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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE VARIANTES MOLECULARES DO
RECEPTOR DE MELANOCORTINA 1 (MC1R)
E O MELANOMA CUTÂNEO
DÉBORA TEIXEIRA DUARTE
ORIENTADORA: PROFª Drª LIDIA ANDREU GUILLO
Dissertação apresentada ao Instituto
de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Goiás
como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Biologia – Área de concentração:
Biologia Celular e Molecular.
GOIÂNIA, 2008
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2
Aos pacientes do Hospital Araújo Jorge
que, gentil e literalmente, deram o sangue para
este trabalho. Em um momento de dor,
colaboraram com algo que não lhes trará
benefício algum. Tal lição de amor ao próximo eu
não poderia ter aprendido em outra ocasião.
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3
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Luiz Augusto e Márcia. Por tudo, e especialmente pelo
incentivo e zelo que sempre tiveram com a minha formação acadêmica (o que inclui,
necessariamente, me levar no laboratório em horários inconvenientes, fazer suco de
laranja às quatro da manhã e revisar a dissertação com olhos atentos, dentre outras
habilidades especiais).
Aos meus irmãos Lívia e Rafael, pela companhia desde a mais tenra idade e
por suportarem (quase sempre sem revidar) meus ataques de fúria e desespero,
principalmente nesta reta final.
Às amigas e companheiras de mestrado: Paula, por seu sorriso acolhedor e
por aturar minhas lamentações quase diárias; Lidiane, pela “co-orientação”, broncas,
conselhos e momentos de descontração maravilhosos, sem os quais eu teria
enlouquecido.
À amiga e “super hiper mega” eficiente estagiária Larissa Matuda, com quem
eu dividi de fato todas as alegrias, desilusões e surpresas deste trabalho.
À Erika, pela companhia e conselhos oportunos.
À Zenilda, pelo trabalho silencioso e necessário.
À Profª Drª Lidia, pela orientação, inspiração e paciência.
À Profª Drª Célia, do Laboratório de Biologia Molecular da UFG, pelas
sugestões valiosas e por aceitar o convite para esta parceria.
À Juliana Parente, do Laboratório de Biologia Molecular da UFG, pelas mãos
precisas na hora de sequenciar a minha placa.
À Profª Drª Sueli, do Instituto de Química da Universidade de São Paulo, por
abrir as portas de seu laboratório para um estágio que muito me enriqueceu.
4
À Luci, pelo apoio, agasalho, conversas, “tour” na Cidade Universitária e
dicas turísticas sobre São Paulo. E claro, pelo trabalho eficiente e zelo com minhas
amostras.
À equipe do Serviço de Sequenciamento do Cenargen (Embrapa DF).
À equipe do Ambulatório de Pele e Tórax do Hospital Araújo Jorge de
Goiânia: Nermindo, Nildes, Flávio, Saulo, Roberto, Raimundo, Sormany, Odenir,
Verônica e Elenita.
À equipe do Laboratório Hemolabor, pelas amostras cedidas.
À Luciana “prima cunhada”, pela ajuda na formatação.
Aos amigos de todas as horas: Luciana, Patrícia & Leandro Mourão, Anna
Paolla, Vinícius Batista e Paola Bergamini.
A todos da minha família: tios, primos e avós, que torceram por mim.
A todos os voluntários que doaram sangue, sem os quais este trabalho não
existiria.
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“Quem tem consciência para ter coragem
Quem tem a força de saber que existe
E no centro da própria engrenagem
Inventa a contra-mola que resiste
Quem não vacila mesmo derrotado
Quem já perdido não se desespera
E envolto em tempestade, decepado
Entre os dentes segura a primavera.”
(Primavera nos Dentes, João Ricardo & João Apolinário)
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ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE VARIANTES MOLECULARES DO RECEPTOR
DE MELANOCORTINA 1 (MC1R) E O MELANOMA CUTÂNEO
O gene do receptor de melanocortina 1 (MC1R) codifica um receptor acoplado à
proteína G, o qual exerce um papel central na produção de melanina através de uma
via de sinalização mediada por cAMP e ativada pelo hormônio melanócito-
estimulante. A região codante do MC1R é altamente polimórfica, e algumas
variantes têm sido associadas com um risco elevado de melanoma cutâneo,
sugerindo que este seja um gene baixa penetrância na suscetibilidade ao
melanoma. Neste estudo nós procuramos determinar a contribuição das variantes do
MC1R para o risco de melanoma cutâneo na população brasileira. Este é o primeiro
estudo a descrever variantes do MC1R em indivíduos do Brasil. 34 pacientes com
melanoma e 71 controles não aparentados e saudáveis foram recrutados
consecutivamente entre setembro de 2006 e outubro de 2007. Informações sobre o
fototipo cutâneo e características de pigmentação foram coletadas por meio de
questionário padronizado. O DNA genômico foi extraído a partir do sangue venoso, e
o gene MC1R foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR). A
presença de variantes foi investigada por seqüenciamento com o kit BigDye
Terminator Cycle Sequencing. A análise das seqüências foi feita com a plataforma
SNPpipeline, mantida pelo Laboratório de Genética de Populações do Instituto
Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI, NIH, USA). A sequência consenso foi
importada do GenBank (AF153431). Não foram detectadas associações de cor de
pele, olhos, cabelos e fototipo com o melanoma em níveis significantes, apenas uma
tendência de associação entre indivíduos com fototipos I e II e o melanoma
(OR=2,03; p=0,1358). Foram encontrados onze diferentes polimorfismos, dos quais
sete levam à troca de aminoácido no MC1R (Val60Leu, Val92Met, Arg151Cys,
Arg160Trp, Arg163Gln, Asp184His, e Asp294His), incluindo o novo alelo Asp184His;
e quatro são mutações silenciosas (Asp42Asp, Thr177Thr, Gln233Gln e
Phe300Phe). De todos os indivíduos, 41,90% eram portadores de pelo menos um
polimorfismo, incluindo 16 (47,06%) casos e 28 (39,44%) controles. As variantes
mais freqüentes foram Val60Leu, que foi encontrada em 13 indivíduos (2 casos e 11
controles) e Arg163Gln, que foi encontrada em 12 indivíduos (6 casos e 6 controles).
Nenhuma associação significante com risco de melanoma, subtipo histopatológico
de melanoma ou fototipo foi observada para portadores de variantes não sinônimas
do MC1R. Não obstante, foram observadas tendências de associação entre as
variantes Asp42Asp (OR=6,4; p=0,32), Val92Met (OR=4,6; p=0,08), Arg151Cys
(OR=6,8; p=0,10), Arg163Gln (OR=2,3; p=0,20), Asp184His (OR=6,4; p=0,32) e
Asp294His (OR=2,1; p=0,54) e o melanoma. Além disso, observamos uma
tendência de associação entre a presença de qualquer variante não sinônima e o
melanoma de subtipo “não nodular” (lentiginoso acral, extensivo superficial ou
lentigo maligna).
PALAVRAS-CHAVE: melanoma, receptor de melanocortina 1, polimorfismo de base
única.
7
ASSOCIATION STUDY BETWEEN MOLECULAR VARIANTS OF
MELANOCORTIN-1 RECEPTOR (MC1R) GENE AND CUTANEOUS MELANOMA
The melanocortin-1 receptor gene (MC1R) encodes a G protein-coupled receptor
which plays a central role in melanin production by a cAMP-signaling pathway
activated by the melanocyte stimulating hormone. The coding region of MC1R is
highly polymorphic and some variants have been associated with an elevated risk for
cutaneous melanoma, suggesting that it is a low-penetrance melanoma susceptibility
gene. In this study we sought to determine the contribution of MC1R gene variants to
the risk of cutaneous melanoma in the Brazilian population. This is the first study to
describe MC1R variants among subjects from Brazil. 34 melanoma patients and 71
unrelated healthy controls were consecutively recruited between September 2006
and October 2007. Information about skin phototype and pigmentation characteristics
was collected through a standardized questionnaire. Genomic DNA was extracted
from venous blood, and the MC1R gene was amplified by polymerase chain reaction
(PCR). The presence of variants was assessed by sequencing with BigDye
Terminator Cycle Sequencing Kit. Sequence analysis was done with SNP Analysis
Server, provided by the Laboratory of Population Genetics (NCI, NIH, USA).
Consensus sequence was imported from GenBank (AF153431). We haven’t
detected associations of skin color, eye color, hair color or phototype with melanoma
in significant levels, but we have detected an association tendency between subjects
with phototypes I or II and melanoma (OR=2,03 and p=0,1358). We have found
eleven different polymorphisms, of which seven lead to amino acid exchange in
MC1R (Val60Leu, Val92Met, Arg151Cys, Arg160Trp, Arg163Gln, Asp184His, and
Asp294His), including the novel Asp184His allele; and four are silent mutations
(Asp42Asp, Thr177Thr, Gln233Gln and Phe300Phe). From all subjects, 41,90%
carried at least one polymorphism, including 16 (47,06%) cases and 28 (39,44%)
controls. The most frequent variants were Val60Leu, which was found in 13 subjects
(2 cases and 11 controls) and Arg163Gln, which was found in 12 subjects (6 cases
and 6 controls). No significant association with melanoma risk, melanoma
hystopathological subtype or phototypes was observed for carriers of non-
synonymous MC1R variants. However, we did observed association tendencies
between the variants Asp42Asp (OR=6,4; p=0,32), Val92Met (OR=4,6; p=0,08),
Arg151Cys (OR=6,8; p=0,10), Arg163Gln (OR=2,3; p=0,20), Asp184His (OR=6,4;
p=0,32) e Asp294His (OR=2,1; p=0,54) and cutaneous melanoma. Besides that, we
have found an association tendency between the existence of any non synonymous
variant and non-nodular melanoma (acral lentiginous, superficial spreading or lentigo
maligna).
KEY WORDS: melanoma, melanocortin-1 receptor, single nucleotide polymorphisms.
8
Lista de Figuras
Figura 1. Estrutura da pele humana e seus anexos. (Adaptado de STARR &
TAGGART, 1995)........................................................................................14
Figura 2. Camadas da epiderme e suas células características. (Adaptado
de GRAY, 1997)..........................................................................................15
Figura 3. Síntese de melaninas. (SLOMINSKI et al., 2004).........................18
Figura 4. Estrutura do MC1R (Adaptado de GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
...................................................................................................................22
Figura 5. Mecanismo de ação do MC1R. (CHIN, 2003)...............................25
Figura 6. Aspecto macroscópico do melanoma. (DUVIVIER &MCKEE, 1997).
...................................................................................................................30
Figura 7. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma, por
cor de pele, segundo sua auto-declaração................................................47
Figura 8. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por
cor dos olhos..............................................................................................48
Figura 9. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por
cor dos cabelos..........................................................................................49
Figura 10. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por
fotótipo.......................................................................................................49
Figura 11. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma
segundo seu hábito de fotoproteção..........................................................51
Figura 12. Distribuição dos casos de melanoma por subtipo
histopatológico...........................................................................................52
Figura 13. Eletroforese dos produtos da amplificação por PCR em gel de
agarose 1%................................................................................................54
9
Figura 14. Trecho de um dos cromatogramas obtidos...............................55
Figura 15. Comparação das seqüências obtidas com a seqüência de
referência AF153431 na plataforma SNPpipeline. .....................................56
Figura 16. Detalhe de uma seqüência analisada pelo SNPpipeline,
evidenciando mutação na posição 160......................................................57
Figura 17. Página de entrada dos dados e página de resultados do BLAST
específico para verificar troca de aminoácidos decorrente de SNPs, o qual
é acessado a partir da plataforma SNPpipeline.........................................58
10
Lista de Tabelas
Tabela 1. Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle
...................................................................................................................47
Tabela 2. Associação entre características de pigmentação e o melanoma
cutâneo. ....................................................................................................50
Tabela 3. Distribuição dos casos de melanoma cutâneo com tumor
primário por sítio........................................................................................53
Tabela 4. Variantes do MC1R encontradas e sua associação individual com
o melanoma...............................................................................................59
Tabela 5. Freqüências alélicas no locus MC1R e sua associação com o
melanoma cutâneo....................................................................................61
Tabela 6. Associação entre a presença de variantes não sinônimas e o
melanoma cutâneo....................................................................................62
Tabela 7. Associação entre a presença de variantes funcionais do MC1R e
o melanoma cutâneo.................................................................................62
Tabela 8. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do
MC1R e o fototipo no grupo controle.........................................................63
Tabela 9. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do
MC1R e o fototipo no grupo melanoma......................................................63
Tabela 10. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do
MC1R e os subtipos histopatológicos de melanoma..................................64
11
LISTA DE ABREVIATURAS
AC – adenilato ciclase
ACTH – hormônio adrenocorticotrófico
AJCC – The American Joint Committee on Cancer
ARF – alternate reading frame
ASIP – proteína sinalizadora Agouti
cAMP – adenosina monofosfato cíclico
CD – cisteinildopa
CDK4 – cyclin-dependent kinase 4
CDKN2A – cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
cm - centímetros
CREB – elemento de ligação responsivo ao cAMP
CRT – sequenciamento por terminação cíclica reversível
DCT – dopacroma tautomerase ou Tyrp2
ddNTP – didesoxinucleotídeo
DHI - 5,6-diidroxiindol
DHICA – 5,6-diidroxiindol-2-ácido carboxílico
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP - desoxinucleotídeo
DP – desvio padrão
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético
END1 – endotelina 1
GPCR – receptor acoplado à proteína G
GRK – GPCR quinase
GSH – glutationa
H
2
O
2
– peróxido de hidrogênio
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IC – intervalo de confiança
L-DOPA – L-diidroxifenilalanina
LEF-1 – lymphoid enhancer-binding factor 1
M – molar
m – mili
MCR – receptor de melanocortina
12
MC1R – receptor de melanocortina 1
MDS – melanoma de disseminação superficial
MITF – fator de transcrição da microftalmia
MLA – melanoma lentiginoso acral
MLM – melanoma lentigo maligna
MN – melanoma nodular
MSH – hormônio melanócito estimulante
NADP – nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato
NADPH - nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato-hidrogênio
nsSNP – SNP não sinônimo
OR – Odds Ratio
PAX3 – paired-box 3
PCR – reação em cadeia da polimerase
PKA – proteína quinase A
POMC – pro-opiomelanocortina
PrASE – microarray-based genotyping technique protease-mediated allele-
specific extention
q.s.p. - quantidade suficiente para
RFLP – polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição
RPE – epitélio pigmentar da retina
rpm – rotações por minuto
SBH – sequenciamento por hibridização
SBS – sequenciamento por síntese
SNA – sequenciamento por adição de único nucleotídeo
SNP – polimorfismo de base única
SOX10 – sex determining region Y box 10
SSCP – análise de polimorfismo de conformação de fita simples
SSDNA – Serviço de Seqüenciamento de DNA, Universidade de São Paulo
sSNP – SNP sinônimo
TGFβ – fator de crescimento transformador beta
TNFα – fator de necrose tumoral alfa
TRP – proteína relacionada à tirosinase
Tyrp – proteína relacionada à tirosinase
UV – radiação ou luz ultravioleta
µL – microlitros
°C – graus celsius
13
Sumário
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................15
1.1 Estrutura da pele humana................................................................15
1.1.1 Derme........................................................................................15
1.1.2 Epiderme...................................................................................16
1.2 Melanócito e unidade de pigmentação epidérmica..........................17
1.3 Melanina e melanogênese................................................................19
1.4 MC1R ...............................................................................................23
1.4.1 Estrutura do MC1R.....................................................................23
1.4.2 Mecanismo de ação e regulação do MC1R................................28
1.5 Melanoma........................................................................................31
1.5.1 Histórico....................................................................................31
1.5.2 Características Clínicas..............................................................31
1.5.3 Classificação Histopatológica....................................................31
1.5.4 Epidemiologia............................................................................34
1.5.5 Etiologia e fatores de risco........................................................34
1.6 Polimorfismos de base única (SNPs)................................................37
1.7 Seqüenciamento de DNA..................................................................39
2 JUSTIFICATIVA.........................................................................................40
3 OBJETIVO GERAL.....................................................................................41
3.1 Objetivos Específicos........................................................................41
4 METODOLOGIA........................................................................................42
4.1 Participantes....................................................................................42
4.2 Aferição de características de pigmentação e histórico de câncer. .42
4.3 Coleta de sangue.............................................................................43
4.4 Extração de DNA genômico..............................................................44
4.5 Quantificação...................................................................................44
4.6 Reação em cadeia da polimerase....................................................44
4.7 Eletroforese em agarose..................................................................45
4.8 Purificação........................................................................................46
14
4.9 Quantificação...................................................................................46
4.10 Seqüenciamento de DNA................................................................46
4.10.1 Preparo das reações de seqüenciamento................................47
4.10.2 Precipitação.............................................................................47
4.11 Detecção de polimorfismos de base única.....................................48
4.12 Análise estatística..........................................................................49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................50
5.1 Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle..50
5.2 Características de pigmentação e hábito de fotoproteção...............52
5.3 Características clínicas do grupo melanoma....................................58
5.3.1 Subtipos histopatológicos do grupo melanoma.........................58
5.3.2 Localização do tumor primário..................................................59
5.4 Análise Molecular.............................................................................60
5.4.1 Amplificação do gene MC1R por PCR.........................................60
5.4.2 Seqüenciamento e detecção de SNPs.......................................61
5.4.3 Distribuição das variantes do MC1R e sua associação com
características de pigmentação e risco de melanoma cutâneo..........65
6 CONCLUSÕES..........................................................................................72
7 PERSPECTIVAS........................................................................................73
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................74
9 ANEXOS...................................................................................................82
9.1 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Associação de Combate
ao Câncer em Goiás...............................................................................83
9.2 Comprovante de aprovação do projeto multicêntrico pela Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)................................................84
9.3 Questionário sobre características de pigmentação........................85
9.4 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – grupo controle.......87
9.5 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – grupo melanoma....88
9.6 Planilha dos dados dos indivíduos do grupo controle. .....................90
9.7 Planilha dos dados dos indivíduos do grupo melanoma. .................91
15
1 INTRODUÇÃO
A pele, o maior órgão do corpo humano, consiste de um tecido conjuntivo
(derme) revestido por um epitélio estratificado (epiderme), continuamente renovado
ao longo da vida. Além de revestir e proteger o corpo, a pele apresenta funções
termorregulatória, sensorial, imune e metabólica, dentre outras (FREEDBERG et al.,
2003).
Como todo e qualquer órgão do corpo, a pele está sujeita à distúrbios
proliferativos, resultantes de mutações e outros processos que alterem o ciclo
celular, levando a um crescimento desordenado e à formação de uma massa de
células anormais denominada tumor. Um tumor pode ser benigno ou maligno,
dependendo de sua capacidade de invasão dos tecidos adjacentes; os tumores
malignos também são conhecidos como cânceres (SCHULZ, 2005).
Os cânceres de pele mais comuns são os carcinomas, originados por
queratinócitos da epiderme. Apesar disso, praticamente não ocupam espaço nas
estatísticas de mortes por câncer, porque são pouco invasivos e facilmente curáveis.
Já o câncer originado de melanócitos, o melanoma, é mais raro e costuma ser
bastante agressivo, sendo letal quando descoberto tardiamente (LEBOIT et al.,
2006).
1.1 Estrutura da pele humana
1.1.1 Derme
A derme é um tecido conjuntivo vascularizado, responsável pela nutrição da
pele. Apresenta, além de vasos sanguíneos, vasos linfáticos, fibras nervosas
sensoriais e aferentes, feixes de músculo liso, células imunes e fibroblastos, os
quais produzem uma matriz extracelular rica em colágeno e elastina (ver figura 1).
16
Também abriga estruturas de origem epitelial, tais como glândulas sebáceas,
glândulas sudoríparas e folículos pilosos (REES, 2004).
Logo acima da derme, sobre a membrana basal, está a epiderme, um
epitélio estratificado pavimentoso e queratinizado, cujas células dispõe-se em
camadas de acordo com seu estado de maturação.
Figura 1. Estrutura da pele humana e seus anexos. (Adaptado de STARR & TAGGART,
1995).
1.1.2 Epiderme
A epiderme é formada por quatro camadas contíguas (ver figura 2). A
camada mais externa (estrato córneo) é composta de queratinócitos mortos
preenchidos com proteínas filamentosas (queratina). Esta camada forma uma
barreira que protege a pele contra agentes infecciosos, reage com compostos
químicos e absorve radiação. As camadas logo abaixo (estrato granuloso e estrato
espinhoso) são formadas por células vivas, irreversivelmente comprometidas com a
diferenciação terminal. Assim, mudanças genéticas nestas células raramente se
17
tornam permanentes, porque elas estão destinadas à se tornarem incapazes de
proliferar, perdendo seu núcleo e sendo eventualmente eliminadas por descamação.
Mesmo a camada basal, à qual a atividade proliferativa é confinada, consiste em
sua maioria de células com um potencial replicativo limitado. Este é um dos motivos
pelos quais os tumores cutâneos originados destas células (carcinomas) são
geralmente pouco agressivos (SCHULZ, 2005).
Além dos queratinócitos, a epiderme apresenta células de Langerhans, que
participam de processos imunes na pele, processando e apresentando antígenos; e
melanócitos, responsáveis pela pigmentação cutânea (REES, 2004).
Figura 2. Camadas da epiderme e suas células características. À direita, melanócito
situado na camada basal, com seus prolongamentos dendríticos em direção aos queratinócitos
adjacentes (Adaptado de GRAY, 1997).
1.2 Melanócito e unidade de pigmentação epidérmica
Os melanócitos situam-se na camada basal da epiderme (ver figura 2), e
pertencem a uma linhagem embrionária diferente dos queratinócitos. Durante o
desenvolvimento embrionário, os precursores dos melanócitos (melanoblastos)
proliferam-se, diferenciam-se e migram da crista neural para seu destino final, que
pode ser a camada basal da pele, as meninges, a mucosa ectodérmica ou o trato
uveal (KUFE et al., 2003).
Os melanócitos adultos são especializados na produção de melanina a partir
18
de tirosina, em vesículas denominadas melanossomos (YAAR & GILCHREST,
2004).
Os melanossomos são organelas intracelulares membranosas, originárias do
retículo endoplasmático. Podem ser encontrados em quatro estágios de maturação
morfologicamente distintos: (1) pré-melanossomos ou melanossomos de estágio I,
sem pigmento visível e com estruturas de membrana interna irregulares; (2)
melanossomos de estágio II, caracterizados por vesículas mais alongadas e
membranas internas organizadas em estruturas paralelas; (3) melanossomos de
estágio III, onde a deposição ordenada de melanina nas fibras internas pode gerar
um aspecto de colar de contas; (4) melanossomos de estágio IV ou melanossomos
maduros, completamente preenchidos com melanina e sem estruturas luminais
aparentes (SETALURI, 2003).
Durante o seu desenvolvimento, o melanossomo adquire a tirosinase e as
proteínas relacionadas à tirosinase 1 e 2 (Tyrp1 e Tyrp2), as quais participam da
melanogênese. O tamanho e o número dos melanossomos é importante na
determinação da pigmentação humana, e em geral os melanossomos da pele negra
são maiores do que os encontrados na pele branca (TSATMALI et al., 2002).
Na pele, os melanócitos interagem com queratinócitos adjacentes por meio
de projeções dendríticas (ver figura 2) , transferindo assim seus grânulos de
melanina, que irão se estabelecer de modo a formar um “cap” protetor para o núcleo
do queratinócito. O processo de diferenciação dos queratinócitos transporta a
melanina para as camadas mais externas da pele, onde ela confere pigmentação ao
tecido epidérmico e absorve luz visível e luz ultravioleta (UV), protegendo as células
vivas da pele.
A transferência de melanina para os queratinócitos epidérmicos ou para os
queratinócitos corticais / medulares da haste do pêlo em crescimento provavelmente
envolve um mesmo mecanismo, ainda não elucidado. Diversas teorias têm sido
propostas para explicar este processo de doação de organelas entre células. A
“Teoria Autofágica” propõe que o queratinócito participe ativamente, fagocitando as
extremidades dos dendritos dos melanócitos com melanossomos maduros de
estágio IV. A “Teoria da Descarga” considera que os melanossomos sejam liberados
19
no espaço intercelular e então internalizados pelos queratinócitos adjacentes. A
“Teoria da Fusão” propõe, como o nome sugere, que ocorra a fusão das membranas
plasmáticas de melanócitos e queratinócitos, permitindo assim a passagem dos
melanossomos maduros de uma célula para a outra. Por fim, a “Teoria Citócrina”
sugere que os melanócitos injetem a melanina nos queratinócitos destinatários
(SLOMINSKY et al., 2004).
Além da interação óbvia na transferência de melanina, os queratinócitos
atuam regulando o crescimento, a dendricidade, a dispersão, os contatos célula-
célula e a melanização dos melanócitos, por meio de fatores secretados
(SLOMINSKY et al., 2004).
1.3 Melanina e melanogênese
A melanina é um polímero formado a partir da oxidação enzimática de
tirosina, pela tirosinase. Existem dois tipos principais de melanina, que diferem entre
si na composição química, propriedades físicas e estruturais: eumelanina, de cor
acastanhada ou negra, e feomelanina, de cor avermelhada ou amarela (SLOMINSKI
et al., 2004).
A eumelanina é uma macromolécula heterogênea, formada por 5,6-
diidroxiindol (DHI), 5,6-diidroxiindol-2-ácido carboxílico (DHICA) e suas formas
totalmente oxidadas (quinonas) e semi-oxidadas (semiquinonas). A feomelanina,
também uma macromolécula heterogênea, é derivada do composto sulfúrico
cisteinildopa (CD) (MEREDITH & SARNA, 2006).
A biossíntese de melaninas (Ver figura 3) pode ser iniciada a partir da
fenilalanina, que é hidroxilada à L-tirosina pela fenilalanina-hidroxilase; ou a partir da
L-tirosina, que é hidroxilada à L-diidroxifenilalanina (L-DOPA) pela tirosinase. A
tirosinase (EC 1.14.18.1), estruturalmente uma glicoproteína com átomos de cobre
em seu sítio ativo, é a principal enzima da melanogênese, capaz de catalisar dois
tipos de reações diferentes: a hidroxilação de monofenóis a orto-difenóis (atividade
monofenolase) e a oxidação do orto-difenol resultante a orto-quinonas (atividade
difenolase). Por participar da melanogênese em três pontos distintos, é chamada
enzima “rate-limiting”, que determina a velocidade da via. Além de precursora das
20
melaninas, a L-DOPA também participa da via de formação das catecolaminas.
Para a formação das melaninas, a L-DOPA é oxidada à dopaquinona pela
tirosinase, e a partir deste ponto, as vias de eumelanogênese e feomelanogênese
divergem. Na via de eumelanogênese, a dopaquinona é convertida em
leucodopacroma e sofre uma série de reações de oxirredução, produzindo os
intermediários DHI e DHICA, que se polimerizam, formando a eumelanina. Na via de
feomelanogênese, a dopaquinona é conjugada com cisteína ou glutationa, formando
cisteinildopa ou glutationildopa, os quais irão sofrer oxidação à cisteinildopaquinona,
e posteriomente, ciclização intramolecular e polimerização, formando assim a
feomelanina (SLOMINSKI et al., 2004).
Figura 3. Síntese de melaninas. GSH, glutationa; Cys, cisteína. 1: Hidroxilação de L-
fenilalanina pela fenilalanina-hidroxilase; 2: hidroxilação de L-tirosina pela tirosinase; 3: oxidação de
L-DOPA pela tirosinase ; 4: tautomerização de dopacroma (pela DCT/Tyrp2 ou cátions metálicos). 5a:
oxidação de DHICA (por Tyrp1 ou peroxidase); 5b: oxidação de DHI (por tirosinase ou peroxidase); a:
hidrólise de glutationildopa (pela γ-glutamiltranspeptidase); b: oxidação de cisteinildopa (por
peroxidase); c: ciclização intramolecular de cisteinildopaquinona (pode ser facilitada pela peroxidase)
(SLOMINSKI et al., 2004).
21
Em ambas as vias, o passo obrigatório é a formação de L-DOPA pela
tirosinase. As etapas seguintes podem ocorrer espontaneamente em taxas variáveis,
dependendo da concentração de H
+
, presença e concentração de cátions metálicos,
agentes redutores, tióis e oxigênio.
A formação de eumelanina ou feomelanina está diretamente relacionada à
presença ou ausência de cisteína e glutationa em seu estado tiolato totalmente
reduzido. Assim, a presença e atividade de enzimas antioxidantes no melanócito,
tais como catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa
redutase podem alterar a via melanogênica quantitativamente ou qualitativamente.
Quando a concentração de compostos sulfídricos é baixa, a dopaquinona é
convertida em dopacroma, iniciando a eumelanogênese. Alternativamente, altas
concentrações de cisteína e glutationa levam à sua conjugação com dopacroma,
formando cisteinildopa e glutationildopa. A transformação da glutationa oxidada em
sua forma reduzida pela glutationa redutase requer NADPH, e é essencial para a
formação de glutationildopa. Assim, o sistema de reciclagem de NADPH/NADP e a
via pentose fosfato estão indiretamente envolvidos na regulação da melanogênese
(SLOMINSKI et al., 2004).
Dentre as propriedades físicas e químicas das melaninas relevantes para a
sua função no organismo estão: habilidades de troca de elétrons (reduzir e oxidar
outras moléculas), baixa fluorescência (mais de 99,9% dos fótons absorvidos estão
sujeitos à dissipação não radioativa, o que é uma característica importante num
fotoprotetor), baixa concentração de radicais livres e a capacidade de se ligar a íons
metálicos (MEREDITH & SARNA, 2006).
As melaninas diferem em suas respostas à luz UV: enquanto a eumelanina
tem efeito fotoprotetor, porque absorve a luz UV e aprisiona os radicais livres
gerados por esta radiação, a feomelanina não só absorve pouca luz UV, como
também gera radicais por fotólise; dentre eles, superóxido, radicais hidroxil e
peróxido de hidrogênio (SLOMINSKI et al., 2004).
A razão entre eumelanina e feomelanina é controlada pelo Receptor de
Melanocortina 1 (MC1R), ao qual se liga o hormônio melanócito estimulante (MSH,
do inglês melanocyte stimulating hormone), determinando assim a pigmentação da
22
pele em seres humanos (REES, 2004). O MSH atua induzindo genes melanócito-
específicos, aumentando a produção de eumelanina e estimulando a proliferação de
melanócitos normais (SLOMINSKI et al., 2004).
23
1.4 MC1R
1.4.1 Estrutura do MC1R
O gene que codifica o MC1R está localizado na região cromossômica
16q24.3 e aparentemente não apresenta íntrons. Este gene tem se mostrado
altamente polimórfico, e algumas variantes tem sido associadas ao fenótipo do
cabelo ruivo e à uma maior susceptibilidade ao melanoma (HARDING et al., 2000).
O MC1R é uma molécula protéica de 317 resíduos de aminoácidos
(MOUNTJOY et al., 1992; CHHAJLANI et al., 1992) que faz parte da subfamília de
receptores de melanocortina (MCR, do inglês melanocortin receptor), um subgrupo
da superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR, do inglês G protein
coupled receptor).
Como sua principal função é o controle da melanogênese, o MC1R é
expresso principalmente em melanócitos, tanto normais como neoplásicos, e
também em queratinócitos, fibroblastos, células dendríticas e células endoteliais,
muito embora nestas últimas, em níveis baixos, incapazes de ativar a sinalização via
adenosina monofosfato cíclico (cAMP) (ROBERTS et al., 2006).
Assim como os demais membros da superfamília GPCR, o MC1R possui sete
hélices transmembrana, um amino-terminal extracelular e uma região carboxi-
terminal intracelular (ver figura 4). O amino-terminal extracelular do MC1R possui
dois sítios de N-glicosilação (sequons), marcados em roxo na figura 4. Embora haja
evidências de glicosilação, não se sabe se ambos os sítios são ocupados (GARCÍA-
BORRÓN et al., 2005).
Ao contrário da maioria das proteínas de membrana, o amino-terminal do
MC1R não contém um peptídeo sinal clivável que o direcione para a membrana do
retículo endoplasmático. Assim, um outro tipo de sinal de direcionamento, não
clivável, deve estar presente, provavelmente no primeiro domínio transmembrana
(GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
24
Figura 4. Estrutura do MC1R. As posições de mutações não sinônimas são mostradas
em vermelho (alelos fortemente associados a cabelos ruivos e ao melanoma: Asp84His, Arg142His,
Arg151Cys, Arg160Trp e Asp294His) e em laranja (alelos fracamente associados ou não associados
a cabelos ruivos e ao melanoma). Em verde, resíduos de cisteína que podem estar envolvidos em
pontes dissulfeto (adaptado de GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
25
Os loops extracelulares do MC1R são pequenos, em especial o segundo,
característico dos membros da subfamília MCR e responsável por sua alta atividade
constitutiva. O terceiro loop apresenta resíduos de prolina e cisteína (em verde na
figura 4) altamente conservados entre os MCRs, sugerindo uma função muito
especializada. É provável que as cisteínas 267 e 275 formem uma ponte dissulfeto
intramolecular estruturalmente importante, ligando os domínios transmembrana 6 e
7. Mutantes nestas posições apresentam menor afinidade de ligação por seus
agonistas ou mesmo perda de função, o que indica a importância destes resíduos no
reconhecimento do ligante (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
Os loops intracelulares dos GPCRs geralmente contêm interfaces de ligação
para proteínas G heterotriméricas e sítios de fosforilação envolvidos na regulação da
sinalização, internalização e ciclização. No MC1R, o segundo loop intracelular é alvo
de seis mutações que ocorrem naturalmente em populações humanas (Arg142His,
Arg151Cys, Tyr152stop, Ile155Thr, Val156Leu, Arg160Trp), das quais algumas são
mutações de perda de função total ou parcial (Arg142His, Arg151Cys e Arg160Trp)
e já associadas à presença de cabelos ruivos e à maior predisposição ao melanoma,
o que reafirma a importância funcional deste domínio (FLANAGAN et al., 2000;
STURM et al., 2003).
Os fragmentos transmembrana do MC1R estão dispostos aproximadamente
de modo perpendicular ao plano da membrana plasmática, em sentido anti-horário,
formando uma “cavidade” para o ligante, abaixo da interface extracelular da
membrana plasmática. De acordo com modelos tridimensionais do complexo
receptor-agonista, uma região altamente carregada formada pelos resíduos Glu94
(localizado no segundo fragmento transmembrana), Asp117 e Asp121 (localizados
no terceiro fragmento transmembrana) interage com o resíduo de arginina da
sequência His-Phe-Arg-Trp, que é compartilhada pelas melanocortinas naturais
(GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
Curiosamente, a segunda hélice transmembrana é alvo de 11 mutações
naturais (Phe76Tyr, Ala81Pro, Ser83Leu, Asp84Glu, Ser90Thr, Asn91Asp,
Val92Met, Leu93Arg, Thr95Met, Val97Ile e Leu99Ile; ver figura 4) (GARCÍA-
BORRÓN et al., 2005). Duas delas, Val92Met e Asp84Glu, geram alterações
funcionais relevantes. A primeira leva à uma diminuição da afinidade pelo agonista
26
cerca de 100 vezes, se comparada ao receptor selvagem (RINGHOLM et al., 2004)
e foi associada ao melanoma por Valverde e colaboradores em 1996. A segunda
leva à uma ligeira diminuição da afinidade, e à queda na produção de cAMP via
adenilato ciclase, que é o mecanismo de transdução de sinal do MC1R (RINGHOLM
et al., 2004).
No quarto fragmento transmembrana há um sítio de mutação comum em
populações do extremo oeste da Ásia, Arg163Gln, já associada ao desenvolvimento
de lentigem solar e sardas (MOTOKAWA et al., 2007).
Outras posições de mutação importantes nos segmentos transmembrana
encontram-se na primeira e na sétima hélices: Val60Leu e Asp294His,
respectivamente, ambas em vermelho na figura 4. Val60Leu é uma variante muito
comum em populações caucasianas, parcialmente penetrante para o cabelo ruivo
(FLANAGAN et al., 2000). Asp294His também é associada a cabelos ruivos e ao
melanoma, como já demonstraram Flanagan e cols. (2000) e Sturm e cols. (2003).
Segundo Ringholm e cols. (2004), esta variante apresenta habilidade de se ligar ao
α-MSH ligeiramente menor que o receptor selvagem, e reduzida capacidade de
produção de cAMP.
A região carboxi-terminal também é funcionalmente importante, estando
envolvida nos seguintes processos: interação do complexo receptor-ligante com a
proteína G, sinalização para o tráfego intracelular e correta localização do receptor
na membrana plasmática, determinação do número de moléculas do receptor
disponíveis na superfície da membrana e controle da dessensibilização do receptor.
Tais funções são mediadas pela acilação (palmitoilação e miristoilação) de resíduos
de cisteína altamente conservados entre GPCRs (SÁNCHEZ-MÁS et al., 2005).
Assim como outros GPCRs, é provável que o MC1R sofra dimerização
constitutiva, e que isso seja um evento inicial em sua biossíntese, ocorrendo no
retículo endoplasmático. Alguns mutantes naturais podem formar homodímeros e
heterodímeros com a proteína selvagem (não mutada). Embora o MC1R não exiba
cooperatividade na ligação de agonistas, a formação de heterodímeros de mutantes
com selvagem tem consequências funcionais diversas, incluindo efeito dominante
negativo e a modulação de características farmacológicas tais como a afinidade pelo
27
agonista ou a eficácia da ligação do hormônio (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
Os principais agonistas do MC1R são peptídeos derivados da clivagem da
proopiomelanocortina (POMC): as melanocortinas α-MSH, β-MSH e γ-MSH, e o
hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), os quais compartilham o tetrapeptídeo His-
Phe-Arg-Trp (HFRW), essencial para a atividade melanotrópica (GETTING, 2006).
No processo de síntese de melanina, a α-MSH ou hormônio melanócito-estimulante
é o mais importante (SLOMINSKI et al., 2004).
O antagonista endógeno do MC1R é a proteína sinalizadora Agouti (ASIP, do
inglês Agouti Signal Protein). Esta proteína contém 132 aminoácidos, dos quais
aproximadamente 60 formam uma região básica e 40 formam um carboxi-terminal
rico em cisteína, que contém o sítio ativo essencial para sua atividade biológica
(WILSON et al., 1995). A ASIP atua como um antagonista competitivo, que bloqueia
a ativação do MC1R pelo α-MSH (ROUZAUD & HEARING, 2005), estimulando
assim a síntese de feomelanina (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
Uma forma alternativa do MC1R, gerada por splicing alternativo, foi
primeiramente descrita por TAN e cols. em 1999 e depois caracterizada por
Rouzaud e cols., em 2006. Esta forma, com 350 aminoácidos, parece atuar como
um regulador negativo da melanogênese, com ações opostas às do MC1R clássico.
Dentre seus efeitos está a diminuição da expressão de tirosinase e do fator de
transcrição da microftalmia (MITF), o qual tem um papel importante na ação do
MC1R clássico, conforme veremos mais adiante (ROUZAUD et al., 2006). Cabe
esclarecer que neste estudo estaremos sempre nos referindo à forma clássica do
receptor, com 317 aminoácidos.
28
1.4.2 Mecanismo de ação e regulação do MC1R
Quando o α-MSH se liga ao MC1R, inicia-se uma cadeia de transdução de
sinal que começa com a ativação da adenilato ciclase, responsável pelo aumento
dos níveis intracelulares de cAMP. Tal aumento leva à ativação da proteína quinase
A (PKA) e à conseqüente fosforilação de fatores de transcrição responsivos ao
cAMP (CREB, do inglês cAMP responsive-element-binding protein). Os CREBs, uma
vez fosforilados, ativam a transcrição de vários genes, dentre eles o fator de
transcrição da microftalmia (MITF, do inglês microphthalmia transcription factor),
essencial para a expressão de enzimas da via da melanogênese e fatores de
diferenciação celular (ver figura abaixo) (LIN & FISHER, 2007).
Figura 5. Mecanismo de ação do MC1R. Após a ligação do agonista, a subunidade A da
proteína G trimérica dissocia-se das demais para ativar a adenilato ciclase (AC), que irá produzir o
segundo mensageiro dessa cascata de sinalização (CHIN, 2003).
29
O MITF é um elemento chave na regulação da pigmentação em mamíferos, e
essencial para o desenvolvimento e funcionabilidade de melanócitos, mastócitos,
osteoclastos e epitélio pigmentado da retina. Existem pelo menos seis isoformas de
MITF (nomeadas como MITF-A, MITF-B, MITF-C, MITF-D, MITF-H e MITF-M), as
quais são geradas por diferentes promotores e sítios alternativos de iniciação da
transcrição. A região promotora da isoforma MITF-M, específica de melanócitos,
contém sítios de ligação para CREB, SOX10 (sex determining region Y box 10),
PAX3 (paired-box 3) e LEF-1 (lymphoid enhancer-binding factor 1), os quais irão
estimular a transcrição do gene ao interagir com os fatores regulatórios
correspondentes e com a β-catenina (SLOMINSKI et al., 2004).
Um dos principais efeitos do MITF-M é a regulação positiva da tirosinase,
pelo aumento da transcrição dos genes TyrP1 e TyrP2. Esses genes contêm boxes
M (AGTCATGTGCT) e E (CATGTG) em sua sequência, ao qual o MITF-M se liga. A
acentuação da atividade da tirosinase aumenta a síntese de eumelanina. Por outro
lado, a perda de função do receptor MC1R desativa essa cascata de sinalização, o
que diminui a síntese de eumelanina e causa um aumento na síntese de
feomelanina (SLOMINSKI et al., 2004).
O próprio MC1R possui, em sua região promotora, uma sequência E-box, à
qual o MITF-M se liga, estimulando sua expressão. Outros agentes capazes de
aumentar a expressão do MC1R são a exposição à luz UV, as melanocortinas, a
endotelina 1 (END1) e as interleucinas 1α e 1β. A diminuição da expressão se dá na
presença de TNFα, TGFβ e H
2
O
2
(GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
A regulação do MC1R se dá também em nível pós-traducional, através da
dessensibilização homóloga, um mecanismo regulatório muito comum nos GPCRs.
Neste tipo de dessensibilização, há uma atenuação da sinalização após minutos de
exposição ao agonista, através da fosforilação do receptor por GRK2 e GRK6,
enzimas da família das GPCR quinases (GRK, do inglês GPCR kinase). O receptor,
fosforilado, torna-se incapaz de se acoplar à sua via de sinalização (SÁNCHEZ-MÁS
et al., 2005).
30
Na maioria dos GPCRs, a fosforilação é seguida da internalização do
complexo receptor-agonista em vesículas endocíticas. A internalização pode ainda
marcar o receptor para degradação nos lisossomos, ou ser seguida pela volta do
receptor à membrana plasmática (reciclagem). É provável que esse mecanismo
também ocorra no MC1R fosforilado, embora não se saiba o destino dos complexos
internalizados (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).
31
1.5 Melanoma
1.5.1 Histórico
A primeira descrição confiável de melanoma em humanos apareceu nos
escritos de Hipócrates (460-375 a.C.), seguida pela do médico grego Rufus de
Ephesus (60-120 a.C.). Ao longo dos séculos, muitos outros médicos relataram
lesões cutâneas pigmentadas com metástases distantes; entretanto, só no século
XIX a descrição e o tratamento do melanoma humano avançaram significativamente.
Num artigo não publicado apresentado à Faculdade de Medicina em Paris, em 1806,
Laennec discutiu “la melanose”, descrevendo sua cor como “melanótica”. A primeira
descrição da base genética do melanoma foi feita por Norris, em 1820. O termo
“melanoma” só apareceu em 1838, quando Carswell usa-o para descrever lesões
cutâneas pigmentadas malignas. Em 1858, Pemberton defendeu e executou uma
excisão de melanoma profunda e radical, que viria a se tornar, um século depois, a
técnica cirúrgica padrão no tratamento de melanoma (KUFE et al., 2003).
1.5.2 Características Clínicas
Os sinais clássicos do melanoma cutâneo são alterações na cor, diâmetro ou
superfície de uma lesão pigmentada prévia, além da presença de bordas irregulares.
Sangramento, formação de nódulos e prurido também podem ocorrer, embora em
lesões mais avançadas. Sintomas sutis, tais como uma ligeira assimetria no formato
da lesão e a presença de mais de uma nuance de cor são frequentes em
melanomas iniciais, embora possam ser imperceptíveis a olho nu. Cerca de 1% dos
melanomas não apresentam pigmentação, e por isso são denominados
“amelanóticos” (KUFE et al., 2003; RAGER et al., 2005).
1.5.3 Classificação Histopatológica
Os melanomas cutâneos podem ser classificados em cinco diferentes grupos,
segundo a AJCC (The American Joint Committee on Cancer): melanoma lentigo
maligna, melanoma de disseminação superficial, melanoma nodular, melanoma
lentiginoso acral e melanoma lentiginoso das mucosas. Estas formas de melanoma
32
representam entidades patológicas distintas, com caraterísticas clínicas e biológicas
diferentes, descritas nos itens a seguir.
a) Melanoma de disseminação superficial (MDS)
O Melanoma de Disseminação Superficial (MDS) é a forma mais comum de
melanoma cutâneo, respondendo aproximadamente por 70% de todos os
melanomas. Geralmente surge de uma lesão preexistente, não raro associada à
Síndrome do Nevo Displásico. Em sua fase inicial, apresenta-se plano e com bordas
irregulares. O festonamento das bordas é um aspecto característico, assim como a
presença de múltiplas tonalidades, variando entre tons castanhos, preto, vermelho e
branco (ver figura 6a). Áreas amelanóticas podem estar presentes, indicando
regressão. À medida que a lesão cresce, sua superfície pode tornar-se irregular
(KUFE et al., 2003).
b) Melanoma Nodular (MN)
O melanoma nodular é o segundo mais comum padrão de crescimento,
abrangendo de 10 a 15% de todos os melanomas cutâneos. Pode aparecer em
qualquer lugar da superfície corporal, mas geralmente é diagnosticado no tronco, em
indivíduos do sexo masculino. Clinicamente, é caracterizado por lesões escuras e de
cor uniforme. Histologicamente, é notável a completa ausência de anormalidades
melanóticas na epiderme adjacente. Pode apresentar-se amelanótico em alguns
casos (ver figura 6b). É biologicamente mais agressivo que o melanoma de
disseminação superficial. Não apresenta a fase radial de crescimento, sendo
associado à rápida evolução para a fase vertical de crescimento e invasão da
derme. Por isso, os melanomas nodulares tendem a ser mais espessos e,
consequentemente, mais perigosos (KUFE et al., 2003).
c) Melanoma Lentigo Maligna (MLM)
O melanoma lentigo maligna surge da lesão melanocítica de mesmo nome
(também conhecida como Sarda Melanótica de Hutchinson ou Melanose pré-
cancerosa de Dubreuilh). É encontrado mais frequentemente em regiões da pele
exposta ao sol, em indivíduos idosos (idade média de 70 anos). Clinicamente, as
lesões apresentam-se grandes (3-4 cm de diâmetro), planas, com bordas irregulares
33
e coloração variando entre tons castanhos (ver figura 6c). Áreas hipopigmentadas
podem estar presentes na lesão, indicando regressão. A lesão precursora, o lentigo
maligna, geralmente está presente há longos períodos (5 a 15 anos) antes do
desenvolvimento do melanoma invasivo (KUFE et al., 2003).
d) Melanoma Lentiginoso Acral (MLA)
O melanoma lentiginoso acral ocorre nas palmas das mãos, solas dos pés e
regiões subungueais. Representa aproximadamente de 3% a 5% de todos os
melanomas cutâneos, sendo mais frequente em indivíduos de pele escura. As
lesões geralmente apresentam-se acastanhadas, com bordas irregulares e pelo
menos 3 cm de diâmetro. Em estágios avançados, pode haver ulceração (ver figura
6d). É bastante agressivo, com rápida evolução para a fase de crescimento vertical
(KUFE et al., 2003).
e) Melanoma Lentiginoso das Mucosas (MLM)
Semelhante ao melanoma lentiginoso acral, o melanoma lentiginoso das
mucosas pode ocorrer em diversos sítios mucosos, tais como cavidade oral,
esôfago, ânus, vagina e conjuntiva (KUFE et al., 2003).
Figura 6. Aspecto macroscópico do melanoma. a: Melanoma de disseminação
superficial; b: Melanoma nodular; c: Melanoma lentigo maligna; d: Melanoma lentiginoso acral
(DUVIVIER &MCKEE, 1997).
a b c da b c d
34
1.5.4 Epidemiologia
O melanoma cutâneo representa cerca de 5% do total de tumores de pele
diagnosticados e 1% de todos os tumores malignos. Sua incidência tem aumentado
significativamente nos últimos 40 anos entre a população de pele clara de países
industrializados (BRESSAC-DE-PAILLERETS et al., 2002).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, em 2002 foram diagnosticados
cerca de 160.000 novos casos de melanoma, sendo 79.000 em homens e 81.000
em mulheres. Neste mesmo ano, foram registrados cerca de 31.000 óbitos em
decorrência deste tumor (LEBOIT, 2006).
No Brasil, o melanoma é o menos comum dos tumores de pele, com cerca de
5920 novos casos esperados para o ano de 2008 (2950 em homens e 2970 em
mulheres). Apesar da baixa incidência (3 casos / 100.000 indivíduos), apresenta alta
letalidade se não for diagnosticado em seus estágios iniciais; por isso os
mecanismos de prevenção e diagnóstico precoce são de grande importância (INCA,
2007).
Em Goiânia, o melanoma cutâneo apresenta um padrão semelhante ao
mundial, com incidência crescente para ambos os sexos e mortalidade crescente
para o sexo masculino e tendendo à estabilidade para o sexo feminino (SORTINO-
RACHOU et al., 2006).
1.5.5 Etiologia e fatores de risco
O melanoma é uma doença multifatorial, onde fatores genéticos e ambientais
estão envolvidos. Embora sua etiologia não seja completamente compreendida,
diversos estudos têm identificado fatores presentes em populações com alto risco de
desenvolver melanoma.
Dentre os fatores ambientais, destaca-se a exposição à radiação UV
proveniente da luz solar, particularmente o espectro UVB, que é um reconhecido
carcinógeno cutâneo, implicado tanto no desenvolvimento de melanomas quanto de
carcinomas basocelulares (ALISON, 2004).
35
A exposição à radiação UV é capaz de produzir lesões nas bases
nitrogenadas e quebras no esqueleto de açúcar-fosfato do DNA. As lesões mais
importantes são os dímeros de timina e os fotoprodutos de pirimidina – (6,4) –
pirimidona. Tais lesões, se não reparadas, levam à transições C → T quando o DNA
se replica. Além disso, a radiação UV pode induzir alterações na expressão gênica,
como parte da resposta ao stress (ALISON, 2004).
Diferentemente dos carcinomas escamoso e basal, o melanoma não tem
uma relação direta com a exposição cumulativa ao sol, já que os tumores podem
aparecer em áreas relativamente não expostas à luz solar, como palmas das mãos,
sola dos pés e mucosas, embora em taxas consideravelmente menores que nas
áreas expostas. Assim, a relação entre exposição solar e o risco de desenvolver
melanoma é complexa, incluindo também a exposição aguda, intensa, intermitente e
a ocorrência de queimaduras (KUFE et al., 2003).
Dentre os fatores de risco não ambientais estão o histórico familiar, a
presença de pele clara, nevos displásicos (CHAUDRU et al., 2004), cabelos ruivos
ou louros e o desenvolvimento de efélides (ou “sardas”) (HUSSEIN, 2005; RAGER
et al., 2005). Tais fatores estão associados a mutações nos genes CDKN2A (cyclin-
dependent kinase inhibitor 2A, também conhecido como p16), CDK4 (cyclin-
dependent kinase 4) e p14
ARF
(alternate reading frame), além do MC1R (HARLAND
et al., 2001; RANDERSON-MOOR et al., 2001; BASTIAENS et al., 2001; BISHOP &
BISHOP, 2005; PHO et al., 2006; NAYSMITH et al., 2004; MOTOKAWA et al.,
2007). CDKN2A, CDK4 e p14
ARF
estão envolvidos no controle do ciclo celular, e são
considerados genes de predisposição ao melanoma com alta penetrância. Mutações
neles, quando em células germinativas, estão associadas ao melanoma familial, e
são herdadas num padrão autossômico dominante, conferindo risco extremamente
alto. O MC1R, por sua vez, é considerado um gene de predisposição ao melanoma
com baixa penetrância. É altamente polimórfico na população em geral (mais de 60
variantes já foram descritas até o momento), e sua associação com o melanoma
ainda não está bem definida (PHO et al., 2006).
Segundo Palmer e cols. (2000), os alelos do MC1R Arg151Cys, Arg160Trp e
Asp294His dobram o risco de melanoma em relação ao alelo selvagem. Estes alelos
já haviam sido associados ao fenótipo de cabelos ruivos e pele clara por Box e cols.
36
em 1997 e depois por Flanagan e cols. em 2000. Em 2003, Sturm e cols.
demonstraram que dois destes alelos (Arg151Cys e Arg160Trp) continham apenas
melanossomos imaturos em seus dendritos, o que justifica o fenótipo de pele e
cabelos claros e o maior risco de câncer de pele, devido à menor fotoproteção.
Matichard e cols., em 2004, também relataram a associação de alguns alelos
(Arg151Cys, Val60Leu e Arg160Trp) com o melanoma na população francesa. Na
população espanhola, foram associadas ao melanoma as variantes Val60Leu,
Val92Met, Ile155Thr, Arg160Trp, Arg163Gln e Asp294His, num estudo que também
encontrou três novas variantes (Ser41Phe, Met128Thr e Asn281Ser) (FERNANDEZ
et al., 2007).
Na população italiana, a variante Arg151Cys é a mais fortemente associada
ao melanoma, segundo Fargnoli e cols. (2006).
Estudos em populações asiáticas descrevem variantes do MC1R com perda
de função (Phe147Δ, Thr157Ile e Pro159Thr) que não haviam sido encontradas nas
populações européias, nas quais a maioria absoluta dos estudos sobre os
polimorfismos do MC1R é conduzida (NAKAYAMA et al., 2006). Isso mostra a
variação do perfil alélico entre as populações, e que a associação de algum alelo
com o melanoma não deve ser extrapolada para outras populações, daí a
importância de estudos que incluam populações não européias para compreensão
do papel do MC1R, tanto na pigmentação quanto na predisposição ao melanoma.
As variantes do MC1R conhecidas até o momento são resultado da alteração
de apenas uma única base na seqüência de nucleotídeos do gene, também
chamado de polimorfismo de base única (SNP, do inglês single nucleotide
polymorphism). Os SNPs são o tipo mais comum de diversidade gênica, e serão
abordados a seguir.
37
1.6 Polimorfismos de base única (SNPs)
Teoricamente o SNP é definido como uma mutação em uma única base que
ocorra em pelo menos 1% da população. Na prática, um locus é um potencial SNP
se ao menos duas seqüências apresentarem o alelo minoritário (BROOKES, 1999).
De acordo com sua localização no genoma, os SNPs podem ser classificados
em: iSNPs, localizados em regiões intrônicas; cSNPs, localizados em regiões
codantes (éxons); rSNPs, localizados em regiões regulatórias e gSNPs, localizados
em regiões intergênicas. Os cSNPs podem ainda ser classificados de acordo com
sua função: sSNPs (SNPs sinônimos), quando a trinca de bases alterada continua
codificando o mesmo aminoácido, e nsSNPs (SNPs não sinônimos), quando a trinca
de bases resultante codifica outro aminoácido ou o término da cadeia. Os rSNPs,
embora não modifiquem nenhuma seqüência de aminoácidos do organismo,
também podem alterar o fenótipo, por meio de mudanças na expressão gênica
(MOONEY, 2005).
Os SNPs são muito freqüentes no genoma humano, ocorrendo ao menos um
a cada 100-1000 pares de bases. Eles respondem por mais de 90% das diferenças
entre indivíduos, e não estão distribuídos aleatoriamente no genoma. As maiores
frequências de SNPs são observadas em íntrons e regiões intergênicas, que
escapam da pressão seletiva à qual as regiões codificantes do genoma estão
sujeitas (COLLINS et al., 1998).
Os SNPs têm se tornado o marcador genético de escolha para estudos de
associação, porque ocorrem numa freqüência maior do que outros marcadores
como microssatélites, e são estáveis e bem distribuídos por todo o genoma. Os
SNPs são marcadores adequados tanto para comparar diferentes indivíduos como
para comparar sequências entre diferentes espécies (BROOKES, 1999).
Os SNPs podem ser identificados através de sequenciamento direto de DNA,
análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP, do inglês
restriction fragment lenght polymorphism), hibridização alelo-específica com sondas
marcadas radioativamente, análise de polimorfismo de conformação de fita simples
(SSCP, do inglês single strand conformation polymorphism), PCR alelo-específica
38
(AS-PCR, do inglês allele-specific PCR) e microarray-based genotyping technique
protease-mediated allele-specific extention (PrASE), dentre outras técnicas (DUFFY
et al., 2004; NAKAYAMA et al., 2006).
Para o estudo de SNPs em uma população sobre a qual não se dispõe de
dados sobre quais alelos estão presentes, ou em que frequência, o método mais
adequado é o sequenciamento direto. Apesar de ser o método mais caro, foi o
método de escolha da nossa equipe para avaliar o polimorfismo do MC1R, já que
não há estudos prévios sobre este gene na população brasileira. Este método será
brevemente descrito no tópico a seguir.
39
1.7 Seqüenciamento de DNA
Atualmente existem diversas técnicas para o seqüenciamento de DNA, que
podem ser classificadas de acordo com seu princípio básico: seqüenciamento por
hibridização (SBH, do inglês sequencing by hybridization), seqüenciamento por
nanoporos e seqüenciamento por síntese (SBS, do inglês sequencing by synthesis),
também conhecido como seqüenciamento DNA polimerase-dependente. Este último
grupo engloba três diferentes estratégias: sequenciamento de Sanger, adição de
único nucleotídeo (SNA, do inglês single nucleotide addition) e terminação cíclica
reversível (CRT, do inglês cyclic reversible termination) (METZKER, 2005).
De todas as técnicas disponíveis, o seqüenciamento de Sanger é a mais
popular, sendo também conhecido como “seqüenciamento didesoxi”. É baseada na
síntese de uma fita de DNA complementar usando 2'-desoxinucleotídeos (dNTPs) e
na terminação da síntese usando 2',3'-didesoxinucleotídeos (ddNTPs). A razão entre
dNTPs e ddNTPs determina a freqüência da terminação da cadeia, e portanto a
distribuição dos comprimentos das cadeias terminadas. Os fragmentos são então
separados por tamanho, por eletroforese em gel de alta resolução, e analisados,
revelando assim a seqüência do DNA (METZKER, 2005).
No seqüenciamento de Sanger automatizado, método empregado por nossa
equipe, os ddNTPs são marcados com corantes fluorescentes e os fragmentos
resultantes são injetados por eletrocinética nos capilares do seqüenciador de DNA,
onde ocorrerá a eletroforese. Quando esses fragmentos marcados passam pela
região de detecção do seqüenciador, os fluoróforos dos ddNTPs são excitados por
um laser, produzindo emissões de fluorescência em quatro cores diferentes, uma
para cada ddNTP. A determinação da cor emitida permite a identificação da base
nitrogenada, e a ordem dos fragmentos fluorescentes revela a seqüência do DNA
(METZKER, 2005).
40
2 JUSTIFICATIVA
Apesar dos constantes avanços na busca de alternativas terapêuticas para o
melanoma cutâneo, a letalidade ainda é muito alta quando o tumor é detectado
tardiamente, por isso é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas de
diagnóstico e prevenção.
Por ser um tipo de câncer pouco freqüente no Brasil se comparado aos
cânceres de mama (51 casos / 100.000 mulheres) e pulmão (19 casos / 100.000
homens e 10 casos / 100.000 mulheres) (INCA, 2007), por exemplo, as medidas
preventivas contra o melanoma serão mais eficazes se dirigidas diretamente aos
grupos de maior risco. Assim, faz-se necessário a condução de estudos que possam
identificar tais grupos de alto risco e a partir daí, o estabelecimento de políticas
adequadas para o diagnóstico precoce e prevenção.
Além disso, nenhum estudo sobre a variabilidade da população brasileira no
locus do MC1R foi publicado até o presente momento, o que torna os resultados
deste trabalho bastante relevantes, mesmo que não seja verificada uma associação
das variantes com o melanoma cutâneo.
41
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo do trabalho é estudar a associação entre variantes moleculares do
MC1R e a susceptibilidade ao melanoma cutâneo, através de um estudo caso-
controle, de modo a identificar os alelos que caracterizam um grupo de risco e
contribuir para o entendimento da etiologia do melanoma e da melanogênese como
um todo.
3.1 Objetivos Específicos
● Descrever a distribuição das freqüências alélicas do MC1R em uma
amostra de 71 indivíduos saudáveis, recrutados voluntariamente entre
doadores de sangue do Laboratório Hemolabor (Goiânia, Goiás);
● Descrever a distribuição das freqüências alélicas do MC1R em uma
amostra de 34 casos prevalentes de melanoma cutâneo, recrutados
voluntariamente entre os pacientes com melanoma cutâneo em
tratamento no Ambulatório de Pele e Tórax do Hospital Araújo Jorge
(Goiânia, Goiás);
● Verificar a associação das variantes de MC1R com os fototipos
cutâneos;
● Verificar a associação entre variantes do MC1R e a susceptibilidade
ao melanoma cutâneo;
● Verificar a associação entre variantes do MC1R e os subtipos
histopatológicos de melanoma.
42
4 METODOLOGIA
4.1 Participantes
Foram recrutados 34 pacientes com diagnóstico de melanoma cutâneo
confirmado por exame histopatológico, em tratamento no Ambulatório de Pele e
Tórax do Hospital Araújo Jorge (Goiânia, GO), no período de setembro de 2006 a
março de 2007, e 71 voluntários saudáveis, doadores de sangue do Laboratório
Hemolabor (Goiânia, GO), no período de agosto a outubro de 2007.
Os participantes foram incluídos no estudo mediante concordância expressa
em um “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” (ver Anexos 9.4 e 9.5). O
projeto foi previamente encaminhado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Associação de Combate ao Câncer em Goiás (CEP/ACCG) (ver Anexo 9.1) e
pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) (ver Anexo 9.2), como
parte do projeto multicêntrico “Expressão Gênica Diferencial e Caracterização
Funcional de Alvos Moleculares Visando o Desenvolvimento de Terapia Anti-
Tumoral Direcionada e Diagnose do Câncer”, coordenado pela Profª Enilza
Espreáfico (Faculdade de Medicina, USP, Ribeirão Preto, SP).
4.2 Aferição de características de pigmentação e histórico de câncer
A aferição de características de pigmentação e histórico de câncer na família
se deu por meio de entrevista presencial. Inicialmente, a proposta era um
questionário de múltipla escolha auto-aplicável; entretanto, em razão da baixa
escolaridade / analfabetismo, dificuldades na compreensão das questões e idade
avançada de alguns participantes (principalmente no grupo melanoma), o método de
coleta dos dados foi alterado. As informações assim obtidas foram simultaneamente
transcritas para o questionário impresso (Ver anexo 9.3).
43
As categorias de cor de olhos (azul, verde/cinza, castanho/preto), cor de pele
(branca, morena clara, morena, morena escura, negra) e cor de cabelos (ruivo, louro
claro, louro, castanho, preto) foram arbitrariamente definidas por nossa equipe,
visando tão somente facilitar o processo de classificação dos participantes pelos
entrevistadores.
A tradicional classificação em “raças” ou “etnias”, com os termos caucasóide,
negróide e ameríndia não foi utilizada já que, na população brasileira, altamente
miscigenada, a correlação entre cor de pele e origem geográfica dos ancestrais (à
qual os termos se referem) não é confiável e sujeita à imperfeições (PIMENTA et
al., 2006).
A classificação de “cor ou raça” adotada oficialmente pelo IBGE, (branco,
preto, pardo, amarelo e indígena) também foi desprezada por ser pouco informativa,
já que as categorias empregadas carecem de definição precisa. Além disso, os
termos cor de pele e raça não são sinônimos, sendo o conceito de “raça” inexistente
do ponto de vista biológico, e amplamente polêmico do ponto de vista antropológico
(SALZANO, 2007).
Para a aferição de fototipo, utilizou-se a classificação de Fitzpatrick, com as
seguintes categorias: I. sempre se queima e nunca se bronzeia; II. quase sempre se
queima, raramente se bronzeia; III. quase sempre se bronzeia, raramente se
queima; IV. sempre se bronzeia, nunca se queima (FITZPATRICK, 1988).
4.3 Coleta de sangue
Um volume variável de sangue (1-3 mL) foi coletado por punção da veia
mediana do antebraço (preferencialmente), sendo o mesmo armazenado à 8-10°C
em tubos à vácuo contendo EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) até o
momento da extração de DNA, que se deu nas 24 horas seguintes.
44
4.4 Extração de DNA genômico
O DNA genômico foi isolado a partir de 1 mL de sangue periférico, com o kit
GFX Genomic Blood (GE Healthcaare Life Sciences), de acordo com o protocolo do
fabricante. Primeiramente, as hemácias foram lisadas com 3 mL de tampão de lise
(KHCO
3
10 mM, NH
4
Cl 155 mM, EDTA 0,1 mM) e o pellet de leucócitos resultante foi
lavado seguidas vezes com o mesmo tampão, a fim de retirar resíduos de
hemoglobina. Então, os leucócitos foram lisados com a Solução de Extração
(fornecida pelo kit), que é composta de um agente tamponante, um agente
caotrópico e um detergente. O lisado foi transferido para uma coluna contendo uma
matriz de fibra de vidro, à qual o DNA genômico se liga. O DNA permanece ligado à
matriz enquanto os contaminantes foram removidos por lavagens com Tampão TE
(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0) e etanol. O DNA purificado foi então eluido em
100uL de tampão TE a 70°C.
4.5 Quantificação
Uma alíquota de 2uL de cada amostra de DNA genômico obtido na etapa
anterior foi empregada para quantificação por fluorimetria. Foi usado o kit Quant-IT
TM
dsDNA BR (Invitrogen). Após o preparo das amostras e das soluções-padrão
conforme as instruções do fabricante, as amostras foram gentilmente
homogeneizadas por inversão e depois agitadas no vórtex por 2 segundos.
Procedeu-se então à um spin de centrifugação à 2000 rpm, e à incubação por 3 min
em temperatura ambiente. A leitura das amostras foi feita no fluorímetro Qubit
TM
(Invitrogen), previamente calibrado com os padrões.
4.6 Reação em cadeia da polimerase
Para a amplificação de toda a região codificante do gene MC1R, utilizou-se a
técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain
reaction). As reações foram, após otimização, padronizadas nas seguintes
condições: 100-300 ng de DNA genômico; 1,3 unidades de enzima Taq Polymerase
45
(Biotools do Brasil); 1X Reaction buffer; 3 mM MgCl
2
; 0,4 mM de dNTPs; 0,43 mM de
oligonucleotídeo iniciador (primer) e água Milli-Q autoclavada (q.s.p 50uL). Para
cada grupo de reações preparadas no mesmo dia foi feito um controle negativo, nas
mesmas condições acima, sem DNA genômico, para assegurar que os reagentes
estavam livres de contaminação. Os primers utilizados foram os seguintes:
● MC1R - FW: 5’- ACT CCT TCC TGC TTC CTG GAC A -3’ (sense)
● MC1R - RV: 5’- ACA CTT AAA GCG CGT GCA CCG C -3’ (antisense)
As reações foram realizadas em termociclador TC-312 (Techne), seguindo o
programa abaixo:
● desnaturação inicial – 2 min à 95°C
● desnaturação – 1 min à 95°C
● anelamento – 2 min à 68°C 35 ciclos
● extensão – 3 min à 72°C
● extensão final – 10 min à 72°C
4.7 Eletroforese em agarose
O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose, para fins
de verificação da reação e do controle negativo.
O gel de agarose a 1% foi preparado através da dissolução de 0,4 g de
agarose UltraPure
TM
(Invitrogen) em 40mL de tampão TBE 5X (Tris, Borato EDTA,
pH 8,4), acrescido de 4uL de brometo de etídio (EtBr) UltraPure
TM
(Invitrogen). À
uma alíquota de 3uL de cada reação, incluindo o controle negativo, foi acrescido 5uL
de tampão de amostra (Azul de Bromofenol e Glicerol). Após serem agitadas no
vórtex e centrifugadas, as amostras foram aplicadas no gel. Foi usado o marcador
de massa molecular Track-IT 100bp DNA Ladder (Invitrogen). A eletroforese foi
conduzida por 1h e 30 min, à 80V e 300 mA. Todos os géis foram visualizados em
transluminador com luz Ultravioleta (UV) e documentados por fotografia digital.
46
4.8 Purificação
As amostras eficientemente amplificadas foram purificadas com o kit
PureLink™ PCR Purification kit (Invitrogen) segundo as especificações do
fabricante, para a remoção de primers, enzimas e sais. A purificação é baseada na
ligação seletiva do DNA de fita dupla à uma membrana de sílica, na presença de
sais caotrópicos. Os contaminantes são removidos por lavagens etanólicas e
centrifugações. O fragmento de interesse foi eluído em 35 μL de água Milli-Q a 70°C
(pH 8,0).
4.9 Quantificação
Após a purificação, as amostras foram novamente quantificadas por
fluorimetria, seguindo os mesmos procedimentos da quantificação anterior, exceto
pelo kit usado, Quant-IT
TM
dsDNA HS (Invitrogen), específico para amostras de DNA
menos concentradas.
4.10 Seqüenciamento de DNA
As amostras com rendimento adequado (~20ng/μL) foram seqüenciada em
três laboratórios distintos: Plataforma de Seqüenciamento do Cenargen (EMBRAPA
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF), Laboratório de Biologia Molecular
(Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO), e
Serviço de Seqüenciamento de DNA (SSDNA) (Instituto de Química, Universidade
de São Paulo, São Paulo, SP).
A região codificante do MC1R foi seqüenciada com os seguintes primers:
● SF1: 5' – AGC AAC GTC CTG GAG AC – 3' (sense)
● SR1: 5' – TGT GGT AGC GCA GTG CGT AGA A – 3' (antisense)
● SR2: 5' – CAG CAT GTG GAC GTA CAG – 3' (antisense)
Todas as amostras foram seqüenciadas com os três primers, para garantir
47
que as variações encontradas representassem de fato mutações no gene e não
artefatos da própria reação.
Para o seqüenciamento no SSDNA, as reações foram preparadas e
precipitadas em nosso laboratório, conforme procedimento descrito a seguir. Para o
seqüenciamento nos demais laboratórios, as amostras de DNA e primers foram
entregues nas concentrações solicitadas, e as reações foram feitas de acordo com o
protocolo local.
4.10.1 Preparo das reações de seqüenciamento
As reações de seqüenciamento foram preparadas utilizando-se o kit
comercial Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Cada reação continha 2uL
do reagente Big Dye, 3uL de Sequencing Buffer 5x, 3uL de primer a 3,2 pmoles/uL,
aproximadamente 100ng de DNA (usualmente, entre 2 e 7uL, dependendo do
rendimento obtido na PCR da etapa anterior) e água “milli-Q” (q.s.p 15uL). As
amostras foram submetidas à desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos, seguido de
30 ciclos com denaturação a 95°C por 45s, anelamento a 50°C por 30s e extensão a
60°C por 4 minutos.
4.10.2 Precipitação
Para a precipitação das reações de seqüenciamento, adicionou-se 25 uL de
“coquetel de precipitação” (25 volumes de etanol 100% gelado; 1 volume de NaOAc
3M pH5,2; 1 volume de glicogênio 1mg/mL) em cada tubo. Após rápida
homogeneização no vórtex, os tubos foram mantidos no gelo e ao abrigo da luz por
15 minutos. Procedeu-se então à centrifugação à 4000 rpm, por 30 minutos à
temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante de cada tubo com uma
inversão vigorosa, os mesmos foram invertidos e submetidos à 2 pulsos de
centrifugação à 1000 rpm. Adicionou-se então 50uL de etanol 70% gelado e
centrifugou-se novamente à 4000 rpm, por 20 minutos. Repetiu-se a drenagem dos
tubos (descarte do sobrenadante e centrifugação com o tubo invertido), e procedeu-
se à secagem das amostras, deixando os tubos abertos, por 1 minuto à 95°C, no
termociclador. Os tubos foram então fechados e guardados à -20°C, envoltos em
papel alumínio, até o momento de serem enviados ao SSDNA.
48
4.11 Detecção de polimorfismos de base única
As seqüências obtidas por este método foram visualizadas no software
Chromas e comparadas com a seqüência consenso do MC1R selvagem depositada
no GenBank (número de acesso: AF153431), possibilitando assim a identificação
das variantes presentes.
Todas as seqüências foram submetidas à análise em duas plataformas
diferentes: SNPpipeline e CLC DNA Workbench.
O SNPpipeline é uma web-plataforma gratuita, mantida pelo Laboratório de
Genética de Populações do Center for Cancer Research (NCI, NIH, USA). É
composta por 3 softwares integrados: PHRED, PHRAP e DEMIGLACE, os quais
fazem o reconhecimento das bases seqüenciadas (base calling) a partir dos
eletroferogramas e estabelecem valores de qualidade para cada base (PHRED),
alinham as seqüências (PHRAP), e identificam os possíveis sítios de SNP
(DEMIGLACE). À cada possível SNP é associado um score numérico, que reflete a
probabilidade de uma posição da seqüência, em um dado alinhamento, apresentar
heterogeneidade em sua composição de nucleotídeos. Regiões cujas diferenças na
seqüência de nucleotídeos sejam devido à baixa qualidade das bases são
automaticamente excluídas, restando apenas os SNPs “legítimos” (BUETOW et al.,
1999).
A CLC DNA Workbench realiza apenas o alinhamento das seqüências,
necessitando que a procura e detecção dos possíveis SNPs seja feita manualmente.
Esta plataforma foi usada para conferência das mutações encontradas com o
SNPpipeline.
49
4.12 Análise estatística
A tabulação dos dados das características de pigmentação e o cálculo de
desvio padrão (DP) foram feitos em planilhas do software OpenOffice Calc
(http://www.openoffice.org).
A determinação de Odds Ratio (OR) e dos intervalos de confiança (IC) foi
feita no software GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA). Para a comparação
das freqüências nos grupos caso e controle foi utilizado o Teste Exato de Fisher
bicaudal. As diferenças foram consideradas significativas para p menor ou igual a
0,05.
50
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle
O grupo melanoma foi composto de 34 indivíduos com diagnóstico de
melanoma cutâneo, e o grupo controle foi composto de 71 indivíduos saudáveis,
sem histórico de neoplasias malignas na família, conforme descrito anteriormente.
O grupo melanoma apresentou idade variando de 25 a 92 anos, com média
de 63,26 anos (DP=16,16), e o grupo controle apresentou idade variando de 18 a 57
anos, com média de 33,06 anos (DP=11,93). Pinheiro e colaboradores (2003)
descrevem resultados semelhantes num estudo com pacientes do Hospital
Universitário de Brasília, com 44% dos pacientes com melanoma estando na faixa
etária entre 61 e 80 anos, e outros 34% entre 41 e 60 anos. Um estudo
epidemiológico mais recente (SORTINO-RACHOU et al., 2006), em Goiânia,
apresenta idade mediana de diagnóstico de 54 anos.
A diferença de idade entre os grupos melanoma e controle se deve ao fato de
o melanoma ser uma doença complexa, que expressa um desequilíbrio associado
ao envelhecimento e à presença de mutações genéticas, em parte causadas pela
exposição à radiação UV ao longo da vida, afetando principalmente indivíduos
idosos. O grupo controle, como esperado, apresenta um perfil mais jovem, já que a
doação de sangue não é permitida a indivíduos com mais de 60 anos. Como as
alterações estudadas são mutações herdadas dos pais, presentes em todas as
células do indivíduo (somáticas e germinativas), em qualquer época da vida, a
diferença de idade entre os grupos não invalida as análises descritas mais adiante.
Quanto ao gênero, o grupo melanoma continha 19 (56%) indivíduos do sexo
masculino e 15 (44%) do sexo feminino, corroborando os dados de Sortino-Rachou
e colaboradores (2006) (razão masculino / feminino igual a 1,02) e diferindo
51
acentuadamente da população descrita por Pinheiro e colaboradores (2003), que é
majoritariamente do sexo feminino (78%).
O grupo controle continha 48 indivíduos do sexo masculino (68%) e 15 (21%)
do sexo feminino. Ainda no grupo controle, esta informação não estava disponível
para 8 (11%) indivíduos. A grande proporção do sexo masculino no controle reflete o
perfil dos doadores de sangue em Goiânia, em sua maioria homens jovens. Tal
diferença também não é relevante para as análises feitas neste estudo, uma vez que
as características estudadas não estão ligadas ao sexo, e o gene de interesse não
se localiza nos cromossomos sexuais.
Os dados de idade e gênero estão resumidos na tabela a seguir.
Tabela 1. Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle
Característica
Melanoma
(n=34), n (%)
Controle
(n=71), n (%)
Sexo masculino 19 (55,88) 48 (67,60)
feminino 15 (44,12) 15 (21,13)
não disponível - 8 (11,27)
Idade média 63,26 33,06
mediana 64 32
DP 16,16 11,93
52
5.2 Características de pigmentação e hábito de fotoproteção
O grupo controle apresentou-se composto em sua maior parte por indivíduos
de pele clara, com 36% se afirmando “brancos” e 20% se afirmando “morenos
claros”, conforme a figura abaixo. Em 10% dos casos esta informação não estava
disponível. É razoável supor que a proporção de indivíduos brancos esteja
superestimada, devido ao viés implícito na auto-declaração.
Figura 7. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma, por cor de pele,
segundo sua auto-declaração.
No grupo melanoma, também observa-se uma maior proporção de indivíduos
de pele clara (32% “brancos” e 36% “morenos claros”; ver figura 7). Nenhum
indivíduo reportou-se como negro. Pinheiro e colaboradores (2003) também
apresentam dados semelhantes, com 87,5% dos pacientes sendo brancos, embora
o sistema de classificação de cor de pele empregado seja diferente, com apenas
três categorias (branco, pardo e negro).
Controle
36%
20%
21%
7%
6%
10%
Branco
Moreno claro
Moreno
Moreno escuro
Negro
não disponível
Melanoma
32%
36%
26%
6%
0%
0%
Branco
Moreno claro
Moreno
Moreno escuro
Negro
Não disponível
Cor de Pele
Controle
36%
20%
21%
7%
6%
10%
Branco
Moreno claro
Moreno
Moreno escuro
Negro
não disponível
Melanoma
32%
36%
26%
6%
0%
0%
Branco
Moreno claro
Moreno
Moreno escuro
Negro
Não disponível
Cor de Pele
53
A maior porcentagem de indivíduos “morenos” no grupo melanoma (26%) do
que no grupo controle (21%) também fala a favor de um viés na auto-declaração,
especialmente no grupo controle, embora tal diferença não seja estatisticamente
relevante (ver tabela 2).
No quesito cor dos olhos, os grupos controle e melanoma apresentaram-se
muito semelhantes, com absoluta maioria de indivíduos de olhos castanhos ou
pretos, conforme a figura abaixo. Nota-se, no grupo controle, a ausência de
indivíduos de olhos azuis.
Figura 8. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por cor dos olhos.
No quesito cor dos cabelos, ambos os grupos também se mostraram
semelhantes, sendo compostos majoritariamente por indivíduos de cabelos
castanhos ou pretos, conforme evidenciado na figura 9. Em nenhum dos grupos
havia indivíduos de cabelo ruivo, nos quais é muito comum a presença de variantes
alélicas do MC1R, segundo Flanagan e colaboradores (2000), tais como Arg142His,
Arg151Cys, Arg160Trp e Asp294H.
Controle
0%
11%
79%
10%
Azul
Verde / cinza
Castanho / preto
não disponível
Melanoma
3%
9%
88%
0%
Azul
Verde / cinza
Castanho / preto
Não disponível
Cor dos Olhos
Controle
0%
11%
79%
10%
Azul
Verde / cinza
Castanho / preto
não disponível
Melanoma
3%
9%
88%
0%
Azul
Verde / cinza
Castanho / preto
Não disponível
Cor dos Olhos
54
Figura 9. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por cor dos
cabelos.
Quanto ao fototipo, o grupo controle continha apenas 3% de indivíduos com
fototipo I e 34% com fototipo II (ver figura 10). Sendo os fototipos I e II
característicos de indivíduos de pele clara (“brancos” e “morenos claros” que somam
56% no grupo controle), pode-se observar mais uma vez o viés contido na
classificação de cor de pele baseada na auto-declaração.
Figura 10. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por fotótipo.
Fototipo
Controle
3%
34%
25%
27%
11%
I
II
III
IV
não disponível
Melanoma
32%
26%
36%
6%
0%
I
II
III
IV
Não disponível
Fototipo
Controle
3%
34%
25%
27%
11%
I
II
III
IV
não disponível
Melanoma
32%
26%
36%
6%
0%
I
II
III
IV
Não disponível
Cor dos Cabelos
Controle
0%
8%
55%
27%
10%
Ruivo
Louro
Castanho
Preto
não disponível
Melanoma
0%
9%
50%
41%
0%
Ruivo
Louro
Castanho
Preto
Não disponível
55
Tal viés na classificação de cor de pele, caso tenha ocorrido também no
grupo melanoma, é certamente menos pronunciado, já que não há uma discrepância
tão grande entre a proporção de indivíduos com fototipos I e II (58%, ver figura 10) e
a proporção de indivíduos de pele clara (68%, somando-se “brancos” e “morenos
claros”).
Não foi encontrada associação entre as características de pigmentação (cor
de pele, olhos, cabelos e fototipo) e o risco de melanoma (ver Tabela 2), muito
embora se observe uma tendência entre indivíduos com fototipos I / II para o
desenvolvimento do melanoma (OR = 2,033). Consideramos que, para esta
característica, a falta de significância estatística se deve ao pequeno número
amostral, enquanto que para as demais (cor de pele, olhos e cabelos), a falta de
associação com o melanoma parece ser consistente.
Tabela 2. Associação entre características de pigmentação e o melanoma cutâneo.
Característica
Melanoma
n=34, n (%)
Controle
a
n (%)
OR
(IC 95%)
b
P-valor
Cor dos
olhos
castanho / preto
30 (88,24) 56 (87,5) 1
c
azul / verde / cinza
4 (11,76) 8 (12,5)
0,9333
(0,2595 – 3,356)
-
1,0000
Cor dos
cabelos
castanho / preto
31 (91,18) 58 (90,63) 1
c
ruivo / louro
3 (8,82) 6 (9,37)
0,9355
(0,2187 - 4,001)
-
1,0000
Cor de pele
morena / morena escura /
negra
11 (32,35) 24 (37,5) 1
c
branca / morena clara
23 (67,65) 40 (62,5)
1,255
(0,5209 - 3,022)
-
0,6631
Fototipo
III / IV
14 (41,18) 37 (58,73) 1
c
I / II
20 (58,82) 26 (41,27)
2,033
(0,8710 - 4,745)
-
0,1358
a
Os totais do controle foram variáveis: n= 64 para cor dos olhos, cabelos e pele; n= 63 para fototipo.
b
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
c
Categoria de Referência
56
Quanto ao hábito de fotoproteção, 34% dos indivíduos do grupo controle
declararam nunca usar fotoprotetor, e 44% disseram fazê-lo raramente (ver figura
11). Um estudo recente com jovens do Sul do Brasil revela um quadro semelhante,
com metade dos entrevistados relatando não usarem fotoprotetor regularmente e
30% usarem sempre que expostos ao sol (HAACK et al., 2008).
Ainda no grupo controle, apenas 3% afirmaram sempre usar fotoprotetor.
Szklo e colaboradores (2007), num estudo com populações de 15 capitais
brasileiras, reporta uma prevalência de uso de fotoprotetor variando de 10 a 20%,
sem entretanto especificar a frequência do uso.
Embora não haja um consenso sobre a eficácia do uso de cremes
fotoprotetores na prevenção do melanoma (DENNIS et al., 2003), é preocupante o
fato de apenas 3% dos indivíduos terem este hábito, pois indica a falta de
conhecimento da população sobre os malefícios da radiação solar.
Sendo o Brasil um país com grande faixa litorânea e com grande incidência
de raios UV, onde há a cultura de se considerar “saudável” uma pele com aspecto
bronzeado, o esclarecimento dos indivíduos sobre os riscos da exposição ao sol é
sem dúvida uma ferramenta importante no combate ao câncer de pele.
Figura 11. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma segundo seu
hábito de fotoproteção.
Controle
3%
8%
44%
34%
11%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
não disponível
Melanoma
12%
3%
3%
38%
44%
0%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
Após o
diagnóstico
Não disponível
Uso de Fotoprotetor
Controle
3%
8%
44%
34%
11%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
não disponível
Melanoma
12%
3%
3%
38%
44%
0%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
Após o
diagnóstico
Não disponível
Controle
3%
8%
44%
34%
11%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
não disponível
Melanoma
12%
3%
3%
38%
44%
0%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
Após o
diagnóstico
Não disponível
Uso de Fotoprotetor
Controle
3%
8%
44%
34%
11%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
não disponível
Melanoma
12%
3%
3%
38%
44%
0%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
Após o
diagnóstico
Não disponível
Uso de Fotoprotetor
Controle
3%
8%
44%
34%
11%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
não disponível
Melanoma
12%
3%
3%
38%
44%
0%
Sempre
Ocasionalmente
Raramente
Nunca
Após o
diagnóstico
Não disponível
57
Embora a maioria dos indivíduos do grupo melanoma faça uso regular de
creme fotoprotetor para a pele (56%, ver figura 11), apenas 12% declararam fazê-lo
sempre, mesmo antes do diagnóstico do tumor. Cerca de 44% afirmaram o uso
regular após o diagnóstico de melanoma, por recomendação médica. Apesar deste
hábito não alterar a progressão de um tumor já existente, é uma medida positiva do
ponto de vista educativo, com o objetivo de prevenção do câncer de pele na
população em geral.
É alarmante o fato de 38% dos pacientes terem declarado nunca usar
fotoprotetor, mesmo com orientação médica regular para tal. Lee e colaboradores
(2007) alertam para a necessidade de maior ênfase nas recomendações médicas
para pacientes em seguimento de melanoma, diante da persistência da exposição
ao sol sem proteção e de episódios de queimaduras após o diagnóstico.
58
5.3 Características clínicas do grupo melanoma
5.3.1 Subtipos histopatológicos do grupo melanoma
Os subtipos histopatológicos mais frequentes foram o Melanoma Lentiginoso
Acral (MLA) e o Melanoma Extensivo Superficial (MES), com 8 casos cada, sendo
que um dos indivíduos com MES apresentava também o subtipo Melanoma Lentigo
Maligna (MLM). Em 12% dos casos, só havia informação sobre o foco de
metástase, sendo o tumor primário desconhecido ou ausente, o que impossibilita a
determinação do subtipo histopatológico. Em 18% dos casos o tumor primário não
foi classificado.
Figura 12. Distribuição dos casos de melanoma por subtipo histopatológico.
Subtipo Histopatológico de Melanoma
20%
21%
23%
3%
3%
12%
18%
Extensivo Superficial
Nodular
Lentiginoso Acral
Lentigo Maligna
Extensivo superficial +
Lentigo Maligna
Metastático com tumor
primário ignorado
Não disponível
59
5.3.2 Localização do tumor primário
Nos 30 casos para os quais foi possível identificar um tumor primário, a
localização mais freqüente para este tumor foi a extremidade dos membros
inferiores (57%), seguida do tronco (17%), conforme a tabela a seguir.
Tabela 3. Distribuição dos casos de melanoma cutâneo com tumor primário por sítio.
Sítio n %
face 3 10,00
tronco 5 16,67
extremidade dos membros superiores 1 3,33
membros inferiores 2 6,67
extremidade dos membros inferiores 17 56,67
não disponível 2 6,67
total 30 100
60
5.4 Análise Molecular
5.4.1 Amplificação do gene MC1R por PCR
O fragmento de interesse, contendo cerca de 1000 pares de bases, foi
amplificado eficientemente nas condições já descritas, conforme evidenciado na
figura 13.
Figura 13. Eletroforese dos produtos da amplificação por PCR em gel de agarose 1%. 1:
Controle negativo. 4: Marcador de Massa Molecular. 2, 3, 5, 6 e 7: amostras de DNA dos pacientes
M1, M2, M3, M4 e M5.
Nota-se a ausência de bandas inespecíficas, assim como de contaminantes
no controle negativo. Todas as amostras amplificadas (n=105) foram submetidas à
eletroforese em gel de agarose, e apresentaram padrão de bandas semelhante ao
mostrado na figura acima (dados não mostrados).
61
5.4.2 Seqüenciamento e detecção de SNPs
Após purificação, o fragmento de interesse foi seqüenciado nas condições
mencionadas anteriormente. A figura abaixo ilustra a alta qualidade das seqüências
obtidas, essencial para a identificação de polimorfismos de base única.
Figura 14. Trecho de um dos cromatogramas obtidos. Os picos bem definidos e a
ausência de background são indicativos de boa qualidade. Imagem gerada no software ChromasPro.
62
Figura 15. Comparação das seqüências obtidas com a seqüência de referência
AF153431 na plataforma SNPpipeline. As setas horizontais representam as seqüências obtidas, e
sua orientação em relação à seqüência de referência. Os pontilhados vermelhos indicam a
localização das mutações encontradas em relação ao contig.
Após serem depositadas no banco de dados da plataforma SNPpipeline, as
seqüências foram montadas e analisadas automaticamente para a presença de
SNPs (ver figura 15). Como cada amostra foi seqüenciada com 3 primers diferentes,
poderia ter sido montado um contig para cada indivíduo, já que as 3 seqüências
resultantes se sobrepõem em alguns momentos. Entretanto, para facilitar o processo
de conferência manual dos SNPs encontrados, preferimos não fazê-lo, analisando
cada seqüência individualmente.
63
Figura 16. Detalhe de uma seqüência analisada pelo SNPpipeline, evidenciando
mutação na posição 160. Por se tratar de um heterozigoto, há dois picos distintos sobrepostos.
Após visualizar as alterações na seqüência de nucleotídeos (ver figura 16),
foi verificado se elas resultariam ou não em troca de aminoácido na cadeia
polipeptídica do MC1R. A figura a seguir ilustra essa análise, que foi repetida para
cada uma das mutações encontradas.
64
Figura 17. Página de entrada dos dados e página de resultados do BLAST específico
para verificar troca de aminoácidos decorrente de SNPs, o qual é acessado a partir da plataforma
SNPpipeline.
65
5.4.3 Distribuição das variantes do MC1R e sua associação com
características de pigmentação e risco de melanoma cutâneo
Diversos estudos caso-controle em populações predominantemente
caucasianas têm revelado associações de variantes alélicas do MC1R com o risco
de melanoma cutâneo. No Brasil, este é o primeiro estudo do gênero.
Dos 105 indivíduos estudados, 44 (41,90%) carregavam pelo menos uma
variante do MC1R, incluindo 16 (47,06%) de 34 casos e 28 (39,44%) de 71
controles. As 11 variantes encontradas estão listadas na Tabela 4. Dentre estas, 4
são mutações sinônimas e 7 são mutações não sinônimas (resultam em troca de
aminoácido), das quais 6 já haviam sido descritas previamente e uma foi identificada
pela primeira vez (Asp184His). Não foram encontradas inserções ou deleções.
Tabela 4. Variantes do MC1R encontradas e sua associação individual com o
melanoma.
mutação
Códon
alterado
Melanoma
n=34, n (%)
Controle
n=71, n (%)
OR (IC 95%)
a
P-valor
Asp42Asp
GAC → GAT
1 (2,94) -
6,403
(0,2539 - 161,5)
0,3238
Val60Leu
GTG → TTG
2 (5,88) 11 (15,49)
0,3409
(0,07114 - 1,634)
0,2146
Val92Met
GTG → ATG
4 (11,76) 4 (5,634)
4,600
(0,7985 - 26,50)
0,0847
Arg151Cys
CGC → TGC
3 (8,82) 1 (1,408)
6,774
(0,6772 - 67,76)
0,0986
Arg160Trp
CGG → TGG
- 1 (1,408) - -
Arg163Gln
CGA → CAA
6 (17,65) 6 (8,451)
2,321
(0,6884 - 7,828)
0,1965
Thr177Thr
ACG → ACA
- 1 (1,408) - -
Asp184His
GAC → CAC
1 (2,94) -
6,403
(0,2539 - 161,5)
0,3238
Gln233Gln
CAG → CAA
- 2 (2,817) - -
Asp294His
GAC → CAC
1 (2,94) 1 (1,408)
2,121
(0,1286 - 35,00)
0,5449
Phe300Phe
TTC → TTT
- 2 (2,817) - -
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
66
A nova variante encontrada (Asp184His) localiza-se no segundo loop
extracelular, segundo os modelos tridimensionais aceitos atualmente para o MC1R.
Por se tratar da substituição de um aminoácido de caráter ácido para um de caráter
básico, com aumento de volume, é possível que haja alguma conseqüência
funcional relevante, decorrente de alterações na estrutura tridimensional ou ainda na
afinidade de ligação com o agonista. Assim, tornam-se necessários estudos
funcionais desta nova variante para determinar sua importância na suscetibilidade
ao melanoma.
Em nosso estudo, a taxa de polimorfismo encontrada no grupo controle
(39,44% dos indivíduos) é semelhante às relatadas por De-Misa e colaboradores
(2008) para a população das Ilhas Canárias (43,1%), por Stratigos e colaboradores
(2006) para a população grega (37,5%) e por Matichard e colaboradores (2004) para
a população francesa (31%); e menor do que as encontradas nas populações
italiana (58% segundo Landi et al., 2005 e 72% segundo Fargnoli et al., 2005),
australiana (55,4%, segundo Palmer et al., 2000) e na população americana branca
de origem não-hispânica (75,4%, segundo Kanetsky et al., 2004).
No grupo de pacientes com melanoma, encontramos uma taxa de
polimorfismos menor (47,06%) do que nas populações grega (59.4%, segundo
Stratigos et al., 2005), italiana (78%, segundo Fargnoli et al., 2005) e francesa (68%,
segundo Matichard et al., 2004). Na população alemã, um estudo com portadores de
diversos tipos de câncer de pele (melanoma e carcinomas) e controles encontrou
polimorfismos em 72,9% dos indivíduos, sem entretanto especificar as porcentagens
de cada grupo (BASTIAENS et al., 2001).
Não foram detectadas associações estatisticamente significantes entre a
presença de qualquer das variantes e o melanoma, muito embora se observe uma
tendência de associação com as variantes Asp42Asp (OR=6,4), Val92Met (OR=4,6),
Arg151Cys (OR=6,8), Arg163Gln (OR=2,3), Asp184His (OR=6,4) e Asp294His
(OR=2,1). A tendência de associação que parece ser mais relevante é com a
variante Arg151Cys, que além de apresentar o maior valor de odds ratio, possui um
baixo p-valor (0,0986), ainda que não significante. Esta variante já foi associada ao
melanoma nas populações italiana (FARGNOLI et al., 2006), grega (STRATIGOS et
al., 2006) e australiana (PALMER et al., 2000).
67
No grupo melanoma, dois indivíduos apresentaram mais de uma mutação,
sendo um deles duplo heterozigoto (Arg151Cys / Val92Met) e um duplo homozigoto
(Arg163Gln / Asp42Asp). No grupo controle, dois indivíduos também apresentaram
mais de uma mutação, sendo os dois duplo heterozigotos (Arg163Gln / Val60Leu;
Arg163Gln / Val92Met). Ainda no grupo controle, 3 indivíduos apresentaram-se
homozigotos para as variantes Arg163Gln, Val60Leu e Phe300Phe. As demais
variantes em ambos os grupos apresentaram-se sozinhas e em heterozigose.
Para os homozigotos simples e o duplo homozigoto, podemos afirmar com
certeza que ambos os alelos estão mutados, enquanto que para os duplo
heterozigotos, há duas possibilidades alélicas: se ambas as mutações estiverem no
mesmo cromossomo, há a presença de um alelo selvagem; se cada mutação estiver
em um cromossomo distinto, então os dois alelos estão mutados. Não foi possível
determinar qual das duas situações estava presente em cada caso de duplo
heterozigoto, exceto para o caso Arg163Gln / Val92Met, do grupo controle, no qual
cada mutação encontrava-se em um cromossomo. Neste caso específico, a
genotipagem da prole do indivíduo nos permitiu chegar a esta conclusão, pois as
mutações segregaram de forma independente.
Para os demais duplo heterozigotos, admitimos o mesmo (as mutações
segregaram independentemente), a fim de calcular as freqüências alélicas, que se
encontram na tabela abaixo. Esta decisão, embora arbitrária, baseia-se no fato de
que as mutações Val60Leu, Val92Met, Arg151Cys e Arg163Gln foram encontradas
isoladamente na população, portanto, pode-se afirmar que tais alelos existem de
fato, enquanto que os haplotipos Arg151Cys / Val92Met; Arg163Gln / Val60Leu e
Arg163Gln / Val92Met, embora teoricamente possíveis, carecem de evidências
experimentais.
68
Tabela 5. Freqüências alélicas no locus MC1R e sua associação com o melanoma
cutâneo.
Alelo
Melanoma
n=68, n (%)
Controle
n=142, n (%)
OR (IC 95%)
a
P-valor
Selvagem 50 (73,53) 109 (76,76) - -
Asp42Asp 0 0 - -
Val60Leu 2 (2,941) 12 (8,451) 0,3283 (0,07134 - 1,511) 0,2349
Val92Met 4 (5,882) 4 (2,817) 2,156 (0,5224 - 8,899) 0,2768
Arg151Cys 3 (4,412) 1 (0,7042) 6,508 (0,6638 - 63,80) 0,1007
Arg160Trp 0 1 (0,7042) - -
Arg163Gln 5 (7,353) 8 (5,634) 1,329 (0,4180 - 4,228) 0,7605
Arg163Gln
Asp42Asp
2 (2,941) 0 10,71 (0,5069 - 226,5) 0,1038
Thr177Thr 0 1 (0,7042) - -
Asp184His 1 (1,471) 0 6,429 (0,2582 - 160,0) 0,3206
Gln233Gln 0 2 (1,408) - -
Asp294His 1 (1,471) 1 (0,7042) 2,104 (0,1296 - 34,18) 0,5438
Phe300Phe 0 3 (2,311) - -
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
Considerando-se as freqüências alélicas de cada variante, também não
foram encontradas associações estatisticamente significantes com o melanoma
cutâneo, apesar do alto valor de odds ratio para o alelo Arg163Gln / Asp42Asp
(OR=10,71 e p=0,10).
No caso da variante sinônima Asp42Asp, onde não há mudança de
aminoácido na sequência polipeptídica do MC1R, o pronunciado valor de odds ratio
deve-se à sua ligação com a variante Arg163Gln, formando um haplotipo que foi
encontrado apenas no grupo melanoma.
A variante Arg163Gln, a mais freqüente no grupo melanoma (presente em
17,65% dos indivíduos, com freqüência alélica de 7,35%) e a segunda mais
freqüente no controle (presente em 8,45% dos indivíduos, com freqüência alélica de
5,63%) em nosso estudo, é uma variante característica da população japonesa,
onde é encontrada em freqüências superiores a 70%, e associada ao
69
desenvolvimento de sardas e lentigo solar (MOTOKAWA et al., 2007). Esta variante
também é associada ao melanoma na população espanhola (FERNANDEZ et al.,
2007).
A variante Val60Leu, a mais freqüente no grupo controle (presente em
15,49% dos indivíduos, com frequência alélica de 8,45%) é também a mais
frequente na população grega (encontrada em 20% dos indivíduos controles,
segundo Stratigos e colaboradores, 2006) e na população das Ilhas Canárias
(encontrada em 16,4% dos indivíduos, com frequência alélica de 9,1%, segundo De-
Misa e colaboradores, 2008). Esta variante foi associada ao melanoma nas
populações francesa (MATICHARD et al., 2004), espanhola (FERNANDEZ et al.,
2007) e grega (STRATIGOS et al., 2006), mas não em nossa população, onde esta
variante sequer apresentou uma tendência de associação com o melanoma (ODDS
ratio de 0,34).
Agrupando-se todas as variantes não sinônimas (ver tabela 6), observamos
um odds ratio de 1,855 para o risco de melanoma; entretanto sem significância
estatística (p=0,1954). A associação de variantes não sinônimas quaisquer com o
melanoma já foi reportada nas populações da Suécia e da Espanha, mas não na
população islandesa (GUDBJARTSSON et al., 2008).
Tabela 6. Associação entre a presença de variantes não sinônimas e o melanoma
cutâneo.
Número de
variantes não
sinônimas
Melanoma
n=34 (%)
Controle
n=71 (%)
OR (IC 95%)
a
P-valor
nenhuma 18 48 1
b
-
pelo menos 1 16 23 1,8555 (0,8031 - 4,285) 0,1954
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
b
Categoria de Referência
Considerando-se apenas as variantes ditas funcionais (Asp84Glu, Arg142His,
Arg151Cys, Arg160Trp e Asp294His, segundo FERNANDEZ et al., 2007), o risco de
melanoma parece aumentar (OR=3,022), conforme demonstrado na tabela a seguir,
embora ainda careça de significância estatística (p=0,2097).
70
Tabela 7. Associação entre a presença de variantes funcionais do MC1R e o melanoma
cutâneo.
Número de
variantes
funcionais
Melanoma
n=34, n (%)
Controle
n=71, n (%)
OR (IC 95%)
a
P-valor
nenhuma 30 (88,24) 68 (95,77) 1
b
-
pelo menos 1 4 (11,76) 3 (4,23) 3,022 (0,6365 - 14,35) 0,2097
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
b
Categoria de Referência
Não foi detectada nenhuma associação entre a presença de variantes não
sinônimas e o fototipo dos indivíduos, tanto no grupo controle quanto no grupo
melanoma (ver Tabelas 8 e 9). Na população das Ilhas Canárias o quadro é
semelhante, não havendo associação entre presença de variantes do MC1R e
características de pigmentação diversas, tais como cor de pele, olhos e cabelos (DE-
MISA et al., 2008).
Tabela 8. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do MC1R e o fototipo
no grupo controle.
Número de
variantes não
sinônimas
Fototipo I / II
n=26, n (%)
Fototipo III / IV
n=38, n (%)
OR (IC 95%)
a
P-valor
nenhuma 19 (73,08) 23 (60,53) 1
b
-
pelo menos 1 7 (26,92) 15 (39,47) 0,5649 (0,1911 - 1,670) 0,4224
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
b
Categoria de Referência
Tabela 9. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do MC1R e o fototipo
no grupo melanoma.
Número de
variantes não
sinônimas
Fototipo I / II
n=20, n (%)
Fototipo III / IV
n=14, n (%)
OR (IC 95%)
a
P-valor
nenhuma 10 (50) 8 (57,14) 1
b
-
pelo menos 1 10 (50) 6 (42,86) 1,333 (0,3372 - 5,272) 0,7385
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
b
Categoria de Referência
71
Em relação ao subtipo histopatológico, parece haver uma tendência de
associação entre a presença de variantes não sinônimas e os subtipos lentiginoso
acral e extensivo superficial (odds ratio de 2,3 e 4,8; respectivamente), conforme a
tabela 10. Quanto ao subtipo lentigo maligna, apenas dois indivíduos foram
analisados, o que torna imprudente tal suposição, apesar do pronunciado valor de
odds ratio (6,4). Pode-se dizer ainda de uma forte tendência de associação entre a
ausência de variantes não sinônimas e o subtipo nodular. Entretanto, para a
confirmação de tais associações, seria necessário analisar um número maior de
indivíduos, já que a pequena amostra utilizada não permitiu que alcançássemos a
significância estatística.
Tabela 10. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do MC1R e os
subtipos histopatológicos de melanoma.
Subtipo
Histopatológico
pelo menos
1 variante
sem nenhuma
variante
OR (IC 95%)
a
P-valor
Lentiginoso acral 5 3 2,273 (0,4455 - 11,59) 0,4290
Extensivo
superficial
6 2 4,800 (0,8053 - 28,61) 0,1100
Nodular 1 6 0,1333 (0,01406 - 1,264) 0,0900
Lentigo Maligna 2 0 6,379 (0,2834 - 143,6) 0,2139
a
OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
O presente estudo tem como principal limitação o pequeno tamanho
amostral, que certamente impossibilitou alcançar a significância estatística desejada
em algumas correlações. Além disso, a determinação de cor de pele baseada na
auto-declaração cria um viés que poderia ser evitado por medidas quantitativas da
concentração de melanina na pele, por exemplo.
Finalmente, a população brasileira apresenta uma diversidade genética sem
precedentes entre as populações caucasianas, o que pode dificultar a determinação
da contribuição de um alelo específico na formação de um fenótipo ou no
desenvolvimento de um tumor.
72
6 CONCLUSÕES
O grupo controle (n=71) apresentou idade média de 33 anos (DP=11,93),
68% de indivíduos do sexo masculino e 21% do sexo feminino. O grupo melanoma
(n=34) apresentou idade média de 63 anos (DP=16,16), 56% de indivíduos do sexo
masculino e 44% do sexo feminino. A cor de pele mais frequentemente reportada
por auto-declaração foi “branca”, em ambos os grupos (36% no grupo controle e
32% no grupo melanoma). A cor dos olhos mais freqüente foi castanho ou preto
(79% no grupo controle e 88% no grupo melanoma) e a cor dos cabelos mais
freqüente foi o castanho (55% no grupo controle e 50% no grupo melanoma). Os
fototipos mais freqüentes foram o II no grupo controle (34%) e o I no grupo
melanoma (32%).
Não foram detectadas associações de cor de pele, olhos, cabelos e fototipo
com o melanoma em níveis significantes, apenas uma tendência de associação
entre indivíduos com fototipos I e II e o melanoma (OR=2,03; p=0,1358).
Não foram encontradas associações de variantes alélicas do MC1R com
fototipos, risco de melanoma cutâneo ou com algum subtipo histopatológico de
melanoma em níveis estatisticamente significantes. Não obstante, pode-se observar
tendências de associação entre as variantes Asp42Asp (OR=6,4; p=0,32), Val92Met
(OR=4,6; p=0,08), Arg151Cys (OR=6,8; p=0,10), Arg163Gln (OR=2,3; p=0,20),
Asp184His (OR=6,4; p=0,32) e Asp294His (OR=2,1; p=0,54) e o melanoma, as
quais poderão ser confirmadas em estudos posteriores, com maior número amostral.
Além disso, observamos uma tendência de associação entre a presença de qualquer
variante não sinônima e o melanoma de subtipo “não nodular” (lentiginoso acral,
extensivo superficial ou lentigo maligna).
73
7 PERSPECTIVAS
Tendo em mente as tendências de associações observadas, pretendemos
ampliar a amostragem para 100 indivíduos em cada grupo, em busca da
significância estatística. Vale ressaltar que já dispomos, em nosso laboratório, de
mais 70 amostras de DNA de pacientes com melanoma e 40 de indivíduos
saudáveis, devidamente extraídas e quantificadas, assim como dos respectivos
questionários com as características de pigmentação. Tais amostras serão
seqüenciadas a partir de Agosto de 2008.
A partir dos resultados desta segunda etapa, poderemos definir quais as
mutações mais importantes na população brasileira, e assim realizar a genotipagem
em maior escala, por outros métodos que não o seqüenciamento direto, com menor
custo, tais como PCR alelo específica ou com enzimas de restrição. A simplificação
do processo de genotipagem é sem dúvida um passo importante a ser dado, que
nos permitirá explorar todas as possibilidades acerca das variantes do MC1R, tais
como associação com outros tipos de câncer de pele (carcinomas basocelulares e
escamocelulares) e com mutações em outros genes de suscetibilidade ao câncer.
74
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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82
9 ANEXOS
83
9.1 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Associação de
Combate ao Câncer em Goiás
84
9.2 Comprovante de aprovação do projeto multicêntrico pela Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)
85
9.3 Questionário sobre características de pigmentação
QUESTIONÁRIO
O presente questionário faz parte do projeto de pesquisa intitulado “Estudo de
associação entre variantes genéticas do receptor de melanocortina 1 (MC1R) e o
melanoma cutâneo”. Após responder você será convidado a doar 5 mL de sangue. Não
há necessidade prévia de jejum ou ingestão de qualquer tipo de alimento, e todo o
material utilizado é estéril. Favor informar ao responsável pela coleta qualquer problema
que você tenha apresentado em coletas de sangue anteriores. Sua amostra de sangue
será identificada apenas com o número presente no canto superior direito desta folha, e
as respostas dadas a seguir servirão apenas como dado estatístico.
Muito obrigado por sua colaboração!!!
I. IDENTIFICAÇÃO
Nome (apenas as iniciais): __________________ Idade: ____________ Sexo: ______________
Endereço atual: ___________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Cidade de Nascimento: _____________________________ Telefone: ___________________
Ocupação: ______________________
II. CARACTERÍSTICAS DE PIGMENTAÇÃO
Descendência (pais ou avós):
( )européia ( )asiática ( )africana ( )indígena
Cor da pele:
( )Branca ( )Morena clara ( )Morena ( ) Morena escura ( )Negra
Cor dos olhos
: ( )azul ( )verde / cinza ( )castanho / preto
Cor dos cabelos:
( )Ruivos ( )Louro claro ( )Louro ( )Castanhos ( )Pretos
Uso de filtro solar:
( ) sempre ( ) ocasionalmente ( ) raramente ( ) nunca
86
Presença de: sardas
( ) não ( ) sim ( ) face
( ) ombros
( ) colo
( ) costas
( ) abdome
( ) braços
( ) pernas
nevos (pintas)
( )não ( )sim ( ) pouco
( ) moderado
( ) muito
Ao tomar sol:
I.
( ) sempre se queima, nunca se bronzeia
II. ( ) normalmente se queima, e depois se bronzeia / às vezes se bronzeia
III. ( ) normalmente se bronzeia, às vezes se queima
IV. ( ) sempre se bronzeia, nunca se queima
Outras observações:
______________________________________________________________
________________________________________________________________________________
III. QUADRO CLÍNICO
É / foi portador de melanoma (sim / não)? ___________
Em caso afirmativo, está fazendo tratamento do melanoma? _______ Há quanto tempo? _________
Alguém da família já teve melanoma (sim / não)? __________________
Em caso afirmativo, qual o grau de parentesco? ____________________
Outras observações ou comentários: __________________________________________________
Responsável pela coleta de sangue:
Nome: ________________________________
Assinatura: ________________________________
Local e data: _________________, ____/____/____
87
9.4 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – grupo controle
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HEMOLABOR
Rua 5A, n
o
90 -Setor Aeroporto –Fone: (62) 3223 3366
CEP: 74.075-210 – Goiânia - GO
Aos doadores de sangue do Hemolabor:
Pedimos sua colaboração na realização de uma pesquisa sobre um tipo de câncer de pele
chamado melanoma. Para tanto, solicitamos uma pequena quantidade de sangue (5 mL), a ser coletada no
momento da sua doação, pela equipe do Hemolabor, sem nenhum desconforto adicional. Também
solicitamos que responda a um breve questionário sobre a cor de sua pele, olhos, cabelos e histórico de
câncer na família. Tais informações serão muito úteis e servirão como “controle” em nossos estudos sobre o
melanoma.
Tanto a amostra de sangue como o questionário serão usados exclusivamente para esta
pesquisa sobre melanoma, e não serão, em hipótese alguma, usados em pesquisas com outras finalidades.
Esse material permanecerá guardado no laboratório onde a pesquisa será feita. O seu direito ao anonimato e
à privacidade está garantido e sua identidade não será divulgada, porque sua amostra será identificada
apenas com um número presente no questionário.
Concordando em participar desta pesquisa, esclarecemos que você não receberá dinheiro, ou
qualquer benefício, nem terá direitos financeiros sobre os eventuais resultados obtidos. Quando a pesquisa
terminar, os resultados serão publicados e enviados para o seu conhecimento. Caso aceite participar e
depois decida retirar seu consentimento, ou mesmo caso não aceite participar desta pesquisa, você não será
em hipótese alguma prejudicado ou penalizado.
Em caso de dúvidas, você poderá entrar em contato a qualquer momento com a pesquisadora
responsável Dra. Lídia Andreu Guillo, nos telefones : (62) 3521-1495 ou (62) 99761878.
Agradecemos a sua colaboração.
Assinatura do (a) paciente ou representante legal:_________________________________________________________
Nome do paciente ou representante legal:________________________________________________________________
Data: _____/_____/______
TESTEMUNHAS (sem vínculo com o pesquisador responsável)
Nome: ______________________________________________________________________________________
Assinatura:
_________________________________________________________________________
Nome: ______________________________________________________________________________________
Assinatura: __________________________________________________________________________________
88
9.5 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – grupo melanoma
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL ARAÚJO JORGE
Rua 239, n
o
181-Setor Universitário –Fone: 32437000
CEP74605-070 –Goiânia - GO
Aos pacientes do Hospital Araújo Jorge:
Você está sendo admitido neste ambulatório de Pele e Tórax para o tratamento
de seu câncer de pele, que se chama melanoma. Como parte de seu tratamento, você será
submetido a uma cirurgia para retirada de um pedaço de pele contendo o tumor. É rotina
do hospital retirar um pequeno pedaço de pele para fazer exames laboratoriais e ter
certeza da doença. Também é necessária a coleta de sangue para vários outros exames.
Através de estudos, é possível conhecer melhor esse tipo de câncer e oferecer
novos tratamentos e diagnósticos para o melanoma. Assim, convidamos você para
participar de uma pesquisa sobre melanoma (intitulada “Estudo da associação entre
variantes genéticas do receptor de melanocortina e o melanoma maligno cutâneo”), com
duração prevista de um ano. Neste estudo vamos procurar fazer uma associação entre as
modificações que todas as pessoas têm na estrutura de uma substância responsável pela
cor de nossa pele e o aparecimento do melanoma. Como todos nós já nascemos com
essas modificações, é preciso analisar um numero muito grande de pessoas que tenham o
melanoma e de pessoas que não tenham essa doença, para sabermos se existem
modificações que se produzem somente nas pessoas com melanoma. Quando você estiver
lendo este termo, o projeto já terá sido aprovado por um comitê de ética, que é o órgão
responsável por autorizar as pesquisas envolvendo seres humanos. Se desejar, solicite ao
pesquisador responsável informações sobre a data de início e término da pesquisa.
Após ser esclarecido (a) sobre as informações a seguir, caso aceite fazer parte da
pesquisa, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a
outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa, você não será penalizado (a) de
forma alguma.
Ao aceitar participar da pesquisa, você estará autorizando o pesquisador a utilizar
uma pequena quantidade de seu sangue (5 mL) em estudos sobre o melanoma. Na coleta
de sangue poderá ocorrer algum desconforto devido ao uso de agulhas de tamanho
inadequado ou ao garroteamento de seu braço (uso de um elástico ou borracha apertando
o braço para facilitar a coleta do sangue). Entretanto, tais situações são raras, pois a
equipe responsável pela coleta é treinada para evitá-las. Também pedimos que responda a
um questionário sobre a cor de sua pele, olhos e cabelos, e histórico de câncer de pele na
família, para complementar a pesquisa.
89
As informações obtidas a partir do sangue nos fornecerão dados importantes para
entender melhor o melanoma. O sangue, assim como o questionário, serão usados
exclusivamente para a pesquisa sobre melanoma mencionada acima, e não serão, em
hipótese alguma, usados em pesquisas com outras finalidades. Esse material permanecerá
guardado no laboratório onde a pesquisa será feita. O seu direito ao anonimato e à
privacidade está garantido, e sua identidade não será divulgada, porque suas amostras
serão identificadas apenas com um número presente no questionário.
Concordando em participar desta pesquisa, esclarecemos que você não receberá
dinheiro, ou qualquer benefício, nem terá direitos financeiros sobre os eventuais resultados
obtidos. Quando a pesquisa terminar, os resultados serão publicados e enviados para o
seu conhecimento. Caso aceite participar e depois decida retirar seu consentimento, ou
mesmo caso não aceite participar desta pesquisa, você não será em hipótese alguma
prejudicado em seu tratamento ou acompanhamento no ambulatório.
Em caso de dúvidas, você poderá perguntar ao seu médico ou poderá entrar em
contato a qualquer momento com a pesquisadora responsável Dra. Lídia Andreu Guillo,
nos telefones : (62) 3521-1495 ou (62) 99761878.
Agradecemos a sua colaboração.
Assinatura do (a) paciente ou representante legal:____________________________________
Nome do paciente ou representante legal:___________________________________________
Médico responsável:____________________________________________________________
Data: _____/_____/______
TESTEMUNHAS (sem vínculo com o pesquisador responsável)
Nome: _______________________________________________________________________________________
Assinatura
____________________________________________________________________________
Nome: _______________________________________________________________________________________
Assinatura____________________________________________________________________________________
Observações complementares:
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
90
9.6 Planilha dos dados dos indivíduos do grupo controle.
WT: genótipo selvagem. M: masculino. F: feminino. FPS: protetor solar. Cor de pele: 1=branca, 2=morena clara,
3=morena, 4=morena escura, 5=negra. Olhos: 1=azul, 2=verde/cinza, 3=castanho/preto. Cabelos: 1=ruivo,
2=louro claro, 3=louro, 4=castanho, 5=preto. Uso FPS: 1=sempre, 2=ocasionalmente, 3=raramente, 4=nunca.
91
9.7 Planilha dos dados dos indivíduos do grupo melanoma.
WT: genótipo selvagem. M: masculino. F: feminino. FPS: protetor solar. Cor de pele: 1=branca, 2=morena clara,
3=morena, 4=morena escura, 5=negra. Olhos: 1=azul, 2=verde/cinza, 3=castanho/preto. Cabelos: 1=ruivo,
2=louro claro, 3=louro, 4=castanho, 5=preto. Uso FPS: 1=sempre, 2=ocasionalmente, 3=raramente, 4=nunca,
5=após o diagnóstico. ES: melanoma extensivo superficial. LM: melanoma lentigo maligna. LA: melanoma
lentiginoso acral. N: melanoma nodular
Amostra Genótipo Tipo de Melanoma FOTOTIPO SEXO IDADE COR PELE OLHOS
CABELOS
USO FPS
M1 ES 1 M 61 1 3 5 3
M2 WT ES 1 M 72 1 2 5 4
M3 LM 2 M 79 2 3 4 4
M4 WT não disponível 3 M 87 1 2 5 4
M5 ES+LM 3 F 72 1 3 5 5
M6 ES 1 F 73 2 3 5 4
M7 R151C ES 1 F 30 1 1 2 1
M8 D184H LA 3 M 60 3 3 4 4
M9 D294H ES 2 M 57 2 3 4 5
M10 WT LA 2 M 82 3 3 5 5
M11 ES 2 F 25 2 3 4 5
M12 LA 3 F 58 3 3 5 1
M13 WT N 2 F 48 2 2 4 5
M14 WT N 2 F 87 3 3 4 1
M15 WT N 3 M 71 3 3 4 5
M16 LA 2 F 92 2 3 4 5
M17 WT não disponível 1 M 60 1 3 4 5
M18 WT não disponível 3 M 66 1 3 5 2
M19 WT N 3 M 63 2 3 5 5
M20 N 3 M 76 3 3 4 4
M21 não disponível 1 M 40 1 3 2 1
M22 WT não disponível 3 F 76 3 3 5 4
M23 WT não disponível 3 M 55 3 3 4 4
M56 WT metastático 1 M 75 1 3 4 4
M58 WT LA 3 M 57 2 3 4 4
M60 2 F 58 1 3 4 5
M71 LA 4 M 74 4 3 4 4
M77 WT N 1 F 51 2 3 5 4
M84 não disponível 1 F 70 2 3 5 5
M90 WT N 1 M 27 1 3 2 5
M91 WT ES 1 F 54 2 3 4 5
M93 WT LA 2 F 65 2 3 4 5
M98 WT metastático 3 F 69 3 3 5 5
M104 LA 4 M 71 4 3 5 4
V60L heteroz
R163Q heteroz
V92M heteroz
R151C e V92M heteroz
R163Q heteroz
R163Q heteroz
R163Q heteroz
R163Q heteroz
V60L heteroz
R151C heteroz mestastático
V92M heteroz
V92M heteroz
R163Q e D42D homoz
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