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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ANTONIO RAFAEL COELHO JORGE
Estudo dos efeitos da alta ingestão de cloreto de
sódio por via oral sobre o metabolismo diário e
função renal de ratos
.
Fortaleza
2008
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2
ANTONIO RAFAEL COELHO JORGE
Estudo dos efeitos da alta ingestão de cloreto de sódio por via oral
sobre o metabolismo diário e função renal de ratos.
Dissertação de Mestrado submetida
à Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Prof
a
. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Co-orientador: Prof
o
. Dr. Manasses Claudino Fonteles
FORTALEZA
2008
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3
ANTONIO RAFAEL COELHO JORGE
Estudo dos efeitos da alta ingestão de cloreto de sódio por via
oral sobre o metabolismo diário e função renal de ratos.
Dissertação de Mestrado submetida
à Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do título de
Mestrer em Farmacologia.
Aprovada em: ____/dezembro/ 2009
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Prof
a
. Dra. Helena Serra Azul Monteiro (Orientadora)
_______________________________________________
Prof. Dr. Manassés Claudino Fonteles
_______________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Havt
_______________________________________________
Profa. Dra. Gisela Costa Camarão
4
Senhor, tu és o nosso refúgio, sempre,
de geração em geração.
Antes de nascerem os montes
e de criares a terra e o mundo,
de eternidade e eternidade tu és Deus.
Salmo 90
5
AGRADECIMENTOS
A Deus todo poderoso que está sempre ao meu lado me guiando e me
mostrando que nada é impossível.
Aos meus pais Margarida e Milton, que sempre me apóiam e me
oferecem um porto seguro mesmo nas mais tenebrosas tempestades.
A Dra. Helena Serra Azul Monteiro, pela confiança de ter me aceito
como orientando e pela dedicação oferecida, com sua imensa experiência e
sabedoria.
Ao Dr. Manassés Claudino Fonteles, por ter idealizado esse trabalho tão
fascinante e ter depositado em mim a confiança de realizá-lo.
Ao Dr. Alexandre Havt, pelos conselhos e sua dedicação em ensinar
tudo pacientemente, um exemplo de pesquisador a ser seguido.
Aos meus amigos Renata de Sousa Alves e René Duarte que me
receberam tão bem desde o primeiro dia que entrei no laboratório e me
ensinaram as técnicas básicas necessárias para desenvolver esse trabalho.
Aos pós-graduandos, mestrandos e doutorandos, do Laboratório de
Farmacologia de Venenos e Toxinas (LAFAVET) Daniel Freire, Rafael
Ximenes, Terentia, Fabíola Carine, Daniela Amora, Paulo César, Juliana,
Ticiana, Claudênio, pela ajuda e amizade que me foram prestadas.
Aos alunos de Iniciação Científica Isadora, Diego, Neto, João Vítor, Ana
Luiza, João Paulo, pela ajuda e apoio nos experimentos.
Aos funcionários do IBIMED José Amadeus, Silvia Helena, Domingos
Barreto, Terezinha, Juciê, Bento, Charliene, Francisca que me ajudaram e me
ensinaram muitas das técnicas e do funcionamento do laboratório.
Aos meus amigos e colegas que compartilharam comigo diversos
momentos no Departamento de Fisiologia e Farmacologia.
As secretárias do Programa de Pós-graduação em Farmacologia Aura e
Márcia, por sempre me atenderem com atenção e presteza.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e desenvolvimento (CNPq) pela
bolsa auxílio para execução deste trabalho.
A todos os meus amigos e familiares que contribuíram direta ou
indiretamente na conclusão deste trabalho, agradeço a todos!
6
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ABREVIAÇÕES
LISTA DE TABELA
LISTA DE FIGURAS
1. INTRODUÇÃO
17
1.1. Regulação da excreção renal de Cloreto de Sódio (NaCl)
18
1.2. Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona
19
1.3. Peptídeos Natriuréticos
20
1.4. Peptídeo Guanilina e Uroguanilina
22
1.5. Efeitos Gerais das Guanilinas
25
1.6. O Receptor Guanilato Ciclase
28
1.7. O Peptídeo Guanilina nas Fisiopatologias
34
1.8. Considerações Gerais
35
2. JUSTIFICATIVA
37
3. OBJETIVOS
39
3.1. Objetivo Geral
40
3.2. Objetivos Específicos
40
4. MATERIAL E MÉTODOS
41
4.1. Animais de Experimentação
42
4.2. Avaliação do metabolismo diário
42
4.3. Grupos Experimentais
42
7
4.4. Perfusão de Rim Isolado
43
4.4.1. O Sistema de Perfusão
43
4.4.2. Calibração do Sistema
45
4.4.3. Solução Perfusora
47
4.4.4. Substâncias Utilizadas
48
4.4.5. Técnica Cirúrgica
48
4.4.6. Protocolo Experimental
50
4.4.7. Análises Bioquímicas
50
4.4.8. Cálculo dos parâmetros renais
50
4.5. Análises Estatísticas
52
4.6. Comitê de ética
52
5. Resultados
53
5.1. Avaliação do metabolismo diário
54
5.2. Perfusão de Rim Isolado
58
6. DISCUSSÃO
75
7. CONCLUSÕES
83
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
85
ANEXO
8
RESUMO
Estudo dos efeitos da alta ingestão de cloreto de sódio por via oral sobre
o metabolismo diário e função renal de ratos. Mestrando: Antonio Rafael
Coelho Jorge. Orientadora: Dra. Helena Serra Azul Monteiro, Universidade
Federal do Ceará. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. 2008.
Guanilina (GN), uroguanilina (UGN) e a enterotoxina termo-estável da
Escherichia coli (STa) fazem parte de uma nova família de peptídeos que
ativam a formação de cGMP. A ingestão de sal na dieta induz a secreção de
GN e UGN no lúmen intestinal, inibindo a reabsorção de sódio e induzindo a
secreção de Cl
-
, HCO
3
-
e água. Simultaneamente, esses hormônios estimulam
a excreção renal de eletrólitos através da indução de natriurese, caliurese e
diurese. Esse mecanismo altamente integrado permite a manutenção do sódio
corporal, através da eliminação desse excesso de sódio pela urina. Entretanto,
essa regulação fisiológica entre o intestino e o rim na tem sido muito bem
estudada. O objetivo desse trabalho é estudar as alterações no metabolismo
diário e na função renal de ratos submetidos a uma alta ingestão de cloreto de
sódio. Os efeitos forma examinados usando ratos Wistar mantidos por 10 dias
em gaiolas metabólicas. O grupo controle recebeu somente água destilada,
enquanto que os grupos tratados receberam 1% e 2% de solução de NaCl.
Forma analisadas diariamente o volume urinário, o peso corporal e o consumo
de água e alimento. A função renal foi avaliada através da perfusão de rim
isolado de ratos após dez dias de tratamento em gaiolas metabólicas, onde a
perfusão foi realizada com solução de Krebs-Henseleit modificada com 6g% de
albumina bovina. Os dados foram comparados através de teste t de Student e
ANOVA, com significância p<0,05. O peso dos ratos tratados com 2% de NaCl
apresentou uma redução a partir do dia 8, em relação ao controle, enquanto
que 1% não apresentou redução significativa. O volume urinário e o consumo
de água apresentaram um aumento em ambos os tratamentos a partir do dia 2.
O consumo de alimento ingerido não apresentou grandes variações entre os
grupos. Em rim isolado de rato ambos os tratamentos aumentou a pressão de
perfusão (PP). A resistência vascular renal (RVR), o fluxo urinário (FU), o ritmo
de filtração glomerular (RFG) e o clearance osmolar (Cosm) aumentou no
grupo de 1% comparado ao controle, porém esses mesmos parâmetros
diminuíram no grupo de 2%. Em relação ao transporte de eletrólitos observa-se
alteração somente no grupo de 2%, onde reduziu o transporte de sódio
(%TNa
+
, %pTNa
+
), potássio (%TK
+
, %pTK
+
) e cloreto (%TCl
-
, %pTCl
-
). Esses
resultados sugerem que a alta ingestão de NaCl na dieta promove significativa
alterações no metabolismo diário e na função renal.
Plavras-chaves: guanilina, uroguanilina, NaCl, cGMP, gaiolas metabólicas,
perfusão de rim isolado.
9
ABSTRACT
Study of effects on the daily metabolism and the renal function of rats
under high oral ingestion of sodium chloride. Antonio Rafael Coelho Jorge.
Advisor: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro. Master’s Dissertation. Post-
Graduate Program in Pharmacology. Faculty of Medicine. Department of
Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceara, 2008.
Guanylin (GN), uroguanylin (UGN), and the bacterial heat-stable enterotoxin
(ST) peptides comprise a new family of cyclic guanosine 3’-5’ monophosphate
(cGMP)-regulating agonist. Ingestion of a salt meal induces secretion of GN and
UGN into the intestinal lumen, where they inhibit Na
+
absorption and induces Cl
-
, HCO
3
-
, and water secretion. Simultaneously, these hormones stimulate renal
electrolyte excretion by inducing natriuresis, kaliuresis, and diuresis. The highly
integrated mechanism allows the organism to maintain sodium balance by
eliminating excess NaCl in the urine. However, their physiological regulation
within the kidney has not been studied. The aim of this study was showing
changes on daily metabolism and renal function of rat under high sodium
chloride ingestion. Its effects were examined using wistar rats maintained for
ten days in metabolic cages. Control group received only water, two more
groups received 1% and 2% solutions of sodium chlroride. We daily analyzed
urinary volume, weigh, and food and water consume. The renal function was
evaluated using isolated perfused kidneys, in which the kidneys were perfused
after ten days in metabolic cages, only with Krebs-Henseleit solution containing
6g% of a previously dialysed bovine albumine serum. All data were analyzed by
ANOVA and Student t-test with level of significance set at *p<0,05. Rat’s
weights of 2% group decreased after eighth day, compared with control group,
while 1% group did not show significative weight lost. Urinary volume and water
consume increased, in both treatments, from second day. Food consume did
not show significative among groups. In isolated kidney both treatments
increase perfusion pressure (PP). The renal vascular resistence (RVR), urinary
flow (UF), glomerular filtration rate (GFR) and the osmolar clearance (Cosm)
increased in the 1% group compared with control group, however decreased in
2% NaCl group. Treatment with 2% NaCl decreased the sodium (%TNa
+
,
%pTNa
+
), potassium (%TK
+
, %pTK
+
) and chloride (%TCl
-
, %pTCl
-
). These
results suggest that a high salt ingestion on diet promote significative changes
on daily metabolism and the renal function of rats.
Key-words: guanylin, uroguanylin, NaCl, cGMP, metabolic cages, isolated
perfused kidney.
10
LISTA DE ABREVIATURAS
ANP – Peptídeo natriurético atrial
ATP – Trifosfato de adenosina
ADH – Hormônio antidiurético
ACTH - Adrenocorticotropina
BNP – Peptídeo natriurético cerebral
cDNA – DNA complementar
CF – Fibrose cística
CFTR – Proteína reguladora da condução transmembrana da fibrose cística
cAMP – adenosina monofosfato cíclica
cGMP – guanidina monofosfato cíclica
C osm. - clearance osmótico
FU - fluxo urinário
GC – Guanilato ciclase
GN – guanilina
mRNA – RNA mensageiro
NO – óxido nítrico
OK-GC – Receptor guanilato ciclase encontrado em rim de gambá
PDE – Fosfodiesterase
PKA-II – Proteína quinase II, dependente de cAMP
PKG-II – Proteína quinase II, dependente de cGMP
PLA
2
– fosfolipase A
2
PP - pressão de perfusão
%TCl - percentual de cloro tubular total transportado
%pTCl - percentual de cloro tubular proximal transportado
TCl – transporte de cloreto
%TK - percentual de potássio tubular total transportado
%pTK - percentual de potássio tubular proximal transportado
TK – Transporte de potássio
%TNa – percentual de sódio tubular total transportado
%pTNa - percentual de sódio tubular proximal transportado
TNa – transporte de sódio
11
RFG - ritmo de filtração glomerular
RVR - resistência vascular renal
STa - enterotoxina termo-estável da Escherichia coli
UGN – uroguanilina
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Polipeptídios precursores das formas de guanilina de
rato, uroguanilina e linfoguanilina de gambá, cuja
cadeia de aminoácidos é constituída por 115, 109 e 109
resíduos respectivamente. A porção COOH terminal é
biologicamente ativa sendo os aminoácidos
representados por sua abreviação. 24
Figura 2: Estrutura primária de peptídeos da família das
guanilinas e da toxina termo-estável da E. coli (STa),
estão representadas as pontes de dissulfeto que fazem
ligações entre as cisteínas. As classes são agrupadas
em ordem de descoberta. 26
Figura 3: Sinalização dos peptídeos da família das guanilinas no
intestino. 27
Figura 4: Estrutura molecular da guanilato ciclase C (GC-C) na
sua forma dimerizada. O ligante (L) corresponde a GN,
UGN ou STa. 30
Figura 5: Mecanismo de sinalização celular do peptídeo GN e
UGN em células de túbulo proximal renal. GN ativa
duas vias de sinalização: GC-C e cGMP dependentes e
ativada por proteína G sensível à toxina pertussis. 33
Figura 6: Foto do sistema de perfusão de rim isolado. 44
Figura 7: Representação esquemática do sistema de perfusão de
rim isolado. 45
Figura 8: Valores de pressão de perfusão (PP) registrados
durante a calibração do sistema (n=6). 46
Figura 9: Valores registrados pelo fluxômetro (L/h) durante a
calibração do sistema (n=6). 46
Figura 10: Valores de volume urinário (mL/min) registrados
durante a calibração do sistema (n=6). 47
Figura 11: Técnica cirúrgica. A - veia femoral; B - ureter direito
canulado; C - artéria mesentérica; D - cânula arterial. 49
13
Figura 12: Medições diárias do peso de ratos submetidos a uma
ingestão diária de solução de 1% e 2% de NaCl na
água durante o período de 10 dias em gaiolas
metabólicas (n=6). 55
Figura 13: Medições diárias do volume urinário de ratos
submetidos a uma ingestão diária de solução de 1% e
2% de NaCl na água durante o período de 10 dias em
gaiolas metabólicas (n=6). 55
Figura 14: Medições diárias do consumo de água de ratos
submetidos a uma ingestão diária de solução de 1% e
2% de NaCl na água durante o período de 10 dias em
gaiolas metabólicas (n=6). 56
Figura 15: Medições diárias do consumo de alimento de ratos
submetidos a uma ingestão diária de solução de 1% e
2% de NaCl na água durante o período de 10 dias em
gaiolas metabólicas (n=6). 56
Figura 16: Pressão de Perfusão (PP) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 61
Figura 17: Resistência Vascular Renal (RVR) nos grupos controle
(n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10
dias em gaiolas metabólicas. 62
Figura 18: Fluxo Urinário (FU) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas. 63
Figura 19: Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl
por 10 dias em gaiolas metabólicas. 64
Figura 20: Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 65
Figura 21: Percentual de Transporte Tubular de Potássio (%TK
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 66
14
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Figura 22: Percentual de Transporte Tubular de Cloreto (%TCl
-
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 67
Figura 23: Percentual de Transporte Tubular Proximal de Sódio
(%pTNa
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)
com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas. 68
Figura 24: Percentual de Transporte Tubular Proximal de Potássio
(%pTK
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)
com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas. 69
Figura 25: Percentual de Transporte Tubular Proximal de Cloreto
(%pTCl
-
) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)
com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas. 70
Figura 26: Transporte de Sódio (TNa
+
) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 71
Figura 27: Transporte de Sódio (TK
+
) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 72
Figura 28: Transporte de Cloreto (TCl
-
) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 73
Figura 29:
Clearance osmolar (Cosm) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 74
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Isoformas da enzima guanilato ciclase. 29
Tabela 2: Efeitos da ingestão de 1% e 2% de NaCl no peso,
volume urinário, consumo de água e alimento de ratos
tratados por 10 dias em gaiolas metabólicas. 57
Tabela 3: Pressão de Perfusão (PP) em mmHg nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl
por 10 dias em gaiolas metabólicas. 61
Tabela 4: Resistência Vascular Renal (RVR) em mmHg/mL.g
-
1
.min
-1
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com
1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 62
Tabela 5: Fluxo Urinário (FU) em mL.g
-
1
.min
-
1
nos grupos controle
(n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10
dias em gaiolas metabólicas. 63
Tabela 6: Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) em mL.g
-
1
.min
-
1
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 64
Tabela 7: Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 65
Tabela 8: Percentual de Transporte Tubular de Potássio (%TK
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 66
Tabela 9: Percentual de Transporte Tubular de Cloreto (%TCl
-
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e
2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas. 67
Tabela 10: Percentual de Transporte Tubular Proximal de Sódio
(%pTNa
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)
com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas. 68
Tabela 11: Percentual de Transporte Tubular Proximal de Potássio
(%pTK
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) 69
16
com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
Tabela 12: Percentual de Transporte Tubular Proximal de Cloreto
(%pTCl
-
) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)
com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas. 70
Tabela 13: Transporte de Sódio (TNa
+
) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 71
Tabela 14: Transporte de Sódio (TK
+
) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 72
Tabela 15: Transporte de Cloreto (TCl
-
) nos grupos controle (n=6)
e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 73
Tabela 16:
Clearance osmolar (Cosm) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas. 74
17
INTRODUÇÃO
18
1. INTRODUÇÃO
1.1 Regulação da excreção renal de Cloreto de Sódio (NaCl)
De maneira geral, os seres vivos podem ser descritos como uma solução
aquosa envolta por uma membrana, a superfície do corpo. O volume do
organismo deve ser mantido dentro de limites bastante estreitos. O
funcionamento fisiológico de um animal requer uma composição relativamente
constante e bem definida de seus fluidos corpóreos e grandes alterações são
geralmente incompatíveis com a vida (Schmidt-Nielsen, 2002).
Por milhares de anos os ancestrais evolucionários da espécie humana se
alimentavam de uma dieta com baixas quantidades de sal, ingerindo valores
inferiores a 1 g de sal por dia. Esses dados implicam que a espécie humana
nos dias presentes é geneticamente programada para uma baixa ingestão de
sal. Nos últimos anos devido à agricultura e a industrialização o consumo de
sal passou para aproximadamente 10 g/dia (Blackburn et al., 1983). Porém,
mecanismos fisiológicos muito bem regulados, permitem que esse excesso de
sal ingerido na dieta não seja retido no organismo.
Os órgãos excretores foram desenvolvidos para manterem as
concentrações desejadas de água e solutos no organismo. Os rins são os
órgãos excretores mais bem conhecidos e constituem a principal via de
excreção de cloreto de sódio do corpo. Assim, eles desempenham um papel
importante na regulação do volume do fluido extracelular. Em condições
normais, os rins mantêm o volume do fluido extracelular constante, por meio do
ajuste da excreção de NaCl para igualar a quantidade excretada à quantidade
ingerida na dieta (Berne et al., 2004).
Os mecanismos renais que regulam a excreção do sódio incluem tanto
sinais neurais como hormonais, dentre eles podemos citar a atividade nervosa
simpática, o sistema renina-angiotensina-aldosterona, o peptídeo natriurético
atrial (Vander et al., 2001) e o mecanismo das guanilinas e uroguanilinas.
19
As fibras nervosas simpáticas inervam as arteríolas aferente e eferente dos
glomérulos, assim como as células dos néfrons. Quando há uma ingestão
aumentada de sódio ocorre uma expansão de volume que é percebido pelos
barorreceptores, reduzindo a atividade simpática no rim. O resultado final
consiste na excreção aumentada de sódio. Contrariamente, quando há um
balanço negativo de sódio, a atividade simpática no rim é aumentada (Greger,
2000).
1.2 Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona
O sistema renina-angiotensina-aldosterona exerce um papel fundamental
na regulação do metabolismo renal de sódio e água através de uma variedade
de vias fisiológicas (Kwon et al., 2003). O produto final dessa via, a
angiotensina
II
(ANG
II
), tem seus efeitos estabelecidos na regulação da
hemodinâmica renal, taxa de filtração glomerular, secreção de aldosterona,
além de seus efeitos diretos no túbulo proximal de células renais (Burns et al.,
1993).
A renina é sintetizada, armazenada e secretada em células granulares
justaglomerulares que revestem a arteríola aferente (Greger, 2000). A secreção
de renina pelo rim é controlada por diversos fatores, incluindo o sistema
nervoso simpático, um barorreceptor intrarrenal e pela liberação de NaCl para a
mácula densa (Lumbers, 1999). O aumento da atividade nervosa simpática,
mediada pela ativação dos receptores β
1
-adrenérgicos estimula a liberação de
renina. O outro mecanismo de controle de liberação de renina envolve um
barorreceptor intrarenal, aumento e decréscimo na pressão dos vasos pré-
glomerulares inibe e estimula a liberação de renina, respectivamente (Carey,
1997). A mácula densa contém um receptor sensível a alteração na taxa de
suprimento de NaCl no túbulo distal, aumento na carga de NaCl inibe a
secreção de renina e por outro lado redução de NaCl estimula sua secreção
(Jackson, 2006).
O angiotensinogênio é o substrato glicoprotéico circulante, sintetizado
predominantemente no fígado, cuja clivagem pela renina libera o decapeptídeo
20
angiotensina
I
(Jackson, 2006). A angiotensina
I
apresenta pouca ou nenhuma
atividade biológica, porém é convertida em angiotensina
II
pela enzima
conversora de angiotensina (ECA). A enzima conversora, uma metaloprotease
encontrada em ambas as formas solúvel e ligada à membrana, catalisa a
clivagem de dipeptídios a partir da extremidade carboxi-terminal, liberando o
octapeptídeo angiotensina
II
, um potente vasoconstritor (Lumbers, 1999).
A angiotensina
II
é conhecida por sua ação vasoconstritor muito potente.
Porém a angiotensina
II
apresenta muitas outras funções fisiológicas
importantes, uma delas é estimular a secreção de aldosterona que reduz a
excreção de NaCl estimulando sua reabsorção distal. A angiotensina
II
age
diretamente no rim produzindo vasoconstrição renal, aumento da reabsorção
tubular proximal de sódio e inibição da secreção de renina (Dina et al., 2000).
O sistema renina-angiotensina-aldosterona é ativado quando ocorre a
diminuição do volume, resultando na diminuição da excreção de NaCl pelos
rins. Porém quando ocorre expansão de volume, esse sistema precisa ser
inibido para que a excreção de NaCl seja intensificado, e assim o volume seja
restabelecido ao seu normal (Berne et al., 2004).
1.3 Peptídeos Natriuréticos
Os peptídeos natriuréticos apresentam diversas funções na regulação
da fisiologia renal e cardiovascular. A família inclui o peptídeo natriurético atrial
(ANP), o peptídeo natriurético cerebral (BNP) e o peptídeo natriurético tipo-C
(CNP). ANP e BNP são peptídeos natriuréticos que são expressos
principalmente nos átrios e ventrículos, respectivamente, e são referidos como
peptídeos natriuréticos cardíacos. Enquanto que o CNP é expresso no sistema
nervoso central e vascular (células endoteliais, monócitos/macrófagos), onde
está envolvido na regulação neuronal e no controle vascular, sua ação ainda
não é bem conhecida (Suzuki et al., 2001).
21
A estrutura bioquímica dos três peptídeos é bastante semelhante, sendo
produzidos como pró-hormônio ou proteína precursora que precisa ser clivada
para produzir sua forma ativa. Uma propriedade bioquímica comum dos
peptídeos natriuréticos é a formação de uma ponte dissulfeto que resulta em
uma estrutura em forma de anel. Os aminoácidos presentes na estrutura de
anel são amplamente conservados, pois essa estrutura é necessária para a
ligação ao receptor (Boomsma et al., 2001).
As ações biológicas dos peptídeos natriuréticos são moduladas através
de sua associação a receptores específicos. Esses receptores são
denominados como ANP-A (NPR-A, GC-A), ANP-B (NPR-B, GC-B) e ANP-C
(NPR-C) (Suzuki et al., 2001). Os receptores ANP-A e ANP-B apresentam
como domínio catalítico a enzima guanilato ciclase, estando envolvidos na
cascata de sinalização dependente de cGMP. Os principais ligantes do
receptor ANP-A são o ANP e o BNP, enquanto que o receptor ANP-B
apresenta como ligante primário o CNP. O receptor ANP-C não possui um
domínio intracelular e não se encontra acoplado à guanilato ciclase como os
demais receptores, sua função está relacionada ao clearance dos peptídeos
natriuréticos e regulação celular através do acoplamento à proteína-G e
adenilato ciclase (Murthy et al.,2000).
Os principais efeitos dos peptídeos natriuréticos estão relacionados a
ações periféricas e centrais. O ANP é liberado pelo coração quando ocorre
expansão de volume, o BNP apresenta propriedades semelhantes ao ANP.
Enquanto que o CNP exibe pouca atividade natriurética e diurética. Os
principais efeitos periféricos incluem natriurese, vasodilatação e inibição do
sistema renina-angiotensina-aldosterona. Efeitos centrais incluem inibição do
centro da sede, efeito antipressor, inibição do apetite ao sal e dos hormônios
ADH e ACTH (Suzuki et al., 2001).
A expansão de volume promove ação diurética pelo ANP através da
vasodilatação da arteríola aferente e vasoconstrição da arteríola eferente dos
glomérulos, aumentando a taxa de filtração glomerular e a carga filtrada de
sódio (Melo et al., 2000). O ANP também inibe a reabsorção tubular de NaCl e
22
água nos túbulos distais e coletores do rim. O ANP também inibe a secreção
de renina pela arteríola aferente, inibe a secreção de aldosterona pelo córtex
adrenal e inibe a secreção de ADH pela pituitária posterior (Berne et al., 2004).
A urodilatina é um peptídeo de 32 resíduos de aminoácidos que foi
isolado em 1988 da urina de humano por Schulz-Knappe e colaboradores. A
urodilatina é sintetizada nos túbulos renais e pertence à família do peptídeo
natriurético do tipo-A (ANP). A urodilatina assim como o ANP, liga-se ao
receptor NPR-A localizado no túbulo renal e músculo liso vascular renal e sua
ação consiste em aumentar a diurese, natriurese e uma considerável queda da
pressão arterial. Outros efeitos desse peptídeo consistem na broncodilatação
pulmonar e inibição da secreção de renina e aldosterona (Forssmann et al.,
2001).
Diversos outros peptídeos além dos natriuréticos são sintetizados no
intuito de regular a excreção de sódio, havendo a participação não só do rim e
do coração, mas também do sistema gastrointestinal e sistema nervoso central.
Entre esses peptídeos podemos citar a uroguanilina, que participa do
mecanismo renal que regula o transporte tubular de sódio e contribui para a
natriurese induzida pela ingestão aumentada de sal na dieta (Meneton et al.,
2005).
1.4 Peptídeos Guanilina e Uroguanilina
Os peptídeos guanilina (GN) e uroguanilina (UGN) são moléculas
pequenas, termos-estáveis com 15 a 19 aminoácidos compondo sua estrutura.
A descoberta das guanilinas é similar a dos opióides endógenos, pois os
receptores para os agonistas exógenos foram identificados bem antes dos
peptídeos endógenos serem isolados e possuírem sua estrutura molecular
caracterizada (Forte, 2004). Uroguanilina é similar em sua estrutura a
enterotoxina termo-estável da Escherichia coli (STa), responsável pela diarréia
secretória, produzindo assim efeitos natriuréticos similares como primeiramente
descrito por Lima e Fonteles, em 1983. Estudos posteriores demonstraram que
a natriurese e a caliurese da enterotoxina ST de E. coli e do 8-bromo
23
monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) em rins perfundidos de ratos são
produzidos de forma dose-dependente. Esses achados sugerem a existência
de um peptídeo endógeno, similar à enterotoxina ST, que regula a função do
transporte tubular de sódio renal (Lima et al., 1992). Os peptídeos da família
das guanilinas foram recentemente descobertos e muito de suas funções na
homeostase do organismo ainda não foram bem esclarecidas (Currie et. al.,
1992).
O primeiro peptídeo endógeno “STa-like” identificado foi isolado da
mucosa intestinal de ratos como um ativador endógeno da guanilato ciclase C
intestinal, denominado de guanilina. Guanilina é um peptídeo composto por 15
aminoácidos em sua estrutura que foi purificado do intestino através do
bioensaio de cGMP usando células intestinais T84 que detectou a atividade do
peptídeo em extratos de jejuno (Currie et al., 1992). O bioensaio baseia-se no
fato de que células T84 de carcinoma de cólon humano apresentam grande
produção de cGMP em resposta ao peptídeo STa de E. coli e que essas
células apresentam pouca ou nenhuma resposta na produção de cGMP ao
peptídeo natriurético atrial (ANP) e ao óxido nítrico (NO), sugerindo a presença
no intestino de substância com atividade farmacológica similar para a ativação
desses receptores (Forte et al., 2000).
Peptídeo similar a guanilina foi encontrado abundantemente na urina do
gambá, onde foram isolado e seqüenciado, sendo reconhecido como um novo
peptídeo que foi denominado de Uroguanilina. Uroguanilina foi posteriormente
isolada da urina de humanos e ratos, mucosa intestinal de gambás e ratos, e
do plasma obtido de humanos e gambá. Uroguanilina é o principal peptídeo
das guanilinas encontrado na urina, devido principalmente a ausência ou
baixas concentrações de guanilina na urina (Hamra et al., 1993).
O terceiro peptídeo da família das guanilinas foi identificado através da
clonagem molecular de cDNA, codificando um peptídeo similar a guanilina que
foi denominado de linfoguanilina (Forte et al., 1999).
24
Os peptídeos da família das guanilinas são derivados de um pro-
hormônio inativo que precisa ser clivado para se tornar ativo (Figura 01). Os
polipeptídios precursores da guanilina, uroguanilina e linfoguanilina foram
isolados, demonstrando que os peptídeos ativos são localizados na porção
COOH-terminal dessas proteínas de 100-116 aminoácidos (Wiegand et al.,
1992; Fane et al., 1996). Proguanilina e prouroguanilina são polipeptídios
secretados que apresentam pouca ou nenhuma ação biológica, sendo
necessário a clivagem por enzimas proteolíticas para a liberação dos peptídeos
ativos que interagem com os receptores GCs (Hamra et al., 1996).
Figura 01 – Polipeptídios precursores das formas de guanilina de rato,
uroguanilina e linfoguanilina de gambá, cuja cadeia de aminoácidos é
constituída por 115, 109 e 109 resíduos respectivamente. A porção COOH
terminal é biologicamente ativa sendo os aminoácidos representados por sua
abreviação. (Adaptado de Forte et al., 2000).
Uroguanilina e guanilina apresentam em sua estrutura quatro cisteínas
conservadas em cada domínio do peptídeo ativo. Pontes de dissulfeto são
formadas entre a primeira e a terceira, segunda e quarta cisteínas em cada
peptídio (Figura 02). As pontes de dissulfeto são essenciais para a ação do
peptídeo (Kita et al., 1994). Os genes para a guanilina são localizados em
humanos no cromossomo 1 (p33 ao p36) e em camundongos no cromossomo
4. Guanilina e uroguanilina humana são codificada por diferente mas similar
+
3
HN
1
101 115
CO
-
2
Guanilina
PNTCEICAYAACTGC
+
3
HN
1 95 109
CO
-
2
Uroguanilina
QEDCELCINVACTGC
+
3
HN
1 95 109
CO
-
2
Linfoguanilina
QEECELCINMACTGY
25
genes que consistem de três éxons e dois íntrons (Schulz, 1999). E. coli STa
apresenta o mesmo par de pontes de dissulfeto da guanilina, porém a presença
de uma terceira ponte de dissulfeto pode contribuir para sua maior potência na
ativação do receptor intestinal de GCs comparado aos peptídeos GN e UGN.
Linfoguanilina apresenta em sua estrutura três cisteínas, possibilitando a
formação de somente uma ponte de dissulfeto intramolecular. Um peptídeo de
linfoguanilina contendo uma simples ponte de dissulfeto entre a primeira e
terceira cisteína foi sintetizado e os resultados demonstraram a ativação de
receptores GCs de células T84 intestinais e receptores OK-GC em células
renais de gambá (Forte, et al. 1999).
Os peptídeos da família das guanilinas podem ser divididos em três
subclasses distintas de acordo com o número de pontes de dissulfeto
intramolecular (Figura 02). Em ordem de descoberta, classe 1 – peptídeos da
E. coli STa contendo três pontes de dissulfeto, classe 2 – peptídeos GN e UGN
com duas pontes de dissulfeto, classe 3 – peptídeo Linfoguanilina contendo
uma simples ponte de dissulfeto (Forte el al., 2000).
1.5 Efeitos Gerais das Guanilinas
O peptídeo guanilina é produzido no intestino após alta ingestão oral de
sal e secretado no lúmen intestinal. No intestino GN e UGN ativam enterócitos
via guanilato ciclase C (GC-C), com a produção de cGMP como segundo
mensageiro. A ativação dessa via promove a secreção de Cl
-
e HCO
3
-
e
inibição da absorção de Na
+
. Além disso, esse hormônio induz o aumento da
excreção de sal e água no rim. O decréscimo da absorção de sal no intestino,
associado ao aumento da excreção de sal no rim, previne o desenvolvimento
de hipernatremia após a ingestão de altas quantidades de sal na dieta (Kita et
al., 1999).
26
Figura 02 – Estrutura primária de peptídeos da família das guanilinas e da
toxina termo-estável da E. coli (STa), estão representadas as pontes de
dissulfeto que fazem ligações entre as cisteínas. As classes são agrupadas em
ordem de descoberta. (Adaptado de Forte et al., 2000).
Guanilina secretada no lúmen intestinal em resposta a alta ingestão oral
de sal, liga-se a GC-C localizado na membrana luminal de enterócitos e induz e
excreção de água e eletrólitos por uma complexa cascata de sinalização
(Figura 03): 1) Aumento da concentração intracelular de cGMP; 2) Inibição do
transportador Na
+
/H
+
,
com conseqüente decréscimo na reabsorção de Na
+
; 3)
Ativação da PKG II; 4) Inibição da fosfodiesterase III (PDE III), levando um
aumento do cAMP intracelular e ativação da PKA; 5) PKG II e PKA ativa a
proteína reguladora da condução transmembrana da fibrose cística (CFTR) na
membrana luminal, resultando na secreção de Cl
-
no lúmen intestinal; 6) CFTR
ativa o transportador Cl
-
/HCO
3
-
, promovendo a secreção de bicarbonato no
lúmen intestinal (Sindic & Schlatter, 2006).
Guanilina e uroguanilina aumentam a secreção de Na
+
, K
+
e água em
rim isolado de rato com mudanças em parâmetros renais, tais como aumento
da taxa de filtração glomerular (GFR) e do fluxo urinário (FU) (Fonteles et al.,
Classe I
E. coli STa N S S N Y C C E L C C N P A C T G C Y
Classe II
Guanilina
Uroguanilina
P N T C E I C A Y A A C T G C
Q E D C E L C I N V A C T G C
Classe III
Linfoguanilina Q E E C E L C I N M A C T G Y
27
1998). A uroguanilina então passou a ser determinada como um peptídeo
natriurético intestinal, tendo seu efeito natriurético principalmente após uma alta
ingestão oral de sal, porém a ação da UGN no rim pode ser endócrina
(produzida no intestino tendo sua ação no rim), parácrina (produzida pelo rim),
ou ambas. Indivíduos submetidos a uma alta dieta de sal foram comparados
aos que tinham uma alimentação com baixa quantidade de sal, mostrando uma
concentração plasmática de UGN bem maior no primeiro grupo, sugerindo a
predominância da via endócrina de ação da UGN (Kinoshita et al, 1997).
Figura 03 – Sinalização dos peptídeos da família das guanilinas no intestino
(Modificado de Sindic & Schlatter, 2006).
A administração de STa em rim isolado perfundido, causa forte aumento
na excreção de água, sódio, potássio e cloreto (Lima et al., 1992). Estudos
demonstraram que STa é responsável pela diarréia produzida por colônias de
E. coli por atuarem no mesmo receptor das guanilinas, elevando a
Lúmen
Sangue
CFTR
GC-C
Cl
-
28
concentração de cGMP com conseqüente secreção de fluídos e eletrólitos
(Forte et al., 2004).
A ação da linfoguanilina em rim isolado de rato também foi testada,
demonstrando também seu papel na excreção aumentada de Na
+
, K
+
e água
(Fonteles et al., 1999). Esses achados demonstram que os peptídeos da
família das guanilinas produzem respostas renais por ação direta no rim, como
elucidado principalmente pelo modelo de rim isolado de rato.
1.5 O Receptor Guanilato Ciclase
A guanilato ciclase (GC) está diretamente envolvida na síntese de cGMP
em resposta a diversos sinais, tais como óxido nítrico (NO) e peptídeos
ligantes. A concentração intracelular de cGMP regula a fisiologia celular por
ativar proteínasquinases ou alterar a concentração intracelular de nucleotídeos
cíclicos através da regulação de fosfodiesterases (PDEs) (Lucas et al., 2000).
A enzima guanilato ciclase é encontra em duas formas principais: a
solúvel e a particulada. A ativação da forma solúvel ocorre em resposta ao
óxido nítrico (NO). A particulada está presente na membrana plasmática e é
ativada em resposta a peptídeos endógenos. Os principais ligantes que atuam
como agonistas para os receptores de GCs são os peptídeos natriuréticos e o
da família das guanilinas (Kuhn, 2004).
Os receptores GCs presentes na membrana plasmática são proteínas
transmembrânicas apresentando quatro principais regiões, consistindo de um
domínio NH
2
terminal altamente variável que funciona como ligante aos
peptídeos endógenos, uma região transmembranar, um domínio homólogo a
quinase e a região catalítica altamente conservada localizada na região COOH
terminal da proteína (Figura 04) (Krause et al., 1997).
Foram encontrados sete isoformas para o receptor de membrana
guanilato ciclase. Os receptores dos peptídeos natriuréticos, guanilato ciclase A
(GC-A) e B (GC-B), foram os primeiros GCs clonados de tecidos de mamíferos
29
(Chang et al., 1989), posteriormente foi determinado que GC-A (ou NPR-A) é o
receptor para ANP e BNP, enquanto GC-B (ou NPR-B) tem CNP como
agonista (Sindic et al., 2006). Guanilato ciclase C (GC-C) é o receptor para a
enterotoxina termo-estável da E. coli (STa) (Schulz et al., 1990), e para os
peptídeos endógenos guanilina e uroguanilina (Hamra et al., 1993). Os
receptores GCs remanescentes são denominado de receptores órfãos, pois os
ligantes extracelulares ainda não são conhecidos. Guanilato ciclase D (GC-D) é
expresso principalmente em célula olfatórias, as duas outras isoformas de GC
também apresentam a sua predominância em células olfatórias, guanilato
ciclase E (GC-E) e F (GC-F) são expressas na retina. O mais recente das GCs
descritas foi a guanilato ciclase G (GC-G), apresentando uma semelhança com
os receptores de peptídeos natriuréticos, embora não seja ativado por esses
peptídeos (Sindic et al., 2006). Estudos com Caenorhabditis elegans
mostraram a existência de aproximadamente 30 genes codificantes para a GC,
demonstrando o pouco conhecimento presente em estudo com mamíferos (Yu
et al., 1997). A tabela 01 mostra as isoformas de GCs, a sua distribuição e seus
agonistas detalhadamente.
Tabela 01 – Isoformas da enzima guanilato ciclase.
Ciclase Distribuição Agonistas
GC-A
Músculo liso, rim, adrenal, coração,
SNC
ANP, BNP
GC-B Fibroblasto, coração, SNC CNP
GC-C
Intestino, adrenal, SNC, pulmão,
glândulas reprodutivas, rim
STa, GN, UGN
GC-D Células olfatórias Indeterminado
GC-E Retina Indeterminado
GC-F Retina Indeterminado
GC-G
Músculo esquelético, pulmão,
intestino, rim
Indeterminado
30
Guanilato ciclase C é o principal receptor para a guanilina no intestino
(Figura 04). Estudos de mRNA para a GC-C demonstraram sua expressão em
glândulas adrenal, no fígado embrionário ou em estados regenerativos,
placenta, testículos, vias aéreas, timo e linfonodos. GC-C de humanos e ratos
apresentam 71% de homologia no domínio extracelular e 91% no domínio
intracelular (Fan et al., 1997).
Figura 04 – Estrutura molecular da guanilato ciclase C (GC-C) na sua forma
dimerizada. O ligante (L) corresponde a GN, UGN ou STa. Para detalhes, ver
texto (Modificados de Sindic & Schlatter, 2006).
O estudo da distribuição do mRNA para o receptor de GC-C em néfron
de ratos, demonstraram a sua expressão em maior quantidade em túbulos
coletores corticais, seguindo uma ordem decrescente de expressão em túbulo
proximal, ramo ascendente espesso da alça de Henle, ducto coletor e ramo
delgado da alça de Henle. O mesmo estudo também mostrou que o mRNA
para GN e UGN também é expresso em néfron de ratos, sugerindo então uma
regulação endócrina intrarenal para GN e UGN (Carrithers et al., 2000).
Domínio
extracelular
Domínio
transmembrana
Domínio homólogo
a quinase
Domínio catalítico
Região carboxi-terminal
31
Potthast et al. (2001) localizou GC-C em rim de camundongos somente no
glomérulo e túbulo proximal, enquanto que o estudo com rim de humanos
detectou a expressão de mRNA para GC-C somente na região cortical,
especificamente no túbulo proximal (Sindic et al., 2005). Esses achados
sugerem diferenças na distribuição renal para o receptor de GC-C em
diferentes espécies.
A existência de um receptor adicional para a guanilina, passou a ser
discutido após estudos dos efeitos renais e intestinais desse peptídeo em
camundongos “knockout” para o gene de GC-C. O tratamento desses animais
in vivo com o peptídeo guanilina e uroguanilina induz o aumento da excreção
urinária de sódio, cloreto, potássio e água de maneira quantitativamente similar
as respostas renais apresentadas em camundongos que apresentam o gene
para GC-C (Carrithers et al., 1999, 2004).
Os receptores GCs são amplamente distribuídos em diferentes células,
tecidos e órgãos do corpo, sugerindo sua importância na regulação de diversos
mecanismos celulares ainda não elucidados. O envolvimento do cGMP na via
de sinalização renal sugere um possível envolvimento de outro receptor GC
além do GC-C, pois o tratamento de camundongos “knockout” para GC-C com
o peptídeos GN também demonstraram o aumento da excreção urinária de
cGMP (Carrithers et al., 2004). Estudo realizado com peixes teleósteos tem
sugerido a existência de duas diferentes formas do gene para GC-C, sugerindo
a existência em mamíferos superiores de mais de uma isoforma para o
receptor de GC-C (Comrie et al., 2001).
O estudo com linhagem de células de túbulo proximal de humanos,
IHKE-1, demonstram que UG pode desencadear duas diferentes respostas
biológicas. GN, UGN e STa inibem a condutância ao potássio via ativação da
GC-C e aumento do cGMP celular. O segundo receptor é ativado por UGN,
sendo uma via independente de cGMP. Essse receptor ainda não foi
determinado, mas sabe-se que ele é acoplado a proteína G sensível à toxina
pertussis (PT), levando a hiperpolarização celular e ativação da condutância ao
K
+
(Figura 05). Mudanças na condutância para o K
+
influência na força
32
propulsora e o transporte através do túbulo proximal é direcionado para a sua
excreção. O primeiro receptor GC-C apresenta maior afinidade para GN e STa,
enquanto que o segundo independente de cGMP se liga com mais afinidade a
UGN (Sindice et al., 2002).
Dados de vários estudos com cultura de células de túbulo proximal
sugerem que GN inibe a reabsorção de Na
+
em segmentos do néfron. UGN
diminui a expressão da Na
+
/K
+
-ATPase, que diminui o gradiente de
concentração para Na
+
e conseqüentemente reduz o transporte de Na
+
e
aumenta a sua excreção para o lúmen tubular (Carrithers et al., 1999). Além
disso, como citado anteriormente, GN diminui a força propulsora elétrica para a
reabsorção do Na
+
por inibir os canais de K
+
via cGMP, com conseqüente
despolarização celular (Figura 05). Outro mecanismo de ação da GN e UGN
consiste na inibição do antiporte Na
+
/H
+
pelo aumento do cGMP, promovendo
assim a redução na reabsorção de Na
+
e água no túbulo proximal (Sindice et
al., 2002).
Proteínas isoladas da membrana de células intestinais também
apresentam afinidade para GN e UGN, sendo outros possíveis receptores
envolvidos nesse mecanismo de regulação de sódio. A concentração de cGMP
intracelular influencia a secreção transepitelial de Cl
-
e HCO
3
-
no intestino pela
interação com proteínaquinase II dependente de cGMP (PKG II) ou
proteínaquinase II dependente de cAMP (PKA II), que servem como receptores
para GN e UGN (Vaandrager et al., 1997). Camundongos “knockout” para o
gene que codifica PKG II resulta na inibição da secreção de fluidos em
resposta a STa in vivo e um decréscimo na secreção de eletrólitos in vitro
(Pfeifer et al., 1996).
A proteína reguladora da condução transmembrana da fibrose cística
(CFTR) exerce um importante papel nas respostas celulares induzidas por GN
e UGN (Figura 03). A CFTR é um membro da família das proteínas ABC que
transportam pequenas moléculas através da membrana celular em uma via
dependente de ATP. A CFTR também funciona como canais para a secreção
de Cl
-
e HCO
3
-
para o lúmen intestinal. Mutação do gene para CFTR resulta em
33
perda da proteína ou modificação de sua atividade, produzindo a doença
genética fibrose cística (Joo et al., 1998). CFTR também é expressa em células
renais, produzindo como principais efeitos diurese, natriurese e caliurese em
respostas a UGN e STa (Morales et al., 1996).
A provável sinalização celular envolve a alteração da concentração
intracelular de cGMP com ativação da PKG II e/ou PKA II para fosforilação da
CFTR, com conseqüente alterações na transporte de Cl
-
e/ou Na
+
em células
tubulares renais que são alvos da GN e UGN (Forte et al., 2000).
Figura 05 – Mecanismo de sinalização celular do peptídeo GN e UGN em
células de túbulo proximal renal. GN ativa duas vias de sinalização: GC-C e
cGMP dependentes e ativada por proteína G sensível à toxina pertussis. Para
detalhes, ver texto (Modificados de Sindic & Schlatter, 2006).
Luz
Fosfato
Sulfato
Glicose
Aminoácidos
Sangue
34
Em células principais do ducto coletor UGN inibe os canais de potássio
(ROMK) por um mecanismo dependente de fosfolipase A
2
e ácido
araquidônico, inibindo a secreção de K
+
ao mesmo tempo reduzindo a força
propulsora para a reabsorção de Na
+
, resultando em natriurese (Michell et al.,
2008). Estudos com camundongos “knockout” para GC-C com UGN
mostraram o aumento da excreção urinária de cGMP, sugerindo a ativação
de outros receptores GCs, um possível candidato seria o receptor órfão GC-G
(Sindic et al., 2006).
1.6 O Peptídeo Guanilina nas Fisiopatologias
Foi demonstrado o envolvimento da GN no desenvolvimento e possível
tratamento de tumores intestinais. GN e UGN são expressos em baixas
quantidades no câncer de cólon, embora nos tecidos adjacentes, tenha sido
encontrada a expressão normal de seu RNA mensageiro (Cohen et al., 1996).
Observações demonstraram que a baixa incidência de tumores intestinais em
países do terceiro mundo, está relacionado à alta incidência de infecções
intestinais, que estimulam a GC-C e a produção de cGMP em células
intestinais (Pitari et al., 2001).
GN e STa estão envolvidos na regulação da proliferação e
diferenciação, prolongando o ciclo celular, e induzindo apoptose de células
T84 e células intestinais de camundongos. A aplicação oral de UGN produziu
um decréscimo no número e tamanho de pólipos em camundongos com
desenvolvimento de tumores intestinais, permitindo então especular um
possível uso da UGN no tratamento de câncer de cólon (Shailubahai et al.,
2000).
A UGN se encontra em altas concentrações no plasma e na urina de
pacientes com insuficiência renal crônica, glomerulonefrite e em pacientes
que realizam hemodiálise. As possíveis explicações para essas observações
são danos renais e reduzida capacidade de metabolizar e excretar o peptídeo
guanilina (Nakazato et al., 1996).
35
GN pode também estar envolvida em processos regenerativos em
conseqüência de hepatectomia parcial ou injúria ocasionada por agentes
hepatotóxicos, durante esse processo observa-se um forte aumento na
expressão de GC-C no fígado. Estudos mostraram que 24 horas após a
ressecção de 2/3 do fígado, há um aumento significativo na atividade desses
receptores (Scheving et al., 1996).
A família dos peptídeos guanilina que regulam o cGMP é composta por
uma variedade de novos peptídeos, com atividade biológica que os tornam
promissores candidatos para o desenvolvimento de novos agentes
diagnósticos e terapêuticos (Forte, 2004).
1.7 Considerações Gerais
Uroguanilina é o principal candidato a fator natriurético intestinal, pois a
sua liberação no intestino, após uma ingestão oral de NaCl, apresentam
respostas natriuréticas muito mais pronunciadas do que o sal administrado
por via intravenosa (Drummer et al., 1996). A via endócrina que envolve a
liberação do peptídeo uroguanilina na circulação sanguínea pelo trato
gastrintestinal está relacionada ao controle de sódio corporal, sendo esse
peptídeo o principal mediador responsável pela interação direta entre sistema
digestivo e renal (Saville et al., 1988).
O aumento da excreção urinária de sal e água após uma refeição é
influenciado por diversos fatores, dentre eles podemos citar os peptídeos da
família das guanilinas, os peptídeos natriuréticos e o óxido nítrico (NO)
produzido pelo próprio rim. O mecanismo de ação desses mediadores ainda
não foram completamente elucidados, mas sabe-se que guanilinas e
peptídeos natriuréticos regulam a função celular através da ativação de
receptores de guanilato cilcase (GC) de membrana, enquanto o NO ativa GC
citosólico (Forte et al., 2000). Esses achados demonstram a importância do
cGMP como um sinalizador fundamental na regulação da excreção de sal e
água no rim em estado pós-prandial.
36
Estudos citados anteriormente demonstram a existência de diversos
receptores GC sem a identificação de seus agonistas, sendo denominados de
receptores órfãos. O conhecimento dos agonistas e o mecanismo de ação
envolvido na sua regulação serão importantes na compreensão das ações
fisiológicas desses peptídeos, principalmente na função renal.
37
JUSTIFICATIVA
38
2. JUSTIFICATIVA
Em condições normais, os rins mantêm o volume do fluido extracelular
constante, por meio do ajuste da excreção de NaCl para igualar a quantidade
excretada à quantidade ingerida na dieta. Os mecanismos de transporte de
água e eletrólitos são fundamentais para a manutenção da vida (Volmer et al.,
2001). Peptídeos como o natriurético atrial (ANP), a urodilatina, a guanilina e a
uroguanilina têm sido implicados na regulação da homeostase de sal e água.
Essas substâncias têm afinidade por receptores de membrana, cujas
mensagens são traduzidas em segundos mensageiros, alterando as
concentrações intracelulares de monofosfato cíclico de guanosina (cGMP)
(Michell et al., 2007).
Estudos com a toxina termoestável da Escherichia coli mostraram suas
ações intestinais através do aumento da excreção de fluídos e eletrólitos,
guanilina e uroguanilina estimulam a secreção de cloreto pelas células
intestinais, sendo responsáveis pelo mecanismo de secreção de sal e água
(Hamra et al., 1993). Desde então diversas pesquisas mostraram a existência
de uma integração direta entre o intestino e o rim na regulação de sal ingerido
na dieta. Os processos envolvidos são complexos e ainda não foram
completamente esclarecidos, mas sabe-se que as guanilinas ligam-se a
receptores presentes tanto na mucosa intestinal quanto nos túbulos renais,
fazendo assim, uma ponte entre esses dois sistemas.
O estudo dos mecanismos fisiológicos envolvidos na regulação do NaCl
ingerido por via oral, através da sinalização intestino-rim via peptídeo guanilina,
constitui ferramentas importantes na compreensão de mecanismos
fisiopatológicos. Os estudos in vivo com ratos em gaiolas metabólicas
submetidos à ingestão de NaCl, permite estudar as alterações promovidas no
metabolismo diária e na fisiologia renal desses animais. A proposta desse
estudo consiste em avaliar as alterações induzidas pelo NaCl tanto no
metabolismo diário de ratos como na fisiologia renal, no intuito de compreender
esse mecanismo de sinalização após uma alta ingestão de sal.
39
OBJETIVOS
40
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Investigar as alterações produzidas tanto no metabolismo diário quanto
na função renal de ratos submetidos a uma alta ingestão crônica de NaCl.
3.2 Objetivos Específicos
• Avaliar as alterações metabólicas de ratos submetidos à ingestão de 1%
e 2% de NaCl por um período de 10 dias em gaiolas metabólicas;
• Estudar os alterações no metabolismo diário de ratos causados pela
ingestão de 1% e 2% de NaCl;
• Estudar as alterações renais causados pela ingestão de 1% e 2% de
NaCl;
41
MATERIAL E MÉTODOS
4. MATERIAL E MÉTODOS
42
4.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Ratos Wistar adultos, machos, pesando entre 250 e 300g, pertencentes
ao biotério da Unidade de Pesquisas Clínicas do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará.
4.2 AVALIAÇÃO DO METABOLISMO DIÁRIO
Para avaliação do metabolismo diário, os animais (n=6) foram colocados
em gaiolas metabólicas, sendo previamente pesados. Após um período de 24
horas de adaptação às novas condições, os ratos foram novamente pesados e
iniciou-se o oferecimento de sal (NaCl) na água em concentrações conhecidas,
sendo o controle água destilada e os grupos salinos de 1% e 2% de NaCl. A
água era fornecida em bebedouros de plásticos com o volume que variava de
150 a 200mL/dia/gaiola. A quantidade de ração oferecida era pesada
diariamente e variava de 50 a 200g/dia/gaiola. A urina era coletada em béquer
de plástico com funil e peneira para evitar a evaporação e resíduos de ração e
fezes. No dia seguinte, era pesado o que sobrou da ração fornecida e anotado
o volume restante de água e a quantidade de urina presente no béquer coletor;
além disso, o peso corpóreo dos ratos era medido diariamente. Esse
procedimento foi repetido durante 10 dias consecutivos e observando sempre o
mesmo horário de avaliação.
4.3 GRUPOS EXPERIMENTAIS
A avaliação dos mecanismos renais foi realizada através do sistema de
perfusão de rim isolado de rato, onde os animais após 10 dias em gaiolas
metabólicas foram submetidos a uma cirurgia para a retirada do rim, os grupos
experimentais foram divididos da seguinte forma:
Grupo Controle
: Ratos (n=6) mantidos por 10 dias em gaiolas
metabólicas com ingestão de água destilada.
43
Grupos Tratados: Ratos (n=6) mantidos por 10 dias em gaiolas
metabólicas com ingestão de 1% e 2% de NaCl.
4.4 PERFUSÃO DE RIM ISOLADO
4.4.1 O Sistema de Perfusão
A perfusão de rim isolado consiste em um método desenvolvido para o
estudo da função renal, onde o rim é mantido fora do organismo em condições
similares as observados desse órgão no organismo vivo. O nosso sistema
consiste na perfusão de rim isolado com recirculação (Figura 06). Este sistema
foi inicialmente baseado nos estudos desenvolvidos por Bowman e Mack
(1974) e Ross (1978), com modificações feitas por Fonteles (1980; 1983),
através da adaptação de um pulmão artificial do tipo silástico, baseado no
modelo de Hamilton (1974), e descrito por Moreira Lima (1983). O sistema de
perfusão consiste de dois subsistemas, um in situ e outro em circuito fechado,
para perfusão in vitro, mantidos ambos à mesma temperatura de 37°C. Neste
sistema o perfusato recircula no rim com uma quantidade de 100 mL de
solução Krebs-Hanseleit modificada e a oxigenação é adaptada ao sistema
(Monteiro, 1990).
O sistema de perfusão é constituído pelos seguintes equipamentos
(Figura 07):
1) Condensador: Mantém aquecido o cilindro reto que comporta a
solução do experimento;
2) Coletor de urina: Frasco que recebe a urina do rim montado no
sistema, trocados em intervalos de 10 minutos;
3) Seringa coletora de perfusão: Coletor da solução de perfusão no
sistema feita em intervalos de 10 minutos;
4) Bomba de perfusão (Watson): Bombeia a solução de perfusão no
sistema, apresenta cinco velocidades;
5) Filtro de millipore (5µm)
: Filtra a solução perfusora;
44
6) Banho Maria: aquece o oxigenador ou o pulmão artificial mantendo a
temperatura constante entre 37ºC;
7) Fluxômetro: Mede o fluxo da solução;
8) Manômetro de mercúrio: Mede a pressão do perfusato;
9) Catabolhas: Retira as bolhas formadas evitando assim embolia no
rim;
10) Oxigenador ou pulmão artificial: Promove as trocas gasosas (95%
de O
2
e 5% de CO
2
)
11) Bomba aquecedora com termostato: mantém o perfusato na
temperatura de 37ºC.
Figura 06 - Foto do sistema de perfusão de rim isolado (LAFAVET-UFC)
Catabolhas
45
Figura 07 – Representação esquemática do sistema de perfusão de rim
isolado.
4.4.2 Calibração do Sistema
O sistema foi calibrado sempre antes do início dos experimentos. A
calibração foi realizada com solução salina a 0,9%, onde foi avaliada em cada
unidade da bomba a pressão de perfusão (PP) em mmHg, o fluxo urinário(L/h)
e o volume de salina coletado em um minuto em proveta milimetrada (mL/min).
A calibração é feita com o objetivo de conhecer o fluxo de perfusão em face da
resistência da própria cânula. Para tanto, os resultados da calibração obtidos
serão compilados em curvas, onde se representa a velocidade da bomba nos
46
eixos das abscissas (X) contra a pressão de perfusão, o valor obtido no
fluxômetro e volume de salina coletado (fluxo) no eixo das ordenadas (Y)
(Figura 09; 10 e 11).
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
PP (mmHg)
Figura 08 – Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a
calibração do sistema (n=6).
0
0,02
0,04
0,06
1 2 3 4 5
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Fluxômetro (L/h)
Figura 09 – Valores registrados pelo fluxômetro (L/h) durante a calibração do
sistema (n=6).
47
0
25
50
75
1 2 3 4 5
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Fluxo (mL/min)
Figura 10 – Valores de volume urinário (mL/min) registrados durante a
calibração do sistema (n=6).
4.4.3 Solução Perfusora
A solução empregada nesse sistema é a de Krebs-Henseleit modificada,
associada à albumina bovina fração V, 6g% (Monteiro, 1990; Lima et al., 1992),
Inicialmente foi preparada uma solução de Krebs-Henseleit concentrada a 20%,
contendo 138g de NaCl, 7g de KCl, 3,2g de NaH
2
PO
4
.H
2
O, 5,8g de MgSO
4
. 7
H
2
O e 10g de Uréia. Quarenta e oito horas antes dos experimentos, 100mL
desta solução foi separada e acrescida de 4,2 g de NaHCO
3
, 0,74g de CaCl
2
.
2 H
2
O, 2,0g de glicose e 0,05g penicilina G potássica cristalina. Em seguida, o
volume foi completado para 2L com água bidestilada. Foram retirados 300 mL
desta solução, aos qual se adiciona albumina bovina (6g%). Em seguida,
solução foi dializada, auxiliada por um homogeneizador. A diálise tem como
objetivo retirar substâncias contaminantes como piruvatos, citratos e lactatos
(Hanson; Ballard, 1968; Cohen; Kook; Little,1977; Ross, 1978).
A solução de Krebs-Henseleit para a diálise foi trocada com 24 horas.
No final, após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi acrescida com 0,15g
de inulina. O pH da solução perfusora foi ainda ajustado entre os valores de 7,3
e 7,4.
48
4.4.4 Substâncias utilizadas
NaHCO
3
(Synth)
NaH
2
PO
4
.H
2
O (Synth)
NaCl (Synth)
MgSO
4
. 7H
2
O (Reagen)
CaCl
2
. 2H
2
O (Reagen)
Manitol (Reagen)
Uréia (Reagen)
KCl (Merck)
Glicose (Squibb)
Penicilina G Potássica Cristalina (Squibb)
Heparina (hipolabor)
Inulina (Sigma)
Pentobarbital Sódico (Cristália)
4.4.5 Técnica Cirúrgica
Após 10 dias em gaiolas metabólicas os animais foram anestesiados
com Pentobarbital Sódico na dose de 50 mg/Kg de peso corporal, por via
intraperitoneal (IP). A veia femoral devidamente isolada, onde foi administrado
3,0mL de manitol a 20 %, com intuito de melhorar o acesso cirúrgico ao ureter.
Após assepsia do abdome, foi realizada uma incisão da parede
abdominal com base na linha alba e duas incisões perpendiculares à primeira,
no meio da parede, para facilitar a manipulação. Rebatidas às vísceras para o
lado esquerdo para visualização do rim direito e conseqüente limpeza dos
tecidos presentes na área. Em seguida, o ureter foi isolado e canulado com
tubo de polietileno (PE
50
). A glândula adrenal direita foi identificada, isolada e
seccionada, para com isso providenciar a descapsulação do rim.
Posteriormente, a artéria renal foi canulada a partir da artéria mesentérica
superior, sem a interrupção do fluxo sangüíneo para o rim. Logo a seguir, o
órgão é retirado, limpado e acoplado ao sistema. Esperava-se um período de
20 a 30 minutos para a adaptação renal ás novas condições.
49
Figura 11 - Técnica cirúrgica. A - veia femoral; B - ureter direito canulado; C -
artéria mesentérica; D - cânula arterial.
50
4.4.6 Protocolo experimental
O rim passava por um período de adaptação de aproximadamente 20
minutos, depois de decorrido esse tempo os experimentos foram iniciados. O
tempo total de perfusão do órgão foi de 120 minutos. Durante esse período,
foram coletados a cada 5 minutos as medida do fluxômetro e a pressão de
perfusão. Em intervalos de 10 minutos, de maneira intercalada, foram
coletados a urina e o perfusato. Estes frascos com urina foram pesados e,
juntamente com os frascos de perfusato, mantidos em temperatura de -20
º
C
para permitir posteriores dosagens de potássio, sódio, cloro, inulina e
osmolaridade. O rim esquerdo foi pesado e seu valor anotado e após o fim do
experimento, foi realizado o mesmo procedimento com o rim direito.
4.4.7 Análises bioquímicas
Nas amostras de perfusatos e urinas foram realizados testes
bioquímicos. O clearance foi mensurado de acordo com Pitts (1971), e
Martinez-Maldonado e Opava-Stitzer (1978). A dosagem de sódio e potássio
foi realizada pelo método de fotometria de chama (Flame photometer - modelo
443IL). As dosagens de cloro foram realizadas seguindo o método descrito pelo
kit do fabricante Labtest. A inulina foi dosada a partir do mesmo material,
através de hidrólise direta, como descrito por Walser e colaboradores (1955), e
modificada por Fonteles e Leibach (1982). Finalmente foi medida a
osmolaridade das amostras com um osmômetro (vapor pressur osmometer -
modelo 5520 WESCOR). Todas as análises bioquímicas foram realizadas na
Unidade de Pesquisas Clínicas da Universidade Federal do Ceará.
4.4.8 Cálculos dos parâmetros renais
A seguir estão representadas as fórmulas para determinação de
parâmetros funcionais renais (Martinez-Maldonado et al., 1978; Fonteles et al.,
1993).
51
1. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro
2. RVR (mmHg/mL.g-¹.min
-1
) = Resistência vascular renal = PP (mmHg) / FPR
3. FPR (mL.g
-
1
.min
-
1
) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/ intervalo
de tempo x peso do rim x)
4. FU (mL.g
-
1
. min
-
1
) = Fluxo urinário = Peso do volume urinário / Peso do rim
esquerdo x 10 (admitiu-se que a urina possui a mesma densidade da água)
5. RFG (mL.g
-
1
.min
-
1
)= Ritmo de filtração glomerular
RFG = DOU in / DOP in x FU sendo DOU in = densidade ótica da inulina na urina e
DOP in = densidade ótica da inulina no perfusato
6. %TNa
+
= Percentual de sódio transportado= TNa
+
x 100 / FNa
+
7. TNa
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
. min
-1
) = Sódio transportado = FNa
+
- ENa
+
8. FNa
+
= (µ
µµ
µEq.g
-
1
. min
-
1
) = Sódio filtrado
= RFG x PNa
+
(PNa
+
= Concentração de
sódio no perfusato)
9. ENa
+
= (µ
µµ
µEq.g
-
1
. min
-
1
) = Sódio excretado= FU x UNa
+
(UNa
+
= Concentração de
sódio na urina)
10. CH2O - Clearance de água livre (mL.g
-1
.min
-1
) = FU - C. osm
11.Cosm (mL.g
-
1
.min
-
1
) = Clearance osmótico = [Uosm / Posm] x FU (onde Uosm =
Osmolaridade urinária e Posm = Osmolaridade do perfusato)
12. %TK
+
(µ
µµ
µEq.g
-1
. min
-1
) = Percentual de potássio transportado = TK
+
x 100 / FK
13. TK
+
(µ
µµ
µEq.g
-1
. min
-1
)= Potássio transportado = TK
+
= FK
+
x EK
+
14. % TCl
–
(µ
µµ
µEq.g
-
1
. min
-
1
) = Percentual de cloreto transportado = TCl
–
x 100 / F
TCl
–
15. TCl
–
(µ
µµ
µEq.g
-
1
. min
-
1
) = Cloreto transportado = TCl
–
= FCl
–
x ECl
–
Todos os cálculos realizados para a determinação dos parâmetros do
sódio foram repetidos para o potássio e o cloreto.
52
4.5. Análises Estatísticas
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão de seis
experimentos em cada grupo. Diferenças entre os grupos foram comparados
utilizando teste t de Student ou Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste
de Bonferroni com significância de 5%.
4.6. Comitê de Ética
A metodologia desenvolvida no presente trabalho foi submetida e
aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade
Federal do Ceará.
53
RESULTADOS
54
5. RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO DO METABOLISMO DIÁRIO
Com este estudo foi observado uma redução do peso corporal dos
animais tratados com NaCl quando comparados ao grupo controle (Figura 13).
Observa-se que no grupo controle não há alteração do peso ao longo dos 10
dias de tratamento (Dia 1: 308,8g ± 8,0; Dia 10: 302g ± 11,6); o grupo de 1% de
NaCl apresentou redução do peso do dia 2 ao 6 quando comparado ao
controle, com posterior recuperação (controle – Dia 1: 300,8±8,0; Dia 6:
304,4±8,4; Dia 10: 302±11,6) (1% - Dia 1: 284,6g ± 8,9; Dia 6: 277±11,8; Dia
10: 297g ± 8,7); no entanto o animais submetidos a uma ingestão de 2% de
NaCl apresentaram uma redução considerável do peso ao longo do tratamento
(Dia 1: 289,8g ± 3,9; Dia 10: 251g ± 10,0*). Para maiores detalhes ver Tabela
02.
Em relação ao volume urinário observa-se um aumento entre os grupos
tratados com NaCl, principalmente com o grupo submetido a ingestão de 2%
de NaCl (Figura 14). Observa-se que no dia 1 de experimento todos os animais
apresentam o mesmo volume urinário (C: 3,48mL ± 0,86; NaCl 1%: 4,55mL ±
1,29; NaCl 2%: 3,9mL ± 0,71), porém a partir do segundo dia há um aumento
do volume urinário nos grupos tratados com sal, sendo esse acréscimo bem
mais pronunciado no grupo de 2% de NaCl (Tabela 02).
O consumo de água aumentou proporcional ao aumento da
concentração de NaCl presente na dieta desses animais, sendo o grupo de 2%
de NaCl o mais significativo (Figura 15). O consumo de alimento apresentou-se
bastante variável, porém observa-se uma redução nos dois tratamentos (Figura
16) (Tabela 02).
55
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
180
205
230
255
280
305
330
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* p < 0,05
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
Dia
Peso (g)
Figura 12 - Medições diárias do peso de ratos submetidos a uma ingestão
diária de solução de 1% e 2% de NaCl na água durante o período de 10 dias
em gaiolas metabólicas (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
NaCl 2%
NaCl 1%
Controle
* p < 0,05
Dia
Volume Urinário (mL)
Figura 13 - Medições diárias do volume urinário de ratos submetidos a uma
ingestão diária de solução de 1% e 2% de NaCl na água durante o período de
10 dias em gaiolas metabólicas (n=6).
56
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
25
50
75
100
125
150
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
NaCl 2%
NaCl 1%
Controle
* p < 0,05
Dia
Água Consumida (mL)
Figura 14 - Medições diárias do consumo de água de ratos submetidos a uma
ingestão diária de solução de 1% e 2% de NaCl na água durante o período de
10 dias em gaiolas metabólicas (n=6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
10
20
30
40
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
* p < 0,05
Dia
Alimento Consumido (g)
Figura 15 - Medições diárias do consumo de alimento de ratos submetidos a
uma ingestão diária de solução de 1% e 2% de NaCl na água durante o
período de 10 dias em gaiolas metabólicas (n=6).
57
Tabela 02 – Efeitos da ingestão de 1% e 2% de NaCl no peso, volume urinário, consumo de água e alimento de ratos tratados por
10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle
Tratamento DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 DIA 6 DIA 7 DIA 8 DIA 9 DIA 10
Peso (g)
Controle
300,8±8,0 301,4±7,4 303,4±7,1 306,8±7,5 305,4±8,1 304,4±8,4 301,8±9,3 301±9,8 301,2±10,8 302±11,6
NaCl
1%
284,6±8,9 280,6±10,7*
285±8,9* 280,4±8,4* 276,8±8,7*
277±11,8* 283,8±9,4 289±8,9 290,4±9,5 297±8,7
NaCl
2%
289,8±3,9 255,6±4,9* 260,8±4,7* 252,8±2,9* 254,4±2,5*
256,6±5,8* 262,8±7,1 260±6,8 255±9,2* 251±10,0*
Volume
Urinário
(mL)
Controle
3,48±0,86 2,90±0,73 2,88±0,64 1,40±0,31 1,00±0,05 2,40±0,54 2,93±0,70 3,20±0,92 3,77±0,64 4,05±0,6
NaCl
1%
4,55±1,29 17,5±3,52* 14,0±1,60* 14,3±1,76* 14,8±1,71*
15,05±1,65*
22,43±4,59*
17,1±1,66* 24,8±5,02* 23,0±5,32*
NaCl
2%
3,9±0,71 34,0±1,96* 72,0±5,12* 78,8±7,0* 72,5±5,9* 85,5±7,73* 74,7±7,75* 84,8±9,12* 82,3±7,12* 81,0±8,36*
Consumo
de Água
(mL)
Controle
24,0±2,45 24,0±2,45 27,0±3,39 26,0±2,45 26,0±4,30 22,0±4,89 28,0±4,90 26,0±3,67 31,0±4,00 32,0±3,39
NaCl
1%
50,0±3,54*
46,0±4,30* 43,0±2,55* 49,0±1,87* 50,0±3,54*
47,2±2,06* 43,0±4,36* 46,0±4,85* 40,0±6,52 42,0±4,64
NaCl
2%
53,4±1,89*
96,4±1,86* 103,4±12,9*
106,6±4,12*
87,0±6,34*
102,6±3,87*
117,2±10,2*
102,4±4,96*
101,2±2,46*
125,6±10,2*
Consumo
de
Alimento
(g)
Controle
24±1,50 30,6±2,86 18,4±2,06 23,8±1,91 14,6±0,87 10,2±0,49 15,6±1,47 13,0±1,52 21,0±1,09 18,6±1,54
NaCl
1%
24,0±1,95 20,8±1,46* 21,2±1,71 21,0±0,95 21,4±2,04*
19,8±1,11* 20,6±1,08* 25,4±2,32* 18,8±2,86 18,6±0,93
NaCl
2%
22,4±0,60 16,8±0,86* 17,6±2,21 13,8±2,71* 16,8±1,39 14,6±1,44* 22,0±1,70* 20,4±1,25* 21,0±1,58 20,8±1,16
58
5.2 PERFUSÃO DE RIM ISOLADO
Os resultados mostram um aumento significativo na pressão de perfusão
dos grupos tratados com NaCl em relação ao controle, sendo esse aumento
mais pronunciado na concentração de 1% de NaCl. Observou-se que no tempo
de 90 e 120 minutos a PP do grupo 1% de NaCl apresentou-se mais elevada
do que a do grupo 2% de NaCl. Os dados mostram que houve uma oscilação
na pressão de perfusão do grupo de 1% de NaCl com uma tendência a
elevação, já no grupo de 2% de NaCl esse efeito não foi observado, pois a
pressão se mantêm constante ao longo de todo o experimento (Tabela
03/Figura 17).
A resistência vascular renal também foi aumentada significativamente no
grupo de 1% de NaCl em relação ao controle, apresentando uma elevação a
partir dos 30 minutos iniciais. No grupo de 2% de NaCl a RVR mostrou uma
redução significativa tanto em relação ao controle quanto ao grupo de 1% de
NaCl, mantendo essa redução constante ao longo de todo o experimento
(Tabela 04/Figura 18).
Observou-se que no fluxo urinário do grupo de 1% de NaCl houve um
aumento significativo em relação ao controle a partir dos 60 minutos de
experimento, que elevou-se mais ainda nos tempos 90 e 120 minutos. Em
relação ao grupo de 2% de NaCl observa-se uma redução significativa em
relação ao controle somente aos 30 minutos, porém comparando-se ao grupo
de 1% de NaCl essa redução foi significativa para todos os tempos (Tabela
05/Figura 19).
O ritmo de filtração glomerular mostrou-se significativamente aumentado
em relação ao controle no grupo de 1 % de NaCl, sendo esse aumento mais
pronunciado nos tempos 90 e 120 minutos. Em relação ao grupo de 2% de
NaCl o RFG apresentou-se significativamente reduzido quando comparado ao
controle e ao grupo de 1% de NaCl ao longo de todo o experimento,
assemelhando-se aos dados de resistência vascular renal (Tabela 06/Figura
20).
59
O percentual de transporte tubular de sódio foi alterado aos 30 minutos
de perfusão, sofrendo redução significativa em relação ao controle para ambos
os tratamentos de NaCl. Observou-se também redução aos 120 minutos para o
grupo de 2% de NaCl quando comparado ao controle, conforme pode ser
observado na tabela 07/figura 21.
O percentual de transporte tubular de potássio apresentou uma redução
significativa somente no grupo de 2% de NaCl, tanto em relação ao controle
quanto ao grupo de 1% de NaCl, sendo essa redução constante durante todo o
experimento como visto na tabela 08/figura 22.
A avaliação do percentual de transporte tubular de cloreto mostrou uma
redução significativa somente nos tempos de 30 e 120 minutos do grupo de 2%
de NaCl, sendo essa redução comparada ao controle e ao grupo de 1% de
NaCl. Os dados estão representados na tabela 09/figura 23.
O transporte tubular proximal de sódio, tabela 10/figura 24, apresentou
uma redução significativa somente no grupo 2% de NaCl nos tempos de 30 e
120 minutos, observou-se a redução do transporte tanto em relação ao controle
quanto ao grupo de 1% de NaCl.
Em relação ao transporte tubular de potássio observa-se que no grupo
de 1% de NaCl não há qualquer alteração em relação ao controle durante todo
o experimento, porém no grupo de 2% de NaCl ocorre uma redução
significativa quando comparado ao controle e ao grupo de 1% de NaCl, sendo
essa redução mantida durante todo o período do experimento (Tabela
11/Figura 25).
O transporte tubular de cloreto foi reduzido significativamente somente
aos 60 minutos no grupo de 1% de NaCl, em relação ao grupo de 2% de NaCl
observou-se uma redução significativa comparada ao controle durante todo
experimento. Além disso, o grupo de 2% de NaCl apresentou uma redução no
transporte em relação ao grupo de 1% de NaCl nos tempos 30 e 120 minutos
(Tabela 12/Figura 26).
60
O transporte de sódio foi alterando em ambos os grupos de tratamento
salino, observa-se que no grupo de 1% de NaCl há um aumento significativo
em relação ao controle durante todo o período de experimento. O grupo de 2%
de NaCl mostra também um aumento significativo em relação controle, porém
esse aumento não se mostra tão acentuado como observado no grupo de 1%
de NaCl, os dados podem ser melhores visualizados na tabela 13/figura 27.
A avaliação do transporte de potássio se mostrou similar ao de sódio
com elevação significativa nos grupos de 1% e 2% de NaCl em relação ao
controle, sendo esse aumento mais pronunciado no grupo de 1% de NaCl
(Tabela 14/Figura 28).
O transporte de cloreto também apresentou um perfil similar ao sódio e
potássio, os dados estão apresentados na tabela 15/figura 29.
Os dados mostrados na tabela 16/figura 30 são relacionados ao
clearance osmolar. Observa-se um aumento significativo em relação ao
controle no grupo de 1% de NaCl durante todo o experimento, porém no grupo
de 2% de NaCl observa-se uma redução em relação ao controle nos tempos
30, 60 e 90 minutos; e uma redução em relação ao grupo de 1% de NaCl em
todo o experimento.
61
Tabela 03 – Pressão de Perfusão (PP) em mmHg nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
50
100
150
200
Controle NaCl 1%
NaCl 2%
*
*
*
*
*
*
*
#
*
#
Tempo (minutos)
PP (mmHg)
Figura 16 – Pressão de Perfusão (PP) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 106,62
±
2,22 119,4
±
3,89* 122,7
±
0,86*
60 104,17
±
3,72 136,6
±
7,59* 127,5
±
1,46*
90 104,73
±
4,23 152,7
±
10,4* 127,2
±
2,07*
#
120 107,62
±
3,15 167,7
±
12,5 128,0
±
1,84*
#
62
Tabela 04 – Resistência Vascular Renal (RVR) em mmHg/mL.g
-1
.min
-1
nos
grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Controle NaCl 1% NaCl 2%
*
*
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
Tempo (minutos)
RVR
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
Figura 17 – Resistência Vascular Renal (RVR) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 4,85
±
0,15 6,15
±
0,47* 2,73
±
0,07*
#
60 4,90
±
0,16 6,89
±
0,47* 2,89
±
0,10*
#
90 4,47
±
0,20 7,63
±
0,56* 2,88
±
0,13*
#
120 4,71
±
0,18 8,26
±
0,59* 2,91
±
0,12*
#
63
Tabela 05 – Fluxo Urinário (FU) em mL.g
-1
.min
-1
nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
*
*
*
*
#
#
#
#
Tempo (minutos)
FU (mL.g
-1
.min
-1
)
Figura 18 – Fluxo Urinário (FU) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com
1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 0,168
±
0,011 0,200
±
0,017 0,119
±
0,007*
#
60 0,161
±
0,015 0,309
±
0,035* 0,128
±
0,020
#
90 0,164
±
0,024 0,401
±
0,049* 0,118
±
0,022
#
120 0,160
±
0,020 0,463
±
0,057* 0,124
±
0,017
#
64
Tabela 06 – Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) em mL.g
-1
.min
-1
nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
*
*
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
Tempo (minutos)
RFG (mL.g
-1
.min
-1
)
Figura 19 – Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) nos grupos controle (n=6) e
tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 0,701
±
0,073 1,039
±
0,108* 0,349
±
0,026*
#
60 0,707
±
0,051 1,350
±
0,139* 0,466
±
0,048*
#
90 0,633
±
0,051 1,824
±
0,182* 0,384
±
0,055*
#
120 0,697
±
0,084 1,959
±
0,226* 0,395
±
0,090*
#
65
Tabela 07 – Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa
+
) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
Controle
1% NaCl
2% NaCl
*
#
*
Tempo (minutos)
% TNa
+
Figura 20 – Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa
+
) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 81,94
±
1,24 82,82
±
1,63 71,77
±
3,361*
#
60 81,11
±
1,52 80,37
±
1,33 75,77
±
3,611
90 79,26
±
0,90 80,35
±
1,93 77,25
±
2,440
120 79,76
±
0,56 76,99
±
2,52 69,41
±
3,038*
66
Tabela 08 – Percentual de Transporte Tubular de Potássio (%TK
+
) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
Controle 1% NaCl 2% NaCl
*
#
*
#
*
#
*
#
Tempo (minutos)
%TK
+
Figura 21 – Percentual de Transporte Tubular de Potássio (%TK
+
) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 69,13
±
4,14 65,60
±
65,60 45,10
±
5,40*
#
60 69,04
±
5,68 63,96
±
63,96 45,36
±
5,87*
#
90 71,84
±
4,21 70,90
±
70,90 43,34
±
5,63*
#
120 69,94
±
6,86 67,93
±
67,93 40,87
±
5,45*
#
67
Tabela 09 – Percentual de Transporte Tubular de Cloreto (%TCl
-
) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
Controle
1% NaCl 2% NaCl
*
#
*
#
Tempo (minutos)
%TCl
-
Figura 22 – Percentual de Transporte Tubular de Cloreto (%TCl
-
) nos grupos
controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas
metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 79,90
±
0,98 78,38
±
2,16 67,30
±
3,69*
#
60 81,25
±
1,06 76,43
±
1,70 71,75
±
4,29
90 77,32
±
1,12 73,55
±
4,14 72,81
±
2,85
120 78,53
±
0,89 74,95
±
3,19 64,19
±
3,15*
#
68
Tabela 10 – Percentual de Transporte Tubular Proximal de Sódio (%pTNa
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias
em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
#
*
#
*
Tempo (minutos)
%pTNa
+
Figura 23 – Percentual de Transporte Tubular Proximal de Sódio (%pTNa
+
) nos
grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 75,69 ±
1,680
78,61
±
1,744 65,51
±
4,672*
#
60 72,59 ±
1,900
76,58
±
1,573 68,39
±
4,951
90 74,33 ±
1,330
77,34
±
1,931 71,84
±
3,177
120 72,18 ±
1,970
74,57
±
2,537 64,30
±
3,885*
#
69
Tabela 11 – Percentual de Transporte Tubular Proximal de Potássio (%pTK
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias
em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
#
*
#
*
#
*
#
*
Tempo (minutos)
%pTK
+
Figura 24 – Percentual de Transporte Tubular Proximal de Potássio (%pTK
+
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias
em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 59,06 ±
1,10 61,39
±
2,63 41,88
±
5,71*
#
60 63,68 ±
1,19 60,17
±
3,61 48,63
±
4,46*
#
90 64,68 ±
1,24 67,90
±
2,29 40,00
±
5,47*
#
120 63,78 ±
0,73 65,51
±
2,57 40,64
±
5,11*
#
70
Tabela 12 – Percentual de Transporte Tubular Proximal de Cloreto (%pTCl
-
)
nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias
em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
Controle
NaCl 1%
NaCl 2%
#
*
#
*
*
*
*
Tempo (minutos)
%pTCl
-
Figura 25 – Percentual de Transporte Tubular Proximal de Cloreto (%pTCl
-
) nos
grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em
gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 76,81 ±
0,65 74,18
±
2,27 61,05
±
4,94*
#
60 78,49 ±
1,54 72,64
±
1,75* 64,37
±
5,62*
90 76,58 ±
0,35 70,55
±
4,17 67,40
±
3,58*
120 76,36 ±
0,78 72,53
±
3,08 59,07
±
4,12*
#
71
Tabela 13 – Transporte de Sódio (TNa
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
50
100
150
200
250
NaCl 1%
NaCl 2%
Controle
*
*
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
Tempo (minutos)
TNa
+
(
µ
µ
µ
µ
Eq.g
-1
.min
-1
)
Figura 26 – Transporte de Sódio (TNa
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 14,87
±
0,886 114,5
±
11,99* 35,06
±
3,733*
#
60 13,81
±
1,186 147,2
±
15,77* 50,34
±
6,486*
#
90 13,24
±
1,147 193,5
±
20,25* 42,27
±
6,921*
#
120 13,53
±
1,038 189,3
±
22,73* 41,30
±
10,52*
#
72
Tabela 14 – Transporte de Sódio (TK
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
2
4
6
8
NaCl 1% NaCl 2%
Controle
*
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
*
Tempo (minutos)
TK
+
(
µ
µ
µ
µ
Eq.g
-1
.min
-1
)
Figura 27 – Transporte de Sódio (TK
+
) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 0,365
±
0,038 2,964
±
0,362* 0,780
±
0,116*
#
60 0,342
±
0,051 3,722
±
0,538* 1,198
±
0,181*
#
90 0,355
±
0,029 5,385
±
0,623* 0,881
±
0,223*
#
120 0,335
±
0,024 5,519
±
0,796* 0,873
±
0,297*
#
73
Tabela 15 – Transporte de Cloreto (TCl
-
) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
120
NaCl 1%
NaCl 2%
Controle
*
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
*
Tempo (minutos)
TCl
-
(
µ
µ
µ
µ
Eq.g
-1
.min
-1
)
Figura 28 – Transporte de Cloreto (TCl
-
) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 13,80
±
1,542 47,36
±
5,444* 23,36
±
3,035*
#
60 12,58
±
1,673 78,33
±
5,592* 38,14
±
5,036*
#
90 11,46
±
1,412 93,30
±
10,77* 31,49
±
5,290*
#
120 10,72
±
1,443 101,0
±
14,40* 29,75
±
7,580*
#
74
Tabela 16 –
Clearance
osmolar (Cosm) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
Resultados expressos em Média ± EPM,
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Controle
NaCl 1% NaCl 2%
*
*
*
#
*
#
#
*
#
*
Tempo (minutos)
C osm (mL/g/min)
Figura 29 –
Clearance
osmolar (Cosm) nos grupos controle (n=6) e tratados
(n=6) com 1% e 2% de NaCl por 10 dias em gaiolas metabólicas.
*p < 0,05 para comparação em relação ao controle,
# p < 0,05 para comparação em relação ao grupo de 1% de NaCl.
Tempo (min)
Controle NaCl 1% NaCl 2%
30 0,130
±
0,01 0,160
±
0,02 0,101
±
0,01*
#
60 0,130
±
0,01 0,267
±
0,03* 0,105
±
0,01*
#
90 0,130
±
0,01 0,339
±
0,04* 0,086
±
0,01*
#
120 0,130
±
0,01 0,416
±
0,05* 0,109
±
0,02
#
75
DISCUSSÃO
76
6. DISCUSSÃO
Os resultados do metabolismo diário, avaliados através de gaiolas
metabólicas, mostraram que o aumento da ingestão de NaCl altera os diversos
parâmetros analisados. O aumento da concentração de NaCl promove uma
redução do peso corpóreo e da quantidade de alimento ingerido, e ao mesmo
tempo aumenta o volume urinário e a ingestão de água. Estudos na literatura
de ratos submetidos à ingestão de 1% e 2% de NaCl na água por 10 dias em
gaiolas metabólicas são escassos, porém são importantes para compreensão
dos mecanismos fisiológicos de regulação do sódio.
O sistema renina-angiotensina-aldosterona é um dos principais sistemas
hormonais que regula a quantidade de sódio. A sua ação fisiológica consiste
principalmente estimular a reabsorção de Na
+
através dos rins, quando há uma
redução do volume (Mangrum
et al
., 2002). Quando há uma ingestão
acentuada de água e sal consequentemente irá haver uma expansão do
volume corporal, então o sistema renina-angiotensina-aldosterona estará
inibido aumentando a excreção desse excesso de Na
+
(Hall, 1986).
A ingestão de grande quantidade de água e NaCl promove a expansão
do volume, estimulando a liberação do peptídeo natriurético (ANP) pelo
coração, produzindo como efeito final a inibição da reabsorção tubular de NaCl
e água nos rins (Melo
et al
., 2000). Estudos mais recentes demonstraram que o
sistema gastrointestinal também está envolvido na regulação de sódio ingerido
através da dieta, sendo os peptídeos guanilina e uroguanilina os principais
candidatos a atuarem como “hormônio natriurético intestinal”. Essa
denominação refere-se ao fato de que evidências mostraram que uma dieta
alterada de sódio influencia na produção de ambos os peptídeos GN e UGN
pelas células da mucosa intestinal (Li
et al
., 1996).
77
Potthast e colaboradores (2001) em um estudo mostrou que
camundongos submetidos por 3 dias a ingestão de 1% de NaCl na água
apresentaram redução da ingestão alimentar e do peso corpóreo, além disso
os autores mostraram através de RT-PCR um aumento na expressão do
mRNA para o peptídeo uroguanilina. Mangrum
et al
. (2002) submeteu
camudongos por 2 dias em gaiolas metabólicas a uma dieta rica em sal (3,14g
de NaCl/100g de dieta) demonstrando um aumento na ingestão de água, no
volume urinário e na excreção de sódio urinário.
Estudos com ratos recebendo alta quantidade de sal no alimento por um
período de 4 dias, demonstraram um aumento na excreção de sódio e da
expressão do mRNA para GN e UGN no intestino (Carrithers
et al
., 2002). Uma
exposição crônica (7 dias) de ratos a uma grande concentração de sal (1% e
4% de NaCl na dieta), também comprovaram um aumento da expressão do
mRNA para os peptídeos GN e UGN no intestino (Li
et al
., 1996).
Esses achados corroboram os nossos resultados de metabolismo diário,
mostrando que altas quantidades de sal quando ingeridos principalmente por
via oral através da água, estimulam a expressão de GN e UGN no intestino que
por sua vez exercem suas ações no rim, promovendo um aumento no volume
urinário. A redução do peso corpóreo pode estar associada a menor ingestão
de alimento observada, além da acentuada diurese que pode levar a uma
desidratação.
Os estudos in vivo são importantes para compreensão da interação
entre os órgãos na regulação do Na
+
ingerido através da dieta, porém certos
mecanismos não podem ser explicados devido a grande complexidade de
mediadores e órgãos que são envolvidos em uma resposta fisiológica, devido a
isso se faz necessário o estudo de órgão isolado com o objetivo de entender as
alterações fisiológicas promovidas no órgão que se quer estudar, em nosso
estudo se fez uso de rim isolado de rato para compreender as alterações
promovidas pela exposição crônica de NaCl na dieta.
78
Perfusão de rim isolado de rato com uroguanilina induziu aumento da
pressão de perfusão nos tempo de 60, 90 e 120 minutos, observou-se também
um aumento do fluxo urinário a partir dos 60 minutos. Enquanto isso guanilina
não promoveu nenhuma alteração nesses dois parâmetros. Em relação ao
transporte de eletrólitos, UGN reduziu a reabsorção tubular fracionada de
sódio, potássio e cloreto a partir dos 60 minutos de experimento. UGN também
aumentou o
clearance osmolar
a partir dos 60 minutos. Esses resultados
demonstraram que UGN e GN apresentam atividades natriuréticas, caliuréticas
e diuréticas em rim isolado de rato (Fonteles
et al
., 1998).
O estudo da toxina termoestável da
Escherichia coli
em rim isolado de
rato também demonstraram seu efeitos na excreção urinária de Na
+
e K
+
(Lima
et al
., 1992). Forte (1999) sugeriu uma ordem de potência desses peptídeos
baseado em um estudo da produção de cGMP em células T84 e em rim de
gambá, onde STa mostrou-se mais potente que UGN e esta, por sua vez, que
a GN. Essa mesma ordem de potência foi confirmada em sistema de perfusão
de rim isolado de rato (Fonteles
et al
., 1998).
A substituição de aminoácidos específicos nos peptídeos da família das
guanilinas o torna mais potente como agonista dos receptores de guanilato
cilcase, produzindo respostas fisiológicas mais acentuadas. A substituição de
um resíduo de cisteína (Cys) na posição 7 por um de serina (Ser) no peptídedo
Linfoguanilina (LGN) produziu o análogo LGN
Ser
, que em rim isolado promoveu
aumento da excreção urinária de cGMP, de Na
+
, K
+
e água; através da
atrivação de GC localizado em células do túbulo renal (Fonteles
et al
., 2001).
Similarmente o peptídeo ser-thr-lys-guanilina foi sintetizado e teve sua
ação renal testada. Esse peptídeo produziu um aumento da pressão de
perfusão aos 120 minutos, porém em relação ao fluxo urinário observou-se que
a concentração de 0,5µg/mL promoveu um aumento a partir dos 90 minutos,
enquanto que na concentração de 1µg/mL observou-se um efeito contrário no
mesmo intervalo de tempo. A ser-thr-lys-GN também reduziu a reabsorção
tubular fracionada de sódio, potássio e cloreto (Sousa, 2005).
79
No presente trabalho observa-se resultados similares aos obtidos
nesses estudos realizados em rim isolado de reato com peptídeos da família
das guanilinas. A concentração de 1% de NaCl apresentou um aumento da
pressão de perfusão desde os 30 minutos iniciais, com similar aumento na
resistência vascular renal e no ritmo de filtração. O fluxo urinário apresentou-se
elevado a partir dos 60 minutos. Porém não houve alteração no percentual de
transporte tubular de eletrólitos. Os resultados também mostram um aumento
do
clearance osmolar
nos 60, 90 e 120 minutos de perfusão.
Esses achados do grupo de 1% de NaCl se mostram similar aos
resultados discutidos anteriormente em rim isolado de rato com os peptídeos
UGN e ser-thr-lys-GN (Fonteles
et al
., 1998; Sousa, 2005), evidenciando a
participação das guanilinas nessa resposta. Os resultados mostram também
que os receptores renais permanecem ativados mesmo o órgão estando
isolado e fora do organismo.
A participação dos outros sistemas reguladores de sal também pode
estar envolvida nessa resposta, visto que no grupo de 1% de NaCl não
observou-se alterações no transporte de eletrólitos, como visto nos
experimentos citados anteriormente.
O grupo de 2% de NaCl também apresentou um aumento na pressão de
perfusão desde os 30 minutos iniciais, sendo esse efeito bem menos
pronunciado do que o visto para o grupo de 1%. Observou-se uma redução da
resistência vascular renal e no ritmo de filtração glomerular e nenhuma
alteração no fluxo urinário, sendo um efeito oposto ao mostrado pelo grupo de
1% para esses parâmetros. Em relação ao transporte de eletrólitos os
resultados demonstram um aumento da excreção de Na
+
, K
+
e Cl
-
. No entanto
o
clearance osmolar
não foi alterado.
Esses resultados mostram que a concentração de 2% de NaCl altera
principalmente o transporte de eletrólitos, ao contrário do que observado no
grupo de 1%, sendo essa concentração insuficiente para alterar tais
parâmetros.
80
O percentual de transporte tubular proximal de sódio, potássio e cloreto
foi reduzido no grupo de 2% de NaCl, comprovando os efeitos natriuréticos e
caliuréticos promovidos pela UGN. Sindice
et al
. (2002) demonstraram, em
linhagem de células de túbulo proximal de humanos (IHKE-1), que os
hormônios GN e UGN alteram a condutância ao K
+
promovendo a sua
excreção, essas respostas foram comprovadas em nosso experimento, visto
que o percentual de transporte tubular proximal de potássio foi o mais alterado
pela concentração de 2% de NaCl.
Fonteles
et al
. (1998) sugeriu que a natriurese provocada em túbulos
proximais ocasionaria grande concentração de sódio nos túbulos distais, o que
consequentemente poderia estimula a secreção de potássio por esses
segmentos do néfron. Essa seria uma outra explicação para a excreção dos
eletrólitos observada nos grupos tratados com sal.
A alta ingestão de sal na água aumenta a expressão de mRNA do
peptídeo UGN em células renais e não afeta a expressão de GN, esse estudo
também demonstrou que o padrão de expressão renal para esses peptídeos
varia de acordo com a região, sendo a UGN mais amplamente distribuída em
células do túbulo proximal e a GN predominante em células do ducto coletor
(Potthast
et al
., 2001).
Potthast
et al
. (2001) no mesmo estudo citado anteriormente, também
mostrou que a modulação na expressão gênica para UGN renal é mais
acentuada quando a ingestão de altas quantidades de sal se faz através da
água e não do alimento. Esse mecanismo pode ser explicado através de
regulação fisiológica, pois quando há um aumento na quantidade de sal
ingerido através do alimento observa-se um proporcional aumento da ingestão
de água, induzindo um aumento na produção de urina e na excreção urinário
desse excesso de sódio. Por outro lado, quando o sal é ingerido através da
água, há uma voluntária redução da ingestão de alimento com conseqüente
perda de peso corpóreo, isso permite conservar a razão massa hídrica por
massa corporal (Collier
et al
., 1991).
81
Esse fato é interessante, pois os animais submetidos a uma ingestão de
altas quantidades de sal através da água são incapazes de compensar esse
excesso de NaCl por ingestão de mais água, como o observado nos animais
ingerido sal pela dieta (Latta
et al
., 1983). Por isso que essa forma de
tratamento foi escolhida para a realização desse experimento, para que as
respostas fisiológicas fossem bem melhores avaliadas.
Os peptídeo STa. GN e UGN ativam receptores de guanilato ciclase C
(GC-C) presentes em células intestinais, produzindo seus efeitos que já foram
muito bem comprovados nesse órgão. Porém, o mecanismo de ação renal se
mostra mais complexo de elucidação e ainda não foi esclarecido. Estudos
utilizando camundongo deficiente em GC-C, demonstram que o peptideo GN
não apresenta efeito intestinal (Schulz
et al
., 1997), porém sua ação
natriurética permanece sugerindo a existência de uma outra via, além da GC-C
em células renais (Carrithers
et al
., 1999).
A descoberta do receptor OK-GC de rim de gambá comprovou que o
mesmo pode ser ativado pela GN, UGN e STa (London
et al
., 1999). A
expressão do mRNA para o receptor OK-GC foi encontrado no córtex renal e
na mucosa intestinal, além da bexiga urinária e coração. A descoberta desse
receptor OK-GC permitiu então a explicação dos efeitos natriuréticos
observado em camundongos “knockout” para GC-C (Mann
et al
., 1997).
O emprego da técnica de RT-PCR permitiu determinar a distribuição do
mRNA do receptor GC-C em segmentos do néfron de rato. A expressão do
mRNA para GC-C foi bem maior no ducto coletor cortical, seguido de túbulo
contorcido proximal e por fim na alça de Henle. O mesmo estudo também
mostra que existe uma síntese renal de GN e UGN, podendo então contribuir
para a regulação do transporte tubular renal (Carrithers
et al
., 2000).
Os peptídeos da família das guanilinas podem atuar em diversos locais
do rim, foi comprovada a sua ação através de receptores GC-C, porém a
existência de receptores órfãs de guanilato ciclase sugere outros possíveis
candidatos a serem ativados pelas guanilinas (Sindic
et al
., 2006). Foi
82
descoberto também que os peptídeos da família das guanilinas atuam por
outras vias independentes de GCs, tais como a regulação de canais de
potássio Kcn1 (Yao
et al
., 1996), o receptor CFTR (Forte
et al
., 2000) e os
canais de potássio do tipo ROMK (Michell
et al
., 2008). A interação dessas vias
ativadas pelas GNs ainda não se encontra elucidada.
Outros estudos também mostraram a expressão de mRNA do peptídeo
UGN em átrios e ventrículos do coração, esse achado então demonstrou
também a participação do miocárdio na sinalização renal via UGN no controle
da regulação de sal presente em excesso na circulação (Fan
et al
., 1996).
No presente estudo, o tratamento crônico de ratos em gaiolas
metabólicas submetidos à ingestão de 1% e 2% de NaCl na água
demonstraram alterações no metabolismo, principalmente com aumento da
diurese e redução do peso corpóreo. O estudo da função renal demonstrou
alterações na pressão de perfusão, no fluxo urinário e principalmente no
aumento da excreção de potássio, confirmando os dados descritos na
literatura.
O advento de novas tecnologias como RT-PCR possibilitarão a
descoberta dos possíveis receptores renais envolvidos nesse processo e a
comprovação do mecanismo de ação do peptídeo da família da guanilinas.
83
CONCLUSÕES
84
7. CONCLUSÕES
O presente estudo mostrou que o tratamento de 1% e 2% de NaCl
promove alterações significativas no metabolismo diário de ratos.
O tratamento de 2% de NaCl apresentou uma maior alteração na
avaliação do metabolismo diário do que o grupo de 1%.
O tratamento de 1% de NaCl alterou a pressão de perfusão, o fluxo
urinário, porém não alterou o transporte de eletrólitos em rim isolado de
rato.
O tratamento de 2% de NaCl alterou a pressão de perfusão e os outros
parâmetros bem menos pronunciado do que o 1%, porém observa-se
alteração no transporte de eletrólitos, principalmente o potássio.
Os resultados comprovam os efeitos da guanilina e uroguanilina
presente na literatura, demonstrando a participação desses hormônios
na sinalização.
O mecanismo de ação dessas alterações metabólicas e renais ainda
não foi completamente esclarecido.
85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
86
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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97
ANEXO
98
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