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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
ATIVIDADE BIOINSETICIDA E MECANISMO DE AÇÃO DE
VICILINAS DE SEMENTES Erythrina velutina SOBRE MOSCAS-
DAS-FRUTAS Ceratitis capitata
Natal/RN
2007
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LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
ATIVIDADE BIOINSETICIDA E MECANISMO DE AÇÃO DE
VICILINAS DE SEMENTES Erythrina velutina SOBRE MOSCAS-
DAS-FRUTAS Ceratitis capitata
Dissertação apresentada ao Departamento
de Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre
em Bioquímica.
Orientador: Dr. Maurício Pereira de Sales
NATAL
2007
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II
LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
ATIVIDADE BIOINSETICIDA E MECANISMO DE AÇÃO DE VICILINAS DE
SEMENTES Erythrina velutina SOBRE MOSCAS-DAS-FRUTAS Ceratitis capitata
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de
Mestre em Bioquímica.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Dr. Maurício Pereira de Sales
Departamento de Bioquímica - UFRN
Orientador
____________________________________________________
Dr. Aldo Malavasi Filho
Diretor Presidente, Biofábrica Moscamed Brasil – BA
1º Examinador
____________________________________________________
Dra. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
2º Examinador
III
Dedico esta obra
A Deus, nosso senhor, por sua luz, pelo seu amor e pela grande oportunidade de
convivência com os amigos.
À minha vovó Rita da Silva Macedo (In memoriam) pelo exemplo de luta, de
resignação e de amor.
Aos meus pais Francisco Pepino de Macedo e Adelaide Maria Ferreira de Lima, que
não mediram esforços para ajudar em minha formação, pelo amor, paciência e apóio
incondicional. Dedico também a meus irmãos, Linardo e Cristina, principalmente pela
alegria de vivermos em família acima de tudo nos amando.
À Carol, um grande presente de Deus, pela paciência e dedicação ao nosso amor.
Ao meu orientador, professor Maurício, pela oportunidade de fazer parte da família
LQFPB, pela paciência, pela confiança, pelos valiosos ensinamentos e incentivos,
pelo exemplo de dedicação e de amor à ciência.
IV
AGRADECIMENTOS
“Nunca atribua a você o sucesso desta ou daquela tarefa, compreendendo que em
todo trabalho há que considerar o espírito de equipe.”
André Luiz (Chico Xavier)
Às eternas amigas Gioconda, Kátia Anaya e Ticiana. Eu não merecia e por isso sou
muito grato a Deus pela oportunidade de ter convivido e aprendido com vocês o
nobre sentimento de uma fraterna amizade.
A todos os professores do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, em especial: Fernanda, Hugo, Edda, Luiz, Dilma, Suely, João
Felipe e Selma; o meu sincero agradecimento.
Ao Prof. Elizeu Antunes dos Santos pelas palavras amigas, orientações, sugestões e
dicas importantíssimas para a execução deste trabalho.
A professora Luciana Duarte Martins da Matta por importantes sugestões durante a
Qualificação.
Aos meus inestimáveis e inesquecíveis amigos Adeliana e Fabiano Teixeira pelos
longo e prazeroso tempo de convivência e sinceridade.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN: Eliene, Ana, Creuza.
Em especial a: Itamar, Jonas, pela boa vontade e criatividade.
Aos amigos do mestrado, Duda, Robério, Edílson, Dani Bananinha, Daniele (Dani de
Elizeu), Josane, Leila, Erica, Cybele, Nednaldo, Virginia, Leandro.
Aos imprescindíveis amigos do LQFP, Ludovico, Rodrigo, Ana Celly, Jannison,
Ibson, ABCDeyse, Joelma, Hugo, Cleysyvan, André magão, Norberto e professor
Alexandre que fizeram dos momentos de trabalho mais prazerosos.
V
A todos os funcionários e a grande família do Centro de Biociências, a dona
Mariquinha, ao Galego, a Geomar por mesmo sem saber serem indispensáveis nas
horas difíceis.
Ao Departamento de Biologia Celular e Genética, por oferecerem as condições
necessárias para o desenvolvimento da pesquisa.
Aos professores e funcionários do departamento de Biologia Celular e Genética, a
Edvaldo, Marilda, Francisco, Núbia e Carmem. Professor Sebastião, João Maria,
Gleider, Marcos,Katia Scortecci, Lucymara, Cristiane. Muito obrigado.
À professora Adriana Uchôa pela imprescindível contribuição durante todo o
trabalho, por importantes sugestões durante a qualificação e pelas palavras amigas
nas horas difíceis.
A Maria do Carmo, por sua importantíssima colaboração e paciência no Laboratório
de Moscas-das-frutas, que sempre foi uma mãe para as Ceratitis, e sem a sua ajuda
eu não estaria aqui te escrevendo.
A todos os professores, funcinários e alunos do Laboratório de Petróleo da UFRN
(LAPET), em especial às Professoras Rosângela Balaban e Marta Costa. À
inesquecível e amiga Dona Telma e aos amigos Michele, Fabio, Keila, Vanessa,
Rusa, Suzan, Odemar, Mauricio. Muito obrigado pela ajuda e companhia.
À Marcel Dore da Dore refrigerantes, pela doação das garrafas “pet” importantes
para os bioensaios.
Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
(IBAMA), pela aquisição de sementes de Mulungu.
À Capes e o Banco do Nordeste pelo suporte financeiro à pesquisa.
VI
“Fracassos? Não sei do que falas, em cada experiência
descubro um dos motivos pelo qual a lâmpada não
funciona. Agora sei mais de mil maneiras de como
não fazer a lâmpada.”
Thomas Edison
VII
RESUMO
A mosca-da-fruta Ceratitis capitata é considerada a praga mais destrutiva da
fruticultura mundial, para o seu controle vários programas de erradicação baseados
em agroquímicos foram criados para permitir o comércio mundial de frutas. Soluções
para a diminuição do uso de inseticidas sintéticos na agricultura estão baseadas no
desenvolvimento de novos compostos alvos-específicos com menos persistência no
meio ambiente, em especial proteínas vegetais com efeitos inseticidas. Neste
trabalho o principal objetivo foi avaliar o efeito deletério de uma vicilina purificada de
sementes de E. velutina (EvV) para larvas de C. capitata e propor o mecanismo de
ação da proteína. EvV foi purificada, caracterizada e o seu efeito deletério foi testado
em sistemas de bioensaios. O mecanismo de ação de EvV foi determinado por
técnicas de imunodetecção e localização por fluorescência em estruturas quitinosas,
presentes no sistema digestório de C. capitata. EvV é uma glicoproteína com
afinidade a quitina cuja massa molecular foi de 216,57 kDa, determinado por
cromatografia de gel filtração em sistema de FPLC. Por SDS-PAGE, EvV dissociou-
se em duas subunidades principais de 54,8 e 50,8 kDa, e quando foi submetida a
eletroforese em condições nativas apresentou uma banda única de característica
eletroforética ácida. Nos bioensaios a WD
50
e a LD
50
para as larvas
foram de 0,13%
e 0,14% (p/p). Os efeitos deletérios de EvV foram relacionados a sua ligação a
estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica e no epitélio intestinal,
associado com a baixa capacidade de C. capitata em digeri-la. Com esses
resultados é possível propor a EvV como candidata a fazer parte de programas de
manejo integrado de pragas, na composição de iscas tóxicas, como um potencial
bioinseticida de natureza protéica.
VIII
ABSTRACT
The fruit fly Ceratitis capitata is considered the most destructive pest of the
world fruitculture. Many pest management practices, mainly based on agrochemicals,
have been developed to allow the world-wide commerce of fruit. Solutions to
decrease the use of synthetic insecticides in agriculture are based on the
development of new target-specific compounds which cause less damage to the
environment, especially vegetal proteins with insecticidal effects. The aim of this work
was to evaluate the deleterious effect of a purified vicilin of E. velutina (EvV) seeds to
C. capitata larvae and adult insects and to investigate the mechanisms involved in
these effects. EvV was purified, characterized and its deleterious effect was tested in
bioassay systems. EvV mechanism of action was determined by immunodetection
techniques and fluorescence localization in chitin structures that are present in C.
capitata digestory system. EvV is a glycoprotein with affinity to chitin. Its molecular
weight, of 216,57 kDa, was determined by gel filtration chromatography in FPLC
system. Using SDS-PAGE, it was possible to observe EvV dissociation in two main
subunits of 54,8 and 50,8 kDa. When it was submitted to eletrophoresis in native
conditions, EvV presented only one band of acid characteristic. The WD
50
and LD
50
values found in the bioassays were 0,13% and 0,14% (w/w), respectively for the
larvae. EvV deleterious effects were related to the binding to chitin structures
presented in peritrophic membrane and gut epithelial cells, associated with its low
digestibility in C. capitata digestive tract. The results described herein are the first
demonstration of the larvicidal effects of plant protein on C. capitata larvae. EvV may
be part of the pest management programs, in the toxic bait composition, or an
alternative in plant improvement program.
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo de vida de Moscas-das-Frutas (Salles, 2000) ................................19
Figura 2 – Inseto adulto e larva de Ceratitis capitata................................................22
Figura 3 – Sementes de Mulungu (Erythrina velutina)..............................................33
Figura 5 – Esquema da Metodologia empregada no trabalho..................................55
Figura 6 – Perfil de eluição de EvV em cromatografia de afinidade em quitina........56
Figura 7 – (A) Perfil de eluição protéica de EvV em cromatografia Superose 6 10
300 GL. ..............................................................................................................58
Figura 8 – (A) SDS-PAGE (15%) de EvV corado com Comassie ............................59
Figura 9 – Curva de densidade para avaliação do efeito da competição das larvas
de C. capitata pela dieta ....................................................................................61
Figura 10 – Curva de instares larvais em relação ao comprimento corporal............62
Figura 11 – (A) Efeito de EvV sobre a massa de larvas de C. capitata em diferentes
concentrações....................................................................................................64
Figura 12 – Efeito EvV sobre a mortalidade de larvas de C. capitata em diferentes
concentrações....................................................................................................65
Figura 15 – (A) SDS-PAGE e (B) Imunobloting das proteínas extraídas de fezes de
larvas de C. capitata. M- marcador; 1 – BSA; 2 – Larva + BSA; 3 – EvV; 4 –
Larva + EvV. ......................................................................................................66
Figura 16 – Western blotting das proteínas extraídas de membranas peritróficas de
larvas de C. capitata. 1 – EvV; 2 – Larva + BSA; 3 – Larva + EvV. ...................68
Figura 17 –Fotomicrografia de fluorescência e de campo claro do epitélio intestinal e
da membrana peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dietas
contendo EvV-FITC acrescida ou não de N-acetil D-glicosamina......................70
X
LISTA DE TABELA
Tabela 1 Detecção de quitina em intestinos médios de C. capitata.................67
XI
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA Albumina sérica bovina
DMSO Dimetilsulfóxido
EB Extrato Bruto de Erythrina velutina
EvV Vicilina de E. velutina
F0-70 Fração protéica obtida do fracionamento com sulfato de amônia em
0-70% de saturação. Também denominada fração albuminíca
F70-90 Fração protéica obtida do fracionamento com sulfato de amônia em
70-90% de saturação. Também denominada fração globulínica.
FITC Fluoresceína isotiocianato
HIL Homogenato Intestinal de larvas de C. capitata
IgG Imunoglobulina da classe G
kDa Quilodalton
LC
50
Quantidade de vicilina capaz causar uma mortalidade de 50%
LT
50
Tempo necessário para a vicilina causar 50% de mortalidade da
população experimental
mA Miliampere
MP Membrana peritrófica
nm Nanômetro
p/p Relação peso/peso
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em Gel de poliacrilamida com SDS
TCA Ácido tricloroacético
Tris tris hidroximetil amino metano
UH Unidade de Hemaglutinação
v/v Relação volume/volume
WD
50
Quantidade de vicilina necessária para reduzir a massa das larvas
em 50%
WGA Lectina de germe de trigo específica para quitina
g Gravidade
XII
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO....................................................................................................16
1.1 – PRODUÇÃO BRASILEIRA DE FRUTAS .........................................................16
1.2 – MOSCAS-DAS-FRUTAS..................................................................................18
1.2.1 – Ceratitis capitata............................................................................................21
1.3 – CONTROLE DE PRAGAS................................................................................23
1.4 – SISTEMA DIGESTÓRIO DOS INSETOS.........................................................26
1.5 – MECANISMOS DE DEFESA DAS PLANTAS ..................................................28
1.6 – VICILINAS ........................................................................................................30
2.0 – OBJETIVO.......................................................................................................34
3.0 – MATERIAL.......................................................................................................35
3.1 – MATERIAL BIOLÓGICO ..................................................................................35
3.1.1 – Moscas-das-Frutas - Ceratitis capitata..........................................................35
3.1.2 – Sementes de Mulungu...................................................................................35
3.2 – REAGENTES ...................................................................................................36
3.3 – APARELHOS ...................................................................................................36
4.0 – MÉTODOS.......................................................................................................37
4.1 – CRIAÇÃO DA POPULAÇÃO DE C. CAPITATA...............................................37
4.1.2 - Dieta artificial para C. capitata .......................................................................38
4.2– PURIFICAÇÃO DE VICILINAS DAS SEMENTES.............................................38
4.2.1 – Preparo da Farinha de Sementes de E. velutina...........................................38
4.2.2 – Preparo do Extrato Bruto das Sementes.......................................................38
4.2.3 – Fracionamento com Sulfato de Amônio.........................................................39
4.2.4 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina.........................................39
4.3 – CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR EM SUPEROSE 6-10-300
GL DE EVV......................................................................................................39
4.4 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS ...........................................................................40
4.4 – DOSAGEM DE CARBOIDRATOS ...................................................................40
4.5 – DETECÇÃO DE OUTRAS PROTEÍNAS DE DEFESA LIGANTES Á QUITINA
NA FRAÇÃO ELUÍDA DA MATRIZ QUITINOSA .............................................41
XIII
4.5.1 – Ensaio de Inibição das Atividades Proteolíticas no Homogenato Intestinal de
Larvas de C. capitata ................................................................................................41
4.5.1.1– Preparação do Homogenato Intestinal de C. capitata.................................41
4.5.1.2 – Preparo de Azocaseína 1,0%.....................................................................42
4.5.1.3 – Ensaio de inibição da atividade azocaseinolítica........................................42
4.5.2 – Ensaio de Hemaglutinação............................................................................43
4.5.2.1 – Tratamento de Eritrócitos com Papaína .....................................................43
4.5.2.2 – Ensaio de Hemaglutinação de EvV ............................................................43
4.6 – PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA VICILINA DE E. VELUTINA .........44
4.6.1 – Obtenção de soro pré-imune.........................................................................44
4.6.2 – Imunização ....................................................................................................44
4.6.3 – Isolamento de imunoglobulinas do tipo G (IgG) ............................................45
4.7 – ANÁLISE DE EVV ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA...........45
4.7.1 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e desnaturante .............45
4.7.2 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e não
desnaturante .............................................................................................................46
4.7.3 – Coloração com Coomassie Blue ...................................................................46
4.8 – IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS - “WESTERN BLOTTING”....................46
4.9 – BIOENSAIO COM LARVAS DE C. capitata.....................................................49
4.9.1 – Curva de Densidade......................................................................................49
4.9.2– Curva de instares larval..................................................................................50
4.9.3 – Efeito de vicilinas sobre o Desenvolvimento de Larvas de C. capitata..........50
4.11– ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................50
4.12 – DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DE VICILINAS ...............51
4.12.1 – Digestibilidade in vivo de vicilinas por larvas de C. capitata........................51
4.12.2 – Detecção de quitina em Intestino médio de C.capitata................................51
4.12.3 – Ensaio de ligação in vivo de EvV em membrana peritrófica de larvas de C.
capitata......................................................................................................................52
4.12.4 – Detecção de EvV-FITC retidas em estruturas quitinosas de larvas C.
capitata......................................................................................................................52
4.12.4.1 – Conjugação covalente de EvV-FITC ........................................................52
XIV
4.12.4.2 - Localização de EvV-FITC fluorescente no epitélio intestinal e em
membrana peritrófica de larvas de C. capitata e ensaio de inibição de ligação com N-
acetil D-glicosamina ..................................................................................................53
4.12.4.3 - Ensaio de inibição da ligação de EvV–FITC a estruturas quitinosas com N-
acetil D-glicosamina ..................................................................................................53
5.0 – RESULTADOS.................................................................................................56
5.1 – ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE VICILINA DE Erythrina velutina ....56
5.1.1 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina.........................................56
5.1.2 – Análise da presença de proteínas de defesa ligantes a quitina co-eluídas da
matriz de quitina........................................................................................................57
5.1.3 – Cromatografia de Exclusão Molecular em Superose 6-10-300 GL em sistema
de FPLC AKTA Purifier e Determinação da Massa Molecular de EvV......................57
5.1.4 – Análise eletroforética de EvV em gel de poliacrilamida em condições
desnaturante e não desnaturante..............................................................................59
5.1.5 – Quantificação de carboidratos em EvV .........................................................60
5.2 – BIOENSAIOS ...................................................................................................60
5.2.1- Bioensaios com larvas ....................................................................................60
5.2.1.1 – Determinação das condições ótimas de bioensaios para larvas de C.
capitata – Curva de densidade..................................................................................60
5.2.1.2 – Determinação das condições ótimas de bioensaios para larvas de C.
capitata – Curva de Instars/ comprimento corporal...................................................62
5.2.2 – Efeito de EvV sobre a massa de larvas de C. capitata..................................63
5.2.3 – Efeito de EvV sobre a mortalidade de larvas de C. capitata..........................63
5.3 – MECANISMO DE AÇÃO DE EVV ....................................................................66
5.3.1 – Digestibilidade in vivo de EvV .......................................................................66
5.3.2 – Mecanismo de ação de EvV baseado na ligação à quitina presente na
membrana peritrófica de C. capitata .........................................................................67
5.3.2.1. Teste de Von Wisseling para detecção de quitina em intestinos de C.
capitata......................................................................................................................67
5.3.2.2 – Ensaio de ligação in vivo de EvV em membranas peritróficas de
C. capitata.................................................................................................................67
XV
5.3.2.3. – Localização fluorescente de EvV-FITC no epitélio intestinal e em
membrana peritrófica de larvas de C. capitata..........................................................69
•Localização fluorescente de EvV-FITC em larvas
..................................................................................................................................69
6.0 – DISCUSSÃO....................................................................................................72
7.0 – CONCLUSÃO ..................................................................................................80
8.0 – REFERÊNCIAS................................................................................................81
INTRODUÇÃO
16
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – PRODUÇÃO BRASILEIRA DE FRUTAS
As frutas são alimentos essenciais para uma dieta balanceada e saudável
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002). Elas são consideradas junto com as
hortaliças as principais e mais baratas fontes de importantes micronutrientes como
vitaminas e minerais, e ricas em fibras, desempenhando papel importante na
prevenção de deficiências de micronutrientes e promovendo o funcionamento
saudável do intestino (NANDI & BHATTACHARJEE, 2005). A Organização Mundial
da Saúde (OMS) e a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e
Alimentação (FAO) (2005) recomendam o consumo mínimo de 400 g de frutas e
verduras por dia para a prevenção de doenças crônicas como cardiopatias, câncer,
diabetes tipo 2 e obesidade (DE CHAVEZ & CHAVEZ, 1998; RIBOLI & NORAT,
2003; HUNG et al., 2004). Segundo o World Health Report (2002) estima-se que
mais de 2,6 milhões de mortes a cada ano poderiam ser evitadas se o consumo de
frutas e hortaliças fosse aumentado. De acordo com a FAO o mercado mundial de
frutas frescas esteve em plena ascensão na ultima década (FAOSTAT-FAO
STATISTICS DIVISION, 2007). A produção mundial de frutas frescas cresceu cerca
de 2,5% ao ano, alcançando um volume de 520 milhões de toneladas em 2005
contra 415 milhões de toneladas em 1995 (FAOSTAT-FAO STATISTICS DIVISION,
2007). Este aumento está associado a uma maior conscientização da população
para os efeitos benéficos do consumo de frutas na saúde humana, e das melhorias
na logística de produção e comercialização das frutas e produtos relacionados
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003a; b).
INTRODUÇÃO
17
O Brasil é o terceiro produtor mundial de frutas, atrás de China e Índia
(NANDI & BHATTACHARJEE, 2005), com uma produção que supera os 39 milhões
de toneladas, sendo que destes aproximadamente 20 milhões de toneladas foram
destinados aos mercados de fruta fresca. Não obstante essa colocação, o Brasil
exporta pouco mais de 1% da sua produção de frutas in natura, ocupando o 20°
lugar entre os países exportadores (SECEX, 2006). De 1998 a 2005 o país
aumentou suas exportações em mais de 200%, passando de US$ 120 milhões para
US$ 440 milhões de dólares obtidos na venda de frutas para o exterior (PEREIRA,
2006). Os principais destinos das frutas brasileiras são os países europeus, as
Américas do Norte e do Sul, o Oriente Médio, além de perspectivas de vendas para
o mercado asiático (IBRAF, 2005).
A fruticultura hoje é um dos principais segmentos da agricultura brasileira,
respondendo por 25% do valor da produção agrícola nacional (LACERDA et al.,
2004). A base agrícola da cadeia produtiva das frutas abrange 2,9 milhões de
hectares, gera 6 milhões de empregos diretos, ou seja, 27% do total da mão-de-obra
agrícola ocupada no país (IBGE, 2005). O valor bruto da produção de frutas atingiu
em 2006 cerca de 13,5 bilhões de reais, 14,1% do valor da produção agrícola
brasileira (IBGE, 2005).
O comércio internacional de produtos alimentares é fortemente condicionado
por vários mecanismos de regulação fitossanitária (FAVERET FILHO et al., 1999).
Preocupados com possíveis efeitos sobre consumidores e, especialmente, sobre
suas regiões produtoras, quase todos os países impõem restrições ao trânsito de
alimentos (FAVERET FILHO, et al., 1999; SILVA, 2000). No caso de produtos
frescos, a preocupação é redobrada, pois um lote infectado pode anular esforços de
erradicação de pragas ou doenças que levaram anos e custaram milhões de dólares.
INTRODUÇÃO
18
Note-se que os países com regras e instituições de controle de qualidade mais
rigorosas são justamente os grandes importadores: Estados Unidos, União Européia
e Japão, o que torna extremamente seletivo o acesso de novos exportadores aos
fluxos de comércio internacional de frutas (FAVERET FILHO, et al., 1999). No Brasil,
as moscas-das-frutas ocupam uma posição de destaque entre as maiores pragas da
fruticultura (DUARTE & MALAVASI, 2000).
1.2 – MOSCAS-DAS-FRUTAS
As moscas-das-frutas (Diptera: Tephritidae) são insetos pragas que atacam
uma grande variedade de espécies vegetais, podendo infestar flores, ramos,
sementes e frutos, no entanto os danos causados em frutos representam os maiores
prejuízos para a fruticultura (NISHIDA, 1980; DUARTE & MALAVASI, 2000; LIMA,
2001). Os tefritídeos possuem ciclo de vida relativamente curto, porém apresentam
metamorfose completa (holometabólicos). O desenvolvimento larval, em três
instares, dá-se no interior das frutas infestadas onde crescem alimentando-se da
polpa e abrindo galerias, de onde as larvas saem para empupar no solo. Após algum
tempo, que varia para cada espécie, emergem os adultos, que recomeçam o ciclo
(Figura 1) (MORGANTE, 1991; DUARTE & MALAVASI, 2000; SALLES, 2000a).
Os danos causados pelas moscas-das-frutas podem ser diretos, através da
oviposição nos frutos e da alimentação na fase larvais, ou indiretos, através da
invasão dos tecidos vegetais por microorganismos tornando os frutos impróprios
para o consumo in natura, e sua utilização na industria alimentícia (DUARTE &
MALAVASI, 2000).
INTRODUÇÃO
19
Figura 1 – Ciclo de vida de Moscas-das-Frutas (Salles, 2000)
A família Tephritidae apresenta ampla distribuição geográfica, com
predominância na região Neotropical, apresentando 4.352 espécies agrupadas em
481 gêneros (NORRBOM, 2004), dos quais somente cinco são de importância
econômica: Anastrepha, Ceratitis, Bactrocera, Rhagoletis e Toxotrypana (WHITE &
ELSON-HARRIS). No gênero Toxotrypana, a única espécie de importância
econômica, T. curvicauda (mosca-da-papaia), não ocorre no Brasil. O gênero
Bactrocera está representado por uma única espécie, B. carambolae (mosca-da-
carambola), recentemente introduzida e restrita ao Oiapoque (AP) (ZUCCHI, 2000).
As quatro espécies de Rhagoletis registradas no Brasil têm pouca importância
agrícola, pois são referidas como pragas esporádicas na região Sul (ZUCCHI, 2000).
O gênero Anastrepha é representado no Brasil por noventa e cinco espécies
(URAMOTO, 2007).
INTRODUÇÃO
20
O Gênero Ceratitis, de origem sub-Saariana, é um dos mais conhecidos em
todo o mundo por causa da notoriedade de uma de suas espécies, a mosca-do-
mediterrâneo, C. capitata. Mais de 100 espécies de Ceratitis já foram descritas e
estão limitadas ao continente africano, seis das quais são pragas, atacando uma
enorme variedade de plantas (CAREY, 1996). A única espécie do gênero no Brasil é
a C. capitata, que juntamente com sete espécies de Anastrepha — A. fraterculus
(Wied.), A. sororcula (Zucchi), A. zenildae (Zucchi), A. striata Schiner, A.
pseudoparallela (Loew), A. grandis (Macquart) e A. obliqua (Macquart) —,
representam as moscas-das-frutas mais importantes do ponto de vista econômico no
Brasil (ZUCCHI, 2000).
A grande variedade de hospedeiros infestados confirma as observações de
BATEMAN (1976), que considera as espécies tropicais de “moscas-das-frutas” como
tendo alta capacidade de colonização. Elas ocorrem em grande variedade de
hospedeiros em regiões ecológicas bastante diversas. As medidas do grau de
infestação mostraram que em hospedeiros nativos, a freqüência de Anastrepha ssp.
é maior que a de C. capitata, invertendo-se em hospedeiros introduzidos
(MALAVASI, 1977). Apesar desta preferência, já existe adaptação de C. capitata às
frutas nativas e de Anastrepha ssp. aos hospedeiros introduzidos (MALAVASI &
MORGANTE, 1980). A expansão de hospedeiros nas moscas-das-frutas pode ser
facilitada por um comportamento de oviposição de baixa discriminação e habilidade
das larvas para sobreviverem e se desenvolverem nos novos hospedeiros
(KRAINACKER et al., 1987; FLETCHER & PROKOPY, 1991).
Em muitas partes do mundo, as perdas causadas em regiões infestadas por
moscas-das-frutas chegam a 100% da produção (NISHIDA et al., 1957; CAREY &
DOWELL, 1989). Devido à sua importância econômica mundial, o comércio
INTRODUÇÃO
21
internacional de frutas frescas impõe normas que visam impedir a introdução de
espécies que ocorrem no país exportador para o país importador, por isso um dos
maiores obstáculos à produção e livre comercialização de frutas frescas entre o
Brasil e no resto do mundo é a presença de moscas-das-frutas nas áreas de
produção (DUARTE & MALAVASI, 2000). Tratamentos quarentenários são
requeridos pelos Estados Unidos para o controle de moscas-das-frutas que infestam
manga (Mangifera indica) e goiaba (Psidium guajava), no Brasil e Perú (SHARP &
PICHOMARTINEZ, 1990; NASCIMENTO et al., 1992). A adequação a essas normas
e exigências dos mercados, a busca pela segurança alimentar e quarentenária,
exigem rápidas mudanças nas técnicas de controle utilizadas na fruticultura
brasileira (CARVALHO, 2005).
1.2.1 – Ceratitis capitata
A mosca do mediterrâneo, Ceratitis capitata Wied.(1824) é a única espécie do
gênero Ceratitis no Brasil (ZUCCHI, 1988) (figura 2). Essa espécie é considerada a
mais cosmopolita e invasora dentre todos os tefritídeos. É a praga mais destrutiva da
fruticultura mundial, devido à natureza do dano causado, ao grande número de
gerações por ano e à sua grande adaptabilidade a vários tipos de hospedeiros,
sendo capaz de infestar mais de 350 espécies vegetais, inclusive aquelas de
importância econômica (WEEMS, 1981; METCALF, 1995). O provável centro de
origem dessa espécie é a África Equatorial, mas um processo global de invasão tem
ocorrido desde o século passado. No Brasil, onde sua presença foi registrada no
início do século XX (IHERING, 1901), ela é considerada uma das pragas de maior
importância quarentenária (MALAVASI & MORGANTE, 1980).
Devido aos danos causados por moscas-das-frutas, bilhões de dólares são
perdidos anualmente e vários programas foram criados para controlar e erradicar
INTRODUÇÃO
22
esta praga. Cada vez mais inseticidas são utilizados, como forma de proteção
mesmo quando a população de moscas-das-frutas ainda não atingiu o nível de dano
econômico, implicando em gastos e danos ao meio ambiente (DENT, 2000).
Figura 2 – Inseto adulto e larva de Ceratitis capitata
INTRODUÇÃO
23
1.3 – CONTROLE DE PRAGAS
O aumento da população mundial e a demanda crescente de alimentos têm
motivado o uso de grandes quantidades de pesticidas nas plantações (para prevenir
ou combater pragas), visando assegurar maior produtividade (CALDAS & DE
SOUZA, 2000). Segundo OERKE et al. (1994) o ataque de insetos pragas
consomem cerca de 14% da produção agrícola mundial. Atualmente a proteção da
lavoura está baseada na utilização de agroquímicos, que em 2001 movimentou um
mercado mundial de aproximadamente 32 bilhões de dólares, segundo a agência de
proteção ambiental dos Estados Unidos (KIELY et al., 2004). Porém na ausência
desse meio de combate às pragas, as perdas poderiam ser muito mais sérias
(HILDER & BOULTER, 1999). Segundo Krattiger (1997) os danos causados na
agricultura mundial sem o uso de pesticidas e outras estratégias de controle são
estimados em 70% da produção agrícola, totalizando cerca de 400 bilhões de
dólares por ano.
Os primeiros inseticidas realmente eficientes foram introduzidos no combate
de pragas na metade do século 20, antes, o controle de pragas era baseado na
utilização de compostos inorgânicos como enxofre, arsênio, cianetos e boratos
(CASIDA & QUISTAD, 1998), os quais apresentavam alta toxidade e baixa
especificidade, sendo tóxicos para vertebrados (LOPEZ et al., 2005). A introdução
dos inseticidas organoclorados, organofosforados e carbamatos, todos químicos
neurotóxicos, significou uma grande revolução na agricultura (ISHAAYA, 2003).
Contudo, a utilização dos pesticidas constitui-se num dos mais importantes fatores
de risco para o homem e para o meio ambiente (TILMAN et al., 2001; HAPEMAN et
al., 2003). Apesar dos benefícios produtivos destes compostos, anualmente, 355 mil
pessoas morrem em decorrência de envenenamento em todo o mundo, sendo 75%
INTRODUÇÃO
24
destes casos em paises em desenvolvimento (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2003c). Alguns pesticidas dependendo da sua persistência e volatilidade, dispersam
globalmente (WILKENING, 2001; GODDUHN & DUFFY, 2003). Cada vez mais,
grandes quantidades de pesticida e seus metabólitos são detectados contaminando
águas superficiais e subterrâneas (KOLPIN et al., 2004; FAVA et al., 2005;
WORRALL & BESIEN, 2005), solos (SIVANESAN et al., 2004; CRAVEN & HOY,
2005), a atmosfera (DUBUS et al., 2000; DUYZER, 2003). Estes pesticidas
bioacumulam em cadeias alimentares (KIDD et al., 1995), provocam impactos sobre
a saúde humana e de outras espécies longe de seu local de liberação até muitos
anos depois de liberados (WOLKERS et al., 2006; SAGIV et al., 2007).
Em muitos paises, como no Brasil, há ocorrências de casos concretos de
fracassos no controle de pragas através do uso exclusivo de pesticidas,
principalmente devido a problemas decorrentes da eliminação de inimigos naturais,
desenvolvimento ou aumento de resistência e ressurgência de pragas secundárias.
O potencial acúmulo de resíduos de pesticidas no agrossistema e nos produtos
vegetais causa uma crescente preocupação mundial. Além das exigências impostas
pela lei à não presença ou aceitação de resíduos tóxicos nos alimentos, a sociedade
está, a cada dia, exigindo por produtos que estejam seguramente livres de
agrotóxicos (SALLES, 2000b). Além dos aspectos ambientais negativos e afim de
superar a resistência de populações de insetos resistentes aos inseticidas
neurotóxicos convencionais a tendência nas pesquisas é a procura por pesticidas
com diferentes mecanismos de ação e com baixa toxicidade para a saúde humana e
para o meio ambiente (DHADIALLA et al., 1998; GRAPOV, 1999).
Em meados de 1960 pesquisadores começaram a questionar o modelo de
agricultura exclusivamente agroquímico que com o passar do tempo provocam
INTRODUÇÃO
25
problemas ecologicamente e economicamente insustentáveis (GEIER, 1966;
KOGAN, 1998). Como conseqüência surgiu um novo conceito de controle de pragas
visando a minimização de todos esses problemas. Este novo conceito recebeu
inicialmente a denominação de Controle Integrado, evoluindo para o termo "Manejo
Integrado de Pragas" (MIP) para designar o controle de insetos com bases
ecológicas e envolvendo qualquer tipo de problema que limitasse a produção
agrícola decorrente da competição interespecífica (patógenos, insetos, nematóides,
plantas daninhas, etc) (KOGAN, 1998). A prática do MIP foi descrita por Geier (1966)
e baseia-se nos seguintes pontos: (1) como se deve modificar o sistema de vida de
uma praga para reduzir a sua população a níveis toleráveis, ou seja, inferior ao nível
de dano econômico; (2) aplicação do conhecimento biológico e da tecnologia
disponível para obter a modificação desejada (ecologia aplicada); e (3) uso de
táticas no controle de pragas adequado à tecnologia existente, compatível com os
aspectos qualitativos, econômicos e ambientais, ou seja de aceitação econômica e
social. O manejo integrado de moscas-das-frutas no Brasil utiliza basicamente a
técnica do monitoramento de adultos com armadilhas e o uso de iscas tóxicas ou
pulverização de inseticida em cobertura (NASCIMENTO & CARVALHO, 2000).
Havendo, portanto uma necessidade por novos métodos alternativos eficazes de
controle que mantenham a população das moscas em níveis seguros, e que possam
ser associadas aos programas de manejo de pragas dentro do agronegócio.
Um dos principais objetivos de investigações básicas associadas ao manejo
integrado de pragas é a perspectiva de entender e interferir nos processos vitais do
inseto (genéticos-bioquímicos-morfofisiológicos), de modo que tal interferência
possua escassa ou nenhuma influência sobre outros animais, e ao mesmo tempo,
possa servir como instrumento potencial para o controle de espécies prejudiciais
INTRODUÇÃO
26
(CRUZ et al., 2000). Dentro desta perspectiva o sistema digestório dos insetos é
uma região importante de exposição deste com o meio ambiente, dessa forma,
estratégias que interferiram na bioquímica e fisiologia desta região, visando à
redução de absorção de nutrientes, seriam ferramentas potencialmente eficientes no
manejo de pragas (SHEWRY & LUCAS, 1997).
1.4 – SISTEMA DIGESTÓRIO DOS INSETOS
A habilidade dos insetos de se alimentar de praticamente todo tipo de matéria
orgânica é o maior fator para o seu sucesso, capacitando-os para os mais diversos
nichos ecológicos (WIGGLESWORTH, 1972). A grande variedade de alimentos que
podem ser ingeridos pelos insetos é refletido na diversidade de estruturas das peças
bucais bem como, na diversidade do trato digestório, com um alto grau de
especialização que varia com o tipo particular de dieta (WIGGLESWORTH, 1972).
Seu trato digestório é constituído por um tubo de células epiteliais que se estende da
boca até o ânus (WIGGLESWORTH, 1972; TERRA & FERREIRA, 1994). Está
dividido em três principais regiões baseado na origem embrionária e na sua função
fisiológica em estomodeu (intestinos anterior), mesêntero (intestino médio) e
proctodeu (intestino posterior), onde o principal local de absorção e digestão é o
intestino médio (WIGGLESWORTH, 1972; TERRA & FERREIRA, 1994; TERRA et
al., 1996).
O trato digestório animal está exposto a uma variedade de agentes nocivos
de natureza química, física e biológica, necessitando de mecanismos para a sua
proteção. Nos vertebrados, o muco é uma secreção que recobre e protege o epitélio
intestinal, enquanto auxilia o processo de digestão. Nos insetos, entretanto, não se
observa uma camada mucosa propriamente dita recobrindo o trato digestório, em
seu lugar, o intestino médio dos insetos é protegido por uma estrutura acelular e
INTRODUÇÃO
27
semipermeável denominada membrana peritrófica ou matriz peritrófica ou gel
peritrófico (PETERS, 1992; LEHANE, 1997; TERRA, 2001). A membrana peritrófica
é uma estrutura mucosa (WANG & GRANADOS, 1997), que difere do muco dos
vertebrados pela incorporação de quitina, resultando em uma estrutura protéica
reforçada por fibrilas de quitina (PETERS, 1992). É constituída principalmente por
glicoproteínas e proteoglicanos (20-55%) e por quitina (3-40%) (KRAMER et al.,
1995; LEHANE, 1997) em uma organização que fornece semi-permeabilidade e
elasticidade a estrutura (LEHANE, 1997). A quitina é um importante componente
estrutural da membrana peritrófica por além de fornecer rigidez, serve também como
sítio de ancoragem para proteínas como as peritrofinas (WANG & GRANADOS,
2001). A presença desta membrana define a formação de um espaço
endoperitrófico, o qual contém o alimento ingerido; e o espaço ectoperitrófico
correspondendo a região entre a membrana peritrófica e o epitélio intestinal.
A Membrana peritrófica, em insetos pode ocorrer em duas formas, definidas
quanto ao seu sitio de síntese: Tipo I e Tipo II (WIGGLESWORTH, 1972; PETERS,
1992). A membrana peritrófica do tipo I, produzida por exemplo em muitos insetos
adultos hematófagos, é sintetizada por células epiteliais do intestino médio, sendo
produzida em resposta a ingestão de alimento, que por descamação da superfície
epitelial, dá origem a uma estrutura em forma de bolsa que recobre o alimento
(LEHANE, 1997). O Tipo II de membrana peritrófica é produzido a partir de um
pequeno órgão altamente especializado chamado de cárdia situado na região
anterior do intestino médio. Este tipo de Membrana peritrófica é constitutivamente
produzida como um contínuo tubo com estrutura altamente organizada. As mais bem
caracterizadas membranas peritróficas do tipo II são de larvas de dípteros
muscóides (PETERS, 1992; TELLAM & EISEMANN, 2000).
INTRODUÇÃO
28
As principais funções atribuídas a esta membrana são a de proteção
mecânica contra injúria as células do intestino médio (WIGGLESWORTH, 1972),
uma barreira física contra microorganismos (PETERS, 1992), uma barreira seletiva
para enzimas digestivas e produtos de digestão (DAY & WATERHOUSE, 1953) e
atuação no mecanismo de reciclagem de enzimas digestivas, fenômeno conhecido
como circulação ecto-endoperitrófica (TERRA, 1988; TERRA & FERREIRA, 1994;
TERRA, 2001).
Diversos trabalhos demonstram que alteração na permeabilidade da
membrana peritrófica pode causar a morte de insetos por desnutrição (EISEMANN
et al., 1994; TELLAM & EISEMANN, 1998; WANG & GRANADOS, 2001). Esse
efeito pode ser alcançado pela incorporação, na dieta destes insetos, de proteínas
que tenham afinidade por quitina, como lectinas, anticorpos e vicilinas (EISEMANN &
BINNINGTON, 1994; HARPER et al., 1998; HOPKINS & HARPER, 2001; MACEDO
et al., 2007; MOURA et al., 2007).
1.5 – MECANISMOS DE DEFESA DAS PLANTAS
Em resposta a herbivoria excessiva dos insetos as plantas desenvolveram
diversas estratégias de proteção e ou resistência. A resistência é o termo usado para
descrever a capacidade das plantas em prevenir, restringir ou retardar a penetração
de um predador no tecido hospedeiro (KOGAN, 1986; HAMMOND-KOSACK &
JONES, 1996). Essa resistência é baseada nos vários mecanismos de defesa
desenvolvidos pelas plantas, durante a evolução (SCHULER et al., 1998). As
defesas de plantas podem ser classificadas como físicas (espinhos, tricomas, e
tegumentos) ou químicas se há envolvimento de substâncias químicas nos
mecanismos pelos quais elas se protegem. As defesas químicas, por sua vez,
podem ser de natureza não protéica ou de natureza protéica (RYAN, 1990). Por
INTRODUÇÃO
29
outro lado, as defesas também podem ser agrupadas em duas categorias: defesas
constitutivas, se sua ação faz-se dentro do programa de desenvolvimento normal da
planta nos diferentes tecidos vegetais; ou induzidas quando estão envolvidas
diretamente na resposta a infecção ou estímulos ambientais (CHESSIN & ZIPF,
1990). Essa resposta induzida pode resultar em efetivos mecanismos de resistência
a doenças quando ela é expressa pela planta, sistemicamente. Nesse caso, os
agentes envolvidos induzem uma resposta do hospedeiro, não apenas em torno das
partes atingidas, como também em partes da planta distante da área onde ocorreu à
injúria, sendo este processo denominado imunização sistêmica adquirida (DEAN &
KUC, 1986; GOTTSTEIN & KUC, 1989). As defesas induzidas são mais importantes
para as defesas de partes vegetativas das plantas, enquanto que as defesas
constitutivas são mais importantes para as defesas das sementes (XAVIER-FILHO,
1993; UCHÔA et al., 2002).
Diversas proteínas envolvidas no processo de defesa presentes em sementes
de leguminosas foram isoladas, purificadas e caracterizadas. Entre elas estão
enzimas como, quitinases (SANTOS et al., 2004) , β–1,3 glucanases, inibidores de
enzimas hidrolíticas como, inibidores de amilases (SAWADA et al., 2006) e de
proteinases (ARAUJO et al., 2005; GOMES et al., 2005b), e proteínas de reserva
como as arcelinas (MINNEY et al., 1990), vicilinas (MOURA, et al., 2007), lectinas
(MORAES et al., 1996).
Muitas destas proteínas de defesa podem ser divididas em dois principais
grupos segundo a forma pelas quais podem causar efeitos tóxicos no processo de
digestão dos insetos. No primeiro grupo, elas podem ser proteínas que inibem
enzimas digestivas. Neste grupo estão os inibidores de α-amilases (FRANCO et al.,
2000; FRANCO et al., 2005) e os inibidores de proteases (GATEHOUSE et al., 1999;
INTRODUÇÃO
30
OLIVEIRA et al., 2003; FRANCO et al., 2004; GOMES et al., 2005a; GOMES, et al.,
2005b). Os efeitos tóxicos causados por estas proteínas são devido a privação de
nutrientes decorrido pela inibição seletiva de enzimas digestivas presentes no trato
intestinal dos insetos (JONGSMA & BOLTER, 1997; GATEHOUSE, et al., 1999). No
segundo grupo estão as proteínas que se ligam a quitina, como lectinas (DUTTA et
al., 2005; GUPTA et al., 2005; MACEDO, et al., 2007) e vicilinas (MACEDO et al.,
1995; SALES et al., 1996; MOURA, et al., 2007) , e, portanto capazes de se ligarem
à membrana peritrófica interferindo na assimilação de nutrientes, e levando o inseto
à morte (SALES, et al., 1996)..
Em estudos recentes de caracterização das enzimas proteolíticas em Ceratitis
capitata foi verificado que estes insetos utilizam principalmente proteases alcalinas
do tipo serínicas (SILVA et al., 2006; SAN ANDRES et al., 2007), esta detecção
motivou a utilização de inibidores de proteinases serínicos obtidos de sementes,
como promissores candidatos a bioinseticidas, atuando na inibição especifica da
digestão das proteínas. A utilização destes inibidores em sistema de dieta artificial
afetou significantemente o desenvolvimento larval de C. capitata, porém, causou
pouco efeito sobre a mortalidade das larvas (ARAUJO, et al., 2005; GOMES, et al.,
2005b). Com relação ao efeito de proteínas que se ligam a estruturas presentes no
trato digestório de insetos, muitos estudos comprovaram sua ação inseticida em
dípteros (EISEMANN, et al., 1994; TELLAM & EISEMANN, 1998), contudo a
potencial utilização destas proteínas no combate as moscas-das-frutas não foi
testada.
1.6 – VICILINAS
As vicilinas compreendem uma classe de proteína de reserva muito bem
conhecida, podendo constituir 70-80% do total de proteínas da semente. são
INTRODUÇÃO
31
proteínas triméricas de peso molecular entre 150 a 190 kDa, não formam pontes
dissulfeto devido a ausência de resíduos de cisteína (DERBYSHIRE et al., 1976;
PEDALINO et al., 1992). As subunidades da vicilina de ervilha são sintetizadas
inicialmente como um grupo de polipepitídeos de peso molecular entre 47 a 50 kDa,
porém a proteólise pós-traducional e glicosilação resulta em subunidades com pesos
moleculares entre 12,5 a 33 kDa (GATEHOUSE et al., 1984). Esta característica
pode também ser resultado da adição incompleta ou degradação parcial da ligação
dos oligossacarídeos nas cadeias laterais dos peptídeos tornando difícil sua
digestão por insetos (CHEE et al., 1991; MACEDO, et al., 1995). As subunidades
são codificadas, na sua maioria, por 2 a 3 tipos de genes, com 3 a 4 copias de cada
tipo por genoma haplóide (GOLDBERG et al., 1981; SUN et al., 1981; TIERNEY et
al., 1987; BOWN et al., 1988; HARADA et al., 1989). Observa-se que os genes de
vicilinas de Phaseolus vulgaris, Pisum sativum e Glycine max quando comparados
apresentam alta homologia (DOYLE et al., 1986). Cada gene tem 6 éxons e 5 íntrons
(DOYLE, et al., 1986; HIGGINS et al., 1988).
Em sementes de legumes, as vicilinas são proteínas multifuncionais,
funcionando como uma fonte de aminoácidos durante a germinação e ao mesmo
tempo sendo tóxica para bruquídeos (MACEDO et al., 1993; SHUTOV et al., 1995;
SALES et al., 2000). Vicilinas de Vigna unguiculata mostraram forte associação com
quitina, quitosana e quitina completamente acetilada (SALES, et al., 1996). Por esta
razão, estas proteínas podem se ligar à parede celular de fungos, interferindo na
germinação dos esporos ou dos conídios de uma variedade de fungos (GOMES et
al., 1997), atuam inibindo o crescimento de leveduras (GOMES et al., 1998), e ainda
podem se ligar a estruturas quitinosas do intestino médio de Callosobruchus
maculatus interferindo assim no seu desenvolvimento (YUNES et al., 1998).
INTRODUÇÃO
32
Portanto, vicilinas são proteínas bioativas importantes nos processos de
defesa de muitas espécies de plantas. Essas proteínas possuem atividades
bioinseticidas sobre diversas pragas associando-se a estruturas do epitélio e
membranas peritróficas presentes no intestino de vários insetos, podendo ser
usadas como aleloquímicos no controle de pragas importantes, seja como
constituinte tóxico de iscas ou nos programas de melhoramento de plantas
cultivadas por meio de técnicas de transgenia.
No nosso laboratório são realizados estudos de bioprospecção por proteínas
tóxicas em sementes ditas selvagens presentes nos biomas de mata atlântica e
caatinga. Dentre essas sementes destacam-se as de mulungu (Erythrina velutina)
que é uma leguminosa de grande porte endêmica de regiões semi-áridas do
nordeste do Brasil (RIBEIRO et al., 2006) (figura 3). Resultados recentes do nosso
grupo mostraram que vicilinas extraídas das sementes desta leguminosa foi tóxica
para os bruquídeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes sufasciatus. Neste estudo,
vicilina de sementes de E. velutina foi purificada, caracterizada e utilizadas em
sistema de bioensaio com o intuito de se propor um modelo de controle biorracional
da população da mosca-da-fruta C. capitata.
INTRODUÇÃO
33
Figura 3 – Sementes de Mulungu (Erythrina velutina)
OBJETIVOS
34
2.0 – OBJETIVO
Objetivo geral:
Investigar o potencial bioinseticida de vicilinas de Erythrina velutina (Mulungu)
sobre C. capitata .
Objetivos específicos:
1. Isolar, purificar e caracterizar vicilinas de sementes da leguminosa
Erythrina velutina (Mulungu).
2. Avaliar o efeito de vicilinas de leguminosas sobre a massa e mortalidade de
larvas de C. capitata, determinando o LD
50
e WD
50
.
3. Determinar o possível mecanismo de ação das vicilinas.
MATERIAL
35
3.0 – MATERIAL
3.1 – MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1 – Moscas-das-Frutas - Ceratitis capitata
Neste trabalho, o material biológico constituído do inseto adulto e de larvas
de C. capitata, foi obtido a partir de frutos de castanholas (Terminalia catappa L.)
infestadas recolhidas no campus da UFRN (5°50'18.47"S; 35°12'3.99"O), na
cidade de Natal, no Estado do Rio Grande do Norte.
3.1.2 – Sementes de Mulungu
Neste trabalho foram utilizadas sementes secas de mulungu (Erythrina
velutina) fornecidas pela divisão Técnica – Setor de Sementeiras do Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA), Natal, RN.
MATERIAL
36
3.2 – REAGENTES
• Azocaseína, BSA, Dimetilsulfóxido, anti-IgG de coelho conjugada à
peroxidase, Fluoresceína 5-isotiocianato isômero I (SIGMA Chemical Co., St.
Louis, MO, EUA).
• Membrana de Nitrocelulose - Amersham Hybond™-C Extra (GE
Healthcare Bio-Sciences Corp.)
• Coomassie brilliant blue G – 250 - Bio Rad
• Os demais reagentes foram de grau analítico e adquiridos
comercialmente.
3.3 – APARELHOS
• Agitador Magnético Mod. 257 FANEM
• Banho Maria TCE – 056 TECNAL
• BOD - TECNAL
• Centrífuga Eppendorf – Netheler Hlnz GmbH 22331 Hamburg
• Centrífuga Refrigerada Sigma Laborzentrifugen 2K15
• Espectrofotômetro Femto 700 Plus
• Medidor de pH Analyser 300
• Microscópio de fluorescência Nikon Eclipse E200
• FPLC AKTA Purifier (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)
MÉTODOS
37
4.0 – MÉTODOS
4.1 – CRIAÇÃO DA POPULAÇÃO DE C. capitata
Os frutos de castanholas (Terminalia catappa L.) infestadas por Ceratitis
capitata foram colhidos no campus da UFRN e deixados em bandejas plásticas (49 x
28 x 7 cm) com vermiculita até a empupação. As pupas foram peneiradas e
colocadas em recipientes plásticos fechados e arejados. Os insetos adultos, após
emergirem, foram classificados e os que pertenciam ao gênero Ceratitis foram
separados e colocados em gaiolas. Esses insetos foram mantidos à base de dieta
composta por: 150 g de açúcar mascavo, 100 g de açúcar refinado, 36 g de lêvedo
de cerveja, 3 g de sustagen®, 60 mL mel de abelha e 180 mL de hidrolisado de
proteína de milho. Uma esponja embebida com água ficou permanentemente a
disposição dos insetos.
Após um período de aproximadamente 10 dias de idade, os insetos adultos
atingiram o estágio de maturação sexual. As fêmeas começaram a ovipositar na
malha do filó - que cobre uma das faces da gaiola, estimuladas pela incidência de
luz nesta face. Os ovos foram então recolhidos em uma calha coletora contendo
salina, o que dessa forma evitou-se o ressecamento dos ovos. No período da
manhã, as calhas foram limpas e a suspensão, contendo os ovos, filtrada em filó.
Por fim os ovos foram espalhados na superfície da dieta artificial para larvas de
Ceratitis capitata. Após um período de 48 horas as larvas emergiram dos ovos e
após mais 120 horas as larvas atingiram o terceiro instar. Como comportamento
característico dessa espécie, as larvas começaram a saltar e conseguiram sair do
recipiente que contém a dieta, caindo em vermiculita onde empuparam. Esse
recipiente deve ser mantido no escuro. Todas as etapas do processo descritas
MÉTODOS
38
acima foram realizadas a 28 °C com a umidade relativa em torno de 75%. Os
adultos foram mantidos em fotoperíodo 12:12 (Luz:Escuro).
4.1.2 - Dieta artificial para C. capitata
O preparo de 500 g de dieta artificial (Walder, 2002) foi realizado adicionando-
se gérmen de trigo (15 g), farinha de trigo (32,5 g), açúcar cristal (60 g), extrato de
levedura (49,5 g), benzoato de sódio (1,5 g), HCl (4,5 g), H
2
O (285 g) e bagaço de
cana-de-açúcar (52 g). O material foi misturado até a formação de uma pasta
homogênea.
4.2– PURIFICAÇÃO DE VICILINAS DAS SEMENTES
4.2.1 – Preparo da Farinha de Sementes de E. velutina
Sementes secas Erythrina velutina depois de retirados seus tegumentos,
foram trituradas em multiprocessador, passadas no moinho elétrico e peneiradas
para obtenção de uma farinha de granulação fina.
4.2.2 – Preparo do Extrato Bruto das Sementes
O extrato bruto da farinha das sementes foi obtido a partir da
homogeneização em tampão Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5 na proporção de
1:10 (m/v) sob agitação constante por 2 horas à temperatura ambiente. A suspensão
foi centrifugada a 12000 x g por 30 minutos a 4 ºC. O precipitado foi descartado e o
sobrenadante filtrado em lã de vidro e denominado de Extrato Bruto (EB).
MÉTODOS
39
4.2.3 – Fracionamento com Sulfato de Amônio
O extrato bruto foi fracionado com sulfato de amônio em duas etapas de
concentração: 0-70% e 70-90%. Após cada etapa de fracionamento, a solução
permaneceu a 4 ºC por aproximadamente 16 horas e, posteriormente centrifugada a
12.000 x g durante 30 minutos, a 4 ºC. Os precipitados resultantes de cada
fracionamento foram ressuspensos em tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5
submetidos à diálise durante 18 horas a 4 °C contra o mesmo tampão. Após diálise
as frações foram denominadas F0-70 (fração albumínica) e F70-90 (fração
globulínica), de acordo com a faixa de saturação de sulfato de amônio em que
precipitaram.
4.2.4 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina
A fração F70-90 das sementes foi submetida a uma cromatografia de
afinidade em matriz de quitina, previamente equilibrada com tampão tetraborato de
sódio 50 mM pH 7,5. Frações de 3,0 mL foram coletadas e a absorbância
acompanhada a 280 nm. Após a eluição das proteínas não adsorvidas com tampão
de equilíbrio, as proteínas retidas foram eluídas com tampão Glicina 100 mM, pH
2,0. Os eluatos correspondentes ao pico retido foram dialisadas contra água
destiladas, liofilizadas e denominadas EvV.
4.3 – CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR EM SUPEROSE 6-10-300
GL DE EvV
Para confirmação da purificação e determinação da massa molecular de EvV,
um mililitro de solução da proteína (0,83 mg/mL) foi submetida à cromatografia de
exclusão molecular Superose-6-10-300-GL, em sistema de FPLC AKTA Purifier,
MÉTODOS
40
previamente equilibrada em tampão tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. Esta coluna
foi previamente calibrada com os seguintes padrões de proteínas: tireoglobulina
(669 kDa), β-amilase (200 kDa), álcool desidrogenase (150 kDa) e anidrase
carbônica (29 KDa). Frações de 0,5 ml foram coletadas sob um fluxo de 0,5 ml/min e
absorbância medida a 280 nm. As massas moleculares aparentes das vicilinas
foram estimadas a partir da interpolação logarítmica entre massas moleculares dos
diferentes marcadores protéicos utilizados e os seus respectivos volumes de eluição.
4.4 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS
As concentrações protéicas foram determinadas pelo método colorimétrico de
Bradford (1976), no qual albumina sérica bovina é utilizada como padrão. Para o
ensaio, 50 μL de amostra protéica foram completados com 2500 μL com Reagente
de Bradford. A reação foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos, agitada
em vortex. As leituras das amostras foram verificadas à absorbância a 595 nm. A
concentração protéica das amostras foi calculada a partir da equação da curva
previamente construída.
4.4 – DOSAGEM DE CARBOIDRATOS
A quantificação de açucares totais foi determinada pelo método do fenol/ácido
sulfúrico como previamente descrito por Dubois et al. (1956) empregando-se como
padrão D-glicose. EvV foi dissolvida em tampão tetraborato de sódio, 50 mM pH 7,5
na concentração de 10 mg/mL. Para o ensaio 40 μL desta solução foram
completados para 1000 μL com água destilada e acrescida de 25 μl fenol 80%, 2,5
ml de ácido sulfúrico. A reação foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos,
agitada em vortex, e deixada em banho-maria a 37 ºC por mais 30 minutos. As
leituras das amostras foram verificadas à absorbância a 490 nm. A concentração de
MÉTODOS
41
carboidratos das amostras foi calculada a partir da equação da curva previamente
construída.
4.5 – DETECÇÃO DE OUTRAS PROTEÍNAS DE DEFESA LIGANTES Á QUITINA
NA FRAÇÃO ELUÍDA DA MATRIZ QUITINOSA
Para detectar a presença de outras proteínas de defesa ligantes à matriz de
quitina de amostras de vicilinas purificadas foram feitos ensaios inibitórios contra
enzimas do tipo serínicas, de homogenatos intestinais de larvas de C. capitata.
Também foram realizados ensaios de hemaglutinação para detectar a presença de
lectinas.
4.5.1 – Ensaio de Inibição das Atividades Proteolíticas no Homogenato
Intestinal de Larvas de C. capitata
4.5.1.1– Preparação do Homogenato Intestinal de C. capitata
Larvas de terceiro instar de C. capitata foram mergulhados em solução de
NaCl 150 mM e mantidos no gelo até a dissecação. Esta foi realizada a frio com
auxílio de uma lupa esterioscópica. Após a exposição do trato intestinal, o intestino
foi seccionado e transferido para tubo de microcentrífuga contendo 200 μL do
tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5 (TBS) e mantido em gelo até a retirada
de 100 intestinos por tubo. Estes permaneceram estocados a -20ºC até sua
utilização nos ensaios.
Os intestinos obtidos como acima descrito foram homogeneizados em Potter
durante 5 minutos em banho de gelo, após a homogeneização, foram adicionados
800 μL de tampão Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. A suspensão foi centrifugada
a 12000 x g por 15 minutos a 4 ºC. O precipitado foi desprezado e o sobrenadante,
MÉTODOS
42
denominado homogenato intestinal de larvas (HIL). Os homogenatos foram
utilizados imediatamente nos ensaios.
4.5.1.2 – Preparo de Azocaseína 1,0%
Um grama de azocaseína foi pesado e dissolvido em 100 mL de tampão
Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. A suspensão foi aquecida e deixada em
ebulição por 5 minutos. Após o resfriamento, o pH da solução foi reajustado e o
volume completado para 100 mL com água destilada. Essa solução foi armazenada
a -20 °C até sua utilização.
4.5.1.3 – Ensaio de inibição da atividade azocaseinolítica
A inibição da atividade azocaseinolítica de homogenatos intestinais de larvas
de C. capitata foi determinada pré-incubando-se por 15 minutos a 37 °C alíquotas de
50 μL das soluções (4 mg/ mL) de vicilinas com 50 μL de homogenatos. Após o
tempo de pré-incubação foram adicionados 400 μL de tampão tetraborato de sódio
50 mM pH 7,5 e 500 μL de azocaseina 1,0% a 37°C por 60 minutos. A reação foi
parada com a adição de 300 μL de TCA 20%. Os tubos foram deixados em repouso
por 15 minutos e centrifugados por mais 15 minutos a 13000 x g. alíquotas de 400
μL do sobrenadante foram alcalinizadas com o mesmo volume de NaOH 2N. O
efeito das vicilinas sobre a atividade proteolítica a pH 7,5 foi determinada pela
medida da absorbância dos peptídeos diazotizados produzidos a 440 nm. O ensaio
controle foi realizado na ausência de vicilinas nas mesmas condições acima
descritas. Os ensaios foram realizados em triplicata e provas em branco foram feitas.
MÉTODOS
43
4.5.2 – Ensaio de Hemaglutinação
4.5.2.1 – Tratamento de Eritrócitos com Papaína
Uma solução estoque de papaína a 1% em solução salina foi preparada e
mantida a 4 °C por 24 horas com agitação ocasional. A solução foi estocada em
alíquotas de 3 mL de papaína a –20 °C. Quando necessário, foi diluído na proporção
1:10 (v/v) com tampão SORENGEN (3 partes de NaH
2
PO
4
0,067 M e 1 parte de
KH
2
POH, 0.067 M).
A solução de papaína foi adicionada ao sangue, previamente lavado, na
proporção de 1:1 (v/v). A mistura foi incubada por 30 minutos a 37°C, com agitação
ocasional. Em seguida foi centrifugado a 2.500 x g, por 5 minutos e seu precipitado
foi lavado 6 vezes com solução salina gelada. O hematócrito foi realizado e as
hemáceas foram diluídas a 4% em solução salina.
4.5.2.2 – Ensaio de Hemaglutinação de EvV
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados em placas de ELISA
com fundo em “V” por meio de diluição seriada (1/2, 1/4, 1/8, etc...). Em cada poço
foram adicionados 25 μL de NaCl 0,15 M, 25 μL da amostra e 25 μL da suspensão
de eritrócitos humanos a 4%. A placa foi deixada em descanso à temperatura
ambiente; após 30 minutos a aglutinação foi observada, e o título expresso em
unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido como inverso da maior diluição
da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação (MOREIRA & PERRONE,
1977).
.
MÉTODOS
44
4.6 – PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA VICILINA DE E. velutina
4.6.1 – Obtenção de soro pré-imune
Os Coelhos de três meses de idade foram imobilizados e sangrados através
de corte na extremidade da orelha feito com bisturi cirúrgico, para obtenção do soro
pré-imune. Após a coleta de 5 mL de sangue este material foi deixado em repouso
por 16 horas a 5 °C . O soro foi separado do coágulo formado, centrifugado para
clarificar e reservado a -20 °C.
4.6.2 – Imunização
Após a obtenção do soro pré-imune, amostras de EvV foram preparadas a
uma concentração de 1 mg/mL em solução salina, NaCl 150 mM. Este material foi
emulsificado em adjuvante completo de Freund (ACF) na proporção 1:1 (solução de
EvV: adjuvante). Após 30 dias, novas aplicações de antígenos emulsificados em
adjuvante incompleto de Freund (AIF) foram realizadas regularmente. O protocolo
utilizado para imunização do coelho com obtenção de anticorpos policlonais foi
seguindo o método descrito por Thorpe (1994):
1° dia – imunização subcutânea do antígeno + ACF (0,5 mL)
30° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL)
60° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 1° sangria
90° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 2° sangria
120° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 3° sangria
A obtenção e estocagem do soro após imunização seguiram o mesmo
procedimento do soro pré-imune. Reforços foram aplicados semanalmente e
antissoros obtidos regularmente.
MÉTODOS
45
4.6.3 – Isolamento de imunoglobulinas do tipo G (IgG)
As amostras de antissoros obtidas foram passadas em uma coluna de
proteína A-Sepharose previamente equilibrada com tampão NaH
2
PO
4
0,02M pH 8,0,
150 mM NaCl. O material não adsorvido foi eluído com tampão de equilíbrio. A
eluição de IgGs adsorvidas na coluna foi realizada com tampão Na
2
HPO
4
50mM,
Acido cítrico 25mM, pH 3,0. As IgG isoladas foram neutralizadas com NaOH 0,1M,
dialisadas contra água e liofilizadas. Soluções estoques de IgG foram preparadas
em PBS pH 7,5, BSA 2% na concentração de 10 mg/mL. Os anticorpos assim
obtidos foram utilizados para o imunoblot. O título do anticorpo foi estabelecido pela
técnica de “dot-blot”.
4.7 – ANÁLISE DE EvV ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
4.7.1 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e
desnaturante
A eletroforese das amostras foi feita segundo o método desenvolvido por
Laemmli (1970). Foram utilizadas placas de vidro de dimensões 10 x 14 cm,
espaçadores de 1,0 mm e solução estoque de acrilamida/bisacrilamida (30%/ 0,8%,
w/w) dissolvidas em água destilada em volume para 100 mL. Esta solução foi filtrada
em papel de filtro Whatman n
°
1 e estocada em frascos escuros a 5
0
C. O gel de
separação foi preparado numa concentração de 15% contendo: 1,2 mL de água
destilada, 1,3 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, 50 μl de SDS 10%, 2,5 mL de
solução estoque de acrilamida/bisacrilamida, 25 μl de persulfato de amônio e 2,5 μl
de TEMED. O gel de concentração foi preparado com 1,5 mL de água destilada,
0,625 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 6,8, 25 μl de SDS 10%, 0,330 mL de
MÉTODOS
46
solução estoque de acrilamida/bisacrilamida, 12,5 μl de persulfato de amônio e 2,5 μl
TEMED. Às frações protéicas contendo 15 μg de proteínas, foi adicionada tampão
de amostra constituído de Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10% v/v, e
0,01% de azul de bromofenol. O tampão de corrida continha trizma base 25 mM,
glicina 192 mM e SDS 10%. A eletroforese foi realizada sob corrente constante de
20 mA por aproximadamente 2 horas e após o marcador de corrida (azul de
bromofenol) atingir o final do gel, a eletroforese foi parada.
4.7.2 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e não
desnaturante
A metodologia estabelecida por Laemmli (1970) foi modificada para a análise
de EvV. O protocolo do item 4.7.1 foi repetido, sem a adição de SDS. A eletroforese
foi realizada sob corrente constante de 20 mA por aproximadamente 2 horas e após
o marcador de corrida (azul de bromofenol) atingir o final do gel, o tempo de corrida
foi estendido por mais 3 horas.
4.7.3 – Coloração com Coomassie Blue
Após a eletroforese o gel foi corado segundo procedimento descrito por
Weber e Osborne (1969). A solução corante foi preparada usando-se Comassie Blue
R-250 a 1%, metanol 40%, ácido acético 10% em água destilada. O descoloração foi
feito com uma solução contendo ácido acético 10% e etanol 30%.
4.8 – IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS - “WESTERN BLOTTING”
O método de “western blotting” ou “imunoblotting” representa uma
combinação das técnicas de eletroforese e imunodetecção de proteínas, com o
MÉTODOS
47
objetivo de visualizar a especificidade de interação antígeno/anticorpo por meio de
uma imunoreação (TOWBIN et al., 1979).
Após a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, os géis foram
retirados das placas e equilibrados em tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina
192 mM pH 8,0, metanol 20%). Membranas de nitrocelulose e papéis de filtros
Whatman 3MM foram cortados no tamanho dos géis. As membranas foram também
equilibradas com tampão de transferência por 5 minutos. Em uma bandeja de vidro
foi montado um “sanduiche” que tinha a seguinte ordem de empilhamento: primeiro
foi colocado o suporte plástico do aparelho de transferência, seguido de uma
esponja, três folhas de papel de filtro, o gel de eletroforese, a membrana de
nitrocelulose e por último mais três folhas de papel de filtro, esponja e outro suporte
de plástico (Figura 2). Entre o gel e a membrana teve-se o cuidado de retirar bolhas
de ar que poderiam interferir na transferência das proteínas. O “sanduiche” foi
comprimido pelos suportes plásticos que se conectavam, colocado em uma cuba de
eletrotransferência (célula comercial Transblot) e imerso em tampão de
transferência. A eletrotransferência foi feita por 90 minutos com uma corrente
constante de 200 mA a 4 °C. Após transferência o “sanduiche” foi desfeito e a
membrana, retirada cuidadosamente, foi corada com Vermelho de Ponceau 2%,
para se verificar a eficiência da transferência.
MÉTODOS
48
Figura 6 – Esquema de montagem do “sanduíche” para eletrotransferência de proteínas de
gel de poliacrilamida para membrana de nitrocelulose.
A imunodetecção das proteínas seguiu o procedimento descrito por Towbin et
al., 1979:
1. Bloqueio dos sítios não específicos na membrana com tampão bloqueador
(tampão fosfato 0,1 M, NaCI 0,15 M Tween 20 0,05%, leite desnatado 2%, pH 7,4).
A membrana ficou nesta solução por 1 hora;
2. Lavagem da membrana com tampão fosfato 0,1 M, NaCI 0,15 M, pH 7,4
por 6 vezes, cada lavagem com duração de 10 minutos;
3. Reação com o anticorpo primário. Os anticorpos anti-EvV produzidos em
coelho foram utilizados na titulação 1:2000. Todos os anticorpos foram diluídos em
bloqueador, e as membranas imersas nestas soluções por 1 hora;
4. Repetição do ítem 2;
5. Reação com o anticorpo secundário. HRP-anti-lgG de coelho foi diluída em
tampão bloqueador (1:5000) e a membrana imersa nesta solução por 1 hora;
6. Repetição do ítem 2;
Suporte plástico
Esponja
Papel Whatman
Gel
Nitrocelulose
Papel Whatman
Esponja
Suporte plástico
MÉTODOS
49
7. Visualização da reação imunológica. As bandas protéicas imunoreativas
para EvV foram reveladas por uma reação com o cromógeno diaminobenzidina
(DAB). As membranas foram imersas em uma solução contendo 5 mg de DAB
dissolvidos em 4,9 mL de água destilada, 0,3 mL de imidazol 0,1M, 0,1 mL de
tampão Tris-HCl 2M pH 7,5 e 5 μL de H
2
O
2
a 30% (4°C). As membranas ficaram
imersas nesta solução por 10 minutos ou até aparecerem bandas coradas em
marrom.
8. Provas em branco com soro pré-imune foram incluídas.
4.9 – BIOENSAIO COM LARVAS DE C. capitata
4.9.1 – Curva de Densidade
Para determinação do número mínimo de larvas que poderiam ser usadas no
bioensaio sem, entretanto, afetar o resultado em decorrência da competição, uma
curva de densidade foi primeiramente construída.
O Bioensaio foi realizado em tubo de ensaio para hemólise, onde para cada
tubo foi adicionada dieta para larvas de C. capitata. Cinco densidades foram
testadas (20, 40, 60, 80 e 100 larvas por grama de dieta). Para isto, larvas recém
eclodidas foram cuidadosamente transferidas para as dietas dos tubos, e após 96
horas o bioensaio foi paralisado, colocando os tubos em banho de gelo, as larvas
foram retiradas da dieta, lavadas, contadas, enxugadas em papel toalha e por fim
pesadas.
Os experimentos foram feitos em quadruplicatas e os tubos ordenados de
forma aleatória, ordenação esta obedecida na hora da contagem e pesagem das
larvas.
MÉTODOS
50
4.9.2– Curva de instares larval
Para a determinação e caracterização dos instares larvais de C. capitata,
quinze larvas foram coletadas durante cada um dos seis dias do desenvolvimento
larval. Estas larvas foram acondicionadas em microtubos de centrifuga com solução
fixadora (Solução de Pampel: 44% etanol; 4% formaldeído; 6% Ácido acético),
fervidas por um minuto e deixadas em descanso por no mínimo 24 horas. Após esse
período as larvas foram fotografadas e suas imagens analisadas no programa Image
Tool ver. 3.0. Os comprimentos larvais obtidos foram plotados em um gráfico para a
determinação dos instares. Neste tipo de análise cada instar larval é caracterizado
pela formação de agrupamentos de pontos.
4.9.3 – Efeito de vicilinas sobre o Desenvolvimento de Larvas de C.
capitata
Para avaliar o efeito das vicilinas purificadas sobre o desenvolvimento de C.
capitata, quantidades crescentes de EvV foram adicionadas à dieta das larvas.
Foram utilizadas as seguintes concentrações: 0; 0,0125; 0,025; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2;
0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0% (p/p). Neste bioensaio 15 larvas recém eclodidas foram
colocadas cuidadosamente em 500 mg de dieta e após 96 horas, as larvas foram
retiradas da dieta, lavadas em NaCl 0,15 M, contadas, enxugadas em papel toalha e
por fim pesadas. Os experimentos foram feitos em quadruplicatas e os tubos
ordenados de forma aleatória, ordenação esta obedecida na hora da contagem e
pesagem das larvas.
4.11– ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para analisar os dados obtidos nos bioensaios foi aplicado uma análise de
variância, seguida do teste de comparações múltiplas de Turkey, ao nível de 5% de
MÉTODOS
51
significância. Todos os cálculos foram feitos no sistema Statistica ’99 versão 6.0. A
WD
50
e a LD
50
foram mensurados para todos os bioensaios com larvas.
4.12 – DETERMINAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DE VICILINAS
4.12.1 – Digestibilidade in vivo de vicilinas por larvas de C. capitata
Para o ensaio de digestibilidade in vivo, larvas de 3° instar foram alimentadas
em dieta líquida que consistia de uma suspensão composta de amido 2%, sacarose
20% e NaCl 0,9% por 3 horas. Depois deste período as larvas foram colocadas em
dieta acrescida de EvV em uma concentração de 0,125% (p/v) (valor inferior ao
WD
50
). As larvas foram mantidas durante 3 horas, sendo, em seguida, removidas
para dieta controle sem EvV e alimentadas por mais 3 horas. Posteriormente a
suspensão contendo as fezes foi centrifugada a 13000 x g. O precipitado foi
descartado e o sobrenadante analisado pela metodologia de SDS-PAGE e
imunodetecção ( “Western blotting”). Tratamento controle com BSA foram realizados
nas mesmas condições descritas acima.
4.12.2 – Detecção de quitina em Intestino médio de C.capitata
Intestinos médios de larvas de 3° instar foram dissecados e submetidos a
análise da presença de quitina, pelo método de Von Wisseling, descrito por Rogers e
Perkins (1968). As amostras de intestinos de C. capitata foram aquecidos por 20
minutos a 160 ºC em solução de NaOH saturado. Os resíduos foram lavados
sucessivamente com etanol nas concentrações de 10, 20, 40, 80 e 95%. O material
resultante foi colocado sobre lâminas de vidro e a presença de quitina foi testada
gotejando solução de lugol seguida do gotejamento de solução de ácido sulfúrico a
1%. O aparecimento de coloração marrom no resíduo após gotejamento da solução
MÉTODOS
52
de lugol indica a presença de quitina e o aparecimento da coloração violeta após
gotejamento com ácido confirma a presença nos resíduos testados. Nestes
experimentos foram usados quitina de carapaça de lagosta como controle positivo e
celulose de algodão como controle negativo.
4.12.3 – Ensaio de ligação in vivo de EvV em membrana peritrófica de
larvas de C. capitata
Para verificar a ligação in vivo de EvV a quitina presente em membrana
peritrófica de larvas, cerca de 2000 larvas, previamente alimentadas com EvV
(0,125% p/v) por 3 horas, foram dissecadas e as membranas peritróficas
armazenadas em tubos de microcentrífugas contendo tampão tetraborato de sódio
50 mM pH 7,5. As membranas foram submetidas a 10 lavagens de 1mL cada
lavagens, seguido de centrifugações a cada lavagem. As lavagens foram
monitoradas por quantificação protéica pelo método de Bradford até zerar a leitura a
595 nm. A eluição das proteínas adsorvidas nas membranas peritróficas foi feita pela
adição de 100μL de HCl 10 mM, seguida de centrifugação, diálise e liofilização. O
material liofilizado foi ressuspenso em tampão de amostra e submetido à SDS-PAGE
e Western blotting.
4.12.4 – Detecção de EvV-FITC retidas em estruturas quitinosas de
larvas de C. capitata
4.12.4.1 – Conjugação covalente de EvV-FITC
Para a conjugação com FITC 200 mg de EvV foram dissolvidos em tampão
carbonato 500 mM, pH 9,5, numa concentração final de 2 mg/mL. Um mililitro da
solução de FITC (20mg/mL em DMSO) foi adicionado à solução de vicilina em uma
proporção final de 0,1mg FITC/ mg de EvV. A mistura foi armazenada em um frasco
MÉTODOS
53
escuro e agitada levemente por 1 hora a temperatura ambiente. O FITC não reativo
foi removido por precipitação da vicilina com sulfato de amônio 0-90% de saturação.
O precipitado foi dialisado contra água destilada e liofilizado.
4.12.4.2 - Localização de EvV-FITC fluorescente no epitélio intestinal e
em membrana peritrófica de larvas de C. capitata e ensaio de inibição de
ligação com N-acetil D-glicosamina
Para verificar a ligação de EvV em estruturas quitinosas de C. capitata, o
EvV-FITC foi adicionado a dieta dos insetos a uma concentração de 0,125% (p/p)
para as larvas.
As larvas foram alimentadas com a dieta contendo vicilina marcada por 3
horas, e por mais 3 horas em dieta sem vicilina. Após esse período as larvas foram
dissecadas para a separação do epitélio intestinal e das membranas peritróficas. Os
epitélios intestinais foram imediatamente montados sobre lâminas e analisados ao
microscópio de fluorescência. As membranas peritróficas foram submetidas a 6
lavagens em PBS pH 7,5, 10 minutos cada para a retirada de EvV-FITC livre
remanescente. As imagens foram digitalizadas utilizando o sistema de capitação de
imagem Evolution MP Color da Media Cybernetics acoplado ao microscópio e o
programa Qcapture Pro v. 5.0.1.26.
4.12.4.3 - Ensaio de inibição da ligação de EvV–FITC a estruturas
quitinosas com N-acetil D-glicosamina
Para o ensaio de inibição da ligação, o protocolo do item 4.12.4.2 foi repetido
e a dieta contendo EvV-FITC foi complementada com 2,5% (p/p) de N-acetil D-
glicosamina. Os controles foram feitos utilizado BSA na mesma concentração de
MÉTODOS
54
EvV-FITC, controles contendo somente EvV não marcada, N-acetil D-glicosamina e
FITC também foram realizados.
MÉTODOS
55
Figura 5 – Esquema da Metodologia empregada no trabalho
EvV
F0-70%
Cromatografia de
Quitina
F70-90%
Gel filtração Sepharose
6-10-300 GL
SDS-PAGE e PAGE
Caracterização
bioquímica
Localização de EvV-FITC
fluorescente
Larva Digestibilidade in vivo
Ligação in vivo de EvV em
Membrana peritrofica
LD
50
WD
50
Farinha de Sementes
Erythrina velutina
Extrato Bruto
Bioensaios
Determinação do
mecanismo de ação
Detecção de outros
fatores antinutricionais
Quantificação de
carboidratos
Extração em tampão Bórax pH 7,5 50 mM
Precipitação com sulfato de amônio
RESULTADOS
56
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 102030405060
Fração
Abs 280 nm
Glicina
p
H 2.0
5.0 – RESULTADOS
5.1 – ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE VICILINA DE Erythrina velutina
5.1.1 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Quitina
A fração protéica F70-90%, proveniente da precipitação com sulfato de
amônio, rica em proteínas de natureza globulínica foi submetida a uma
cromatografia em matriz de quitina com a finalidade de isolar a vicilina de E. velutina.
O perfil cromatográfico da fração de E. velutina, depois de submetida a uma
cromatografia de afinidade em matriz de quitina, apresentou um pico retido que foi
obtido após eluição do material com tampão glicina 0,1M pH 2,0 (Figura 6). A
proteína eluída foi dialisada contra água destilada e liofilizada. O liofilizado foi
submetido aos passos seguintes de purificação e caracterização da vicilina.
Figura 6 – Perfil de eluição de EvV em cromatografia de afinidade em quitina. A coluna foi
previamente equilibrada com tampão tetraborato de sódio 50 mM , pH 7,5. As proteínas adsovidas
foram eluídas com glicina 0,1M, pH 2,0 em fluxo constante de 2 mL/min., a absorbância medida a
280 nm ( __●__ ).
RESULTADOS
57
5.1.2 – Análise da presença de proteínas de defesa ligantes a quitina co-
eluídas da matriz de quitina
Durante a etapa de isolamento de EvV por afinidade à quitina, ensaios para a
detecção de outras proteínas de defesa ligantes à quitina foram realizados.
Inibidores de proteinases serínicas e atividades lectínicas não foram detectados no
material eluído da matriz de quitina.
5.1.3 – Cromatografia de Exclusão Molecular em Superose 6-10-300 GL
em sistema de FPLC AKTA Purifier e Determinação da Massa Molecular de
EvV.
A vicilina de E. velutina ligante à quitina obtida da coluna de afinidade foi
submetida a uma cromatografia em coluna de gel filtração Superose 6-10-300 GL,
em um sistema para purificação de proteínas FPLC AKTA Purifier (Figura 7A). A
coluna foi previamente calibrada com proteínas de massas moleculares conhecidas.
Por meio da interpolação logarítmica entre massas moleculares das proteínas
conhecidas e os volumes de eluição obtidos das mesmas foi possível determinar a
massa molecular de EvV que foi de 216,57 kDa (Figura 7B) .
RESULTADOS
58
Figura 7 – (A) Perfil de eluição protéica de EvV em cromatografia Superose 6 10 300 GL. A coluna
foi equilibrada e eluída com tampão tetraborato de sódio 50 mM , pH 7,5 em fluxo constante de 0,5
mL/min., a absorbância medida a 280 nm (
__
●
__
); (B) Determinação da massa molecular de EvV
através da curva de calibração. Marcadores de massa molecular: 1- Tireoglobulina (669 kDa); 2-
EvV (216kDa); 3- β-amilase (200 kDa); 4- Álcool desidrogenase (150 kDa); 5- Anidrase carbônica
(29 kDa).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (mL)
Abs 280 nm (mUA
)
1 2 3 4 5
A
10
100
1000
1234
Rf
Peso molecular (KDa)
1
4
5
3
2
B
RESULTADOS
59
5.1.4 – Análise eletroforética de EvV em gel de poliacrilamida em
condições desnaturante e não desnaturante
EvV foi submetida a análise eletroforética em condições desnaturantes e não
desnaturantes. Em condições desnaturantes, EvV apresentou-se como uma proteína
multimérica composta por duas subunidades de 54,8 kDa e por duas de 50,8 kDa,
segundo uma curva de calibração obtida a partir de marcadores de massas
moleculares conhecidos (Figuras 8A e 8B). Proteínas de alta massa molecular foram
observadas, possivelmente complexos formados durante o processo de purificação.
Em condições não desnaturantes EvV apresentou-se como uma proteína única com
característica ácida (Figura 8C), indicando que os complexos de alta massa
molecular são parte da proteína dimérica.
Figura 8 – (A) SDS-PAGE (15%) de EvV corado com Comassie . M: marcadores de massa
molecular; EvV: setas indicam as subunidades; (B) Determinação da massa molecular de EvV
através da curva de calibração. Marcadores de massa molecular: 1- β-Galactosidase (116,0 kDa);
2- Albumina sérica bovina (66,2 kDa); 3- EvV1 (54,8 kDa); 4- EvV2 (50,8 kDa); 5- Ovalbumina
(45,0 kDa); 6- Lactato desidrogenase (35,0 kDa); 7- Enzima de restrição Bsp98 (25,0 kDa); 8- β-
Lactoalbumina (18,4 KDa); 9- Lisozima (14,4 kDa); (C) PAGE (15%) de EvV.
+
_
EvV
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
00,51
Rf
Log PM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
14,4
M EvV
A
B
C
RESULTADOS
60
5.1.5 – Quantificação de carboidratos em EvV
Por meio da construção de uma curva de glicose dosada pelo método de
Dubois (1948) foi possível estabelecer o conteúdo de carboidrato presente em EvV
que foi de 1,85%.
5.2 – BIOENSAIOS
5.2.1- Bioensaios com larvas
Os efeitos in vivo de vicilinas ligantes à quitina de E. veluntina para larvas de
Ceratitis capitata foram avaliados utilizando um sistema de dieta artificial. Para o
estabelecimento deste modelo de bioensaio foi primeiramente construída uma curva
de densidade para determinar as quantidades ótimas de número de larvas e massa
de dieta. E também foi construída uma curva de ínstar em relação ao comprimento
do corpo da larva.
5.2.1.1 – Determinação das condições ótimas de bioensaios para larvas
de C. capitata – Curva de densidade
Uma curva de densidade foi primeiramente construída para determinação do
número mínimo de larvas que poderiam ser usadas no bioensaio. Número este que
não afetaria os resultados em decorrência da competição entre as larvas pela dieta.
Diferença significativa para o aumento da densidade sobre o peso das larvas (GL:4;
F: 38,666; P_valor:4,7 X 10
-6
) foi obtido por análise de variância. Observou-se que
densidades larvais entre 20 a 40 larvas por grama de dieta não apresentaram
diferenças significativas na massa das larvas (Figura 9). Porém em densidades
superiores a 40 larvas por grama de dieta o desenvolvimento das larvas foi
retardado, chegando a uma redução de peso de 58,7%, quando presentes 100
RESULTADOS
61
larvas por grama de dieta. Por isso, uma densidade de 30 larvas por grama de dieta
foi estabelecida para os bioensaios seguintes.
Figura 9 – Curva de densidade para avaliação do efeito da competição das larvas de C. capitata
pela dieta. Cinco densidades foram testadas: 20, 40, 60, 80 e 100 larvas por grama de dieta. Após
96 horas o bioensaio foi interrompido para pesagem das larvas. Médias seguidas pela mesma letra
não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de significância de 5%.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
20 40 60 80 100
Número de larvas / g de dieta
Peso das larvas (mg)
a
a
b
c
d
RESULTADOS
62
5.2.1.2 – Determinação das condições ótimas de bioensaios para larvas
de C. capitata – Curva de Instars/ comprimento corporal
Com a finalidade de determinar o ínstar larval em relação ao comprimento do
corpo foi construída uma curva de instares (figura 10). O primeiro ínstar foi
caracterizado por larvas cujo comprimento corporal estava entre 0,7 a 3,0 mm. No
segundo ínstar as larvas mediam entre 4,5 a 6,3 mm, e o terceiro ínstar de 7 a 8,5
mm. Estes resultados foram adotados como padrões para verificar o retardo no
desenvolvimento larval quando as larvas eram submetidas às dietas testes.
Figura 10 – Curva de instares larvais em relação ao comprimento corporal. Amostras de quinze
larvas de cada um dos seis dias de desenvolvimento larval tiveram suas imagens digitalizadas e
medidas no programa Image Tool 3.0.
0
1
2
3
4
5
6
7
0123456789
Tamanho (mm)
Dias
1° ínstar
2° ínstar
3° ínstar
RESULTADOS
63
5.2.2 – Efeito de EvV sobre a massa de larvas de C. capitata
Para avaliar o efeito de EvV sobre a massa de C. capitata durante o
desenvolvimento larval, concentrações crescentes da vicilina foram incorporadas à
dieta das larvas em um modelo de bioensaio. Após 4 dias as larvas foram retiradas
das dietas e pesadas em balança analítica. Observou-se que EvV na concentração
de 0,20% foi capaz de reduzir a massa das larvas em 81,12% (Figura 11A). A WD
50
,
ou seja, a quantidade de vicilina necessária para reduzir a massa das larvas em
50%, foi para EvV de 0,13% (p/p), obtida pela equação de regressão linear. Na
figura 11B observa-se que larvas alimentadas em dietas contendo EvV na
concentração de 0,2% não se desenvolveram e estacionaram em um valor de
tamanho corporal equivalente a larvas de 1° ínstar.
5.2.3 – Efeito de EvV sobre a mortalidade de larvas de C. capitata
Uma curva dose resposta foi realizada para verificar o efeito de EvV durante o
desenvolvimento larval sobre a mortalidade de C. capitata. A partir da curva dose
resposta observou-se que EvV em concentrações superiores a de 0,25%,
adicionada na dieta, causou a mortalidade de 100% das larvas (Figura 12). A LD
50
,
ou seja, a quantidade de vicilina necessária para causar 50% de mortalidade, foi
para EvV de 0,14% (p/p). O controle com BSA não causou efeito sobre o
desenvolvimento larval.
RESULTADOS
64
Figura 11 – (A) Efeito de EvV sobre a massa de larvas de C. capitata em diferentes
concentrações. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao
nível de significância de 5%. (B) Larvas de C. capitata alimentadas em dieta artificial na
concentração de 0,2% de EvV. A barra = 1,5 mm.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300
Concentração (%)
Peso das larvas (mg)
EvV BSA
A
a
a
b
bc
c
a
a
a a
y = -39.877x + 9.9637 R
2
= 0.93
B
Controle 0,2%
RESULTADOS
65
Figura 12 – Efeito EvV sobre a mortalidade de larvas de C. capitata em diferentes concentrações.
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de
significância de 5%.
0
20
40
60
80
100
120
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300
Concentração (%)
Mortalidade (%)
EvV BSA
y = 359,46x - 0,991 R
2
= 0,95
a
a
b
b
c
a
a
a
a
RESULTADOS
66
5.3 – MECANISMO DE AÇÃO DE EvV
5.3.1 – Digestibilidade in vivo de EvV
A digestibilidade ou indigestibilidade de EvV foi avaliada in vivo quando larvas
de terceiro ínstar foram alimentadas com dietas contendo a vicilina na concentração
de 0,125% (p/p). Após 3 horas, as fezes dos animais foram coletadas, e as proteínas
extraídas foram submetidas primeiramente a uma SDS-PAGE seguido de uma
imunodetecção usando anticorpos gerados contra EvV. Bandas correspondentes às
subunidades de EvV foram visualizadas por eletroforese indicando que as proteínas
foram refratárias à hidrólise pelas enzimas digestivas dos animais (Figura 15A). A
indigestibilidade de EvV foi comprovada por imunodetecção onde se observa reação
cruzada entre o anticorpo gerado contra EvV e a proteína refratária a digestão que
foi extraída das fezes dos animais (Figura 15B). Também observa-se em ambas
metodologias que ocorreu redução na massa molecular das bandas protéicas das
subunidades de EvV.
Figura 15 – (A) SDS-PAGE e (B) Imunobloting das proteínas extraídas de fezes de larvas de C.
capitata. M- marcador; 1 – BSA; 2 – Larva + BSA; 3 – EvV; 4 – Larva + EvV.
M 1 2 3 4 5
B
M 1 2 3 4
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
14,4
A
RESULTADOS
67
5.3.2 – Mecanismo de ação de EvV baseado na ligação à quitina presente
na membrana peritrófica de C. capitata
5.3.2.1. Teste de Von Wisseling para detecção de quitina em intestinos
de C. capitata
Para detecção qualitativa de quitina em intestinos médios de larvas foi
utilizado o teste de Von Wisseling (ROGERS & PERKINS, 1968). Este teste
colorimétrico comprovou a presença de quitina em estruturas de intestinos médios
de C. capitata (tabela 1). O que indica que estas estruturas quitinosas possam servir
de sítios de ligação para EvV.
Tabela 1. Detecção de quitina em intestinos médios de C. capitata
Teste de Von Wisseling
Coloração
marrom
(lugol)
Coloração
violeta
(H
2
SO
4
)
Quitina + +
Intestinos de larvas de C. capitata + +
Algodão ND ND
(ND) não detectado; (+) detecção. Controle positivo: quitina de lagosta; Controle negativo: algodão.
5.3.2.2 – Ensaio de ligação in vivo de EvV em membranas peritróficas de
C. capitata
A ligação de EvV à membrana peritrófica de larvas de C. capitata foi
analisada por imunodetecção da vicilina em estruturas quitinosas dos animais.
Larvas de C. capitata, previamente alimentados com EvV, tiveram os intestinos
dissecados e as membranas peritróficas retiradas e estocadas. As membranas
peritróficas foram lavadas com tampão tetraborato de sódio 50mM pH 7,5, até que
as proteínas presentes e não ligadas às estruturas quitinosas fossem totalmente
RESULTADOS
68
retiradas. As proteínas retidas foram eluídas com uma solução de HCl 10 mM e
posteriormente submetidas a um SDS-PAGE. Em seguida as proteínas foram
transferidas para membranas de nitrocelulose e submetidas a imunodetecção,
utilizando um anticorpo gerado contra EvV. A reação de IgG anti-EvV e as proteínas
eluídas da membrana peritrófica foi positiva, confirmando que EvV adicionada à
dieta se ligou in vivo em estrutura da membrana peritrófica (Figura 16).
Figura 16 – Western blotting das proteínas extraídas de membranas peritróficas de larvas de C.
capitata. 1 – EvV; 2 – Larva + BSA; 3 – Larva + EvV.
1 2 3
RESULTADOS
69
5.3.2.3. – Localização fluorescente de EvV-FITC no epitélio intestinal e
em membrana peritrófica de larvas de C. capitata
• Localização fluorescente de EvV-FITC em larvas
A ligação de EvV em estruturas quitinosas presente em intestinos de larvas
de C. capitata foi comprovada por microscopia de fluorescência de larvas
alimentadas em dieta artificial contendo EvV-FITC a 0,12% (p/p). A fluorescência
observada nos painéis 1A e 3A da figura 17 comprovou a ligação de EvV-FITC ao
epitélio intestinal e a membrana peritrófica das larvas de C. capitata. A adição de
2,5% de N-acetil D-glicosamina foi eficiente na inibição da ligação de Evv-FITC à
estruturas quitinosas, observada nos painéis 2A e 4A, e pode ser indicativo que a
ligação de EvV-FITC nessas estruturas foi específica. Tratamentos controles com
EvV não marcada não apresentaram nenhum sinal de fluorescência.
RESULTADOS
70
Figura 17 –Fotomicrografia de fluorescência e de campo claro do epitélio intestinal e da membrana
peritrófica de larvas de C. capitata alimentadas em dietas contendo EvV-FITC acrescida ou não de
N-acetil D-glicosamina.
Painel 1A: Microscopia de fluorescência do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas
em dieta contendo EvV-FITC.
Painel 1B: Microscopia de campo claro do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas
em dieta contendo EvV-FITC.
Painel 2A: Microscopia de fluorescência do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas
em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.
Painel 2B: Microscopia de campo claro do epitélio intestinal de larvas de C. capitata alimentadas
em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.
Painel 3A: Microscopia de fluorescência da membrana peritrófica de larvas de C. capitata
alimentadas em dieta contendo EvV-FITC.
Painel 3B: Microscopia de campo claro da membrana peritrófica de larvas de C. capitata
alimentadas em dieta contendo EvV-FITC.
Painel 4A: Microscopia de fluorescência da membrana peritrófica de larvas de C. capitata
alimentadas em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.
Painel 4B: Microscopia de campo claro da membrana peritrófica de larvas de C. capitata
alimentadas em dieta contendo EvV-FITC complementada de N-acetil D-glicosamina.
OBS: Painéis 1 e 2 a barras = 200 μm;
Painéis 3 e 4 a barra = 50 μm
RESULTADOS
71
1A
2A
3A
4A
1B
2B
3B
4B
DISCUSSÃO
72
6.0 – DISCUSSÃO
A necessidade de controlar as pragas e patógenos na agricultura tem
impulsionado o desenvolvimento de uma variedade de pesticidas que diminuem as
perdas no agronegócio. Estudos toxicológicos baseados nos efeitos agudos e
crônicos da exposição a estas substâncias revelaram que muitos inseticidas
sintéticos são altamente tóxicos não somente à espécie da praga alvo, mas também
aos mamíferos e seres humanos. Conseqüentemente é necessária a busca por
alternativas mais seguras, com diferentes mecanismos de ação e ambientalmente
sustentáveis para o controle de pragas (LOPEZ, et al., 2005).
No curso de mais de 300 milhões de anos de coevolução as plantas
adquiriram efetivas contra-repostas aos insetos predadores. Muitos tipos de
compostos tóxicos são naturalmente depositados nas sementes como uma das
formas de garantir a integridade do genoma contra a herbivoria das pragas (KOGAN,
1986). Isso torna as sementes de plantas selvagens como verdadeiros armazéns de
moléculas que podem ser utilizados como bioprodutos nas áreas agronômicas e
biomédicas. Por isso, uma especial atenção tem sido direcionada na busca de
biomoléculas, em particular as de origem protéica, com atividades antimetabólicas e
ou tóxicas para patógenos e pragas. Neste grupo, proteínas como os inibidores de
proteinases (cisteínicas e serínicas), inibidores de α-amilases, lectinas, quitinases,
glucanases e mais recentemente as vicilinas (globulinas 7S) fazem parte do arsenal
protéico de defesas das sementes (XAVIER-FILHO et al., 1989; MACEDO, et al.,
1993; SALES, et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2002; ARAUJO, et al., 2005).
Em sementes de leguminosas, as vicilinas possuem papel fisiológico tanto
como fonte de aminoácidos para a plântula durante a germinação, quanto de defesa
DISCUSSÃO
73
durante o período de quiescência da semente (MACEDO, et al., 1993; SHUTOV, et
al., 1995; SALES et al., 2001). Essa propriedade de defesa das vicilinas foi
primeiramente descritas em sementes nigerianas de Vigna unguiculata (acesso TVU
2027 e seus descendentes IT81D-032 e IT81D-1045) resistentes ao bruquídeo
Callosobruchus maculatus. As vicilinas das sementes nigerianas foram indicadas
como as responsáveis por tal resistência, pois foram capazes de causar a
mortalidade e ou interferir no desenvolvimento de C. maculatus (MACEDO, et al.,
1993).
Sales et al. (1996) observaram que vicilina de sementes de Vigna unguiculata
ficavam retidas em matrizes composta de quitina, um polímero de N-
acetilglicosamina. Resultados posteriores mostraram que as vicilinas (globulinas 7S
de diversas outras leguminosas, como o feijão azuki (Vigna angularis), feijão-de-
porco (Canavalia ensiformis), soja (Glycine max), feijão-comum (Phaseolus vulgaris)
e fava (P. lunatus) ligavam-se fortemente à quitina (YUNES, et al., 1998), indicando
que estas proteínas tinham afinidade por este polissacarídeo. No presente estudo, a
vicilina da semente da leguminosa Erythrina velutina foi isolada quando a fração
globulinica da semente foi submetida à uma cromatografia em matriz de quitina,
onde as proteínas retidas e eluídas da matriz eram na maior parte de natureza
vicilínica.
Diversas proteínas de defesa presentes em sementes são capazes de se ligar
a matrizes de quitina entre elas quitinases (KRISHNAVENI et al., 1999; TAIRA et al.,
2001; SANTOS, et al., 2004), lectinas (BLOCH & BURGER, 1974; DATTA et al.,
1984; SANTI-GADELHA et al., 2006) e inibidores de proteinases (MACEDO et al.,
2002; MACEDO et al., 2003). Amostras de EvV isolada neste trabalho foram
submetidas a ensaios de detecção dessas outras proteínas de defesa, depois dos
DISCUSSÃO
74
quais foi confirmado que estavam livres destes outros fatores antimetabólicos. Na
etapa seguinte, para verificar o grau de purificação, amostras de EvV foram
submetidas a uma cromatografia analítica de exclusão molecular em Superose 6-10-
300 GL em sistema de FPLC AKTA Purifier. A eluição de um único pico protéico
comprovou a eficiência da etapa de cromatografia em quitina para a purificação de
EvV. Este método se mostrou um eficiente método alternativo àquele descrito por
Macedo et al. (1995).
A Vicilina de E. velutina apresentou peso molecular de 216,57 KDa, por
cromatografia de exclusão molecular e por SDS-PAGE, EvV se dissociou em duas
principais subunidades de 54,8 e 50,8 kDa, apresentando um bandeamento
eletroforético semelhantes ao encontrados para vicilina Vigna angulares (YUNES, et
al., 1998), portanto, na sua forma nativa EvV é um tetrâmero formado por 2
subunidades de 54,8 kDa e por 2 subunidades 50,8 kDa. Além das duas de EvV foi
verificada também a presença de subunidades de menores massas moleculares
provenientes de processamento proteolítico pós-traducional das subunidades da
proteína, que é uma das características dessa classe de proteínas oligoméricas
(SCHOLZ et al., 1983; SPENCER et al., 1983; SHEWRY et al., 1995). A
homogeneidade de EvV foi analisada em eletroforese nativa e foi observado a
presença de uma única banda com característica levemente ácida em concordância
com resultados encontrados para diversas globulinas 7S (PEDALINO, et al., 1992;
ORRUNO & MORGAN, 2007). Assim como outras vicilinas, EvV é uma glicoproteína
com 1,85% de sua massa composta por carboidratos, este resultado está dentro da
faixa observada para outras vicilinas que foi de 1 a 2% (DERBYSHIRE, et al., 1976;
BURKS et al., 1995; SHEWRY, et al., 1995; MÜLLER et al., 2000; LAUER et al.,
2004).
DISCUSSÃO
75
Yunes et al. isolaram vicilinas de sementes de várias espécies de
leguminosas e testaram-nas contra o bruquídeo C. maculatus. Essas vicilinas
mostraram-se deletérias para este inseto praga (YUNES, et al., 1998). Em outro
estudo foi mostrado que essas vicilinas poderiam ser usadas contra outros insetos
não predadores de sementes como broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis,
que também foram susceptíveis a ação tóxica de vicilinas de Vigna unguiculata a
qual causou uma redução considerável na taxa de sobrevivência deste inseto
(MOTA et al., 2003). Teixeira et al. (2007) comprovaram que vicilina da semente da
leguminosa E. velutina comportou-se também como uma proteína tóxica,
semelhantes a outras vicilinas isoladas de sementes de leguminosas, quando
adicionada à dieta de C. maculatus e Zabrotes subfasciatus, bruquídeos predadores
de sementes armazenadas. Com a finalidade de verificar o efeito tóxico de EvV
sobre o díptera C. capitata, um modelo de bioensaio foi utilizado para larvas
(EISEMANN, et al., 1994; CHANG, 2004). Um curva dose-resposta foi realizada para
avaliar o efeito de EvV sobre o desenvolvimento larval. EvV na concentração de
0,20% reduziu o peso das larvas em 81,12%, e foi letal em concentrações acima de
0,25%. A WD
50
e a LD
50
calculados no bioensaio larval foram de 0,118% e 0,15%
(p/p), respectivamente.
Os possíveis mecanismos de ação de EvV podem ser os mesmos observados
por Sales et al. (2001) para vicilina de V.unguiculata, onde a interação à quitina,
presente no intestino médios das larvas de C. maculatus, associada a baixa
digestibilidade destas proteínas poderiam explicar a baixa taxa de emergência e o
longo período de desenvolvimento dos insetos.
Para testar a hipótese de que o efeito tóxico de EvV estava relacionado a
indigestibilidade, fezes das larvas foram coletadas e analisadas por imunodetecção.
DISCUSSÃO
76
EvV se mostrou resistente a proteólise pelas enzimas intestinais de larvas de C.
capitata. Proteínas de sementes, geralmente, são resistentes à ação de enzimas
heterólogas (ROMERO & RYAN, 1978; NIELSEN et al., 1988). Durante a
germinação a mobilização das proteínas de reserva só é iniciada quando uma
proteinase cisteínica especifica abre a molécula para que outras proteinases possam
iniciar a degradação num sistema de proteólise em “zipper” (SHUTOV &
VAINTRAUB, 1987). Os insetos que se alimentam de grãos armazenados
desenvolveram um sistema proteolítico que permitiu utilizar como fonte de nitrogênio
as proteínas das sementes. A semelhança entre o sistema de degradação das
proteínas durante a germinação e o sistema proteolítico de bruquídeos é constatada
na utilização por estes insetos de enzimas de classes mecanísticas semelhantes
àquelas encontradas em sementes, como as proteinases cisteínicas e aspárticas
(WIEMAN & NIELSEN, 1988; CAMPOS et al., 1989; LEMOS et al., 1990; SILVA &
XAVIER-FILHO, 1991). Estudos demonstraram que as formas nativas das proteínas
de reserva são resistentes à proteólise por enzimas de mamíferos e enzimas
bacterianas do tipo serínicas. Segundo Silva et al. (2006) as enzimas proteolíticas
predominantes no sistema digestivo de C. capitata são do tipo serínicas. A ausência
de um sistema enzimático específico explicaria a indigestibilidade de EvV por C.
capitata. A indigestibilidade de EvV, contudo, não pode ser relacionada como a
principal determinante da toxicidade de EvV em C. capitata, uma vez que o
tratamento controle contendo BSA, que é uma proteína resistente a digestão
(BERETTA et al., 2001; RESTANI et al., 2004), não foi capaz de causar mortalidade
das larvas.
A existência de estruturas quitinosas no sistema digestivo de C. capitata foi
comprovada pelo teste de Von Wisseling. A hipótese de que a toxicidade de EvV
DISCUSSÃO
77
estava relacionada a sua capacidade de se ligar em estruturas quitinosas no trato
intestinal de C. capitata foi então analisada por imunodetecção e por localização
fluorescente de EvV-FITC no sistema digestório de larvas. A presença de EvV nas
amostras eluídas das membranas peritróficas foi confirmada pela ligação de EvV à
estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica. A especificidade de EvV
pela quitina presentes nestas estruturas foi confirmada quando a dieta dos insetos
foi suplementada com N-acetil-D-glucosamina que inibiu a ligação de EvV-FITC nas
estruturas quitinosas e consequentemente não foi detectada por fluorescência. Esse
mecanismo de ação foi observado em larvas de Callosobruchus maculatus onde a
propriedade de se ligar à estruturas quitinosas presente em membrana peritrófica e
ao ápice de células epiteliais do intestino médio causaram o efeito deletério para
este inseto (FIRMINO et al., 1996; SALES, et al., 2001).
Este provável mecanismo de ação de vicilinas é semelhante aos mecanismos
propostos para algumas lectinas, que se ligam a constituintes glicoprotéicos
presentes nos intestinos médios de insetos (ZHU-SALZMAN et al., 1998; FITCHES
et al., 2001). Eiseman et al. (1994), utilizando WGA mostraram que essa proteína se
liga à estruturas quitinosas presentes na membrana peritrófica e no ápice das
células do epitélio intestinal das larvas de Lucilia cuprina. A ingestão desta proteína
causou redução na taxa de crescimento larval e morte das larvas em concentrações
altas de lectina. Segundo os mesmos autores, estes efeitos foram provavelmente
causados por três mecanismos de ação: (1) redução na ingestão da dieta; (2)
bloqueio parcial dos poros da membrana peritrófica; e (3) a ligação direta das
lectinas nas microvilosidades do epitélio intestinal. Esta ligação poderia afetar várias
funções da membrana celular. Um mecanismo semelhante a este pode ser invocado
para explicar a ação de EvV sobre larvas de C. capitata.
DISCUSSÃO
78
A ligação de EvV no epitélio intestinal das larvas de C. capitata também foi
observada, além da ligação à estruturas quitinosas presentes na membrana
peritrófica. Resultado semelhante foi observado por Eisemann et al (1994) que
propuseram que possivelmente os sítios de ligação de proteínas ligantes à quitina
podem estar distantes ou ausentes em áreas restritas da membrana peritrófica
(PETERS, 1992), resultando em uma maior permeabilidade nestas regiões
(EISEMANN, et al., 1994). Sendo que o bloqueio aparente dos poros da membrana
peritrófica pela ingestão de proteínas que se ligam a quitina não é um evento
simples, e as membranas peritróficas, particularmente as do tipo II, não são barreiras
homogêneas de filtração, mas sim uma série de barreiras com diferentes potenciais
de filtração. Diversos fatores físicos e químicos alteram a permeabilidade da
membrana peritrófica (LEHANE, 1997) e estudos para determinação dos limites de
filtração em membranas peritróficas do tipo I e II de uma grande variedade de
dípteros sugerem que os diâmetros máximos dos poros estão entre 2 a 10nm, e a
faixa de exclusão para proteínas globulares está entre 6 a 200 kDa,
aproximadamente (PETERS & WIESE, 1986; MILLER & LEHANE, 1990). A
detecção de EvV-FITC ligada no epitélio de larvas de C. capitata está provavelmente
relacionada ao tamanho dos poros da membrana peritrófica e a massa molecular de
EvV.
Muitas proteínas tóxicas, como toxinas de Bacillus thuringiensis e lectinas,
têm os seus mecanismos de ação baseados na sua capacidade de se ligar em
determinados alvos no epitélio intestinal (MAJUMDER et al., 2005; GOMEZ et al.,
2006). Muitas lectinas foram inseticidas a uma grande variedade de pragas
economicamente importantes (POWELL et al., 1993; RAHBE et al., 1995; STOGER
et al., 1999), onde a ligação de lectinas no epitélio afetou o mecanismo de regulação
DISCUSSÃO
79
enzimática no microambiente das microvilosidades, causou anormalidades nas
células epiteliais e o rompimento das microvilosidades (FITCHES & GATEHOUSE,
1998). Em adição a destruição celular, estudos ultraestruturais mostraram a
presença de proliferação bacteriana nos sítios de ligação da lectina (POWELL et al.,
1998).
Portanto de acordo com os resultados apresentados neste trabalho o
mecanismo bioinseticida de EvV se deve a sua ligação a estruturas quitinosas
presentes na membrana peritrófica e no epitélio intestinal, associado com a baixa
capacidade de C. capitata em digeri-la. Esses resultados confirmam que vicilinas 7S
apresentam um papel importante nos mecanismos de defesa de plantas contra
insetos, e assim como as outras proteínas ligantes à quitina, são parte do arsenal de
defesa de sementes que podem ser utilizadas no combate a insetos não adaptados
como as moscas-das-frutas. Este trabalho é um dos primeiros a propor um
mecanismo de ação efetivo contra moscas-das-frutas baseado nas propriedades
tóxicas de proteínas de origem vegetal. Isto evidencia a grande potencialidade de
proteínas antimetábolicas encontradas em sementes de leguminosas de vários
ecossistemas, tanto regionais como nacionais, tornando-as candidatas a serem
usadas como bioinseticidas, em programas de manejo integrado de pragas, na
composição de iscas tóxicas, ou mesmo nos programas de melhoramento de
plantas cultivadas.
CONCLUSÃO
80
7.0 – CONCLUSÃO
1. A vicilina de E. velutina é uma glicoproteína dimérica e acida, com peso
molecular de 216,57 kDa que possui afinidade por quitina.
2. EvV é um potente larvicida. Causou mortalidade total em concentrações
acima de 0,25% (p/p). Esta proteína pode no futuro fazer parte de programas de
melhoramento genético de frutos resistentes ao ataque por moscas-das-frutas.
3. Larvas de C. capitata não foram capazes de digerir EvV.
5. EvV foi capaz de interagir com as estruturas quitinosas presentes no
intestino das larvas.
8.0 – REFERÊNCIAS
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