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Tânia Cristina Alexandrino Becker
CICLO PARASSEXUAL COM PARAMEIOSE EM LINHAGENS MUTANTES DE
Aspergillus nidulans
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (área de concentração – Biologia
Celular), da Universidade Estadual de
Maringá para a obtenção do grau de Doutor
em Ciências Biológicas.
Maringá - Paraná
2007
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Orientadora: Dr
a
Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
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Dedico
Ao meu esposo, Alexandre Becker,
pelo seu amor, incentivo e
compreensão durante todos esses
anos...
Aos meus filhos, Amanda e Alexandre,
pelo carinho e alegria que sustentam
minha vida....
Aos meus pais, Ângelo e Anna pelo
carinho e apoio constantes...
- 4 -
AGRADECIMENTOS
À Deus que sempre me conduziu e capacitou,
À Professora Dr
a
Marialba A. A. de Castro-Prado pela orientação, dedicação, apoio e
incentivo a pesquisa,
À Sônia A. de Carvalho e Luzia A. de Souza Regassi pelos auxílios técnicos prestados,
Aos amigos do Laboratório de Genética de Microrganismos; Francielle, Cleverson, Saulo,
Simone, Josy, Carmen e Edílson pela amizade e compreensão em todos os momentos,
Ao meu esposo Alexandre pelo amor, apoio, incentivo e compreensão,
Aos meus filhos Amanda e Alexandre pela compreensão em todos os momentos de
ausência,
Aos meus pais Ângelo e Anna por todo o carinho e apoio durante a realização deste trabalho,
Ao meu sogro Fred e minha sogra Carmen, pelo carinho e palavras de incentivo, e
Aos demais familiares e amigos que sempre me incentivaram nos estudos.
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APRESENTAÇÃO
A tese de doutorado intitulada “Ciclo parassexual com parameiose em linhagens mutantes de
Aspergillus nidulans” é composta pelos seguintes artigos científicos:
- Ciclo vegetativo, assexual e parassexual de Aspergillus nidulans (mini revisão)
- Parasexuality in asexual development mutants of Aspergillus nidulans (Biol Res 39: 297-
305, 2006).
- Asexual Recombination in a uvsH Mutant of Aspergillus nidulans (Biol Res - aceito para
publicação).
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ÍNDICE
Resumo
7
Abstrat
9
Ciclos vegetativo, assexual e parassexual de Aspergillus nidulans (mini revisão)
11
Parasexuality in asexual development mutants of Aspergillus nidulans
53
Asexual recombination in a uvsH mutant of Aspergillus nidulans
76
- 7 -
CICLO PARASSEXUAL COM PARAMEIOSE EM MUTANTES DE
Aspergillus nidulans
Tânia Cristina Alexandrino Becker
Dr
a
Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
RESUMO
O ascomiceto Aspergillus nidulans é um fungo holomórfico, que se propaga
através de esporos sexuais (ascósporos) e assexuais (conidios). O ciclo de vida de A.
nidulans apresenta uma grande diversidade, sendo dividido em ciclo vegetativo, ciclo
assexual ou conidiogênese, ciclo parassexual e ciclo sexual ou ascosporogênese. O ciclo
vegetativo inicia-se através da germinação de ascósporos ou de conidios, ambos haplóides e
uninucleados. Os esporos são dispersos como células em dormência, originando colônias
com as mesmas propriedades daquela que lhe deu origem. A transição do ciclo vegetativo
para o ciclo assexual encontra-se sob rígido controle genético, sendo fluG (fluffy), flbA, flbB,
flbC, flbD e flbE (fluffy like bristle) genes caracterizados como precoces na indução da
conidiogênese. Para o desenvolvimento normal dos conidióforos e dos conidios, os genes
wetA, brlA e abaA são considerados essenciais na via principal de regulação da
conidiogênese. stunted (stu) e medusa (med) são outros genes envolvidos na regulação do
desenvolvimento em A. nidulans, sendo necessários para a precisa organização espacial e
temporal do conidióforo multicelular. O ciclo parassexual, por sua vez, inicia-se com a
formação do heterocário, que consiste na existência de núcleos haplóides geneticamente
distintos num mesmo citoplasma, os quais, após a fusão, originam núcleos diplóides
heterozigotos, sujeitos a sucessivas divisões mitóticas. Durante essas divisões, dois
processos podem ocorrer: não-disjunção-cromossômica e o crossing-over mitótico. Em
algumas espécies de fungos, os núcleos diplóides formados no interior das hifas
heterocarióticas são altamente instáveis, sofrendo recombinação e haploidização antes da
produção de conídios, permitindo assim a obtenção de haplóides recombinantes diretamente
do micélio heterocariótico, sem a recuperação da fase diplóide. Este processo foi
denominado ciclo parassexual com parameiose. Um mutante para a conidiogênese (B84),
previamente obtido em presença de doxorrubicina (7,0 µM), foi caracterizado no presente
trabalho, e utilizado para a obtenção de segregantes parameióticos. As análises
evidenciaram o fenótipo medusa da linhagem mutante, sendo o alelo medA103 mapeado no
cromossomo I. Os heterocários B84(med) // G422(med+) e B84(med) // G839(brl) foram
formados em meio líquido apropriado e inoculados em meios seletivos. Dois grupos de
- 8 -
segregantes mitóticos foram obtidos: aneuplóides e recombinantes haplóides estáveis
(parameióticos). A instabilidade mitótica dos parameióticos, bem como o comportamento
meiótico destes segregantes foram analisados em presença de Benlate e através de
cruzamentos sexuais com linhagens mestras, respectivamente. Um mutante uvsH de A.
nidulans, obtido através do ciclo sexual, foi também utilizado no presente trabalho, para o
isolamento de segregantes parameióticos. O mutante uvsH, denominado B511, apresentou
freqüência normal de recombinação meiótica em cruzamentos sexuais e altas freqüências de
segregantes parameióticos em cruzamentos parassexuais. Os resultados apresentados
caracterizam a parameiose como ferramenta valiosa na obtenção de linhagens
recombinantes.
- 9 -
PARASEXUAL CYCLE WITH PARAMEIOSIS IN Aspergillus nidulans MUTANTS
Tânia Cristina Alexandrino Becker
Dr
a
Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
ABSTRACT.
Ascomycete Aspergillus nidulans is a holomorphic fungus which propagates itself by
sexual (ascospores) and asexual (conidia) spores. The Aspergillus nidulans’s life cycle may be
subdivided into the vegetative cycle, asexual cycle or conidiogenesis, parasexual cycle and sexual
cycle or ascosporogenesis. The vegetative cycle starts with the germination of ascospores or
conidia which are haploids and uninuclear. Spores are spread as if dormant cells and give rise to
colonies with exactly the same characteristics as those that begot them. The vegetative cycle’s
transition to the asexual cycle lies within strict genetic control, or rather, fluG (fluffy), flbA, flbB, flbC,
flbD and flbE (fluffy-like bristle) characterized as early genes in conidiogenesis induction. Genes
wetA, brlA and abaA are essential for the normal development of conidiophores and conidia within
the main conidiogenesis regulation pathway. Stunted (stu) and medusa (med) genes are involved
in A. nidulans’s development regulation and are needed for the exact spatial and temporal
organization of pluricellular conidiophore. On the other hand, the parasexual cycle starts on the
heterokaryon formation which consists of genetically distinct haploid nuclei within the same
cytoplasm. After fusion, these nuclei give rise to heterozygous diploid nuclei which undergo
successive mitotic divisions. Chromosomal non-disjunction and mitotic crossing-over processes
may occur during these divisions. In certain fungus species diploid nuclei within the interior of
heterokaryotic hyphae are highly unstable and undergo recombination and haploidization prior to
conidia production. Consequently, they produce recombinant haploids directly from the
heterokaryotic mycelium without the recovery of the diploid phase. Parasexual cycle with
parameiosis is the name given to this process. A mutant for conidiogenesis (B84), previously
obtained in the presence of doxorubicin (7.0 µM), was characterized in current research and used
to obtain parameiotic segregants. Analyses confirmed the medusa phenotype of the mutant strain
and allele medA103 was mapped on chromosome I. Heterokaryons B84(med) // G422(med+) and
B84(med) // G839(brl) were formed in appropriate liquid medium and inoculated in selective media.
Two groups of mitotic segregants, namely aneuploids and stable haploid recombinants
(parameiotic), were thus obtained. Mitotic unstableness of the parameiotic segregants and the
meiotic behavior of the segregants were respectively analyzed with Benlate and by sexual
crossings with master strains. The mutant uvsH of A. nidulans, derived from the sexual crosses
between master strains, was also used in current research to isolate parameiotic segregants.
- 10 -
Mutant uvsH, named B511, had a normal frequency of meiotic recombination in sexual crossings
and high frequencies of parameiotic segregants in parasexual crossings. Results show parameiosis
as a useful tool to obtain recombinant strains.
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CICLOS VEGETATIVO, ASSEXUAL E
PARASSEXUAL DE Aspergillus
nidulans
- 12 -
Mini Revisão
CICLOS VEGETATIVO, ASSEXUAL E PARASSEXUAL DE Aspergillus nidulans
Tânia Cristina Alexandrino Becker e Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
Universidade Estadual de Maringá. Departmento de Genetica e Biologia celular.
Avenida Colombo 5790. 87020-900 – Maringá PR, Brazil.
Palavras-chave: Aspergillus nidulans, ciclo assexual, parassexual e parameiose
Autor para correspondência: Dr. Marialba Avezum Alves de Castro-Prado. Universidade
Estadual de Maringá. Departmento de Genetica e Biologia celular. Avenida Colombo 5790.
87020-900 – Maringá PR, Brasil. Telefone (44) 3261 4679. e-mail: maacprado@uem.br.
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ÍNDICE
1. RESUMO..................................................................................................................
14
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 15
2.1 O FUNGO Aspergillus nidulans.............…...........................................................
2.2 CICLO VEGETATIVO...........................................................................................
15
16
3. CICLO ASSEXUAL OU CONIDIOGÊNESE ............................................................
18
3.1 FORMAÇÃO DO CONIDIÓFORO........................................................................ 18
3.2 PRINCIPAIS GENES ENVOLVIDOS NO CONTROLE DA CONIDIOGÊNESE...
19
4. CICLO PARASSEXUAL...........................................................................................
23
4.1 FORMAÇÃO DO MICÉLIO HETEROCARIÓTICO............................................... 23
4.2 FORMAÇÃO E HAPLOIDIZAÇÃO DO NÚCLEO DIPLÓIDE HETEROZIGOTO.
27
5. CICLO PARASSEXUAL COM PARAMEIOSE.........................................................
31
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................
34
7. LEGENDA DAS FIGURAS.......................................................................................
FIGURA 1.............................................................................................
42
44
FIGURA 2.............................................................................................
45
FIGURA 3.............................................................................................
46
FIGURA 4.............................................................................................
47
FIGURA 5.............................................................................................
48
FIGURA 6.............................................................................................
49
FIGURA 7.............................................................................................
50
FIGURA 8.............................................................................................
51
FIGURA 9.............................................................................................. 52
- 14 -
1. RESUMO
O presente estudo reúne informações sobre genes e proteínas do fungo Aspergillus nidulans
envolvidos nos seguintes processos celulares: recombinação mitótica, desenvolvimento e
diferenciação celular, consagrando este microorganismo como um modelo biológico para estudos
genéticos através de seus diferentes ciclos de vida. A nidulans é um fungo holomórfico, que se
propaga através de esporos sexuais (ascósporos) e assexuais (conidios), e cujo ciclo de vida pode
ser dividido em: ciclo vegetativo, ciclo assexual ou conidiogênese, ciclo parassexual e ciclo sexual
ou ascosporogênese. O ciclo vegetativo inicia-se através da germinação de ascósporos ou de
conídios, ambos haplóides e uninucleados. Os esporos são dispersos como células em dormência,
originando colônias com as mesmas propriedades daquela que lhe deu origem. O fungo origina
colônias circulares e multicelulares, formadas por células tubulares multinucleadas, denominadas
hifas. A transição do ciclo vegetativo para o ciclo assexual encontra-se sob rígido controle
genético, sendo os genes fluG (fluffy), flbA, flbB, flbC, flbD e flbE (fluffy like bristle) caracterizados
como precoces na indução da conidiogênese. Para o desenvolvimento normal dos conidióforos e
dos conídios, os genes wetA, brlA e abaA são considerados essenciais na via central de regulação
da conidiogênese. stunted (stu) e medusa (med) são outros genes envolvidos na regulação do
desenvolvimento em A. nidulans, sendo necessários para a precisa organização espacial e
temporal do conidióforo multicelular. O ciclo parassexual, por sua vez, inicia-se com a formação do
heterocário, que consiste na existência de núcleos haplóides, geneticamente distintos, num
mesmo citoplasma, os quais podem eventualmente fundir-se, formando núcleos diplóides
heterozigotos. Durante as divisões mitóticas do núcleo diplóide, dois processos podem ocorrer:
não-disjunção-cromossômica e crossing-over mitótico. Em algumas espécies de fungos, os
núcleos diplóides formados no interior das hifas heterocarióticas são altamente instáveis, sofrendo
recombinação e haploidização antes da produção de conídios, permitindo a obtenção de haplóides
recombinantes diretamente do micélio heterocariótico. Este processo foi denominado ciclo
parassexual com parameiose. A recombinação mitótica associada ao ciclo parassexual pode ser
induzida por agentes químicos que promovem lesões na molécula de DNA, como os venenos de
topoisomerase II, doxorrubicina e etoposida. A avaliação do potencial recombinagênico destes
compostos pode ser realizada através da determinação do Índice de Homozigotização (HI),
utilizando-se mutantes uvs (sensíveis à radiação ultra-violeta) de A. nidulans. A parameiose pode
também ser utilizada na investigação do efeito recombinagênico de drogas que afetam o DNA,
caracterizando-se como ferramenta valiosa na obtenção de linhagens recombinantes.
- 15 -
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O FUNGO Aspergillus nidulans
Aspergillus nidulans, [teleomorfo Emericella nidulans (EIDAM) VUILL.], é um fungo
holomórfico, pertencente à classe dos ascomicetos, que se propaga através de esporos sexuais
(ascóporos) e assexuais (conídios) (Geiser et al., 1994). O fungo é capaz de crescer em meios de
cultura constituídos basicamente por uma fonte de carbono (glicose) e sais minerais, os quais
podem ser enriquecidos pela adição de aminoácidos e vitaminas (Van De Vate e Jansen, 1978).
Como ferramentas de estudos genéticos, várias classes de mutantes de A. nidulans foram
identificadas no transcorrer de vários anos, dentre as quais podemos destacar as classes dos
mutantes auxotróficos, os mutantes resistentes a fungicidas e os mutantes morfológicos. Esta
última classe pode ser subdividida em mutantes para as fases do ciclo celular (Morris, 1975),
mutantes para a aquisição de competência (Axelrod, 1972) e para a morfogênese do conidióforo
(Clutterbuck, 1969). Estas três subdivisões podem ser consideradas como o estudo da genética do
desenvolvimento.
Fungos filamentosos, como A. nidulans, originam colônias circulares e multinucleadas,
formadas por células tubulares com diâmetro aproximado de 6.0 µm, e denominadas hifas. Tais
células crescem por extensão apical, de forma ramificada, formando redes interconectadas de
células, originando um micélio. Este pode conter núcleos geneticamente idênticos, sendo
denominado homocariótico, ou conter núcleos geneticamente diferentes, formados pela fusão de
duas linhagens distintas, sendo então denominado heterocariótico. Núcleos geneticamente
distintos podem fundir-se e formar núcleos diplóides heterozigotos. Sob tal condição, geralmente
estável, e submetido a condições de cultivo que permitam a expressão de mutações recessivas, o
núcleo diplóide pode retornar à condição haplóide, contendo combinações aleatórias de
cromossomos de ambas linhagens paternais. A produção e haploidização do estado diplóide são
caracterizadas como etapas do ciclo parassexual, o qual permite o mapeamento de novas
mutações cromossômicas em A. nidulans (Clutterbuck, 1990, 1997; Pontecorvo et al., 1953).
A predominância do estado diplóide em organismos eucariotos, pode ser uma opção
favorável à espécie, uma vez que organismos diplóides podem acumular mutações deletérias (m),
as quais não serão expressas imediatamente, devido à presença do alelo selvagem (m+). Tais
mutações estarão, portanto protegidas da seleção natural. Núcleos diplóides heterozigotos, por
outro lado, estarão sujeitos ao processo de recombinação somática, que pode originar células
homozigotas para genes localizados em posição distal ao ponto de permuta. Desta forma, células
diplóides, homozigotas para mutações deletérias (m/m), poderão se originar através do crossing-
over mitótico (Deacon, 2005; Timberlake e Marshall, 1989).
- 16 -
O ascomiceto A. nidulans destaca-se entre outros organismos eucariotos, em razão de
apresentar vários núcleos no mesmo citoplasma, os quais mascaram a presença de mutações
recessivas em um determinado núcleo, permitindo o desenvolvimento do fungo mesmo em
condições desfavoráveis ao núcleo mutante (Deacon, 2005).
Através da técnica de separação de cromossomos por eletroforese de campo pulsado
(“pulsed field gel eletrophoresis”), confirmou-se que A. nidulans possui oito cromossomos em seu
núcleo, os quais correspondem a oito grupos de ligação geneticamente definidos, contendo
centenas de genes mapeados, que afetam diversos caracteres metabólicos e de desenvolvimento
(Brody e Carbon, 1989).
O ciclo de vida de A. nidulans apresenta uma grande diversidade, sendo dividido em: ciclo
vegetativo, ciclo assexual ou conidiogênese, ciclo parassexual e ciclo sexual ou ascosporogênese.
Entre estes ciclos, existe uma estreita relação: em condições normais, inicialmente ocorre o
desenvolvimento vegetativo, em seguida, dá-se início à conidiogênese (ciclo assexual), mediante a
inibição do ciclo vegetativo, e posteriormente, formam-se as hifas ascógenas e a diferenciação dos
cleistotécios (ciclo sexual) (Adams et al., 1998).
2.2 CICLO VEGETATIVO
O ciclo vegetativo inicia-se através da germinação de esporos sexuais (ascósporos) ou
assexuais, ambos haplóides e uninucleados. Estes esporos são dispersos como células em
dormência, com ciclo celular na fase G1. Em condições favoráveis de temperatura (entre 25 e
37ºC), umidade e de nutrientes, os conídios germinam e originam colônias com as mesmas
propriedades daquela que lhe deu origem (Timberlake e Clutterbuck, 1994; Bergen e Morris,
1983).
A germinação do esporo (Fig. 1) ocorre em três estágios seqüenciais: (i) ativação do esporo
em dormência, (ii) expansão conidial dirigida pela incorporação de água e substratos do meio
(fonte de carbono) e crescimento da parede celular, (iii) divisões mitóticas sucessivas e início do
crescimento polarizado do tubo germinativo (Osherov e May, 2000; D’Enfert, 1997).
Os estágios de germinação e expansão conidiais (Fig. 1 i-ii) são controlados por um
mecanismo sensorial dependente da proteína Ras, presente em todas as células eucarióticas.
Quando os conídios em dormência (ou seja, na fase G
1
do ciclo celular) encontram-se em
condições favoráveis de germinação (presença de água e fonte de carbono) a concentração da
forma ativa da proteína Ras (Ras-GTP) alcança níveis bastante elevados, os quais são
necessários para a germinação do conídio, bem como para o início da divisão e migração
nucleares (Osherov e May, 2000; Som e Kolaparthi, 1994).
- 17 -
No processo de mitose nuclear (Fig. 1 - iii) originam-se dois núcleos filhos, envolvendo
reagrupamento e separação coordenada dos componentes nucleares. No período de
aproximadamente quatro horas, após a germinação do conidio, ocorre a primeira divisão mitótica,
tempo necessário para a quebra da dormência. Após 8 horas, período em que já se completaram 3
divisões nucleares, o conteúdo citoplasmático apresenta um aumento considerável, devido aos
processos de síntese de proteínas e de DNA (Fiddy e Trinci, 1976). Bergen e Morris (1983)
descreveram a cinética de divisão nuclear em A. nidulans in vitro, estabelecendo que o ciclo
celular ocorre durante a germinação do conidio, levando em torno de 75-120 minutos, dependendo
das condições de cultivo. Na temperatura de 37ºC, a duração da fase M é em torno de 5 minutos,
G2 dura cerca de 30 minutos, a fase S, 25 minutos e G1, dura em torno de 15 minutos.
As alterações morfogenéticas no conidio ocorrem com a formação do tubo germinativo, ao
mesmo tempo em que ocorre a segunda divisão mitótica. O tubo germinativo apresenta
desenvolvimento apical, estabelecendo-se um eixo de crescimento polarizado na extremidade do
tubo germinativo, pela deposição da parede celular (Fiddy e Trinci, 1976). O processo de
deposição da parede celular é muito importante, pois sua remoção enzimática tem como
conseqüência a formação de protoplastos esféricos, com perda do crescimento polarizado
(McGoldrick et al., 1995; Doonan, 1992). De modo geral, este evento inclui: (i) o estabelecimento e
manutenção da polaridade celular, (ii) a organização assimétrica da maquinaria da biossíntese da
parede celular (i.e. citoesqueleto e o aparato secretório), em resposta a “sinais de polarização”, (iii)
deposição de parede celular na extremidade da hifa e (iv) a especificação de novos pontos de
crescimento polarizado em sítios subapicais que levam à formação de ramificações laterais
(Harris, 1997). Após o desenvolvimento do primeiro tubo germinativo, um segundo tubo é emitido
em direção oposta ao primeiro (Morris et al., 1995).
Três séries de divisões mitóticas ocorrem após a formação do tubo germinativo, dando
origem a oito núcleos que serão distribuídos por toda a extensão deste tubo. Paralelamente a este
processo, há a formação de septos descontínuos, que delimitam células com 2 a 10 núcleos e que
permitem a passagem de organelas e núcleos entre as células (Morris, 1976). À medida que a hifa
se expande na região apical, os núcleos que ficam nos compartimentos distais entram em
dormência. Eventualmente, estes núcleos podem voltar a se dividir mitoticamente, para formar
ramificações laterais na hifa, caso haja o estabelecimento de um novo pólo de crescimento. Nem
todos os compartimentos podem ser ativados para se ramificarem, e desconhece-se o sinal que
determina qual será o compartimento selecionado (Harris, 1997). Sabe-se, entretanto, que os
núcleos presentes nas regiões apicais das hifas (cerca de 40 núcleos), são mitoticamente ativos e
dividem-se sincronicamente, fazendo parte dos compartimentos septados.
- 18 -
Dynesen e Nielsen (2003) demonstraram que as ramificações das hifas são coordenadas
pelo crescimento das hifas em mitose, isto é, para estabelecer a ramificação do micélio é
necessária uma relação entre a progressão do ciclo celular e a migração nuclear. A partir do
momento em que o tubo germinativo se ramifica, as extremidades das hifas deixam de ser o único
sítio de crescimento polarizado e, então, o micélio apresenta vários pontos de crescimento ativo e
a colônia adquire seu aspecto circular (Harris e Kraus, 1998)
Os genes sepA (septation deficient), hypA (abnormal hyphal morphology) podB, podC e podD
(polarity defective) são responsáveis pela estabilização e manutenção da polaridade das hifas em
fungos filamentosos (Harris et al., 1999). Os genes sepA, hypA e podB são necessários em vários
aspéctos da morfogênese da hifa, sendo os genes sepA e podB requeridos para a organização do
citoesqueleto da extremidade da hifa. Os genes podC e podD, por sua vez, codificam proteínas
que aparentemente são requeridas especificamente para o estabelecimento da polaridade da hifa
durante a germinação do esporo. Estas evidências indicam que a integridade da formação dos
filamentos de actina é necessária para o desenvolvimento normal do tubo germinativo.
Consequentemente, mutações nestes genes, podem alterar o padrão espacial da morfogênese
polarizada, bem como a germinação de esporos em fungos filamentosos.
A extremidade de uma hifa em crescimento contém um complexo denominado
“Spizenkörper”, ou corpo apical, formado por vários tipos de vesículas ligadas à membrana, as
quais contêm enzimas envolvidas na síntese e lise da parede celular (Glass et al. 2004; Glass et
al. 2000, vide item 4.1).
3. CICLO ASSEXUAL OU CONIDIOGÊNESE
3.1 Formação do Conidióforo
A formação de conidióforos é um processo complexo, que pode ser dividido em vários
estágios distintos morfologicamente (Timberlake, 1990). Aproximadamente 16 horas após a
germinação do conidio, inicia-se a primeira evidência fenotípica de especialização da hifa dentro
da colônia. A hifa aérea ramificada diferencia-se, dando origem a um conidióforo, estrutura
reprodutora do ciclo assexual de A. nidulans (Fig. 2). A taxa de expansão radial de uma colônia de
A. nidulans, crescendo em meio completo à 37ºC, é de 0,5 mm/h e o conidióforo pode ser
observado dentro de 1 a 2 mm da margem da colônia (Morris, 1990). O processo de
desenvolvimento e de diferenciação do conidióforo, até a formação dos conidios, constitui a
conidiogênese (Adams et al., 1998; Lee e Adams, 1994).
A morfologia do conidióforo apresenta cinco estágios de desenvolvimento: (i) transformação
de uma hifa vegetativa em célula-pé, (ii) diferenciação da célula-pé formando a haste do
- 19 -
conidióforo, e expansão gradativa de seu ápice, formando a vesícula do conidióforo, (iii)
brotamento de métulas na superfície interna da parede da vesícula, (iv) brotamento das fiálides no
ápice das métulas e (v) formação da cadeia de conidios no ápice das fiálides (Timberlake e
Clutterbuck, 1994; Mims et al., 1988).
A célula pé pode ser distinguida das outras hifas vegetativas, por apresentar duas camadas
de parede celular. A camada externa, ou parede primária, é constituída pela parede da própria hifa
e a camada interna, ou parede secundária, delimita o conteúdo celular da célula pé (Fig. 2A)
(Oliver, 1972). A partir da célula pé, tem início o desenvolvimento da haste do conidióforo, que é
multinucleada e asseptada (Fig. 2B). A região apical da haste é rica em vesículas citoplasmáticas
contendo substâncias precursoras e polimerizadoras da parede celular. Estas vesículas fundem-se
à membrana plasmática, promovendo o alongamento da haste (Mims et al., 1988; Oliver, 1972).
A região apical da haste sofre um alargamento gradual constituindo-se na vesícula do
conidióforo (Fig. 2C), que também possui dupla camada de parede celular. Durante sua formação,
ocorre acúmulo de vesículas citoplasmáticas que possuem substâncias precursoras e
polimerizadoras da parede celular, localizadas no ápice da vesícula do conidióforo (Oliver, 1972).
Esta vesícula possui vários núcleos que sofrem divisão mitótica, dando início ao desenvolvimento
das métulas (Fig. 2D). Estas surgem como protuberâncias na superfície interna da parede da
vesícula. Um núcleo migra da vesícula para cada métula em formação. A delimitação entre a
vesícula e a métula ocorre através de um septo descontínuo, com poro central, que permite a
comunicação citoplasmática entre os dois compartimentos (Mims et al., 1988; Oliver, 1972).
No ápice das métulas ocorre o brotamento das fiálides (Fig. 2E). O núcleo que migrou para a
métula sofre divisão mitótica, originando um núcleo filho, que migra para a fiálide. A delimitação
entre a métula e a fiálide ocorre também através da formação de um septo descontínuo, com um
poro central. O conjunto de métulas e fiálides é denominado esterigma. Finalizado o
desenvolvimento das fiálides tem início a formação dos conidios primários, que emergem do ápice
das fiálides (Fig. 2F). Durante este processo, o núcleo das fiálides sofre repetidas divisões
mitóticas, migrando para o conidio em formação, ocorrendo um atraso na fase G1 do ciclo celular,
que contribui para a formação da parede celular do conídio. Tal processo tem início com o
prolongamento das paredes primárias e secundárias das fiálides e, no decorrer da maturação dos
conidios, ocorre a deposição interna de novas membranas, tornando-os impermeáveis e
garantindo sua dormência. Este é um processo contínuo, formando-se longas cadeias de esporos
derivados de cada fiálide, de tal maneira que o primeiro conidio formado localiza-se no topo da
cadeia de esporos (Mims et al., 1988; Bergen e Morris, 1983; Timbelake, 1980; Oliver, 1972).
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3.2 Principais Genes envolvidos no controle da Conidiogênese
A diferenciação envolvida na morfogênese do conidióforo de Aspergillus nidulans, encontra-
se sob rígido controle genético. A análise de mutantes para os diferentes passos da conidiogênese
contribuiu para um maior entendimento dos processos relacionados ao desenvolvimento e
diferenciação do conidióforo em A. nidulans e, de acordo com Timberlake (1990), vários genes
estão relacionados com a transição do ciclo vegetativo ciclo assexual, controlando a formação
do conidióforo e dos conidios.
A transição do ciclo vegetativo para o ciclo assexual ocorre em resposta a sinais de
desenvolvimento, que requerem a expressão de um grande número de genes, dentre os quais
podemos destacar: fluG (fluffy), flbA, flbB, flbC, flbD e flbE (fluffy like bristle), caracterizados como
genes precoces na indução da conidiogênese (Wieser et al. 1994).
O gene fluG é requerido para a produção de um fator extracelular, necessário para iniciar a
conidiogênese. O mecanismo pelo qual a proteína FluG ativa este fator extracelular ainda é
desconhecido (Wieser et al. 1994; Lee e Adams 1994).
O produto do gene flbA (FlbA) inativa a subunidade α de uma proteína G- heteromérica,
codificada pelo gene fadA (fluffy autolitic dominant). Mutantes para o gene flbA, além de aconidiais,
são também autolíticos, resultando numa completa lise celular após vários dias de crescimento a
37
o
C. (Yu et al., 1999). O produto do gene fad, por sua vez, regula negativamente a
conidiogênese.
Os demais genes, flbB, flbC, flbD e flbE, são também requeridos para a transmissão do sinal
de FluG e produção do RNAm do gene brlA (Wieser et al., 1994).
Com relação aos genes que afetam a formação do conidióforo e dos conidios, através de
estudos moleculares e bioquímicos, foi possível demonstrar que wetA, brlA e abaA são os
principais genes requeridos especificamente para o desenvolvimento normal dos conidióforos, e
considerados essenciais na via central de regulação da conidiogênese (Clutterbuck, 1969).
Mutações em qualquer um destes três genes bloqueiam a esporulação assexual em estágios
específicos da morfogênese do conidióforo, e previnem a expressão de classes de genes que
codificam o RNAm, envolvidos na regulação do desenvolvimento (Mirabito et al., 1989; Boylan et
al., 1987)
O locus brlA (bristle) codifica um regulador transcricional do tipo zinc-finger, a proteína BrlA,
necessária para desencadear o desenvolvimento do conidióforo. O gene brlA possui uma única
ORF (open reading frame) e ausência de introns (Adams et al., 1988). Prade e Timberlake (1993)
encontraram dois tipos de RNAms do gene brlA: um de 2,1 Kb, denominado α, e um menos
abundante, de 2,5 Kb, denominado β. Ambos RNAms são resultantes de dois sítios de início de
transcrição no gene brlA e apresentam uma sobreposição na região estrutural, sendo que a
- 21 -
transcrição de β é iniciada a quase 1 Kb à frente do transcrito α. Portanto, a proteína BrlA
codificada por β contém 23 aminoácidos adicionais em relação à proteína resultante da tradução
de α. Tem sido proposto que o produto da expressão de brlAβ realiza um papel importante
durante a iniciação e os primeiros estágios de diferenciação do conidióforo enquanto que o produto
de brlAα, seria essencial nos estágios mais avançados do desenvolvimento do conidióforo. Através
de técnicas moleculares de recombinação homóloga, removeram-se os sítios de início de
transcrição do gene brlA, ora do transcrito α, ora do β, ou de ambos. Os mutantes que
expressavam apenas o transcrito α apresentavam conidióforos secundários, os que expressavam
apenas β, formavam cadeias de métulas, e os mutantes que perderam ambos os transcritos,
apresentavam fenótipo bristle grave ou nulo típico, formando apenas longas hastes
indiferenciadas. As diferenças na morfogênese dos mutantes indicam que ambos transcritos são
necessários para o correto desenvolvimento do conidióforo (Han et al., 1993; Prade e Timberlake,
1993)
Os conidióforos de mutantes brlA (deficientes para a síntese da proteína BrlA) não formam as
vesículas e apresentam hastes que podem se alongar até 2-3 mm. Mutantes brlA, denominados
graves, não formam esterigmas e podem ser aconidiais (Adams et al. 1998). Cluterbuck (1969)
analisando vários mutantes brl, observou a existência de fenótipos intermediários entre bristle
grave (mutantes que formam apenas as hastes dos conidióforos) e fenótipos selvagens.
O gene abaA (abacus) codifica um fator de transcrição, a proteína ABAA, que se liga ao
DNA, reconhecendo a seqüência 5’-CATTCY-3’, sendo Y uma pirimidina. Os produtos do gene
abaA estão envolvidos na regulação do desenvolvimento do esterigma e, presumivelmente,
afetam alguns aspectos da diferenciação das fiálides, uma vez que o RNAm de abaA acumula-se
durante o período de formação de métulas e fiálides (Boylan et al., 1987).
A indução do gene abaA leva à ativação de genes específicos para o desenvolvimento, tais
como brlA e wetA. Estes genes são induzidos reciprocamente, mas, a expressão de brlA deve
ocorrer antes da expressão de abaA para que a conidiogênese se complete. Para a formação das
fiálides apenas a expressão do gene brlA é necessária, mas para estas tornarem-se funcionais e
produzirem conídios, é necessária a expressão do gene abaA (Adams et al., 1998). A expressão
induzida de brlA nas hifas indiferenciadas, ativa a transcrição de abaA com o desenvolvimento de
fiálides funcionais. A ativação induzida do gene abaA não leva à formação imediata de fiálides e
conídios, mas ativa a transcrição do gene brlA, causando alterações morfológicas no conidióforo
(Fig. 3A). Destas observações concluiu-se que a ativação do gene abaA deve ocorrer
ordenadamente, para que a diferenciação de fiálides funcionais ocorra normalmente (Mirabito et
al., 1989; Boylan et al., 1987).
- 22 -
O gene wetA codifica um polipeptídeo rico em serina, treonina e prolina. Embora análises de
seqüências de nucleotídeos deste gene não indiquem claramente sua função, análises de
sequências similares, obtidas de banco de dados, têm proposto que o gene wetA codifica um
regulador de expressão de genes esporo-específicos, envolvidos na síntese de componentes
essenciais da parede celular (Marshall e Timberlake, 1991). Esta hipótese se baseia em estudos
de mutantes wetA, os quais acumulam uma grande quantidade de RNAm específicos para a
conidiação (Boylan et al., 1987). Além disto, a ativação forçada de wetA em células vegetativas,
causa inibição do crescimento e ramificação excessiva das hifas, resultando no acúmulo de
transcritos de vários genes que normalmente são expressos apenas durante a formação do
esporo, e cujos RNAm são encontrados nos esporos maduros (Marshall e Timberlake, 1991). A
ativação de wetA em hifas, não resulta na ativação de brlA ou abaA, tampouco na indução
prematura da esporogênese. Mutantes wet-white (wetA) (Fig. 3.B) produzem conídios não-
pigmentados (brancos), aparentemente normais, mas que sofrem autólise logo após sua formação,
devido à falha na formação de sua parede celular interna (Sewall et al., 1990).
As informações disponíveis sobre o desenvolvimento dos conidióforos sugerem que os três
genes wetA, brlA e abaA, controlam a diferenciação temporal e espacial do conidióforo em A.
nidulans, sendo o gene brlA epistático sobre os genes abaA e wetA, e abaA epistático sobre wetA,
tanto em nível molecular quanto morfológico (Sewall et al., 1990; Mirabito et al., 1989; Boylan et
al., 1987).
stunted (stu) e medusa (med) são outros genes envolvidos na regulação do desenvolvimento
em A. nidulans, sendo necessários para a precisa organização espacial e temporal do conidióforo
multicelular (Aguirre, 1993; Miller et al., 1992; Mirabito et al., 1989; Mims et al., 1988). Tais genes
têm sido chamados de modificadores do desenvolvimento. Mutações em qualquer um destes dois
genes proporcionam o desarranjo da organização do conidióforo, mas ambos mutantes são
capazes de produzir conidios viáveis (Clutterbuck, 1969).
O gene stuA de A. nidulans, tal como o locus brlA, possui dois transcritos, stuAα e stuAβ os
quais são produzidos a partir de diferentes sítios de transcrição. Os transcritos α e β codificam
proteínas que apresentam domínios de ligação ao DNA similares a fatores de transcrição de outros
fungos (Gimeno e Fink, 1994).
O gene stuA possui grande similaridade com o gene phd1 de S. cerevisiae, cuja expressão
induz o desenvolvimento de pseudo-hifas, processo este que aparentemente, pode ser análogo à
produção de conidióforos (Gimeno e Fink, 1994). Durante o desenvolvimento da pseudo-hifa,
ocorre alongamento polar das células mãe, originando células filhas que irão produzir os
filamentos. A via de desenvolvimento de pseudo-hifas é semelhante à morfogênese do conidióforo,
onde o brotamento das métulas e fiálides resulta da germinação polar das vesículas. Estas
- 23 -
divisões polares são ausentes em mutantes stuA. A super expressão do gene stuA, isto é, o uso
de cópias extras do gene stuA em linhagens medA
-
, bloqueia a atuação do gene brlA em
direcionar a diferenciação terminal do conidióforo, promovendo o crescimento das pseudo-hifas,
indicando assim o papel de stuA neste processo (Busby et al., 1996). Portanto, stuA é
indispensável para a diferenciação das métulas e fiálides, as quais são estruturas consideradas
morfologicamente análogas à pseudo-hifas (Miller et al., 1992). Mutações no gene stuA resultam
na produção de conidióforos curtos, com parede celular afinada, com falta de métulas e fiálides,
mas que sustentam os conidios de coloração aparentemente normal, produzidos diretamente da
vesícula do conidióforo (Fig 3.C-E) (Clutterbuck, 1969).
O gene medusa (medA) codifica um fator de transcrição aparentemente requerido para a
correta expressão temporal de brlA, pois os produtos de brlA são detectados mais precocemente
em mutantes medA do que em linhagens selvagens (Adams et al., 1998). Semelhante aos genes
stuA e brlA, mutantes medA possuem expressão anormal do gene abaA (reduzida ou ausente),
essencial para o desenvolvimento das fiálides (Busby et al., 1996). Estes resultados sugerem uma
interação entre as proteínas MedA e BrlA, demonstrando que, provavelmente, MedA atua como
estabilizador do complexo transcricional presente no gene brlA (fig. 3.F-H) (Miller et al., 1991).
A Fig. 4 apresenta um esquema que resume a participação dos principais genes envolvidos
na organização do conidióforo, bem como a participação de sinais do meio externo.
4. CICLO PARASSEXUAL
O ciclo parassexual, foi descrito pela primeira vez em Aspergillus nidulans por Pontecorvo et
al. (1953), como um mecanismo de variabilidade genética, principalmente em fungos sem
reprodução sexual.
Este ciclo resulta na obtenção de recombinantes mitóticos entre duas linhagens de fungos e
apresenta a seguinte seqüência de eventos: (i) anastomose de hifas de homocários de diferentes
genótipos, que resulta na formação do heterocário (hetero = diferente; karyos = núcleo), (ii) fusão
de dois núcleos haplóides diferentes gerando um diplóide heterozigoto, (iii) recombinações
mitóticas ocasionais durante a multiplicação dos núcleos diplóides, e (iv) não-disjunção
cromossômica, que origina recombinantes haplóides, via sucessivos estágios de aneuploidia
(Pontecorvo et al., 1953).
4.1 Formação do Micélio Heterocariótico
A fusão das hifas é um processo que se observa em várias etapas do ciclo de vida dos
fungos filamentosos. Durante a anastomose, as hifas estabelecem contatos através da quebra da
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parede celular, seguida pela fusão das membranas plasmáticas. A fusão pode ocorrer entre hifas
de uma mesma colônia ou entre colônias diferentes, resultando assim na formação do heterocário,
que por sua vez, está sujeito ao controle dos sistemas de incompatibilidade vegetativa (Glass e
Kaneko, 2003; Xiang et al., 2002). A anastomose de hifas ocorre em três estágios fisiológicos
distintos: pré-contato, pós-contato e pós-fusão (Glass et al., 2000).
O início do estágio de pré-contato envolve o crescimento e o direcionamento da extremidade
de uma hifa, que estabelecerá contato com outra hifa da mesma colônia ou de uma colônia
diferente. Tal processo, provavelmente, ocorre pela difusão de sinais químicos.
No estágio pós-contato, as extremidades das hifas que sofreram anastomose param de
crescer. Tais extremidades contêm um conjunto de vesículas ligadas à membrana e envolvidas por
uma rede de microfilamentos de actina. Este complexo é denominado corpo apical ou complexo
“Spizenkörper” (Fig. 5) (Glass et al., 2004; Glass et al., 2000).
As vesículas que formam o corpo apical são provavelmente formadas no complexo de Golgi
e transportadas para o ápice da hifa em crescimento, por filamentos de actina do citoesqueleto
(Jockusch et al., 1977). Tais vesículas se fundem à membrana plasmática da hifa em crescimento,
liberando seu conteúdo, ou seja, enzimas envolvidas na síntese da parede celular (quitina sintase
e glucano sintase), enzimas envolvidas na lise de parede, enzimas ativadoras e os polímeros pré-
formados de parede celular, tais como as manoproteínas (Bartnicki-Garcia et al. 1995; Howard,
1981).
Os eventos que caracterizam o estágio de pós-fusão incluem a fusão das membranas
plasmáticas e a mistura dos componentes citoplasmáticos (Jacobson et al., 1998). Neste estágio, o
corpo apical ainda persiste, ocorrendo adesão das paredes celulares das hifas, acompanhadas
pela parada do crescimento das extremidades. Posteriormente ocorre a destruição das paredes
celulares no ponto de contato entre as hifas envolvidas, provavelmente pela liberação de enzimas
hidrolíticas. Uma nova parede celular é formada entre as hifas envolvidas na anastomose,
processo relacionado com a liberação do conteúdo das vesículas que fazem parte do complexo
“Spitzenköper” (Hickey et al., 2002).
A formação do heterocário através da anastomose de hifas homocarióticas é um processo
importante no ciclo de vida de várias espécies de fungos, atuando como um pré-requisito para a
ocorrência dos processos de reprodução sexual e parassexual (Xiang e Glass 2004; Jacobson et
al., 1998). Genes que integram os sistemas de incompatibilidade vegetativa regulam a formação
do heterocário em fungos filamentosos (Saupe, 2000).
Dois tipos de sistemas genéticos foram descritos como reguladores da incompatibilidade
vegetativa, o sistema alélico e o não-alélico. No sistema alélico, a anastomose entre linhagens que
contém especificidades alternativas para um único locus het, leva a incompatibilidade vegetativa.
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No sistema não-alélico, uma interação entre alelos específicos de dois loci diferentes desencadeia
a incompatibilidade (Leslie, 1993; Glass e Kuldau, 1992). Linhagens vegetativamente compatíveis
são incluídas no mesmo grupo de compatibilidade vegetativa (VCG) e linhagens sexualmente
compatíveis são governadas por um ou mais loci denominados mating-type, que podem
apresentar um ou mais alelos (Coppin et al., 1997). A fusão de hifas entre linhagens
geneticamente idênticas para um conjunto de loci denominados het (incompatibilidade
heterocariótica) ou loci vic (incompatibilidade vegetativa) resulta geralmente num heterocário
vegetativo estável. Alternativamente, linhagens que diferem entre si em qualquer um destes loci
(het ou vic) são incapazes de formar heterocário e são classificadas como vegetativamente
incompatíveis (Saupe, 2000).
A fusão das hifas pode ocorrer normalmente entre linhagens com núcleos vegetativamente
incompatíveis. Contudo, após a fusão incompatível ocorrer, uma reação de morte celular é
desencadeada nas células que formam o heterocário. Na região de contato entre as duas colônias,
há formação de uma barreira, que consiste numa região contendo células mortas ou hifas em
processo de morte celular (Fig. 6). Grânulos citoplasmáticos são formados minutos após a fusão
das hifas e, os poros septais, pelos quais as células se comunicam, tornam-se obstruídos,
provavelmente para compartimentalizar os segmentos de hifas em processo de morte. O
citoplasma torna-se vacuolizado, fragmentando-se em pequenas vesículas envolvidas por
membrana plasmática, as organelas são degradadas e a membrana plasmática é deslocada a
partir da parede celular. O citoplasma contém vesículas com proteases e enzimas de degradação,
as quais são liberadas, promovendo a lise celular aproximadamente 30 minutos após a fusão
(Marek et al., 2003; Glass e Kaneko, 2003; Leslie, 1993). As mudanças estruturais das hifas em
processo de morte são consistentes com o processo de morte celular programada (MCP)
observado em eucariontes superiores (Fig. 6) (Glass et al., 2000).
Dentre os ascomicetos, o número de loci het ou vic pode variar de seis a onze, dependendo
da espécie (Glass et al., 2000). Em Aspergillus nidulans, oito loci het foram identificados e
mapeados nos cromossomos II, III, V, VI e VII (Anwar et al.,1993). Em Neurospora crassa onze
loci het controlam o processo da incompatibilidade (Glass e Kuldau, 1992). Em Podospora
anserina, nove loci het foram descritos controlando o processo da incompatibilidade vegetativa
(Loubradou e Turcq, 2000). Em Fusarium moniliforme, dez loci vic foram identificados com base na
segregação de diferentes VCGS, entre cruzamentos de linhagens específicas (Puhalla e Speith,
1985).
Três métodos podem ser utilizados na identificação dos loci vic: avaliação direta da formação
do heterocário (geralmente pela complementação entre marcadores genéticos); avaliação direta da
incapacidade de formar um heterocário (geralmente pela formação de barreiras); e caracterização
- 26 -
de linhagens que apresentam regiões duplicadas do genoma, tornando-as heterozigotas para um
ou mais loci vic (Leslie, 1993).
Os testes de avaliação direta da heterocariose envolvem geralmente a formação de um
heterocário prototrófico estável nas condições em que, isoladamente, nenhuma das duas
linhagens auxotróficas poderia sobreviver. Em princípio, qualquer marcador genético pode ser
usado para esta avaliação, porém, na prática, marcadores nutricionais, de resistência a fungicidas
ou de coloração de conídios são preferencialmente utilizados, pela facilidade de caracterização
fenotípica do heterocário. De qualquer maneira, deve-se considerar que heterocários prototróficos
serão obtidos somente se as linhagens envolvidas forem idênticas quanto aos alelos dos loci het
ou vic, caso contrário, o crescimento prototrófico não ocorrerá (Puhalla e Spieth, 1985; Leslie,
1993).
A identificação de loci vic, através da obtenção de linhagens portadoras de duplicações de
regiões cromossômicas que contém genes de incompatibilidade vegetativa, é possível através da
construção de linhagens heterozigotas para um locus particular. Tais linhagens são
fenotipicamente aberrantes, apresentando crescimento, pigmentação e morfologia anormal
(Perkins, 1988).
A caracterização de linhagens através da determinação dos grupos de compatibilidade
vegetativa permite a identificação de clones provenientes de um progenitor comum, uma vez que
linhagens pertencentes a um mesmo VCG são geneticamente semelhantes. Este método auxilia
também na identificação de linhagens patogênicas e no mapeamento gênico (Leslie, 1993;
Chaisrisook e Leslie, 1990). A utilização de VCGs como ferramenta de diagnóstico é de extrema
validade para os fitopatologistas, uma vez que sua aplicação está relacionada com a hipótese de
que linhagens pertencentes ao mesmo grupo patogênico integram um determinado VCG (Fig. 7)
(Puhalla e Spieth, 1985).
Os sistemas de incompatibilidade vegetativa atuam, portanto, no sentido de restringir a
transferência nuclear e de elementos citoplasmáticos durante o crescimento de fungos
filamentosos (Leslie, 1993).
As barreiras da incompatibilidade vegetativa podem ser superadas artificialmente pela
técnica de fusão de protoplastos, caracterizada pela remoção enzimática da parede celular. Esta
técnica consiste num método valioso para a obtenção de híbridos intra e inter-específicos de várias
espécies de fungos, tornando-a uma ferramenta fundamental para análises genéticas (Corner e
Poulter, 1989). A fusão intra-específica de protoplastos é eficiente para induzir o ciclo parassexual,
permitindo a obtenção de diplóides heterozigotos e, consequentemente, de novas linhagens
através de recombinação mitótica (Furlaneto e Pizziani-Kleiner, 1992; Anne, 1983).
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Viaud et al. (1998) obtiveram pela de fusão interespecífica de protoplastos, entre as espécies
Beauveria bassiana (linhagem Bb28) e Beauveria sulfurescens (linhagem Bs2) híbridos somáticos,
os quais foram significativamente diferentes dos paternais, com relação à patogenicidade. Alguns
dos híbridos foram hipervirulentos, matando insetos mais rapidamente do que a linhagem Bb28,
provavelmente porque seus híbridos adquiriram a atividade tóxica da linhagem Bs2. Análises
genéticas dos híbridos demonstraram a ocorrência de possíveis eventos de recombinação
mitótica, pela combinação de informações originadas de diferentes marcadores moleculares dos
paternais.
4.2 Formação e haploidização do núcleo diplóide heterozigoto
Na seqüência de eventos que compõem o ciclo parassexual, a formação do núcleo diplóide
ocorre em razão da fusão de dois núcleos haplóides. Tal mecanismo ainda é pouco compreendido
e parece ser um evento relativamente raro. O núcleo diplóide pode ser estável mitoticamente e,
através de divisões mitóticas sucessivas, poderá dar origem a outros núcleos diplóides. Durante a
propagação do núcleo diplóide, núcleos recombinantes podem se originar espontaneamente
através do crossig-over mitótico. Ao contrário do que se observa em Sacharomyces cerevisiae, o
fungo filamentoso A. nidulans permanece grande parte de seu ciclo celular em G2, fase em que
seus cromossomos encontram-se duplicados. Este fato favorece significativamente a ocorrência
de eventos de recombinação mitótica (crossing-over mitótico) (Osman et al.,1993; Pontecorvo e
Kafer, 1958).
A instabilidade somática dos núcleos diplóides de A. nidulans encontra-se geralmente
associada a ocorrência de crossing-over mitótico e a perdas de material genético, durante o
processo de haploidização (Georgpoulos et al., 1976; Parag e Roper, 1975). Durante a divisão
mitótica do núcleo diplóide (2n), perdas cromossômicas podem ocorrer, originando núcleos
filhos com número extra (2n+1, 2n+2, etc) ou incompleto de cromossomos (2n-1, 2n-2, etc). Tais
núcleos, denominados aneuplóides, são extremamente instáveis e continuam a perder
cromossomos durante as subseqüentes divisões mitóticas. Consequentemente, os núcleos
2n+1 revertem ao estado 2n, enquanto os núcleos 2n-1 progressivamente revertem para o
estado haplóide (n) (Deacon, 2005; Paccolla-Meirelles e Azevedo, 1991).
Em A. nidulans, linhagens aneuplóides podem ser macroscopicamente identificadas
pela formação de colônias com bordos irregulares e de crescimento mais lento que as colônias
haplóides normais. Tais linhagens são mitoticamente instáveis, originando espontaneamente
segregantes mitóticos em suas colônias (Pollard et al., 1968).
O crossing-over mitótico constitui um dos principais mecanismos de reparo do DNA em
eucariotos, resultando em trocas cromossomais espontâneas ou induzidas por agentes químicos
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ou físicos. O reparo de danos no DNA, através do processo de recombinação mitótica requer que
a célula contenha em seu genoma uma região de homologia com a região danificada. Em células
diplóides, as moléculas de DNA estão presentes na forma de cromossomos homólogos. Nas
células haplóides, por outro lado, o homólogo é providenciado pela cromátide irmã, presente na
fase G2 do ciclo celular, após a replicação do DNA (Galli e Schiestl, 1998; Esposito, 1978; Fabre,
1978).
No reparo recombinacional, as fitas que sofreram os cortes iniciais geram uma extremidade
3’OH livre, que invade uma região homóloga, criando uma alça-D (região de DNA heteroduplex). A
extremidade 3’OH invasora é utilizada como primer, sendo estendida pela síntese de DNA. A alça-
D, por sua vez, permite o reparo da fita complementar, havendo a formação de duas junções de
Holliday que são resolvidas por clivagem endonucleotídica, originando cromossomos paternais ou
recombinantes (Davies et al., 1975).
O crossing-over mitótico tem uma função importante na identificação de mutações recessivas
em células diplóides heterozigotas. Permutas mitóticas podem ocorrer durante a segregação das
cromátides, durante a mitose e após as cromátides homólogas estabelecerem contatos entre si. A
segregação de uma cromátide paternal e uma recombinante em direção ao mesmo pólo mitótico,
resulta na homozigose dos genes distais ao ponto de permuta mitótica. A perda da
heterozigosidade resultante de um evento de permuta mitótica pode originar células homozigotas
para o alelo não-funcional (Beumer et al., 1998). Desta maneira, o processo de recombinação
mitótica pode favorecer a expressão de genes deletérios, previamente presentes na condição
heterozigota (Hagstrom e Dryja, 1999; Beumer et al., 1998; Pires e Zucchi, 1994). Em razão disto,
o estudo da genotoxicidade de substâncias químicas torna-se primordial no sentido de se detectar
aquelas que apresentam potencial recombinagênico (Barrett, 1993).
Dentre os agentes físicos que induzem o crossing-over mitótico, podemos citar as radiações
ionizantes e as não-ionizantes. As radiações ionizantes, como os raios-X, promovem quebras em
fitas duplas de DNA, e as não-ionizantes, como a luz ultra-violeta (UV), promovem a formação de
dímeros ciclobutanos de pirimidinas (CPD) e 6-4 fotoprodutos (6-4 PP) na molécula de DNA
(Abbadessa e Burdick, 1963; Wood e Kafer, 1969). As lesões induzidas pela luz UV, resultam em
distorções consideráveis na estrutura do DNA (Michel e Nairm, 1989).
Mutantes de A. nidulans deficientes para o reparo do DNA foram identificados e divididos
em quatro grupos epistáticos. O grupo UvsF/H é formado por mutantes para os loci uvsF, uvsH
e uvsJ, os quais apresentam defeitos no reparo por excisão de nucleotídeos, altos índices de
recombinação mitótica intergênica e mutagênese induzida por UV (Kafer e Mayor, 1986).
Mutantes do grupo UvsB (uvsB e uvsD) estão relacionados com o controle dos sistemas de
checagem, que avaliam a aptidão das células para procederem no ciclo celular, em resposta a
- 29 -
lesões e/ou replicação incompleta do DNA. Mutantes deste grupo apresentam alterações no
controle do ciclo celular, originando segregantes instáveis a partir de conídios diplóides.
Mutantes desse grupo epistático UvsC (uvsC, uvsE e uvsA) são deficientes no reparo
recombinagênico, hiper-sensíveis a drogas que induzem DSBs (double-strands break – quebras
em fitas duplas de DNA) e apresentam altas freqüências de recombinaçãp mitótica. A proteína
UVSC é homóloga às proteínas RECA de Escherichia coli e RAD51 de Saccharomyces
cerevisae, que atuam na via de reparo pós-replicação ou recombinagênico (Han et al., 1998). O
grupo UvsI (uvsI), codifica uma proteína homóloga à REV3 (sub-unidade catalítica da DNA
polimerase Zeta) de S. cerevisae, envolvida no reparo de lesões no DNA. Mutantes uvsI,
apresentam redução na reversão espontânea ou induzida de certas mutações de ponto,
provavelmente em consequência de deficiências na síntese de DNA em certos tipos de lesões
(Goldman et al., 2002; Han et al, 1998; Kafer e Mayor, 1986).
Mutantes uvsH de A. nidulans vêm sendo utilizados com sucesso, no monitoramento de
eventos de recombinação mitótica, em razão de apresentarem altas taxas de recombinação
mitótica intergênica, em diplóides homozigotos (uvsH//uvsH) (Busso et al., 2001). Tais diplóides
foram utilizados para avaliar a atividade genotóxica do cremofor EL, solvente orgânico utilizado
em protocolos de quimioterapia, como solubilizante de drogas hidrofóbicas, e como
emulsificante na indústria de alimentos. Diplóides uvsH//uvsH tratados com cremofor EL
apresentaram aumento significativo na freqüência de crossing-over mitótico quando
comparados com linhagens não tratadas.
Pires e Zuchi (1994) descreveram um método para detectar o potencial genotóxico de
substâncias químicas, utilizando o ciclo parassexual de A. nidulans. O método consiste em obter
diplóides prototróficos, porém heterozigotos para mutações letais condicionais, utilizando-se,
especificamente, de marcadores nutricionais. Os diplóides são cultivados em Meio Mínimo
(MM), acrescido da substância em estudo, permitindo apenas o crescimento de linhagens
prototróficas. Os núcleos diplóides passarão por mitoses sucessivas, originando novos núcleos
diplóides, os quais, por sua vez, poderão ser heterozigotos (+/- ou -/+) ou homozigotos (+/+)
para um determinado marcador genético, porém núcleos homozigotos para genes recessivos (-
/-) serão incapazes de se desenvolverem em MM. O monitoramento da recombinação mitótica
neste teste é feito através da determinação do Índice de Homozigotização (HI) para um
determinado marcador nutricional, cuja análise baseia-se na ocorrência de recombinação
mitótica em intervalos gênicos específicos. Segregantes diplóides prototróficos obtidos em
presença do composto em estudo são purificados em MM e haploidizados em Meio Completo
(MC). Os segregantes haplóides obtidos são posteriormente caracterizados fenotipicamente. O
HI para cada marcador é dado pelo quociente entre o número de segregantes prototróficos e o
- 30 -
número de segregantes auxotróficos. Se o composto em análise induzir o crossing-over mitótico
no diplóide original, HIs ≥ 2,0 serão obtidos. Por outro lado, HIs < 2,0 indicam ausência de
recombinação mitótica (Fig. 8).
Substâncias que alteram os processos de duplicação e transcrição do DNA, tais como
doxorrubicina e etoposida, quimioterápicos utilizados no tratamento de cânceres humanos,
estimulam o crossing-over mitótico em células eucarióticas (Chiuchetta e Castro-Prado, 2002).
Tais compostos são denominados “venenos” de topoisomerase II, pois se ligam às moléculas de
DNA e inibem a atividade catalítica desta enzima, cuja função é essencial na manutenção da
topologia do DNA (Boege, 1996; Crebelli e Carere, 1987). Becker et al. (2003) utilizaram o agente
intercalante brometo de etídio, inibidor da topoisomerase II, para avaliar a perda de
heterogozidade de marcadores nutricionais, em células diplóides de A. nidulans, através da
determinação dos valores de HI. Os diplóides tratados com este agente apresentaram valores de
HI significativamente maiores do que os valores do controle. Estes resultados indicam que o
agente intercalante é potencialmente capaz de induzir crossing-over mitótico em células diplóides
de A. nidulans, e esta atividade pode ser relacionada com outras drogas quimioterápicas usadas
no tratamento do câncer.
O potencial recombinagênico do alcalóide vincristina, utilizado no tratamento de vários tipos
de cânceres (Tsutsui et al., 1986; Morgan e Crossen, 1980), foi avaliado com a utilização de duas
linhagens diplóides de A. nidulans: uma selvagem para o gene uvsH (uvsH
+
//uvsH
+
) e outra
deficiente para o reparo por excisão de nucleotídeos do DNA (uvsH/uvsH). A avaliação do
potencial recombinagênico desta droga foi realizada através da determinação dos valores de HI. O
diplóide deficiente para o reparo apresentou maior sensibilidade ao efeito recombinagênico da
droga, confirmado pelos valores de HI obtidos (Chiuchetta e Castro-Prado, 2002).
A recombinação via processos parassexuais tem sido demonstrada na maioria dos fungos
filamentosos já estudados, incluindo os fungos de importância industrial, os entomopatogênicos, os
fitopatogênicos e os de interesse médico (Debets, 1998).
A ocorrência natural dos processos parassexuais foi demonstrada pelo isolamento de
linhagens diplóides em várias espécies de fungos, incluindo: Ustilago maydis, Verticillium dahliae,
V. albo-atrum, Aspergillus niger dentre outras (Caten, 1981). Zeigler et al. (1997) sugeriram a
ocorrência de trocas de material genético, via processos parassexuais, entre isolados de
Magnaporthe grisea, utilizando a técnica de RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism).
A recombinação parassexual ocorreu em freqüência detectável, caracterizando-se como um
importante mecanismo de variabilidade genética, além de ser capaz de eliminar mutações
deletérias acumuladas em linhagens clonais.
- 31 -
Os processos parassexuais de recombinação têm sido utilizados em análises genéticas de
fungos, tanto aqueles que apresentam reprodução sexual, quanto aqueles cujo ciclo sexual não foi
ainda descrito (Debets, 1998). Os recombinantes intercromossomais fornecem informações úteis
sobre o número de cromossomos da espécie, e auxiliam no mapeamento de novas mutações
(Swart, 2001).
O ciclo parassexual também vem sendo utilizado para a obtenção de linhagens do gênero
Aspergillus, que apresentam altos níveis de produção de certos metabólitos, tais como a proteína
quimosina (Bodie et al., 1994) e o ácido cítrico (Sarangbin et al., 1994). Loera e Córdova (2003)
descreveram o aumento da produção de xilanase em uma linhagem diplóide (D4) de Aspergillus
niger. Esta linhagem foi isolada via recombinação parassexual entre duas linhagens haplóides
produtoras desta enzima. O diplóide D4 produziu uma quantidade aproximadamente 100 vezes
maior da enzima, quando comparada com a linhagem haplóide selvagem. Desta maneira, a
recombinação parassexual torna-se uma ferramenta muito importante na obtenção de linhagens
super-produtoras de enzimas, tais como a xilanase, mundialmente utilizada nas indústrias de papel
(Gerber et al., 1997) e alimentos (Coughlan e Hazlewood, 1993).
5. CICLO PARASSEXUAL COM PARAMEIOSE
O ciclo parassexual, como originalmente descrito, apresenta variações em um grande
número de espécies de fungos. Tais variações estão relacionadas com a instabilidade do núcleo
diplóide e têm sido detectadas em diferentes espécies e por diferentes procedimentos (Bonatelli Jr
et al., 1983; Das e Ilczuck, 1978).
Os núcleos diplóides formados no interior das hifas heterocarióticas podem ser altamente
instáveis, sofrendo haploidização antes da produção de conídios. Desta maneira, a fase diplóide é
considerada transitória, sendo os haplóides recombinantes obtidos diretamente do heterocário.
Este processo foi denominado parameiose (Bonatelli Jr et al., 1983), sendo descrito inicialmente
em Cephalosporium acremonium (Ball e Hamlyn, 1982) e posteriormente em outros
deuteromicetos, tais como Aspergillus niger (Bonatelli Jr et al., 1983), Metharhizium anisopliae
(Bagagli et al., 1991), Beauveria bassiana (Paccola-Meirelles e Azevedo, 1991; Bello e Paccola-
Meirelles, 1998) e Trichoderma pseudokoningii (Bagagli et al., 1995).
A seleção de diplóides em heterocários formados entre linhagens geneticamente distintas e
portadoras de auxotrofias complementares é normalmente realizada em meio pobre, constituído
basicamente de glicose e sais minerais, permitindo apenas o isolamento de linhagens
prototróficas, diplóides ou haplóides. Este procedimento, entretanto impede a seleção de
- 32 -
segregantes parameióticos, os quais podem apresentar auxotrofias, uma vez que possuem
genótipos recombinantes.
Inicialmente a parameiose foi descrita apenas em fungos imperfeitos, ou seja, aqueles que
não possuem reprodução sexual. Recentemente, entretanto, este processo foi descrito em
organismos que apresentam ciclo sexual, tais como Aspergillus nidulans (Baptista et al., 2003) e
Colletotrichum sublineolum (Souza-Paccola et al., 2003).
Baptista et al. (2003) utilizaram linhagens mutantes de A. nidulans, sensíveis à radiação UV
(uvs), para formar heterocários homozigotos e heterozigotos para estas mutações. Estes foram
inoculados em diferentes meios de cultura, enriquecidos com alguns dos requerimentos
nutricionais das linhagens paternais, permitindo assim o isolamento de segregantes auxotróficos
haplóides e estáveis mitoticamente (parameióticos).
Bagagli et al. (1991) formaram heterocários entre linhagens do fungo entomopatogênico
Metharhizium anisopliae, com marcadores genéticos nutricionais complementares. Estes foram
inoculados em meios de cultura, contendo os nutrientes apropriados para o isolamento de
segregantes parameióticos, diretamente do heterocário. Conidios foram isolados diretamente do
heterocário e analisados quanto à morfologia e requerimentos nutricionais. Estes procedimentos
permitiram o isolamento de haplóides recombinantes em freqüência relativamente elevada. Tal
resultado sugere que a parameiose consiste em um importante processo de obtenção de novas
combinações gênicas entre linhagens de M. anisopliae, fungo que apresenta grande potencial no
controle biológico de insetos.
No fungo fitopatogênico Colletotrichum sublineolum, agente causal da antracose do sorgo, a
recombinação genética, através do ciclo parassexual com parameiose, também foi observada.
Através do cruzamento entre mutantes ben (resistentes ao benlate) e act (resistente a
ciclohexemide), linhagens resistentes a ambos fungicidas puderam ser isoladas. A parameiose
atua, portanto, como um mecanismo natural para criar variabilidade genética, através do qual,
novas raças do patógeno podem ser isoladas (Souza-Paccolla et al., 2003).
O ciclo parassexual com parameiose consiste numa ferramenta importante para estudos de
variabilidade genética, por constituir uma forma rápida de obtenção de recombinantes, através do
crossing-over mitótico (Becker e Castro-Prado, 2006,2004; Baptista et al., 2003; Bello e Pacolla-
Meirelles, 1998; Bagagli et al., 1991; Bonatelli et al., 1983). Consequentemente, a parameiose
pode também ser utilizada como ferramenta na investigação do efeito recombinagênico de drogas
que afetam o DNA.
A doxorrubicina é um inibidor da enzima topoisomerase II que, embora seja amplamente
utilizada como agente antineoplásico, apresenta efeito recombinagênico (Chiucheta e Castro-
Prado, 2002). Tal efeito foi utilizado para induzir eventos parameióticos em heterocários formados
- 33 -
entre linhagens uvs e uvs+ de A. nidulans, os quais foram formados e inoculados em meios
seletivos contendo doxorrubicina. Segregantes haplóides (parameióticos e paternais) e
aneuplóides foram selecionados a partir de setores visíveis derivados dos heterocários. A
freqüência de segregantes parameióticos obtida foi significativamete maior em presença da droga
do que em sua ausência (Fig.9) (Becker e Castro-Prado, 2004).
A heterocariose em fungos atua como um fator que contribui para a extraordinária
capacidade adaptativa e elevada variabilidade genética observada entre os fungos filamentosos.
Os ciclos parassexual e parassexual com parameiose podem ser utilizados, portanto, como
ferramentas em estudos genéticos, tais como no mapeamento de novas mutações, na detecção de
aberrações cromossômicas e de translocações, e na obtenção de linhagens recombinantes
(Becker e Castro-Prado, 2006, 2004; Baptista el al., 2003; Souza-Pacolla et al., 2003; Bonatelli et
al., 1983).
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- 42 -
7. LEGENDA DAS FIGURAS
Fig. 1. Germinação, crescimento e divisão do conidiósporo uninucleado, originando uma hifa
multinucleada - (i) ativação do esporo em dormência, (ii) expansão conidial e crescimento da
parede celular, (iii) divisões mitóticas sucessivas e início do crescimento polarizado do tubo
germinativo (Figura fornecida por Doonan 1992).
Fig. 2. Alterações morfológicas durante a conidiação de Aspergillus nidulans. (A) hifas vegetativas
indiferenciadas, (B) formação da haste do conidióforo, (C) formação da vesícula, (D) métulas
emergindo a partir da vesícula, (E) formação das fiálides, (F) conidióforo maduro. Foto de
microscopia eletrônica de varredura de colônias FGSC 4 - Glasgow wild type (Boylan et al., 1987).
Fig. 3. Reprodução de foto de microscopia eletrônica de varredura (Aguire, 1993) de mutantes de
Aspergillus nidulans abaA (A) e wetA (B). Mutantes stuA, com conídios anormais formados
diretamente da vesícula do conidióforo (C) ou formados de um esterigma anormal (D e E). Mutante
medusa com várias camadas de métulas formadas (F e G) e com a produção de conidióforos
secundários (H).
Fig. 4. Esquema das interações gênicas que controlam o desenvolvimento do conidióforo,
incluindo a participação de sinais do meio externo (fontes de nitrogênio e carbono) e receptores de
membrana para a proteína FluG, na transição do ciclo vegetativo para o ciclo assexual.
Fig. 5. Região da extremidade apical de hifas de Fusarium acuminatum. A seta indica o complexo
“Spitzenkörpe”, formado por um aglomerado de vesículas localizadas na região apical da hifa. 1 =
microtúbulos, 2 = mitocôndria, 3 = microvesículas e 4 = cisternas de complexo de Golgi (Howard,
1981).
Fig. 6. Diagrama esquemático da fusão de hifas entre duas linhagens vegetativamente
compatíveis e incompatíveis de fungos filamentosos. Se ambas as linhagens forem idênticas para
todos os loci het, um heterocário vigoroso será formado. Se, por outro lado, as linhagens forem
diferentes quanto aos loci het, haverá degeneração da hifa no local da fusão (Glass e Kaneko,
2003).
- 43 -
Fig. 7. Complementação gênica entre mutantes nitM (A, B e C) de Fusarium graminearum. A
formação de heterocários (H) indica que os mutantes pertencem ao mesmo grupo de
compatibilidade vegetativa.
Fig. 8. Origem de diplóides heterozigotos (-/+ e +/-) e homozigotos (+/+) através de crossing-over
mitótico entre o gene paba (ácido p-aminobenzóico) e o centrômero. * O diplóide homozigoto (-/-)
não é selecionado em Meio Mínimo.
Fig. 9. Segregantes mitóticos (parameióticos) obtidos de heterocários formados entre linhagens
haplóides de A. nidulans.
- 44 -
Linhagem selvagem
Fig .1.
(i)
(ii)
(iii)
- 45 -
Fig. 2.
- 46 -
A
B
C D E
F
G
H
Fig. 3
- 47 -
Genes envolvidos na
diferenciação das fiálides
RECEPTOR ?
stuA
medA
FluG, flbA,
flb B, flbC,
flbD, flbE
brlA
abaA
wetA
Sinais do meio
externo
(Nitrogênio e Carbono)
Sinal extracelular
FluG
Gene esporo-
específico
Genes envolvidos na organização do
conidióforo
Genes precoces na indução
da conidiogênese
Fig. 4.
- 48 -
Fig. 5.
- 49 -
Linhagem A
Linhagem B
Fusão Hifas
Loci Het geneticamente compatíveis
Estabelecimento de heterocário compatível
Loci het geneticamente incompatíveis
Compartimentalização e morte celular
Vacuolização do citoplasma
Degradação de organelas e membranas
Fragmentação DNA
Fig. 6
- 50 -
.
Fig. 7.
A
H
B
H
C
- 51 -
Fig. 8.
A
A
/C =
-
/+
B
D
C
A
/D =
-
/+
B/C =
-
/+
B/D =
-
/+
4 + : 4
-
B
A
C
D
A
/C =
-
/
-
*
A
/D =
-
/+
B/C = +/
-
B/D = +/+
4 + : 2
-
sem crossing-over
crossing-over
paba
paba
+
+
+
+
paba
paba
+
+
- 52 -
Fig. 9.
- 53 -
Parasexuality in asexual development
mutants of Aspergillus nidulans
- 54 -
Parasexuality in asexual development mutants of Aspergillus nidulans
TÂNIA CRISTINA ALEXANDRINO BECKER
1
AND MARIALBA A. ALVES DE CASTRO-
PRADO
2
State University of Maringá,
1
Department of Clinical Analyses;
2
Department of Cell Biology
and Genetics. Avenida Colombo 5790 - Maringá PR Brazil, 87020-900.
Running title: Parameiosis in A. nidulans
Key words: parasexual cycle, conidiation mutants, mitotic recombination, haploid
recombinants.
(
2
) Author for correspondence.
State University of Maringá, Department of Cell Biology and Genetics. Avenida
Colombo 5790, Maringá PR Brazil. 87020-900. e-mail:maacprado@uem.br – phone: (44) 3261-4679
- 55 -
ABSTRACT
The parasexual cycle with parameiosis has been characterized previously by the occurrence of
genetic recombination and haploidization inside heterokaryotic hyphae prior to conidial formation.
The aim of current research was to characterize through genetic and cytological analyses an asexual
development mutant strain of A. nidulans and to use it for the obtaining of parameiotic segregants.
Analyses showed the medusa phenotype of the B84 strain, whose mutant allele was mapped in the
chromosome I. The heterokaryons B84(med)//G422(med+) and B84(med)//G839(brl) were formed in
liquid MM+2% CM and inoculated in the appropriate selective media. Two mitotic segregant groups
were obtained: aneuploids and haploid stable recombinants. Mitotic segregants, wild-types and
developmental mutants, which did not produce new visible mitotic sectors in the presence of Benlate
and which showed normal meiotic behavior during sexual cycle, were classified as parameiotics.
KEY TERMS: parasexual cycle, conidiation mutants, mitotic recombination, haploid recombinants
- 56 -
INTRODUCTION
The ascomycetous fungus Aspergillus nidulans, a genetic model organism extensively
studied to understand mitosis, gene regulation and mechanisms that control development and
sporulation, shows the coexistence of sexual and asexual reproduction, which may be
complemented by the parasexual cycle (Timberlake and Clutterbuck, 1994; Aramayo et al., 1989).
Whereas sexual reproduction requires the differentiation of several specialized tissues,
including the dikaryotic hyphae, sexual ascospores are produced in fruiting bodies (cleistothecia),
each of which is the result of a single fertilization event (Bruggeman et al., 2003; Yager, 1992;
Pontecorvo et al., 1953a). On the other hand, A. nidulans asexual reproductive cycle involves the
formation of a multicellular structure (conidiophore) and spore production (conidia). The products of
several major regulatory genes, such as the bristle, abacus, medusa and stunted genes, interact
genetically to control conidiophore morphogenesis. Bristle (brlA) and abacus (abaA) genes constitute
key regulators of core genetic pathway and regulate conidial differentiation in A. nidulans. Stunted
(stuA) and medusa (medA) genes modify development and are required for the spatial organization
of the conidiophore. MedAp interacts physically with BrlAp and is required as a co-activator of abaA.
Alternatively, medA mutations result in the production of multiple layers of sterigmata and of
conidiophores bearing secondary conidiophores (Busby et al., 1996; Aramayo et al., 1989).
The parasexual cycle may generate recombinants in fungi. The process involves anastomosis
of haploid hyphae, the formation of a heterokaryon, followed by karyogamy, resulting in a diploid
nucleus. After undergoing mitotic crossing-over, diploid nucleus may return to its haploid status
through subsequent mitotic divisions. Parasexual recombination has already been demonstrated in
several fungal species such as A. nidulans, Beauveria bassiana, Magnaporthe grisea and
Rhynchosporium secalis (Ziegler et al., 1997; Paccola Meirelles and Azevedo, 1991; Newman and
Owen, 1985; Pontecorvo et al., 1953 a and b).
The isolation of recombinant haploid conidia directly from heterokaryons, without the recovery
of the diploid phases, has been described previously in the entomopathogenic fungus Metarhizium
- 57 -
anisopliae and in a citric acid producing strain of A. niger. Recombinant’s isolation has been
explained by the high mitotic instability of heterozygous diploid nuclei, with mitotic crossing-over and
haploidization occurring in the heterokaryotic hyphae prior to conidial formation. The process, called
parameiosis, is a variation of the parasexual cycle and plays an important role in increasing genetic
variability in filamentous fungi (Bagagli et al., 1991; Bonatelli et al., 1983). Although parameiosis has
also been reported in Beauveria bassiana, Trichoderma pseudokoningii and Cephalosporium
acremonium (Bagagli et al., 1995; Paccola-Meirelles and Azevedo, 1991; Ball and Hamlym, 1982), in
contrast to the previous observation, the process does not seem to occur in imperfect fungi only.
Actually parameiosis has been recently reported in fungi presenting the sexual stage, such as A.
nidulans and Colletotrichum sublineolum (Baptista et al., 2003, Souza-Paccola et al., 2003; Bagagli
et al., 1991).
In the present study, recombinant haploid segregants were isolated directly from
heterokaryons formed by B84 developmental mutant of A. nidulans. B84 is a uvs mutant with
abnormal conidiophore vesicles bearing multiple layers of sterigmata. Morphological alterations of
B84 revealed themselves recessive in the heterozygous condition and the mutant allele received the
provisional name of medA103.
MATERIAL AND METHODS
Strains and culture media
Table I shows Aspergillus nidulans strains. Minimal medium (MM) consisted of Czapek-Dox with 1%
(W/V) glucose. Complete medium (CM) consisted of (in g/L) glucose 10, peptone 2, yeast extract 2,
hydrolyzed casein 1, and (in µg/L) inositol 4000, choline chloride 2000, pantothenic acid 2000,
nicotinic acid 1000, riboflavin 1000, 4-aminobenzoic acid 100, folic acid 500, pyridoxine 500, thiamine
200 and biotin 2 added to MM. Selective Medium (SM) consisted of MM supplemented with all the
nutritional requirements of the crossing strains with the omission of one of them in each type of
- 58 -
medium. Compact colonies were obtained in SM plus Triton X-100 (0,01%) (TSM). Solid medium
contained 1.5% agar; temperature of incubation was 37ºC.
Genetic techniques
General methodology has been described by Pontecorvo et al. (1953a). Diploid B84//A288 was
obtained by Roper’s method (1952). Heterokaryons B84//G422 and B84//G839 were formed in liquid
MM + 2.0% liquid CM. Whereas B84//G839 heterokaryons were inoculated in MM, B84//422
heterokaryons were inoculated in the following selective media: MM + adenine (1.0µg/ml) + biotin
(0.005µg/ml); MM + biotin (0.005µg/ml) + methionine (10.0µg/ml); MM + methionine (10.0µg/ml) +
pyridoxine (1.0µg/ml); MM + adenine (1.0µg/ml) + pyridoxine (1.0µg/ml). Cleistothecia were obtained
from heterokaryons, in sealed plates, after 21-days incubation period. Location of mutant allele of the
B84 strain on chromosome I was determined by haploidization of diploid B84//A288 posterior to
Benomyl treatment (Franzoni and Castro-Prado, 2000; Hastie, 1970).
Determination of UV sensitivity (Baptista and Castro-Prado 2002)
Conidia from B84 mutant were collected with Tween 80 (0.01%) and NaCl (0.85%) (Baptista and
Castro-Prado, 2002). The suspension was filtered, washed by centrifugation and stored at 5
o
C in
NaCl (0.85%) before treatments. Density of suspension was determined by haemocytomer counts.
Aliquots of conidia suspension were spread on TSM and irradiated for UV sensitivity. UV dose rate
reached 1.4 ergs.sec
–1
. Results represent mean SEM of 4 experiments carried out in red light to
exclude photoreactivation.
Cytological characterization of B84 mutant
For microscopic observation of the mutant strain, spores were inoculated over a dialysis membrane
supported by solidified. Complete Medium and the plates were incubated at 37°C for 24hs. After this
period, dialysis membranes containing one or more colonies were stained with cotton-blue-
lactophenol and examined under the light microscope.
- 59 -
Obtaining parameiotic segregants
Two methodologies were used to assess parameiotic segregants from heterokaryons: (1) Isolation of
sectors showing vigorous growth, directly from the heterokaryons (B84//G422). Single spore colonies
of these recombinants, purified in CM, were classified for conidial color and nutritional requirements.
(2) Conidial suspensions from heterokaryons (B84//G839) (Bagagli et al., 1991). Aliquots of this
suspension were inoculated later in MM to recover prototroph recombinants.
Phenotypic analysis of parameiotic segregants
Parameiotic segregants, isolated from heterokaryons, were purified in CM and transferred to
appropriate Selective Media for phenotype determination. Mitotic stability of segregants was tested in
CM + Benomyl (0.5µg/ml). Mitotically stable segregants underwent sexual cycle.
RESULTS AND DISCUSSION
B84 uvs mutant was obtained by treatment of G514 strains with doxorubicin (Becker and
Castro-Prado, 2004). Although mutant is isogenic with parental strain G514, it shows abnormal
conidiophore vesicles bearing multi-layered metullae (Fig 1 and 2). B84//A288 diploid strain (Fig 3A)
was formed and haploidized in CM + Benomyl (0.5 mg/L) to map the mutant allele medA103. Fifty-
four haploid segregants were selected and their phenotypic analysis showed that, with the exception
of linkage group I marker (y), medA103 assorted independently from all markers of the mapping
A288 strain (Table 2).
The B84 mutant failed to produce cleistothecia in a cross with another developmental medusa
mutant (B116) (results not shown). This has been expected because medusa mutants are self-
sterile. Result in fact suggests allelism of medA102 (B116) and medA103 (B84) mutations. On the
other hand, hybrid cleistothecia were obtained when B84 was crossing with A507 master strain.
- 60 -
Since the 1:1 Mendelian segregations in this cross were observed for the genetic markers of parental
strains, this fact indicated that B84 phenotypic alterations had resulted from a change in a single
nuclear gene (results not shown). Progeny analysis of this cross showed linkage between medA103
and pfaB37 alleles (Table 3). Results mapped medA103 mutant allele on chromosome I of B84
strain (Tables 2 and 3).
The analysis of mitotic recombination in A. nidulans has been improved by uvs (sensitive to
UV light) mutations, which change the normal frequencies of mitotic recombination in diploid cells
(Osman et al., 1991). Since uvsH, uvsJ, and uvsF mutations actually alter chromosomal segregation
and recombination in mitosis (Becker and Castro-Prado, 2004; Baptista et al., 2003; Chiuchetta and
Castro-Prado, 2002; Kafer and May, 1998), the isolation of mitotic recombinants has been facilitated
in the present research by B84 (Fig 2) and G422 strains (Table 1).
Heterokaryons B84//G422 (Fig. 3B), obtained in MM + 2% CM, were inoculated in
supplemented Minimal Media with two nutritional requirement of G422 strain without riboflavin.
Twenty-three mitotic sectors showing vigorous growth were isolated from heterokaryons, purified in
CM and submitted to stability tests using Benomyl. One of them (P1) showed mitotic and meiotic
stabilities and was classified as parameiotic segregant. Nine segregants were highly unstable in
presence of Benomyl and were classified as aneuploid. These segregants probably were isolated
during the haploidization phase by non-disjuction with chromosome losses. Each one of the
remaining thirteen segregants originated a stable variant when plated on CM+Benomyl, but only five
of them (P2 to P6), classified as haploid recombinants, showed Mendelian segregation of genetic
markers when submitted to the sexual cycle (Tables 4-6).
Sixty-four prototrophic segregants were obtained from conidial suspensions from
B84(med)//G839(brl) heterokaryons plated onto Minimal Medium. The degree of ploidy of
segregants was determined by the Benomyl test. Aneuploid and haploid segregants were obtained
but no diploid colony was isolated. Thirty-one segregants exhibited mitotic stability and underwent
sexual cycle with the mapping strain A288. However, only eight (P7 to P14) showed the expected
- 61 -
normal segregation of the nutritional and conidia color genetic markers. These segregants were
phenotypically characterized as med, brl and med
+
,brl
+
, and classified as haploid stable parameiotic
recombinants (Tables 4-6). The prototrophic P14 haploid segregant did not produce hybrid
cleistothecia in P14 x A288 cross but cleistothecia were obtained from P14 x P14 self-cross. Three
cleistothecia of this crossing were isolated, and equal volumes of ascosporous suspensions were
seeded in CM and MM so that number of segregants from each medium could be compared. Results
showed lack of auxotrophic segregants and P14 meiotic stability (Table 7).
The recovery of recombinants with genetic markers from both parental strains involved in
crosses B84//G422 and B84//G839 proves the transfer of genetic material between the strains and
thus demonstrating that parameiosis is an important mechanism for the generation of genetic
variation in A. nidulans. Heterokaryons B84//G422 and B84//G839-isolated parameiotic segregants
both through independent chromosome segregation and through mitotic crossing-over. Diploid
colonies have also not been isolated from the B84//G422 heterokaryon. The great number of
aneuploid segregants from both crossings (B84//G422 and B84//G839) (Tabe 6) is probably related
to the high unstableness of diploid nuclei formed in the interior of heterokaryotic hyphae. In fact,
mitotically unstable diploids have been detected in different fungus species and it is generally
associated with high frequency of haploidization and recombination (Paccola-Meirelles and Azevedo,
1991; Silveira and Azevedo, 1987; Bonatelli et al., 1983; Minut and Esser, 1983; Das and Ilczuk,
1978).
The present study describes, for the first time, the isolation of parameiotic segregants from
asexual development mutants of A. nidulans. Process has been proved to be an important
mechanism in genetic variation generation in several fungus species and may also be deployed in
the mapping of genetic markers in non-sexual fungi. Parasexual exchange of genetic information in
fungi may eliminate deleterious mutations, reconstitute the genome, and generate novel variants
(Sousa-Paccola et al., 2003; Zeigler et al., 1997).
- 62 -
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- 65 -
TABLES
Table I: Genotype and origin of Aspergillus nidulans strains:
Strains Genotype* Origin**
A757
yA2 (I), methA17 (II), pyroA4 (IV).
FGSC
G514
riboA1 (I), AcrA1 (II), uvsJ1 (V), chaA1 (VIII)
Glasgow
G228
adE20 (I), suA1adE20(I), yA2(I), wA2(II), galA1(III),
pyroA4(IV), facA303(V), sB3(VI), nicB8(VII), riboB2(VIII).
Glasgow
G422
A783
adE20(I), biA1(I), wA3(II), uvsH4(IV), methG1(IV),
pyroA4(IV).
SulA1(I), AcrA1(II), ActA1(III), pabaB2(IV), nicA2(V),
sbA3(VI), choA1(VII), riboB2, chaA1(VIII).
Glasgow
FGSC
A507
anA1(I), pabaA1(I), FpaB37(I), SulA1(I)
FGSC
G839
G1101
pabaA1(I), uaY9(VIII), brlA42(VIII)
acuM301(I), wA3 (II), pyroA4 (IV)
Glasgow
Glasgow
B520
pabaA1(I), biA1(I), methA17 (II)
Baptista and Castro-
Prado (2001)
B116
B84
medA103 (I), biA1(I), methA17 (II), pyroA4(IV), Dp (II-I)
medA103 (I), riboA1 (I), AcrA1 (II), uvsJ1 (V), chaA1 (VIII)
Costa et al . (2001)
Becker and Castro-
Prado (2004)
*
Mutant allele phenotypes. Requirement for:
adenine =
adE20,
aneurine =
anA1,
riboflavin =
ribo
A1 or
ribo
B2, p-amino
benzoic acid =
paba
A124
, pabaA1
or
pabaB2,
biotin =
bio
A1, methionine =
met
A17 or
meth
G1, pyridoxine =
pyro
A4,
choline =
cho
A1, nicotinic acid =
nic
A1 or
nic
B8. Conidia
color: chartreuse =
chaA1
;
white
=
wA2 and wA3
;
and
yellow
=
yA2
;
AcrA1
, SulA2, ActA1, and FpaB37, resistance to acriflavine, sulphanilamide, actidione, and p-
fluorophrnylalanine respectively; acid uric utilization =
ua
Y9; sulfate transport impairment = sB3; galA1, acu, facA303,
and sbA3, unable to grow on galactose, ammonium acetate, and sorbitol, respectively, as the sole carbon source;
supressor of UV light =
uvs
J1
or
uvs
H4
;
Dp (II-I) = segment from chromosome II duplicated and transposed to
chromosome I, including the Acr, w and meth+ genes. **FGSC: Fungal Genetic Stock Center (University of Kansas
Medical Center, Kansas, U.S.A).
- 66 -
Table II: Phenotypic analysis of the mitotic segregants derived from B84//A288 diploid strain.
yA2 wA2 galA1 pyroA4 facA303 sB3 nicB8 chaA1
+ - + - + - + - + - + - + - + -
med
+
01 11 12 22 25 09 27 07 10 24 31 03 25 09 11 01
med
12 00 12 08 16 04 19 01 11 09 15 05 14 06 07 05
- 67 -
Table III: Meiotic segregation of the fpaB37 marker from chromosome I in the B84 x A507 cross.
fpaB
+
fpaB
med
+
04 38
med
74 09
- 68 -
Table IV. Phenotype of haploid segregants from B84//G422 and B841//G839 crosses.
Parameiotic
Segregants
Phenotype Crosses
Origin
P1
med, w, cha
B84//G422 ia
P2
med, w ,pyro, cha
B84//G422 ia
P3
med, w
B84//G422 ia
P4
med, cha
B84//G422 mco, chromosome II
P5
med, w, Acr, cha
B84//G422 mco, chromosome II
P6
med, w, Acr, cha
B84//G422 mco, chromosome II
P7
cha
B84//G839
mco, chromosome I
P8
wild type
B84//G839
mco, chromosome I
P9
cha
B84//G839
mco, chromosome I
P10
med
B84//G839
mco, chromosome I
P11
med
B84//G839
mco, chromosome I
P12
brl
B84//G839
mco, chromosome I
P13
med
B84//G839
mco, chromosome I
P14
cha
B84//G839
mco, chromosome I
mco - mitotic crossing over, ia – independent assortment
- 69 -
Table V. Meiotic segregation of genetic markers in sexual crosses of parameiotic segregants:
Meiotic segregation of genetic markers
Chromossomes
I II III IV V VI VII VIII
med
+
:med Sul
+
:Sul
-
Acr
+
:Acr
-
w
+
: w
-
Act
+
:Act
-
pyro
+
:pyro
paba
+
:paba
-
nic
+
:nic
-
sb
+
:sb
-
cho
+
:cho
-
ribo
+
:ribo
-
cha
+
:cha
-
*Control Cross - 69 : 56 68 : 57 57 : 68 62 : 63 66 : 59 68 : 57 66 : 59 54 : 71 69 : 56 68 : 55** 24 : 33
P1 x A783 59 : 40 49 : 50 59 : 40 51 : 48 59 : 40 - 47 : 52 41 : 58 53 : 46 43 : 56 45 : 54 -
P2 x A783 59 : 40 51 : 48 50 : 49 47 : 52 58 : 41 44 : 55 54 : 45 58 : 41 54 : 45 56 : 43 57 : 42 -
P3 x A783 58 : 41 48 : 51 50 : 49 58 : 41 51 : 48 - 55 : 44 51 : 48 49 : 50 59 : 40 59 ; 40 -
P4 x A783 46 : 52 45 : 53 40 : 58 - 48 : 50 - 58 : 40 52 : 46 58 : 40 58 : 40 56 : 42 -
P5 x A783 54 : 43 58 : 39 - 48 : 49 57 : 40 - 53 :44 53 : 44 45 : 52 57 : 40 57 : 40 18 : 30
P6 x A783 44 : 45 47 : 52 47 : 52 59 : 40 52 ; 47 - 54 : 46 59 : 40 52 : 48 59 : 40 58 : 42 21 : 38
Chromossomes
I II III IV V VI VII VIII
med
+
:med
-
y
+
:y
-
w+:w
-
gal
+
: gal
-
pyro
+
:pyro
-
fac
+
:fac
sB
+
:sB
-
nic
+
:nic
-
ribo
+
:ribo
-
cha
+
:cha
-
brl
+
:brl
-
**Control Cross - 29 : 26 55 : 68 60 : 63 68 : 55 62 : 61 69 : 54 58 : 65 68 : 55 24 : 33* -
P7 X A288 - 29 : 37 66 : 58 60 : 64 65 : 59 59 : 65 70 : 54 57 : 67 59 : 65 31 : 35 -
P8 x A288 - 26 : 22 48 : 52 55 : 45 44 : 56 41 : 59 55 : 45 55 : 45 59 : 41 - -
P9 x A288 - 27 : 14 41 : 59 41 : 59 58 : 42 41 : 59 55 : 45 54 : 46 59 : 41 27 : 14 -
P10 x A288 56 : 44 12 : 10 22 : 34 56 : 44 47 : 53 54 : 46 49 : 51 57 : 43 46 ; 54 - -
P11 x A288 53 : 46 09 : 11 20 : 33 53 : 46 45 : 54 58 : 41 57 : 42 50 : 49 46 : 53 - -
P12 X A288 - 06 : 13 19 : 26 41 : 34 39 : 36 43 : 32 34 : 41 39 : 36 33 : 42 - 45 : 30
P13 x A288 55 : 45 13 : 11 24 : 21 45 : 55 51 : 49 41 : 59 47 : 53 57 : 43 41 : 59 14 : 10 -
(-) not determined. Control crosses: *A783xG1101; **A288xB520.
- 70 -
Table VI. Stable haploid (parameiotic) and aneuploid segregants derived from B84//G422 and B84//G839
heterokaryons.
Aneuploids
Heterokaryons
Total nº of segregants
Unstable
Mitotically
Untable
meiotically
Parameiotic Segregants
B84//G422 23 09 08 06 (P1-P6)
B84//G839 64 33 23 08 (P7-P14)
- 71 -
Table VII. Phenotipic analysis of outcross P14 x P14 cross.
Meiotic cross
Cleistothecia Nº segregants obtained
MC MM
C1 90 84
C2 26 23
P14 x P14
C3 16 19
- 72 -
LEGEND OF FIGURES
Figure 1 – Conidiophore morphology of B84 (A) and A288 (B) strains, vesicle of conidiophore with
multiple layers of sterigmata; B, normal conidiophore. The conidiophore vesicle corresponds to 10.0 µm.
Figure 2 – Survival of
uvs
+ (B520), and
uvs
mutants (G514 and B84) strains after UV radiation of
quiescent conidia.
Figure 3 – Diploid and parasexual segregants. Arrows indicate (A) the origin of B84//A288 diploid strain
and (B) parasexual segregants derived from B84//G422 hetrokaryon. Bars correspond to 10.0 mm.
- 73 -
B
A
- 74 -
B
C
D
E
F
Figure 1
0 10 20 30 40
0
20
40
60
80
100
B520
B84
G514
UV Time (s)
Survival (%)
Figure 2
- 75 -
A
B
Figure 3
- 76 -
Asexual Recombination in a uvsH
Mutant of Aspergillus nidulans
- 77 -
Asexual Recombination in a uvsH mutant of Aspergillus nidulans
.
BECKER, TCA
1
; SOUZA-JÚNIOR, SA
2
and CASTRO-PRADO, MAA
2
*
1
Department of Clinical Analyses,
2
Department of Cell Biology and Genetics, State University of
Maringá. Avenida Colombo 5790 - Maringá PR Brazil, 87020-900.
(
∗
) Author for correspondence.
State University of Maringá, Department of Cell Biology and Genetics. Avenida Colombo 5790,
Maringá PR Brazil. 87020-900. e-mail:maacprado@uem.br – phone: (55) 44 3261-4679
- 78 -
ABSTRACT
Mutations in the gene
uvsH
of
Aspergillus nidulans
result in increased spontaneous
chromosome instability and increased intragenic and intergenic mitotic recombination in
homozygous diploids. The aim of the present work was to obtain a
uvs
mutant of
A. nidulans
and to
use it for the isolation of asexual recombinants (parameiotic segregants). The mutant
uvsH
, named
B511, showed normal frequency of meiotic recombination in sexual crosses and high frequency of
parameiotic segregants in the parasexual crossings with master strains (B511//A757 and
B511//A288). Asexual haploid recombinants (parameiotic segregants), diploid and aneuploid
segregants were recovered directly from the
uvs//uvs
+ heterokaryons (B511//A757 and
B511//A288). Parameiotic segregants originated through mitotic crossing-over and independent
assortment of chromosomes.
Key words: mitotic crossing-over, parameiosis,
uvs
mutation.
- 79 -
INTRODUCTION
Aspergillus nidulans
is a homothallic fungus (i.e. it is self-fertile) with eight genetically defined
chromosomes, which provides an excellent model for studying different aspects of developmental
characters (Timberlake and Marshall, 1988). The utilization of
A. nidulans
in genetic analysis has
been improved by different life cycles in the ascomycete. Different from most filamentous fungi,
A.
nidulans
shows three different proliferation cycles: asexual, sexual, and parasexual. Only the last
two favour the occurrence of genetic variability (Baptista
et al,
2003, Van de Vate and Jansen 1978,
Kafer 1977, 1969, 1960, Pontecorvo and Roper 1952).
The parasexual cycle essentially involves the hyphal anastomosis of genotypically distinctive
homokaryons, resulting in a heterokaryotic mycelium. The fusion of two unlike haploid nuclei results
in a diploid nucleus. After undergoing mitotic crossing-over and/or mitotic non-disjunction, diploid
nucleus may return to the haploid status through subsequent mitotic divisions (Debets 1998,
Pontecorvo 1956). Parameiosis is a variation of the parasexual cycle in which genetic
recombination and haploidization may occur inside the heterokaryotic hyphae, before conidia
production. In fact, haploid recombinant segregants are originated directly from heterokaryons and
the diploid phase is not recovered. The parasexual cycle with parameiosis constitutes an important
pathway for studying the occurrence of genetic exchanges. In contrast to the long-term process
required by conventional parasexual cycle to form recombinant cells, parameiosis is a ready
manner to evaluate mitotic crossing-over (Becker and Castro-Prado 2004, 2006, Baptista
et al.
2003, Bello and Pacolla-Meirelles 1998, Bagagli
et al.
1991, Bonatelli
et al.
1983).
The analysis of mitotic recombination in
A. nidulans
has also been improved by
uvs
(sensitive to UV
light) mutations, which change the normal frequencies of mitotic recombination in diploid cells
(Baptista
et al.
2003, Chiuchetta and Castro-Prado 2002, Osman
et al.
1991). Mutations of two
uvs
epistatic groups, UvsC (
uvsA, uvsC
and
uvsE
) and UvsF (
uvsF
,
uvsH
and
uvsJ
) have been
reported to be associated with the post-replication repair process (Goldman
et al.
2002). The
uvsH
mutation actually shows homology with
Saccharomyces cerevisiae
RAD18
and
Neurospora crassa
- 80 -
uvs-2
mutations
.
Haploid
nuvA (uvsH)
mutants are not merely slow growing and have a “crinkly”
morphology, but are also highly sensitive to UV light and to methyl-methane-sulphonate (MMS).
nuv//nuv
diploid mutants have significantly increased frequencies of mitotic recombination (Iwanejko
et al,
1996, Osman
et al.
1991).
Since
A. nidulans
spends most of its cell cycle in G2 phase (Osman
et al.
1993), favors the event of
mitotic recombination once the chromosomes become duplicated in this phase (Kafer and May
1998, Osman
et al
. 1993), current research aims to obtain an
A. nidulans
uvsH
mutant and apply it
to obtain parameiotic segregants (asexual recombinants).
MATERIAL AND METHODS
Media and Aspergillus nidulans strains
:
Complete (CM) and Minimal Medium (MM) have been previously described (Van de Vate and
Jansen 1978, Pontecorvo
et al.
1953). Selective medium (SM) consisted of MM supplemented with
the nutritional requirements of the crossing strains with the omission of one of them, in each type of
medium. Solid medium contained 1.5% agar. Triton X100 (0.01%) (TSM) was used to obtain
compact colonies, while
Aspergillus nidulans
strains are described in Table 1.
Genetic techniques
The general methodology followed those previously described (Pontecorvo
et al.
1953, Roper
1952). Heterokaryons were prepared in liquid MM plus 2.0% CM. After 21 days of incubation at
37ºC cleistothecia were obtained from heterokaryons and the ascospores were inoculated in CM
plates for further analysis.
Phenotype analysis of segregants
:
Aliquots of ascospores suspension of a hybrid cleistothecium from A837 x A495 cross were
inoculated in CM plates to determine the phenotype of meiotic segregants. Progeny was isolated
- 81 -
and inoculated in CM plates containing 25 pre-defined positions (master plates). The phenotype of
each segregant was determined by inoculating them in different SM. Only those that demonstrated
paba,
lys, nic,
phenotype were selected for UV-sensitivity test.
Conidia suspension
:
Conidia of each strain were inoculated in CM plates and incubated for 5 days at 37
o
C. Plate
surface was washed with Tween 80 (0.001%); conidia suspension was filtered, washed by
centrifugation and stored at 5
o
C in NaCl (0.85%) before treatments. The number of conidia was
determined by haemocytometer counts.
UV-sensitivity test
:
Conidia of each meiotic segregant were inoculated in TSM for UV-sensitivity test. Plates were
irradiated for periods of 0, 5, 10, 20 and 40 seconds in a UV-camera, using a Philips 30W germicide
light, at a distance of 55 cm (UV dose rate reached 1.4 ergs.sec
-1
). Experiments were carried out in
the dark to prevent photoreactivation.
Obtaining asexual parameiotic recombinants from heterokaryons:
Conidia of crossed strains were inoculated together in liquid medium to form heterokaryons.
Heterokaryons constituted by
uvs
+
//uvs
+
and
uvsH//uvs
+
crosses were inoculated in different
selective media as shown in Table 2. Parameiotic segregants were identified as homogeneous and
vigorous sectors growing from heterokaryons as shown in Fig. 2.
Analysis of Parameiotic Segregants:
To determinate the mitotic stability of parameiotic segregants they were inoculated in MC +
benomyl (0.5 mg/L) plates. Stable segregants were crossed with master strains for the analysis of
meiotic segregation of genetic markers. Results were compared using a Table 2x2 Contingency,
Yates’ Corrected
X
2
- test (p
<
0, 05).
- 82 -
RESULTS AND DISCUSSION
Analysis of meiotic progeny from A837 x A495 cross showed that four segregants were obtained
with nutritional requirements for paraminobenzoic acid, lysine and nicotinamide (results not shown).
Only B511 strain, with genotype:
chaA1
(VIII),
pA2
(V),
pabaA1
(I),
uvsH77
(IV),
lysB5
(V) and
nicA2
(V), was sensitive to UV light as shown in Figure 1.
Previous researches demonstrate that meiotic recombination frequencies, in
uvsH
homozygous
crosses, corresponded to those observed in both
uvsH
x
uvs
+
and
uvs
+
x
uvs
+
crosses (Iwanejko
et
al.
1996, Kafer and Mayor 1986). In current research and according to the literature, meiotic
homozygous cross for
uvsH
mutation (B511 x B211) matched the recombination frequencies
observed for heterozygous (
uvs
+
x uvsH
) and homozygous (
uvs
+
x
uvs
+
) crosses (Table 3).
Asexual parameiotic recombinants, diploid and aneuploid segregants were recovered from
heterokaryons of heterozygous
uvsH
crosses (B511//A288 and B511//A757) (Table 4, Fig. 2). The
obtaining of parameiotic segregants may be explained by the occurrence of independent
assortment of chromosomes or mitotic crossing-over and haploidization of diploid nuclei inside the
heterokaryotic hyphae. On the other hand, aneuploid segregants may have been the result of
unstable diploid nuclei that did not attain to their haploid condition (Bello and Pacolla-Meirelles
1998, Bagagli
et al.
1991, Osman
et al
1991).
Our results demonstrate in Table 4 that heterokaryons formed with the B511 mutant strain were
able to produce, by parasexual cycle, a higher number of parameiotic segregants (asexual
recombinants) than the A288
//
A757control cross. Recombinant parameiotic segregants were
produced by mitotic crossing-over (P2, P5, P7, P8, P10 and P11) and by independent chromosomal
assortment (P1, P3, P4, P6 and P9) (Table 5). Since
uvsH
mutation actually increases the
frequencies of intra- and intergenic mitotic recombination and alters chromosomal segregation in
mitosis (Kafer and May 1998, Osman
et al
1991), the isolation of mitotic recombinants has been
facilitated by B511 strain.
- 83 -
Mitotic stability of parameiotic segregants was observed in presence of benomyl. Normal
frequencies of recombination and Mendelian segregation of genetic markers were observed in
meiotic crosses of parameiotic segregants with master strains, as shown in Table 6. P1, P7, P8
and P9 were self-crossed and the ascospores only gave origin to prototrophic segregants (results
not shown). Results reveal the genetic and chromosomal stability of parameiotic segregants or
asexual recombinants.
Mitotic recombination may results from spontaneous chromosomal exchanges or may be induced
by both physical and chemical agents. The process favors the expression of deleterious genes
previously present in heterozygous condition through the origin of clones of cells homozygous for
the distal genes to the point of exchange (Hagstrom and Dryja 1999, Beumer
et al.
1998, Pires and
Zucchi 1994).
Present research has shown the isolation of a
uvs
mutant of
A. nidulans
applicable to
recombinagenesis studies. Strain B511 proved to be a useful tool for the production of stable
parameiotic segregants.
ACKNOWLEDGEMENTS
We would like to thank CAPES (Nucleus for Upgrading University Personnel), CNPq (National
Council for Scientific and Technological Development) and Foundation Araucária (Foundation for
the Support of Research of the State of Paraná) for their support. Thanks are also due to Ms.
Sônia Aparecida de Carvalho and Mrs. Luzia de Souza Regazzi for their technical assistance. To
god, once more, our efforts.
- 84 -
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- 87 -
LEGEND OF FIGURES
Figure 1. Survival curve of B520 (
uvs+
), A837 (
uvsH
) and B511 (
uvsH
) strains during 5, 10, 20
and 40 seconds exposition to UV light.
Figure 2. Mitotic segregants obtained from heterokaryon B511//A757: A: 1- parameiotic (haploid)
and 2 - heterokaryotic sectors; B: parameiotic P7 segregant (arrow); Mitotic segregants obtained
from heterokaryon B511//A757: C: 1 – parameiotic (P10) and 2 – aneuploid segregants; D: arrows
show aneuploid segregants.
- 88 -
Figure 1
0 10 20 30 40
1.0×10
-02
0.1
1
10
100
B520
A837
B511
Time (s)
Survival (%)
- 89 -
Figure 2
Figure 2
- 90 -
Table 1: Genotypes of
A. nidulans
strains
.
Strains Genotype Origin
A837
pabaA1
(I),
uvsH77
(IV),
pyroA4
(IV
), choA1
(VII),
chaA1
(VIII)
FGSC
A495
lysB5 (V),
nicA2
(V),
pA2
(V)
FGSC
A288
yA2
(I),
adE20
(I),
su adE20
(I);
wA3
(II);
galA1
(III);
pyroA4
(IV);
facA303
(V
); sB3
FGSC
(VI);
nicB8
(VII);
riboB2
(VIII)
A757
yA2
(I),
methA17
(II),
pyroA4
(IVR)
FGSC
A610
yA2
(I),
pabaA1
(I).
FGSC
A507
FpaB37
(I),
SulA1
(I),
anA1
(I),
pabaA
1 (I)
FGSC
UT448
wA2
(II),
riboA1
(VIII),
pabaA124
(I),
biA1
(I),
AcrA1
(II)
Utrecht
UT184
SulA1
(I);
AcrA1
(II);
galA1
(III);
pyroA4
(IV);
facA303
(V);
lacA1
,
sB3
(VI);
nicB8
(VII);
riboB2
(VIII),
chaA
1 (VIII)
Utrecht
B211
yA2
(I); biA1 (I);
wA2
(II);
AcrA1
(II);
methA17
(II);
pyroA4
(IV);
uvsH77
(IV);
MGL
chaA1
(VIII)
B520
pabaA124
(I);
biA1
(I);
methA17
(II)
MGL
B511
pabaA1
(I);
uvsH77
(IV), l
ysB5
(V),
nicA2
(V),
pA2
(V),
chaA1
(VIII)
MGL
Mutant alleles have the following phenotypes:
pyro, lys, nic, sB, ribo, paba, bi, meth, cho, an, ad, pro
: requirements for pyridoxine, lysine,
nicotinamide, thiosulfate, riboflavine, paraminobenzoic acid, biotin, methionine, choline, aneurine, adenine and proline, respectively;
y
,
w, cha,
p
: yellow, white, chartreuse and pale, conidial color, respectively;
Acr, Fpa
,
Sul
determine resistance to Acriflavine,
ρ
-fluorofenilalanine and
sulphanilamide, respectively;
gal
and f
ac
: unable to grow on galactose and acetate as a carbon source respectively;
su
suppressor of
ad
allele;
uvs
: sensibility to UV light. FGSC, Fungal Genetic Stock Center, Kansas, USA; MGL, Microorganisms Genetic Laboratory, State
University of Maringá.
- 91 -
Table 2. Selective media for the inoculation of heterokaryons.
Crosses
Selective Media
B511//A288 MM
MM +
pyro
+
ribo
B511//A757
MM +
meth
+
lys
MM +
meth
+
lys
+
nic
MM +
paba
+
pyro
A288//A757
MM +
ad
+
pyro
+
ribo
MM +
pyro
+
nic
+
ribo
MM +
pyro
+
sB
+
ribo
MM +
ad
+
pyro
+
nic
MM +
pyro
+
ribo
MM +
pyro
MM, Minimal medium;
meth, lys, paba, nic, ribo, pyro, ad
and
sB
are methionine,
lysine, paraminobenzoic acid, nicotinamide, riboflavine, pyridoxine, adenine and
thiosulfate nutritional requeriments, respectively.
- 92 -
Table 3. Meiotic segregation of genetic markers of chromosomes I, II, IV and VIII and frequencies of
recombination between markers in chromosomes I and II of B511 x A288 and B511 x B211 crosses.
Segregation of Genetic markers
Meiotic
Crosses
ribo
+
:ribo paba
+
:paba y
+
:y bi
+
:bi Acr
+
:Acr w
+
:w meth
+
:meth
pyro
+
:pyro
cha
+
:cha
Control
108:109
a
117:100
a
61:54
a
107:110
a
100:117
a
102:115
a
105:112
a
57:41
b
49:49
b
B511 X A288 46:38 37:45 10:6 - - 39:43 - 42:40 22:17
B511 X B211 - 56:44 26:27 42:58 51:49 53:47 52:48 48:52 -
Frequencies of recombination (%)
paba-bi paba-y y-bi Acr-w
Control
23.4 (34/145)
a
14.1 (12/85)
a
7.0 (6/85)
a
28.2 (41/145)
a
B511 X A288 - 17.9 (7/39) - -
B511 X B211 14.0 (14/100) 11.3 (6/53) 13.2 (7/53) 24.0 (24/100)
(
a
), A757XUT448; (
b
) A507XUT184; (-) Not analysed
- 93 -
Table 4. Mitotic segregants from
uvs
+
//uvs
+
and
uvsH//uvs
+
heterokaryons.
H, heterokaryons; P, parental; D, diploids; A, aneuploids, PS, parameiotic segregants; T, total of segregants. (*)
Significantly different from A288//A757 control cross, Table 2x2 Contingency, Yates’ Corrected Chi-square test, p<0.05.
CROSSES
H
P
D
A
PS
PS/H (%)
T
A288//A757
24 3 0 7 0 0 10
B511//A757 16 3 0 8 9* 56.3 20
B511//A288
8 0 2 15* 2 25.0 19
H, heterokaryons; P, parental; D, diploids; A, aneuploids, PS, parameiotic
segregants; T, total of segregants. (*) Significantly different from A288//A757
Yates’ Corrected Chi
-square test, p<0.05.
- 94 -
Table 5. Phenotype of parameiotic segregants recovered from B511//A288
and B511//A757 crosses.
Parameiotic
Segregants
Phenotype
Origin
Crosses
P1
y, uvs
ia B511//A757
P2
cha, meth
mco B511//A757
P3
y, uvs
ia B511//A757
P4
y, uvs, cha
ia B511//A757
P5 wild-type mco B511//A757
P6
y
, uvs,
cha
ia B511//A757
P7 wild-type mco B511//A757
P8 wild-type
mco B511//A757
P9
y, uvs, cha
ia B511//A757
P10
w
+
, y
mco B511//A288
P11
cha
mco B511//A288
(ia) independent assortment of chromosomes; (mco) mitotic crossing-over
Table 6. Meiotic segregation of genetic markers from parameiotic segregants crossed with master strains, and
frequencies of meiotic recombination of P3 x UT448 and P4 x B520 crosses.
Segregation of Genetic markers
Meiotic Crosses
ribo
+
:ribo paba
+
:paba y
+
:y Acr
+
:Acr w
+
:w
meth
+
:meth pyro
+
:pyro cha
+
:cha
Control
108:109
a
117:100
a
61:54
a
100:117
a
102:115
a
105:112
a
57:41
b
49:49
b
P2 X B520 - 59:65 - - - - - 69:55
P3 X UT448 73:77 77:73 41: 36 63: 87 77: 73 - - -
P4 X B520 - 63: 62 58: 67 - - 64: 61 - -
P5 X UT448 69: 56 61: 64 - - 57: 68 - - -
P6 X B520 - 60: 64 52: 72 - - 54: 70 - 74: 50
P10 X A610 - 50: 50 - - - - - -
P11 X A610 - 51: 56 51: 56 - - - - -
paba-y Acr-w
Control
14.1 (12/85)
a
28.2 (41/145)
a
P3 X UT448
7.8 (6/77)
25.3 (38/150)
P4 X B520 11.2 (14/125) -
(a) A757 X UT448, (
b
) A507 X UT 184, (-) not analysed
Meiotic
Crosses
Frequencies of recombination (%)
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Becker, Tânia Cristina Alexandrino
B396c Ciclo parassexual com parameiose em linhagens mutantes de
Aspergillus nidulans / Tânia Cristina Alexandrino Becker. --
Maringá : [s.n.], 2007.
94 f. : il. color., figs.
Orientador : Profª. Drª. Marialba Avezum Alves de Castro-
Prado.
Tese(doutorado) - Universidade Estadual de Maringá.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (área de
concentração - Biologia Celular), 2007.
1. Aspergillus nidulans. 2. Ciclo parassexual. 3.
Parameiose. 4. Recombinação mitótica. I. Universidade
Estadual de Maringá. Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas. II. Título.
CDD 22.ed. 579.135
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