS1.2 x SS1.2
CV
Micélio claro sem separação
SS1.3 x SS1.3
CV
Micélio claro
SS1.1 x SS1.2 x SS1.3
CV
Micélio claro contínuo
SS2
SS2.4 x SS2.4
CV
Micélio claro ralo
SS2.5 x SS2.5
CV
Micélio claro ralo
SS2.6 xSS2.6
SS4.4 x SS5 xSS5.6
CV
Micélio claro ralo
MCV
Micélio ralo escuro
SS3
SS3.7 x SS3.7
CV
Micélio claro ralo
SS3.8 xSS3.8
CV
Micélio claro ralo
SS3.9 x SS3.9
SS3.7 x SS3.8 x SS3.9
CV
Micélio claro ralo
MCV
Micélio ralo escuro
SS4
SS4.10 x SS4.10
CV
Micélio claro
SS4.11 x SS4.11
SS4.12 x SS4.12
CV
Micélio claro
CV
Micélio claro
SS4.10 x SS4.11 x SS4.12
CV
Micélio claro
SS1.2 x SS.2 5 x SS3.8
SS1.3 x SS2.6 x SS3.9
ICV
Micélio escuro
ICV
CV = compatibilidade vegetativa, MCV = média compatibilidade vegetativa, ICV =
incompatibilidade vegetativa.
58
FIGURA 6- REAÇÃO DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA (CV – SETA
BRANCA) E INCOMPATIBILIDADE VEGETATIVA (ICV – SETA
AMARELA) ENTRE ISOLADOS MONOSPÓRICOS DE
Sphaeropsis sapinea EM MEIO AA.
FOTO: ALBINO GRIGOLETTI JUNIOR, 2006
FOTO: ALBINO GRIGOLETTI JUNIOR, 2006
FIGURA 7 – PLACAS COM OS ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
MOSTRANDO MÉDIA COMPATIBILIDADE VEGETATIVA
(MCV - SETA AMARELA) E COMPATIBILIDADE
VEGETATIVA (CV – SETA VERDE) EM MEIO BDA.
59
4.3
.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Sphaeropsis sapinea
4.3.1.Resultado da técnica RAPD em Sphaeropsis sapinea
Para a extração do DNA, dois métodos haviam sido testados: a
raspagem direta do micélio com alça de platina e a remoção direta de
aproximadamente um cubo com um cm
2
de micélio-ágar com bisturi cirúrgico,
eliminando-se o máximo do gel. Desses métodos, o melhor foi o método do
cubo de micélio-ágar, por apresentar maior uniformidade na quantidade de
DNA extraído.
Durante a caracterização molecular de microrganismos é necessária a
variação nos perfis eletroforéticos dos mesmos. Entretanto, nos trabalhos de
caracterização molecular, não foi este o resultado obtido com os primers
testados, pois em sua maioria houveram comportamentos monomórficos, como
pode ser visualizado na FIGURA 8. O comportamento monomórfico ocorre
quando se formam perfis de bandas similares entre si. Dos 11 primers testados
apenas um apresentou bandas polimórficas.
Como somente um primer apresentou polimorfismo, os resultados
serviram para uma interpretação preliminar sobre o perfil genético dos isolados
de S. sapinea. O dendrograma obtido com o perfil desse primer apresentou
tendência similar aos resultados do teste de CV. É importante ressaltar que o
número de isolados para ambos os testes foi pequeno, mas que esta limitação
ocorreu pela dificuldade de se obter isolados oriundos de material doente em P.
taeda, espécie considerada resistente ao fungo.
A FIGURA 9 apresenta o primer com características polimórficas
usadas para análise do S. sapinea. Nota-se que os isolados numerados de 1 e
2 apresentaram problemas na amplificação do DNA e foram descartados para
a análise dos resultados. Como as bandas são as variáveis procuradas dentro
de uma análise molecular, logo se não há bandas estes devem ser tratados
como parcela perdida. Na continuação deste tipo de estudo, a seleção de
novos primers e repetição de isolados que possuam problemas de amplificação
deverá ser efetuada.
60
FIGURA 8 - REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DE RAPD EM Sphaeropsis sapinea
APRESENTANDO MONOMORFISMO ENTRE OS ISOLADOS.
Os números acima da figura correspondem a distruibuição dos morfotipos como
SS1 (4) com os monospóricos: SS1.1 (1), SS1.2 (2), SS1.3 (3); SS2 (8) com os
monospóricos SS2.4 (5), SS2.5 (6), SS2.6 (7); SS3 (12) com os monospóricos:
SS3.7 (9), SS3.8 (10), SS3.9 (11); SS4 (ausente) e os monospóricos: SS4.10
(13), SS4.11 (14), SS4.12 (15). Os números entre parênteses correspondem a
numeração que os isolados receberam na eletroforese.
FONTE: O AUTOR, 2007
61
FIGURA 9 - REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DE RAPD DE Sphaeropsis
sapinea APRESENTANDO POLIMORFISMO ENTRE
ISOLADOS.
Os números acima da figura correspondem a distruibuição dos morfotipos na
SS1 (4) com os monospóricos: SS1.1 (1), SS1.2 (2), SS1.3 (3); SS2 (8) com
os monospóricos SS2.4 (5), SS2.5 (6), SS2.6 (7); SS3 (12) com os
monospóricos: SS3.7 (9), SS3.8 (10), SS3.9 (11); SS4 (ausente) e os
monospóricos: SS4.10 (13), SS4.11 (14), SS4.12 (15). Os números entre
parêntese correspondem a numeração que os isolados receberam na
eletroforese.
FONTE: O AUTOR, 2007
62
4.3.2 Análise do polimorfismo
A análise das bandas do perfil com polimorfismo revelou, apesar do
pequeno número de isolados, algumas tendências na distribuição geográfica
destes isolados similares aos resultados encontrados na caracterização
morfológica. Portanto, os comentários sobre o dendrograma (FIGURA 10)
serão acompanhados com as tendências obtidas com a caracterização
morfológica e compatibilidade vegetativa.
O dendrograma mostrou a formação de três agrupamentos geográficos
no ponto de corte de 75. No nó superior estão agrupados isolados mais
similares entre si, quando comparados com o terceiro grupo de isolados
monospóricos 4 (SS1) e 5, 6, 7 e 8 (SS2). Este grupo apresentou uma boa
estruturação entre seus isolados monospóricos, mas mostrou duas situações
bem peculiares. O isolado monospórico 8 (SS2), que representa o conjunto
gênico dos monospóricos 5, 6, 7 (SS2.4, SS2.5, SS2.6), arranjou-se como um
subgrupo de seus monospóricos, mas apresentando a mesma similaridade.
Este comportamento do isolado 8 (SS2) pode indicar que ele possui ainda no
seu conjunto muitos outros isolados monospóricos divergentes podendo ser um
indicativo de uma boa variabilidade intra-específica deste isolado.
Entretanto, verificou-se que o isolado de São José do Ouro/RS,
monospórico 4 (SS1) apresentou-se no mesmo grupamento dos isolados
monospóricos 5, 6 e 7 (SS2.4, SS2.5, SS2.6) de Rancho Queimado/SC. Nestes
dois grupos encontram-se os isolados monospóricos mais agressivos. O fato
do isolado 4 (SS1) ter-se agrupado com os isolados monospóricos de SS2
pode ser um indício que eles tiveram uma origem comum ou ainda esta
tendência poderia ser subdividida se aumentado o número de bandas
analisadas ou de isolados estudados.
63
FIGURA 10 - DENDROGRAMA DA DIVERGÊNCIA GENÉTICA A PARTIR DO ÍNDICE
DE SIMILARIDADE DE JACCARD.
Os números correspondem aos isolados monospóricos: SS1 (4) com os isolados
monospóricos SS1.1 (1), SS1.2 (2), SS1.3 (3); SS2 (8) com os isolados monospóricos
SS2.4 (5), SS2.5 (6), SS2.6 (7); SS3 (12) com os isolados monospóricos SS3.7 (9), SS3.8
(10), SS3.9 (11); SS4 (ausente) com os isolados monospóricos SS4.10 (13), SS4.11 (14),
SS4.12 (15).
FONTE: O AUTOR, 2007
64
O isolado monospórico 3 (SS1.3) que pertence ao grupo do isolado 4
(SS1) apresentou uma grande divergência genética, não apenas no
dendrograma, pois apresentou tendências distintas nos demais experimentos
realizados. Esta divergência em relação ao isolado 4 (SS1) é muito evidente.
No dendrograma (Figura 10), o isolado monospórico 3 (SS1.3) de São José do
Ouro se agrupou com o isolado monospórico 14 (SS4.11), que fez parte do
grupo dos isolados monospóricos de Curitiba (SS4). Esta divergência pode ser
considerada como a formação de uma linhagem clonal dentro de populações,
como citado por McDonald (1997) onde ele afirma que há esta tendência para
fungos com reprodução assexuada.
Outra possibilidade, para este comportamento do monospórico 3 (SS1.3)
pode ser um indício de ancestralidade comum com os monospóricos de
Curitiba (SS4). Esta situação, se comprovada, ligaria os monospóricos de
Curitiba (SS4) com os monospóricos de Rancho Queimado (SS2/SC) o que os
ligariam a um ancestral comum proveniente de uma mesma procedência
exógena.
Com a distribuição das procedências pelo Brasil, impondo uma
separação geográfica, cada isolado divergiu-se de acordo com o ambiente e
com as pressões ambientais do seu novo hábitat. Esse isolado monospórico 3
(SS1.3) comportou-se como um dos mais patogênicos e agressivos durante os
testes de patogenicidade. Mostrando, portanto, que sua divergência genética
pode estar refletindo na sua capacidade de provocar lesões no seu hospedeiro.
O material proveniente de Santa Maria do Oeste (PR) formado pelos
isolados monospóricos 9, 10, 11, e 12 (SS3) apresentou-se muito bem
estruturado formando um grupo bem compacto com todos os seus isolados
monospóricos SS3 (SS3.7, SS3.8, SS9). A estruturação deste grupo pode ser
um indicativo de baixa variabilidade intrapopulacional. Este agrupamento
mostrou-se o menos agressivo nos testes de agressividade. Este grupo foi
também o que apresentou crescimento mais lento entre todos os grupos
testados.
Os isolados monospóricos 13, 14, 15 (SS4) apresentaram uma baixa
estruturação genética. Mas, dois componentes deste grupo mostraram
similaridade acima de 75 % com os isolados monospóricos 9, 10 ,11, 12.(SS3).
Isto pode ser um indício de uma origem comum dos isolados SS3 e SS4 no seu
65
habitat. Estes indícios, se comprovados, ligariam o grupo dos isolados
monospóricos de Curitiba com os isolados monospóricos de Santa Maria do
Oeste, sugerindo a possibilidade de uma introdução comum no Paraná.
O agrupamento de Curitiba (PR) e São José do Ouro (RS) foram os
que se apresentaram menos estruturados neste dendrograma e estão
presentes nestes dois grupos os isolados monospóricos com maior capacidade
de provocar lesões nos hospedeiros.
Este dendrograma mostrou uma tendência clara de uma melhor
estruturação entre os grupos monospóricos de Santa Catarina e Rio Grande do
Sul e os grupos monospóricos do Paraná (Santa Maria do Oeste e Curitiba).
Este dendrograma mostrou também a grande divergência entre os
isolados monospóricos do RS e do isolado monospórico 15 (SS4.12) de
Curitiba que apresentou entre todos os monospóricos a menor similaridade
genética. Não existe, nos outros testes realizados de caracterização
morfológica, uma resposta clara para esta divergência. Mas, este isolado
monospórico é proveniente do grupo de Curitiba, que cresceu bem em meio
BDA, formou picnídios rapidamente em meio AA e teve boa capacidade de
provocar lesões no hospedeiro. Esta seria a única indicação, que poderia ser
fornecida por este trabalho, para a divergência apresentada por este
dendrograma para este monospórico 15.
As causas que podem levar uma população original semelhante a
divergir-se e decidir qual fator atuou para que esta divergência tenha ocorrido é
muito especulativo, mas neste caso a separação geográfica dos isolados e as
diferentes pressões ambientais dos isolados foram provavelmente os motivos
principais da divergência e das diferentes estratégias de sobrevivência destes
isolados.
Os testes de CV entre os isolados mostraram um padrão regionalizado
na divergência genética entre os isolados obtidos na região Sul do Brasil.
Como o S. sapinea apresenta apenas reprodução assexuada a divergência
genética encontrada nestes isolados não pode ser explicada pela distância
geográfica entre os isolados. O isolamento geográfico deve ser acompanhado
por um isolamento sexual intenso e prolongado quanto existe apenas
reprodução assexuada. Segundo Burgess et al. (2004) na ausência de
reprodução sexual, deve-se pensar que esta divergência pode ser em
66
conseqüência de várias introduções do S. sapinea e neste caso podem estar
envolvidos mais de um morfotipo do fungo.
A análise molecular dos isolados pelo método de RAPD também
revelou a divergência genética mostrada nos testes de Compatibilidade
Vegetativa, sendo esta divergência mais evidente entre os isolados de SS4 e
SS1.
4.4. AVALIAÇÃO DA AGRESSIVIDADE DE ISOLADOS DE Sphaeropsis
sapinea EM FRUTOS DE MAÇÃ
Os isolados SS1, SS2, SS3 e SS4 de S. sapinea foram patogênicos
nos frutos de maçã var. Granny Smith, formando grandes lesões (FIGURA 11).
Houveram diferenças na agressividade entre os isolados testados (TABELA 4).
Essas variações foram significativas (P < 0,05) pelo teste F, aos 7 e 14 dias
D.A.I. A diferença na agressividade dos isolados é um indicativo de
divergências genéticas entre os isolados, as quais podem ser comprovadas
através dos testes de agressividade (DE WET et al., 2002, DE WET et. al.,
2003, BURGESS et. al., 2001).
Observou-se que aos 7 DAI foi encontrado um coeficiente de variação
alto (43 %) indicando dispersão entre os dados. A análise de variância com os
dados das medições aos 14 DAI mostrou um valor de coeficiente de variação
mais baixo (23,84 %) indicando menor erro experimental. O isolado SS1
mostrou-se o mais agressivo, aos 7 DAI e aos 14 DAI, por isso, de acordo com
os resultados recomenda-se que a seja feita aos 14 dias.
Estudo similar realizado por De Wet et al. (2002) testou a agressividade
de S. sapinea ao inocular três diferentes morfotipos (A, B, C) em frutos de
maçã, encontrando diferenças significativas no tamanho das lesões. As lesões
do morfotipo “C” foram maiores que as do morfotipo “A”, que por sua vez, foram
maiores que do morfotipo “B”. Segundo estes autores o teste de
patogenicidade em maçãs é muito eficiente em predizer a agressividade dos
isolados de diversos fungos, inclusive de S. sapinea.
67
TABELA 4 – LESÕES (CM) EM FRUTOS DE MAÇÃ VAR, GRANNY SMITH
INOCULADAS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
OBTIDOS DE Pinus spp.
TAMANHO DA LESÃO (cm)∗
ISOLADOS TESTADOS 7 DAI 14 DAI
SS 1 4,84 a 7,93 a
SS 2 3,46 b 6,33 b
SS 3 3,17.b 6,33 b
SS 4 3,89 b 5,32 b
TESTEMUNHA 1,43 c 1,48 c
VALOR DE P
0,02 0,01
CV (%)
43,0 23,8
∗Valores correspondem à média de 5 repetições por isolado. Médias seguidas pela mesma
letra não diferem pelo teste de Duncan ao nível de significância de 5 %. DAÍ = dias após
inoculação.
68
A
B
FIGURA 11 – LESÕES EM FRUTOS DE MAÇÃ VAR. GRANNY SMITH
INOCULADAS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea. A.
vista externa. B. vista interna.
FOTO: ALBINO GRIGOLETTI JUNIOR, 2006
69
4.5 AVALIAÇÃO DO TIPO DE INOCULAÇÃO, DA AGRESSIVIDADE DE
ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea E REGIME HÍDRICO NO
DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA EM MUDAS DE Pinus taeda
A análise de variância mostrou que existem diferenças significativas (P <
0,05) com relação à agressividade dos diversos isolados inoculados em mudas
de P. taeda. Entretanto, ocorreram outras fontes de variação como as
condições em que experimento foi realizado, sugerindo, portanto, que houve
interação entre os isolados monospóricos e o tipo de inoculação, e, entre os
isolados monospóricos e o regime hídrico nas estufas.
O melhor regime hídrico para a realização dos testes foi o de duas
aspersões diárias e foi nesse regime que a doença provocada pelo S sapinea
desenvolveu-se melhor (ANEXO 3).
De acordo com os resultados, os isolados mais agressivos foram SS2. 4,
SS4.10, SS1.3 e SS1.1 (TABELA 5). Os resultados mostraram também que o
tipo de inoculação 1 (com fungo e com injúria) foi o mais eficaz em provocar os
sintomas. O isolado monospórico SS2.4 foi o mais agressivo em mudas de P.
taeda seguido pelos isolados SS4.10, SS1.3, os quais podem ser selecionados
para os testes de agressividade e de seleção para resistência.
Uma das explicações para a grande variação na agressividade entre os
isolados monospóricos do isolado SS2 pode ser obtida no trabalho de
McDonald (1997) onde ele evidencia que a variabilidade do S. sapinea decorre
da presença de linhagens clonais dentro de suas populações.
A TABELA 5 mostra que SS.3 (SS3.7, SS3.8, SS3.9) foram pouco
agressivos quando inoculados em P. taeda. Em conjunto com o baixo
desempenho destes isolados verificou-se que a velocidade de crescimento de
seus isolados monospóricos foi a menor entre todos os isolados monospóricos
analisados.
70
TABELA.5 - LESÕES (CM) EM MUDAS DE Pinus taeda INOCULADAS
COM ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea OBTIDOS DE
Pinus spp.
Médias seguidas por letras minúsculas (coluna) e maiúsculas (linha) diferente diferem
significativamente entre si (P < 0,05, Duncan). Inoculação: tipo 1 (com fungo, com injúria) e tipo
2 (com fungo, sem injúria).
ISOLADO MONOSPÓRICO
INOCULAÇÃO
MÉDIA
TIPO 1 TIPO 2
SS2.4 8,42 1,33 4,87 a
SS4.10
7,22 1,11 4,16 a
SS1.3
6,89 0,33 3,61 a
SS1.1
6,06 0,61 3,33 ab
SS4.12
6,44 0,11 3,27 bc
SS2.5
3,78 0,00 1,89 bcd
SS3.7
3,33 0,39 1,86 bcd
SS3.8
2,83 0,61 1,72 bcd
SS2.6
2,33 0,67 1,50 cd
SS4.11
2,50 0,00 1,25 d
SS1.2
0,61 0,00 0,30 d
SS3.9
0,33 0,00 0,16 d
MÉDIA
4,23 A 0,43 B
71
Os resultados obtidos neste experimento com P. taeda mostraram
diferenças na agressividade dos isolados, os quais estariam ligados à
divergência genética entre os mesmos (De Wet et al., 2000). A explicação de
como estas diferenças na agressividade foram desenvolvidas e distribuídas
entre as populações não está muito claro, uma vez que o S. sapinea se
reproduz apenas assexuadamente. A variabilidade possível de se obter via
reprodução assexuada é muito baixa e geralmente insuficiente para responder
por tal divergência genética. Por outro lado, as linhagens clonais são comuns
em fungos que se reproduzem apenas assexuadamente (MCDONALD, 1997).
4.5.1 Recuperação de Sphaeropsis sapinea de lesões em mudas
Os resultados da eficiência das três metodologias no reisolamento do
fungo S. sapinea nos quatro tipos de inoculação testados são mostrados na
TABELA 6.
Os resultados mostraram que a metodologia de isolamento por
plaqueamento foi a menos eficaz em reisolar o fungo e que manter o material
em câmara úmida (saco plástico ou gerbox) foi muito mais eficiente. O
isolamento por plaqueamento foi o primeiro método a ser testado, mas após
sucessivas avaliações ficou claro que este método não estava sendo eficiente
para avaliar o experimento.
O reisolamento efetuado por câmara úmida (saco plástico) é o mais
prático e conseguiu um bom resultado entre os testados e pode ser
recomendado.
72
TABELA 6 - AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS PARA REISOLAMENTO DE
Sphaeropsis sapinea APÓS INOCULAÇÃO EM MUDAS DE Pinus
taeda.
MÉTODO DE
REISOLAMENTO
FREQÜÊNCIA DE REISOLAMENTO (%)
PONTEIROS
COLETADOS
TIPO DE INOCULAÇÃO
TOTAL
1 2 3 4
CÂMARA ÚMIDA
EM SACO
PLÁSTICO
12,8 1,7 0,0* 0,0 16,2 360
CAMARA ÚMIDA
E GERBOX
30,0 25,0 0,0 0,0 55,0 20
PLAQUEAMENTO
EM MEIO BDA
1,7 0,8 0,0 0,8 3,3 360
Inoculação: tipo 1 (com injúria, com fungo); tipo 2 (com injúria, sem fungo); tipo 3 (sem injúria,
com fungo); tipo 4 (sem injúria, sem fungo).
* resultado indicando endofitismo do fungo.
73
É importante ressaltar, que em todos os métodos avaliados neste
experimento, foi baixo o reisolamento de S. sapinea em mudas de P. taeda. Em
várias mudas com grandes lesões a partir do ponto de inoculação do fungo o S.
sapinea não foi reisolado, em nenhum dos métodos avaliados. Em outras
situações, algumas mudas de P. taeda que não foram inoculadas e não
apresentaram lesão, o fungo foi reisolado. A explicação para este fato pode ser
encontrada no trabalho de Stanosz (2002) onde este autor sugere que nestas
situações é difícil saber se o fungo já estava presente no pínus, comportando-
se como endofítico. Burgess et al. (2004) acreditam que foi comportando-se
desta forma que S. sapinea foi sendo disseminado pelo mundo. Como S.
sapinea é patogênico para vários gêneros de Pinus, estes autores acreditam
que o fungo foi sendo distribuído juntamente com as introduções de mudas de
pínus pelos países. Baseado nesta hipótese, S. sapinea pode ter sido
introduzido no Brasil, na década de 1940, e provocado a doença em arboretos
de P. radiata, a espécie considerada mais suscetível ao fungo.
4.6. AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE PROGÊNIES DE Pinus radiata À
Sphaeropsis sapinea
4.6.1 Avaliação da agressividade dos isolados e resistência das progênies de
Pinus radiata
Os dados de agressividade dos isolados monospóricos de S. sapinea
inoculados nas mudas de P radiata foram analisados de duas formas: com e
sem interação entre fungo e progênies. Os testes foram realizados com
isolados monospóricos, para que toda variação observada nas progênies fosse
proveniente da capacidade das mudas de P. radiata em reagir aos isolados
inoculados.As análises e os resultados originais com interação entre os fungos
e as progênies estão disponíveis nos ANEXOS.
Os resultados apresentados na TABELA 7 referem-se às análises de
variância realizadas sem interação para o tamanho da lesão que os isolados
SS1.3, SS2.4 e SS4.10 provocaram nas 16 progênies de P. radiata. Na análise
com interação, o resultado do isolado monospórico SS4.10, o menos agressivo
74
em mudas de P. radiata, mascarou os resultados dos isolados monospóricos
SS1.3 e SS2.4 que foram muito mais agressivos em P. radiata.
Com relação à reação das progênies aos três isolados foi observado
que houve resposta diferencial, ou seja, de acordo com o isolado testado
encontraram-se diferentes progênies resistentes ao mesmo. Assim, para o
controle de um dado isolado deverá ser utilizada uma progênie específica a
esse isolado.
As progênies 7, 9 e 15 foram mais resistentes ao isolado monospórico
SS1.3, seguidas pelas outras progênies que estatisticamente não se
diferenciaram no tamanho da lesão provocada por este isolado. A progênie 16
foi a mais suscetível ao isolado SS1.3.
As progênies 10, 14 e 16 foram mais resistentes ao isolado
monospórico SS2.4, seguidas pelas outras progênies que estatisticamente não
se diferenciaram no tamanho da lesão provocada por esse isolado. A progênie
6 foi a mais suscetível ao SS2.4.
As progênies de P. radiata não se diferenciaram estatisticamente
quanto ao ataque do isolado monospórico SS4.10. Tal comportamento indicou
que esse isolado foi pouco agressivo e possivelmente apresente caráter
endofítico e saprófita.
O fato da progênie 16 ter sido a mais suscetível ao isolado SS1.3 e
uma das mais resistentes ao isolados SS1.4 indica que houve interação entre
as progênies e os isolados.
Na média geral, as progênies que apresentaram menor tamanho de
lesões foram as progênies 14, 15 e 13. Porém, essa classificação não seria
recomendada pelo mascaramento causado pelo isolado monospórico SS4.10.
75
TABELA 7 - LESÕES (CM) PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO DOS
ISOLADOS SS1.3, SS2.4, SS4.10 DE Sphaeropsis sapinea EM
MUDAS DE PROGÊNIES DE Pinus.radiata.
LESÕES (cm)* / ISOLADOS
PROGÊNIES SS1.3 SS2.4 SS4.10 MÉDIA
1
3,25 abc 2,37 ab 0,50 a 2,02
2
2,37 abc 1,62 ab 0,87 a 1,62
3
3,12 abc 1,25 ab 0,50 a 2,43
4
2,62 abc 2,87 ab 0,37 a 1,95
5
2,75 abc 2,37 ab 0,62 a 1,91
6
2,37 abc 3,50 a 0,00 a 1,96
7
2,00 bc 1,75 ab 0,00 a 1,87
8
4,87 ab 1,87 ab 1,00 a 2,58
9
1,87 c 2,62 ab 0,75 a 1,75
10
4,12 abc 1,00 b 0,00 a 1,71
11
3,12 abc 1,25 ab 0,62 a 1,66
12
4,12 abc 2,12 ab 1,00 a 2,41
13
2,25 abc 1,87 ab 0,75 a 1,62
14
2,75 abc 1,00 b 0,37 a 1,37
15
2,00 bc 2,25 ab 0,12 a 1,46
16
5,00 a 1,12 ab 0,62 a 2,25
*Médias seguidas por letras minúsculas (coluna) iguais não apresentam diferença significativa
entre si (P < 0,05, Duncan).
76
A TABELA 8 apresenta a avaliação da agressividade com que os
isolados SS1.2, SS2.4 e SS4.10 causaram seca e morte de ponteiros nas
mudas de 16 progênies de P. radiata inoculadas. Como no caso do tamanho
das lesões (TABELA 7) houve resposta diferencial das progênies em relação
ao isolado testado.
A progênie 9 foi a mais resistente ao SS1.3 quanto à seca de ponteiros.
A progênie 16 foi a mais suscetível ao ataque do SS1.3. Com as outras
progênies os resultados não apresentaram diferenças estatísticas significativas.
A progênie 16 foi a mais resistente ao secamento causado pelo isolado
SS2.4, seguida pelas progênies 3, 10 e 11 que não apresentaram diferenças
estatísticas entre si. A progênie 12 foi mais suscetível ao isolado SS2.4.
Os resultados mostraram que houve interação entre as progênies e os
isolados SS1.3, SS2. 4 e SS4. 10 inoculados. As progênies resistentes a um
isolado podem ser suscetíveis a outro isolado.
As progênies de P. radiata inoculadas com o isolado monospórico
SS4.10 foram as que mais sobreviveram e não se diferenciaram
estatisticamente quanto ao seu ataque. Pode-se observar que foi o menos
agressivo com todas as progênies estudadas, a exemplo do observado com o
tamanho das lesões (TABELA 7).
Na média geral, as progênies que apresentaram os menores graus de
secamento e morte de ponteiro foram as progênies 7, 10 e 11. Porém, essa
classificação não seria recomendada pelo mascaramento causado pelo isolado
monospórico SS4.10.
77
TABELA 8 - SECAMENTO DE PONTEIROS PRODUZIDO PELA
INOCULAÇÃO DOS ISOLADOS SS1.3, SS2.4, SS4.10 DE
Sphaeropsis sapinea EM MUDAS DE PROGÊNIES DE Pinus
radiata.
GRAU DE SECA DE PONTEIRO* / ISOLADOS
PROGÊNIES SS1.3 SS2.4 SS4.10 MÉDIA
1
3,00 Ab 2,37 ab 0,25 a 1,87
2
2,00 Ab 1,62 abc 0,50 a 1,37
3
2,50 Ab 0,87 bc 0,37 a 1,25
4
2,00 Ab 1,50 abc 0,25 a 1,25
5
1,75 Ab 1,87 abc 0,62 a 1,41
6
2,62 Ab 2,00 abc 0,00 a 1,54
7
1,50 Ab 1,62 abc 0,00 a 1,04
8
3,75 Ab 1,12 abc 0,75 a 1,87
9
1,37 B 2,12 abc 0,75 a 1,41
10
2,62 Ab 0,62 bc 0,00 a 1,08
11
1,87 Ab 0,87 bc 0,62 a 1,12
12
3,37 Ab 2,75 a 1,00 a 2,37
13
2,62 Ab 0,87 bc 0,87 a 1,45
14
2,37 Ab 1,62 abc 0,37 a 1,45
15
2,50 Ab 1,12 abc 0,12 a 1,25
16
3,87 A 0,50 c 0,87 a 1,75
*Médias seguidas por letras minúsculas (coluna) iguais não apresentam diferença significativa
entre si (P < 0,05, Duncan).
O grau de secamento do ponteiro foi avaliado de acordo com uma escala, onde 0 significou
ausência de sintoma da doença, 1 para o início de lesão, 2 quando houve seca de ponteiro, 3
para seca de ponteiro sem anelamento, 4 para seca de ponteiro com anelamento e 5 para
muda morta.
78
As TABELAS 9 e 10 apresentam os isolados monospóricos SS1.3,
SS2. 4 e SS4. 10 são separados em classes de agressividade pelo tamanho
das lesões, complementando as informações sobre a agressividade dos
isolados de S. sapinea.
Nenhuma progênie quando inoculada com o isolado monospórico
SS1.3 teve lesão menor que 1 cm, na média. A grande maioria das progênies
quando inoculadas com este isolado monospórico apresentaram lesões acima
de 2 cm. O isolado monospórico SS1.3 foi muito agressivo nas progênies de P.
radiata provocando extensas lesões nas mudas.
O isolado monospórico SS2.4 não provocou lesões tão extensas como
o isolado monospórico SS1.3, como pode ser observado nas TABELAS 7 e 9,
porém a severidade foi alta e a maioria das mudas suscetíveis acabaram
apresentando seca de ponteiro e morreram (TABELA 11).
As lesões provocadas pelo isolado monospórico SS4.10 foram muito
menores e menos severas e a maioria das progênies inoculadas por este
monospórico não tiveram lesões acima de 1 cm, em média (TABELA 11).
A mortalidade decorrente da inoculação dos isolados monospóricos
SS1.3, SS2.4 e SS4.10 foi variada. Observou-se que tanto o isolado SS1.3
como o isolado SS2.4 causaram lesões severas em mudas de P. radiata
provocando a morte de muitas mudas, confirmando que o S. sapinea é muito
patogênico em P. radiata.
Quando o S. sapinea formou lesões e elas não eram extensas no P.
radiata, a severidade era fator limitante para a sobrevivência. Neste caso, se as
feridas não foram muito severas foi evidenciado que as mudas conseguiram
sobreviver, conforme pode ser comprovado com as progênies 5, 10, 15, 7, 11.
Por outro lado, se as lesões foram muito severas mesmo sendo pequenas as
taxas de mortalidade entre as progênies pode ser alta. Quando as lesões foram
extensas e severas como aconteceu com as progênies 12 e 1, as taxas de
mortalidade foram altas para as duas progênies. Quando as lesões foram
extensas e não muito severas algumas progênies conseguiram sobreviver.
79
TABELA 9 – CLASSES DE TAMANHO DAS LESÕES (CM) PRODUZIDAS
PELA INOCULAÇÃO DOS ISOLADOS MONOSPÓRICOS
SS1.3 SS2.4 SS4.10 DE Sphaeropsis sapinea EM MUDAS DE
PROGÊNIES DE Pinus radiata.
CLASSES DE LESÕES (cm)/ISOLADOS
0 a 1
SS1.3 SS2.4 SS4.10
1 a 1,99
SS1.3 SS2.4 SS4.10
2 a 2,99
SS1.3 SS2.4 SS4.10
3 a 3,99
SS1.3 SS2.4 SS4.10
4 a 5
SS1.3
9*
14 10 7 16 12 3 12
12 6
16
10 6 15 3 8 11 16
10
7 13 11
1 5
8
15 2 2
1
14
6
7
9
4
4
8
4
3
5
13
1
14
5
16
11
9
13
2
*Número das progênies de Pinus radiata (1 até 16).
80
TABELA 10 – CLASSES DE GRAU DE SECAMENTO DE PONTEIROS
PELA INOCULAÇÃO DOS ISOLADOS MONOSPÓRICOS DE
Sphaeropsis sapinea NAS MUDAS DE PROGÊNIES DE
Pinus radiata.
.
CLASSES DE GRAU DE SECAMENTO/ISOLADOS
0 a 1 2 3 4 5**
SS1.3
SS2.4 SS4.10
SS1.3 SS2.4 SS4.10 SS1.3 SS2.4 SS4.10 SS1.3 SS2.4 SS4.10
16* 6 9 15
4 6
1
10 7 7 8
2 9
12
3 10 5 4
14 1
8
13 15 11 7
15 12
16
11 4
2
3
1
14
10
3
5
6
14
13
2
5
11
8
9
13
16
12
*Número das progênies de Pinus radiata (1 até 16)
**A classe 5 não apresentou progênies.
81
TABELA 11 – MORTALIDADE (%) DAS MUDAS DE PROGÊNIES DE Pinus
radiata INOCULADAS COM OS ISOLADOS
MONOSPÓRICOS SS1.3, SS2.4, SS4.10 DE Sphaeropsis
sapinea.
MORTALIDADE (%)
PROGÊNIE SS1.3 SS2.4 SS4.10 TESTEMUNHA TOTAL
1 12,5 8,3 - - 20,8
2 8,3 4,2 - - 12,5
3 12,5 - - - 12,5
4 4,2 4,2 - - 8,3
5 - - - - -
6 4,2 4,2 - - 8,3
7 - 8,3 - - 8,3
8 8,3 - - - 8,3
9 - 12,5 4,2 - 16,7
10 4,2 - - - 4,2
11 - - 4,2 - 4,2
12 4,2 8,3 4,2 - 16,7
13 4,2 4,2 - - 8,3
14 4,2 4,2 - - 8,3
15 4,2 - - - 4,2
16 8,3 - 4,2 - 12,5
Vinte e quatro plantas inoculadas por família.
- ausência de plantas mortas.
82
Com os resultados apresentados nessa tabela observou-se que as
progênies 5 e 11 foram resistentes aos isolados SS1.3 e SS2.4. Estas
progênies tiveram lesões provocadas pelos isolados, mas como estas lesões
não foram muito severas as progênies conseguiram sobreviver.
As progênies 7 e 10 tiveram comportamento semelhante Apesar
dessas progênies terem sido atacadas pelo S. sapinea a maioria conseguiu
sobreviver porque as lesões não foram muito severas.
As progênies 16 e 15 também merecem destaque. A progênie 16 foi
bem suscetível ao isolado SS1.3, mas sem muita severidade, e apresentou boa
sobrevivência para esse isolado. A progênie 15 foi resistente em relação ao
SS2.4 e grande parte das mudas sobreviveram aos ataques do SS1.3.
Em uma avaliação geral das respostas das progênies de P. radiata à
inoculação de S. sapinea, as progênies que se destacaram foram:
a) Progênies 5 e 11 - pela ausência de mortalidade em decorrência do ataque
dos isolados;
b) Progênies 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 15 e 16 - pela boa taxa de sobrevivência;
c) Progênies 7 e 9 - pela resistência ao isolado SS1.3, que foi o isolado
monospórico mais agressivo, com P. taeda e com P. radiata;
d) Progênies 3, 8, 15 e 16 - pela resistência ao isolado SS2.4 que se foi o mais
agressivo em P. radiata.
4.6.2 Avaliação da herdabilidade da resistência de progênies de Pinus radiata
contra Sphaeropsis sapinea
A análise da herdabilidade da resistência de P. radiata foi dividida em
duas variáveis: tamanho de lesão e grau de secamento de ponteiros. A
TABELA 12 mostra os resultados obtidos para herdabilidade de P. radiata com
relação ao tamanho da lesão causada pelos isolados SS1.3, SS2.4 e SS4.10.
A herdabilidade das progênies para esta característica com o isolado
monospórico SS1.3 foi de 0,33578, para o isolado monospórico SS2.4 foi
0,080677 e para o isolado monospórico SS4.10 foi nula (0,0).
Com relação ao grau de secamento de ponteiros causado pelos isolados
monospóricos SS1.3, SS2.4, SS4.10, houveram resultados diferentes do
observado com o tamanho da lesão (TABELA 13). A herdabilidade das
83
progênies para esta característica para o isolado monospórico SS1.3 foi de
0,0388, para o isolado monospórico SS2.4 foi 0,256347 e para o isolado
monospórico SS4.10 foi de 0,025891.
A herdabilidade do P. radiata com relação às duas características foi
baixa pelo fato da fraca patogenicidade desse isolado nas progênies, como já
discutido anteriormente.
As análises dos experimentos mostraram que existem diferenças
significativas na herdabilidade entre as progênies de P. radiata, Este trabalho
encontrou herdabilidade de H
2
M
= 0,3357870 para característica “tamanho de
lesão” e
H
2
M
= 0,256347 para a característica “grau de secamento de ponteiro”.
Estes valores são considerados muitos bons (RESENDE, 2002) e indicam que
a característica é herdável. Estes resultados são importantes porque dão
sustentação para a continuidade dos trabalhos de seleção de
progênies/indivíduos de P. radiata resistentes ao fungo S. sapinea permitindo
os inícios dos testes de campo.
84
TABELA 12 - HERDABILIDADE PARA TAMANHO DE LESÕES
PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO DE ISOLADOS
MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea EM PROGÊNIES
DE Pinus radiata.
ISOLADOS
PARÂMETRO SS1.3 SS2.4 SS4.10
V
0
2,655295 1,915017 0,652517
V
M
0,33559 0,042014 -0,04757
H
2
M
0,335787 0,080677 0,0
V
O
= quadrado
médio do resíduo. V
M
= quadrado médio das progênies.
H
2
M
= herdabilidade das progênies
TABELA 13- HERDABILIDADE PARA SECAMENTO DE PONTEIROS
PRODUZIDAS PELA INOCULAÇÃO DE ISOLADOS
MONOSPÓRICOS DE Sphaeropsis sapinea EM PROGÊNIES
DE Pinus radiata.
ISOLADOS
PARÂMETRO SS1.3 SS2.4 SS4.10
V
O
2,113542 1,261111 0,444184
V
M
0,021354 0,108681 0,002952
H
2
M
0,038844 0,256347 0,025891
V
O
= quadrado
médio do resíduo. V
M
= quadrado médio das progênies.
H
2
M
= herdabilidade das progênies
85
5 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos, as seguintes conclusões podem
ser listadas:
a) A caracterização morfológica dos isolados de S. sapinea indica que o
morfotipo predominante é do tipo “A”.
b) O teste de Compatibilidade Vegetativa (CV) mostrou uma divergência
genética, entre os isolados, coincidindo com a sua origem.
c) A divergência genética observada no teste de CV pode ser indicativa da
presença de mais de um morfotipo de S. sapinea na região Sul do Brasil.
d) A análise molecular dos isolados pelo método de RAPD confirmou a
divergência genética observada no teste de CV, mais evidente entre os
isolados monospóricos de SS1 e SS4.
e) Os isolados testados foram patogênicos em frutos de maçã var. Granny
Smith e o isolado SS1 foi o mais agressivo.
f) Os isolados monospóricos SS1.3, SS2.4 e SS4.10 foram os mais
agressivos em mudas de P. taeda.
g) A inoculação com injúria foi a mais eficiente em causar lesões e
secamento de ponteiros em mudas de P. taeda, em casa de vegetação.
h) O regime de aspersão mais favorável ao desenvolvimento da seca de
ponteiro em mudas de P. taeda, em casa de vegetação, foi o regime
com duas aspersões diárias em período de 4 minutos cada.
i) Os isolados de S. sapinea patogênicos em P. taeda também foram
patogênicos em mudas de P. radiata.
j) Existe resposta diferencial das progênies em função do isolado testado e
da variável da doença avaliada.
k) Existem diferenças significativas na herdabilidade entre as progênies de
P. radiata, com herdabilidade de
H
2
M
= 0,3357870 para a variável
tamanho de lesão e
H
2
M
= 0,256347 para a variável secamento de
ponteiro.
l) A seleção de progênies de P. radiata para a seca de ponteiro por S.
sapinea dependerá do isolado presente na região, onde serão feitos os
plantios comerciais.
86
6 RECOMENDAÇÕES FINAIS
As análises de caracterização morfológica e molecular apresentaram
uma variação fenotípica que foi sustentada pelas análises moleculares. Esta
divergência observada é constantemente apresentada nos ensaios com S.
sapinea realizados em várias partes do mundo (PALMER et al.,1987;
BLODGET; STANOSZ, 1999; BURGESS, 2001; DE WET et al., 2002; WANG
et al.,1986; PALMER et al., 1987; DE WET et al., 2003.). De acordo com estes
autores, no caso do fungo S. sapinea, esta divergência não pode ser explicada
por via sexual, sendo portanto, uma evidência da presença de diferentes
morfotipos nos locais onde o patógeno foi obtido. Este resultado merece
atenção porque a presença de vários morfotipos exige estratégias diferentes na
instalação de testes no campo, porque estas estratégias serão determinadas
de acordo com a presença do morfotipo do fungo presente no local, conforme
recomendação de Stanosz (2002).
Os resultados também mostraram que é importante saber qual
morfotipo do S. sapinea está presente no Brasil. Qualquer estratégia de ação e
prevenção contra a doença causada por este fungo, de acordo com Stanosz
(2002) depende desta informação, uma vez que, cada morfotipo comporta-se
de forma distinta. Para uma caracterização final, serão necessárias feitas
fotografias ao microscópio eletrônico da parede dos conídios dos isolados do S.
sapinea usados neste trabalho. Estudos feitos por De Wet et al. (2004) com
fotografias eletrônicas da parede dos conídios serviram para confirmar o
morfotipo existente e se pertence ao tipo “A”.
A seleção praticada neste estudo visou explorar as diferenças naturais
dentro das progênies testadas, de uma forma bem direcionada, procurando
favorecer apenas aqueles indivíduos que manifestaram as características
consideradas como desejáveis para este trabalho, em função do produto final
desejado: material resistente de P. radiata para montagem de um jardim clonal
visando à produção massal de material vegetativo para testes clonais e de
progênies no campo. De acordo com Resende (2002), a propagação vegetativa
é muito útil porque permite a fixação de genótipos superiores, já selecionados,
visando plantios clonais.
87
Todas as progênies sobreviventes nesta avaliação de resistência serão
propagadas vegetativamente para a realização de novos testes de resistência
em casa de vegetação e testes clonais. Esses testes clonais deverão ser
realizados em vários locais de acordo com um mapeamento de
morfotipo/isolados de S. sapinea na região Sul do Brasil. Tal mapeamento não
deverá ser difícil, uma vez que as caracterizações morfológicas e moleculares
apontam para uma regionalização dos isolados. Devem-se buscar locais
apropriados para a instalação dos testes clonais, atentando-se para a escolha
de sítios adequados para o P. radiata. Recomenda-se, também, que seja
incluída a avaliação das características silviculturais dos materiais resistentes à
doença.
Os testes clonais poderão ser montados com 100 progênies, 20
indivíduos por progênie e 3 clones por indivíduo com o esquema de repetições
clonais (RESENDE, 2002). Este material deve ser disponibilizado ao mesmo
tempo no momento da montagem dos testes no campo. Por isso é necessário
propagar massivamente o material já selecionado e selecionar outros, de
acordo com a metodologia apresentada nesta dissertação com o objetivo de
aumentar o número de populações e procedências.
Futuramente, deverá ser montado um teste de progênie com todo
material pré-selecionado. O teste deve ser montado com indivíduos repetidos
por meio de clones, diferentes famílias e diferentes procedências ou
populações. Para obter o máximo possível de informações, bem como a
precisão na avaliação dos indivíduos, os propágulos de cada indivíduo devem
divididos em várias parcelas (repetições) com uma planta por parcela. Deve ser
adotado também um esquema hierárquico de indivíduos dentro de família e
família dentro de procedências, segundo o delineamento em blocos de famílias
compactas (RESENDE E ARAÚJO, 1993, citados por RESENDE, 2002).
Por último, considera-se importante a busca por marcadores
moleculares para genes de resistência à seca de ponteiros causada por S.
sapinea em material genético de P. radiata, para um maior avanço no
programa de sua reintrodução no Brasil.
88
REFERÊNCIAS
ANAGNOSTAKIS, S.L. Conversion of curative morphology in Endothia
parasitica and its restriction by vegetative compatibility. Mycologia, New York,
v.75, n. 5 p. 777-780, set./out.1983.
AUER, C.G.; GRIGOLETTI, J.A. A ocorrência de Sphaeropsis sapinea em
Pinus no Sul do Brasil In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, 18.,
1995, Piracicaba. Resumos... Piracicaba: Grupo Paulista de Fitopatologia,
1995p.121.
AUER, C.G.; GRIGOLETTI, J.A.. SANTOS, A. F. Doenças em Pinus:
identificação e controle. Embrapa Florestas. Circular técnica. 48. 28p.Colombo.
2001.
BASILIO, P.R.C.; AUER, C.G.; SANTOS, A.F.dos; HIGA, A.R.
.Metodologia para
esporulação e produção de culturas monospóricas de Sphaeropsis sapinea.
Pesquisa Florestal Brasileira, v. 54, p. 145-147, 2007.
BLODGETT, J.T.; STANOSZ, G.R.Sphaeropsis sapinea morphotypes differ in
aggressiveness, but both infect nonwounded red or jack pines. Plant Disease,
St. Paul, v. 81, n. 2, p.143-147, 1997.
BLODGETT, J. T.; STANOSZ, G. R. Differences in aggressiveness of
Sphaeropsis sapinea RAPD marker group isolates on several conifers. Plant
Disease, St. Paul, v. 83, n.9, p.853-856, 1999.
BURGESS, T. I.; WINGFIELD, M. J.; WINGFIELD, B. D. Simple sequence
repeat (SSR) markers distinguish between morphotypes of Sphaeropsis
sapinea. Applied and Environmental. Microbiology, Washington, v. 67, n.1,
p. 354–362, jan, 2001.
BURGESS, T.I.; WINGFIELD, B.D.; WINGFIELD, M. J. Comparison of
genotypic diversity in nature and introduced populations of Sphaeropsis sapinea
isolated from Pinus radiata. Mycological Research, Cambridge, v. 105, n. 11,
p. 1331-1339, nov. 2001.
BURGESS,T.I.; GORDON,T. R.; WINGFIELD M. J.; WINGFIELD, B.D.
Geographic isolation of Diplodia scrobiculata and its association with native
Pinus radiate. Mycological Research, Cambridge, v. 108, n.12, p. 1399-1406,
dec, 2004.
BURDON, R. D.; CURRIE, D.; CHOU, C.K.S. Responses to inoculation with
Diplodia pinea in progenies of apparently resistant trees of Pinus radiate.
Australian Journal of Plant Pathology, Melbourne, v.11, n. 4, p.37-39, 1982.
89
CEDEÑO, L.; CARRERO, C.; FRANCO W.;TORRES LEZAMA, A. Sphaeropsis
sapinea asociado con quema del cogollo, muerte regresiva y cáncer en troncos,
ramas y raíces del pino Caribe en Venezuela. Interciencia, Caracas, v.26, n. 5,
p. 210-214, 2001.
CHOU, C.K.S. Crown wilt of Pinus radiata associated with Diplodia pinea
infection or woody stems. European Journal of Forest Pathology, Hamburg,
v.17, n.7, p. 398-411, 1987.
CHOU, C.; MACKENZI, M. E. Effect of pruning intensity and season on Diplodia
pinea infection of Pinus radiata stem through pruning wounds. European.
Journal of Forest Pathology, Hamburg, v.18, n.7, p. 437-444, 1988.
CORMA -Corporación Chilena De La Madera Viii Región Del Bío Bío
Concepción, 2003. Disponível em:
www.cormabiobio.cl/.../Jefe%20de%20Faena%20Silv.%20M%F3dulo%20Gene
ral%20Control%20Fitosanitario.pdf. Acesso em: 7/11/2007.
CRUZ, C. D. Princípios de Genética Quantitativa. Viçosa, MG: UFV, 2005.
391 p.
CSIRO. 2000. CSIRO Forestry and Forest Products. Kingston, Austrália:
CSIRO. E.S, ed. Wood supply worries: Prospects of fibre shortage are forcing
action by producers. Financial Post, v.90, n.9, p.14, 1996.
DALLIMORE, W.; JACKSON, A. Handbook on Coniferae and Ginkgoaceae.
4. ed. London: Edward Arnold, 1966.
DE WET, J.; WINGFELD, M.J.; COUTINHO, T.A; WINGFELD, B.D.
Characterization of Sphaeropsis sapinea isolates from South Africa, Mexico and
Indonesia. Plant Diseases, St. Paul, v.84, n.2, p. 151-156, 2000.
DE WET, J.; WINGFIELD, M.J.; COUTINHO, T.; WINGFIELD, B.D.
Characterisation “of “C” morphotype of the pine pathogen Sphaeropsis sapinea.
Forest Ecology and Management, Amsterdan, v. 161, p.181-188, 2002.
DE WET, J.; BURGESS, T. SLIPPERS, B. PREISIG, O.; WINGFIELD, B.D.;
WINFIELD, M. Multiple gene genealogies and microsatellite markers reflect
relationships between morphotypes of Sphaeropsis sapinea and distinguish a
new species of Diplodia. Mycological Research, Cambridge, v. 107, n. 5, p.
557-566, maio 2003.
ELDRIDGE, K.G. Refreshing the genetic resources of radiata pine
plantations: Detailed internal report on seed collections of Pinus radiata
from its five natural populations. February and March 1978. CSIRO Division
of Forest Research, Genetics Section Report number 7, 120p. CSIRO,
Canberra,1978.
EARLE, C.J. 2007.Gymnosperm Database. Disponível em:
www.conifers.org/pi/pin/radiata.htm. Acesso em: 29/1/2008
90
FLOWERS,J.; NUCKLES, E.; HARTMAN, J. VAILLANCOURT, L. Latent
Infection of Austrian and Scots pine tissues by Sphaeropsis sapinea .Plant
Disease, St. Paul, v.85, n. 10, p.1107-1112, 2001.
FLORES, F.J.; ALLEN H.L. Efectos del clima y capacidad de almacenamiento
de água del suelo en la productividad de rodales de pino radiata em chile: un
análisis utilizando el modelo 3-PG. Bosque, Valdivia, v.25, n.3, p.23-24. 2004.
FORDE, M.B. Variation in Natural populations of Pinus radiate in California.
Parte 3 Cone Charactters, Forest Research Institute, Rotorua. New Zeland
Journal of Botany, Wellington, v. 2, p. 459-485, 1964.
GANDULLO, J. M; GONZÁLEZ A., S.; SÁNCHEZ ,P., Ecologia de los pinares
Españoles, IV Pinus radiata D. Don.,Colección Monografias INIA n. 13. Instituto
Nacional de Investigaciones Agrarias, Ministerio de Agricultura, Madri,1974.
GARCIA, B.; DIEZ, J. Uso del método de rodales y sistemático para evaluar
daños por Sphaeropsis sapinea en Pinus radiata afectado por granizo en
Bizkaia, España. Bioagro, Barquisimeto, v.15, n.1, p. 3-16, jan. 2003.
GIBSON, I.A.S. Diseases of Forest Trees widely planted on Exotics in the
Tropics and Southern Hemisphere. Part 2. The genus Pinus. Commonwealth
Mycological Institute, Kew.London, 135 p.,1979.
GIESLER, L. J. Extension Plant Pathologist File G646 under: Plant Diseases
B-6, Trees Revised June 2000, 5,000 Electronic version issued May
2003.Disponível em:
<www.oznet.kstate.edu/pathext/factSheets/Trees/Pines/Sphaeropsis%20Tip%2
0Blight%20of%20Pines.asp>. Acesso em: 7/11/2007.
GLIENKE, C. Variabilidade genética no fungo endofítico Guinardia
citricarpa Kiely detectada por RAPD. Dissertação (Mestrado em Genética) -
Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, 1995.
GOMES, N.S.B. Armilariose em Pinus elliotti e Pinus taeda na região Sul
do Brasil. Tese (Doutorado em Engenharia Florestal), Universidade Federal do
Paraná, 2005.
HALWARD, T.M.; STALKER, H.T.; LARUE, E.A.; KOCHERT, G. Genetic
variation detectable markers among unadapted germoplasm resources of
cultivated peanut and related wild species. Genome, Ottawa, v. 34, p.1013-
1020, 1991.
HARTMAN, J; JENNIFER, F.; LISA, V.; MARIE, S; JERRY, H; LARRY, H.
Research Report Nursery and Landscape Program. Injections with
Fungicides for Management of Pine Tip Blight—A Four-Year Study 2002.
Disponível em: <www.ca.uky.edu/agc/pubs/pr/pr468/pr468.htm>. Acesso em:
15/1/2008.
91
HAUSNER, G.; HOPKINS, A.A.; DAVIS, C.N.; REID, J. Variation in culture and
rDNA among isolates of Sphaeropsis sapinea from Ontario and Manitoba.
Canadian Journal of Plant Pathology, Ontário, v. 21, n. 3, p. 256-264,1999.
HIGA, A. R.; SILVA, L. D. Pomar de Sementes de Espécies Florestais
Nativas. Curitiba: FUPEF do Paraná, 2006.
KREBS, J. S. Monterey Pine: An Introduced Species in Chile. Elmer, NEW
JOURNAL: C W Thronthwaite Associates, 1976.
LAVERY, P. B. Pinus radiata–An introduction to the species. In: Plantation
Forestry with Pinus radiata (P. B. Lavery, ed.): 5–12. [Review Papers No. 12.]
School of Forestry, University of Canterbury, Christchurch, New Zealand. Legat,
C. E. (1930) The cultivation of exotic conifers in South Africa.1986.
LAUGHTON, E.M. The incidence of fungal disease on timber trees. South
African Journal of Science, Johanesburg, v. 33, p. 377-382, 1937.
LESLIE J F Fungal Vegetative Compatibility. Annual Review of
Phytopathology, Palo Alto, v. 31, n. 9, p. 127-150, sep. 1993.
MANULLIS, S.; WILLIANS,J.G,K,;TANSKLEY,S.D. Rapid identification markers
linked to a pseudomonas resistance gene in tomato by using randon primers
and near-isogenic lines. Proceedings of the National Academy of Science of
the United States of America, Washington, v.88, p. 2336-2340,1991.
MCDONALD, B.A. The population genetics of fungi: tools and techniques.
Phytopathology, Lancaster, v. 87 n. 4, p. 448–453, 1997.
MCDONALD, P. M.; LAACKE R. Discovery Life Pinaceae Pinus radiate
D.Don. ServicesUnited State Department of Agriculture-Natural Resources
Conservation service. Disponível em: <http://www.discoverlife.org
>. Acesso
em: 2/1/2008.
MACKNNELL, F.H. Wide Spacing silviculture un western Australia’s pine
plantation. Proceedings wood: Future growth and conversion workshop,
Canberra, 1981.
MARSH, E.K. 1978. (Compiler): The cultivation and management of commercial
pine plantations in South Africa. Bulletin 56, Department of Forestry, Pretoria.
MILLER, R. Pinus radiata D. Don. USDA Forest Service, 2008.
Disponível em: <www.cnr.vt.edu/DENDRO/dendrology/syllabus/Pradiata.htm
>.
Acesso em: 15/1/2008.
MILLAR, C.I. Evolution and Biogeography of Pinus radiate, with a propose
revision of its quaternary history. USDA Forest Service. New Zealand Journal
of Forestry Science, Wellington, v. 29, n. 3, p. 335-365, 2000.
92
MIZUBUTI, E.S.G.; MAFFIA, L.A. Introdução à Fitopatologia: caderno
didático. Viçosa: Ed. Viçosa 2006. 190 p.
OFFORD, H.R. Diseases of Monterrey pine in native stands of California and in
plantations of Western North America. Paper PSW –14, 1964.
OVINGTON, J.D. Some aspects of the biology of radiate pine plantations .
proceedings Pines Radiate symposium, Camberra, 1970. The Australian
National University. 1971.
PALMER, A.M. How to identify and control Diplodia shoot blight, collar rot
and canker of conifers. University of Minnesota. Disponível em:
www.na.fs.fed.us/spfo/pubs/howtos/ht_conifers/ht_conifers.htm. Acesso em :
7/11/2007.
PALMER, M.A.; STEWART, E.L.; WINGFIELD, M. J. Variation among isolates
of Sphaeropsis sapinea in the north central United States. Phytopathology,
Lancaster, v. 77, n. 6, p. 944-948, 1987.
PATAKY, NANCY R., Sphaeropsis Blight or Diplodia Tip Blight of Pines.
Disponível em: <www.ipm.uiuc.edu/landturf/diseases/sphaeropsis/index.html>.
Acesso em: 7/11/2007.
PETERSON, G. W. Infection, epidemiology, and control of diplodia blight of
Austrian, ponderosa, and Scots pines. Phytopathology, Lancaster, v. 67,
p.511-514, 1977. Disponível em: <ohioline.osu.edu/hyg-fact/3000/3041.html>.
Acesso em: 15/1/2008.
PETERSON, G. W Diplodia pinea. Version 01.1 saved 4 January 2005.
Disponível em: <ohioline.osu.edu/hyg-fact/3000/3041.html>. Acesso em:
15/1/2008.
PHILLIP, A.J.L Diplodia pinea. Version 01 saved 30 March 2005. Disponível
em: <http://www.crem.fct.unl.pt/botryosphaeria_site/diplodia_pinea_2.htm
>.
Acesso em: 7/11/2007.
POYTON, R. J. Tree Planting in Southern Africa. Pretoria: Department of
Forestry, 1979. v. 1- The pines.
PRICE, R. A.; A. LISTON; S. H. STRAUSS. Phylogeny and systematics of
Pinus. Pp. 49-68 In: Richardson, D.M. (ed.), Ecology and Biogeography of
Pinus. Cambridge University Press. 1998.
QUINTA DO PRAZO : viveiros florestais Ltda. Disponível em: <http://
www.qtprazo.naturlink.pt/services.htm
>. Acesso em: 2/10/2007.
RECHER, H.F. Pinus radiata – a million dollar miscalculation? Australian
Natural History, Sydney, v. 20, n. 10, p. 318-325, 1982.
93
RESENDE, M. D. V. Genética Biométrica e Estatística no Melhoramento de
Plantas Perenes. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2002,.975p.
ROGERS, DEBORAH L In situ genetic conservation of Monterey pine (Pinus
radiata D. Don):Information and recommendations. Report No.26. ed.P.E.
McGuire University of California Division of Agriculture and Natural Resources,
Genetic Resources Conservation Program, Davis CA USA. September 2002
RODRIGUES CASSIOLATO, A. M.; MELO, I. S. de. Reação de resistência de
genótipos de tomateiro (Lycopersicum spp.) à infecção por Rhizoctonia solani
Kuhn. Scientia Agrícola, Piracicaba, v.51, n.3 sep./dec.1994.
SAG -Serviço Agrícola e Ganadera. Divisão de proteção agrícola
Coordenación General de la edición: Subdepartamento de vigilância y control
de plagas florestales y exóticas invasoras. Informe anual 2004. Disponível em:
<http//: www.sag.cl>. Acesso em: 16/10/2007.
SCOTT, C. W. Pinus radiata. Food and Agriculture Organization of theUnited
Nations, Forestry and Forest Products Study 14. Rome, Italy. 328 p. Pinus
radiata Disponível em: <www.gvmelle.com/bomen/pi_radi.htm>. Acesso
em:20/10/2007
SHAW, G.S. 1914 Genus Pine. Arnould Arboretum Publication. N. 5. Riverside
Press Cambridge.
SHIMIZU, J.Y.; MEDRADO, M. J. S. Cultivo de Pinus. Embrapa floresta 2005.
Disponível em: sistema producao.cnptia.embrapa.br/ Acesso 7/11/2007
SINCLAIR, J.B. Latent infection of soybean plants and seeds by fungi. St Paul.
Plant Disease, St. Paul, v. 75, n.3, p. 220-224, 1991.
SMITH, H., WINGFIELD, M. J., DE WET, J., COUTINHO, T. A. Genotypic
diversity of Sphaeropsis sapinea from South Africa and Northern Sumatra.
Plant Disease, St. Paul, v. 84, n. 2, p. 139-142, 2000.
SNEATH, P.H.; SOKAL, R.R. Numerical taxonomy. W.H. Freeman and
Company, San Francisco,1973. 573p.
SOUZA. S.M.de ; WHITE, T. L.; HODGE, G. R.; SCHMIDT, R. A. Genetic
Parameter Estimates for Greenhouse traits of Slash Pine Artificially inoculated
with Fusiform Rust Fungus. Forest Science, Lawrence v.37, n.3, p.836-848,
1991.
SOUZA. S.M. de; HODGE, G.R.; WHITE, T. L. Indirect Prediction of Breeding
Values for Fusiform Rust Resistance of Slash Pine Parents Using Greenhouse
Tests. Forest Science, Lawrence, v 38, n.1, p.45 - 65, 1992.
STANOSZ, G.R.; CUMMINGS CARLSON, J. Association of mortality of recently
planted seedlings and established saplings in red pine plantations with
Sphaeropsis collar rot. Plant Disease, St. Paul, v. 80, n. 7 p. 750-753, 1996.
94
STANOSZ G. R.;KIMBLER D. L. Shoot Blight of Lodgepole Pine Seedlings in
Nebraska Caused by Sphaeropsis sapinea . Plant Disease, St. Paul, v. 81, n.
3, p.311, mar. 1997
STANOSZ, G. R. ,SMITH, D. R. , GUTHMILLER, M. A., STANOSZ, J. C.
Persistence of Sphaeropsis sapinea on or in asyntomatic shoots of red and jack
pine. Mycologia, Lawrence, v. 89, n.4, p. 525-530, 1997.
STANOSZ, G. R. Univ. of Wisconsin-Madison, Depts. of Plant Pathology and
Forest Ecology and Management, 1630 Linden Drive, Madison. Evaluation
distribution and structure of epidemic populations of Sphaeropsis sapinea.2002.
Disponível em
<http://fhm.fs.fed.us/em/funded/04/eval_sphaeropsis_sapinea.pdf>.
Acesso em: 26/09/2007
SUTTON, B.C. Sphaeropsis sapinea. In: COELOMYCETES. (Commonwealth.
Mycological Institute) Inst/assoc. Appl. Biol., Kew, Surrey. England.
p.120/121,1980.
SWART, W.J.; WINGFIELD, M.J. Biology and control of Sphaeropsis sapinea
on Pinus species in South Africa. Plant Disease, St. Paul, v.75, n. 8, p.761-
766,1991.
TPCP: Sphaeropsis sapinea diseases.2002. Modi LTDA. Disponível em:
<http://.up.ac.za/academic/fabi/tpcp>. Acesso em: 26/09/2007
TURNER, J.; LAMBERT, M.J.Nutrition and Nutritional relationships of Pinus
radiata. Annual Review of Ecology and Systematics, Palo Alto, v.17, n.11
p. 325-350, nov.1986.
VASCONCELLOS, M.J.V; MACHADO, M.A.; ALMEIDA, A.M.R.; HENNING,
A.A.; BARROS, E.G.; MOREIRA, M.A. Differentiation of Colletotrichum
truncatun isolates by random amplified polimorphic DNA. Fitopatologia
Brasileira, Brasilia, v.19, n. 4, p.520-530, 1994.
WANG, C.G.; BLANCHETTE, R.A.; JACKSON, W.A.; PALMER, M.A.
Differences in conidial morphology among isolates of Sphaeropsis sapinea.
Plant Disease, St. Paul, v. 69, p. 838-841, 1985.
WANG, C.G.; BLANCHETTE, R. A.;PALMER, M. A.. Ultraestructural aspects of
the conidium cell wall of Sphaeropsis sapinea. Mycologia, Lawrence, v. 78,
n.6, p. 960-963, nov./dec.1986.
WANG, C.G.; BLANCHETTE, R. A.;PALMER, M. A.. Ultraestructural aspects of
the conidium cell wall of Sphaeropsis sapinea. Mycologia, Lawrence, v. 78,
n.6, p. 960-963, nov./dec.1986.
95
WILLIANS,J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY,S.V.
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, London, v. 18, n.22, p. 6531-6535, 1990.
WINGFIELD, M.J.; KNOX-DAVIES, P.S. Association of Diplodia pinea with a
root disease of pines in South Africa. Plant. Disease, St. Paul, v. 64, n. 2, p.
221-223, 1980.
96
ANEXOS
ANEXO 1 – DADOS ORIGINAIS DAS LESÕES CAUSADAS POR Sphaeropsis
sapinea EM FRUTOS DE MAÇÃ VAR. GRANNY SMITH
Local Repetição Isolados 7dias 10dias
1
1 1 9,7 9,7
1
2 1 2,36 5,66
1
3 1 4,23 8,5
1
4 1 4,16 8,166
1
5 1 3,76 8,6
1
1 2 2,96 7
1
2 2 3,53 5,43
1
3 2 2,33 4,8
1
4 2 4,26 8,83
1
5 2 4,23 5,6
1
1 3 1,9 7
1
2 3 2,9 5,43
1
3 3 2,3 4,8
1
4 3 5,13 8,83
1
5 3 3,6 5,6
1
1 4 4,4 4,9
1
2 4 3,6 6
1
3 4 3,96 4,5
1
4 4 4,13 6,77
1
5 4 3,36 4,43
1
1 5 1,3 1,3
1
2 5 1,26 1,4
1
3 5 1,53 1,53
1
4 5 1,53 1,53
1
5 5 1,63 1,63
97
ANEXO 2 - SECAMENTO DO PONTEIRO DE MUDAS DE Pinus taeda
CAUSADO POR ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea
Modo de inoculação: M1 – com injúria e com fungo; M2 – sem injúria e com
fungo; M3 – com injúria e sem fungo; M4 – sem injúria e sem fungo.
Ambientes testados: Túnel 1, Túnel 2 e Sombrite (0).
ESCALA DE SEVERIDADE
Sem sintoma 0
Sintoma inicial 1
Seca de ponteiro 2
Seca sem anelamento 3
Seca com anelamento 4
Morte da planta 5
98
ANEXO 3 – ANÁLISE DE LESÕES (CM) EM PONTEIROS DE Pinus taeda
INOCULADOS COM ISOLADOS DE Sphaeropsis sapinea OBTIDOS DE Pinus
spp, EM TRÊS AMBIENTES DIFERENTES.
Túnel 1 Túnel 2 Sombrite
ISOLADO M1 M2 M3 M4 M1 M2 M3 M4 M1 M2 M3 M4
1
3,00 0,00 0,00 0,00
8,67 1,33 0,00 0,00 6,50 0,50 0,00 1,50
2
0,67 0,00 0,00 0,00
0,00 0,00 0,00 0,00 1,17 0,00 0,00 0,00
3
6,17 0,00 0,00 0,00
7,33 0,00 0,00 0,00 7,17 1,00 0,00 0,00
4
7,00 0,00 0,00 0,00
10,00 3,67 0,00 0,00 8,25 0,33 0,00 0,00
5
1,33 0,00 0,00 0,00
5,17 0,00 1,33 0,00 4,83 0,00 0,00 0,00
6
2,00 0,00 0,00 0,00
4,67 1,50 0,00 0,00 0,33 0,50 0,00 0,00
7
4,50 1,17 0,00 0,00
4,50 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00
8
0,17 0,00 0,00 0,00
6,67 1,83 0,00 0,00 1,67 0,00 0,00 0,00
9
0,50 0,00 0,00 0,00
0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00
10
7,17 0,00 0,00 0,00
8,00 0,00 0,00 0,00 6,50 3,33 0,00 0,00
11
1,33 0,00 0,00 0,00
6,17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
12
8,50 0,00 0,00 0,00
2,83 0,00 0,00 0,00 8,00 0,33 0,00 0,00
Médias 3,53 0,10 0,00 0,00 5,33 0,69 0,11 0,00 3,83 0,50 0,00 0,13
99
ANEXO 4 - ANALISE DE VARIÂNCIA DO ENSAIO DE AGRESSIVIDADE EM
MUDAS DE Pinus taeda
FONTE DE
V
ARIA
Ç
ÃO GL QM F Nível de si
g
nificância
BLOCO 2 14,77 4,01 0,0191
TRATAMENTO 3 444,02 120,68 0,0000
LOCAL 11 20,42 5,55 0,0000
BLOCO X TRATAMENTO 6 7,51 2,04 0,0602
BLOCO X LOCAL 22 4,82 1,31 0,1633
TRATAMENTO X LOCAL 33 15,21 4,13 0,0000
BLOCO X TRATAMENTO X LOCAL 66 3,56 0,97 0,5536
ERRO 287 3,68
ANEXO 5 - ANALISE DE VARIÂNCIA PARA SECAMENTO DE PONTEIRO DO
ISOLADO MONOSPÓRICO SS1.3 DE Sphaeropsis sapinea INOCULADO EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata
FONTES DE
VARIAÇÃO
GL QM F P-LEVEL
BLOCO 3 1,296875 0,613603 0,609737
PROGÊNIES 15 2,198958 1,040414 0,434846
RESÍDUOS 45 2,113542
ANEXO 6 - ANALISE DE VARIÂNCIA PARA SECAMENTO DE PONTEIRO DO
ISOLADO MONOSPÓRICO SS2.4 DE Sphaeropsis sapinea INOCULADO EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata
FONTES DE
VARIAÇÃO
GL QM F P-LEVEL
BLOCO 3 0,250000 0,198238 0,897047
PROGÊNIES 15 1,695833 1,344714 0,216822
RESÍDUOS 45 1,261111
ANEXO 7 - ANALISE DE VARIÂNCIA PARA SECAMENTO DE PONTEIRO DO
ISOLADO MONOSPÓRICO SS4.10 DE Sphaeropsis sapinea INOCULADO EM
PROGÊNIES DE Pinus radiata
FONTES DE
VARIAÇÃO
GL QM F P-LEVEL
BLOCO 3 0,250000 0,198238 0,897047
PROGÊNIES 15 1,695833 1,344714 0,216822
RESÍDUOS 45 1,261111
100
ANEXO 8 - ANALISE DE VARIÂNCIA PARA TAMANHO DE LESÕES DO
ISOLADO MONOSPÓRICO SS1.3 INOCULADO EM PROGÊNIES DE Pinus
radiata
FONTES DE
VARIAÇÃO
GL QM F NÍVEL DE
SIGNIFICÂNCIA
BLOCO 3 6,566406 2,472948 0,073776
PROGÊNIES 15 3,997656 1,505541 0,143928
RESÍDUOS 45 2,655295
ANEXO 9 - ANALISE DE VARIÂNCIA PARA TAMANHO DE LESÕES DO
ISOLADO MONOSPÓRICO SS2.4 INOCULADO EM PROGÊNIES DE Pinus
radiata
FONTES DE
VARIAÇÃO
GL QM F NÍVEL DE
SIGNIFICÂNCIA
BLOCOS 3 1,170573 0,611260 0,611216
PROGÊNIES 15 2,083073 1,087757 0,611216
RESÍDUOS 45 1,915017
ANEXO 10 - ANALISE DE VARIÂNCIA PARA TAMANHO DE LESÕES DO
ISOLADO MONOSPÓRICO SS4.10 INOCULADO EM PROGÊNIES DE Pinus
radiata
FONTES DE
VARIAÇÃO
GL QM F NÍVEL DE
SIGNIFICÂNCIA
BLOCOS 3 3,983073 6,104164 0,001417
PROGÊNIES 15 0,462240 0,708394 0,762810
RESÍDUOS 45 0,652517
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