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Universidade de Brasília
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Celular
Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular
Produção de quimosina B de Bos taurus
em Pichia pastoris
Juliana de Amorim Araújo
Orientador: Prof. Dr. Fernando Araripe Torres
Brasília, DF
2008
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Universidade de Brasília
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Celular
Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular
Construção de um vetor integrativo em múltiplas
cópias para Saccharomyces cerevisiae
utilizando seqüências delta
Theyssa Fernanda Barbosa Borges
Orientadora: Prof. Dra. Lidia Maria Pepe de Moraes
Brasília, DF
2009
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
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Universidade de Brasília
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Celular
Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular
Construção de um vetor integrativo em múltiplas
cópias para Saccharomyces cerevisiae
utilizando seqüências delta
Theyssa Fernanda Barbosa Borges
Orientadora: Prof. Dra. Lidia Maria Pepe de Moraes
Brasília, DF
2009
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Departamento de Biologia Celular
do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade de Brasília como
requisito parcial à obtenção do grau
de Mestre em Biologia Molecular.
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Theyssa Fernanda Barbosa Borges
Construção de um vetor integrativo em múltiplas
cópias para Saccharomyces cerevisiae
utilizando seqüências delta
Dissertação apresentada à banca como exigência parcial para a obtenção do
título de Mestre em Biologia Molecular da Universidade de Brasília
13 Fevereiro de 2009
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. Lidia Maria Pepe de Moraes
Universidade de Brasília
Presidente da Banca
Prof. Dra. Lucília Marcelino
Embrapa Cenargen
Membro Efetivo
Prof. Dra. Beatriz Dolabela de Lima
Universidade de Brasília
Membro Efetivo
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“O homem que sente o vento da mudança
não deve construir um quebra-vento,
mas um moinho de vento”
(Stephen King)
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Ao meu querido avô João,
um dos maiores incentivadores que já tive
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AGRADECIMENTOS
À Deus, pela vida, por conservar minha saúde, me amparar nas horas mais
difíceis e ser sempre meu melhor amigo;
Aos meus pais, porque sempre estiveram ao meu lado me apoiando e sendo
parte fundamental de todas as minhas decisões. Pelo amor e carinho que sempre me
dedicaram, não tenho palavras para expressar minha gratidão. Essa vitória, assim
como todas as outras que ainda virão, é muito mais de vocês do que minha;
Às minhas irmãs, Larissy e Christiane, por também me apoiarem e vibrarem
com as minhas conquistas, pelas brigas (que me fazem exercitar a capacidade de
argumentação rs) e pelas fofocas até tarde da noite nos fins-de-semana. Vocês não
fazem idéia do quanto são importantes na minha vida.
Ao meu irmão lindo Pedro Augusto, apenas por ser você! Meu orgulho! E
porque eu não consigo imaginar minha vida sem a sua alegria.
Aos meus avós, por que sempre se orgulharam de mim mesmo sem entender
direito o que eu fazia, por se preocuparem se eu estava me alimentando bem em
Brasília e por serem sempre meu exemplo.
Ao meu namorado, Marcos, pela compreensão da distância, pela paciência
com os meus telefonemas nos momentos de stress, por entender que “não basta ser
namorado, tem que participar”, pela ajuda constante, pela torcida e principalmente
pelo carinho. Te amo!
À minha família de Brasília. Meus queridos primos Márcia e Vitor, por que
me acolheram com tanto carinho, por me ensinarem tantas coisas (sobre vinho,
inclusive), pelos livros emprestados e filmes assistidos, por me incluírem no passeios,
pelas conversas filosóficas, por agüentarem meus desabafos e devaneios e por me
darem teto e proteção. E minhas primas lindas Fernanda e Thais, por terem sido
minhas primeiras e melhores amigas nessa cidade maluca, por me indicarem os
caminhos na UnB, pelas caronas diárias, por dividirem seu espaço comigo, pela
compreensão, pelas conversas e tudo mais. Jamais poderei agradecer suficientemente
tudo o que vocês quatro fizeram por mim.
Aos meus tios pela torcida; e aos meus primos por me mostrarem que meus
melhores amigos são a minha família;
À minha orientadora, professora Dra. Lidia Maria Pepe de Moraes, pela
oportunidade, pelos ensinamentos e pela ajuda sempre;
!
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Ao professor Dr. Fernando Araripe Torres pela disponibilidade nos momentos
de duvida e pelas dicas preciosas.
Aos demais professores do laboratório de Biologia Molecular: Andréa
Maranhão, Elida Campos, Janice Lisboa, Marcelo Brígido, Márcio Poças, Maria Sueli
e Ildinete Pereira por estarem sempre dispostos a ajudar;
À Vivis, pela paciência com as inúmeras e repetidas perguntas desde quando
eu entrei no laboratório até a escrita desse trabalho, pelos protocolos e pela amizade;
Aos meus primeiros orientadores na bancada, Saulo e Camila Marinho, pelas
palavras de apoio e incentivo, por me fazerem entender a dinâmica do laboratório,
pela paciência sempre e também pela amizade;
À minha amiga xifópaga Juliana, por ter sido a primeira a conversar comigo,
por ser a melhor companheira de bancada que eu poderia ter pois está sempre pronta
pra me socorrer, por agüentar as broncas no meu lugar, pelas conversas nerds e as
supérfluas, pelos conselhos, apoio, pela correção dos textos e principalmente pelas
quartas-feiras que foram fundamentais;
Aos meus amiguinhos queridos Marciano e Túlio, também pelas quartas-
feiras, pelos favores prestados sempre que eu pedi e pela amizade que já é eterna no
meu coração;
Às minhas amigas Stephany e Calliandra, por me ajudarem a sobreviver em
Brasilia quando eu cheguei, pelas risadas e maluquices, pelos almoços, lanches e
cinema. Calli, obrigada por sempre ter chocolate e pela companhia no ônibus;
Ao Hugo, por toda ajuda que me deu: no desenho dos primers e nas
ferramentas de bioinformática; pelos protocolos e dicas na execução dos
experimentos, pelos materiais emprestados, pelo companheirismo nas disciplinas e
nos fins-de-semana que fiquei no laboratório.
Aos colegas do Lab 2 que estiveram comigo nesses dois anos: Andrelisse,
Alexsandro, Basti, Betulia, Bia, Bruno, Cristiane, Ezequiel, Loise, Karen, Carolina
Brettas (companheira de bancada), Pollyanna, Tiago e Vinicius. É maravilhoso
trabalhar com vocês.
Aos demais colegas da BioMol que tornam o ambiente de trabalho tão
prazeroso.
À Dona Ivonildes e à Fátima, pela paciência e pelo apoio técnico fundamental
para o funcionamento do laboratório;
!
À Ana, da secretaria, por agüentar minhas milhares e milhares de perguntas;
Aos meus eternos e verdadeiros amigos: Elisa (irmã que eu escolhi), Alcides,
Marcos, Thallytta, Cecília (por me acolher no Rio), Fernando, Janaina, Dim e demais
apêndices. Por tornarem as lutas suportáveis, por fazerem parte da minha vida e por
me fazerem sentir orgulho em dizer que tenho bons amigos!
À Patrícia (nega), especialmente, por escutar minhas lamúrias quando esteve em
Brasília e por abrir as portas do laboratório em Goiânia pra eu corar minhas placas;
À CAPES pelo apoio financeiro;
À todos que participaram desse momento na minha vida e contribuíram de
alguma forma para a realização deste trabalho.
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ÍNDICE
Lista de figuras
i
Lista de tabelas
ii
Abreviaturas
iii
Resumo
vi
Abstract
viii
1. Introdução
1
1.1 Produção de etanol a partir de amido: visão econômica
1
1.2 Enzimas de degradação de amido: amilases
5
1.3 Saccharomyces cerevisiae na produção de etanol
7
1.4 S. cerevisiae: Linhagens de laboratório X Linhagens industriais
9
1.5 Transformação de uma linhagem industrial
12
1.5.1 Marca de Seleção
13
1.5.2 Vetores de Expressão
15
1.5.3 Estratégias de Integração: rDNA X Tyδ
17
1.6 A linha de pesquisa “produção de etanol a partir de amido” do grupo de
Biotecnologia Molecular da UnB
19
2. Objetivos
21
2.1 Objetivo Geral
21
2.2 Objetivos Específicos
21
3. Estratégia
22
4. Material
21
4.1 Microrganismos utilizados
21
4.1.1 Linhagens bacterianas
21
4.1.2 Linhagens de leveduras
21
4.2 Enzimas
21
4.3 Marcadores de DNA
22
4.4 Kits
22
4.5 Ferramentas de Bioinformática
23
4.6 Vetores
23
4.7 Meios de cultura e soluções
24
4.7.1 Meios e soluções para cultivo de Escherichia coli
24
4.7.2 Meios e soluções para cultivo de Saccharomyces cerevisiae
25
4.7.3 Soluções e tampões para técnicas de DNA recombinantes
26
!
4.7.3.1 Extração de DNA plasmidial
26
4.7.3.2 Análise de ácidos nucléicos em gel de agarose
27
4.7.3.3 Extração de DNA de levedura
27
4.7.3.4 Soluções e tampões para transformação de S. cerevisiae
28
4.7.4 Soluções e tampões para ensaio de atividade enzimática (dosagem
amilolítica.
29
5. Métodos
30
5.1 Extração do DNA total de levedura
30
5.2 Reação de cadeia de polimerase (PCR)
30
5.3 Análise dos ácidos nucléicos em gel de agarose
31
5.4 Seqüenciamento e análise da seqüencia do DNA
31
5.5 Ligação dos fragmentos de DNA
31
5.6 Defosforilação dos vetores para ligações não direcionadas
31
5.7 Transformação de bactéria
32
5.8 Preparação de DNA plasmidial em pequena escala (mini-prep)
32
5.9 Preparação de DNA plasmidial em média escala (midi-prep)
33
5.10 Digestão de DNA com enzimas de restrição
33
5.11 Precipitação de DNA
34
5.12 Purificação e eluição de fragmentos de DNA em gel de agarose
34
5.13 Transformação rápida de levedura em fase estacionaria
34
5.14 Teste de tolerância ao antibiótico
35
5.15 Transformação de Saccharomyces cerevisiae por eletroporação
35
5.16 Seleção de clones recombinantes
36
5.17 Determinação da atividade amilolítica
36
5.18 Análise do crescimento celular
36
5.19 Teste de estabilidade mitótica
37
6. Resultados
38
6.1 Desenho dos iniciadores para amplificação da seqüência Tyδ
40
6.2 Amplificação dos fragmentos TyD e TyE por PCR
41
6.3 Construção do vetor pTm
43
6.4 Construção do vetor pT
46
6.5 Inserção dos cassetes da α-amilase e glicoamilase no vetor pT
48
6.6 Transformação de linhagens de Saccharomyces cerevisiae e seleção dos
clones transformantes
57
6.7 Curva de crescimento das colônias transformantes e atividade enzimática
59
!
!
6.8 Teste de estabilidade mitótica
62
7. Discussão
65
8. Conclusões e Perspectivas
76
9. Referências
78
10. Anexos
Anexo 1 Marcadores utilizados
Anexo 2 Mapa do vetor de clonagem pGEMT
®
Easy (Promega)
Anexo 3 Mapa do vetor de clonagem pBlueScript II KS+ (Promega)
Anexo 4 Mapa do vetor YEp 351 – PGK
Anexo 5 Mapa do vetor PYC230
!
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
6
Figura 2
7
Figura 3
10
Figura 4
41
Figura 5
42
Figura 6
44
Figura 7
46
Figura 8
47
Figura 9
48
Figura 10
50
Figura 11
52
Figura 12
53
Figura 13
54
Figura 14
55
Figura 15
56
Figura 16
58
Figura 17
59
Figura 18
60
Figura 19
62
Figura 20
64
Figura 21
65
Figura 22
66
Figura 23
67
Figura 24
68
Figura 25
70
Figura 26
72
!
!
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
2
Tabela 2
14
Tabela 3
15
Tabela 4
61
Tabela 5
68
!
ABREVIATURAS
A
adenina
C
citosina
CaCl
2
cloreto de cálcio
CO
2
gás carbônico
DNA
ácido desoxirribonucléico
dNTP
deoxirribonucleotídeo
EDTA
ácido etilenodiaminotetracético
g
grama
g
gravidade
G
guanina
GRAS
generally recognized as safe
G418
geneticina
g/L
grama por litro
h
hora
H
2
O
água
IPTG
isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
I
2
iodo
KCl
cloreto de potássio
kb
kilobase
L
litro
LB
Luria-Bertani
M
molar
MgCl
2
cloreto de magnésio
mg
miligrama
mg/mL
miligrama por mililitro
mL
mililitro
mm
milímetro
mM
milimolar
MM
meio mínimo
min
minuto
NaCl
cloreto de sódio
NaOH
hidróxido de sódio
NH
4
SO
4
sulfato de amônio
OD
600
densidade óptica a 600 nanômetros
!
!
OD
660
densidade óptica a 660 nanômetros
pb
pares de base
PCR
reação de polimerização em cadeia
pH
potencial hidrogeniônico
PROALCOOL
Programa de incentivo à produção de etanol
p/v
peso por volume
q. s. p.
quantidade suficiente para
RbCl
2
cloreto de rubídio
RNA
ácido ribonucleico
rpm
rotações por minuto
SAP
fosfatase alcalina de camarão
SDS
dodecilsulfato de sódio
seg
segundo
T
timina
TAE
tampão tris-acetato-EDTA
TEB
tampão tris-borato-EDTA
U
unidade
V
volume
V
volts
v/v
volume por volume
x
vezes
X-gal
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosideo
YCp
plasmídios centroméricos
YEp
plasmídios epissomais
YIp
plasmídios integrativos
YLp
Plasmídios lineares
YNB
base nitrogenada de levedura
YPD
meio complexo para levedura
YRp
plasmídios replicativos
:
para
/
por
%
por cento
°C
graus Celsuis
µF
micro-faradays
µg
micrograma
!
µg/mL
micrograma por mililitro
µL
microlitro
µm
micrometro
µm
micron
ηg
nanogramas
Ω
ohm
ρmol
picomol
!
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RESUMO
Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de etanol a partir
de biomassa. E o Brasil já tem considerável experiência na produção de bioetanol a
partir de cana-de-açúcar, no entanto ela é uma planta sazonal e requer terra de plantio
de alta qualidade para seu crescimento. Como substrato alternativo para produção de
etanol no Brasil a baixo custo, temos a mandioca. O grupo de biotecnologia molecular
da UnB possui uma linha de pesquisa que visa diminuir os custos da produção de
etanol a partir de amido de mandioca. Em 1995, Moraes et al. construiu oito linhagens
de Saccharomyces cerevisiae capazes de converter amido a etanol, no entanto o vetor
utilizado nas construções é epissomal e por não ser estável pode ser facilmente
perdido durante o processo industrial onde há o stress ambiental e competição entre as
linhagens. Para reverter este quadro, este trabalho visou a construção de um vetor
integrativo baseado na seqüência δ do transposon Ty de Saccharomyces cerevisiae no
qual foram inseridos os cassetes de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis e
glicoamilase de Aspergillus awamori, gerando três diferentes vetores: pTA (contendo
o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e pTAGA
(contendo ambos os cassetes). A linhagem semi-industrial MFL e a linhagem
industrial JP1 foram transformadas com os vetores construídos. Foram encontrados
cinco clones positivos para atividade amilolítica nas transformações da MFL e dois na
JP1, a baixa eficiência de seleção de transformantes deve-se ao fato de a marca de
seleção não estar inserida no vetor integrativo. As curvas de crescimento dos clones
positivos mostraram que não houve alterações no crescimento das linhagens após
integração dos vetores e os testes de atividade enzimática mostraram que os clones
estão produzindo as enzimas de interesse. Além disso, os testes de estabilidade
mitótica mostraram alta estabilidade do vetor nos clones positivos da linhagem JP1, o
que torna este sistema de expressão atrativo para produção industrial.
!
ABSTRACT
At present, the market became favorable for ethanol production from biomass.
And Brazil already has considerable experience in the bioethanol production from
sugar-cane, however it is a seasonal plant and it requires land of planting of high
quality for his growth. As alternative substrate for low cost ethanol production in
Brazil, we have the cassava. The molecular biotechnology group of UnB has a line of
research that aims to reduce the costs of ethanol production from cassava starch . In
1995, Moraes et al. built eight Saccharomyces cerevisiae strains able to convert starch
to ethanol, however the vector used in this constructions is epissomal and because of
not being stable it can be easily lost during the industrial process where there is the
environmental stress and competition between strains. To revert this picture, this work
aimed the construction of an integrative vector based on sequence δ of the
Saccharomyces cerevisiae transposon Ty in which the cassettes of expression of
Bacillus subtilis α-amilase and Aspergillus awamori glicoamilase were inserted,
resulting three different vectors: pTA (containing the cassette of α-amilase), pTGA
(containing the cassette of the glicoamilase) and pTAGA (containing both cassettes).
The semi-industrial strain MFL and the industrial strain JP1 were transformed by
these vectors. Five positive clones were found with amylolytic activity in the MFL
transformations and two in the JP1, the low selection efficiency of positive clones is
due to the fact that the selection mark wasn’t inserted in the integrative vector. The
positive clone’s growth curves showed that there were no alterations in the strain’s
growth after vector’s integration and the tests of enzymatic activity showed that the
clones are producing the enzymes of interest. Moreover, the mitotic stability’s tests
showed high stability of the vector in the positive clones of the strain JP1, which
makes this system of expression attractive for industrial production.
!
!
1. Introdução
!
1.1 Produção de etanol a partir de amido: visão econômica
Devido a instabilidade geopolítica das principais regiões detentoras da
produção de petróleo e seus derivados e da oscilação do preço do barril, surgiu uma
grande busca mundial por novas matrizes energéticas que pudessem ser viáveis
economicamente. Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de
etanol, por se tratar de uma fonte de energia renovável e por possuir um apelo
ecologicamente correto (EVTEC, 2005).
O Brasil já possui tradição na produção de etanol a partir de cana-de-açúcar,
pois o combustível é produzido desde 1975, quando foi lançado um programa de
incentivo à produção de bioetanol, como meio de fugir da crise no Oriente Médio que
elevou o preço do petróleo a patamares extremos na década de 70. O PROALCOOL,
como ficou conhecido esse programa, além de visar a redução da dependência do
país do petróleo (antes do programa o Brasil chegou a importar 85 % do produto que
era consumido internamente, 44,5 % de toda atividade de importação brasileira), teve
como objetivo salvar os produtores de cana-de-açúcar da falência, pois nos anos 70
houve uma repentina queda nos preços do açúcar no mercado internacional que
comprometia a economia agrícola local. O programa ainda possuía caráter social e
propunha o desenvolvimento brasileiro por meio da geração de postos de trabalho
gerados pelas novas empresas produtoras de álcool (EVTEC, 2005).
Desde então o álcool passou a ser utilizado como combustível no país tanto na
sua forma hidratada como misturado à gasolina, no caso dos carros bicombustíveis
(flex). Isso tornou o Brasil um líder na produção de etanol. Segundo dados do NIPE-
UNICAMP, nos últimos anos, o Brasil passou a exportar 15 % do etanol produzido.
Por causa do Protocolo de Kyoto, vários países, entre eles o Japão, já consideram
adicionar álcool à gasolina como uma forma de diminuir a emissão de gases
poluentes. Todavia, a atual produção brasileira não será suficiente para atender a esta
futura demanda. Haveria a necessidade de aumentar a área de cultivo de cana-de-
açúcar, avançando em áreas de preservação, ou substituindo outros cultivos. Ambas
as alternativas trariam prejuízos à sociedade (Guandalini & Silva, 2006). Outra
barreira para o aumento do cultivo da cana-de-açúcar é o fato de ela ser uma planta
sazonal e requerer terra de plantio de alta qualidade para seu crescimento, assim ela
não poderia ocupar todos os nichos agrícolas que o Brasil oferece (Moraes et al.,
1995).
!
!
Nos EUA, que hoje é o maior produtor de etanol, a produção do combustível é
baseado principalmente no amido de milho como substrato. Mas a utilização desse
amido para a produção de etanol encontra várias barreiras. Uma delas é o valor
agregado dos produtos derivados do amido de milho, como xarope de glicose e
maltose, que são maiores que o do etanol, além de serem produtos de consumo
popular.
Tabela 1: Principais países produtores de etanol. Fonte: Veja abril/2008
País
Fonte utilizada para produção de bioetanol
Brasil
cana-de-açúcar
Estados Unidos
principalmente milho, mas com boa perspectiva de chegar
primeiro ao etanol de celulose
Canadá
trigo e milho
China
Mandioca
Índia
cana, melaço
Colômbia
cana e óleo de palma
Devido a essas e outras limitações dos substratos que vem sendo utilizados na
produção do combustível, os principais países produtores de etanol têm investido em
estudos que visam promover a produção de etanol a partir fontes alternativas. Dentre
as pesquisas, muitas estão focadas na utilização de resíduos lignocelulósicos para
produção de etanol, por serem estes uma fonte de carboidratos muito abundante na
natureza e por representarem uma possibilidade de utilização dos resíduos agrícolas, o
que evitaria a expansão desmedida de áreas agricultáveis para geração de energia. No
entanto o uso deste tipo de substrato ainda é economicamente problemático, pois os
resíduos lignocelulósicos só se tornam disponíveis para fermentação após tratamento
com ácidos e uma etapa de hidrólise da celulose e a da hemicelulose (Sun & Cheng,
2002). As enzimas empregadas nas etapas iniciais de hidrólise da celulose, as
celulases, possuem atividade pouco específica e a problemática de serem inibidas pelo
próprio produto, o que interrompe a reação antes do término. Além disso, elas são
produzidas por empresas como Genecor e Novozymes, que por serem empresas
!
estrageiras, podem aumentar significativamente os custos do processo (Suto &
Tomita, 2001).!!
Outros estudos visam a otimização de tecnologias para obtenção de etanol a
partir das fontes já utilizadas (glicose e o amido), o que é favorável do ponto de vista
econômico (Bai et al., 2007).
A produção de álcool a partir de amido já foi cogitada no Brasil no início do
PROALCOOL como uma tentativa de se obter uma fonte alternativa à cana-de-
açúcar. De modo que 1977 começou a operar a usina Curvelo, uma indústria capaz de
produzir sessenta mil litros diários de álcool com base em mandioca. A mandioca
(fonte de amido) possui inúmeras vantagens que a torna uma boa opção como
alternativa para a produção de bioetanol a baixo custo, como por exemplo, o fato de
ela ser uma planta produzida na maioria dos estados brasileiros, possuir variedades
que podem ser colhidas em diferentes épocas do ano, menor nível de exigência do
solo e menor sensibilidade climática quando comparada com a cana-de-açúcar, além
de possuir baixos custos de produção, fácil colheita, e capacidade de estocagem sem
perda de qualidade em sua forma desidratada. Porém, a produção de etanol a partir da
mandioca na década de 70 mostrou-se um empreendimento inviável pois as
instalações de indústrias produtoras de álcool de mandioca foram construídas em
regiões não tradicionais para cultivo, ou em fim de ciclo do pólo mandioqueiro. Além
disso, o modelo comercial, desenhado na época, não era adequado, pois previa que o
controle da produção de mandioca ficaria sob a guarda de poucas empresas o que
gerava dependência no abastecimento. E por falta de condições tecnológicas, a usina
de Curvelo, junto com outras oito, fracassou. (EVTEC, 2005).
Em 2005, no entanto, um estudo de viabilidade técnica econômica e comercial
(EVTEC) sobre a comparação da produção de etanol a partir de amido de mandioca e
cana-de-açúcar foi realizado pelo Centro de Apoio de Desenvolvimento Tecnológico
(CDT) da Universidade de Brasília, concluindo que a implementação de
microdestilarias para a produção de álcool a partir de mandioca é plenamente viável e
o produto é altamente competitivo, se consideradas as proporções mercadológicas
globais e focado nos arranjos produtivos locais.
Além disso, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas com o fim de diminuir
os custos de produção do etanol a partir de amido e para isso um grande número de
estratégias podem ser adotadas. Como a Saccharomyces cerevisiae, que é o principal
microrganismo utilizado na produção de etanol a partir de cana-de-açúcar, não é capaz
!
!
de utilizar diretamente o amido como fonte de energia, uma dessas estratégias é a
construção de linhagens capazes de utilizar o amido como fonte energética, para isso
são utilizadas fusões protoplasmáticas interespecíficas ou intergenéricas e a introdução
de genes heterólogos que codificam amilases nesses microrganismos (Moraes et al.,
1995) a fim de desenvolver um processo de sacarificação e fermentação simultâneas
(SSF).
O processo SSF envolve a hidrólise de polissacarídeos a glicose e sua conversão
em etanol no mesmo reator. Algumas vantagens desse método com relação à hidrólise
e fermentação separadas são: custos mais baixos, devido à diminuição do número de
reatores na indústria, aumento na taxa de hidrólise e baixa inibição do microrganismo
pelo próprio produto, além da diminuição no tempo da fermentação (Giordano et. al.,
2007).
!
1.2 Enzimas de degradação de amido (amilases)
Para a quebra completa da molécula do amido, várias enzimas que clivam o
polímero em locais diferentes são necessárias (Figura 1). Para o processo de produção
de etanol a partir de amido basicamente duas enzimas são utilizadas: a α-amilase,
numa etapa da produção que é chamada de liquefação, e a glicoamilase, numa outra
etapa que é chamada de sacarificação (Van der Maarel et al., 2002).
A α-amilase, classificada como uma endoamilase é capaz de quebrar as ligações
glicosídicas presentes na parte interna (endo-) da cadeia de amilose e amilopectina.
Os produtos finais da ação das α-amilases são oligossacarídeos de diversos tamanhos
em uma configuração anomérica α, e dextrinas limites, na qual constituem os
oligossacarídeos ramificados (Van der Maarel et al., 2002). Para as α-amilases, o
mecanismo catalítico mais aceito é o de duplo deslocamento com manutenção da
configuração anomérica original (α) do produto originado. Esse mecanismo envolve 2
resíduos catalíticos no sítio ativo; um ácido glutâmico que atua na catálise ácido/base
e um aspartato que atua como nucleófilo. Todo o mecanismo pode ser agrupado em 5
etapas: (i) depois de o substrato ter se ligado ao sítio ativo, o ácido glutâmico
protonado doa um próton para o oxigênio da ligação glicosídica, (ii) um estado de
transição com um íon oxocarbônio é formado seguido pela formação de um
intermediário covalente; (iii) uma molécula de glicose protonada deixa o sítio ativo,
enquanto uma molécula de água ou uma nova molécula de glicose interage no sítio
ativo a ataca a ligação covalente entre a molécula de glicose e o aspartato; (iv) um
estado de transição com um íon oxocarbônio é formado novamente; (v) o glutamato
que atua na catálise agora como uma base aceita um hidrogênio da água ou da nova
molécula de glicose (Galdino, 2008).
Já a glicoamilase, também conhecida como amiloglicosidase ou γ-amilase, age
sobre os resíduos externos de glicose da amilose e da amilopectina produzindo
somente glicose, sendo classificada, portanto com uma exoamilase. Ela é capaz de
hidrolisar as ligações glicosídicas α-1,4 em amido solúvel e oligossacarídeos
relacionados com inversão da configuração para produzir β-glicose. Além da
atividade α-1,4, a glicoamilase fúngica hidrolisa lentamente as ligações α-1,6 do
amido (Norouzian et al., 2006). A eficiência catalítica (Kcat/Km) para a hidrólise das
ligações α-1,6 é apenas 0,2% da atividade α-1,4. Este efeito adverso compromete o
!
!
rendimento da sacarificação em nível industrial. No entanto, um aumento no
rendimento de glicose produzida na etapa de sacarificação pode chegar a níveis
maiores que 96% por meio da atividade glicosídica α-1,6 das glicoamilases (Sauer et
al., 2000).
Figura 1: Diferentes enzimas envolvidas na degradação do amido. A estrutura em
forma de anel fechado representa a extremidade redutora de uma cadeia
oligossacarídica. Fonte: Bertoldo & Antranikian (2002).
!
mobilis has also been intensively studied over the past
three decades and repeatedly claimed by some research-
ers to replace S. cerevisiae in ethanol production,
because this species possesses some “superior char-
acteristics” compared to its counterpart S. cerevisiae.
2.1. Saccharomyces cerevisiae
Although many researchers studied the ethan ol fer-
mentation with S. cerevisiae, in some cases a lack of
recognition of its metabolic pathway led to approaches
that are unli kely to yield significant improvements. The
main metabolic pathway involv ed in the ethanol f er-
mentation is glycolysis (Embden–Meyerhof–Par nas or
E MP pathway) , through which one molecule of
glucose is metabolized, and two molecules of pyruvate
are produced (Madigan et al. , 2000), as illustrated in
Fig. 2.
Und er anaerobic conditions, the pyr uvate is further
reduced to ethanol with the release of CO
2
. Theo ret-
ically, the yield is 0.511 for ethanol and 0.489 for CO
2
on a mass basis of glucose metabolized. Two ATPs
produced in the glycolysis are use d to drive the
biosynthesis of yeast cells which inv olv es a variety
of energy-requiring bi oreactions. Therefore, ethanol
production is tightly coupled with yeast cell growth,
which means yeast must be produced as a co-product.
Without the continuous consumption of ATPs by the
growth of yeast cells, the glycol ytic metabolism of
glucose will be interrupted immediately, because of the
intracellular accumu lation of ATP, which inhibits
phosphofructokinase (PF K), one of the most important
regulation enzymes in the glycolysi s. This very basic
principle contradicts the ethanol fermentation wit h the
yeast cells immobilized b y supporting mater ials,
particularly by gel entrapments , which physi cally
restrict the yeast cells and sig nificantly retard their
growth.
In addition to ethanol and CO
2
, various by-products
are also produced during ethanol fermentation. Glycer-
ol, producing at a level of about 1.0% (w/v) for most
ethanol fermentations, is the main one. Higher mash pH,
Fig. 2. Metabolic pathway of ethanol fermentation in S. cerevisiae. Abbreviations: HK: hexokinase, PGI: phosphoglucoisomerase, PFK:
phosphofructokinase, FBPA: fructose bisphosphate aldolase, TPI: triose phosphate isomerase, GAPDH: glyceraldehydes-3-phosphate dehy-
drogenase, PGK: phosphoglycerate kinase, PGM: phosphoglyceromutase, ENO: enolase, PYK: pyruvate kinase, PDC: pyruvate decarboxylase,
ADH: alcohol dehydrogenase.
91F.W. Bai et al. / Biotechnology Advances 26 (2008) 89–105
1.3 Saccharomyces cerevisiae na produção de etanol
Diversos organismos vem sendo estudados para a utilização na produção de
bioetanol, mas a levedura Saccharomyces cerevisiae continua sendo a principal
espécie utilizada para este fim (Bai, 2008). A S. cerevisiae é um organismo unicelular
que se reproduz assexuadamente por brotamento, é anaeróbico facultativo e apresenta
fenótipo Kluyver positivo, ou seja, é capaz de produzir etanol na presença de oxigênio
em altas concentrações de glicose (Kingsman & Kingsman, 1988; Leite et al.,2008).
A principal via metabólica envolvida na fermentação alcoólica de S. cerevisiae é a via
da glicólise, na qual uma molécula de glicose é metabolizada e duas moléculas de
piruvato são produzidas. Em condições anaeróbicas, o piruvato é reduzido a etanol
com a liberação de CO
2
(Bai, 2008) (Figura 2).
Figura 2: Via metabólica da fermentação alcoólica em Saccharomyces cerevisiae
– Abreviações: HK: hexoquinase, PGI: fosfoglucoisomerase, PFK: fosfofrutoquinase,
FBPA: fructose bisfosfato aldolase, TPI: triose fosfato isomerase, GAPDH: gliceraldeido-
!
!
3-fosfato desidrogenase, PGK: fosfoglicerato quinase, PGM: fosfogliceromutase, ENO:
enolase, PYK: piruvato quinase, PDC: piruvato descarboxilase, ADH: alcool
desidrogenase. (Fonte: Bai, 2008).
Devido ao fato da S. cerevisiae ser utilizada na produção de vinho, cerveja,
pães e álcool combustível, entre outros produtos de importância econômica, e por ser
receptivo aos mais sofisticados níveis de manipulação genética, ela despertou o
interesse dos pesquisadores de biotecnologia. Tal fato resultou em inúmeros estudos,
sendo que a seqüência completa do genoma da levedura foi depositado nos bancos de
dados públicos em 1996 (Nobrega, 2001). Todas essas informações foram
disponibilizadas no sítio da internet (Rede Mundial de Computadores) da SGD
(Saccharomyces Genome Database) (SGD, 2005). A publicação da seqüência do
genoma de S. cerevisiae, assim como os avanços na compreensão de sua fisiologia
tornaram esse microrganismo eucarioto modelo para aplicações em biologia
molecular. Isto, associado ao crescente desenvolvimento da tecnologia do DNA
recombinante, tem viabilizado o melhoramento genético de linhagens possibilitando
um melhor aproveitamento desse microrganismo no campo da biotecnologia (Shüller
& Casal, 2005).
Outras vantagens deste microrganismo e que também são um atrativo para
aplicações tecnológicas é o fato de ele ser geralmente reconhecida como um
microrganismo seguro (GRAS), produzir etanol por fermentação acima de 20 % (v/v)
a partir de fontes de carbono (Cot et al., 2006), além de possuir alta resistência às
condições ambientais adversas (Tavares, 2004).
!
1.4 S. cerevisiae: Linhagens de laboratório X Linhagens industriais
Apesar de todas as diferenças descritas na literatura entre linhagens industriais
e de laboratório, o vasto conhecimento que se tem acerca da S. cerevisiae é
proveniente de estudos com linhagens laboratoriais, e a problemática disso é que após
anos de manipulação em laboratório essas linhagens perderam características que as
linhagens utilizadas na indústria possuem (Wheals et al., 1999).
Linhagens de laboratório são de mais fácil manipulação e por isso geralmente
são as primeiras a serem utilizadas quando a engenharia metabólica em S. cerevisiae
deve ser provada. Entretanto, para aplicação industrial, os mesmos conceitos devem
ser testados utilizando linhagens provenientes da indústria (Zaldivar, 2002).
Visto que o processo industrial no Brasil ocorre em condições não estéreis, ele
fica susceptível à contaminação por outras leveduras que não a S. cerevisiae e ao
ganho de novas células da própria S. cerevisiae, o que produz uma sucessão na
população de leveduras, onde aquelas que estão genetica e fisiologicamente mais
adaptadas tendem a dominar (Silva-Filho et al., 2005).
Por esse motivo, linhagens provenientes de indústrias alcooleiras estão
recebendo uma maior atenção dos pesquisadores devido à possibilidade de utilização
de leveduras mais adaptadas e altamente produtivas para a otimização da produção
industrial de etanol. As qualidades requeridas para o processo industrial incluem a
tolerância ao estresse fermentativo, altas temperaturas, variações de pressão osmótica
e ao próprio etanol, além de baixos pHs, interrupções de produção, etc. (Figura 3)
(Silva-Filho et al., 2005).
!
!
Figura 3: Potenciais estresses ambientais enfrentados pela Saccharomyces
cerevisiae durante o processo de produção de etanol. (Fonte: Bai, 2008)
Do ponto de vista molecular, linhagens industriais, quando comparadas às
linhagens de laboratório, são geneticamente mais complexas e não possuem
estabilidade em seu estado haplóide, sendo aneuploidias comuns em leveduras
industriais. Por outro lado, estas linhagens tem evoluído para uma melhor adaptação a
diferentes ambientes ou nichos ecológicos modificados, ou não, pela atividade
humana. Este processo é denominado “domesticação” e pode ser responsável por
certas características genéticas das linhagens industriais como, por exemplo, número
variado de ploidia e polimorfismo cromossômico (Lucena et al., 2007). A
modificação da constituição genética das linhagens industriais para uma melhor
adaptação ao ambiente industrial ocorre por meio de eventos como recombinação
mitótica entre seqüências homólogas, crossing-over mitótico e conversões gênicas.
Estas mudanças tendem a ser fixadas numa linhagem como resultado de uma pressão
seletiva para as características genéticas que melhor satisfazem àquelas condições
ambientais (Leite, 2008). Pretorious (2000) descreveu ainda a presença de
cromossomos extras em linhagens industriais e com ela a superexpressão
concomitante de genes, uma adaptação deste tipo de linhagem que poderia conferir
mais uma vantagem sobre as linhagens de laboratório (Zaldivar, 2002).
Portanto, devido ao longo processo de “domesticação”, as linhagens
industriais tem acumulado uma alta complexidade genômica. Esta complexidade tem
increased osmotic press ure, lower flux of pyruvate due
to the utilization of glycolytic intermediates subsequent
to the step in the pathway producing reduced NAD for
biosynthesis all can stimulate the conversion of dihy-
droxyacetone phosphate to glycerol ( Ingledew, 1999).
Other by-products such as organic acids and higher
alc oho ls are produced at much lower levels. The
production of these by-products as well as the growth
of yeast cells inevitably direct some glycolytic inter-
mediates to the corresponding metabolic pathways,
decreasing the ethanol yield to some extent. In the
industry, the ethanol yield that is calculated based on the
total sugar feeding into the fermentation system without
deduction of the residual sugar can be as high as 90–
93% of its theoretical value of ethanol to glucose
(Ingledew, 1999). Therefore, the residual sugar must be
controlled at a very low level. For example, no more
than 2 g l
−1
and 5 g l
−1
are controlled for the residual
reducing sugar and total sugar, respectively, in the
ethanol product ion from starch materials. Any ethanol
fermentation research which is expected to be practical
needs to bear these criteria.
During ethanol fermentations, yeast cells suffer from
various stresses. Some are environmental such as nu-
trient deficiency, high temperature and contamination,
while the others are from the yeast cell metabolism such
as ethanol accumulation and its corresponding inhibi-
tion on yeast cell grow th and ethanol production, es-
pecially under very high gravity (VHG) conditions that
will be discussed later. Fig. 3 summ arizes some of these
stresses. Many of them are synergistic, affecting yeast
cells more severely than any single one, leading to
reduced yeast viability and vigor as well as lower eth-
anol yield.
2.2. Zymomonas mobilis
Z. mobilis is an anaerobic, gram-negative bacterium
which produces ethanol from glucose via the Entner–
Doudoroff (ED) pathway in conjun ction with the en-
zymes pyruvate decarboxylase (PDC) and alcohol de-
hydrogenase (ADH) (Conway, 1992), as illustrated in
Fig. 4. This microorganism was originally discovered in
fermenting sugar-rich plant saps, e.g. in the traditional
pulque drink of Mexico, palm wines of tropical African,
or ripening honey (Swings and Deley, 1977).
Compared with the EMP pathway of S. cerevisiae,
which involves the cleavage of fructose-1, 6-bispho-
sphate by fructose bisphosphate aldolase to y ield one
molecule each of glyceraldehy des-3- phosphate and di-
hydroxyaceto ne pho sphate, the E D pathway forms
glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate by the
cleavage of 2-keto-3-deoxy -6-phosphogluconate by
2-keto-3-deo xy-gluconate aldolase, yielding only one
molecule ATP per glucose m olecule. As a conse-
quence, Z. mobilis pr oduces less biomass than S.
cerevisiae, and more car bon is funneled to the ethanol
fermentation. It was reporte d that the ethanol yield of
Z. mobilis could be as hig h as 97% of the theoretical
yield of ethanol to glucose (Sprenger, 1996), wh ile
only 90 – 9 3% can be achi eved for S. cerevi siae. Also,
as a con sequ ence of the lo w ATP yield, Z. mob ilis
maintains a higher glucose metabolic flux, and
correspondingly, guarantees its higher ethanol pro-
ductivity, normally 3– 5 folds higher than that of
S. cerevisiae (Sprenger, 1996).
Despite these advant ages, Z. mobilis is not suitable
for the industrial ethanol production. Firstly, this
species has a ve ry spec ific substrate spectrum includ-
ing only three sugars:
D-glucose, D-fructose, and
sucrose. Its growth on sucrose is accompanied by the
extracellular formation of fructose oligomers (levan)
and so rb itol, with a significant decrease in its ethanol
yield (Sp re nger, 1996) , making it u nsuitable for the
ethanol production from molasses. Since it can
effectively ferment only glucose in the hydrolysate of
starch m aterials, not other suga rs such as sucrose,
fructose and malto se form ed in the cooking and
saccharifying, it is also un suitable for the ethanol
pr oduction from sta rch materials. Th e etha nol fe rmen-
tation industry cannot use pure glucose as its raw
material like many re searchers did in their laboratory
studies. Secondly, although Z. mobilis is generally
regard ed as sa fe (GRAS) (Lin and Tanaka, 2006) , its
biomass is not commonly ac ceptable to be used as
animal feed, whic h inevitably generates the problem
for its biomass dispos al if it replaces S. cerevisiae in
Fig. 3. Potential environmental stresses on S. cerevisiae during ethanol
fermentation (Ingledew, 1999).
92 F.W. Bai et al. / Biotechnology Advances 26 (2008) 89–105
!
dificultado a aplicação de técnicas moleculares rotineiras para modificação genética
facilmente aplicáveis a linhagens laboratoriais. Assim, algumas adaptações nos
procedimentos correntes de modificação genética são necessárias quando se pretende
manipular linhagens industriais (Leite, 2008).
!
!
1.5 Transformação de uma linhagem industrial
Em 2005, uma linhagem industrial foi isolada por Silva-Filho et al. por
possuir alta dominância sobre as demais em uma população de leveduras proveniente
de uma usina produtora de bioetanol (Japungu) do nordeste brasileiro, a essa linhagem
foi dado o nome de JP1. Conforme descrito no trabalho, quando a JP1 dominava o
processo industrial, a eficiência de conversão de açúcar para etanol era de 92 %. Foi
observado que ela possui uma especificidade de substrato: é competitiva apenas em
indústrias que utilizam a cana-de-açúcar para a produção do bioetanol. A JP1
demonstrou ainda ser mais resistente aos estresses ambientais encontrados na
indústria alcooleira, além de ser de fácil manipulação genética, com eficiência de
transformação para plasmídios, tanto epissomais quanto integrativos, maior do que
qualquer outra linhagem comercial testada (Silva-Filho et al., 2005).
Como a JP1 é uma linhagem industrial, diversos fatores devem ser
considerados para que se tenha uma boa estratégia de transformação da mesma. Os
vetores de expressão para aplicações industriais, além de demonstrar eficiência em
transformação, devem se manter estáveis por muitas gerações sendo capazes de se
manter na célula sob cultivo não seletivo (Takahashi et al., 2003). Porém, para uso
nestas linhagens, os sistemas já descritos ainda apresentam algumas desvantagens
(Leite, 2008):
a) a marca de seleção é baseada principalmente em supressão de
auxotrofia ou marca de resistência a compostos químicos;
b) nem sempre a marca de seleção é excisável o que impossibilita a
reutilização do sistema para múltiplas modificações numa mesma
linhagem;
c) o alvo de integração nem sempre é multicópia, impossibilitando
também a reutilização do sistema;
d) os vetores ainda não são totalmente isentos de seqüência bacterianas.
Nas linhagens industriais de leveduras, as modificações introduzidas também
não devem alterar as características essenciais da célula hospedeira no processo de
fermentação, como por exemplo, desempenho fermentativo e velocidade de
crescimento (Schüller & Casal, 2005).
!
Para a construção de um vetor eficiente para S. cerevisiae, algumas
características devem ser consideradas. Dentre estas estão a marca de seleção e o alvo
de integração cromossômica, que visam garantir uma boa expressão do gene desejado.
1.5.1 Marca de Seleção
Diversas marcas de seleção são utilizadas para expressão heteróloga em S.
cerevisiae. Em linhagens de laboratório é comum a utilização de marcas baseadas na
complementação nutricional de mutantes auxotróficos (supressão de auxotrofia)
(Pronk, 2002), pois linhagens laboratoriais geralmente são haplóides, possuem uma
cópia de cada gene, o que possibilita uma construção relativamente fácil de linhagens
auxotróficas (Leite, 2008). Os genes marcadores utilizados para esse tipo de marca
seletiva são alelos tipo selvagem que codificam enzimas essenciais nas vias
metabólicas a eles relacionadas. O uso destes genes como marca de seleção é restrito
a linhagens hospedeiras que são auxotróficas para o nutriente em questão devido à
ausência de uma cópia cromossômica funcional do gene marcador (Pronk, 2002).
Quando o vetor portando a cópia funcional do gene é introduzido na célula, a levedura
torna-se capaz de propagar-se em meio de cultura sem o nutriente relacionado ao gene
marcador. As marcas auxotróficas mais utilizadas são LEU2, TRPI, URA3, HIS3 e
HIS4 aplicadas a linhagens auxotróficas que não são capazes de sintetizar leucina,
triptofano, uracil, histidina e histidina, respectivamente (Leite, 2008).
No entanto, como dito anteriormente, linhagens de destilarias são de difícil
manipulação, o que impossibilita ou inviabiliza a utilização destes tipos de seleção,
devido à dificuldade de construir linhagens industriais auxotróficas. Ademais, os
poucos transformantes obtidos por integração em cópia única em linhagens
provenientes de indústrias, são instáveis e perdem a informação heteróloga após
algumas gerações. (Shimura et al., 1993). Para contornar este problema usam-se, para
a transformação de linhagens industriais, marcas dominantes tais como as descritas na
Tabela 2.
!
!
Tabela 2: Marcas seletivas dominantes mais usadas na tecnologia de DNA
recombinante de S. cerevisiae (adaptado de Domingues, 2001)
Marca
Comentário
CUP1
Resistência ao cobre
G418
R
Resistência ao antibiótico G418
TUN
R
Resistência à Tunicamicina
KILk1
Imunidade à toxina killer
C230
Marcador cromogênico
SMR1
Resistência ao sulfometurão de metilo
SFA
Codifica para a desidrogenase de formato (as células podem
crescer em 6mM de formaldeído)
ARO4
Resistência ao OFP ou PFP
Higromicina
R
Metotrexato
R
Cloranfenicol
R
Resistência a drogas
Duoron
R
Zeocina
R
Canavanina
R
Marcas de resistência a antibióticos são dominantes e não requerem linhagens
com mutações auxotróficas (Gueiroz, 2006). Dentre essas marcas de seleção, os genes
mais utilizados são cyh2, ble, kan, natnt2 e hphnt1 que conferem resistência às drogas
cicloheximida, fleomicina, canamicina (G418), estreptomicina e higromicina B,
respectivamente (Schüller & Casal, 2005). Para a seleção de células modificadas com
vetores portando uma destas marcas, o antibiótico a ela relacionada é adicionado ao
meio de cultura. As células modificadas utilizando marcas de resistência a
antibióticos são, entretanto, indesejáveis na indústria por haver uma preocupação em
torno do evento da transferência gênica entre os microrganismos do ambiente
industrial, pelo efeito da presença do antibiótico sobre as funções celulares e devido
ao alto custo para aplicação de antibióticos no processo industrial (Leite, 2008).
Outra questão associada a marcas de seleção, seja ela supressora de auxotrofia
ou de resistência a compostos químicos, é a inviabilidade de sua reutilização numa
mesma linhagem em sucessivos eventos de transformação, tendo em vista, muitas
vezes, a impossibilidade de sua remoção (Walker et. al., 2005; Leite, 2008).
Mas esse problema pode ser sanado ou pela inserção da marca de seleção num
vetor epissomal, que pode ser perdido facilmente durante a divisão mitótica das
células das leveduras transformadas, ou pela excisão da marca de seleção quando
seqüências repetidas flanqueiam o gene marcador, como a seqüência loxP por
!
exemplo que, segundo Sauer (1994), tem se mostrado bastante eficiente na excisão de
marcas seletivas em leveduras.
1.5.2 Vetores de Expressão
Diversos vetores de transformação de leveduras foram desenvolvidos, com
características que variam de acordo com o tipo de replicação sendo descritos
brevemente a seguir na Tabela 3 (Nobrega, 2001).
Tabela 3: Tipos de vetores e seus mecanismos de ação (adaptado de Nobrega,
2001)
Tipo de
plasmídeo
Sigla
Como funcionam
Vantagens
Desvantagens
Plasmídios
Replicativos
YRP
Vetores
extracromossomais
contendo uma seqüência
de replicação autônoma
(ARS), que funciona
como origem de
replicação.
Vetores ARS estão
presentes em múltiplas
cópias por célula.
São mitoticamente muito
instáveis, cerca de 20 %
das células perdem seus
plasmídios a cada geração
quando crescidas na
ausência de pressão
seletiva.
Plasmídios
Epissômicos
YEp
Vetores que replicam
autonomamente por meio
de um segmento de
plasmídios natural de S.
cerevisiae 2µ.
São os mais comumente
utilizados em Biologia
Molecular, sendo
normalmente
bifuncionais. São
mantidos em
aproximadamente em
100 cópias por célula
(haplóide).
Sua estabilidade é um
pouco maior do que
vetores ARS, atingindo
cerca de 1 a 10 % de
instabilidade a cada
geração.
Plasmídios
Integrativos
YIp
A expressão a partir
destes vetores é baseada
na integração da
informação genética ao
cromossomo da levedura
hospedeira através da
recombinação homóloga.
A informação é muito
estável, havendo perda
de aproximadamente 0,1
% a cada geração, na
ausência da pressão
seletiva.
A freqüência de
transformação desses
vetores é muito baixa,
atingindo 1 a 10
transformantes /µg de
DNA.
Plasmídios
Centroméricos
YCp
Contêm uma seqüência
que permite a replicação
autônoma na levedura, e
seqüências
Possuem segregação
estável, mantendo-se na
célula.
Baixo número de cópias
por célula (1 a 2 cópias /
célula). A perda desse
plasmídio corresponde a
!
!
correspondentes às
regiões centroméricas
cromossômicas.
aproximadamente 1 % por
geração.
Plasmídios
Lineares
YLp
Contém seqüências
teloméricas e elementos
ARS para replicação
autônoma, mantendo-se
lineares dentro da célula.
São também chamados de
“cromossomos artificiais”
Apresentam boa
estabilidade
Baixa eficiência de
transformação.
Para assegurar altos níveis de expressão o vetor empregado para a introdução
de genes heterólogos deve combinar o adequado número de cópias do gene para a
expressão desejável e a estabilidade mitótica sob condições não seletivas. Geralmente,
os vetores não conseguem combinar essas duas características (Leite, 2008).
Para transformação em leveduras, plasmídios epissomais (YEp) satisfazem
ambos critérios em condições laboratoriais. Esse tipo de plasmídio está sendo
utilizado com sucesso em escala laboratorial com altos níveis de expressão para
vários tipos de genes heterólogos. No entanto, as condições específicas aplicadas na
fermentação industrial, como por exemplo, altas temperaturas e alta pressão seletiva,
tornam os vetores YEp pouco convenientes para a produção em larga escala (Lopes,
1988). Os problemas relatados com o uso de YEp podem ser contornados utilizando
vetores integrativos (YIp) que por integrarem a informação genética ao cromossomo
da levedura hospedeira através da recombinação homóloga asseguram maior
estabilidade do vetor durante a divisão mitótica. Mas, o número de cópias desse tipo
de vetor é menor do que aquele observado para YEp (Lopes, 1988). A fim de
combinar as propriedades favoráveis dos plasmídeos YEp e YIp e chegar a vetor ideal
para expressão heteróloga em células de leveduras industriais é necessário aumentar o
número de cópias do YIp por meio da inserção do mesmo em seqüências de DNA
presentes em múltiplas cópias no genoma da levedura (Lopes, 1988).
Existem duas seqüências presentes no genoma da S. cerevisiae em múltiplas
cópias com potencial para utilização na transformação de linhagens industriais, são
elas o rDNA e as sequências Tyδ.
!
1.5.3 Estratégias de Integração: rDNA X Tyδ
Para se obter a estabilidade mitótica e um número ótimo de cópias integradas
para um nível de expressão aceitável, Cho (1998) e Lopes (1989) usaram seqüências
de rDNA como alvo para integração.
O rDNA existe em aproximadamente 200 cópias no genoma da levedura e é
possível integrar genes heterólogos em uma ordem de mais ou menos 100 cópias
(Cho, 1998). Um trabalho desenvolvido por Lopes et al. (1989) mostrou a construção
de um vetor integrativo de múltiplas cópias (pMIRY2) que se integrava no rDNA
acima de 140 cópias e era capaz de se manter estável por um longo período de tempo
sob condições não seletivas. A introdução de genes homólogos e heterólogos nesse
vetor teve um nível de produção de proteínas similar àqueles observados para os
vetores YEp em um número comparável de cópias.
No entanto, Lopes observou que o rDNA varia de tamanho dependendo da
fase de crescimento da cultura e o número de cópias integradas do vetor pMIRY2 era
maior durante a fase exponencial de crescimento que durante as fases lag e
estacionária. Segundo a observação de Lopes, o tamanho estável para rDNA varia de
9 a 9,1 kb, caso a seqüência fosse maior ou menor do que isto ela se torna instável.
Além disso, a integrações no rDNA ocorrem primariamente em um arranjo em
tandem (Lee e Da-Silva, 1997), e repetições em tandem possuem uma alta
probabilidade de serem removidas pelo processo de recombinação. Assim, quando o
rDNA é submetido a uma pressão seletiva, como a encontrada no processo industrial,
ele se torna instável e as cópias são perdidas rapidamente a cada geração.
De acordo com Lee e Da-Silva (1997), o trabalho com esse tipo de inserção se
mostrou instável. Os métodos de recombinação homóloga não podiam ser regulados,
os marcadores auxotróficos eram rapidamente esgotados, e quando uma seleção por
antibiótico era empregada, apenas um round de transformação era possível.
A outra opção para a integração do vetor em múltiplas cópias é a utilização
das seqüências Tyδ. Os elementos Ty são uma família de retrotransposons que
representam aproximadamente 1-2 % do genoma da levedura (Parket & Kupiec,
1992). Dentro desta família encontra-se o retrotransposon Ty1 que têm repetições de
aproximadamente 30 cópias dentro do genoma da Saccharomyces cerevisiae e
constitui cerca de 0,04 % de seu DNA total. Esses elementos de 6 kb possuem uma
!
!
grande região central, épsilon, flanqueadas por repetições diretas de 334 pb chamados
elementos delta (δ) (Fink et al.,1985).
As sequências δ, por sua vez, por serem cicatrizes de locais onde o Ty1 se
integrou e depois se excisou, apresentam 425 cópias dentro do genoma da S.
cerevisiae, o que torna o método de integração em múltiplas cópias com a utilização
de seqüências Tyδ uma boa opção, pois ele permite que mais cópias de genes
heterólogos sejam integradas no cromossomo da levedura do que qualquer outro
sistema de integração convencional (Cho et al., 1999). Além disso, as integrações
utilizando o Tyδ provaram ser estáveis. De acordo com Lee e Da-Silva (1997), depois
da transformação e passadas 50 gerações não houve mudanças significantes na
estabilidade estrutural do vetor.
!
1.6 A linha de pesquisa “produção de etanol a partir de amido” do grupo de
Biotecnologia Molecular da UnB
Em 1986, Astolfi-Filho et al. introduziram o gene da α-amilase pancreática de
camundongo em uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae. Esta linhagem
apresentou altos níveis de atividade amilolítica, no entanto não era capaz de usar os
produtos de hidrólise. A seguir, essa linhagem foi cruzada com uma linhagem
produtora de maltase constitutivamente e com uma linhagem produtora de
glicoamilase de Saccharomyces diastaticus (Ribeiro-dos-Santos, 1988). A linhagem
resultante, chamada de 4D, foi capaz de produzir álcool a partir de amido com 94% de
eficiência. No entanto, foi incapaz de usar 22 % do amido total, devido à falta de
atividade desramificadora. Com o objetivo de melhorar esta linhagem, foi adicionado
o gene da pululanase de Klebsiella pneumoniae, mas nenhuma atividade foi detectada.
Uma nova estratégia foi montada por Moraes et al. (1995), onde oito linhagens
expressando o gene da α-amilase de Bacillus subtilis, ou o gene da α-amilase
pancreática de camundongo e o cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori,
isolados ou na forma de uma proteína de fusão, foram construídas. Os melhores
resultados foram obtidos com a combinação do gene da α-amilase de B. subtilis e o
cDNA da glicoamilase fúngica, tanto isoladas quanto na forma de fusão. A linhagem
expressando as duas enzimas separadamente foi capaz de degradar amilose e amido
de milho, esgotando totalmente o meio, e produzir etanol. Já a linhagem produtora da
proteína de fusão, foi capaz de crescer em amilose, mas não em amido de milho,
indicando uma deficiência. Análises feitas com a proteína de fusão (Moraes et al.,
1999) indicaram que todas as atividades amilolíticas, endo α1-4, exo α1-4 e exo α1-6,
estavam presentes na proteína de fusão, sugerindo que a deficiência da linhagem
produtora da fusão não estava na perda de uma das atividades, e sim, talvez na relação
da atividade de α-amilase e glicoamilase. Estudos de comparação entre as atividades
produzidas entre as duas linhagens indicaram um excesso de três vezes na atividade
de glicoamilase em relação à de α-amilase, na linhagem que produzia as enzimas
separadamente, quando comparadas com a linhagem que expressava a proteína de
fusão. Análises em fermentador da linhagem que produz as duas enzimas separadas
demonstram a sua capacidade de converter amido a etanol, com um aproveitamento
de 85,4 % do amido contido no meio de cultura (Fitzsimon et al., 2004).
!
!
A linhagem de S. cerevisiae utilizada na construção das linhagens descritas
acima não é a ideal para a produção de etanol em larga escala. Por isso, fez-se
necessário a construção de uma linhagem de S. cerevisiae que além de ser capaz de
degradar amido e produzir etanol com eficiência satisfatória, esteja preparada para
enfrentar o estresse ambiental encontrado em uma usina de etanol. Para a introdução
dos cassetes de expressão de genes amilolíticos desenvolvidos por Moraes et al.
(1995), este trabalho objetivou a construção de um vetor integrativo em múltiplas
cópias baseado na seqüência δ to retrotransposon Ty de S. cerevisiae a fim de utilizá-
lo na linhagem industrial JP1, de modo que fosse construída uma linhagem eficiente
na produção de etanol em escala industrial.
!
2. Objetivos
!
!
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo principal a construção de um vetor de
integração em múltiplas cópias para a transformação de leveduras industriais e
introdução dos cassetes de expressão dos genes amilolíticos para a produção de álcool
a partir de amido.
2.2 Objetivos Específicos
• Construção de um vetor de integração em múltiplas cópias baseados na
seqüência δ do transposon Ty1 de Saccharomyces serevisiae;
• Inserção dos cassetes de expressão da α-amilase e glicoamilase no vetor de
integração em múltiplas cópias;
• Construção de linhagens industriais com atividade amilolítica e com a
informação heteróloga estável.
!
3. Estratégia
!
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Teste de estabilidade mitótica dos clones com aividade amilolítica
Transformação da linhagem
industrial JP1 com os cassetes de
integração
!
Screening dos clones através de teste em placa contendo amido e coloração
com vapor de iodo
Avaliação da curva de crescimento dos clones com atividade amilolítica
Construção de um vetor integrativo em
múltiplas cópias para Saccharomyces
cerevisiae utilizando seqüências delta
Amplificação do elemento Tyδ de S. cerevisiae e clonagem dos mesmos no
vetor de clonagem pGEMT Easy
Construção do vetor integrativo pT pela subclonagem dos fragmentos Tyδ no
vetor pBlueScript KS+
Clonagem dos cassetes de expressão de α-amilase e glicoamilase no vetor pT
gerando os vetores PTA (contendo o cassete da α-amilase, pTGA (contendo
o cassete da glicoamilase) e pTAGA (contendo ambos os cassetes)
Liberação dos cassetes de integração com o uso da digestão dos vetores pTA,
pTGA e pTAGA com a enzima de restrição XhoI
Transformação da linhagem semi-
industrial MFL com os cassetes de
integração
!
4. Material
!
!
4.1 Microrganismos utilizados
4.1.1 Linhagens bacterianas
Escherichia coli linhagem DH5-α (GIBCO BRL) – endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17
supE44 relA1 ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) IU169 dcoR phoA.
Escherichia coli linhagem XL10 Gold (Stratagene) - Tetr Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-
hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F’ proAB lacIqZ
ΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr a
Escherichia coli linhagem TOP10 (Invitrogen) – F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL
(StrR) endA1 nupG.
4.1.2 Linhagens de leveduras
Saccharomyces cerevisiae linhagem MFL (semi-industrial)
É uma mutante auxotrófica para leucina obtida da ruptura do gene LEU2 da linhagem
industrial FTPT472 isolada de um fermentador industrial da Fundação Tropical de
Pesquisas Tecnológicas André Tosello (Campinas – São Paulo) (Fitzsimon et al.,
2004)
Saccharomyces cerevisiae linhagem JP1 (industrial)
É uma linhagem industrial que foi isolada em 2005 em uma usina produtora de
bioetanol no nordeste brasileiro (Silva-Filho et al., 2005).
4.2 Enzimas
Enzimas de restrição
As enzimas XhoI, SacI, KpnI, BglII, SalI, BamHI, XbaI e HindIII foram fornecidas
pela New England Biolabs, Promega, QBiogene e Fermentas Life Sciences e
utilizadas como indicado pelo fabricante.
!
Ligases
T4 DNA ligase – New England Biolabs Inc.
T4 DNA ligase – USB Corporation
T4 DNA ligase – kit pGEM
®
-T System I (Promega)
Fosfatases
Para as reações de defosforilação de vetores linearizados com apenas uma enzima
foram utilizadas as fosfatases alcalina de camarão (SAP – Boehringer Mannheim) e
Antartic da New England Biolabs. Ambas utilizadas conforme especificações do
fabricante.
RNAse A
RNAse A (“DNAse-free”) 10 mg/mL
Acetato de sódio 50 mM, pH 4,8
Fervida em banho-maria por 10 minutos
4.3 Marcadores de DNA (anexo 1)
100 pb DNA ladder (Promega)
DNA de fago λ digerido com EcoRI e HindIII
DNA de fago λ digerido com BstEII
4.4 Kits
QIAquick PCR purification kit (Qiagen) – utilizado para purificação dos produtos de
PCR.
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) – utilizado para purificação
dos produtos de PCR.
DyEnamic ET DYE Terminator Cycle Sequencing – utilizado no seqüenciamento.
!
!
4.5 Ferramentas de Bioinformática
Busca das seqüências: GenBank (Ncbi – National Center of Biotechnology
Information) - (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Cálculo do conteúdo de G+C: “Genomics %G~C Content Calculator” -
http://www.sciencebuddies.org/mentoring/project_ideas/Genom_GC_Calculator.shtl)
Análises de restrição: NEBcutter V2.0 -
(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)
Alinhamento: ClustalW - (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)
4.6 Vetores
Os mapas de todos os vetores utilizados encontram-se nos anexos (anexo 2-4)
pGEM
®
-T Easy (Promega) - Para a clonagem dos produtos de PCR foi utilizado
pGEM
®
-T Easy. Esse vetor de 3,0 kb possui o gene de resistência a ampicilina como
marca de seleção, a origem de replicação do fago f1, parte do gene lacZ que codifica
o fragmento amino-terminal da enzima β-galactosidase, diversos sítios de clonagem
na região codante do lacZ e as seqüências T7 e SP6 (para o anelamento dos
oligonucleotídeos universal e reverso) flanqueando a região de clonagem. A seleção
dos recombinantes é feita pela ausência da atividade da β-galactosidase na presença
de X-gal.
pBluescript II KS+ (Promega) - A construção dos vetores integrativos (pT) foi feita
utilizando o vetor comercial pBluescript II KS+ da Promega como base. O vetor
pBluescript II KS + tem aproximadamente 3,0 kb e possui o gene de resistência a
ampicilina (marca de seleção), a origem de replicação do fago f1 e parte do gene lacZ
da enzima β-galactosidase; ele possui ainda um sitio de múltiplas clonagens que foi
utilizado para a clonagem dos diversos fragmentos durante a construção do vetor pT.
!
YEP351-PGK (Moraes et al., 1995) - Para a seleção dos clones transformantes na
linhagem MFL de S. cerevisiae foi feita uma co-transformação dos vetores derivados
de pT (construídos nesse trabalho) com o vetor YEP351-PGK (Moraes et al., 1995),
que promove a produção de leucina (LEU2). O vetor possui a origem de replicação do
círculo 2 µm de S. cerevisiae, parte da seqüência do vetor PUC18, o gene funcional de
resistência à ampicilina (Amp
r
) como marca de seleção para transformações
bacterianas, o promotor PGK e um sítio de múltiplas clonagens.
PYC230 – Utilizado na co-transformação da linhagem JP1 a fim de promover a
seleção dos clones pois ele confere a resistência ao antibiótico G418 (Hansen et al.,
2003). O vetor PYC230 possui aproximadamente 6,2 kb, e alem do gene de
resistência ao G418, possui o gene de resistência à ampicilina para transformações
bacterianas, um sítio de múltiplas clonagens e a origem de replicação 2 µm.
4.7 Meios de cultura e soluções
Todos os meios de cultura e soluções utilizados para cultivo de
microrganismos foram esterilizados em autoclave a 120°C por 20 minutos ou, quando
indicado, em filtros 0,22 µm 25 mm estéril (Millipore).
4.7.1 Meios e soluções para cultivo de Escherichia coli
Meio Luria-Bertani (LB)
Peptona caseína
1,0 % (p/v)
Extrato de levedura
0,5 % (p/v)
NaCl
1,0 % (p/v)
O pH foi ajustado para 7,2.
Para o meio sólido foi adicionado 15 g/L de ágar bacteriológico.
!
!
Meio SOB
Bacto triptona
2,0 % (p/v)
Extrato de levedura
0,5 % (p/v)
NaCl
0,0584 % (p/v)
KCl
0,0186 % (p/v)
O pH foi ajustado para 7,2.
4.7.2 Meios e soluções para cultivo de Saccharomyces cerevisiae
Meio YPD
Extrato de levedura
2,0 % (p/v)
Peptona de caseína
4,0 % (p/v)
Glicose
4,0 % (p/v)
O extrato de levedura e a peptona (meio 2YP) foram autoclavados separadamente da
glicose. Depois misturados numa proporção de 1:1.
Para o meio sólido foi adicionado 15 g/L de ágar bacteriológico.
Meio YNB 1,34% (sem aminoácidos)
Yeast Nitrogen Base Without Amin acids (Difco)
3,4 % (p/v)
NH
4
SO
4
10 % (p/v)
* Esterilização por filtração (membrana 0,22
µ
m).
Meio mínimo para S. cerevisiae (MM)
Tampão fosfato
100 mM, pH 5,0
YNB
0,67 % (p/v)
Glicose
2,0 % (p/v)
Para o meio sólido foi adicionado 15 g/L de ágar bacteriológico.
Meio mínimo amido
No meio mínimo líquido e sólido foi adicionado amido solúvel a uma concentração
final de 0,5% (p/v). O amido foi solubilizado por aquecimento a 70 °C.
!
4.7.3 Soluções e tampões para técnicas de DNA recombinante
4.7.3.1 Extração de DNA plasmidial
Tampão TE
Trizma base (pH 8,0)
25 mM
EDTA
10 mM
Solução 2
NaOH
0,4 M
SDS
2,0 % (p/v)
Misturados antes do uso numa proporção de 1:1.
Solução 3
Acetato de potássio 5M
60 mL
Ácido acético glacial
11,5 mL
Água destilada
28,5 mL
Clorofane
Fenol hidratado (USB)
pH 8,0
Clorofórmio
Misturados numa proporção de 1:1.
Solução estoque de ampicilina
Ampicilina
10 mg
Água destilada (q. s. p.)
100 mL
*Esterilização por filtração (membrana 0,22
µ
m).
!
!
4.7.3.2 Análise de ácidos nucléicos em gel de agarose
Tampão Tris-Borato EDTA (TEB) 20X
Trizma base
1,78 M
Ácido bórico
1,78 M
EDTA
0,16 M
O pH foi ajustado para 8,4.
Tampão Tris-acetato EDTA (TAE) 1X
Trizma base
40 mM
EDTA
1 mM
O pH foi ajustado para 8,5 com ácido acético.
Tampão de amostra para DNA 5X
TEB 20X
50,00% (v/v)
Glicerol
30,00% (v/v)
Azul de Bromofenol
0,25% (p/v)
Xilenocianol
0,25% (p/v)
Solução de brometo de etídio
Brometo de etídio
1,0 % (p/v)
4.7.3.3 Extração de DNA de levedura
Tampão SE
Sorbitol
0,9 M
EDTA
100 mM
O pH foi ajustado para 7,5
Solução de liticase
Liticase (Sigma) 100 mg/mL em água.
!
Solução de Equilíbrio
Trizma base
100 mM
NaCl
100 mM
O pH foi ajustado para 8,5 com ácido clorídrico 2 M.
Solução TE
20
Trizma base
10 mM
EDTA
20 mM
O pH foi ajustado para 7,5 com ácido clorídrico 2 M.
4.7.3.4 Soluções e tampões para transformação de S. cerevisiae
a) Transformação rápida
Tampão TE 10X
Trizma base
100 mM
EDTA
10 mM
O pH foi ajustado para 7,5 com ácido clorídrico 2 M.
Tampão de transformação
PEG 4000
50,0% (p/v)
Acetato de lítio
2 M
DTT
1 M
Misturados no momento do uso numa proporção de 8:1:1 respectivamente
b) Transformação por eletroporação
Sorbitol 1M
Sorbitol
1 M
Mantido gelado a 4 °C
!
!
4.7.4 Soluções e tampões para ensaios de atividade enzimática (dosagem
amilolítica)
Tampão acetato de sódio 0,5M (pH 5,5)
Acetato de Sódio
41 g
Água destilada (q. s. p.)
1 L
O pH foi ajustado para 5,5 com ácido acético glacial.
Ácido acético 1M
Ácido acético glacial
2,9 mL
Água destilada (q. s. p.)
50 mL
Reagente Fuwa
I
2
1% (p/v) diluído em etanol 100%
KI
10% (p/v)
A solucao de uso é I2/KI/H2O
1:1:3
Amido solúvel 0,5%
Cerca de 0,5 g de amido foi pesado e dissolvido em 80 mL de água destilada com
aquecimento em bico de Bunsen e agitação continua até a solução ficar transparente.
O volume então foi completado para 100 mL e a solução foi armazenada a
temperatura ambiente.
!
5. Métodos
!
!
5.1 Extração do DNA total de levedura (adaptado de Burke et al., 2000)
A levedura Saccharomyces cerevisiae da linhagem JP1 foi crescida até a
saturação em 40 mL de meio YPD em um frasco de 250 mL. As células foram
coletadas por centrifugação a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente e
ressuspendidas em 3 mL de tampão SE. Em seguida foi adicionado 100 µL da solução
de liticase (100 mg/mL), sendo essa suspensão de células incubada a 37 °C. Após 60
min de incubação, a suspensão foi centrifugada a 3.000 x g durante 5 min e as células
ressuspendidas em 3 mL de TE
20
. A seguir foi adicionado 0,5 mL de SDS 10 %
sendo agitado por inversão do tubo e incubado a 65 °C durante 30 min. Ao final do
período de incubação foi adicionado 1,5 mL de acetato de potássio 5 M, e a suspensão
incubada no gelo por 30 min. A seguir a suspensão foi centrifugada a 10.000 x g a 4
°C por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com 5 mL de
etanol 70 % e centrifugado a 10.000 x g por 5 min. Após secar foi ressuspendido em
200 µL de TE acrescido de 4 µL de RNAse A a 10 mg/mL. O DNA foi quantificado
em gel de agarose 0,8 % e estocado a -4 °C.
5.2 Reação de cadeia de polimerase (PCR)
Os oligonucleotídeos TyEF (5’ GCGAGCTCTGAGATATATGTGAGTAAT
TAGATAATTG 3’), TyER (5’ GCGGATCCGAATTCGATATCCTGCAGACTAGT
TGTTGGAATAAAATCCACTATCGTCTATC 3’), TyDF (5’ GCGTCGACAAGTG
AGATATATGTGAGTAATTAGATAATTG 3’), TyDR (5’ GCGGTACCTGTTGG
AATAAAATCCACTATCG 3’) foram utilizados para amplificação dos fragmentos
TyD (assim convencionado por ocupar a porção direita do vetor pT - ver esquema na
Figura 6.7A) e TyE (que por sua vez ocupa a porção esquerda de pT - Figura 6.7A).
Os iniciadores foram ressuspendidos em água MiliQ. As reações de PCR contendo 20
ηg de DNA genômico de S. cerevisiae (JP1), 0,2 mM de dNTP, tampão da Taq DNA
polimerase, MgCl
2
(testado em três diferentes concentrações - 1mM, 2 mM e 3 mM),
1U de Taq DNA polimerase (CENBIOT), 10 ρmol de cada um dos iniciadores em um
volume final de 50 µL, foram realizadas na seguintes condições: desnaturação inicial
(94 °C / 5 min), desnaturação (94 °C / 1 min), anelamento (testada em três diferentes
!
temperaturas – 50 °C, 55 °C e 60 °C / 1 min), extensão (72 °C / 30 seg), extensão
final (72 °C / 5 min), por 30 ciclos de desnaturação / anelamento / extensão.
A purificação dos produtos de PCR foi realizada com o uso dos kits descritos
no item 4.4.
5.3 Análise dos ácidos nucléicos em gel de agarose
A eletroforese em gel de agarose foi utilizada para análise e avaliação do
tamanho dos fragmentos de DNA, conforme descrito por Azevedo et al. (2003). A
agarose foi preparada em tampão TAE 1X em concentração final de 0,8 ou 1 %.
5.4 Seqüenciamento e análise da seqüência do DNA
As reações de seqüenciamento foram realizadas no seqüenciador automático
MegaBACE 1000 (Molecular Dynamics). Era utilizado cerca de 100 ηg de DNA, 5
ρmoles dos primers apropriados e o kit “DyEnamic ET DYE Terminator Cycle
Sequencing”. Os DNAs utilizados no seqüenciamento eram quantificados por
espectrofotometria utilizando o GeneQuant RNA/DNA Calculator pro (Biochrom). A
qualidade das seqüências obtidas através do seqüenciamento automático era
analisada, utilizando as ferramentas de bioinformática: Phred, Phrap, CAP3
disponíveis na página: www.unb.br/ib/cel/biomol. Depois da análise de qualidade, as
seqüencias eram submetidas ao programa BLAST (Altschul et al., 1990), para análise
de identidade com seqüencias já depositadas no GenBank do Ncbi.
5.5 Ligação dos fragmentos de DNA
Nos sistemas de ligação, as concentrações de DNA (razão molar vetor : inserto)
variaram entre 1:3 e 1:5. O sistema foi incubado por pelo menos 14 h de acordo com a
ligase utilizada, a uma temperatura de 4 ºC. A quantidade de T4 DNA ligase para
cada sistema de ligação foi feita de acordo com as recomendações de cada fabricante.
5.6 Defosforilação dos vetores para ligações não direcionadas
Para sistemas de ligação de fragmentos de DNA não direcionados (apenas um
!
!
sítio de restrição) foi necessário defosforilar as extremidades do vetor linearizado. A
defosforilação foi realizada com até 150 ηg de vetor linearizado tratados com 1 U da
enzima fosfatase alcalina de camarão (SAP – Boehringer Mannheim) a 37 °C por 10
minutos, seguidos de incubação a 65 °C por 15 min para inativar sua atividade; ou
com 1 U da enzima fosfatase Antártica (New England – Biolabs).
5.7 Transformação de bactéria
O preparo de células de E. coli competentes pelo método de choque térmico foi
realizado como descrito por Sambrook et al., 2001 (com modificações). As células da
linhagem de E. coli foram inoculadas em 10 mL de meio SOB e incubadas a 37 ºC
durante a noite sob agitação a 250 rpm. Em seguida 1mL do pré-inóculo foi
adicionado a 100 mL de meio SOB pré-aquecido a uma temperatura de 37 °C, sendo a
cultura de células novamente incubada a 37 ºC sob agitação (250 rpm) até atingir uma
OD
600
de 0.45 a 0.55. As células foram então coletadas por centrifugação a 3.000 x g
durante 10 min a 4º C. As células foram ressuspendidas em 10 mL de RbCl
2
a 100
mM e submetidas a uma nova centrifugação nas mesmas condições anteriores e
novamente ressuspendidas em 10 mL de RbCl
2
a 10 mM e 15 % de glicerol.
Alíquotas de 50 ou 100 µL foram preparadas e estocadas a –80 ºC.
Para transformação, o sistema de ligação foi adicionado a uma alíquota de
células competentes (até 10% do volume de células) adicionado e incubados no gelo
por 30 minutos. O sistema de transformação foi submetido ao choque térmico de 42
ºC durante 90 seg. Em seguida foi adicionado 1 mL de meio LB e as células foram
incubadas por 1 hora a 37ºC. Um volume de 50 a 200 µL de células foi semeado em
placas de Petri com meio LB-Ágar mais ampicilina (100 µg/mL), e 2 % de X-gal e 10
mM de IPTG quando necessário.
5.8 Preparação de DNA plasmidial em pequena escala (mini-prep) (adaptado de
Sambrook et al., 2001)
Uma colônia de bactéria foi inoculada em 5 mL de meio LB contendo o
antibiótico adequado (100 µg/mL de ampicilina) e cultivada a 37 ºC por 16 horas.
Estas células foram coletadas através de centrifugação a 12000 x g por 2 min a 4 ºC,
!
descartando-se o sobrenadante. O sedimento foi ressuspenso em 200 µL de solução I,
e em seguida adicionou-se 360 µL de solução II recém preparada. A amostra foi
homogeneizada, com cuidado, por inversão rápida do tubo. Após incubação por 5
minutos à temperatura ambiente, foram adicionados 300 µL de solução III gelada ao
lisado, procedendo-se nova homogeneização por inversão do tubo. A amostra foi
então incubada no gelo por 5 min e centrifugada a 12000 x g por 5 minutos a 4 °C. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo contendo 750 µL de isopropanol. A
solução foi homogeneizada por inversão e submetida a uma nova centrifugação a
12000 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso
em 200 µL de solução TE. Foi adicionado 100 µL de clorofane. Após forte agitação
por 1 min, o sistema foi centrifugado a 6000 g por 3 min. A fase aquosa foi
recuperada em um tubo limpo, onde foi adicionado 750 µL de etanol 100 % gelado e
0,3 M de acetato de sódio e incubado no gelo por 30 min. A mistura foi centrifugada a
12000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente. O precipitado foi lavado (sem
ressuspender) com 1 mL de etanol 70 % gelado. Após secagem por exposição ao ar, o
precipitado foi ressuspenso em 50 µL de TE com RNAse A a uma concentração de
0,1 µg/mL. O DNA plasmidial foi estocado a -20 °C até o uso.
5.9 Preparação de DNA plasmidial em média escala (midi-prep) (adaptado de
Sambrook et al., 2001)
O procedimento foi o mesmo do descrito para a preparação de plasmídios em
pequena escala. Apenas os volumes das soluções utilizadas foram ajustadas ao
volume de cultura de 50 mL. A análise e a estocagem do material, também seguiram
os procedimentos da mini-preparação.
5.10 Digestão de DNA com enzimas de restrição
As digestões foram realizadas conforme instruções dos fabricantes das enzimas
de restrição. O tempo de incubação, os tampões, as temperaturas de reação, as
concentrações de DNA e enzima variavam de acordo com o material a ser digerido e a
eficácia da enzima. Geralmente foram utilizadas 10 U de enzima para cada 5 µg de
DNA, incubados a 37 ˚C por 3 h. Teve-se o cuidado de se observar se o volume da
!
!
enzima não ultrapassava 10 % do volume final da reação, com a finalidade de evitar a
degradação inespecífica do DNA pela enzima, causada pelo excesso de glicerol.
5.11 Precipitação de DNA
Para precipitação do DNA foi adicionado 0,3 M de NaCl no sistema. Após
homogeneização, foi adicionado o equivalente a 2,5 x o volume do sistema de etanol
100 %. A mistura foi incubada a 4 °C durante a noite. Realizou-se então uma
centrifugação a 12000 x g por 30 min a 4 °C. O precipitado foi lavado (sem
ressuspender) com 1 mL de etanol a uma concentração de 70 % gelado e novamente
centrifugado a 4 °C por 30 min. Após secagem por exposição ao ar, o precipitado foi
ressuspenso em 20 µL de H
2
O.
5.12 Purificação e eluição de fragmentos de DNA em gel de agarose
Após digestão dos plasmídios com as enzimas de restrição apropriadas, os
fragmentos de DNA contendo as seqüências de interesse foram aplicados em gel de
agarose e submetidos à eletroforese. Os fragmentos de DNA de interesse foram
recortados do gel, pesados e purificados utilizando-se o kit QIAquick Gel Extraction,
conforme as especificações do fabricante.
5.13 Transformação rápida de levedura em fase estacionária
A introdução de plasmídios em leveduras foi realizada utilizando o protocolo
descrito por Chen et al. (1992). As células da levedura S. cerevisiae foram crescidas a
30 ºC sob a agitação de 240 rpm. Após atingir a fase estacionária, aproximadamente
18 horas de crescimento, 200 µL da cultura de células foram coletadas e centrifugados
a 10.000 x g durante 10 segundos. O sedimento foi ressuspendido em tampão de
transformação ao qual foram adicionados de 50 a 100 ng de DNA plasmidial para um
volume final de 100 µL. As células foram incubadas a 45 ºC durante 1 h e lavadas
com 1 mL de sorbitol a 1 M. A suspensão de células foi centrifugada a 10.000 x g por
1 min, retirou-se 700 µL da fase líquida e o restante das células foi homogeneizado e
semeado em MM (100 µL da suspensão de células por placa de Petri pequena). As
!
placas foram incubadas na estufa a 30 ºC durante no mínimo 48 h.
5.14 Teste de tolerância ao antibiótico
A concentração do antibiótico G418 nas placas contendo meio YPD para
seleção dos clones recombinantes foi determinada por um teste de tolerância ao
antibiótico, neste teste a linhagem JP1 em diferentes concentrações celulares (10
3
,
10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
) foi submetida a diferentes concentrações do antibiótico (50
µg/mL, 100 µg/mL e 150 µg/mL). A determinação das concentrações celulares foi
feita por meio de contagem das células em microscópio óptico.
5.15 Transformação de Saccharomyces cerevisiae por eletroporação
! Uma colônia de S. cerevisiae (JP1 ou MFL) foi pré-inoculada em 5 mL de YPD
e crescida durante a noite. Retirou-se 1 mL do pré-inóculo para inocular 100 mL de
meio YPD, que foi crescido durante aproximadamente 16 h até que atingisse uma
OD
600
de 1,3 a 1,5. as células foram então centrifugadas a 1500 x g durante 5 min a
uma temperatura de 4 ºC e ressuspensas em 100 mL de água estéril gelada. Foram
feitas mais uma lavagem com 100 mL de água gelada estéril e outra com 50 mL para
retirar todos os resíduos de meio. Após uma nova centrifugação, a células foram
ressuspensas em 10 mL de sorbitol 1 M estéril gelado. As células foram novamente
centrifugadas e ressuspensas dessa vez em 250-500 µL de sorbitol 1 M para um
volume final de aproximadamente 800 µL de células competentes. Retirou-se então
200 µL de suspensão de células para cada sistema de transformação que foram
misturadas com 1 a 5 ηg do DNA linearizado (este, por sua vez, dissolvido em 5 a 10
µL de água acrescido do RNA carreador) e transferidas para uma cubeta de
eletroporação de 0,2 cm. O sistema foi incubado no gelo por 5 min. A seguir
adicionou-se 320 µL de sorbitol 1 M gelado e realizou-se a eletroporação com os
seguintes parâmetros: 1500 V, 25 µF e 400 Ω. Imediatamente após a eletroporação foi
adicionado 680 µL de sorbitol gelado estéril à cubeta e o seu conteúdo foi recuperado
e transferido para um tubo estéril. O tubo foi então centrifugado a 10.000 x g a
temperatura ambiente durante 10 segundos, retirou-se 700 µL da solução e foi feita a
ressuspensão das células na solução restante. Essa suspensão foi plaqueada em 3
placas de meio seletivo com 100 µL de suspensão de células por placa . As placas
!
!
foram incubadas em estufa a 30 ºC até que as colônias aparecessem
(aproximadamente 48 h).
5.16 Seleção de clones recombinantes
A seleção de colônias transformantes em MFL foi feita em meio mínimo
(YNB) contendo glicose e tamponado com solução de fosfato (pH 6,0). Para a
linhagem JP1, a seleção dos transformantes foi realizada em meio YPD acrescido com
o antibiótico G418 numa concentração de 100 µg/mL.
As colônias que cresciam nos meios seletivos eram transferidas para placas
contendo amido 0,5 % para detecção de atividade amilolítica em placa. As placas
foram incubadas na estufa a 30 ºC durante no mínimo 48 horas. As placas foram
invertidas e coradas com vapor de iodo e os possíveis clones positivos foram
selecionados de acordo com a formação do halo de hidrólise não corado. Como
controle negativo da expressão enzimática, células de S. cerevisiae foram
transformadas com o vetor pT (vetor integrativo sem os cassetes de expressão de
amilases).
5.17 Determinação da atividade amilolítica
A atividade amilolítica foi determinada por meio de um método que utiliza
amido como substrato. Este método é denominado de atividade dextrinizante e baseia-
se na variação da intensidade da cor do complexo iodo-amido (Fuwa, 1954). Nele, as
células de S. cerevisiae crescidas em YPD eram centrifugadas e o sobrenadante era
separado. Aproximadamente 60 µL desse sobrenadante era adicionado a 40 µL de
tampão acetato 0,5 M, pH 6,0 e 100 µL de amido solúvel 0,5 % em tubo de ensaio
que era, em seguida, incubados a 42 ºC durante 30 min. Ao final dos 30 min,
adicionou-se 200 µL de ácido acético 1 M, 9,4 mL (ou 5,4 mL) de água e 200 µL de
solução de “iodo Fuwa”. O tubo de ensaio foi agitado vigorosamente e a absorbância
foi lida a 660 nm.
!
5.18 Análise de crescimento celular
Clones transformantes de S. cerevisiae foram pré-inoculados em 10 mL de meio
YPD e incubado a 30°C em incubadora sob agitação constante de 240 rpm durante 24
h. Desse pré-inóculo foi feito um inóculo em 50 mL de meio YPD ou MM em
erlemeyers de 300 mL de modo que a OD
600
inicial fosse de 0,3 (fase lag).
Essa cultura foi incubada a 30 °C em incubadora sob agitação constante de 240
rpm até que atingissem a fase estacionária. Em intervalos de 2 horas a partir do
momento do inóculo (cultura em fase lag), 2 mL de cada cultura foram retirados para
análise do perfil de degradação do amido com o uso do método de Fuwa (1954) e
crescimento celular pela leitura através da OD
600
.
5.19 Teste de estabilidade mitótica
Para o teste de estabilidade mitótica, 1 colônia de cada clone positivo foi
inoculada em 5 mL de meio YPD e deixada sob agitação de 240 rpm a uma
temperatura de 30 °C durante a noite. Foi retirado 1 mL da cultura para inocular 10
mL de meio YPD que foi deixado nas mesmas condições do inóculo anterior durante
a noite. Mais uma vez, retirou-se 1 mL da nova cultura que foi inoculado em mais 10
mL de meio YPD que foi deixada durante a noite a 30 °C sob agitação de 240 rpm.
As células resultantes desse último inóculo foram inoculadas em meio YPD agar
numa concentração de aproximadamente 10
8
células, as placas foram incubadas em
estufa a 30 °C durante 48 h. As colônias crescidas foram transferidas para placas com
MM com amido 0,5 % acrescido de leucina a uma concentração de 100 µg/mL e para
um espelho de MM com amido para a linhagem MFL; e em YPD acrescido de G418 a
uma concentração de 100 µg/mL e um espelho em MM com amido para a linhagem
JP1.
!
!
!
6. Resultados
!
A maioria dos vetores de expressão heteróloga utilizados para leveduras
contém seqüencias bacterianas que causam problemas quando da utilização comercial
das linhagens transformantes. Uma estratégia para evitar a disseminação dessas
seqüências contendo genes de resistência a antibióticos é a eliminação das mesmas
dos vetores, flanqueando os cassetes de expressão com fragmentos de DNA de
levedura. O vetor bacteriano seria usado somente para amplificação.
As seqüências Tyδ estão presentes no genoma da levedura Saccharomyces
cerevisiae em alto número de cópias, cerca de 400 cópias por genoma haplóide. Neste
trabalho decidiu-se usar estas seqüências como alvo de integração em múltiplas
cópias. Para tanto foi construído um vetor base, denominado de pT (Figura 4), onde
os cassetes de expressão clonados, tanto para α-amilase de Bacillus subtilis quanto
para a glicoamilase de Aspergillus awamori, estariam flanqueados pelas seqüências
Tyδ. Os plasmídios então seriam linearizados com uma enzima interna das seqüências
delta e estes fragmentos, que não conteriam nenhuma seqüência bacteriana, seriam
usados para a transformação de linhagens de S. cerevisiae.
!
!
!
!
!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!+
+
!!!!!!!!!!!
Ligação do fragmento
TyE no vetor pBlueScript
KS+ nos sítios de
SacI e BamHI
Ligação do fragmento TyD
no vetor pTm nos sítios de
SalI e KpnI
Digestão do vetor pBlueScript KS+
com SacI e BamHI
Digestão do vetor pTm com SalI e
KpnI
!
Figura 4: Esquema descrevendo a construção do vetor pT.
6.1 Desenho dos iniciadores para amplificação das seqüências Tyδ
Para o desenho dos iniciadores que seriam utilizados na amplificação das
seqüências Tyδ de Saccharomyces cerevisiae, foi feita previamente uma análise
detalhada das seqüências de todos os elementos que iriam compor os vetores finais
(Ty δ, promotores PGK e ADHI, gene da α-amilase de Bacillus subtilis e cDNA da
glicoamilase de Aspergillus awamori. Essa análise fez-se necessária para que a
estratégia de montagem dos vetores fosse traçada.
O resultado dessa estratégia foi o desenho de iniciadores que continham não
somente a seqüência para amplificação do Tyδ, mas as seqüências dos sítios de
clivagem de diversas enzimas de restrição (múltiplo sítio de clonagem), que
facilitariam as clonagens posteriores. Dois pares de iniciadores foram desenhados e
estão representadas na Figura 5.
Figura 5: Seqüências dos iniciadores para amplificação das seqüências delta TyE
e TyD.
TYE
Universal
SacI
5’ GCGAGCTCTGAGATATATGTGAGTAATTAGATAATTG 3’
Reverso
BamH EcoRI EcoRV PstI SpeI
5’ GCGGATCCGAATTCGATATCCTGCAGACTAGTTGTTGGAATAAA
ATCCACTATCGTCTATC 3’
TYD
Universal
SalI HindIII
5’ GCGTCGACAAGCTTGAGATATATGTGAGTAATTAGATAATTG 3’
Reverso
KpnI
5’ GCGGTACCTGTTGGAATAAAATCCACTATCG 3’
!
!
!
6.2 Amplificação dos fragmentos TyD e TyE por PCR
Os pares de iniciadores (universal e reverso) e o DNA cromossomal da
linhagem JP1 de Saccharomyces cerevisiae foram utilizados para a amplificação por
PCR dos fragmentos TyD e TyE que iriam flanquear o vetor pT. A análise em gel de
agarose, mostrou uma banda de aproximadamente 300 pb tanto para TyD (Figura 6A)
quanto para TyE (Figura 6B), correspondente ao tamanho da porção δ do transposon
Ty1 de S. cerevisiae (Figura 6C). A figura 6, mostra as melhores condições de
amplificação dos fragmentos TyD e TyE com a utilização dos iniciadores desenhados,
para ambos os pares de iniciadores, a melhor amplificação foi obtida utilizando
concentrações de 3 mM de MgCl
2
a 50°C.
!
Seqüência do elemento Tyδ de Saccharomyces cerevisiae
TGAGATATATGTGAGTAATTAGATAATTGTTGGGATTTCATTGCTGATAAA
GGCTATAATATTAGGTATACGAATATACTAGAAGTTCTCCTCGAGGATAT
AGGAATCCTCAAAATGGAATCTATATTTCTACATACTAATATTACGATTAT
TCCTCATTCCGTTTTATATGTTTATATTCATTGATCTATTACATTATCAATC
CTTGCGTTTCAGCTTCCTCTAACATCGATGACAGCTTCTCATAACTTATGT
CATCATCTTAACACCGTATATGATAATATATTGATAATATAACTATTAGTT
GATAGACGATAGTGGATTTTTATTCCAACA
Tamanho : 336 pb
Fonte: Ncbi
A: sítio de XhoI
!
A 50°C 55°C 60°C Temperatura
1mM 2mM 3mM 1mM 2mM 3mM M 1mM 2mM 3mM [Mg]
TyD
B 50°C 55°C 60°C Temperatura
1mM 2mM 3mM 1mM 2mM 3mM M 1mM 2mM 3mM [Mg]
TyE
Figura 6: Amplificação dos fragmentos TyD e TyE - análise eletroforética em gel
de agarose 1% dos produtos de PCR utilizando os pares de iniciadores TYDF, TYDR
(A) e TYEF e TYER(B). M – marcador 100 pb ladder da Invitrogen (Anexo 1). Em
100pb
600pb
300pb
100pb
600pb
300pb!
C!
!
!
C, a seqüência da região δ do transposon Ty de S. cerevisiae de acordo com os dados
do Ncbi (National Center for Biotechnology Information).
Foi feito o seqüenciamento dos fragmentos TyD e TyE e o alinhamento com a
seqüência do Tyδ contida nos bancos de dados do Ncbi (National Center for
Biotechnology Information). A identidade das seqüências foi de 100% (Figura 7).
TYD CGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGA 60
SGD ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
TYD AGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGC 120
SGD ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
TYD AAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGC 180
SGD ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
TYD CAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGG 240
SGD -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TT 240
TYD CCGCCATGGCCGCGGGATTGCGTCGACAAGCTTTGAGATATATGTGAGTAATTAGATAAT 300
SGD TTTTTTTCTGTGAATGTACGTATAT------------- TTTTGAGATATATGTGGGTAATTAGATAAT 300
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
TYD TGTTGGGATTCCATTGTTGATAAAGGCTATAATATTAGGTATACAGAATATACTAGAAGT 360
SGD TGTTGGGATTCCATTGTTGATAAAGGCTATAATATTAGGTATACAGAATATACTAGAAGT 360
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
TYD TCTCCTCGAGGATATAGGAATCCTCAAAATGGAATCTATATTTCTACATACTAATATTAC 420
SGD TCTCCTCGAGGATATAGGAATCCTCAAAATGGAATCTATATTTCTACATACTAATATTAC 420
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
TYD GATTATTCCTCATTCCGTTTTATATGTTTATATTCATTGATCCTATTACATTATCAATCC 480
!
SGD GATTATTCCTCATTCCGTTTTATATGTTTATATTCATTGATCCTATTACATTATCAATCC 480
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
TYD TTGCGTTTCAGCTTCCTCTAACATCGATGACAGCTTCTCATAACTTATGTCATCATCTTA 540
SGD TTGCGTTTCAGCTTCCTCTAACATCGATGACAGCTTCTCATAACTTATGTCATCATCTTA 540
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
TYD ACACCGTATATGATAATATATTGATAATATAACTATTAGTTGATAGACGATAGTGGATTT 600
SGD ACACCGTATATGATAATATATTGATAATATAACTATTAGTTGATAGACGATAGTGGATTT 600
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
TYD TTATTCCAACAGGTACCGCAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGA 660
SGD TTATTCCAACA-----TACC-------ACCCATAATGTAATAG ----------------------------------------------------
* * * * * * * * * * * * * * *
TYD GCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAG ------------------------------------------720
SGD --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 720
Figura 7: Alinhamento da seqüência do TyD amplificado por PCR com a
seqüência de Tyδ do banco de dados do Ncbi – a identidade das bases entre as duas
seqüências foi de 100%; as regiões destacadas em amarelo são os sítios de clivagem
inseridos nos desenhos dos iniciadores, os asteriscos representam as bases idênticas
entre as duas seqüências.
6.3 Construção do vetor pTm
O produto de ambas as amplificações por PCR (TyD e TyE) foi ligado no
vetor de clonagem pGEM-T
®
Easy da Promega (separadamente). Após transformação
bacteriana, os clones transformantes foram submetidos a procedimentos para extração
de DNA plasmidial que foi caracterizado através de digestão com enzimas de
restrição apropriadas (Figura 8).
!
!
Figura 8: Digestão do vetor pGEMT-TyD e pGEMT-TyE com a enzima de
restrição XhoI - Análise eletroforética em gel de agarose 0,8 % - no poço 1 a
digestão do vetor pGEMT-TyD, em 2 o vetor intacto, no poço 3 a digestão do vetor
pGEMT-TyE e em 4 o vetor intacto. M - marcador DNA do fago λ digerido com as
enzimas EcoRI e HindIII
O vetor pBlueScript II KS+ foi escolhido como base para as construções para
montagem do vetor pT. Este vetor apresenta um amplo repertório de sítios de
clonagem que facilitaram as etapas a seguir.
Para obtenção dos fragmentos que seriam subclonados no vetor pBlueScript
KS+, o vetor resultante da ligação pGEMT-TyD foi digerido com a enzima de
restrição KpnI; o produto da digestão foi precipitado e digerido com a enzima SalI. O
vetor pGEMT-TyE foi duplamente digerido com as enzimas SacI e BamHI. Os
fragmentos de mais ou menos 300 pb resultantes das digestões foram extraídos do gel
e purificados.
O vetor pBlueScript II KS+ foi linearizado com as enzimas SacI e BamHI, e
após purificação foi ligado ao fragmento TyE, gerando o vetor que foi denominado
pb M 1 2 3 4
21.226
6!
3.530
2.027
564
≅ 3.350 pb
!
pTm. Posteriormente aos procedimentos de transformação em E. coli e extração de
DNA plasmidial foram realizadas análises de restrição que comprovaram a presença
do inserto no vetor e a integridade do mesmo (Figura 9).
A
1 2 3 intac. 4 5 6 M 7 8 intac. 9 10
B
11 12 13 intac. 14 15 16 M 17 18 intac. 19 20
Figura 9: Análise de restrição de pTm com a enzima XhoI. (A) Mapa esquemático
do vetor pTm; (B) Análise eletroforética em gel de agarose 1% dos clones 1 a 20
digeridos com a enzima XhoI, M - Marcador 100 pb ladder da Invitrogen.
Os clones que apresentassem o inserto deveriam liberar uma banda de
aproximadamente 300 pb na digestão com a enzima XhoI, pois havia um sítio de
300pb!
300pb!
100pb
100pb!
700pb
700pb
!
!
restrição da enzima dentro da seqüência do TyD e outro no próprio pBlueScript II
KS+ (Figura 9A). Vários clones foram obtidos com esse perfil, um deles foi escolhido
aleatoriamente para os próximos passos da construção do vetor pT.
6.4 Construção do vetor pT
O vetor pTm foi linearizado com as enzimas de restrição KpnI e SalI e ligado
ao fragmento TyD (resultante da digestão do pGEMT-TyD com as mesmas enzimas).
O vetor resultante dessa ligação foi denominado pT, células bacterianas foram
transformadas com o sistema de ligação e foi realizada a extração plasmidial de
alguns clones. A confirmação da integridade do vetor foi realizada com o uso da
técnica de PCR na qual foi utilizado os iniciadores universal e reverso do vetor
pBlueScript II KS+ e o DNA plasmidial dos clones transformantes (Figura 10). Esta
técnica foi utilizada porque a análise de restrição foi dificultada devido ao fato de que
o tamanho dos fragmentos gerados pela digestão por diversas enzimas não seriam
confirmatórios quanto à presença ou não da segunda cópia da seqüência delta
(fragmento TyD).
!
700 pb
400 pb
A
B
Figura 10: Confirmação da integridade do vetor pT – (A) Desenho esquemático
do vetor pT. (B) Análise em gel de agarose 0,8 % dos produtos do PCR utilizando os
iniciadores universal e reverso do vetor pBlueScript II KS + e o DNA plasmidial dos
clones transformantes. M - marcador DNA do fago λ digerido com as enzimas EcoRI
e HindIII. Em destaque os clones positivos que apresentavam uma banda de
400 pb
700 pb
pb 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11
!
12 13 14 15 16 M 17 18 19 20 C+ C-!
564
564
831
831
21.226
21.226
!
!
aproximadamente 700 pb, indicando a presença das duas cópias da seqüência delta
(aproximadamente 400 pb do vetor mais TyE + aproximadamente 300 pb do TyD).
6.5 Inserção dos cassetes da α-amilase e glicoamilase no vetor pT
A estratégia de construção dos vetores contendo os cassetes de expressão da α-
amilase de Bacillus subtilis e da glicoamilase de Aspergillus awamori estão
apresentadas nas Figuras 11, 12 e 13.
!
!!!!!!!!!!!!+
Figura 11: Esquema descrevendo a construção do vetor pTA, contendo o cassete
de expressão da α-amilase de Bacillus subtilis.
Digestão com BamHI
e isolamento do
cassete de expressão
da α-amilase
pT digerido com
BamHI
Ligação no sítio de
BamHI
!
!
!!!!!!!+
Figura 12: Esquema descrevendo a construção do vetor pTGA, contendo o
cassete de expressão da glicoamilase de Aspergillus awamori.
Digestão com HindIII
e isolamento do
cassete de expressão
da glicoamilase
pT digerido com
HindIII
Ligação no sítio de
HindIII
!
Tratamento com
MspI metilase
!!!!!!!!+
Figura 13: Estratégia de construção do vetor pTAGA.
Digestão com
BamHI
Ligação no sítio de
BamHI
!
!
O cassete de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis contendo o promotor
ADH1 foi clivado do vetor pAA3 (Moraes et al., 1995) utilizando a enzima de
restrição BamHI, e ligado ao vetor pT linearizado com o a mesma enzima e
defosforilado. A seguir foi feita a transformação de células de E. coli, extração de
DNA plasmidial e análise de restrição. A digestão com a enzima HindIII, confirmou
não só a presença do inserto quanto a orientação do mesmo dentro do vetor pT
(Figura 14). O vetor pT ligado ao cassete de α-amilase recebeu o nome de pTA.
A
B I II
Figura 14: Digestão do vetor pTA com a enzima HindIII – (A) Os clones 1 a 10
foram digeridos com a enzima HindIII. M – marcador DNA do fago λ digerido com
as enzimas EcoRI e HindIII. i – intacto (B) As duas orientações possíveis para a
ligação não direcionada do cassete de expressão da α-amilase no vetor pT. O clone 8
apresentou as três bandas correspondentes à orientação representada em BI (≅ 2.300
pb; ≅ 1.530 pb; ≅ 4.000 pb).
!
Para a ligação do cassete de expressão da glicoamilase de Aspergillus
awamori sob o controle do promotor PGK1 foi utilizado o vetor pG5 (Moraes et al.,
1995). O vetor pG5 foi digerido com a enzima HindIII e o fragmento de 3,5 kb
resultante foi clonado no vetor pT digerido com a mesma enzima e defosforilado para
evitar a religação do vetor. Foram realizados os procedimentos de ligação,
transformação bacteriana e extração de plasmídios. A confirmação da clonagem e a
determinação da orientação foi realizada em uma única etapa com a utilização da
enzima de restrição BamHI (Figura 15). O vetor pT com o cassete da glicoamilase foi
denominado pTGA.
A
B I II
Figura 15: Digestão do vetor pTGA com a enzima BamHI – (A) Os clones 1 a 10
foram digeridos com a enzima BamHI. M – marcador DNA do fago λ digerido com as
enzimas EcoRI e HindIII. i - intacto (B) As duas orientações possíveis para a ligação
não direcionada do cassete de expressão da glicoamilase no vetor pT. O clone 8
apresentou as duas bandas correspondentes à direção representada em BII (≅ 900 pb e
≅ 6.750 pb).
!
!
Uma terceira construção foi realizada para que fosse obtido um vetor que
contivesse ambos os cassetes de expressão da α-amilase e glicoamilase (Figura 6.10).
Para tanto foi decidido clonar o cassete de expressão da α-amilase no sítio de restrição
para a enzima BamHI, no vetor pTGA, que já continha o cassete da glicoamilase. No
entanto, o cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori contém um sítio de BamHI
próximo a extremidade 3’, dentro da região codante. Para permitir a clonagem do
fragmento contendo o cassete de expressão da α-amilase, o vetor pTGA foi
previamente tratado com a enzima MspI metilase, que bloquearia o sítio de BamHI do
cDNA da glicoamilase com a inserção de um grupo metil sobre a seqüência
reconhecida pela enzima MspI que se sobrepunha a seqüência reconhecida pela
enzima BamHI. Assim, o vetor pôde ser linearizado com BamHI (Figura 16).
!
A B
sítio de metilação da enzima
MspI metilase (Biolabs)
sítio de clivagem da enzima
BamHI
C
Figura 16: Tratamento do vetor pTGA com a enzima MspI metilase – (A) A
enzima MspI metilase possui sítio que se sobrepõe ao sitio de clivagem de BamHI.
Em B, análise em gel de agarose 0,8 % da digestão do vetor pTGA com a enzima
BamHI após tratamento com MspI metilase e sem o tratamento com a enzima. M -
marcador DNA do fago λ digerido com as enzimas EcoRI e HindIII. Em C, o sítio de
BamHI no vetor pTGA que foi eliminado com a metilação pela enzima MspI.
M intac MspIm/ BamHI
BamHI
!
!
O vetor pTGA foi defosforilado para que o cassete de expressão da α-amilase
fosse ligado ao vetor pTGA, gerando o vetor que foi denominado pTAGA. Após
procedimentos de transformação de células de E. coli e extração de plasmídios, a
construção e a orientação do segundo cassete foi verificada com a análise de restrição
com a enzima HindIII (Figura 17).
A
B
(inserir figura do gel)
Figura 17: Digestão do vetor pTAGA com a enzima HindIII (A) Os clones 1 a 4
foram digeridos com a enzima HindIII. M – marcador DNA do fago λ digerido com
as enzimas EcoRI e HindIII. i – vetores intactos. (B) Esquema da orientação que o
cassete de α-amilase foi inserido no vetor pTGA gerando o vetor pTAGA. O clone 4
apresentou o padrão de bandas correspondentes a essa orientação (≅ 450 pb; ≅ 4.000
pb; ≅ 2.300 pb; ≅ 5.150 pb).
!
6.6 Transformação de linhagens de Saccharomyces cerevisiae e seleção dos
clones transformantes
Os três vetores finais contendo os cassetes de expressão das amilases (pTA,
pTGA e pTAGA) foram, por fim, digeridos com a enzima de restrição XhoI, de modo
que toda a porção bacteriana dos vetores fosse excisada e os cassetes de integração
fossem liberados. O produto da digestão foi utilizado para transformação das
linhagens de levedura (Figura 18).
Figura 18: Cassetes de integração pTA, pTGA e pTAGA após digestão dos
vetores com a enzima de XhoI
Para validar as construções acima foram selecionadas duas linhagens de S.
cerevisiae, uma de laboratório, linhagem MFL, onde todas as construções epissomais
foram testadas, e a linhagem industrial JP1. Com o uso do protocolo de eletroporação,
células da linhagem MFL foram co-transformadas com cerca de 5 µg de cada uma das
construções vetoriais finais (pTA, pTGA e pTAGA) separadamente e com 1 µg do
vetor de expressão epissomal YEP351-PGK (LEU2) que proveria a marca de seleção
dos transformantes em culturas em meio mínimo sem leucina.
!
!
Na linhagem JP1, a co-transformação foi realizada com o uso do vetor
epissomal PYC230 que possui a marca de seleção G418r, os transformantes, portanto,
seriam capazes de crescer em meio complexo (YPD) na presença do antibiótico G418.
A eficiência de transformação em ambos os casos foi alta, com uma média de
1500 colônias a cada transformação para a linhagem MFL e 800 colônias para JP1.
No entanto, por se tratar de uma co-transformação de vetores separados sendo que um
é epissomal enquanto o outro é integrativo, para testar a eficiência de integração, as
colônias transformadas foram transferidas para meio seletivo contendo 0,5 % de
amido.
Após 48 h de crescimento, as placas contendo as colônias transformantes
foram coradas com vapor de iodo para a verificação de formação de halo de hidrólise.
Na linhagem MFL foram encontrados 2 clones com atividade de α-amilase e 3 com
atividade de glicoamilase dos 648 clones analisados (Figura 18A), não foi encontrada
nenhuma colônia transformada com o vetor pTAGA que apresentasse atividade
aparente. Na linhagem JP1 foram encontrados 2 clones com atividade de glicoamilase
dos 1944 analisados (resultantes de 3 diferentes transformações), não foram
encontrados clones com atividade amilolítica nas transformações com pTA e pTAGA
(Figura 18B).
Todos os clones que apresentaram halo de hidrólise foram selecionados para
os testes posteriores.
Tabela 4: Clones com atividade amilolítica
Linhagem
Vetor
Clones
MFL
pTA
M1 e M3
MFL
pTGA
M4, M5 e M6
JP1
pTGA
JI e JII
!
A
B
Figura 19: Teste de atividade em placa contendo amido 0,5 % e corado com
vapor de iodo. Clones com atividade das linhagens MFL (A) e JP1 (B) – Os clones
M1 e M3 foram transformados com o vetor pTA enquanto os restantes (M4, M5, M6,
JI e JII) foram transformados com o vetor pTGA. C – controles: linhagens selvagens.
M4!
M3!
M1!
M6!
M5!
!!C!
JII!
JI!
!!C!
!
!
Devido à baixa freqüência de clones com atividade amilolítica na linhagem
JP1, levantou-se a hipótese de que havia uma incompatibilidade dos promotores
utilizados no vetor e a linhagem industrial, para testar essa hipótese, o cassete da α-
amilase foi ligado ao vetor PYC230 (que continha a marca de seleção G418
r
) gerando
o vetor PUC230-AMY, um vetor epissomal que teria uma maior freqüência de
transformação que um vetor integrativo; células da linhagem JP1 foram transformadas
com a construção, a freqüência de halos de hidrolise nos clones selecionados
aleatoriamente nas placas contendo meio seletivo (YPD + G418) foi de 100 % (Figura
20), enquanto a freqüência de halos de hidrólise, na transformação com os vetores
integrativos, dos clones que cresceram no meio seletivo para a linhagem MFL foi de
0,77 % e na linhagem JP1 foi de apenas 0,1 %.
!
A
B
Figura 20: Clonagem do cassete da α-amilase no vetor PYC230 – (A) Digestão do
vetor PYC230-AMY com a enzima de restrição BamHI para análise da integridade do
vetor, os vetores intactos dos clones de 1 a 10 estão nos poços 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, e 19 respectivamente, e as digestões estão nos poços 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e
20. os clones 1, 6, 9 e 10 apresentaram as quatro bandas confirmado a clonagem do
cassete de α-amilase, sendo que o cassete está clonado em uma direção nos clones 1 e
6 e na direção contraria nos clones 9 e 10. M - marcador DNA do fago λ digerido com
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
!
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
!
!
!
as enzimas EcoRI e HindIII. (B) Células da linhagem JP1 transformadas com o vetor
PYC-AMY, o clone 1 foi utilizado na transformação.
6.7 Curva de crescimento das colônias transformantes e atividade enzimática.
Foi traçado o perfil de crescimento para todas as colônias selecionadas no
teste em placa contendo amido. A observação foi realizada até que a curva de
crescimento atingisse a fase estacionária. Em meio YPD sob agitação a 30 °C, os
clones da linhagem MFL tiveram suas curvas de crescimento bastante semelhantes
entre si e demoraram cerca de 22 h para entrarem na fase estacionária de crescimento
(Figura 21).
Figura 21: Curva de crescimento dos clones positivos para atividade amilolítica
da linhagem MFL em meio complexo (YPD) – Os clones M1 e M3 são resultantes
da transformação com o vetor pTA enquanto os clones M4, M5 e M6 são clones
transformantes de pTGA.
No ensaio enzimático, feito pelo método de Fuwa e medido por meio da
absorbância (OD
660
), houve degradação do amido dissolvido em praticamente todos
os pontos analisados. Sendo que os clones da transformação com pTA (M1 e M3)
0!
5!
10!
15!
20!
25!
30!
35!
0!
2!
4!
6!
8!
10!
12!
14!
16!
18!
20!
22!
24!
26!
OD!
tempo!(horas)!
Curva!de!crescimento!(YPD)!;!clones!
positivos!MFL!
M!1!
M!3!
M!4!
M!5!
M!6!
!
apresentaram maior degradação do amido, o que é esperado já que a α-amilase é uma
enzima dextrinizante enquanto que a glicoamilase é uma enzima sacarificante (Figura
22).
Figura 22: Ensaio enzimático dos clones positivos da linhagem MFL - Os clones
M1 e M3 são resultantes da transformação com o vetor pTA enquanto os clones M4,
M5 e M6 são clones transformantes de pTGA.
Nos clones JI e JII, da transformação da linhagem industrial JP1 com o vetor
pTGA (cassete da glicoamilase), a curva de crescimento atingiu a fase estacionária
com aproximadamente 18 horas de cultura em meio YPD sob agitação de 240 rpm a
30 °C (Figura 23). O clone JII apresentou um crescimento acentuado e atingiu a fase
estacionária antes do clone JI.
!
!
Figura 23: Curva de crescimento em meio YPD dos clones positivos para
atividade de glicoamilase da linhagem JP1.
O gráfico do ensaio enzimático para os clones JI e JII mostrou uma maior
degradação do amido dissolvido pelo clone JII (Figura 24) em relação ao clone JI.
0!
5!
10!
15!
20!
25!
0!
2!
4!
6!
8!
10!
12!
14!
16!
18!
20!
22!
OD!
tempo!(horas)!
Curva!de!crescimento!(YPD)!;!JP1/
pTGA!
JI!
JII!
!
Figura 24: Ensaio enzimático dos clones positivos da linhagem MFL
6.8 Teste de estabilidade mitótica
Para verificar a estabilidade da informação integrada foi realizado o teste de
estabilidade mitótica com todos os clones com atividade amilolítica. Todos os clones
transformantes foram crescidos em meio não seletivo durante 48 horas e depois
plaqueados em meio não seletivo contendo amido. A seguir todas as colônias foram
plaqueadas em meio seletivo. O teste mostrou que o vetor integrativo é mais estável
que o vetor epissomal que garantia o crescimento da linhagem MFL em meio sem
leucina, ou o crescimento da linhagem JP1 em meio YPD na presença do antibiótico
G418.
A linhagem JP1 representada pelo clone JII (Figura 6.20 A e B) apresentou
crescimento de 23 colônias das 52 plaqueadas, mostrando que 44 % dos clones
perderam o vetor epissomal que conferia resistência ao antibiótico G418 presente na
placa com meio YPD. No entanto, 100 % dos clones apresentaram halo de hidrólise
nas placas com MM mais 0,5 % de amido, mostrando que a integração permaneceu
!
!
estável durante o teste. A linhagem MFL representada pelo clone M4 (Figura 25C e
D) apresentou crescimento em apenas 7 colônias das 52 plaqueadas, de modo que
86,5 % dos clones perderam o vetor epissomal que garantia que as células crescessem
em meio MM sem leucina (C), mas somente 5 colônias apresentaram halo de
hidrólise no MM contendo 0,5 % de amido (D).
A integração foi mais estável na linhagem JP1, em ambos os clones JI e JII,
todas as colônias plaqueadas apresentaram halo de hidrólise após 4 passagens, o
mesmo não aconteceu nas linhagens da MFL que variaram o número de colônias que
apresentavam halo de hidrólise na placa contendo 0,5 % de amido (Figura 25).
!
JII A B
M4 C D
Figura 25: Teste de estabilidade mitótica – (A) Colônias do clone JII plaqueado em
meio seletivo com G418. (B) Colônias do clone JII plaqueados em meio contendo
0,5% de amido, e corada com vapor de iodo. (C) Colônias do clone M4 em meio
seletivo sem leucina. (D) Colônias do clone M4 plaqueados em meio contendo 0,5 %
de amido, e corada com vapor de iodo.
!
!
7. Discussão
!
Nos dias de hoje as leveduras do gênero Saccharomyces ainda são as mais
utilizadas para a produção de etanol devido à grande tolerância deste microrganismo a
elevadas concentrações desse composto (Bai et al., 2008), mas elas são incapazes de
usar substratos mais complexos como amido e celulose como única fonte de carbono.
Por isso, vários pesquisadores têm desenvolvido cepas de S. cerevisiae contendo
genes de amilases e glicoamilases de outros organismos, possibilitando, desta forma,
que essas novas linhagens sejam capazes de degradar amido para a produção de etanol
(Galdino et al., 2008).
Em 2004, Fitzsimon et al. obtiveram bons resultados com a transformação da
linhagem semi-industrial de S. cerevisiae MFL com vetores epissomais contendo os
cassetes de expressão da α-amilase de Bacillus subtilis e da glicoamilase de
Aspergillus awamori. No entanto, essa linhagem não é ideal para o estressante
ambiente industrial, pois as células de Saccharomyces cerevisiae são constantemente
submetidas a oscilações na concentração de substrato e do produto (etanol), a
flutuações de temperatura e a variações de pH. Além disso, por que o processo
industrial não ocorre em condições estéreis, as células são constantemente recicladas
durante o ciclo de fermentação que dura em torno de seis meses (Lucena, 2007). Ou
seja, a informação heteróloga (cassetes de α-amilase e glicoamilase), por estar na
forma plasmidial, é perdida facilmente quando essas células entram em competição
com as outras leveduras do processo industrial.
De modo que fez-se necessária a construção de um vetor integrativo para a
integração dos cassetes de expressão da α-amilase de Bacillus subtilis e da
glicoamilase de Aspergillus awamori no cromossomo da levedura a fim de manter os
altos níveis de expressão observados por Moraes et al. (1995) e Fitzsimon et al.
(2004), mas, acima de tudo, manter a informação heteróloga o mais estável possível
na levedura, visto que vetores integrativos possuem um índice de perda da informação
heteróloga muito pequeno (aproximadamente 0,1 % a cada geração) (Nobrega, 2001).
Os vetores epissomais como os utilizados por Moraes et al. (1995) e Fitzsimon
et al. (2004) são caracterizados por manter-se em um alto número de cópias dentro da
célula (cerca de 100 cópias), uma vantagem que para ser alcançada por um vetor
integrativo é preciso que se busque um alvo de integração que esteja presente nos
cromossomos da levedura em múltiplas cópias (Nobrega, 2001). Por esse motivo,
para a construção do vetor integrativo para S. cerevisiae foi escolhida a seqüência δ
do transposon Ty que possui um número de repetições de 425 cópias dentro do
!
!
genoma da levedura, além de ser um sistema de integração bastante estável, segundo
dados da literatura (Lee & Da-Silva, 1997). Vários trabalhos já utilizaram com
sucesso essa região-alvo (Sakai et al., 1990; Mochizuki et al., 1994; Parekh et al.,
1996; Wang et al., 1996; Lee e Da-Silva, 1997; Cho et al., 1999; Kim et al., 2001;
Chung et al., 2002). Assim, decidiu-se que a seqüência Tyδ iria flanquear a
informação heteróloga a ser integrada no cromossomo da levedura.
O início da estratégia de construção do vetor integrativo baseado na seqüência
de Tyδ de S. cerevisiae deu-se no desenho dos iniciadores para PCR, que deveriam
amplificar não somente a seqüência do próprio Tyδ, mas os sítios de restrição para
possibilitar as futuras clonagens para as quais o vetor integrativo fosse utilizado.
Optou-se, após análise das seqüências de todos os elementos que fariam parte dos
vetores finais para transformação das linhagens de S. cerevisiae (Tyδ, promotores
PGK e ADH1, gene da α-amilase Bacillus subtilis e o cDNA da glicoamilase de
Aspergillus awamori), por inserir uma região de múltiplos sítios de clonagem que
seria utilizado tanto para essas clonagens quanto para a clonagem de outras
seqüências em trabalhos futuros. Por isso, além dos sítios de BamHI (onde seria
inserido o cassete de expressão da α-amilase) e HindIII (onde seria inserido o cassete
de expressão da glicoamilase), a região de múltiplos sítios de clonagem inserido nos
iniciadores continha os sítios de restrição para as enzimas SacI, SpeI, PstI, EcoRV,
EcoRI, SalI e KpnI (Figura 26).
Figura 26: Esquema linear do vetor pT.
!
Para a amplificação por PCR dos fragmentos Tyδ foi utilizado o DNA
cromossomal da linhagem industrial JP1. Optou-se por utilizar o DNA de uma
levedura industrial, pois existem dados na literatura que mostram que leveduras
industriais possuem algumas diferenças em seu genoma quando comparadas com
linhagens de laboratório, tais como diferenças de bases, rearranjos cromossomais,
aumento ou diminuição do número de cromossomos, dentre outras, uma vez que as
linhagens industriais estão sob constante pressão seletiva, estresse, interação e
competição com outras leveduras o que promove essas adaptações (Nobrega, 2001;
Lucena et al., 2007).
Como a construção desse vetor tem como objetivo principal a transformação de
linhagens industriais tais como a JP1, que foi selecionada por dominar o processo
industrial de uma usina no nordeste brasileiro e portanto, possuir a possibilidade de
continuar a ser altamente competitiva após a inserção da informação heteróloga
(Silva-Filho et al., 2005), a amplificação dos fragmentos Tyδ foi realizada utilizando
o DNA cromossomal da própria JP1 como molde.
No entanto, após amplificação da seqüência Ty, utilizando os iniciadores
desenhados, os fragmentos resultantes de aproximadamente 300 pb (TyD e TyE)
foram seqüenciados e alinhados com a seqüência contida nos bancos de dados
genômicos da S. cerevisiae (Ncbi - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e não foram
observadas diferenças entre as duas seqüências (houve 100 % de correspondência).
A construção do vetor pT foi realizada tendo como base o vetor comercial
pBlueScript II KS+. Uma vez confirmada a construção, os cassetes de expressão da α-
amilase de Bacillus subtilis, excisado do vetor pAA3 (Moraes et al., 1995), e da
glicoamilase de Aspergillus awamori excisado do vetor pG5 (Moraes et al., 1995)
foram ligados ao vetor pT, dando origem aos vetores que foram denominados de pTA
(contendo o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e
pTAGA (contendo ambos os cassetes).
Os três vetores de expressão foram então digeridos com a enzima XhoI que,
segundo a análise da seqüência feita durante o planejamento da estratégia de
construção dos vetores, clivaria os vetores somente nos fragmentos Tyδ a uma altura
de aproximadamente 100 pb do início da seqüência, eliminando assim toda a porção
bacteriana do vetor-base e obtendo-se um fragmento de DNA com seqüências delta
nas extremidades, dirigindo desta forma a integração para estes loci. Em levedura o
principal mecanismo de integração é por recombinação homóloga, sendo necessário
!
!
apenas uma seqüência mínima de 30 pb com deleções nas extremidades 5’ e 3’ para
dirigir a integração ao sítio-alvo (Malissard et al., 1999).
Como as marcas de seleção não estavam inseridas no vetor integrativo, em
ambas as linhagens (MFL e JP1) foram realizadas co-transformações do vetor
integrativo junto com os vetores epissomais contendo a marca de seleção
correspondente a cada linhagem (LEU2 para MFL e G418
r
para JP1). O método da
co-transformação foi escolhido porque estando a marca seletiva em um vetor
epissomal ele poderia ser retirado do clone transformante apenas com as passagens de
gerações (Figura 6.20), visto que a perda de vetores YEps é mais alto do que vetores
YIp (Nobrega, 2001); de modo que o clone poderia ser novamente utilizado para
integração em múltiplas cópias de outras informações heterólogas.
As linhagens MFL e JP1 foram transformadas utilizando-se o protocolo de
eletroporação que foi a metodologia usada para integração em seqüências δ de
transposons de S. cerevisiae com sucesso em diversos trabalhos, com a obtenção de
um alto número de cópias de um só vez (Oliveira, 2005) (Tabela 5).
Tabela 5: Informações heterólogas integradas no genoma de S. cerevisiae usando
sistemas de integração baseados na seqüência Tyδ e o protocolo de
eletroporação, respectivos autores e número máximo de cópias integradas.
Autores
Proteínas
Número máximo de
cópias integradas no
genoma da levedura
Wang et al. (2006)
Invertase
20
Lee & Da Silva (1997)
β-galactosidase E. coli
9
Cho et al. (1999)
endo/exo - glucanases e β-
glucosidase
44
Kim et al. (2001)
Hirudina
10
Chung et al. (2002)
Xilose redutase
Não determinado
Apesar da boa eficiência de transformação, o resultado das transformações foi
uma baixa freqüência de clones com atividade amilolítica dentre os transformantes.
Isso se deve ao fato de a marca de seleção não estar inserida no vetor de integração.
Vetores epissomais possuem uma freqüência de transformação maior que os vetores
integrativos (Nobrega, 2001), de modo que se a marca de seleção estivesse inserida no
!
próprio vetor integrativo, os clones que crescessem no meio seletivo provavelmente
teriam os cassetes de expressão de α-amilase e glicoamilase, e, portanto,
apresentariam o halo de hidrólise nas placas com 0,5 % de amido coradas com vapor
de iodo. A inserção do cassetes de expressão da α-amilase no vetor epissomal
contendo a marca de seleção para o antibiótico G418 (PYC230) provou realmente que
se a marca de seleção estivesse inserida no vetor integrativo a eficiência de seleção do
sistema seria aumentada, pois todos os clones resistentes ao antibiótico que foram
testados apresentaram o halo de hidrólise em placa contendo amido; a hipótese
levantada de que os promotores utilizados poderiam não ser compatíveis com a
linhagem industrial JP1 foi excluída com este experimento, que mostrou que a
levedura foi capaz de expressar o gene da α-amilase com o mesmo promotor utilizado
na construção do vetor integrativo. Além disso, esse teste também confirmou que a
linhagem JP1 é um bom modelo de estudo e, conforme Silva-Filho et al. (2005) havia
descrito, é receptivo às ferramentas usuais de biologia molecular, é de fácil
manipulação e eficiente na transformação de vetores epissomais.
Apesar da baixa eficiência de integração, foram encontrados clones positivos
para atividade amilolítica nos testes com placas contendo amido para as construções
pTA e pTGA. Não foi obtido nenhum transformante amilolítico nas transformações
com o vetor contendo os dois cassetes de expressão (pTAGA), o que pode ser
explicado pela própria baixa eficiência de seleção ou pelo tamanho do fragmento, que
pode estar tornando instável a integração. De acordo com Lopes (1989) a estabilidade
da integração depende do tamanho do fragmento a ser integrado, não devendo ser
superior a 9,1 kb no caso da integração em rDNA, o mesmo pode estar acontecendo
com a integração nas seqüências Tyδ.
Os clones amilolíticos obtidos da transformação das linhagens MFL e JP1 foram
testados quanto ao crescimento celular em meio YPD. Não houve alterações
significantes na velocidade de crescimento da célula hospedeira, um dos itens listados
por Schüller & Casal (2005) como essencial para um bom sistema de expressão
heteróloga para aplicação industrial.
Os clones positivos da linhagem MFL tiveram as curvas de crescimento muito
semelhantes, já os dois clones da linhagem JP1 tiveram uma pequena diferença na
velocidade de crescimento, com destaque para o clone JII que apresentou uma taxa de
crescimento maior que o clone JI. O clone JII também exibiu um halo de hidrólise da
amido maior que o clone JI, provavelmente indicando um maior número de cópias
!
!
integradas ou integração em loci mais favoráveis a transcrição (Wang et al., 1996).
Nos testes de atividade enzimática em meio líquido (Fuwa, 1954), nos clones da
linhagem MFL que foram transformados com o vetor pTA (α-amilase) foi observada
uma maior degradação do amido, refletido pela diminuição da incorporação do iodo,
do que nos clones que foram transformados com o vetor pTGA (glicoamilase). Esse
fato explica-se pelo mecanismo de ação diferenciado de cada tipo de enzima já que a
α-amilase reduz a estrutura de hélice das regiões lineares do amido (ausência de
coloração), onde o iodo se incorpora, mais rapidamente que a glicoamilase, que ataca
a estrutura pelas extremidades, apresentando uma coloração roxo-clara quando corada
com iodo (Van der Maarel et al., 2002).
Os clones transformantes da linhagem JP1 com o vetor pTGA também
mostraram atividade enzimática no ensaio em meio líquido utilizando o método
Fuwa, sendo que o clone JII apresentou aparentemente uma maior degradação do
amido no meio que o clone JI, no entanto, mais testes necessitam ser realizados para a
determinação das unidades de degradação de amido para os clones transformados com
o vetor pTGA, já que o método Fuwa é utilizado principalmente para determinação da
atividade de endoamilases tais como a α-amilase.
Por fim, foram realizados testes de estabilidade mitótica com os sete clones
positivos para atividade amilolítica. Os clones positivos da linhagem JP1
apresentaram uma boa estabilidade mitótica, já que 100 % das colônias testadas
apresentaram o halo de hidrólise em placa contendo MM e amido 0,5 %. Mas o
mesmo resultado não se repetiu nos clones transformantes para MFL, a baixa
estabilidade mitótica nessa linhagem pode ser explicada pela amplificação da
seqüência Tyδ que foi feita com a utilização do DNA cromossomal de JP1. Como a
linhagem MFL é uma mutante da linhagem industrial FTPT472 isolada de um
fermentador industrial em Campinas – São Paulo (Fitzsimon et al., 2004), ela pode ter
modificações na seqüencia Tyδ.
Outros autores também observaram instabilidade em algumas transformações
utilizando seqüências δ, Romanos et al. (1992), por exemplo, observou que algumas
integrações em seu trabalho ocorreram, sob a forma de longos arranjos em tandem
(inserções de várias cópias seqüenciais do gene de interesse num único sítio), assim a
probabilidade de serem eliminadas por recombinação excisional é maior.
Já com Lee e Da Silva (1997) e Wang et al. (1996), a instabilidade da
!
integração foi observada quando eles utilizaram o vetor pδ-neo, que continha o gene
de resistência ao antibiótico G418, e obtiveram instabilidades estruturais
significativas quando da expressão dos cassetes integrados. Os transformantes
contendo 5 ou mais cópias do cassete, foram muito instáveis durante cultura não
seletiva, 20% a 75% perderam todos os genes integrados e o número de cópias
diminuiu significativamente nas restantes. Segundo esses autores, a linhagem de S.
cerevisiae utilizada para a transformação era aneuploide, e a ploidia influencia a
estabilidade, pois a inserção dos cassetes deve ocorrer no mesmo local em todos os
cromossomos para ser estável durante a replicação do DNA e subseqüente divisão
celular; caso não haja esta integração ocorrerá um rearranjo durante o pareamento que
poderá ou duplicar a informação nas outras cópias do cromossomo ou removê-la. A
linhagem MFL também é aneuploide, o que poderia explicar a instabilidade do vetor,
enquanto a linhagem JP1 é haplóide (Oliveira, 2005).
No entanto, diversos autores conseguiram boa estabilidade mitótica de seus
transformantes e produções de proteína melhoradas quando comparadas com
linhagens contendo plasmídios baseados no 2 µm, como por exemplo, produção de β-
glucosidase e endo/exo-glucanases (Cho et al. 1999) e hirudina (Kim et al. 2001).
Os resultados apresentados aqui mostram que a utilização da seqüência δ do
transposon Ty1 de Saccharomyces cerevisiae é plenamente viável para expressão
heteróloga em leveduras industriais, e abrem diversas perspectivas.
Objetiva-se, por exemplo, a realização de mais transformações em leveduras
utilizando o vetor construído, a fim de encontrar um clone com alta expressão de
glicoamilase e que seja capaz de crescer em amido como única fonte de energia. Este
clone seria transformado com o cassete da α-amilase, a fim de mimetizar o que ocorre
com o vetor epissomal que produz as duas enzimas, antes de ser testado para a
produção de etanol.
O desenvolvimento de um processo SSF (sacarificação e fermentação
simultâneas) para conversão de amido de mandioca a etanol para utilização em
destilarias, inclusive, pode ser realizado com a utilização de linhagens recombinantes
transformadas com as construções do presente trabalho. Para o desenvolvimento desse
processo será ainda determinado número de cópias integradas no clones positivos e a
atividade enzimática dos mesmos. Serão realizadas também fermentações em pequena
escala onde será observada a estabilidade da informação no fermentador comparada
com as linhagens transformadas com os vetores epissomais (Filtzmon, 2004). As
!
!
linhagens que se mostrarem com alta atividade enzimática e boa estabilidade nesses
testes serão testadas em ensaios fermentativos em média e larga escala.
Uma solução para melhorar a eficiência de seleção do vetor pT, é a adição da
marca de seleção ARO4-OFP, que é um alelo mutante do gene ARO4 da própria S.
cerevisiae e que codifica uma DAHP sintase resistente à inibição pela tirosina, e,
portanto à droga OFP (Cebollero, 2004). Essa marca de seleção, além de ser uma
marca dominante, possui a seqüência da própria levedura, uma vantagem, já que não
haverá adição de genes bacterianos de resistência a antibiótico que são um risco de
biossegurança e que a indústria evita (Leite, 2008). Além disso a JP1 é sensível a
droga da ARO4
OFP
(Reis, 2008), o que indica que esta marca pode ser usada nesta
linhagem para o desenvolvimento do processo SSF.
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8. Conclusões e
Perspectivas
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Os dados obtidos nesse trabalho permitem chegar às seguintes conclusões:
1. O fragmento de DNA obtido por PCR com o uso dos iniciadores desenhados
é o DNA correspondente às seqüências δ do transposon Ty de Saccharomyces
cerevisiae;
2. Foi possível construir o vetor integrativo pT utilizando como base o vetor
comercial pBlueScript II KS+ e nas seqüências δ do retrotransposon Ty1 de
Saccharomyces cerevisiae;
3. Os cassetes de α-amilase e glicoamilase foram inseridos com sucesso no vetor
integrativo gerando os vetores que foram denominados pTA, pTGA e
pTAGA;
4. A transformação das linhagens MFL e JP1 de Saccharomyces cerevisiae com
os vetores pTA e pTGA ocorreu com sucesso pois gerou linhagens capazes de
secretar as enzimas de interesse de forma funcional, no entanto com um baixo
numero de transformantes com atividade amilolítica, o que deve-se ao fato de
a marca de seleção não estar inserida no vetor integrativo e por isso há uma
baixa eficiência na seleção dos clones;
5. Não foi encontrado nenhum clone positivo para atividade amilolítica nos
transformantes com o vetor pTAGA, ou devido à baixa eficiência na seleção
dos clones ou porque o vetor (por possuir os dois cassetes) é muito grande e
isso pode dificultar a integração;
6. As linhagens transformadas não apresentaram alterações significantes na
curvas de crescimento quando comparadas com a linhagem selvagem;
7. As linhagens transformadas de MFL tiveram atividades enzimáticas
semelhantes segundo o método de Fuwa, sendo que os clones transformados
com o vetor pTA tiveram maior diminuição da OD
660
devido à atividade da
própria α-amilase;
!
8. A linhagem JII teve melhor crescimento que a JI e melhor atividade
enzimática;
9. O vetor permaneceu estável após algumas gerações na linhagem JP1, mas não
nas transformantes da linhagem MFL, isso pode ser explicado pelo fato do
DNA cromossomal que foi utilizado para amplificação das seqüencias Tyδ foi
o da JP1 e não o da MFL, podendo haver alguma diferença entre as
seqüências;
10. O vetor integrativo baseado na seqüência Tyδ pode ser utilizado como meio de
manter a informação heteróloga estável no cromossomo da linhagem industrial
JP1.
Os resultados desse trabalho abre ainda as seguintes perspectivas:
1. Inserção de uma marca de seleção dominante no vetor integrativo pT;
2. Inserção de outros cassetes de expressão de enzimas de interesse na linhagem
industrial JPI com a utilização do vetor construído;
3. Realização de ensaios de fermentação em pequena, média e larga escala para
seleção de linhagens eficientes na conversão de amido a etanol;
4. Desenvolvimento de um processo SSF para a produção de etanol a partir de
amido.
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9. Referências
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10. Anexos
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Anexo 1: Marcadores utilizados
DNA do fago λ digerido com EcoRI e HindIII DNA do fago λ digerido com BstEII
100 pb ladder Invitrogen
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Anexo 2: Mapa do vetor de clonagem pGEMT
®
Easy (Promega)
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Anexo 3: Mapa do vetor de clonagem pBlueScript II KS+ (Promega)
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Anexo 4: Mapa do vetor YEp 351 – PGK
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Anexo 5: Mapa do vetor PYC230
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