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LUDMILA ROSA BERGSTEN TORRALBA
ESTUDO DE FUNGOS DA COLEÇÃO DE MICRORGANISMOS DE REFERÊNCIA DO
INCQS E DE FUNGOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE IGARAPÉS EM MANAUS
(AM) COM CAPACIDADE DE DESCOLORIR E DETOXIFICAR CORANTES TÊXTEIS
PPGVS/INCQS
FIOCRUZ
2008
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ESTUDO DE FUNGOS DA COLEÇÃO DE MICRORGANISMOS DE REFERÊNCIA DO
INCQS E DE FUNGOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE IGARAPÉS EM MANAUS
(AM) COM CAPACIDADE DE DESCOLORIR E DETOXIFICAR CORANTES TÊXTEIS
LUDMILA ROSA BERGSTEN TORRALBA
Mestrado Acadêmico
Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Orientadora: Drª. Manuela da Silva
Rio de Janeiro
2008
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Título: Estudo de fungos da Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS e de fungos
isolados de sedimentos de igarapés em Manaus (AM) com capacidade de descolorir e
detoxificar corantes têxteis.
Ludmila Rosa Bergsten Torralba
Dissertação submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do
Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados de outras
instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre.
Aprovada:
____________________________________________________
Profª. Drª. Verônica Viana Vieira
(INCQS/FIOCRUZ)
____________________________________________________
Profª. Drª. Cláudia Alessandra Aiub
(INCQS/FIOCRUZ)
____________________________________________________
Profª. Drª. Viridiana Santana Ferreira-Leitão
(Instituto de Tecnologia – INT)
Orientadora: __________________________________________
Profª. Drª. Manuela da Silva
(INCQS/FIOCRUZ)
Rio de Janeiro
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
“Study of fungi of the Collection Reference Microorganisms of INCQS and fungi
isolated from sediments from igarapés in Manaus (AM) with the ability to decolorize
and detoxified textile dyes”
Bergsten-Torralba, Ludmila Rosa
Estudo de fungos da Coleção de Microrganismos de Referência do
INCQS e de fungos isolados de sedimentos de igarapés em Manaus (AM) com
capacidade de descolorir e detoxificar corantes têxteis./ Ludmila Rosa Bergsten
Torralba. Rio de Janeiro: INCQS/FIOCRUZ, 2008.
xxv, 106p., il., tab.
Dissertação (Mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Saúde, Programa de Pós-Graduação em Vigilância
Sanitária, Rio de Janeiro, 2008. Orientadora: Manuela da Silva.
1. Fungos filamentosos. 2. Corantes têxteis. 3. Toxicidade. 4. Biodegradação. 4.
Mutagenicidade.
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Dedicatória
Aos meus pais, irmãos e marido,
que sempre me incentivaram,
em todos os momentos,
me fazendo ter esperanças.
A DEUS POR TUDO QUE É E REPRESENTA
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Agradecimentos
Agradeço a todos que participaram no desenvolvimento deste trabalho, em
especial:
À minha orientadora Drª. Manuela da Silva com quem aprendi tantas coisas e
cresci profissionalmente. Obrigada pelo grande apoio, compreensão, apertos,
correções e por ter acreditado no meu potencial;
Ao programa de pós-graduação do INCQS por ter contribuído na minha formação
profissional e por acreditar na importância deste trabalho;
À Fundação de desenvolvimento científico e tecnológico em saúde (FIOTEC) pela
bolsa auxílio concedida nos dois anos de curso;
Ao Departamento de Microbiologia do INCQS, em especial à Renata Trotta,
Cláudia Souto, Suely Fracalanza, Paola Cardarelli, Érica Scheidegger, Eliana
Duarte, Maria Esther e Carmen Lúcia que me apoiaram neste período e pelos
momentos inesquecíveis que passei ao lado de cada um de forma especial;
À Ana Paula Alcides e Marília M. Nishikawa pelo apoio e pela contribuição para a
melhoria textual desta dissertação;
À Will Robson, José Marcos, Eliete da Silva e Leonardo do Setor de Meios de
cultura pelo apoio e preparo dos meios e soluções e ainda à Mônica, Jorge e
Sineide do Setor de Esterilização pelo preparo de materiais.
Aos funcionários do Departamento de Química, Claúdia Maria, Sinea Mendes e
Filipe Soares pela colaboração na realização das análises espectrofotométricas;
À Danielly M. de Paiva, do Departamento de Biologia - IOC pela amizade e auxílio
na realização dos testes de toxicidade com microcrustáceo;
À Drª Helena Zamith do Setor de Ensaios Toxicológicos - DFT por ceder o
espaço e conhecimento para realização do Ensaio Cometa;
À técnica Taline Conde pela amizade e pelo grande auxílio na realização do Ensaio
Cometa;
À colega Virgínia por dispor cordialmente vários conhecimentos químicos no
decorrer deste trabalho;
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À Indústria Dystar por fornecer os corantes têxteis;
Ao grupo da Drª. Silvana Jacob pela coleta de sedimento da margem de igarapés
em Manaus –AM;
À Drª. Cláudia Aiub pelo apoio e dicas para melhoria deste trabalho e por ter
conseguido, na fase final deste trabalho, o contato para realização do Teste de
Ames;
Ao Dr. Israel Felzenszwalb do Departamento de Biofísica na UERJ por ceder o
espaço e material para a realização do Teste de Ames;
Aos amigos de turma Clarice, Thadeu, Priscilla, Aline Dias, Rafaela e Marcus
Vinícius pela valiosa amizade e pelos momentos de descontração em meio a tantos
estresses;
Ao funcionário e amigo Carlos Roberto pela ajuda nos momentos mais complicados
e pelo grande carinho demonstrado por mim;
Ao Laboratório de Fungos de Referência, Msc. Marília M. Nishikawa e Miguel M.
Fialho pelo apoio, amizade e pelo espaço cedido para realização deste trabalho;
Ao Aluno de graduação, Felipe, por ter me auxiliado na realização do Teste de
Ames em fins de semana e por me acompanhar nas idas e vindas da UERJ para
Fiocruz;
À Drª. Viridiana Leitão e sua aluna Michelly do Instituto Nacional de Tecnologia
(INT) por ceder um dos corantes utilizados neste trabalho;
OBRIGADO A TODOS QUE PARTICIPARAM DESTA CONQUISTA!!!
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Resumo
Os problemas associados à indústria têxtil provêm especialmente da utilização de corantes,
visto que a maioria é recalcitrante e alguns apresentam caráter mutagênico e carcinogênico.
Agências reguladoras relacionadas à saúde pública, incluindo a Vigilância Sanitária, devem
atuar conjuntamente com outros segmentos voltados à saúde ambiental no intuito de reduzir
ou eliminar os riscos provenientes deste setor. Deste modo vem sendo investigada à
capacidade de fungos de descolorir e detoxificar diferentes tipos de corantes têxteis. Amostras
de sedimentos de cinco igarapés na região de Manaus (AM) foram coletados com intuito de
isolar fungos com capacidade de descolorir eficientemente os corantes Vermelho Reativo 198
(V198) e Azul Reativo 21 (A21). Os fungos isolados foram testados juntamente com fungos
da Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS, àqueles eficientes na descoloração
foram avaliados na presença de outro corante, Azul Reativo 214 (A214) e da mistura dos 3
corantes (MXC). Os tratamentos foram avaliados toxicologicamente utilizando os ensaios
ecotoxicológico com o microcrustáceo Daphnia pulex, de genotoxicidade com células
sanguíneas (Ensaio Cometa) e de mutagenicidade com a bactéria Salmonella typhimurium
(Teste de Ames). Os isolados de Manaus não foram considerados eficientes na descoloração,
pois adsorveram o corante, ao contrário dos fungos da Coleção do INCQS, Penicillium
simplicissimum
INCQS 40211, e do fungo de referência Lentinula edodes INCQS 40220.
Ambos apresentaram descoloração completa de V198, A21, A214 e MXC.
L. edodes reduziu
93% da toxicidade de V198 e 95% de A21 no teste com as daphnias e 60% da genotoxicidade
da mistura MXC, entretanto em outros experimentos avaliados pelos testes com as daphnias e
bactérias (Teste de Ames) houve aumento da toxicidade. P. simplicissimum foi capaz de
reduzir 87% da toxicidade do corante V198 e 94% de A21, mas aumentou a toxicidade de
A214 e de MXC com as daphnias. Não foi detectada genotoxicidade nos tratamentos por este
fungo, contudo com as bactérias todos os tratamentos foram citotóxicos e alguns também
foram mutagênicos. Portanto, os fungos selecionados são eficientes na descoloração dos
corantes, no entanto os resultados de toxicidade demonstram a grande importância e
necessidade da realização ensaios toxicológicos associados aos estudos de descoloração para
garantir menores riscos ao ambiente e à saúde da população.
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Abstract
The problems associated with the textile industry are especially due to the use of dyes, since
the majority is recalcitrant and some of them might be mutagenic and carcinogenic.
Regulatory agencies related to public health, including the Health Surveillance, must act
jointly with other segments regarding environmental health in order to reduce or eliminate the
risks from this sector. Thus the ability of fungi to decolorize and reduce the toxicity of
different types of textile dyes have been investigated. Sediment samples of five igarapés of
Manaus region – (AM) were collected in order to isolate fungi able to efficiently decolorize
Reactive Red 198 (V198) and Reactive Blue 21 (A21). The fungal isolates were tested
simultaneously with fungi from the Reference Collection of Microorganisms of INCQS. The
fungi that efficiently decolorized the dyes were evaluated in the presence of another dye,
Reactive Blue 214 (A214), and a mixture of the 3 dyes (MXC). The treatments were
toxicologically evaluated using ecotoxicological test with the microcrustacean
Daphnia pulex,
genotoxicity test with blood cells (SGE – Assay Comet) and mutagenicity test with the
bacteria Salmonella typhimurium (Ames Test). None of the fungi isolated from Manaus was
efficient on decolorization without adsorbing the dye, differently of the fungi from the Culture
Collection, Penicillium simplicissimum (INCQS 40211) and Lentinula edodes (INCQS
40220). Both showed complete decolorization of V198, A21, A214 and MXC. L. edodes
reduced 93% of the toxicity of V198 and 95% of A21 with daphnia test and 60% of the
genotoxicity the mixture MXC, however in other experiments evaluated by tests with
daphnia
and bacteria (Ames Test) the toxicity increased. P. simplicissimum reduced 87% of the
toxicity of V198 and 94% of A21, but increased the toxicity of A214 and MXC with the
daphnias. Genotoxicity was not detected in the treatments by this fungus, however with the
bacteria all the treatments were cytotoxic and some of them also were mutagenic. Therefore,
the fungi selected were efficient on dye decolorization, nevertheless the toxicological results
demonstrated the great importance and need of decolorization studies to be associated with
toxicological tests to ensure risks reduced risks to the environment and the population health.
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química dos corantes estudados: A – Vermelho Reativo 198; B –Azul
Reativo 21; C – Azul Reativo 214.................................................................................19
Figura 2. Esquema do processamento das amostras de sedimento de igarapés em Manaus –
AM.................................................................................................................................23
Figura 3. Esquema do isolamento dos fungos de sedimento.........................................................24
Figura 4. Esquema de avaliação toxicológica utilizando o microcrustáceo Daphnia pulex .........28
Figura 5. Esquema do ensaio de citotoxicidade e do Ensaio Cometa utilizando sangue
periférico humano..........................................................................................................29
Figura 6. Ensaio de viabilidade celular para o Ensaio Cometa: Visualização de lâmina através
de microscópio de fluorescência, células viáveis (verde) e mortas (laranja). ...............30
Figura 7. Classes de dano ao DNA. A- classe 0 (sem dano); B – classe 1 (dano leve); C –
classe 2 (dano moderado) e D – classe 3 (dano severo) ................................................30
Figura 8. Esquema do ensaio de mutagenicidade utilizando a bactéria Salmonella
typhimurium...................................................................................................................34
Figura 9. Esquema do ensaio de citotoxicidade utilizando a bactéria Salmonella typhimurium
.......................................................................................................................................35
Figura 10. Frascos de IDB incubados com corante V198 na concentração de 100 ppm, onde
A é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o
tratamento, após 7 dias de incubação ............................................................................38
Figura 11. Frascos de IDB incubados com corante A21 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o
tratamento, após 7 dias de incubação ............................................................................38
Figura 12. Frascos de IDN incubados com corante V198 na concentração de 100 ppm, onde
A é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o
tratamento, após 7 dias de incubação ............................................................................38
Figura 13. Frascos de IDN incubados com corante A21 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o
tratamento, após 7 dias de incubação .............................................................................39
Figura 14. Frascos de IR incubados com corante V198 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o
tratamento, após 7 dias de incubação... ..........................................................................39
xv
Figura 15. Frascos de IR incubados com corante A21 na concentração de 100 ppm, onde A é
o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o
tratamento, após 7 dias de incubação. ...........................................................................39
Figura 16. Características macroscópicas apresentadas por A. japonicus (DKNA1) nos meios
de cultura: A – MEA; B – CYA25; C – CYA37; D – CY20S e E – CZ.......................42
Figura 17. Características microscópicas apresentadas por A. japonicus (DKNA1): A –
detalhe da vesícula, das fiálides e dos conídios; B – estipes e cabeças conidiais. ........42
Figura 18. Características microscópicas apresentadas por Acremonium sp. A – anastomose
entre hifas hialinas, B – detalhe dos esporos cilíndricos e alongados, C – detalhe
dos esporos globosos agrupados em forma de flor nas extremidades das fiálides e D
– micélio ramificado e hialino.......................................................................................43
Figura 19. Características apresentadas por Fusarium sp. (A) Caracterísitica macroscópica
em PDA + V198 e (B) Característica microscópica com detalhe de microconídios.....44
Figura 20. A – Frasco do controle corante V198 (100 ppm); B – Frasco do tratamento com A.
japonicus DKNA1 após 28 dias de incubação ..............................................................46
Figura 21. Espectros de absorbância de Fusarium sp. RV1 na presença do corante V198. A)
Pico característico de 520 nm no tempo 0; B) desaparecimento do pico
característico em 19 dias; C) Novo pico de 476nm em 28 dias de incubação com
Fusarium sp RV1 ..........................................................................................................49
Figura 22. Gráfico do percentual de descoloração dos corantes V198 e A21 por L. edodes
INCQS 40220 em 28 dias de incubação........................................................................50
Figura 23. 1 – Frascos antes da filtração; 2 - Frascos filtrados em membrana 0,22 m. A –
Controle corante A21 (100 ppm); B – Frasco do tratamento com A. japonicus
DKNA1 após 28 dias.....................................................................................................53
Figura 24. Frascos contendo o corante V198 tratados por P. simplicissimum INCQS 40211. A
– 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação...........................................58
Figura 25. Frascos contendo o corante A21 tratados por P. simplicissimum INCQS 40211. A
– 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação...........................................58
Figura 26. Frascos contendo o corante A214 tratados por P. simplicissimum INCQS 40211. A
– 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação...........................................58
Figura 27. Frascos contendo a mistura dos corantes MXC tratados por P. simplicissimum
INCQS 40211. A – 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação..............58
Figura 28. Frascos contendo o corante V198 tratados por L. edodes. A – controle V198; B – 2
dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação..................................................60
xvi
Figura 29. Frascos contendo o corante A21 tratados por L. edodes. A – controle A21; B – 2
dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação ..................................................60
Figura 30. Frascos contendo o corante A214 tratados por L. edodes. A – controle A214; B – 2
dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação...................................................60
Figura 31. Frascos contendo a mistura dos corantes MXC tratados por L. edodes. A –
controle MXC; B – 2 dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação................61
xvii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Princípios dos ensaios toxicológicos realizados no estudo .........................................26
Quadro 2. Relação de linhagens utilizadas no teste de mutagenicidade e suas características
genotípicas......................................................................................................................32
xviii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Informações referentes aos corantes utilizados .............................................................20
Tabela 2. Dados e características físico-químicas referentes aos pontos de coleta da região de
Manaus ...........................................................................................................................23
Tabela 3. Percentual de descoloração das amostras de sedimento de igarapés da Região de
Manaus - AM ................................................................................................................40
Tabela 4. Identificação dos isolados de sedimento de igarapés em Manaus – AM.......................41
Tabela 5. Percentual de descoloração dos fungos testados somente na presença do corante
V198 por 28 dias de incubação......................................................................................50
Tabela 6. Percentual de descoloração dos fungos testados somente na presença do corante
A21 por 28 dias de incubação........................................................................................53
Tabela 7. Resumo do percentual de descoloração dos fungos testados em 28 dias de
incubação........................................................................................................................54
Tabela 8. Percentual de descoloração dos corantes V198, A21, A214 e MXC por L. edodes
INCQS 40220 e P. simplicissimum INCQS 40211 em 14 dias de incubação...............55
Tabela 9. Resultados do ensaio toxicológico com microcrustáceo Daphina pulex dos isolados
que apresentaram melhor percentual de descoloração dos corantes V198 e A21
após 28 dias de incubação .............................................................................................63
Tabela 10. Resultados do ensaio toxicológico com microcrustáceo Daphina pulex dos fungos
selecionados testados em V198, A21, A214 e na mistura, MXC após 14 dias de
incubação.......................................................................................................................66
Tabela 11. Relação dos grupos de controle comparados com as respectivas amostras testadas
após a realização do Ensaio Cometa utilizando células sanguíneas..............................68
Tabela 12. Resultados do Ensaio Cometa e do ensaio de citotoxicidade em células sanguíneas
humana ..........................................................................................................................70
Tabela 13. Relação dos grupos controle comparados com as respectivas amostras testadas
após a realização do Teste de Ames e citotoxicidade utilizando a bactéria
Salmonella typhimurium................................................................................................72
Tabela 14. Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA97 de S.
typhimurium...................................................................................................................74
Tabela 15. Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA98 de S.
typhimurium...................................................................................................................77
Tabela 16. Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA100 de S.
typhimurium...................................................................................................................78
xix
Tabela 17. Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA102 de S.
typhimurium...................................................................................................................80
Tabela 18. Resumo dos resultados positivos em relação à toxicidade e mutagenicidade no
Teste de Ames, à genotoxicidade no Ensaio Cometa e à toxicidade com o
microcrustáceo
Daphnia pulex ......................................................................................81
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SIGLAS E ABREVIATURAS
λ
max
– Absorbância máxima
4-NQO – 4-Nitroquinilona-1-N-Óxido
A21 – Azul Reativo 21
A214 – Azul Reativo 214
Aa – Absorbância máxima após a descoloração
Ab – Absorbância máxima antes da descoloração
AS – Azida Sódica
BPF – Baixo Ponto de Fusão
BrEt – Brometo de Etídio
CAS – (sigla em inglês) – Número de registro no Serviço de Resumo Químico
CCT – Coleção de Culturas Tropical
C.I. – Colour Index
CZ – Agar Czapek Dox
CYA – Ágar Czapek Extrato de Levedura
CY20S – Ágar Czapek Extrato de Levedura com 20% de Sacarose
CYP – Citocromo oxidase
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
et al. – e colaboradores
FDA – Diacetato de Fluoresceína
FTd – Fator de Toxicidade
g – Grama
h – Horas
HB – Histidina-Biotina
his - Histidina
IA – Igarapé Acará
IDB- Igarapé Reserva Ducke ponto Bo
IDN – Igarapé Reserva Ducke ponto N
I.M. – Índice de Mutagenicidade
INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
IR – Igarapé Ramal Água Branca
LB – Louria Bertani
Le –
Lentinula edodes
mA – MiliAmpere
xxi
MEA – Agar Extrato de Malte e Peptona
mg – Miligrama
mL – Mililitro
L - Microlitro
m – Micrômetro
mM – Milimolar
MMS – Metil Metano Sulfonato
MXC – Mistura de corantes
NADP – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NBR – Norma Brasileira
nm – Nanômetro
NaOH – Hidróxido de Sódio
NBR – Norma Brasileira
°C – Graus/Celsius
OD – Oxigênio Dissolvido
PBS – Tampão Fosfato-Salina
PDA – Agar Batata Dextrose
PDB – Caldo Batata Dextrose
Pen – Penicillium simplicissimum
PFN – Ponto de Fusão Normal
pH – Potencial hidrogêniônico
rpm – Rotações por minuto
SDB – Caldo Sabouraud Dextrose
SUS – Sistema Único de Saúde
TFS – Tampão Fosfato de Sódio
tons – Toneladas
UA – Unidades Arbitrárias
UAT – Unidades Arbitrárias Totais
UV – Ultra-Violeta
V – Volt
V198 – Vermelho Reativo 198
VB – Vogel-Bonner
VIS – Visível
VISA – Vigilância Sanitária
xxii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................................................2
1.1. SAÚDE E AMBIENTE..........................................................................................................2
1.2. I
NDÚSTRIA TÊXTIL ...........................................................................................................3
1.3. CORANTES TÊXTEIS .........................................................................................................5
1.3.1. Classificação dos corantes ..............................................................................5
1.3.2. Química dos corantes .....................................................................................6
1.3.3. Toxicidade dos corantes .................................................................................7
1.4. TRATAMENTO DE EFLUENTES .........................................................................................9
1.4.1. Tratamento químico......................................................................................10
1.4.2. Tratamento físico ..........................................................................................11
1.4.3. Tratamento biológico ....................................................................................11
1.5. B
IORREMEDIAÇÃO ........................................................................................................12
1.6. F
UNGOS COM POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DE POLUENTES........................................13
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................17
2.1.O
BJETIVOS ESPECÍFICOS ...............................................................................................17
3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................................19
3.1. REAGENTES QUÍMICOS..................................................................................................19
3.2. MEIOS DE CULTURAS E SOLUÇÕES ...............................................................................20
3.2.1. Isolamento e ensaio de descoloração............................................................20
3.2.2. Identificação e manutenção dos fungos filamentosos isolados..................20
3.2.3. Ensaio de citotoxicidade utilizando células sanguíneas e Ensaio
Cometa......................................................................................................................21
3.2.4. Ensaio de citotoxicidade utilizando bactérias e Teste de Ames ................21
3.3. SELEÇÃO DE FUNGOS DE SEDIMENTO DE IGARAPÉS EM MANAUS (AM) E DA
COLEÇÃO DE MICRORGANISMOS DE REFERÊNCIA DO INCQS EFICIENTES NA
DESCOLORAÇÃO DE CORANTES ...........................................................................................22
3.3.1. Seleção das amostras de sedimento de igarapés com capacidade de
descolorir corantes ..................................................................................................22
3.3.2. Isolamento dos fungos de sedimento de igarapés .......................................24
3.3.2.1. Caracterização morfológica e identificação dos isolados ....................24
xxiii
3.4. SELEÇÃO DE FUNGOS DE SEDIMENTO DE IGARAPÉS EM MANAUS (AM) E DA
COLEÇÃO DE MICRORGANISMOS DE REFERÊNCIA DO INCQS COM CAPACIDADE DE
DESCOLORIR EM MEIO LÍQUIDO ...........................................................................................24
3.4.1. Estudo da descoloração de corantes em meio líquido pelos fungos
selecionados..............................................................................................................25
3.4.2. Determinação da descoloração dos corantes ..............................................25
3.5. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DO MEIO DE CULTURA PÓS-TRATAMENTO FÚNGICO .....26
3.5.1. Avaliação de toxicidade com o microcrustáceo Daphnia pulex.................27
3.5.2. Avaliação de genotoxicidade com sangue periférico humano (Ensaio
Cometa) ....................................................................................................................28
3.5.2.1. Ensaio de citotoxicidade utilizando sangue periférico humano............28
3.5.2.2. Ensaio Cometa .....................................................................................30
3.5.3. Ensaio de mutagenicidade utilizando a bactéria Salmonella
typhimurium
(Teste de Ames).................................................................................31
3.5.3.1. Linhagens ..............................................................................................32
3.5.3.2. Teste de Ames.......................................................................................33
3.5.3.3. Ensaio de citotoxicidade utilizando a bactéria Salmonella
typhimurium .......................................................................................................34
3.6. PRESERVAÇÃO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS................................................................35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................36
4.1. SELEÇÃO DE FUNGOS DE SEDIMENTO DE IGARAPÉS DE MANAUS (AM) E DA
COLEÇÃO DE MICRORGANISMOS DE REFERÊNCIA DO INCQS EFICIENTES NA
DESCOLORAÇÃO DE CORANTE .............................................................................................37
4.1.1. Seleção das amostras de sedimento com capacidade de descolorir
corantes ....................................................................................................................37
4.1.2. Isolamento de fungos do sedimento de igarapés.........................................40
4.1.3. Caracterização morfológica e identificação dos isolados ..........................40
4.1.3.1. DKNA1 – Aspergillus japonicus ..........................................................41
4.1.3.2. DKBV1 – Acremonium sp. ..................................................................42
4.1.3.3. RV1 – Fusarium sp. .............................................................................43
4.1.3.4. DKBV2 – dematiáceo e DKNA2 – Aspergillus sp. ..............................44
4.1.4. Seleção de fungos isolados de sedimento de igarapés em Manaus e da
Coleção de Microrganismos de Referência com capacidade de descolorir em
meio líquido .............................................................................................................44
4.1.4.1. Fungos testados na presença do corante V198......................................45
xxiv
4.1.4.1.1. Aspergillus japonicus DKNA1 .....................................................45
4.1.4.1.2. Aspergillus sp. DKNA2.................................................................46
4.1.4.1.3. Associação de
Aspergillus japonicus DKNA1 e Aspergillus sp.
DKNA2..........................................................................................................46
4.1.4.1.4.
Acremonium sp. DKBV1...............................................................47
4.1.4.1.5. dematiáceo DKBV2.......................................................................47
4.1.4.1.6. Associação Acremonium sp. DKBV1 e dematiáceo DKBV2 ......48
4.1.4.1.7. Fusarium sp. RV1 .........................................................................48
4.1.4.1.8.
Lentinula edodes INCQS 40220....................................................49
4.1.4.2. Fungos testados na presença do corante A21........................................51
4.1.4.2.1.
Psilocybe sp. INCQS 40212 .........................................................51
4.1.4.2.2. Ceriporiopsis sp. INCQS 40260 ...................................................51
4.1.4.2.3.
Aspergillus japonicus DKNA1 .....................................................52
4.1.4.2.4.
Lentinula edodes INCQS 40220....................................................52
4.1.5. Estudo da descoloração em meio líquido pelos fungos selecionados .......54
4.2.5. Avaliação Toxicológica do Meio de Cultura Pós-tratamento fúngico .....61
4.2.5.1. Avaliação toxicológica, com o microcrustáceo Daphnia pulex, de A.
japonicus e L. edodes após 28 dias de incubação na presença dos corantes
V198 e A21 ........................................................................................................62
4.2.5.2. Avaliação toxicológica dos fungos selecionados P. simplicissimum
INCQS 40211 e L. edodes INCQS 40220 após 14 dias de incubação na
presença dos corantes V198, A21, A214 e da mistura MXC.............................64
4.2.5.2.1. Avaliação de toxicidade com o microcrustáceo
Daphnia pulex ..64
4.2.5.2.2. Avaliação de genotoxicidade utilizando sangue periférico
humano (Ensaio Cometa) ..............................................................................67
4.2.5.2.3. Ensaio de mutagenicidade utilizando a bactéria
Salmonella
typhimurium (Teste de Ames) .......................................................................71
4.2.5.2.3.1. Resposta tóxica e mutagênica utilizando a Linhagem
TA97 ....................................................................................................72
4.2.5.2.3.2. Resposta tóxica e mutagênica utilizando a Linhagem
TA98 ....................................................................................................75
4.2.5.2.3.3. Resposta tóxica e mutagênica utilizando a Linhagem
TA100 ..................................................................................................77
4.2.5.2.3.4. Resposta tóxica e mutagênica utilizando a Linhagem
TA102 ..................................................................................................78
xxv
4.3.5. Resumo de todos os ensaios toxicológicos realizados após o tratamento
dos corantes V198, A21, A214 e da mistura MXC pelos fungos selecionados...80
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................................86
6. CONCLUSÕES........................................................................................................................88
7. PERSPECTIVAS ....................................................................................................................90
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................92
1
1
1
.
.
I
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o
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ã
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o
o
1. Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Saúde e ambiente
As civilizações humanas sempre provocaram modificações no ambiente, e com o
surgimento das grandes cidades e das diversas formas de poluição resultantes da moderna
sociedade industrial houve um aumento do impacto sobre o ambiente e, conseqüentemente,
sobre a saúde, sendo assim os problemas ambientais têm se tornado cada vez mais críticos e
freqüentes causando alterações na qualidade do solo, ar e água (KUNZ et al., 2002).
A Revolução Industrial trouxe um acelerado crescimento da produção, do mercado e
do consumo, fazendo emergir novas configurações sociais e novos desafios para o setor de
saúde. Deste modo, o mundo industrializado trouxe mais riscos e perigos à saúde ambiental e
humana, assim como de suas futuras gerações, ampliando-se gradativamente o escopo da
proteção da saúde em decorrência da introdução de novos padrões na produção envolvendo
agentes radiológicos, químicos e biológicos, ameaçando a segurança sanitária (COSTA,
2001).
Ações promocionais e preventivas no âmbito da saúde ocupam lugar de destaque após
a identificação dos fatores determinantes dos agravos que acometem as populações ao longo
do tempo. A partir das observações empíricas a respeito da ocorrência de doenças, as
comunidades antigas foram estabelecendo leis e regulamentos acerca de muitos aspectos da
vida comunitária, visando à proteção da saúde pública (LUCCHESE, 2001a).
A vigilância sanitária (VISA) originou-se no Brasil entre os séculos XVIII e XIX, com
o surgimento da noção de “polícia sanitária”, que tinha como função regulamentar o exercício
da profissão e combater o charlatanismo. Exercia ainda o saneamento da cidade, através de
fiscalização de embarcações, cemitérios e de comércio de alimentos com o objetivo de evitar
a propagação das doenças (LUCCHESE, 2001a; EDUARDO & MIRANDA, 2006).
A Constituição Federal de 1988 propôs, considerando as novas percepções sobre a
saúde pública, defini-la como direito social e instituiu o Sistema Único de Saúde (SUS) como
meio de concretizar esse direito. O artigo 200 da Constituição Federal estabelece como
competência do SUS controlar e fiscalizar procedimentos, produtos e substâncias de interesse
para a saúde (BRASIL, 1988).
Para regulamentar a estrutura e o funcionamento do SUS, foi aprovada a Lei Orgânica
da Saúde n° 8.080 de 1990, que definiu a função da VISA como um conjunto de ações
capazes de prevenir, diminuir ou eliminar riscos à saúde e de intervir nos problemas sanitários
1. Introdução
3
decorrentes do ambiente, da produção e circulação de bens e da prestação de serviços de
interesse à saúde (BRASIL, 1990). Esta legislação permite que se perceba e analise a VISA
sob o ponto de vista de um espaço de intervenção do Estado, com a prioridade de trabalhar no
sentido de adequar o sistema produtivo de bens e serviços de interesse sanitário, e os
ambientes, às demandas sociais de saúde, para os indivíduos e para a coletividade, e às
necessidades do sistema de saúde (LUCCHESE, 2001b). Portanto, é de responsabilidade da
VISA, respeitada a legislação em vigor, regulamentar, controlar e fiscalizar os produtos e
serviços que envolvam risco à saúde pública (BRASIL, 1999).
Para que seja efetiva a prevenção, diminuição ou eliminação dos riscos é necessário
que se conheçam as possíveis causas das doenças e os mecanismos pelos quais os indivíduos
estão expostos. O conhecimento sobre os riscos pode levar a um processo de recomendação
de ações sanitárias que prevê medidas e atividades fundadas cientificamente para a prevenção
de doenças (TAMBELLINI & CÂMARA, 2002).
No Brasil vem crescendo entre os profissionais da área de saúde coletiva o
conhecimento sobre a relação entre a categoria ambiente e o padrão de saúde/doenças das
populações. A área de saúde coletiva incorporou a saúde ambiental entre suas questões
prioritárias, coincidindo com uma maior preocupação nos meios acadêmicos com problemas
de saúde relacionados ao ambiente, além do crescimento e maior visibilidade dos movimentos
ecológicos (TAMBELLINI & CÂMARA, 2002).
Deste modo, para vincular a saúde à ecologia é preciso articular suas relações com a
produção e a tecnologia, identificando as situações de risco que antecedem os efeitos
considerados adversos à saúde (AUGUSTO, 2005), pois este conhecimento pode levar a um
processo de recomendação de ações sanitárias que prevê medidas e atividades fundadas
cientificamente para a prevenção de doenças (TAMBELLINI & CÂMARA, 2002).
2.2. Indústria têxtil
A indústria têxtil, um importante setor dentro da economia brasileira, constitui uma
atividade tradicional e apresenta alto potencial poluidor. A partir de seus processos são
gerados efluentes líquidos, constituídos por uma mistura complexa de compostos coloridos e
tóxicos, incluindo compostos cancerígenos, assim como emissões gasosas e resíduos sólidos
(ROBINSON et al., 2001a).
No Brasil as primeiras indústrias têxteis foram implantadas no ano de 1850 e foi peça
fundamental na estratégia de desenvolvimento da política industrial brasileira, uma vez que
foi através dela que o Brasil iniciou seu processo de industrialização (HASSEMER & SENS,
1. Introdução
4
2002; MELO, 2005). Hoje o Brasil é importante produtor de artigos têxteis, ocupando a
sétima posição na produção de fios e tecidos planos e a terceira na produção de malha. No
entanto, no comércio internacional sua participação ainda é pequena, estando apenas entre os
20 maiores comerciantes de têxteis no mundo. O consumo
per capita de têxteis no Brasil
cresceu de 8,3 kg/habitante em 1990 para 9,5 kg/habitante em 1999 – crescimento acumulado
superior ao da população, embora ainda seja considerado um nível baixo em relação ao
consumo médio dos maiores mercados mundiais (LIMA, 2004).
O setor na década passada era constituído por aproximadamente 5.000 empresas
espalhadas pelo País, das quais apenas 11% eram consideradas de grande porte e 21% de
pequeno e médio porte. As microempresas atingiam 68% do total e representavam a grande
maioria do setor (VIEIRA, 1995). Cerca de 75% das indústrias estavam localizados na região
sul (Santa Catarina), sudeste (São Paulo e Minas Gerais) e nordeste (Pernambuco, Bahia e
Ceará) (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Durante o processamento na indústria têxtil há consumo de significativa soma de água,
energia e produtos químicos, sendo que o principal problema no efluente têxtil está na
presença de corantes liberados, pois mesmo utilizando-se corantes de elevada capacidade de
fixação, como o do tipo azo que são utilizados em 60 a 70% de todos os artigos têxteis
produzidos (VANDEVIVERE et al., 1998), admite-se que, em média, 10-15% de toda a carga
de corantes utilizada em operações de tingimento é perdida nos efluentes industriais e
eventualmente lançados no ambiente (SINGH, 2006).
A concentração dos corantes do tipo azo é menor do que muitos outros químicos
encontrados nos efluentes, mas sua cor é visível em baixas concentrações, tornando este
poluente um problema em potencial para o ambiente (HASSAMER & SENS, 2002), pois
impede a entrada de luz na água, o que resulta a diminuição da fotossíntese e
consequentemente a oxigenação da água causando a morte de diversos organismos.
Segundo a Resolução do CONAMA n° 357/05 os efluentes de qualquer fonte
poluidora somente poderão ser lançados, direta ou indiretamente, nos corpos de água após o
devido tratamento, e o efluente não deverá causar ou possuir potencial que resulte em efeitos
tóxicos.
Seguindo uma tendência mundial, as indústrias de corantes e têxteis no Brasil têm
dedicado esforços para atender as regras de proteção ambiental, entretanto grande
porcentagem destas indústrias são pequenas empresas, dificultando a atividade de fiscalização
(GUARATINI & ZANONI, 2000). Assim, existe a necessidade da união de diferentes órgãos
1. Introdução
5
de fiscalização relacionados à saúde pública, incluindo a Vigilância Sanitária, e a saúde
ambiental no intuito de controlar, reduzir ou eliminar os riscos provenientes deste setor.
2.3. Corantes têxteis
Até a metade do século XIX, só existiam pigmentos naturais, provenientes de vegetais,
insetos, moluscos e minerais, como o anil e a cochinilha, ambos intensamente produzidos na
América Central e que “morreram de morte sintética quando, por volta de 1850, os químicos
alemães inventaram as anilinas e outras tintas mais baratas para tingir os tecidos”
(GALEANO, 1976, p. 139). A intensa inovação tecnológica ao redor de 1915 manteve a
Alemanha com monopólio sobre a produção de corante sintético até a Segunda Guerra
Mundial, após este período a indústria de corantes dos Estados Unidos se tornou a maior fonte
exportadora destes produtos (SALEM, 1995).
No Brasil, desde seu descobrimento sua história está relacionada à produção de
corantes. A começar pelo nome do país, uma vez que este é proveniente da madeira “Pau-
Brasil”, fonte natural de corante avermelhado. A produção industrial de corantes sintéticos no
país foi introduzida logo após a Primeira Guerra Mundial e atualmente supre 60% de sua
demanda doméstica (GUARATINI & ZANONI, 2000; ZANONI & CARNEIRO, 2001).
Há mais de 100.000 corantes descritos que estão disponíveis comercialmente, com
produção de 7x10
5
tons por ano sendo 26.500 tons somente no Brasil (NIGAM et al., 1996;
KUNZ et al., 2002).
Os corantes do tipo azo são constituintes de corantes reativos, que diferem de todas as
outras classes de corantes por se ligarem a fibras têxteis, tais como algodão, através de
ligações covalentes que conferem grande resistência à degradação. Eles apresentam
características favoráveis de cor brilhante, lavagem rápida, técnicas simples de aplicação com
baixo consumo de energia (ROBINSON et al., 2001a; AKSU & DÖNMEZ, 2003;
HARAZONO & NAKAMURA, 2005), assim por apresentarem estas características são
utilizados em larga escala pelas indústrias.
2.3.1. Classificação dos corantes
Os corantes podem ser classificados de acordo com a estrutura química, por seu uso ou
método de aplicação. Os químicos na prática adotam os termos oriundos da estrutura química
tais como: azo corantes, antraquinonas e ftalocianinas. Os tecnologistas utilizam os termos de
acordo com o uso ou método de aplicação, como corantes básicos, ácidos, diretos, dispersivos
e reativos (HAO et al., 2000; HUNGER, 2003).
1. Introdução
6
O Colour Index (CI), catálogo da Society of Dyers and Colourists e publicado pela
American Association of Textile Chemists and Colorists e pela British Society of Dyers and
Colorists
, contém uma lista organizada de nomes e números para designar os diversos tipos
de corantes onde estão registrados mais de 8 mil corantes orgânicos sintéticos associados à
indústria têxtil. Estes corantes podem ser (MIRSHRA & TRIPATHY, 1993; FU &
VIRARAGHAVAN, 2001):
Aniônicos: diretos, ácidos e reativos;
Catiônicos: básicos;
Não aniônicos: dispersivos.
1.3.2. Química dos corantes
A molécula do corante utilizada para tingimento da fibra têxtil pode ser dividida em
duas partes principais, o grupo cromóforo e os auxocromos.
Os grupos cromóforos atribuem coloração aos corpos aromáticos, estes são tão
importantes que freqüentemente a classificação de muitos corantes é dada pelo principal
cromóforo que possuem (FU & VIRARAGHAVAN, 2001; HUNGER, 2003).
A outra parte da molécula do corante ligada ao grupo cromóforo, os auxocromos
(intensificadores de cor), são responsáveis pela fixação do corante à fibra. Estes são
constituídos por heteroátomos (O, N, S, Cl, etc) com ao menos um par de elétrons livres,
possibilitando a interação destes grupos com as fibras (SHORE, 1990). De modo geral, os
corantes podem ser escritos seguindo a seguinte equação: Corantes = cromóforos +
auxocromos.
Os grupos de corantes mais utilizados são:
a Azo corantes Esta classe é a mais importante com mais de 50% de
todos os corantes comerciais e têm sido mais estudada que qualquer outra
classe. São corantes produzidos, em sua maioria, a partir da reação de
diazotação de uma amina primária e se caracterizam por apresentarem um
ou mais grupos azo (-N=N-) e geralmente associados a grupos
auxocrômicos (-OH ou –NH) e sistemas aromáticos (SHORE, 1990).
b Antraquinonas Esta é a 2ª classe mais importante de corantes
apresentando uma larga escala de cores e inclui alguns dos mais antigos
corantes. São fortemente coloridos mesmo na ausência do grupo auxocromo
(HUNGER, 2003).
1. Introdução
7
c Ftalocianinas Os mais importantes cromógenos do século XX foram os
derivados das ftalocianinas, introduzidos em 1934. O termo ftalocianina foi
usado pela primeira vez por Linstead em 1933 para descrever uma classe de
corantes orgânicos, cujas cores variam do azul ao verde amarelado. O nome
ftalocianina é originado dos termos gregos naphtha para óleo mineral e
cyanine para azul escuro. Estes compostos são análogos a duas porfirinas
naturais: a clorofila e a hemoglobina. As ftalocianinas formam complexos
com numerosos metais, e os complexos com cobre são os mais comuns
(HUNGER, 2003).
1.3.3. Toxicidade dos corantes
A avaliação e o conhecimento das propriedades químicas, físicas, ecológicas e
toxicológicas de corantes são essenciais para avaliar sua influência no ambiente e estimar se o
produto apresenta um perigo potencial (HUNGER, 2003). Os riscos toxicológicos de corantes
sintéticos à saúde humana estão intrinsicamente relacionados ao modo e tempo de exposição,
ingestão oral, sensibilização da pele e sensibilização das vias respiratórias (GUARATINI &
ZANONI, 2000).
Os corantes sintéticos, extensivamente utilizados pela indústria têxtil, exibem uma
grande diversidade de estruturas, sendo a maioria deles corantes do tipo azo. Devido à
importância comercial, o impacto e a toxicidade dos corantes que são liberados no ambiente
têm sido muito estudados (FORGACS et al., 2004). Em estudo realizado por Ryberg et al.
(2006) foi observado que o contato com corantes têxteis pode causar reações alérgicas, tais
como dermatites e ainda sinais atípicos como urticária e eritema multiforme.
Os corantes reativos (que incluem os azo corantes) são os mais utilizados no Brasil e
caracterizam-se por apresentarem grupos quimicamente ativos capazes de reagir
covalentemente com celulose, porém esta reação é estendida às proteínas o que,
comprovadamente, resulta na reação com moléculas biologicamente importantes. Portanto,
resíduos destes corantes podem ser altamente nocivos quando presentes em qualquer
organismo vivo. Além disso, estes compostos na forma não hidrolisada apresentam alta
estabilidade hidrolítica em meio neutro, permitindo um longo tempo de vida destes compostos
em ambiente aquático (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Quanto à classificação de toxicidade, alguns corantes ácidos, básicos e azo corantes
têm sido identificados como tóxicos agudos para peixes, crustáceos, algas e bactérias
(OLLEGAARD apud NOVOTNÝ et al., 2006). A maioria dos corantes azo requer ativação
1. Introdução
8
metabólica, ou seja, redução e quebra da grupo azo em aminas aromáticas, para exibir
mutagenicidade em testes in vitro, em animais e humanos, deste modo é necessária a
avaliação destes corantes em relação aos efeitos nocivos à saúde humana (CHUNG &
CERNIGLIA, 1992; NOVOTNÝ et al., 2006).
Os efeitos genotóxicos, que causam dano ao DNA, de corantes têxteis, principalmente
no caso de alguns corantes do tipo azo, são discutidos e seu uso tem sido drasticamente
reduzido na Europa, com base na regulamentação nacional e no certificado de qualidade têxtil
(EU flower, Oeko-Tex Standard 100), mas ainda são um problema em países fora da Europa
(SCHNEIDER et al., 2004).
Compostos com potencial genotóxico podem resultar em dois processos celulares: o
processo de morte celular ou em um processo de reparo, caso o reparo seja correto não
ocasionará nenhum dano ao organismo, já se ocorrer um reparo incorreto resultará em uma
mutação que poderá ter como conseqüência doenças hereditárias, envelhecimento celular e/ou
ainda o câncer, ou seja, um composto genotóxico pode exibir mutagenicidade e
posteriormente levar a carcinogenicidade.
Visto que existe uma grande exposição do ambiente e da população a diferentes
compostos altamente tóxicos, há necessidade da realização de testes capazes de detectar
compostos genotóxicos e mutagênicos a fim de minimizar o potencial risco a saúde. Para
detectar compostos genotóxicos vêm sendo utilizado o Ensaio Cometa, também conhecido
como eletroforese em gel de célula única, e para a detecção de substâncias mutagênicas pode
ser aplicado o Teste de Ames, utilizando a bactéria Salmonella typhimurium, estes ensaios são
importantes, pois são utilizados de maneira preditiva.
Tsuda et al. (2000) observaram resposta genotóxica, utilizando o ensaio cometa, em 17
dos 24 azo corantes testados após a administração em camundongos. Outro tipo de corante,
verde malaquita (Verde Básico 4), um composto triarilmetano, foi avaliado em células de
ovário de hamster, e apresentou danos ao DNA deste animal (FESSARD et al., 1999;
SCHNEIDER et al., 2004).
Em estudo realizado por Novotný et al. (2006) foi observado que o corante azo
Laranja Reativo 16 apresentou efeito mutagênico e em outro estudo Jäger et al. (2004)
observaram que dos 53 corantes testados 15 foram positivos no Teste de Ames, incluindo azo
corantes e antraquinonas.
Os azo corantes Vermelho Direto 28, Azul Direto 6, Marrom Direto 95 e Preto Direto
28 foram administrados em macaco do gênero Rhesus, e após a ingestão dos corantes foram
1. Introdução
9
detectadas benzidina e monoacetilbenzidina como metabólitos na urina (RINDE & TROLL,
1975 apud HUNGER, 2003). Outro estudo com o azo corante Resacor azul 2F (azul Direto
15) demonstrou que após a metabolização deste por azoredutases presentes em células do
fígado, em bactérias intestinais e na microbiota presente na superfície da pele, foi liberada a
3,3´-dimetoxibenzidina (HILDENBRAND et al., 1999). As benzidinas, entre outras aminas
aromáticas, são conhecidas como potentes carcinógenos em humanos (CHUNG et al., 2006).
Outros tipos de corantes, como antraquinonas, ftalocianinas entre outros, também vêm
sendo investigados quanto à toxicidade. No entanto, ainda são escassas as informações
disponíveis sobre a toxicidade destes corantes. O Teste de Ames tem sido utilizado para
avaliar efeitos mutagênicos de alguns corantes antraquinonas, como no caso do Azul
Dispersivo 3 que apresentou efeitos mutagênicos (NOVOTNÝ et al., 2006). Já em outro
estudo o derivado do antraquinona Azul Dipersivo 1 foi descrito como agente indutor de
tumor de bexiga em ratos (TAMARO et al.,1975; NOVOTNÝ et al.
, 2006).
O câncer de bexiga é o 11° câncer mais comum, contabilizando de 3-4% de todos as
doenças. O primeiro câncer de bexiga descrito em humanos foi pela exposição ocupacional às
aminas aromáticas arilaminas, incluindo 2-naftilamina, 4-aminobifenil, e benzidinas,
principalmente em trabalhadores de indústria têxtil (YU et al., 2002).
Para pessoas que trabalham no processo de manufatura dos corantes azo e
consumidores, existe o risco destes corantes serem incorporados por inalação, digestão ou
contato dérmico e em seguida poderem ser metabolizados pelo organismo, possibilitando
mecanismos genotóxicos e a formação de câncer (HILDENBRAND et al., 1999).
1.4. Tratamento de efluentes
A remoção de corantes tem sido um objeto de grande atenção nos últimos anos, não
somente por sua toxicidade, mas também por sua visibilidade quando liberados por efluentes.
Existe uma variedade de tratamentos químicos e físicos para os efluentes têxteis, no entanto
são altamente custosos e não muito eficientes, tornando-se comercialmente menos atraentes.
O tratamento biológico é uma alternativa de menor custo e ambientalmente mais aceitável
(BANAT et al., 1996).
Corantes sintéticos, como os corantes do tipo azo, caracterizados por apresentarem um
ou mais grupamentos -N=N- ligados a sistemas aromáticos que conferem grande resistência à
degradação natural, não são degradados uniformemente em tratamentos biológicos
convencionais. Sob condições anaeróbias os corantes do tipo azo são metabolizados
1. Introdução
10
resultando em aminas aromáticas, compostos tóxicos, mutagênicos e por vezes cancerígenos
(CHUNG & STEVENS JR., 1993; ROBINSON et al., 2001a; WEISBURGER, 2002).
Portanto, dentre os resíduos industriais, os corantes provenientes das indústrias têxteis
são os mais difíceis de serem tratados. Os corantes são detectáveis pelo olho humano, mesmo
em concentrações de 1 mg L
-1
, e especificamente, no caso de corantes reativos a concentração
mínima detectável é da ordem de 5µg L
-1
(GUARATINI & ZANONI, 2000). Alguns corantes
podem ser ainda acumulados por plantas expostas a efluentes da indústria têxtil e
conseqüentemente passar pela cadeia alimentar, contaminando outros organismos, incluindo o
homem (ZANONI & CARNEIRO, 2001). Há, portanto, uma procura por agentes biológicos
não só capazes de degradarem o efluente têxtil de forma mais eficiente, mas também de
reduzirem sua toxicidade.
A legislação ambiental, cada vez mais rigorosa, está obrigando que os efluentes
industriais sejam tratados antes do descarte, para evitar problemas ecológicos e toxicológicos
sérios (PASCHOAL & TREMILIOSI-FILHO, 2005). Deste modo uma grande diversidade de
tratamentos químicos, físicos e biológicos para efluentes têxteis tem sido desenvolvida para a
remoção de cor de águas e para reduzir o impacto sobre o ambiente e à saúde humana.
As tecnologias envolvem adsorção em matrizes orgânicas e inorgânicas, descoloração
por fotocatálise e/ou processos oxidativos, decomposição enzimática, entre outras
(FORGACS et al., 2004). O emprego de métodos biológicos e químicos combinados no
tratamento de efluentes também tem mostrado grande eficiência. Porém o tratamento
biológico é o mais utilizado pela indústria têxtil (PASCHOAL & TREMILIOSI-FILHO,
2005).
1.4.1. Tratamento químico O tratamento químico por floculação é geralmente o
mais eficiente e o mais robusto na remoção da cor. O processo envolve adição de
um agente floculante, tais como íon férrico (Fe
3+
) e alumínio (Al
3+
), no efluente
que induz a floculação. Um coagulante pode também ser adicionado para auxiliar
o processo. O produto final é um lodo concentrado (SELCUK, 2005;
PASCHOAL & TREMILIOSI-FILHO, 2005). Outro método para tratamento
destes efluentes é a oxidação química, este procedimento utiliza agentes
oxidantes como ozônio, peróxido de hidrogênio ou permanganato de sódio para
forçar a degradação de moléculas orgânicas mais resistentes. Entretanto, estes
tratamentos são muito caros e possuem escala limitada (HUNGER, 2003). No
caso do tratamento por ozônio, um inconveniente muitas vezes encontrado nos
1. Introdução
11
estudos de degradação refere-se ao aumento da toxicidade devido à produção de
alguns intermediários da reação (SELCUK, 2005).
1.4.2. Tratamento físico Dentre os processos físicos mais utilizados no
tratamento de efluentes têxteis, a remoção de cor por adsorção em carbono
ativado vem sendo intensamente estudada. O carbono ativado é muito efetivo na
remoção de baixas concentrações de substâncias químicas solúveis, incluindo
corantes. Seu principal problema é sua capacidade limitada, pois permite a
remoção de cor apenas a partir do efluente diluído (HUNGER, 2003).
Recentemente o estudo de alguns agentes alternativos utilizando-se de biomassa
como adsorvente também tem despertado a atenção. A utilização de tecnologias
de membranas, como osmose reversa, microfiltração, nanofiltração e
ultrafiltração têm se tornado muito atrativa por possibilitarem a reutilização da
água no processo industrial. Por outro lado, envolvem custo muito elevado
(KUNZ et al., 2002).
1.4.3. Tratamento biológico Há dois tipos de tratamento biológico, o aeróbio
(ÖZTÜRK & ABDULLAH, 2006) e o anaeróbio (MANU & CHAUDHARI,
2002). O tratamento biológico é a técnica mais comum utilizada no tratamento de
efluentes, tem sido utilizada por mais de 150 anos. O lodo ativado é um processo
essencialmente aeróbio que oxida a matéria orgânica a CO
2
, H
2
O, NH
4
. O ar é
provido por aeração mecânica ou por um difusor. Uma característica importante
do lodo ativado é a recirculação de uma grande proporção da biomassa. Essa
prática ajuda a manter um elevado número de microrganismos que efetivamente
oxidam compostos orgânicos em um tempo relativamente curto. Entretanto, a
quantidade de lodo formada é muito alta, sendo uma séria desvantagem desse
método. No caso de efluentes têxteis, os corantes não são removidos
completamente, apenas em torno de 10-20%, portanto este método tradicional
não é eficiente na remoção de cor (HUNGER, 2003; DURÁN, 2004). Nos
últimos anos, os fungos têm sido intensamente estudados para o tratamento de
vários tipos de corantes liberados por efluentes (SANTOS et al., 2004). Fungos
são capazes de metabolizar uma diversidade de compostos presentes em
efluentes (KIRBY et al., 2000). Os basidiomicetos tais como os gêneros
Lentinula, Trametes, Pleurotus, Phanerochaete, entre outros, são capazes de
degradar diversos poluentes, além de serem eficientes na redução da toxicidade
do efluente (DELLAMATRICE et al., 2005).
1. Introdução
12
As rotinas de remediação tipicamente utilizadas pela indústria têxtil de pequeno porte
envolvem processos de coagulação química, adsorção em carbono ativado e, menos
freqüentemente, processos de ultrafiltração. Em indústrias de maior porte, os processos
biológicos, principalmente sistema de lodos ativados, são utilizados preferencialmente
(KUNZ et al., 2002).
1.5. Biorremediação
A contaminação de solos, sedimentos, águas subterrâneas e superficiais e ar por
compostos orgânicos tóxicos tornou-se um dos maiores problemas enfrentados pelo mundo
industrializado de hoje. As áreas contaminadas geralmente estão impactadas por uma mistura
de poluentes. Uma estratégia alternativa para contornar este problema de contaminação é a
biorremediação (da SILVA & ESPOSITO, 2004).
A biorremediação é definida como um processo tecnológico pelo qual sistemas
biológicos são utilizados para tratar a poluição e restaurar a qualidade ambiental, reduzindo a
concentração dos poluentes a níveis considerados seguros, por meio da degradação destes
compostos. Os sistemas biológicos mais utilizados na biorremediação são os microbiológicos,
principalmente bactérias, fungos filamentosos e leveduras (da SILVA & ESPOSITO, 2004).
A biorremediação pode ser aplicada in situ, sem a remoção da matriz contaminada, ou
ex situ, pela remoção da matriz. As tecnologias in-situ incluem bioestimulação, ou seja,
adição de nutrientes que aumenta a atividade microbiana nativa; bioaumentação, que ocorre
com adição de linhagens microbianas exógenas degradadoras. Estas duas tecnologias ainda
podem ser mais eficientes com a adição de surfactantes, que auxilia a metabolização dos
compostos poluentes, facilitando o transporte destes substratos orgânicos para o interior das
células microbianas ou diminuindo as interações superficiais contaminante/solo; a adição de
enzimas comerciais, que favorecem a oxidação de moléculas de difícil degradação em
moléculas de fácil assimilação pelos microrganismos; e a bioventilação. Estas tecnologias
possuem um baixo custo relativo quando comparadas às tecnologias ex-situ como
“landfarming”, biopilhas e biorreatores (ALEXANDER, 1999).
Nos últimos anos a degradação de poluentes, incluindo corantes, por fungos vêm sendo
avaliada com resultados muito promissores. Portanto, estes organismos podem ser aplicados
na biorremediação de efluentes (SINGH, 2006).
1. Introdução
13
1.6. Fungos com potencial de degradação de poluentes
Vem sendo investigada a capacidade de diversos fungos metabolizarem diferentes
tipos de poluentes. No ambiente, os fungos são responsáveis pela maioria das transformações
que caracterizam as ciclagens de matéria orgânica. A capacidade dos fungos de adaptar
rapidamente o seu metabolismo a diferentes fontes de carbono e energia é um fator essencial
para a sua sobrevivência. Essa flexibilidade metabólica se deve à produção de uma grande
quantidade de enzimas intra e extracelulares, não específicas, capazes de degradar polímeros
de origem vegetal, assim como uma grande variedade de outras moléculas orgânicas, tanto de
alta, quanto de baixa massa molar (da SILVA & ESPOSITO, 2004). Graças a essas enzimas
com grande capacidade catalítica e o fato de possuírem hifas que penetram o substrato,
alcançando mais facilmente os poluentes, os fungos se apresentam como agentes eficientes na
degradação de moléculas complexas e também na biorremediação (WAINWRIGHT, 1992;
GRAVESEN et al., 1994).
A degradação de moléculas complexas por fungos é através de dois sistemas
enzimáticos, um extracelular, envolvendo enzimas ligninolíticas e outra intracelular,
envolvendo o sistema enzimático citocromo P-450 monoxigenase e a epóxido hidrolase
(ATLAS & CERNIGLIA, 1995). Também já foram observadas enzimas hidrolíticas como:
amilases, glicoamilases, lipases, pectinases e proteases envolvidas em processos de
biodegradação de biopolímeros relativamente simples pelos fungos (BENNET et al., 2002).
Fungos ligninolíticos, fungos que apresentam enzimas ligninolíticas e que geralmente
são da classe dos basidiomicetos, têm sido amplamente estudados quanto ao seu potencial de
degradar uma diversidade de compostos tóxicos, incluindo corantes empregados na indústria
têxtil (KIRBY et al., 2000; MINUSSI et al., 2001; NOVOTNÝ et al., 2001; MARTINS et al.,
2002; HARAZONO & NAKAMURA, 2005; ÖZSOY et al., 2005). A utilização destes fungos
no tratamento de poluentes ocorre especialmente por apresentarem mecanismos não
específicos na degradação de lignina, um polímero natural que apresenta estrutura aromática
complexa de difícil degradação, pela produção de enzimas como manganês peroxidase, lacase
e lignina peroxidase (BENNET et al., 2002).
Fungos ligninolíticos como Lentinula edodes (SANTOS et al., 2004; BOER et al.,
2004), Trametes versicolor (HEINFLING et al., 1997) e Phanerochaete chrysosporium
(CONNEELY et al., 1999) demonstraram grande potencial de degradar vários tipos de
corantes, que pode ser atribuída não somente às suas enzimas extracelulares, mas também à
presença de sideróforos, quelantes específicos com alta afinidade por metais, os quais formam
1. Introdução
14
complexos altamente estáveis, e citocromo P-450. Já foi constatada a produção de sideróforos
durante a descoloração de efluente têxtil por L. edodes (da SILVA & ESPOSITO, 2004).
L. edodes é um cogumelo asiático sendo o 2° cogumelo mais popular no mundo,
conhecido como shiitake. Este fungo é eficiente na produção de manganês peroxidase e
lacase, enzimas que mineralizam uma grande variedade de xenobióticos como
hidrocarbonetos, bifenilas, pesticidas organoclorados, pentaclorofenol (HAVATNI & MÉCS,
2003) e ainda corantes industriais (SANTOS et al., 2004).
Degradação de substâncias húmicas por fungos também vem sendo estudada por se
tratarem de substâncias semelhantes aos compostos aromáticos, apresentando estruturas mais
complexas e condensadas do que a lignina (GRAMSS et al., 1999). Portanto, fungos com
capacidade de degradar ácidos húmicos apresentam alto potencial na degradação de outros
compostos aromáticos, que fazem parte da estrutura química de diversos poluentes, incluindo
dos corantes têxteis. Nos últimos anos tem se destacado o tratamento de efluentes industriais
têxteis por meio de degradação biológica, mais especificamente na remoção de cor destes
efluentes por fungos (DIAS et al., 2003).
A eficiência de fungos não basidiomicetos, cujo sistema enzimático envolvido na
degradação de poluentes é, em muitos casos, intracelular, têm sido menos avaliada. Entretanto
alguns pesquisadores vêm obtendo resultados promissores com estes fungos (KIM &
SHODA, 1999; CHA et al., 2001). Fungos como
Aspergillus fumigatus (JIN et al., 2007),
Umbelopsis isabellina e Penicillium geastrivorus (YANG et al., 2003) têm demonstrado
capacidade de descolorir corantes. Em estudo realizado por Ambrósio & Campos-Takaki
(2004) Cunninghamella elegans apresentou capacidade de descolorir 3 corantes distintos. Em
outro estudo,
Funalia troggi foi capaz de descolorir até 98% de 2 corantes (ÖZOY et al.,
2005).
Em estudos de biodegradação de corantes, além do desaparecimento destes
compostos, também devem ser monitorados outros parâmetros que demonstrem a redução de
toxicidade após o tratamento fúngico, visto que o metabolismo envolvido nos processos de
biodegradação pode, às vezes, resultar na formação de metabólitos tóxicos (LEVIN et al.,
2004). A toxicidade de corantes do tipo azo e ftalocianina foi extensivamente reduzida após
degradação pelos fungos ligninolíticos
Trametes versicolor e Bjerkandera adusta
(HEINFLING et al., 1997). Apesar da comprovada eficiência da aplicação de fungos nos
tratamentos de efluentes, esta é ainda subestimada na prática (COULIBALY et al., 2003).
Este fato, possivelmente, seja devido ao menor número de estudos comprovando a eficiência
dos fungos em biodegradação comparativamente aos estudos envolvendo bactérias.
1. Introdução
15
Com base nestes estudos e pelo fato dos fungos filamentosos serem capazes de
mineralizar poluentes, transformando-os em CO
2
, H
2
O e biomassa através de seu sistema
enzimático não específico e altamente oxidativo, além de possuírem hifas que os capacitam a
penetrar o solo eficientemente, a sua utilização no processo de biorremediação de áreas
contaminadas por corantes têxteis é uma alternativa muito promissora (TOH et al., 2003;
BOER et al., 2004; SANTOS et al., 2004).
A grande descarga de efluentes têxteis no ambiente e, conseqüentemente, maiores
preocupações pelos órgãos de regulação que exigem tratamentos mais eficientes, fez crescer a
busca por tratamentos biológicos alternativos, tais como a biorremediação utilizando fungos.
Assim, fungos do acervo da Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS, amostras
de fungos provenientes de sedimento e seus isolados foram investigados quanto a sua
capacidade de descolorir meios na presença de corantes do tipo azo e ftalocianina de cobre,
intensamente utilizados nos processos de tingimento pela indústria têxtil brasileira, além de
avaliar a toxicidade do produto final obtido após os tratamentos, aliando-se desta forma os
estudos microbiológicos aos estudos toxicológicos.
16
2
2
.
.
O
O
b
b
j
j
e
e
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t
i
i
v
v
o
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s
s
2. Objetivos
17
2. OBJETIVOS
Estudar a capacidade de amostras de sedimentos de igarapés na região de Manaus (AM), seus
isolados e ainda dos fungos filamentosos da Coleção de Microrganismos de Referência do
INCQS na descoloração de corantes provenientes da indústria têxtil e avaliar a toxicidade
antes e após os tratamentos fúngicos.
2.1. Objetivos específicos
1. Avaliar o potencial de descoloração de amostras coletadas de sedimento, com alto teor de
ácido húmico das margens de igarapés, da região de Manaus (AM);
2. A partir das amostras de sedimento que se mostrarem positivas na descoloração dos
corantes em meio líquido, realizar o isolamento dos fungos;
3. Caracterizar morfologicamente e identificar os fungos filamentosos isolados das amostras
positivas;
4. Avaliar a capacidade dos fungos isolados de sedimento de Manaus (AM) e de Psilocybe sp.
INCQS 40212, Penicillium simplicissimum INCQS 40211 e Ceriporiopsis sp. INCQS 40260,
comparativamente ao fungo filamentoso de referência Lentinula edodes INCQS 40220 (CCT
4519), depositados na Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS, de descolorir os
corantes em meio líquido;
5. Realizar avaliação toxicológica do meio líquido, com o microcrustáceo Daphnia pulex,
após tratamento por Lentinula edodes e com os demais fungos filamentosos que
demonstrarem eficiência na descoloração dos corantes;
6. Selecionar os fungos das amostras de sedimento e da Coleção de Microrganismos de
Referência do INCQS com melhor capacidade de descoloração e detoxificação;
7. Avaliar a capacidade dos fungos selecionados em descolorir outros tipos de corantes e a
mistura de 3 corantes;
8. Realizar avaliação toxicológica com o microcrustáceo Daphnia pulex, a genotoxicidade
com sangue periférico humano e a mutagenicidade com bactérias, após o tratamento dos
corantes pelos fungos selecionados e por Lentinula edodes;
18
3
3
.
.
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M
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3. Materiais e Métodos
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi desenvolvido no Departamento de Microbiologia (INCQS), no Setor de
Fungos de Referência chefiado pela MSc. Marília M. Nishikawa, com colaboração do grupo
de pesquisa coordenado pela Dr
a
. Silvana do Couto Jacob do Departamento de Química
(INCQS) que realizou as coletas de sedimento de igarapés em Manaus (AM); do Setor de
Ensaios Toxicológicos chefiado pela Dr
a
. Helena Zamith do Departamento de Farmacologia e
Toxicologia (INCQS) que auxiliou na realização do Ensaio Cometa; do grupo de pesquisa
coordenado pelo Dr. Israel Felzenszwalb do Departamento de Biofísica e Biometria do
Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (UERJ) que auxiliou na realização do teste de
Ames; e do Departamento de Biologia (IOC) onde foram realizados os ensaios
ecotoxicológicos utilizando o microcrustáceo Daphnia pulex pela MSc. Danielly de Paiva
Magalhães.
3.1. Reagentes Químicos
Foram preparadas soluções estoques de 3 corantes, o corante azo Remazol Vermelho
RB (DyStar, Suzano, SP, Brasil), também conhecido como Vermelho Reativo 198 (V198); a
ftalocianina Remazol Azul Turquesa (DyStar, Suzano, SP, Brasil), também conhecida como
Azul Reativo 21 (A21); o corante azo Azul Marinho Drimarene X-GN 150 (doado pelo
Instituto Nacional de Tecnologia - INT, Rio de Janeiro, RJ), também conhecido como Azul
Reativo 214 (A214) (Figura 1), dissolvendo-os em água destilada estéril e filtrando-os em
membrana 0,22 μm. Estes corantes foram escolhidos como representantes de corantes
comercialmente usados pela indústria têxtil, além da mistura dos 3 corantes (MXC)
adicionando proporcionalmente cada um dos corantes solubilizados anteriormente ao meio de
cultura. As informações referentes aos corantes estão descritas na Tabela 1.
Figura 1: Estrutura química dos corantes estudados: A – Vermelho Reativo 198; B – Azul
Reativo 21; C – Azul Reativo 214.
C
3. Materiais e Métodos
20
Tabela 1: Informações referentes aos corantes utilizados neste estudo.
Nome no C.I. Nome comercial Abreviação C.I.
N°
CAS
Classificação
do corante
λ
max
(nm)
Vermelho Reativo
198
Remazol Vermelho RB V198 18221
145017-
98-8
Monoazo 520
Azul Reativo
21
Remazol Azul Turquesa
G 133%
A21 ND
131257-
19-1
Ftalocianina
de cobre
675
Azul Reativo
214
Azul marinho Drimarene
X-GN 150
A214 ND
141255-
32-5
Diazo 608
- -
MXC
- -
Mistura dos
corantes
620
Nota: C.I. – Colour Index; λ
max
- Espectro máximo de absorbância; ND – Não disponível; N° CAS (sigla em
inglês) – Número de registro no Serviço de Resumo Químico;
3.2. Meios de culturas e soluções
3.2.1. Isolamento e ensaio de descoloração
Para isolamento e purificação de fungos coletados de sedimento dos igarapés da
Região de Manaus foi usado Caldo Sabouraud Dextrose (SDB) (1% de peptona e 4% de
dextrose) acrescido de cloranfenicol (400 mg/mL) como meio de enriquecimento, o meio
Caldo Batata Dextrose (PDB) (20% de caldo de batata e 2% de dextrose) e o meio Ágar
Batata Dextrose (PDA) (meio PDB acrescido de 2% de ágar) para o isolamento e pré-seleção
dos fungos com capacidade de descolorir corantes. Para o estudo de descoloração em meio
líquido pelos fungos selecionados e pelos fungos da Coleção de Microrganismos de
Referência do INCQS também foi usado PDB (KIM et al., 1995; ZHENG et al., 1999).
3.2.2. Identificação e manutenção dos fungos filamentosos isolados
Para identificação dos fungos filamentosos isolados de sedimentos foram utilizados os
meios Ágar Czapek Extrato de Levedura (CYA) (0,1% de K
2
HPO
4
, 1% de concentrado de
Czapek extrato de malte, 0,5% de extrato de levedura, 3% de sacarose e 1,5% de ágar), Ágar
Extrato de Malte e Peptona (MEA) (2% de extrato de malte, 0,1% de peptona e 2% de glicose
e 2% de ágar), Ágar Czapek Dox (CZ) (1% de concentrado de Czapek extrato de malte, 0,1%
de K
2
HPO
4
, 3% de sacarose, 1,75% Ágar) e Ágar Czapek extrato de levedura com 20% de
sacarose (CY20S) (0,1% de K
2
HPO
4,
1% de concentrado de Czapek extrato de malte, 5% de
3. Materiais e Métodos
21
extrato de levedura, 2% de sacarose e 1,5% de Ágar) (KLICH, 2002). Os meios Ágar Extrato
de Malte e Peptona (MEA) e Ágar Czapek Extrato de Levedura (CYA) também foram
utilizados para manutenção dos fungos filamentosos.
3.2.3. Ensaio de citotoxicidade utilizando células sanguíneas e Ensaio Cometa
Para o ensaio de citotoxicidade com sangue total humano foi utilizada a solução de
0,6% de brometo de etídio (BrEt) e 4% de diacetato de fluoresceína (FDA) dissolvidos em
95,4% de PBS (83,8% de NaCl, 2,1% de KCl, 12% de Na
2
HPO
4
e 2,1% de KH
2
PO
4
) pH 7,4
para análise da viabilidade das células em microscópio de fluorescência.
Para fixação nas lâminas, no Ensaio Cometa, foi utilizado agarose em ponto de fusão
normal (PFN) à 1,5%, na segunda camada de agarose foi usado agarose em baixo ponto de
fusão (BPF) à 0,5%. No Ensaio Cometa foi utilizado solução de lise (solução 1: 79,3% de
cloreto de sódio, 20,1% de EDTA dissódico, 0,6% de Tris; solução 2: 1% de Triton X 100 e
10% de DMSO), para a eletroforese foi utilizada a solução tampão alcalino (2,9% de NaOH e
0,5% de EDTA dissódico). Após a corrida foi utilizada a solução de tampão de neutralização
(48,5% de Tris) e para fixação das lâminas foi utilizado etanol (99,5%).
3.2.4. Ensaio de citotoxicidade utilizando bactérias e Teste de Ames
Para realização do ensaio de citotoxicidade utilizando bactérias de Salmonella
typhimurium foi usado o meio Louria Bertani (LB) líquido (1% de bacto triptona, 0,5% de
bacto extrato de levedura e 1% de NaCl) para obtenção da cultura de bactérias. Para
realização do ensaio foi utilizado o meio LB sólido, ou seja, LB líquido acrescido de 1,5% de
ágar, ambos os meios foram ajustados para pH 7. Para a realização das diluições das bactérias
foi usado tampão fosfato de sódio 0,2M (TFS) (0,3% de NaH
2
PO
4
e 4,3% de Na
2
HPO
4
) em
pH 7,4.
No teste de Ames os meios foram preparados de acordo com MARON & AMES
(1983). Foram preparados top ágar (gelose) (0,7% de ágar e 0,5% de NaCl) para adição em
meio mínimo glicosado que é composto por 1,5% de ágar, 2% de sais de Vogel-Bonner (VB)
50X (1% de MgSO
4
, 10% de ácido cítrico monohidratado, 51% de K
2
HPO
4
e 18% de
NaHNH
4
PO
4
) e 5% de glicose. Em ambos os ensaios foi utilizado 0,5 mM de histidina-biotina
(HB) misturados ao top ágar, na proporção de 10:1.
Foi utilizado o liófilo da fração S9 adquirida do laboratório Molecular Toxicology Inc.
(MOLTOX
TM
, USA), preparada a partir de fígado de ratos pré-induzidos por bifenil-
policlorinato (Aroclor 1254), um indutor para a produção de enzimas microssomais CYP
3. Materiais e Métodos
22
(citocromos oxidases). Esta fração revela se a amostra teste ao ser metabolizada apresenta
efeito mutagênico. Foi preparado 4% da fração liofilizada ao qual foi acrescido de 2% da
solução de sais (4M MgCl
2
e 0,4 M KCl), 0,5% de glicose-6P, 4% de NADP, 50% de tampão
fosfato e 39,5% de água destilada, todos mantidos em gelo durante o experimento. Para os
testes sem ativação metabólica, ou seja, na ausência da fração S9, foi utilizado TFS.
3.3. Seleção de fungos de sedimento de igarapés em Manaus (AM) e da Coleção
de Microrganismos de Referência do INCQS eficientes na descoloração de
corante.
3.3.1. Seleção das amostras de sedimento de igarapés com capacidade de
descolorir corantes.
Amostras de sedimento foram coletadas de quatro pontos da margem de igarapés na
região de Manaus: dois na Reserva Ducke (Reserva do IMPA), denominados de Igarapé da
Reserva Ducke N (IDN) e Igarapé da Reserva Ducke Bolívia (IDB), outro também na Reserva
Ducke, chamado de Igarapé de Acará (IA), e o quarto, fora da Reserva Ducke, no Igarapé de
Ramal Água Branca (IR), todos livres de impactos ambientais. Os dados e as características
físico-químicas referentes aos pontos de coleta estão apresentados na Tabela 2. A partir de
cada amostra, foram tomados 30 g de sedimento e dissolvidos em 270 mL de água estéril.
Depois de homogeneizado em liquidificador por 5 minutos, 2 mL da mistura foram
inoculados em 400 mL de meio de enriquecimento SDB acrescido de cloranfenicol (400
ppm), que foi incubado por 5 dias a 28C em agitação de 140 rpm. Após incubação, foram
transferidos 3 mL da cultura para 100 mL de meio PDB complementado com 100 e 200 ppm
dos corantes V198 e A21, separadamente (KIM et al., 1995; KIRBY et al., 2000; ROBINSON
et al., 2001b). Em seguida, foram incubados por 7 dias a 28C, em agitação de 140 rpm e
realizada a leitura em espectrofotômetro. Experimentos controle foram realizados incubando o
meio PDB, sem fungo, com as mesmas concentrações testadas dos dois corantes (Figura 2).
Os ensaios foram realizados em duplicata e ao abrigo da luz.
3. Materiais e Métodos
23
Tabela 2: Dados e características físico-químicas referentes aos pontos de coleta da região de
Manaus.
GPS
Pontos de
coleta
Data da
coleta
Características
do local
pH
Temperatura
da água (ºC)
Profundidade
(cm)
O
2
dissolvido
(mg/mL)
S W
Código
Igarapé da
Reserva
Ducke N–S
3 L-O 7
01/03/2005 Água limpa ND ND ND ND 02°58′42,6′′ 59°56′34,9′′ IDN
Igarapé da
Reserva
Ducke ponto
Bolívia
01/03/2005 Água limpa 4,3 25,4 22 4,28 02°59′28,5′′ 59°56′29,0′′ IDB
Igarapé de
Ramal Água
Branca
28/02/2005 Água limpa,
presença de
peixe e
camarão. Zona
de Malária
4,4 25,4 44 5,63 02°54
′07,4′′ 59°54′25,2′′ IR
Igarapé de
Acará
02/03/2005 Água limpa ND ND ND ND 02°56′41,0′′ 59°57′28,9′′ IA
ND: não determinado.
Figura 2: Esquema de processamento das amostras de sedimento de igarapés em Manaus-AM.
30 g de sedimento
em 270 mL de H
2
O
Homogenização em
liquidificador
Inoculação de 2mL
da mistura em SDB
+ 400 ppm de
cloranfenicol
5 dias de incubação em
agitação 140 rpm/28°C
Inoculação de 3mL
da cultura em PDB +
100 e 200 ppm dos
corantes
7 dias de incubação
em agitação 140
rpm/28°C
Leitura em
espectrofôtometro
3. Materiais e Métodos
24
3.3.2. Isolamento dos fungos do sedimento de igarapés
Das culturas que apresentaram descoloração visível a olho desarmado e por
espectrofotometria (análise descrita no item 3.4.2.), em comparação com os controles, foram
utilizados 0,2 mL para inocular meio sólido PDA, contendo 200 ppm de corante, que foram
incubados a 28C por 7 dias. As colônias que se desenvolveram foram isoladas, purificadas e
inoculadas em MEA e CYA (Figura 3) (YANG et al., 2003). Os ensaios foram realizados em
duplicata e ao abrigo da luz.
Figura 3: Esquema do isolamento dos fungos de sedimento.
3.3.2.1. Caracterização morfológica e identificação dos fungos isolados
A morfologia dos fungos filamentosos isolados foi examinada macroscopicamente
através de observação das colônias, e microscopicamente através do preparo de lâminas
coradas com lactofenol e azul de algodão, com exame em microscópio ótico Olympus BH-2.
Com base nestas observações e seguindo critérios determinados pela literatura pertinente, os
fungos foram identificados, quando possível, ao nível de espécie.
3.4. Seleção de fungos isolados de sedimento de igarapés em Manaus e da Coleção
de Microrganismos de Referência do INCQS com capacidade de descolorir em
meio líquido
Os fungos filamentosos isolados de sedimento (item 3.3.2.), juntamente com os fungos
da Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS, Lentinula edodes INCQS 40220
(CCT 4519), fungo de referência, e os fungos Ceriporiopsis sp. INCQS 40260 (CCT 6629),
Penicillium simplicissimum INCQS 40211 (CCT 6686) e Psilocybe sp. INCQS 40212 (CCT
6614), fungos anteriormente isolados de sedimento estuarino contaminado por diferentes
poluentes industriais, como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, e que apresentaram
capacidade de degradar pireno (da SILVA et al., 2003a), foram cultivados em PDA
adicionado de 200 ppm do corante V198 ou A21 e incubados por 5 dias a 28C. Destas
Meio
descolorido
Inoculação
em PDA +
corante
0,2 mL
Inoculação
em MEA e
CYA
Isolamento das colônias
durante 7 dias de
incubação à 28° C
3. Materiais e Métodos
25
culturas foram retirados 3 discos de 5 mm de diâmetro da periferia da colônia e usados para
inocular 50 mL de meio PDB em frascos Erlenmeyer de 125 mL. Os frascos inoculados foram
incubados por 2 dias a 28C sob agitação de 140 rpm (HEINFLING-WEIDTMANN et al.,
2001; MÁXIMO et al., 2003). Após este período foi adicionado 100 ppm do corante ao meio
líquido. As culturas continuaram sendo incubadas nas mesmas condições anteriores por mais
28 dias. Todos os ensaios foram realizados em duplicata e ao abrigo da luz. O meio de cultura
com corante, mas sem fungo foi utilizado como controle (da SILVA et al., 2003b). A partir
deste experimento foram selecionados os fungos a serem testados com os demais corantes e
para a realização de todos os testes toxicológicos.
3.4.1. Estudo da descoloração de corantes em meio líquido pelos fungos
selecionados
Os fungos selecionados a partir do experimento realizado no item 3.4. foram
cultivados em PDA adicionado de 200 ppm dos corantes, V198, A21, A214 e MXC, e
incubados por 5 dias a 28
C. Destas culturas foram retirados 9 discos de 5 mm de diâmetro da
periferia da colônia e usados para inocular 150 mL de meio PDB em frascos Erlenmeyer de
250 mL. Os frascos inoculados foram incubados por 2 dias a 28C sob agitação de 140 rpm
(HEINFLING-WEIDTMANN et al., 2001; MÁXIMO et al., 2003). Após este período foi
adicionado 100 ppm dos corantes ao meio líquido. As culturas continuaram sendo incubadas
nas mesmas condições anteriores por mais 14 dias e realizada leitura em espectrofotômetro,
sendo analisado o pico característico dos corantes testados (Tabela 1). Todos os ensaios foram
realizados em triplicata e ao abrigo da luz. O meio de cultura com corante, mas sem fungo foi
utilizado como controle (da SILVA et al., 2003b).
3.4.2. Determinação da descoloração dos corantes
O nível de descoloração obtido nos frascos provenientes das culturas de sedimento e
inoculadas em meio PDB (item 3.3.1) foram analisadas nos tempos 2, 4 e 7 dias após a adição
dos corantes. Para os fungos filamentosos selecionados no item 3.4. e os da Coleção de
Microrganismos de Referência do INCQS o nível de descoloração foi analisado por 28 dias
nos tempos: 0, 2, 5, 7, 14, 16, 19, 21 e 28 dias (MARTINS et al., 2002). Para os fungos
selecionados como mais eficientes na descoloração dos corantes (item 3.4.1.), o nível de
descoloração foi analisado por 14 dias nos tempos: 0, 2, 5, 7 e 14 dias (ARORA &
CHANDER, 2004). Durante todo o experimento foram utilizados frascos controle contendo o
meio de cultura com corante e sem inóculo e o meio sem corante e sem inóculo que foi
utilizado como branco. O sobrenadante do cultivo de Lentinula edodes INCQS 40220 foi
utilizado como controle positivo.
3. Materiais e Métodos
26
Deste modo, a partir das culturas testadas foram retirados 2 mL e transferidos para
tubos tipo Eppendorf
que foram em seguida centrifugados a 10000rpm/10min/4ºC, 0,5 mL
do sobrenadante foi diluído 10 vezes em água purificada para a análise em espectrofotômetro
(Shimadzu – UV-1601, Japão). Os espectros foram lidos entre 200 e 700 nm com a
absorbância de 0,00A à 1,00A. Com base nestes resultados o percentual de descoloração foi
calculado de acordo com a fórmula: Ab-Aa/Ab*100, sendo Ab o máximo de Absorbância
antes da descoloração e Aa o máximo de absorbância após a descoloração. As absorbâncias
analisadas foram as dos picos característicos referentes a cada corante (Tabela 1) (ÖZSOY et
al., 2005).
Através do espectro de absorção do corante também foram confirmados estes
resultados: quando ocorre degradação do corante, o pico característico do corante desaparece
e nos casos de adsorção pelo micélio, o pico característico apenas diminui (GLENN &
GOLD, 1983). Os demais espectros obtidos na faixa de 200 à 700 nm foram analisados com
relação a transformação do corante (JUNGHANNS et al., 2007), através do aparecimento de
novos picos, e a formação de compostos coloridos (COOKSON, 1995). Também foi
considerada a análise visual, pois a adsorção pode ser observada pela coloração da biomassa
(VITALI, 2005).
3.5. Avaliação Toxicológica do Meio de Cultura Pós-tratamento Fúngico
Os fungos considerados mais eficientes na descoloração foram avaliados quanto à
detoxificação utilizando o teste com o microcrustáceo Daphnia pulex. Subseqüentemente os
fungos que foram eficientes nesta etapa de avaliação toxicológica também foram avaliados
pelo Ensaio Cometa (Eletroforese em Gel de Célula Única) (ENSAIO COMETA, 2007) e
pelo Teste de Ames com a bactéria Salmonella typhimurium (AMES et al., 1973; MARON &
AMES, 1983). No Quadro 1 estão descritos os princípios de cada teste utilizado.
Quadro 1: Princípio dos ensaios toxicológicos realizados no estudo.
Teste Toxicológico Bioindicador Princípio do teste
Toxicidade aguda Microcrustáceo Daphnia
pulex
Identifica substâncias com potencial tóxico
Ensaio Cometa ou eletroforese
em Gel de célula única
Sangue periférico total
humano
Identifica substâncias com potencial
genotóxico e danos em células individualizadas
Teste de Ames Bactéria
Salmonella
typhimurium
Identifica substâncias mutagênicas
3. Materiais e Métodos
27
3.5.1. Avaliação de toxicidade com o microcrustáceo Daphnia pulex
As Daphnias spp. pertencem ao filo Arthropoda, classe Crustácea, e ordem Cladocera,
este microcrustáceo planctônico atua como consumidor primário na cadeia alimentar aquática
e se alimenta através de filtração da matéria orgânica suspensa. Dentre os microcrustáceos as
daphnias são conhecidas como pulgas d’água (RUPPERT & BARNES, 1996).
O cultivo destes organismos depende essencialmente da água e do alimento utilizado.
A água deve propiciar aos organismos sobrevivência e reprodução. Neste estudo foi utilizado
para desenvolvimento das daphnias a água Minalba® e para alimentá-las foi utilizada a alga
Scenedesmus subspicatus. As culturas foram mantidas em temperatura controlada 24ºC ±2 por
24h, as fêmeas se reproduzem por partenogênese, o que garante que os indivíduos são clones
um do outro, cada lote produz em torno de 15 a 20 indivíduos, exclusivamente fêmeas.
Deste modo, para a realização do teste da toxicidade resultante após a descoloração
dos corantes pelos fungos mais eficientes, foi primeiramente avaliado pelo ensaio
ecotoxicológico utilizando o microcrustáceo
Daphnia pulex seguindo o protocolo da NBR
12713 (ABNT, 2004).
Antes da realização do experimento foram medidas as grandezas que influenciam na
sobrevivência das daphnias, tais como pH e oxigênio dissolvido (OD).
No momento da análise, a água de diluição (Minalba®) foi oxigenada até atingir 100%
de saturação com o objetivo de minimizar o efeito das amostras com características de
redução do oxigênio dissolvido (OD). O valor mínimo de OD nos experimentos para ser
validado foi de 2 mg/mL. As daphnias vivem em meio com pH entre 7,0 e 8,0, assim as
amostras com pH ácido ou básico foram ajustadas para pH neutro, através da adição de HCl
1N, para amostras básicas, e NaOH 1N, para amostras ácidas.
Para realização do teste foram utilizados 20 neonatos de Daphnia pulex com 24 horas
de vida, divididos em duas réplicas de 10 indivíduos por concentração-teste. O tempo de
exposição foi de 24 horas sob temperatura constante de 24
o
C ao abrigo da luz. O método
utilizado foi o estático, ou seja, não houve troca do meio de exposição durante as 24h.
Após a exposição das daphnias ao tratamento fúngico por 24h foram medidos pH,
oxigênio dissolvido (OD) e estimado o fator de toxicidade (FTd) (Figura 4). O FTd
corresponde à menor diluição da amostra em que não ocorre imobilidade ou mortalidade em
mais de 10% dos organismos. Os resultados foram expressos com percentual de mortalidade
dos organismos após 24h de exposição.
3. Materiais e Métodos
28
Figura 4: Esquema de avaliação toxicológica utilizando o microcrustáceo Daphnia pulex
3.5.2. Avaliação de genotoxicidade com sangue periférico humano (Ensaio
Cometa)
O Ensaio Cometa foi utilizado a fim de avaliar o dano estrutural ao DNA, ou seja, a
genotoxicidade das substâncias. Assim, este teste não é utilizado para detectar mutações
pontuais, mas sim lesões genômicas que, após serem processadas, podem resultar em quebras
simples e/ou duplas na cadeia de DNA.
Após 14 dias de incubação os frascos contendo os fungos selecionados na presença
dos corantes testados e na ausência do corante (item 3.4.1.) foram filtrados em membrana de
0,22 m e utilizados na avaliação de citotoxicidade e genotoxicidade em células sanguíneas
totais.
Estimativa
do Fator de toxicidade
Filtração em membrana 0,22
m
Exposição de neonatos de
Daphnia pulex
ao produto final por 24h no escuro
pH
Oxigênio dissol
vido
3. Materiais e Métodos
29
3.5.2.1. Ensaio de citotoxicidade utilizando sangue periférico humano
Visto que o processo citotóxico leva, inevitavelmente, à formação de quebras de fita
dupla no DNA, o Ensaio Cometa deve ser realizado em condições mínimas de toxicidade
celular. Assim, foi conduzido juntamente ao Ensaio Cometa o teste de viabilidade celular
(Figura 5) das amostras filtradas e dos controles. A partir deste teste foi observado se a
amostra testada não causou dano superior a 30% das células sanguíneas totais.
Seguindo a metodologia de Hartmann & Speit (1997) foi utilizado o volume de 100 µl
de células sanguíneas totais humanas (sangue periférico), obtido de sexo masculino (saudável,
não fumante, 30 anos), que foram misturadas à 100 µl das amostras teste filtradas (item 3.4.1.)
e aos controles: controle-solvente (PDB, H
2
O e PBS), controle-positivo Metil Metano-
sulfonato (MMS) 0,04 mM e controle celular (sem tratamento), em seguida foram incubadas à
37ºC por 2h. Duzentas células foram analisadas através de microscópio de fluorescência
(Nikon – Japão) com aumento de 400X utilizando 50 µl da solução BrEt e FDA para a análise
da viabilidade celular. As células viáveis apresentam fluorescência verde e as células mortas
laranja (Figura 6) (HARTMANN & SPEIT, 1997; ENSAIO COMETA, 2007). Assim, o
resultado foi expresso através do percentual de células viáveis, sendo considerado tóxico
quando causou morte superior a 30%.
Figura 5: Esquema do ensaio de citotoxicidade e do Ensaio Cometa utilizando sangue
periférico humano.
3. Materiais e Métodos
30
Figura 6: Ensaio de viabilidade de celular para Ensaio Cometa: Visualização de lâmina
através de microscópio de fluorescência de células viáveis (verde) e mortas (laranja).
3.5.2.2. Ensaio Cometa
O Ensaio Cometa foi realizado de acordo com Hartmann e Speit (1997) com algumas
modificações apresentadas na referência Ensaio Cometa (2007) (Figura 5). O volume de 100
µl de células sanguíneas foi misturado às amostras teste e aos controles incubados à 37ºC.
Após 2h 120 µl de agarose BPF 0,5% à 37ºC foi misturada à 10 µl de cada tubo tipo
Eppendorf contendo as amostras de controles e tratamentos e após serem homogeneizados
foram imediatamente pipetados em lâminas com agarose PFN.
As lâminas preparadas em duplicata foram guardadas em geladeira à 5ºC por 5
minutos e em seguida foram imersas em solução de lise celular e armazenadas em geladeira à
5ºC overnight. Após este período as lâminas foram colocadas em cuba de eletroforese com
tampão alcalino por 20 minutos e em seguida foi realizada a corrida de eletroforese em 25 V,
300 mA por 20 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos com
tampão de neutralização e colocadas em etanol por 10 minutos.
As lâminas secas foram coradas com 30 µl de brometo de etídio e analisadas em
microscópio de fluorescência (Nikon - Japão), com aumento de 200X. Foram analisadas 50
células por lâmina, ou seja, foi avaliado o dano em 100 células sanguíneas (2 lâminas) de
acordo com a intensidade da cauda dos cometas, em 4 diferentes classes (0 a 3) como
demonstrado na Figura 7. Os resultados dos diferentes grupos de tratamento foram expressos
em percentual de células nas 4 diferentes classes e unidades arbitrárias (UA). Posteriormente,
foram comparados utilizando o teste t de student unicaudal. Observações não pareadas entre o
grupo tratado e o grupo controle p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos
(WATANABE et al., 2005).
Células viáveis
Células mortas
3. Materiais e Métodos
31
Figura 7: Classes de Dano ao DNA. A – classe 0 (sem dano); B – classe 1 (dano leve); C –
classe 2 (dano moderado) e D – classe 3 (dano severo).
3.5.3. Ensaio de mutagenicidade utilizando a bactéria Salmonella typhimurium
(Teste de Ames).
O Teste de Ames baseia-se na indução de mutações reversas em linhagens de
Salmonella typhimurium, auxotróficas para o aminoácido histidina (his
-
), e mede-se a reversão
para o estado prototrófico (his
+
). O teste utiliza várias linhagens mutantes construídas para
detectar mutações por deslocamento do quadro de leitura ou por substituição de pares de base
no DNA. Cada uma das cepas contém um tipo diferente de mutação em um dos vários genes
que governam a síntese de histidina (operon histidina), e não pode crescer, a não ser que este
aminoácido seja incorporado ao meio de cultura (RIBEIRO et al., 2003).
As bactérias utilizadas neste ensaio têm capacidade metabólica limitada, não
apresentam a maioria das enzimas envolvidas no processo da biotransformação, que ocorre
em mamíferos. Como o teste é empregado com um sentido preditivo, torna-se necessário
adicionar um sistema extrínseco de “ativação metabólica”, neste caso foi utilizada a mistura
S9. Esta mistura é preparada em fígados de ratos previamente tratados com um indutor
(Aroclor 1254) de enzimas microssomais de metabolização de xenobióticos.
Assim, este ensaio foi utilizado com o intuito de evidenciar se a amostra testada e/ou
seus metabólitos interagem diretamente com a molécula de DNA bacteriano, revertendo o
efeito de uma mutação pré-existente, de modo que as bactérias recuperem a capacidade de
sintetizar histidina.
A B D
C
3. Materiais e Métodos
32
3.5.3.1. Linhagens
Foram utilizadas as linhagens TA97, TA98, TA100 e TA102 de Salmonella
typhimurium
. As características genéticas referentes a cada linhagem estão descritas no
Quadro 2. Para preparo das linhagens 100 µl de cultura estoque (50% glicerol, 50% LB
líquido) de cada uma das linhagens foram inoculadas em 10 mL de meio LB líquido, em
seguida incubado à 37ºC, 131 rpm, por 16h, para obtenção de densidade de aproximadamente
2 x10
9
células/mL.
Quadro 2: Relação de linhagens utilizadas no teste de mutagenicidade e suas respectivas
características genotípicas.
Linhagem Genótipo Característica
S. typhimurium TA97 hisD6610 rfa ∆uvrB
-
bio
-
R
+
Detecta mutação do tipo frameshift, por adição
de bases
S. typhimurium TA98 hisD3052 rfa ∆uvrB
-
bio
-
R
+
Detecta mutação do tipo frameshift, por adição
ou deleção de bases
S. typhimurium TA100 hisG46 rfa ∆uvrB
-
bio
-
R
+
Detecta mutação pontual de G-C para T-A
S. typhimurium TA102 hisG46 rfa uvrB
+
bio
+
R
+
Detecta mutação pontual de T-A para G-C
Nota: his – mutação responsável pela síntese de histidina; rfa – permeabilidade da membrana de lipossacarídeos;
uvrB – gene responsável pelo reparo no DNA; bio – mutação responsável pela síntese de biotina; R
+
- adição de
plasmídeo de resistência a ampicilina; Fonte: Maron & Ames, 1983
Como apresentado no Quadro 1, cada cepa possui além de mutação no operon
histidina (his) que impede as linhagens sintetizem esta aminoácido essencial para o
desenvolvimento, há outras modificações genéticas adicionais, como as mutações
rfa, uvrB e
o fator de resistência à ampicilina (R
+
), ou seja o plasmídeo pKM101.
A superfície das bactérias é, em geral, coberta por uma parede de constituição
lipopolissacarídica que serve como barreira à penetração de substâncias químicas. A mutação
rfa elimina parte da parede bacteriana, tornando as bactérias que a possuem mais permeáveis
às substâncias e completamente não patogênicas (AMES et al., 1973).
A mutação uvrB consiste na deleção deste gene que codifica o sistema de reparo do
DNA por excisão de nucleotídeos. Neste caso, o aduto formado pela ligação covalente da
substância química com o DNA não é retirado por este mecanismo de reparo fiel, aumentando
a ocorrência de mutagênese. Esta deleção estendeu-se até o gene bio e, como conseqüência, as
bactérias contendo a mutação também requerem biotina para se desenvolverem (MARON &
AMES, 1983). Assim, com estas modificações na S. typhimurium o ensaio torna-se muito
sensível, e podem ser detectadas quantidades muito pequenas do agente mutagênico.
3. Materiais e Métodos
33
3.5.3.2. Teste de Ames
Neste ensaio as amostras filtradas após o tratamento fúngico (item 3.4.1.), os controles
negativos e os controles positivos foram misturados a 100 µl da cultura de bactérias
preparadas previamente (item 3.5.3.1.) e acrescidos de 500 µl de tampão fosfato de sódio
(TFS), pH 7,4 (ou 500 µl da mistura S9 nos ensaios com ativação metabólica).
Após 5 minutos adicionou-se 2 mL de “top ágar” suplementado com traços de
histidina e biotina, insuficiente para possibilitar a formação de colônias, mas permite que se
sucedam as primeiras divisões celulares que são indispensáveis para que ocorra a expressão
das mutações. Homogeneizou-se e foram vertidas em placa de Petri contendo o meio mínimo.
Em seguida as placas foram incubadas por 72h a 37°C. Após a incubação foi realizada a
contagem das colônias revertentes por placa. O ensaio foi realizado em triplicata e ao abrigo
de luz. A Figura 8 apresenta o esquema simples do procedimento.
Como controles foram utilizados água (H
2
O), o meio de cultura PDB usado
anteriormente para crescimento dos fungos (item 3.2.1.), PDB+V198, PDB+A21,
PDB+A214, PDB+MXC e como controles positivos, para confirmação da reversão, foram
utilizados 4-nitroquinolona-N-óxido (4-NQO) (1 mg/mL) para as linhagens TA97, TA98 e
TA102 e Azida Sódica (AS) (0,1 mg/mL) para a linhagem TA100.
Para calcular os valores dos índices de mutagenicidade (IM) obtidos em relação a seus
respectivos controles foi utilizado o seguinte cálculo: n° médio de revertentes da amostra
(espontâneas + induzidas) / n° médio de revertentes do controle. Os dados foram analisados
em programa Excel utilizando o teste T unicaudal, quando p<0,05 foi considerado
significativo. A mutagenicidade foi considerada positiva quando IM foi igual ou maior que
2,0 e induziu aumento significativo de revertentes e negativo quando IM foi menor que 2,0.
3. Materiais e Métodos
34
Figura 8: Esquema do ensaio de mutagenicidade utilizando a bactéria Salmonella
typhimurium.
3.5.3.3 Ensaio de citotoxicidade utilizando a bactéria Salmonella typhimurium
A toxicidade das amostras foi estimada a partir da análise de crescimento em meio rico
(LB) a fim de verificar se as amostras testadas, na presença (+S9) e na ausência (-S9) de
metabolização, influenciaram no resultado negativo à mutagenicidade.
Deste modo, simultaneamente ao teste de Ames foram retirados 10 µL de 2 tubos de
cada amostra teste acrescido de TFS ou S9 (item 3.5.3.2.) e realizadas 3 diluições em TFS até
se obter aproximadamente 10
2
células. Em seguida, foram inoculados 100 µL da amostra
diluída em meio LB sólido que foram espalhados com o auxílio de pérolas de vidro. Após 24h
de incubação à 37ºC, foram realizadas as contagens das colônias nas placas. Este experimento
foi realizado em duplicata. Os controles utilizados foram os mesmos do teste de Ames (item
3.5.3.2.). Para calcular o percentual de sobrevivência foi realizado o seguinte cálculo: n°
médio de colônias da amostra*100 / nº médio de colônias do controle. Quando o total de
colônias foi inferior a 70% em relação ao controle a substância foi considerada tóxica (Figura
9).
72h de incubação em
TA97, TA98, TA100 e
TA102
Inoculação em meio
mínimo
100µl bactéria
100 µl substância
500 µl de TFS ou S9
Incubação por 30
min/131opm/37ºC
Adição de 2 mL de
gelose/HB
Contagem de
células revertentes
T
R
I
P
L
I
C
A
T
A
37°C ao
abrigo de
luz
3. Materiais e Métodos
35
Figura 9: Esquema do ensaio de citotoxicidade utilizando a bactéria Salmonella typhimurium.
3.6. Preservação dos fungos filamentosos
Os fungos filamentosos isolados e selecionados foram mantidos em tubos contendo
MEA e CYA e congelados em glicerol a - 70C, procedimento já realizado para os fungos da
Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS, o fungo anamórfico Penicillium
simplicissimum INCQS 40211, e os basidiomicetos Psilocybe sp. INCQS 40212, Lentinula
edodes INCQS 40220 (CCT 4519) e Ceriporiopsis sp. INCQS 40260.
100µl bactéria
100 µl substância
500 µl de TFS
990µl de TFS
10
6
células
990µl de TFS
10
4
células
900µl de TFS
10
3
células
10µl
10µl
100µl
100µl
D
U
P
L
I
C
A
T
A
990µl de TFS
10
6
células
990µl de TFS
10
4
células
900µl de TFS
10
3
células
10µl
10µl
100µl
100µl
100µl bactéria
100 µl substância
500 µl de S9
TA97, TA98,
TA100 e TA102
TA97, TA98,
TA100 e TA102
Meio LB sólido
Contagem
de células
10
2
células
10
2
células
36
4
4
.
.
R
R
e
e
s
s
u
u
l
l
t
t
a
a
d
d
o
o
s
s
&
&
D
D
i
i
s
s
c
c
u
u
s
s
s
s
ã
ã
o
o
4. Resultados e Discussão
37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.Seleção de fungos de sedimento de igarapés em Manaus (AM) e da Coleção de
Microrganismos de Referência do INCQS eficientes na descoloração de corantes
4.1.1. Seleção das amostras de sedimento com capacidade de descolorir corantes
Após 2 dias de incubação das amostras ambientais foi realizada a análise visual dos
meios e observado que em todos os frascos de IDB e IDN ocorreu completa descoloração,
porém a biomassa fúngica apresentou coloração respectiva ao corante utilizado,
caracterizando adsorção do corante.
Quanto à análise por espectrofotometria as médias com o percentual de descoloração
estão descritos na Tabela 3. Com base nos cálculos de absorbância dos picos característicos
foi confirmado que os frascos de IDB com o corante V198 (Figura 10) e com A21 (Figura
11), e de IDN com V198 (Figura 12) e com A21 (Figura 13) apresentaram alto percentual de
descoloração, com média entre 85 e 100% em 2 dias, e em 7 dias 100% em todos os frascos
testados.
Com relação aos frascos de IR, a biomassa não adsorveu os corantes, pois esta
apresentava coloração cinza. Já o sobrenadante apresentou coloração diferente do corante
utilizado, marrom claro com V198 (Figura 14) e cinza com A21 (Figura 15). Como descrito
na Tabela 3 o frasco de IR na presença de V198 (100 ppm) apresentou bons resultados na
análise por espectrofotometria com média de descoloração de 85% ao fim de 7 dias de
incubação e na concentração maior (200 ppm) foi de 73%.
Junghanns et al. (2007) observaram que após o tratamento de diferentes corantes por
fungos, novos espectros foram obtidos, indicando a formação de metabólitos. Foi observado o
desaparecimento do pico característico do corante de 520 nm e o surgimento de novo espectro
de aproximadamente 474 nm em 7 dias. Assim com base nesta observação, na coloração da
biomassa e na coloração do meio é possível inferir que ocorreu degradação do corante nos
frascos de IR na presença do corante V198.
Na presença do corante A21, a descoloração ocorrida nos frascos de IR foi de 79% em
100 ppm, e em 200 ppm de 32% após 7 dias de incubação. O tratamento de A21 por IR
apresentou perfil diferente do observado com o corante V198, pois não foi observado
desaparecimento do pico característico (675 nm) e nem o surgimento de um novo pico. Deste
4. Resultados e Discussão
38
modo, pode-se inferir que a coloração mais escura do meio deve-se provavelmente pela
liberação de pigmentos coloridos ao meio, tornando o meio com coloração diferente da
inicial.
Os frascos que apresentaram menor percentual de descoloração foram os de IA, onde
os melhores resultados foram, na presença do corante V198 (100 ppm) com 37,7% e na
presença do corante A21 (100 ppm) com 32% (Tabela 3).
Apesar da biomassa dos frascos de IDN e IDB terem demonstrado características de
adsorção do corante, a coloração da biomassa era mais clara que o corante utilizado. Assim os
fungos, possivelmente, estavam atuando tanto enzimaticamente na descoloração quanto na
adsorção de forma abiótica. Portanto, os frascos de IDN e IDB foram selecionados para o
próximo experimento, assim como o frasco de IR pelo fato do pico referente ao corante V198
(520 nm) ter desaparecido.
Figura 10: Frascos de IDB incubados com corante V198 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o tratamento, após 7
dias de incubação.
Figura 11: Frascos de IDB incubados com corante A21 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o tratamento, após 7
dias de incubação.
Figura 12: Frascos de IDN incubados com corante V198 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o tratamento, após 7
dias de incubação.
C
D
A
B
A
B
C
D
A B C D
4. Resultados e Discussão
39
Figura 13: Frascos de IDN incubados com corante A21 na concentração de 100 ppm, onde A
é o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o tratamento, após 7
dias de incubação.
Figura 14: Frascos de IR incubados com corante V198 na concentração de 100 ppm, onde A é
o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o tratamento, após 7
dias de incubação.
Figura 15: Frascos de IR incubados com corante A21 na concentração de 100 ppm, onde A é
o controle e B é o tratamento, e de 200 ppm, onde C é o controle e D é o tratamento, após 7
dias de incubação.
B
A
A B C D
A B C D
C D
4. Resultados e Discussão
40
Tabela 3: Percentual de descoloração das amostras de sedimento de igarapés da Região de
Manaus - AM
Percentual de descoloração (%)
Amostras
2 dias 4 dias 7 dias
IDB – V198 100 ppm 99,6 100 100
IDB – V198 200 ppm 94,2 97,8 100
IDB – A21 100 ppm 100 100 100
IDB – A21 200 ppm 99,6 100 100
IDN – V198 100 ppm 99,8 100 100
IDN – V198 200 ppm 86,6 100 100
IDN – A21 100 ppm 100 100 100
IDN – A21 200 ppm 99,4 100 100
IR – V198 100 ppm 22,9 76,2 85
IR – V198 200 ppm 9,3 72,1 73,2
IR – A21 100 ppm 1 68,1 79
IR – A21 200 ppm 8 43,4 32
IA – V198 100 ppm 22,7 24 37,7
IA – V198 200 ppm 1,5 11 15,4
IA – A21 100 ppm 38,5 47,6 32,4
IA – A21 200 ppm 14,1 10,1 15,6
Nota: IDN – Igarapé Reserva Ducke N; IDB – Igarapé Reserva Ducke ponto Bo; IR – Igarapé Ramal Água
Branca; IA – Igarapé Acará.
4.1.2. Isolamento de fungos do sedimento de igarapés
Para isolamento dos fungos presentes nas amostras do sedimento capazes de descolorir
os corantes, placas com meio PDA + corante foram inoculadas com as culturas dos frascos
que apresentaram bom percentual de descoloração (IDN, IDB e IR) descritos no item 4.1.1.
Assim foram isolados os fungos filamentosos que cresceram em PDA, ou seja, os que
prevaleceram na competição pelo substrato e foram tolerantes ao corante. No total foram
isolados 5 fungos, sendo 2 de IDN, 2 de IDB e 1 de IR. Estes isolados receberam os códigos
DKNA1, DKNA2, DKBV1, DKBV2 e RV1, respectivamente.
4.1.3. Caracterização morfológica e identificação dos isolados
Foram realizadas caracterizações morfológicas dos fungos filamentosos isolados (item
4.1.2). As identificações de cada isolado e seus pontos de coleta estão apresentadas na Tabela
4.
4. Resultados e Discussão
41
Tabela 4: Identificação dos isolados de sedimento de igarapés em Manaus – AM.
Pontos de coleta Isolados Identificação
DKNA1 Aspergillus japonicusReserva Ducke ponto N (IDN)
DKNA2
Aspergillus sp.
DKBV1
Acremonium sp.Reserva Ducke ponto Bo (IDB)
DKBV2 dematiaceo
Ramal (IR) RV1 Fusarium sp.
4.1.3.1. DKNA1 Aspergillus japonicus
O isolado identificado como DKNA1 apresentou características comuns à Aspergillus
japonicus, pois na avaliação macroscópica em MEA foi observada esporulação negra e
esparsa, micélio amarelado e verso amarelo. Em CYA25 foi observada esporulação negra
compacta no centro e mais esparsa ao redor com bastante micélio estéril de cor amarelada,
verso amarelo. Em CYA37 a esporulação era negra compacta e umbutonada, e verso negro.
Em CZ a colônia apresentou esporulação negra compacta, micélio creme e verso amarelo
limão e em CY20S foi observado micélio estéril creme e felpudo, esporulação esparsa e verso
amarelo forte (KLICH & PITT, 1988). Na Figura 16 estão apresentadas as colônias do fungo
em todos os meios utilizados para sua identificação.
Também foram observadas características microscópicas como o tamanho do estipe,
da fiálide, da vesícula, que apresentou aspecto globoso, e dos conídios que eram globosos e
espiculados (Figura 17) (KLICH, 2002; KLICH & PITT, 1988). Espécies deste gênero são
freqüentemente encontradas em solo (DOMSH et al., 1980).
4. Resultados e Discussão
42
Figura 16: Características macroscópicas apresentadas por A. japonicus (DKNA1) nos meios
de cultura: A – MEA; B – CYA25; C – CYA37; D – CY20S e E – CZ.
Figura 17: Características microscópicas apresentadas por A. japonicus (DKNA1): A –
detalhe da vesícula, das fiálides e dos conídios; B – estipes e cabeças conidiais.
4.1.3.1. DKBV1 Acremonium sp.
O isolado DKBV1 apresentou características comuns ao gênero Acremonium sp.
Macroscopicamente apresentou colônia branca, plana, compacta, com aspecto algodoado e
crescimento rápido após 5 dias de incubação (SAMSON et al., 2002). As imagens referentes a
colônia deste isolado não foram incluídas, pois estavam fora de foco.
Microscopicamente o fungo apresentou micélio septado muito fino (1 - 3µm),
ramificado e hialino, presença de muitas anastomoses entre as hifas, pequenos esporos
globosos agrupados em forma de flor produzidos em frágeis cadeias na extremidade das
A B
A B C
D E
4. Resultados e Discussão
43
fiálides e alguns esporos cilíndricos e alongados (Figura 18). Muitas espécies deste gênero são
isoladas de plantas mortas e de solo (DOMSH et al., 1980; SAMSON et al., 2002).
Este isolado não foi identificado quanto ao gênero devido a grande dificuldade
existente na identificação de espécies deste gênero e pela escassez de literatura para
identificação precisa desta espécie.
Figura 18: Características microscópicas apresentadas por Acremonium sp. A – anastomose
entre hifas hialinas, B – detalhe dos esporos cilíndricos e alongados, C – detalhe dos esporos
globosos agrupados em forma de flor nas extremidades das fiálides e D – micélio ramificado e
hialino.
4.1.3.3. RV1 Fusarium sp.
O isolado RV1 foi identificado somente quanto ao gênero como Fusarium sp. por
apresentar macroscopicamente crescimento rápido em meio sólido, hifas aéreas e
microscopicamente diversos microconídios (Figura 19). Espécies deste gênero são comuns em
solo (DOMSH et al., 1980; SAMSON et al., 2002). Não foi identificada a espécie, pois
espécies deste gênero apresentam grandes variações nas características fenotípicas, sendo
assim as caracterizações baseadas somente na morfologia são dificultadas, havendo
necessidade de outros métodos taxonômicos, como a molecular, o que leva a taxonomia
polifásica (PASCOE, 1990a; PASCOE, 1990b; GUARRO & GENÉ, 1992; NELSON et al.,
1994). Mas nesta fase dos experimentos não houve possibilidade para realizar esta outra
caracterização.
A B
C D
4. Resultados e Discussão
44
Figura 19: Características apresentadas por Fusarium sp. (A) Caracterísitica macroscópica em
PDA + V198 e (B) Característica microscópica com detalhe de microconídios.
4.1.3.4. DKBV2 dematiaceo e DKNA2 Aspergillus sp.
O isolado DKNA2 foi identificado somente ao nível de gênero como Aspergillus sp.,
pois apresentou vesícula e fiálides características a este gênero com presença de conídios
globosos. DKBV2 foi identificado como pertencente à família Dematiacea (SUTTON, 1980;
ELLIS, 1971), pois apresentou micélio negro. Infelizmente não foi possível registrar as
observações morfológicas destes dois fungos através das imagens digitalizadas.
Não foi identificada a espécie do isolado DKNA2, pois as características apresentadas
confundiam-se com a de outras espécies do gênero e o isolado DKBV2 não foi identificado,
pois não foram observadas as estruturas de reprodução o que não permitiu nem mesmo a
identificação do gênero.
4.1.4. Seleção de fungos isolados de sedimento de igarapés em Manaus e da
Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS com capacidade de descolorir em
meio líquido
Foram avaliados individualmente os 5 isolados do sedimento de igarapés em Manaus –
AM,
Aspergillus japonicus DKNA1, Acremonium sp. DKBV1, o Dematiaceo DKBV2,
Aspergillus sp. DKNA2 e Fusarium sp. RV1, assim como em associação.
Estudos com microrganismos em associação têm sido realizados e têm apresentado
resultados promissores (ASHGER et al., 2007; MACHADO et al., 2006; FANG et al., 2004).
Assim foram testados em associação Acremonium sp. DKBV1 juntamente com o Dematiaceo
DKBV2 e Aspergillus sp. DKNA2 em associação com Aspergillus japonicus DKNA1, pois
estes fungos foram isolados do mesmo ponto de coleta (item 5.2.1.).
Foram avaliados ainda os fungos da Coleção de Microrganismos de Referência, L.
edodes INCQS 40220, Psilocybe sp. INCQS 40212 e Ceriporiopsis sp. INCQS 40260.
A
B
4. Resultados e Discussão
45
Inicialmente foram testados na presença de 100 ppm de V198 somente os fungos
isolados de sedimento, Aspergillus japonicus DKNA1, Aspergillus sp. DKNA2, Acremonium
sp. DKBV1, dematiaceo DKBV2, Fusarium sp. RV1 e as associações juntamente com o
fungo de referência L. edodes. Destes fungos, os que apresentaram boa capacidade de
descoloração em relação ao corante V198 foram também testados na presença de A21, na
mesma concentração. juntamente com os demais fungos da Coleção de Microrganismos de
Referência do INCQS.
Inversamente ao realizado com os isolados de sedimento de Manaus, os fungos da
Coleção de Microrganismos de Referência do INCQS foram primeiramente testados com o
corante A21 e aqueles que fossem eficientes na descoloração deste corante seriam também
testados na presença de V198. Estes fungos foram incluídos posteriormente ao estudo, por
isso não seguiram a mesma seqüência usada para os fungos isolados de sedimento de igarapés
em Manaus.
4.1.4.1. Fungos testados na presença do corante V198
Na Tabela 5 estão apresentados os percentuais de descoloração nos tempos 0, 2, 5, 7,
14, 16, 19, 21 e 28 dias de cada isolado testado e as associações na presença de V198 .
4.1.4.1.1. Aspergillus japonicus DKNA1
A. japonicus DKNA1 apresentou em 7 dias de incubação 95,3%, de descoloração do
corante V198 na concentração de 100 ppm, porém em 14 dias apresentou redução no
percentual para 68,9% e em 28 dias alcançou percentual próximo ao inicial (90,4%), esta
flutuação pode ter ocorrido devido a adsorção e dessorção do corante pela biomassa (Figura
20). Este mesmo perfil de dessorção do corante foi observado por outras espécies de
Aspergillus (EL-RAHIM & MOAWAD, 2003).
O pico característico deste corante (520 nm) foi reduzindo após 14 dias de incubação,
chegando em 28 dias com pico de 508 nm em uma das duplicatas e na outra o pico
desapareceu, segundo Glenn & Gold (1983) somente quando o pico desaparece é possível
afirmar que houve degradação, no entanto a biomassa apresentou certa modificação na
coloração em 28 dias o que pode caracterizar degradação intracelular, assim por ter reduzido o
pico característico e ter modificado a coloração da biomassa este foi selecionado para o teste
de descoloração com o corante A21.
A mesma espécie deste estudo,
Aspergillus japonicus, foi avaliada em outro estudo
quanto a capacidade de adsorção de corante azo na concentração de 50 ppm pela biomassa
4. Resultados e Discussão
46
morta, e obtiveram 4% de descoloração do corante Preto Reativo 8, 9% do Marrom Reativo 9
e 7% do Verde Reativo 19 (KUMARI & ABRAHAM, 2007). Assim é possível inferir que a
biomassa viva apresenta maior capacidade de adsorção de corantes do tipo azo.
O alto percentual de descoloração obtida pelas células vivas de
A. japonicus pode
envolver mecanismos mais complexos que a adsorção, como a atuação do sistema enzimático
(e.g. oxidases extracelulares e intracelulares) (FU & VIRARAGHAVAN, 2001).
Figura 20: A – Frasco do controle corante V198 (100 ppm); B – Frasco do tratamento com
A.
japonicus DKNA1 após 28 dias de incubação.
4.1.4.1.2. Aspergillus sp. DKNA2
Aspergillus sp. DKNA2 na presença do corante V198 em 2 dias apresentou 8,2% de
descoloração (Tabela 5), já em 5 dias de incubação apresentou coloração marrom escuro e
permaneceu até 28 dias nesta condição. O pico característico do corante (520 nm) não
desapareceu e foi observado aumento de um pico na região próxima à 355 nm. Segundo
Souza & Peralta-Zamora (2006), as estruturas aromáticas absorvem fortemente na região
próxima a 300 nm o que pode caracterizar produção de novos metabólitos, sendo assim esta
pode ser a causa do aumento significativo na absorbância nesta região e conseqüentemente do
escurecimento do meio, que por outro lado também pode ter sido causado pela a produção de
pigmentos coloridos naturalmente produzidos pelos fungos e que confundem a interpretação
dos resultados (COOKSON, 1995).
4.1.4.1.3. Associação de Aspergillus japonicus DKNA1 e Aspergillus sp. DKNA2
Na associação entre A. japonicus DKNA1 + Aspergillus sp. DKNA2 a descoloração de
V198 foi eficiente alcançando em 7 dias de incubação o percentual de 82,8%; em 14 dias
apresentou redução drástica (39%) que em 16 dias aumentou novamente (66,1%) e
gradativamente subiu o percentual de descoloração até alcançar 78,6% em 28 dias de
incubação. O meio apresentou coloração marrom claro e a biomassa vermelha. Ou seja, o
resultado obtido em 7 dias voltou a se repetir ao final de 28 dias. A flutuação presente na
A B
4. Resultados e Discussão
47
descoloração pela associação pode ter ocorrido devido à dessorção e sorção do corante pela
biomassa, como ocorreu anteriormente com o isolado DKNA1 (item 4.1.4.1.1)
Sendo assim, não foi possível reproduzir os resultados obtidos a partir dos testes
inicias com as amostras de sedimento IDN de onde estes fungos foram isolados (Tabela 3,
item 4.1.1.); provavelmente havia na amostra de sedimento algum fungo mais eficiente, que
juntamente com os outros fungos isolados descoloriram eficientemente o corante, mas não foi
isolado.
4.1.4.1.4. Acremonium sp. DKBV1
Neste estudo Acremonium sp. DKBV1 foi capaz de reduzir rapidamente a coloração
do meio, apresentando em 2 dias 89,5% de descoloração do corante V198, e em 16 dias
alcançou 100% de descoloração, porém em 28 dias a porcentagem retornou ao nível inicial
(89,7%) (Tabela 5) e foi observado forte característica de adsorção do corante (Tabela 5).
Assim, a flutuação na descoloração pode ter ocorrido devido à dessorção e sorção do corante
pela biomassa. Esta observação é confirmada como adsorção do corante, pois segundo Glenn
& Gold (1983) no caso de degradação o pico característico desapareceria definitivamente, e
nesta avaliação não foi observado o desaparecimento do pico.
Não foram encontrados trabalhos relacionados à descoloração utilizando espécies
deste gênero, porém Bhatt et al. (2006), observaram a capacidade de
Acremonium sp.
mineralizar 34% de um contaminante aromático de sedimento marinho, ciclotrimetileno-
trinitro-amina, em 58 dias de incubação. Portanto, este gênero apresenta potencial para
degradar diferentes compostos.
4.1.4.1.5. dematiaceo DKBV2
O dematiaceo DKBV2 não foi capaz de descolorir eficientemente o corante azo V198
(Tabela 5), intensificou a coloração do meio a partir do 5° dia e ao final de 28 dias tornou o
meio vinho escuro. O pico característico do corante (520 nm) não desapareceu e na região
próxima a 300 nm houve aumento na absorbância, característica semelhante à apresentada
pelo isolado
Aspergillus sp. DKNA2 (item 4.1.4.1.1.). Ou seja, produtos da degradação ou
pigmentos coloridos estão sendo detectados visivelmente e através da espectrofotometria.
4. Resultados e Discussão
48
4.1.4.1.6. Associação entre Acremonium sp. DKBV1 e dematiaceo DKBV2
Na associação entre o dematiaceo DKBV2 e Acremonium sp. DKBV1 o corante foi
adsorvido pela biomassa, pois apresentou coloração vermelho escuro. O percentual de
descoloração do corante inicialmente foi de 14,8% (Tabela 5) e a partir do 7° dia houve
intensificação na coloração do meio, tornando-se vermelho escuro. O pico característico do
corante não desapareceu e foi observado aumento da absorbância na região próxima a 300
nm. Comparando os resultados dos fungos avaliados isoladamente e em associação, nota-se
que o dematiaceo DKBV2 é o responsável pelo escurecimento do meio no tratamento pela
associação
Acremonium sp. DKBV1 com dematiaceo DKBV2 (item 4.1.4.1.4.).
4.1.4.1.7. Fusarium sp. RV1
Após 2 dias da adição do corante, o tratamento por Fusarium sp. RV1 apresentou
descoloração de 74,6%, entre o 5° e o 16° houve oscilações no percentual, em 19 dias
alcançou 100% de descoloração e manteve até o fim de 28 dias (Tabela 5). A partir do 5° dia
foi observado redução do pico característico, em 19 dias desapareceu e em 21 dias surgiu
novo pico. A biomassa apresentou coloração cinza e o meio coloração marrom, o que poderia
ser resultado da produção de outros compostos também coloridos.
Na Figura 21 é mostrado o espectro obtido após o tratamento com Fusarium sp. RV1
na presença do corante V198, onde observa-se o pico característico de 520 nm do corante no
tempo 0, seguido de desaparecimento em 19 dias de incubação e o surgimento do novo pico
de aproximadamente 476 nm em 28 dias de incubação.
Junghanns et al. (2007) observaram que após o tratamento de vários corantes por
diferentes fungos aquáticos, novos picos além dos picos dos corantes foram obtidos,
indicando transformação dos corantes em metabólitos. Com base nos trabalhos de Glenn &
Gold (1983), que afirmaram que a degradação do corante é comprovada pelo desaparecimento
do pico característico do corante e de Junghanns et al. (2007), este isolado pode também ter
transformado o corante em metabólitos que foram detectados através da espectrofotometria.
Rodriguez et al. (1996) avaliaram a capacidade de Fusarium oxysporum e F. solani de
degradarem substâncias aromáticas como a lignina. A eficiência na degradação de lignina por
estes isolados foi atribuída a presença de enzimas oxidativas não específicas. A lignina é um
composto aromático, portanto estas enzimas podem também estar presentes no Fusarium sp.
RV1 atuando na degradação do corante V198.
4. Resultados e Discussão
49
Comparando os resultados obtidos com Fusarium sp. RV1 (Tabela 5) com aqueles
obtidos anteriormente a partir das culturas do sedimento (IR) (Tabela 3), pode-se afirmar que
este isolado era o fungo que estaria atuando nos frascos de IR, pois apresentou as mesmas
características observadas inicialmente (item 4.1.1.).
Figura 21: Espectros de absorbância de Fusarium sp. RV1 na presença do corante V198. A)
Pico característico de 520 nm no tempo 0; B) desaparecimento do pico característico em 19
dias; C) Novo pico de 476nm em 28 dias de incubação com Fusarium sp RV1.
4.1.4.1.8. Lentinula edodes INCQS 40220
Na Figura 22 está representado em gráfico o perfil de descoloração do corante V198
por L. edodes INCQS 40220. Após 5 dias de incubação foi observado 70,7% de descoloração,
em 7 dias obteve 95,3% e em 14 dias alcançou 100% de descoloração que foi mantido até 28
dias de incubação (Tabela 5). Em relação ao pico característico do corante, foi observado que
foi reduzindo até 7 dias e em 14 dias desapareceu, não reaparecendo até 28 dias, ou seja, esta
característica é confirmada como degradação deste corante. Outros estudos (BOER et al.
2004; NAGAI et al. 2002) com esse fungo comprovam sua grande capacidade de descolorir
diversos corantes em meio líquido.
A
B
C
4. Resultados e Discussão
50
Tabela 5: Percentual de descoloração dos fungos testados somente na presença do corante
V198 por 28 dias de incubação.
PERCENTUAL DE DESCOLORAÇÃO (%)
Isolados
Tempo
0 dias 2 dias 5 dias 7 dias 14 dias 16 dias 19 dias 21 dias 28 dias
A. japonicus DKNA1 0 53,5 89,5 95,3 68,9 71,1 69,3 74,9 90,4
Aspergillus sp.DKNA2 0 8,2 0 0 0 0 0 0 0
A. japonicus
DKNA1+Aspergillus
sp.DKNA2
0 54,9 78,8 82,8 39 66,1 70,2 78,6 78,6
Acremonium sp. DKBV1 0 89,5 97,6 97,1 98,9 100 95 89,5 89,7
dematiaceo DKBV2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Acremonium sp.
DKBV1+dematiaceo
DKBV2
0 14,8 13,8 0 0 0 0 0 0
Fusarium sp.RV1 0 74,6 53,3 42,7 59,1 52,4 100 100 100
L. edodes INCQS 40220 0 24,2 70,7 90,3 100 100 100 100 100
0
20
40
60
80
100
120
0 dias 2 dias 5 dias 7 dias 14 dias 16 dias 19 dias 21 dias 28 dias
Tempo de incubação (dias)
Descoloração (%)
V198 A21
Figura 22: Gráfico do percentual de descoloração dos corantes V198 e A21 por L. edodes
INCQS 40220 em 28 dias de incubação
4. Resultados e Discussão
51
4.1.4.2. Fungos testados na presença do corante A21
Na Tabela 6 estão apresentados os resultados de descoloração do corante tipo
ftalocianina A21 em 0, 2, 5, 7, 14, 16, 19, 21 e 28 dias, por
Psilocybe sp. INCQS 40212,
Ceriporiopsis sp. INCQS 40260 e A. japonicus DKNA1, que dentre aqueles isolados de
Manaus foi o fungo que apresentou melhor percentual de descoloração do corante V198 e
características de transformação do corante pela biomassa. Apesar de
Fusarium sp. ter
apresentado bom percentual de descoloração, este não foi testado pois apresentou coloração
visível no meio após os 28 dias de incubação. O fungo de referência L. edodes, também foi
avaliado na presença de A21.
4.1.4.2.1. Psilocybe sp. INCQS 40212
Psilocybe sp. INCQS 40212 em 14 dias apresentou 98,6% de descoloração na
presença do corante A21, no entanto a partir de 16 dias começou a reduzir este percentual e
em 28 dias apresentou 41% de descoloração (Tabela 6) e visivelmente o meio estava verde,
sendo que o corante tem coloração azul. O pico característico do corante (675 nm) não
desapareceu após tratamento por Psilocybe sp. INCQS 40212 e apresentou aumento na região
próxima a 300 nm, o que pode caracterizar transformação do corante e/ou produção de
metabólitos.
Já foi observado em outros estudos que Psilocybe sp. apresenta capacidade de
degradar compostos aromáticos (da SILVA et al., 2003b) e ainda que pode ser aplicado em
biorremediação (COMPART et al., 2007), porém neste estudo esta espécie não apresentou
eficiência na descoloração de corantes, sendo assim não foi testado na presença de V198.
4.1.4.2.2. Ceriporiopsis sp. INCQS 40260
Após 2 dias de incubação Ceriporiopsis sp. INCQS 40260 na presença do corante A21
obteve 11,2% de descoloração, que foi reduzido em 5 dias para 4,8%. No entanto, após esta
redução houve aumento da descoloração para 68% no 7° dia seguido de aumento gradual até
alcançar 100% em 19 dias de incubação e manteve este percentual até 28 dias (Tabela 6). O
pico característico do corante desapareceu em 19 dias e permaneceu até 28 dias,o que
caracteriza, segundo Glenn & Gold (1983), a degradação do corante, porém a biomassa estava
com coloração respectiva ao corante, azul, caracterizando a adsorção. Deste modo, por ser um
fungo basidiomiceto como o fungo de referência
L. edodes INCQS 40220, e não ter
apresentado capacidade superior de descoloração ao do fungo de referência (item 4.1.4.2.3.),
4. Resultados e Discussão
52
ou seja, sem apresentar característica de adsorção, Ceriporiopsis sp. INCQS 40260 não foi
testado na presença do corante V198.
4.1.4.2.3. Aspergillus japonicus DKNA1
Na presença de A21 este isolado apresentou descoloração mais rápida do meio do que
quando na presença de V198 (Tabela 5), pois em 2 dias de incubação descoloriu 96,3% e em
5 dias alcançou 100% de descoloração, porém em 14 dias apresentou decréscimo no
percentual para 98,7%, e foi reduzindo este percentual até 21 dias alcançando 68,8% (Tabela
6), ou seja, também apresentou característica de dessorção do corante (Figura 23). O pico
característico do corante desapareceu após 5 dias de incubação e reapareceu em 14 dias,
permanecendo até 28 dias, que confirma se tratar de adsorção do corante (GLENN &GOLD,
1983), não foi observado aumento da absorbância em nenhum dos espectros.
Kumari & Abraham (2007) avaliaram a capacidade da biomassa morta de
A. japonicus
de descolorir 2 ftalocianinas, Azul Reativo 38 e Azul Reativo 3, e foi observado baixo
percentual de descoloração, 20% e 12%, respectivamente. Assim, como observado no teste
com o corante do tipo azo (item 4.1.4.1.1.), a biomassa viva de
A. japonicus DKNA1 também
apresenta capacidade superior ao da biomassa morta na adsorção de corantes como as
ftalocianinas.
Alguns estudos realizados com espécies de Aspergillus demonstraram que a utilização
destes como adsorventes são uma alternativa interessante para remoção de cor de efluentes
(PARSHETTI et al., 2007; FU & VIRARAGHAVAN, 2002). Portanto, A. japonicus
apresenta potencial como adsorvente.
4.1.4.2.3. L. edodes INCQS 40220
A Figura 22 demonstra através de representação gráfica, que o desempenho de
descoloração por
L. edodes INCQS 40220 foi mais rápido na presença de A21 (97,9%) que
em V198 (70,7%), no entanto ambos alcançaram 100% em 14 dias de incubação. Assim, foi
comprovada a eficiência de L. edodes INCQS 40220 na descoloração de diferentes tipos de
corantes. Em relação à análise do pico característico de A21, L. edodes reduziu o pico até 7
dias e em 14 dias o pico do corante desapareceu e permaneceu nesta condição até 28 dias de
incubação.
4. Resultados e Discussão
53
A Tabela 7 apresenta o resumo dos percentuais de descoloração referentes a cada
fungo testado na presença de V198 e de A21 após 28 dias de incubação.
Figura 23: 1 – Frascos antes da filtração; 2 - Frascos filtrados em membrana 0,22
m. A –
Controle corante A21 (100 ppm); B – Frasco do tratamento com
A. japonicus DKNA1 após
28 dias.
Tabela 6: Percentual de descoloração dos fungos testados somente na presença do corante
A21 por 28 dias de incubação.
PERCENTUAL DE DESCOLORAÇÃO (%)
Isolados
Tempo
0 dias 2 dias 5 dias 7 dias 14 dias 16 dias 19 dias 21 dias 28 dias
Psilocybe sp.
INCQS 40212
0 47,5 62,4 70,2 98,6 93,1 88,4 72,6 41
Ceriporiopsis sp.
INCQS 40260
0 11,2 4,8 68 85,2 92,8 100 100 100
A. japonicus
DKNA1
0 96,3 100 100 98,7 91,3 88,7 78,8 84,8
L. edodes INCQS
40220
0 51,3 97,9 97,9 100 100 100 100 100
4. Resultados e Discussão
54
Tabela 7: Resumo do percentual de descoloração dos fungos testados em 28 dias de
incubação.
Percentual de descoloração
Isolados
V198 A21
Aspergillus japonicus DKNA1
90,4 84,8
Aspergillus sp. DKNA2
0 NT
Aspergillus japonicus DKNA1 + Aspergillus
sp. DKNA2 78,6 NT
Acremonium sp. DKBV1
86,7 NT
Dematiaceo DKBV2 0 NT
Acremonium sp. DKBV1 + dematiaceo
DKBV2 0 NT
Fusarium sp. RV1
100 NT
L. edodes INCQS 40220
100 100
Psilocybe sp. INCQS 40212
NT 41
Ceriporiopsis sp. INCQS 40260
NT 100
NT – não testado
4.1.5. Estudo da descoloração em meio líquido pelos fungos selecionados
Os fungos isolados de sedimento de igarapés em Manaus apresentaram forte
característica de adsorção e dessorção do corante ao longo do período de incubação, sendo
que alguns intensificaram a coloração. Sendo assim, nenhum dos isolados foram selecionados
para os estudos de descoloração com os demais corantes. Os fungos da Coleção de
Microrganismos de Referência,
Psilocybe sp. INCQS 40212 e Ceriporiopsis sp. INCQS
40260 que foram testados com A21 e também apresentaram adsorção do corante. Portanto
estes fungos também não foram selecionados.
Posteriormente aos experimentos para os fungos eficientes na descoloração (item
4.1.4.), foi decidido testar a capacidade de outro isolado da Coleção de Microrganismos de
Referência, o fungo anamórfico Penicillium simplicissimum INCQS 40211, isolado de
sedimento estuarino, por ter sido capaz de degradar hidrocarbonetos aromáticos (da SILVA et
al., 2003b). É também justificada a sua utilização por ter outros estudos com outras espécies
deste mesmo gênero que demonstraram capacidade de degradar e transformar lignina
(RODRÍGUEZ et al., 1994).
Deste modo foram selecionados para os testes de descoloração de todos os corantes
isoladamente, incluindo o corante ainda não testado A214, e a mistura dos corantes, MXC,
apenas pelo fungo de referência, L. edodes INCQS 40220, e P. simplicissimum INCQS 40211.
O tempo de incubação foi reduzido para 14 dias com base na capacidade de L. edodes
INCQS 40220 descolorir 100% neste período (item 4.1.4.). Na Tabela 8 estão apresentados os
4. Resultados e Discussão
55
percentuais de descoloração obtidos por L. edodes INCQS 40220 e P. simplicissimum INCQS
40211 ao longo dos 14 dias de incubação na presença dos corantes V198, A21, A214 e MXC.
Tabela 8: Percentual de descoloração dos corantes V198, A21, A214 e MXC por
L. edodes
INCQS 40220 e P. simplicissimum INCQS 40211 em 14 dias de incubação.
PERCENTUAL DE DESCOLORAÇÃO (%)
Isolados L. edodes INCQS 40220 P. simplicissimum INCQS 40211
Corantes Tempo de incubação (dias) Tempo de incubação (dias)
0 2 5 7 14 0 2 5 7 14
V198 0 5,5 68,2 81,1 100 0 89,8 98,4 100 100
A21 0 36,8 100 100 100 0 100 100 100 100
A214 0 5,6 100 100 100 0 81 99 100 100
MXC 0 29,1 94,3 96,7 100 0 96,3 96,7 100 100
P. simplicissimum INCQS 40211 apresentou boa capacidade de descoloração dos
diferentes corantes testados (Tabela 8), com característica comum aos outros fungos testados
anteriormente, a adsorção. No entanto, foi observada descoloração visível da biomassa após a
adsorção do corante no decorrer dos 14 dias de incubação, o que pode significar uma
metabolização do corante através do sistema enzimático intracelular.
Na presença do corante V198 foi observada completa descoloração por P.
simplicissimum INCQS 40211 em 7 dias de incubação e demonstrou grande redução na
coloração da biomassa ao longo do período de incubação (Tabela 8, Figura 24). Com base na
descoloração da biomassa e na redução do pico característico do corante em 2 e 5 dias, até
desaparecer em 7 dias, permanecendo nesta condição até 14 dias, é possível que tenha
ocorrido metabolização do corante. Esta observação é confirmada como adsorção do corante
seguido de degradação, devido à redução na coloração da biomassa e ao desaparecimento do
pico característico do corante (520 nm) (GLENN & GOLD, 1983).
Outro fungo não basidiomiceto, Cunninghamela elegans, foi avaliado na presença do
mesmo corante V198 e este apresentou, após 7 dias de incubação, 80% de adsorção do
corante (AMBRÓSIO & CAMPOS-TAKAKI, 2004).
P. simplicissimum INCQS 40211 na presença do corante A21 foi capaz de descolorir
completamente o corante em 2 dias de incubação, apresentando maior rapidez na adsorção do
corante quando comparado aos demais corantes testados (Tabela 8). O pico característico do
4. Resultados e Discussão
56
corante foi reduzido em 2 dias, em 5 dias desapareceu e manteve-se até 14 dias, assim devido
à redução na cor da biomassa, e o desaparecimento do pico característico pode-se inferir que
ocorreu degradação deste corante (GLENN & GOLD, 1983). A Figura 25 apresenta a
biomassa fúngica que demonstrou redução na coloração principalmente entre o 7° e o 14° dia.
Comparando a capacidade de descoloração de P. simplicissimum INCQS 40211, com
o fungo ligninolítico, Phanerochaete chrysosporium, muito estudado em relação à degradação
de vários compostos tóxicos, e que foi testado na presença do mesmo corante A21, este
apresentou completa descoloração em 7 dias (CONEELY et al., 1999) enquanto P.
simplicissimum
INCQS 40211 apresentou em 2 dias (Tabela 8). Deste modo, a capacidade
demonstrada
P. simplicissimum INCQS 40211, pode ser comparada a este fungo, em relação
ao tempo de descoloração.
A capacidade de descoloração dos fungos é também dependente da estrutura do
corante (FU & VIRARAGHAVAN, 2001). A21, uma ftalocianina, apresenta em sua estrutura
o cobre que pode influenciar na capacidade de descoloração por alguns fungos como foi
observado no estudo realizado por Novotný et al. (2004), onde A21 foi considerado o mais
tóxico inibindo o crescimento de alguns fungos. Em outro estudo com o mesmo corante foi
observada maior resistência na descoloração biológica no tratamento com culturas de
bactérias metanogênicas (FONTENOT et al., 2003), Portanto P. simplicissimum INCQS
40211, comparado a estes outros organismos apresenta maior resistência e eficiência no
tratamento deste tipo de corante.
Na presença do corante A214 em 7 dias foi observado 100% de descoloração, porém
visivelmente houve menor redução na coloração da biomassa (Tabela 8, Figura 26). Na
análise dos espectros, o pico característico do corante (608 nm) desapareceu em 5 dias e
simultaneamente um pico de 540 nm surgiu, este permaneceu em 7 dias e em 14 dias
desapareceu. A formação destes novos picos pode ser indicativo de biotransformação do
corante (JUNGHANNS et al., 2007).
Quando comparado aos outros corantes testados, P. simplicissimum INCQS 40211
apresentou maior dificuldade em reduzir a coloração da biomassa, isso ocorreu provavelmente
pela maior complexidade na estrutura deste corante. A capacidade de descoloração dos fungos
é também dependente da estrutura do corante (FU & VIRARAGHAVAN, 2001).
P. simplicissimum INCQS 40211 quando testado na presença da mistura dos corantes,
MXC, em 5 dias apresentou 100% de descoloração e manteve este percentual até 14 dias
(Tabela 8), foi visivelmente observada boa redução na coloração da biomassa entre 7 e 14
4. Resultados e Discussão
57
dias (Figura 27). O pico característico foi reduzido em 2 dias e em 5 dias o pico característico
desapareceu, não reaparecendo em 7 ou 14 dias. Assim o tratamento de MXC por P.
simplicissimum
INCQS 40211 também foi caracterizada como degradação, uma vez que não
reapareceu após 5 dias de incubação (GLENN & GOLD, 1983).
Com base nestes experimentos,
P. simplicissimum INCQS 40211 possui grande
capacidade de descolorir a mistura de diferentes tipos de corantes, como monoazo (V198),
diazo (A214) e ftalocianina (A21), uma vez que o pico característico do corante testado
desapareceu e ainda a coloração da biomassa foi reduzida.
Em estudo realizado por Zheng et al. (1999) demonstraram que a espécie do gênero
Penicillium sp. apresenta habilidade na remoção de corante por adsorção e subseqüente
degradação. No entanto, Yang et al. (2003) ao avaliarem outra espécie deste gênero,
Penicillium geastrivorus, não observaram a presença das enzimas consideradas as maiores
responsáveis pela degradação de corantes, como lignina peroxidase, manganês peroxidase e
lacase, o que pode representar a variabilidade na capacidade de secreção de enzimas por
espécies deste gênero.
Trabalhos relacionados à descoloração de corantes por P. simplicissimum não foram
encontrados, mas há estudos sobre atividade enzimática deste fungo. Em estudo realizado por
Zeng et al. (2006) foi observada a produção de lacase e que a atividade desta enzima
aumentou significativamente após o esgotamento da fonte de carbono simples, a celulose,
passando a utilizar fonte de carbono mais complexa, a lignina.
Outro estudo demonstrou a produção de enzima intracelular por P. simplicissimum,
como o álcool vanílico oxidase, que é responsável por catalisar grande variedade de
compostos fenólicos (FRAAIJE et al., 1995; FRAAIJE et al., 1997).
Deste modo é possível sugerir que a redução na coloração da biomassa por P.
simplicissimum neste trabalho ocorreu visivelmente entre o 7° e o 14º dia devido ao fungo já
ter consumido a fonte de carbono simples, glicose, e ter começado a utilizar o corante
adsorvido como fonte de carbono complexo a partir de enzimas intracelulares ou mesmo
extracelulares. Seria necessário confirmar estas possibilidades fazendo análises para detectar a
presença e atuação de enzimas neste processo de metabolização.
No tratamento de efluentes têxteis é utilizado o processo tradicional por lodo ativado,
onde ocorre adsorção do corante. Esta é uma das desvantagens encontradas neste processo,
uma vez que o teor de corantes adsorvidos pela biomassa é elevado.
4. Resultados e Discussão
58
P. simplicissimum apresentou característica semelhante ao lodo ativado ao adsorver o
corante no início da incubação. Porém a descoloração da biomassa ao longo do período de
incubação é interessante para uma possível aplicação deste fungo em tratamento de efluentes,
pois além de adsorver parte dos corantes também há transformação destes compostos.
Figura 24: Frascos contendo o corante V198 tratados por P. simplicissimum INCQS 40211. A
– 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação.
Figura 25: Frascos contendo o corante A21 tratados por P. simplicissimum INCQS 40211. A –
2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação.
Figura 26: Frascos contendo o corante A214 tratados por
P. simplicissimum INCQS 40211. A
– 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação.
Figura 27: Frascos contendo a mistura dos corantes MXC tratados por
P. simplicissimum
INCQS 40211. A – 2 dias; B - 5 dias; C – 7 dias e D – 14 dias de incubação.
A B C D
A B C D
A B C D
A B C D
4. Resultados e Discussão
59
L. edodes INCQS 40220 apresentou completa descoloração na presença de V198 em
14 dias de incubação (Tabela 8, Figura 28), como observado anteriormente (Tabela 5, item
4.1.4.1.8.). O pico característico do corante foi reduzido em 5 e 7 dias, desaparecendo em 14
dias de incubação. Assim pode-se inferir que ocorreu degradação, devido o desaparecimento o
pico característico do corante (GLENN & GOLD, 1983).
Na presença de A21 L. edodes INCQS 40220 apresentou descoloração rápida
alcançando 100% em 5 dias (Tabela 8, Figura 29), anteriormente apresentou 100% em 14 dias
(Tabela 6, item 4.1.4.2.3.), no entanto revelou característica não apresentada anteriormente, a
adsorção deste corante, assim é justificada a maior agilidade de descoloração devido a
adsorção do corante. Neste experimento o pico característico do corante (675 nm)
desapareceu completamente em 5 dias e permaneceu ausente até 14 dias, caracterizando a
degradação do corante (GLENN & GOLD, 1983).
Segundo Santos et al. (2004) a estrutura do corante, a composição do meio de cultura,
as condições de pH, temperatura e agitação podem influenciar nos resultados. Neste estudo foi
identificada apenas uma variável, o volume do meio, anteriormente utilizava-se 50 mL e nesta
fase dos testes foi utilizado 150 mL, talvez esta variável tenha influenciado na alteração do
potencial de descoloração de L. edodes, pois foi o aumentado o volume mas não a rotação
utilizada (140 rpm).
Os corantes A214 (Figura 30) e a mistura MXC (Figura 31) tratados por L. edodes
INCQS 40220 apresentaram 100% de descoloração após 5 e 14 dias, respectivamente (Tabela
8). No entanto, foi observado adsorção do corante pela biomassa no 5° dia de incubação,
permanecendo nesta condição até 14 dias.
Em relação ao desempenho de
L. edodes INCQS 40220 na descoloração do corante
A214 foi observado que o meio apresentava coloração avermelhada. Na análise dos espectros
foi observado desaparecimento do pico característico do corante (608 nm) em 5 dias e
simultaneamente o surgimento do pico de 485 nm, em 7 dias este pico foi reduzido para 470
nm e em 14 dias desapareceu. Segundo Junghanns et al. (2007) a formação de novos picos
pode ser um indicativo de biotransformação do corante.
Deste modo, a estrutura deste corante pode ter influenciado na redução da capacidade
de descoloração por
L. edodes. Assim, estudos posteriores com L. edodes INCQS 40220
deverão ser realizados, a fim de observar se haverá novas variações quanto a sua capacidade
de descoloração.
4. Resultados e Discussão
60
O pico característico da mistura, MXC (620 nm), desapareceu em 14 dias de
incubação e não houve aparecimento de novos picos, deste modo é confirmada a degradação
deste corante.
Portanto neste estudo de descoloração
P. simplicissimum INCQS 40211 apresentou
maior agilidade no tempo de descoloração em relação aos corantes V198, A21 e da MXC
quando comparado com
L. edodes INCQS 40220, e mesmo apresentando adsorção do corante,
este foi capaz de reduzir esta coloração da biomassa. Em relação ao corante A214 ambos os
fungos apresentaram aspectos negativos após a descoloração, tendo L. edodes INCQS 40220
apresentado coloração visível no meio e
P. simplicissimum INCQS 40211 apresentou após
adsorção do corante menor capacidade de redução na coloração da biomassa.
Figura 28: Frascos contendo o corante V198 tratados por
L. edodes. A – controle V198; B – 2
dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação.
Figura 29: Frascos contendo o corante A21 tratados por L. edodes. A – controle A21; B – 2
dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação.
Figura 30: Frascos contendo o corante A214 tratados por L. edodes. A – controle A214; B – 2
dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação.
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
4. Resultados e Discussão
61
Figura 31: Frascos contendo a mistura dos corantes MXC tratados por L. edodes. A – controle
MXC; B – 2 dias; C- 5 dias; D – 7 dias e E – 14 dias de incubação.
4.2.5. Avaliação Toxicológica do Meio de Cultura Pós-tratamento Fúngico
A utilização de microrganismos na biorremediação pode produzir compostos
intermediários, que algumas vezes, podem ser tóxicos ou mais tóxicos do que o composto
original. Assim existe a necessidade de realização de estudos de descoloração associados à
avaliação de toxicidade após o tratamento.
Alguns estudos de descoloração por fungos vêm sendo acompanhados por análises
toxicológicas, utilizando testes como: a bactéria
Bacillus cereus (PALMIERI et al., 2005), a
planta
Lemma minor (EICHLEROVÁ et al., 2007), o cnidário Hydra attenuatam, a alga
Selenastrum capricornutum, sementes de alface Lactuca sativa (DELLAMATRICE et al.,
2005), Teste de Ames utilizando a bactéria Salmonella typhimurium (EL-RAHIM &
MOAWAD, 2003), microtox utilizando bactérias luminescentes (RAMSAY & NGUYEN,
2002), entre outros testes.
A fim de verificar a capacidade de alguns fungos deste estudo de reduzirem a
toxicidade após a descoloração de corantes têxteis, foi realizada a análise toxicológica
utilizando o microcrustáceo Daphnia pulex, sangue periférico humano total (Ensaio cometa) e
a bactéria Salmonella typhimurium (Teste de Ames).
Inicialmente foram analisados toxicologicamente, utilizando o microcrustáceo
Daphnia pulex, os meios tratados pelos fungos que apresentaram melhores resultados na
descoloração dos corantes V198 e A21 visivelmente e por espectrofotometria após 28 dias de
incubação (item 4.1.4.). Assim, foram avaliados os meios de A. japonicus DKNA1, que teve
melhor desempenho na descoloração dos corantes, apesar da adsorção de parte deles pela
biomassa, e o meio do fungo de referência L. edodes INCQS 40220 (item 4.1.4).
Posteriormente os meios tratados pelos fungos selecionados no item 4.1.5., P.
simplicissimum e L. edodes foram testados com o microcrustáceo Daphnia pulex em relação à
redução da toxicidade dos corantes V198, A21, A214 e da mistura MXC. L. edodes foi testada
A
B
C
D
E
4. Resultados e Discussão
62
novamente em A21 e V198, por ser o fungo de referência. Como estes fungos foram os que
apresentaram os melhores resultados de descoloração (item 4.1.5.), também foram avaliados
seus tratamentos quanto à genotoxicidade (Ensaio Cometa), utilizando sangue periférico total
humano e ainda quanto ao potencial mutagênico e citotóxico utilizando a bactéria
Salmonella
typhimurium
(Teste de Ames).
4.2.5.1. Avaliação toxicológica, com microcrustáceo Daphnia pulex, dos meios
tratados por A. japonicus e L. edodes após 28 dias de incubação na presença dos
corantes V198 e A21
Na Tabela 9 estão apresentados os resultados de toxicidade juntamente com os
parâmetros fisico-químicos dos isolados com melhores percentuais de descoloração após 28
dias de incubação.
Precedendo a exposição às daphnias, foram analisados os parâmetros físico-químicos
das amostras dos corantes A21 e V198 e dos tratamentos por A. japonicus e L. edodes, pois as
daphnias vivem bem em pH entre 7,0 e 8,0 e com Oxigênio dissolvido (OD) superior a 2
mg/mL, valores inferiores a estes podem influenciar na sobrevivência das daphnias.
Assim foi observado que todas as amostras apresentaram pH inferior à 7,0 e
precisavam ser ajustadas utilizando solução de NaOH 1N, já o OD em todas as amostras
analisadas foram superiores à 2 mg/mL, ou seja, valores em que há possibilidade de
sobrevivência das daphnias (Tabela 9).
Após a exposição das daphnias às amostras dos corantes, foi observado que os
corantes V198 e A21 apresentaram redução do OD, para 0,07 mg/mL e 0,05 mg/mL,
respectivamente, e que o corante V198 apresentou Fator de Toxicidade (FTd) de 125 e A21
apresentou FTd 111 (Tabela 9). Estes valores podem ter sido influenciados pela redução de
OD.
Os corantes do tipo azo já são conhecidos quanto a sua toxicidade a diversos
organismos. Em relação ao corante A21, ftalocianina de cobre, Bae & Freeman (2007)
avaliaram a toxicidade de corantes do tipo azo utilizando o microcrustáceo
Daphnia magna,
sendo que um dos corantes testados de outro tipo que não azo, o Azul Direto 218, mereceu
destaque por ter sido muito tóxico às daphnias. Os autores associaram essa toxicidade à
presença de cobre na estrutura deste corante. Deste modo a toxicidade apresentada pelo
corante A21 neste estudo pode ser devido à presença de cobre em sua estrutura.
4. Resultados e Discussão
63
Os meios tratados por A. japonicus e L. edodes, tanto na presença de V198 quanto de
A21, foram redutores do OD (OD < 2 mg/mL), que influencia na sobrevivência das daphnias.
L. edodes apresentou maior percentual de redução da toxicidade 93,4% (FTd 8,3) do V198
que A. japonicus DKNA1, que reduziu 92% (FTd 10). Já o tratamento de corante A21 por A.
japonicus
DKNA1 reduziu 97,4% da toxicidade, enquanto L. edodes reduziu 95,5% (Tabela
9).
Abadulla et al. (2000) utilizaram a bactéria Pseudomonas putida para avaliar a
toxicidade após o tratamento por lacase imobilizada do fungo Trametes hirsuta de 2 corantes
do tipo azo e outro tipo que apresenta cobre em sua estrutura. Eles observaram através deste
teste baixo percentual de redução da toxicidade, sendo 11,4% de redução do corante azo Preto
Reativo 5, 39% do azo Azul Direto 71 e 4,1% do corante com presença de cobre na estrutura.
Comparando estes resultados com os obtidos neste trabalho, L. edodes e A. japonicus DKNA1
são mais eficientes na redução da toxicidade de corantes do tipo azo e de corantes tipo
ftalocianina de cobre, como o A21.
Apesar destes resultados, A. japonicus DKNA1 não foi selecionado para os
experimentos posteriores, pois nos experimentos anteriores de descoloração a redução da cor
do meio foi resultado principalmente da adsorção dos corantes. Este experimento com as
daphnias foi realizado com este fungo visto que era o fungo que mais se sobressaiu em
relação aos outros isolados de Manaus.
Tabela 9: Resultados do ensaio toxicológico com microcrustáceo Daphina pulex dos
isolados que apresentaram melhor percentual de descoloração dos corantes V198 e A21 após
28 dias de incubação.
pH OD (mg/mL) FTd 24h
Amostras
Antes
24h
Após
24h
Antes 24h Após 24h Valor
medido
% de
redução
Corante V198 4,87 6,71 4,60 0,07 125 -
A. japonicus em V198 6,90 7,09 6,09 0 10 92
L. edodes em V198 5,87 6,95 6,36 0 8,3 93,4
Corante A21 4,72 7,09 6,44 0,05 111 -
A. japonicus em A21 6,41 6,68 3,88 0,04 4 96,4
L. edodes em A21
6,39 6,61 5,34 0,06 5 95,5
Nota: OD – Oxigênio dissolvido; FTd – Fator de toxicidade.
4. Resultados e Discussão
64
4.2.5.2. Avaliação toxicológica dos meios tratados pelos fungos selecionados P.
simplicissimum INCQS 40211 e L. edodes INCQS 40220 após 14 dias de incubação
na presença dos corantes V198, A21, A214 e da mistura MXC.
Os fungos selecionados no item 4.1.5., P. simplicissimum e L. edodes, foram testados
em relação à redução da toxicidade dos corantes V198, A21, A214 e mistura MXC através de
diferentes metodologias, com o microcrustáceo
Daphnia pulex, com sangue periférico
humano quanto à genotoxicidade (Ensaio Cometa) e ainda avaliados quanto ao potencial
mutagênico e citotóxico utilizando a bactéria Salmonella typhimurium (Teste de Ames).
4.2.5.2.1. Avaliação de toxicidade com o microcrustáceo Daphnia pulex
Inicialmente foram analisados os parâmetros físico-químicos que pudessem influenciar
à análise dos resultados. Foi observado que todas as amostras dos corantes V198, A21, A214
e mistura MXC e os tratamentos por P. simplicissimum e L. edodes apresentavam
características ácidas, pH em torno de 4,0 e 5,0 (Tabela 10), assim foi realizado o ajuste do
pH para 7,0. O parâmetro de Oxigênio Dissolvido (OD) em todas as amostras apresentaram
valores superiores à 2 mg/mL (Tabela 10), não sendo necessária a oxigenação do meio.
Após a exposição das daphnias às amostras de corantes, foi observado que todos os
corantes testados apresentaram redução do OD. Em relação à toxicidade os corantes
considerados mais tóxicos foram V198 e A21, com fator de toxicidade (FTd) de 125 e 128,
respectivamente (Tabela 10). Estes resultados são semelhantes ao observado anteriormente
(Tabela 9), o que garante a reprodutibilidade da utilização deste teste na detecção da
toxicidade dos corantes. O corante A214 e a mistura MXC apresentaram toxicidade muito
baixa quando comparados aos outros 2 corantes, com FTd 14,3 e FTD 2,5, respectivamente
(Tabela 10).
O tratamento por P. siplicissimum apresentou bom percentual de redução da
toxicidade do corante V198, 87,2% (FTd 16), e do corante A21, 93,7% (FTd 8). Já o
tratamento dos corantes V198 e A21 por L. edodes foram diferentes do apresentado
anteriormente (Tabela 9), pois aumentou para ambos os corantes em 107,2% de V198 (FTd
259) e 300,7% de A21 (FTd 513) (Tabela 10).
Como discutido anteriormente (item 4.1.5.), a alteração na capacidade de L. edodes de
reduzir a toxicidade, assim como em relação a sua capacidade de descoloração, pode também
estar sendo influenciada pela alteração do volume de meio. Contudo, em relação à toxicidade,
outro aspecto pode estar influenciando o aumento da toxicidade, o tempo de incubação. No
experimento anterior a capacidade de L. edodes reduzir a toxicidade foi testada após 28 dias
4. Resultados e Discussão
65
de incubação, neste teste a avaliação foi realizada após 14 dias. Assim, metabólitos
produzidos a partir da degradação dos corantes por L. edodes em 14 dias de incubação podem
ter influenciado nesta resposta tóxica, enquanto que em 28 dias de incubação o próprio fungo
pode ter tido mais tempo para eliminar os compostos tóxicos as daphnias.
Em estudo realizado por Nascimento (2008) foi observado que o tratamento por L.
edodes dos corantes V198 e A214 aumentaram a toxicidade em aproximadamente 20000% e
4900%, respectivamente. Assim, estes resultados demonstram que há reprodutibilidade deste
ensaio, pois em ambos os estudos L. edodes apresentou o mesmo perfil de toxicidade.
Os meios tratados por
P. simplicissimum e L. edodes apresentaram aumento na
toxicidade quando comparados ao composto original, o corante A214 (FTd 14,3).
P.
simplicissimum aumentou a toxicidade em 39,9% (FTd 20) e L. edodes foi ainda mais tóxico
aumentando em 599,3% (FTd 100) (Tabela 10).
L. edodes e P. simplicissimum podem ter transformado parte do corante em
metabólitos mais tóxicos do que o próprio corante, que possui estrutura mais complexa. No
entanto, mesmo
P. simplicissimum tendo demonstrado aumento da toxicidade, ainda foi bem
inferior ao apresentado pelo fungo de referência L. edodes (Tabela 10).
Como discutido anteriormente (item 4.1.5.), P. simplicissimum e L. edodes
apresentaram maior dificuldade em descolorir o corante A214 (Figura 26 e Figura 30), mas
mesmo assim parte do corante pode ter sido transformado e resultado em metabólitos tóxicos.
P. simplicissimum, apesar de ter aumentado a toxicidade do meio, este ainda estava menos
tóxico do que o meio após o tratamento com o fungo de referência L. edodes.
Em relação à mistura MXC houve um aumento na toxicidade do corante após o
tratamento pelos 2 fungos testados.
P. simplicissimum aumentou a toxicidade em 3900% e L.
edodes
aumentou em 40000%, quando comparados ao controle da mistura, MXC. Assim
como observado no tratamento do corante A214, P. simplicissimum apresentou toxicidade
menor que L. edodes (Tabela 10).
P. simplicissimum demonstrou capacidade de reduzir a toxicidade de corantes como
V198 (monoazo) e A21 (ftalocianina), porém aumentou a toxicidade de corantes mais
complexos como A214 (diazo) e a mistura, MXC. Deste modo, a capacidade deste fungo deve
ser avaliada quanto a detoxificação para posterior aplicação em biorremediação, pois mesmo
tendo apresentado bom percentual de descoloração anteriormente (item 4.1.5.), não foi capaz
de reduzir a toxicidade de todos os corantes testados.
4. Resultados e Discussão
66
Já L. edodes apresentou variações nos resultados de descoloração e detoxificação,
sendo assim é necessária melhor avaliação da capacidade deste fungo, pois sabe-se que este
possui a capacidade de descolorir eficientemente alguns corantes (item 4.1.5), e anteriormente
apresentou bom percentual na detoxificação de V198 e A21 (Tabela 9).
Portanto, através deste ensaio de toxicidade foi demonstrada a grande importância e
necessidade de avaliação toxicológica associada aos estudos de descoloração, uma vez que a
descoloração eficiente nem sempre está associada à redução da toxicidade, inviabilizando o
uso de fungos eficientes na degradação e deficientes na redução de toxicidade dos corantes
em processos de biorremediação.
Tabela 10: Resultados do ensaio toxicológico com microcrustáceo Daphina pulex dos
fungos selecionados testados em V198, A21, A214 e na mistura, MXC após 14 dias de
incubação.
pH OD (mg/mL) FTd 24h
Amostras
Antes
24h
Após
24h
Antes 24h Após 24h Valor
medido
% de
redução
Corante V198 4,90 7,02 6,1 0 125 -
P. simplicissimum em
V198
4,59 6,68 6,0 4,6 16 87,2
L. edodes em V198 5,04 6,87 6,3 2,5 259 +107,2*
Corante A21 4,87 6,71 6,08 0 128 -
P. simplicissimum em
A21
4,82 6,74 6,1 2,7 8 93,7
L. edodes em A21
5,03 6,92 6,2 5,5 513 +300,7*
Corante A214 4,79 7,11 5,73 0,05 14,3 -
P. simplicissimum em
A214
4,40 7,24 5,34 5,38 20 +39,9*
L. edodes em A214
5,03 7,05 5,41 0,78 100 +599,3*
Corante MXC 4,87 6,15 4,88 0,02 2,5 -
P. simplicissimum em
MXC
4,89 7,38 4,97 4,75 100 +3900*
L. edodes em MXC
4,94 7,54 4,65 5,50 1000 +40000*
Nota: OD – Oxigênio dissolvido; FTd – Fator de toxicidade; * aumento da toxicidade
4. Resultados e Discussão
67
4.2.5.2.2. Avaliação de genotoxicidade utilizando sangue periférico humano
(Ensaio Cometa).
Testes de genotoxicidade utilizando células de mamíferos são considerados
apropriados para identificação do potencial risco de grande quantidade de compostos
químicos à saúde humana. Atualmente o Ensaio Cometa tem atraído muita atenção como um
teste indicador de genotoxicidade (PARK & CHOI, 2007).
Assim foi realizada avaliação da genotoxicidade dos corantes têxteis V198, A21,
A214 e da mistura MXC e dos tratamentos destes corantes pelos fungos selecionados
anteriormente L. edodes e P. simplicissimum (item 4.1.5.).
Na Tabela 11 estão apresentados os grupos que foram estabelecidos com o objetivo de
comparar os resultados obtidos no Ensaio Cometa com seus respectivos controles.
Assim, foram feitas as seguintes comparações em relação as Unidades Arbitrárias
Totais (UAT):
- grupo A: os valores dos solventes H
2
O, PBS e PDB foram comparados ao controle
celular;
- grupo B: os valores de PDB+V198, PDB+A21, PDB+A214 e PDB+MXC foram
comparados ao controle de meio de cultura PDB;
- grupo C: os valores de H
2
O+V198, H
2
O+A21, H
2
O+A214 e H
2
O+MXC foram
comparados ao controle negativo H
2
O;
- grupo D: o valor do controle positivo MMS foi comparado ao solvente PBS
- grupo E: os valores de PDB+V198+Le e PDB+V198+Pen foram comparados ao
controle PDB+V198;
- grupo F: os valores de PDB+A21+Le e PDB+A21+Pen comparados ao controle
PDB+A21;
- grupo G: os valores de PDB+A214+Le e PDB+A214+Pen comparados ao controle
PDB+A214;
- grupo H: os valores de PDB+MXC+Le e PDB+MXC+Pen comparados ao controle
PDB+MXC;
4. Resultados e Discussão
68
Tabela 11: Relação dos grupos de controle comparados com as respectivas amostras testadas
após a realização do Ensaio Cometa utilizando células sanguíneas.
Grupo
A
Controle
celular
(sangue)
Grupo B
Controle
PDB
Grupo C
Controle
H
2
O
Grupo
D
controle
PBS
Grupo E
Controle
PDB+V198
Grupo F
Controle
PDB+A21
Grupo G
Controle
PDB+A214
Grupo H
Controle
PDB+MXC
H
2
O PDB+V198 H
2
O+V198 MMS PDB+V198+Le PDB+A21+Le PDB+A214+Le PDB+MXC+Le
PDB PDB+A21 H
2
O+A21 - PDB+V198+Pen PDB+A21+Pen PDB+A214+Pen PDB+MXC+Pen
PBS PDB+A214 H
2
O+A214 - - - - -
- PDB+MXC H
2
O+MXC - - - - -
Nota: PDB – Meio de cultura caldo de batata; MMS – metil metano sulfonato; Le – L. edodes;
Pen –
P. simplicissimum.
Os resultados obtidos no teste de citotoxicidade e de genotoxicidade utilizando células
sanguíneas estão apresentados na Tabela 12.
Em relação à citotoxicidade não foi observado em nenhuma das amostras testadas
resposta tóxica, pois os percentuais de viabilidade celular em todas as amostras testadas foram
superiores a 98% (Tabela 12).
No ensaio de genotoxicidade os solventes PDB, PBS e H
2
O não apresentaram
diferença significativa (p>0,05) quando comparados com controle celular, ou seja, nenhum
dos solventes utilizados foi genotóxico. O controle positivo MMS apresentou diferença
significativa (p<0,05) quando comparado ao seu controle, PBS, confirmando a resposta
positiva à genotoxicidade (Tabela 12).
Neste estudo os corantes do tipo azo ou que contêm esta classe de corante, H
2
O+V198,
H
2
O+A214, H
2
O+MXC e PDB+MXC, apresentaram características genotóxicas significativas
(p<0,05). Tsuboy et al. (2007) avaliaram o potencial genotóxico de um azo corante, Azul
dispersivo 291, através do Ensaio Cometa e também observaram significativo dano ao DNA.
Outro estudo observou genotoxicidade em 17 dos 24 corantes do tipo azo testados (TSUDA et
al., 2000). Sendo assim, este teste é sensível para detecção de genotoxicidade destes tipos de
compostos.
4. Resultados e Discussão
69
Entretanto, os azo corantes V198 e A214 quando diluídos em PDB não apresentaram
genotoxicidade significativa, o que pode caracterizar interferência do meio PDB reduzindo a
genotoxicidade destes corantes, uma vez que foram genotóxicos quando diluídos em água
(H
2
O). Assim, esta característica deve ser melhor avaliada uma vez que pode ser interferente
em resultados positivos à genotoxicidade.
A mistura MXC foi considerada a mais tóxica, pois apresentou característica
genotóxica significativa (p<0,05) tanto do corante em PDB (PDB+MXC), 132 UAT, quanto
do diluído em H
2
O (H
2
O+MXC), 54 UAT quando comparados aos seus respectivos controles.
Portanto, a mistura MXC pode estar potencializando a toxicidade dos corantes testados
individualmente, como ocorre nos efluentes têxteis, no qual há mistura de corantes. Através
da exposição de amostras de efluentes têxteis às células sanguíneas de peixes, foi detectado
genotoxicidade através do Ensaio Cometa (SUMATHI et al., 2001).
O único corante testado que não apresentou em nenhuma das condições avaliadas
característica genotóxica foi a ftalocianina A21, tanto na diluição em H
2
O quanto em PDB.
No entanto, quando foram testados os tratamentos deste corante pelos fungos foi observado
que o tratamento deste corante por L. edodes apresentou característica genotóxica
significativa (p<0,05), assim os produtos da degradação deste corante por L. edodes podem ter
influenciado para o surgimento desta característica (Tabela 12).
O tratamento do corante V198 por P. simplicissimum e por L. edodes não
apresentaram características genotóxicas quando comparados ao controle de solvente PDB.
Assim, estes fungos foram eficientes na descoloração de V198 (item 4.1.5.) e não
apresentaram potencial genotóxico após o tratamento deste corante.
Os demais tratamentos realizados por
P. simplicissimum não apresentaram
genotoxicidade, deste modo o produto final obtido após o tratamento por este fungo não foi
tóxico às células, tornado este fungo atraente para aplicação na descoloração, pois apresentou
bom percentual de descoloração anteriormente (Tabela 8) e neste experimento não causou
dano ao DNA das células sanguíneas.
O tratamento de MXC por
P. simplicissimum (PDB+MXC+Pen) apresentou redução
na genotoxicidade (82 UAT) quando comparado ao controle PDB+MXC (132 UAT), porém
não foi significativa, pois p=0,05. Já para o tratamento realizado por L. edodes apresentou
redução da genotoxicidade (52 UAT) que foi considerada altamente significativa, pois
p<0,01.
4. Resultados e Discussão
70
Assim, P. simplicissimum não apresentou características genotóxicas após o
tratamento de todos os corantes e conseguiu reduzir a toxicidade da mistura MXC. L. edodes
reduziu significativamente a genotoxicidade da mistura MXC, o mais tóxico de todos, porém
apresentou aumento da toxicidade da ftalocianina, A21. Ambos os fungos não apresentam
potencial genotóxico da maioria dos corantes testados e ainda são capazes de reduzir o
potencial genotóxico da mistura, MXC. Portanto, estes resultados sugerem que estes fungos
apresentam potencial para serem aplicados em biorremediação, pois além destes resultados
positivos em relação à genotoxicidade, eles descolorem eficientemente os corantes e a mistura
deles.
Neste estudo foi realizado apenas um experimento e não dois experimentos
independentes como recomendado para garantir a confiabilidade dos resultados obtidos
(HARTMANN & SPEIT, 1987). Mas futuramente deverão ser realizados, inclusive para a
publicação deste trabalho em revista científica.
Foi observada ainda a necessidade de teste com ativação metabólica, pois em estudo
realizado por Sharma & Sobti (2000) constatou-se que os corantes testados na ausência de
ativação metabólica apresentaram baixo potencial genotóxico, sendo este potencial
aumentado na presença da fração S9, enzimas microssomais. Assim, outros estudos com os
corantes e os tratamentos fúngicos também deverão ser realizados a fim de serem observados
a potencialização da genotoxicidade em células sanguíneas ou redução desta característica na
presença de fração S9.
4. Resultados e Discussão
71
Tabela 12: Resultados do Ensaio Cometa e do ensaio de citotoxicidade em células sanguíneas
humana.
Amostras Classes de Dano ao DNA (%)
Controles 0 1 2 3
UAT Células
viáveis (%)
A controle-celular 85,5 9,5 1,0 4,0 47 (±2,8) 100
B PDB 91,5 4,5 3 1 27 (±0,7) 100
C PBS 90,5 5,5 1,5 2,5 32 (±1,4) NT
D H
2
O 94,5 4 0,5 1 16 (±1,4) NT
MMS 0 3 23,5 73,5
547** (±6,4) 98,5
H
2
O+V198 94 4 0 2 99* (±1,4) NT
E PDB+V198 74,5 14 4,5 7 20 (±19,8) 98
PDB+V198+Le 89,5 5 3,5 2 36 (±4,2) NT
PDB+V198+ Pen 92 6,5 0,5 1 21 (±7,8) 98,5
H
2
O+A214 90,5 6 0,5 3 32* (±2,8) NT
F PDB+A214 72 13 8,5 6,5 99 (±21,9) 98,5
PDB+A214+ Pen 86,5 9,5 2 2 39 (±4,9) 100
PDB+A214+ Le 92 4 2,5 1,5 27 (±2,1) 99,5
H
2
O+A21 92 5 5,5 1 1,5 (±5,7) NT
G PDB+A21 97,5 2 0 0,5 7 (±0,7) 100
PDB+A21+ Pen 87 11 2 0 30 (±14,1) 100
PDB+A21+ Le 85 11,5 3 0,5
38 (±4,2) 99,5
H
2
O+MXC 81,5 12,5 3,5 2,5 54* (±1,4) NT
H PDB+MXC 52,5 33 10,5 4
132** (±1,4) 100
PDB+MXC+ Pen 69,5 22 6,5 2 82 (±12,7) 99,5
PDB+MXC+Le 76 22,5 1 0,5
52*(±4,2) 100
Nota: PDB – Meio de cultura caldo de batata; MMS – metil metanosulfonato; Le – L. edodes;
Pen –
P. simplicissimum; Classes de dano: 0- sem dano, 1 –dano leve, 2 –dano moderado, 3 –
dano severo; NT- não testado; UAT – Unidades Arbitrárias Totais; (±valor) – desvio padrão;
* p<0,05; ** p<0,01;
4.2.5.2.2. Ensaio de mutagenicidade utilizando a bactéria Salmonella typhimurium
(Teste de Ames)
Dados da literatura demonstram o potencial mutagênico de diferentes tipos de corantes
através do Teste de Ames (KNASMÜLLER et al., 1993; JÄGER et al., 2004), que é uma
metodologia de triagem validada para detecção de substâncias mutagênicas (MARON &
AMES, 1983).
Simultaneamente ao Teste de Ames devem ser realizados os testes de toxicidade, a fim
de observar o crescimento das linhagens bacterianas, em meio rico (LB). Quando o
crescimento bacteriano for inferior a 70% em relação ao controle, então a amostra é
considerada tóxica e esta toxicidade pode influenciar na detecção de mutagenicidade.
Deste modo, a fim de verificar o potencial mutagênico e a toxicidade antes e após o
tratamento por P. simplicissimum e L. edodes dos corantes monoazo V198, da ftalocianina de
4. Resultados e Discussão
72
cobre A21, do diazo A214 e da mistura MXC foram realizados experimentos quantitativos,
utilizando diferentes linhagens de Salmonella typhimurium, TA97, TA98, TA100 e TA102,
que permitem avaliar a mutagênese por deslocamento do quadro de leitura por adição de
bases, deslocamento do quadro de leitura por adição e deleção de bases, substituição de pares
de bases e danos oxidativos, respectivamente.
Foi incluído ao teste, como controle negativo, além da H
2
O, o meio de cultura PDB,
uma vez que estava presente em todas as amostras de tratamento dos corantes, deste modo
seria importante avaliar se este não estaria interferindo na promoção da mutação espontânea,
favorecendo “falsos positivos” ou influenciando nos resultados de toxicidade dos tratamentos.
PDB sem corante na presença de L. edodes e de P. simplicissimum também foram
incluídos ao experimento para observação da toxicidade e do potencial mutagênico de
metabólitos produzidos pelo próprio metabolismo fúngico na ausência do corante. E ainda os
corantes dissolvidos em H
2
O para serem observadas possíveis interferências da mistura de
PDB com o corante teste (V198, A21, A214 e a mistura MXC).
Na tabela 13 estão descritos os grupos que foram criados a fim de serem comparados
com os resultados obtidos no Teste de Ames e de toxicidade com seus respectivos controles.
Para obter os valores médios referentes ao índice de mutagenicidade (I.M.) e às
sobrevivências (%) foram realizadas as seguintes comparações:
- grupo A: os valores de PDB, H
2
O+V198, H
2
O+A21, H
2
O+A214 e H
2
O+MXC foram
comparados ao controle negativo H
2
O;
- grupo B: os valores de PDB+Le, PDB+Pen, PDB+V198, PDB+A21, PDB+A214 e
PDB+MXC foram comparados ao controle de meio de cultura PDB;
- grupo C: os valores de PDB+V198+Le e PDB+V198+Pen foram comparados ao
controle PDB+V198;
- grupo D: os valores de PDB+A21+Le e PDB+A21+Pen comparados ao controle
PDB+A21;
- grupo E: os valores de PDB+A214+Le e PDB+A214+Pen comparados ao controle
PDB+A214 e;
- grupo F: os valores de PDB+MXC+Le e PDB+MXC+Pen comparados ao controle
PDB+MXC.
4. Resultados e Discussão
73
Tabela 13: Relação dos grupos controle comparados com as respectivas amostras testadas
após a realização do Teste de Ames e citotoxicidade utilizando a bactéria Salmonella
typhimurium
.
Grupo A
Controle H
2
O
Grupo B
Controle PDB
Grupo C
Controle
PDB+V198
Grupo D
Controle
PDB+A21
Grupo E Controle
PDB+A214
Grupo F Controle
PDB+MXC
PDB PDB+Le PDB+V198+Le PDB+A21+Le PDB+A214+Le PDB+MXC+Le
H
2
O+V198 PDB+Pen PDB+V198+Pen PDB+A21+Pen PDB+A214+Pen PDB+MXC+Pen
H
2
O+A21 PDB+V198 - - - -
H
2
O+A214 PDB+A21 - - - -
H
2
O+MXC PDB+A214 - - - -
- PDB+MXC - - - -
Nota: PDB – Meio de cultura caldo de batata; Le – L. edodes; Pen – P. simplicissimum.
4.2.5.2.2.1. Resposta tóxica e mutagênica utilizando a Linhagem TA97.
Não foi observado mutagenicidade em nenhuma das condições testadas com a
linhagem TA97, pois o Índice de Mutagenicidade (I.M.) foi menor que 2,0, tanto na ausência
(-S9), quanto na presença (+S9) de metabolização (Tabela 14). Sendo assim, não foram
detectadas mutações por adição de pares de base.
Nenhuma das amostras testadas apresentaram toxicidade à linhagem TA97 na ausência
de metabolização (-S9). No entanto, após a metabolização (+S9) foi observado toxicidade em
várias amostras (Tabela 14). Por esta razão, foi importante avaliar através da adição de
enzimas microssomais (+S9) se há indução ou inibição das atividades dos compostos
presentes nas amostras testadas.
Todas as amostras em que L. edodes esteve presente foram tóxicas, após a
metabolização (+S9), exceto na presença do corante A214 (Tabela 14). Provavelmente
produtos do próprio metabolismo deste fungo foram tóxicos para esta linhagem bacteriana,
impedindo que a mesma fosse capaz de se desenvolver. Esta afirmação pode ser comprovada,
pois na ausência de corante L. edodes apresentou toxicidade, estes resultados positivos à
toxicidade podem ter mascarado resultados positivos de mutagenicidade.
A redução da toxicidade do corante A214 por L. edodes pode estar relacionada à
transformação deste corante pelo fungo (Tabela 8), que produziu compostos menos tóxico ao
metabolismo das bactérias.
4. Resultados e Discussão
74
O corante V198, em H
2
O e PDB, não apresentou resposta tóxica, deste modo pode-se
inferir que os produtos da degradação deste corante ou metabólitos produzidos pelo
metabolismo de
L. edodes foram ativados pelas enzimas microssomais (+S9) tornando-os
tóxicos a esta linhagem bacteriana (TA97).
Conneely et al. (1999) detectaram cobre livre no sobrenadante após o tratamento do
mesmo corante utilizado neste estudo, A21, pelo basidiomiceto
Phanerochaete chrysosporium
e em outro estudo o mesmo corante foi classificado como o mais tóxico dentre os corantes
avaliados por ter inibido o crescimento fúngico (NOVOTNÝ et al., 2004). Também foi
observada a toxicidade de outros corantes com presença de metais em relação à bactéria
Pseudomonas putida e segundo os autores desta investigação, a presença de metais após a
descoloração pode ter gerado produtos mais tóxicos devido à precipitação ou floculação dos
metais (BOSCHKE et al., 2007). Assim, a toxicidade observada nos tratamentos por ambos os
fungos na presença de A21 pode ter sido resultado da presença do cobre no meio que inibiu o
desenvolvimento desta linhagem bacteriana.
O corante A214 e a mistura MXC foram muito tóxicos após a metabolização (Tabela
14). Este resultado pode indicar alta sensibilidade da linhagem bacteriana aos produtos da
metabolização (+S9) de corantes do tipo diazo ou de componentes da estrutura deste corante.
Assim, este resultado tóxico pode indicar potencial mutagênico por adição de pares de base
destes corantes, uma vez que não permitiu o bom desenvolvimento desta linhagem e
consequentemente a detecção de resposta mutagênica.
Vale ressaltar que o corante A214 e a mistura MXC diluídos em água apresentaram
maior resposta tóxica do que em meio de cultura PDB, o que pode significar certa
interferência do meio.
A mistura dos corantes MXC na presença de metabolização (+S9) foi considerada a
mais tóxica, apresentando toxicidade antes e após o tratamento pelos fungos. O tratamento por
L. edodes aumentou a toxicidade em 26,6% e o tratamento por P. simplicissimum reduziu
2,2% da toxicidade da mistura MXC (Tabela 14).
Vanhulle et al. (2008) observaram apenas 30% de redução da toxicidade, após a
degradação de amostra de efluente têxtil, que é composto por uma mistura de corantes, pelo
basidiomiceto Pycnoporus sanguineus. Assim, apesar Vanhulle et al. (2008) terem observado
maior percentual de redução da toxicidade do que neste estudo, foi concluído que a misturas
de corantes, por serem mais complexas, são difíceis de serem detoxificadas.
4. Resultados e Discussão
75
Portanto, o tratamento com P. simplicissimum não foi tóxico após o tratamento de
V198, reduziu a toxicidade de V198, de A214 e da mistura MXC, mas por outro lado
aumentou a toxicidade do corante A21. Já o tratamento com
L. edodes foi tóxico após o
tratamento de V198, aumentou a toxicidade de A21 e da mistura MXC, mas reduziu a
toxicidade de A214.
Tabela 14: Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA97.
Linhagem TA97
Amostras -S9 + S9
I.M. Sobrevivência I.M. Sobrevivência
Média % Média %
H
2
O 1,0 236 100 1,0 357 100
PDB 1,0 284 100 0,9 384 100
PDB + Le 1,4 589 100 0,6
189 49,2
PDB + Pen 0,4 319 100 1,2 329 85,7
H
2
O + V198 0,8 240 100 1,0 387 100
PDB + V198 1,3 328 100 0,8 583 100
PDB + V198 + Le 0,9 412 100 1,1
398 68,3
PDB + V198 + Pen 0,9 230 70,2 0,9 474 81,2
H
2
0 + A21 0,7 191 80,9 0,9 340 95,4
PDB + A21 1,2 315 100 1,0 500 100
PDB + A21 + Le 0,9 370 100 0,9
323 64,7
PDB + A21 + Pen 0,7 682 100 0,7
179 35,8
H
2
0 + A214 0,8 249 100 0,8
122 34,2
PDB + A214 1,2 376 100 1,0
238 61,8
PDB + A214 + Le 0,8 395 100 0,7 273 100
PDB + A214 + Pen 0,7 368 98 0,7 257 100
H
2
O + MXC 1,0 178 75,4 0,7
25 7
PDB + MXC 1,2 487 100 0,7
213 55,5
PDB + MXC + Le 0,9 571 100 1,4
61 28,6
PDB + MXC + Pen 0,8 395 81,2 1,4
123 57,7
Nota: Respostas positivas à mutagenicidade ou à toxicidade estão em negrito (tóxico<70% e mutagênico >2,0);
PDB – Meio de cultura caldo de batata; Le –
L. edodes; Pen – P. simplicissimum; I. M. – índice de
mutagenicidade; Controle positivo: 4-Nitroquinolona 1- Óxido (4NQO), I.M (-S9)= 2,3 e I.M. (+S9)= 4,6.
4.2.5.2.2.2. Resposta tóxica e mutagênica utilizando a linhagem TA98.
Não foi observada mutagenicidade das amostras testadas com a linhagem TA98 tanto
na ausência (-S9) quanto na presença (+S9) de ativação metabólica, ou seja, não foram
evidenciadas mutações por adição ou deleção de pares de base.
No entanto, foi observada resposta tóxica dos corantes V198, A21 e da mistura MXC
após a metabolização (+S9), indicando a necessidade de bioativação (+S9) destes corantes
para a geração de compostos tóxicos (Tabela 15). Já o corante A214 não foi tóxico a esta
linhagem tanto na ausência (-S9) quanto na presença (+S9) de metabolização.
Moawad et al. (2003) observaram toxicidade à linhagem TA98 com todos os corantes
do tipo azo testados. No presente estudo foi observada toxicidade do corante azo V198 e da
4. Resultados e Discussão
76
mistura MXC, mas não foi observada toxicidade do corante azo A214. Sendo assim, a
estrutura do corante pode ter influenciado na resposta tóxica, portanto esta linhagem
bacteriana seria mais sensível aos corantes do tipo monoazo, como o corante V198, do que
aos corantes do tipo diazo, como o corante A214.
A amostra com corante V198 tratada por L. edodes apresentou toxicidade na ausência
(-S9) de metabolização, mas a metabolização (+S9) tornou os produtos tóxicos produzidos
pela degradação deste corante e/ou metabólitos do próprio metabolismo deste fungo em
compostos inócuos a esta linhagem bacteriana.
O corante A21, a ftalocianina de cobre, apresentou toxicidade após a metabolização
(34,5% de sobrevivência). Osugi et al. (2006) observaram que outro corante tipo ftalocianina
de cobre apresentou efeito tóxico a esta mesma linhagem TA98 após o tratamento por
oxidação fotoeletrocatalítico. Ao contrário do resultado obtido por Osugi et al. (2006), as
amostras deste corante tratadas por
L. edodes, na ausência (-S9) e na presença (+S9) de
ativação metabólica, e por
P. simplicissimum, após a ativação metabólica (+S9), não
promoveram aumento da toxicidade deste corante a esta linhagem, mas sim a redução.
O corante A214 após o tratamento por L. edodes apresentou toxicidade antes e após a
metabolização (Tabela 15). Assim, possíveis produtos da degradação deste corante por L.
edodes, que anteriormente foram visivelmente transformados de azul para uma coloração
avermelhada (Figura 30) influenciaram na resposta tóxica à esta linhagem bacteriana.
Anteriormente a mistura MXC já havia apresentado característica tóxica para a
linhagem TA97 (Tabela 14), deste modo a toxicidade apresentada para TA97 e TA98 pode
estar mascarando resultados positivos a mutagenicidade do tipo deslocamento no quadro de
leitura por adição de pares de base que é o tipo de mutação detectada por ambas as linhagens.
A amostra com a mistura MXC tratada por L. edodes apresentou o mesmo percentual
de toxicidade deste corante em PDB, após a metabolização (+S9) (Tabela 15), assim a
toxicidade do corante foi ativada após a adição da fração S9 e o tratamento com este fungo
não foi capaz de reduzir a resposta tóxica.
Todas as amostras testadas na presença de P. simplicissimum na ausência de
metabolização (-S9), apresentaram toxicidade, no entanto foi observado que na ausência do
corante (PDB+Pen) foi detectada toxicidade (Tabela 15), ou seja, compostos produzidos
naturalmente pelo próprio metabolismo deste fungo, podem estar sendo tóxicos a esta
4. Resultados e Discussão
77
linhagem bacteriana. Após a ativação metabólica (+S9) a toxicidade de todas as amostras
tratadas por este fungo foram reduzidas, exceto a amostra do fungo sem corante.
Portanto,
L. edodes aumentou a toxicidade de V198 e A214, reduziu a toxicidade de
A21 e não apresentou toxicidade após o tratamento da mistura MXC, na ausência de
metabolização (-S9). Após a metabolização (+S9) reduziu a toxicidade de V198 e A21,
aumentou a toxicidade de A214 e apresentou a mesma toxicidade da mistura MXC, ou seja,
não reduziu a toxicidade. Já
P. simplicissimum na ausência de ativação metabólica (-S9) foi
tóxico em todas as amostras em que estava presente, mas após a adição da fração S9 reduziu o
potencial tóxico apresentado pelos corantes V198, A21 e da mistura MXC e o tratamento do
corante A214 não foi tóxico.
Ramsay & Nguyen (2002) associaram a toxicidade apresentada pela descoloração de
corantes do tipo azo pelo basidiomiceto Trametes versicolor à produção de possíveis produtos
da descoloração e/ou outros metabólitos excretados pelo fungo ao longo do período de
incubação como ácidos orgânicos. Deste modo, deve-se levar em consideração as respostas
tóxicas apresentadas por P. simplicissimum e L. edodes, uma vez que os fungos produzem
naturalmente compostos tóxicos às bactérias.
Tabela 15: Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA98.
Linhagem TA98
Amostras -S9 + S9
I.M. Sobrevivência I.M. Sobrevivência
Média % Média %
H
2
O 1,0 43 100 1,0 101 100
PDB 1,5 55 100 1,2 176 100
PDB + Le 1,1 332 100 0,4 134 76,4
PDB + Pen 1,2
32 58,2
0,7
90 51
H
2
O + V198 1,3 41 94,2 0,6 309 100
PDB + V198 0,8 66 100 1,1
49 27,6
PDB + V198 + Le 0,9
27 40,2
1,2 129 100
PDB + V198 + Pen 1,2
20 29,5
0,3 63 100
H
2
0 + A21 1,4 35 81,4 1,7 95 100
PDB + A21 0,9 313 100 1,0
61 34,5
PDB + A21 + Le 1,0 286 91,2 1,4 92 100
PDB + A21 + Pen 1,4
57 18,1
1,3 180 100
H
2
0 + A214 1,3 57 100 0,9 164 100
PDB + A214 1,4 220 100 1,4 214 100
PDB + A214 + Le 0,9
99 44,9
0,8
113 52,7
PDB + A214 + Pen 1,3
82 37,1
1,8 156 72,8
H
2
O + MXC 1,6 274 100 1,0 99 100
PDB + MXC 1,1 129 100 0,9
56 31,9
PDB + MXC + Le 1,2 246 100 0,9
56 31,9
PDB + MXC + Pen 1,0
21 15,9
0,8 197 100
Nota: Respostas positivas a mutagenicidade ou a toxicidade estão em negrito (tóxico<70% e mutagênico >2,0);
PDB – Meio de cultura caldo de batata; Le –
L. edodes; Pen – P. simplicissimum; I. M. – índice de
mutagenicidade; Controle positivo: 4-Nitroquinolona 1- Óxido (4NQO), I.M (-S9)= 5,8 e I.M. (+S9)= 3,0.
4. Resultados e Discussão
78
4.2.5.2.2.3. Resposta tóxica e mutagênica à Linhagem TA100 de Salmonella
typhimurium.
Em nenhuma das análises realizadas com a linhagem TA100 foi observada
mutagenicidade, no entanto as amostras H
2
O+V198 e H
2
O+A21 apresentaram toxicidade, na
ausência de ativação metabólica, e esta característica foi reduzida após a metabolização (+S9)
(Tabela 16).
Mathur et al. (2005) observaram que 6 dos 7 corantes azo testados foram mutagênicos
na ausência de ativação metabólica em relação à linhagem TA100. Em outro estudo, Novótny
et al. (2006) encontraram resposta mutagênica positiva para TA98 e TA100 na presença do
corante azo Laranja Reativo 16 (LR16), tanto na ausência quanto na presença de ativação
metabólica. Ao contrário destes estudos, no presente estudo não foi observado
mutagenicidade dos corantes azo testados na presença de TA98 e TA100, o que
possivelmente pode ser resultado da influência da toxicidade, ou ainda devido a estrutura dos
corantes (KNASMÜLLER et al., 1993; WANG et al., 2008).
O tratamento dos corantes V198, A21 e da mistura MXC pelos fungos não apresentou
toxicidade à esta linhagem bacteriana em nenhuma das condições testadas.
Já o tratamento do corante A214 por
L. edodes e P. simplicissimum apresentou
toxicidade, na ausência de ativação metabólica (Tabela 16), ou seja, compostos produzidos
pela descoloração deste corante foram tóxicos às bactérias e podem ter ocultado possíveis
mutações por substituição de pares de base que são detectadas por TA100. Após a ativação
metabólica (+S9) a toxicidade apresentada no tratamento por ambos os fungos foi reduzida, o
que pode indicar transformação destes metabólitos a compostos inócuos.
4. Resultados e Discussão
79
Tabela 16: Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA100.
Linhagem TA100
Amostras -S9 + S9
I.M. Sobrevivência I.M. Sobrevivência
Média % Média %
H
2
O 1,0 86 100 1,0 114 100
PDB 0,9 34 100 0,7 108 94,3
PDB + Le 1,0 71 100 1,4 107 93,9
PDB + Pen 1,6 120 100 0,8 109 95,2
H
2
O + V198 0,8
53 61,6
0,8 98 86
PDB + V198 1,1 35 100 0,9 140 100
PDB + V198 + Le 0,8 45 100 1,6 115 81,8
PDB + V198 + Pen 1,4 54 100 1,4 170 100
H
2
0 + A21 0,7
58 67,4
0,5 130 100
PDB + A21 0,8 38 100 1,1 163 100
PDB + A21 + Le 1,1 57 100 0,9 123 75,2
PDB + A21 + Pen 1,4 68 100 1,0 138 84,4
H
2
0 + A214 0,7 131 100 0,7 96 84,2
PDB + A214 0,9 122 100 1,2 107 93,9
PDB + A214 + Le 1,4
56 45,5
1,1 139 100
PDB + A214 + Pen 1,7
84 68,9
1,0 209 100
H
2
O + MXC 0,5 91 100 0,7 81 71,1
PDB + MXC 0,9 59 100 1,1 149 100
PDB + MXC + Le 1,2 73 100 0,9 105 70,7
PDB + MXC + Pen 1,6 65 100 1,0 210 100
Nota: Respostas positivas à mutagenicidade ou à toxicidade estão em negrito (tóxico<70% e mutagênico >2,0);
PDB – Meio de cultura caldo de batata; Le –
L. edodes; Pen – P. simplicissimum; I. M. – índice de
mutagenicidade; Controle positivo: Azida Sódica (AS), I.M (-S9) =10,6 e I.M. (+S9) = 8,4.
4.2.5.2.2.4. Resposta tóxica e mutagênica à Linhagem TA102.
Na presença da linhagem TA102 os corantes diluídos em H
2
O, na ausência de
metabolização, apresentaram toxicidade, exceto A21, mas todos apresentaram redução da
toxicidade após a metabolização (+S9) (Tabela 17). Como observado com a linhagem TA100
(Tabela 16), somente os corantes diluídos em H
2
0 apresentaram resposta tóxica, o que pode
caracterizar influência do meio de cultura PDB na redução da toxicidade dos corantes para
estas linhagens. Dos tratamentos fúngicos somente a amostra PDB+A214 tratado por P.
simplicissimum apresentou toxicidade após metabolização (Tabela 17).
Os tratamentos dos corantes V198 e MXC por P. simplicissimum INCQS 40211, sem
ativação metabólica (-S9), exibiram efeito mutagênico significativo, I.M. 2,1 e I.M. 5,6
respectivamente (Tabela 17), o que indica que ocorreram danos oxidativos ao DNA.
Provavelmente estes danos foram induzidos por produtos da degradação destes corantes por
P. simplicissimum INCQS 40211, uma vez que foi observado anteriormente redução na
coloração da biomassa adsorvida por este fungo e ainda desaparecimento do pico
característico do corante (item 4.1.5.). Após ativação metabólica, a mutagenicidade do corante
V198 e da mistura MXC foi reduzida, porém a mistura MXC tratada por este fungo
permaneceu com características mutagênicas (I.M. 2,3), ou seja, as enzimas presentes na
4. Resultados e Discussão
80
fração S9 atuaram na redução desta característica, mas não eliminaram a mutagenicidade
apresentada no tratamento da mistura MXC por P. simplicissimum INCQS 40211 (Tabela 17).
El-Rahim & Moawad (2003) testaram a capacidade de descoloração de dois corantes
do tipo azo, Direto Marrom e Polar Vermelho, por duas espécies de
Aspergillus e observaram
mutagenicidade após o tratamento fúngico por adsorção. Assim, fungos que atuam como
adsorventes também podem exibir mutagenicidade, o que evidência a grande importância da
realização de ensaios toxicológicos após a descoloração, mesmo por processos de biosorção.
Tabela 17: Teste de mutagenicidade e de toxicidade utilizando a linhagem TA102.
Linhagem TA102
Amostras -S9 + S9
I.M. Sobrevivência I.M. Sobrevivência
Média % Média %
H
2
O 1,0 1386 100 1,0 1118 100
PDB 0,8 1046 75,5 0,7 1256 100
PDB + Le 1,2 1110 100 1,6 992 79
PDB + Pen 1,0 1154 100 1,1 1095 87,2
H
2
O + V198 1,0
943 68,1
1,2 786 70,3
PDB + V198 0,3 871 83,3 1,5 1055 84
PDB + V198 + Le 1,0 907 86,7 0,5 1009 80,3
PDB + V198 + Pen
2,1*
1106 100 1,0 751 71,2
H
2
0 + A21 1,2 1125 81,2 1,3 1317 100
PDB + A21 1,3 1046 100 1,4 965 76,8
PDB + A21 + Le 0,3 936 89,5 0,9 956 99,1
PDB + A21 + Pen 0,5 1098 100 0,7 1152 100
H
2
0 + A214 0,8
856 61,8
0,9 975 87,2
PDB + A214 1,2 937 89,5 1,5 1048 83,4
PDB + A214 + Le 1,3 1017 100 0,8 932 89
PDB + A214 + Pen 0,3 1676 100 0,0
688 65,6
H
2
O + MXC 0,7
750 54,1
1,0 973 87
PDB + MXC 0,3 790 75,5 1,0 950 75,6
PDB + MXC + Le 1,0 1296 100 0,9 840 88,4
PDB + MXC + Pen
5,6**
1045 100
2,3**
1153 100
Nota: Respostas positivas a mutagenicidade ou a toxicidade estão em negrito (tóxico<70% e mutagênico >2,0);
PDB – Meio de cultura caldo de batata; Le –
L. edodes; Pen – P. simplicissimum; I. M. – índice de
mutagenicidade; Controle positivo: 4-Nitroquinolona 1- Óxido (4NQO) I.M. (-S9) = 3,5 e I.M. (+S9) = 7,0.
Estudos posteriores deverão ser realizados para garantir a confiabilidade dos
resultados obtidos no Teste de Ames, pois segundo Maron & Ames (1983) é necessário a
realização de dois experimentos independentes para garantia da confiabilidade dos resultados
obtidos, porém neste estudo não foi possível a realização destes 2 experimentos devido a
quantidade de amostras a serem testadas em curto período de tempo.
4. Resultados e Discussão
81
4.3.5. Resumo de todos os ensaios toxicológicos realizados após o tratamento dos
corantes V198, A21, A214 e da mistura MXC pelos fungos selecionados.
Tabela 18: Resumo dos resultados positivos em relação à toxicidade e mutagenicidade no
Teste de Ames, à genotoxicidade no Ensaio Cometa e à toxicidade com o microcrustáceo
Daphnia pulex.
Teste de Ames
TA97 TA98 TA100 TA102
Testes
Amostras
(-S9) (+S9) (-S9) (+S9) (-S9) (+S9) (-S9) (+S9)
Ensaio
Cometa
Daphnia
pulex
PDB + Le -
TOX
- - - - - - NT NT
PDB + Pen - -
TOX TOX
- - - - NT NT
H
2
O + V198 - - - -
TOX
-
TOX
-
GEN
NT
PDB + V198 - - -
TOX
- - - - -
TOX
PDB + V198 + Le -
TOX TOX
- - - - - -
TOX
PDB + V198 + Pen - -
TOX
- - -
MUT
- - -
H
2
0 + A21 - - - -
TOX
- - - - NT
PDB + A21 - - -
TOX
- - - - -
TOX
PDB + A21 + Le -
TOX
- - - - - -
GEN TOX
PDB + A21 + Pen -
TOX TOX
- - - - - - -
H
2
0 + A214 -
TOX
- - - -
TOX
-
GEN
NT
PDB + A214 -
TOX
- - - - - - -
TOX
PDB + A214 + Le - -
TOX TOX TOX
- - - -
TOX
PDB + A214 + Pen - -
TOX
-
TOX
- -
TOX
-
TOX
H
2
O + MXC -
TOX
- - - -
TOX
-
GEN
NT
PDB + MXC -
TOX
-
TOX
- - - -
GEN TOX
PDB + MXC + Le -
TOX
-
TOX
- - - - -
TOX
PDB + MXC + Pen -
TOX TOX
- - -
MUT MUT
-
TOX
Nota: Le – Lentinula edodes; Pen – Penicillium simplicissimum; TOX – tóxico; MUT – mutagênico; GEN –
genotóxico; NT – não testado; - resposta tóxica não detectada;
A Tabela 18 apresenta os resultados de toxicidade dos corantes e seus tratamentos nos
três testes toxicológicos realizados: com o microcrustáceo Daphnia pulex, com sangue
periférico humano (Ensaio Cometa) e com bactérias S. typhimurium (Teste de Ames).
As amostras com os produtos obtidos pelo metabolismo fúngico na ausência de
corante (PDB+Le e PDB+Pen) foram testados apenas na presença das bactérias S.
typhimurium e apresentaram toxicidade às linhagens TA97 (Tabela 14 e 18) e TA98 (Tabelas
15 e 18). Deste modo, a partir deste resultado foi observada a necessidade de testar estas
amostras também nos outros ensaios toxicológicos a fim de observar o potencial tóxico dos
compostos naturalmente produzidos pelos fungos na ausência do corante na tentativa de
evitar que este fator seja confundido com os produtos da degradação dos corantes.
4. Resultados e Discussão
82
Através da análise do Índice de Mutagenicidade (I.M.) com as linhagens TA97
(Tabela 14), TA98 (Tabela 15) e TA100 (Tabela 16) não foram observados efeitos
mutagênicos, tanto na ausência (-S9) quanto na presença (+S9) de ativação metabólica, em
nenhuma das amostras testadas, uma vez que os valores foram menores que 2 (I.M. <2). No
entanto, foi observada maior sensibilidade das linhagens TA97 e TA98 na detecção de
toxicidade (Tabela 18).
O corante V198 diluído em H
2
O apresentou toxicidade para as linhagens TA100
(Tabela 15) e TA102 na ausência de metabolização (Tabela 16), coincidindo com resultado
positivo à genotoxicidade observado no Ensaio Cometa (Tabela 12). Portanto, a toxicidade
apresentada pode estar mascarando resultados positivos à mutagenicidade do tipo substituição
de pares de base identificado pela linhagem TA100 ou por danos oxidativos identificado pela
linhagem TA102. Este mesmo corante em meio de cultura PDB, foi tóxico somente para a
linhagem TA98 (Tabela 15), que identifica danos por adição ou deleção de pares de base
(Tabela 18).
Alguns corantes do tipo azo são conhecidos por apresentar potencial mutagênico,
entretanto os corantes utilizados neste trabalho não apresentaram mutagenicidade
provavelmente pela toxicidade apresentada em algumas linhagens que poderiam identificar o
tipo de mutação e/ou devido à estrutura dos corantes utilizados, uma vez que a posição das
hidroxilas (GOTTLIEB et al., 2003), a presença de grupos sulfônicos (NOVÓTNY et al.,
2006), nitroaromáticos (UMBUZEIRO et al., 2005) ou aminas influenciam na detecção de
mutagenicidade.
O tratamento de V198 por L. edodes foi tóxico para as linhagens TA97 após a
metabolização (+S9) (Tabela 14 e 18) e para TA98 na ausência de metabolização (-S9)
(Tabela 15 e 18). A toxicidade deste corante foi reduzida por este fungo com a TA 100
(Tabela 16 e 18), TA102 (Tabela 17 e 18) e após a metabolização com a TA98. No entanto,
apresentou toxicidade superior ao corante no teste com as daphnias (Tabela 10 e 18). O
tratamento de V198 por P. simplicissimum foi tóxico somente para a linhagem TA98 na
ausência de metabolização, no entanto foi observado mutagenicidade por danos oxidativos, na
ausência de metabolização (-S9), com a linhagem TA102 (Tabela 17 e 18).
O tratamento do corante A21 por L. edodes teve redução de toxicidade na presença da
linhagem TA98, mas foi tóxico para a linhagem TA97, para o microcrustáceo e no Ensaio
Cometa foi genotóxico para as células sanguíneas (Tabela 12 e 18). O tratamento do mesmo
corante por P. simplicissimum apresentou resposta tóxica após a metabolização (+S9) junto à
4. Resultados e Discussão
83
linhagem TA97 (Tabela 14 e 18) e sem metabolização (-S9) junto à linhagem TA98 (Tabela
15 e 18), mas não apresentou resposta tóxica às daphnias (Tabela 10 e 18).
Segundo Sponza et al. (2006), a variação nos testes de toxicidade pode ser justificada
pela diferença na sensibilidade e resistência dos organismos, e no caso do corante A21, a
presença de cobre pode ter influenciado na redução do número de algumas linhagens
bacterianas e das daphnias após ambos os tratamentos fúngicos.
O corante A214 diluído em H
2
O apresentou toxicidade à linhagem TA97, que
identifica mutação por adição de pares de bases, após a metabolização (+S9) (Tabela 14 e 18)
e à linhagem TA102, que identifica danos oxidativos ao DNA, na ausência de metabolização
(-S9) (Tabela 17 e 18). No Ensaio Cometa, este corante apresentou genotoxicidade (Tabela 12
e 18), ou seja, este corante apresenta potencial para exibição de mutagenicidade através de
mutação por adição de pares de base ou por danos oxidativos, na entanto podem não ter sido
detectados no Teste de Ames devido à toxicidade deste corante a estas linhagens.
O tratamento de A214 por L. edodes foi tóxico para TA98 na ausência e na presença
de metabolização (Tabela 15 e 18) e para TA100 apenas na ausência de metabolização
(Tabela 16 e 18), esta toxicidade também foi observada com as daphnias (Tabela 10 e 18). Já
o tratamento deste corante por P. simplicissimum INCQS 40211 foi tóxico para as linhagens
TA98 e TA100, na ausência de metabolização (-S9), para TA102 na presença de
metabolização (+S9) e para as daphnias.
Assim, estes fungos foram capazes de reduzir a toxicidade quando testado com a
linhagem TA97 (Tabela 14 e 18), mas apresentaram compostos potencialmente tóxicos às
linhagens TA98 (Tabela 15 e 18), TA100 (Tabela 16 e 18), TA102 (Tabela 17 e 18) e as
daphnias (Tabela 10 e 18).
A mistura MXC diluída em H
2
O foi tóxica para TA97 (Tabela 14 e 18), TA102
(Tabela 17 e 18) e ainda apresentou genotoxicidade no Ensaio Cometa (Tabela 12 e 18). A
mistura MXC em PDB também foi tóxica para TA97 (Tabela 14) e TA98 (Tabela 15), sendo
também confirmado como positiva a genotoxicidade no Ensaio Cometa (Tabela 12 e 18). Ou
seja, os resultados tóxicos as linhagens podem ter mascarado resultados positivos a mutação
do tipo adição de pares de base, identificada TA97 e TA98, ou ainda mutação por danos
oxidativos, identificado pela TA102.
O tratamento da mistura MXC por L. edodes aumentou a toxicidade em relação à
TA97 após a metabolização (+S9) (Tabela 14 e 18), não resultou em alteração de sua
4. Resultados e Discussão
84
toxicidade em relação à TA98 (Tabela 15 e 18), reduziu a genotoxicidade (Tabela 12 e 18) e
aumentou a toxicidade no teste com o microcrustáceo Daphnia pulex (Tabela 10 e 18). A
variabilidade nos resultados de toxicidade pode indicar diferença na sensibilidade dos
organismos, quanto à genotoxicidade o tratamento por
L. edodes parece ter sido efetivo na
redução do potencial genotóxico, no entanto a nível ecotoxicológico apresentou efeito
negativo aos microcrustáceos.
O tratamento da mistura MXC por
P. simplicissimum INCQS 40211 não reduziu a
toxicidade em relação às linhagens TA97 (Tabela 14 e 18), foi tóxico na ausência de
metabolização (-S9) e reduziu a toxicidade do corante após a metabolização (+S9) em relação
à linhagem TA98 (Tabela 15 e 18), reduziu a genotoxicidade, mas não foi considerado
significativo (Tabela 12 e 18), apresentou ainda mutagenicidade na presença de TA102
(Tabela 17 e 18) e aumento da toxicidade no teste com o microcrustáceo Daphnia pulex
(Tabela 10 e 18). Assim, os produtos da degradação deste corante por este fungo, que foi
confirmada anteriormente como degradação através da análise do pico característico do
corante (item 4.1.5.), foram transformados em produtos mais tóxicos que o composto original
e ainda mutagênico.
Após extensa pesquisa bibliográfica foi possível constatar que são poucos os trabalhos
que avaliam a toxicidade após os tratamentos de descoloração realizados por fungos. Pode-se
destacar alguns trabalhos como o realizado por Heinfling et al. (1997), onde avaliaram a
toxicidade utilizando o teste com
Vibrio fischeri após o tratamento de corantes azo e
ftalocianina pelo fungo Trametes versicolor, Abadulla et al. (2000) utilizaram a bactéria
Pseudomonas putida para avaliar a toxicidade após a descoloração pelo fungo Trametes
hirsuta
, já El-Rahim & Moawad (2003) testaram o potencial mutagênico após a descoloração
de corantes azo por espécies de
Aspergillus.
Podem ser destacados ainda Rosolen et al. (2004) que avaliaram a capacidade de
descoloração, por espécies de Pleurotus, e de detoxificação através do teste com alface
Lactuca sativa, com a alga Selenastrum capricornutum e do cnidário Hydra attenuata. Ainda
em 2004 foi avaliado o potencial de descoloração de corantes do tipo azo pelo fungo
Cunninghamella elegans, a toxicidade após o tratamento foi medida através do teste com a
bactéria Escherichia coli (AMBRÓSIO & CAMPOS-TAKAKI, 2004). Finalmente
Eichelerová et al. (2007) avaliaram a toxicidade com a planta Lemma minor após a
descoloração de corantes azo pelo fungo Dichomitus squalens.
4. Resultados e Discussão
85
No entanto, em relação ao basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium, muito
estudado devido seu grande potencial de descoloração de corantes, não foram encontrados em
muitos estudos com ensaios toxicológicos associados aos testes de descoloração. Cripps et al
(1990), Spadaro et al (1992), Tatarko & Bumpus (1997), Balan & Monteiro (2001) estudaram
o potencial deste fungo em descolorir diversos tipos de corantes e apresentaram resultados
promissores para aplicação em biorremediação, entretanto não avaliaram a toxicidade após o
tratamento.
Assim, o presente estudo demonstra a grande importância dos testes de ecotoxicidade,
citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade realizados após a descoloração dos corantes
pelos fungos para o ambiente e à saúde humana. Pois, a aplicação destes tratamentos de
descoloração sem o monitoramento toxicológico pode resultar em um elevado risco à saúde
ambiental e conseqüentemente à saúde da população que estará exposta aos diversos tipos de
compostos resultantes dos tratamentos que podem ser mais tóxicos que os compostos
originais.
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5. Considerações finais
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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos nesta dissertação demonstram o potencial de L. edodes INCQS
40220 na descoloração de diferentes corantes têxteis, porém deve ser melhor avaliado, uma
vez que apresentou variações nos resultados de descoloração nas diferentes etapas dos
experimentos. Após a descoloração dos corantes V198 e A21 a toxicidade, avaliada pelo teste
com as daphnias, inicialmente foi reduzida e posteriormente aumentou devido as variáveis da
metodologia, já o tratamento do corante A214 e da mistura MXC resultaram em aumento da
toxicidade. A variação nos resultados de toxicidade com as daphnias demonstraram a
necessidade de padronização deste teste. Já no ensaio com células sanguíneas,
L. edodes foi
capaz de reduzir a genotoxicidade da mistura MXC e no teste com as linhagens bacterianas de
Salmonella typhimurium foi observado resposta tóxica para algumas linhagens,
principalmente TA97, e não apresentou potencial mutagênico com nenhuma das linhagens.
Portanto, com base nestes resultados de toxicidade este fungo tornou-se menos atraente para
aplicação em biorremediação após a realização dos ensaios toxicológicos.
P. simplicissimum INCQS 40211 foi eficiente na descoloração por adsorção e
subseqüente descoloração da biomassa, porém estudos posteriores deverão ser realizados a
fim de identificar os metabólitos produzidos após a descoloração do corante V198 e da
mistura dos corantes MXC uma vez que estes apresentaram resposta positiva à
mutagenicidade na presença da linhagem TA102 que identifica danos oxidativos ao DNA.
Outras análises deverão ser realizadas quanto à detoxificação dos corantes, pois os compostos
produzidos por P. simplicissimum e/ou outros interferentes da metodologia podem ter
influenciado na resposta tóxica no teste com as daphnias e para algumas linhagens de
bactérias de
Salmonella typhimurium, principalmente para a linhagem TA98 onde apresentou
alto grau de toxicidade. Assim, este fungo foi eficiente na descoloração e na detoxificação de
alguns corantes, porém pelas características apresentadas quanto à mutagenicidade até o
momento não é recomendado para aplicação em biorremediação.
Há necessidade de investimento em novos métodos para o tratamento de efluentes,
para prevenir possíveis efeitos deletérios de compostos como os azo corantes aos humanos e
aos organismos aquáticos (TSUBOY et al., 2007). O tratamento de efluentes por fungos pode
ser uma alternativa interessante, no entanto, como demonstrado no presente estudo, os
resultados obtidos com o microcrustáceo
Daphnia pulex, o Teste de Ames e o Ensaio Cometa,
confirmam a grande necessidade da realização das análises toxicológicas após o tratamento
fúngico de corantes.
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6. Conclusões
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6. CONCLUSÕES
As amostras de sedimento do Igarapé Ramal Água Branca (IR), Igarapé Reserva
Ducke ponto N (IDN) e Reserva Ducke ponto Bo (IDB) demonstraram bom percentual de
descoloração. Dessas amostras foram isolados 5 fungos filamentosos, nos quais
Aspergillus
japonicus DKNA1 e Acremonium sp. DKBV1 foram os mais eficientes na descoloração do
corante V198, porém ocorreu através de adsorção do corante pela biomassa.
Fusarium sp.
RV1 apresentou a mesma característica das amostras de sedimento (IR), transformação do
corante, mas a coloração escura do meio não permitiu a seleção deste fungo;
Aspergillus japonicus DKNA1 também foi eficiente na descoloração do corante A21 e
ainda reduziu a toxicidade de ambos os corantes no teste com daphnias, no entanto, por não
apresentar capacidade superior a nossa referência não foi testado na presença de outros
corantes. Após os vários testes de descoloração apenas
L. edodes INCQS 40220, fungo
referência, e
P. simplicissimum INCQS 40211 foram selecionados para os demais ensaios de
descoloração e toxicológicos. Estes fungos foram capazes de descolorir eficientemente todos
os corantes testados, V198, A21, A214 e a mistura MXC. P. simplicissimum inicialmente
adsorveu os corantes testados, mas posteriormente foi capaz descolorir inclusive da biomassa;
Nos ensaios toxicológicos foi demonstrada variação no potencial de redução da
toxicidade pelos fungos selecionados. L. edodes reduziu a toxicidade dos corantes na presença
de algumas linhagens de bactéria Salmonella typhimurium e reduziu a genotoxicidade da
mistura MXC significativamente, mas aumentou a toxicidade dos corantes no segundo teste
realizado com as daphnias.
P. simplicissimum reduziu a toxicidade dos corantes V198 e A21 com as daphnias,
mas aumentou a toxicidade dos corantes A214 e da mistura MXC. No Ensaio Cometa houve
redução no potencial genotóxico da mistura MXC, mas não foi estatisticamente significativo,
já no Teste de Ames foi observado mutagenicidade por dano oxidativo após o tratamento do
corante azo V198 e da mistura MXC. Portanto, os fungos L. edodes e P. simplicissimum
podem ser aplicados na descoloração e detoxificação apenas de alguns corantes.
Assim neste estudo foi demonstrada a importância da avaliação da capacidade dos
fungos em detoxificar os corantes e não somente descolorir. Foi observado que a literatura é
escassa em relação à avaliação da toxicidade após os estudos de descoloração utilizando
fungos, sendo necessário padronizar metodologias toxicológicas para garantir a confiabilidade
nos testes de toxicidade após os tratamentos fúngicos.
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7. Perspectivas
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7. PERSPECTIVAS
- Realizar análise das enzimas envolvidas na descoloração dos corantes por P. simplicissimum
e L. edodes;
- Caracterizar os metabólitos produzidos a partir da transformação dos corantes e avaliar a
toxicidade destes metabólitos;
- Padronizar os ensaios toxicológicos com o microcrustáceo
Daphnia pulex, com as células
sanguíneas (Ensaio Cometa) e com as bactérias (Teste de Ames) reduzindo as possíveis
variáveis;
- Realizar as repetições sugeridas pela literatura do Ensaio Cometa e do teste de Ames;
- Testar outras concentrações dos corantes que apresentarem toxicidade, para detectar
possíveis efeitos mutagênicos;
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8. Referências bibliográficas
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