( PDF ) Caracterização química e físico-química e estudos preliminares de planejamento da formulação fitoterápica semi-sólida contendo tintura de Calendula officinalis L

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E FÍSICO-QUÍMICA E ESTUDOS

PRELIMINARES DE PLANEJAMENTO DA FORMULAÇÃO FITOTERÁPICA

SEMI-SÓLIDA CONTENDO TINTURA DE Calendula officinalis L.

KARIANE MENDES NUNES

BELÉM-PA

2008

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KARIANE MENDES NUNES

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E FÍSICO-QUÍMICA E ESTUDOS

PRELIMINARES DE PLANEJAMENTO DA FORMULAÇÃO FITOTERÁPICA

SEMI-SÓLIDA CONTENDO TINTURA DE Calendula officinalis L.

Dissertação de mestrado apresentado ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal do Pará para obtenção do

título de mestre em Ciências Farmacêuticas.

Área de concentração: fármacos e medicamentos

Orientador: Prof. Dr. José Otávio Carrera Silva Júnior

BELÉM-PA

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Nunes, Kariane Mendes.

Caracterização química e físico-química e estudos

preliminares de planejamento da formulação fitoterápica semi-sólida

contendo tintura de Calendula officinalis L./ Kariane Mendes Nunes -

Belém, 2009. 141p.; il.; 30 cm.

Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Fármacos e

Medicamentos), Faculdade de Farmácia/Universidade Federal do

Pará.

Orientador: Silva Júnior, José Otávio Carrera.

1. Calendula officinalis L. 2. Rutina. 3. Fitoterápicos. 4. Controle de

qualidade. 5. Planejamento/pré-formulação

KARIANE MENDES NUNES

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E FÍSICO-QUÍMICA E ESTUDOS

PRELIMINARES DE PLANEJAMENTO DA FORMULAÇÃO FITOTERÁPICA

SEMI-SÓLIDA CONTENDO TINTURA DE Calendula officinalis L.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da Universidade Federal do Pará para obtenção do título de

Mestre em Ciências Farmacêuticas

Trabalho defendido e aprovado em: _____/_____/2008

Banca Examinadora

Prof. Dr. Fernando Batista da Costa

Instituição: Universidade de São Paulo

Prof. Dr

. Roseane Maria Ribeiro Costa

Instituição: Universidade Federal do Pará

Prof. Dr. José Otávio Carréra Silva Júnior

Instituição: Universidade Federal do Pará

BELÉM-PA

2008

Dedicatória

À minha querida avó Zenaide Lopes, pelo apoio, cuidado e exemplo de vida

constantemente.

Aos meus pais Ileny e Barbosa pelo amor, dedicação e apoio dispensados em

todos os momentos da minha vida, juntamente com meus irmãos Karine e

Rodrigo.

À grande amiga Roberta, pelo incentivo, apoio e cima de tudo pela amizade

verdadeira.

Agradecimentos

Á Deus por permitir a realização de mais um projeto, e pela proteção

dispensada em todos os momentos.

Aos meus maravilhosos pais, irmãos e familiares pelo apoio, carinho e

incentivo demonstrados em todos os momentos.

Ao meu orientador prof. Dr. José Otávio Carrera Silva Júnior pela orientação

concedida, apoio e confiança que me foi depositado, além das oportunidades

proporcionadas durante esses dois anos de trabalho. Muito obrigada prof.

Otávio.

Ao Prof. Dr. Edemilson, pelo grande apoio e incentivo, além das colaborações

durante a realização desse trabalho.

Ao Prof. Dr. Wagner Barbosa por sua relevante colaboração científica, além de

disponibilização dos laboratórios de fitoquímica para a realização deste

trabalho.

Ao Prof. Dr. José Luiz, Prof. Dr. José Maria Vieira e Prof. Dr. Pergentino pela

atenção, apoio e amizade.

À Profª. MSc Eliene por suas contribuições e amizade.

À Profª. Dr

. Roseane Maria que gentilmente contribuiu de forma relevante para

a realização do estudo de permeação.

À Profª. Drª. Eliana Ozela por disponibilizar o laboratório de bromatologia para

realização deste trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pelo auxílio financeiro na forma de bolsa.

A Universidade Federal do Pará e ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêutica, pela oportunidade de aprendizado e crescimento

profissional.

Às minhas queridas amigas do Laboratório de Toxicologia (LATOX), Tânia

Mara, Glaécia Nascimento, Margareth Nascimento, Larissa Borges e Daniella

Paternostro, pela amizade, incentivo e colaboração durante a realização deste

trabalho.

Às secretárias da pós-graduação Brasília e Cliciane pela doçura, apoio e

carinho dispensados a todo instante.

Aos amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciência Farmacêutica,

Andrex, Cláudio, Luciana Bravin, Luciana Pinto, Mauro, Russane e Sara pelo

companheirismo, apoio e amizade.

Aos técnicos, Paulão, Eduardo e Zé Maria da FCFRP-USP, pela ótima

recepção e atenção dispensadas durante minha passagem por lá.

Ao Prof. Dr. Osvaldo de Freitas da FCFRP-USP pela ótima recepção e

permissão da utilização dos laboratórios de farmacotécnica para a realização

deste trabalho. E sua aluna doutoranda Flávia de Faria Caetano pela

colaboração, carinho e atenção dispensados.

Pelo carinho, amizade e apoio permanentes das minhas grandes amigas

Cristina, Roberta e Tia Hilda.

Enfim, a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização

deste trabalho, meus sinceros e profundos agradecimentos.

“Nossa Universidade atual forma, pelo mundo afora, uma

proporção demasiado grande de especialistas em disciplinas

predeterminadas, portanto artificialmente delimitadas, enquanto

uma grande parte das atividades sociais, como o próprio

desenvolvimento da ciência, exige homens capazes de um

ângulo de visão muito mais amplo e, ao mesmo tempo, de um

enfoque dos problemas em profundidade, além de novos

progressos que transgridam as fronteiras históricas das

discipli

nas”.

Lichn

erowicz

RESUMO

A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que vem

crescendo visivelmente ao longo dos anos, no entanto, apesar da extensa

utilização dos fitoterápicos, a qualidade destes medicamentos muitas vezes é

deficiente e questionável. Dentre as plantas medicinais mais empregadas como

fitoterápicos, temos a Calendula officinalis L.(Asteraceae)

utilizada pelos seus

efeitos antiinflamatórios, antisépticos e cicatrizantes. Sendo assim, o presente

estudo objetivou aprimorar e consolidar o emprego de metodologias de

tecnologia farmacêutica na área de desenvolvimento de fitoterápicos, por meio

da realização de estudos preliminares do planejamento/pré-formulação de uma

formulação fitoterápica semi-sólida contendo tintura de C. officinalis L.,

visando o controle de qualidade das etapas do seu desenvolvimento. Na

caracterização física e físico-química do pó e da tintura de calêndula foi

possível obter especificações farmacognósticas condizentes com as da

literatura, além de constatar a identidade do material vegetal através da

detecção do marcador químico rutina por CCD. Por meio da validação do

método, que apresentou parâmetros recomendados pela legislação vigente,

foram determinados 463 µg/mL de rutina na tintura. Os espectros obtidos na

região do infravermelho (IV) mostraram bandas características da rutina no

extrato liofilizado, além de demonstrar a permanência dessas bandas após

sua mistura com os excipientes da formulação. As técnicas termoanalíticas

confirmaram a compatibilidade entre os excipientes e o extrato liofilizado de

calêndula. Na avaliação da estabilidade preliminar do gel, a formulação

permaneceu estável durante a realização dos ciclos em estufa (45 ± 2

C) e

temperatura ambiente (25 ± 2

C). No estudo preliminar da permeação, o gel

apresentou tendência para favorecer a permeação dos flavonóides totais

expresso em rutina para a fase receptora. Estes resultados demonstram a

importância do emprego de protocolos de controle de qualidade das matérias-

primas vegetais, além do estabelecimento de metodologias tecnológicas para

a produção de fitoterápicos.

Palavras chaves: Calendula officinalis L., rutina, fitoterápicos, controle de

qualidade, planejamento/pré-formulação.

ABSTRACT

The phytotherapy is a form of medicinal therapy that has been grown

noticeably over the years, however, despite the broad use of phytomedicines,

the quality of these drugs is often poor and questionable. Among the several

medicinal plants used as herbal medicine, the Calendula officinalis L. is known

for its anti-inflammatory, antiseptic and healing effects. Thus, this present study

aimed to enhance and consolidate the use of methods of pharmaceutical

technology in the development of phytotherapeutic agents, through the

completion of preliminary studies of the planning of a semi-solid formulation

phytotherapic containing tincture of Calendula officinalis L., for the quality

control of the stages of their development. In the physical characterization and

physical chemistry of the dust and tincture of calendula were obtained

farmacognóstics specifications consistent with the literature, and to establish

the identity of the plant material through the detection of the chemical marker

rutin by Thin-Layer Chromatography (TLC). Through the validation of the

method, that presented parameters recommended by existing legislation, was

given 463 µg/mL of rutin in tincture. The infrared (IR) spectra showed

characteristics of rutin in the lyophilised extract, in addition to demonstrate the

permanence of these bands after mixing with the excipients of the formulation.

The thermoanalytic techniques confirmed the compatibility between the

excipients and lyophilisate of calendula extract. In the preliminary assessment

of the stability of the gel formulation remained stable during the cycles in

greenhouse (45 ± 2

C) and temperature (25 ± 2

C). In the preliminary study of

the gel, permeation tended to favor the permeation of total flavonoids as rutin

for receiving phase. These results demonstrate the importance of employment

of protocols for quality control of raw materials plant, besides the establishment

of technological methods for the production of phytotherapic.

Keywords: Calendula officinalis L., rutin, phytotherapy, quality control,

planning/preformulation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Calendula officinalis L. Fonte: Thomé Flora von Deutschland,

Osterreich und der Schweiz 1885.

Figura 2. Estrutura química da rutina (CHOQUENET et al., 2008).

Figura 3: Esquema da configuração experimental utilizada para o acoplamento

da CL/UV/MS e CL/UV/RNM (QUEIROZ; HOSTETTMANN, 2006).

Figura 4: Estrutura da pele (http://www.afh.bio.br/sentidos/sentidos10.asp),

acessado em 12/2008.

Figura 5: Esquema representativo das vias de penetração do fármaco através

do estrato córneo via transcelular e via intercecular (MARTINS; VEIGA, 2002).

Figura 6: Modelo da célula de difusão. a) célula fechada, onde há orifícios de

entrada (inferior) e saída (lateral) da solução receptora; b) célula aberta, 1-

parte superior da célula (CD), onde foram colocadas as amostras, 2 – parte

inferior da célula (CR), que continha parte da solução receptora, 3 – pinos de

vedação da célula e 4 – borracha de vêdação da membrana (ARAUJO, 2003).

Figura 7: Diagrama esquemático do modelo da célula de difusão com suas

respectivas medidas.

Figura 8: Esquema de montagem do sistema de difusão a partir da célula de

difusão. 1- banho termostatizado; 2- recipiente receptor; 3- célula de difusão; 4-

bomba peristáltica.

Figura 9: Determinação da distribuição granulométrica do pó de Calendula

officinalis L.

Figura 10: Curvas TG-DTG correspondentes ao pó das flores de Calendula

officinalis L.

Figura 11: Curva DTA correspondente ao pó das flores de Calendula officinalis

Figura 12: Análise por CCD da tintura de Calendula officinalis L. Eluente I:

acetato de etila; ácido fórmico; ácido acético glacial; água (100:11:11:26);

revelador: NP/PEG 4000. Observação sob luz UV 365 nm; P- Padrão de rutina;

T- tintura de calêndula.

Figura 13: Espectro na região do infravermelho, correspondente ao extrato

liofilizado das flores de Calendula officinalis L.

Figura 14: Curvas TG-DTG correspondentes ao extrato liofilizado das flores de

Calendula officinalis L. (4,043mg).

Figura 15: Curva DTA correspondentes ao extrato liofilizado das flores de

Calendula officinalis L.

Figura 16: Análise qualitativa por CLAE/UV−DAD da tintura de Calendula

officinalis L.: Cromatogramas (A) padrão de rutina, (B) tintura de calêndula in

natura, (C) tintura de calêndula com padrão rutina.

Figura 17: Análise qualitativa por CLAE da tintura de Calendula officinalis L.:

Cromatogramas (D) padrão de quercetina (24,36 min), (E) tintura in natura, (F)

tintura de calêndula com padrão quercetina (23,49 min).

Figura 18: Representação gráfica da linearidade da rutina.

Figura 19: Representação gráfica da curva de calibração da rutina.

Figura 20: Espectro na região do IV, correspondente a rutina.

Figura 21: Curva TG correspondente ao marcador químico rutina.

Figura 22: Curva DTA correspondente ao marcador químico rutina.

Figura 23: Espectro na região do IV, correspondente ao hidroxietilcelulose, ao

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de

hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Figura 24. Espectro na região do IV, correspondente ao propilenoglicol, ao

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de

propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1 p/p).

Figura 25: Espectro na região do IV, correspondentes ao metilparabeno,

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de

propilenoglicol/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Figura 26: Curvas TG correspondentes ao hidroxietilcelulose, ao extrato

liofilizado de Calendula officinalis L. e à mistura binária de

hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Figura 27: Curvas DTA correspondentes ao hidroxietilcelulose, ao extrato

liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de

hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Figura 28: Curvas TG correspondentes ao propilenoglicol, ao extrato liofilizado

de Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado

(2:1 p/p).

Figura 29: Curvas DTA correspondentes ao propilenoglicol, ao extrato

liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato

liofilizado (2:1 p/p).

Figura 30: Curvas TG correspondentes ao metilparabeno, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de metilparabeno/extrato liofilizado (2:1

p/p).

Figura 31: Curvas DTA correspondentes ao metilparabeno, ao extrato

liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato

liofilizado (1:1 p/p).

Figura 32: Amostra do gel com tintura de Calendula officinalis L. a 10%.

Figura 33. Perfil do pH durante o teste de estresse térmico obtido das

amostras do gel de calêndula submetidas à temperatura de 45 ± 2

C, e das

amostras (padrão) do gel de calêndula à temperatura ambiente (25 ± 2

C). Os

resultados foram expressos pela média das leituras (n=3).

100

Figura 34: Perfil de permeação dos flavonóides totais expresso em rutina

presentes na formulação fitoterápica do tipo gel contendo tintura de Calendula

officinalis L.

101

LISTA DE TABELAS

Tabela I: Gradiente de eluiçao utilizado na análise da tintura de Calendula

officinalis L. por CLAE/DAD.

Tabela II: Perda por dessecação e teor de cinzas totais do pó de Calendula

officinalis L.

Tabela III: Dados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA) do pó de

Calendula officinalis L.

Tabela IV: Densidade aparente, pH e resíduo seco da tintura de flores de

Calendula officinalis L.

Tabela V: Prospecção química da tintura de flores de Calendula officinalis L.

Tabela VI: Bandas de absorção na região do IV, correspondente ao extrato

liofilizado das flores de Calendula officinalis L.

Tabela VII: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA) do

extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

Tabela VIII: Parâmetros cromatográficos utilizados para validação da

metodologia analítica.

Tabela IX: Gradiente de eluiçao utilizado na análise da tintura de Calendula

officinalis L. por CLAE/UV−DAD

Tabela X: Média dos tempos de retenção da rutina padrão e in natura na

tintura.

Tabela XI: Linearidade da rutina.

Tabela XII: Curva de calibração da rutina

Tabela XIII: Bandas de absorção na região do IV, correspondente à rutina.

Tabela XIV: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao marcador químico rutina

Tabela XV: Bandas de absorção na região do IV, correspondente ao

hidroxieticelulose e mistura binária (hidroxietilcelulose/extrato liofilizado).

Tabela XVI: Bandas de absorção na região do IV, correspondente ao

propilenoglicol e mistura binária (propilenoglicol/extrato liofilizado).

Tabela XVII: Bandas de absorção na região do IV, correspondente ao

metilparabeno e mistura binária (metilparabeno/extrato liofilizado).

Tabela XVIII: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao hidroxietilcelulose, extrato liofilizado de Calendula

officinalis L. e mistura binária de hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Tabela XIX: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao propilenoglicol, extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

e mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1 p/p).

Tabela XX: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao metilparabeno, extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

e mistura binária de metilparabeno/extrato liofilizado (1:1 p/p).

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CCD

Cromatografia em Camada Delgada

CLAE/UV-DAD

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência/Ultravioleta com

detector de arranjo de diodos

DTA

DTG

Análise Térmica Diferencial

Termogravimetria derivativa

FDA

HEC

Food and Drug Administration

Hidroxietilcelulose

Infravermelho

OMS

Organização Mundial de Saúde

PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares

TG Termogravimetria

SUS Sistema Único de Saúde

OMS

Organização Mundial de Saúde

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Calendula officinalis L.

2.1.1 Histórico do uso popular 24

2.1.2 Aspectos botânicos 24

2.1.3 Características farmacognósticas 25

2.1.4 Composição química 26

2.1.5 Ensaio farmacológico experimental com Calendula officinalis L.

2.2 Aspectos gerais sobre política, normatização e legislação brasileira sobre

medicamentos fitoterápicos

2.2.1 Políticas 28

2.2.2 Normatização e legislação 31

2.3 Principais técnicas analíticas utilizadas no desenvolvimento, avaliação e controle de

qualidade de fitoterápicos

2.3.1 Cromatografia 32

2.3.2 Espectrometria na região do infravermelho 35

2.3.3 Fundamentos da análise térmica 35

2.4 Formulações de uso tópico 38

2.4.1 Géis 38

2.4.2 Hidroxietilcelulose 40

2.5 Desenvolvimento de formulações fitoterápicas 40

2.6 Teste de estabilidade preliminar 42

2.7 Estrutura da pele e vias de permeação percutânea 42

2.8 Estudo de permeação percutânea 45

3. OBJETIVOS

3.1 Geral 47

3.2 Específicos 47

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL 48

4.1.1 Material vegetal 48

4.1.2. Equipamentos 49

4.1.3 Reagentes e soluções 49

4.2. MÉTODOS 49

4.2.1 Caracterização física e físico-química do pó das flores de Calendula officinalis L.

4.2.1.1. Determinação da distribuição granulométrica do pó das flores de Calendula

officinalis L.

4.2.1.2. Determinação de perda por dessecação 50

4.2.1.3. Determinação do teor de cinzas totais 51

4.2.1.4 Termogravimetria (TG) do pó das flores de Calendula officinalis L.

4.2.1.5 Análise térmica diferencial (DTA) do pó das flores de Calendula officinalis L.

4.2.2 Obtenção e caracterização química, física e físico-química da tintura de flores de

Calendula officinalis L.

4.2.2.1 Obtenção da tintura das flores de Calendula officinalis L.

4.2.2.2 Determinação da densidade aparente da tintura das flores de Calendula officinalis L.

4.2.2.3 Determinação do pH da tintura das flores de Calendula officinalis L.

4.2.2.4 Determinação do resíduo seco da tintura das flores de Calendula officinalis L.

4.2.2.5 Obtenção do extrato seco da tintura de Calendula officinalis L.

4.2.2.6 Prospecção química da tintura das flores de Calendula officinalis L.

4.2.2.7 Determinação do perfil cromatográfico da tintura das flores de Calendula officinalis

L. por Cromatografia em camada delgada (CCD)

4.2.2.8 Obtenção do extrato liofilizado a partir da tintura de Calendula officinalis L.

4.2.2.9 Espectroscopia na região do infravermelho extrato liofilizado de Calendula officinalis

L..

4.2.2.10 Termogravimetria (TG)do extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

4.2.2.11 Análise térmica diferencial (DTA) do extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

4.3 Análise quantitativa da rutina na tintura das flores de Calendula officinalis L..

4.3.1 Validação do método 60

4.3.1.1 Condições cromatográficas 60

4.3.1.2 Amostras e preparação das soluções padrões 61

4.3.1.3 Seletividade 61

4.3.1.4 Linearidade 61

4.3.1.5 Intervalo 62

4.3.1.6 Curva de calibração 62

4.3.1.7 Repetibilidade (precisão intra-corrida) 62

4.3.2 Análise estatística 62

4.4 Planejamento/pré-formulação preliminar da formulação fitoterápica semi-sólida

contendo tintura de flores de Calendula officinalis L.

4.4.1 Obtenção da formulação 63

4.4.2 Caracterização

físico-química do marcador químico rutina por espectrometria na

região do infravermelho (IV), Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA)

4.4.2.1 Espectrometria na região do infravermelho (IV) da rutina 64

4.4.2.2 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) da rutina 64

4.4.3 Ensaios preliminares de avaliação dos excipientes da formulação e suas misturas

binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L.. por Espectrometria na Região

do Infravermelho (IV) , Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA)

4.4.3.1 Preparo das misturas binárias 64

4.4.3.2 Espectrometria na Região do Infravermelho (IV) dos excipientes da formulação e

suas misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

4.4.3.3 Termogravimetria (TG) dos excipientes da formulação e suas misturas binárias

com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

4.4.3.4 Análise Térmica Diferencial (DTA) dos excipientes da formulação e suas misturas

binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

4.4.4 Teste de estabilidade preliminar da formulação 66

4.4.4.1 Teste de centrifugação 66

4.4.4.2 Teste do estresse térmico 66

4.4.4.3 Determinação do valor de pH 67

4.4.5 Ensaio de permeação da formulação fitoterápica tópica do tipo gel contendo tintura

de Calendula officinalis L..após difusão em modelo de biomembrana alternativo (muda de pele

ou estrato córneo de cobra)

4.4.5.1 Demonstração e identificação do sistema de difusão 67

4.4.5.2 Determinação de flavonóides totais expressos em rutina após permeação cutânea

in vitro em modelo de biomembrana alternativo

4.4.5.2.1 Solução estoque do padrão de rutina e série de diluições 69

4.4.5.2.2 Curva analítica e linearidade 69

4.4.5.3 Preparo das células de difusão para a realização do ensaio de permeação

cutânea in vitro em modelo de biomembrana alternativo

5. RESULTADOS

5.1 Caracterização química, física e físico-química do pó das flores de Calendula

officinalis L.

5.1.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó das flores de Calendula

officinalis L.

5.1.2 Determinação de perda por dessecação e do teor de cinzas totais 72

5.1.3 Termogravimetria (TGA) e Análise Térmica Diferencial (DTA) do pó das flores de

Calendula officinalis. L

5.2 Caracterização química, física e físico-química da tintura de flores de Calendula

officinalis L.

5.2.1 Determinação da densidade aparente, pH e resíduo seco da tintura de flores de

Calendula officinalis L.

5.2.2 Prospecção química da tintura de flores de Calendula officinalis L.

5.2.3 Determinação do perfil cromatográfico da tintura de flores de Calendula officinalis L.

por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

5.2.4 Espectroscopia na Região do Infravermelho do extrato liofilizado de Calendula

officinalis L.

5.2.5 Termogravimetria (TGA) e Análise Térmica Diferencial (DTA) do extrato liofilizado

de Calendula officinalis L.

5.3 Análise quanlitativa da rutina na tintura de flores de Calendula officinalis L. por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por Arranjo de Diodos (CLAE/UV-DAD)

5.3.1 Validação do método 79

5.3.1.1 Condições cromatográficas 79

5.3.1.2 Seletividade 80

5.3.1.3 Linearidade 83

5.3.1.4 Intervalo 84

5.3.1.5 Curva de calibração 84

5.3.1.6 Repetibilidade (precisão intra-corrida) 85

5.4 Planejamento/pré-formulação preliminar da formulação fitoterápica semi-sólida

contendo tintura de flores de Calendula officinalis L.

5.4.1 Caracterização

físico-química do marcador químico rutina por Espectrometria na

Região do Infravermelho (IV), Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA)

5.4.1.1 Espectrometria na Região do Infravermelho (IV) da rutina 85

5.4.1.2 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) da rutina 86

5.4.2 Ensaios preliminares de avaliação dos excipientes da formulação e suas misturas

binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L.. por Espectrometria na Região

do Infravermelho (IV) , Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA)

5.4.2.1 Espectrometria na Região do Infravermelho (IV) dos excipientes da formulação e

suas misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

5.4.2.2 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) dos excipientes da

formulação e suas misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L..

5.4.3 Teste de estabilidade preliminar da formulação 98

5.4.3.1 Teste de centrifugação 98

5.4.3.2 Teste do estresse térmico 98

5.4.3.3 Ensaio de permeação do gel contendo tintura de Calendula officinalis L. após

difusão em modelo de biomembrana alternativo (muda de pele ou estrato córneo de

cobra)

100

6. DISCUSSÃO

102

7. CONCLUSÕES 116

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 118

APÊNDICES 137

1. INTRODUÇÃO

O uso de plantas e produtos naturais como recursos terapêuticos

pela medicina tradicional e popular é uma prática milenar que antecede a

química moderna, uma vez que, foi a partir da experimentação e aplicação das

plantas medicinais na prevenção e no tratamento das diversas doenças, que

foram descobertos os primeiros compostos químicos naturais dotados de

propriedades biológicas. A partir de então, deu-se início a incessantes

pesquisas científicas a cerca do potencial químico das plantas medicinais na

descoberta de compostos farmacologicamente ativos como protótipos para o

desenvolvimento de novos medicamentos (YUNES; CALIXTO, 2001;

WAGNER; WIESENAUER, 2006).

É nesses moldes que surge a necessidade de aliar o conhecimento

empírico do uso popular de plantas medicinais à pesquisa científica

fundamentada em estudos minuciosos das espécies vegetais, bem como

aspectos botânicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos, e de

desenvolvimento de metodologias científicas e tecnológicas (PETROVICK et

al., 1997). O resultado deste avanço científico foi o desenvolvimento de um

produto vegetal terapêutico diferencial, pois ao contrário das preparações

tradicionais obtidas de plantas na medicina popular, a fundamentação científica

e tecnológica proporcionou o desenvolvimento do medicamento fitoterápico

(WAGNER; WIESENAUER, 2006; LEITE, 2008).

De acordo com a RDC n° 48/04(ANVISA), legislação em vigor que

dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos, sua definição se

estende a medicamento cujo (s) princípio (s) ativo é um derivado de droga

vegetal (extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco e outros), obtido

empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais, caracterizado

pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela

reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Não se considera como

medicamento fitoterápico aquele que inclua substâncias ativas isoladas, de

qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais (BRASIL,

2004).

A fitoterapia constitui uma forma de medicina que vem crescendo

visivelmente ao longo dos anos, ao ponto que atualmente o mercado mundial

de fitoterápicos gira em torno de 22 bilhões de dólares (YUNES et al., 2001).

No entanto, apesar de sua extensa utilização, a qualidade dos medicamentos

fitoterápicos muitas vezes é deficiente e questionável, já que a qualidade de um

produto fitoterápico se dá por vários fatores, que vão desde a matéria-prima

vegetal até técnicas de desenvolvimento farmacêutico para a obtenção do

produto acabado (FARIAS, 2004; CARVALHO et al., 2006 ).

Dentre as diversas plantas medicinais mais utilizadas na fitoterapia,

temos a Calendula officinalis L., uma herbácea anual pertencente à família

Asteraceae. Originária do Egito, foi levada para a Europa no séc. XII e trazida

para o Brasil no séc. XVIII, sendo cultivada como planta ornamental e

medicinal. Na medicina tradicional é utilizada pelos seus efeitos

antiinflamatórios, antisépticos e cicatrizantes. As flores são as partes usadas

medicinalmente, e na maioria das preparações empregadas como extratos,

tinturas, bálsamos e formulações semi-sólidas (BALDUCCI-ROSLINDO et al.,

1999; PARENTE et al., 2002; WHO, 2002; CARVALHO, 2004; NITZ et al.,

2006).

Por sua vez, de acordo com a Política Nacional de Plantas

Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) aprovada pelo Decreto n° 5.813/06

(ANVISA), é imprescindível garantir à população brasileira o acesso seguro e

uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, por meio da adoção de boas

práticas de cultivo e manipulação de plantas medicinais e produção de

fitoterápicos. Portanto, em decorrência da importância da C. officinalis L. como

planta medicinal utilizada extensivamente na medicina tradicional e oficial em

todo o mundo, faz-se necessários estudos relevantes para o controle de

qualidade e o estabelecimento de metodologias para o desenvolvimento

tecnológico de seus derivados fitoterápicos (BRASIL, 2006).

Sendo assim, o presente estudo se dá no sentido de aprimorar e

consolidar o emprego de metodologias de tecnologia farmacêutica na área de

desenvolvimento de fitoterápicos, por meio da realização de estudos

preliminares de planejamento/pré-formulação da formulação fitoterápica tópica

do tipo gel contendo tintura de Calendula officinalis L., visando o controle de

qualidade das etapas de desenvolvimento tecnológico de um fitoterápico,

parâmetro fundamental para padronização de sua produção. O que resultará

na ampliação do arsenal terapêutico fitoterápico aos usuários com garantia da

sua qualidade, segurança e eficácia, na perspectiva da integralidade da

atenção à saúde pública.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Calendula officinalis L.

2.1.1 Histórico do uso tradicional e popular

Cultivada pelos egípcios, gregos, hindus e árabes, a calêndula cresceu

nos jardins europeus e tem sido usada medicinalmente desde o século XII. Seu

nome tem origem na palavra latina calends, que quer dizer o primeiro dia de

todo mês, por causa de seu longo período de florescimento. Porque as flores

acompanham o sol, por isso foi relacionada como signo astrológico do verão, e

para o tratamento do coração e condições causadas pelo calor.

Tradicionalmente, calêndula era usada internamente para tratar febres, e

controlar menstruações e tratamento de icterícia, além de pequenas

inflamações da pele. O mais interessante é que as flores passaram a ser

utilizadas na forma de extratos, tinturas e pomadas e aplicadas diretamente

sobre a pele para ajudar na cura de ferimentos e para aliviar a pele inflamada e

danificada (KEMPER, 1999).

As preparações derivadas de calêndula têm sido positivamente

revisadas pela promoção da cicatrização de ferimentos como um

antiinflamatório tópico (HAMBURGUER et al., 2003). Popularmente, é utilizada

como anti-inflamatória, cicatrizante, analgésica, colerética, antitumoral,

tratamento de amenorréia, gastrite, hipotensão e reumatismo, é usada sob as

mais variadas formas, tais como: infusões, tintura, ungüento, tópico, por via oral

e através de uso homeopático (BALDUCCI-ROSLINDO et al., 1999; PARENTE

et al., 2002; WHO, 2002; NITZ et al., 2006).

2.1.2 Aspectos botânicos

A calêndula é uma herbácea anual pertencente à família Asteraceae,

espécie descrita pelo botânico sueco Carl Von Linné, a qual responde pelo

binômio Calendula officinalis L. Seus nomes comuns ou populares são:

calêndula, maravilha calêndula do campo, calêndula do jardim, maravilhas do

campo, calêndula de panela e Pot Marigold (em inglês). Originária da Europa

Central e Mediterrâneo, domesticada e adaptada ao Brasil, cresce

naturalmente em localizações ensolaradas ao longo da América do Norte e

Europa. O florescimento acontece de maio até outubro, cresce mais ou menos

30 cm e com galhos múltiplos. As flores são as partes utilizadas

medicinalmente (KEMPER, 1999; CARVALHO, 2004).

2.1.3 Características morfológicas

Na descrição macroscópica, suas flores são dispostas em capítulos de 3

cm a 7 cm, envolvidas por um invólucro de 2 séries de brácteas. As flores da

periferia são liguladas, pistiladas, de 1,5 cm a 3,0 cm de comprimento e 0,5 cm

a 0,7 cm de largura na porção mediana da lígula. Corolas amareladas ou

alaranjadas, com o limbo tridentado, apresentando 4 ou 5 nervuras e tubo curto

coberto de tricomas, ocasionalmente acompanhadas de um estilete filiforme e

um estigma bífido. As flores do centro são escassas, tubulosas, pequenas,

curtas, de aproximadamente 0,5 cm de comprimento, hermafroditas, amarelas

ou alaranjadas, raro quase avermelhadas, com corola qüinqüedentada, anteras

sagitadas e estilete indiviso, conforme Figura 1. Papus ausente

(FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV, 2001).

2.1.4 Composição química

As flores liguladas da C. officinalis L. apresentam como componentes

químicos principalmente: saponinas, triterpenos e ésteres de ácidos graxos,

carotenóides, flavonóides, cumarinas, óleos essenciais, hidrocarbonetos e

ácidos graxos (HAMBURGUER et al., 2003; PARENTE et al., 2004). Os

constituintes com presença majoritária na calêndula são os triterpenos e

saponinas (2-10%), baseado em ácido oleanólico (calendulosídeos) e

flavonóides (3-O-glicosídeos e de isorhamnetina quercetina), incluindo

hyperosideos, isoquercetina e rutina (WHO, 2002).

Uma das classes de metabólitos secundários mais pesquisados na

composição química de C. officinalis L são os flavonóides, devido estudos

relevantes a cerca de sua atividade antiinflamatória e cicatrizante (BEZÀKOVA

et al., 1996; CARVALHO, 2004; KURKIN; SHAROVA, 2007; MENÉNDEZ et al.,

2007). Os flavonóides são compostos polifenólicos de ocorrência ampla no

reino vegetal. Foram descritos, aproximadamente, mais de 4.200 tipos deste

grupo de substâncias (ZUANAZZI et al., 2004).

Todos flavonóides apresentam em comum a origem biossintética, isto é,

o processo de biossíntese. Assim, sob o ponto de vista químico, são

compostos formados por um núcleo comum fundamental benzopirano ou

cromano unido a anel aromático caracterizado pelo esqueleto de carbono C6-

C3-C6. São subdivididos, sucintamente, como segue: flavonol, flavona,

catequina, flavana, flavanona, antocianidina e isoflavonóide (COSTA, 1987;

GUARDIA et al., 2001; NISHIKAWA et al., 2007).

Figura 1:

Calendula officinalis L. Fonte: Thomé Flora von Deutschland, Österreich

und der Schweiz 1885

Entre os flavonóides encontrados nas flores de Calendula officinalis L

destaca-se o heterosídeo flavonoídico muito comum 3-rutinosídeo quercetina

(Rutina) demonstrado na Figura 2 (ZUANAZZI et al., 2004). A rutina é um

flavonóide da classe dos flavonóis que possui ampla gama de propriedades

biológicas, tais como, promoção de efeitos benéficos em doenças, as quais

estão envolvidas com a peroxidação lipídica descontrolada, capacidade de

interagir com proteínas fosforilantes, eliminar radicais livres como antioxidante,

é empregada na prevenção ou tratamento da insuficiência venosa ou linfática e

da fragilidade ou permeabilidade capilar, além de outras atividades

farmacológicas relatadas, como seu efeito sobre o sistema imunológico, células

inflamatórias e até mesmo efeito anticarcinogênico. (BRUNETON, 1991;

ROLIM, et al., 2005; VELASCO et al., 2008). Essa riqueza de propriedades

farmacológicas da rutina pode explicar a sua grande utilização em produtos

fitocosméticos, cosméticos e fitoterápicos.

Figura 2. Estrutura química da Rutina (CHOQUENET et al., 2008).

2.1.5 Ensaios Farmacológicos com Calendula officinalis L.

Em estudos farmacológicos realizados com extratos ou frações a partir

de flores de C. officinalis L. foram detectadas as mesmas propriedades que são

reportadas na medicina tradicional. Estudos realizados por Dumenil (1980)

demonstraram que os extratos etanólicos de C. officinalis L. a 80% mostraram

atividade antibacteriana principalmente contra Staphylococcus aureus e S.

fecalis. Autores como Schipochliev (1981) e Fleischner (1985 ) conduziram

estudos que revelaram as propriedades anti-inflamatórias do extrato de

calêndula. Fleischner (1985) e Michel (1987) demonstraram o poder

cicatrizante dos extratos de C. officinalis em animais de experimentação e em

seres humanos (VALDÉS; GARCÍA, 1999).

Em estudo realizado por Martins e colaboradores (2003), foram

comparados os efeitos de fitoterápicos derivados da C. officinalis L., do

Symphytum officinale e do Stryphnodendron barbatiman na cicatrização de

pele por segunda intenção em eqüinos, e por meio dos resultados obtidos

observou-se que, na fase inflamatória do processo de cicatrização, as feridas

tratadas com calêndula apresentaram bordos menos edemaciados e crostas

serosas, lisas e delgadas, comparado aos demais grupos de tratamento.

Concluiu-se assim que a C. officinalis L. apresentou vantagem na fase

inflamatória do processo de cicatrização.

Menéndez e colaboradores (2007) avaliaram em suas pesquisas o

efeito cicatrizante e o nível de irritabilidade de um creme de C. officinalis L. a

1% aplicados em feridas abertas na pele de ratos para o estudo de

cicatrização, e aplicados nos olhos e na pele de coelhos para avaliação do

índice de irritabilidade. Após análises histopatológicas e clínicas, comprovou-se

que o creme favorece o processo de cicatrização na pele de ratos e

demonstrou não ser irritante na utilização dérmica e oftálmica em coelhos, com

um índice de irritabilidade inexpressivo de 0 a 0,83, respectivamente. Assim,

concluiu-se que os resultados demonstram a possibilidade de uso do creme

como agente fitoterápico tópico

2.2 Aspectos gerais sobre Política, Normatização e Legislação Brasileira

sobre Medicamentos Fitoterápicos

2.2.1 Políticas

Desde a Declaração da Alma Ata em 1978, a Organização Mundial de

Saúde (OMS) tem expressado a sua posição a respeito da necessidade de

valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito sanitário, tendo em conta

que 80% da população mundial utiliza essas plantas ou preparações destas no

que se refere à atenção primária de saúde. Sendo assim, a OMS, mediante a

Resolução (WHA 31.33, 1978) junto aos países membros, reconhece a

importância das plantas medicinais nos cuidados com a saúde e recomenda

que sejam providenciados aspectos como:

• Um inventário e classificação terapêutica, atualizados periodicamente,

de plantas medicinais utilizadas nos diferentes países.

• Critérios científicos e métodos para assegurar a qualidade das

preparações com plantas medicinais e sua eficácia no tratamento de

condições específicas e enfermidades.

• Estandartização internacional e específica de identidade, pureza,

potência e boas práticas de fabricação.

• Métodos para o uso seguro e efetivo de produtos fitoterapêuticos por

diferentes profissionais da saúde.

• Disseminação de centros de investigação nos estados membros.

• Designação de centros de investigação e capacidade para o estudo das

plantas medicinais.

Ainda no sentido da implementação de políticas voltadas à utilização de

plantas na medicina tradicional, em maio de 1987, a 40ª Assembléia Geral da

Organização Mundial de Saúde, através da Resolução (WHA 40.33), reiterou

os aspectos anteriores e recomendou enfaticamente aos estados-membros

"iniciar programas amplos, relativos à identificação, avaliação, preparo, cultivo

e conservação de plantas usadas em medicina tradicional; assegurar o controle

da qualidade das drogas derivadas de medicamentos tradicionais, extraídas de

plantas, pelo uso de técnicas modernas e aplicações de padrões apropriados

de Boas Práticas de Fabricação (BPF)” (MIGUEL; MIGUEL, 2004).

Logo após a fomentação desses novos paradigmas a respeito do uso de

plantas medicinais em todo mundo, no Brasil, surgiam às primeiras mudanças

por meio por meio das Diretrizes e Prioridades de Investigação em Saúde

(Portaria n° 212/81), incluindo as plantas medicina is, e regulamentação da

implantação da Fitoterapia nos serviços de saúde com criação de

procedimentos e rotinas relativas à sua prática nas unidades assistenciais

médicas pela Comissão Nacional Interministerial de Planejamento e

Coordenação (Resolução-RE CIPLAN n° 8/88).

Recentemente, o país aprovou documentos de suma importância que

norteiam aspectos de toda cadeia produtiva dos fitoterápicos, bem como seu

uso como terapêutica oficial, dentre os quais se destacam: a Portaria 971, de

03 de maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e

Complementares (PNPIC) e o Decreto n.º 5.813, de 22 de junho de 2006, que

aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF).

A PNPIC é extremamente oportuna e culmina a partir de esforços de

inúmeros órgãos de representação social e profissionais que atuam por

décadas no setor (MARQUES et al., 2007). No âmbito da Fitoterapia tem por

objetivo garantir à população brasileira o acesso ao uso racional das plantas

medicinais, promovendo o uso da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia

produtiva e a sustentabilidade da indústria nacional. De acordo com a Política,

para tornar disponíveis plantas medicinais e/ou fitoterápicos nas unidades de

saúde, foram estabelecidas as seguintes diretrizes:

• Estabelecimento de políticas de financiamento para o desenvolvimento

de ações voltadas à implantação das plantas medicinais e da fitoterapia

no SUS.

• Incentivo à pesquisa e desenvolvimento de plantas medicinais e

fitoterápicos, priorizando a biodiversidade do país.

• Promoção do uso racional de plantas medicinais e dos fitoterápicos no

SUS.

• Elaboração da Relação de Nacional de Plantas Medicinais e da Relação

Nacional dos Fitoterápicos.

• Garantia do acesso a plantas medicinais e fitoterápicos aos usuários do

SUS.

• Formação e educação permanente dos profissionais de saúde em

plantas medicinais e fitoterapia.

• Cumprimento dos critérios de qualidade, eficácia, eficiência e segurança

no uso.

• Acompanhamento e avaliação da inserção e implementação das plantas

medicinais e fitoterapia no SUS.

A PNPMF estabelece diretrizes e linhas prioritárias para o

desenvolvimento de ações pelos diversos parceiros em torno de objetivos

comuns voltados à garantia do acesso seguro e uso racional de plantas

medicinais e fitoterápicos em nosso país, ao desenvolvimento de tecnologias e

inovações, assim como ao fortalecimento das cadeias e dos arranjos

produtivos, ao uso sustentável da biodiversidade e ao desenvolvimento do

Complexo Produtivo da Saúde (BRASIL, 2006).

Dentre as diretrizes estabelecidas pela PNPMF, é de suma importância

destacar algumas delas como: a necessidade de incentivar a incorporação

racional de novas tecnologias no processo de produção de plantas medicinais

e fitoterápicos e, garantir e promover a segurança, a eficácia e a qualidade no

acesso a plantas medicinais e fitoterápicos.

2.2.2 Normatização e Legislação

A qualidade de um produto terapêutico vegetal concretiza-se no conjunto

de critérios que caracterizam a matéria-prima para o uso ao qual se destina

(CARVALHO et al., 2006). Essa caracterização se estabelece desde a

obtenção da planta medicinal, adequadamente cultivada, colhida e desidratada,

avaliada quanto à sua morfologia e qualidade, até o processamento, por meio

de técnicas como a infusão, maceração, percolação, filtração, concentração e a

secagem, além da caracterização físico-química do insumo farmacêutico

vegetal obtido (tintura, extrato seco e fluido, ou óleo essencial). Portanto, a

qualidade da matéria prima vegetal é a determinante inicial da qualidade do

fitoterápico (FARIAS, 2004).

Todos os fitoterápicos industrializados devem ser registrados na ANVISA

antes de serem comercializados, a fim de garantir que a população tenha

acesso a medicamentos seguros, eficazes e de qualidade comprovada

(CARVALHO et al., 2007). Desta forma, para o desenvolvimento de um

fitoterápico é imprescindível que se atenda todas as exigências da principal

legislação atual que regulamenta seu registro, a RDC n° 48/04 – ANVISA

(BRASIL, 2004).

A legislação RDC 48, de 16 de março de 2004, visa a normatização do

registro de medicamentos fitoterápicos, onde são estabelecidos todos os

requisitos necessários para a sua concessão. As avaliações abrangem desde a

matéria-prima vegetal, derivados da droga vegetal até o produto final.

Dentre os requisitos e parâmetros exigidos pela RDC 48, estão a

necessidade do controle de qualidade, com métodos analíticos que incluam

resultados de prospecção (screening)

fitoquímica ou perfis cromatográficos por

cromatografia em camada delgada, cromatografia líquida de alta eficiência –

CLAE/ cromatografia gasosa – CG, quando cabível, além de comprovação de

segurança de uso, incluindo estudos de toxicidade pré-clínica. Outras

resoluções da mesma data fornecem as referências bibliográficas para

avaliação de segurança e eficácia de fitoterápicos (Resolução-RE n°88/04 –

ANVISA), tratando ainda de detalhes dos estudos de toxicidade (Resolução-RE

n°90/04 – ANVISA) e fornecendo os requisitos necess ários para o processo de

registro, além da Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos (Resolução-RE

n°89/04 – ANVISA), onde as espécies ali registradas possuem condições

definidas como: parte usada, padronização, formas de uso, indicações/ações

terapêuticas, dose, via de administração, posologia e restrição de uso. Assim,

os fitoterápicos derivados das espécies registradas na lista, terão seu registro

na ANVISA facilitado por não haver necessidade de validação de suas

indicações terapêuticas e segurança de uso (BRASIL, 2004).

No controle de qualidade dos fitoterápicos que perpassa pelos derivados

da droga vegetal, excipientes até o produto tecnologicamente acabado, deve-

se utilizar metodologia descrita em farmacopéia ou formulários oficiais

reconhecido pela ANVISA (RDC n° 79/03), ou validar a metodologia analítica

no controle de qualidade obedecendo aos parâmetros especificados para a

validação de métodos analíticos apresentados na RE 899/03 – ANVISA

(NETTO et al., 2006).

Portanto, no contexto da utilização de fitoterápicos, faz-se necessário e

imprescindível a existência de normatização a ser cumprida com a finalidade

de garantir a qualidade destes medicamentos, de forma a possibilitar um

adequado tratamento das doenças, garantindo ao cidadão o cumprimento do

direito a saúde conforme Constituição Federal Brasileira (OLIVEIRA et al.,

2007).

2.3 Principais Técnicas Analíticas utilizadas no Desenvolvimento,

Avaliação e Controle de Qualidade de Fitoterápicos

2.3.1 Cromatografia

Quando os constituintes químicos de uma preparação vegetal são

conhecidos, é realizada a caracterização sobre estes compostos e a

cromatografia qualitativa como a cromatografia em camada delgada (CCD) é

complementada com a determinação quantitativa das substâncias ativas por

meio de CLAE ou CG analítica, obtendo-se assim uma correlação entre

quantidade dos compostos presentes e sua eficácia terapêutica e

farmacológica. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) permite a

realização de análises qualitativas e quantitativas de modo eficaz. Tendo

definidas as condições de análise, o cromatograma forma uma espécie de

desenho característico (perfil cromatográfico ou “fingerprint”) devido aos

diferentes tempos de retenção e intensidades de absorção de seus constituin-

tes, em que a proporção entre os seus componentes deve ser constante

(SHARAPIN, 2000).

Nas últimas três décadas, ocorreu o desenvolvimento de vários

detectores espectrofotométricos que operam em comprimento de onda variável

e houve um aumento na utilização de detectores eletroquímicos, por

fluorescência e por fluorescência induzida por laser, bem como o acoplamento

com espectrômetro de massas. Com eles, tornou-se possível a detecção de

uma faixa mais ampla de compostos e a análise de compostos em baixas

concentrações presentes em amostras complexas, como sangue, urina, solo,

alimentos, petróleo etc (COLLINS et al., 2006).

Com o auxílio de detectores espectrofotométricos, obtém-se o espectro

de absorção correspondente a cada pico do “fingerprint” que pode ser

comparado com espectros presentes em bancos de dados para auxiliar a

identificação. Devem ser utilizados padrões para comparação dos tempos de

retenção e espectros de absorção característicos para cada composto. Em

preparações que não se conhece a totalidade dos constituintes químicos,

compostos dominantes ou marcadores químicos podem ser utilizados para a

sua caracterização, mesmo não estando relacionados com a atividade do

extrato (VOLPATO, 2005).

Para análises qualitativas e quantitativas do perfil químico de extratos de

plantas e ou fitoterápicos, é necessário o uso de várias técnicas analíticas

acopladas ou hifenadas que permitam a separação, identificação e mesmo a

quantificação e padronização dos vários metabólitos e ou marcadores químicos

presentes na planta ou espécie vegetal de origem (ROCHA, 2000). Desta

forma, se faz possível o emprego de fitoterápicos como fonte de recurso

terapêutico seguro e eficaz.

O termo técnicas hifenadas refere-se ao acoplamento entre duas ou

mais técnicas analíticas com o objetivo de obter uma ferramenta analítica mais

eficiente e rápida que as técnicas convencionais. As técnicas analíticas

químicas mais empregadas na análise de produtos à base de plantas

medicinais são a cromatografia e a espectroscopia. As técnicas a serem

acopladas deverão gerar informações diferentes, ou seja, ser ortogonais. Um

exemplo típico é o acoplamento de métodos eficientes de separação como a

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a cromatografia gasosa (GC),

com técnicas espectrométricas como espectrofotômetro de UV-Vis (DAD),

espectrômetro de massas (MS e MS-MS) e ressonância magnética nuclear

(NMR), que fornecem informações adicionais sobre a estrutura química dos

componentes da amostra, funcionando como detectores. Desta forma, a

escolha do detector torna-se fundamental quando o analito se encontra em

nível de traços, necessitando de baixos limites de detecção (RODRIGUES et

al., 2006).

Detectores baseados em absorção de luz ultravioleta (UV),

fluorescência, índice de refração, difração de luz e eletroquímica proporcionam

uma boa detecção e sensibilidade, porém pouco ou nenhuma informação

estrutural. A introdução das técnicas de acoplamento tais como CL/UV

equipada com uma rede de detecção por fotodiodos (CL/UV-DAD) e o

acoplamento com a espectrometria de massa (CL/MS), proporcionou um real

avanço na identificação estrutural, em linha, de produtos naturais. Um exemplo

do esquema da configuração experimental das técnicas acopladas está

ilustrado na Figura 3 (LINDON et al., 1997;

QUEIROZ; HOSTETTMANN, 2006).

Dentre as técnicas analíticas hifenadas utilizadas no presente estudo

para a caracterização e controle de qualidade do derivado da droga vegetal

(tintura), destaca-se: cromatografia líquida acoplada ao detector UV equipada

com uma rede de detecção por fotodiodos arranjo de diodos – CL/UV-DAD. É

uma técnica amplamente utilizada na análise de produtos naturais desde que o

analito apresente grupos cromóforos que propiciem a absorção de luz na

região de UV-visível, identificando compostos conhecidos, através da

comparação do tempo de retenção e espectro UV com o padrão analítico

fornecido por um banco de dados (ROCHA, 2000).

Figura 3: Esquema da configuração experimental utilizada para o acoplamento da

CL/UV/MS e CL/UV/RNM (QUEIROZ; HOSTETTMANN, 2006).

2.3.2 Espectrometria na Região do Infravermelho

Quase todos os compostos contendo ligações covalentes absorvem

várias freqüências da radiação eletromagnética na região do infravermelho no

espectro eletromagnético. A radiação infravermelha na faixa aproximada de

10.000 a 100 cm

-1

quando absorvida, converte-se em energia de vibração

molecular e, como resultado, as ligações químicas sofrem deformações (axiais

e angulares). Este processo é quantizado, porém o espectro vibracional

costuma aparecer como uma série de bandas ao invés de linhas. As linhas se

sobrepõem dando lugar às bandas observadas. São estas bandas de vibração-

rotação, particularmente as que ocorrem entre 4.000 e 400 cm

-1

, a porção de

maior interesse para a investigação das informações estruturais úteis de

moléculas orgânicas (SILVERSTEIN et al., 2006).

2.3.3 Fundamentos da Análise Térmica

A análise térmica é definida como grupo de técnicas por meio das quais

uma propriedade física de uma substância e/ou de seus de seus produtos de

reação é medida em função da temperatura e/ou tempo, enquanto essa

substância é submetida a um programa controlado de temperatura. Os

resultados são fornecidos na forma de curvas, as quais contêm as informações

a respeito da variação do parâmetro medido (WENDLANDT, 1986; LUCAS et

al., 2001; GIRON, 2002; SILVA et al., 2007).

As potenciais aplicações da análise térmica na indústria farmacêutica

são inúmeras em torno da investigação físico-química de produtos

farmacêuticos. Por isso, tem sido extensivamente utilizada como ferramenta

analítica confiável e essencial para o controle de qualidade e desenvolvimento

de novas formulações farmacêuticas, bem como para o estudo da estabilidade,

compatibilidade e das possíveis interações entre fármacos e excipientes e suas

misturas, contribuindo dessa forma para estudos de pré-formulação

(WENDLANDT, 1986; SANTOS et al., 2008). No desenvolvimento de diversos

estudos, é possível a associação de duas ou mais técnicas termoanalíticas,

como por exemplo, a Análise Térmica Diferencial (DTA) ou a (Calorimetria

Exploratória Diferencial) DSC com a Termogravimetria (TG). Em muitas

situações, para a solução de problemas, é necessário associar os resultados

de análise térmica a resultados obtidos por outras técnicas convencionais

físico-químicas e analíticas (MATOS; MACHADO, 2004; SILVA et al., 2007).

Dentre as técnicas termoanáliticas empregadas com maior freqüência na

indústria farmacêutica estão: a Termogravimetria (TG); Análise Térmica

Diferencial (DTA); Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) (ARAÚJO et al.,

2006).

Na Termogravimetria (TG) o parâmetro a ser medido é a massa, por

meio da utilização de uma termobalança que permite medir o ganho ou perda

de massa que ocorre na amostra em função de uma variação controlada de

temperatura. O transdutor ou sensor utilizado na termogravimetria é uma

balança registradora (LUCAS et al., 2001). As curvas obtidas fornecem

informações relativas à composição e estabilidade térmica da amostra, dos

produtos intermediários e do resíduo formado. Dada a natureza dinâmica da

variação de temperatura da amostra para originar curvas TG, fatores

instrumentais [razão de aquecimento, atmosfera (N

, ar ou outros), vazão de

gás, composição do cadinho, geometria do porta amostra e tamanho e forma

do forno] e relacionados às características da amostra (quantidade,

granulometria, forma cristalina, empacotamento, condutividade térmica,

solubilidade dos gases liberados da amostra e calor de reação envolvido)

podem influenciar a natureza, a precisão e a exatidão dos resultados

experimentais (WENDLANDT, 1986; SILVA et al., 2007).

Análise Térmica Diferencial é a técnica pela qual a diferença de

temperatura (∆T) entre a substância e o material de referência (termicamente

estável) é medida em função da temperatura, enquanto ambos são submetidos

a uma programação controlada de temperatura. A temperatura é medida por

termopares conectados aos suportes metálicos das cápsulas de amostra e do

material de referência, ambos contidos no mesmo forno. As variações de

temperatura na amostra são devido às transições entálpicas ou reações

endotérmicas ou exotérmicas. As curvas DTA representam os registros de ∆

em função da temperatura (T) ou do tempo (t), de modo que os eventos são

apresentados na forma de picos. Os picos ascendentes caracterizam os

eventos exotérmicos e os descendentes os endotérmicos (WENDLANDT,

1986; SILVA et al., 2007).

A DTA, a DSC e a TG podem ser utilizadas, por ex., na compreensão

dos mecanismos físico-químicos relativos a processos de decomposição

térmica ou no estudo e desenvolvimento de novos compostos, entre outros

(ANDRADE et al., 2007). As curvas TG e DSC fornecem informações

importante sobre a propriedade física das substâncias como estabilidade,

compatibilidade, cinética, decomposição térmica, fase de transição e

polimorfismo (GIRON, 2002; RODRIGUES et al., 2005; SANTOS et al., 2008).

A DSC é a técnica, na qual se mede a diferença de energia fornecida à

substância e a um material de referência (termicamente estável), em função da

temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos

a uma programação controlada de temperatura (SILVA et al., 2007).

A pequena quantidade de amostra utilizada, a rapidez de resultados, a

limpeza da técnica e a possibilidade de visualização do seu perfil

termoanalítico, fazem dessas técnicas poderosas ferramentas no estudo de

padronização das matérias-primas vegetais e ensaios de pré-formulação para o

desenvolvimento tecnológico de medicamentos fitoterápicos (ARAGÃO et al.,

2002; ARAÚJO et al., 2006; SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES, 2008).

2.4 Formulações de uso tópico

A administração tópica é conhecida como via alternativa da

administração oral de ativos medicamentosos e oferece muitas vantagens

como a ausência do efeito de primeira passagem. A habilidade de um fármaco

presente em formulações tópicas em permear a pele depende da sua

capacidade de liberação do veículo para a pele, e da difusão por esta barreira

para seu sítio de ação. Contudo, são poucos os compostos de interesse

terapêutico que possuem propriedades físico-químicas adequadas para

penetrar rapidamente a epiderme viável e principalmente o estrato córneo

constituído por células ricas em queratina envolvidas em múltiplas camadas

lipídicas que representam à principal barreira a permeação (LIRA et al., 2004).

As preparações dermatológicas, seja medicamento ou cosmético,

consistem na grande maioria em sistemas semi-sólidos. Estas formulações

caracterizam-se por serem sólidas em temperatura ambiente e se tornam

fluidos quando estressados mecanicamente durante sua aplicação na pele.

Entre os sistemas semi-sólidos podemos destacar pomadas, pastas, géis, além

de cremes e loções emulsionadas (ALLEN Jr. et al., 2007).

Os fármacos que são aplicados topicamente, ou seja, sobre a pele,

visam sobretudo uma ação local. Embora essa via também possa ser utilizada

para a liberação sistêmica de fármacos, a absorção percutânea é escassa e

errática com freqüência, ainda que atualmente estejam disponíveis diversos

adesivos (patches) transdérmicos, capazes de liberar o fármaco para

distribuição sistêmica. Os fármacos aplicados na pele para efeito local incluem

agentes anti-sépticos, antifúngicos e antiinflamatórios, assim como emolientes

da pele para fins de proteção (AUTON, 2005).

2.4.1 Géis

São definidos como sistemas semi-sólidos constituídos por dispersões

de pequenas partículas inorgânicas ou de grandes moléculas orgânicas,

encerradas ou interpretadas por um líquido. Geralmente, as substâncias

formadoras de géis são polímeros que, quando dispersos em meio aquoso,

doam viscosidade a preparação. A consistência dos géis decorre do forte

entrelaçamento da fase dispersa que retém e segura o meio de dispersão em

sua rede, existindo, portanto, uma estrutura interna possuidora de esqueleto, a

qual é responsável por sua viscosidade estrutural (AUTON, 2005; ALLEN Jr. et

al., 2007).

Os polímeros são basicamente substâncias de alto peso molecular,

também chamadas de macromoléculas. O tipo de polímero empregado na

formulação do gel pode influenciar o comportamento reológico desta e,

portanto, pode influenciar a estabilidade física do produto, assim como no seu

comportamento sobre a pele (liberação do ativo pelo veículo e formação de

filme na pele) resultando em diferentes graus de aceitação do mesmo pelo

consumidor (CORRÊA et al., 2005).

Os tipos de géis mais utilizados como formas farmacêuticas de uso

tópico são os géis hidrofílicos (hidrossolúvel, hidrogéis), obtidos pela

incorporação de agentes geleificantes à água, ao glicerol ou ao propilenoglicol,

tais como tragacanto, amido, celulose, derivados, polímeros de carboxivinil e

silicatos de magnésio-alumínio, e os géis hidrofóbicos (oleogéis) constituídos

usualmente de parafina líquida com polietileno ou óleos gordurosos com sílica

coloidal ou sabões de alumínio ou zinco. Sem dúvida os géis hidrófilos são

mais utilizados ou mais comuns, sendo relativamente pequena a quantidade de

preparações apresentadas como oleogéis (PRISTA et al., 1990; GENNARO,

2004; FERREIRA; LEITE, 2008).

Os géis hidrofílicos têm sido usados extensivamente em produtos

cosméticos e como base dermatológica, uma vez que apresentam fácil

espalhamento, não são gordurosos e podem veicular princípios ativos

hidrossolúveis e lipossomas (CORRÊA et al., 2005). Partindo do pressuposto

de que o fármaco não se liga ao polímero, tais géis liberam bem o fármaco. Os

poros permitem a difusão relativamente livre de moléculas menores (AUTON,

2005). Desta forma, torna-se um sistema semi-sólido de grande importância

para veiculação de princípios ativos empregados no tratamento das várias

patologias acometidas pela pele.

Contudo, é importante ressaltar que um dos principais problemas que

podem ocorrer com formulações tipo gel é a incompatibilidade entre o polímero

formador do gel e os outros constituintes da fórmula, principalmente

metabólitos do extrato vegetal. Isso acontece geralmente quando se associa

um extrato rico em constituintes que apresenta carga iônica positiva como

alguns derivados de amina quaternária, com um polímero que apresenta carga

iônica negativa, ocorrendo a desestruturação do esqueleto de gel e verificando-

se a fluidificação da fórmula (LEITE, 2008). Portanto, para o desenvolvimento

de géis se faz necessário e importante conhecer as características e

estabilidade desses polímeros, com intuito de promover uma seleção adequada

dos excipientes da formulação.

2.4.2 Hidroxietilcelulose (Natrozol

250)

É um polímero não-iônico estável na faixa de pH 2 a 12, composto por

grupos hidroxietila ligados à cadeia de celulose e também se encontra

disponível em diferentes graus de viscosidade. Hidroxietilcelulose (HEC) é

solúvel tanto em água quente como em água fria, não formando gel sob

aquecimento (AUTON, 2005).

O gel de HEC é uma das bases de celulose de maior interesse para a

veiculação de ativos em dermatologia devido seu caráter não-iônico que

permite sua utilização em um ampla faixa de pH. É muito indicado para a

incorporação de ativos que levam a um abaixamento do pH final da formulação,

como, por exemplo, o ácido glicólico. Embora bem tolerados, pHs extremos

podem causar alterações na viscosidade (FERREIRA, 2002).

2.5 Desenvolvimento de formulações fitoterápicas

Os estágios iniciais de qualquer formulação nova implicam estudos para

coletar informações básicas sobre as características físicas e químicas do

fármaco a ser utilizado em uma forma farmacêutica. Os estudos básicos

compreendem o trabalho de pré-formulação, necessários antes de iniciar uma

formulação (ALLEN Jr. et al., 2007).

Forma farmacêutica é definida como o estado final de apresentação que

os princípios ativos farmacêuticos possuem após uma ou mais operações

farmacêuticas executadas com ou sem a adição de excipientes apropriados, a

fim de facilitar a sua utilização e obter o efeito terapêutico desejado, com

características apropriadas a determinada via de administração (BRASIL, 2006;

FERREIRA; LEITE, 2008). Nesse sentido, a obtenção de formas farmacêuticas

derivadas de matéria-prima vegetal necessita de um planejamento inicial, com

a finalidade de planejar o manejo adequado da matéria-prima vegetal e demais

excipientes de acordo com as especificações dos mesmos, além da

determinação seqüencial das ações de transformação tecnológica e

monitoramento dos pontos e metodologias de controle de qualidade mais

apropriadas segundo as legislações e normatizações vigentes, para o

desenvolvimento de fitoterápicos (TOLEDO et al., 2003; OLIVEIRA et al.,

2007).

No desenvolvimento tecnológico de um produto fitoterápico se fazem

necessários estudos prévios relativos a aspectos botânicos, agronômicos,

fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos, de desenvolvimento de

metodologias analíticas e tecnológicas. Com isso, evidencia-se o caráter

interdisciplinar e multidisciplinar da cadeia produtiva de fitoterápicos

(PETROVICK et al., 1997; TOLEDO et al., 2003; SONAGLIO, et al., 2004).

Contudo, um dos fatores críticos para o desenvolvimento e emprego

clínico dos medicamentos fitoterápicos pela indústria farmacêutica envolve,

especialmente, dificuldades de controle de qualidade e da estabilidade desses

produtos. Por isso, a importância do emprego de técnicas como a

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia em camada

delgada (CCD), espectrometria de massa (MS), ressonância nuclear magnética

(RMN), espectrometria no ultravioleta (UV) espectrometria no infravermelho

(IV) e análise térmica, usadas isoladamente ou em combinação, para

estabelecer critérios analíticos visando controle de qualidade e a padronização

dos medicamentos fitoterápicos (WENDLANDT, 1986; YUNES; CALIXTO,

2001; TOLEDO et al., 2003; SANTOS et al.,2008)).

O desenvolvimento e a correta formulação de uma forma farmacêutica

requerem o conhecimento das características físicas, químicas e biológicas de

todas as substâncias ativas e excipientes utilizados na preparação. Os extratos

vegetais podem ser veiculados, praticamente, a partir de todas as formas

farmacêuticas. Essa facilidade encontrada na veiculação de drogas vegetais

está relacionada ao fato de que é possível encontrar os extratos vegetais nas

formas físicas líquida, semi-sólida e seca (ALLEN Jr. et al., 2007; FERREIRA;

LEITE, 2008).

No caso de fitoterápicos, a escolha apropriada da forma farmacêutica e

da via de administração requer considerações prévias a cerca da eficácia e

segurança do marcador químico ativo presente na planta medicinal ou derivado

intermediário, de modo que, durante a transformação do material vegetal em

um produto tecnicamente elaborado, o fitoterápico, a qualidade seja

assegurada pela preservação da integridade química e farmacológica do(s)

marcador(es) químico(s) da planta, garantindo a constância de sua ação

biológica e a segurança de sua utilização, além de valorizar seu potencial

terapêutico (TOLEDO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2007; FERREIRA; LEITE,

2008).

2.6 Teste de estabilidade preliminar

Segundo a Farmacopéia Americana (USP, 1990) estabilidade é definida

como a amplitude na qual um produto mantém, dentro de limites especificados,

as mesmas propriedades e características que possuía quando de sua

fabricação durante o seu período de armazenamento e uso.

Antes de iniciar os estudos de estabilidade, recomenda-se submeter o

produto ao teste de centrifugação. Sugere-se centrifugar uma amostra a 3.000

rpm durante 30 minutos. O produto deve permanecer estável e qualquer sinal

de instabilidade indica a necessidade de reformulação. Se aprovado nesse

teste, o produto pode ser submetido aos testes de estabilidade (BRASIL, 2004).

O estudo de estabilidade preliminar consiste na realização do teste na

fase inicial do desenvolvimento do produto, utilizando-se diferentes

formulações de laboratório e com duração reduzida. Empregam-se condições

extremas de temperatura (estresse térmico) com o objetivo de acelerar

possíveis reações entre seus componentes e o surgimento de sinais de

instabilidade que devem ser observados e analisados conforme as

características específicas de cada tipo de produto. Devido às condições em

que é conduzido, este estudo não tem a finalidade de estimar a vida útil do

produto, mas sim de auxiliar na triagem das formulações (BRASIL, 2004; BABY

et al., 2008; ISAAC et al., 2008).

2.7 Estrutura da pele e vias de permeação percutânea

A função primordial da pele é a proteção contra processos de

desidratação e microorganismos agressores. Desta forma, ela se faz mais ou

menos permeável às substâncias químicas e permite a passagem de

medicamentos em certas condições, podendo ser considerada uma interface

terapêutica. E mesmo que a pele represente uma barreira física à penetração

de substâncias, existem várias formas farmacêuticas de uso tópico que sofrem

absorção, inclusive as de uso sistêmico (LIRA, 2003).

A pele é composta por três camadas: a epiderme, a derme e a

hipoderme (Figura 4). A epiderme é a camada externa da pele e está

subdividida em cinco camadas ou estratos, que são denominados de dentro

para fora da pele de estrato germinativo ou basal, estrato espinhoso, estrato

granuloso, estrato lúcido e estrato córneo (ANSEL et al., 2000). A derme é o

tecido conjuntivo em que se apóia a epiderme e une a pele ao tecido celular

subcutâneo ou hipoderme (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Caracteriza-se

como acelular, mas é rica em vasos sanguíneos, vasos linfáticos e terminações

nervosas (FOLDVARI, 2000). Já a hipoderme funciona como amortecedor

mecânico e barreira térmica, que sintetiza e estoca rapidamente substâncias

energéticas prontamente disponíveis (AUTON, 2005).

O estrato córneo é a barreira que limita a velocidade e restringe os

movimentos de entrada e saída de substâncias (LACHMAN, 2001). Sendo

assim, a permeação percutânea de fármacos pelo estrato córneo até as

camadas mais profundas da pele ocorre por difusão através de três vias

diferentes, as quais são descritas e ilustradas na Figura 5:

• Via transcelular por difusão através das células – (através dos

corneócitos e matriz lipídica intercelular);

• Via intercelular por difusão entre as células – (por entre os

corneócitos e pela matriz lipídica);

• Via transanexal por difusão através dos folículos pilosos,

glândulas sudoríparas e sebáceas e anexos pilosebáceos

(ANSEL et al., 2000).

Figura 4:

Estrutura da pele (http://www.afh.bio.br/sentidos/sentidos10.asp), acessado

em 12/2008.

Figura 5: Esquema representativo das vias de penetração do fármaco através

do estrato córneo via transcelular e via intercelular (MARTINS; VEIGA, 2002).

Se a pele estiver intacta, a principal via de penetração dos fármacos são

as camadas epidérmicas e não os folículos pilosos ou ductos das glândulas,

pois sua área superficial é bastante pequena em comparação com a da pele

que não contém nenhum desses elementos anatômicos. Portanto, a absorção

percutânea dos medicamentos resulta da penetração direta do fármaco através

do estrato córneo, passando os tecidos epidérmicos mais profundos e atingindo

a derme que é vascularizada e onde o fármaco torna-se disponível para

absorção (ANSEL et al., 2000).

2.8 Estudos de permeação percutânea

Durante a fase de desenvolvimento de produtos dermatológicos, é

através dos estudos in vitro de liberação e absorção cutânea que se faz

possível selecionar os excipientes mais apropriados às formas farmacêuticas

de liberação dérmica, com intuito de proporcionar uma liberação adequada dos

princípios ativos, contribuindo dessa forma para o alcance do efeito terapêutico

desejado.

(ANTONIO, 2007; SATO et al., 2007). A habilidade de um fármaco

presente em formulações tópicas em permear a pele depende da sua

capacidade de liberação do veículo para a pele, e da difusão por esta barreira

para seu sítio de ação (LIRA et al., 2004).

Os estudos de permeação cutânea in vitro são realizados de modo que o

fármaco seja liberado da formulação onde está veiculado, e se difunda através

de uma membrana para uma solução receptora, a qual deve garantir condições

termodinâmicas favoráveis ao fármaco (LOPEZ et al., 1998). Desta forma,

esses estudos estabelecem-se como ferramentas valiosas e determinantes na

avaliação do comportamento de formulações semi-sólidas de uso tópico, diante

das inúmeras variáveis que comprometem o processo de desenvolvimento.

Através deles se obtém dados que possibilitam um maior entendimento dos

fatos ocorridos, desde a aplicação na pele, liberação do fármaco da forma

farmacêutica, retenção e absorção cutânea. (NOKHODCHI et al., 2003;

ANTONIO, 2007).

Os sistemas de difusão celular são empregados in vitro para quantificar

a velocidade de liberação dos princípios ativos das preparações tópicas.

Nesses sistemas, membranas da pele ou sintéticas podem ser empregadas

como barreira ao fluxo do fármaco e do veículo para simular um sistema in

vivo. Os estudos de penetração in vitro utilizando pele humana são limitados

devido á dificuldade de obtenção do material, armazenagem, custos e a

variabilidade da permeação. A pele retirada de animais também pode variar em

qualidade e permeabilidade (ANSEL et al., 2000).

Atualmente, percebe-se um grande interesse na utilização de mudas de

pele de cobra como modelo de biomembrana alternativo no estudo de

penetração e permeação de fármacos por pesquisadores, os quais têm

avaliado a aplicabilidade do método com respostas satisfatórias. Está é

composta por estrato córneo puro, não vivo, sem pêlos e semelhante à pele

humana, fornecendo barreira similar ao humano, e pode ser obtida

abundantemente sem a morte do animal, uma vez que a troca de pele (ou

ecdise) ocorre regularmente no animal adulto, em geral a cada 2 a 3 meses. A

muda de pele de cobra apresenta armazenamento facilitado e não apresenta

tendência à contaminação e degradação microbiológica, por não conter tecidos

vivos (ITOH et al., 1990; ITOH et al., 1990; ANSEL et al., 2000; WIDLER,

SIGRIST, GAFNER, 2002; BABY et al., 2008).

Baby e colaboradores (2008) avaliaram a penetração e a retenção

cutânea in vitro da rutina em uma emulsão cosmética que tinha como promotor

de penetração cutânea o propilenoglicol, empregando-se para isso, células de

difusão vertical com muda de pele de cobra Crotalus durissus como modelo de

biomembrana alternativo, e água destilada e álcool etílico absoluto 99,5% (1:1),

como fluido receptor. A emulsão não promoveu a penetração cutânea da rutina

através da muda de pele de C. durissus, contudo, foi verificado a retenção

cutânea da rutina no modelo de biomembrana.

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Realizar estudos preliminares de planejamento/pré-formulação de uma

formulação fitoterápica semi-sólida contendo tintura de Calendula officinalis L.,

visando o controle de qualidade das etapas de desenvolvimento tecnológico de

um fitoterápico.

3.2 Específicos

Caracterizar propriedades físicas e físico-químicas da matéria-prima

vegetal (pó).

Obter e caracterizar propriedades químicas, físicas e físico-químicas do

produto intermediário (tintura).

Validar uma metodologia para a quantificação de rutina na tintura de

Calendula officinalis L.

Obter formulação semi-sólida que proporcione a incorporação da tintura

de Calendula officinalis L. de forma estável.

Caracterizar o marcador químico rutina por espectrometria na região do

infravermelho (IV) e obter seu perfil termoanalítico por Termogravimetria (TG)

e Análise Térmica Diferencial (DTA)

Avaliar os excipientes da formulação e suas misturas binárias com

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. por espectrometria na região do

IV, TG e DTA.

Realizar teste de estabilidade preliminar da formulação

Realizar um ensaio preliminar de permeação da formulação fitoterápica

tópica do tipo gel contendo tintura de Calendula officinalis L. após difusão em

modelo de biomembrana alternativo (muda de pele ou estrato córneo de

cobra).

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

4.1.1 Material vegetal

Para o estudo foi utilizado o pó das flores da Calendula officinalis L.,

adquirido da Empresa Ely Martins, sediada em Ribeirão Preto, São Paulo. Os

dados descritos a seguir, são resultados da análise do controle de qualidade

conforme o laudo emitido pela empresa:

- Nome científico: Calendula officinalis. L

- Identificação botânica: Calendula officinalis. L

- Família: Asteraceae/Compositae

- Procedência: Egito

- Parte utilizada: Flores

- Método de Secagem: Secador com aquecimento

- Descontaminação: Radiação Gama

- Cor: Castanho-amarelada

- Odor: Fraco

- Sabor: levemente amargo

- Umidade: 11,70%

- Cinzas totais: 7,32%

- Flavonóides Totais (Hiperosídeos): 0,45%

- Granulometria: Pó fino

- Data de Fabricação: 08/2005

- Data de Validade: 08/2008

- Lote: CALE 06/02

4.1.2. Equipamentos

Estufa termoestatizada Quimis; Forno mufla; Agitador Eletromagnético

para peneiras Bertel; Balança analítica modelo BK 500; Analisador térmico

Shimadz (DTA 50; TGA 50); Potenciômetro Meter; Evaporador rotativo Buchi

Switzerland modelo R-3000; Bomba de vácuo modelo TE-058; Banho-maria

com termoestato Fisatom; Banho de ultra-som Maxiclen modelo1450; Câmara

de luz ultravioleta (254 e 365nm); Cromatógrafo líquido de alta eficiência

Merck Hitachi LaChrom

D-7000; Espectrofotômetro Nicolet, modelo Projete

460 com transformador de Fourrier (FTIR); Aparelho UV Meter modelo SP-

2000 UV.

4.1.3 Reagentes e soluções

Ácido sulfúrico P.A., ácido clorídrico P.A., álcool etílico absoluto P.A.,

metanol P.A., éter etílico P.A., lugol, fucsina básica 1%, azul de Astra,

glutaraldeído 2,5%, fosfato de sódio 0,1M, hidroxietilmetacrilato, solução de

hidróxido de sódio (FeCl

) 1N e 2N, solução de hidróxido de amônio (NH

OH)

10 %, solução alcoólica de cloreto férrico 1%. Solução de nitroprussianato de

sódio, solução aquosa de nihidrina a 1%, solução de ácido clorídrico (HCl) 5%,

solução de HCl a 1N e 6N, solução de NH

OH 6N, solução alcoólica de

cloridrato de hidroxilamina 10%, solução metanólica de hidróxido de potássio

(KOH) 10 %, solução de anidrido acético, raspas de magnésio, água

oxigenada (H

concentrada, reativo de Pascová, reativo de Fehling A e B,

reativo de Bouchard, reativo de Dragendorff, reativo de Mayer, reativo de

Bertrand e reativo de Kede e ácido fosfórico (Vetec, Brasil).

4.2. MÉTODOS

Todas as análises descritas foram realizadas nos Laboratórios P&D

Farmacotécnico, de Fitoquímica e Bromatologia da Faculdade de Farmácia-

UFPA. As análises espectroscópicas e técnicas termoanalíticas foram

realizadas na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP.

4.2.1 Caracterização física e físico-química do pó das flores de Calendula

officinalis L.

4.2.1.1. Determinação da distribuição granulométrica do pó das flores de

Calendula officinalis L.:

Na granulometria utilizou-se um agitador eletromagnético para peneiras.

Cerca de 10 g do pó foram submetidos a uma série de tamizes de abertura de

malha (2,00 e 1,40 mm, 710, 355, 250, 180, 125 µm) agitados por 30 mim

(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).

4.2.1.2 Determinação de perda por dessecação

O teor de umidade baseou-se na perda por dessecação, onde cerca de

2 g do pó de Calendula officinalis L. foram pesados em pesa-filtros,

previamente dessecados por 30 min em estufa a 105° C, utilizando-se balança

analítica. As amostras foram submetidas a aquecimento em estufa a 105˚ C

durante duas horas, seguidos de resfriamento em dessecador e pesagem. A

operação foi repedida até obtenção de pesos constantes. (FARMACOPÉIA

BRASILEIRA, 1988).

Os resultados de três determinações foram avaliados em termos de

porcentagem ponderal sobre a quantidade da amostra, utilizando a equação 1:

% perda = Pu – Ps x 100

Onde:

Pa = peso da amostra (g)

Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação (g)

Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação (g)

4.2.1.3 Determinação do teor de cinzas totais

Para estabelecer-se a quantidade de substâncias residuais não-

voláteis realizou-se a determinação de cinzas totais. Cerca de 2 g do pó de

Calendula officinalis. L foram pesados em cadinhos de porcelana, previamente

calcinados em forno mufla, resfriados e pesados. As amostras nos cadinhos

foram incineradas em mufla a 450 °C por duas horas, resfriadas em

dessecador sob vácuo e pesadas. A operação foi repetida até a obtenção de

pesos constantes (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).

4.2.1.4 Termogravimetria (TG) do pó das flores de Calendula officinalis

Para obtenção da curva termogravimétrica (TG) do pó de C. officinalis.

L, utilizou-se cerca de 5 mg do pó, transferiu-o para um cadinho de platina.

Logo após, o pó foi submetido a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 °C,

com auxílio de um analisador térmico Shimadzu (modelo: TGA 50), sob

atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento de

5 °C/min. Os cálculos de perda de massa foram feito s com auxílio do programa

TA-50WS da Shimadzu.

4.2.1.5 Análise Térmica Diferencial (DTA) do pó das flores de Calendula

officinalis L.

Para obtenção da curva térmica diferencial (DTA) do pó de C. officinalis.

L, utilizou-se cerca de 5 mg do pó, e as transferiu para um cadinho de platina.

Logo após, o pó foi submetido a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 °C,

com auxílio de um analisador térmico Shimadzu (modelo: DTA 50), sob

atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento de 5

°C/min.

Os cálculos da diferença de temperatura (∆T) foram feitos com auxílio do

programa TA-50WS da

Shimadzu

4.2.2 Obtenção e caracterização química, física e físico-química da

tintura de flores de Calendula officinalis L.

4.2.2.1 Obtenção da tintura de flores de Calendula officinalis L.

Na obtenção da tintura em estudo, utilizou-se o método de extração por

maceração descrita em Farmacopéia Brasileira II (1959). Assim, 400 g do pó

das flores de calêndula permaneceram em maceração durante 10 dias em

2000 g de etanol 70 ºGL num percolador hermeticamente fechado ao abrigo da

luz e temperatura ambiente (25°C). A solução foi ag itada freqüentemente, e

após o término da extração, efetuou-se a filtração do macerado ou tintura.

4.2.2.2 Determinação da densidade aparente da tintura de flores de

Calendula officinalis. L.

A análise da densidade aparente da tintura foi realizada em triplicata

segundo a metodologia proposta pela Farmacopéia Brasileira IV (1988). Um

picnômetro com capacidade para 5 mL, previamente tarado, foi preenchido

com o líquido padrão (água recém-destilada e fervida) e pesado. Em seguida, o

picnômetro foi rinsado com a amostra (tintura de calêndula) e pesado. A

relação entre o peso do padrão e da amostra, em um volume fixo, forneceu o

valor da densidade relativa da tintura de calêndula.

4.2.2.3 Determinação do pH da tintura de flores de Calendula officinalis L.

A determinação do pH foi realizada em potenciômetro previamente

calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 e os resultados correspondem à

média de três determinações independentes (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV,

1988).

4.2.2.4 Determinação do resíduo seco da tintura de flores de Calendula

officinalis L.

Para uma cápsula de fundo plano de cerca de 50 mm de diâmetro e

cerca de 30 mm de altura, pesou-se rapidamente 2 g da tintura. As amostras,

em triplicata, foram evaporadas à secura em banho de água e secadas na

estufa a 100-105°C durante três horas. Em seguida, foram arrefecidas em

dessecador em presença gel de sílica anidro R e pesadas. Os resultados

foram expressos em percentagem m/m (FARMACOPÉIA PORTUGUESA,

2002).

4.2.2.5 Obtenção do extrato seco da tintura de Calendula officinalis L.

Adicionou-se 300 ml da tintura de calêndula num balão de fundo

redondo acoplado a um evaporador rotativo para concentração da tintura

evaporando-se o líquido extrator (etanol). A retirada do extrato do balão

volumétrico foi feita com metanol e clorofórmio, auxiliada por um banho de

ultra-som e transferido para uma placa de Petri devidamente tarada e pesada.

Logo após, obteve-se o peso do extrato seco de calêndula

4.2.2.6 Prospecção química da tintura de flores de Calendula officinalis

Na análise fitoquímica da tintura, investigou-se qualitativamente a

presença de metabólitos secundários em triplicata, na concentração de 5

mg/ml, segundo Barbosa (2001). Os metabólitos secundários analisados estão

descritos a seguir.

Saponinas espumídicas

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 ml de água

destilada. Em seguida, diluídos para 15 mL e agitado vigorosamente durante 2

min em tubo fechado. A camada de espuma permanecendo estável por mais

de 30 min, indica resultado considerado positivo.

Açúcares redutores

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de

água destilada e filtrados. Adicionou-se 2 mL do reativo de Fehling A e 2 mL do

reativo de Fehling B. Aqueceu-se em banho-maria em ebulição durante 5

minutos. Se houver o aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, o

resultado é considerado positivo.

Polissacarídeos

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de água

destilada e filtrados. Adicionaram-se duas gotas de lugol. O aparecimento de

coloração azul indica resultado considerado positivo.

Proteínas e Aminoácidos

Foram dissolvidos 15 mg do extrato seco de calêndula em 3 ml de água

destilada e filtrada. Adicionou-se 0,5 ml de solução aquosa de ninidrina a 0,1%

e aqueceu-se até ebulição. O aparecimento de coloração violeta persistente

indica resultado positivo.

Fenóis e Taninos

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de água

destilada e filtrados. Adicionaram-se duas gotas de solução alcoólica de FeCl

a 1%. Qualquer mudança na coloração ou formação de precipitado é indicativo

de reação positiva, quando comparado com o teste em branco. Coloração

inicial entre o azul e o vermelho, é indicativo da presença de fenóis, quando o

teste em branco for negativo; precipitado escuro de tonalidade azul, indica

presença de taninos pirogálicos, e verde, presença de taninos catéquicos.

Flavonóides

Geral:

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de

metanol e filtrados. Adicionaram-se cinco gotas de HCl concentrado e raspas

de magnésio. O surgimento de uma coloração rósea na solução indica reação

positiva.

Por classes:

Antocianidinas, antocianinas, flavonas, flavononóis, xantonas, chalconas,

auronas e flavanonóis

Foram dissolvidos 35 mg do extrato seco em 20 mL de água destilada e

filtrados. Transferiu-se para três tubos de ensaio 3 mL da solução (para cada

tubo). Acidulou-se um a pH 3,0 alcalinizou-se os dois restantes a pH 8.5 e 11,0;

- A presença de coloração vermelha em pH 3,0 lilás em pH 8,5 e azul púrpura

em pH 11,0 indica resultado positivo para antocianidinas e antocianinas;

- A presença de coloração amarela em pH 11,0 indica resultado positivo para

flavonas, flavonóis, xantonas;

- A presença de coloração vermelha em pH 3,0 e vermelho púrpura em pH 11,0

indica resultado positivo para chalconas, auronas;

- A presença de coloração vermelho-laranja em pH, 11,0 indica resultado

positivo para flavanonóis.

b) Leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas:

Foram dissolvidos 10 mg do extrato seco em 5 mL de água destilada e

filtrados. Transferiu-se para dois tubos de ensaio 3 mL da solução (para cada

tubo). Acidulou-se um a pH 1 – 3,0 com HCl e alcalinizou-se os outros a pH

11,0 com solução de NaOH. Aqueceu-se com auxílio de uma lâmpada de

álcool durante 2 – 3 minutos e observou-se se houve modificação na coloração,

comparando-se com os tubos utilizados no teste anterior (para antocianidinas,

antocianinas, flavonas, flavononóis, xantonas, chalconas, auronas e

flavanonóis).

- A presença de coloração vermelho em pH ácido indica resultado positivo para

Leucoantocianidinas;

- A presença de coloração pardo - amarelada em pH ácido indica resultado

positivo para catequinas (taninos catéquicos);

- A presença de coloração vermelho - alaranjado em pH alcalino indica

resultado positivo para flavanonas.

c) Flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas:

Transferiu-se para um tubo de ensaio 3 mL da solução extrativa usada

no teste anterior e acrescentou-se alguns miligramas de magnésio em raspas,

e 0,5 mL de HCl concentrado. Aguardou-se o término da efervescência e

observou-se, por comparação, a mudança na coloração em relação aos tubos

acidificados dos testes anteriores. O aparecimento ou intensificação da cor

vermelha é indicativo da presença dos metabólitos acima citados.

Alcalóides

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de

solução de HCl a 5% e filtrados. Separaram-se quatro porções de 1mL em

placa de toque e adicionou-se 3 gotas dos reativos de Bouchard, Dragendorff,

Mayer e Bertrand. Precipitação ou turvação em pelo menos um tubo é

indicativo de resultado positivo.

Purinas

Numa cápsula de porcelana, juntou-se 5 mg do extrato seco de

calêndula, três gotas de solução de HCl 6N e duas gotas de H

concentrado

(30 %) e evaporou-se em banho-maria até a formação de um resíduo corado

de vermelho. Juntou-se três gotas de solução de NH

OH 6N. O surgimento de

coloração violeta indica reação positiva.

Glicosídios cardíacos

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de

metanol e filtrados. Separou-se em duas porções de 2 mL cada e adicionou-se

gotas do reativo de Keede. O aparecimento de coloração azul ou violeta indica

reação positiva.

Catequinas

Foram dissolvidos 15 mg do extrato seco de calêndula em 3 mL de

metanol e filtrados. Juntou-se 1 mL de solução aquosa de vanilina a 1% e 1 mL

de HCl concentrado. O surgimento de uma coloração vermelha intensa indica

reação positiva.

Derivados Benzaquinonas, Naftoquinonas e Fenantraquinonas

Foram dissolvidos 15 mg do extrato seco de calêndula em 3 ml de

metanol e filtrados. Adicionaram-se duas gotas de Na

a 25%, duas gotas

de formaldeido a 4% e duas gotas de o-dinitrobenzeno a 5 %. Aqueceu a

mistura em banho-maria. A coloração violeta indica reação positiva.

Lactonas serquiterpênicas

Foram dissolvidos 15 mg do extrato seco de calêndula em 3 mL de

metanol e filtrados. Adicionaram-se doze gotas de solução alcoólica de

cloridrato de hidroxilamina a 10% e duas gotas de solução metanólica de KOH

a 10 %. Aqueceu-se suavemente em banho-maria durante dois minutos. Em

seguida, resfriou-se e acidulou-se com solução de HCl a 1N e adicionou-se

uma gota de FeCl

1%. O surgimento de uma coloração violeta indica reação

positiva.

Esteróides e Triterpenóides:

Foram dissolvidos 50 mg do extrato seco de calêndula em 10 mL de

clorofórmio e filtrados sobre carvão ativado. Transferiu-se o filtrado para um

tubo de ensaio completamente seco e adicionou-se 1 mL de anidrido acético e

agitou-se suavemente. Em seguida, adicionou-se cuidadosamente, três gotas

de H

concentrado e agitou-se novamente. O rápido desenvolvimento de

cores, que vão do azul evanescente ao verde persistente, indicam resultado

positivo.

Azulenos

Foram dissolvidos 10 mg do extrato seco de calêndula em 2 ml de

clorofórmio e filtrados. Concentrou-se até 0,5 em banho-maria e adicionou 2,5

ml da solução p-dimetilaminobenzaldeído. Aqueceu em banho-maria por cinco

minutos e, após esfriar em um funil de decantação, agitou com 10 ml de éter de

petróleo. Após as duas fases ficarem distintas, observou-se a fase aquosa. Se

houver presença de proazulenos, a fase aquosa adquire coloração azul, porém,

quando estes estão em pequena quantidade, a coloração observada é

esverdeada.

Carotenóides

Foram dissolvidos 15 mg do extrato seco de calêndula em 2 ml de

clorofórmio e filtrados. Juntou-se 2 ml de clorofómio saturado com tricloreto de

antimônio. O aparecimento da coloração azul indica resultado positivo.

Depsídios e Depsidonas

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de éter

etílico e filtrados. Evaporou-se todo o éter em banho-maria e juntou-se ao

resíduo 3 mL de metanol. Após agitação, adicionaram-se três gotas de solução

de FeCl

a 1%. O aparecimento de coloração verde, azul ou cinza, indica

reação positiva.

Derivados da Cumarina

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de éter

etílico e concentrados em banho-maria até 0,5 mL. Em papel filtro, aplicaram-

se gotas da solução etérea, de modo que se formaram duas manchas de

aproximadamente 1 cm de diâmetro cada. A uma destas, adicionou-se uma

gota de solução de NaOH 1N. Cobriu-se a metade da mancha com papel

escuro, e expôs-se a outra metade a luz ultravioleta. Descobriu-se e

compararam-se as manchas. O aparecimento de fluorescência azul na parte

exposta da mancha indica reação positiva.

Antraquinonas

Foram dissolvidos 25 mg do extrato seco de calêndula em 5 mL de

tolueno e filtrados. Adicionou-se 2 mL de solução de NH

OH a 10 % e agitou-

se suavemente. O aparecimento de coloração rósea, vermelha ou violeta na

fase aquosa, indica reação positiva.

4.2.2.7 Determinação do perfil cromatográfico da tintura de flores de

Calendula officinalis L. por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Para a separação das substâncias e determinação do perfil

cromatográfico da tintura de calêndula in natura por CCD, foi utilizada a

técnica

de cromatografia por adsorção em placa de sílica (COLLINS et al., 2006).

Os marcadores químicos utilizados como padrão foram a rutina e

quercetina (Sigma

) na concentração de 1mg/mL. A validação do método

consistiu na comparação do fator de retenção (Rf) e da cor desenvolvida pela

zona cromatográfica apresentada pela amostra analisada e padrões comerciais

concomitantemente, conforme dados descritos em literatura (WAGNER;

BLADT, 2001).

Desta forma, a tintura e os padrões foram aplicados em placas pré-fabricadas

de sílica-gel de fase normal (Merck) previamente ativadas em estufa a 105 °C

com auxilio de micropipetas nas quantidades exatas de 60 µL e 20 µL

respectivamente. A forma de desenvolvimento adotada foi a ascendente,

utilizando como fase móvel dois sistemas, sendo estes, eluente I: acetato de

etila; ácido fórmico; ácido acético glacial; água (100:11:11:26) e eluente II: n-

butanol; ácido acético; água (4:1:5). As placas foram colocadas em cubas

cromatográficas previamente saturadas com a fase móvel. Após o

desenvolvimento cromatográfico, as placas foram secas e reveladas com o

reagente Natural Products – polyethyleniglycol (NP/PEG 4000) específico para

visualização de polifenóis por radiação ultravioleta em comprimento de onda de

365 nm (WAGNER; BLADT, 2001). Logo após, as placas cromatográficas

foram fotografadas e o valor do fator de retenção (Rf) de cada zona

cromatográfica foi calculado.

4.2.2.8 Obtenção do extrato liofilizado a partir da tintura de flores de

Calendula officinalis L.

A tintura de calêndula foi concentrada em evaporador rotativo, em

seguida congelada e liofilizada (liofilizador Edwards - Edwards do Brasil). O

produto obtido foi devidamente acondicionado.

4.2.2.9 Espectroscopia na região do infravermelho do extrato liofilizado

de Calendula officinalis L.

A espectroscopia de absorção na região do infravermelho do extrato

liofilizado de C. officinalis L. foi realizada em um espectrofotômetro com

transformador de Fourier (FTIR, Nicolet modelo Projete 460) utilizando discos

de KBr na região espectral de 4000 a 500 cm

-1

4.2.2.10 Termogravimetria (TG) do extrato liofilizado de Calendula

officinalis L.

Para obtenção da curva termogravimétrica (TG) do extrato liofilizado de

C. officinalis. L., utilizou-se uma massa em torno de 5 mg da amostra que foi

transferida para um cadinho de platina, logo após, foi submetida a uma faixa

de temperatura entre 25 e 600 °C, com auxílio de um analisador térmico

Shimadzu (modelo:TGA 50), sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00

mL/min) e razão de aquecimento de 5 °C/min.

Os cálculos de perda de massa

foram feitos com auxílio do programa TA-50WS da

Shimadzu

4.2.2.11 Análise Térmica Diferencial (DTA) do extrato liofilizado de

Calendula officinalis L.

Para obtenção da curva térmica diferencial (DTA) do extrato liofilizado,

utilizou-se uma massa em torno de 5 mg da amostra, a qual foi transferida para

um cadinho de platina, logo após, foi submetida a uma faixa de temperatura

entre 25 e 600 °C, com auxílio de um analisador tér mico Shimadzu (modelo:

DTA 50), sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de

aquecimento de 5 °C/min.

Os cálculos da diferença de temperatura (∆T) foram feitos

com auxílio do programa TA-50WS da

Shimadzu

4.3 Análise quantitativa da rutina na tintura de flores de Calendula

officinalis L. por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção

por Arranjo de Diodos (CLAE/UV−DAD)

4.3.1 Validação do método

A validação do método foi realizada com objetivo de garantir a

confiabilidade e segurança dos resultados obtidos (ANVISA, 2003). A detecção

e quantificação da rutina na tintura de Calendula officinalis L. foi realizada por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector UV em arranjo de diodo

(CLAE/DAD), segundo Bilia et al. (2001), com adaptações.

4.3.1.1 Condições cromatográficas

As condições cromatográficas apropriadas para o objetivo do trabalho

foram obtidas utilizando-se soluções padrão de rutina e quercetina (Sigma

Foram otimizadas a vazão, a constituição da fase móvel e o comprimento de

onda de detecção foi adquirido dentro de um intervalo de 190 nm a 450 nm.

Assim, este teste teve o propósito de obter as primeiras informações sobre as

condições cromatográficas, a fim de estabelecer condições ideais de trabalho.

4.3.1.2 Amostras e preparação das soluções padrões

Para esta análise utilizaram-se amostras de tintura in natura de C.

officinalis L. de um mesmo lote e soluções padrão de rutina. As soluções foram

preparadas por dissolução da rutina em volumes apropriados de metanol, a fim

de obter concentrações de 1,2 (solução estoque), 0,96, 0,72, 0,6, 0,48, 0,2 e

0,1 mg/mL . A amostra e as soluções-padrão foram filtradas sobre membrana

de Milipore

0,45 µm e injetadas com volume de 50 µL.

4.3.1.3 Seletividade

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto

em presença de outros componentes, tais como impurezas, produtos de

degradação e componentes da matriz (ANVISA, 2003). A seletividade do

método foi avaliada através da identificação do flavonóide rutina na amostra

por comparação entre os tempos de retenção dos picos da tintura e o tempo de

retenção do padrão de referência, bem como pela comparação do espectro no

UV do composto investigado na tintura com o espectro do padrão de referência

fornecido pela biblioteca do equipamento (BILIA et al., 2001; RIBANI et al.,

2004).

4.3.1.4 Linearidade

A linearidade do método foi avaliada empregando-se concentrações

crescentes da solução padrão de rutina de 0,1, 0,2, 0,48, 0,6, 0,72, 0,96 e

1,2mg/mL. Cada concentração foi injetada em quintuplicata no cromatógrafo,

em volume de 50 µL. As médias das áreas de cada concentração de rutina

foram plotadas no eixo das ordenadas e as respectivas concentrações nas

abscissas. A equação da reta foi obtida pelo método dos mínimos quadrados e

expressa por y= a + bx, onde o coeficiente angular (a) é a inclinação da reta em

relação aos eixos e o coeficiente linear (b) é a interseção da reta com o eixo y.

Já a faixa linear de trabalho foi determinada por intermédio do coeficiente de

correlação de Pearson (r) (FDA, 2001; ANVISA, 2003).

4.3.1.5 Intervalo

É a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um

método analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e depende

da aplicação pretendida do método (ANVISA, 2003). Desta forma, a faixa de

intervalo empregada (0,1 a 0,72 mg/mL) para análise quantitativa, foi

estabelecida de acordo com a média das áreas encontrada para o pico de

rutina na tintura de calêndula (alcance de 80% a 120%).

4.3.1.6 Curva de calibração

A curva de calibração para a rutina foi construída através da faixa de

intervalo encontrado para rutina descrita no item 4.3.2.3. Sendo assim, as

médias das áreas de cada concentração de rutina foram plotadas no eixo das

ordenadas e as respectivas concentrações nas abscissas. A regressão linear

foi realizada para obtenção da equação da reta (y= a + bx) e o coeficiente de

Pearson (r) para avaliar a correlação entre a concentração e a relação das

áreas (FDA, 2001; ANVISA, 2003).

4.3.1.7 Repetibilidade (precisão intra-corrida)

A repetibilidade do método foi verificada através da injeção em

sextuplicata

da tintura in natura de calêndula no cromatógrafo, em um único

dia. Logo após, foi calculado o valor do coeficiente de variação das injeções

para expressar a precisão do método (FDA, 2001; ANVISA, 2003).

4.3.2 Análise estatística

Os dados foram analisados no programa de estatística Bioestat 5.0 e

EXCEL®.

4.4 Planejamento/pré-formulação preliminar da formulação fitoterápica

semi-sólida contendo tintura de Calendula officinalis L.

4.4.1 Obtenção da formulação

Foi preparada uma base galênica geleificante de característica

hidrofílica empregando-se como polímero o hidroxietilcelulose (Natrozol

250)

comumente empregado na farmacotécnica de formas farmacêuticas semi-

sólidas, na qual foi incorporada a tintura de C. officinalis L. na concentração

de 10%.

Para o preparo da base, foram pesados separadamente o

hidroxietilcelulose (HEC), propilenoglicol, metilparabeno e água destilada

q.s.p. O conservante metilparabeno foi diluído em água q.s.p e essa mistura

foi levada a uma placa aquecedora sob temperatura de 55,0 ± 2,0 ºC. Logo

após, acrescentou-se o hidroxietilcelulose umedecido em propilenoglicol,

agitando continuamente com bastão de vidro até completa dissolução desses

componentes. Obtida a dissolução, a mistura foi retirada da placa e deixada

em repouso à temperatura ambiente por 2 horas. Todos os componentes

empregados na formulação estão descritos na Tabela I.

Tabela I. Componentes e seus respectivos percentuais utilizados para o

desenvolvimento do gel com tintura de Calendula officinalis L.

Componentes

Concentração (%)

Hidroxietilcelulose 1,5

Propilenoglicol 5

Metilparabeno 0,2

Água destilada q.s.p 100

4.4.2 Caracterização físico-química do marcador químico rutina por

Espectrometria na região do infravermelho (IV), Termogravimetria (TG) e

Análise Térmica Diferencial (DTA)

4.4.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho da rutina

A espectroscopia de absorção na região do infravermelho da rutina foi

realizada em um espectrofotômetro com transformador de Fourier (FTIR,

Nicolet modelo Projete 460) utilizando discos de KBr na região espectral de

4000 a 500 cm

-1

4.4.2.2 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) da

rutina

Para obtenção da curvas TG e DTA da rutina, utilizou-se uma massa em

torno de 5 mg amostra e as transferiu para um cadinho de platina, logo após,

foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 °C, com auxílio

de um analisador térmico de Shimadzu (modelo: DTA 50), sob atmosfera

dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento de 5 °C/min. Os

cálculos

de perda de massa e

da diferença de temperatura (∆T) foram feitos

com auxílio do programa TA-50WS da Shimadzu.

4.4.3 Ensaios preliminares de avaliação dos excipientes da formulação e suas

misturas binárias com extrato liofilizado de Calendula officinalis L. por

Espectrometria na Região do Infravermelho (IV), Termogravimetria (TG) e

Análise Térmica Diferencial (DTA)

4.4.3.1 Preparo das misturas binárias

As mistura binária foram preparadas por misturas físicas dos

excipientes da formulação com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

nas seguintes concentrações:

Tintura de Calendula officinalis L.

• Hidroetilcelulose/ extrato liofilizado de Calendula officinalis L (1:1

p/p)

• Propilenoglicol/ extrato liofilizado de Calendula officinalis L (2:1 p/p)

• Metilparabeno/ extrato liofilizado de Calendula officinalis L (1:1 p/p)

4.4.3.2 Espectroscopia na Região do Infravermelho dos excipientes da

formulação e de suas misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula

officinalis L.

A espectroscopia de absorção na região do infravermelho dos

excipientes da formulação e de suas misturas binárias com o extrato liofilizado,

foi realizada em um espectrofotômetro com transformador de Fourier (FTIR,

Nicolet modelo Projete 460) utilizando discos de KBr na região espectral de

4000 a 500 cm

-1

4.4.3.3 Termogravimetria (TG) dos excipientes da formulação e de suas

misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

Para obtenção da curva termogravimétrica (TG) dos excipientes e de

suas misturas binárias com o extrato liofilizado, utilizou-se uma massa em

torno de 5 mg de cada amostra e as transferiu para um cadinho de platina,

logo após, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 °C,

com auxílio de um analisador térmico Shimadzu (modelo:TGA 50), sob

atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento de

5 °C/min.

Os cálculos de perda de massa foram

feitos com auxílio do

programa TA-50WS da Shimadzu.

4.4.3.4 Análise Térmica Diferencial (DTA) dos excipientes da formulação e

de suas misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

Para obtenção da curva térmica diferencial (DTA) dos excipientes e de

suas misturas binárias com o extrato liofilizado utilizou-se uma massa em torno

de 5 mg de cada amostra e as transferiu para um cadinho de platina, logo

após, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 a 600 °C, com

auxílio de um analisador térmico Shimadzu (modelo: DTA 50), sob atmosfera

dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento de 5 °C/min. Os

cálculos da diferença de temperatura (∆T) foram feitos com auxílio do programa

TA-50WS da Shimadzu.

4.4.4 Teste de estabilidade preliminar da formulação

O estudo de estabilidade preliminar consiste na realização do teste na

fase inicial do desenvolvimento do produto, empregando-se condições

extremas de temperatura (estresse térmico), com o objetivo de acelerar

possíveis reações entre seus componentes e o surgimento de sinais de

instabilidade que devem ser observados e analisados conforme as

características específicas de cada tipo de produto. (BRASIL, 2004; BABY et

al., 2008; ISAAC et al., 2008). Após 24 h do preparo da formulação, foi

submetida à avaliação preliminar da estabilidade, empregando os testes de

centrifugação e do estresse térmico.

4.4.4.1 Teste de centrifugação

Foram pesados 5,0 g do gel de calêndula em tubos de centrífuga.

Procedeu-se ao teste da centrifugação, em réplicas de três, nas seguintes

condições experimentais: temperatura ambiente (25,0 ± 2,0 ºC); velocidade de

rotação de 3.000 rpm e tempo de teste de 30 minutos (BRASIL, 2004).

4.4.4.2 Teste do estresse térmico

Para realização desse teste, utilizaram-se réplicas de 12 amostras do gel

de calêndula (peso: 5 g) do mesmo lote, as quais foram acondicionadas em

vidros neutros. Sendo assim, seis amostras foram submetidas ao aquecimento

em estufa à temperatura de 45 ± 2

C em 6 ciclos avaliados no intervalo de 24

h, enquanto que as outras seis amostras permaneceram à temperatura

ambiente (25,0 ± 2,0

C) para serem utilizadas como controle, condições onde

são esperadas as menores alterações. Logo após o término de cada ciclo, as

amostras foram avaliadas pelos seguintes parâmetros: análise macroscópica e

determinação do valor de pH. Os resultados obtidos nos tempos t

a t

do ciclo

da estufa foram comparados aos resultados das amostras de referência

(BRASIL, 2004).

4.4.4.3 Determinação do valor pH

Foi determinado nas dispersões das amostras em água recém-destilada

e na proporção 1:10 em réplicas de três e à temperatura ambiente (25,0 ± 2,0

C). As leituras de cada amostra foram realizadas em triplicata.

4.4.5 Ensaio de permeação do gel contendo tintura de Calendula officinalis L.

após difusão em modelo de biomembrana alternativo (muda de pele ou estrato

córneo de cobra)

4.4.5.1 Demonstração e Identificação do sistema de difusão

O sistema é formado por dois compartimentos 1 e 2 (Figura 6), onde o

compartimento 1 é denominado de câmara doadora (CD) e o 2 de câmara

receptora (CR). A mostra em estudo é acondicionada em CD e a solução

receptora em CR. Entre as duas câmaras a membrana é inserida e fixada por

uma borracha, acessório 4 Figura 6. A membrana fica de um lado em contato

com a amostra em estudo e, do outro, com a solução receptora. Desta forma,

todo material liberado pelo veículo e permeado pela membrana é quantificado

na fase receptora. O modelo da célula com suas medidas e o esquema de

montagem do sistema completo de difusão estão ilustrados nas Figuras 7 e 8,

respectivamente. (ARAÚJO, 2003; SILVA JÚNIOR, 2006; SILVA JÚNIOR;

PEREIRA, 2008)

Figura 7: Diagrama esquemático do modelo da célula de difusão com suas

respectivas medidas.

Figura 6:

Modelo da célula de difusão. a) célula fechada, onde há orifícios de entrada

(inferior) e saída (lateral) da solução receptora; b) célula aberta, 1- parte superior da

célula (CD), onde foram colocadas as amostras, 2 – parte inferior da célula (CR), que

continha parte da solução receptora, 3 – pinos de vedação da célula e 4 – borracha de

vedação da membrana (ARAUJO, 2003).

5cm

1,7cm

1,5cm

0,3cm

5.6cm

7cm

5cm

reservatório

membrana

Sentido do fluxo

4.4.5.2 Determinação de flavonóides totais expressos em rutina após

permeação cutânea in vitro em modelo de biomembrana alternativo

Empregou-se a espectrofotometria na região da radiação UV a 350 nm,

para a quantificação de flavonóides totais após permeação cutânea in vitro em

modelo de biomembrana alternativo. Como substância química de referência

foi utilizada a rutina padrão e como solvente e branco de leitura

espectrofotométrica a solução de tampão fosfato 0,2 M pH 7,4 (ROLIM, et al.,

2005).

4.4.5.2.1 Solução estoque do padrão de rutina e série de diluições

Foram pesados exatamente 10 mg de rutina e transferidos para um

balão volumétrico de 50 ml seguido de adição de solução tampão e etanol 70

ºGL na proporção de 1:1 para promover a dissolução total, e a concentração

obtida foi de 200 µg/mL. Diluições seriadas foram preparadas com tampão

fosfato para as concentrações de 2,0, 4,0, 6,0 8,0, 10,0, 20,0, 30,0, 40,0 e 60,0

µg/mL.

4.4.5.2.2 Curva analítica e linearidade

A linearidade do método analítico para a determinação de flavonóides

totais expressos em rutina após a penetração e retenção cutânea in vitro foi

avaliada por meio da curva analítica e tratamento estatístico dos dados,

envolvendo diluições seriadas da rutina padrão de referência. Foram

preparadas soluções de concentrações: 2,0, 4,0, 6,0 8,0, 10,0, 20,0, 30,0, 40,0

e 60,0 µg/mL, submetidas à leitura espectrofotométrica a 350 nm, em triplicata.

O cálculo da equação da reta da curva analítica foi realizado pela regressão

linear por meio do método dos mínimos quadrados. Para cada concentração foi

Figura 8

: Esquema de montagem do sistema de difusão a partir da célula de difusão. 1- banho

termostatizado; 2- recipiente receptor; 3- célula de difusão; 4- bomba peristáltica.

calculado a média das absorbâncias. A regressão linear foi realizada para

obtenção da equação da reta (y= a + bx) e o coeficiente de Pearson (r) para

avaliar a correlação entre a concentração e a relação das áreas (FDA, 2001;

ANVISA, 2003).

4.4.5.3 Preparo das células de difusão para realização do ensaio de

permeação cutânea in vitro em modelo de biomembrana alternativo

As mudas de pele íntegras de cobra de Boa constrictor, vulgarmente

conhecida como jibóia, foram cedidas pelo Instituto Paraense Museu Emílio

Goeldi. Como membranas de difusão, foram utilizados cortes da porção ventral

das mudas de pele de Boa constrictor, previamente hidratadas por 12 h em

água destilada.

Conforme esquema do processo de difusão (Figura 8) a amostra do gel

contendo tintura de C. officinalis L. (3 g) foi colocada no compartimento doador

(CD), em seguida, cortes ventrais de muda de pele de Boa constrictor foram

dispostos nas 3 células entre as câmaras doadora (CD) e receptora (CR),

fixadas por uma borracha, e diretamente em contato com amostras do gel

avaliado. Na câmara receptora, foi utilizado tampão fosfato 0,2 M pH 7,4

mantido a 37 ˚C por água circulante e sob agitação de 200 rpm com auxílio de

barras magnéticas. A área de exposição da membrana foi de 19,625 cm

, o

volume no compartimento receptor foi de 50 mL, e o experimento foi realizado

em triplicata. Durante o experimento, 5 mL da solução receptora foram

removidos (nos tempos; 15’, 30’, 60’, 120’, 240’, 360’, 420’, 480’) com auxílio de

uma pipeta volumétrica e reposto imediatamente com solução tampão. No final

do experimento o material coletado na solução receptora foi analisado em

comprimento de onda de 350 nm através do espectrofotômetro (SILVA

JÚNIOR, 2006; SILVA JÚNIOR; PEREIRA, 2008).

5. RESULTADOS

5.1 Caracterização química, física e físico-química do pó das flores de

Calendula officinalis L.

5.1.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó das flores de C.

officinalis L.

A análise granulométrica do material vegetal moído é um parâmetro

importante a ser estabelecido, pois representa uma influência direta sobre a

eficiência no processo extrativo. Após a tamização do pó da droga vegetal,

constatou-se que as partículas passaram em sua totalidade pelo tamis de

malha 710 µm e menos de 40% passaram pelo tamis de malha 250 µm,

caracterizando-o como pó moderadamente grosso de acordo com a

Farmacopéia Brasileira (1988), conforme na Figura 9.

Figura 9: Determinação da distribuição granulométrica do pó de Calendula officinalis

5.1.2 Determinação de perda por dessecação e do teor de cinzas totais

Os resultados obtidos para a perda por dessecação e teor de cinzas

totais do pó de C. officinalis L. estão apresentados na tabela II abaixo.

Tabela II: Perda por dessecação e teor de cinzas totais do pó de Calendula officinalis

Testes ŋ Determinações (%)

Perda por dessecação 3 11,42 ± 0,2

Teor de cinzas totais 3 12,77 ± 0,43

5.1.3 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) do pó

das flores de Calendula officinalis L.

As curvas termogravimétrica (TG) e termodiferencial (DTA) do pó de

calêndula estão apresentadas nas Figuras 10 e 11, respectivamente. Os

resultados referentes ao comportamento térmico deste material vegetal estão

descritos na Tabela III, que apresentaram consideráveis números de etapas

de perdas de massa.

Figura 10

Curvas TG-DTG correspondentes ao pó das flores de Calendula

officinalis L.

Tabela III: Dados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA) do pó de

Calendula officinalis L

5.2 Caracterização química, física e físico-química da tintura de flores de

Calendula officinalis L.

5.2.1 Determinação da densidade aparente, pH e resíduo seco da tintura

de flores de Calendula officinalis L.

Os resultados obtidos para densidade aparente, pH e resíduo seco da

tintura de flores de C. officinalis L. estão descritos na tabela IV.

Amo

tra

Etapas

termodecom

posição

Temperat

de decomp.

inicial/ °

°°

°C

Temperat

de decomp.

final / °

°°

°C

Massa

perdida

(%)

Res

duo

(%)

Variação de

entalpia

(J/g)

Pó de

Calendula

officinalis

116

175

278

396

116

175

278

396

600

7,96

3,35

23,78

13,26

30,16

-395,71

10,94

42,83

307,24

1070

Figura 11

Curva DTA correspondente ao pó das flores de Calendula officinalis L.

Tabela IV: densidade aparente, pH e resíduo seco da tintura de flores de Calendula

officinalis L.

Testes ŋ Determinações

Densidade aparente 3 0, 89067 g/cm

pH 3 4,79

Resíduo seco 3 9,6

5.2.2 Prospecção química da tintura de flores de Calendula officinalis L.

As análises fitoquímicas preliminares visaram estabelecer quais

metabólitos secundários estavam presentes no material vegetal intermediário

através de reações de identificações (Tabela V). Está etapa foi de

fundamental importância para o controle de qualidade da matéria prima

vegetal e caracterização do perfil fitoquímico da tintura hidroalcoólica 70 % de

C. officinalis L.

Tabela V: Prospecção química da tintura de flores de Calendula officinalis L.

Classe Positivo Negativo

Indicativo

Saponinas x

Açúcares redutores x

Polissacarídeos x

Proteínas e Aminoácidos x

Fenóis e Taninos

Indicativo p/ fenóis

Flavonóides geral x

Flavonas / Flavonóis e Xantonas x

Leucoantocianidinas / Catequinas e

Flavanonas

Flavonóis / Flavanonas / Flavanonóis e

Xantonas

Alcalóides x

Purinas x

Glicosídeos cardíacos x

Catequinas x

Derivados Benzaquinonas /

Naftoquinonas e Fenantraquinonas

Sequiterpenolactonas e outras lactonas x

Esteróides e Triperpenóides x

Azulenos x

Carotenóides x

Depsídios e Depsidonas x

Derivados de Cumarina x

Antraquinona x

5.2.3 Determinação do perfil cromatográfico da tintura de flores de

Calendula officinalis L. por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

O perfil cromatográfico obtido para tintura de C. officinalis L. foi

desenvolvido no eluente I, constituído de

acetato de etila; ácido fórmico; ácido

acético glacial; água (100:11:11:26), apresentando uma zona cromatográfica

fluorescente amarela Rf 0,4 idêntico ao valores de Rf do padrão rutina (0,4), e

três zonas cromatográficas fluorescentes azuis atribuídas aos ácidos

clorogênico, caféico e isoclorogênico com Rfs (0,5 - 0,75 - 0,85),

respectivamente (Figura 12). Contudo, a tintura de calêndula não apresentou

zona cromatográfica referente ao padrão de quercetina.

=365nm

Figura 12

Análise por CCD da tintura de Calendula officinalis L. Eluente I: acetato de

etila; ácido fórmico; ácido acético glacial; água (100:11:11:26); revelador: NP/PEG 4000.

Observação sob luz UV 365 nm; P- padrão de rutina; T- tintura de calêndula.

5.2.4 Espectroscopia na Região do Infravermelho do extrato liofilizado de

Calendula officinalis L.

O espectro de absorção obtido para o extrato liofilizado de calêndula

está apresentado na Figura 13, e as interpretações referentes às bandas de

absorção de relevância para o estudo estão exemplificadas na Tabela VI.

Bandas

de absorção (cm

)

Vibrações características

Figura 13

Espectro na região do infravermelho, correspondente ao extrato

liofilizado das flores de Calendula officinalis L.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Transmitância (%)

Numero de onda (cm

-1

)

3408

1628

1406

2922

1460

1053

Tabela VI

: Bandas de absorção na região do infravermelho, correspondente ao extrato

liofilizado das flores de Calendula officinalis L.

5.2.5 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) do

extrato liofilizado de Calendula officinalis L.

As curvas termogravimétrica (TG) e termodiferencial (DTA) do extrato

liofilizado de calêndula estão apresentadas nas Figuras 14 e 15,

respectivamente. Os resultados referentes ao seu comportamento térmico

estão descritos na Tabela VII.

3408 O−H

2922 C−H

1628 C = O

1460 C = C

1406 C = C

1048 C−H

Figura 14

: Curvas TG-DTG correspondentes ao extrato liofilizado das flores de

Calendula officinalis L.

5.3 Análise quantitativa da rutina na tintura de flores de Calendula

officinalis L. por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção

por Arranjo de Diodos (CLAE/UV−DAD)

5.3.1 Validação do método

5.3.1.1 Condições cromatográficas

Amostra

Nº de

estágios

decomp.

Temperat

de decomp.

inicial/ °

°°

°C

Temperat

de decomp.

final/ °

°°

°C

Massa

perdida

(%)

Res

duo

(%)

Variação

temperatur

a (J/g)

Extrato

liofilizado

Calendula

officinalis

116

318

409

116

318

409

600

5,83

41,63

10,16

12,01

30,35

-138,36

752,0

122,16

540,08

Figura 15

: Curva DTA correspondentes ao extrato liofilizado das flores de

Calendula officinalis L.

Tabela V

Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA) do extrato

liofilizado de Calendula officinalis L

As condições cromatográficas que foram utilizadas para validação da

metodologia analítica estão apresentadas nas Tabelas VIII e IX.

Tabela VIII: Parâmetro cromatográfico utilizados para validação da metodologia

analtica.

PARÂMETRO

CONDIÇÃO

Detecção UV (λ = 250 nm)

Fluxo 1,3 mL/min

Coluna

Agilent LiChrospher 100

, RP18

com 5 µm e 250 x 3,0 mm.

Fase móvel Gradiente linear de acetonitrila e água

ultra-pura pH 3,0 ajustado com H

a 50%.

Volume de injeção 50 µL

Temperatura do forno 26 ºC (+ ou - 1ºC).

Tabela IX: Gradiente de eluição utilizado na análise da tintura de Calendula officinalis

L. por

CLAE/UV−DAD

Tempo (mim) % H

O % CH

CN Fluxo (mL/mim)

0,0 88,0 12,0 1,3

10,0 82,0 18,0 1,3

15,0 82,0 18,0 1,3

30,0 55,0 45,0 1,3

35,0 0,0 100,0 1,3

42,0 0,0 100,0 1,3

5.3.1.2 Seletividade

Nestas condições cromatográficas, os tempos de retenção dos picos

referentes à rutina padrão, in natura e adicionada na tintura de Calendula

officinalis L. foram de 11,33, 12,16 e 12,16 min, respectivamente. Estes, estão

apresentados nos cromatogramas da Figura 16. Para análise qualitativa da

quercetina na tintura de C. officinalis L. foi realizada a comparação dos

cromatogramas apresentados na Figura 17, o que possibilitou detectar a

ausência do pico referente à quercetina. Na tabela X podem ser observados a

média ( ) e desvio padrão (dp) dos tempos de retenção

rutina padrão e in

natura na tintura.

Absorbâ

ncia (mAU)

250 nm

Rutina

250 nm

Figura 16

Análise qualitativa por CLAE/UV−DAD da tintura de Calendula

officinalis L.: Cromatogramas (A) padrão de rutina, (B) tintura de calêndula in

natura, (C) tintura de calêndula com padrão rutina.

250 nm

Absorbância (mAU)

250 nm

Tabela X: Média dos tempos de retenção da rutina padrão e in natura na tintura.

5.3.1.3 Linearidade

A linearidade do método, juntamente com a equação da reta e o

coeficiente de correlação de Pearson (r) para a rutina, está expressa na Figura

18 e as áreas obtidas frente às diversas concentrações apresentada na Tabela

XI.

RUTINA

TEMPO DE RETENÇÃO

(X ± dp)

Padrão 6 10,71± 0,22

In natura

6 11± 0,56

Figura 17

Análise quantitativa por CLAE/UV-DAD da tintura de Calendula officinalis

L.: Cromatogramas (D) padrão de quercetina (24,36 min), (E) tintura in natura, (F)

tintura de calêndula com padrão quercetina (23,49 min).

Tabela XI

: Linearidade da rutina.

Rutina

mg/mL

n Relação das áreas

1,2 5 16.785.632

0,96 5 13.422.159

0,72 5 9.942.998

0,6 5 8.246.671,2

0,48 5 6.743.901,4

0,2 5 2.115.954,75

0,1 5 1.059.595

n= número de determinações

5.3.1.4 Intervalo

Como a área da rutina na tintura teve uma média de 6.174.118, o

intervalo estabelecido foi de 0,1 a 0,72 mg/mL.

5.3.1.5 Curva de calibração

Figura 18: representação gráfica da linearidade da rutina.

A curva analítica, com a respectiva equação da reta e o coeficiente de

correlação de Pearson (r) para a rutina está expressa na Figura 19 e as áreas

obtidas frente às diversas concentrações apresentada na Tabela XII.

Tabela XII

: Curva de calibração da rutina.

Rutina

µg/mL

n Relação das áreas

0,72

5 16.785.632

0,6 5

8.246.671,2

0,48 5

6.743.901,4

0,2 5

2.115.954,75

0,1 5

1.059.595

n= número de determinações

5.3.1.6 Repetibilidade (precisão intra-corrida)

O valor do coeficiente de variação intra-corrida do método

cromatográfico selecionado, calculado conforme o descrito no item 4.3.1.7 foi

de 9,05%.

Figura 19: representação gráfica da curva de calibração da rutina.

r = 0,999

Y= -549738.8603 + 14694197.4530X

5.4 Planejamento/pré-formulação preliminar da formulação fitoterápica

semi-sólida contendo tintura de Calendula officinalis L.

5.4.1 Caracterização físico-química do marcado químico rutina por

Espectrometria na Região do Infravermelho (IV)

Termogravimetria (TG) e

Análise Térmica Diferencial (DTA)

5.4.1.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho da rutina

O espectro de absorção obtido para a rutina está apresentado na Figura

20 e as interpretações referentes às bandas de absorção correspondentes a

sua molécula estão exemplificadas na Tabela XIII.

Tabela XIII: Bandas de absorção na região do infravermelho, correspondente a rutina.

3426

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

100

110

Transmitância (%)

Nùmero de onda (cm

-1

)

1654

1601

1503

1452

1296

802,8

1054

724,6

Figura 20: Espectro na região do infravermelho, correspondente a rutina.

5.4.1.2 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) do

marcador químico rutina

As curvas termogravimétrica (TG) e termodiferencial (DTA) obtidas para

o marcador químico rutina estão representadas nas Figuras 21 e 22,

respectivamente. Os resultados fornecidos pelo estudo do comportamento

térmico por TG, calculados em massa perdida, e DTA calculados em variação

da temperatura da rutina, estão descritos na Tabela XIV.

Bandas

de absorção (cm

)

Vibrações característ

cas

3426 O−H

1654 C = O

1601 C = C

1503 C = C

1452 C = C

1296 = C−O− C

1054 C−H

802,8 C−H

724,6 C−H

Figura 21

Curva TG correspondente ao marcador químico rutina.

Tabela XIV: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao marcador químico rutina.

5.4.2 Ensaios preliminares de avaliação dos excipientes da formulação e suas

misturas binárias com extrato liofilizado de Calendula officinalis L. por

Espectrometria na Região do Infravermelho (IV), Termogravimetria (TG),

Análise Térmica Diferencial (DTA)

Amo

tra

Etapas

termodecom

posição

Temperat

de decomp.

inicial/ °

°°

°C

Tempera

de decomp.

final / °

°°

°C

Massa

perdida

(%)

Res

duo

(%)

Variação de

temperatura

(J/g)

Rutina

145

304

145

304

600

7,99

24,72

26,58

40,69

-928,81

291,65

3000

Figura 22

Curva DTA correspondente ao marcador químico rutina.

5.4.2.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho dos excipientes da

formulação e de suas misturas binárias com o extrato liofilizado de Calendula

officinalis L.

Nas Figuras 23 estão os espectros obtidos na região do infravermelho

para o hidroxietilcelulose, extrato liofilizado de C. officinalis L. e mistura

binária de hidroxietilcelulose/extrato liofilizado. As interpretações das bandas

correspondentes ao hidroxietilcelulose e mistura binária

(hidroxietilcelulose/extrato liofilizado) estão descritas na Tabela XV.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Extrato liofilizado

Hidroxietilcelulose

Mistura binària

Transmitância (u. a.)

Numero de onda (cm

-1

)

Figura 23:

Espectro na região do infravermelho, correspondente ao hidroxietilcelulose,

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de hidroxietilcelulose/extrato

liofilizado (1:1 p/p).

Tabela XV: Bandas de absorção na região do infravermelho, correspondente ao

hidroxietilcelulose e mistura binária (hidroxietilcelulose/extrato liofilizado).

Na Figura 24 estão os espectros obtidos na região do infravermelho

para o propilenoglicol, extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura

binária de propilenoglicol/extrato liofilizado. As interpretações das bandas

correspondentes ao propilenoglicol e mistura binária (propilenoglicol/extrato

liofilizado) estão descritas na Tabela XVI.

Hidroxietilcelulose

Bandas de absorção (cm

-1

)

Vibrações características

3423 O−H

2929 C−H

1629 C = O

1460 C = C

1063 C = C

1048 C−H

Mistura binária

Bandas de absorção (cm

-1

)

Vibrações características

3423 O−H

2929 C−H

1629 C = O

1460 C = C

1063 C−H

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Extrato Liofilizado

Propilenoglicol

Mistura binària

Transmitância (u. a.)

Nùmero de onda (cm

-1

)

Tabela XVI: Bandas de absorção na região do infravermelho, correspondente ao

propilenoglicol e mistura binária (propilenoglicol/extrato liofilizado).

Propilenoglicol

Bandas de absorção (cm

-1

)

Vibrações características

3408 O−H

2922 C−H

1628 C = O

1460 C = C

1406 C = C

1048 C−H

Mistura binária

Bandas de absorção (cm

-1

)

Vibrações características

3346 O−H

2928 C−H

Figura 24

Espectro na região do infravermelho, correspondente ao propilenoglicol,

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de

propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1 p/p)

Na Figura 25 estão os espectros obtidos na região do infravermelho

para o metilparabeno, extrato liofilizado de C. officinalis L. e mistura binária de

metilparabeno/extrato liofilizado. As interpretações das bandas

correspondentes ao metilparabeno e mistura binária (metilparabeno/extrato

liofilizado) estão descritas na Tabela XVII.

1628 C = O

1462 C = C

1052 C−H

Extrato liofilizado

Metilparabeno

Mistura binària

Transmitância (u. a.)

Metilparabeno

Bandas de absorção (cm

-1

)

Vibrações características

3408 O−H

2922 C−H

1628 C = O

1460 C = C

1406 C = C

1048 C−H

Mistura binária

Bandas de absorção (cm

-1

)

Vibrações características

3290 O−H

2950 C−H

1682 C = O

1602 C = C

1504 C = C

1286 C−H

Figura 25

Espectro na região do infravermelho, correspondentes ao metilparabeno,

extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato

liofilizado (1:1 p/p).

Tabela X

Bandas de absorção na região do infravermelho, correspondente ao

metilparabeno e mistura binária (metilparabeno/extrato liofilizado).

5.4.2.2 Termogravimetria (TG) e Análise Térmica Diferencial (DTA) dos

excipientes da formulação e suas misturas binárias com extrato liofilizado de

Calendula officinalis L.

As curvas TG e DTA do hidroxietilcelulose, extrato liofilizado e mistura

binária de hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p) estão superpostas nos

gráficos das Figuras 26 e 27, respectivamente. Os resultados referentes aos

seus percentuais de perda de massa e variação de temperatura estão descritos

na Tabela XVIII.

Extrato liofilizado

_ Mistura binária

_Hidroxietilcelulose

Figura 26

Curvas TG correspondentes a hidroxietilcelulose, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Tabela XVIII: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes a hidroxietilcelulose, extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e

mistura binária de hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1 p/p).

Amostra

Etapa

termodeco

mposição

Temper

ra de

decomp.

inicial/ °

°°

°C

Temp

atura

decom

p. final/

°°

°C

Massa

perdida (%)

Res

o (%)

Variação

temperatu

ra (J/g)

Extrato

liofilizado

116

318

409

116

318

409

600

5,83

41,63

10,16

12,01

30,35

-138,36

752,0

122,16

540,08

Hidroxieti

lcelulose

(HEC)

600

5,5

73,17

21,33 -426

9750

Mistura

binária

(HEC x

Ext.liof.)

110

420

110

420

600

10,1

54,5

6,76

28,64

-363,63

1640

153,74

_Extrato liofilizado

_ Mistura binária

_Hidroxietilcelulose

Figura 27

Curvas DTA correspondentes ao hidroxietilcelulose, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de hidroxietilcelulose/extrato liofilizado (1:1

p/p).

As curvas TG e DTA do propilenoglicol, extrato liofilizado e mistura

binária de propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1 p/p) estão superpostas nos

gráficos das Figuras 28 e 29, respectivamente. Os resultados referentes aos

seus percentuais de perda de massa e variação de temperatura estão descritos

na Tabela XIX.

Figura 28

Curvas TG correspondentes ao propilenoglicol, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1 p/p).

Extrato liofilizado

_ Mistura binária

_Propilenoglicol

_Extrato liofilizado

_ Mistura binária

_Propilenoglicol

Figura 29

Curvas DTA correspondentes ao propilenoglicol, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1

p/p).

Tabela XIX: Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao propilenoglicol, extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e

mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado (2:1 p/p).

As curvas TG e DTA do metilparabeno, extrato liofilizado e mistura

binária de metilparabeno/extrato liofilizado (1:1 p/p) estão superpostas nos

gráficos das Figuras 30 e 31, respectivamente. Os resultados referentes aos

seus percentuais de perda de massa e variação de temperatura, estão

descritos na Tabela XX.

Amostra

Etapa

termodecom

posição

Temperat

a de

decomp.

inicial/ °

°°

°C

Temp

atura

decomp

. final/

°°

°C

Massa

perdida (%)

Res

o (%)

Variação

temperatu

ra (J/g)

Extrato

liofilizado

116

318

409

116

318

409

600

5,83

41,63

10,16

12,01

30,35

-138,36

752,0

122,16

540,08

Propilenogli

col

1 25 140 99,05 0,95 421,72

Mistura

binária

(propilenogli

col x

Ext.liof.)

188

600

73,49

18,33

8,17

-363,63

1640

153,74

Figura 30

Curvas TG correspondentes ao metilparabeno, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de metilparabeno/extrato liofilizado (2:1 p/p).

_Extrato liofilizado

_ Mistura binária

_Metilparabeno

_Extrato liofilizado

_ Mistura binária

_Metil

parabeno

Figura 31

Curvas DTA correspondentes ao metilparabeno, extrato liofilizado de

Calendula officinalis L. e mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado (1:1

p/p).

5.4.3. Teste de estabilidade preliminar da formulação

5.4.3.1 Teste de centrifugação

Após o gel ter sido submetido à força centrípeta para acelerar possíveis

processos de instabilidade, observou-se a não ocorrência de desestruturação

da cadeia polimérica do gel, ou seja, a formulação foi aprovada no teste de

centrifugação.

5.4.3.2 Teste do estresse térmico

Durante a realização dos ciclos em estufa e temperatura ambiente,

foram verificadas as seguintes características organolépticas: aspecto, cor e

odor (BRASIL, 2004; LIMA et al., 2008). Após 24 h do preparo da formulação,

observou-se, por análise macroscópica, que o gel apresentou aspecto de gel

Amostra

Etapa

termodecom

posição

Temperat

a de

decomp.

inicial/ °

°°

°C

Temp

tura de

decomp.

final/ °

°°

°C

Massa

perdida (%)

Res

duo

(%)

Variação de

entalpia

(J/g)

Extrato

liofilizado

116

318

409

116

318

409

600

5,83

41,63

10,16

12,01

30,35

-138,36

752,0

122,16

540,08

Metilparab

eno

1 25 600 98,73 1,27 4060

Mistura

binária

(Metilparab

enp x

Ext.liof)

132

452

132

452

600

1,9

6,5

70,98

4,77

15,85

-140,13

-54,09

3620

-73,39

Tabela X

Resultados termogravimétricos (TG) e termodiferenciais (DTA),

correspondentes ao metilparabeno, extrato liofilizado de Calendula officinalis L. e mistura

binária de metilparabeno/extrato liofilizado (1:1 p/p)

100

macroscopicamente sem alterações físicas, de cor amarelo escuro e odor

característico da tintura de calêndula (Figura 32). Essas características foram

consideradas como padrão para comparação com as amostras submetidas aos

ciclos em estufa (45 ± 2

C). Portanto, após a análise macroscópica de cada

amostra ao término dos ciclos, não se observou quaisquer características

organolépticas diferentes das características apresentadas pela amostra

padrão.

Os valores de pH obtidos por potenciometria direta em dispersão aquosa

das amostras de gel em estufa (45 ± 2

C) e amostras padrões à temperatura

ambiente (25 ± 2

C), estão representados graficamente na Figura 33. Os

valores dos coeficientes de variação da amostra em estufa e amostras (padrão)

foram de 2,2% e 0,99%, respectivamente.

Figura 32:

Amostra do gel com tintura de Calendula officinalis L. a 10%.

101

5.4.3.3 Ensaio de permeação do gel contendo tintura de Calendula officinalis

L. após difusão em modelo de biomembrana alternativo (muda de pele ou

estrato córneo de cobra)

O perfil de permeação dos flavonóides totais expresso em rutina

realizado conforme item 4.4.5, está apresentado graficamente em função da

concentração permeada vs. tempo (Figura 34).

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

T0 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo 4 ciclo 5 ciclo 6 ciclo

Ciclos de Estabilidade

Valor de pH

Amostra Padrão

Figura 33

. Perfil do pH durante o teste de estresse térmico obtido das amostras do gel de

calêndula submetidas á temperatura de 45 ± 2

C, e das amostras (padrão) do gel de

calêndula à temperatura ambiente (25 ± 2

C). Os resultados foram expressos pela média

das leituras (n=3)

102

Figura 34

Perfil de permeação dos flavonóides totais expresso em rutina

presentes no gel contendo tintura de Calendula officinalis L.

100

110

0 100 200 300 400 500 600

Tempo (min)

Concentração ug/mL

103

6. DISCUSSÃO

Para o desenvolvimento tecnológico de formulações fitoterápicas que

atendam as exigências e especificações da legislação vigente no país, é

indispensável o estabelecimento de protocolos que garantam o controle de

qualidade das matérias-primas, derivados vegetais e excipientes empregados

na sua produção, assim como a validação de técnicas qualitativas e

quantitativas apropriadas aos marcadores químicos escolhidos para o

desenvolvimento do fitoterápico. Só assim é possível obter um produto

tecnologicamente acabado com qualidade assegurada (TOLEDO et al., 2003;

BASSANI et al., 2005; NETTO, et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007).

Diante desta premissa, a primeira etapa deste trabalho se deteve na

realização de metodologias estabelecidas por protocolos de controle de

qualidade para produção e comercialização de fitoterápicos, exigidos pela

RDC n° 48/04 (ANVISA) e por monografia farmacopeica específica para a

espécie em estudo (C. officinalis L.), como a caracterização física e físico-

química da matéria-prima vegetal (pó das flores de calêndula) e a obtenção e

caracterização física, química e físico-química do derivado vegetal (tintura de

calêndula).

A granulometria de drogas vegetais determina a superfície de contato

disponível para interação com o solvente utilizado na obtenção do derivado

vegetal, visto isso, é um parâmetro preliminar e importante para a escolha do

processo de extração adequado, já que é uma

influencia direta sobre a

eficiência do processo extrativo (SANTOS, 2000; MIGLIATO et al., 2007 ). Na

distribuição granulométrica do pó de calêndula ilustrada na Figura 9 (pág. 71),

foi possível classificá-lo como moderadamente grosso segundo Farmacopéia

Brasileira (1988). Este resultado foi um dos critérios determinantes para a

escolha do processo de obtenção da tintura. Contudo, este resultado foi

divergente ao emitido pelo laudo técnico da empresa fornecedora desta

matéria-prima, o que reforça a necessidade da confirmação dos resultados de

laudos técnicos emitidos por empresas fornecedoras de insumos farmacêuticos

e matérias-primas vegetais, bem como a qualificação desses fornecedores

pois, segundo Carvalho e colaboradores (2006), a qualidade da matéria-prima

104

vegetal é a determinante inicial da qualidade do fitoterápico. Por isso, se faz tão

pertinente a questão da problematização da qualidade dos fitoterápicos,

principalmente os produzidos em pequena escala como em farmácias de

manipulação ou mesmo em indústrias de médio e pequeno porte.

A perda por dessecação é um método analítico que determina o teor de

material volátil do vegetal a 105 °C, ou seja, que expressa o percentual de

umidade residual da droga vegetal. Este tipo de análise é importante, uma vez

que pode oferecer informações a cerca do armazenamento da droga vegetal. O

valor obtido nessa análise para o pó das flores de calêndula conforme descrito

na Tabela II (pág. 72) foi de 11,42 % (m/m), sendo que este se encontra dentro

dos limites estabelecidos em sua monografia farmacopeica, que permite valor

máximo de 12% (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV, 2001). Sob o ponto de vista

tecnológico e de produção, este resultado é de grande relevância para

assegurar a estabilidade microbiológica e química da formulação fitoterápica,

uma vez que, teores de umidade acima do especificado propiciam a

proliferação de fungos e bactérias, além de possíveis degradações de

substâncias químicas por processos de hidrólise, mesmo em um curto prazo.

Pode-se afirmar que os valores característicos da perda por dessecação, além

de informação importante do ponto de vista tecnológico, servem também como

parâmetro de controle da qualidade do pó de C. officinalis L (WHO, 1992;

MACIEL, et al., 2006; MIGLIATO et al., 2007 ).

Na determinação do teor de cinzas totais do pó das flores de C.

officinalis L., obteve-se o valor de 12,77 % (m/m). Este resultado, descrito na

Tabela II encontra-se acima do limite especificado por sua monografia que é de

no máximo 10 %. A realização deste ensaio permite verificar prováveis

impurezas inorgânicas não-voláteis, e quando o teor de cinzas é superior ao

permitido, provavelmente seja indício de procedimentos de colheita e pós-

colheita inadequados (SHARAPIN, 2000; SOUSA et al., 2003).

O estudo termogravimétrico (TG) do pó das flores de C. officinalis L.

apresentou um comportamento térmico com cinco etapas de

termodecomposição (Figura 10 na pág. 73, e Tabela III na pág. 74). A

primeira etapa, entre 25 e 116°C, apresentou uma pe rda de massa de 7,96%,

105

que pode está relacionada com a eliminação de água adsorvida na matéria

prima, podendo ser confirmada pela curva endotérmica observada na DTA

(Figura 11), no mesmo intervalo de temperatura. Após a desidratação, foram

observadas mais três etapas de perda de massa (116-396°C) que totalizaram

um percentual de 48,13%, podendo ser visualizadas nas curvas DTG, e

apresentando uma variação de temperatura de 361,01 J/g. Essas perdas

estão associadas à decomposição térmica dos compostos orgânicos. A quinta

etapa de termodecomposição, entre 396-600°C, com um a variação de

temperatura de 1,07 kJ/g, envolveu um percentual de perda de massa de

13,26%, caracterizado como a formação do material carbonáceo e sua

decomposição (ARAÚJO et al., 2006).

A avaliação da qualidade de uma tintura inicia-se com a análise da

matéria prima ou droga vegetal utilizada para sua obtenção, atentando-se

principalmente para a identificação botânica ou zoológica (DESMICHELLE,

1987). Após o processo de produção, as tinturas devem passar por vários

ensaios dentre eles a identificação, observação de características

organolépticas, determinação da densidade, do resíduo seco, do teor

alcoólico e doseamento de compostos marcadores (FONSECA; LIBRANDI,

2008).

Todos estes ensaios são importantes para assegurar a qualidade,

atendendo a uma especificação pré-estabelecida. Seguindo este

entendimento, na caracterização e controle de qualidade da tintura obtida a

partir do pó das flores de C. officinalis L. (Tabela IV pág.74), o valor da

densidade aparente encontrado foi de 0,89 g/cm

, o qual se manteve dentro

do limite preconizado para tinturas 0,87 e 0,98 g/cm

(PRISTA et al., 1990). O

valor de pH encontrado para a tintura de calêndula foi de 4,79,

caracterizando-a como ácida. Este resultado representa um dado

determinante na escolha dos adjuvantes empregados na formulação

fitoterápica, além de ser um fator de influência na estabilidade de formulações

(MACIEL et al., 2006). O percentual de resíduo seco da tintura foi obtido a 105

°C e expresso em 9,6 % (m/m). A determinação do res íduo seco é um

parâmetro fundamental e preliminar quando se objetiva alcançar a eficácia de

106

uma formulação fitoterápica, pois este ensaio implica na quantificação das

substâncias extraídas da planta através da eliminação do solvente extrator.

Sendo assim, esse percentual é um indicativo da concentração da tintura de

calêndula (OLIVEIRA; BERRETTA, 2007).

Por meio da análise fitoquímica realizada segundo metodologia proposta

por Barbosa (2001), foi possível estabelecer o perfil químico da tintura de

calêndula, parâmetro preliminar para o seu controle de qualidade e

caracterização da matéria-prima. A Tabela V demonstra os metabólitos

secundários identificados na tintura que foram os açúcares redutores, proteínas

e aminoácidos, fenóis, flavonóides gerais, flavonas, flavonóis e xantonas,

flavanonas, flavanonóis e alcalóides. A presença de várias classes de

favonóides foi um dos importantes indícios para a certificação da identidade da

matéria-prima em estudo, como sendo a C. officinalis L.

Para investigação preliminar da presença dos flavonóides (quercetina e

rutina) na tintura de C. officinalis L. procedeu-se a analise por Cromatografia

em Camada Delgada, uma técnica analítica extremamente simples e poderosa

para a prospecção de substâncias presentes em fitoterápicos. Esta, consiste na

separação dos componentes de um extrato por migração diferencial sobre uma

camada fina de gel de sílica (fase estacionária), retida sobre uma superfície

plana por ação da fase móvel constituída por uma mistura de solventes em

proporções diferentes (ROCHA, 2006; COLLINS et al, 2006).

Assim, a determinação do perfil cromatográfico da tintura possibilitou a

comparação dos valores de Rf das substâncias da amostra com os valores de

Rf dos padrões rutina e quercetina, além da comparação das colorações

desenvolvidas pelas zonas cromatográficas. Seguindo este procedimento, o

perfil cromatográfico por CCD obtido para tintura de C. officinalis L. apresentou

melhor desenvolvimento no eluente I, constituído de

acetato de etila; ácido

fórmico; ácido acético glacial; água (100:11:11:26), pois proporcionou uma

melhor separação dos componentes e, conseqüentemente, melhor rendimento

quando comparado ao eluente II. Após o desenvolvimento do cromatograma, a

placa apresentou uma zona cromatográfica fluorescente amarela com valor de

Rf 0,4 idêntico ao valor de Rf do padrão rutina (0,4), e três zonas

107

cromatográficas fluorescentes azuis atribuídas aos ácidos clorogênico, caféico

e isoclorogênico com respectivos Rfs (0,5 - 0,75 - 0,85), ilustradas na Figura 12

pág. 76 (WAGNER; BLADT, 2001). No entanto, a tintura não apresentou

mancha referente ao padrão de quercetina. De acordo com a Farmacopéia

Brasileira IV (2001), que incluiu nesta edição com o fascículo 2 revisado, a C.

officinalis L., recomenda que para a caracterização e controle de qualidade

desta espécie, é necessário a determinação da presença, por meio de CCD, do

flavonóide rutina e do ácido clorogênico. Portanto, através da análise qualitativa

por cromatografia em camada delgada, foi caracterizada a presença destes

marcadores químicos, comprovando assim a identidade e assegurando a

qualidade da matéria-prima e conseqüentemente, do derivado vegetal obtido

(tintura).

Dentro da cadeia produtiva de fitoterápicos, um dos pontos mais críticos

é o estabelecimento de técnicas analíticas qualitativas e quantitativas

apropriadas, que permitam comprovar a presença dos marcadores químicos

responsáveis pela ação biológica. Desta forma, a Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE) é uma técnica de análise moderna, que ocupa um lugar de

destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e

quantificação das espécies químicas (COLLINS et al, 2006).

Contudo, ainda é notável um grande problema relacionado à adequação

da produção dos medicamentos fitoterápicos as normas e exigências

estabelecidas pelos órgãos fiscalizadores, para que se possa garantir a

qualidade, eficácia e segurança do produto final. Nesse contexto, é

imprescindível que se faça a validação das metodologias empregadas nas

etapas do desenvolvimento dos fitoterápicos, com o objetivo de demonstrar que

o método é apropriado para a finalidade pretendida, a fim de se obter a

confiabilidade dos resultados (ANVISA, 2003; NETO et al., 2006; OLIVEIRA et

al., 2007).

Segundo a RE 899/03 (ANVISA) para análises quantitativas de

princípios ativos em matérias primas vegetais, é exigido que o método

apresente os seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, intervalo e

repetibilidade.

108

A primeira etapa realizada para o estabelecimento da metodologia de

quantificação da rutina na tintura de C. officinalis L. foi à adequação das

condições cromatográficas idéias para está análise. Os estudos realizados por

Bilia e colaboradores (2001) de caracterização da tintura de flores de calêndula

por CLAE-DAD e CLAE-MS, foram utilizados a fim de subsidiar os

experimentos de otimização da análise conforme mostrado na Tabela VIII e IX

na pág. 80.

Após o estabelecimento das condições cromatográficas ideais para a

validação, foi realizada a seletividade do método, já que este parâmetro possui

a capacidade de medir exatamente um composto em presença de outros

componentes (ANVISA, 2003). Os resultados dos testes de seletividade

apresentados na Figura 16 pág. 81 confirmam a presença de rutina na tintura

de C. officinalis L., uma vez que houve um aumento significativo da área do

pico de tempo de retenção de 12,16 min do cromatograma da tintura in natura

(B), o que se deve ao aumento da quantidade de rutina detectada pelo

equipamento. A comparação das médias dos tempos de retenção da rutina

padrão e rutina na tintura in natura (Tabela X pág. 83) foi mais um parâmetro

utilizado para a confirmação da seletividade do método, pois suas médias

tiveram valores semelhantes.

Estudos realizados por Pietta e Bruno (1982) e Bilia e colaboradores

(2001) detectaram a presença de quercetina em extrato e tintura de C.

officinalis L., respectivamente. No entanto, a comparação dos cromatogramas

apresentados na Figura 17 pág. 89 possibilitou caracterizar a ausência do pico

referente à quercetina na tintura in natura.

A variabilidade do material vegetal deve-se às diferenças do

crescimento, colheita, secagem, e condições de armazenagem. A polaridade

do solvente, o modo de extração, e a instabilidade dos constituintes também

podem influenciar na composição e na qualidade dos extratos. Portanto, para

se obter um produto fitoterápico com qualidade, segurança e eficácia, é

desejável que o cultivo de plantas medicinais seja feito em condições

padronizadas (BAUER, 1998; MIGUEL; MIGUEL, 2004). Desta forma, torna-se

imprescindível a discussão a cerca do controle de qualidade das matérias-

109

primas, empregadas no desenvolvimento de fitoterápicos, adquiridas por

empresas fornecedoras desses produtos.

A linearidade apresentou baixa dispersão dos pontos experimentais com

relação de áreas diretamente proporcionais às concentrações dos analitos, que

foi caracterizado pelo coeficiente de correlação (r) superior a 0,99, critério

mínimo aceitável pela legislação em vigor (Figura 18 pág. 83 e Tabela XI pág

84) . O intervalo do método foi obtido através do estudo da linearidade do

método e baseado na área do pico de rutina na tintura de calêndula, através do

qual foi obtido intervalo de 0,1 a 0,72 mg/mL. Este intervalo foi empregado para

a construção da curva de calibração da rutina ilustrada graficamente na Figura

19 (FDA, 1994; ANVISA, 2003).

A repetibilidade do método (precisão intra-corrida) avaliada a partir do

coeficiente de variação das áreas da tintura de C. officinalis L. apresentou

valores adequados segundo as recomendações vigentes, isto é, inferior a 15%

(FDA, 1994; ANVISA, 2003).

Outra técnica utilizada para o controle de qualidade do planejamento da

formulação foi a espectroscopia na região do infravermelho. Está técnica, tem

por objetivo a identificação ou mesmo determinação de grupos funcionais

característicos dos compostos orgânicos analisadas, propiciando um estudo

preliminar de sua estrutura química (MACIEL, et al., 2002).

O espectro de absorção do marcador químico rutina ilustrado na Figura

20 apresentou bandas de absorção características dos grupos funcionais de

sua estrutura química (Tabela XIII pág. 86). Uma banda de absorção larga em

3426 cm

-1

foi atribuída ao estiramento da hidroxila fenólica, e a banda de

absorção em aproximadamente 2937 cm

-1

pode ser relacionada à deformação

axial da ligação C−H de aromáticos. Segundo Jin e colaboradores (2007), a

banda de absorção em 1655 cm

-1

apresentada no espectro da rutina, é

atribuída ao estiramento da carbonila (C=O); absorções em 1601 cm

-1

, 1503

-1

e 1452 cm

-1

são referentes a estiramentos do anel fenil (C=C). A banda de

absorção em torno de 1295 cm

-1

foi atribuída ao estiramento C=C−O−C. Já a

banda de absorção em 1054 cm

-1

pode ser relacionada à deformação angular

110

no plano da ligação C−H do anel aromático (DENG, et al., 1997; OLIVEIRA;

CARVALHO, 1999; SILVERSTEIN et al., 2006; JIN et al., 2007).

A interpretação no espectro de infravermelho do extrato liofilizado de C.

officinalis L. (Figura 13 e Tabela VI pág. 77) foi realizada com base nos grupos

funcionais característicos apresentados pelo padrão de rutina, uma vez que foi

o marcador químico escolhido para a padronização e desenvolvimento da

formulação fitoterápica da espécie vegetal em estudo. Bandas de absorção

semelhantes às apresentadas pelo espectro de absorção da rutina foram

identificadas no espectro do extrato liofilizado, como em 3408 cm

-1

atribuída a

hidroxila fenólica, em 2922 cm

-1

referente à ligação C−H de aromáticos, em

1628 cm

-1

correspondente ao estiramento do grupo carbonila (C=O), em 1460

-1

e 1406 cm

-1

referentes aos estiramentos do anel fenil (C=C), e a banda de

absorção em 1048 cm

-1

atribuída a ligação C−H do anel. Dessa forma, através

da comparação do espectro da rutina (padrão) com o espectro do extrato

liofilizado foi possível confirmar a presença dos grupos funcionais

característicos da rutina no extrato, concretizando-se em mais um parâmetro

de caracterização e controle de qualidade da tintura de C. officinalis L.

Os métodos de extração e manipulação utilizados para o

desenvolvimento de medicamentos oriundo de plantas medicinais têm uma

significativa influência na estabilidade química e física do produto

tecnologicamente acabado. Neste contexto, justifica-se a utilização da análise

térmica neste trabalho como método de caracterização, avaliação do

comportamento térmico e da estabilidade térmica, podendo ser empregada no

controle de qualidade de matérias-primas e avaliação de desenvolvimento de

medicamentos fitoterápicos (COSTA et al., 2002; SILVA, et al., 2007; ZHANG,

et al., 2008).

A pequena quantidade de amostra utilizada, a rapidez de resultados, a

limpeza da técnica e a possibilidade de visualização do seu perfil

termoanalítico, fazem dessas técnicas poderosas ferramentas no estudo de

padronização das matérias-primas vegetais e ensaios de pré-formulação para o

desenvolvimento tecnológico de medicamentos fitoterápicos (ARAGÃO et al.,

2002; ARAÚJO et al., 2006; SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES, 2008).

111

A caracterização térmica do marcador químico rutina apresentou três

etapas de decomposição térmica (Figura 21, 22 pág. 87 e Tabela XIV pág.

88). A primeira etapa de termodecomposição (25-145°C) apresentou um

percentual de perda de massa de aproximadamente 7,99%, que pode está

relacionada com a eliminação da água adsorvida na superfície da rutina,

confirmada pela presença de uma curva endotérmica na DTA. A segunda

etapa (145-304°C) apresentou um percentual de perda de massa de 24,72%.

Esta significante perda de massa está relacionada com a eliminação de duas

moléculas de água, decompostas com efervescência, tornando-se dessa

forma anidro, com uma variação de temperatura de 291,65 J/g (COSTA et al.,

2002). A terceira etapa de termodecomposição (26,58%) ocorreu na região de

304 a 600°C. Segundo estudos realizados por Zhang e colaboradores (2008),

essa perda corresponde à eliminação dos complexos e o início da

decomposição dos açúcares da rutina, apresentando uma variação de

temperatura de aproximadamente 3,00 kJ/g.

A curva TG do extrato liofilizado da calêndula apresentou quatro etapas

de termodecomposição (Figura 14 pág. 78). A primeira etapa ocorreu no

intervalo de 25 a 116°C, com um percentual de perda de massa de 5,83%,

que evidenciou a perda de água superficial ou de umidade. Contudo, as

demais etapas de perda de massa, ocorreram no intervalo de 116 a 600°C,

envolvendo processos de decomposição da matéria orgânica (carboidratos,

proteínas, aminoácidos, flavonóides entre outros), até a formação do material

carbonáceo, além do início da decomposição dos açúcares presentes na

rutina. As curvas DTA apresentaram eventos endotérmicos em todas as

etapas de perda de massa do extrato liofilizado, como podem ser observados

na Figura 15 pág. 78 e Tabela VII pág. 79.

Após a obtenção do gel contendo tintura de C. officinalis L. foram

realizados estudos preliminares do planejamento/pré-formulação da formulação

obtida, com intuito de avaliar a viabilidade do seu desenvolvimento.

Desta forma, foram obtidos espectros na região do infravermelho para os

excipientes e suas misturas com o extrato liofilizado, a fim de analisar as

bandas de absorção características do marcador químico rutina no extrato

112

liofilizado de C. officinalis L., após sua mistura com os excipientes da

formulação. Os espectros das misturas binárias hidroxietilcelulose/extrato

liofilizado, propilenoglicol/extrato liofilizado e metilparabeno/extrato liofilizado

(Figura 23, 24 e 25, Tabelas XV, XVI e XVII págs. 89, 90, 91 e 92,

respectivamente) apresentaram bandas de absorção características de todos

os grupos funcionais do extrato liofilizado, inferindo assim, que mesmo depois

da mistura física dos excipientes ao extrato liofilizado, não houve mudanças

significativas que pudessem interferir no perfil do extrato liofilizado, garantindo

a permanência das bandas atribuídas ao marcador químico rutina. Estes

resultados confirmam preliminarmente a compatibilidade entre os constituintes

da formulação, além de representar um parâmetro fundamental para assegurar

a eficácia do produto fitoterápico acabado.

Portanto, o infravermelho contribuiu como uma técnica de caracterização

estrutural com intuito de confirmar a presença dos grupos funcionais

importantes para a determinação do marcador químico rutina no material

vegetal intermediário em estudo (extrato liofilizado da C. officinalis L). Além de

auxiliar nos estudos de planejamento da formulação fitoterápica, proposta por

meio da identificação de bandas características dos grupos funcionais de cada

componente da formulação, tanto isolados como em misturas binárias com o

extrato liofilizado, ainda auxiliou na comprovação de que não houve

degradação e nem interferência dos excipientes sobre a disponibilidade do

marcador.

As curvas TG dos excipientes hidroxietilcelulose, propilenoglicol e

metilparabeno comparadas com as curvas TG das suas respectivas misturas

com o extrato liofilizado de calêndula apresentaram, no decorrer do estudo

diferentes comportamentos térmicos (Figuras 26, 28 e 30 págs. 93, 95 e 97,

respectivamente). Entretanto, a análise termodiferencial (DTA) mostrou que

houve apenas ocorrência de eventos endotérmicos para todos os excipientes

e misturas binárias. Os valores de variação de temperatura, referentes aos

eventos de perda de massa dos excipientes e de suas misturas binárias com

o extrato liofilizado estão descritos nas Tabelas XVIII, XIX e XX págs. 94, 96 e

98, respectivamente.

113

O hidroxietilcelulose apresentou um percentual de perda de massa de

aproximadamente 5,5%, no intervalo de 25 a 80°C. Já sua mistura binária

com o extrato liofilizado apresentou um percentual de perda de massa de

10,1%, no intervalo de 25 a 110°C. Os resultados ob tidos inferem uma

compatibilidade entre o hidroxietilcelulose e o extrato liofilizado, uma vez que

o extrato liofilizado apresentou um percentual de perda de massa de 5,83%,

no intervalo de 25 a 116°C. Desta forma observa-se que a mistura manteve o

mesmo perfil térmico das substâncias isoladas.

As curvas TG da mistura binária de propilenoglicol/extrato liofilizado

apresentaram duas etapas de termodecomposição significativas. A primeira

etapa de perda de massa ocorreu no intervalo de 25 a 188°C, com um

percentual de perda de massa de 73,49%. O segundo intervalo entre 188 e

600°C, foi observado um percentual de perda de mass a de 18,33%. Estes

resultados indicaram que houve uma melhora do comportamento térmico do

propilenoglicol, ou seja, um aumento de sua estabilidade térmica, já que na

análise termogravimétrica desse excipiente isolado pode ser observado um

percentual de perda de massa de 99,05%, no intervalo de 25 a 140°C,

indicando que a mistura entre o propilenoglicol e extrato liofilizado foi

compatível.

A Termogravimetria (TG) da mistura binária do metilparabeno/extrato

liofilizado apresentou um comportamento térmico semelhante ao do extrato

liofilizado, pois suas perdas de massa ocorreram em quatro etapas. A

primeira etapa de perda de massa da mistura binária (metilparabeno/extrato

liofilizado) ocorreu no intervalo de 25 a 90°C, com um percentual de perda de

massa de 1,9%. Este resultado infere uma melhora da estabilidade térmica do

extrato liofilizado quando misturado fisicamente com o metilparabeno, visto

que o extrato liofilizado, quando analisado isoladamente, apresentou um

percentual de termodecomposição de 4,23% no mesmo intervalo de

temperatura (25 a 90°C).

As técnicas termoanáliticas utilizadas para o planejamento do

desenvolvimento do gel de C. officinalis L. mostram-se como ferramentas

potenciais para a obtenção de parâmetros tecnológicos, em controle de

114

qualidade, compatibilidade entre os excipientes e o extrato liofilizado de

calêndula, estabilidade térmica dos constituintes da formulação fitoterápica,

além de fornecer condições adequadas de armazenamento.

O ensaio de estabilidade representa uma fase fundamental e crucial no

desenvolvimento e avaliação de medicamentos, pois a instabilidade de uma

formulação ou preparação farmacêutica modifica requisitos essenciais como a

qualidade, segurança e eficácia (BILIA et al., 2001). Partindo desse

pressuposto, o teste de estabilidade preliminar teve cunho orientativo no

desenvolvimento da formulação, a qual foi submetida a condições extremas de

temperatura e centrifugação visando acelerar possíveis processos de

instabilidade na formulação.

O primeiro teste realizado para avaliação da estabilidade preliminar da

formulação com caráter eliminatório foi o de centrifugação. Mesmo depois de a

amostra ter sido submetida a uma força centrípeta de 3000 rpm por 30 min,

não houve quaisquer sinais de instabilidade apresentado, ou seja, o teste não

provocou a desestruturação da cadeia polimérica do gel. No entanto, a não

ocorrência de sinais de instabilidade no gel não assegura sua estabilidade, mas

somente indica que o produto poderia ser submetido, sem necessidade de

reformulação, a outras condições de tensão, como o estresse térmico (BRASIL,

2004; ISAAC et al., 2008; LIMA et al., 2008).

A análise macroscópica das amostras do gel de calêndula (Figura 32

pág. 99) foi realizada comparando-se características organolépticas (aspecto,

cor e odor) das amostras submetidas ao estresse em estufa (45 ± 2

C) com as

características organolépticas das amostras padrões do gel à temperatura

ambiente (25 ± 2

C). Desta forma, foi verificado que as amostras em estufa

permaneceram aparentemente estáveis, com características organolépticas

adequadas, conforme as apresentadas pela amostra padrão, com aspecto de

gel límpido, de cor amarelo escuro e odor característico da tintura de calêndula.

Esse resultado reforça a boa estabilidade preliminar da formulação, bem como

um agradável aspecto estético ou visual. Segundo Barry (2002), é desejável

que as formulações tópicas tenham aparência homogênea, límpida e com odor

115

agradável, proporcionando estimativas melhores da adesão do paciente ao

tratamento.

No teste de estresse térmico, o parâmetro analisado foi o valor de pH, os

quais estão sendo apresentados na Figura 33 pág. 100. Como pode ser

verificado, o perfil do gráfico para os dois valores de pH da amostra em estufa

(45 ± 2

C) e a temperatura ambiente (25 ± 2

C) é semelhante, apesar do

estresse térmico sofrido pela amostra em estufa com intuito de acelerar seu

envelhecimento. Esse resultado representa a manutenção do parâmetro pH, já

que não houve alterações maiores que 2,2% (QUEIROZ, 2008). Portanto,

presume-se que a base geleificante de hidroxietilcelulose 1,5% utilizada para a

incorporação da tintura de C. officinalis L. permaneceu estável, ou seja, não

apresentou desestruturação da cadeia polimérica do gel, nem mudanças

relevantes no pH durante esses estudos, o que se caracteriza em mais um

indicativo primário da estabilidade da formulação.

A realização do estudo preliminar de estabilidade foi de suma

importância para o planejamento da formulação proposta, pois possibilitou à

obtenção de resultados satisfatórios acerca da estabilidade do gel em um curto

intervalo de tempo do seu desenvolvimento inicial. Isto porque que uma das

situações mais críticas no desenvolvimento de formulações farmacêuticas

semi-sólidas é o relevante número de incompatibilidades que podem ocorrer,

simultaneamente ou não, entre os princípios ativos e os excipientes (ISAAC et

al., 2008; LIMA et al., 2008). No caso de formulações fitoterápicas do tipo gel,

essas incompatibilidades geralmente acontecem entre o polímero formador do

gel e os outros constituintes da fórmula, principalmente após a incorporação de

extratos e tinturas, gerando processos de instabilidade como turbidez,

precipitação, cristalização, alteração da cor, alteração de odor, variação de

viscosidade e desestruturação da cadeia poliméricas (ZAGUE, 2008;

FERREIRA; LEITE, 2008).

A seleção do modelo de ensaio de permeação in vitro representa uma

das etapas fundamentais no desenvolvimento de formulações de uso tópico e

tem por objetivo investigar a permeação de substâncias ativas através da pele

(SCHMOOK et al., 2001; BABY et al., 2006). Sendo assim, para avaliar o perfil

116

de permeação dos flavonóides totais expresso em rutina no gel contendo

tintura de C. officinalis L., foi utilizado como modelo de biomembrana a muda

de pele de cobra Boa constrictor. Embora a muda de pele de cobra não seja

um tegumento de procedência de mamíferos, este material biológico

apresenta similaridade ao estrato córneo humano e vantagens potenciais que

a tornam um modelo de membrana para ensaios de difusão (BABY et al.,

2008).

Durante a realização do estudo preliminar de permeação in vitro, o gel

apresentou tendência para favorecer o transporte dos flavonóides totais para a

fase receptora por um período de oito horas, os quais foram detectados por

método espectrofotométrico a 350 nm. Desta forma, o perfil de difusão dos

flavonóides totais expresso em rutina obtido para o gel com tintura de C.

officinalis L. apresentou uma relação linear entre a massa cumulativa

permeada e o tempo em que o gel permaneceu em contato com a

biomembrana (Figura 34 pág. 101).

O estudo de permeação cutânea in vitro é uma ferramenta

imprescindível para o desenvolvimento e controle de qualidade de formulações

farmacêuticas semi-sólidas, pois se destaca por sua eficiência e praticidade,

implicando em uma ampla aplicabilidade (ANTÔNIO, 2007). E em se tratando

de formulações fitoterápicas semi-sólidas, seu emprego ainda é inexpressivo, o

que reforça a necessidade do estabelecimento e validação dessa metodologia

para seu emprego na averiguação da eficácia destas formulações.

Os resultados obtidos até o presente momento acerca do controle de

qualidade e planejamento da formulação fitoterápica do tipo gel contendo

tintura de C. officinalis L. demonstram a importância de se adequar à produção

de fitoterápicos as normas de regulamentação frente à Agência Nacional de

Vigilância Sanitária, através do emprego de protocolos de controle de

qualidade das matérias-primas vegetais, além do estabelecimento de

metodologias tecnológicas para a produção de fitoterápicos.

117

7. CONCLUSÕES

A problemática da qualidade e da insuficiência de metodologias

tecnológicas para a produção de fitoterápicos no país, principalmente na

região norte, impulsionou o desenvolvimento deste trabalho conforme as

normas regulatórias estabelecidas pela legislação vigente sobre fitoterápicos.

Visto isso, após sua realização foi possível concluir que:

Através da caracterização física e físico-química da droga vegetal (pó

das flores de calêndula) e do derivado vegetal (tintura de calêndula), foi

possível obter especificações farmacognósticas além de parâmetros de

controle de qualidade condizentes com a monografia farmacopeica específica

para a espécie em estudo, além de constatar a identidade do material vegetal

como sendo C. officinalis L. através da detecção do marcador químico rutina

por CCD.

A validação do método para a quantificação da rutina na tintura de

calêndula por CLAE/UV-DAD apresentou parâmetros de desempenho

condizentes aos objetivos do trabalho e estão em conformidade com os

parâmetros recomendados pela legislação sanitária vigente no país.

A caracterização do marcador químico rutina por espectrometria na

região do infravermelho (IV) e técnicas termoanalíticas (TG e DTA) permitiu

confirmar a presença dos grupos funcionais característicos deste marcador no

118

extrato liofilizado de calêndula, além de monitorá-los após sua mistura com os

excipientes da formulação e obter seu comportamento térmico,

respectivamente.

No planejamento da formulação fitoterápica, os espectros obtidos na

região do IV para os excipientes da formulação e suas misturas binárias com

o extrato liofilizado possibilitaram detectar a permanência das bandas

atribuídas ao marcador químico rutina no extrato mesmo após sua mistura com

os excipientes, demonstrando que não houve degradação, nem interferência,

dos excipientes sobre a disponibilidade do marcador.

As técnicas termoanáliticas (TG e DTA) utilizadas para o planejamento

do desenvolvimento do gel de C. officinalis L. proporcionaram a obtenção de

parâmetros tecnológicos em controle de qualidade, confirmando a

compatibilidade entre os excipientes e o extrato liofilizado de calêndula e

fornecendo dados relevantes acerca da estabilidade térmica dos constituintes

da formulação fitoterápica.

Os resultados obtidos na avaliação da estabilidade preliminar do gel

foram considerados satisfatórios, pois a formulação permaneceu estável

durante a realização dos ciclos em estufa (45 ± 2

C) e temperatura ambiente

(25 ± 2

C), não sendo identificados quaisquer sinais de instabilidade,

atestando-se que a formulação obtida proporcionou a incorporação da tintura

de C. officinalis L. de forma estável.

No estudo preliminar da permeação do gel contendo tintura de

Calendula officinalis L. após difusão em muda de pele de Boa constrictor, o gel

apresentou tendência para favorecer a permeação dos flavonóides totais

expresso em rutina para a fase receptora.

119

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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