Gislaine Angélica Rodrigues Silva

(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Orientador : Profª. Drª. Ana Silvia Lapenta.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá. Departamento

de Ciências Biológicas, 2007.

1. Esterase. 2. Organofosforado. 3. Resistência a inseticidas. 4.

A Deus, minha inspiração.

A minha mãe, uma mulher admirável.

Esta dissertação é composta por um artigo, o qual foi concluído a partir de

estudos sobre o envolvimento das esterases na resistência aos inseticidas em duas

espécies de insetos praga: Oryzaephilus mercator e Oryzaephilus surinamensis. Este

Mecanismos metabólicos de resistência a inseticidas envolvendo as esterases têm sido

estudados, pois estas estão relacionadas com a detoxificação. Este trabalho foi

conduzido com o objetivo de identificar e caracterizar as esterases, verificar a

toxicidade dos organofosforados malathion e clorpirifós-metil em diferentes linhagens

destas espécies e, também, analisar o possível envolvimento destas enzimas nos

O papel realizado pelas esterases nos mecanismos de resistência aos inseticidas

tem sido amplamente estudado em insetos mostrando-se de fundamental importância.

Duas classes de esterases estão envolvidas neste processo, as colinesterases e as

carboxilesterases. Dentre as colinesterases, a acetilcolinesterase regula os níveis de

acetilcolina por catalisar a hidrólise desta nos terminais dos impulsos nervosos.

de detoxificação metabólica como a EST-9 em Drosophila melanogaster (Healy et al.,

1991).

Estudos demonstraram que os insetos podem adquirir insensibilidade a

inseticidas por mutações em ponto em acetilcolinesterases, a substituição de

aminoácidos no sítio ativo da enzima foi encontrada em populações de Drosophila

detectaram que todas as linhagens de campo de Tribolium castaneum testadas nos

Estados Unidos, apresentaram resistência ao malathion e que esta resistência está

associada com as carboxilesterases que estão envolvidas com a detoxificação deste

composto.

fenitrothion. Neste mesmo estudo, análises quantitativas e qualitativas das esterases

permitiram observar um elevado aumento nos níveis de atividade das esterases em duas

linhagens altamente resistentes ao clorpirifós-metil e diferentemente resistentes ao

fenitrotion, também foi possível observar diferenças qualitativas nas esterases entre

estas duas linhagens. Estas esterases foram classificadas como β-esterases e as

linhagens de O. surinamensis ao organofosforado fenitrotion e, por meio de

zimogramas, verificaram as diferenças no padrão de bandas entre a linhagem resistente

e a suscetível, identificando a esterase envolvida com resistência ao inseticida, a qual foi

purificada e caracterizada.

Uma vez que as esterases desempenham um importante papel na resistência aos

organofosforados, usados no controle destes insetos.

Para a realização deste estudo foram utilizadas quatro linhagens de Oryzaephilus

A linhagem OmLPT-10 foi derivada da linhagem OmLPT, a qual foi exposta por oito

meses a uma concentração de malathion de 0,05 µg/g. Os insetos foram mantidos em

laboratório a temperatura ambiente em culturas montadas com ração para cães e

sementes de girassol, levemente triturados.

Determinação da CL

Para cada bioensaio foram colocados 25 adultos, não sexados e sem idade

definida, em recipientes de vidro que foram vedados com tecido voal e elásticos para

evitar a fuga. Os insetos permaneceram expostos aos tratamentos durante 24 h, quando

então, a mortalidade foi avaliada. Os indivíduos sobreviventes foram então congelados e

submetidos posteriormente à análise eletroforética para verificação das esterases.

Neste trabalho foi empregado a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE),

técnica modificada de Davis (1964) e Laemmli (1970). A técnica foi realizada em gel

cada amostra de O. mercator ou 10 µL do sobrenadante de O. surinamensis foi aplicado

no gel. Em O. mercator foram analisados cerca de 260 insetos e para O. surinamensis,

aproximadamente 160 insetos.

Os géis foram submetidos à eletroforese por cinco horas, a uma voltagem

constante de 200 V, utilizando-se para o preenchimento dos compartimentos superiores

e inferiores da cuba, o tampão Tris-glicina 0,1 M pH 8,3. Após a corrida eletroforética,

os géis foram pré-incubados em 50 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 6,2. Após 30

minutos o tampão foi retirado e foi adicionado a solução de coloração. Esta solução é

composta por tampão fosfato 0,1 M pH 6,2 (50 mL), por n-propanol (5 mL), pelo

corante Fast Blue RR Salt (0,06 g) e pelos substratos α-naftil acetato e β-naftil acetato

(0,03 g e 0,02 g, respectivamente), previamente solubilizados em acetona (1 mL). Após

cerca de uma hora de incubação no escuro à temperatura ambiente, as esterases foram

visualizadas nos géis como bandas pretas ou vermelhas, indicativas da presença de α e

Tratamento com inibidores para caracterização bioquímica das esterases

Para o teste com inibidores, os géis foram pré-incubados em tampão fosfato 0,1

M pH 6,2 e depois submetidos à coloração na presença dos mesmos. Simultaneamente

ao gel tratado foi preparado um gel controle contendo as mesmas amostras. Os

inibidores utilizados foram o sulfato de eserina na concentração de 1 mM; malathion a

0,3 mM; fenilmetilsulfonila (PMSF) a 10 mM para Oryzaephilus mercator e 7,8 mM

para O. surinamensis; iodoacetamida (IAC) na concentração de 10 mM; para-

cloromercuriobenzoato (pCMB) a 1,5 mM e o carbaril a 0,0745 mM. Os inibidores

foram dissolvidos diretamente no tampão fosfato 0,1 M pH 6,2, com exceção do PMSF

que foi previamente dissolvido em 1 mL de metanol e adicionado ao tampão de

A técnica empregada para secagem dos géis foi baseada no método de Ceron et

em um bastidor entre duas folhas de papel celofane e deixados à temperatura ambiente

por três a quatro dias para secagem.

como produtos da expressão de sete loci gênicos para as esterases. Estas bandas foram

identificadas ao longo do desenvolvimento em Oryzaephilus mercator para a linhagem

OmLV, analisando as fases de larva, pupa e adulto (tabela 1).

Destes sete loci gênicos identificados, seis foram representados por mais de uma

banda, sendo considerados polimórficos, estas esterases apresentaram estrutura

mesma caracterização enzimática. As OmEST-1, 4, 5, 6 e 7 são enzimas que

hidrolisaram preferencialmente α-naftil acetato e a OmEST-1 hidrolisou exclusivamente

o substrato α-naftil acetato, sendo consideradas α-esterases. As OmEST-2 e 3

hidrolisaram exclusivamente o substrato β-naftil, sendo consideradas β-esterases (figura

2).

presença de um resíduo de serina e cisteína, respectivamente, os inibidores possibilitam

a classificação das esterases em carboxilesterases, acetilesterases, colinesterases e

arilesterases. Três colinesterases foram identificadas, as OmEST-1, 5 e 7, que diferiram

na inibição por malathion, como observado para a OmEST-7, a ausência de inibição. As

OmEST-4 e 6 foram classificadas como carboxilesterases, devido à inibição por

desenvolvimento, larva, pupa e adulto. No zimograma apresentado na figura 2 estão

representadas as 11 enzimas observadas para esta espécie, que foram atribuídas como

produtos de cinco loci gênicos.

O padrão de esterases foi o mesmo para larvas e adultos, sendo os cinco loci

para as esterases expressos em ambas às fases. Já na fase de pupa pôde-se observar a

A análise da especificidade nas duas linhagens permitiu caracterizar as OsEST-

1, 2 e 4 como α-esterases por hidrolisar preferencialmente o α-naftil acetato e a OsEST-

3, β-esterase, por hidrolisar preferencialmente o β-naftil acetato. Já a OsEST-5