( PDF ) Espermatogênese e comportamento nucleolar em espécies da família pentatomidae (heteroptera) de importância econômica

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

Hederson Vinícius de Souza

ESPERMATOGÊNESE E COMPORTAMENTO NUCLEOLAR

EM ESPÉCIES DA FAMÍLIA PENTATOMIDAE

(HETEROPTERA) DE IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

Dissertação apresentada para

obtenção do Título de Mestre em

Genética

São José do Rio Preto-SP

2009

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Hederson Vinícius de Souza

ESPERMATOGÊNESE E COMPORTAMENTO NUCLEOLAR

EM ESPÉCIES DA FAMÍLIA PENTATOMIDAE

(HETEROPTERA) DE IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

Dissertação apresentada para

obtenção do título de Mestre em

Genética, área de Genética Animal e

Evolução junto ao Programa de Pós-

Graduação em Genética do Instituto

de Biociências, Letras e Ciências

Exatas da Universidade Estadual

Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,

Campus de São José do Rio Preto.

Orientadora: Profa. Dra. Mary Massumi Itoyama

São José do Rio Preto-SP

2009

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Souza, Hederson Vinícius de.

Espermatogênese e comportamento nucleolar em espécies da família

Pentatomidae (Heteroptera) de importância econômica / Hederson Vinícius

de Souza. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2009.

128 f. : il. ; 30 cm.

Orientador: Mary Massumi Itoyama

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas

1. Citogenética animal. 2. Espermatogênese em animais. 3.

Hemíptera. 4. Heteroptera. 5. Pentatomidae. I. Itoyama, Mary Massumi.

II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e

Ciências Exatas. III. Título.

CDU - 575

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE

Campus de São José do Rio Preto - UNESP

HEDERSON VINÍCIUS DE SOUZA

Espermatogênese e comportamento nucleolar em espécies da família

Pentatomidae (Heteroptera) de importância econômica

Dissertação apresentada para obtenção do

título de Mestre em Genética, área de

Genética Animal e Evolução junto ao

Programa de Pós-Graduação em Genética do

Instituto de Biociências, Letras e Ciências

Exatas da Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São

José do Rio Preto.

BANCA EXAMINADORA

Profª. Drª. Mary Massumi Itoyama

Professor Assistente Doutor

UNESP – São José do Rio Preto

Orientador

Profª. Drª. Doralice Maria Cella

Professor Assistente Doutor

UNESP – Rio Claro

Profª. Drª. Maria Elisabete Jorge Amaral

Professor Assistente Doutor

UNESP – São José do Rio Preto

São José do Rio Preto, 18 de fevereiro de 2009

AGRADECIMENTOS

A elaboração de uma dissertação não depende somente do autor,

mas também do meio no qual ele está inserido. É neste contexto que se evidencia

as várias pessoas que colaboraram com idéias, auxílios, críticas, sugestões, entre

outras inúmeras fontes inesgotáveis de conhecimento.

Desse modo, meus pais tiveram grande importância na

elaboração desta dissertação, assim como minhas irmãs, pessoas que serei

eternamente grato.

Aos meus amigos, e às vezes muito mais que amigos, que

ajudaram a compor os passos dessa escalada rumo à inatingível perfeição.

Com relação ao conhecimento científico, minha especial

dedicação a Profa. Dra. Mary Massumi Itoyama, minha orientadora, que desde o

estágio básico me incentiva e motiva para que eu possa sempre fazer o melhor. A

Profa. Dra. Hermione Elly Melara de Campos Bicudo, que nos auxilia com seu

magnífico saber científico. A Profa. Dra. Sônia Maria Oliani pelas oportunidades

de capturar as imagens. A Profa. Dra Eliana Morielle Versute e a Profa. Dra.

Lilian Madi-Ravazzi pelas críticas e sugestões durante a defesa da qualificação. A

Profa. Dra. Maria Elisabete Jorge Amaral e a Profa. Dra. Doralice Maria Cella

pelas sugestões e críticas durante a defesa da presente dissertação e aos demais

professores da UNESP/IBILCE que de maneira direta ou indireta, ajudaram na

elaboração desta dissertação.

Aos funcionários deste Instituto, em especial, aos da seção de

Pós-Graduação, cujo companheirismo, atenção e presteza são insuperáveis.

Aos meus companheiros de laboratório que sempre me

auxiliaram, me ensinaram e que tornaram o trabalho algo gratificante.

Aos órgãos de fomento, FAPESP, pela bolsa concedida e a

FUNDUNESP pelo auxílio com as despesas do projeto.

Meus sinceros agradecimentos a todos que me auxiliaram na

elaboração desta dissertação.

“Todos esses que aí estão

Atravancando meu caminho,

Eles passarão...

Eu passarinho!”

(Mário Quintana)

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 6

II. OBJETIVOS ...............................................................................................

III. ARTIGOS ................................................................................................... 16

1. Estudo da meiose e da espermiogênese nos lobos testiculares de

Antiteuchus tripterus (Heteroptera: Pentatomidae) ..................................... 17

2. Padrão de coloração pelo nitrato de prata durante a meiose e

espermiogênese nos lobos testiculares de Antiteuchus tripterus

(Heteroptera: Pentatomidae) ........................................................................

3. Padrões morfológicos da cromatina heteropicnótica e do material

nucleolar na meiose e espermiogênese de alguns Pentatomidae

(Heteroptera) ............................................................................................... 42

4. Aspectos evolutivos da espermatogênese de Euschistus heros,

Platycarenus umbractulatus e Thyanta perditor (Heteroptera:

Pentatomidae) na formação do lobo harlequin ........................................... 50

5. Avaliação da espermatogênese após o uso de Periodic Acid Schiff

(PAS) em Pentatomidae (Heteroptera) ........................................................ 86

IV. DISCUSSÃO GERAL ............................................................................... 102

V. CONCLUSÕES GERAIS ..........................................................................

107

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 111

VII. ANEXOS ..................................................................................................... 118

1. Materiais e Métodos ......................................................................................

2. Espécies Analisadas ......................................................................................

119

122

VIII. RESUMO .................................................................................................... 124

IX. ABSTRACT ................................................................................................ 125

I. INTRODUÇÃO

Os Heteroptera constituem um dos mais importantes grupos de

insetos do ponto de vista econômico, pois a maioria, durante os estádios de ninfa e

adulto, alimenta-se de plantações ou grãos armazenados para o consumo humano.

Os Heteroptera incluem aproximadamente 37.000 espécies distribuídas em oito

infraordens, cinco das quais abrigam essas espécies nocivas (REBAGLIATI et al.,

2005). Entre estas se encontra a família Pentatomidae, que inclui 4112 espécies,

muitas das quais são pragas de plantações (SCHAEFER; PANIZZI, 2000). Esses

insetos são comumente denominados de maria-fedidas devido ao seu desagradável

odor, produzido por meio de uma glândula que se abre na região da metapleura.

Essa família é constituída de oito subfamílias (Asopinae, Cyrtocorinae,

Discocephalinae, Edessinae, Pentatominae, Phyllocephalinae, Podopinae e

Serbaninae).

Com relação aos aspectos citogenéticos, os Heteroptera possuem

cromossomos holocêntricos (sem centrômero localizado), não apresentam

estrutura cinetocórica nas células meióticas (BUCK, 1967; COMINGS; OKADA,

1972; MOTZKO; RUTHMAN, 1984; RUFAS; GIMÉNEZ-MARTÍN, 1986;

WOLF, 1996), atividade cinética é restrita aos finais dos cromossomos, ou seja,

nas regiões teloméricas (cromossomos são denominados telocinéticos,

GONZALEZ-GARCIA et al., 1996; HUGHES-SCHRADER; SCHRADER,

1961; MOTZKO; RUTHMANN, 1984; SCHRADER, 1935, 1940),

terminalização dos quiasmas é presumido ocorrer (JOHN; KING, 1985), embora

haja trabalhos que discutam este assunto (JONES, 1987; SOLARI; AGOPIAN,

1987) e a primeira divisão meiótica é reducional para os autossomos e equacional

para os cromossomos sexuais.

Com relação aos sistemas cromossômicos do sexo já foram

descritos os simples (XY/XX, 74,7% das espécies e o X0/XX, 14,8%) e os

múltiplos (originados por fragmentação do cromossomo X e, menos

frequentemente, do cromossomo Y, Xn0/XnXn, XnY/XnXn e XYn/XX, 10,3%)

(UESHIMA, 1979; MANNA, 1984). Há, ainda, um sistema particular neo-XY

(0,2%) (CHICKERING; BACORN, 1933; JANDE, 1959; SCHRADER, 1940).

Relatos citogenéticos de espécies da família Pentatomidae

mostram número diplóide de cromossomos, em machos, de seis a 27, sendo o

mais frequente o de 14 (85%) (REBAGLIATI et al., 2005) e o sistema

cromossômico do sexo XX/XY (fêmea/macho), exceto em três espécies

(Macropygium retuculare, X1X2Y; Rhytidolomia senilis, neo-XY e Thyanta

calceata, X1X2Y) e não apresentam m-cromossomos. Entretanto uma

característica particular dos Pentatomidae é a presença, em algumas espécies, de

uma meiose atípica em um dos lobos testiculares (lobo harlequin) (LANZONE et

al., 2003; REBAGLIATI et al., 2001; REBAGLIATI et al. 2005).

Segundo Rebagliati et al. (2005), as características que são

diferentes no lobo harlequin, comparado aos demais, são as associações não-

específicas dos autossomos, disposição anômala dos cromossomos na placa

metafásica, segregação cromossômica e fusão celular, resultando como

consequência a produção de espermatozóides com número cromossômico

altamente variável, o qual pode afetar a fertilidade do indivíduo. Até a revisão de

Rebagliati et al. (2005), 22 espécies, pertencentes a 15 gêneros e três subfamílias

diferentes (Discocephalinae, Edessinae e Pentatominae) foram relatadas

possuírem este lobo.

Estes insetos apresentam outras particularidades durante a

meiose. No leptóteno-zigóteno o cromossomo X é positivamente heteropicnótico

e está localizado na periferia do núcleo. Após o diplóteno, as células aumentam de

tamanho e o núcleo torna-se semelhante ao estado interfásico, sendo este

denominado de “difuso”. No final da diacinese o cromossomo X torna-se

isopicnótico. Na metáfase I o cromossomo X localiza-se no centro do anel

formado pelos autossomos bivalentes. Na anáfase I os autossomos bivalentes

dividem-se reducionalmente enquanto o cromossomo X divide-se

equacionalmente. A segunda divisão segue-se diretamente após a telófase I, sem

os estágios restantes. Na metáfase II os autossomos dispõem-se no plano

equatorial formando uma configuração em anel, com o cromossomo X no centro.

Após a telófase II, as células filhas formadas, terão como destino o processo de

espermiação, pela diferenciação dos espermatócitos e elongação dessas células

(BRESSA et al., 2002).

Uma estrutura que vem sendo bastante estudada é o nucléolo.

Sabe-se que o tamanho e o número de nucléolos e dos corpos pré-nucleolares

dependem das características funcionais das células e podem refletir, então, em

diferenças metabólicas e funcionais (SOUZA et al., 2007a; TAVARES;

AZEREDO-OLIVEIRA, 1997). Segundo Bressa et al., (2003) a persistência do

nucléolo e dos corpos pré-nucleolares observados na meiose de Dysdercus

imitator (Pyrrhocoridae, Heteroptera), pode estar relacionado com a intensa

atividade sintética a fim de produzir RNA ribossômico (RNAr) requerido para a

espermatogênese. Entretanto, a possibilidade de que a alta taxa de transcrição de

RNAr possa estar relacionado a um outro fator desconhecido não pode ser

descartada (BRESSA et al., 2003).

O número e a localização das Regiões Organizadoras

Nucleolares (RONs) foram determinados em poucas espécies de Heteroptera por

diferentes técnicas e diferentes resultados foram relatados. Em todos eles uma

única RON foi observada, mas com diferentes localizações: na posição mediana

ou subterminal em diferentes pares de autossomos ou nos cromossomos sexuais

(CAMACHO et al., 1985; FOSSEY; LIEBENBERG, 1995; GONZALEZ-

GARCIA et al., 1996; PAPESCHI; BRESSA, 2002; PAPESCHI et al., 2003;

REBAGLIATI et al., 2003).

Nos Pentatomidae uma única RON foi detectada na região

telomérica de um par de autossomos em Edessa meditabunda (REBAGLIATI et

al., 2003), na posição mediana em um par de autossomos grande em Nezara

viridula (CAMACHO et al., 1985; PAPESCHI et al., 2003) ou na região

telomérica do cromossomo X de Graphosoma italicum (GONZALEZ-GARCIA et

al., 1996).

O estudo dos espermatozóides, também vem sendo objeto de

estudo de muitos pesquisadores. O primeiro sistema para classificação dos

espermatozóides, em algumas espécies de invertebrados, utilizou o complemento

cromossômico para distinguir os diferentes tipos (MEVES, 1903).

Espermatozóides com complemento cromossômico haplóide foram denominados

eupirenes, aqueles com os números cromossômicos superiores aos haplóides

foram chamados de hiperpirenes, os com complemento inferior ao haplóide foram

denominados de oligopirenes e os que não contêm cromatina de apirene.

Inicialmente era aceito que muitos destes espermatozóides com morfologia

alternativa, particularmente aqueles com divergência no conteúdo de cromatina,

não poderiam fertilizar e, portanto, eram chamados de atípicos. Healy e Jamieson

(1981), entre outros, sugeriram que os espermatozóides não fertilizantes fossem

chamados de paraespermatozóides e os fertilizantes de euespermatozóides.

As possíveis funções dos espermatozóides heteromórficos, em

insetos, foram primeiramente descritas por Sivinski (1980), enquanto Silberglied

et al. (1984) discutiram o possível papel dos espermatozóides apirenes em

algumas espécies de Lepidoptera. Swallow e Wilkinson (2002) elaboraram uma

hipótese com relação às possíveis funções dos espermatozóides heteromórficos e

as dividiram em quatro categorias diferentes: non-adaptative (não possui função),

provisioning (inicia a capacitação dos espermatozóides e fornece nutrientes para

as fêmeas, euespermatozóides e óvulo), facilitation (auxilia a migração dos

euespermatozóides nos testículos e nas fêmeas) e competition (remove/tira os

espermatozóides estocados e inutiliza-os).

Os testículos de todas as espécies de Pentatomidae consistem de

um número de subdivisões, compartimentos ou lobos. O número mais comum de

lobos é sete, embora haja variações entre as tribos e as espécies. As características

dos espermatozóides (tamanho e/ou ploidia) diferem entre os lobos (SWALLOW;

WILKINSON, 2002). Montgomery (1898 apud SCHRADER, 1960a) classificou

pela primeira vez os espermatozóides de Pentatomidae em três classes: grande,

médio e pequeno. Por exemplo, em Arvelius albopunctatus, o volume dos

espermatozóides da classe grande é aproximadamente oito vezes maior do que o

do pequeno (SCHRADER; LEUCHTENBERGER, 1950, 1951). Em todos os

casos descritos a produção de espermatozóides de tamanhos diferentes está

associada com um lobo particular do testículo. Dois lobos produzem o

espermatozóide com tamanho maior e estes lobos flanqueiam um lobo que produz

espermatozóides de tamanho menor. Os lobos remanescentes produzem os

gametas de tamanho médio. É importante ressaltar que estes espermatozóides de

classes diferentes resultam de meiose normal. Assim, o conteúdo de proteína e

RNA das diferentes classes de espermatozóides está positivamente relacionado ao

tamanho, enquanto o número cromossômico haplóide permanece constante.

Tamanho dos espermatócitos não está correlacionado com o tamanho do lobo. De

fato o lobo que produz o espermatozóide de tamanho menor é frequentemente o

maior e o lobo que produz o espermatozóide maior é o menor (SCHRADER,

1960a, b; SCHRADER; LEUCHTENBERGER, 1950, 1951; SOUZA et. al.,

2007b).

A polimegalia, descrita anteriormente, difere completamente de

um outro processo visto em um pequeno subgrupo de espécies da subfamília

Pentatominae, o qual resulta não somente em espermatozóides de diferentes

tamanhos, mas também de ploidias diferentes (BOWEN, 1922; SCHRADER,

1960a, b). Heteroploidia não é restrita para grupos monofiléticos, mas estão sendo

relatadas nas tribos Pentatomini, Halyini e Discocephalini. Resulta de um

processo irregular de meiose, em um dos lobos testiculares, originando

espermátides com um, o qual sempre é o cromossomo sexual, até 100

cromossomos, mais do que 10 vezes o número haplóide esperado, por exemplo,

para o gênero Loxa (BOWEN, 1922; SCHRADER, 1945a, b). Este lobo foi

denominado de harlequin e, geralmente, corresponde ao maior lobo, que em

alguns casos, levam a formação de testículos torcidos ou enrolados e produz o

espermatozóide de morfologia menor na maioria das espécies na subfamília.

Schrader (1960b) observou que as condições fisiológicas e químicas dos

harlequins diferem dos demais lobos.

Com relação a esta variação extraordinária no número

cromossômico, há sugestões que isto deva estar relacionado com a formação de

espermatozóides de diferentes tamanhos dependendo do conteúdo de

cromossomos. O tamanho dos espermatozóides é proporcionalmente relacionado

à quantidade de cromossomos. Mesmo que o desenvolvimento dos

espermatozóides prossiga independentemente do número de cromossomos,

evidências indicam que somente estes espermatozóides contendo pelo menos um

complemento completo de cromossomos sempre alcancem o ducto ejaculatório

(SCHRADER, 1960a, b). Assim, o espermatozóide menor, com quantidade de

cromossomos inferior ao número haplóide nunca deixa o aparelho reprodutor do

macho.

Schrader (1945a; 1960a, b) surpreendeu-se ao verificar que as

forças da evolução persistiram com os lobos harlequins, uma estrutura que produz

espermatozóides heteropoliplóides não usados na fertilização. Ele sugeriu que os

espermatozóides devam fornecer nutrientes adicionais, especialmente

nucleoproteínas para o desenvolvimento dos ovos. Como os espermatozóides

harlequins são provavelmente não férteis, o argumento de ocorrência de

poliespermia é duvidoso. Nem a ocorrência regular de poliespermia, em geral,

nem a entrada de espermatozóides harlequins nos ovos, em particular, foram

investigados em Pentatominae (SWALLOW; WILKINSON, 2002). Embora não

observados por Schrader, espermatozóides heteropoliplóides poderiam também ter

outros papéis nutritivos, isto é, para as fêmeas ou para os espermatozóides

fertilizantes (SWALLOW; WILKINSON, 2002).

Na revisão de Schrader (1960b) sobre a ocorrência de

heteroploidia em Pentatomidae foi relatada uma aparente associação com habitats

tropicais e subtropicais para mais de 20 espécies que tinha a característica.

Nenhuma associação entre o lobo harlequin e a condição ecológica foi descrita.

Pesquisas com Nezara viridula provém alguns suportes para o

papel nutritivo dos espermatozóides harlequin de tamanhos maiores. McLain

(1998) observou que os machos que não copulavam tinham os lobos harlequins

menores do que os que copulavam. O porquê das fêmeas sempre escolherem os

machos com melhores sucessos reprodutivos, foi medido pelo número de ovos

fertilizados durante a vida das fêmeas. McLain (1990, 1998) inferiu que fêmeas

receberam benefícios não-genéticos de preferência masculina. McLain (1998)

sugeriu que os benefícios não-genéticos poderiam resultar de espermatozóides

gigantes e multinucleados, se espermatozóides não fertilizantes fornecer nutrientes

para os ovos ou fêmeas. Para este argumento ser sustentado, a largura dos lobos

harlequin deveria ser correlacionada com o tamanho ou número de

espermatozóides produzidos e no caso de benefícios nutricionais diretos para o

ovo, poliespermia deveria ocorrer com alguma frequência.

Souza et al. (2007b) analisaram citogeneticamente testículos de

machos adultos de Antiteuchus tripterus e observaram divisões meióticas atípicas

no lobo 5 (harlequin). Outra característica observada foi a presença de um lobo

interno ao lobo harlequin. Souza et al. (2007b) sugere que pressões evolutivas

podem estar atuando para a manutenção desses lobos com espermatozóides

especializados.

Outra estrutura que vem sendo bastante estudada é o acrossomo.

Ele pode ter um importante papel durante o processo de fertilização, talvez agindo

como um ativador ou contendo enzimas que proporcionará o primeiro passo para

o início desenvolvimento do ovo (BOWEN, 1924). Os acrossomos de muitas

espécies animais foram analisados, verificando-se a variação na sua forma e

posição (SCHRADER; LEUCHTENBERGER, 1951).

Schrader e Leuchtenberger (1951) verificaram que a síntese de

material do acrossomo ocorre independentemente da síntese de outras estruturas

celulares. As alterações fisiológicas no terceiro e quinto lobos testiculares de

Arvelius albopunctatus provocaram um grande aumento do nucleoplasma, do

citoplasma e do nucléolo, induzindo, até mesmo, um crescimento do acrossomo.

O resultado foi um acrossomo enorme que possivelmente afeta a eficiência do

espermatozóide na sua fertilização. Assim, os pesquisadores sugeriram que

alterações muito leves no ambiente fisiológico podem afetar a formação do

acrossomo e consequentemente pode provocar algum grau de esterilidade.

Estes estudos mostram também, que essas espécies que possuem

os diferentes tipos de espermatozóides nos diferentes lobos, ou seja, indivíduos

com esterilidade localizada parece não apresentar grande influência na vida desses

machos. Eles são tão vigorosos e ativos quanto os machos de outras espécies com

formação de um único tipo de espermatozóide e o fato de muitas espécies terem

sobrevivido indica que uma adaptação para esta peculiar característica reprodutiva

foi atingida (SCHRADER; LEUCHTENBERGER, 1951).

II. OBJETIVOS

Dada a importância citogenética e econômica (pragas de grãos)

dos Heteroptera da família Pentatomidae, o nosso objetivo foi o de:

a) Analisar detalhadamente o comportamento meiótico, das seguintes espécies

de Pentatomidae: Antiteuchus tripterus, Euschistus heros, Mormidea

quinqueluteum, Oebalus poecilus, Oebalus ypsilongriseus, Platycarenus

umbractulatus e Thyanta perditor, em cada um dos lobos testiculares

separadamente;

b) Analisar o comportamento nucleolar, nos diferentes lobos, durante a

espermatogênese;

c) Analisar a morfologia do acrossomo em cada lobo separadamente.

III. ARTIGOS

ARTIGO 1

Estudo da meiose e da espermiogênese nos lobos testiculares de Antiteuchus

tripterus (Heteroptera: Pentatomidae)

SOUZA, H. V.; BICUDO, H. E. M. C; COSTA, L. A. A.; ITOYAMA, M. M. A

study of meiosis and spermiogenesis in the testicular lobes of Antiteuchus

tripterus (Heteroptera: Pentatomidae). European Journal of Entomology, v.

104, p. 353-362, 2007.

Resumo: As análises permitiram concluir que A. tripterus (Pentatomidae) possui

testículo formado de seis lobos, incluindo um lobo composto, isto é, um lobo

contendo outro em seu interior. O estudo da meiose e da estrutura dos

espermatozóides nos diferentes lobos revelou uma meiose convencional nos lobos

um a três. No lobo quatro, contudo, os espermatócitos na prófase I exibem

morfologia característica ao chamado estágio difuso e são maiores que aqueles

encontrados nos lobos 1-3 e também para as outras fases da meiose. Isso resulta

em espermátides não somente grandes, mas com suas cabeças morfologicamente

diferentes. Lobo 5 apresentou características conhecidas de outras espécies de

Heteroptera, como distribuição anormal de cromatina para as células filhas, da

qual origina células de diferentes tamanhos. Este lobo forma espermatozóides de

diferentes tamanhos. Lobo 6, contido dentro do lobo 5, difere deste por apresentar

células grandes semelhantes as do estágio difuso e com espermátides de cauda

com divisões transversais, a qual não foi encontrada nos outros lobos e ainda não

reportada na literatura.

ARTIGO 2

Padrão de coloração pelo nitrato de prata durante a meiose e espermiogênese

nos lobos testiculares de Antiteuchus tripterus (Heteroptera: Pentatomidae)

SOUZA, H. V.; CASTANHOLE, M. M. U.; BICUDO, H. E. M. C.; ITOYAMA,

M. M. Pattern of silver nitrate-staining during meiosis in testicular lobes of

Antiteuchus tripterus (Heteroptera: Pentatomidae). Genetics and Molecular

Research, v. 7, n. 1, p. 196-206, 2008.

Resumo: As análises permitiram verificar que os lobos testiculares de A. tripterus

diferiram quanto à atividade nucleolar. De modo geral, essas diferenças,

detectadas pelo uso da técnica de impregnação pelos íons prata, relacionaram-se

ao número, tamanho, intensidade de coloração e posição dos corpúsculos ou

material nucleolar, bem como as suas alterações no decorrer da espermatogênese.

Os lobos 1 a 3 caracterizaram-se por apresentar resultados semelhantes quanto a

esses aspectos. Os lobos 4 a 6, porém, diferiram entre si e em relação aos lobos 1

a 3. Os lobos 1 a 3, cuja meiose, previamente descrita, segue os padrões

considerados normais, sugeriram que essa espécie apresenta um par de

cromossomos portador da região organizadora nucleolar, como já havia sido

observado para outras espécies de Pentatomidae. Em geral, a quantidade de

material nucleolar observado nas células dos lobos 1 a 3 é menor do que nos

demais lobos. As diferenças entre os lobos ocorrem ao longo de todo o processo

de espermatogênese, sendo observadas, inclusive, na morfologia do material

impregnado pela prata presente na cabeça das espermátides. Dado que a função

fundamental do nucléolo é seu envolvimento na síntese protéica, as variações

interlobulares devem estar relacionadas às funções atribuídas aos diferentes lobos:

reprodução normal para os lobos 1 a 3 e função basicamente nutricional para os

lobos 4 a 6. Tanto quanto saibamos, este é o primeiro estudo da atividade

nucleolar ao longo da espermatogênese e individualmente para cada lobo

testicular.

ARTIGO 3

Padrões morfológicos da cromatina heteropicnótica e do material nucleolar

na meiose e espermiogênese de alguns Pentatomidae (Heteroptera)

SOUZA, H. V.; CASTANHOLE, M. M. C.; BICUDO, H. E. M. C.; COSTA, L.

A. A.; ITOYAMA, M. M. Morphological patterns of the heteropycnotic and

nucleolar material in meiosis and spermiogenesis of Mormidea v-luteum, Oebalus

poecilus e Oebalus ypsilongriseus (Heteroptera: Pentatomidae). Genetics and

Molecular Biology, v. 31, n. 3, p.686-691, 2008.

Resumo: Os insetos da família Pentatomidae, que incluem várias pragas da

agricultura, vêm sendo analisados quanto a diferentes aspectos da meiose e

espermiogênese. No presente estudo, o enfoque foi dirigido para os padrões

morfológicos da cromatina heteropicnótica e do material nucleolar de espécies de

dois gêneros. Os resultados mostraram que os testículos das três espécies

analisadas é multilobado, sendo constituído por três em Mormidea v-luteum e

quatro nas duas espécies do gênero Oebalus. A análise citogenética realizada

nesses lobos permitiu caracterizar o cariótipo de todas como constituído por 2n=

14 cromossomos (12A + XY). Outras características como ausência de lobo

testicular harlequin, meiose quiasmática, migração tardia dos cromossomos

sexuais e semi-persistência nucleolar foram comuns às três espécies. Elas também

partilharam várias das observações quanto aos padrões da cromatina

heteropicnótica e do material nucleolar, mas se diferenciaram por outras, entre as

quais destacamos a distribuição do material heteropicnótico nas espermátides e a

morfologia e distribuição do material nucleolar, no zigóteno. As diferenças

ocorreram sempre entre as espécies do gênero Oebalus de um lado e a espécie

Mormidea v-luteum do outro, sugerindo tratar-se de diferenças selecionadas no

processo evolutivo que originou os dois gêneros.

ARTIGO 4

Aspectos evolutivos da espermatogênese de Euschistus heros, Platycarenus

umbractulatus e Thyanta perditor (Heteroptera: Pentatomidae) na formação

do lobo harlequin

Hederson Vinicius de Souza, Hermione Elly Melara de Campos Bicudo, Luiz

Antônio Alves Costa*, Mary Massumi Itoyama.

UNESP - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e

Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Laboratório de Citogenética de

Insetos, Rua Cristóvão Colombo, 2265, Jardim Nazareth, CEP: 15054-000, São

José do Rio Preto, SP, *Museu Nacional, Departamento de Entomologia, Rio de

Janeiro, Brasil.

Resumo: A presença de testículos formados por compartimentos denominados de

lobos é uma característica da família Pentatomidae. Em algumas espécies um dos

lobos é o harlequin, o qual se diferencia dos demais por ser maior e por apresentar

células espermatogoniais com diferenças na divisão celular, resultando na

produção de espermatozóides com função não fecundante. Com objetivo de

avaliar a presença do lobo harlequin nas espécies Euschistus heros, Platycarenus

umbractulatus e Thyanta perditor os lobos testiculares foram analisados

individualmente. Euschistus heros apresentou testículos envoltos por membrana

avermelhada constituído por 6 lobos testiculares sendo o 5 mais delgado. Os lobos

4 e 6 apresentaram células de tamanho aumentado e com mais regiões

impregnadas pelos íons prata, padrão semelhante aos encontrados em

Pentatomidae com lobo harlequin. Platycarenus umbractulatus, exibiu 7 lobos

testiculares e apesar de não apresentar lobo harlequin, mostrou características

diferenciadas nas espermátides do lobo 5, sugerindo pré-adaptação para formação

de espermatozóides diferenciados neste lobo. Também foi observada associação

do nucléolo com os cromossomos sexuais. Thyanta perditor apresentou 3 lobos

testiculares e não apresentou diferenças entre os lobos. Desse modo, a análise,

dessas espécies, forneceu dados importantes para auxiliar na elucidação do

cenário evolutivo concernente a formação do lobo harlequin.

INTRODUÇÃO

Os testículos dos Heteroptera são divididos, por um tecido

conectivo, em algumas subunidades denominadas de “lobos”. O número mais

comum de lobos é sete, embora haja variações entre tribos e espécies. A meiose,

na maioria dos Heteroptera, segue o mesmo padrão em todos os lobos, contudo

meiose atípica pode ocorrer em algumas espécies da família Pentatomidae em um

dos lobos testiculares, denominado de lobo harlequin (NICKLAS, 1961;

REBAGLIATI et al., 2005).

Segundo Rebagliati et al. (2005), as características que são

alteradas no lobo harlequin é a associação não-específica dos autossomos,

disposição anômala dos cromossomos na placa metafásica, segregação

cromossômica e fissão celular, trazendo como consequência a produção de

espermatozóides com um número cromossômico altamente variável, o qual pode

afetar a fertilidade do indivíduo. Este lobo, geralmente, corresponde ao maior de

todos e como consequência, às vezes, produzem testículos torcidos ou enrolados

(NICKLAS, 1961; REBAGLIATI et al., 2005).

Até o momento um total de 23 espécies pertencentes a 15

gêneros da família Pentatomidae foi relatado possuir o lobo harlequin

(REBAGLIATI et al., 2005; SOUZA et al., 2007). Souza et al. (2007) observaram

em Antiteuchus tripterus (Heteroptera, Pentatomidae) a presença de 6 lobos

testiculares, sendo o sexto interno ao quinto (harlequin), o qual possui células e

espermatozóides diferenciados e com possível função de nutrição dos

espermatozóides do lobo harlequin.

Os Heteroptera, além de possuírem algumas espécies contendo o

lobo harlequin, possuem cromossomos holocêntricos (sem centrômero

localizado), não possuem estrutura cinetocórica (BUCK, 1967; COMINGS,

OKADA, 1972; MOTZKO, RUTHMAN, 1984; RUFAS, GIMÉNEZ-MARTÍN,

1986; WOLF, 1996), atividade cinética é restrita aos finais dos cromossomos, ou

seja, nas regiões teloméricas (cromossomos são denominados telocinéticos,

GONZALEZ-GARCIA et al., 1996; HUGHES-SCHRADER, SCHRADER, 1961;

MOTZKO, RUTHMANN, 1984; SCHRADER, 1935, 1940), terminalização dos

quiasmas é presumido ocorrer (JOHN; KING, 1985), embora haja trabalhos que

discutam este assunto (JONES, 1987; SOLARI; AGOPIAN, 1987) e a primeira

divisão meiótica é reducional para os autossomos e equacional para os sexuais.

Relatos citogenéticos de espécies da família Pentatomidae

mostraram que o número diplóide de cromossomos, em machos, varia de 6 a 27,

sendo o mais frequente o de 14 (85%) (REBAGLIATI et al., 2005) e sistema

cromossômico do sexo XX/XY (fêmea/macho), exceto em 3 espécies

(Macropygium retuculare, X1X2Y; Rhytidolomia senilis, neo-XY; Thyanta

calceata, X1X2Y) e não apresentam m-cromossomos (REBAGLIATI et al., 2001,

2005).

Uma estrutura que vem sendo bastante estudada nas espécies de

Pentatomidae é o nucléolo. O tamanho dessa estrutura está relacionado com a

atividade biosintética da célula; portanto, o tamanho e o número de nucléolos e

corpos pré-nucleolares dependem das características funcionais das células e

podem refletir, então, em diferenças metabólicas e funcionais (SOUZA et al.,

2008a; TAVARES; AZEREDO-OLIVEIRA, 1997).

Assim, o presente estudo teve como objetivo analisar em

Euschistus heros, Platycarenus umbractulatus e Thyanta perditor a

espermatogênese e o comportamento das células testiculares após a impregnação

por íons prata, em cada lobo separadamente e comparar os dados obtidos com

aqueles de espécies relacionadas já descritas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Quinze machos adultos de E. heros (Heteroptera, Pentatomidae,

Pentatominae, Carpocorini), P. umbractulatus (Heteroptera, Pentatomidae,

Discocephalinae, Discocephalini) e T. perditor (Heteroptera, Pentatomidae,

Pentatominae, Pentatomini) foram coletados, respectivamente, em pés de pata-de-

vaca (Bauhinia punctata), plantas de soja (Glycine max) e em pés de quiabo

(Hibiscus esculentus), na cidade de São José do Rio Preto (20º47’32” S,

49º21’37” W), SP, Brasil. Os insetos fixados em metanol:ácido acético (3:1),

tiveram os seus lobos testiculares separados e submetidos à técnica de

esmagamento (coloração com orceína lacto-acética). Para estudo do

comportamento nucleolar durante a espermatogênese, as lâminas foram

submetidas à técnica de impregnação pelos íons prata. Para a espécie E. heros

foram realizadas medidas do diâmetro em 100 células no estágio difuso e em 100

espermátides, de cada lobo, utilizando o programa UTHSCSA Image Tool v.3.00

e o programa Minitab versão 15.1 para o teste estatístico ANOVA (Tukey´s

comparasion com 95% de intervalo de confiança) para comparar as medidas das

células entre os lobos testiculares. As melhores células foram capturadas no

microscópio Zeiss, utilizando o programa de análise de imagens AXIO VISION.

RESULTADOS

Os testículos de E. heros são formados de 6 lobos alongados e

envoltos por membrana, sendo o quinto mais delgado. Essa membrana na região

proximal do ducto ejaculatório é avermelhada e na distal é transparente (Figura

1a,b). Platycarenus umbractulatus apresenta testículos envoltos por membrana

avermelhada e formados por sete lobos testiculares alongados, todos apresentando

tamanhos semelhantes entre si (Figura 1c,d). Thyanta perditor possui testículos

envoltos por membrana amarelada na região próxima ao ducto ejaculatório (região

proximal) e transparente na região distal, sendo constituídos por 3 lobos

testiculares alongados, sendo o lobo 2 mais espesso (Figura 2).

Análise da espermatogênese

Euschistus heros

Durante a espermatogênese, o comportamento das células de E.

heros, foi semelhante nos lobos 1, 2, 3 e 5 e entre o 4 e 6. Observou-se que nos

lobos 1, 2, 3 e 5 as células em prófase I apresentam um corpúsculo

heteropicnótico arredondado e bem definido localizado na periferia do núcleo

(Figura 3a-c) que provavelmente são os cromossomos sexuais, XY, sendo o maior

o X. Visualiza-se, ainda, a presença de quiasmas nos autossomos (Figura 3c). Na

metáfase I os cromossomos podem ser visualizados na forma radial (visão polar)

ou linear (visão lateral), sendo constituídos de 2n= 14 (12A + XY) cromossomos

(Figura 3d,e). Durante a anáfase e telófase observa-se comportamento regular de

segregação dos cromossomos (Figura 3f,g). No início da espermiogênese, as

espermátides são arredondadas e possuem material heteropicnótico, também,

arredondados no centro e, em forma de meia lua, próximo ao envoltório nuclear

(Figura 3h). Durante o alongamento observa-se somente a região heteropicnótica

próxima ao envoltório (Figura 3i,j). No final do processo a cromatina distribui-se

uniformemente na região anterior da cabeça, visualizando-se no final da região

posterior, uma pequena quantidade de material heteropicnótico (Figura 3k).

O comportamento meiótico das células durante a

espermatogênese dos lobos 4 e 6 foi semelhante, portanto, estão sendo

apresentados em conjunto. As prófases I (Figura 4a,b) apresentam um único

corpúsculo heteropicnótico, semelhante à dos lobos 1, 2, 3 e 5, mas as células são

maiores do que as mencionadas anteriormente. Todas as demais fases da meiose

apresentam o mesmo comportamento dos outros lobos, com a única diferença de

que são maiores (Figura 4c,d). Durante a espermiogênese a única diferença

observada, em relação aos demais lobos, é o tamanho aumentado das

espermátides na fase final do processo (Figura 4e-i).

Com relação ao tamanho das células, o teste ANOVA,

evidenciou que as células no estágio de prófase dos lobos 1, 2 e 3 são iguais

(p<0,0001), mas um pouco menores que as do lobo 5. As células dos lobos 4 e 6

são iguais (p<0,0001), entretanto são duas vezes maiores que as dos lobos 1, 2, 3 e

5. As medidas das espermátides arredondadas demonstraram que elas seguem o

mesmo padrão das células em prófase, mas não havendo diferenças entre os lobos

1, 2, 3, e 5 (p<0,0001) (Tabela 1).

Platycarenus umbractulatus

A análise da espermatogênese foi realizada individualmente nos

sete lobos. Pelo fato deles apresentarem características semelhantes, os dados

foram agrupados.

A prófase I apresentou um corpúsculo heteropicnótico evidente

e arredondado localizado na periferia do núcleo (Figura 5a). Na metáfase I, visão

polar, os cromossomos sexuais ficam no centro do anel formado pelos autossomos

e verifica-se a presença de 14 cromossomos (2n= 12A + XY) (Figura 5b). A

anáfase e a telófase são regulares, isto é, sem migração tardia de cromossomos

(Figura 5c-e). No início do processo de espermiogênese os espermatócitos

apresentam uma vesícula grande ao lado do núcleo (Figura 5f) e são constituídos

de várias regiões heteropicnóticas e que, posteriormente, adquire a forma de C

(Figura 5g,h). Durante o alongamento esse material heteropicnótico é encontrado

somente em um dos lados do núcleo (Figura 5i-l).

Apesar do processo de espermatogênese ter sido semelhante

entre os sete lobos, algumas diferenças foram observadas. Nos lobos 4 e 6 os

cromossomos foram encontrados agrupados 2 a 2 em algumas células da metáfase

I (Figura 6a,b). No lobo 5 as espermátides arredondadas e em início de

alongamento apresentaram diferentes padrões de concentração de material

heteropicnótico (Figura 6c-h), no lobo 6 o material heteropicnótico foi encontrado

no centro da espermátide (Figura 6i) e no lobo 4 e 6 observou-se a presença de

vesículas nas espermátides em alongamento (Figura 6j,k).

Thyanta perditor

O comportamento das células durante toda a espermatogênese

de Thyanta perditor foi semelhante entre os três lobos testiculares. Entre as

células testiculares após coloração com orceína lacto-acética, existem células com

dos núcleos poliplóides que apresentam uma massa heteropicnótica arredondada e

evidente deslocada para a periferia do núcleo (Figura 7a,b). As células em prófase

I apresentam uma ou duas regiões heteropicnóticas bastante evidentes, que

persistem até o final desta fase (Figura 7c-h). No diplóteno observa-se a

associação cromatínica entre os cromossomos homólogos através da região

telomérica. Durante a metáfase I verifica-se que o complemento cromossômico é

de 2n= 14 cromossomos (12A + XY), na qual os cromossomos sexuais situam-se

ao centro de um anel formado pelos autossomos (7j – visão polar). Na Figura 7i

observa-se uma metáfase I em visão lateral. Na Figura 7k-n observa-se anáfases

com migração tardia de um dos cromossomos, provavelmente o cromossomo X

(Figura 7n). Durante a espermiogênese, os espermatócitos apresentam vários

corpúsculos heteropicnóticos (Figura 7o), os quais se juntam para, nas

espermátides arredondadas, formar um corpúsculo heteropicnótico no centro

(Figura 7p). No início do alongamento das espermátides, o material

heteropicnótico está na periferia do núcleo em forma de C e no centro (Figura

7q,r), sendo arredondado e, posteriormente, torna-se alongado permanecendo

apenas na periferia do núcleo (Figura 7s-x).

Impregnação pelos íons prata durante a espermatogênese

Euschistus heros

O comportamento celular após impregnação por íons prata

durante a espermatogênese foi semelhante entre os lobos testiculares 1, 2, 3 e 5 e

entre os 4 e 6, semelhantemente aos resultados encontrados com relação ao

comportamento das células coradas com orceína lacto-acética durante a

espermatogênese.

O comportamento após a impregnação durante a

espermatogênese dos lobos 1 a 3 e 5 evidenciou a presença de dois corpúsculos

impregnados pelos íons prata de tamanhos diferentes no início da prófase I

(Figura 8a), que se desorganiza (Figura 8b,c), ficando o material dispersos ao

longo dos cromossomos (Figura 8d) e no interior das células até o final da telófase

nos lobos 1 a 3 (Figura 8j). No lobo 5 o material desorganiza-se por completo não

sendo mais observado no final da prófase I e metáfase I (Figura 8e-i). As

espermátides apresentam em torno de 4 corpúsculos impregnados de morfologia

variável (Figura 8k-m). Durante o processo de alongamento as espermátides dos

lobos 1 a 3 apresentam três marcações, uma na região mediana da cabeça e as

outras duas na região posterior próxima ao início da cauda (Figura 8n-p). As

espermátides médias do lobo 5 apresentam duas marcações, uma na região

mediana da cabeça e a outra na região posterior (Figura 8q). Em um estágio mais

avançado observa-se marcação apenas na região posterior da cabeça (Figura 8r,s).

Pode-se observar espermátides alongadas com forte impregnação ao longo de seu

comprimento nos lobos 1 a 3 (Figura 8t) e no lobo 5, também, com forte

marcação, mas com vários grânulos ao longo do comprimento (Figura 8u).

Os lobos 4 e 6 apresentaram dois corpúsculos impregnados

pelos íons prata de tamanhos diferentes e vários menores no início da prófase I

(Figura 9a), que se desorganizam (Figura 9b) e são observados distribuídos por

todo citoplasma até o final da telófase (Figura 9c-e). As espermátides

arredondadas apresentaram em torno de seis corpúsculos de morfologia variável

(Figura 9f,g). Foram visualizados espermátides com várias marcações pequenas e

um filamento ao longo de toda a cabeça e uma marcação pequena e alongada na

região posterior da cabeça (Figura 9h). Foram observadas, ainda, espermátides

com um filamento bastante impregnado atravessando toda a cabeça (Figura 9i) ou

material impregnado por quase toda a cabeça (Figura 9j) ou em torno de 50% ao

longo da cabeça (Figura 9k) ou apresentando um filamento e vários corpúsculos

arredondados ao longo da cabeça (Figura 9l).

Platycarenus umbractulatus

Pelo fato do comportamento após impregnação pelos íons prata,

durante a espermatogênese, ter sido semelhante nos sete lobos, os dados, também

foram agrupados. Durante a prófase I observou-se de dois a quatro corpúsculos

impregnados pelos íons prata sendo sempre um mais impregnado (Figura 10a-c).

Esses corpúsculos desorganizam-se durante o diplóteno/diacinese (Figura 10d),

observando resíduo de material impregnado nos cromossomos e no citoplasma.

Na metáfase I há regiões cromossômicas marcadas, corpúsculos menores e

material impregnado no citoplasma (Figura 10e). Na anáfase há marcações nos

dois grupos de cromossomos (Figura 10f). Na telófase observa-se reorganização

do material impregnado pelos íons prata nas duas células em formação ou em uma

única (Figura 10g,h). As espermátides arredondadas apresentam de uma a várias

marcações (Figura 10i-k) e que durante o alongamento é encontrada na região

posterior da cabeça (Figura 10l-o).

Apesar de quase todas as fases da espermatogênese terem sido

semelhantes nos diferentes lobos após impregnação pela prata, algumas diferenças

foram encontradas nos lobos 4, 5 e 6 durante a espermiogênese. As espermátides

arredondadas do lobo 5 apresentam uma única marcação arredondada em uma das

extremidades da cabeça, ou em torno de cinco marcações distribuídas pela

espermátide ou localizadas em uma única região (Figura 11a-c). Outras

espermátides em início de alongamento não apresentaram marcações (Figura

11d), ou apresentaram várias marcações de diferentes tamanhos distribuídas ao

longo da cabeça (Figura 11e-g), ou uma única marcação em apenas um lado da

cabeça, ou nos dois lados da cabeça ou distribuída por toda extensão da cabeça

(Figura 11h-k).

As espermátides em início de alongamento do lobo 6

apresentaram um filamento impregnado ao longo da extensão da cabeça e várias

impregnações distribuídas uniformemente ao longo da cabeça (Figura 11l). As

espermátides alongadas dos lobos 4 e 6 apresentaram as cabeças com

impregnação uniforme ou várias impregnações de tamanho pequeno ou grande

(Figura 11m-o).

Thyanta perditor

O comportamento da impregnação pelos íons prata em Thyanta

perditor foi semelhante entre os três lobos testiculares. Os núcleos das células

poliplóides apresentam uma ou duas massas amórficas impregnadas pelos íons

prata e outras bem menores (Figura 12a,b). Nas células em prófase I visualiza-se

um ou dois corpúsculos (Figura 12c-g), os quais se desorganizam completamente

até o final da prófase I, na qual se verifica uma marcação telomérica em um dos

autossomos (Figura 12g). Na metáfase I os cromossomos apresentam intensidade

de marcações diferentes (Figura 12h,i). Essas marcações nos cromossomos são

observadas da anáfase até a telófase (Figura 13j-m). Os espermatócitos

apresentam uma ou duas marcações (Figura 12n) que se fragmentam. As

espermátides arredondadas apresentam várias marcações (Figura 12o,p), as quais

migram para região anterior e posterior da espermátide durante o alongamento

(Figura 12q-t). Em uma fase mais adiantada de alongamento (Figura 13u) a

espermátide fica marcada continuamente.

DISCUSSÃO

Os testículos dos Heteroptera são formados por números

variáveis de lobos e recobertos por membrana de diferentes colorações.

Antiteuchus tripterus (Pentatomidae, Discocephalinae, Discocephalini) possui

testículo recoberto por membrana avermelhada e constituído de seis lobos

testiculares alongados, sendo o sexto interno ao quinto (SOUZA et al., 2007).

Mormidea quinqueluteum, Oebalus poecilus e O. ypsilongriseus (Pentatomidae,

Pentatominae, Carpocorini), analisados por Souza et al. (2008b) possuem,

também, membrana avermelhada recobrindo o testículo, mas o número de lobos

encontrado foi de três, quatro e quatro respectivamente. As espécies analisadas no

presente trabalho apresentaram três, seis e sete lobos alongados, respectivamente

para Thyanta perditor (Pentatomidae, Pentatominae, Pentatomini), Euschistus

heros (Pentatomidae, Pentatominae, Carpocorini) e Platycarenus umbractulatus

(Pentatomidae, Discocephalinae, Discocephalini) e os testículos são recobertos

por membrana amarelada ou avermelhada. Portanto, a partir dos resultados

descritos na literatura não há condição de se chegar à conclusão se há relação

entre o número de lobos e, por exemplo, a tribo a qual elas pertencem, assim

como, com relação a cor da membrana que envolve os testículos.

Na tabela 2 está contido o levantamento bibliográfico referente

as espécies cujos autores forneceram as seguintes informações: número de lobos,

meiose atípica e polimegalia. Foram descritas 51 espécies pertencentes as

subfamílias Asopinae, Acanthosomatinae, Discocephalinae, Edessinae e

Pentatominae com essas informações. As espécies das subfamílias Asopinae e

Acanthosomatinae apresentaram seis ou sete lobos e meiose normal, as espécies

das demais subfamílias apresentaram de três a oito lobos testiculares e algumas

espécies com meiose atípica. Verifica-se, portanto, através dessa tabela, uma

distribuição homogênea dos números dos lobos testiculares entre as espécies de

uma mesma subfamília e aparentemente não há correlação entre o número de

lobos com as subfamílias, necessitando, portanto de uma análise mais detalhada

com relação a este aspecto.

Algumas espécies da família Pentatomidae além de

apresentarem números variáveis de lobos testiculares podem ou não apresentar um

lobo diferenciado denominado de lobo harlequin. Dos quinze gêneros estudados

com a presença do lobo harlequin em Pentatomidae, 11 pertencem a subfamília

Discocephalinae, somente Platycarenus notulatus (Pentatomidae,

Discocephalinae, Discocephalini) não o possui. Por outro lado, somente três

espécies do gênero Loxa (Amyot e Serville, 1843), uma do gênero Mayrinia

(Horvath, 1925) e uma do gênero Adevoplitus (Grazia e Becker, 1997)

(Pseudevoplitus Ruckes, 1958) dentro de Pentatomini, uma das mais amplas tribos

dentro de Pentatominae estudada, e Brachystethus rubromaculatus (Dallas, 1851)

dentro de Edessinae apresentam meiose atípica (REBAGLIATI et al., 2005).

Segundo Schuh e Slater (1995) a família Pentatomidae é

subdividida oito subfamílias: Asopinae, Cyrtocorinae, Discocephalinae,

Edessinae, Pentatominae, Phyllocephalinae, Podopinae e Serbaninae, portanto

somente três subfamílias (Discocephalinae, Edessinae e Pentatominae) possuem o

lobo harlequin.

Segundo Schrader e Schrader (1946a,b) e Schrader (1945a,b) o

lobo harlequin não possui ocorrência acidental ou esporádica dentro das espécies

possuidoras. Eles são encontrados em todos os testículos e em todos os machos de

uma dada espécie e é sempre o mesmo lobo. Em Discocephalinae, por exemplo,

geralmente é o lobo 5, contado a partir do ducto ejaculatório, o harlequin. Isto

pode ser confirmado a partir do levantamento bibliográfico realizado na Tabela 2.

Há relatos, na literatura, de que algumas espécies que não

possuem o lobo harlequin, possuem polimegalia e que, geralmente, estão

relacionados aos lobos 4 e 6 (SCHRADER, LEUCHTENBERGER, 1950, 1951;

SCHRADER, 1960a, b). A espécie Antiteuchus tripterus (Heteroptera,

Pentatomidae, Discocephalinae) analisada por Souza et al. (2007) também

apresenta seis lobos testiculares, sendo o 5 o harlequin. Esse é o maior que os

demais, enquanto que o lobo 4 é o mais delgado e o lobo 6 é interno ao 5, ambos

lobos (4 e 6), nesta espécie, apresentam formação de células polimégalas.

A espécie Euschistus heros (Heteroptera, Pentatomidae,

Pentatominae) analisada no presente trabalho, possui seis lobos testiculares e

apesar de não possuir o lobo harlequin propriamente dito, as células da prófase

meiótica dos lobos 4 e 6 são maiores do que as dos demais lobos. Portanto, esses

resultados são concordantes com os descritos na literatura com relação a esses

lobos nas espécies possuidoras do lobo harlequin. Euschistus heros, por não

apresentar o lobo harlequin, propriamente dito, possui características evolutivas

intermediárias e seu estudo é importante para auxiliar na compreensão da

evolução de espermatozóides não fecundantes em espécies de Heteroptera. Outra

conclusão que se pode chegar, até o momento, é que os lobos 1 a 3 de todas as

espécies analisadas possuem espermatozóides normais e fecundantes, pois são

provenientes de processos de espermatogênese normal.

A outra espécie analisada no presente trabalho, Platycarenus

umbractulatus possui sete lobos testiculares e, também, não possui o lobo

harlequin, mas as células espermatogênicas dos lobos 4 e 6 apresentam diferenças

na concentração de cromatina e material impregnado pela prata, indicando, mais

uma vez, que estes são lobos relacionados com a polimegalia.

A exceção dentro da subfamília Discocephalinae a não

apresentar lobo harlequin é Platycarenus notalus (REBAGLIATI et al., 2005). No

presente estudo, a espécie P. umbractulatus, também não apresenta lobo

harlequin, contudo apresenta características diferenciadas na formação das

espermátides no lobo 5 com diferentes concentrações de heterocromatina e

marcações pelos íons prata sugerindo pré-adaptação para formação de

espermatozóides diferenciados neste lobo. Essas diferenças, observadas em

Euschistus heros e P. umbractulatus e inéditas na literatura, podem evidenciar

uma evolução independente para formação de espermatozóides não fecundantes

ou serem um passo intermediário na formação do lobo harlequin, mas que

necessitam de outras avaliações, assim como, da análise de outras espécies da

mesma subfamília.

AGRADECIMENTOS

Agradecimentos especiais à Profa. Dra Sonia Maria Oliani do

Departamento de Biologia do IBILCE/UNESP pela oportunidade de captura das

imagens celulares. À FUNDUNESP e à FAPESP pelo apoio financeiro.

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Tabela 1. Média dos valores medidos do diâmetro da células em

estágio difuso e seus respectivos núcleos e das espermátides

arredondadas de Euschistus heros, escolhidas aleatoriamente. As

barras laterais indicam igualdade entre os valores.

Valores (µm)

Lobos Células Núcleo Espermátides

1 23,60 ± 0,20 16,68 ± 0,15 8,32 ± 0,06

2 23,51 ± 0,22 17,45 ± 0,15 8,72 ± 0,06

3 23,06 ± 0,24 15,79 ± 0,20 8,53 ± 0,05

5 26,08 ± 0,25 19,53 ± 0,17 8,64 ± 0,09

4 37,78 ± 0,43 27,70 ± 0,28 14,15 ± 0,10

6 42,72 ± 0,43 30,28 ± 0,29 13,27 ± 0,11

p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001

Tabela 2. Espécies de Pentatomidae estudadas cujos autores informaram o número dos lobos

testiculares e aquele(s) com a ocorrência de meiose atípica e polimegalia.

Espécie N

Lobos

Lobo com

Meiose

Atípica

Lobo com

Polimegalia

Referências

Família Pentatomidae

Subfamília Asopinae

Apateticus crocatus 7 Não Não Bowen (1922a)

Euthyrhynchus floridanus (Linnaeus) 6 Não Não Bowen (1922a)

Perillus bioculatus (Fabricius 1775)

(as Mineus bioculatus, 1775)

7 Não Não Wilson (1906), Bowen (1922a)

Podisus maculiventris (Say) 7 Não Não Bowen (1922a)

[as P. modestus (Dallas, 1851)] Wilson (1906, 1909)

[as P. spinosus (Dallas, 1851)] Montgomery (1901, 1906)

Wilson (1905a, 1906, 1909)

Stiretrus anchorago (Fabricius 1775) 7 Não Não Wilson (1909), Bowen (1922a)

Subfamília Acanthosomatinae

Elasmostethus cruciatus (Say) 7 Não Não Bowen (1922a)

Subfamília Discocephalinae

Tribo Discocephalini

Antiteuchus tripterus (Fabricius,1787)

(as Mecistorhinus tripterus)

6 5 4 e 6 Schrader (1946b, 1960a), Lanzone

et al. (2003), Souza et al. (2007)

Dinocoris rufitarsus (Ruckes, 1958) 8 Schrader (1960a,b)

Discocephalessa humilis (Herrich-

Schaeffer, 1843) [as Platycarenus

notulatus (Stal, 1862)]

4 Não Schrader (1946b)

Platycarenus umbractulatus 7 Não Present work

Tribo Ochlerini

Alitocoris schraderi (Sailer, 1950) 5 5 4 degenerado Martin (1953), Schrader (1960a)

Subfamília Edessinae

Brachystethus rubromaculatus

(Dallas, 1851)

4 4 Schrader 1946b

Edessa bífida (Say) 5 Não 2 e 4 Bowen (1922a)

E. meditabunda (Fabricius, 1794) 4 Não In press, Rebagliati et al. (2003)

Subfamília Pentatominae

Tribo Aeliini

Aelia americana 7 Não Não Bowen (1922a)

Tribo Carpocorini

Carpocoris sp. 6 Não 3 ? Bowen (1922a)

Coenus delius (Say, 1832) 6 5 4 e 6 Montgomery (1901, 1906),

Wilson (1905a), Wilson (1906),

Bowen (1922a)

Cosmopepla bimaculata (Distant) 5 Não ? Bowen (1922a)

Euschistus euschistoides,

(Vollenhoven, 1868) (as E. ﬁssilis

Uhler, 1871)

6 5 4 e 6 Wilson (1905a, 1906), Bowen

(1922a)

Euschistus heros (Fabricius, 1798) 6 Não 4 e 6 Rebagliati (2005), Present work

E. ictericus (Linnaeus, 1763) 6 5 4 e 6 Wilson (1906), Bowen (1922a)

E. inflatus 6 5 4 e 6 Bowen (1922a)

Classificação N.

Lobos

Meiose

Atípica

Polimegalia Referências

E. servus (Say, 1832) 6 5 4 e 6 Wilson (1906) Foot, Strobell

(1914), Bowen (1922a)

Hughes-Schrader, Schrader (1961)

E. tristigmus (Say, 1832) 6 5 ? 4 e 6 Montgomery (1901, 1906),

Wilson (1906), Bowen (1922a),

Hughes-Schrader, Schrader (1961)

E. variolarius (Palisot de Beauvois,

1805) (as Pentatoma)

6 5 4 e 6 Montgomery (1897, 1898, 1901,

1906)

Wilson (1906), Foot, Strobell

(1914), Bowen (1922a,b)

Holcostethus limbolarius (Stål, 1872)

(as Peribalus)

6 Não Não Montgomery (1901, 1906),

Bowen (1922a)

Mormidea quinqueluteum

(Lichtenstien, 1796)

3 Não Rebagliati et al. (2005), Souza, et

al. (2008b)

Oebalus poecilus 4 Não Souza, et al. (2008b)

O. (Fabricius, 1775) (as Solubea

pugnax)

4 Não Não Wilson (1909), Bowen (1922a),

Hughes-Schrader, Schrader (1961)

O. ypsilongriseus (De Geer, 1773) 4 Não Rebagliati et al. (2005), Souza, et

al. (2008b)

Trichopepla semivittata (Say) 7 Não Não Montgomery (1901, 1906),

Bowen, (1922a)

Tribo Chlorocorini

Arvelius albopunctatus (De Geer,

1773)

6 4 3 e 5 Bowen (1922a), Hughes-Schrader,

Schrader (1956), Rebagliati, et al.

(2005)

Chlorocoris complanatus 7 5 4 e 6 In press

Loxa flavicollis (Drury, 1773) [as L.

florida (Van Duzze)]

7 5 4 e 6 Bowen (1922b), Schrader

(1945a,b)

L. viridis (Palisot de Beauvois, 1805)

[as L. picticornis (Horvath, 1925)]

7 5 4 e 6 Schrader (1945a,b) 1960a)

Tribo Nezarini

Chlorochroa uhleri (Stål) 6 Não 3 e 5 Bowen (1922a)

Nezara viridula (Linnaeus, 1758) 6 4 3 e 5 Bowen (1922a), Wilson (1911),

Xavier, Da (1945)

Manna (1951), Yosida (1956)

Hughes-Schrader, Schrader (1957)

Nuamah (1982), Camacho et al.

(1985)

Papeschi et al. (2003)

Rhytidolomia saucia (as Chlorochroa

saucia) (Say, 1832)

6 Não 3 e 5 Bowen (1922a), Schrader (1940)

R. senilis (as Chlorochroa senilis)

(Say, 1832)

6 3 e 5 Não Bowen (1922a), Wilson (1913)

Schrader (1940)

Tribo Halyini

Brochymena quadripustulata

(Fabricius)

7 Não 4 e 5 Bowen (1922a)

Tribo Pentatomini

Acledra hilare (Say, 1832) (as Nezara

hilaris)

6 Não Não Bowen (1922a), Hughes-Schrader,

Schrader (1957)

Montgomery (1901, 1906)

Wilson (1905a, 1906)

Wilson (1906, 1911)

Continuação

Classificação N. de

Lobos

Meiose

Atípica

Polimegalia Referências

Adevoplitus longicomis (Ruckes,

1958) (as Pseudevoplitus longicomis)

6 3 e 5 Schrader; Leuchtenberger 1951,

Schrader (1960a)

Banasa calva (Say, 1832) 3 Não Não Bowen (1922a), Wilson (1905b,

1907), Schrader, Hughes-Schrader

(1958)

B. dimidiata (Say, 1832) 3 Não Não Bowen (1922a), Wilson (1907)

Schrader, Hughes-Schrader (1958)

Thyanta calceata (Say, 1832) [as T.

custator (Fabricius, 1803)]

4 3 ? Não Bowen (1922a), Wilson (1911)

Schrader, Hughes-Schrader (1956)

T. casta 6 Não 3 e 6 Bowen (1922a)

T. custator 4 3 ? Não Bowen (1922a)

T. perditor (Fabricius, 1794) 3 Não Schrader, Hughes-Schrader

(1956), Present work

Tribo Strachiini

Murgantia histriônica 5 Não 3 e 4 Bowen (1922a)

M. histriônica (var. nigricans) 5 Não 3 e 4 Bowen (1922a)

Tribo Piezodorini

Piezodorus guildinii (Westwood) 5 ? Não Não Bowen (1922a), Rebagliati et al.

(2001)

Continuação

a b

Figura 1. (a) Testículo de Euschistus heros envolto por membrana avermelhada

sendo a região proximal (RP) do ducto ejaculatório (DE) mais avermelhada do que a

distal (RD); observar em (b) a presença dos 6 lobos alongados, sendo o 5 o mais

delgado (seta). Barra= 1 mm; c) testículo de Platycarenus umbractulatus, envolto por

membrana avermelhada e constituído por 7 lobos testiculares alongados (b).

Aumento 32x

a b

Figura 1. (a) Testículo de Euschistus heros envolto por membrana avermelhada

sendo a região proximal (RP) do ducto ejaculatório (DE) mais avermelhada do que a

distal (RD); observar em (b) a presença dos 6 lobos alongados, sendo o 5 o mais

delgado (seta). Barra= 1 mm; c) testículo de Platycarenus umbractulatus, envolto por

membrana avermelhada e constituído por 7 lobos testiculares alongados (b).

Aumento 32x

Figura 2. Testículo de Thyanta perditor envolto por

membrana amarelada na região proximal (RP),

tornando-se transparente na região distal (RD) do

ducto ejaculatório (DE), observar a presença de 3

lobos testiculares. Aumento 32x

Figura 4. Células dos lobos testiculares 4 e 6 de Euschistus heros coradas com

orceína lacto-acética. a,b) Prófases I com material heteropicnótico arredondado

evidente; c) metáfase I constituída de 2n= 14 cromossomos (12A + XY) (seta mostra

o cromossomo X e cabeça de seta o Y); d) telófase com separação regular dos

cromossomos; e) espermátide arredondada com material heteropicnótico localizado

próximo ao envoltório nuclear em forma de meia lua; f) espermátide em início de

alongamento, notar uma vesícula do tamanho do núcleo (seta); g-i) espermátides em

alongamento (i, seta mostra cromatina tênue). Notar que a cromatina passa a não ser

mais visualizada (h). Barra= 10 µm