( PDF ) Estudo da estabilidade térmica da redutase da Adenosina 5'-Fosfosulfato-reduzida em meio aquoso via dinâmica molecular

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE FÍSICA

Programa de Pós-Graduação em Física

Dissertação de Mestrado

Estudo da Estabilidade Térmica da Redutase da Adenosina

5’- Fosfosulfato-reduzida em meio aquoso via Dinâmica

Molecular

Elias Silva dos Santos

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE FÍSICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FÍSICA

Estudo da Estabilidade Térmica da Redutase da Adenosina

5’- Fosfosulfato-reduzida em meio aquoso via Dinâmica

Molecular

Elias Silva dos Santos

Orientador: Prof. Dr. Elias Ramos de Souza

Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando Almeida

Dissertação apresentada ao Instituto de Física

da Universidade Federal da Bahia para a

obtenção do título de Mestre em Física.

Salvador - 2007

Estudo da Estabilidade Térmica da Redutase da Adenosina 5’-

Fosfosulfato-reduzida em meio aquoso via Dinâmica Molecular

Elias Silva dos Santos

Abstract

The reduced Adenosine 5’ phosphosulfate Reductase- APSR-red is an oxireductase involved

in the biogenics production of sulﬁde gas, where it is responsible for the reduction of the

APS - Adenosine 5’phosphosulfate to sulﬁte. In this work we use the technique of the

Molecular Dynamics to study some structural and dynamical aspects of the APSR-red from

the hyperthermophilic A. fulgidus. The RAPS-red contains a molecule of FAD not covalently

bound, on and two iron-sulphur centers, coordinated by cisteins, that are responsible for

the transfer of two electrons to the FAD molecule from the protein surface. The topology

of the macromolecule was built with the Gromacs classic force ﬁeld and with the semi-

empirical and ab initio calculations, in order to obtain parameters to the FAD and do the

iron-sulphur centers. Here we present the results obtained from three 5ns simulations, in an

aqueous media, at the temperatures of 300K, 311K and 363K and at the pressure of 1bar.

The results indicate that the conformation of the protein backbone does not experience

any considerable change at all of the temperature simulations. However, the region mainly

formed by alfa helix is the most ﬂexivel one of the protein and therefore the transistion

process must there be initiated. The FAD molecule is quite ﬂexible and remais bound do the

protein by some hydrogen bonds and by non speciﬁc forces. Also, the iron-sulphur clusters

conformations remain nearly unchanged during all of the simulations, but the elargement of

the active sitio access channel is observed at the optimal temperature for hyperthermophilic

organisms (363K).

Resumo

A enzima Redutase da Adenosina 5’ - Fosfosulfato reduzida - RAPS- red é uma oxiredutase

que está envolvida na produção biogênica de gás sulfídrico, cujo processo é responsável pela

redução da APS - Adenosina 5‘- Fosfosulfato a sulﬁto. Neste trabalho, nós utilizamos a téc-

nica da Dinâmica Molecular (DM) para estudar aspectos estruturais e dinâmicos da RAPS-

red da arqueobactéria Archaeoglobus fulgidus, a qual contém uma FAD - Flavina Adenina

de nucleotídeo, ligada não covalentemente, e dois centros de ferro-enxofre, coordenados por

cisteínas, os quais são responsáveis pela transferência de dois elétrons da superfície da pro-

teína até a FAD. A topologia da molécula foi construída utilizando-se o campo de forças

clássico do GROMACS, com o auxílio de cálculos semi-empíricos e de cálculos ab initio para

a obtenção de parâmetros, respectivamente, para a FAD e para os centros de ferro-enxofre.

São aqui apresentados os resultados de três simulações de 5ns, em meio aquoso, nas temper-

aturas de 300K, 311K e 363K e na pressão de 1bar. Os resultados das simulações indicam

que o esqueleto da proteína mantém a sua estrutura tridimensional praticamente inalterada

nas três simulações e que a região formada principalmente por hélices alfa é a região mais

ﬂexível da proteína. A FAD goza de grande ﬂexibilidade e mantém-se ligada à enzima por

uma pequena rede de pontes de hidrogênio e pelas interações não-especíﬁcas. Os centros

de ferro-enxofre também mantêm as suas conformações praticamente inalteradas durante

todas as simulações, enquanto que observa-se o alargamento do canal que dá acesso ao sítio

ativo na temperatura ótima para organismos hipertermofílicos (363K).

Agradecimentos

Primeramente

A Deus Todo Poderoso autor e criador do Universo.

Especialmente

A meu amigo e colega Dermeval, pelos estudos e discussões. Ao Prof. Elias Ramos

por ter me acolhido como orientando. Ao Prof. Paulo Almeida pelos esclarecimentos sobre

organismos mesóﬁlos e hipertermóﬁlos. A Arlan Gonçalves pela ajuda na construção das

cargas parciais dos centros de ferro-enxofre. A Alan Hilter pelas dicas sobre o GROMACS.

À Profa. Maria das Graças Martins sem a qual não teríamos terminado este trabalho. Aos

colegas e amigos do Mestrado.

(Este trabalho foi ﬁnanciado pela CENPES/Petrobrás)

“A distância entre loucura e genialidade é medida ape-

nas pelo sucesso”

Eliott Caver.

iii

Aos meus pais

José Epifânio (in memory) e Cacildinha

A minha esposa Selma

pela paciência e a minha ﬁlha Elise por alegrar minha vida.

Conteúdo

Lista de Figuras viii

Lista de Tabelas x

Introdução 1

0.1 Redução Desassimilativa do Sulfato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

0.2 Estrutura Molecular da Redutase da Adenosina 5

- Fosfosulfato Desassimilativa-

reduzida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

0.2.1 A Molécula de Flavina Adenina de Nucleotídeo - FAD e Centros

Metálicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1 Fundamentação Teórica 15

1.1 Teoria da Dinâmica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.1.1 Interações Importantes em Sistemas Biológicos . . . . . . . . . . . . 20

1.1.2 Algoritmo de Verlet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.1.3 Algoritmo Leapfrog . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1.1.4 Otimização da Geometria Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Algoritmo Steepest-Descent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Algoritmo Gradiente Conjugado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.1.5 Topologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.2 Teoria do Orbital Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2 Metodologia 28

2.1 Preparando a Molécula para Simulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.2 Construção da Topologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3 Simulação no Gromacs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.3.1 Minimização de Energia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.3.2 Parâmetros de Simulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

vii

3 Resultados e Discussão 34

3.1 Propriedades Gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2 Canal de Acesso para a FAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.3 Sítio Ativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.3.1 Centros de ferro-enxofre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4 Conclusão e Perspectivas 58

5 Apêndice 62

5.0.2 Apêndice A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

5.0.3 Apêndice B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Bibliograﬁa 86

viii

Lista de Figuras

0.1 Cadeia Polipepídica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

0.2 Ciclo do Enxofre. Os passos 1, 3 e 4 representam a transformação do sulfato

a sulfeto pela via desassimilativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

0.3 Mecanismo de Catálise da RAPS. (A) Ataque nucleofílico do átomo N

molécula de FAD sobre o enxofre da APS. (B) Formação do intermediário

FAD-APS. (C) Rearanjo espontâneo de elétrons. (D) O intermediário FAD-

APS decai para AMP e o sulﬁto é liberado. (adaptado de Fritz et al. 2002). 10

0.4 Vista Stereo da estrutura dos domínios da RAPS. A subunidade alfa foi

colorida de acordo com o domínio da estrutura. O domínio de ligação da FAD

é mostrado em azul, o domínio em chapéu é mostrado em ciano e o helicoidal

em azul claro. A subunidade beta é mostrada em vermelho (adaptado de

Schiﬀer,2003). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.1 Estrutura da RAPS-red duplicada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.1 DRQM com respeito a estrutura cristalografada. FAD em marron (300 K) em

margenta (311 K) e verde (363 K). O Esqueleto da enzima em ciano (300 K),

laranja (311 K) e preto (363 K). O aumento da temperatura leva ao aumento

do DRQM para a FAD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.2 Raio de giro da FAD. Preto (300 K) , azul (311 K) e vermelho (363 K). . . . 39

3.3 Raio de giro da proteína. A temperatura de azul (300 K), marron (311 K) e

vermelho (363 K). A proteína mantém praticamente o mesmo volume para

temperaturas abaixo de 311K. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.4 A ﬂutuação da raiz quadrática média para a faixa de temperatura de cresci-

mento de organismos mesóﬁlos. Preto (300 K) e verde (311 K). . . . . . . . 41

3.5 As conformações do canal que leva ao sítio ativo são mostradas a cada 1 ns

de simulação na temperatura de 311 K. Resíduos carregados estão em azul.

Entre 2 ns e 4 ns os resíduos que contornam o canal apresentam-se mais dis-

tantes, facilitando a passagem de grandes substratos. . . . . . . . . . . . . 43

3.6 Raio de giro do canal que leva ao sítio ativo. Preto (300 K), verde (311 K)

e azul (363 K). Nota-se uma pequena queda no diâmetro do canal de acesso

na temperatura ambiente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.7 Pontes de hidrogênio entre a FAD e a proteína. Preto (300 K), verde (311 K)

e azul (363 K). As pontes de hidrogênio têm papel importante do ponto

de vista estrutural, por ajudar na estabilidade da FAD, como também é

fundamental para as propriedades catalíticas da enzima. . . . . . . . . . . . 46

3.8 Molécula de FAD (modiﬁcada de FEENSTRA, 2002). . . . . . . . . . . . . 48

3.9 Flutuação do ângulo formado entre os vetores C

−C

e C

10A

−N

. Preto

(300 K), verde (311 K) e azul (363 K). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.10 Flutuação do ângulo formado pelos planos da ﬂavina e adenina. Vermelho

(300 K), verde (311 K) e azul (363 K). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.11 Vista das conformações da molécula de FAD, nas três temperaturas de sim-

ulação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.12 Raio de giro do centro I. Preto (300 K) , vermelho (311 K) e azul (363 K). . 53

3.13 Raio de giro do centro II. Preto (300 K), vermelho (311 K) e azul (363 K).

Flutuações observadas no centro II indicam que o ambiente lhe confere menos

rigidez que o centro I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.14 Distâncias entre os centros de ferro-enxofre. Azul (300 K), amarelo (311K)

e vermelho 363 K. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.15 Rede de pontes de hidrogênio no último nanosegundo de simulação na tem-

peratura de 363 K modula o potencial dos centros de ferro-enxofre e pode

estar ligada com o mecanismo de transferência de elétrons. . . . . . . . . . . 56

Lista de Tabelas

2.1 Cargas atômicas parciais para FS4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.1 Resumo das interações não ligadas durante os 5ns de dinâmica para as duas

temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.2 Resumo das propriedades energéticas do sistema calculadas das trajetórias

simuladas da DM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Introdução

As proteínas constituem a maior parte da matéria seca de uma célula. Entretanto,

não são apenas elementos constituintes das células, pois executam praticamente todas as

funções celulares. Uma molécula de proteína é formada por uma longa cadeia de aminoáci-

dos, na qual cada aminoácido está unido ao seu vizinho por uma ligação peptídica covalente.

Os aminoácidos são distinguidos dos outros por sua cadeia lateral (grupo-R). Essas cadeias

são mantidas juntas por ligações covalentes, as quais se realizam pelo compartilhamento de

elétrons entre átomos ligados. Os grupos-R dos aminoácidos são ligados ao átomo carbono

central C

. Ele é conectado de um lado pelo nitrogênio do NH

(terminal-N), o grupo

amino, e do outro pelo C

do grupo carboxílico COOH (terminal C). Ao remover-se um

átomo H do NH

e o OH do COOH , um novo resíduo é adicionado à proteína quando

a ligação entre N e C

, chamada ponte peptídica, é formada. Como a ligação peptídica é

planar e não gira como as outras pontes ao longo do esqueleto da proteína, as rotações em

torno das ligações N − C

e C

−C

determinam a estrutura tridimensional do esqueleto

da proteína e os ângulos de rotação são descritos por diedrais (ângulo formado por quatro

átomos consecutivos). O ângulo Φ representa a rotação em torno de N −C

e Ψ em torno

de C

−C

, Fig.0.1.

Figura 0.1: Cadeia Polipepídica.

As enzimas constituem uma importante classe de proteínas, já que são respon-

sáveis por determinar as transformações químicas que ocorrem nas células, quando se ligam

a outras moléculas chamadas substratos, convertendo-as em produtos quimicamente modiﬁ-

cados, podendo acelerar uma reação química por milhares de vezes sem que sofram alteração

em sua estrutura ou propriedades químicas agindo, assim, como aceleradores ou biocatal-

izadores de reações quando constroem ou destroem uma ligação covalente [1]. Muitas enzi-

mas são compostas totalmente por aminoácidos, enquanto algumas apresentam outros com-

ponentes como íons metálicos ou grupos orgânicos essenciais para sua atividade catalítica.

O metal geralmente é ligado à enzima no sítio de ligação que pode incluir cisteínas ou his-

tidinas. A ação catalítica de qualquer enzima é inﬂuenciada por fatores ﬁsicos, químicos ou

físico-químicos como a temperatura ou pH. De uma maneira geral, as enzimas podem ser

inativadas por exposição a altas temperaturas; entretanto, aquelas que são encontradas em

organismos termóﬁlos, ou hipertemóﬁlos podem suportar temperaturas da ordem de 100

◦

Diz-se que um organismo é termóﬁlo se sua temperatura de crescimento é maior que 45

◦

Um organismo que cresce a temperaturas acima de 80

◦

C é dito hipertermóﬁlo.

Na natureza muitos microrganismos podem sintetizar, degradar ou converter di-

versos compostos em seus vários estados de valência, desde os estados mais reduzidos aos

mais oxidados. Alguns desses organismos são capazes de viver em condições extremas de

temperatura, pressão, salinidade ou mesmo pH. O termo extremóﬁlo foi usado para designar

organismos que se desenvolvem em ambientes extremos. Com a descoberta da arqueobac-

téria, o terceiro ramo da árvore da vida, na década de 70, que inclui organismos hiperter-

móﬁlos, os quais apresentam temperaturas ótimas (temperatura em que o organismo tem

crescimento máximo) acima de 80

◦

C, na década de 80, abriram-se novas perspectivas a

respeito da origem da vida. Essa característica de suportar temperaturas elevadas implica

estabilização de todos os componentes celulares de modo que a sua funcionalidade seja man-

tida em condições de temperatura que seriam danosas para outros organismos, embora as

proteínas desses organismos termóﬁlos sejam compostas pelos mesmos 20 aminoácidos que

se apresentam nas demais proteínas. Estudos comparativos com proteínas de outros organ-

ismos mesóﬁlos (organismos que crescem na faixa de temperatura entre 25

◦

C e 45

◦

C) não

revelam diferenças consistentes na estrutura tridimensional correlacionáveis com diversos

graus de termoestabilidade. Desta forma, a energia de estabilização de proteínas oriun-

das de termóﬁlos varia muito pouco comparada com uma homóloga vinda de mesóﬁlos.

Pequenas diferenças na estrutura primária são responsáveis por produzir essa estabiliza-

ção adicional [2]. Mudanças pontuais de resíduos em enzimas resultaram em aumento na

estabilidade térmica e na atividade catalítica [3].

As enzimas mostram uma diminuição de sua capacidade catalítica na presença

de algumas moléculas ou inibidores. Alguns, não especíﬁcos, podem inibir várias enzimas;

outros inibem apenas determinada enzima ligando-se especiﬁcamente à mesma e alterando

sua forma. Há ainda a inibição irreversível, na qual o inibidor se liga covalentemente à

enzima formando compostos estáveis inativos.

Diferentes espécies de bactérias são encontradas em superfícies submersas na água

produzindo uma quantidade muito grande de enzimas. Enzimas como as hidrogenases de

bactérias redutoras de sulfato (BRS) anaeróbias promovem a corrosão do ferro atuando

diretamente nas reações de redução dissimilativa levando à dissolução de ﬁlmes, óxidos

ou hidróxidos que protegem a superfície metálica, causando a perda ou a diminuição da

estabilidade das camadas passivas sobre a superfície metálica [4].

A produção biológica de gás sulfídrico (biossulfetogênese) pelas BRS ocasiona

sérios problemas econômicos à indústria de petróleo devido às propriedades corrosivas deste

composto que afetam os sistemas de produção, transporte e armazenamento de óleo e gás

bem como à qualidade do petróleo e gás produzidos. Além disso, a alta toxicidade do gás

sulfídrico representa riscos elevados à saúde do pessoal de campo, às populações, e prejuízos

signiﬁcativos ao meio ambiente das áreas circunvizinhas.

Na indústria petrolífera, a biossulfetogênese leva a sérios problemas econômicos,

devido à corrosão de oleodutos, como também ambientais, pela letalidade do gás.

Após a extração primária de petróleo dos reservatórios localizados em alto mar

(oﬀshore) é comum a injeção de água salgada para facilitar a extração secundária do óleo.

Contudo, a água do mar rica em sulfato, estimula o crescimento de BRS com a subsequente

produção de H

S, gás altamente tóxico e corrosivo que contamina o gás natural e o petróleo,

além de provocar a corrosão de superfícies metálicas e entupimento de reservatórios devido à

formação de precipitados de enxofre. Como os campos de petróleo são quase que ilimitados

na quantidade de potenciais doadores de elétrons, a atividade da BRS pode ser limitada

diminuindo a oferta de aceptores de elétrons. A presença de hidrocarbonetos pode induzir

a biodegradação do metal devido às propriedades desses compostos para formar bioﬁlmes

sobre a superfície metálica durante a produção, transporte e estocagem do óleo.

Um grupo muito comum de BRS cresce a temperaturas entre 25

◦

C e 38

◦

C, en-

quanto os termofílicos são capazes de funcionar eﬁcientemente a mais de 60

◦

C, em reser-

vatórios oﬀshore, devido à temperatura desses reservatórios profundos [5].

Distintas alternativas têm sido propostas para o controle da produção biogênica

de gás sulfídrico. A produção de H

S pode ser controlada pela adição de biocidas junto

com a água ou inibidores de redução do sulfato, mas essas alternativas são anti-econômicas

e não produzem o efeito desejado.

Uma alternativa é o uso de nitrato, o qual estabelece uma competição entre dois

grupos de bactérias: bactéria redutora de nitrato (BRN) e a BRS. Interações entre os

ciclos do enxofre e do nitrogênio podem impactar a produção, acumulação e eliminação

do sulfeto. Ambos ânions (sulfato e nitrato) funcionam como aceptores de elétrons para

diferentes grupos de bactérias e a competição é baseada em propriedades termodinâmicas,

cinéticas e no potencial redox, uma vez que a produção biogênica de sulfeto não ocorre

quando o potencial redox está acima de -100mV, pois o crescimento das BRS é inibido

pela elevação deste potencial. Do ponto de vista termodinâmico a redução do nitrato para

nitrogênio ou amônia produz mais energia livre que a redução do sulfato [6]. Resultados

recentes mostram que a concentração e fonte de carbono inﬂuenciam o tratamento com

nitrato, promovendo o crescimento das BRN, em detrimento do crescimento das BRS [7].

Uma outra alternativa é a remoção do sulfato da água do mar através de nanoﬁl-

tração, mas o método apresenta custo elevado para ser aplicado em larga escala [8].

0.1 Redução Desassimilativa do Sulfato

O Ciclo do enxofre (Fig.0.2) mostra a transformação do enxofre inorgânico em seus

vários estados de oxidação. Na redução assimilativa o sulfato é transformado em sulfeto

Figura 0.2: Ciclo do Enxofre. Os passos 1, 3 e 4 representam a transformação do sulfato a

sulfeto pela via desassimilativa.

envolvendo no processo dois intermediários: a APS - adenosina 5



− fosfosulfato (via APS)

e a PAPS - adenosina 3



-fosfato 5



- fosfosulfato (via PAPS). A via APS é usada comumente

por organismos que realizam fotossíntese oxigênica a exemplo de cianobactérias, algas e

plantas, enquanto o intermediário PAPS é utilizado por organismos que fazem uma foto-

síntese anoxigênica como a bactéria Echerichia coli. A redução desassimilativa do sulfato é

usada na conservação de energia por bactérias redutoras de sulfato e arqueobactérias. Os

equivalentes redox que são gerados por oxidação de compostos orgânicos são transferidos

para o sulfato pelo sistema de transporte de elétrons. Essa capacidade para usar o sulfato

como aceptor ﬁnal de elétron é característica de alguns organismos, incluindo gram-positivos

(Desulfotomaculum) e gram-negativos (Desulfovíbrio), eubactéria redutora de sulfato [9] e

a arqueobactéria redutora de sulfato, Archaeoglobus fulgidus [10]. A redução do sulfato a

enxofre envolve três enzimas: Sulfurilase da adenosina trifosfato (SATP), Eq. 0.1; Redutase

da adenosina 5



− fosfosulfato (RAPS), Eq. 0.2, e a Redutase do sulﬁto (RSI), Eq. 0.3. A

estrutura e função das enzimas presentes nas reações acima referidas têm sido estudadas por

técnicas experimentais, em particular análises bioquímicas, difração de raios X e ressonân-

cia magnética nuclear (RMN). Entretanto, a compreensão de suas propriedades pode ser

consideravelmente melhorada utilizando técnicas da Dinâmica Molecular (DM), as quais

permitem mimetizar o comportamento dessas proteínas através de experimentos in silico.

A aplicação de técnicas da DM para investigar o comportamento das propriedades estru-

turais e dinâmicas em solução da Redutase da APS pode gerar informações importantes

com respeito à estabilidade das interações e ao movimento de resíduos na enzima, a qual

constitui, dentre as três enzimas acima mencionadas, aquela cuja estrutura tridimensional

é melhor conhecida experimentalmente. A redutase da APS catalisa a reação de redução da

APS. As equações abaixo mostram a cadeia de reações que levam à redução desassimilativa

do sulfato a sulfeto. O sulfato, resultante da oxidação do S

−2

, S ou S

−2

é facilmente

assimilável pela maioria dos organismos contudo, é estável e não reativo, pelo que deve ser

ativado, antes de ser utilizado, num processo chamado adenilação. Esse processo requer

que uma porção da adenosina 5’ fosforilo da ATP seja transferida para o sulfato, conforme

Eq.0.1. Na segunda reação, a Redutase da APS catalisa a reação de redução da APS, en-

quanto a terceira equação ﬁnaliza a seqüência reduzindo o sulﬁto a sulfeto utilizando seis

elétrons provenientes do NADPH dissociável ou de ﬂavinas coordenadas [11].

MgAT P + SO

−2

SAT P

→ MgP P

+ APS (0.1)

APS + 2e

−

RAP S

→ AMP + HSO

−

(0.2)

HSO

−

+ 6e

−

+ 6H

RSI

→ HS

−

+ 3H

O (0.3)

A RAPS tem sido encontrada em alguns grupos de BRS. Essa enzima catalisa

a redução da APS, cuja quebra hidrolítica da ligação S-O-P produz ≈ 80 kcal/mol. Esta

energia é usada pela RAPS no processo de transformação da APS para sulﬁto e Adenosina

Monofosfato (AMP) [12]. O processo de redução se dá através do ataque nucleofílico do

átomo N5 da Flavina Adenina Dinucleotídeo reduzida (FADH

) sobre o enxofre da APS

para formar a ligação FAD-APS. Este intermediário decompõe-se em AMP pelo rearranjo

espontâneo de elétrons, após o que o sulﬁto dissocia-se e o FAD oxidado é recuperado,

Fig.0.3. A redução da APS ocorre com a transferência de dois elétrons ao FAD através dos

centros de ferro-enxofre I e II. Na estrutura da RAPS-red depositada no Protein Data Bank

- PDB, sob o código 1JNR, estes centros estão a 9.7 Å um do outro e a distância entre o S

do cluster I e o grupo metil C

da FAD é de 12.4 Å.

0.2 Estrutura Molecular da Redutase da Adenosina 5

- Fos-

fosulfato Desassimilativa-reduzida

A estrutura da Redutase da APS foi puriﬁcada e obtida para três bactérias: Desul-

fovíbrio desulfuricans, Desulfovíbrio vulgaris, Thiobacillus denitriﬁcans e para a arqueobac-

téria Archaeoglobus fulgidus [11]. A RAPS reduzida (RAPS-red) da Archaeoglobus fulgidus

Figura 0.3: Mecanismo de Catálise da RAPS. (A) Ataque nucleofílico do átomo N

molécula de FAD sobre o enxofre da APS. (B) Formação do intermediário FAD-APS. (C)

Rearanjo espontâneo de elétrons. (D) O intermediário FAD-APS decai para AMP e o sulﬁto

é liberado. (adaptado de Fritz et al. 2002).

serviu como padrão para este estudo. Ela foi resolvida através da técnica da difração de

raios X, resolução de 1.6 Å, na ausência de oxigênio, concluindo-se que é constituída por

dois heterodímeros α

. Entretanto, análises utilizando dinâmica de espalhamento de luz

e ﬁltração em gel indicam que em alguns organismos a RAPS forma um heterodímero αβ

em solução [12], o que permite inferir que a diferença estrutural entre a proteína em solução

e a proteína na forma de cristal isolado é, provavelmente, causada pela concentração da

proteína e pelas condições do tampão utilizado no processo de cristalização. Desta forma,

pode-se concluir que a unidade funcionalmente essencial é um heterodímero αβ com massa

molecular de 95kDa, e dimensões 56 x 65 x 70 Å. A subunidade α de 75kDa abriga uma

molécula de FAD, a qual está no estado reduzido de dois elétrons e encontra-se a cerca de

30 Å da superfície da enzima, e a subunidade β com 20kDa contém dois centros de ferro-

enxofre [4Fe-4S]

. A subunidade α é dividida em três domínios: o domínio de ligação da

molécula de FAD, o helicoidal e o em chapéu.

A subunidade β também pode ser dividida em três domínios: o primeiro que abriga

os centros de ferro-enxofre [4Fe-4S]

, ambos tendo a forma de cubos distorcidos, separados

por uma distância de 9.7 Å, Fig.0.4, sendo cada centro coordenado por quatro cisteínas.

O cluster II encontra-se mais próximo à superfície e portanto bem exposto ao solvente,

enquanto o cluster I está mais próximo a FAD. O segundo domínio é composto por três

folhas β antiparalelas e o terceiro, terminal c, forma uma cauda que envolve a subunidade

α. Os centros ferro-enxofre I e II têm potencial redox em torno de -60 mV e -500 mV,

respectivamente [12].

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Figura 0.4: Vista Stereo da estrutura dos domínios da RAPS. A subunidade alfa foi colorida

de acordo com o domínio da estrutura. O domínio de ligação da FAD é mostrado em azul,

o domínio em chapéu é mostrado em ciano e o helicoidal em azul claro. A subunidade beta

é mostrada em vermelho (adaptado de Schiﬀer,2003).

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0.2.1 A Molécula de Flavina Adenina de Nucleotídeo - FAD e Centros

Metálicos

Para estudar o comportamento dinâmico de enzimas contendo o grupo prostético

FAD, molécula orgânica não protéica complexa, é preciso levar em conta sua conformação

na catálise. Já que ele está localizado no sítio ativo da enzima, seu estudo pode produzir

informações importantes sobre a dinâmica do centro ativo. A FAD pode existir em duas

conformações: a estendida ou aberta, responsável pela sua ﬂuorescência

e a empilhada ou

fechada, na qual o anel isoaloxazina e o anel adenina interagem através de ligações π − π.

Em solução sua conformação é notadamente fechada [13], sendo as forças de dispersão de

London-van der Waals o principal fator na manutenção dessa conformação.

Os centros metálicos apresentam grande diversidade, principalmente devido à var-

iedade de diferentes arranjos de ligantes sobre a rede metálica. Existem centros dos mais

simples como os binucleares, que podem existir com ou sem ligação metal-metal, aos mais

complexos com alta nucleatividade, incorporando átomos de hidrogênio, carbono, enxofre,

fósforo e nitrogênio. São encontrados em proteínas de transferência de elétrons, em motivos

de ligação de DNA incluindo a transcrição do fumarato da proteína redutora de nitrato em

sua função regulatória (produção de amônia) para mudar o metabolismo de aeróbio para

anaeróbio [14] ou na aconitase, onde os centros ferro-enxofre estão envolvidos em processos

regulatórios tais como centros de degradação, conversão, ou processos redox. Os centros

ferro-enxofre em tais sistemas são importantes como unidades estruturais determinantes,

devido a suas interações com ligantes de proteínas e como centros reativos, por causa de

O FAD emite luz verde

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suas propriedades eletrônicas podendo aceitar, liberar e armazenar elétrons, a exemplo do

[NiFe]-hidrogenase do Desulfovíbrio gigas, onde três centros alinhados deﬁnem a etapa de

transporte de elétrons em direção à saída da proteína. Os centros de ferro-enxofre também

podem ligar e ativar substratos como o ligante do citrato para o centro Fe

da aconitase

[15].

Capítulo 1

Fundamentação Teórica

1.1 Teoria da Dinâmica Molecular

Simulações de Dinâmica Molecular fazem uso das leis da física clássica para ex-

plicar e interpretar o comportamento de átomos e moléculas. Como estamos tratando de

sistemas de muitos corpos as simulações são essencialmente mecânica estatística computa-

cional, onde a termodinâmica descreve a tendência dos processos químicos, expressando

as relações energéticas entre os vários estados possíveis como também o comportamento

cinético para o qual o processo ocorre.

A trajetória no espaço de fase é obtida através das equações do movimento de

Newton, baseando-se nos seguintes princípios:

a. Os núcleos e elétrons são tratados como partículas tipo átomos;

b. As partículas são esféricas com carga líquida;

c. As interações entre as partículas incluem as ligações cujos potenciais são de-

scritos por interações através de molas e as forças eletrostática e de van der Waals. Os

potenciais clássicos determinam a distribuição espacial das partículas e suas energias.

Na DM existem vários campos de forças, sendo que cada campo de força é composto

por um conjunto de funções que deﬁnem como a energia potencial de uma molécula varia

com as posições de seus átomos componentes, os quais constituem um conjunto de tipos

de átomos que descrevem diferentes características e comportamento para um elemento

dependendo do ambiente onde se encontre, além de um conjunto de parâmetros que ajustam

as funções e os átomos a dados experimentais. O conjunto parâmetros deﬁne constantes

de força, que são valores usados nas funções para relacionar características atômicas a

componentes da energia e dados estruturais, tais como comprimentos de ligações, ângulos,

ângulos diedrais e diedrais impróprios formados entre elas.

As forças que agem sobre os átomos são obtidas calculando-se a primeira derivada

do potencial em relação às coordenadas atômicas. Em seguida, tais forças são usadas para

a solução das equações do movimento de Newton.

Os comprimentos das ligações químicas oscilam em torno de um valor de equilíbrio.

No campo de forças do GROMACS tais ligações são descritas pela Lei de Hooke aproxi-

mando o sistema a um oscilador harmônico representado por massas unidas por molas. A

energia potencial associada à variação do comprimento destas ligações é descrita por:

(x − x

)

. (1.1)

onde K

representa a constante que associa a ligação química em apreço, x é o comprimento

da ligação e x

é o comprimento de equilíbrio da ligação.

As oscilações angulares são também representadas por um potencial harmônico do

tipo

(θ − θ

)

, (1.2)

onde K

é a constante do potencial harmônico angular, θ é o ângulo entre duas ligações

químicas e θ

é o valor do ângulo de equilíbrio.

Um terceiro potencial é deﬁnido com o objetivo de descrever a variação angular

entre estruturas planares formadas por grupos de quatro átomos, em que um átomo central

i é ligado a três outros j, k, l

(ξ − ξ

)

, (1.3)

onde ξ é o ângulo formado entre os planos i, j, k e j, k, l.

O termo torcional para representar a rotação em torno de ligações químicas é

representado pelo menor termo da expansão de cossenos

= K

[1 + cos (nφ − δ)] , (1.4)

onde n é o número de mínimos para a torção, φ é o ângulo diedral para a ligação central e

δ é a defasagem no ângulo diedral.

As forças de dispersão de London-van der Waals entre os átomos são representadas

por potenciais contendo termos de longo e curto alcance, representados pela interação de

van der Waals

= 4







−







, (1.5)

onde  é o comprimento do poço entre as barreiras atrativa e repulsiva e σ representa o

diâmetro do poço.

Por ﬁm, o termo Coulombiano

= f

, (1.6)

onde f =

4πε

, q

e q

são as cargas dos átomos i e j, r é a distância entre eles, e ε

constante dielétrica do meio.

Assim, a energia potencial total é representada pela soma dos termos descritos

acima

V =



n=1

(x − x

)



n=1

(θ − θ

)



n=1

(ξ − ξ

)

+ (1.7)



n=1

[1 + cos (nφ − δ)] +



i<j



(i, j)

)

−

(i, j)

)

+ f



, (1.8)

na qual os três primeiros termos a direita da igualdade correspondem aos potenciais har-

mônicos somados sobre as N

ligações químicas, os N

ângulos entre pares de ligações

consecutivas e os N

ângulos diedrais impróprios respectivamente. O quarto termos a di-

reita da igualdade corresponde ao potencial torcional somado sobre os N

ângulos diedrais

próprios. O termo seguinte corresponde aos potenciais de van der Waals e Coulomb so-

mados sobre todos os pares de átomos i e j exluindo-se os primeiros e segundos vizinhos

quimicamente ligados. Os parâmetros  e σ do potencial de van der Waals são substituídos

pelas constantes C

(i, j) e C

(i, j).

Desta forma, a Hamiltoniana do sistema molecular é composta pela soma das

energias potenciais e energia cinética em função do conjunto de coordenadas de posição

−→

e momento

−→

para os átomos do sistema. As velocidades atômicas

→

, são relacionadas

com a temperatura absoluta, T , através da relação



i=1

T, (1.8.1)

onde m

é a massa do átomo, K

é a constante de Boltzmann e a soma é sobre os N átomos.

Inicialmente em T (0) = 0 as velocidades v

(0) = 0, à medida que a temperatura aumenta

as velocidades são corrigidas conforme a Eq.1.8.1.

A Hamiltoniana do sistema é dada pela Eq.1.9a

H = K + V (1.9a)

•

−→

∂H

∂

−→

, (1.9b)

•

−→

= −

∂H

∂

−→

onde K é a energia cinética do sistema. Resolvendo numericamente o sistema de equações

dado por 1.9b, temos as trajetórias atômicas no espaço de fase, ou seja, a evolução temporal

das posições e velocidades dos átomos e, como resultado, as energias dos átomos. Numa

boa simulação a energia total tende a estabilizar-se com o tempo, porém erros de integração

e atritos entre as partículas produzem ruídos térmicos; deste modo, a troca de calor entre

o sistema e um reservatório térmico pode manter a temperatura num valor desejado.

Como não se pode simular um meio inﬁnito, ou suﬁcientemente grande para ser

deﬁnido ﬁsicamente como inﬁnito, no qual a molécula esteja inserida, o sistema pode ser

simulado sob condições periódicas de contorno através, por exemplo, de uma caixa cúbica,

de forma que ela possa ser cercada por suas imagens transladadas e que respeite um certo

raio de corte R

1.1.1 Interações Importantes em Sistemas Biológicos

Quando dois ou mais átomos se unem para formar uma molécula as forças que at-

uam para ligar um átomo fortemente a outro na molécula são chamadas de forças covalentes.

Elas se caracterizam pelo compartilhamento de elétrons entre os átomos envolvidos na lig-

ação. Ligações covalentes são interações fortes com energias da ordem de ~50-250 kcal/mol,

responsáveis por manter juntas as cadeias principal e lateral da proteína. Reações bioquími-

cas que envolvem a quebra de ligação covalente são normalmente catalizadas por enzimas.

As interações de van der Waals são descritas como combinações entre uma interação

de longo alcance e uma outra de curto alcance. O termo de curto alcance surge da repulsão

devida à sobreposição das nuvens eletrônicas e varia com o inverso da décima segunda

potência da distância entre os átomos. Por outro lado, o termo de longo alcance surge

como resultado da interação entre ﬂutuações quanto-mecânicas dos momentos de dipolo

dos átomos, variando com o inverso da sexta potência e a repulsão eletrostática do núcleo

com o átomo mais próximo. Esta energia pode estabilizar uma estrutura se muitos contatos

forem formados. Quando isso não acontece surgem os efeitos estéricos que põem limite ao

número de conformações da proteína. O raio de van der Waals deﬁne o volume ocupado por

um átomo o qual é "impenetrável" para outros átomos e moléculas a temperaturas normais

e é medido a partir da distância mínima entre átomos vizinhos não covalentemente ligados

no estado cristalino.

As fontes de cargas elétricas estáticas na proteína, em condições normais, vêm de

resíduos de aminoácidos carregados, normalmente expostos ao solvente, ou interagindo com

resíduos de cargas opostas chamadas de pontes salinas, como também da partilha desigual

de elétrons em uma ligação covalente, quando alguns elementos mais eletronegativos que

outros atraem mais fortemente elétrons que seu parceiro.

A ponte de hidrogênio é um tipo especial de interação atrativa, que é veriﬁcada

quando da interação próxima entre átomos de hidrogênio ligado covalentemente a um átomo

deﬁnido doador com um átomo não ligado deﬁnido aceptor, ambos eletronegativos. Os

átomos doadores, que junto com o hidrogênio formam um dipolo elétrico, podem ser o

nitrogênio, oxigênio, enxofre e ﬂuor. A energia envolvida em pontes de hidrogênio é da

ordem de 1 a 6 kcal/mol, superior à energia de ruído térmico, que é da ordem de 0,6 kcal/mol,

na temperatura ambiente, porém inferiores às ligações iônicas.

Elas são usadas para estabilizar e determinar a estrutura de macromoléculas, como

as proteínas e ácidos nucléicos, além de participar do processo de catálise em enzimas.

Força hidrofóbica é a forma de descrever como interações água-água tendem a ser

mais favoráveis que interações água-proteína e que certas interações proteína-proteína. A

hidrofobicidade de um resíduo é determinada por sua polaridade e pelo seu tamanho tal

que, quanto menos polar um resíduo, mais hidrofóbico ele será. Os resíduos neutros também

são hidrofóbicos e a energia associada a esse efeito está em torno de 2 kcal/mol.

1.1.2 Algoritmo de Verlet

O potencial descrito pela Eq. 1.7 é contínuo com respeito às posições de modo

que, se tomarmos um passo de tempo suﬁcientemente pequeno, as posições variarão de

forma suave. Assim, admitindo uma certa posição atômica num dado instante de tempo t,

as posições subseqüentes podem ser calculadas expandindo as equações do movimento para

cada átomo em cada instante de tempo, através da expansão de Taylor. A aceleração é

obtida da função potencial tomando as derivadas com respeito à posição de cada átomo, a

cada conjunto de novas coordenadas para o cálculo das novas posições. As velocidades são

usadas no cálculo da energia cinética para obtenção da energia total do sistema.

−→

(t + δt) =

−→

(t) +

−→

δt +

−→

(t) δt

+ ... (1.10)

Da mesma maneira são obtidas as posições anteriores

−→

(t − δt) =

−→

(t) −

−→

δt +

−→

(t) δt

−..., (1.11)

onde δt é o passo de tempo. A soma das duas expressões anteriores dá o algoritmo de Verlet

[16] para a propagação das posições, desprezando os termo de ordem superior:

−→

(t + δt) = 2

−→

(t) −

−→

(t −δt) +

−→

(t) δt

. (1.12)

1.1.3 Algoritmo Leapfrog

O algoritmo de Leapfrog [17] é uma modiﬁcação do algoritmo de Verlet para evitar

erros no cálculo da posição dos átomos, que é calculado levando em conta a diferença entre

as duas posições para se obter a posição seguinte tomando meio passo de tempo. Isso

revela resultados mais precisos na medida em que a diferença entre as posições não é grande

comparada com as pequenas variações de posições atômicas, o que não acontece no algoritmo

Verlet

−→



t +

δt



[

−→

(t + δt) −

−→

(t)]

δt

, (1.13)

−→



t −

δt



[

−→

(t) −

−→

(t −δt)]

δt

e a propagação das posições é

−→

(t + δt) =

−→

(t) +

−→



t +

δt



δt. (1.14)

1.1.4 Otimização da Geometria Molecular

Uma macromolécula fora do estado de equilíbrio térmico possui forças muito

grandes que podem levar a uma má interpretação da energia do sistema. Por conseguinte,

é preciso antes de mais nada relaxar a molécula. As contribuições parciais dos potenciais

geram uma hipersuperfície de energia a qual deve ser percorrida em busca de regiões de

mínima energia; essas regiões ou mínimos correspondem a pontos no espaço de conﬁgu-

rações nos quais as forças que agem sobre os átomos estão equilibradas. As macromoléculas

biológicas têm como característica o grande número de graus de liberdade. Cada região

dessa hipersuperfície de energia deﬁne uma estrutura molecular particular e sua altura cor-

responde a energia da estrutura. Existem três tipos de extremos da função energia potencial

sobre a hipersuperfície: o ponto mais profundo, mínimo global, um grande número de mín-

imos locais e pontos de sela, sendo praticamente impossível com o aparato computacional

atual varrer toda hipersuperfície. Embora a minimização cubra uma pequena parte dos

mínimos, os ajustes nas posições dos átomos relaxam as distorções nas ligações, nos ângulos

e nos contatos de van der Waals [18]. A minimização ainda retira todas as componentes de

energia cinética do sistema prevenindo ruídos térmicos.

Algoritmo Steepest-Descent

Este método utiliza a primeira derivada; a força sobre um átomo é obtida pelo

gradiente da energia potencial incrementando as coordenadas do átomo na direção e no

sentido da força resultante. Em cada passo a diferença entre o valor do potencial atual e

o anterior é calculada; se essa diferença for menor que um certo valor de convergência o

algoritmo pára, ou então, quando o número de evoluções especiﬁcado é alcançado. Embora

convirja mais vagarosamente na vizinhança do mínimo ele é mais efetivo a grandes distâncias

do mínimo de energia. Com ∆V = 10

−5

kcal/mol chega-se a um mínimo de energia para

vários sistemas, embora valores menores ainda diminuem a energia em algumas kcal/mol

[18].

Algoritmo Gradiente Conjugado

Este método garante uma convergência mais rápida que o steepest-descent pois,

além do cálculo da primeira derivada, leva em conta o caminho já percorrido para chegar ao

mínimo. A sua vantagem em relação ao anterior é que a direção do novo ponto será sempre

perpendicular ao gradiente do ponto anterior. Essa propriedade determina um caminho mais

direto ao fundo do poço de potencial, evitando que se visite novamente o mesmo ponto.

1.1.5 Topologia

A topologia de um sistema biomolecular é a forma como os grupos de aminoácidos

se organizam no espaço para deﬁnir a conformação espacial. Portanto, para compor a

topologia é preciso informações estruturais sobre os diversos componentes do sistema e os

parâmetros para o campo de forças escolhido. Nele devem constar informações sobre a

massa, carga, constante dielétrica, comprimento e ângulos de equilíbrio entre as ligações e

ângulos diedrais de equilíbrio, dentre outras.

Na maioria dos campos de forças esses parâmetros já existem mas, ao lidar com

moléculas que apresentam cofatores não comuns a aminoácidos é necessária a inclusão de

novos parâmetros. As topologias normais serão geradas usando os parâmetros padrão do

campo de forças, mas aquelas que não podem ser geradas deverão ser construídas manual-

mente.

Dois métodos são muito utilizados na obtenção de parâmetros moleculares; o ab

initio (primeiros princípios), que usa as leis fundamentais da mecânica quântica, e o semi-

empírico que faz uso de dados experimentais. Os métodos ab initio, diferentemente do

semi-empírico, não usam parâmetros experimentais nos seus cálculos, os quais são basea-

dos nas leis da mecânica quântica. Eles se referem a solução da equação de Schr

odinger

através de aproximações matemáticas. Já o método semi-empírico faz uso de parâmetros

vindos de dados experimentais, com o objetivo de simpliﬁcar a equação de Schr

odinger,

habilitando-a para uso em sistemas grandes onde o método ab initio seria muito custoso

computacionalmente.

1.2 Teoria do Orbital Molecular

A teoria de Hartree-Fock é a base da teoria do orbital molecular, a qual leva

em conta que o movimento de cada elétron pode ser descrito por uma função que não

depende explicitamente de movimentos instantâneos de outros elétrons. Esta teoria foi

construída com o objetivo de resolver a equação de Schr

odinger eletrônica, considerando a

aproximação de Born-Oppenheimer, onde

−→

r denota o grau de liberdade eletrônico e

−→

R o

grau de liberdade nuclear (em unidades atômicas)





−



∇

−



A,i



A>B



i>j







−→

r ;

−→



= E



−→

r ;

−→



. (1.15)

O primeiro termo refere-se à energia cinética dos elétrons, o segundo à interação

núcleo-elétron, o terceiro termo refere-se à interação núcleo-núcleo e o quarto termo à in-

teração Coolombiana. Para resolver a Eq.1.15 foi usar a função de onda Ψ escrita como

(

−→

, ...,

−→

) = φ

(

−→

) φ

(

−→

) ...φ

(

−→

) , (1.16)

conhecida como Produto de Hartree, onde φ (

−→

r ) é o orbital espacial.

Contudo, tal representação não é capaz de satisfazer o Princípio da Antissimetria,

quando a função de onda que descreve estados para férmions tem suas coordenadas espaço-

spin intercambiadas. Chamando ω uma coordenada de spin genérica para cada coordenada

de spin intrínseco (α ou β) e o conjunto de coordenadas espaço-spin como

−→

x = {

−→

r , ω} a

notação para o orbital espacial será mudada para χ (

−→

x ), um spin orbital, exceto para a

chamada Teoria Geral Hartree Fock [19].

Para satisfazer a antisimetria a função solução de 1.15 pode ser escrita na forma

de determinante

Ψ =

√



(

−→

) χ

(

−→

) ... χ

(

−→

)

. χ

(

−→

) ... χ

(

−→

)

(

−→

) χ

(

−→

) ... χ

(

−→

)



, (1.17)

chamado determinante de Slater.

Uma forma de resolver o problema é expressar os orbitais moleculares como com-

binações lineares de um conjunto pré-deﬁndo de funções de um elétron, conhecidas como

funções de base. Um orbital molecular é deﬁnido como



µ=1

µi

χ

, (1.18)

onde c

µi

são coeﬁcientes da expansão do orbital molecular e χ

são as funções de base

ortonormais.

O problema agora é obter o conjunto de coeﬁcientes para a expansão do orbital

molecular e, para isso usa-se o princípio variacional que fornece a melhor energia possível

para o estado fundamental, no conjunto base escolhido.

Assim, obtém-se o conjunto de equações:



ν=1



µν

−ε

µν



νi

= 0, (1.19)

onde µ = 1, 2, ...N, que pode ser escrita na forma de matriz

F C = SCε, (1.20)

onde F é o operador de Fock dado por

µν

= h

µν



αβ



(µν|αβ) −

(µβ|αν)



, (1.21)

e S é a matriz sobreposição escrita como

µν



χ

∗

χ

dϕ (1.22)

ε é a matriz diagonal de energias orbitais.

Capítulo 2

Metodologia

2.1 Preparando a Molécula para Simulação

Para começar as simulações da Redutase da APS reduzida foi necessário um ar-

quivo contendo a estrutura inicial obtida no formato PDB-Protein Data Bank. Esse arquivo

é compatível com o aplicativo utilizado para simulação. O PDB do Research Collaboratory

for Structural Bioinformatics (RCSB) é um grande banco de dados onde estão depositadas

estruturas tridimensionais obtidas experimentalmente, contendo informações sobre coorde-

nadas espaciais, bibliográﬁcas, estruturas primárias e secundárias, dentre outras. Como

mencionado anteriormente, a molécula da RAPS-red contém dois heterodímeros α

, for-

mado por quatro cadeias iguais duas a duas A, C e B, D, Fig.(2.1) , mas a unidade essen-

cial para função catálitica é um heterodímero αβ. Na cadeia A e na cadeia C existe uma

molécula de FAD, enquanto a cadeia B e a cadeia D abrigam os centros Fe

. Existe ainda,

no arquivo do PDB, uma molécula de Glicerol usada quando da preparação da substância

(RAPS) para a puriﬁcação a qual foi retirada, pois não faz parte da molécula RAPS. Em

vista da duplicação das cadeias escolhemos simular as cadeias A e B. A cadeia A possui

643 resíduos com 5216 átomos, enquanto a cadeia B tem 151 resíduos com 1188 átomos.

O aplicativo GROMACS versão 3.2.1 foi usado para fazer a DM, bem como na

construção da topologia da molécula. O Gromacs é um programa de alta performance,

bem otimizado, rico em recursos para análise e estudo de proteínas assim como lipídios,

usando a teoria da dinâmica molecular. Pode ser compilado em precisão simples ou dupla.

O equipamento utilizado foi um Athlon 2000+ com 1Gbyte de memória RAM.

2.2 Construção da Topologia

Os campos de forças disponíveis no Gromacs possuem, em seus arquivos de parâmet-

ros, constantes atribuídas a cada átomo necessárias à criação da topologia de proteínas con-

stituídas exclusivamente de aminoácidos. Todavia, o arquivo extraído do PDB (1JNR.pdb)

carrega moléculas de FAD e [4Fe-4S]

para as quais o Gromacs não tem parâmetros para

criar topologias.

Para obtermos a topologia da FAD, molécula relativamente grande para o uso de

cálculos ab initio, optamos pelo servidor da web PRODRG, utilizado comumente na con-

strução de topologias para drogas. Ele transforma as coordenadas de pequenas moléculas

em diversos formatos para as coordenadas do GROMACS e formatos de topologia. Este

programa gerou, dentre outros, dois arquivos (fad.gro e fad.itp) que contêm as informações

necessárias ao campo de forças. Na molécula de [4Fe-4S]

o programa GAMESS ver-

são 1997 foi utilizado para a obtenção das cargas parciais calculadas através da Teoria de

Hartree-Fock e um conjunto de bases mínima (RHF/STO-3G). O ajuste eletrostático para

Figura 2.1: Estrutura da RAPS-red duplicada.

densidade dos elétrons foi realizado pelo CHELPG (Charges from Electrostatic Potentials).

Esses dados foram inseridos no arquivo (.rtp) do GROMACS para gerar a topologia dos

centros de ferro-enxofre. Na Tabela 3.1 temos os valores das cargas parciais para os centros

Apesar de incluir apenas os átomos dos centros de ferro-enxofre, estes cálculos são

aceitáveis em uma primeira abordagem do problema, já que os átomos das cisteínas (SG),

ligados covalentemente aos átomos de ferros, não foram contabilizados nesses cálculos.

Átomo Carga

F e1 0, 7026

F e2 0, 6714

F e3 0, 6919

F e4 0, 7299

S1 −0, 2051

S2 −0, 1844

S3 −0, 2099

S4 −0, 1965

Tabela 2.1: Cargas atômicas parciais para FS4

O arquivo de topologia foi editado para retirar algumas ligações covalentes ferro-

ferro, as quais não constam na literatura da enzima em estudo, além de acrescentar as

ligações entre átomos de ferro ligados covalentemente ao grupo sulﬁdrila das quatro cisteínas

que coordenam os dois centros ferro-enxofre.

2.3 Simulação no Gromacs

2.3.1 Minimização de Energia

A estrutura da proteína foi minimizada usando os algoritmos Steepest Descent e

Gradiente Conjugado para uma caixa tipo triclínica com volume aproximado de 665,20 nm

A caixa foi solvatada com 18123 moléculas de água do tipo simple point charge (SPC) sendo

a distância mínima entre a proteína e as paredes da caixa 0,8 nm. Desde que o sistema tinha

carga total de -18e, contraíons de Na

foram adicionados para neutralizar a carga na caixa.

Depois da minimização o sistema foi equilibrado durante 500 ps com posição restringida

sobre os átomos da proteína com passo de tempo de 2 fs, tendo como objetivo acomodar as

moléculas de água junto à proteína.

2.3.2 Parâmetros de Simulação

Todas as simulações foram feitas usando o campo de forças GROMOS87. Foi us-

ado o algoritmo SHAKE [20] para vínculos entre todas as ligações. A aplicação de vínculos

em DM aumentou o passo de tempo máximo, permitindo uma maior precisão na integração

das equações do movimento relacionadas com as freqüências de movimentos rápidos e as-

sim diminuindo o esforço computacional. Nesse algoritmo, as N

equações de vínculos são

multiplicadas por muiltiplicadores de Lagrange e somadas à energia potencial. O algoritmo

SETTLE [21] foi usado para vínculos das moléculas de água. As interações não ligadas

foram empregadas com um corte de 1,2 nm. As temperaturas foram mantidas por banhos

externos a 300K, 311 K e 363 K com uma constante de tempo τ

= 0,1 ps, através do

acoplamento fraco termostato de Berendsen. As velocidades iniciais usadas na equilibração

do sistema foram geradas via Distribuição de Maxwell. A pressão foi mantida pelo acopla-

mento fraco barostato de Berendsen com constante de tempo τ

= 1 ps, considerando que

efeitos importantes da pressão sobre a estrutura da proteína são observados apenas para

variações de pressão muito altas [2]. As simulações foram realizadas em banhos a 1 bar e a

constante dielétrica relativa, 

=1, foi usada.

Capítulo 3

Resultados e Discussão

3.1 Propriedades Gerais

Para investigar o efeito da temperatura sobre o espaço conformacional da proteína

e sua estabilidade, simulações foram feitas nas temperaturas de 300 K e 311 K e na faixa

de temperatura ótima, 363 K, durante 5 ns. A atividade de uma enzima é extremamente

dependente da temperatura. Ela provoca o aumento na velocidade de reação química, mas

a estabilidade da proteína diminui devido à desativação térmica.

Todas as enzimas possuem uma temperatura ótima na qual sua atividade biológica

é máxima. Temperatura ótima é aquela temperatura na qual a atividade biológica da enzima

mantém-se constante num intervalo de tempo.

A atividade catalítica da enzima é determinada por sua estrutura terciária (domínios),

que sobrepõe os grupos-R especíﬁcos de aminoácidos de modo a formar sítios. Se a molécula

absorve muita energia sua estrutura terciária se rompe e a enzima perde sua atividade

catalítica, ou seja, ela se desnatura.

Enzimas de baixo peso molecular, compostas por uma única cadeia polipeptídica

e possuindo pontes dissufeto (S-S), são geralmente mais estáveis ao calor [22].

Assim, para avaliar a estabilidade da RAPS-red, na faixa de temperatura de cresci-

mento para hipertermofílicos que está entre 88 e 98

◦

C [3], justiﬁca-se fazer a terceira sim-

ulação. A estabilidade da proteína e algumas propriedades foram analisadas, focando o

estudo nas mudanças conformacionais na região do sítio ativo e da FAD para determinar-

mos a acessibilidade de substratos.

A estabilidade da proteína e da FAD em solução foi estudada computando as

propriedades energéticas e geométricas, iniciando pela estrutura do cristal. A proteína foi

considerada estável, porque nas três simulações as conformações permanecem próximas à

conformação inicial. Pequenos valores do desvio da raiz quadrática média- DRQM indicam

que a molécula de proteína tende a manter a conformação do cristal; logo é relativamente

estável. Valores grandes signiﬁcam o oposto, ou seja, baixa estabilidade ou dinâmica com

tempo insuﬁciente para fornecer a estimativa da estabilidade.

Os desvios da raiz quadrática média e as ﬂutuações da raiz quadráica media (desvio

padrão) das posições atômicas nas simulações são calculadas de acordo com

∆R =





i=1

{(∆x

)

+ (∆y

)

+ (∆z

)

}



, (3.1)

onde N

e o número total de átomos e os brackets ... representam a média temporal. No

cálculo do DRQM, ∆x

, ∆y

e ∆z

são diferenças atômicas entre as coordenadas iniciais para

o i-ésimo átomo; enquanto no cálculo do FRQM, elas são a diferença entre as coordenadas

médias e instantâneas para o i-ésimo átomo.

A evolução temporal do DRQM do esqueleto da enzima e da ﬂavina adenina din-

ucleotídeo comparados à estrutura do cristal são mostrados na Fig.3.1. Na temperatura

300K ambos FAD e esqueleto da enzima não desviam signiﬁcativamente da estrutura do

cristal estabilizando-se a um valor médio de 0,2 nm. Com o aumento da temperatura, 311 K,

a molécula de FAD estabiliza-se após 3 ns enquanto o esqueleto da enzima comporta-se da

mesma forma que na temperatura inferior. Para 363 K a FAD mostra ser mais ﬂexível, o

valor ﬁnal para o DRQM é de 0,625 nm, cerca de 0,375nm maior que o valor obtido para a

faixa de crescimento de mesóﬁlos, enquanto o esqueleto continua com uma pequena ﬂutu-

ação. A estabilidade no esqueleto da proteína para altas temperaturas é inﬂuenciada pelos

resíduos da cadeia lateral, sobretudo aqueles que formam folhas β, como será mostrado

adiante.

O raio de giro (Rg) é uma propriedade relacionada com o volume da molécula.

O crescimento deste parâmetro signiﬁca que a proteína aumentou seu volume, o que pode

signiﬁcar em alguns casos desenovelamento.

O raio de giro é calculado de acordo com a equação





−→





, (3.2)

onde m

é a massa do átomo i e

−→

a posição do átomo i com respeito ao centro de massa

da molécula.

As Figs.3.2 e 3.3 mostram os raios de giro com uma função do tempo para a FAD

e para a proteína.

Na Fig. 3.2 observa-se um substancial decréscimo do raio de giro da FAD entre

0 ns e 4,5 ns na temperatura de 311K, após o que a molécula aparentemente tende a se

Figura 3.1: DRQM com respeito a estrutura cristalografada. FAD em marron (300 K) em

margenta (311 K) e verde (363 K). O Esqueleto da enzima em ciano (300 K), laranja (311 K)

e preto (363 K). O aumento da temperatura leva ao aumento do DRQM para a FAD.

estabilizar em um valor próximo a 0,65 nm. À temperatura de 300K, a estabilização inicia-

se a 1,5ns de simulação no valor médio de 0,75 nm. Com a elevação da temperatura ao

nível de 363 K, a molécula de FAD sofre várias alterações no seu raio de giro, esses diversos

picos no Rg da molécula de FAD mostram que a molécula nesta temperatura tem seu

número de conformações aumentado e uma progressiva diminuição em seu volume após

4,5 ns. Entretanto, a diﬁculdade em obter a estabilização também cresce. Os resultados

sugerem que a mudança da conformação aberta para a conformação fechada ocorre, como

uma bifurcação, a uma temperatura situada entre 300 K e 311 K.

A Fig.3.3 mostra que o raio de giro da proteína permanece praticamente constante

durante todo tempo de simulação, com o Rg médio de 2,51 nm para as duas temperaturas

mais baixas.

A elevação da temperatura para 363K propocionou o crescimento do volume da

molécula, sem contudo perturbar seu equilíbrio termoestável. A janela entre 1 ns e 4 ns é a

faixa onde se tem as menores ﬂutuações para, a partir de 4,5 ns, veriﬁcar-se uma possível

estabilidade em torno dos 2,8 nm.

Os resultados apresentados nas duas ﬁguras anteriores mostram que a elevação

da temperatura de 300 K para 311K não ocasiona efeitos drásticos na estrutura da FAD,

nem causa modiﬁcações peceptíveis na estrutura da proteína. Mas, na faixa de temperatura

ótima, o volume global da enzima cresceu cerca de 0,05 nm em média, se comparado com

os valores obtidos da cristalograﬁa. A mobilidade observada a alta temperatura para a pro-

teína indica que as regiões de maior ﬂexibilidade podem sofrer mudanças conformacionais

signiﬁcativas.

Figura 3.2: Raio de giro da FAD. Preto (300 K) , azul (311 K) e vermelho (363 K).

Figura 3.3: Raio de giro da proteína. A temperatura de azul (300 K), marron (311 K) e

vermelho (363 K). A proteína mantém praticamente o mesmo volume para temperaturas

abaixo de 311 K.

Para localizar as regiões que estão envolvidas no cálculo do DRQM da enzima, as

ﬂutuações da raiz quadrática média, FRQM, relativas aos resíduos da proteína, foram calcu-

ladas para determinar sua mobilidade ao longo da seqüência de resíduos e são mostradas na

Fig.3.4 em que se desenvolvem os organismos mesóﬁlos. Observamos maiores deslocamentos

nos resíduos ALA288, GLY345, ASP499, LEU500, TRP640, na região do domínio helicoidal

(A488-643), mesmo a temperatura ambiente. Essa região é composta principalmente por

hélices α, e está permanentemente exposta ao solvente, que lhe confere muita ﬂexibilidade.

Os resíduos LYS655, LYS675 e LYS789, na região que envolve o centro II, foram os que

sofreram maior ﬂutuação de suas posições em relação aos dados cristalográﬁcos.

Os valores cujas ﬂutuações são pequenas se referem às regiões formadas por folhas

Figura 3.4: A ﬂutuação da raiz quadrática média para a faixa de temperatura de crescimento

de organismos mesóﬁlos. Preto (300 K) e verde (311K).

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β. Entretanto, notamos que as ﬂutuações com respeito às posições atômicas no cristal da

RAPS-red são em média de 0, 05 nm.

3.2 Canal de Acesso para a FAD

A FAD se localiza no fundo de uma ﬁssura longe da superfície da proteína. A aber-

tura do canal é contornada por resíduos carregados positivamente (Arg-A83, Lys-A281,Lys-

A283 e Arg-A317). O sítio de ligação com o substrato é formado pelos resíduos (His-A398,

Trp-A234, Arg-A265, Val-A273, Gly-A274, Glu-A141, Gln-A145, Asn-A74 e Phe-A448) [9].

A FRQM indica pequenos deslocamentos nos resíduos que formam o canal, ou seja, a alter-

ação do diâmetro de abertura. Essas pequenas mudanças no canal de acesso sugerem que a

possibilidade de moléculas de substratos maiores entrarem no canal é pequena a baixas tem-

peraturas, mas aumenta proporcionalmente ao aumento de temperatura, conforme Fig.3.6.

O raio de giro do canal que leva ao sítio ativo sofre uma pequena redução a 300 K mas, à me-

dida que a temperatura eleva-se, o diâmetro do canal aumenta. Os valores para o diâmetro

de abertura do canal mantêm-se praticamente iguais até 500 ps para as três temperaturas;

a partir daí o efeito da temperatura torna-se mais visível. Identiﬁca-se dois momentos de

crescimento do diâmetro, no intervalo de 2 ns a 2,5ns e entre 4 ns e 4,7 ns, após esse valor

o diâmetro parece estabilizar em torno de 1,128 nm, isso evidencia o importante papel da

temperatura no processo de catálise. Na temperatura de 363 K o diâmetro do canal aumenta

0,12 nm, mantendo-se neste valor até 3 ns e voltando a aumentar após 4 ns atingindo o valor

de 1,5 nm. A vista do canal de acesso para uma das temperaturas (311 K) é mostrada na

Fig.3.5, onde a estrutura do cristal (0 ps) em diferentes cenas está representada.

Figura 3.5: As conformações do canal que leva ao sítio ativo são mostradas a cada 1 ns de

simulação na temperatura de 311 K. Resíduos carregados estão em azul. Entre 2 ns e 4 ns

os resíduos que contornam o canal apresentam-se mais distantes, facilitando a passagem de

grandes substratos.

Figura 3.6: Raio de giro do canal que leva ao sítio ativo. Preto (300 K), verde (311 K) e

azul (363 K). Nota-se uma pequena queda no diâmetro do canal de acesso na temperatura

ambiente.

3.3 Sítio Ativo

A FAD não está covalentemente ligada à proteína, mas permanece ligado por uma

rede de pontes de hidrogênio e por interações eletrostáticas e de Lennard Jones (T abela 4.1).

As pontes de hidrogênio têm papel importante do ponto de vista estrutural, por ajudar na

estabilidade da FAD, como também são fundamentais para as propriedades catalíticas da

enzima. O número de pontes foi computado adotando um critério geométrico que deﬁne

a formação de uma ponte durante a simulação. Se o aceptor de hidrogênio estiver a uma

distância menor que 0,35 nm e o ângulo doador-aceptor for maior que 60

◦

, assume-se que

a ponte existe. A Fig.3.7 mostra o número de pontes de hidrogênio formadas entre a FAD

e a enzima nas três temperaturas. A elevação da temperatura diminui signiﬁcativamente

o número de pontes de hidrogênio, passando em média de 10 pontes (300K) para cerca de

6 pontes (311 K) e 5,3 pontes para a temperatura mais elevada. As maiores ﬂutuações são

observadas na temperatura de 311 K e 363 K, devido ao menor tempo de vida das pontes

de hidrogênio formadas. O maior pico é de 14 pontes e o menor em torno de 4 pontes; para

363K o número mínimo de pontes chega a 3.

A pequena rede de pontes de hidrogênio contribui muito pouco para a estabilidade

da FAD no interior do sítio ativo. Outras interações têm papel importante nesta estabili-

dade, dentre elas a interação Coulombiana. Esta interação junto com a interação de Lenard

Jones é responsável por manter a FAD no sítio ativo, provavelmente devido à atração dos

resíduos carregados nas cadeias laterais, posicionados próximo a ela.

Na Tabela 3.1 temos os valores médios das interações de Lenard Jones e Coulomb

para as três temperaturas. Os valores obtidos mostram que a atração coulombiana entre a

Figura 3.7: Pontes de hidrogênio entre a FAD e a proteína. Preto (300 K), verde (311K) e

azul (363 K). As pontes de hidrogênio têm papel importante do ponto de vista estrutural,

por ajudar na estabilidade da FAD, como também é fundamental para as propriedades

catalíticas da enzima.

molécula de FAD e a proteína crescem com a temperatura e que para altas temperaturas a

contribuição do potencial de Lenard Jones tende a ser repulsiva. O balanço entre estes dois

termos é o que mantém a molécula de FAD no centro catalítico.

Energia média (KJ/mol) 300K 311 K 363K

Coulomb −1346.88 −1556.92 −1.43752e + 06

Lenard Jones −525.27 −483, 28 1.34960e + 05

Tabela 3.1: Resumo das interações não ligadas durante os 5ns de dinâmica para as duas

temperaturas

Moléculas de água no entorno da FAD também ajudam nessa estabilização, per-

mitindo maiores ﬂutuações das cadeias laterais o que facilita a difusão do substrato e do

centro catalítico.

Para estudar as modiﬁcações conformacionais na molécula de FAD (Fig.3.8), o

comportamento do anel ﬂavina foi analisado (anéis A e C respectivamente). O ângulo entre

a região dos anéis semelhantes ao benzeno e a pirimidina foram observados. Esse ângulo é

formado entre os vetores C

−C

e C

10A

−N

(Fig.3.9). O ângulo entre o anel isoaloxazina

e o anel adenina foi tomado entre os planos deﬁnidos por N

, C

e C

10A

da ﬂavina e NAS,

CAT e CAM do anel adenina, respectivamente, Fig.3.10.

Na Fig.3.9 a faixa de conformações para o FAD mostra que na temperatura 311 K,

o ângulo médio entre o anel benzeno e o pirimidina em sua conformação aberta é em média

9,93

◦

podendo chegar até 25,84

◦

onde então volta a cair chegando a uma conﬁguração

planar (0

◦

). Em 300 K a média encontrada é de cerca de 11,47

◦

e o maior valor em torno

de 23,79

◦

. Moléculas de água entre os anéis garantem essa conformação resultando no

decréscimo da coplanalidade. Em conformações abertas o ângulo médio encontrado está

Figura 3.8: Molécula de FAD (modiﬁcada de FEENSTRA, 2002).

Figura 3.9: Flutuação do ângulo formado entre os vetores C

− C

e C

10A

− N

. Preto

(300 K), verde (311 K) e azul (363 K).

entre 15,1

◦

e 13,1

◦

[13]. Para temperatura de 363 K o ângulo médio está próximo de

10,88

◦

. A análise do plano formado entre os aneis isoaloxazina e adenina foi feita baseada

nos dados obtidos da Fig.3.10.

Na conformação inicial esse ângulo começa em 0

◦

e vai aumentando até 60,0

◦

permanecendo neste valor durante 1,5 ns, e ﬁnalizando com 75,52

◦

, na temperatura de

300K. O desvio encontrado no plano dos anéis na temperatura 311 K é em média 63,25

◦

nos

primeiros 3 ns, para depois equilibrar-se em torno de 58,66

◦

; essa conformação mantida por

todo resto da simulação aproxima os anéis e leva à diminução da mobilidade da molécula de

FAD pelo aumento da sobreposição dos anéis que são estabilizados por pontes de hidrogênio.

Figura 3.10: Flutuação do ângulo formado pelos planos da ﬂavina e adenina. Vermelho

(300 K), verde (311 K) e azul (363 K).

A 363 K de temperatura veriﬁca-se na molécula de FAD o crescimento da amplitude de

oscilações, mas a conﬁguração inicial é mantida durante 3 ns, perto de 0

◦

. Depois o ângulo

cresce até alcançar a conﬁguração ﬁnal de 180

◦

As conformações para a molécula de FAD no último nanosegundo de simulação

são mostradas Fig. 3.11. Em geral o anel isoaloxazina e adenina são coplanares, mas com

o aumento de temperatura eles tendem a adotar uma conformação paralela. As simulações

também mostraram que a molécula de FAD pode ﬁcar longos períodos na conformação

estendida.

Figura 3.11: Vista das conformações da molécula de FAD, nas três temperaturas de

simulação.

3.3.1 Centros de ferro-enxofre

Para investigar a inﬂuência do ambiente protéico sobre a estrutura dos centros de

ferro-enxofre avaliamos o raio de giro para estas moléculas. As Figs. ?? e 3.13 mostram

a ﬂutuação dos raios de giro para o centro I (FS4.1) e centro II (FS4.2), respectivamente.

O valor médio para o raio de giro nas duas mais baixas temperaturas é 0,4 nm e 0,47 nm

para FS4.1, enquanto que em 363 K esse valor chega a 0,55 nm. No FS4.2 o valor médio

é de aproximadamente 0,35 nm a 300 K, mas não se veriﬁca mudança substancial para as

outras duas temperaturas, ﬁcando a diferença entre elas por volta de 0,09nm. As variações

no valor do raio de giro do centro II em relação ao centro I, acontece devido à diferença de

ambiente onde cada um está inserido. Isso demonstra que o ambiente mais hidrofílico ao

qual o centro II está lhe confere maior ﬂexibilidade que o centro I.

As distâncias entre os centro I e II são mostradas na Fig. 3.14. Comparativamente

aos dados cristalográﬁcos (0,97 nm), na temperatura de 300 K o valor é de 0,62 nm, na 311 K

0,26 nm e 0,03 nm para 363 K. A diminuição da distância entre os centros eleva a interação

magnética entre eles inﬂuenciando em suas propriedades de oxiredução.

A Fig. 3.15 mostra os centros ferro-enxofre na temperatura 363 K. Um número

diferente de resíduos interage com os dois centros. A rede de pontes de hidrogênio, repre-

sentadas por linhas tracejadas, formadas ao redor do centro I é maior que aquela formada

no centro II, o que contribui para o alto potencial no centro I e o baixo potencial no centro

II.

Na Tabela 3.2 temos um resumo dos parâmetros energéticos obtidos durante as

simulações calculados das trajetórias.

Figura 3.12: Raio de giro do centro I. Preto (300 K) , vermelho (311 K) e azul (363 K).

Energia kJ/mol Média

300K 311K 363K

Lenard Jones 153647 148344 134960

Coulomb -1.5578e+06 -1.53425e+06 -1.43752e+06

potencial

-1.29065e+06 -1.27071e+06 -1.17886e+06

cin´etica

233870 242364 283079

total

-1.05678e+06 -1.02834e+06 -895779

Temperatura ( K) 303.913 314.951 367.86

Pressão ( bar) 1.04488 1.13804 0.990143

Tabela 3.2: Resumo das propriedades energéticas do sistema calculadas das trajetórias

simuladas da DM

Figura 3.13: Raio de giro do centro II. Preto (300 K), vermelho (311 K) e azul (363 K).

Flutuações observadas no centro II indicam que o ambiente lhe confere menos rigidez que

o centro I.

Figura 3.14: Distâncias entre os centros de ferro-enxofre. Azul (300 K), amarelo (311K) e

vermelho 363 K.

Figura 3.15: Rede de pontes de hidrogênio no último nanosegundo de simulação na tem-

peratura de 363 K modula o potencial dos centros de ferro-enxofre e pode estar ligada com

o mecanismo de transferência de elétrons.

A energia total do sistema é conservada durante a simulação de DM se a ﬂutuação

dessa grandeza está entre 5% e 10% da ﬂutuação da energia cinética [23]. Para as três

simulações, as ﬂutuações da energia total foram 0 (zero), mesmo valor encontrado na

energia cinética, signiﬁcando que o sistema é bastante estável energeticamente.

Capítulo 4

Conclusão e Perspectivas

O comportamento dinâmico e estrutural da RAPS-red da A. fulgidus, em meio

aquoso, foi estudado através da Dinâmica Molecular, com o campo de forcas GROMOS87

[24]. Os parâmetros para a FAD, obtidos através de método semi-empírico, com o aplicativo

PRODRG, apresentam boa concordância com dados da literatura [13]. As cargas parciais

dos átomos que constituem os centros de ferro-enxofre foram obtidas através de cálculo ab

initio. Em primeira abordagem, apenas as cargas dos átomos dos centros metálicos foram

consideradas e os demais parâmetros foram ajustados a partir de dados de ligações entre

átomos semelhantes que são adotados no campo de forças utilizado. As simulações de 5

ns, em três temperaturas distintas (300K, 311 K e 363 K) e à pressão de 1 bar, permitiram

analisar o comportamento da molécula do ponto de vista térmico. A temperatura de 363 K

situa-se na faixa de temperatura em ambientes típicos de microorganismos hipertermóﬁlos.

A realização de todas as simulações à pressão de 1 bar decorre do fato de que a ocorrência de

mudanças estruturais signiﬁcativas em proteínas requer variações de pressão muito grandes

[25], bem acima dos valores típicos de pressão encontrados em poços de petróleo.

Alguns apectos foram analisados, em particular, as mudanças conformacionais no

sítio ativo e na região do canal que dá acesso ao mesmo, para compreender as possíveis

variações no seu tamanho, o que é extremamente importante para a determinação da aces-

sibilidade de substratos e, consequentemente, para a realização da atividade catalítica da

enzima.

As simulações revelaram que as mudanças na estrutura do esqueleto da proteína e

nas posições dos resíduos - aminoácidos — são pequenas em relação à estrutura do cristal da

RAPS-red. Entretanto, algumas regiões da proteína se mostraram relativamete ﬂexíveis. O

canal de acesso ao sítio ativo sofreu deformações consideráveis com a variação da temper-

atura. A 363 K, o raio de giro deste canal é signiﬁcativamente maior do que a 300 K e a

311K.

Em temperaturas mais elevadas, a molécula de FAD tem sua mobilidade aumen-

tada; contudo, esta molécula é mantida na região do sítio ativo por uma rede de pontes

de hidrogênio e pelas interações não especíﬁcas. Apesar de apresentarem, individualmete,

energia de ligação relativamente pequena, o grande número de interações resulta em uma

quantidade de energia suﬁciente para manter a FAD ligada à enzima, inclusive em tem-

peraturas elevadas. Nota-se que, na temperatura mais baixa (300 K), a molécula de FAD

adquiriu, em solução aquosa, conformação aberta enquanto que, na temperatura de 311 K

e na temperatura ótima do sistema (363K), a conformação desta molécula muda drasti-

camete, levando os anéis isoaloxazina e adenina a se sobrepor para formar ligações π − π,

mediadas por pontes de hidrogênio. As ﬂutuações quadráticas médias (FRQM) também

revelam a alta mobilidade dos resíduos que formam a região helicoidal. A mudança con-

formacional da FAD a temperaturas mais elevadas deve ser um fator determinante para a

manutenção da funcionalidade da enzima em ambientes extremos. Vale registrar que, no

tempo de simulação considerado, a estrutura da FAD ainda não apresenta-se estável, o que

pode ser visto na representação da evolução temporal do desvio quadrático médio (Fig.

3.1) e do raio de giro (Fig. 3.2). Nota-se, ainda, pela comparação dos resultados mostrados

nestas duas ﬁguras para as temperaturas de 311K e 363 K que, no tempo de 5 ns, o desvio

quadrático médio a 363K é bem maior do que a 311 K, enquanto que os raios de giro nas

duas temperaturas são praticamete iguais. A realização das simulações em um tempo mais

longo poderiam revelar outras diferenças na estrutura tridimensional destas duas moléculas

para estas duas temperaturas. Entretanto, deve-se ressaltar que a conformação da FAD

sofre mudança qualitativa a uma temperatura que se situa entre 300 K e 311K, passando

da conformação aberta para a conformação fechada.

Não é comum que proteínas desenovelem durante simulações de DM, provavelmente

pela imprecisão do campo de forças utilizado mas, quando isso acontece, os elementos da

estrutura secundária se fragmentam. Pela análise do comportamento dinâmico do sistema,

a tendência ao desenovelamento não se apresentou nas simulações realizadas neste trabalho.

No que se refere aos centros de ferro-enxofre, as pontes de hidrogênio formadas en-

tre os átomos que os integram e átomos que se encontram nas cadeias laterais dos aminoáci-

dos vizinhos, têm papel importante na mantenção da geometria dessas moléculas e, provavel-

mente, no transporte de elétrons. O raio de giro identiﬁca baixa ﬂexibilidade nas estruturas

de tais centros metálicos mas o centro II, comparativamente ao I, mostra-se bem mais

ﬂexível, o que deve estar associado ao ambiente mais hidrofílico que o circunda, o que pode

explicar, também, o fato de que, mesmo nos experimentos de difração de raios X, o raio de

giro do centro I é signiﬁcativamente maior do que o raio de giro do centro II.

Na perspectiva de continuação deste trabalho com a RAPS-red pretende-se fazer

o reﬁnamento da estrutura e posteriormente os testes com inibidores. O modelo pode ser

melhorado com a realização de cálculos dos parâmetros de ligações químicas envolvendo

os átomos dos centros de ferro-enxofre, incluindo-se em tais cálculos átomos vizinhos das

cisteínas covalentemente ligadas. A aplicação do método QM/MM (Mecânica Molecular e

Mecânica Quântica) pode ser, também, uma alternativa promissora. A busca de inibidores

para a enzima através de varredura virtual e a realização de simulações de docagem (sim-

ulações feitas com a introdução de inibidores na molécula) podem ajudar na proposição de

alternativas tecnológicas para o controle da produção biogênica de gás sulﬁdrico em campos

de petróleo.

Capítulo 5

Apêndice

5.0.2 Apêndice A

Arquivo de entrada md.mdp

O arquivo md.mdp é o protocolo que controla toda a simulação de dinâmica molec-

ular. Ele é praticamente o mesmo para as três simulações apresentadas.

title = DM

integrator = MD

dt = 0.002

nsteps = 2500000

nstxout = 5000

nstvout = 5000

nstfout = 0

nstlog = 5000

nstenergy = 5000

xtc-grps = protein FS4 FAD Sol Na

energygrps = protein FS4 FAD Sol Na

nstlist = 10

rlist = 1

coulombtype = Cut-oﬀ

rcoulomb = 1.2

epsilon-r = 1

vdw-type = Cut-oﬀ

rvdw = 1.2

fourierspacing = 0.12

fourier_nx = 0

fourier_ny = 0

fourier_nz = 0

optimize_ﬀt = yes

Tcoupl = berendsen

tc-grps = system

tau-t = 0.1 ps

ref-t = 311 K

Pcoupl = berendsen

Pcoupltype = Isotropic

tau-p = 1 ps

compressibility = 4.5e-5/ bar

ref-p = 1 bar

andersen_seed = 815131

gen_vel = yes

gen-temp = 311 K

gen-seed = 173529

constraints = all-bonds

constraint-algorithm = shake

shake-tol = 1e-04

5.0.3 Apêndice B

Topologia para a FAD obtida através do programa PRODRG

Abaixo são mostradas informações sobre carga, pontes, pares não ligados e diedrais

da molécula de FAD.

[ atoms ]

; nr type resnr resid atom cgnr charge mass

1 O 1 FAD O4 1 -1.000 15.9994

2 CB 1 FAD C4 2 0.078 12.0110

3 NR6* 1 FAD N3 2 0.002 14.0067

4 H 1 FAD HAI 2 -0.080 1.0080

5 CB 1 FAD C2 3 0.389 12.0110

6 O 1 FAD O2 3 -0.646 15.9994

7 NR6* 1 FAD N1 3 0.008 14.0067

8 H 1 FAD HAH 3 -0.024 1.0080

9 CB 1 FAD C10A 3 0.273 12.0110

10 CB 1 FAD C4A 4 0.000 12.0110

11 NR6* 1 FAD N5 4 0.000 14.0067

12 H 1 FAD HAJ 5 -0.022 1.0080

13 CB 1 FAD C5A 5 0.124 12.0110

14 CR61 1 FAD C6 5 -0.059 13.0190

15 CB 1 FAD C7 5 -0.040 12.0110

16 CH3 1 FAD CBH 5 -0.003 15.0350

17 CB 1 FAD C8 6 -0.045 12.0110

18 CH3 1 FAD CBJ 6 -0.003 15.0350

19 CR61 1 FAD C9 6 -0.065 13.0190

20 CB 1 FAD C9A 6 0.113 12.0110

21 NR6* 1 FAD N10 7 0.011 14.0067

22 CR61 1 FAD CBO 7 -0.022 13.0190

23 CH1 1 FAD CBP 7 0.151 13.0190

24 OA 1 FAD OBQ 7 -0.140 15.9994

25 HO 1 FAD HAC 8 0.018 1.0080

26 CH1 1 FAD CBR 8 0.094 13.0190

27 OA 1 FAD OBS 8 -0.225 15.9994

28 HO 1 FAD HAD 8 0.019 1.0080

29 CH1 1 FAD CBT 8 0.094 13.0190

30 OA 1 FAD OBU 9 -0.196 15.9994

31 HO 1 FAD HAE 9 0.021 1.0080

32 CH2 1 FAD CBV 9 0.038 14.0270

33 OS 1 FAD OBW 9 -0.187 15.9994

34 P 1 FAD PBX 9 1.324 30.9738

35 OM 1 FAD OBY 10 -0.643 15.9994

36 OM 1 FAD OBZ 10 -0.644 15.9994

37 OS 1 FAD OCA 10 -0.217 15.9994

38 P 1 FAD PAA 10 1.148 30.9738

39 OM 1 FAD OAB 10 -0.644 15.9994

40 OM 1 FAD OAC 11 -0.748 15.9994

41 OS 1 FAD O5* 11 -0.252 15.9994

42 CH2 1 FAD C5* 12 0.040 14.0270

43 CS1 1 FAD C4* 12 0.214 13.0190

44 OS 1 FAD O4* 12 -0.180 15.9994

45 CH1 1 FAD C3* 12 0.113 13.0190

46 OA 1 FAD O3* 12 -0.187 15.9994

47 HO 1 FAD HAA 13 0.016 1.0080

48 CH1 1 FAD C2* 13 0.080 13.0190

49 OA 1 FAD O2* 13 -0.264 15.9994

50 HO 1 FAD HAB 13 0.016 1.0080

51 CS1 1 FAD C1* 13 0.152 13.0190

52 NR5* 1 FAD NAM 14 0.215 14.0067

53 CR51 1 FAD CAN 14 -0.067 13.0190

54 NR5 1 FAD NAO 14 -0.510 14.0067

55 CB 1 FAD CAP 14 0.110 12.0110

56 CB 1 FAD CAV 14 0.252 12.0110

57 NR6* 1 FAD NAU 15 0.013 14.0067

58 H 1 FAD HAG 15 -0.013 1.0080

59 CH2 1 FAD CAT 16 0.043 14.0270

60 NR6* 1 FAD NAS 16 0.638 14.0067

61 H 1 FAD HAF 16 -0.021 1.0080

62 CB 1 FAD CAQ 16 0.304 12.0110

63 NT 1 FAD NAR 16 0.036 14.0067

64 H 1 FAD HAL 17 0.000 1.0080

65 H 1 FAD HAK 17 0.000 1.0080

[ bonds ]

; ai aj fu c0, c1, ...

1 2 1 0.123 502080.0 0.123 502080.0 ; O4 C4

2 3 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; C4 N3

2 10 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C4 C4A

3 4 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; N3 HAI

3 5 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; N3 C2

5 6 1 0.123 502080.0 0.123 502080.0 ; C2 O2

5 7 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; C2 N1

7 8 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; N1 HAH

7 9 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; N1 C10A

9 10 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C10A C4A

9 21 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; C10A N10

10 11 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; C4A N5

11 12 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; N5 HAJ

11 13 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; N5 C5A

13 14 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C5A C6

13 20 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C5A C9A

14 15 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C6 C7

15 16 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; C7 CBH

15 17 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C7 C8

17 18 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; C8 CBJ

17 19 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C8 C9

19 20 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; C9 C9A

20 21 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; C9A N10

21 22 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; N10 CBO

22 23 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CBO CBP

23 24 1 0.143 334720.0 0.143 334720.0 ; CBP OBQ

23 26 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CBP CBR

24 25 1 0.100 313800.0 0.100 313800.0 ; OBQ HAC

26 27 1 0.143 334720.0 0.143 334720.0 ; CBR OBS

26 29 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CBR CBT

27 28 1 0.100 313800.0 0.100 313800.0 ; OBS HAD

29 30 1 0.143 334720.0 0.143 334720.0 ; CBT OBU

29 32 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; CBT CBV

30 31 1 0.100 313800.0 0.100 313800.0 ; OBU HAE

32 33 1 0.143 251040.0 0.143 251040.0 ; CBV OBW

33 34 1 0.161 251040.0 0.161 251040.0 ; OBW PBX

34 35 1 0.148 376560.0 0.148 376560.0 ; PBX OBY

34 36 1 0.148 376560.0 0.148 376560.0 ; PBX OBZ

34 37 1 0.161 251040.0 0.161 251040.0 ; PBX OCA

37 38 1 0.161 251040.0 0.161 251040.0 ; OCA PAA

38 39 1 0.148 376560.0 0.148 376560.0 ; PAA OAB

38 40 1 0.148 376560.0 0.148 376560.0 ; PAA OAC

38 41 1 0.161 251040.0 0.161 251040.0 ; PAA O5*

41 42 1 0.143 251040.0 0.143 251040.0 ; O5* C5*

42 43 1 0.153 251040.0 0.153 251040.0 ; C5* C4*

43 44 1 0.144 251040.0 0.144 251040.0 ; C4* O4*

43 45 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; C4* C3*

44 51 1 0.144 251040.0 0.144 251040.0 ; O4* C1*

45 46 1 0.143 334720.0 0.143 334720.0 ; C3* O3*

45 48 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; C3* C2*

46 47 1 0.100 313800.0 0.100 313800.0 ; O3* HAA

48 49 1 0.143 334720.0 0.143 334720.0 ; C2* O2*

48 51 1 0.153 334720.0 0.153 334720.0 ; C2* C1*

49 50 1 0.100 313800.0 0.100 313800.0 ; O2* HAB

51 52 1 0.148 251040.0 0.148 251040.0 ; C1* NAM

52 53 1 0.133 418400.0 0.133 418400.0 ; NAM CAN

52 56 1 0.133 418400.0 0.133 418400.0 ; NAM CAV

53 54 1 0.133 418400.0 0.133 418400.0 ; CAN NAO

54 55 1 0.133 418400.0 0.133 418400.0 ; NAO CAP

55 56 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; CAP CAV

55 62 1 0.139 418400.0 0.139 418400.0 ; CAP CAQ

56 57 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; CAV NAU

57 58 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; NAU HAG

57 59 1 0.148 334720.0 0.148 334720.0 ; NAU CAT

59 60 1 0.148 334720.0 0.148 334720.0 ; CAT NAS

60 61 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; NAS HAF

60 62 1 0.140 334720.0 0.140 334720.0 ; NAS CAQ

62 63 1 0.133 376560.0 0.133 376560.0 ; CAQ NAR

63 64 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; NAR HAL

63 65 1 0.100 374468.0 0.100 374468.0 ; NAR HAK

[ pairs ]

; ai aj fu c0, c1, ...

1 4 1 ; O4 HAI

1 5 1 ; O4 C2

1 9 1 ; O4 C10A

1 11 1 ; O4 N5

2 6 1 ; C4 O2

2 7 1 ; C4 N1

2 12 1 ; C4 HAJ

2 13 1 ; C4 C5A

2 21 1 ; C4 N10

3 8 1 ; N3 HAH

3 9 1 ; N3 C10A

3 11 1 ; N3 N5

4 6 1 ; HAI O2

4 7 1 ; HAI N1

4 10 1 ; HAI C4A

5 10 1 ; C2 C4A

5 21 1 ; C2 N10

6 8 1 ; O2 HAH

6 9 1 ; O2 C10A

7 11 1 ; N1 N5

7 20 1 ; N1 C9A

7 22 1 ; N1 CBO

8 10 1 ; HAH C4A

8 21 1 ; HAH N10

9 12 1 ; C11 HAJ

9 13 1 ; C11 C5A

9 19 1 ; C11 C9

9 23 1 ; C11 CBP

10 14 1 ; C4A C6

10 20 1 ; C4A C9A

10 22 1 ; C4A CBO

11 15 1 ; N5 C7

11 1 1 ; N5 C9

11 21 1 ; N5 N10

12 14 1 ; HAJ C6

12 20 1 ; HAJ C9A

13 16 1 ; C5A CBH

13 17 1 ; C5A C8

13 22 1 ; C5A CBO

14 18 1 ; C6 CBJ

14 19 1 ; C6 C9

14 21 1 ; C6 N10

15 20 1 ; C7 C9A

16 18 1 ; CBH CBJ

16 19 1 ; CBH C9

17 21 1 ; C8 N10

18 20 1 ; CBJ C9A

19 22 1 ; C9 CBO

20 23 1 ; C9A CBP

21 24 1 ; N10 OBQ

21 26 1 ; N10 CBR

22 25 1 ; CBO HAC

22 27 1 ; CBO OBS

22 29 1 ; CBO CBT

23 28 1 ; CBP HAD

23 30 1 ; CBP OBU

23 32 1 ; CBP CBV

24 27 1 ; OBQ OBS

24 29 1 ; OBQ CBT

25 26 1 ; HAC CBR

26 31 1 ; CBR HAE

26 33 1 ; CBR OBW

27 30 1 ; OBS OBU

27 32 1 ; OBS CBV

28 29 1 ; HAD CBT

29 34 1 ; CBT PBX

30 33 1 ; OBU OBW

31 32 1 ; HAE CBV

32 35 1 ; CBV OBY

32 36 1 ; CBV OBZ

32 37 1 ; CBV OCA

33 38 1 ; OBW PAA

34 39 1 ; PBX OAB

34 40 1 ; PBX OAC

34 41 1 ; PBX O5*

35 38 1 ; OBY PAA

36 38 1 ; OBZ PAA

37 42 1 ; OCA C5*

38 43 1 ; PAA C4*

39 42 1 ; OAB C5*

40 42 1 ; OAC C5*

41 44 1 ; O5* O4*

41 45 1 ; O5* C3*

42 46 1 ; C5* O3*

42 48 1 ; C5* C2*

42 51 1 ; C5* C1*

43 47 1 ; C4* HAA

43 49 1 ; C4* O2*

43 52 1 ; C4* NAM

44 46 1 ; O4* O3*

44 49 1 ; O4* O2*

44 53 1 ; O4* CAN

44 56 1 ; O4* CAV

45 50 1 ; C3* HAB

45 52 1 ; C3* NAM

46 49 1 ; O3* O2*

46 51 1 ; O3* C1*

47 48 1 ; HAA C2*

48 53 1 ; C2* CAN

48 56 1 ; C2* CAV

49 52 1 ; O2* NAM

50 51 1 ; HAB C1*

51 54 1 ; C1* NAO

51 55 1 ; C1* CAP

51 57 1 ; C1* NAU

52 58 1 ; NAM HAG

52 59 1 ; NAM CAT

52 62 1 ; NAM CAQ

53 57 1 ; CAN NAU

53 62 1 ; CAN CAQ

54 57 1 ; NAO NAU

54 60 1 ; NAO NAS

54 63 1 ; NAO NAR

55 58 1 ; CAP HAG

55 59 1 ; CAP CAT

55 61 1 ; CAP HAF

55 64 1 ; CAP HAL

55 65 1 ; CAP HAK

56 60 1 ; CAV NAS

56 63 1 ; CAV NAR

57 61 1 ; NAU HAF

57 62 1 ; NAU CAQ

58 60 1 ; HAG NAS

59 63 1 ; CAT NAR

60 64 1 ; NAS HAL

60 65 1 ; NAS HAK

61 63 1 ; HAF NAR

[ angles ]

; ai aj ak fu c0, c1, ...

1 2 3 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; O4 C4 N3

1 2 10 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; O4 C4 C4A

3 2 10 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N3 C4 C4A

2 3 4 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; C4 N3 HAI

2 3 5 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C4 N3 C2

4 3 5 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; HAI N3 C2

3 5 6 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N3 C2 O2

3 5 7 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N3 C2 N1

6 5 7 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; O2 C2 N1

5 7 8 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; C2 N1 HAH

5 7 9 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C2 N1 C10A

8 7 9 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; HAH N1 C10A

7 9 10 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N1 C10A C4A

7 9 21 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N1 C10A N10

10 9 21 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C4A C10 N10

2 10 9 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C4 C4A C10A

2 10 11 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C4 C4A N5

9 10 11 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C11 C4A N5

10 11 12 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; C4A N5 HAJ

10 11 13 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C4A N5 C5A

12 11 13 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; HAJ N5 C5A

11 13 14 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N5 C5A C6

11 13 20 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N5 C5A C9A

14 13 20 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C6 C5A C9A

13 14 15 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C5A C6 C7

14 15 16 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C6 C7 CBH

14 15 17 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C6 C7 C8

16 15 17 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CBH C7 C8

15 17 18 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C7 C8 CBJ

15 17 19 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C7 C8 C9

18 17 19 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CBJ C8 C9

17 19 20 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C8 C9 C9A

13 20 19 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C5A C9A C9

13 20 21 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C5A C9A N10

19 20 21 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C9 C9A N10

9 21 20 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C11 N10 C9A

9 21 22 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C11 N10 CBO

20 21 22 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; C9A N10 CBO

21 21 23 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; N10 CBO CBP

22 23 24 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; CBO CBP OBQ

22 23 26 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; CBO CBP CBR

24 23 26 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; OBQ CBP CBR

23 24 25 1 109.5 397.5 109.5 397.5 ; CBP OBQ HAC

23 26 27 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; CBP CBR OBS

23 26 29 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; CBP CBR CBT

27 26 29 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; OBS CBR CBT

26 27 28 1 109.5 397.5 109.5 397.5 ; CBR OBS HAD

26 29 30 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; CBR CBT OBU

26 29 32 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; CBR CBT CBV

30 29 32 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; OBU CBT CBV

29 30 31 1 109.5 397.5 109.5 397.5 ; CBT OBU HAE

29 32 33 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; CBT CBV OBW

32 33 34 1 120.0 397.5 120.0 397.5 ; CBV OBW PBX

33 34 35 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OBW PBX OBY

33 34 36 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OBW PBX OBZ

33 34 37 1 103.0 397.5 103.0 397.5 ; OBW PBX OCA

35 34 36 1 120.0 585.8 120.0 585.8 ; OBY PBX OBZ

35 34 37 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OBY PBX OCA

36 34 37 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OBZ PBX OCA

34 37 38 1 120.0 397.5 120.0 397.5 ; PBX OCA PAA

37 38 39 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OCA PAA OAB

37 38 40 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OCA PAA OAC

37 38 41 1 103.0 397.5 103.0 397.5 ; OCA PAA O5*

39 38 40 1 120.0 585.8 120.0 585.8 ; OAB PAA OAC

39 38 41 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OAB PAA O5*

40 38 41 1 109.6 397.5 109.6 397.5 ; OAC PAA O5*

38 41 42 1 120.0 397.5 120.0 397.5 ; PAA O5* C5*

41 42 43 1 111.0 460.2 111.0 460.2 ; O5* C5* C4*

42 43 44 1 109.5 284.5 109.5 284.5 ; C5* C4* O4*

42 43 45 1 109.5 251.0 109.5 251.0 ; C5* C4* C3*

44 43 45 1 104.0 460.2 104.0 460.2 ; O4* C4* C3*

43 44 51 1 104.0 460.2 104.0 460.2 ; C4* O4* C1*

43 45 46 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; C4* C3* O3*

43 45 48 1 104.0 460.2 104.0 460.2 ; C4* C3* C2*

46 45 48 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; O3* C3* C2*

45 46 47 1 109.5 397.5 109.5 397.5 ; C3* O3* HAA

45 48 49 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; C3* C2* O2*

45 48 51 1 104.0 460.2 104.0 460.2 ; C3* C2* C1*

49 48 51 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; O2* C2* C1*

48 49 50 1 109.5 397.5 109.5 397.5 ; C2* O2* HAB

44 51 48 1 104.0 460.2 104.0 460.2 ; O4* C1* C2*

44 51 52 1 109.5 284.5 109.5 284.5 ; O4* C1* NAM

48 51 52 1 109.5 284.5 109.5 284.5 ; C2* C1* NAM

51 52 53 1 126.0 418.4 126.0 418.4 ; C1* NAM CAN

51 52 56 1 126.0 418.4 126.0 418.4 ; C1* NAM CAV

53 52 56 1 108.0 418.4 108.0 418.4 ; CAN NAM CAV

52 53 54 1 108.0 418.4 108.0 418.4 ; NAM CAN NAO

53 54 55 1 108.0 418.4 108.0 418.4 ; CAN NAO CAP

54 55 56 1 108.0 418.4 108.0 418.4 ; NAO CAP CAV

54 55 62 1 132.0 418.4 132.0 418.4 ; NAO CAP CAQ

56 55 62 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CAV CAP CAQ

52 56 55 1 108.0 418.4 108.0 418.4 ; NAM CAV CAP

52 56 57 1 132.0 418.4 132.0 418.4 ; NAM CAV NAU

55 56 57 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CAP CAV NAU

56 57 58 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; CAV NAU HAG

56 57 59 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CAV NAU CAT

58 57 59 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; HAG NAU CAT

57 59 60 1 109.5 460.2 109.5 460.2 ; NAU CAT NAS

59 60 61 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; CAT NAS HAF

59 60 62 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CAT NAS CAQ

61 60 62 1 120.0 376.6 120.0 376.6 ; HAF NAS CAQ

55 62 60 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CAP CAQ NAS

55 62 63 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; CAP CAQ NAR

60 62 63 1 120.0 418.4 120.0 418.4 ; NAS CAQ NAR

62 63 64 1 120.0 292.9 120.0 292.9 ; CAQ NAR HAL

62 63 65 1 120.0 292.9 120.0 292.9 ; CAQ NAR HAK

64 63 65 1 120.0 334.7 120.0 334.7 ; HAL NAR HAK

[ dihedrals ]

; ai aj ak al fu c0, c1, m, ...

2 10 3 1 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C4 C4A N3 O4

3 5 4 2 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp N3 C2 HAI C4

5 3 7 6 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C2 N3 N1 O2

7 9 8 5 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp N1 C11 HAH C2

9 7 21 10 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C11 N1 N10 C4A

10 11 9 2 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C4A N5 C10A C4

11 13 12 10 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp N5 C5A HAJ C4A

13 11 20 14 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C5A N5 C9A C6

15 14 17 16 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C7 C6 C8 CBH

17 15 19 18 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C8 C7 C9 CBJ

20 13 21 19 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C9A C5A N10 C9

21 9 20 22 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp N10 C10A C9A CBO

52 51 53 56 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp NAM C1* CAN CAV

55 62 56 54 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp CAP CAQ CAV NAO

56 57 55 52 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp CAV NAU CAP NAM

57 56 58 59 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp NAU CAV HAG CAT

60 62 61 59 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp NAS CAQ HAF CAT

62 55 60 63 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp CAQ CAP NAS NAR

63 62 64 65 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp NAR CAQ HAL HAK

23 22 24 26 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp CBP CBO OBQ CBR

26 23 27 29 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp CBR CBP OBS CBT

29 26 30 32 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp CBT CBR OBU CBV

34 33 36 35 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp PBX OBW OBZ OBY

38 37 39 40 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp PAA OCA OAB OAC

43 42 45 44 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp C4* C5* C3* O4*

45 43 48 46 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp C3* C4* C2* O3*

48 45 51 49 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp C2* C3* C1* O2*

51 44 48 52 2 35.3 836.8 35.3 836.8 ; imp C1* O4* C2* NAM

52 53 54 55 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp NAM CAN NAO CAP

53 54 55 56 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp CAN NAO CAP CAV

54 55 56 52 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp NAO CAP CAV NAM

55 56 52 53 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp CAP CAV NAM CAN

56 52 53 54 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp CAV NAM CAN NAO

13 14 15 17 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C5A C6 C7 C8

14 15 17 19 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C6 C7 C8 C9

15 17 19 20 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C7 C8 C9 C9A

17 19 20 13 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C8 C9 C9A C5A

19 20 13 14 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C9 C9A C5A C6

20 13 14 15 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C9A C5A C6 C7

2 3 5 7 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C4 N3 C2 N1

3 5 7 9 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp N3 C2 N1 C10A

5 7 9 10 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C2 N1 C10A C4A

7 9 10 2 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp N1 C10A C4A C4

9 10 2 3 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C11 C4A C4 N3

10 2 3 5 2 0.0 1673.6 0.0 1673.6 ; imp C4A C4 N3 C2

22 21 9 7 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih CBO N10 C10A N1

13 11 10 2 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih C5A N5 C4A C4

10 11 13 20 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih C4A N5 C5A C9A

22 21 20 13 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih CBO N10 C9A C5A

9 21 22 23 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih C11 N10 CBP CBR

22 23 24 25 1 0.0 1.3 3 0.0 1.3 3 ; dih CBO CBP OBQ HAC

29 26 23 22 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih CBT CBR CBP CBO

23 26 27 28 1 0.0 1.3 3 0.0 1.3 3 ; dih CBP CBR OBS HAD

32 29 26 23 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih CBV CBT CBR CBP

26 29 30 31 1 0.0 1.3 3 0.0 1.3 3 ; dih CBR CBT OBU HAE

33 32 29 26 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih OBW CBV CBTCBR

34 33 32 29 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih PBX OBW CBV CBT

32 33 34 37 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih CBV OBW PBX OCA

32 33 34 37 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih CBV OBW PBX OCA

38 37 34 33 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih PAA OCA PBX OBW

38 37 34 33 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih PAA OCA PBX OBW

34 37 38 41 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih PBX OCA PAA O5*

34 37 38 41 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih PBX OCA PAA O5*

42 41 38 37 1 0.0 1.0 3 0.0 1.0 3 ; dih C5* O5* PAA OCA

42 41 38 37 1 0.0 3.1 2 0.0 3.1 2 ; dih C5* O5* PAA OCA

38 41 42 43 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih PAA O5* C5* C4*

45 43 42 41 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih C3* C4* C5* O5*

42 43 44 51 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih C5* C4* O4* C1*

42 43 45 48 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih C5* C4* C3* C2*

52 51 44 43 1 0.0 3.8 3 0.0 3.8 3 ; dih NAM C1* O4* C4*

43 45 46 47 1 0.0 1.3 3 0.0 1.3 3 ; dih C4* C3* O3* HAA

51 48 45 43 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih C1* C2* C3* C4*

45 48 49 50 1 0.0 1.3 3 0.0 1.3 3 ; dih C3* C2* O2* HAB

45 48 51 52 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih C3* C2* C1* NAM

44 51 52 56 1 0.0 0.0 2 0.0 0.0 2 ; dih O4* C1* NAM CAV

54 55 62 63 1 180.0 5.9 2 180.0 5.9 2 ; dih NAO CAP CAQ NAR

59 57 56 52 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih CAT NAU CAV NAM

56 57 59 60 1 0.0 0.4 6 0.0 0.4 6 ; dih CAV NAU CAT NAS

62 60 59 57 1 0.0 0.4 6 0.0 0.4 6 ; dih CAQ NAS CAT NAU

59 60 62 63 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih CAT NAS CAQ NAR

55 62 63 65 1 180.0 33.5 2 180.0 33.5 2 ; dih CAP CAQ NAR HAK

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