ads:
6
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE 17-NOR-SUBINCANADINA E,
UM ALCALÓIDE ISOLADO DE Aspidosperma ulei MARKGF.
SOBRE A MUSCULATURA LISA CAVERNOSA DE
COELHOS.
Otacílio Benvindo Deocleciano Júnior
Fortaleza – Ceará
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
7
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Otacílio Benvindo Deocleciano Júnior
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE 17-NOR-SUBINCANADINA E,
UM ALCALÓIDE ISOLADO DE Aspidosperma ulei MARKGF.
SOBRE A MUSCULATURA LISA CAVERNOSA DE
COELHOS.
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Vietla Satyanarayana Rao
Fortaleza – Ceará
2008
ads:
8
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, irmãos e amigos pelo apoio e compreensão durante a
realização deste trabalho.
Ao Professor Vietla Satyanarayana Rao pela orientação científica e
pessoal.
Ao Professor Nilberto Robson Falcão do Nascimento pela inestimável
colaboração na realização deste estudo.
Ao Professor Edilberto Rocha Silveira e Dr. Daniel Esdras de Andrade
Uchoa pelo fornecimento do alcalóide isolado.
À Roberta Dalcico por todos os momentos de felicidade e dedicação na
construção deste trabalho.
À professora Adriana Rolim por ter me confiado à continuação dos seus
estudos e pela amizade.
À professora Maria Angelina Medeiros, pelo incentivo desde o período da
graduação.
À todos os professores do curso de ciências farmacêuticas da
Universidade de Fortaleza.
À Professora Flávia Almeida e todos os amigos do Laboratório de
Produtos Naturais, Danilo, Cíntia, Silveria, Iana, Tiago Olinda, Marjorie, Ana
Carla, Deive, Carol Melo , Alana, Karine, Talita, Natália e D. Marta.
9
Aos Professores Pedro Jorge Caldas Magalhães, Jairo Diniz e Cléa
Florêncio, por terem participado da banca no exame de qualificação.
De forma especial agradeço à Karina Moreira, Clauber Mota e Paula
Priscila costa pelas incontáveis horas de trabalho realizados na UECE e pelas
várias madrugadas passados no laboratório.
À professora Claudia Ferreira Santos pelos inestimáveis ensinamentos e
ajuda.
Aos bolsistas do Laboratório de Produtos Naturais, Tiago Melo, Patrícia,
Sâmia, Daniel, Saulo, Rafaela e Rhaendell por todos os bons momentos
passados no laboratório.
Aos bolsistas do Laboratório de Farmacologia Cardiovascular da
Universidade Estadual do Ceará, Vitor, Ilana e Holivania.
Aos funcionários do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia e o Juciê pela presteza na entrega dos animais.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Alana,
Íris, Chiquinho, Fernando, Marta e Joana.
À secretária da Pós-Graduação, Aura Rhanes, pela amizade, eficiência e
gentileza.
A todos os professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia que
direta ou indiretamente contribuíram para o meu crescimento e realização deste
trabalho.
A CAPES e CNPq pelo suporte financeiro.
10
Tudo o que o homem faz com motivos pessoais é sem valor para o
Eterno. Para atingirmos a salvação e a união com Deus, havemos de agir sem
motivos egoístas, sem tomar em consideração o nosso próprio Eu pessoal,
entregando-nos a Vontade Divina como um instrumento na mão de Deus e, assim,
cumprindo o nosso dever por ser dever, sem pedir recompensas.
Bhagavad Gita
11
RESUMO
Estudos anteriores demonstraram que uma fração rica (F(3-5)) em alcalóides
indólicos extraída das cascas da raiz de Aspidosperma ulei Markgr. exibe função
pró-eretil in vivo e relaxamento em corpos cavernosos de coelhos in vitro. Um estudo
recente demonstrou que 17-nor-subincanadina E (SEC), um alcalóide extraído das
cascas do caule da mesma planta, apresentou atividade pró-eretil in vivo. O presente
trabalho teve por objetivo avaliar o efeito desse alcalóide sobre o tônus de diferentes
tipos de musculatura lisa de coelhos e investigar o mecanismo de ação da
substancia sobre o músculo liso cavernoso in vitro. Os tecidos foram montados em
banhos de 5 ml contendo solução de Krebs-Henseleit (CO
2
5% - O
2
95%; 37ºC). A
resposta relaxante máxima induzida por SEC (1 – 100 µg/ml) em segmentos de
corpos cavernosos de coelhos contraídos com fenilefrina (PHE-10µM) foi de 100%, e
apresentou um efeito relaxante preferencial para esse tecido, IC
50
[7, 174 (3,155 -
16,31) µg/ml]. SEC promoveu também relaxamento em anéis de aorta na presença e
na ausência de endotélio, IC
50
[29,76 (90,32 – 115,6) µg/ml] e IC
50
[26,13 (75,83 –
119,9) µg/ml], respectivamente, anéis de traquéia IC
50
[60,25 (0,330 – 109,8) µg/ml] e
em segmentos de duodeno IC
50
[76,78 (33,09 – 178,2) µg/ml]. O relaxamento
induzido por SEC (1 – 100 µg/ml) não foi afetado por bloqueadores adrenérgicos
(fentolamina e guanetidina), muscarínicos (atropina), ou bloqueadores dos canais de
potássio dependentes de ATP (K
ATP
)(glibenclamida) e ativados por cálcio (Kca)
(apamina e iberiotoxina) e nem na presença de L-NAME; a adição de ODQ (30 µM)
bloqueou o relaxamento induzido por SEC (79,1% ± 4,5%; p<0,05). Observou-se
também um aumento dos níveis teciduais de AMPc (331,95% ± 26,1%; p<0,05) e
GMPc (21,5% ± 4,2%; p<0,05). SEC (10 µg/ml e 30 µg/ml) potencializou o
relaxamento induzido por gliceriltrinitrato (GTN) e forskolina (FK) e foi capaz de
diminuir o relaxamento induzido pela estimulação por campo elétrico (ECE) (65,0% ±
10,9%; p< 0,05). SEC 15 µg/ml bloqueou a contração induzida por CaCl
2
1 - 300 mM
em corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com K
+
(40 mM), 0 Ca
++
. Nossos
resultados indicam que SEC manifesta atividade relaxante preferencial no músculo
liso cavernoso a nível periférico e que esse efeito está aparentemente relacionado
com um aumento dos níveis de AMPc e GMPc e um possível bloqueio do fluxo de
cálcio. Estes dados sugerem que Aspidosperma ulei Markgf. pode ser explorada
como uma alternativa para o tratamento da disfunção erétil.
Palavras-chave: Aspidosperma ulei, 17-nor-subincanadina E (SEC), Corpos
cavernosos de coelhos.
12
ABSTRACT
Past studies have shown that the indole alkaloidal rich fraction (F(3-5)) from
Aspidosperma ulei Markgr. root bark displays pro-erectile function in vivo and a
relaxant effect on isolated rabbit corpus cavernosum in vitro. Also, a recent study
demonstrated the in vivo pro-erectile like activity of 17-nor-subincanadina E (SEC),
an alkaloid isolated from stem bark of this plant.. This study aimed to assess further
the effect of SEC on the smooth muscle tone (spontaneous or induced) in vitro,
utilizing the strips of tracheal, intestinal, vascular and corpus cavernosal tissues of
rabbits. An attempt was also made to study the possible mechanism of SEC on rabbit
corpus cavernosum (RbCC). RbCC strips, were mounted in organ baths containing
Krebs solution. After equilibration, the tissues were precontracted with phenylephrine
(10 µM) or potassium (40mM). SEC (1 – 100 µg/ml) caused a concentration
dependent relaxation in the isolated rabbit corpus cavernosum precontracted with
phenylephrine and displayed comparatively greater relaxant effect on corpus
cavernosum IC
50
[7,174 (3,155 - 16,31) µg/ml], SEC produced concentration-
dependent relaxations of the aortic rings in endothelium intact and denuded
IC
50
[29,76 (90,32 – 115,6) µg/ml] and IC
50
[ 26,13 (75,83 – 119,9) µg/ml],
respectively, trachea rings IC
50
[60,25 (0,330 – 109,8) µg/ml], and of spontaneous
motility in segments of duodenum IC
50
[76,78 (33,09 – 178,2) µg/ml]. The relaxant
effect of SEC (1-100 µg/ml) on phenylephrine contraction was unaffected in the
presence of adrenergic blockers (phentolamine and guanethidine), muscarinic
blocker (atropine), K
ATP
channel blocker (glibenclamide), Ca
2+
-dependent K
+
channel
blockers (apamin and iberiotoxin), and in the presence of N-omega-nitro-L-arginine
methyl ester (L-NAME 100 µM)). However, the SEC relaxation was significantly
attenuated by ODQ (30 µ M) (79.1% ± 4.5%, p <0.05). Incubations of RbCC with
SEC (10 and 30 µg/mL ) caused significant increases of cGMP (21.5% ± 4.2%, p
<0.05) and cAMP (331.95% ± 26.1%, p <0.05) levels. Preincubation with SEC (10
and 30 µM) also significantly enhanced the relaxation response to the exogenous
NO-donor (GTN) and an activator of adenyl cyclase (forskolin). the relaxations
evoked by electrical stimulation was significantly decreased by SEC (10 µg/mL)
(65.0% ± 10.9%, p <0.05). The phasic component of the contraction induced by K+
40 mM as well as the maximal contraction elicited by increasing external Ca
2+
concentrations in depolarized corpora cavernosa was inhibited by SEC (15 µg/mL).
Our results indicate that SEC can induce comparatively a greater relaxant effect on
rabbit cavernosal tissue in vitro via a mechanism that involves an increase of cAMP
and cGMP levels and a blocking effect on calcium flux. These data suggest that
Aspidiosperma ulei Markgr. can be explored as an alternative for the treatment of
erectile dysfunction.
Keywords: Aspidosperma ulei, 17-nor-subincanadina E (SEC), relaxant effect, rabbit
corpus cavernosum (RbCC)
13
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1
Aspidosperma ulei Markgf. (A) árvores, (B) frutos e (C) flores.
25
2
Alcalóides presentes na fração (F(3-5)) extraída das cascas
da raiz de Aspidosperma ulei.
27
3
Mecanismo molecular periférico envolvendo ereção e
detumescência.
39
4
SEC (17-nor-subincanadina E) .
47
5
Isolamento de SEC (17-nor-subincanadina E)
48
6
Cromatograma de AU-8 obtido a partir da fração 10/2.
49
7
Esquema do banho de tecido isolado.
50
8
Montagem dos anéis de aorta em banho isolado.
51
9
Montagem dos anéis de traquéia em banho isolado.
52
10
Esquema do banho isolado de corpo cavernoso e da
aplicação do estímulo elétrico.
53
11
Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em
corpo cavernoso de coelhos.
56
12
Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por fenilefrina 10µM em segmentos de
corpos cavernosos de coelhos.
57
13
Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em
anéis de aorta na ausência e na presença de endotélio.
57
14
Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por fenilefrina 10 µM em anéis de aorta de
coelhos com endotélio.
58
14
15
Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por fenilefrina 10 µM em anéis de aorta de
coelhos sem endotélio.
58
16
Efeito de SEC sobre a contração induzida por carbacol em
anéis de traquéia de coelhos.
59
17
Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por carbacol 10 µM em anéis de traquéia
de coelhos.
60
18 Efeito de SEC sobre a atividade espontânea de duodeno. 60
19
Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC (1-100
µg/ml) sobre a atividade espontânea de segmento de
duodeno de coelhos.
61
20 Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença
de apamina, iberiotoxina e glibenclamida.
62
21 Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por fenilefrina 10µM na presença de
apamina 0,1 µM, iberiotoxina 0,1 µM e glibenclamida 10mM
em segmentos de corpos cavernosos de coelhos.
63
22 Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença
de atropina
64
23 Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC (1 – 100
µg/ml) na contração induzida por fenilefrina 10 µM em corpos
cavernosos de coelhos pré-tratados com atropina (10 µM).
64
24 Efeito sobre a contração induzida por potássio 40mM na
presença de guanetidina e fentolamina.
65
25 Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por solução despolarizante de K
+
40mM
(A) e na presença de guanetidina e fentolamina (10 µM) (B)
em segmentos de corpos cavernosos de coelhos.
66
26 Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença
de OQD.
67
27 Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por fenilefrina 10 µM na presença de ODQ
30 µM em segmentos de corpos cavernosos de coelhos.
68
28 Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença
de L-NAME.
69
15
29
Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na
contração induzida por fenilefrina 10 µM (A) e na presença de
L-NAME 100 µM (B) em segmentos de corpos cavernosos de
coelhos.
70
30 Efeito de SEC sobre a dosagem de GMPc tecidual. 71
31 Efeito de SEC sobre a dosagem de AMPc tecidual. 71
32 Efeito de SECsobre o relaxamento induzido por GTN. 72
33 Registro fisiográfico representativo do efeito relaxante de
GTN (1 - 3000 mM) em segmentos de corpos cavernosos
pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (A) e na presença de
SEC 10 µg/ml e 30 µg/ml (B e C). O traçado acima é
representativo de quatro experimentos.
73
34 Efeito de SEC sobre o relaxamento induzido por Forskolina. 74
35 Registro fisiográfico representativo do efeito relaxante de
forskolina (10
-9
- 10
-5
M) em segmentos de corpos cavernosos
pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (A) e na presença de
SEC 10 µg/ml e 30 µg/ml (B e C, respectivamente).
75
36 Efeito sobre o relaxamento induzido por estimulo elétrico
(ECE).
76
37 Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC sobre o
relaxamento induzido por estímulo elétrico transmural (ECE)
em corpos cavernosos isolados de coelho pré-contraídos por
fenilefrina (10µM).
77
38 Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 - 100 mM)
em corpos cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos
por solução despolarizante de K
+
40 mM; 0 Ca
++
na presença
e na ausência de SEC 3,5 µg/ml
78
39 Registro fisiográfico representativo do efeito de
concentrações cumulativas de CaCl
2
(1-100 µg/ml) na
contração induzida por solução despolarizante de K
+
40mM, 0
Ca
++
na presença ou ausência de SEC 3,5 µg/ml;
79
40 Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1-100 mM)
em corpos cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos
por solução despolarizante de K
+
40 mM; 0 Ca
++
na presença
e na ausência de SEC 7,5 µg/ml.
80
41 Registro fisiográfico representativo do efeito de
concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 - 300 µg/ml) na
contração induzida por solução despolarizante de K
+
40mM, 0
Ca
++
na presença ou ausência de SEC 7,5 µg/ml.
81
16
42 Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 - 100 mM)
em corpos cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos
por solução despolarizante de K
+
40 mM; 0 Ca
++
na presença
e na ausência de SEC 15 µg/ml.
82
43 Registro fisiográfico representativo do efeito de
concentrações cumulativas de CaCl
2
(1-300 µg/ml) na
contração induzida por solução despolarizante de K
+
40mM, 0
Ca
++
na presença ou ausência de SEC 15 µg/ml.
83
17
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
1 Exemplo das diferentes classes de alcalóides, sua origem e
utilização.
21
2 Tipos de acoplamento excitação-contração 32
3 Mecanismos de acoplamento eletromecânico 32
4 Mecanismo de acoplamento farmacomecânico. 33
5 Concentração inibitória 50% em base µg/ml, com seus
respectivos IC95%, de SEC em corpo cavernoso, aorta,
traquéia e duodeno de coelhos, pré-contraídos com fenilefrina
ou carbacol.
61
18
LISTA DE ABREVIATURAS
A.
Aspidosperma
Ach Acetilcolina
Atrop Atropina
AC Adenilato ciclase
AMPc Monofosfato de adenosina cíclico
ATP Trifosfato de adenosina
CaCl
2
Cloreto de cálcio
CaCl
2
6H
2
O Cloreto de cálcio hexahidratado
Ca
+2
Cálcio
Cl
-
Cloreto
CCD Cromatografia em camada delgada
CO
2
Dióxido de carbono
DE Disfunção erétil
DMSO Dimetil sulfóxido
ECE
Estimulação por campo elétrico
FDA
Food and Drug Administration
FK
Forskolin
GC
Guanilato ciclase
GMPc
Monofosfato de guanosina cíclico
19
GTN
Gliceriltrinitrato
GTP
Trifosfato de guanosina
Hz
Hertz
IC
50
Concentração inibitória 50%
IP
3
Trifosfato de inositol
K
+
Potássio
K
ATP
Canal de potássio dependente de ATP
K
Ca
Canal de potássio de alta condutância dependente de cálcio
KH
2
PO
4
Fosfato de sódio dibásico
KHS
Solução de Krebs-Henseleit
KCl
Cloreto de potássio
L-Arg
L-Arginina
L-NAME
L-nitro arginina metil éster
M Molar
M
3
Receptor muscarínico tipo 3
Mg
++
Magnésio
MgCl
2
6H
2
0 Cloreto de magnésio hexahidratado
MgSO
4
Sulfato de magnésio
N Número
Na
+
Sódio
NaCl Cloreto de sódio
20
NaHCO
3
Bicarbonato de sódio
NaH
2
PO
4
Fosfato de sódio
Na
2
SO
4
Sulfato de sódio
NA Noradrenalina
NANC Não adrenérgico não colinérgico
NIH National Institute of Health
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NOSe Óxido nítrico sintase endotelial
NOSn Óxido nítrico sintase neuronal
ODQ
1H-[1,2,4]Oxidiazole[4,3-a]quinoxalin-1-one
P Probabilidade
pH Potencial de hidrogênio
PHE Fenilefrina
PDE Fosfodiesterase
PGE
2
Prostaglandina E2
PGE
R
Receptor para prostaglandina E
PGF
2α
αα
α
Prostaglandina F2α
PKA Proteína quinase A
PKG Proteína cinase dependente de GMP
c
PLC Fosfolipase C
21
R
máx
Resposta máxima
RMN Ressonância magnética nuclear
SEC
17-nor-subincanadina E
SNC Sistema Nervoso Central
TTX Tetrodotoxina
UFC Universidade Federal do Ceará
USA United States of America
Vs
Versus
V Volt (s)
α
αα
α
Receptor adrenérgico alfa
β
ββ
β
Receptor adrenérgico beta
ω
ωω
ω
Omega
∅
Diâmetro
µ
µµ
µg
Micrograma (s)
µ
µµ
µM
Micromolar
22
SUMÁRIO
RESUMO 6
ABSTRACT 7
LISTA DE FIGURAS 8
LISTA DE TABELAS 11
LISTA DE ABREVIATURAS 12
1. INTRODUÇÃO 18
1.1. PLANTAS MEDICINAIS 18
1.2. ALCALÓIDES 20
1.3. O GENERO ASPIDOSPERMA
22
1.4. ASPIDOSPERMA ULEI MARKGF
24
1.5. FISIOLOGIA DO MÚSCULO LISO 29
1.6. O TECIDO ERÉTIL 37
1.7. DISFUNÇÃO ERÉTIL 40
2. OBJETIVOS 42
3. MATERIAIS 43
3.1. ANIMAIS 43
3.2. APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS 43
3.3. DROGAS E REAGENTES 44
3.4. SOLUÇÕES 45
4. MÉTODOS 46
23
4.1. ISOLAMENTO DE 17-NOR-SUBINCANADINA E (SEC)
46
4.2. EFEITO DE SEC SOBRE A MUSCULATURA LISA DE
COELHOS
49
4.2.1. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em
corpo cavernoso de coelhos
50
4.2.2. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em
anéis de aorta na ausência e na presença de endotélio
50
4.2.3 Efeito de SEC sobre a contração induzida por carbacol em
anéis de traquéia
51
4.2.4 Efeito de SEC sobre a atividade espontânea de duodeno 52
4.3. EFEITO DE SEC EM CORPOS CAVERNOSOS DE COELHOS 52
4.3.1. Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina ou potássio 53
4.3.2. Dosagem de GMPc e AMPc tecidual. 53
4.3.3. Efeito sobre o relaxamento induzido por campo elétrico 54
4.3.4. Efeito de SEC sobre contrações induzidas por CaCl
2
, numa
solução despolarizante zero cálcio
55
4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 55
5. RESULTADOS 56
6. DISCUSSÃO 84
7. CONCLUSÃO 94
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95
9. ANEXOS
24
1. INTRODUÇÃO
1.1. PLANTAS MEDICINAIS
As primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo homem
remontam às sagradas escrituras e ao papiro de Ebers. Este papiro foi encontrado
nas proximidades da câmara mortuária de Ramsés II; enumera mais ou menos 100
doenças e descreve um grande número de drogas de natureza animal e vegetal.
Durante o período anterior à era cristã, vários filósofos podem ser destacados por
suas obras sobre história natural. Dentre esses, sobressai-se Hipócrates,
considerado o pai da medicina moderna, que se caracterizou por tomar a natureza
como guia na escolha dos remédios (VILELA, 1977).
O uso de plantas medicinais no tratamento e na cura de enfermidades é
tão antigo quanto a civilização humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do país,
e até mesmo nas grandes cidades brasileiras, as plantas medicinais são
comercializadas em feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais
residenciais (MACIEL et al., 2002).
As plantas medicinais são uma das mais antigas armas empregadas para
o tratamento das doenças humanas e consistem em uma estratégia alternativa na
procura de novos agentes terapêuticos, uma vez que muito já se conhece a respeito
de seu uso por parte da sabedoria popular. Com os avanços científicos, esta prática
milenar perdeu espaço para os medicamentos sintéticos; entretanto, o alto custo
destes fármacos e os efeitos colaterais apresentados contribuíram para o
ressurgimento da fitoterapia (PINTO et al., 2002).
O uso das plantas medicinais pela população mundial ainda tem sido
muito significativo nos últimos tempos. Dados da Organização Mundial de Saúde
(OMS) estimam que cerca de 80% da população mundial utiliza, preferencialmente,
a medicina tradicional nos cuidados primários da saúde, sendo que a maior parte
25
das terapias tradicionais envolve o uso das plantas in natura ou produtos
manufaturados a partir de seus extratos ou princípios ativos (WHO, 1991).
No Brasil, cerca de 20% de nossa população consome 63% dos
medicamentos disponíveis e o restante encontra nos produtos de origem natural,
especialmente nas plantas medicinais, a única fonte de recurso terapêutico. Desta
forma torna-se essencial inventariar o potencial medicinal da flora do país para sua
preservação e uso sustentável, ressaltando ser indispensável a busca pela
conservação da espécie medicinal ameaçada (GUARRERA & MARIGNOLI, 2005).
A investigação de produtos naturais e de seus diversos metabólitos
continua sendo uma fonte potencial para o desenvolvimento de novas substâncias
com uso terapêutico e também que funcionem como ferramentas farmacológicas
indispensáveis para a compreensão de fenômenos moleculares complexos.
A exploração dos recursos vegetais pode levar à identificação de
metabólitos secundários valiosos, que sirvam como drogas, ou conduzir ao
desenvolvimento de novas drogas terapêuticas. O isolamento das primeiras
substâncias puras derivadas de plantas começou no século XVIII. Este século,
juntamente com o XIX, caracterizou-se pelos trabalhos de extração, principalmente
de ácidos orgânicos e de alcalóides. É desta época o isolamento da morfina (1806),
quinina e estriquinina (1820) (PINTO et al., 2002).
Diante da carência financeira, a fitoterapia é uma alternativa viável para a
maioria dos brasileiros. Se por um lado existe a necessidade de intensificação de
estudos com potenciais florísticos do Brasil, visando à descoberta ou comprovação
de plantas usadas popularmente, por outro é preciso reverter os conhecimentos
adquiridos em benefícios das pessoas e obter um maior envolvimento da classe
médica (MARINHO, 2007).
A Universidade Federal do Ceará vem realizando, de forma integrada, um
extenso trabalho de pesquisa sobre a flora nordestina, estudando diversos produtos
de origem natural. Dentre esses, as espécies produtoras de alcalóides são de
especial importância, dada a evidente atividade farmacológica dessas substâncias.
26
1.2. ALCALÓIDES
Alcalóides (termo lingüisticamente derivado da palavra árabe alquali,
denominação vulgar da planta da qual a soda foi originalmente extraída) são
compostos nitrogenados farmacologicamente ativos, encontrados
predominantemente nas angiospermas (KUTCHAN, 1995; EVANS, 1996).
Os alcalóides constituem-se num vasto grupo de metabólitos com grande
diversidade estrutural, representando cerca de 20% das substâncias naturais
descritas. Esse grupo químico tem apresentado um grande impacto através dos
tempos na economia, na medicina e em outros setores sociais e políticos. Os índios
da bacia amazônica utilizam o extrato seco da planta conhecida como curare,
contendo o alcalóide tubocurarina, para preparar dardos e flechas envenenados a
serem empregados na caça e nas guerras (ROBBERS et al., 1997).
Os alcalóides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal,
contudo, em um ou mais órgãos haverá o acúmulo preferencial dessas substâncias.
As funções destes compostos nas plantas não estão bem esclarecidas. Inicialmente,
foram atribuídos aos alcalóides os papéis de proteção, resultante da toxicidade
elevada que conferem ao vegetal. No entanto, acredita-se que os alcalóides atuem
também como reserva da síntese de proteínas, estimulantes ou reguladores do
crescimento, do metabolismo interno ou da reprodução, sendo, ainda, agentes finais
da desintoxicação e da transformação simples de outras substâncias, cujo acúmulo
pode ser nocivo ao vegetal (HENRIQUES et al., 2001).
O amplo espectro das atividades biológicas reportadas aos alcalóides
pode ser relacionado com sua variedade estrutural (tabela 1).
27
Tabela 1 – Exemplo das diferentes classes de alcalóides das plantas.
Classe
Exemplo
Origem
Piperidínicos
Nicotiana spp
Tropânicos
Atropa belladona L
Quinolínicos
Cinchona spp.
Isoquinolínicos
Papaver somniferum L.
Indólicos
Pausinystalia yohimbe
Imidazólicos
Pilocarpus spp.
Purínicos
Camellia sinensis
Aminas
alcaloídicas
Ephedra spp
Fonte : Dicionário de Especialidades Farmacêuticas 2006/2007
.
Teofilina
Pilocarpina
Quinina
Atropina
Nicotina
Morfina
Efedrina
Ioimbina
28
Diversos alcalóides são utilizados em terapêutica atualmente, puros (por
exemplo, os alcalóides indólicos, que são sempre usados na sua forma purificada)
ou em associação, e também na forma de derivados. Outros são utilizados como
matéria-prima para a síntese de fármacos (SIMÕES et al., 2004).
Os alcalóides do tipo indólico por sua vez, possuem grande importância
econômica devido às suas atividades farmacológicas. A atividade dos alcalóides
indólicos é, geralmente, mediada pela sua interação com um ou mais receptores
específicos. Podem atuar como agonistas ou antagonistas parciais nos receptores α-
adrenérgicos (ioimbina), serotoninérgico (reserpina), colinérgico (atropina) e
dopaminérgico (ergotamina) (SIMÕES et al., 2004).
Sabe-se que plantas do gênero Aspidosperma são detentoras de
alcalóides, principalmente do tipo indólico (JÁCOME et al., 2003). Até 1956 eram
conhecidos apenas quatro alcalóides indólicos isolados de espécies de
Aspidosperma. Atualmente, esse número ultrapassa 100 alcalóides (PEREIRA et al.,
2007).
1.3. O GÊNERO ASPIDOSPERMA
Plantas da família Apocynaceae estão incluídas fitogeneticamente na
ordem Gentiales e subclasse Asteridae, sendo consideradas como espécies
dicotiledôneas bem evoluídas e caracterizadas normalmente pela presença de látex.
Na flora brasileira são catalogadas como apocináceas mais de 400 espécies em 41
gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia (PEREIRA et al.,
2007).
Na família Apocynaceae, as espécies do gênero Aspidosperma são
encontradas apenas na América, principalmente entre o México e a Argentina. Além
da qualidade de suas madeiras, as cascas de espécies do gênero Aspidosperma
são usadas comumente na forma de infusões pela medicina popular da região
Amazônica. A baixa toxicidade e a ausência de contra-indicações dessas infusões
29
têm contribuído enormemente para a difusão do uso das cascas de Aspidosperma
(WENIGER et al., 2001; FERREIRA et al., 2004).
Como exemplos, a espécie A. ramiflorum é empregada no tratamento de
leishmaniose (FERREIRA et al., 2004). A espécie A. nitidum é utilizada como
anticonceptiva (RIBEIRO et al., 1999), no tratamento de inflamações de útero e
ovário, em diabetes, em problemas estomacais, contra câncer, febre e reumatismo.
Cascas de A. nitidum, A. album, A. discolor, A. excelsum e A. polineuron são usadas
por nativos de diferentes locais da Amazônia no tratamento da malária. A atividade
antimalárica atribuída a essas espécies foram comprovadas por testes in vitro e in
vivo (CARVALHO et al., 1991).
Cascas de A. quebracho blanco são usadas na região andina como
afrodisíaco e contra febre. No Brasil, essa espécie é usada também em casos de
enfisema, bronquite e pneumonia, bem como no tratamento de disfunção erétil,
contra sintomas da hiperplasia prostática benigna e em dispnéia asmática e cardíaca
(DEUTSCH et al., 1994) .
A família Apocynaceae caracteriza-se quimicamente pela ocorrência
freqüente de estruturas alcaloídicas. No caso de espécies de Aspidosperma, há
predominantemente a ocorrência de alcalóides indólicos de considerável diversidade
estrutural. Segundo a literatura, alcalóides indólicos constituem bons marcadores
quimiotaxonômicos para a classificação botânica das espécies de Aspidosperma
(PEREIRA et al., 2007).
Biologicamente, muitos alcalóides indólicos agem provavelmente nos
sistemas neurotransmissores opiáceos, GABAérgicos, colinérgicos, muscarínicos,
serotoninérgicos e dopaminérgicos (RIVAS et al., 1999). Por isso, são empregados
largamente como hipotensor arterial, simpatolítico, diurético, vasoconstrictor
periférico, estimulante respiratório, anestésico, agente bloqueador adrenérgico,
espasmogênico intestinal, sedativo e relaxante do músculo esquelético (GARRET et
al., 1995). Além disso, são responsáveis pelos efeitos alucinógenos do tabaco, de
bebidas e rapés utilizados por nativos da Amazônia, bem como pelas propriedades
sedativas do maracujá (ALLEN & HOLMSTEDT, 1980).
30
Ensaios biológicos de muitos alcalóides monoterpênicos isolados das
cascas de A. quebracho-blanco indicaram atividade bloqueadora α-adrenérgica e
ação inibitória de contrações de músculo liso de tecidos de diferentes animais além
de ação hipotensora e analgésica. Alcalóides das cascas das raízes e das folhas de
A. pyrifolium apresentam efeito hipotensivo forte na pressão arterial. Esse efeito foi
atribuído a alcalóides indólicos presentes nos extratos dessa espécie (CRAVEIRO et
al., 1983).
Muitos alcalóides indólicos isolados de espécies do gênero Aspidosperma
apresentam efeitos mutagênicos em Salmonella typhimurium, em culturas de células
mamárias e em células pulmonares, além de efeitos inibitórios sobre monoamino
oxidase em tecido animal, crescimento e mitose de fibroblastos cardíacos (NUNES
et al., 1992). A atividade desses alcalóides em células de eucariontes e procariontes
tem sido atribuída à sua capacidade de intercalação quando interagem com o DNA.
Outros alcalóides são parasiticidas e apresentam citotoxicidade em células
cancerosas. Testes contra a doença de Chagas mostram que esses alcalóides são
ativos contra epimastigotos de Tripanosoma cruzi. (PICADA et al., 1997; RIVAS et
al., 1999).
1.4. ASPIDOSPERMA ULEI MARKGF
De acordo com Renato Braga (BRAGA, 1979), Aspidosperma ulei Markgf,
popularmente conhecida como Pitiá, apresenta-se como uma “árvore com casca
áspera e acinzentada. Folhas alternas, pecioladas, lanceoladas, glabras. Flores
alvacentas, pequenas, agrupadas em panículas multifloras terminais. Frutos
capsulares, coriáceos, com sementes achatadas e aladas.” (figura 1).
31
Figura 1. Aspidosperma ulei Markgf. (A) árvores, (B) frutos e (C) flores.
Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira.
A
B
C
32
Em um artigo publicado em 1954, Banerjee utilizou uma solução de
alcalóides extraídos do caule de Aspidosperma ulei e os resultados encontrados
foram os seguintes:
1. Diminuição do efeito espasmogênico da acetilcolina no íleo e útero de
ratas e cobaias e no duodeno de coelhos e redução do efeito espasmogênico da
histamina no íleo e útero de ratas e cobaias;
2. Antagonismo do efeito espasmogênico da adrenalina no útero de
coelhas;
3. Diminuição dos batimentos cardíacos em coração isolado de coelho e
vasoconstrição em ratos;
4. Efeito estimulante central:
• Aumento da temperatura retal em camundongos
• Convulsões tônicas seguidas de morte em camundongos
• “Scratching” das patas traseiras, salivação e lacrimejamento em
coelhos.
5. Atividade amebicida.
Pesquisa no SciFinder Scholar v2006, do Chemical Abstracts, entre 1986
e 2006, usando como palavra-chave “Aspidosperma ulei”, mostrou que nenhum
outro estudo químico fora realizado com essa espécie.
Outros dois trabalhos de Schmutz et al. (1957) e Lehner e Schmutz
(1961), utilizando a casca da raiz de Aspidosperma ulei, mostraram a presença dos
alcalóides uleína, 1,2-dihidro-olivacina e 1,2-dihidro-elipticina. A uleína tem atividade
tripanomiscida (ABREU E SILVA et al., 2002) e interfere na contratilidade da
musculatura lisa vascular e não vascular e na contração induzida pelo cálcio em
útero e em aorta, aparentemente por uma ação direta sobre os canais de cálcio
(SOARES et al., 2004).
Apesar de a uleína ser o marcardor da Aspidoseprma ulei, este alcalóide
não é exclusivo desta espécie; existem relatos da presença da uleína nas espécies
33
A. australe, A. campus-belus, A. desamnthum, A. excelsum, A. eburneum, A.
gomesianum, A. formosamum, A. multiflorum, A. olivaceum, A. parvifolium, A.
pyricollum, A. subcanum, A. tomentosum, Alstonia scholaris, Alstonia undulifolia,
Himatanthus lancifolius, Plumeiai lancifolia (GARCIA & KEITH, 1976; FRANCA et al.,
2000; ABREU E SILVA et al., 2002; MASSIOT et al., 2002; JÁCOME et al., 2003;
SOARES et al., 2004; MACABEO et al., 2005).
O estudo de uma fração rica em alcalóides (SF
3-5
) (figura 2) das cascas
da raiz de A. ulei demonstrou um efeito pró-erétil em camundongos (CAMPOS,
2006). O resultado desse estudo aponta que SF
3-5
facilita a ereção peniana de
camundongos possivelmente através da modulação central de dopamina e de um
bloqueio de receptores α-
2
pré-sinapticos, com um subseqüente aumento na
liberação de óxido nitrico nos nervos e artérias penianas. Esse estudo comprovou o
uso tradicional de extratos de Aspidosperma em disfunção erétil.
Tetrahidro-3,14,4,21-elipticina nor-uleína
Uleína
Figura 2. Alcalóides presentes na fração (F(3-5)) extraída das cascas da raiz de A.
ulei.
N
N
H
ApA-I
N
N
H
H
ApA-II
3
N
N
H
H
34
Campos et al. (2007) verificaram o possível efeito relaxante de (F(3-5))
em tiras de corpos cavernosos isoladas de coelhos pré-contraídas com solução de
potássio (K
+
60 mM), prostraglandina (PGF
2α
10
-3
M), e fenilefrina (10 µM). A fração
SF
3-5
(1 - 300 µg/ml) relaxou tiras de corpos cavernosos de forma dose-dependente
e de modo reversível. Esse efeito relaxante não foi afetado na presença de atropina,
L-NAME, ODQ e em preparações pré-incubadas com tetrodotoxina, apamina,
caribdotoxina e glibenclamida. Os autores discutem que o efeito relaxante dessa
fração possa estar relacionado pelo menos em parte a um bloqueio do influxo de
cálcio ou de sua função.
Estudos recentes mostraram uma atividade pró-eretil de um alcalóide
indólico isolado das cascas do caule de Aspidosperma ulei - 17-nor-subincanadina E
(SEC). Neste experimento a clonidina (100 µg/kg/i.p), uma droga agonista dos
receptores α
2
, inibiu as ereções induzidas por SEC (25 mg/kg/i.p.), mostrando que
SEC pode estar atuando através do sistema noradrenérgico. O haloperidol (2
mg/kg/i.p) não induziu nenhuma resposta sexual nos camundongos. Os dados
obtidos após o tratamento combinado com SEC revelaram que o haloperidol, um
antagonista dopaminérgico não seletivo, inibe as ereções induzidas por SEC.
Baseado nos dados mencionados os autores sugeriram que o sistema
dopaminérgico pode ser responsável pela expressão do comportamento sexual
induzido por SEC em camundongos (CAMPOS et al; 2007).
Nesse mesmo estudo, a injeção intraperitonial do alcalóide (25 mg/kg/i.p.)
mostrou resultados semelhantes à ioimbina (2 mg/Kg). Uma vez que a ioimbina atua
tanto no sistema noradrenérgico como dopaminérgico (RODRÍGUEZ-MANZO, 1999)
é provável que SEC possua as mesmas ações, por também se tratar de um
alcalóide indólico. Além disso, os agonistas dopaminérgicos aumentam a atividade
da NO sintase e sabe-se que o NO participa na condução de importantes sinais intra
e extracelulares da função erétil (HEATON, 2000). Considerando isto, foi utilizado
um inibidor da NO sintase (L-NAME – 10 mg/kg/i.p), e verificou-se uma diminuição
da atividade de SEC.
35
Sendo assim, de acordo com os resultados obtidos no estudo
anteriormrnte descrito, constatou-se que SEC induz ereção peniana em
camundongos e que os sistemas noradrenérgico, dopaminérgico e nitrérgico podem
estar envolvidos nesta ação.
Pelo exposto, verifica-se que os estudos in vitro e in vivo sobre a atividade
das drogas na musculatura lisa cavernosa requerem conhecimentos profundos dos
mecanismos envolvidos na contração e relaxamento muscular. Sendo assim, a
próxima sessão destina-se a descrever tais mecanismos, e a fisiologia do músculo
liso.
1.5. FISIOLOGIA DO MÚSCULO LISO
As células musculares não estriadas ou lisas são um dos principais
componentes das vias aéreas, vasculatura, canal alimentar, trato urogenital e outros
sistemas. O músculo liso deve desenvolver força ou se encurtar para gerar
motilidade ou para alterar as dimensões de um órgão. O músculo liso também deve
ser capaz de realizar contrações econômicas (isto é, consumindo o mínimo de
trifosfato de adenosina, ATP), sustentadas ou tônicas, para manter as dimensões
dos órgãos contra as cargas impostas. Por exemplo, os vasos sanguíneos devem
ser capazes de resistir à pressão arterial. Em órgãos ocos, as células dos músculos
lisos são mecanicamente acopladas, o que lhes permite funcionar de um modo
altamente coordenado (BERNE & LEVY, 2004).
O músculo liso é uma estrutura de grande importância para os
profissionais da área de saúde uma vez que seu comportamento anormal participa
de uma gama de enfermidades como hipertensão, aterosclerose, coronariopatia,
asma, distúrbios intestinais, disfunção erétil, entre outras (MURPHY & BRAYDEN,
1995).
A atividade contrátil do músculo liso cavernoso, vascular, traqueal e
intestinal pode ser alterada por um grande numero de compostos orgânicos, que
podem ser estimulantes ou relaxantes. Produtos naturais também são
potencialmente ativos em processos celulares alterando a conformação de canais
36
iônicos, interferindo em mecanismos de transdução ativados por proteína G ou
mesmo funcionando como bloqueadores de canais (DRUMOND & HUGES, 1987).
A membrana da célula muscular lisa contém muitos tipos diferentes de
proteínas receptoras que podem iniciar ou inibir o processo contrátil (KNOT et al.,
1996). Dessa forma, o músculo liso pode ser ativado por múltiplos tipos de sinais:
por sinais nervosos, por estimulação hormonal ou por estiramento do músculo
(KOTECHA & NEILD, 1955; MEISS, 1989; SATO, 1994 NIXON et al., 1994).
O controle nervoso dos músculos lisos é feito pelo sistema nervoso
autônomo. As divisões simpáticas e parassimpáticas apresentam diferenças
anatômicas, farmacológicas e funcionais. Estas divisões, frequentemente
antagônicas, funcionam integradamente para a manutenção da constância do meio
interno, ou seja, da homeostase (LIVINGSTRON, 1991). No que diz respeito às
diferenças farmacológicas, o mediador neuromuscular no simpático é principalmente
a noradrenalina e no parassimpático a acetilcolina (ZHANG & LANG, 1994).
Um exemplo do controle do músculo liso pelo sistema parassimpático é o
trato respiratório, que recebe inervação colinérgica parassimpática através do nervo
vago, que quando estimulado produz uma rápida broncoconstrição, que é bloqueada
pela atropina. Apesar de existir uma grande população de receptores muscarínicos
nas vias aéreas, estudos in vitro demonstram claramente que os receptores M
3
atuam de maneira importante na resposta contrátil desse tecido (WHITE, 1995).
Em músculo liso existem evidências da participação de uma outra via
neuronal que não é de natureza adrenérgica e nem colinérgica. Foi proposto que o
óxido nítrico (NO) atua como um neurotransmissor não-adrenérgico não-colinérgico
(NANC) das fibras nervosas pós-ganglionares parassimpáticas, inervando uma
variedade de músculos lisos incluindo os corpos cavernosos e o músculo liso
vascular (TODA et al., 2005). A descoberta da inervação nitrérgica das células do
músculo liso vascular tem revelado um novo entendimento do controle neurogênico
na função desse músculo. O sistema de transdução de sinais que promove o
relaxamento do musculo liso vascular é produzido sistema nitrérgico através
37
ativação da guanilato ciclase, com a conseqüente produção de GMPc (SCHMIDT et
al., 1993).
O acoplamento exitação-contração no músculo liso pode ser de dois tipos:
eletromecânico e farmacomecânico (tabela 2). No primeiro caso (eletromecânico) a
contração se origina em decorrência da despolarização da membrana (Em), e no
segundo (farmacomecânico) ocorre através da estimulação por fármacos,
neurotransmissores, autacóides e hormônios receptores de membrana, sem que
haja alterações no Em ou necessitando-as em valores muito baixos (REMBOLD,
1996). O desencadeamento da contração pode ocorrer pela combinação dos dois
mecanismos (SOMLYO e SOMLYO, 1968; RASSMUNSSEN et al. 1987).
No acoplamento eletromecânico, a regulação da força de contração
depende do potencial de membrana (Em). A despolarização da membrana ativa
canais de cálcio tipo L, dependentes de voltagem, com conseqüente aumento no
influxo de cálcio. O aumento na concentração de cálcio intracelular leva à contração.
A hiperpolarização desativa estes canais, diminui o influxo de cálcio e leva ao
relaxamento muscular (REMBOLD, 1996).
A despolarização da membrana pode ocorrer tanto diretamente – por
estimulação elétrica ou pelo aumento na concentração extracelular de potássio
(HERMSMEYERR, et al., 1988) – como indiretamente, por ação de um agonista
(tabela 3) (CHEN & REMBOLD, 1995).
O acoplamento farmacomecânico refere-se à regulação da força de
contração independente da mudança no potencial transmembrana (tabela 4).
Envolve alterações na concentração de cálcio intracelular e na força de contração
(além daquela induzida pela despolarização) ou na resposta celular ao cálcio. No
acoplamento farmacomecânico, a alteração na concentração de cálcio intracelular
pode ocorrer tanto por liberação de cálcio como por influxo de cálcio mediados por
receptor (REMBOLD et al., 1991; MAJERUS, 1992; LEE & AARHUS, 1993; EXTON,
1994; REMBOLD, 1996).
38
Tabela 2. Tipos de acoplamento excitação-contração
Tabela 3. Mecanismos de acoplamento eletromecânico
Tipo Característica Referência
Eletromecânico Mudança no Em (Despolarização) SOMLYO & SOMLYO,1968
Farmacomecânico Independente do Em
SOMLYO & SOMLYO,1968
Tipo Estímulo Referência
Despolarização Direta Estímulo elétrico HERMSMEYER et. al., 1988
↑ [K]
0
Despolarização dependente Norepinefrina HAUESLER E DE PEYER, 1989
de agonista Serotonina MC PHERSON E ANGUS, 1991
Endotelina NEILD E KOTECHA, 1987
Histamina KEFF E BROWEN, 1989
39
Tabela 4. Mecanismos de acoplamento farmacomecânico.
Mecanismo Agonista Referência
Alteração na [Ca
++
]
i
- Liberação de Ca
++
Noradrenalina/α
1
BERRIDGE, 1987
mediada por receptor Angiotensina/AT
1
KOBAYASHI et. al., 1988
Histamina/H
1
CHILVERS ET AL., 1989
Trombina
- Influxo de Ca
++
ATP BENHAM E TISEN, 1987
mediado por receptor Carbacol GANITKEVICH, 1990
Alteração na resposta celular ao Ca
++
KITAZAWA E SOMLYO, 1990
REMBOLD, 1992
40
Norepinefrina (HAEUSLER & DE PEYER, 1989; NELSON et al., 1988;
NEILD & KOTECHA, 1987), histamina (DROOGMANS et al., 1977; CASTEELS &
SUZUKI, 1980; KEEF & ROSS, 1986; KEFF & BOWEN, 1989), 5-hidroxitriptamina
(NEILD & KOTECHA, 1987) e endotelina (McPHERSON & AGNUS, 1991)
despolarizam a célula do músculo liso e, conseqüentemente, ativam canais de cálcio
tipo L. A ativação desses canais aumenta o influxo de Ca
++
, o que leva à contração.
Na contração induzida por agonistas farmacológicos parece existir pouco
envolvimento do Ca
++
extracelular para iniciar a contração. Ações de tais agonistas
dependem mais do Ca
++
liberado de estoques intracelulares, pelo mecanismo de
liberação de cálcio induzida por cálcio e também pela produção de IP
3
(SOMLYO et
al., 1985; HAROOTUNIAN et al., VALDIVIA et al., 1992; MISSIAEN et al., 1992;
ROJAS et al., 1992; NOGUEIRA & D’OCON, 1993; STORK & COCKS, 1994). Esses
agonistas farmacológicos podem também aumentar diretamente a condutância
através de canais de Ca
++
tipo L sem alterações no potencial de membrana
(NELSON et al., 1988).
Estudo em cultura de células musculares lisas de traquéia de uma
variedade de espécies têm demonstrado que bradicinina, carbacol e histamina,
induzem uma hidrólise dos fosfolipídios da membrana e a geração de inositol-
trifosfato (IP
3
) e diacilglicerol (DAG), alterando as concentrações intracelulares de
cálcio. Esse aumento nas concentrações intracelulares de cálcio desenvolve um
papel fundamental na contração muscular observada in vitro (AMRANI et al., 1995).
Em preparações musculares lisas intestinais, a ativação de receptores
muscarínicos geralmente produz contração in vitro. A estimulação com carbacol, por
exemplo, produz uma contração inicialmente fásica, seguida por um componente
tônico, ambos reduzidos por nifedipina ou pela retirada de cálcio extracelular (OHTA,
1991). Estudos em estimulação nervosa colinérgica mostram que, no músculo liso
intestinal, a resposta obtida é um aumento na condutância do sódio e do cálcio,
41
promovendo despolarização e aumentos na descarga de potenciais de ação
(HOYLE & BURNSTOCK, 1989).
No músculo liso intestinal, bem como em outros tipos de músculo liso, os
adrenoceptores são membros de uma família de receptores acoplados a proteínas G
intermediárias de sistemas efetores (SCHWINN, 1993). A norepinefrina atua na
supressão da liberação de acetilcolina de fibras nervosas colinérgicas pela ativação
dos receptores α
2
, podendo também atuar através da hiperpolarização e diminuição
da atividade elétrica espontânea (BULBRING & TOMITA, 1987).
Seja no acoplamento eletromecânico ou farmacomecânico, o mediador
final é geralmente um aumento da concentração de Ca
++
no citoplasma, o qual é
necessário para fosforilação das cadeias leves de miosina que desencadeará o
processo contrátil. A elevação da concentração intracelular de cálcio [Ca
++
]
i
pode ser
produzida pelos seguintes eventos: (1) Influxo de Ca
++
através dos canais de cálcio
dependentes de voltagem (canais lentos ou canais tipo L e canais rápidos ou canais
tipo T); (2) Liberação do Ca
++
existente em estoques intracelulares (retículo
sarcoplasmatico), induzida pelo cálcio ou pelo inositol trifosfato (IP
3
) ou ambos; (3)
Troca Na
+
/Ca
++
operando de maneira reversa; (4) Inibição da bomba de Ca
++
ATPase
(SPERELAKIS, 1993; PACAUD & LOIRAND, 1995).
Estabelecida uma contração, o relaxamento das células musculares lisas
pode acontecer por vários tipos de processos que, na maior parte dos casos, passa
por redução da [Ca
2+
]
i
. Nas células musculares lisas, a liberação de óxido nítrico
(NO) dos nervos e do endotélio inicia uma cascata de sinalização, pela qual a
ativação da guanilato ciclase solúvel (GCs) eleva os níveis de GMPc, que por sua
vez pode interagir com proteínas efetoras como: canais iônicos, fosfodiesterases e
proteínas quinases. Esse mecanismo está bem estabelecido em células da
musculatura lisa cavernosa (ÜCKERT, et al., 2004).
A redução na [Ca
2+
] citoplasmática mediada pelo GMPc pode ser
produzida por alguns mecanismos como: abertura de canais de K
+
, que causa
42
hiperpolarização da célula e posterior diminuição do influxo de Ca
2+
pelos canais
tipo-L (THORNBURY et al., 1991; ROBERTSON et al., 1993); diminuição direta do
influxo de Ca
2+
através de canais do tipo-L independente da alteração no potencial
da membrana (Em) como os efeitos do 8-bromo-GMPc em células musculares
vasculares (ISHIKAWA et al., 1993); ativação da bomba Ca
2+
-ATPase do retículo
sarcoplasmático e da membrana plasmática, dependentes de GMPc com
conseqüente diminuição do Ca
2+
livre no citoplasma (POPESCU et al., 1985;
TWORT & VAN BREEMEN,1988); aumento da atividade trocadora Na
+
/Ca
2+
(ITOH
et al., 1983).
Dessa forma, substâncias que aumentam as concentrações de GMPc
relaxam o músculo liso por uma redução da [Ca
2+
]i em células isoladas e tecidos
intactos (RAPOPORT et al., 1985; KARAKI et al, 1988; WORD et al., 1991; MC
DANIEL et al., 1992).
Também pode ocorrer relaxamento muscular liso por hiperpolarização
celular devida a aumento da probabilidade de abertura de canais K
Ca
e K
ATP
mediada
por aumento da concentração de AMPc (ANWER et al., 1992; QUAYLE et al., 1994).
Entretanto, assim como o GMPc, o AMPc também pode ser considerado capaz de
diminuir a [Ca
2+
]i por diminuição do influxo de Ca
2+
, apresentando efeitos diretos
sobre os canais de Ca
2+
do tipo-L (REMBOLD, 1996). O mecanismo primário para a
diminuição da [Ca
2+
]i provocada pela elevação do AMPc é a ativação da proteína
quinase G (GMPc-dependente) (LINCOLN et al., 1990).
Outra ação do AMPc pode ser a diminuição da sensibilidade ao Ca
2+
intracelular. A ativação de proteínas-quinases dependentes de AMPc produz
fosforilação da quinase de cadeia leve da miosina em determinados sítios in vitro e
isso pode diminuir sua sensibilidade ao cálcio.
Embora o mecanismo mais aceito para a regulação da contração de
músculo liso seja o da ativação da quinase da cadeia leve de miosina dependente
de [Ca
++
]
i
(HARTSHORNE, 1987; RASMUSSEN et al., 1987), evidências sugerem
43
que a regulação entre [Ca
++
]
i
e a fosforilação da cadeia leve de miosina é variável e
depende da forma de estimulação (REMBOLD, 1990 e 1992; TANG et al., 1992). A
dependência relativa da fosforilação da cadeia leve da miosina da [Ca
++
]
i
foi
chamada de sensibilidade da maquinaria contrátil ao Ca
++
. Esta sensibilidade é alta
quando um aumento relativamente pequeno na [Ca
++
]
i
induz um grande aumento na
fosforilação da miosina. Inversamente, a sensibilidade é baixa quando um aumento
relativamente grande na [Ca
++
]
i
induz um pequeno aumento na fosforilação da
miosina (KITAZAWA & SOMLYO, 1990; HIMPENS et al., 1990; STULL et al., 1990;
OZAKI et al., 1991; HIMPENS et al., 1995).
1.6. O TECIDO ERÉTIL
O tecido erétil dos corpos cavernosos é composto por inúmeros espaços
lacunares interconectados, revestidos por células endoteliais, além de trabéculas,
que formam as paredes das lacunas e consistem em bandas espessas de músculo
liso e uma estrutura formada por fibroblastos, colágeno e elastina (GOLDESTEIN et
al., 1982; KRANE et al.,1989). Os corpos cavernosos são divididos por um septo
perfurado, que os permite funcionar como uma unidade.
A ereção desejada inicia-se por um estímulo psíquico e uma resposta
neurológica que irá mediar uma serie de alterações vasculares. Ao estado de
flacidez peniana corresponde um momento de contratura de sua musculatura lisa,
que opõe resistência à entrada de fluxo de sangue arterial nas cavernas; quando
esta contratura desaparece, o fluxo arterial aumenta e surge a ereção. No tecido
erétil, um balanço entre os fatores contráteis e relaxantes controla o grau do tônus
da vasculatura e do músculo liso dos corpos cavernosos e determina o estado
funcional do pênis: detumescência e flacidez, tumescência e ereção (CANOGIA,
1992).
A presença e distribuição das fibras noradrenérgicas na vasculatura
peniana (artérias e veias) e músculo cavernoso foi descrita em vários estudos
(BENSON et al., 1980). Os receptores α
1
noradrenérgicos estão localizados na
44
membrana pós-sináptica e são responsáveis pelo efeito contrátil da noradrenalina
(NA) no tecido erétil, já os receptores α
2
estão localizados na membrana pré-
sináptica nas terminações nervosas noradrenérgicas e inibem a função
noradrenérgica (DHABUWALA et al., 1985).
Além da inervação noradrenérgica, todos os tecidos penianos de animais
e humanos recebem uma rica inervação colinérgica (DAIL, 1993; HEDLUND et al.,
1999, 2000). A acetilcolina (Ach) liberada desses nervos atua em receptores
muscarínicos localizados no músculo liso cavernoso e endotélio (TRAISH et al.,
1995). O receptor muscarínico existente no músculo liso cavernoso é o subtipo M
2
(TOSELLI et al., 1994; TRAISH et al., 1995).
Furchgott e Zawadaski (1980) relataram que a Ach relaxava leitos
vasculares apenas na vigência de um endotélio íntegro, sugerindo que essas células
produziam uma substância responsável pela resposta inibitória evocada pela Ach,
através de receptores M
2
localizados no endotélio. Essa substância foi denominada
de fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF). Estudos subseqüentes
revelaram que o EDRF era química e farmacologicamente indistinguível do NO
(PALMER et al., 1987; IGNARRO et al., 1987a; b).
Um importante papel para o NO no relaxamento dos corpos cavernosos e
na vasculatura é largamente aceito (BURNETT, 1997; TODA et al., 2005). O NO
pode ser produzido pelo endotélio e/ou pela inervação NANC dos corpos
cavernosos.
Existe um consenso de que o NO é um pré-requisito para a geração e
manutenção da pressão intracavernosa e da ereção peniana. A síntese de NO e a
conseqüente ligação do NO à guanilil ciclase (GC) é essencial para o processo erétil.
(ANDERSSON, 2001).
Estudos revelaram que a infusão de inibidores da NOS em ratos
antagoniza a ereção peniana induzida pela estimulação elétrica das terminações
NANC do músculo liso trabecular cavernoso (ANDERSSON, 1995). Os inibidores da
45
GC também inibem o relaxamento dos corpos cavernosos induzido por estimulação
elétrica, bem como por ACh ou por doadores de NO, confirmando a via do GMPc no
mecanismo de relaxamento do corpo cavernoso (IGNARRO et al., 1990; PICKARD
et al., 1991; KIM et al., 1991; HOLMQUIST et al., 1992; HAYASHIDA et al., 1996;
RECIO et al., 1998; HEDLUND et al., 1999).
A figura abaixo resume os mecanismos envolvidos no controle da ereção
e os possíveis locais de ação de drogas pró-eréteis.
Figura 3. Mecanismo periférico envolvendo ereção e detumescência. Esquema
conceitual envolvendo mecanismos de regulação do tônus da musculatura lisa
cavernosa, bem como o mecanismo de ação do tratamento farmacológico da
disfunção erétil. AC – adenilato ciclase, AA – acido araquidônico, eNOS – óxido
nítrico sintase endotelial, NO – óxido nítrico, GC – Guanilato ciclase, L-Arg – L-
arginina, IP3 – Inositol trifosfato, PLC – Fosfolipase C.
Noradrénergico
M
3
M
3
ENDOTÉLIO
O
Colinérgico
Ach
Ca
++
, IP
3
eNOS
O
2
NO
L-Arginina
Ca
++
, IP
3
PGE
2
AA
Prostaglandina
G/H Sintase
NO
GC
GMPc
AMPc
Ca
++
Relaxamento
AC
Forskolin
α
1
α
2
NE
Fentolamina
-
AMPc
IP
3
Ca
++
Contração
Sildenafil
5’GMP
Papaverina
5’AMP
PLC
ET
ET
A/B
PGE
2
EP
2,4
PGE
1
+
NANC
46
1.7. DISFUNÇÃO ERÉTIL
Segundo o Instituto Nacional de Saúde Norte-Americano, a disfunção
erétil (DE) é conceituada como a incapacidade persistente de obter ou manter uma
ereção adequada para permitir uma relação sexual satisfatória, é, portanto, diferente
de perda da libido, ejaculação precoce ou ausência de orgasmo (NIH, 1993). Estima-
se que, em âmbito mundial, aproximadamente 100 milhões de homens apresentem
DE. No Brasil, estima-se que 11 milhões de homens sofram de algum grau de DE
(GONÇALVES et al., 2007).
Estudos populacionais como o Massachusetts Male Aging Study,
utilizando questionários para avaliação da qualidade da ereção, demonstram um
aumento da incidência de DE relacionado com a faixa etária (CHAPPEL et al., 1998).
Um estudo de coorte de base populacional realizado na cidade de Salvador
comprovou que a incidência de DE aumenta com a idade, variando de 33 novos
casos por ano por 1.000 homens entre 40 e 49 anos a até 190 novos casos por ano
para cada grupo de 1.000 homens com idade entre 60 e 69 anos. Fazendo-se uma
projeção desses dados, estima-se a ocorrência anual de aproximadamente
1.025.600 novos casos de DE em todo o Brasil (FERREIRA & SANTOS, 2005).
Quando o óxido nítrico passou a ser reconhecido como mediador da
ereção, em 1992, um considerável número de pesquisas voltou-se para o
entendimento dos mecanismos dessa patologia e um grande número de publicações
foi realizado nesse campo. Concomitante com a evidência cientifica, uma grande
campanha tem sido lançada nos últimos anos para chamar a atenção do homem
para a importância do seu bem estar sexual (CIRINO, 2005).
A causa da disfunção erétil masculina é classificada com freqüência como
psicológica ou orgânica. A etiologia orgânica, o maior grupo, compreende os casos
de origem vascular, neurológica ou hormonal (MILLER, 2000). Neste, há que se
incluir a DE por anormalidades ou lesões que compreendem o músculo liso
47
cavernoso. A de causa psicológica ocorre por inibição central do mecanismo de
ereção, sem que haja um componente físico definido (MELMAN, 1999).
Recentemente, os inibidores seletivos para fosfodiesterase 5, sildenafil,
tadalafil e vardenafil tornaram-se a opção de tratamento para a disfunção erétil, mas
o uso dessas drogas apresenta contra-indicações, como a administração
concomitante de nitratos ou de bloqueadores α-adrenérgicos. Além disso, existem
relatos de distúrbios visuais e cardiovasculares não desejados, presumivelmente
devido à expressão diferencial de enzimas fosfodiesterase em vários tecidos, e à
seletividade dessas enzimas
Portanto, formas alternativas de tratamento médico permanecem
clinicamente interessantes, incluindo extrato de plantas, que muitos pacientes
preferem como modalidade de tratamento.
A pesquisa por produtos naturais pode freqüentemente dar contribuições
substanciais para inovação das drogas, uma vez que provê novas estruturas
químicas e/ou mecanismos de ação. Muitos extratos de plantas são tradicionalmente
empregados em diferentes culturas para melhorar a performance sexual. Existem
evidencias de que alguns alcalóides derivados de plantas tais como papaverina,
apomorfina, berberina e ioimbina podem ser úteis para a impotência e a disfunção
erétil. Recentemente uma atenção tem sido voltada para atividade pró-eretil de
substâncias presentes nas espécies do gênero Aspidosperma.
48
2. OBJETIVOS
Há um crescente interesse das diferentes especialidades médicas pelo
uso cada vez maior de produtos de origen naturail; sendo assim, a introdução de
substâncias naturais com atividade pró-eretil vem se tornando cada vez mais
relevante, pela facilidade com a qual podem ser encontradas e principalmente pelo
baixo custo quando comparadas aos medicamentos atualmente prescritos.
Dentre esses agentes, estudos iniciais com frações ricas em alcalóides da
planta Aspidosperma ulei Markgf têm se mostrado promissores no relaxamento da
musculatura lisa peniana. O presente estudo teve como objetivo geral a investigação
do efeito relaxante sobre musculatura lisa de 17-nor-subincanadina E (SEC), um
alcalóide indólico isolado das cascas do caule de Aspidosperma ulei Markgf.
O estudo teve como objetivos específicos:
1. Avaliar o efeito de SEC em diferentes tipos de tecido muscular liso
corpo cavernoso, aorta, traquéia e duodeno in vitro;
2. Verificar o possível efeito relaxante de SEC sobre a musculatura lisa
cavernosa de coelhos in vitro pré-contraídos com fenilefrina ou potássio;
3. Elucidar o envolvimento dos sistemas adrenérgico, colinérgico e
nitrérgico, bem como o envolvimento dos canais de potássio e cálcio na ação da
droga.
49
3. MATERIAIS
3.1. ANIMAIS
Foram utilizados coelhos Nova Zelândia, pesando entre 2,0 – 3,0 kg,
obtidos no setor de Cunicultura do curso de Zootecnia da Universidade Federal do
Ceará. Os procedimentos obedeceram aos padrões e critérios da Comissão de Ética
em pesquisa animal da Universidade Federal do Ceará, sob protocolo Nº 39/04
(Anexo 1).
3.2. APARELHOS E INTRUMENTOS LABORATORIAIS
Produto Origem
Agitadores magnéticos Fanem, Brasil
Agulhas descartáveis BD, Brasil
Balança analítica Marte AL 200, Brasil
Balança para pesagem de animais Filizola, Brasil
Banho Maria Quimis, Brasil
Bomba para aeração Rebello & Ferreira, Brasil
Cronômetros Technos, Brasil
Material cirúrgico Edlo, Brasil
PHmêtro Alalion-MP 608, Brasil
Pipetas automáticas Jencons , UK
Pipetas Pasteur Unilab, Brasil
Ponteiras plásticas para pipetas Unilab, Brasil
Polígrafo Narco Biossystems, USA
Seringas descartáveis BD, Brasil
Transdutores isométricos Ugo Basile, Varese Itália
Vidrarias Vidrolabor, Brasil
50
3.3. DROGAS E REAGENTES
Produto Origem
Acetilcolina Sigma, USA
Água destilada UECE, Brasil
Apamina Sigma, USA
Bicarbonato de sódio Vetec, Brasil
Carbogênio White Martins, Brasil
Cloreto de cálcio Vetec, Brasil
Cloreto de cálcio hexahidratado Vetec, Brasil
Cloreto de magnésio Hexahidratado Quimex, Brasil
Cloreto de potássio Vetec, Brasil
Cloreto de sódio Vetec, Brasil
DMSO Pro Analysis, Brasil
Fenilefrina Sigma, USA
Fentolamina Sigma, USA
Forskolina Sigma, USA
Fosfato de sódio dibásico Synth, Brasil
Glibenclamida Sigma, USA
Glicose Vetec, Brasil
Guanetidina Sigma, USA
Iberiotoxina Sigma, USA
Indometacina Prodome, Brasil
L-NAME Sigma, USA
ODQ Sigma, USA
SEC UFC, Brasil
Sulfato de magnésio Quimex, Brasil
Sulfato de sódio Vetec, Brasil
51
3.4. SOLUÇÕES
As seguintes soluções foram preparadas com sais de pureza analítica:
3.4.1. Krebs-Henseleit
Composição em mmol/L: NaCl 120; KCl 4,7; CaCl
2
1,8; MgCl
2
1,43;
NaHCO
3
25,0; KH
2
PO
4
1,17 e Glicose 11.
3.4.2. Krebs-Henseleit sem Ca
++
Composição em mmol/L: NaCl 120; KCl 4,7; MgCl
2
1,43; NaHCO
3
25,0;
KH
2
PO
4
1,17 e Glicose 11.
3.4.3. Krebs-Henseleit despolarizante (K
+
40mM)
Composição em mmol/L: NaCl 120; KCl 40; CaCl
2
1,8; MgCl
2
1,43;
NaHCO
3
25,0; KH
2
PO
4
1,17 e Glicose 11.
3.4.4. Carbogênio
Mistura gasosa de CO
2
a 5% e O
2
a 95%.
52
4. MÉTODOS
4.1. ISOLAMENTO DE 17-NOR-SUBINCANADINA E (SEC)
A planta, conhecida como pitiá, foi coletada pelo professor Edilberto
Rocha Silveira (Departamento de Química Orgânica e Inorgânica – UFC) na
localidade de Garapa em Acarape no Estado do Ceará. A espécie foi identificada no
Herbário Prisco Bezerra da UFC e catalogada (exsicata nº 30823).
O isolamento de 17-nor-subincanadina E (SEC) foi realizado no
laboratório de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará,
que se encontra sob supervisão do professor Edilberto Rocha Silveira.
Quatro quilos das cascas do caule de Aspidosperma ulei foram extraídos,
por maceração, com 10 L de etanol por 24 horas. A extração foi repetida 3 vezes e
as soluções etanólicas foram evaporadas a pressão reduzida e reunidas, fornecendo
o extrato denominado ApCCE (435,32 g, 10,88 %).
Aproximadamente 20 gramas (20,7g) de ApCCE foram suspensos em
200mL de HCl 2M e colocados sob agitação por 30 min. A suspensão foi filtrada em
funil de Bücher sob vácuo e extraída com CH
2
Cl
2
(3 x 200 mL cada). A fase orgânica
foi seca com Na
2
SO
4
anidro e rotaevaporado, fornecendo 776,9 mg de uma fração
denominada ApCCE-A.
À fase aquosa ácida foi adicionado NH
4
OH até alcançar pH 9, observado
em papel de pH. A solução foi filtrada em papel de filtro, extraída com CH
2
Cl
2
(3 x
200 mL cada) e seca com Na
2
SO
4
anidro e rotaevaporado, fornecendo 781,8 mg de
uma fração denominada APCCE-B.
ApCCE-A (350 mg) foi adsorvido em 500 mg de gel de sílica e
acondicionado em uma coluna de vidro ( = 2,5 cm) contendo 2,5 g de gel de sílica.
53
Obtiveram-se 10 frações após a eluição com uma mistura de CH
2
Cl
2
/MeOH (100 : 0
a 98 : 2).
A fração 10 (153,0 mg) foi adsorvida em 500 mg de gel de sílica e
acondicionada em uma coluna de vidro ( = 2,5 cm) contendo 2,5 g de gel de sílica.
Obtiveram-se 3 subfrações após a eluição com uma mistura de CH
2
Cl
2
:CH
3
OH (98 :
2 a 94 : 6).
O fracionamento cromatográfico do extrato etanólico (sub-fração 10/2) da
casca da raiz de Aspidosperma ulei permitiu o isolamento de um sólido claro, de
ponto de fusão 229,1-230,4
o
C , denominado AU-8.
AU-8 apresentou-se como um alcalóide através de ressonância
magnética nuclear (RMN). Dados de RMN mostraram que AU-8 tratava-se de 17-
nor-subincanadina E, posteriormente chamado de SEC (figura 4).
A figura 5 ilustra o processo de obtenção do alcalóide.
Figura 5. SEC (17-nor-subincanadina E)
54
Figura 5. Isolamento de SEC (17-nor-subincanadina E)
4,0kg cascas da raiz
de A. ulei
Maceração em solução
etanolica por 24 Hs
ApCCE 435,32g
(10,88%)
20,7g de ApCCE
Extração orgânica
ApCCE-A
776,9 mg
Cromatografia
em gel de sílica
Fração 10 (153,0 mg)
Cromatografia em gel de sílica
Subfração 2 (83,1 mg)
17
-
nor
-
subincanadina
RMN
3 Subfrações
cromatograficas
Subfração 1 (5,2 mg)
Subfração 3 (50,5 mg)
55
Figura 6. Cromatograma de SEC obtido a partir da fração 10/2.
4.2. EFEITO DE SEC SOBRE A MUSCULATURA LISA DE COELHOS
Foram utilizados coelhos machos New Zeland adultos (2 - 3 kg). Após
injeção com tiopental sódico (Tiopentax; 40 mg/kg i.v.) pela veia marginal, o pênis, a
traquéia, a aorta torácica e o duodeno foram retirados e imediatamente colocados
em solução de Krebs-Henseleit. Cada segmento de tecido foi montado em banhos
isolados de 5 ml contendo solução de Krebs-Henseleit aquecida a 37ºC e
borbulhada com 95% de O
2
e 5% de CO
2
. Os tecidos foram conectados a um
transdutor de força. A tensão aplicada aos tecidos (10 mN) foi periodicamente
ajustada até estabilização e a solução nutritiva trocada a cada 15 min durante este
período. As alterações de tensão foram medidas usando-se transdutores isométricos
(Ugo-Basile, Varese, Itália) e registradas em um polígrafo de 2 canais, com o
objetivo de investigar a atividade da droga em estudo (Figura 7).
56
Figura 7. Esquema do banho de tecido isolado.
4.2.1. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em corpo
cavernoso de coelhos
Cada segmento de corpo cavernoso foi montado em banhos isolados
(como descrito previamente). Após 60 minutos de estabilização, o tecido foi pré-
contraído com fenilefrina (PHE 10 µM); no platô da contração induzida por essa
substância, SEC foi adicionado nas concentrações de 1 - 100 µg/ml. A atividade do
alcalóide foi observada pela construção de curvas de concentração-resposta.
4.2.2. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em anéis
de aorta na ausência e na presença de endotélio
Segmentos de aorta de aproximadamente 4 mm, com ou sem endotélio,
foram montados horizontalmente em banhos de 5 ml de capacidade em solução de
Krebs-Henseleit Henseleit aquecida a 37ºC e borbulhada com 95% de O
2
e 5% de
CO
2
. Após um período de equilíbrio de 1 hora com lavagens sucessivas a cada 15
min, observaram-se os efeitos de SEC (1 - 100 µg/ml) sobre a contração induzida
por fenilefrina (PHE 10 µM), (Figura 8).
57
Figura 8. Montagem dos anéis de aorta em banho isolado.
4.2.3 Efeito de SEC sobre a contração induzida por carbacol em anéis de
traquéia
A traquéia foi removida e dissecada, seguindo o procedimento
experimental descrito por Castillo e De Beer (1947). Cuidadosamente o tecido foi
cortado transversalmente entre os seguimentos de cartilagem, e 4 anéis foram
laçados e acoplados a um transdutor isométrico. O tecido foi mantido em solução de
Krebs-Henseleit em banhos de 5 ml borbulhado com 95% de O
2
e 5% de CO
2
(Figura 9). Após um período de equilíbrio de 1 hora com lavagens sucessivas a cada
15 min, observaram-se os efeitos de SEC (1-100 µg/ml) sobre a contração induzida
por carbacol (CCH 10 µM).
58
Figura 9. Montagem dos anéis de traquéia em banho isolado.
4.2.4 Efeito de SEC sobre a atividade espontânea de duodeno
Cerca de 2 cm do segmento proximal do duodeno foram removidos e
dispostos em uma placa de petri. Após a retirada, a luz duodenal foi lavada com
solução fisiológica. O segmento duodenal foi submetido a uma tensão de 1g em um
banho contendo 10 ml de solução de Hrebs-Henseleit. A solução foi mantida a 37ºC,
pH 7,4, e borbulhada com 95% de O
2
e 5% de CO
2
. Após a estabilização,
observaram-se os efeitos de SEC (1 - 100 µg/ml) sobre a atividade espontânea do
tecido.
4.3. EFEITO DE SEC EM CORPOS CAVERNOSOS DE COELHOS
4.3.1. Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina ou potássio
Após 60 minutos de estabilização, o tecido cavernoso foi pré-contraído
com fenilefrina (PHE 10 µM) ou com potássio (K
+
40 mM); no platô da contração
induzida por essas substâncias, observaram-se os efeitos de SEC (1 - 100 µg/ml) na
presença de um bloqueador dos canais de potássio dependente de ATP
(glibenclamida 10 mM) e de inibidores dos canais de potássio cálcio-dependentes de
alta, intermediária e baixa condutância (iberiotoxina e apamina 0,1 µM) e na
presença de um bloqueador muscarínico (atropina 10 µM), e de antagonistas
noradrenérgicos (fentolamina 10 µM e guanetidina 10 µM). Foram observados
também os efeitos de SEC (1 - 100 µg/ml) na presença de um inibidor da guanilato
59
cilcase solúvel e um inibidor da óxido nítrico sintase, ODQ 30 µM e L-NAME
respectivamente, e a atividade de SEC 10 µg/ml e 30 µg/ml sobre o relaxamento
induzido por GTN (1 - 3000 mM) e Forskolina.
4.3.2. Dosagem de GMPc e AMPc tecidual
Foram utilizados coelhos machos New Zeland adultos (2 - 3 kg). Após
injeção com tiopental sódico (Tiopentax; 40 mg/kg i.v.) pela veia marginal, o pênis, a
traquéia, a aorta torácica e o duodeno foram retirados e imediatamente colocados
em solução de Krebs-Henseleit. Cada segmento de tecido foi montado em banhos
isolados de 5 ml contendo solução de Krebs-Henseleit aquecida a 37ºC e
borbulhada com 95% de O
2
e 5% de CO
2
. Os tecidos foram conectados a um
transdutor de força. Em presença de SEC (17-nor-subincanadina E), um alcalóide
isolado das cascas do caule de Aspidosperma ulei MARKGR. , foram realizados os
seguintes protocolos:
I. Medida de GMPc e AMPc basal
Após o período de estabilização, aproximadamente 1 hora, as tiras de
corpos cavernosos foram congeladas em nitrogênio líquido.
II. Medida de GMPc após pré-contração com fenilefrina
Após o período de estabilização, os anéis foram pré-contraídos com
fenilefrina 10
-7
M. Após 10 minutos da adição do agonista contrátil, a contração
atingiu seu platô, e o tecido cavernoso foi congelado em nitrogênio líquido.
III. Medida de GMPc após a exposição ao alcalóide
Após o período de estabilização e pré-contração com fenilefrina (10
-7
M),
foi adicionado SEC 10 µg/ml e 30 µg/ml. Após a obtenção dos efeitos máximos, o
que ocorreu em cerca de 20 min, as tiras de corpos cavernosos foram congeladas
60
em nitrogênio líquido. Todas as amostras foram mantidas a -20ºC até o dia do
experimento.
IV. Homogeneização do tecido e dosagem de proteínas
O tecido congelado foi homogeneizado em solução de Krebs gelado.
Após completa maceração do tecido, alíquotas de todas as amostras foram
separadas para dosagem de proteínas pelo método de Folin Ciocalteau.
V. Preparação da amostra:
Ao macerado de tecido foi adicionado ácido tricloroacético (TCA)
(resultando em uma concentração final do TCA de 10%). O TCA foi utilizado para
precipitar proteínas; após a adição do TCA, as amostras foram agitadas e
posteriormente centrifugadas a 2000 xg por 15 minutos a 4ºC. Removemos o
sobrenadante e descartamos o precipitado. O sobrenadante foi lavado com éter
dietílico saturado de água (em um volume 4 vezes maior que o volume da amostra)
e a fração etílica (superior) foi descartada. Este processo foi repetido por quatro
vezes. Ao final das lavagens secamos as amostras em atmosfera de nitrogênio a
60ºC e as ressuspendemos no tampão de ensaio do “kit” imunoenzimático para
dosagem de GMPc e AMPc. Utilizamos o método de acetilação da amostra para
dosagem, em fentomoles de GMPc e AMPc por poço. Posteriormente, calculamos a
concentração dos nucleotídeos por mg de proteínas do tecido tecido.
4.3.3. Efeito sobre o relaxamento induzido por campo elétrico
O campo elétrico (ECE) utilizado para estimulação do tecido foi gerado
por uma voltagem de 30 V, com uma freqüência variante (0,5, 1, 2, 4, 8 e 16 Hz), na
forma de pulso de onda quadrado (1,0 ms duração do pulso), usando um
estimulador Grass S88 (Astro-Med Industrial Park; RI, USA). O estímulo elétrico foi
aplicado em segmentos de corpos cavernosos pré-contraídos com fenilefrina 10µM
(controle) e na presença de SEC (1-10 µg/ml) (figura 10).
61
Figura 10. Esquema do banho isolado de corpo cavernoso e da aplicação do
estímulo elétrico.
4.3.4. Efeito de SEC sobre contrações induzidas por CaCl
2
, numa solução
despolarizante zero cálcio
Após 60 min de estabilização, a solução de Krebs-Henseleit normal foi
trocada por solução despolarizante (K
+
40 mM) e livre de cálcio em sua composição.
Curvas cumulativas de cálcio (CaCl
2
1 - 300 mM) foram registradas na ausência
(controle) e na presença de SEC (3,5; 7,5 e 15 µg/ml) adicionado à solução 10
minutos antes do início da curva.
4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (X ±
EPM) onde n representa o número de experimentos. São considerados
estatisticamente significantes os resultados que apresentam probabilidade de
ocorrência da hipótese nula menor que 5% (p>0,05). Para comparação de dois
grupos usamos teste t de Student pareado ou não-pareado. Para comparação de
mais de dois grupos experimentais foram utilizados ANOVA e tested de múltipla
comparação, citados apropriadamente na seçãode resultados e/ou nas legendas das
figuras. A concentração da substância capaz de produzir 50% do seu efeito máximo
(IC
50
) foi calculada pelo programa Graph Pad Prism v.3.0.
62
5. RESULTADOS
5.1. EFEITO DE SEC SOBRE A MUSCULATURA LISA DE COELHOS
5.1.1. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em corpo
cavernoso de coelhos
A resposta relaxante máxima induzida por SEC em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos contraídos com fenilefrina 10 µM foi de 100% (SEC 100
µg/ml), como visto nas figuras 11 e 12.
Figura 11. Relaxamento induzido por SEC (1-100 µg/ml) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM. Os dados são
expressos como média ± erro padrão da média (N=4) da porcentagem de
relaxamento dos tecidos contraídos com fenilefrina 10 µM. **p<0,01, teste t de
Student pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
SEC
Controle
**
**
**
63
Figura 12. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por fenilefrina 10µM em segmentos de corpos cavernosos de coelhos.
5.1.2. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina em anéis
de aorta na ausência e na presença de endotélio
A resposta relaxante máxima induzida por SEC em anéis de aorta
contraídos com fenilefrina na presença de endotélio foi de 100% ± 0,00% SEC (100
µg/ml), e na ausência do endotélio foi de 91,67% ± 8,33% (SEC 100 µg/ml), como
visto nas figuras de 13 a 15.
Figura 13. Efeito de SEC sobre a contração induzida por fenilefrina 10 µM em anéis
de aorta de coelhos. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média
(N=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos contraídos com fenilefrina 10 µM.
p>0,05, teste t de Student pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
E
+
E
-
64
Figura 14. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por fenilefrina 10µM em anéis de aorta de coelhos com endotélio, bem
como a recuperação do tecido após um período de 30 minutos de lavagem.
Figura 15. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por fenilefrina 10µM em anéis de aorta de coelhos sem endotélio, bem
como a recuperação do tecido após um período de 30 minutos de lavagem
10min
1g
65
5.1.3. Efeito de SEC sobre a contração induzida por carbacol em anéis de
traquéia de coelhos
A resposta relaxante máxima induzida por SEC em anéis de traquéia
contraídos com carbacol foi de 95,92% ± 1,53% (SEC 100 µg/ml), como visto nas
figuras 16 e 17.
Figura 16. Efeito de SEC sobre a contração induzida por carbacol (CCH) 10µM em
anéis de traquéia de coelhos. Os dados são expressos como média ± erro padrão da
média (N=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos contraídos com carbacol
10 µM. **p<0,01,teste t de Student pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
**
66
Figura 17. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por carbacol 10 µM em anéis de traquéia de coelhos, e a recuperação do
tecido após um período de 30 minutos de lavagem. O traçado acima é representativo
de quatro experimentos.
5.1.4. Efeito de SEC sobre a atividade espontânea de duodeno
A resposta inibitória máxima induzida por SEC na atividade espontânea
de segmentos de duodeno de coelhos foi de 93,40% ± 6,60 (SEC 100 µg/ml), como
visto nas figuras 18 e 19.
Figura 18. Efeito de SEC sobre a atividade espontânea de segmentos de duodeno
de coelhos. A adição cumulativa de SEC (1 - 100 µg/mL) produziu uma inibição na
atividade espontânea do tecido. Os dados são expressos como média ± erro padrão
da média (N=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos. *p<0,05, teste t de
Student pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
*
*
67
Figura 19. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC (1-100 µg/ml) sobre
a atividade espontânea de segmento de duodeno de coelhos. O traçado acima é
representativo de quatro experimentos.
Os dados obtidos a partir dos experimentos acima descritos permitiram a
obtenção de curvas dose-resposta do alcalóide nos diferentes tecidos musculares
estudados e os conseqüentes valores de IC
50
(IC95%). Esses resultados estão
mostrados na tabela 3.
Tabela 3. Concentração inibitória 50% em base µg/ml, com seus respectivos IC95%,
de SEC em corpo cavernoso, aorta, traquéia e duodeno de coelhos, pré-contraídos
com fenilefrina ou carbacol.
DROGA TECIDO IC
50
(IC95%) - µg/ml
Fenilefrina (10µM) Corpo cavernoso 7,174 (3,155 - 16,31)
Fenilefrina (10µM) Aorta E
+
26,15 (6,088 - 112,4)
Fenilefrina (10µM) Aorta E
-
29,76 (12,26 – 72,27)
Carbacol (10µM) Traquéia 60,25 (0,330 - 109,80)
- Duodeno 76,78 (33,09 - 178,2)
CI
50
: concentração inibitória 50%. Concentração necessária para produzir 50% da resposta relaxante máxima
IC95%: Intervalo de confiança de 95%.
68
5.2. EFEITO DE SEC EM CORPOS CAVERNOSOS DE COELHOS
5.2.1. Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença de
apamina, iberiotoxina e glibenclamida
A resposta relaxante máxima induzida por SEC (100 µg/ml) em
segmentos de corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos por fenilefrina 10µM foi
de 100% e de 89,36 % ± 1,69 na presença dos inibidores apamina 0,1µM,
iberiotoxina 0,1µ e glibenclamida 10mM, como visto nas figuras 21 e 22.
Figura 21. Relaxamento induzido por SEC (1-100 µg/ml) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante de K
+
40 mM. Os
dados são expressos como média ± erro padrão da média (N=4) da porcentagem de
relaxamento dos tecidos contraídos com solução despolarizante de K
+
40mM. p >
0,05, teste t de Student não-pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
SEC
SEC + Apa/Glib/Ibtx
69
Figura 22. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por fenilefrina 10µM na presença de apamina 0,1 µM, iberiotoxina 0,1 µM e
glibenclamida 10mM em segmentos de corpos cavernosos de coelhos. O traçado
acima é representativo de quatro experimentos.
5.2.2. Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença de
atropina
A resposta relaxante máxima induzida por SEC em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos contraídos com fenilefrina 10 µM pré-tratados com atropina
10 µM foi de 100 ± 0,00% (SEC 1 - 100 µg/ml), como visto nas figuras 23 e 24.
70
Figura 23. Relaxamento induzido por SEC (1-100 µg/ml) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM na presença de
atropina (10 µM). Os dados são expressos como média ± erro padrão da média
(N=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos contraídos com fenilefrina 10 µM.
p > 0,05, teste t de Student pareado.
Figura 24. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC (1-100µg/ml) na
contração induzida por fenilefrina (PHE) 10 µM em corpos cavernosos de coelhos e
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
SEC
SEC + Atropina
71
pré-tratados com atropina (10 µM).5.2.3. Efeito sobre a contração induzida por
potássio 40mM na presença de guanetidina e fentolamina
A resposta relaxante máxima induzida por SEC em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos contraídos por K
+
na presença de guanetidina e fentolamina
foi de 100,0% (SEC 100µg/ml), como visto nas figuras 25 e 26.
Figura 25. Relaxamento induzido por SEC (1-100 µg/ml) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante de K
+
40mM na
ausência e na presença de guanetidina e fentolamina (10µM). Os dados são
expressos como média ± erro padrão da média (n=4) da porcentagem de
relaxamento dos tecidos contraídos com solução despolarizante de K
+
40mM. p >
0,05, teste t de Student não pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
SEC
SEC + Gua/Fen
72
Figura 26. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por solução despolarizante de K
+
40mM (A) e na presença de guanetidina e
fentolamina (10µM) (B) em segmentos de corpos cavernosos de coelhos. O traçado
acima é representativo de quatro experimentos.
A
B
73
5.2.4. Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença de L-
NAME
A reposta relaxante máxima induzida por SEC 300 µg/ml em segmentos
de corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina foi de 67,93% ± 4,9
e de 62,37% ± 1,64 na presença de L-NAME 100 µM, como visto nas figuras 27 e
28.
Figura 27. Relaxamento induzido por SEC (1-300 µg/ml) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM na ausência e na
presença de L-NAME (18,5mM). Os dados são expressos como média ± erro padrão
da média (n=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos contraídos com
fenilefrina 10 µM. ).p > 0,05, teste t de Student pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
10
20
30
40
50
SEC + L-NAME
SEC
74
Figura 28. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida por fenilefrina 10 µM (A) e na presença de L-NAME 18,5mM (B) em
segmentos de corpos cavernosos de coelhos. O traçado acima é representativo de
quatro experimentos.
A
B
75
5.2.5. Efeito sobre a contração induzida por fenilefrina na presença de
OQD
A reposta relaxante máxima induzida por SEC 100 µg/ml em segmentos
de corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina foi de 100% e de
79,1% ± 4,5 na presença de ODQ 30µM, como visto nas figuras 29 e 30.
Figura 29. Relaxamento induzido por SEC (1-100 µg/ml) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM na ausência e na
presença de ODQ (30µM). Os dados são expressos como média ± erro padrão da
média (n=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos contraídos com fenilefrina
10 µM. ).*p < 0,05, **p < 0,01, teste t de Student não pareado.
SEC µg/ml
1 10 100
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
SEC
SEC + ODQ
**
**
**
**
*
76
Figura 30. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC na contração
induzida fenilefrina 10 µM na presença de ODQ 30µM em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos. O traçado acima é representativo de quatro experimentos.
5.2.7. Efeito sobre o relaxamento induzido por Gliceriltrinitrato (GTN)
A resposta relaxante máxima induzida por GTN (1 - 3000 mM) foi de
61,15 %± 7,8 e na presença de SEC 10 e 30 µg/ml de 73,67 % ± 6,9 e 87,19 % ± 2,9
respectivamente, como visto nas figuras 33 e 34.
77
Figura 33. Relaxamento induzido por GTN (1-3000 mM) em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (controle) e após a pré-
incubação com SEC 10 µg/ml e SEC 30 µg/ml Os dados são expressos como média
± erro padrão da média (n=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos
contraídos com fenilefrina 10 µM.*p < 0,05, **p < 0,01, ANOVA seguida de Tukey.
SEC µg/ml
1 10 100 1000 10000
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
GTN
GTN + SEC 10 µg/ml
GTN + SEC 30 µg/ml
*
*
*
*
*
*
78
Figura 34. Registro fisiográfico representativo do efeito relaxante de GTN (1 - 3000
mM) em segmentos de corpos cavernosos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (A)
e na presença de SEC 10 µg/ml e 30 µg/ml (B e C, respectivamente). O traçado
acima é representativo de quatro experimentos.
A
B
C
79
5.2.8. Efeito sobre o relaxamento induzido por forskolina
A resposta relaxante máxima induzida por forskolina foi de 100% e na
presença de SEC 10 e 30 µg/ml foi 100%, como visto nas figuras 35 e 36.
Figura 35. Relaxamento induzido por Forskolina em segmentos de corpos
cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (controle) e após a pré-
incubação com SEC 10 µg/ml e SEC 30 µg/ml Os dados são expressos como média
± erro padrão da média (n=4) da porcentagem de relaxamento dos tecidos
contraídos com fenilefrina 10 µM.*p < 0,05, ANOVA seguida de Tukey.
- log forskolin [M]
0 1 2 3 4 5 6
Relaxamento (%)
0
20
40
60
80
100
120
FK
FK + SEC 10 µg/ml
FK + SEC 30 µg/ml
*
*
*
*
*
9
8 7 6 5 4
80
Figura 36. Registro fisiográfico representativo do efeito relaxante de forskolina (10
-9
-
10
-5
M) em segmentos de corpos cavernosos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM
(A) e na presença de SEC 10 µg/ml e 30 µg/ml (B e C, respectivamente). O traçado
acima é representativo de quatro experimentos.
A
B
C
81
5.2.6. Efeito sobre a dosagem de GMPc e AMPc tecidual
Os níveis basais de GMPc dosados em corpos cavernosos de coelhos
pré-contraídos com fenilefrina 10 µM foi de 8,3 % ± 2,9 %, na presença de SEC 7,5
e 15 µg/ml foi de 8,5 % ± 1,0 e 21,5 % ± 4,2 % respectivamente, e na presença de
SNP 1 µM foi de 43,6 % ± 1,8 %, como mostrado na figura 31. Os níveis basais de
AMPc dosado em corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10
µM foi de 117,3 % ± 7,9 %; na presença de SEC 15 µg/ml foi de 331,95 % ± 26,1 e
na presença de forskolina 1µM foi de 1933,9 % ± 116,4 %, como mostrado na figura
32.
BASAL SEC7.5 SEC15 SNP
0
10
20
30
40
50
***
***
#
GMPc (pmol/mgP)
Figura 31. Medida de GMPc em tiras de corpos cavernosos de coelhos expostas a
salina (controle), SEC (7,5 ou 15 µg/ml), SNP (1 µM) ***p<0,001 vs. controle,
ANOVA seguido de Tukey (n=4 em duplicata). #p<0,001 SNP vs. SEC15. Os níveis
de GMPc são expressos como média ± SEM.
82
Basal SEC15 FK
0
250
500
1500
1750
2000
***
***
#
AMPc (pmol/mgP)
Figura 32. Medida de AMPc em tiras de corpos cavernosos de coelhos expostas a
salina (controle), SEC (15 µg/ml) ou forskolina (1 µM). ***p<0,001 vs. controle,
ANOVA seguido de Tukey (n=4 em duplicata). #p<0,001 FK vs. SEC15. Os níveis de
AMPc são expressos como média ± SEM.
5.2.10. Efeito sobre o relaxamento induzido por estimulo elétrico (ECE).
A resposta relaxante máxima obtida na maior freqüência utilizada (16 Hz)
foi de 65,0 ± 10,9% e de 0,7 ± 0,7% para a freqüência mínima (2Hz). A incubação
dos tecidos em SEC afetou a resposta ao ECE (figuras 38 e 39).
83
Figura 38. Relaxamento induzido por ECE (0,5-16Hz) antes e após incubação com
SEC (1 – 10 µg/ml) em corpos cavernosos isolados de coelho pré-contraídos por
fenilefrina (10 µM). Os dados estão expressos como média ± erro padrão da média
(N=4) da porcentagem do relaxamento induzido por ECE. *p<0,05, teste t de student
pareado.
Figura 39. Registro fisiográfico representativo do efeito de SEC sobre o relaxamento
induzido por estímulo elétrico transmural (ECE) em corpos cavernosos isolados de
coelho pré-contraídos por fenilefrina (10µM).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0,5Hz 1Hz 2Hz 4Hz 8Hz 16Hz
Variação da frequência
Relaxamento (%)
Controle
SEC 1µg/ml
SEC 3µg/ml
SEC 10µg/ml
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
84
5.2.10. Efeito de SEC sobre contrações induzidas por CaCl
2
, numa
solução despolarizante zero cálcio
A adição cumulativa de cálcio não reverteu o efeito relaxante de SEC (3,5,
7,5 e 15 µg/mL). Estes resultados estão expressos nas figuras 40 a 45.
Figura 40. Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 - 100 mM) em corpos
cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante de K
+
40
mM; 0 Ca
++
na presença e na ausência de SEC 3,5 µg/ml. Os dados são expressos
como média ± erro padrão da média (N=4) da porcentagem de contração dos
tecidos induzidos por CaCl
2
(1-100 mM). p>0,05, teste t de student pareado.
(Cacl
2
mM)
1 10 100
Contração (%)
0
20
40
60
80
100
120
Controle - CaCl
2
SEC + CaCl
2
81
Figura 41. Registro fisiográfico representativo do efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 - 100 µg/ml) na contração
induzida por solução despolarizante de K
+
40mM, 0 Ca
++
na presença ou ausência de SEC 3,5 µg/ml; o gráfico também evidencia
a recuperação do tecido após 30 min de lavagem. O traçado acima é representativo de 4 experimentos.
82
Figura 42. Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 - 100 mM) em corpos
cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante de K
+
40
mM; 0 Ca
++
na presença e na ausência de SEC 7,5 µg/ml. Os dados são expressos
como média ± erro padrão da média (N=4) da porcentagem de contração dos
tecidos induzidos por CaCl
2
(1-100 mM). p>0,05, teste t de student pareado
(CaCl
2
mM)
1 10 100
Contração (%)
0
20
40
60
80
100
120
Controle - CaCl
2
SEC + CaCl
2
83
Figura 43. Registro fisiográfico representativo do efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1-300 µg/ml)
na contração induzida por solução despolarizante de K
+
40mM, 0 Ca
++
na presença ou ausência de SEC 7,5
µg/ml; o gráfico também evidencia a recuperação do tecido após 30 min de lavagem. O traçado acima é
representativo de 4 experimentos.
84
Gráfico 44. Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1-100 mM) em corpos
cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante de K
+
40
mM; 0 Ca
++
na presença e na ausência de SEC 15 µg/ml. Os dados são expressos
como média ± erro padrão da média (N=4) da porcentagem de contração dos
tecidos induzidos por CaCl
2
(1-100 mM). **p<0,01, teste t de student pareado.
(CaCl
2
mM)
1 10 100
Contração (%)
0
20
40
60
80
100
120
Controle - Cacl
2
SEC + Cacl
2
**
**
**
**
85
Figura 45. Registro fisiográfico representativo do efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1-300 µg/ml)
na contração induzida por solução despolarizante de K
+
40mM, 0 Ca
++
na presença ou ausência de SEC 15
µg/ml. O traçado acima é representativo de 4 experimentos.
10min
1g
86
6. DISCUSSÃO
A disponibilidade atual de novos medicamentos para o tratamento da
disfunção erétil oferece a possibilidade de múltiplas intervenções farmacológicas
para o tratamento da impotência. Agentes administrados por via oral, como o
sildenafil, tadalafila e vardenafila, embora apresentem a vantagem da
conveniência, não manifestam efeito sobre a libido e o desejo sexual.
Pesquisas no campo de produtos naturais podem levar a
farmacoterapias mais seguras e eficazes no tratamento da disfunção erétil. Em
estudos clínicos, a ioimbina, um alcalóide presente em diferentes espécies do
gênero Aspidosperma, incluindo A. quebracho-blanco apresentou uma
comprovada eficácia na disfunção erétil, significantemente maior do que o
placebo. As respostas positivas variaram de 34% a 73% para a ioimbina e de 9%
a 28% para o placebo (ERNST & PITTLER, 1998).
Neste sentido, estudos anteriores realizados no nosso laboratório
demonstraram que uma fração rica em alcalóides indólicos extraída das cascas
da raiz de Aspidosperma ulei exibe uma ação pró-eretil nos camundongos in vivo
e um relaxamento em corpos cavernosos de coelhos in vitro (CAMPOS et al.,
2006; 2007). Continuando essa linha de pesquisa, Campos et al. 2007
demonstraram um efeito pró-eretil in vivo de SEC (17-nor-subincanadina E), um
alcalóide isolado das cascas do caule da mesma planta. Para verificar o
mecanismo subjacente na atividade pró-eretil de SEC, o presente estudo teve por
objetivo avaliar a atividade relaxante de SEC no tecido corpo cavernoso in vitro e
analisar o mesmo efeito em diferentes tipos de tecido muscular liso como o
traqueal, o intestinal e o vascular.
Os experimentos foram realizados com corpo cavernoso, aorta,
traquéia e duodeno de coelhos montados em banhos de registro isométrico, aos
quais SEC foi adicionado nas concentrações de 1 - 100 µg/ml. A atividade do
alcalóide foi observada pela construção de curvas de concentração-resposta.
87
As vantagens desse método para estudos farmacológicos incluem a
fácil preparação, poucos equipamentos necessários e o fato de obterem-se
curvas concentração-efeito reprodutíveis quando se estudam agentes contráteis
ou relaxantes. A resposta à estimulação farmacológica através da adição de
agentes contráteis como a fenilefrina, KCl ou outras substâncias é o método mais
comum utilizado para contrair o músculo liso in vitro e para analisar a potência e a
eficácia de agentes relaxantes (MORELAND, 2001).
Como a ereção peniana envolve o relaxamento vascular e muscular
liso durante a estimulação sexual, a aplicação de modelos in vitro aumentou
significativamente o nosso entendimento dos eventos bioquímicos que ocorrem
em nível celular (ANDERSON & WAGNER, 1995). Estes modelos permitem o
esclarecimento dos vários neurotransmissores, fatores vasoativos e as vias de
sinalização envolvidas nesse processo (MORELAND et al., 2001).
No presente estudo, SEC na concentração de 1 a 100 ug/ml produziu
um relaxamento da contração induzida por fenilefrina em corpos cavernosos de
coelhos (100%), relaxamento de anéis de aorta pré-contraídos com fenilefrina na
presença (100%) e na ausência de endotélio (91,67%), relaxamento em anéis de
traquéia pré-contraídos com carbacol (95,92% ± 1,55%) e diminuição da atividade
espontânea do duodeno (93,4% ± 6,6%). Os dados mostram claramente que o
alcalóide em estudo é capaz de causar um relaxamento em quatro diferentes
tipos de musculatura lisa, que esse relaxamento é reversível e ocorre de maneira
dose-dependente.
A seletividade de uma droga para um desejado local de ação é um
fator chave para determinar os efeitos colaterais desta droga
.
Ao comparar as
doses de IC
50
para os tecidos estudados, verificou-se que SEC apresentou uma
IC
50
menor para o corpo cavernoso [7,174 (3,155 - 16,31) µg/ml)] quando
comparado à IC
50
de aorta [26,15 (6,088 - 112,4) µg/ml)], traquéia [60,25 (0,330 -
109,80) µg/ml)] e duodeno [76,78 (33,09 - 178,2) µg/ml)], indicando que o tecido
muscular liso cavernoso é mais sensível às ações relaxantes de SEC, o que
sugere uma seletividade de SEC para este tecido.
88
Alguns estudos da literatura pesquisada relatam que várias
substâncias usadas em disfunção erétil também apresentam efeito sobre outros
tecidos vasculares. Os inibidores de fosfodiesterase (sildenafil, tadalafil e
vardenafil), por exemplo, são capazes de relaxar aortas de rato isoladas pré-
contraídas com fenilefrina (TEIXEIRA et al., 2006). Embora a ação relaxante das
substâncias citadas acima se estenda a outros leitos vasculares, a maior
seletividade das mesmas para o tecido cavernoso faz com que possam ser
usadas com segurança na maioria dos pacientes com disfunção erétil orgânica,
sem efeitos colaterais pronunciados. De maneira semelhante, é possível que
SEC, atuando com maior seletividade para corpo cavernoso, possa futuramente
vir a ser empregada nos mesmos casos de disfunção.
Tendo em vista a aparente seletividade da substância em estudo para
o corpo cavernoso, um dos objetivos do nosso estudo foi verificar o possível
efeito relaxante de SEC em corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com
potássio e fenilefrina, e então elucidar o provável envolvimento dos sistemas
neuroefetores adrenérgico, colinérgico e nitrérgico, que por excelência é o
principal mediador envolvido na fisiologia da ereção, bem como o papel na
ativação de canais de potássio e cálcio nesse mecanismo relaxante.
Vários tipos distintos de canais de potássio têm sido descritos na
musculatura lisa cavernosa. As correntes de potássio têm um papel importante na
determinação do potencial de membrana, nas células excitáveis, incluindo a
muscular lisa do corpo cavernoso. Os canais de potássio dependentes de cálcio
(K
Ca
) e canais de potássio dependentes de ATP (K
ATP
) têm sido bem
caracterizados no músculo liso cavernoso e parecem ser importantes
moduladores da atividade desse músculo (CHRIST, 2000).
Campos et al., (2007), demonstrou que a associação de glibenclamida,
um bloqueador específico do canal de potássio regulado por ATP, apamina um
bloqueador dos canais de potássio considerados ativos em baixa condutância e
caribdotoxina, um bloqueador potente do canal K
Ca
de alta condutância, não
exerceu influência sobre o relaxamento da musculatura lisa cavernosa de coelhos
89
induzido por uma fração rica em alcalóides indólicos extraídos das cascas da raiz
de A. ulei (SF
3-5
).
Sendo assim, para avaliar se SEC relaxa o corpo cavernoso de
coelhos via ativação de canais de potássio, foram realizados experimentos com
bloqueadores específicos. Foi utilizada uma associação de glibenclamida,
iberiotoxina (bloqueador dos canais K
ca
de alta condutância) e apamina. A
associação glibenclamida/Iberiotoxina/apamina não exerceu qualquer influência
sobre o relaxamento induzido por SEC em tiras de corpo cavernoso de coelho
pré-contraídas com fenilefrina, tornando improvável a participação dos canais
K
ATP
e K
Ca
no efeito relaxante de SEC.
O sistema nervoso autônomo é o responsável pelo controle do
relaxamento do músculo liso cavernoso. Os neurotransmissores envolvidos na
regulação do tônus do corpo cavernoso, nas condições fisiológicas mais
importantes são a noradrenalina, a acetilcolina e o óxido nítrico. Há também
alguns neuropeptídeos envolvidos nesse processo de controle do músculo liso
cavernoso, diretamente ou via interação com neurônios colinérgicos e
adrenérgicos. Os corpos cavernosos possuem receptores adrenérgicos do tipo α
1
e α
2
. A liberação endógena de noradrenalina pelas terminações nervosas
simpáticas mantém o tônus da artéria cavernosa, assim o fluxo sangüíneo para
os corpos cavernosos é mantido num nível baixo o suficiente para impedir a
intumescência. Assim, o bloqueio simpático mostrou ser um facilitador da ereção
e provavelmente explica o efeito de intumescência produzido por antagonistas α
1
intracavernosos (NAYLOR, 1998).
A participação do sistema adrenérgico foi verificada no presente
estudo através da pré-contração do tecido com solução despolarizante de
potássio (K
+
40mM) na presença de guanetidina e fentolamina (10µM). A
guanetidina bloqueia os neurônios adrenérgicos, interrompendo a liberação
fisiológica de noradrenalina dos neurônios simpáticos pós-ganglionares, e a
fentolamina é um antagonista competitivo de receptores α
1
e α
2
adrenérgicos
(KATZUNG, 2006). Mesmo na presença dos bloqueadores de receptores
adrenérgicos, SEC causou relaxamento nos segmentos de corpos cavernosos de
90
coelhos, indicando que o bloqueio desses receptores não é o mecanismo
provável para a atividade relaxante do alcalóide.
A Ach, o neurotransmissor parassimpático, relaxa o músculo liso
cavernoso, estimulando a liberação de NO através da ativação dos receptores
muscarínicos M
3
do endotélio vascular (TRAISH, 1990). A estimulação do
receptor M
3
induz uma resposta rápida de relaxamento no corpo cavernoso
quando o endotélio está integro, e esses efeitos são bloqueados pela inibição da
óxido nítrico sintase. Para examinar a participação do sistema colinérgico, o
tecido foi pré-contraído com fenilefrina (10µM) na presença de atropina (10µM),
um agente antagonista dos receptores muscarínicos que bloqueia seletivamente
os efeitos da atividade nervosa parassimpática (DALE, 2004). A falência do
antagonista dos receptores muscarínicos (atropina) em reduzir o relaxamento
induzido por SEC sugere que a liberação de Ach não contribui para esse
relaxamento e provavelmente exclui o envolvimento dos nervos colinérgicos no
mecanismo de ação de SEC.
Para examinar se SEC estaria atuando na via NO/GMPc/L-arg através
da inibição da NOS, foram realizados experimentos em que os corpos
cavernosos foram pré-contraídos com fenilefrina 10µM na presença de L-NAME,
um inibidor inespecífico da NO sintase. De acordo com os resultados
apresentados, os relaxamentos evocados por SEC não foram afetados de
maneira significativa pela infusão de L-NAME, indicando que a substância em
estudo relaxa a preparação de corpo cavernoso de coelho por uma via
independente da liberação de NO.
Foram realizados experimentos com banho de corpos cavernosos de
coelhos utilizando o ODQ (1H-[1,2,4] Oxadiazole [4,3-a]quinoxalin-1one), para
substanciar a investigação e definir se SEC estaria agindo através do sistema
NO/guanilato ciclase solúvel (GCs)/GMPc. A GCs, um dos receptores fisiológicos
para o NO, contém um grupamento heme, com o qual o NO interage para ativar a
enzima (GERZER et al., 1981). A ativação da GCs pelo NO resulta na conversão
de GTP em GMPc, segundo mensageiro que medeia o relaxamento induzido por
vários vasodilatadores como o nitroprussiato de sódio (SNP), bem como por
91
drogas como Ach, que atuam por estimular a liberação de NO (GRUETTER et al.;
RAPOPORT &MURAD, 1983; 1981SCHULTZ et al., 1997).
O ODQ é um potente e seletivo inibidor da guanilato ciclase solúvel
(GC
s
) estimulada pelo NO. Essa substância inibe por mecanismo competitivo a
estimulação promovida pelo NO, no seu sítio de ligação, através da oxidação
reversível da fração heme (SCHRAMMEL, 1996). Esse composto não bloqueia a
GC particulada ou NOS e constitui uma excelente ferramenta para a
demonstração do envolvimento do GMPc em vários processos biológicos como,
por exemplo, relaxamento de corpo cavernoso de coelho (TEIXEIRA et al., 1998;
TEIXEIRA et al., 2001).
No presente estudo, a participação da via NO/GCs/GMPc foi avaliada
através da pré-contração de tiras de corpos cavernosos de coelhos com
fenilefrina 10 µM na presença de ODQ 30 µM. A inibição da guanilato ciclase
solúvel com ODQ 30 µM resultou em uma redução significante da resposta
relaxante de SEC (1-100 µg/ml) indicando que este alcalóide poderia então estar
atuando através de um mecanismo dependente da via NO/GC/GMPc.
Uma das hipóteses é a de que o alcalóide teria alguma ação positiva
sobre a enzima guanilato ciclase solúvel, possivelmente através da ligação direta
à proteína, com a conseqüente ativação da mesma. Tendo em vista que a
introdução de um agente inibidor da GCs foi capaz de reverter parcialmente o
relaxamento induzido por SEC.
Estudos realizados com a substância 3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-benzil
indazol, um ativador de guanilato ciclase conhecido como YC-1, mostraram que,
de maneira semelhante a SEC, este composto relaxou tiras de corpos
cavernosos pré-contraídas com fenilefrina, e este relaxamento foi parcialmente
inibido pelo ODQ. Estes resultados sugeriram que YC-1 se liga à guanilato
ciclase solúvel em um sítio diferente do óxido nítrico (HSIEH et al., 2003).
No presente estudo, como a diminuição do relaxamento produzido por
SEC na presença de ODQ não foi total, pode-se esperar que, se o alcalóide de
92
fato produz alguma ativação da enzima, seria também através da ligação de SEC
a um sítio distinto do sítio para o NO, uma vez que L-NAME, um inibidor da óxido
nítrico sintase (NOS), não afeta o relaxamento induzido por SEC.
Foi também avaliado o efeito relaxante de um doador de óxido nítrico –
GTN (nitroglicerina 1 - 3000 mM) – na presença do alcalóide (10 e 30 µg/ml) em
corpos cavernosos de coelhos. Verificou-se que SEC nas duas concentrações
potencializou o efeito relaxante do agente doador de NO. Esse efeito poderia
provavelmente ser devido ao fato de que SEC e NO estariam agindo de forma
sinérgica ativando a GCs ou que SEC estaria de alguma forma inibindo a
fosfodiesterase.
Os dados que apontam para SEC como possível ativador da guanilato
ciclase solúvel ou inibidor de PDE são corroborados pelos achados dos imuno-
ensaios, que verificaram um aumento nas concentrações de GMPc nos corpos
cavernosos submetidos à ação do alcalóide.
Resultados semelhantes foram verificados por HSIEH et al., (2003)
mostrando que YC-1 e nitroprussiato de sódio (um doador de NO) causaram um
aumento concentração-dependente nos níveis de GMPc em culturas de células
musculares lisas de corpo cavernoso de coelho. Além disso, YC-1 (HSIEH et al.,
2003) e SEC (CAMPOS et al., 2007) demonstraram efeito pró-erétil in vivo, tendo
ambos evocado ereção peniana em ratos. Esses dados sugerem que as
propriedades pró-eréteis semelhantes de SEC e YC-1 podem estar subsidiadas
por eventos bioquímicos também semelhantes.
Antes da utilização clínica de inibidores de PDE-5 para o tratamento da
disfunção erétil, compostos que atuam através dos mecanismos dependentes de
AMPc foram amplamente utilizados em pacientes com disfunção erétil. Alguns
desses agentes ainda são clinicamente relevantes, principalmente em pacientes
que não toleram o tratamento com inibidores de PDE. Esses compostos são:
prostaglandina E1 (PGE-1), polipeptídeo intestinal vasoativo e forskolin, um
diterpeno extraído da Coleus forskolii que estimula a enzima adenilato ciclase
(AC) por um mecanismo independente da ativação da proteína-G (ÜCKERT et
al., 2004).
93
Também foi avaliado o efeito relaxante de um doador de AMPc –
forskolin (10
-9
– 10
-5
M) – na presença do alcalóide (10 e 30 µg/ml). Verificou-se
que SEC nas duas concentrações potencializou o efeito relaxante do forskolin.
Esse efeito poderia ser devido ao aumento na produção de AMPc por SEC como
mostrado no imuno-ensaio. Além do aumento nas concentrações de GMPc, os
imuno-ensaios também mostraram um acréscimo nos níveis de AMPc no tecido
erétil submetido às ações de SEC (15 µg/ml).
O aumento nos níveis de AMPc pode ser explicado pelo fato de que
uma elevação dos níveis de GMPc induzida pela inibição da fosfodiesterase-5
(PDE–5) ou pela ativação da GCs pode causar uma inibição alostérica da
fosfodiesterase-3 (PDE–3), enzima que hidrolisa AMPc, com um conseqüente
aumento dos níveis desse nucleotídeo (ÜCKERT et al., 2004). Esta seria a
hipótese mais provável para um aumento de AMPc no presente estudo.
Dentre as diversas formas de estimulação de um tecido excitável
destaca-se a Estimulação por Campo Elétrico (ECE).
No presente estudo, foram
observadas as atividades de SEC sobre o relaxamento tecidual evocado por
ECE. A estimulação por campo elétrico (ECE) relaxa o músculo liso dos corpos
cavernosos pela formação endógena e liberação de NO e GMPc. A musculatura
lisa cavernosa relaxa em resposta a ECE na presença de atropina e guanetidina;
esse efeito é abolido na presença de tetrodotoxina (TTX), L-NAME,
oxihemoglobina e azul de metileno e restaurado na presença de L-arginina. Após
a estimulação elétrica do corpo cavernoso de coelho, são observados níveis
teciduais aumentados de nitrito e citrulina (IGNARRO et al., 1990; BUSCH et al.,
1992). Com a inibição da NOS ou o bloqueio da condução axonal, observa-se
bloqueio na geração desses metabólitos do NO.
Nesse estudo, a ECE causou relaxamento dos segmentos de corpo
cavernoso de coelho de modo freqüência dependente, sendo tais respostas
transitórias e de desenvolvimento rápido, em preparações pré-contraídas por
fenilefrina 10 µM. O nível máximo de relaxamento das preparações foi alcançado
a freqüências de 8 – 16 Hz. Na presença de SEC (1 - 10 µg/ml) houve uma
94
diminuição significativa do relaxamento do tecido cavernoso evocado pela ECE
de forma dose dependente.
De forma semelhante, um estudo realizado por HALLÉN et al., (2007)
publicado no Britsh Journal of Pharmacology, mostrou que os inibidores seletivos
de fosfodiesterase-5 (IPDE–5) de forma inesperada possuem efeito inibitório
sobre a liberação neuronal de NO induzida pela estimulação por campo elétrico,
provavelmente através de um feedback negativo induzido por GMPc; esse
feedback negativo explicaria porque o priapismo não é visto durante a terapia
com inibidores de PDE–5.
Outra hipótese para explicar o mecanismo pelo qual SEC poderia ser
responsável pela inibição do relaxamento do corpo cavernoso evocado pela ECE,
seria a de que o alcalóide estaria atuando também através do bloqueio no influxo
do cálcio, uma vez que o cálcio é essencial para a exocitose de vesículas
contendo neurotransmisores envolvidos no relaxamento da musculatura lisa
cavernosa, entre eles NO.
Existem também evidências para o papel da entrada do cálcio na
contração tônica das células musculares lisas do corpo cavernoso e essa
contração tônica pode ser abolida por bloqueadores de canais de cálcio voltagem
dependentes, tais como nifedipina, ou pela remoção do cálcio extracelular.
(CAMPOS, 2007). No presente estudo, foram realizados experimentos para
evidenciar o papel do cálcio no relaxamento induzido pelo alcalóide através da
observação da contração do tecido cavernoso após a adição cumulativa de CaCl
2
(1 – 300 mM) na ausência e na presença de SEC (3,5; 7,5 e 15 µg/ml).
SEC parece bloquear o influxo extracelular de cálcio, isso é reforçado
pelo fato de que SEC na concentração de 15 µg/ml impediu as contrações na
musculatura lisa cavernosa despolarizada, em um meio zero cálcio, geradas por
concentrações cumulativas de cálcio no meio, comprovando um possível
envolvimento de SEC no bloqueio do influxo de íons cálcio.
95
Estudos anteriores mostraram que uma fração rica em alcalóides
indólicos extraídos das cascas da raiz de Aspidosperma ulei (SF
3-5
) e SEC
causaram uma diminuição do influxo de
45
Ca
++
basal e estimulado em fatias de
córtex de ratos (dados não publicados).
De forma semelhante, um estudo realizado por CHEN et al., (2007)
sugere que a neferina, um alcalóide isolado das sementes verdes de Nelumbo
nucifera Gaertn promove o relaxamento da musculatura lisa cavernosa de
coelhos e que esse efeito é atribuído à inibição do influxo extracelular e a
liberação dos estoques intracelulares de cálcio.
Este estudo representa a primeira tentativa de investigar o mecanismo
relaxante de SEC (17-nor-subincanadina E) sobre a musculatura lisa cavernosa
de coelhos. Como sugerido até o presente momento, SEC poderia estar atuando
através da ativação da guanilato ciclase solúvel ou da inibição da fosfodiesterase,
entretanto, podem existir outros mecanismos de ação que contribuem para o
efeito relaxante de SEC, como o possível bloqueio do influxo de cálcio para as
células.
SEC promoveu o relaxamento de diferentes tipos de músculo liso, e
mostrou, entre tecidos vasculares, um maior grau de relaxamento para o tecido
cavernoso do que em anéis de aorta de coelho. Os dados do presente trabalho,
combinados com estudos anteriores realizado in vivo, sugerem que
Aspidosperma ulei Markgr. pode ser explorada como uma alternativa para o
tratamento da disfunção erétil. Entretanto, é preciso avaliar a segurança desse
produto em associação com drogas anti-hipertensivas.
Um grande número de mecanismos foram identificados para a
regulação local da contratilidade da musculatura lisa peniana. Moléculas que
possuem participação ativa nesse mecanismo podem ser consideradas alvos
para o desenvolvimento de drogas para o tratamento da disfunção erétil.
96
O alcalóide 17-nor-subincanadina E (SEC) pode ser desenvolvido na
farmocoterapia (como o sildenafil) para ser usado em casos de disfunção erétil
associados a hipertensão arterial, coronariopatia e diabetes.
97
7. CONCLUSÃO
Pelos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:
1. O alcalóide SEC (17-nor-subincanadina E), nas concentrações de 1
a 100 µg/mL, demonstrou atividade relaxante in vitro nos tecidos estudados –
corpo cavernoso, aorta, traquéia e duodeno - esse relaxamento é reversível e
ocorre de maneira dose-dependente.
2. A IC
50
obtida revelou uma sensibilidade maior do corpo cavernoso
para as ações relaxantes de SEC.
3. SEC induziu relaxamento in vitro de corpos cavernosos pré-
contraídos com fenilefrina e potássio. É improvável que o efeito relaxante de SEC
seja devido a uma ação nos sistemas adrenérgico, colinérgico ou canais de
potássio.
4. O alcalóide aumentou os níveis de GMPc e AMPc, apresentando um
comportamento semelhante aos ativadores de guanilato ciclase ou inibidores de
PDEs.
5. A atividade relaxante sobre a musculatura lisa cavernosa desse
alcalóide pode também estar relacionada a um possível bloqueio do influxo
extracelular de cálcio nas células.
98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABREU E SILVA M; OLIVEIRA, A,B,; SOUZA FILHO, J.D.; CHIARI, E.; BRAGA,
F.C.; LOMBARDI, J.A. Isolamento de alcalóides de Aspidosperma tomentosum
biomonitorado por testes in vitro contra Trypanosoma cruzi. Anais da II Semana
da Pós-Graduação da UFMG, 2002.
AMRANI Y., MAGNIER C., ENOUF J., WUYTACK F. BRONNER C. Ca
++
increase
and Ca
++
-influx in human tracheal smooth muscle cells: role of Ca
2+
-pools
controlled by sarco-endoplasmic reticulum Ca
++
-ATPase 2 isoform. British
Journal of Pharmacology v.115, p. 1204-1210, 1995.
ANDERSSON, K.E. Pharmacology of penile erection. Pharmacological
Reviews, v. 53, n. 3, p. 417 – 450, 2001.
ANDERSSON, K.E.; WAGNER, G. Physiology of penile erection. Physiological
Reviews, v. 75, n. 1, p. 191 – 236, 1995.
ANWER, K; TORO, L; OBERTI, C; STEFANI, E; SANBORN, BM. Calcium
activated potassium channels in pregnant rat myometrium: modulation by α-
adrenergic agents. American Journal of Physiology v. 263,nº32, p.1049 - 1056,
1992.
ARGIOLAS, A.; MELIS, M.R. Central control of penile erection: Role of the
paraventricular nucleus of the hypothalamus. Progress in Neurobiology, v. 76,
nº. 1, p. 1 – 21, 2005.
BANERJEE, J.N.; LEWIS, J,J. Pharmacological studies in the apocynaceous
genus Aspidosperma Mart. & Zucc., Aspidosperma ulei MGF. Journal of
Pharmacy and Pharmacology, v. 7, n. 1, p. 42 – 45, 1954.
BENHAM, C. D. & TSIEN, R. W. A novel receptor-operated Ca
2
+-permeable
channel activated by ATP in smooth muscle. Nature, v. 328, n. 6127, p. 275-278,
1987.
99
BENSON, G.S.; MCCONNELL, J.; LIPSHULTZ, L.I.; CORRIERE, J.R.; WOOD, J.
Neuromorphology and neuropharmacology of the human penis: an in vitro study.
The Journal of Clinical Investigation, v. 65, nº. 2, p. 506 – 513, 1980.
BERRIDGE, M. 1. lnositol trisphosphate and diacylglycerol: two interactíng
second messengers. Annu. Rev. Biochem., v. 56, p. 159-193, 1987.
BOLTON, T. B. Mechanism of action of transrnitters and other substances on
smooth muscle. Physiological Reviews., v.59, p.606-718, 1979 b.
BURNETT AL. Erectile dysfunction. Journal of Urology. v.175, p. S25-31,
mar.2006.
BURNETT AL. Role of nitric oxide in the physiology of erection. Biology of
Reproduction, v.52, p. 485-489, 1997.
BUSCH, P.A.; ARONSON, W.J.; BUGA, G.M.; RAJFER, J.; IGNARRO, L. J. Nitric
oxide is a potent relaxant of human and rabbit corpus cavernosum. The Journal
of Urology, v. 147, p. 1650 – 1655, 1992a
CAMPOS, A. R ; DEOCLECIANO, O. B. ; UCHOA, D. E. A. ; SILVEIRA ER ; VSN
RAO . 15R-16,17-Seco-subincanadine E, a Pro-erectile Indole Alkaloid Isolated
from Aspidosperma ulei Stem Bark. In: European Traditional Medicine
International Congress, 2007, Vince. Evidence-based Complementary and
Alternative Medicine, v. 4, p. 56-56, 2007.
CAMPOS, A. R. ; LIMA JUNIOR, R. C. P. ; UCHOA, D. E. A. ; Silveira ER ; Vietla
Satyanarayana Rao . Pro-erectile effects of an alkaloidical rich fraction from
Aspidosperma ulei root bark in mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 104, n.
1, p. 240-244, 2006.
CANONGIA , P.M. diagnóstico da impotência por doença veno-oclusiva. Revista
de Angiologia e Cirurgia Vascular , v. 1, n.2, 1992.
100
CARVALHO, L. H.; BRANDÃO, M. G. L.; SANTOS-FILHO, D.; LOPES, J. L. C.;
KRETTLI, A. U.; Antimalarial activity of crude extracts from Brazilian plants
studied in vivo in Plasmodium berghei-infected mice and in vitro against
Plasmodium falciparum in culture. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research ., v.24, p.11-13, 1991.
CASTEELS, R. & SUZUKl, H. The effect of histamine on the smooth muscle cells
ofthe ear artery ofthe rabbit. European Journal of Physiology., V. 387, n.1, p.
17-25,1980.
CHAPPELL, M.C.; IYER, S.N.; DIZ, D.I.; FERRARIO, C.M. Metabolism of
angiotensin-(1-7) by angiotensin-converting enzyme. Hypertension, v. 31, p.
362–367, 1998.
CHEN, X. L. & REMBOLD, C. M. Phenylephrine contracts rat tail artery by one
electromechanical and three pharmacomechanical mechanisms. American
Journal of Physiology. v.268 (1 Pt 2), p. H74-81, 1995.
CHRIST, G.J.; WANG, H.Z.; VENKATESWARLU, Z.; ZHAO, W.; DAY, N.S. Gap
junctions and ion channels: relevance to erectile dysfunction. International
Journal of Impotence Research, v. 12, p. S12 – S20, 2000.
CHILVERS, E. R., CHALLISS, R.
A,
BARNES, P. 1. and NAHORSKI, S. R.
Mass changes of inositol(1,4,5)trisphosphate in trachealis musde following
agonist stimulation. Eur.
J
Pharmacol., v. 164, n.3, p. 587-90, 1989.
CIRINO G, FUSCO F, IMBIMBO C, MIRONE V. Pharmacology of erectile
dysfunction in man. Pharmacology & Therapeutics, v. n. p. 2005.
CRAVEIRO, A. A.; MATOS, F. J. A.; SERUR, L. M.; Isolation and characterisation
of the monoterpenoid indole alkaloids of Aspidosperma pyrifolium
Phytochemistry. v.22,p.15-26, 1983.
101
DAIL W.G.; Autonomic innervation of male reproductive genitalia. In: The
Autonomic Nervous System. Nervous Control of the Urogenital System, edited by
C.A. Maggi. London, Harwood, v. 6, chap. 3. p. 69-101,1993.
DEUTSCH, H. F.; EVENSON, M. A.; DRESCHER, P.; SPARWASSER, C.;
MADSEN, P. O.; J. An Extract From the Bark of Aspidosperma Quebracho Blanco
Binds to Human Penile α-Adrenoceptors. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, v.12, p. 1283 1994
DHABUWALA C.B., RAMAKRISHNA C.V. & ANDERSSON G.F. Beta adrenergic
receptors in human cavernous tissue. Journal of Urology, n.133: 721-723. 1985.
DROOGMANS, G., RAEYMAEKERS, L. and CASTEELS, R. Electro- and
pharmacomechanical coupling in the smooth muscle cells of the rabbit ear artery.
The Journal of General Physiology ., v. 70, n.2, p. 129-148, 1977.
ERNST E., PITTLER M.H. Yohimbine for erectile dysfunction: a systematic review
and meta-analysis of randomized clinical trials. Journal of Urology, n. 159, p.
433-436, 1998.
EVANS, W. C. trease and evan’s farmacology. 14 ed. London: WB Saunders,
612p. 1996.
EXTON, H. Phosphoinositide phospholipases and G proteins in hormone action.
Annual Review of Physiology ., v. 56, p. 349-369, 1994.
FELDMAN H.A.; GOLDSTEIN I.; HATZICHRISTOU, D.G. et al. Impotence and its
medical and psychosocial correlates: results of the Massachusets male aging
study. Journal of Urology; n.15, p.54-61,1994.
FERREIRA, I.C.P.; LONARDONI, M.V.C.; MACHADO, G.M.C.; LEON, L.L.;
GOBBI FILHO, L.; PINTO, L.H.B.; OLIVEIRA, A.J.B. Anti-leishmanial activity of
alkaloidical extract from Aspidosperma ramiflorum. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, v. 99, n. 3, p. 325 – 327, 2004.
102
FERREIRA, A.J.; SANTOS, R.A.S. Cardiovascular actions of angiotensin-(1-7).
Braz. J. Med. Biol. Res., v. 38, p. 499–507, 2005.
FRANCA, O.O.; BROWN, R.T.; SANTOS, C.A. Uleine and
demethoxyaspidospermine from the bark of Plumeria lancifolia. Fitoterapia, v. 71,
n. 2, p. 208 – 210, 2000.
FURCHGOTT RF & ZAWADSKI JV The obligatory role of endothelial cells in the
refaxation of arterial smooth muscle to acetylcholine. Nature, n.288, p. 373-
376,1980.
GANITKEVICH, V. Ya.
&
ISENBERG, G. Caffeine-induced release and reuptake
of Ca
2
+ by Ca
2
+ stores in myocytes from guinea-pig urinary bladder.
J.
Physiol.,
v. 458, p. 99- 117, 1992a.
GARCIA RUBEN, M.F.; KEITH, S.B. Alkaloids of three Aspidosperma species.
Phytochemistry, v. 15, n. 6, p. 1093 – 1095, 1976.
GERZER R., HOFMANN F. & SCHULTZ G.; Soluble guanylate cyclase purified
from bovine lung contains heme and copper. FEBS Letters, v.132, 1981.
GOLDSTEIN A.M.B., MEEHAN J.P., ZAKHARY R., BUCKLEY P.A. & ROGERS
F.A. New observations on microarchiteture of corpora cavernosa in man and
possible relationship to mechanism of erection. Urology, v.3,p. 259-266,1982.
GUARRERA, P.M.; MARIGNOLI, G.F.S. Ethnobotanical and thnomedicinal uses
of plants in the district of Acquapendente (Latium, Central Italy). Journal of
Ethnopharmacology, v.96, p.429-44, 2005.
HAEUSLER, G. & DE-PEVER, E. Rabbit aorta: electrical properties and agonist-
induced depolarization. European Journal of Pharmacology, v. 166, n.2, p. 175-
182, 1989.
HALLÉN, K.; N.P., WIKLUND & L.E., GUSTAFSSON. Inhibitors of
phosphodiesterase 5 (PDE 5) inhibit the nerve-induced release of nitric oxide from
103
the rabbit corpus cavernosum. British Journal of Pharmacology, n.150, p. 353–
360, 2007.
HAROOTUNIAN, A. T., KAO, P., PARANJAPE, S. et. al. Cytosolic Ca2+
oscillations in REF52 fibroblasts: Ca(2+)- stimulated IP
3
production or voltage-
dependent Ca2+ channels as key positive feedback elements. Cell Calcium. v.
12,n.2-3, p. 153-164, 1991.
HARTSHORNE. D. Biochemistry of the contractile process in smooth muscle. In
JOHNSON, L R. (ed) Physiology of the gastrointestinal tract, Raven Press 2ed.
New York, p. 423-482, 1987.
HAYASHIDA H., OKAMURA T., TOMOYOSHI T. & TODA N. Neurogenic nitric
oxide mediates relaxation of canine corpus cabernosum. Journal of Urology,
v.155, p. 1122-1127,1996.
HEATON, J.P. Apomorphine: an update of clinical trial results. International
Journal of Impotence Research, v. 12, n. 4, p. S67 - S73, 2000.
HEDLUND P., ALMP & ANDERSSON K.E. NO synthase in cholinergic nerves
and NO-induced relaxation in the rat isolated corpus cavernosum. British Journal
of Pharmacology, v.127, p. 349-360,1999.
HEDLUND, P.; ASZODI, A.; PFEIFER, A.; ALM, P.; HOFMANN, F.; AHMAD, M.;
FASSLER, R.; ANDERSSON, K.E. Erectile dysfunction in cyclic GMP-dependent
kinase I-deficient mice. Proceedings of Natural Academy of Sciences, v. 97, n.
5, p. 2349 – 2354, 2000.
HENRIQUES, A.T.; KERBER, V.A. & MORENO, P.R.H. (2001). Alcalóides:
generalidades e aspectos básicos. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.;
Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L.A. & Petrovick, P.R. (eds.).
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3
a
. ed. Editora
Universidade/UFRGS, Porto Alegre.
104
HERMSMEYER, K., STUREK, M. and RUSCH, N. Calcium channel modulation
by dihydropyridines in vascular smooth muscle. New York Academy of
Sciences, v. 522, p. 25-31, 1988.
HIMPENS, B., KITWAZA WZ, T and SOMLYO A. P. Agonist-dependent
modulation of Ca2+ sensitivity in rabbit pulmonary artery smooth muscle.
European Journal of Physiology, v. 417, n. 1, p. 21-28, 1990.
HIMPENS, B., MISSIAEN, L. and CASTEELS, R. Ca2+ homeostasis In vascular
smooth muscle. Journal of Vascular Research., v. 32, n. 4, p. 207-219, 1995.
HOLMQUIST F., HEDLUND H. & ANDERSON K.E. Characterization of inhibitory
neurotransmission in the isolated corpus cavernosum from rabbit and man.
Journal of Physiology, v. 449, p. 295-311, 1992.
HOYLE,
C
H. V.
&
BURNSTOCK, G. Neromuscular transmission in the
gastrointestinal tract. In: SCHUL TZ; WOOD, 1.D. Handbook af Physiology.
Baltimore, M. O: American Physiological Society, v. 13, p 435-463, 1989.
HSIEH, G.C.; O'NEILL, A.B.; MORELAND, R.B.; SULLIVAN, J.P.; BRIONI, J.D.
YC-1 potentiates the nitric oxide/cyclic GMP pathway in corpus cavernosum and
facilitates penile erection in rats. European Journal of Pharmacology. 2003 Jan
1;458(1-2):183-9
IGNARRO L.J., BUSH P.A., BUGA G.M., WOOD K.S., FUKUTO J.M. & RAJFER
J. Nitric oxide and cyclic GMP formation upon electrical field stimulation cause
relaxation of corpus cavernosum smooth muscle. Biochemical Biophysical
Research Communication, v. 170, p. 843-850, 1990.
IGNARRO L.J., BYRNS R.E., BUGA G.M. & WOOD K.S. Endothelium-derived
relaxing factor from pulmonary artery and vein possesses pharmacologic and
chemical properties identical to those of nitric oxide radical. Circulation
Research, v. 61, p.866-879,1987b.
105
IGNARRO LJ, BUGA GM, WOOD KS, BYRNS RE & CHAUDHURI G
Endothelium-derived relaxing factor produeed and released from artery and vein
is nitric oxide. Proceedings of the National Academy of Sciences of United
States of America, v.84, p. 9265-9269,1987a.
ISHIKAWA, T., HUME J.R., KEEF K.D. Regulation of Ca2+ channels by cAMP
and cGMP in vascular smooth muscle cells. Circulation Research
v.73,n.6,p.1128-1137, 1993.
ITOH, T., KURIYAMA H., UENO H. Mechanisms of the nitroglycerine-induced
vasodilation in vascular smooth muscles of the rabbit and pig. Journal of
Physiology (London) v.343,p.233-252, 1983.
JÁCOME, R.L.R.P.; SOUZA, R.A.; OLIVEIRA, A.B. Comparação cromatográfica
entre o extrato de Aspidosperma parvifolium e o fitoterápico “Pau-Pereira”.
Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 13, p. 39- 41, 2003.
JIANG H., SHABB J.B. & CORBIN J.D. Cross-activation: overriding cAMP/cGMP
selectivities of protein kinases in tissues. Biochemistry and Cell Biology , v.70,
p.1283-1289,1992.
KARAKI, H., SATO, K., OZAKl, H. et. aI. Effects of sodium nitroprusside on
cytosolic calcium levei in vascular smooth muscle. European Journal of
Pharmacology, V. 156, p. 259-266, 1988.
KATZUNG, B.G. Farmacologia básica e clínica. 9.ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2006.
KEEF, K. D. & BOWEN, S. M. Effect of ACh on electrical and mechanical activity
in guinea pig coronary arteries. American Journal of Physiology., v. 257, p.
H1096-1103, 1989.
106
KEEF, K. D. & ROSS, G. Rhythmic coronary arterial contractions: changes with
time and membrane potential. American Journal of Physiology, v. 250, n. 3, p.
H524-529,1986.
KIM N., AZADOI K.M., GOLDESTEIN I. & SAENZ DE TEJADA. A oxide nitric-like
factor mediates neurogenic relaxation of penile smooth muscle. Journal of
Clinical Investigation, v.88, p.112-118,1991.
KITAZAWA, T. & SOMLYO, A. P. Desensitization and muscanruc resensitization
of force and myosin light chain phosphorylation to cytoplasmic Ca2+ in smooth
muscle. Biochemical and Biophysical Research Communication. v. 172, p.
1291-1297, 1990.
KOBAYASID, S., SOMLYO, A. P. and SOMLYO, A. V. Guanine nucleotideand
inositol 1,4,5-trisphosphate-induced calcium release in rabbit main pulmonary
artery. J. Physiol. (London), v. 403, p. 601-19, 1988.
KOTECHA , N. & NEILD, T. O. Actions of vasodilatos nerves on arteriolar smooth
muscle and neurotransmitter release from sympathetic nerves in the guinea-pig
small intestine. Journal of Physiology. (London), v. 489, n. 3, p. 849-855, 1995.
KRANE RJ, GOLDSTEIN I & SAENZ DE TEJADA I. Impotence. New England
Journal of medicine, v.321, p.1648-1659,1989.
KUTCHAN, T. Alkaloid biosynthesis – the basis for metabolic engineering of
medicinal plants. Plant Cell, v. 77, p. 1059 – 1070, 1995.
LEE, H. C. & AARHUS, R. Wide distribution of an enzyme that catalyzes the
hydrolysis of cyclic ADP-ribose. Biochimica et Biophysica Acta ., v. 1164, n.1,
p. 68-74, 1993.
LEHNER, H.; SHCMUTZ, J. Dihydro-olivacin um dihydro-ellipticin (u-alkaloid D)
aus Aspidosperma ulei MGF. Helvetica Chimica Acta, v. 44, n. 2, p. 444 – 446,
1961.
107
LIVINGDTON, R. B. Viceral control mecanisms. In: Physiological Basis of
Medical Practice. Best and Taylor, 12. Ed. p. 1053-1067, 1991.
MACABEO, A.P.G.; KROHN, K.; GEHLE, D.; READ, R.W.; BROPHY, J.J.;
CORDELL, G.A.; FRANZBLAU, S.G.; AGUINALDO, A.M. Indole alkaloids from
the leaves for Philipine Alstonia scholaris. Phytochemistry, in press, 2005
MACIEL, M.A.M., PINTO, A.C., VEIGA J.R., GRYNBERG N.F., ECHEVARRIA A.
Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares Química Nova,
v: 25, n.03, p.429-438, 2002.
MAJERUS, P.W Inositol phosphate biochemistry. Annual Reviews of
Biochemical., v. 61, p. 225-250, 1992.
MARCO L, DO CARMO CARREIRAS M. Galanthamine, a natural product for the
treatment of Alzheimer's disease. Recent Patents CNS Drug Discovery. v.1, n.
1, p - 105-11. Review. 2006.
MARINHO, M.L.; ALVES, M.S.; RODRIGUES, M.L.C.; ROTONDANO, T.E.F.;
VIDAL, I.F.; SILVA, W.W.; ATHAYDE, A.C.R. ; A utilização de plantas medicinais
em medicina veterinária: um resgate do saber popular. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais., Botucatu, v.9, n.3, p.64-69, 2007.
MASSIOT, G.; BOUMENJDEL, A.; NUZILLARD, J.M.; RICHARD, B.; MEN-
OLIVIER, L.L.; DAVID, B.; HADI, H.A. Alkaloids from Alstonia undulifolia.
Phytochemistry, v. 31, n. 3, p. 1078 – 1079, 1992.
MCDANIEL NL, CHEN XL, SINGER HA, MURPHY RA, REMBOLD CM.
Nitrovasodilators relax arterial smooth muscle by decreasing [Ca2+]i and
uncoupling stress from myosin phosphorylation. American Journal of
Physiology, v.263, p.C461-C467, 1992.
MCPHERSON, G. A. & ANGUS, J. A. Evidence that acetylcholine-mediated
hyperpolarization of the rat small mesenteric artery does not involve the K+
108
channel opened by cromakalim. British Journal Pharmacology., v. 103, n. 1, p.
1184-1190, 1991.
MEISS, R. A. Mechanical properties of gastrointestinal smooth muscle. In:
SCHULTZ, S. G., WOOD, J. D. et aI (ed) Handbook of Physiollogy. Baltimore:
American Physiological Society. Cap. 8, p. 273-329,1989.
MISSIAEN. I., DE SMEDT, H., DROOGMANS, G. et. aI. Ca2+ release induced by
inositol 1,4,5- triphosphate is a steady-state phenomenon controlled by luminal
Ca
2+
in permeabilized cells. Nature (London) v. 357, p. 599-602, 1992.
MURPHY M.E.
&
BRAYDEN J.E.Nitric oxide hyperpolarizes rabbit mesenteric
arteries via ATP-sensitive potassium channels. Journal of
Physiology, v. 486, p.
47-58. 1995.
MURPHY, R.A. Structural proteins in the myofilaments and regulation of
contraction in vertevrate smooth muscle. Fed Proc. V. 35(6), p. 1302-1306, 1976.
NAYLOR, A.M., Endogenous neurotransmitters mediating penile erection. British
Journal of Urology , v.81, p. 424-431, 1998.
NEILD, T. O. & KOTECHA, N. Relation between membrane potential and
contractile force in smooth muscle of the rat tail artery during stimulation by
norepinephrine, 5-hydroxytryptamine, and potassium. Circulation Research., v.
60, n. 5,p. 791-795, 1987
NELSON, M. T., STANDEN, N. B., BRA YDEN, J. E. et. alo Noradrenaline
contracts arteries by activating voltage-dependent calcium channels. Nature., v.
336, n. 6197, p. 382-385, 1988.
NIH Consensus Conference – Impotence. The Journal of American Medical
Association, v. 270, p. 83 – 90, 1993.
109
NIXON, G. F., MIGNERI, G. A. and SOML YO, A. V. Imunogold loealization of
inositol 1,4,5-triphosphate reeeptors and eharaeterization of ultrastuetural features
of the sareoplasmie retieulum in phasie and tonie smooth muscle. J. Journal of
Muscle Research and Cell Motility ., v. 15, p. 682-700, 1994.
NOGUEIRA, M. A. & D'OCON, M. P. Participation of intraeellular ealeium stores
in serotonin-induleed eontraetions in rat aorta. Pharmacology., v. 47, p. 145-151,
1993.
OZAKl, H., GERTHOFFER, W. T., PUBLICOVER, N. et. alo Time-dependent
changes in Ca2+ sensitivity during phasic contraction of carune antral smooth
muscle. Journal of Physiology. (London), v. 440, p. 207-224, 1991.
PACAUD, P. & LOIRAND, G. Release of Ca2+ by Noradrenaline and ATP from
the same Ca2+ store sensitive to both InSP3 and Ca2+ in rat portal vein
mYQcytes. Journal of Physiology. (London), v. 484, n. 3, p. 549- 555, 1995
PALMER RJM, FERRIGE AG & MONCADA S Nitric oxide release accounts for
the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, 327; 524-
526,1987.
PEREIRA, M.; JÁCOME, R. P.; ALCÂNTARA, A.F.C.; ALVES, R. B. ; RASLAN,
D. S. Alcalóides indólicos isolados de espécies do gênero Aspidosperma
(Apocynaceae). Química Nova vol.30 no.4 São Paulo July/Aug. 2007
PICADA, J. N.; SILVA, K. V. C. L.; ERDTMANN, B.; HENRIQUES, A. T.;
HENRIQUES, J. A. P.; Genotoxic effects of structurally related beta-carboline
alkaloids. Mutation Research., v.379, p.135,1997.
PICKARD R.S., POWELL, P.H. & ZAR M.A. The effects of inhibition of nitric oxide
biosynthesis and cyclic GMP formation on nerve-evoked relaxation of human
cavernosal smooth muscle. British Journal of Pharmacology, v.104,p.755-
759,1991.
110
PINTO A.C., SILVA D.H.S., BOLZANI V.S., LOPES N.P., EPIFANIO R.A.
Produtos naturais: atualidades, desafios e perspectivas. Química Nova. v: 25, p:
45-61, 2002.
POPESCU L.M., FORIL C.P., HINESCU M., PANOIU C, CINTEZA M.,
GHERASIM, L. Nitroglycerin stimulates the sarcolemmal Ca
++
-extrusion ATPase
of coronary smooth muscle cells. Biochemical Pharmacology v.34, n.10,
p.1857-1860, 1985.
QUAYLE, J.M., BONEV, A.D., BRAYDEN, J.E., NELSON, M.T. Calcitonin gene-
related peptide activated ATPsensitive K+ currents in rabbit arterial smooth
muscle via protein kinase A. Journal of Physiology (London),v. 475, p. 9-13,
1994.
Rang, H.P. & Dale, M.M. Farmacologia, 5ª ed., Elsevier, Rio de Janeiro, 2004
RAPOPORT R.M.
&
MURAD·F. Agonist-induced endothelium-dependent
relaxation in rat toracic aorta may be mediated through cGMP. Circulation
Research, v.52, p.352-357,1983.
RAPOPORT, R.M., WALDMAN, S.A., SCHWARTZ, K., WINQUIST, R.J. E
MURAD, F. Effects of atrial natriurético factor, sodium nitroprusside, and
acetylcholine on cyclic GMP levels and relaxation in rat aorta. European Journal
Pharmacology v.115, p.219-229, 1985.
RASMUSSEN, H; TAKUWA, Y E PARK, S. Protein kinase C in the regulation of
smooth muscle contraction. FASEB JOURNAL , v.1, p.177-185, 1987.
RECIO, P., LOPEZ, P.G., HERNABDEZ, M., PRIETO, D., CONTRERAS, J. &
GARCIA-SACRISTAN, A. Nitrergic relaxation of the horse corpus cavernosum.
Role of GMPc. European Journal Pharmacology, v.351, p. 85-94, 1998.
111
REMBOLD, C. M. Electromechanical and pharmacomechanical conpling im
biochemistry of smooth muscle contration. Academic Press., v. 18, p. 227-
239,1996
REMBOLD, C. M. Modulation of the [Ca
2+
] sensitivity of myosm phosphorylation in
intact swine arterial smooth muscle. Journal of Physiology. (London), v. 429, p.
77-94, 1990.
REMBOLD, C. M. Regulation of contraction and relaxation in arterial smooth
muscle. Hypertension. v. 20, n. 2, p. 129-137, 1992.
REMBOLD, C. M., WEA VER, B. A. and LINDEN, 1. Adenosine triphosphate
induces a low [Ca
2+]
i sensitivity of phosphorylation and an unusual form of
receptor desensitization in smooth muscle. Journal of Biological Chemistry
., v. 266, n. 9, p. 5407-5411, 1991.
RIBEIRO, J. E. L. S.; HOPKINS, M. J. G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C. A.;
COSTA, M. A. S.; BRITO, J. M.; SOUZA, M. A. D.; MARTINS, L. H. P.;
LOHMANN, L. G.; ASSUNÇÃO, P. A. C. L.; PEREIRA, E. C.; SILVA, C. F.;
MESQUITA, M. R.; PROCÓPIO, L. C.; Flora da Reserva Ducke: Guia de
Identificação das Plantas Vasculares de uma Floresta de TerraFirme na
Amazônia Central, INPA: Manaus, 1999.
RIVAS, P.; CASSELS, B. K.; MORELLO, A.; REPETTO, Y.; Biochemistry.
Physiology., Part C ,v.122, n. 27,1999.
ROBBERS, J.E.; TYLER, V.E.; SPEEDIE, M.K. Pharmacognosia e
farmacobiotecnilogia. Nova iorque: William & wilkim,. 337p.,1996.
ROBERT M. BERNE & MATTHEW N. LEVY & BRUCE M. KOEPPEN & et al.
Fisiologia elsevier. p- xx – xx, 2004.
ROBERTSON B.E., SCHUBERT R., HESCHELER J., NELSON M.T. cGMP-
dependent protein kinase activates Ca-activated K channels in cerebral artery
112
smooth muscle cells. American Journal of Physiology, v.265, p.C299-
C303,1993.
RODRIGUEZ-MANZO, G. Yohimbine interacts with the dopaminergic system to
reverse sexual satiation: further evidence for a role of sexual motivation in sexual
exhaustion. European Journal of Pharmacology, v. 372, n. 1, p. 1 – 8, 1999.
ROJAS, E., NASSAR-GENTINA, v., POLLARD, M. E. et. aI. Mechanisms of
calcium release from terminal cistemae in crustacean muscle. Advances in
Experimental Medicine and Biologyv.311, p. 305-317, 1992.
SATO, S. O. Uso de plantas nativas de cerrados da região de Baule, na medicina
popular- o pequí (carioca brasiliens e Camb), v. 6, n. 1, p. 32-40, 1987.
SCHMUTZ, J.; HUNZIKER, F.; HIRT, R. Ulein, das hauptalkaloid von
Aspidosperma ulei Mgf. Helvetica Chimica Acta, v. 40, n. 5, p. 1189 – 1200,
1957.
SCHRAMMEL, A.; BEHRENDS, S.; SCHMIDT, K.; KOESLING, D.; MAYER, B.
Characterization of 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinolaxin-1-one as a heme site
inhibitor of nitric oxide-sensitive guanylyl ciclase. Molecular Pharmacology, v.
50, p. 1 – 5, 1996.
SCHULTZ, K.
&
SCHULTZ, G. Sodium nitroprusside and other smooth muscle-
relaxants increase cyclic GMP levels in rat ductus deferens. Nature, v. 265, p.
750-751, 1977.
SIMÕES, O.M.C.;SCHENKEL, P.E.; GOSMAN, G.; MELO, P.C.J.; MENTZ, A. L.
Farmacognosia da planta ao medicamento. 5º edição. Porto alegre 2004.
SOARES, K.C.N.; MASUDA, E.T.; RATTMANN, Y.D.; SOUZA, M.; VELA, W.M.;
RIECK, L.; DA SILVA-SANTOS, J.E. Efeitos da uleína sobre a contratilidade do
músculo liso: envolvimento dos canais de cálcio. XXXVI Congresso de
Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 2004.
SOMLYO, A. P. Excitation-contraction coupling and the ultrastucture of Smooth
Muscle. Circulation Research., v. 57, p. 479-507, 1985.
113
SOMLYO, A. V. & SOMLYO, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical
coupling in vascular smooth muscle. The Journal of pharmacology and
experimental therapeutics ., v. 159, p. 129-145, 1968.
SPERELAKIS, N. Excitation-contraction coupling in cardiac muscle and Smooth
Muscle. ln: SPERELAKlS, N. & BANKS, R. O. (Eds.) Physiology. Boston:
LittleBrown, 1993.
STEFAN UCKERT - PETTER HEDLUND; EGINHARD WALDKIRCH - MICHAEL
SOHN - UDO JONAS; KARL-ERIK ANDERSSON - CHRISTIAN G. STIEF.
Interactions between cGMP- and cAMP-pathways are involved in the regulation of
penile smooth muscle tone. World Journal of Urology 22: 261–266, 2004.
STORK, A. P. & COCKS, T. M. Pharmacological reactivity of human epicardial
coronary arteries: phasic and tonic responses to vasoconstrictor agents
differentiated by nifedipine. British Journal of Pharmacology., V. 113, p.
10931098,1994.
STULL, JT, HSU, LC, TANSEY, MG AND KAMM, KE. Myosin light chain kinase
phosphorylation in tracheal smooth muscle. Journal of Biological Chemistry,
v. 265, p. 27, p.166-166, 1990.
TANG, D. C., STULL, T, KUBOTA.
Y
et. aI. Regulation of the calcium
dependence of smooth muscle contraction. J. Biol. Chem., v. 267, p. 11839-
11845, 1992.
TEIXEIRA, C. E.; BENTO, A.C.; LOPES-MARTINS R.A.B.; TEIXEIRA, A.S.; VON
EICKESTEDT, V.; MUSCARÁ, M.N.; ARANTES,E.C.; GIGLIO, J.R.; ANTUNES &
DE NUCCI G. Tityus serrulatus venom scorpion relaxes the isolated rabbit corpus
cavernosum by activating NANC nitrergic nerves fibers. British Journal
Pharmacology, v. 123, p. 816-820, 1998b.
114
TEIXEIRA, C. E
.
; TEIXEIRA, E; ANTUNES AND G. DE NUCCI. The role of nitric
oxide on the relaxations of rabbit corpus cavernosum induced by Androctonus
australis and Buthotus judaicus scorpion venoms. Toxicon, v. 39, n. 5, p. 633-
639, 2001.
THORNBURY, K.D.; WARD, S.M.; DALZIEL, H.H.; CARL, A.; WESTFALL, D.P.;
SANDERS, K.M.; Nitric oxide and nitrosocysteine mimic nonadrenergic,
noncholinergic hyperpolarization in canine proximal colon. American Journal of
Physiology v. 261, p. G553-G557, 1991.
TODA N, AYAJIKI K, OKAMURA T. Nitric oxide penile erectile function.
Pharmacology & Therapeutics, v.106, n.2, p.233-266, 2005.
TOSELLI, P.; MORELAND, R.; TRAISH, A.M. Detection of m2 muscarinic
acetylcholine receptor mRNA in human corpus cavernosum by in-situ
hybridization. Life Science. n.55, p. 621-627. 1994.
TRAISH, A.M.; NETSUWAN, N.; DALEY, J.; PADMAN-NATHAN, P.;
GOLDSTEIN, I.; SÁENZ DE TEJADA, I. A heterogenous population of alpha-1-
Ars mediates contraction of human corpus cavernosum smooth muscle to
norepinephine. The Journal of Urology, v. 153, p. 222 – 227, 1994.
TRAISH, A; NETSUWAN, N; DALEY,J; PADMAN-NATHAN, H; GOLDSTEIN, I.
SAENZ DE TEJADA, I. A heterogenous population of α
1
adrenergic receptors
mediates contraction of human corpus cavernosum smooth muscle to
norepinephrine. Journal of Urology , n. 153, p. 222-227, 1995b.
TWORT, CH E VAN BREEMEN, C. Cyclic guanosine monophosphate-enhanced
sequestration of Ca
2+
by sarcoplasmic reticulum in vascular smooth muscle.
Circulation Research , v. 62, n. 5, p. 961-964, 1988.
VALDIVIA, C., VAUGHAN, D., POTTER, B. V. et. aI. Fast release o 45Ca induced
by inositol 1,4,5-trisphosphate and Ca
2+
in the sarcoplasrnic reticulum of rabbit
skeletal muscle: evidence for two types of Ca
2+
release channels. Biophysical. v.
61, n. 5, p. 1184-1193, 1992.
115
VILELA, J. D. produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas Revista
Paulista de Medicina., n.89, p.115. 1977.
WENIGER, B.; ROBLEDO, S.; ARANGO, G. J.; DEHARO, E.; ARAGON, R.;
MUÑOZ, V.; CALLAPA, J.; LOBSTEIN, A.; ANTON, R.; Journal of
Ethnopharmacology. V. 78, n.193. 2001.
WHITE, M. V.: Muacarinic receptors in human airways. Journal of Allergy and
Clinical Immunology. n. 95, p - 1065-1968, 1995.
WHO. Guidelines for the Assessment of Herbal Medicines, World Health
Oganization,Geneva; 1991.
WORD, R.A.; CASEY, M.L.; KAMM, K.E.; STULL, J.T.; Effects of cGMP on
[Ca
2+
]i, myosin light chain phosphorylation, and contraction in human
myometrium. American Journal of Physiology, v. 260, p. C861 - C867, 1991.
ZHANG, Y. & LANG, R. J. Effects of intrinsic prostaglandins on the spontaneous
contractile and eletrical activity of the proximal renal pelvis of the guinea-pig.
British journal of Pharmacology, v. 113, p. 431- 438,1994.
116
ANEXOS
Tabela 1. Efeito de SEC na contração induzida por fenilefrina 10µM no corpo
cavernoso de coelhos. A adição cumulativa de SEC (1 - 100 µg/mL) produziu
relaxamento dos tecidos pré-contraídos com fenilefrina (10µM). Os dados estão
expressos como média ± erro padrão da média (n=4) da porcentagem da
resposta máxima obtida. **p<0,01, teste t de Student.
DOSE (SEC µg/mL)
% DE RELAXAMENTO
Controle SEC
1 µg/mL
3,2 ± 1,2 11,3 ± 1,5
3 µg/mL
10,2 ± 2,3 28,3 ± 5,3
10 µg/mL
19,2 ± 4,5 61,5 ± 11,2**
30 µg/mL
13,1 ± 4,8 91,1 ± 0,0**
100 µg/mL
21,3 ± 5,2 100,0 ± 0,0**
Tabela 2. Efeito de SEC na contração induzida por fenilefrina 10 µM em anéis de
aorta de coelhos na presença e na ausência de endotélio A adição cumulativa de
SEC (1 - 100 µg/mL) produziu relaxamento dos tecidos pré-contraídos. Os dados
estão expressos como média ± erro padrão da média (n=4) da porcentagem da
resposta máxima. p > 0,05.
DOSE (SEC µg/mL)
% DE RELAXAMENTO
Com Endotélio Sem endotélio
1 µg/mL
3,3 ± 1,5
0,30 ± 0,30
3 µg/mL
17,0 ± 6,5
10,9 ± 4,9
10 µg/mL
39,6 ± 10,8
25,1 ± 9,2
30 µg/mL
72,5 ± 13,2
61,0 ± 16,6
100 µg/mL
100,0 ± 0,0
91,7 ± 8,3
117
Tabela 3. Efeito de SEC na contração induzida por carbacol (CCH) 10 µM em
anéis de traquéia de coelhos. A adição cumulativa de SEC (1 - 100 µg/mL )
produziu relaxamento dos tecidos pré-contraídos. Os dados estão expressos
como média ± erro padrão da média (n=4) da porcentagem da resposta máxima.
DOSE (SEC µg/mL)
% RELAXAMENTO MÁXIMO
1 µg/mL
1,4 ± 0,8
3 µg/mL
4,0 ± 1,6
10 µg/mL
5,1 ± 3,5
30 µg/mL
24,5 ± 8,2
100 µg/mL
95,9 ± 1,5
Tabela 4. Efeito de SEC sobre a atividade espontânea de segmentos de duodeno
de coelhos. A adição cumulativa de SEC (1 - 100 µg/mL) produziu uma inibição
na atividade espontânea do tecido. Os dados estão expressos como média ± erro
padrão da média (n=4) da porcentagem da resposta máxima.
DOSE (SEC µg/mL)
% RELAXAMENTO MÁXIMO
1 µg/mL
8,3 ± 5,9
3 µg/mL
25,3 ± 6,5
10 µg/mL
33,1 ± 5,4
30 µg/mL
78,1 ± 9,0
100 µg/mL
93,5 ± 6,6
118
Tabela 5. Efeito de SEC (1 – 100 µg/mL) em corpos cavernosos de coelhos
isolados pré-contraídos com fenilefrina (PHE) 10 µM na presença de
glibenclamida (10 µM), apamina e iberiotoxina (0,1µM). A pré-incubação com a
associação apamina/iberiotoxina/glibenclamida não alterou a resposta de SEC.
Os dados mostram média ± erro padrão (n=4) da porcentagem da resposta
máxima obtida. p > 0,05.
DOSE (SEC µg/mL)
% DE RELAXAMENTO
SEC SEC + APA/IBTX/GLIB
1 µg/mL
8,6 ± 4,2 3,83 ± 0,56
3 µg/mL
19,3 ± 7,5 10,59 ± 1,01
10 µg/mL
40,8 ± 10,1 25,73 ± 0,92
30 µg/mL
61,4 ± 9,3 43,91 ± 2,34
100 µg/mL
95,3 ± 4,8 89,36 ± 1,69
Tabela 6. Efeito de SEC (1 – 100 µg/mL) em corpos cavernosos de coelhos
isolados pré-contraídos com fenilefrina (PHE) 10 µM na presença de atropina (10
µM). A pré-incubação com atropina (10 µM) não alterou a resposta de SEC. Os
dados mostram média ± erro padrão (n=4) da porcentagem da resposta máxima
obtida, p > 0,05.
DOSE (SEC µg/mL)
% DE RELAXAMENTO
SEC
SEC + ATROPINA (10µM)
1 µg/mL
12,7 ± 3,0 10,2 ± 2,2
3 µg/mL
38,0 ± 4,0 14,6 ± 3,1
10 µg/mL
63,0 ± 4,9 44,0 ± 3,9
30 µg/mL
79,0 ± 4,3 66,3 ± 4,6
100 µg/mL
100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
119
Tabela 7. Efeito de SEC (1 – 100 µg/mL) em corpos cavernosos de coelhos
isolados pré-contraídos com K
+
40 mM na presença de guanetidina e fentolamina
(10 µM).. A pré-incubação com guanetidina (10 µM) e fentolamina (10 µM ) não
alterou a resposta de SEC. Os dados mostram média ± erro padrão (n=4) da
porcentagem da resposta máxima obtida, p > 0,05.
DOSE % DE RELAXAMENTO
SEC SEC + GUA + FEN
(10µM)
1 µg/mL
8,6 ± 4,2 1,4 ± 0,7
3 µg/mL
19,3 ± 7,5 18,1 ± 1,7
10 µg/mL
40,8 ± 10,1 35,0 ± 8,9
30 µg/mL
61,4 ± 9,3 64,2 ± 7,6
100 µg/mL
95,2 ± 4,8 100,0 ± 0,0
Tabela 8. Efeito de SEC (1 – 100 µg/mL) em corpos cavernosos de coelhos
isolados pré-contraídos com fenilefrina 10 µM na presença de ODQ (30 µM). A
pré-incubação com ODQ diminuiu a resposta de SEC. Os dados mostram
média ± erro padrão (n=4) da porcentagem da resposta máxima obtida, *p <
0,05; **p < 0,01.
DOSE % DE RELAXAMENTO
SEC SEC + ODQ
1 µg/mL
11,3 ± 1,5 0,96 ± 0,96**
3 µg/mL
28,3 ± 5,3 7,15 ± 1,33**
10 µg/mL
61,5 ± 11,2 19,82 ± 3,39*
30 µg/mL
91,1 ± 0,0 37,85 ± 9,03**
100 µg/mL
100,0 ± 0,0 79,1 ± 4,51**
120
Tabela 9. Efeito de SEC (1 – 300 µg/mL) em corpos cavernosos de coelhos
isolados pré-contraídos com fenilefrina 10 µM na presença de L-NAME
(100µM). A pré-incubação com L-NAME não alterou a resposta de SEC. Os
dados mostram média ± erro padrão (n=4) da porcentagem da resposta
máxima obtida, p > 0,05.
DOSE % DE RELAXAMENTO
SEC SEC + L-NAME
1 µg/mL
3,8 ± 1,84 4,01 ± 2,42
3 µg/mL
5,9 ± 2,65 13,7 ± 3,88
10 µg/mL
14,6 ± 4,01 16,3 ± 4,27
30 µg/mL
24,6 ± 5,5 25,3 ± 3,9
100 µg/mL
40,5 ± 7,8 41,9 ± 5,8
300 µg/mL
67,9 ± 4,9
62,3 ± 1,64
Tabela 10. Medida de GMPc em tiras de corpos cavernosos de coelhos expostas
a salina (controle), SEC (7,5 ou 15 µg/ml), SNP (1 µM) ***p<0,001 vs. controle,
ANOVA seguido de Tukey (n=4 em duplicata). #p<0,001 SNP vs. SEC15. Os
níveis de GMPc são expressos como média ± erro padrão da média.
Tabela 11. Medida de AMPc em tiras de corpos cavernosos de coelhos exposto a
salina (controle), SEC (15 µg/ml) ou forskolina (1 µM). ***p<0,001 vs. controle,
ANOVA seguido de Tukey (n=4 em duplicata). #p<0,001 FK vs. SEC15. Os níveis
de AMPc são expressos como média ± erro padrão da média.
Basal
SEC 7,5µg/ml
SEC 15 µg/ml
SNP 1µM
GMPc (%) 8,3 ± 2,9 8,5 ± 1,0 21,5 ± 4,2** 43,6 ± 1,8
Basal
SEC 7,15 µg/ml FK 1 µM
AMPc (%) 117,3 ±
7,9
331,95 ± 26,1** 1933,9 ± 116,4
121
Tabela 12. Efeito do relaxamento induzido por GTN (1-3000 mM) em segmentos
de corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (controle)
e após a pré-incubação com SEC 10 µg/ml e SEC 30 µg/ml Os dados são
expressos como média ± erro padrão da média (n=4) da porcentagem de
relaxamento dos tecidos contraídos com fenilefrina 10 µM, * p<0,05.
DOSE % DE RELAXAMENTO
GTN (controle)
GTN + SEC 10µg/ml
GTN + SEC 30µg/ml
1 mM 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
3 mM 0,0±,0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
10 mM 0,0±,0,0 2,4±1,6 6,2±0,7
30 mM 0,93±0,92 17,4±3,5 22,7±7,9*
100 mM 17,3±7,5 31,8±4,2* 37,7±7,9*
300 mM 33,1±5,1 54,0±9,1* 53,6±5,9*
1000 mM 50,9±7,3 60,9±7,5 73,2±5,8*
3000 mM 61,2±7,7 73,3±6,7 87,2±2,9*
Tabela 13. Efeito do relaxamento induzido por Forskolina em segmentos de
corpos cavernosos de coelhos pré-contraídos com fenilefrina 10 µM (controle) e
após a pré-incubação com SEC 10 µg/ml e SEC 30 µg/ml Os dados são
expressos como média ± erro padrão da média (n=4) da porcentagem de
relaxamento dos tecidos contraídos com fenilefrina (10 µM), * p<0,05.
DOSE % DE RELAXAMENTO
FK (controle)
FK + SEC 10µg/ml
FK + SEC 30µg/ml
10
-
9
M 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 4,82 ± 2,8
3.10
-
9
M 1,1 ± 1,8 2,0 ± 1,2 12,4 ± 6,1
10
-
8
M 1,1 ± 1,8 5,4 ± 2,1 15,2 ± 7,0
3.10
-
8
M 2,7 ± 1,6 9,4 ± 2,5 18,9 ± 8,9
10
-
7
M 6,2 ± 3,6 13,5 ± 4,7 28,4 ± 10,0*
3.10
-
7
M 12,0 ± 4,1 19,2 ± 4,7 40,7 ± 10,2*
10
-
6
M 16,7 ± 4,7 36,1 ± 6,9 43 ± 7,0*
3.10
-
6
M 41,2 ± 3,2 64,6 ± 8,1 81,6 ± 10,*7
10
-
5
M 62,6 ± 1,5 85,2 ± 8,9 87,7 ± 7,1*
3.10
-
5
M 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0
122
Tabela 14. Efeito de SEC no relaxamento de corpos cavernosos de coelhos
induzido por estímulo elétrico em resposta à contração induzida por fenilefrina. A
adição cumulativa de SEC (1-10 µg/ml) produziu um efeito inibitório do
relaxamento induzido pelo estímulo elétrico em tecidos pré-contraídos com
fenilefrina (10 µM). Os dados mostram média ± erro padrão (n=4) da
porcentagem da resposta máxima obtida.
TRATAMENT
O
% DE RELAXAMENTO
0,5 Hz 1Hz 2Hz 4Hz 8Hz 16Hz
Controle 0,7 ± 0,7
7,3 ± 2,7 15,2 ±
5,1
24,2 ± 5,6 38,4 ± 4,9 65,0 ± 10,9
SEC 1µg/mL 1,1 ± 1,1
3,8 ± 2,3 9,7 ± 3,3 21,5 ± 4,3 35,0 ± 7,7 55,1 ±
11,9*
SEC 3µg/mL 0,0 ± 0,0
1,4 ± 1,0*
5,8 ± 2,2*
14,3 ± 3,8*
26,3 ± 6,0*
31,2 ± 8,2*
SEC 10µg/mL 0,0 ± 0,0
1,0 ± 1,0*
3,1 ± 2,1*
5,4 ± 2,7* 8,1 ± 3,7* 10,8 ± 4,9*
Tabela 15. Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 – 100 mM) em
corpos cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante
de K
+
40 mM, 0 Ca
++
, na presença ou na ausência de SEC (3,5 µg/mL). A adição
cumulativa de SEC inibiu de forma significativa as contrações induzidas por CaCl
2
(1 – 300 mM) em corpos cavernosos de coelhos. Os dados mostram média ± erro
padrão (n=4) da porcentagem da resposta máxima obtida.
CaCl
2
% DE RELAXAMENTO
Controle SEC (3,5 µg/mL)
1mM 5,0 ± 3,3 0,0 ± 0,0
3mM 13,9 ± 1,0 1,3 ± 0,9
10mM 40,2 ± 12,2 17,6 ± 1,3
30mM 69,4 ± 8,8 52,8 ± 7,5
100mM 100,0 ± 0,0 71,9 ± 4,3
123
Tabela 16. Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 – 300 mM) em
corpos cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante
de K
+
40 mM, 0 Ca
++
, na presença ou na ausência de SEC (7,5 µg/mL). A adição
cumulativa de SEC inibiu de forma significativa as contrações induzidas por CaCl
2
(1 – 300 mM) em corpos cavernosos de coelhos. Os dados mostram média ± erro
padrão (n=4) da porcentagem da resposta máxima obtida.
CaCl
2
% DE RELAXAMENTO
Controle SEC (7,5 µg/mL)
1 mM 3,5 ± 1,5 0,0 ± 0,0
3 mM 11,3 ± 3,7 0,0 ± 0,0
10 mM 30,1 ± 3,8 5,6 ± 3,2
30 mM 61,3 ± 3,9 31,1 ± 7,3
100 mM 92,7 ± 4,6 63,3 ± 16,8
300 mM 100,0 ± 0,0 65,7 ± 17,5
Tabela 17. Efeito de concentrações cumulativas de CaCl
2
(1 – 300 mM) em
corpos cavernosos isolados de coelhos pré-contraídos por solução despolarizante
de K
+
40 mM, 0 Ca
++
, na presença ou na ausência de SEC (15 µg/mL). A adição
cumulativa de SEC inibiu de forma significativa as contrações induzidas por CaCl
2
(1 – 300 mM) em corpos cavernosos de coelhos. Os dados mostram média ± erro
padrão (n=4) da porcentagem da resposta máxima obtida.
CaCl
2
% DE RELAXAMENTO
Controle SEC (15 µg/mL)
1 mM 21,6 ± 7,7 2,5 ± 2,5
3 mM 40,5 ± 10,1 7,5 ± 7,5
10 mM 70,3 ± 8,9 20,6 ± 10,6
30 mM 84,8 ± 3,6 37,6 ± 12,5
100 mM 92,4 ± 3,1 42,7 ± 13,4
300 mM 100,0 ± 0,0 48,7 ± 12,4
124
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
